JPH07504570A - ヒトの幹細胞および／または造血細胞を維持，生育するための方法，組成物および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 従って、本発明の目的は、複合−次細胞培養物を含む、ヒトの幹細胞および／ま たは初期ヒト造血細胞の維持・増殖のためのバイオリアクターであって、培養を 壊すことなくこの中で産生された細胞を回収することができるバイオリアクター を提供することにある。本発明者らは上述した目的および以下の記載から明らか になるであろうその他の目的を満たすデザインを見いだした。

本発明で提供される方法においては、ヒトの幹細胞および／または造血細胞（特 にヒトの幹細胞を含む突然変異の初期の細胞）を培養して効率的に増殖させるこ とのできるバイオリアクターおよび組成物が用いられる。本発明方法においては 、間質細胞（通常は形質転換されたもの）を任意に用いることもできる。間質細 胞は成長因子を構成的または導入的に産生ずるとともに、物理的に分離されてい て造血細胞を容易に分離するのに役立つ。連続潅流を行い、必要に応じて細胞を 取り出すかまたはリサイクルすることによって、本発明者らは生体外でヒト幹細 胞の細胞分裂が得られること、および生存可能な造血細胞を高密度、高置率で得 られることを見いだした。反応器は間質細胞のためのタンパク表面を存していて もよ（、同質細胞と造血細胞を分離しておくためにタンパク表面または他のバリ アを有してもよい。

本発明の方法においては、ヒトの幹細胞および／または造血細胞を試験管内で維 持し、効率的に増殖させるとともに系統制御することのできる方法および組成物 をバイオリアクターとともに使用する。効率的な増殖はとりわけ、全能造血幹細 胞あるいは多能性造血幹細胞を含む、突然変異の初期における造血細胞に適用さ れる。本発明方法においては、生体内の条件を部分的にシミュレートするととも に、部分的には前述した重要な臨床応用を可能とするための特定の変更を加えた 条件が許容される。本発明のバイオリアクターは、細胞培養を壊すことな（、連 続的、周期的あるいは間欠的に細胞を取り出すことを許容するものである。細胞 はその回収サイクルが先験的に定まっている場合は周期的に回収される。また培 養物をオンライン測定した結果に従って回収するときには間欠的な回収となる。

図面の簡単な説明 図１は潅流チャンバの模式図である。

図２は潅流媒体通路の模式図と流れ図である。

図３ａは細胞分離のための剪断応力を測定するフローチャンバの模式図である。

図３ｂは図３ａのフローチャンバの側面図である。

図３０は造血細胞についての剪断応力のグラフである。

図４ａと４ｂは造血細胞を生育し分離するためのフローチャンバの平面図および 側面図である。

図５８と５ｂは間質細胞を生育させながらバリアを順次除去する、フローチャン バの図である。

因６ａ−ｉは本発明による、平床の造血バイオリアクターの主な構成要素の模式 図である。

図７ａと７ｂは連続的または周期的に細胞を回収する手段を備えた平床の造血バ イオリアクターの主な構成要素の模式図である。

図８８と８ｂは選択的細胞回収を含み、連続的または周期的に細胞を回収する傾 斜した部分を有する、平床の造血バイオリアクターの主な構成要素の模式図であ る。

図９は自動化した細胞培養システムの例示である。

図１０ａ−ｃは（ｉ）ガス膜タイプ、および（ｉ　ｉ）酸素濃度との関連で、全 細胞、ＧＭ、およびＢＦＵ増殖を示す。

図’ｌ１ａ−ｃは本発明によるバイオリアクターを示し、とりわけ選択的細胞回 収を含む細胞回収に適合するものである。

発明を実施するための最良の態様 ヒト幹細胞および／または造血細胞を培養物中で生育させるために本発明方法と バイオリアクターが提供される。成長因子を得るために、任意に繊維芽細胞（通 常は形質転換したもの）を用いてもよ（、この任意成分である繊維芽細胞とヒト 幹細胞および／または造血細胞との混合物に蛋白性の成分を添加し、周期性のあ る間欠的な潅流あるいは実質的に回収した潅流を、任意にリサイクルを伴いつつ 行い、効果的な生育環境を維持する。

特に本発明は（ＩＢ胞のタイプに関して）バランスのとれた複合−次細胞培養物 を維持する方法とバイオリアクターを提供するものであって、これらはこれまで 得られなかったものである。好ましい実施態様においては本発明はヒトの付着間 質細胞、ヒトの付着幹／始原細胞、およびヒトの非付着造血細胞の共培養を含む ものである。

本発明の開示は、リアクターとその内部構造、潅流条件、および形質転換された 間質細胞即ち繊維芽細胞の三部に分かれる。

（ｉ）生体外でのヒトの幹細胞分裂あるいは（ｉ　ｉ）試験管内でヒト造血機能 を引き起こすためには以下に記載の事項が必要である。

ｌ、細胞をｐＨ均衡させた特定組成を育する液性媒体中で生育させるための培養 チャンバ。細胞は（造血機能を存する）バイオリアクター培養チャンバに入れら れ、連続的、周期的あるいは間欠的に呼吸ガスと液性培地が細胞に供給される。

また毒性で阻害性の代謝産物や生理活性を有する阻害物質を、連続的、周期的あ るいは間欠的に、培地の流れや膜を横切る透析によって細胞から除去する。

２、細胞が付着し、生育するための表面領域。活性のある、即ち造血機能を有す る細胞培養物は付着細胞集団と非付着細胞集団の両者を有している。ヒトの造血 幹細胞を含有する造血細胞培養物においては、付着細胞集団には間質細胞（繊維 芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞など）と造血細胞が含まれる。非付着細胞集団は主 として造血細胞、特に分化の進んだ造血細胞からなる。よって培養チャンバは付 着細胞集団の付着と生育のための適切な表面を提供するものでなくてはならない 。

この表面が提供されるにあたってはガスの割合と培地交換のバランスが取れてい なければならない。

本発明のバイオリアクターにおける細胞密度は、−平方センチメートル当たり約 ７００万個に達する。百万個の活性のある細胞は１時間に約０．０５から０．５ マイクロモルの酸素を必要とすることが知られている（Ｔｈｏｍａｓ著、’Ｍａ ｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、Ｗ、Ｇ、　Ｔｈｌｌｌｙ 編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ　（１９８６）参照）B 従って本発明のバイオリアクターにおいては、１時間に０．３５から約３．５マ イクロモルの酸素の移送を実現するために、１平方センチメートルの細胞生育領 域に対して十分なガス交換膜領域が提供されるべきである。知られているように 、もし気体透過膜を本発明のバイオリアクターに用いると、酸素移行率は主とし て用いられた気体透過の透過性能に依存し、そのため、気体透過膜を通って移動 する酸素の割合は必ずしも１平方センチメートルの気体透過膜領域に対し０．３ ５から３．５マイクロモルである必要はない。同様に、本発明において用いられ る細胞培養物領域が要求する栄養は、培地の潅流率をコントロールすることで調 整される。

細胞が付着する表面は、気体が交換される表面（下記第６項参照）であってよい が、必ずしもそうである必要はない。もし、培地に添加される成分をすべて間質 細胞に由来する成分とすることができれば細胞生育表面の提供の要求は緩和され るであろう。

３、培地の組成と還流：バイすりアクタ−中の、適切な組成を有する液性培地は 連続的に、周期的にあるいは間欠的に交換しなければならない（下記参照）。こ の要請により、培地の交換を行うための導入口および排出口が必要となる。培地 は栄養素、成長因子、その他細胞の生育と維持に必要な化学物質を含有する（下 記参照）。この要請は完全に定式化できないことが多々有り、動物やヒトの血清 のような複雑な化学組成物が用いられる（下記参照）。

４、非付着細胞の回収＝　（造血機能）バイオリアクターシステムから得られる １次産物は（造血性）細胞自身、特に幹細胞と始原細胞である。このためこれら の細胞を臨床的に有用な条件下で回収する手段が提供されなければならない。細 胞は連続的に、かつ周期的あるいは間欠的に回収される。培養の最中に回収が行 われる場合には、バイオリアクター中の付着細胞層を擾乱してはならない。回収 機構の具体例としては、重力を利用して細胞を沈降させるもの、傾斜沈降法によ って選択的に細胞を回収するものがあり、これらによって幹細胞および始原細胞 が富化された細胞集団を回収する。細胞の回収は、培地を除去するための排出口 と同一の、あるいは同一でない、細胞回収口から行うことができる。

５、付着細胞の回収：活性のある（造血機能を存する）培養を確立した後のある 時点において付着細胞集合体の一部あるいは全部を回収することが望ましい場合 がある。（造血活性を有する培養が確立されたか否かは、その培養から産生され た細胞を観察するかまたはバイオリアクターから回収される非付着細胞をカウン トすることによって決定される。本発明の好ましい実施態様によれば間質細胞層 が用いられる。そのような間質細胞層が確立するには約１週間（コンフルエント になるまでには２．３週間）かかる。よってチャンバと細胞生育表面は、臨床的 に有用な条件下で付着細胞集団が回収されつるようにするものでなくてはならな い。細胞回収のメカニズムとしては、物理的攪拌（震とうや急速潅流など）およ び生物学的操作（即ち溶解酵素、モノクローナル抗体または付着ブロック剤を適 用する）が挙げられる。

６、酸素の輸送および二酸化炭素の除去：呼吸気体のレベルが適切アある必要が ある。酸素は適切な流量および非阻害的レベルで供給される必要がある。酸素の 生理的濃度は約３０から６０ｍｍＨＨに相当する。通常、８８ｍＨｇを超えるレ ベルは細胞の活性を阻害し、ｌ　６０ｍｍＨｇを超える濃度は育毒である。酸素 の阻害と毒性は細胞株によって異なる。本発明者らによれば骨髄細胞は比較的感 受性が高い（７６０ｍｍＨｇの酸素は３７℃で約１ｍＭに相当する）。産生され た二酸化炭素は除去されなければならない。バイオリアクターは気体交換のため の気−液の自由界面を有してもよいが、好ましくは気体透過膜が用いられる。

細胞を高密度にするためには、気体の体積輸送率は充分に高い比領域（細胞培養 の単位体積に対する層領域）を有する気体透過膜の存在を必要とする。好ましい 細胞密度は最低１ｍｌあたり約５００万から１０００万である。よって、例えば １平方センチメートルあたりの細胞数が１００万であれば、Ｉｍｆあたり約５か ら１０平方センチメートルが必要となる。必要とされる気体交換領域は上記の膜 特性に依存する。この膜によってバイオリアクターは二つの部屋、即ち気体が通 過する気体チャンバと、液体が潅流して細胞が生育する細胞培養チャンバに仕切 られる。後者は気体交換と細胞生育・付着の両者の為の表面を有する。これらの 表面は同一であっても同一でな（でも良い。

それぞれの表面タイプを有する領域は気体透過性と細胞の呼吸率に関してバラン スしていなければならない。呼吸率はもっとも明確には細胞密度によって影響さ れる。たとえば、もし１００万の細胞が１時間に０．０５マイクロモルの酸素を 必要とすれば、Ｉｍｆに１００万個の細胞を有する培養は１時間に０．０５マイ クロモルの酸素の供給を要求するであろうし、一方、１ｍｌ中に１０００万個の 細胞を有する、１０倍密度の高い培養は１時間に０．　５マイクロモルの酸素を 必要とするであろう。このように呼吸率は直接的に細胞密度に依存し、したがっ て間接的には酸素供給および酸素供給膜の比領域に依存することになる。

あるいは呼吸気体を液性培地に入れてから、その培地をバイオリアクターの培養 チャンバに入れてもよい。これは、公知の方法と手段に従って、酸素含有気体ま たは純粋酸素を水性溶液に加えることで達成される。二酸化炭素は好ましくは液 性培地から除去される。酸素の水への溶解度が低いことから、そのような形態は 液性培地潅流速度が早いことを必要とする（例えばＩｍｆあたり１００万個の細 胞を存するリアクターは、細胞の酸素消費速度が遅い場合、ｋｍｌのりアクタ− につき１時間で０．５マイクロモルの酸素を消費する。０．０８ｍＭと同等であ る６０ｍｍＨＨの非阻害レベルで約十分で酸素は枯渇するであろう。このように 、酸素を輸送するために必要とされる液体の潅流率は、Ｉｍｆのりアクタ−で十 分間につき培地１ｍＡ＋である。）が、機械力にょってもたらされた高内部液体 打所応力（第８項参照）と引き換えに気体交換膜を不要とする。そのようなバイ オリアクターの形状は、たとえば図６ａ−ｅに示す形状に対応するものであるが 、６０９．６１０．６１１の三つの排出・導入口を有するバイオリアクター頂部 と、ガスケット６０２と、排出・導入口６０７，６０８が省略されたバイオリア クター底部のみからなるものである。

７、高密度の細胞および細胞添加： 生体内においては高密度のニッシユ（ｎｉｃｈｅ）において造血作用が進行する 。したがって増殖性造血機能バイオリアクターは細胞密度が高いところで細胞生 育と維持を実現しなければならない。そのような細胞密度は１ミリリットル中数 百万個を超えるべきであり、好ましくは１ミリリツトル中１０００万からから５ 億個の間である。高密度は気体交換と細胞付着のために比領域が高いことを必要 とする（たとえば１平方センチメートルに百万個の細胞が存在するとき、１ｍｆ 中１０００万個の細胞密度に対する比領域の要求はＩｍＡ’に対し１０平方セン チメートルであり、同様に、１ｍｊ７中５億個の細胞密度に対してはＩｍｆに対 し５００平方センチメートルである）。さらに効率的に生体内の細胞相似性を再 構築するには、細胞の添加は充分に高くなければならない（実際の細胞添加の下 限量は全単各細胞で５００万から１０００万個である。これは、幹細胞はおよそ １００万個に一個かそれ以下であるためで、そのため、サンプル中にす（なくと も−個の幹細胞を存するようにするためには数百万の細胞が必要となる。臨床的 に意味のある数の細胞を添加するためには、少なくとも約５０００万から１億個 の細胞を特徴とする特に、充分な数の造血細胞が存在することが必要である（即 ち上述のように幹細胞は百万個中約−個かそれ以下の量しか存在しないため、長 期間培養において活性を保持するためには恐らく少なくとも１０００万から１億 の細胞が必要である）。

８、低剪断応カニ 生体内において造血細胞および幹細胞が受ける、液体の機械力による剪断応力は 小さい。（造血）細胞はバイオリアクター中の有害な剪断応力から保護されなけ ればならない。場合によっては、ある振る舞い方を再生するために、限界を定め た上で剪断応力を与える必要がある。たとえば悪性細胞の低減にはそれらを物理 的に除去するにたる低剪断応力をかけることが必要となるかもしれない（下記参 照）。

低剪断応力は、流量を少なくするかまたは細胞を潅流培体から急速に物理的に分 離することで達成される。低流量はたとえば内部気体交換膜（図６１参照）によ って達成することができる（上記第６項参照）。もし高潅流率が必要であれば、 バイオリアクターの培養チャンバは流動部と非流動部に分離される（図６ｈ参照 ）。細胞は、主栄養素などの培地成分の迅速な交換を可能にする育孔膜で流動部 から隔てられている非流動部に置かれる（下記参照）。希望によりこの膜の分子 カットオフ機能を、細胞が非流動部で産生する大きな分子をそこに留めておく目 的で用いることもできる。

一旦これらの要求が稼働中のバイオリアクターモジュールにおいて満たされれば 、このモジュールはシステム全体の構成要素となる（図９参照）。システムは、 消費されなかった培地を適切に保存するための手段、バイオリアクターから細胞 を回収する手段、バイオリアクターに気体を供給しかつこれから気体を除去する 手段、消費された培地を蓄積する手段、および培養進行中においてＩ）Ｈや溶存 酸素圧なとの重要な変数をモニターする手段を有する。

この千年間、哺乳類の細胞を培養するためのバイオリアクターの開発に努力が傾 注されてきたので、この技術は上記の目的に直接応用できると考えられる。たと えば遺伝子工学を利用して得た細胞株から組織プラスミノーゲンアクチベータ（ ｔＰＡ）やエリスロボエチン（Ｅ　ｐ　ｏ）などの治療タンパクが産生され、ハ イブリドーマ細胞によってモノクローナル抗体が産生されたことから、哺乳類細 胞の最適な培養システムが大いに望まれるようになった。

この努力によって哺乳類細胞から治療タンパクを効率的に産生ずるためのバイオ リアクターシヌテムが開発されたが、ヒト幹細胞や造血機能バイオリアクターシ ステムが要求するものはこれとは大きく異なる。従前の大規模パイオリアクター ンステムは、比較的生育しやすい、純粋に形質転換された哺乳類細胞集団のみを 生育するものであった。一方、造血機能を有するバイオリアクターシステムある いはヒトの幹細胞バイオリアクターシステムは、間質細胞（繊維芽細胞、内皮細 胞等）および分化の様々な段階にある造血細胞（幹細胞、始原細胞、エリスロイ ド、顆粒球および単球前駆体）からなる混合−次細胞集団を生育するものでなく てはならない。ヒトの一次細胞を培養生育するのは形質転換され、連続した系統 の細胞株よりもはるかに困難である。さらに重要な点は、造血機能バイオリアク ターシステムから得られた産物は分泌されたタンパク分子ではなく細胞自身であ り、培養中に細胞を回収する手段が必要となる。ヒトの患者から得られる細胞の 用途からはさらに付加的な要求が出てくる。これらの差異は無視できるものでは なく、新世代のバイオリアクターの開発が望まれている。

間質（ストローマ）の必要性および、同質と造血細胞の物理的近位性のために、 懸濁培養やマイクロキャリアによる培養法を使用できる可能性はない。容易に細 胞を除去できなければならない必要性から、細胞産生には不適当な空洞の繊維体 モジュールとなり、さらに本発明者らの実験室における研究および他者の研究（ Ｓａｒｏｎｉｎｉら、（１９９１）、論文２５９ｅ、アメリカ化学エンジニア協 会年次総会、１１月１７−２２日、ロサンジエルス、カリフォルニア）によって 、空洞の繊維体モジュールは従来の操業条件下ではヒト骨髄の生育に適しないこ とがわかった。

大径孔を有するビーズの使用で細胞を酵素的に処理する必要が生じ、また細胞回 収手続きが複雑になった。また、大径孔を存するビーズの使用は臨床的適用を妨 げる。さらに、本発明者らは、骨髄が大径孔を存するコラーゲンビーズ上で生育 された場合には必要なヒト造血細胞と同質細胞の間の細胞集団バランスを得るこ とができないことをみいだした。間質細胞は大径孔ビーズに繁殖しすぎ、造血活 性を完全に阻止してしまう。このように、臨床的に意味のある数のヒトの幹細胞 または造影剤を培養する方法および装置に対して大きな必要性が存在することは 明らかである。

本発明のりアクタ−には容器が含まれるが、この容器はどのような形状であって もよく、都合のよい形状であることができ、必要な細胞分布、栄養素と酸素の導 入、廃棄代謝産物の除去、造血細胞の任意の除去またはリサイクル、間質細胞の 交替、および造血細胞の回収を可能とするものである。リアクターは実質的に骨 潅流を模倣した条件を提供する必要がある。生体中では一分間に骨髄１ｍｆあた り約０．０８ｍＩ！から０．　１ｍ！！の血清が潅流される。これは−日では１ ０”個の細胞につき約０．　２ｍ！！から０．３ｍｌの血清量である。そこで細 胞の密度によって培地を２４時間につき平均５０％から１００％の間で変化させ 生育に影響しない代謝産物のレベルを維持する。変化率は通常、−日に１０’個 の細胞につき潅流媒体を約０．２ｍｌから、好ましくは約０．　５ｍｊ！から１ ．　Ｏｍ！！の間とすることで経験的に生体内の潅流率を模倣することができる 。厳密には潅流率は使用する血清のタイプによる。

バイオリアクター中の潅流率はりアクタ−中の細胞密度によって異なる。２−ｉ ｏｘｔｏ＠個／ｍｌで培養される場合、潅流率はりアクタ−容積１ｍ！！にっき ２４時間で０．２５ｍ１から３．　０ｍｌ！であり、このとき使用される培地は ２０％の血清すなわち、ｌＯ％胎児牛血清および１０％ウマ血清、あるいは２０ ％胎児牛血清を含有する。さらに細胞密度が高い場合には、潅流率を比例的に増 大させ、単位時間、１細胞あたり一定の血清流量を達成する。よってもし細胞が ５×１０１個／ｍ１で培養される場合には潅流率はりアクタ−容積１ｍｉ！にっ き１分間でＯ，Ｉｍｐとなる。

これらの流入率は、血清および培地の流量を細胞密度に釣り合わせており、培養 において任意に用いられる健常ヒト骨髄間質細胞からの造血成長因子の内因性産 生刺激にとって基本的なものである。これらの血清と培地流量によって得られる 造血性成長因子としてはＧＭ−Ｃ３Ｆ、キットリガンドであるＳＣＦ　（幹細胞 因子）、ＩＬ−６、Ｇ−Ｃ３Ｆおよびその他の造血性成長因子が挙げられる。流 量はバイオリアクター中、間質細胞付着領域での幹細胞および始原細胞の縦方向 の流れにおける剪断応力が約１．　０および５．０ｄｙｎ／ｃｍ”以下であるよ うに設定する。

造血細胞および幹細胞を生育するためには様々な培地を使用することができる。

具体的な培地の例としてはＭＥＭ、ＩＭＤＭおよびＲＰＭＩが挙げられ、これら には間質細胞や幹細胞を刺激するために５−２０％（Ｖ／Ｖ）の胎児牛血清、５ −２０％（ｖ／ｖ）の子牛血清、５−５０％（ｖ／ｖ）のヒト血清、５−５０％ （ｖ／ｖ）のヒト血漿、および０−１５％（Ｖ／Ｖ）のウマ血清が添加されてい てもよく、および／またはＰＤＧＦ、ＥＧＦＳＦＧＦ、ＨＧＦまたはその他の成 長因子が添加された無血清培地が添加されていてもよい。形質転換した繊維芽細 胞によって提供される成長因子を補充するために、特に特定の系統に配された細 胞を望む場合には潅流培地に付加的成長因子を加えてもよい。間質細胞分泌また は追加により潅流培地に付加されてもよい成長因子としては、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ −Ｃ３ＦまたはＭ−Ｃ３Ｆ、インターロイキン１−７（とくに１．３．６．７） 　、ＴＧＦ−αまたはβ、エリスロボエチンなどが挙げられ、とくにヒトの因子 が好ましい。とりわけ興味の対象となるのは約１１００−３００ｎ／ｍｊ７のＧ 　−ＣＳ、Ｆおよび１−１００好ましくは１０ｎｇ／ｍＡ’の幹細胞因子（ＳＣ Ｆ、ＭＧＦ、これはマスト細胞因子ともキットリガンドとも呼ばれる）からの、 約０、５−２０、好ましくは５５−１Ｏｎ／ｍｊ７のＧＭ−Ｃ３Ｆ、０．５−２ 、好ましくはＩｎｇ／ｍＩ！のＩＬ−３、および０．１−２Ｕ／ｍｌを最終濃度 とするエリスロボエチンである。本発明の一実施例によれば、−またはそれ以上 の好ましくは少なくとも二種の成長因子が形質転換された細胞から分泌され、そ れらは潅流培地中の成長因子を好ましいレベルに維持するのに充分な量存在する 。

便宜上、リアクター内は生理的温度即ち３７°Ｃとされるが３３°Ｃを含むこれ より低い温度でもよい。但し通常は２５°Ｃより低いことはない。湿度は通常約 １００％で、このとき空気などの酸素含有気体や１−５０％（Ｖ／Ｖ）好ましく は５〜２０％（Ｖ　／　Ｖ　）の酸素を含有する気体は約５％（Ｖ／Ｖ）の二酸 化炭素を含有する。潅流培地はりアクタ−の外部または内部で酸素添加される。

内部での酸素添加には様々な手段が提供される。多孔焼結ディスク、シリコーン チューブまたは適当な有孔度と疎水性を有するその他の膜の使用によって内部で の酸素添加が達成される。栄養素のレベルと代謝産物のレベルは通常、比較的狭 い範囲に維持される。グルコースレベルは約５から２０ｍＭの間であり、通常約 １０から２０ｍＭの間である。乳酸塩濃度は通常約３５ｍＭ未満に維持されるが 、２０ｍＭを超える濃度であってよい。グルタミンの濃度は一般に１から３ｍＭ 、通常１、　５から２．５ｍＭに保たれ、アンモニア濃度は通常約２．５ｍＭ未 満、好ましくは約２．０ｍＭ未満に保たれる。

液体の流れは重力、ポンプあるいはその他の手段により、リアクターの内部構造 によって、どの一方向への流れでも多方向への流れでもよい。好ましくは層状の 流れとされるが、これは実質的にリアクターを横切る水平方向かまたは、リアク ターの底部から頂部、あるいはその逆方法の垂直方向の流れである。

ヒトの造血細胞の供給源が新生細胞、たとえば白血病性リンパ腫やカルチノーマ を有している疑いがあるときには、潅流において正常始原細胞を新生造血細胞か ら分別するようにその流量を選択することができる。正常な造血始原細胞は、縦 方向の液体流からの約１．５−２．０ｄｙｎ／ｃｍ”の応力に耐える親和力で間 質（ストローマ）とマトリックスタンパクに付着する。これに対し、新生細胞と その始原細胞は間質に対して約０．０５から１．２ｄｙｎ／ｃｍ”という実質的 に弱い親和性しか有しない。正常始原細胞と新生物始原細胞の双方が耐えられる 中間の剪断応力（一般に１ｄｙｎ／ｃｍ！より大きい）を与える潅流流量とすれ ば、少なくとも２日、好ましくは最低５日、より好ましくは７日以上の間潅流を 続けながら、新生物始原細胞を正常始原細胞から分離することができる。

このようにしてヒト患者から得た正常造血細胞を増やし、一方適切な流量を選択 することによって新生細胞を分離することができる。このように、腫瘍を有する 患者から造血細胞を得、化学療法やＸ−線照射によって患者を治療しながら正常 造血細胞数を拡大し、正常造血細胞を患者に戻すことによって患者の造血機能や 免疫系を回復させることができる。

造血腫瘍細胞を正常な造血細胞から分離するための剪断応力の使用を慢性骨髄性 白血病（ＣＭＬ）を例にとって説明する。ＣＭＬ細胞の剪断応力耐容性は０．０ ５から１．２ｄｙｎ／ｃｍ”の間である。剪断応力耐容性の違いによって個々の 骨髄サンプルからＣＭＬ細胞が効果的に除去される。約１．　２から１．　５、 好ましくは１．３ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断応力をかけることによってＣＭＬ細胞が 効率よく除去される。

個々人の骨髄細胞中の剪断応力耐容性はテーパー付放射梨フローチャンバを用い て調べることができる。この放射型フローチャンバでは細胞が受ける剪断応力は チャンバの端からの距離を”ｄ“として１／ｄの関数として減少する。細胞のバ ンドを用いてその細胞集団の分析をおこない、希望の細胞集団に対して設定され た剪断応力を保持する。白血病性幹細胞を除去するために、白血病患者の骨髄サ ンプルから得た始原細胞と幹細胞をまず放射型フローチャンバに入れる。

放射型フローチャンバはポリカーボネートかまたはガラスで作られた二枚の平行 なプレートからなり、骨髄の間質細胞を下のプレートに付着させる。最初の測定 は（１）造血細胞の浸出に先立って骨髄細胞の予め形成されたコンフルエントな 単層を確立し、次いで１２−２４時間後に液の流動を開始するか、あるいは（２ ）患者の骨髄を、予め形成された間質細胞の単層を用いることなく直接フローチ ャンバへと接種し、通常は０．０５から１．Ｏｃｃ／分の流動が得られるまで３ −４日待つことによって行われる。希望する剪断応力を達成するための正確な流 量は平行プレート間の距離によって異なる。

プレートはゴム製のガスケットによりその端部でシールされ、調節可能なネジで 保持される。貯液部からの液体は定圧ポンプ（たとえばシリンジ型）によって輸 送され、チャンバにおける幅の狭い一端にチューブによってもたらされる。幅広 い回収端においては、液体と除去された細胞が別のチューブを通って回収される （図３ａ、３ｂ参照）。潅流期間（通常３−７日）の後、非付着細胞を除去し、 プし・−トを分離し、３−５領域のそれぞれからの細胞を別々に吸引するかまた はゴム付ガラス捧で除太し、各分画を標準法により分析して白血病細胞の存在を 確認する（通常染色体バンドによる核型分析）。各分化の分析結果を比較すると 、どの分画において（すなわちとの剪断応力において）白血病細胞がストローマ にｆＪ着せず除去されたかがわかる。これらのチャンバにおいて、細胞が受けた 剪断応力は入口部からの距離の関数として幾何級数的に減少した（図３０参照） 。典を的には、非付着細胞は全であるいはほぼすべて白血病性であり、一方チャ ンバの最も狭い１／２の部分内に付着した細胞は全であるいはほぼすへて正常で ある。

上述の結果に基づいて、平行な長方形のチャンバの組を作成した。これにおいて 下方の面上の液体の流ね（図４ａ、４ｂ参照）はテーパー付チャンバにおいて見 られた剪断応力率をもたらし、正常細胞を全て除去することなく、白血病細胞を ストローマから除去した。慢性骨髄性白血病の患者の骨髄の場合においては、こ の剪断応力は典型的には０．Ｏｌから０．５ｄｙｎ／ｃｍ”である。実際の流量 はチャンバの大きさと形状によって異なる。患者からの骨髄細胞はこれらの長方 形のチャンバで培養される。培養条件は、アイスコープの修飾ダルベツコ培地１ ：：５−２０％（典型的には１０％）の胎児牛血清と０−１４％（典型的には１ ０％）のウマ血清を添加し、これにｉｏ”Ｍのハイドロコルチゾンを添加するか または添加しない培地中、５ｘｌＯ’／ｍＡ’から５０Ｘ１０＠／ｍｕ？の密度 である。

骨髄細胞は液体を流さない状態で１２−２４時間培養され、その後、液体を流す 。

細胞は３−７日培養する。この間にすべての非付着細胞は排除される。付着細胞 は長方形のプレートから吸引と機械的攪拌で回収され集められる。これらの細胞 造血系以外の細胞も剪断応力耐容性の差によって分離することができる。よって 、複雑な細胞の混合物中に顕著な差を有する部分集団がある場合には、上記の方 法を用いて皮膚、肝臓、筋肉、神経または上皮からの細胞の懸濁液から調べたい タイプの細胞を分離することができる。最も興味深い点としては、正常細胞集団 から腫瘍細胞を分離することが挙げられる。分離したい細胞の集団を、それらが 付着可能な精製タンパクや細胞成分などの適切な同質基質に上述のように接触さ せる。付着した部分集団のそれぞれの剪断応力耐容性は上記の手続きにより得ら れる。ついで液流を適切に調整して間質上の調べたい細胞の部分集団を保持する 。その後調べたい細胞を回収する。

リアクターにおいては様々なバッキングを用いて間質細胞と造血細胞のあいだに いくらかの物理的空間を保ちながら、また間質細胞と造血細胞の間に幾らかの接 触または密接接近を許容しながら細胞を付着生育させる。このようにして同質細 胞が分泌した因子は容易に造血細胞に引き上げられ、増殖し、さらに適当である 場合には分化し、成熟する。

細胞を支持するタンパク質マトリックスは細断されたコラーゲン粒子の形状であ ることができる。即ちスポンジ状あるいは多孔性のコラーゲンビーズ、骨髄から の細胞外骨タンパクからなるスポンジやビーズまたはタンパク質で覆われた膜が 挙げられる。ここでタンパク質としてはコラーゲン、フィブロネクチン、ヘモネ クチン、ＲＧＤベースのペプチド、混合骨髄マトリックスタンパクなとが挙げら れる。膜の孔径は通常１−５ミクロンであって異なったタイプの細胞同士を物理 的に分離しつつ相互作用を許容するものである。

膜を用いることができるか、これはタンパク質でコーティングされていてもよい 。様々な膜物質、たとえばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、 ポリスルフォネ−１・などを使用できる。また種々のタンパク質を用いてもよ（ 、特に前述のコラーゲンやその他のタンパク質が使用できる。膜は充分に小さな 孔を有するべきであって、孔の大きさは、形質転換された細胞は膜を通過するこ とはできないが、膜の一方の側で細胞がコンフルエントな層を形成し生育し、そ して細胞膜の一部を孔の中に伸長できるようなものであり得る。一般に孔径は約 １から５ミクロンである。このようにすることによって造血幹細胞は膜の反対側 で生育し、形質転換された細胞と反応し、これによって成長因子は形質転換され た細胞から直接造血始原細胞に移行できる。始原細胞と幹細胞は孔を通って浸入 した細胞質突起に付着する。幹細胞からの造血分化は膜の一方の側で起こり、分 化した後代はもはや孔を通って戻ることはできない。（繊維芽細胞からの細胞質 突起力りコンフルエントになったときに孔はすでに間質細胞層でその大部分を占 められているからである。造血細胞が成熟し分化するにつれて、それらは膜から 離れ栄養培地へと移行する。

リアクターの中央部には種々の粒状物が詰められ、上部チャンバと下部チャンバ とは別の中央チャンバを構成していてもよい。あるいは−以上の膜を用いて、二 つの膜で間質細胞か造血細胞のいずれかに関連する領域を形成するようにし、そ の領域が間質細胞と造血細胞とで交替するようにしてもよい。このようにするこ とによって造血細胞と間質細胞とのチャンバ間で異なった潅流速度を実現するこ とができる。培地の交換速度は通常上記に記載した範囲である。

チャンバを複数として、間質細胞を生育し、サブコンフルエントなレベルて間質 細胞を存するチャンバへと造血細胞を移動させることもできる。チャンバ間に可 動バリアを設けた場合には、同質細胞がコンフルエントになったとき（通常８− １２日）、チャンバ間のバリアを開くが除去し、新しいチャンバに間質細胞を移 行させ造血細胞をサブコンフルエントな間質細胞と接触させてもよい。この間、 サブコンフルエントな間質細胞は造血細胞を含むチャンバに造血因子を供給しつ づける（図５ａ、５ｂ参照）。

造血細胞の移動は流量を適切に設定することによって、あるいは他の都合のよい 手段によって行う。適切な壁で仕切られているウェルをチャンバに備え、一つの ウェルに播種が終わり細胞がコンフルエントになると、細胞を次のウェルに移行 し、サブコンフッはントになるように播種してもよい。システムの他の変形例と しては、８−１２日培養後、増殖しつつある同質細胞に造血細胞を接触させる。

これは幾つかの方法で達成できる。増殖間質細胞への暴露は幾つかの方法で達成 できる。

第一の方法では、培養を色々な方法でＥＤＴＡＩ；３−５分接触させ、これによ り造血幹細胞を間質細胞から除去する。除去された細胞は新しい培養器に移され るが、この培養器は゛３−７日前に播種された骨髄細胞を含有している。このプ ロセスを８−１２日毎に繰り返す。別の方法では、培養物の体積を増加させ８− １２日に追加のコラーゲンビーズをこれに加えることによって表面積を拡大させ る。最終的に、小さな有機物分子やタンパク質、特に血小板由来成長因子（１０ ０−５００ｎｇ／ｍｊ’）　、インターロイキンｌα、腫瘍壊死因子α、塩基性 繊維芽細胞成長因子、またはマイトジェン性ないし繊維芽性因子などのホルモン を３−７日ごとに加える。間質マイトジェン刺激因子に対するこの暴露は、骨髄 細胞の継続的増殖、および造血細胞成長因子の継続的増殖を促進する。これによ り継続的な間質細胞のサブコンフルエント段階を得ることができる。

骨髄細胞集団中で癌性細胞から正常細胞を選択的に分離するために連続液体流を 利用することができる。この方法では、まず放射型フローチャンバを用いて正常 細胞対癌性細胞の間質付着特性をめ、次いで癌性細胞を除去するのに充分な剪断 応力をもたらす流量を存する長方形のフローチャンバによって術前的に正常細胞 と癌性細胞を分離する。

また、本発明の方法と装置は、潅流培地の流れによって失われた幹細胞を再利用 する機会を提供する。表面膜タンパクマーカーＣＤ３４は、成熟した造血細胞か ら成熟した造血細胞を分離する。ＣＤ３４”であるこれらの細胞を捕らえ、再利 用することにより、培地における幹細胞の損失を防止できる。

細胞の未成熟な分画を捕らえてリアクターに戻すために種々の技術を用いること ができる。例えば、ＣＤ３４に対して特異的な抗体を用いて細胞に標識を付け、 この抗体に対する抗体を用いてＣＤ３４”細胞を捕らえ、それらをリアクターに 戻す。積極的な選択の代わりに、消極的な選択を採用することもできる。この方 法では、ブリコツすリン　ＡＳＣＤ３３、ＭＯＩ、０ＫＴ３．０ＫＴ４．０ＫＴ ８．０ＫＴＩＩ、０ＫＴ１６、ＯＫＭＩ、ＯＫＭ５、Ｌｅｕ７、Ｌｅｕ９、Ｌｅ ｕ　Ｍｌ、Ｌｅｕ　Ｍ３等に対する抗体のような、成熟した細胞に関連する種々 のマーカーに対する抗体を用いて成熟細胞を除去できる。種々の造血系統、リン フォイド、ミニロイドおよびエリスロイドの成熟細胞に対する特異的なマーカー のために種々の抗体を利用でき、これらの抗体は、リアクターからの流出液から 成熟した細胞を除去し、残りの細胞を回収し、それらをリアクターへ戻すのに使 用できる。このようにして、幹細胞の損失に起因する培養の低下を防止でき、試 験管内ににおいて幹細胞を無限に生存させることができる。

抗体マーカーを使用した分離は、パンニング、蛍光活性による細胞のソーティン グ、ポリスチレン表面、金属微細粒および磁石等の種々の表面への抗体の結合等 、様々な方法で行うことができる。抗体を、付着細胞と非付着細胞とを分離する 表面に結合させるか、抗体に直接的、または間接的に標識し、標識された細胞と 標識されていない細胞とを選択できるようにする。

本発明により、造血細胞の試験管内での生育期間を大きく延長でき、一般に培養 で生体外ヒト造血機能を少なくとも６か月提供でき、顆粒球形成は少なくとも４ か月維持され、赤血球形成は少なくとも３か月維持される。さらに、培養の期間 を通して、造血始原細胞が連続的に産生され、導入された細胞に対してｌＯ倍以 上の始原細胞の増殖が最終的に得られる。

さらに、本発明により、幹細胞の分裂の割合が大きく増加し、レトロウィルスで トランスフェクトされた遺伝子材料の効率的な挿入が可能となる。最初の２週間 の感染期間の間に適切なレトロウィルスベクターによって挿入された遺伝子は、 その後の４か月以上の培養の間に生じる全ての始原細胞および前駆細胞の１０〜 ３０％において発現できる。本発明は、高度に増殖的なヒト造血幹細胞への遺伝 子材料の移入を成功させる。

特表千７−５０４５７０　（８） 添付の図面において、同じ参照番号は同じかもしくは対応する部分を示している 。これらの図の中で、図１は、還流チャンバーの概略図である。カバープレート １２とフロアプレート１４とを備えたりアクタ−１０は、ボルト１６によって結 合し、蝶ナツト１８によって位置決めされている。歪みを防止するため３本のボ ルトを使用している。

チャンバー２０は３つの部分からなり、中央の部分２２は、同質細胞のための支 持マトリクス、同質細胞のベッド、および骨髄細胞を含んでいる。中央の区画２ ２は、膜または網２８．３０によって、頂部２４と底部２６に分離されている。

ポリスルフォンの膜を採用するか、チャンバーの中央部分に細胞が含まれるよう に十分細かい目のステンレス調の網を採用するのが便利である。分離界面は、分 離膜を機械的に保持するために分割された内側シリンダ２７を用いてチャンバー 内に形成される。頂部２４と底部２６が同一である必要はなく、管や膜を存して おり、液性培地やガスがそれらを通して交換される。ガスは、シリコーン等の疎 水性の管を通して交換され、管の長さくおよびこれによるガス／液体の接触面積 ）は変化して、中央の部分において代謝を行う細胞群の需要を満たすのに十分な ガス流を提供する。培地は、ボート３２を介して、頂部または底部から汲み上げ るか直接排出することができ、供給管３４を通して供給してもよい。

もし必要であれば、外部の酸素投与装置を用いることにより、頂部および底部の 部分を無くすことができる。この場合、分離膜は、円筒溝プレート１２および１ ４に嵌め込まれているガラスシンリダ３６の下側で保持され、円筒溝は、膜を横 切って良好な流れ分布を可能にする。この形状により有限数の入口ボートからの 流体を混合し、半径方向の圧力を平衡させることができ、分離膜を横切る液体の 流れを均一化できる。この構成は、チャンバー内の細胞が比較的少なく、酸素投 与が限界に達しない場合に好適である。

図２には、還流チャンバーを、側部培地収納容器、酸素投与器、検出器チャンバ ー、およびサンプリング／注入ボートと接続する経路を示す概略図である。

外部の新鮮培地供給源５０内の培地は、ポンプ５２によって配管５６を介して培 地収納容器に供給され、使用済みの培地は、ポンプ５２により、収納容器５４か ら配管５８を介して使用済み培地容器６０に供給され、さらに処理される。第２ のポンプ６２は、培地収納容器５４内の培地を配管６４と中空の繊維製酸素投与 器６６を介して汲み上げる。培地は配管６８を介してバイオリアクター７０の第 １チヤンバーに供給される。配管６８に培地成分を注入する手段８２が設けられ 、この培地成分は培地によってバイオリアクター７０の第１チヤンバーに移送さ れる。この成分は、テスト成分や他の因子等である。バイオリアクター７０から の培地は、中央チャンバー７２を介して、バイオリアクターの第２のチャン１（ −７４に導入される。ここから、培地は配管７６によりインライン検出器７８に 導かれ、培地の成分の変化が検出される。

例えば、グルタミン対グルコースの比（ｗｔ、　／ｗｔ、　）は、使用する細胞 株によって約１　＋　５−８の範囲であり、トランスフェクトされた３Ｔ３細胞 の場合には１．８が好ましい。さらに、アンモニア濃度は約２．０ｍＭ以下であ ることが好ましく、乳酸塩の濃度は約３５ｍＭ以下であることが好ましい。バイ オリアクターからの排出液をモニターすることによって、バイオリアクターに導 入される培地を変更し、酸素分圧を変化させ、ガスの流速を変更し、種々の成分 を増加させ、もしくは潅流速度を減少または増大させる。培地はポンプ６２によ り配管８０を通して検出器７８から貯蔵容器５４に導かれる。

上記の流れ経路により、側部貯蔵容器内の培地が、分離したポンプによってゆっ くりと交換される。この仕組みにより、培地の交換速度（外側のポンプ）と、酸 素投与器と潅流チャンバーとを通しての流速とを別々に制御できる。前者は、培 地成分の長期的な変動を制御するのに使用し、後者は溶解酸素の圧力とチャンバ ー内における流れのパターンを制御するために使用する。目の細かい生物学的適 合性を有する膜の使用により、チャン１＜内へのプラグ（ピストン）フローを可 能とし、造血細胞および間質細胞に非常に正確な量だけ導入することが要求され る成長因子や他の特別な成分の供給を高精度で制御できる。

チャンバと経路中の部品を高圧滅菌した後、リアクターを無菌環境で組み立てる 。汚染の兆候をモニターしながら、数日間、培地を側部経路とチャンノ（を通し て循環させる。無菌組立の後、チャンバの中央部分に、細胞外マトリックスのみ 、または間質細胞を含む細胞外マトリックスを接種する。そして、（１）間質細 胞の代謝機能、および／または成長因子応答性をモニターしながら、数日間、間 質細胞をチャンバ内に保持し、良好な結果が得られた場合、骨髄を接種するか、 （２）直ちに骨髄を播種する。

何れの場合でも、細胞層は、潅流チャンバの中央部分の底に保持される。細胞は 付加的な細胞外マトリックスを作り、その細胞層は分離膜に付着する。この時、 チャンバは逆さまであってもよく、この場合、細胞は中央部分の天井に位置する 。

この構造により、成熟中の細胞は、同質層に対する付着力を失ったとき中央チャ ンバの底に落ちつく。この特徴は、成熟細胞および／または成熟度の低い造血細 胞が間質細胞に損傷を与えるのを阻止するのに重要である。この特徴は成熟細胞 の連続的な除去も容易にする。

これらの細胞は、細胞を注射器で吸い出すか、潅流培地の圧力によって、細胞が 出口配管を介してチャンバから連続して流れ出すようにする。

大部分の同質細胞は、必要とされる造血成長因子を提供する１個以上の遺伝子に よって形質転換された繊維芽細胞になる。選択された具体的ホスト細胞に応じて 、遺伝子によってトランスフェクトされるのは同一または異なる細胞であってよ く、同一または異なる細胞を複数の遺伝子に対して使用してもよい。

広い範囲の正常細胞または安定した株を採用できる。しかしながら、幾つかの細 胞株は形質転換すると細胞の過成長をもたらすので、全ての細胞種が利用できる わけではない。好ましくは、採用される細胞は新生性でなく、むしろ支持体への 付着性が要求される。哺乳細胞はヒトや霊長類の細胞である必要はない。健常ヒ ト骨髄付着性細胞、健常ヒト牌臓付着性細胞、および健常人ヒト胸腺上皮など、 種々の非形質転換細胞が吸着細胞層に含まれていてもよい。

繊維芽細胞を含む哺乳類細胞を形質転換する方法は公知であり、膨大な文献があ り、その内の幾つかを前述した。構成物は、プロモータと、適切であればエンハ ンサ−とを含む自然状態で存在する転写開始領域、または誘導性または構成性の 異なる転写開始調整領域を含む。

誘導性または構成性の多数の転写開始領域が利用できる。これらは自然状態で存 在するエンハンサ−と会合するか、または、エンハンサ−が供給され、特定の細 胞においてのみ誘導されるかまたは複数または全ての細胞タイプにおいて機能す る。転写開始領域はウィルス、合成してもよいが自然に発生する遺伝子、もしく はこれらの組合せから得ることができる。

入手可能で存用なプロモータとして、マウスまたはヒトのメタロチオネインＩま たは■プロモータ、アクチンプロモータ等の染色体プロモータ、もしくは５ｖ４ ０初期遺伝子プロモータ、ＣＭＶプロモータ、アデノウィルスプロモータ、レト ロウィルスのＬＴＲに関連するプロモータ等のウィルス性のプロモータが挙げら れる。これらのプロモータは入手可能で、目的とする遺伝子だけでなく転写開始 領域を挿入するためのポリリンカーを含む適切なベクターに容易に挿入できる。

他の例では、発現ベクターを用いることができ、これは転写開始領域と転写終結 領域の間にポリリンカーを提供するとともに、翻訳のメツセンジャーの処理に関 連する種々のシグナル、即ちキャップサイトやポリアデニル化シグナルを提供す る。調整領域と構造遺伝子を包含する発現カセットの構築には、−以上の制限酵 素、アダプター、ポリリンカー、試験管内突然変異誘導物質、プライマー修復、 再切断などの材料、手法を用いる。

発現カセットは通常、マーカーと一以上の複製システムを有するベクターの一部 である。マーカーによって、発現カセットとマーカーが導入された細胞の検出お よび／または選択がなされる。種々のマーカーを使用することができるが、特に ｌ・キシン、なかでも抗生物質に対する耐性を有するもの、が使用される。好ま しくはネオマイシン耐性が使用され、これは哺乳類宿主細胞において６４１８に 対する耐性を与えるものである。、ｒＪＩ製システムは原核複製システムであっ てもよく、これにより発現力セントの個々の成分を合一する種りの段階でクロー ニングが行われる。多くの場合、複製システムは発現カセットが宿主の染色体に 組み込まれるように選択されるが、その他の複製システムも宿主細胞中でエピソ ーム成分を維持するために用いることができる。

発現カセットの宿主への導入は、カルシウム沈降ＤＮＡ、ｈランスフエクション 、感染、電気穿孔法、弾道（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）粒子法を含む、通常の技法に よって行われる。一旦宿主細胞が形質転換されると、それらは選択剤を含有する 適切な栄養培地中で増幅され、マーカーを含む細胞が選択される。生存細胞はそ の後再度増殖され、使用される。

使用できる宿主細胞としてはアフリカミドリザル細胞株１、マウス細胞株ＮＩＩ （−３Ｔ３、健常ヒト骨髄繊維芽細胞、ヒト肺臓繊維芽細胞、健常マウス骨髄繊 維芽細胞および健常マウス肺臓繊維芽細胞が挙げられる。場合によっては、ベク ターと細胞株の選択次第で細胞が新生物となることもあることに留意すべきであ る。重要な点は、得られた形質転換細胞が付着可能でかつ、タンパク質スポンジ やタンパク質でコーティングされた膜などの支持体に固着し続けることができる ことである。

一旦適切な成長因子を発現するベクターが構築されれば、都合のよい手段によっ て細胞を形質転換するのにこれを用いることができる。得られた形質転換細胞は 、すでに記載した支持体に播種される。播種された支持体を導入するか、または りアクタ−中において支持体に播種する。細胞は充分時間をかけて生育させ、そ れらが生存可能であるとともに目的の成長因子を産生ずることを確認する。

リアクターには、造血細胞を適切に播種する。造血細胞としては、実質的に純粋 な幹細胞、実質的に一以上の系統の成熟した造血細胞を含まない造血細胞の混合 物、および造血系の種々の系統の全てもしくは実質的に全ての突然変異の種々の 段階のものを包含する混合物が挙げられる。

細胞は、リアクター内の実質的に連続した潅流下で生育され、関与する種々の栄 養素や因子がそのあいだモニターされる。多くの場合、主要な因子は間質細胞に よって提供されるので、通常、成長因子の濃度は定常状態濃度が達成される。

調整された上清は造血細胞の生育に有効であることが判っているため、リアクタ ー中で成長因子を適切な濃度に維持するような、間質細胞の造血細胞に対する比 を提供することができる。

トランスフェクトされた間質によりヒト幹細胞中に遺伝子が導入される。マウス においてはレトロ１クイルスで仲介された幹細胞への遺伝子伝達は、マウスを５ −ＦＵで前処置し、ついて収集した骨髄細胞をＷＥＨＴ調整培地（ＩＬ−３とＧ Ｍ−Ｃ３Ｆ（Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ、Ｃｅ１ｌ　（１９８６）　４５：９１７）を 含有する）中で生育することによって達成される。目的のレトロウィルスベクタ ーを分泌するレトロウィルス・パンケージ細胞株で生育された人工的な間質（ス トローマ）は、遺伝子を効率的にヒト幹細胞中に導入するために使用できる。た とえば、ヒトのＴ−細胞は、組織特異性をＴ−細胞中で発現するＣＤＣ２調整配 列（Ｇｒｅａｖｅｓ、　Ｃｅ１ｌ　（１９８９）　５６９７９−９８６）の制御 下てＨＩＶ抗原配列を含有するしトロウィルスベクターで幹細胞をインフェクｉ ・することによって、ＨＩＶ感染に対して抵抗性とすることができるであろう。

レトロウィルス・パッケージ細胞株によ−）て提供される因子であってしトロウ ィルスの複製に必須の因子が存在し、この因子は造血標的細胞中には存在しない であろう。いったんウィルスが造血標的細胞に移行すれば、もはや複製は不可能 である。

図３８および３ｂには、入口１０２と出口＋０４を有し、チャンバ１０６を備え た放射型フローチャンバ１００が示されており、矢印＋０８が流れの方向を示し ている。造血細胞＋１０をチャンバ内の間質層１１２の上に播種し、育成する。

流速により、との細胞が付着できるかが決まり、非付着細胞１１４は出口１０４ を通して通過する。図４３および４ｂに示すように、生育チャンバ１２０は入口 １２２ど出口１２４を有している。図４ｂに示すように、入口１２２は、生育と 分離のために細胞１１０と間質細胞１１２を含むチャンバ１２６に給餌するマニ ホールド＋２８を含んでいる。

図５８および５ｂは、生育チャンバを示し、この生育チャンバでは、培養中にバ リヤ１３４、＋３６．１３８か順次除去される。バリヤ１３４は約８−１０週で 、バリヤ１３６は約１８−２０週で、またバリヤ１３８は約２８−３２週で除去 される。

好ましい実施態様では、（造血）バイオリアクターシステムの構成部は、２つに グループ分けられる。第」は、」二に概説した項目別に分けられた要件を満たす 必要のあるバイオリアクター・ユニット自体である。第２は、バイオリアクター のモジュールに付属するもので、プロセス全体として見たときに必要な構成部で ある。

■、バイオリアクター 北に列挙した（造血）バイオリアクターの仕様は、種々の方法で実施可能である 。本明細書に記載する３つの好ましい実施態様は、（１ｌ平面ベッド（造血）バ イオリアクター（図６ａ−４）、（２）細胞のサンプリングと回収のための円錐 部を有する平面ベッド（造血）バイオリアクター（図７ａ、７ｂ）、（３１傾斜 （造血）バイオリアクター（図８ａ、８ｂ）、および（４）テーパーの付けられ た流れプロフィルを存する水平または傾斜バイオリアクター（図１１ａ−ｃ）。

これら４つの実施例を更に詳細に説明する。

１、　１　単一または複数の表面を有する平面ベッド（造血）バイオリアクタこ のバイオリアクターは、少なくとも２つの機械加工されるか成形された平坦な部 材６００および６０１を有する。これらの部材６００と６０１は、ポリカーボネ ート、ポリスルフォン、ポリスチレン等の培養する細胞に対して毒性のない材質 で作られ、バイオリアクター頂部６００とバイオリアクター底部６０１．または この逆に部分を構成する。このバイオリアクターの頂部と底部、６００および６ ０１の間には、２つのガスケツＩ−６０２があり、このガスケット６０２は、シ リコーンゴムのように、培養する細胞に対して毒性がなく、ガスケットを作るの に適した任意の材料から作られている。

バイオリアクターを組み立てる時、バイオリアクターの種々の実施態様を提示す る図６ｆ−ｉに示すように、膜６０３を２つのガスケット６０２の間に置き、こ の組立体をバイオリアクター頂部６００とバイオリアクター底部６０１との間に 置く。この組立体全体を、留め金またはボルト（図には後者が示されている）等 の公知の適当な手段によって一体的に保持する。ボルトを挿通ずる穴６０６が図 ６ａ−６ｅに示されているが、他のボルト構造も可能である。組立により、２つ のチャンバを構成する容器が作られる。チャンバの一方が細胞培養チャンバ６１ ４であり、他方がガスチャンバ６１５である。バイオリアクター頂部６００とバ イオリアクター底部６０１は異なった数の口を持つことでできる。例えば、ｍ　 ６　ａ　−ｅでは、バイオリアクター底部６０１が、２個のがスポート６ｏ７と ６０８を存しており、一方がガスの入口で他方がガスの出口、またはその逆であ る。これに対し、バイオリアクター頂部６００は、３個のポートを有している。

即ち、液体培地人口６１０および液体培地出口６１１、またはこの逆となるポー トと、細胞をサンプリングまたは回収するためのポート６ｏ９（漏れなく密封す るため適切な栓（図略）を用いて密封する）である。出口ボート６１１は、頂部 の部材６００の主面の平面に対して０６でない角度を持って形成され、培養チャ ンバ０１４から出口ボー１−６１１へと流れるかも知れない非付着細胞が重力で 沈降するように構成することができる。図６に示したガスケット６１３内の穴の 形状は円形であるが、入口ボートと出口ボートを焦点位置に有する楕円または他 の形状の穴を使用し、より良い流体分布を提供することもできる（下記参照）。

同様に、必要とされる剪断応力範囲と流体の流れ分布を得るために他の形状を使 用することもできる。

他の簡単な構成では、ガスケット６０２を一枚だけ使用し、膜６０３は使用しな い。この実施態様では、分離した細胞培養チャンバとガスチャンバを含んでおら ず、入口ボート６１０を介して容器内に供給された液体培地は、必要な細胞呼吸 性ガスとともに充填される。

平面ベッド型バイオリアクターの基本的な組立構造は４種類ある。

図６ｆに示す構造ｌは、２つの区画、即ち細胞培養チャンバ６１４とガスチャン バ６１５を提供する。２重膜組立体（例えば、シリコーン膜のような疎水性のガ ス交換膜６０４の上に細胞生育／付着のためのセラミック膜６０５を有するもの ）が２つのチャンバを分離している。細胞培養チャンバ６１４内では、液体培地 が、液体培地入口ボート６１０と液体培地出口ボート６１１を通して潅流され、 同時に気体がガス入口ボート６０７とガス出口ボート６０８を連結するがスチャ ンバ６１５を通して循環されている。細胞６１２は、セラミック製の細胞付着／ 生育膜６０５の上になる培養チャンバ６１４内で生育する。

図６ｇに示す構造２は、構造ｌを逆さまにしたものである。ここでは、培養チャ ンバ６１４の底にあるバイオリアクター底部６０１の表面領域６２５は上で細胞 ６１２が生育する。表面領域６２５は細胞の生育／付着に適合していることが好 ましい。この構造では、１枚のガス交換膜６０４のみが必要で、細胞付着／生育 膜６０５は必要でない。この構造においては、他の構造と同じように、液体培地 が培養チャンバ６１４を通して潅流され、気体がガスチャンバ６１５を通して潅 流される。

図６ｈに示す構造３は、３区画の設計である。バイオリアクターの頂部に位置し 、ガス交換膜６０４によって細胞培養チャンバ６１４と分離されたがスチャンバ ６１−５を通して気体が循環される。細胞６１２は、細胞生育／付着膜６０５に よって液体培地区画６１６から分離された細胞培養チャンバ６１４内にある。こ の構造では、細胞培養チャンバ６１４はとどまっており、一方、液体培地区画６ １６においては、液体培地入口および出口ボート６１０および６１１を通して培 地が潅流される。

図６１に示す構造４も３区画の設計である。この実施態様は、ガス交換膜６０４ と細胞生育／付着膜６０５との間に第３のガスケット６０２を置くことによって 構造Ｉを変形したものである。この構造は、ガスチャンバ６１５と細胞ベッド６ １２との間に停滞液体培地区画６１７を提供する。

ガスの大量の移送と、細胞／細胞外マトリックスの付着を提供し、水の漏れを防 止するために、図６ｆに示す２膜システムを採用するのが好ましい。下側の膜６ ０４は、疎水性で、水漏れを防止し、気体透過性である。さらに、この膜６０４ は、上側の膜６０５を機械的に支持する。上側の膜６０５は、細胞の付着、およ び／または生育のためのもので、無機セラミックを基材とする膜である。これを 、例えばサンディエゴのテレオス・ファーマス−ティカル・インク（Ｔｅｌｅｏ ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、）から販売されている接着性タ ンパク質をベースとするＰｅｐＴｉｔｅ　−２０００ＲＧＤなどの細胞外タンパ ク質で被覆することもできる。このようなタンパク質は公知である。例えば、Ｈ ｕｂｂｅｌｌ　ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９９１）　９：５６８− ５７２参照。更に、使用される無機膜にとって非常に必要とされる特性は、水和 すると透明になり、培養されている細胞の顕微鏡による観察／モニターを可能に することである。

バイオリアクターに培地と気体を供給するための管は、例えばポリプロピレン製 の付属品や、良好な気密性を提供し、漏れの問題がないことで知られているシリ コーン製Ｏリング、ルワーロック（Ｌｕｅｒ　Ｌｏｃｋｓ）リングなどのような 公知の適切な付属品を用い、バイオリアクター頂部６００とバイオリアクター底 部６０１に接続する。

本発明のバイオリアクターの種々の構造は、上記の要求の全てを満たしている。

次に図７ａ、７ｂ、８ａおよび８ｂを参照して、バイオリアクター内の細胞をオ ンラインで簡単にかつ選択的に回収できる２つの構成を説明する。もし必要であ れば、これらの構成の何れもを、図６ａ−ｇおよび６１の構成に適応させること ができる。

１、　２　単一または複数の表面と細胞回収用円錐部を有する平面ベッド（造血 ）バイオリアクター（図７ａ、７ｂに示す）上記した構造１および４の細胞培養 チャンバ６１４の壁の１つを形成するバイオリアクター頂部または底部は、細胞 を連続的、間欠的、または周期的に回収できるように構成することができる。バ イオリアクター底部６０１（例えば図６ａ−ｅ、６ｆまたは６１の構造を使用す る場合には、バイオリアクター頂部６００）に、浅い円錐６１８を形成し、液体 培地および回収された細胞のための単一の出口ボー１−６１９を、円錐６１８の 頂部６２０に設ける。このような構成においては、液体培地出口ボート６１１（ 回路）は設けなくてよい。液体培地入口ボート６１０を円錐６１８の基部６２１ に、好ましくは図７ｂに示すように、円錐の外郭線と平行に設ける。液体培地を 入口ポート６１Ｏを通して供給すると、液体培地６１１の回転は、円錐６２０の 頂部に向かう渦巻きに誘導され、使用済の液体培養培地（および非付着細胞）が 使用済液体培養培地および回収した細胞のだめの出口ボート６１９を通して排出 される。

この構成では、非付着細胞６２４を、出口ポート６１９を介して連続的、間欠的 または周期的に回収し、付着性細胞６２２をバイオリアクター内に残留させるこ とができる。細胞の回収処理の間、又は細胞を連続的に回収する場合、円錐６２ ０の頂部を下向きにし、非付着細胞６２４を、流出する液体培地６１１によって 細胞培養チャンバ６１４から運び去る。細胞を周期的または間欠的に回収するこ とを希望する場合には、バイオリアクターは、細胞回収処理の間を除き、円錐６ ２０の頂部を上向きにして配置するのが好ましく、バイオリアクターを回転して 円錐の頂部６２０を下向きにし、非付着細胞６２４を出口ボート６１９を通して 収集する。

１、　３　内方に傾斜した造血バイオリアクター多くのアプリケーションにおい て、非付着細胞６２４の全数の内、選択した部分だけをサンプリングすることが 要求される。特に、多（のアプリケーションでは、より成熟した細胞群から幹細 胞と始原細胞を分離して回収することが極めて好ましい。この様な分離は、傾斜 沈澱法を使用することによって容易に達成できる。その例をｌｌ８ａおよび８ｂ に示す。図６ａ−ｅ、６ｆまたは６１に示したバイオリアクターの設計に容易に 適用することができるこの分離は、分離すべき非付着細胞群６２４における種々 の細胞の密度の相違に基づくものである。幹細胞と始原細胞は、赤血球細胞や顆 粒球細胞等のより成熟した細胞に比べて低密度である。

付着細胞６２２のベッドを、水平に対して特定の角度（α＝１５°〜７５°、好 ましくは２５°〜４５°）で設置し、液体培地を付着細胞６２２の上を上向きに 流すだけで、重力による沈澱を、前記のバイオリアクター内の本来の場所で行わ せることができる。この場合、中央のガスケット６０２０六６１３の形状は、図 ８ｂに示すように長方形であることが好ましい。図８ａに示すように、付着細胞 ６２２は、細胞培養チャンバ６１４の頂部に設けられた細胞生育／付着膜６０５ の上で生育する。または、図６ｇの構成を使用することもでき、この場合、細胞 培養チャンバロ１４の底を形成するバイオリアクター底部６０１の主面６２５を 、細胞付着を行うために変形する。図８ａおよび８ｂに示すように、バイオリア クターを水平に対して特定の角度（α＝１５°〜７５°、好ましくは２５°〜４ ５°）で設置し、液体入口ポート６１Ｏを２つの出口ボート６１１と分離する。

このようにして、非付着細胞群６２４の連続的、間欠的または周期的な分離と回 収を行う。この構成を使用することにより、高密度の非付着細胞６２３を下側培 地出口ポート６１１から収集し、低密度の非付着細胞６２９を上側培地出口ボー ト６１１から収集する。また、図８ａおよび８ｂに示すように、下側培地出口ボ ート６１１と培地入口ボート６１Ｏの位置は、入れ換えることができ、同様にし て細胞分離および回収を行うことができる。

図１１ａ、ｂおよびＣは、本発明のバイオリアクターの他の実施態様を示す。

この実施態様では、バイオリアクターを枢着手段６２７を介して支持手段６２６ に枢軸に取付けている。この実施態様では、単一または複数のガス入口ボート６ ０７を、複数のガス出口ボー１−６０８とともに使用し、複数の液体培養培地入 口ボート６１Ｏを複数の使用済み液体培養培地出口ボー１−６１１と組み合わせ て使用する。この実施態様では、三角形の囲いにガスチャンバと細胞培養チャン バを配置することが好ましく、三角形の囲いは、図に示すように、ガスケット６ ０２内の三角形状の穴によって作られる。

図１１ａ、ｂおよびＣに示すバイオリアクターの設計は、水平または傾斜状態に あるバイオリアクターのチャンバから細胞を連続的に回収するのに好適である。

図に示すように、液体培養培地の入口ボートと出口ボートは、細胞培養チャンバ の両側に位置し、液体細胞培養培地は、一般的には細胞培養チャンバの中央に位 置する。この実施態様では、バイオリアクターの角度（即ち、細胞ベッドの角度 ）を必要に応じて調整できるように、バイオリアクターは支持手段に枢支されて いる。この構成を使用することにより、液体細胞培養培地出口ポー）６１１を上 向きに傾斜させ、細胞の接種と使用済培地の除去を効率的に行うことができる。

続いて、リアクターを水平状態に置き、間質細胞、および初期の幹および始原細 胞の付着と生育のための付着／生育表面６２５に細胞を落ちつかせることが有利 である。

この構成では、バイオリアクターを水平に保った状態で、液体細胞培養培地を（ 連続的に）細胞培養チャンバを通して潅流できる。バイオリアクターのチャンバ から非付着細胞を回収するためには、バイオリアクターを傾斜させて液体細胞培 養培地出口ボート６１１を上向きに傾斜させる。その結果、細胞培養チャンバ内 で、密度によって細胞が分離し、これにより特定の型の細胞を回収できる。

他の実施態様では、バイオリアクターが垂直に向くようにこれを回転させ、液体 培養培地入口ボート６１０を頂部に、液体細胞培養培地出口ボート６１１を底部 に位置させることができる。成熟細胞の非付着幹細胞と始原細胞を含む培地は下 方に流れ、次に液体培養培地出口ボート６１１を介して（連続的に）除去される 。この構成は、造血を阻止するであろう成熟細胞を除去し、より多くの細胞を産 出する培養を行うのに有利である。逆に、垂直状態で、液体細胞培養培地がボー ｌ−６１０から６１１に流れ、細胞が頂部６２８に落ちつく。頂部６２８から最 も遠い出口ボートから頂部６２８に最も近い出口ボートを通して使用済の細胞培 養液体培地を選択的に除去することにより、必要とされるときに、細胞培養チャ ンバ内から細胞を取り出すことができる。

■、付属部品と全体的な流れ図 例示的な（造血）バイオリアクター増殖システムの工程流れ図が図９に示されて おり、これには運転に必要な付加的な部品が含まれている。

グルタミンや成長因子等の化学的に不安定な培地成分の崩壊を防止するために、 冷却（例えば約４°Ｃ）にした液体培地９００を、ポンプ９０１（例えば、注入 ポンプ、螺動ポンプ等）により、管９０３を通してバイオリアクター９０２の細 胞培養チャンバ６１４に供給する。管９０３は、細胞培養チャンバ６１４に入る 前に培地の容量オスモル濃度が変化するのを防止するため、水に対して非透過性 であることが好ましい。管９０３には弛みがあり、ポンプ９０１および／または 新鮮な培地容器９００を、例えば、冷蔵位１１９１０と、必要とされる操作を無 菌状態で行う層流フード（回路）との間で移動させることができる。余った管９ ０３は、例えば冷却装置（回路）に保管されており、短い管の一部だけが室温ま たはインキュベーターの温度に晒される。

気体は、予め混合された気体（１−５０％（ｖ／ｖＬ好ましくは５−２０％（ｖ ／ｖ）の０２．５％（ｖ　／　ｖ　）のＣＯ，、および残りはＮｚ）を入れたシ リンダー９０４からバイオリアクター９０２のがスチャンバ６１５に供給するか 、または、単純にインキュベーター（回路）から取り出した混合物（典型的には 、空気と５％（Ｖ　／　Ｖ　）のＣＯｔの混合物）である。ガス流の流速と成分 は、公知の方法を利用して簡単に制御できる。ガスはポンプ（回路）を用い標準 的な細胞培養加湿機９０６の砂岩を通して供給され、ガスチャンバ６１５に供給 されるガス混合物の相対湿度はできるだけ１００％に近づけられる。ガス管９０ ７は殺菌フィルター９０５を含んでいてもよい。

使用済の培地は、管９０９を介して収納容器９０８に回収する。使用済の培地の サンプルを収納容器９０８から取り出し、培地の成分を分析することが有利であ る。使用済のガスは管９１１を介して廃棄され、この管９１１からのガスを適切 なガス・アナライザー（回路）を用いて分析することもできる。使用済み液体培 地、および／または使用済みガスの分析は、細胞培養をモニターするための付加 的手段として利用するのが有利である。さらに、手段９１２を用い、ｐＨや溶解 酸素圧力なと重要な培養特性をモニターすることも有利である。

ユニで述べた３種類のバイオリアクターは全て、上記した基準を満たしている。

それらの構成、操作、性能の例を以下に記載する。

本発明を全般的に説明したが、以下に記載するより具体的な実施例を参照するこ とによって、本発明をよりよく理解できるであろう。但し、その実施例は例示に 過ぎず、特別の記載ない限り限定を意図するものではない。

成長因子ヒトＧＭ　−ＣＳ　Ｆ　（Ｗｏｎｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　（１９８５ ）　２２８　：　８１０−８１５　）を真核性の発現ベクターに挿入した。ＨＧ Ｍ−Ｃ３Ｆ　ＣＤＮＡ　（Ｅｃ旦ＲＩから得られたプラスミドはｐＳＰ６５ＧＭ −Ｃ３Ｆであった。マウスのメタロチオネイン・プロモーター（Ｇｌａｎｖｉｌ ｌｅ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）　２９勤２６７−２６９）を旦ｃｏＲＩお よび旦呈↓ＩＩを用いて分解し、プロモーターを含む約２ｋｂの断片をｐＳＰ６ ５の旦且旦Ｒ１からＢａｍＨＩまでの断片に挿入し、ｐ６５ＭＴを作成した。ｐ ｓｐ６５ＧＭ−Ｃ３ＦをＥｃｏＲＩで分解してプラスミドｐｒｖｉ’ｒ　ＧＭ− Ｃ３Ｆを構築し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー（ｋｌｅｎｏｗ）断片とオー バーハングした状態で充填し、その結果得られた直線化されたＤＮＡをＨｉｎｄ ■ｌｌによって分解し、ＧＭ−Ｃ３Ｆのコード領域を含むｙｏｏｂｐの断片を単 離した。この断片を５ａｌＩで満たされたｐ６５ＭＴの旦工ｎｄｌｌＩ位置にサ ブクローニングした。次いて、メタロチオネイン・プロモーターとＧＭ−Ｃ３Ｆ コード領域とを含む２．７ｋｂの断片を単離し、５Ｖ−４０プロモーターを除去 し、ｐ　Ｓ　Ｖ　２　ｎ　ｅ　ｏ　（ＳｏｕｔｈｅｒｎとＢｅｒｇ、　Ｊ、　Ｍ ｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ　（１９８２）１：３２７）中に置いた。この 結果、ＧＭ−Ｃ３Ｆコ一ド配列の下流に５−４０ポリＡシグナルが得られた。

抗生物質ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）　（Ｇ４１８）に対する耐性 を与えるネオマイシン耐性遺伝子を、旦ヱｕｌＴから旦ｃ　ｏ　ＲＩ　マチ（７ ）約３　ｋ　ｂ　（ＤＷｆｒ片を単離し、旦旦旦Ｒ＋リンカ−を旦ヱ旦１１部位 に置くことによって、ｐＳＶ２ｎｅｏから取り出した。ＥｃｏＲＩ末端を有する 新しい耐性遺伝子を、ＧＭ−Ｃ３Ｆ発現プラスミドのＥｃｏＲ１部位にサブクロ ーニングし、プラスミドＭＴＧＭ−Ｃ３Ｆｎｅｏを作成した。

プラスミドＭＴＧＭ−Ｃ３Ｆｎｅｏ単独、および５Ｖ−４０プロモーターとポリ 八部位との制御下でテナガザルＩＬ−３遺伝子をコードするプラスミド（Ｙａｎ ｇ。

Ｃｅ１ｌ　（１９８６）　４７：３−１０　）との同時形質移入体として、直線 化されたＤＮＡの電気穿孔により、アフリカ・ミドリザルの細胞株ＣＶＩとマウ ス細胞株ＮＩＨ３Ｔ３に形質移入した。形質転換体は５００ｍｇ／ｍ！！のＧ４ １８を含む培地中で選択し、分離し、ＡＭＬ−１９３細胞（Ａｄａｍｓら、Ｌｅ ｕｋｅｍｉａ、（１９８９年）ユニ３１４）を用いた上澄みの生物学的検定によ ってスクリーニングを行い、ＧＭ−Ｃ３ＦとＩＬ−３を生産した。陽性株の幾つ かをヒト骨髄細胞のストローマとしてデクスター培地中で使用した。

さらに、健常のマウスの骨髄細胞を、オカヤマのカルシウム／燐酸塩法（Ｃｈｅ ｎ。

Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　（１９８７）　７　：２７４５−２７５２ ）により、上記のプラスミドで形質移入し、導入された遺伝子を効果的に発現す ることを確認した。

形質移入した繊維芽細胞によるＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３の分泌を調べた。無血清 ７２時間培養の上澄みをＮＩＨ−３７３細胞から得、ウサギ抗ＧＭ−Ｃ３Ｆまた は抗ＩＬ−３抗体を中和することによって阻止し得る目標細胞の上での３時間の 摂取によってｈＧＦの分泌を試験した。２０ｍｇ／ｍＩ！のＧＭ−ＣＳＦによっ て誘導された増殖を１００ユニツトのＧＭ−Ｃ３Ｆと設定し、１０ｎｇ／ｍｌの ＩＬ−３によって誘導された増殖を１００ユニツトのＩＬ−３と設定した。同時 に形質移入した細胞は、約３５ユニツト／ｍｌの０ＭＣ３Ｆと約５７ユニ・フト ／ｍｌのＩＬ−３を産生じた。

■、潅流チャンバ 潅流チャンバは、デルリン（Ｄｅｌｒｉｎ）キャップを具備するガラス製シリン ダで、変形のないオートクレーブと生物学的適応性を実現している。キヤ・ノブ は、ガラス製シリンダが嵌合する円筒形の溝を存している。溝の底には０型リン グが設置され、チャンバのルーメン（ｌｕｍｅｎ）を密封している。キャップは 、ルア（ルア・ロック（Ｌｕｅｒ　Ｌｏｋ）　）器具が設けられた幾つかの穴を 有し、ここに培地および気体の供給ラインが挿入され、また、付着性および／ま たは非付着性細胞をサンプリングするためにチューブがチャンバの中央部まで延 びている。キャップは、ガラスシリンダの外側に１２０°の間隔で設けられた３ 本の長いボルトで取り付けられ、その組み付けを強固なものとするために蝶ナツ トとワッシャーを用いている。

チャンバは、側部貯蔵槽にフックで止められている。その経路には、その側部培 地貯蔵槽の他にポンプ、オンライン・センサのチャンバ、酸素投与装置、および サンプルと注入口が設けられている。側部貯蔵槽中の培地は別のポンプでゆっく り交換される。この構造により、培地の交換速度と、酸素投与装置と潅流チャン バを通しての流速とを別々に制御できる。前者の制御は培地成分と潅流の長期間 における変化を制御し、後者の制御は、溶解した酸素の圧力とチャンバ内の流れ のパターンを制御する。細かいメツシュのポリスルフォネート膜を使用すること により、チャンバ内へのプラグフローが可能となり、また成長因子、および非常 に正確な量でバイオリアクターに導入することが要求される他の特定の化合物の 供給を高精度で制御できる。

移入された間質細胞は、細断したコラーゲンのスポンジの上に播種するか、コラ ーゲンによって予め被覆した５μの孔を有するポリカーボネートのフィルターの 一面に置き、間質細胞を数時間かけてフィルターに付着させる。細胞質の突起を 孔を通して供給しながら、適切な栄養培地内で細胞が一方の面上でコンフルエン トになるまで細胞を生育する。次いで骨髄細胞を膜の反対面上に播種すると、＃ ｆｌＢ胞が孔を通して押し込まれた細胞質の突起に何着する。

チャンバと経路内の部品を高圧滅菌した後、滅菌し７た環境のもとてリアクター を組立る。その後、汚染の兆候を・五二ターしながら、側部経路とチャンバとを 通して、数日間培地を循環させる。次いて、バイオリアクターの中央部に、細胞 外マトリックスのみ、または、間質細胞を含有する予め接種した細胞外マトリッ クス支持体を接種する。数日の間、間質細胞をチャンバ内に保持し、それらの代 謝ａ能、および、／または成長因子応答性をモニターする。もし満足できる結果 が得られた場合には、骨髄を接種するか、直ちに骨髄を播種する。何れの場合も 、細胞層は、潅流チャンバの中央部の底に保持される。

細胞を追加の細胞外マトリックスの上に置き、細胞層をその支持体に付着させる 。膜を使用する場合には、チャンバを逆さまにし、細胞層が中央部の天井に位置 するようにしてもよい。この構造により、同質層に対する付着力が無くなると成 熟した細胞が、チャンバの中央部の底に落ち着く。付着力のない細胞は、培地の 潅流圧力が引き起こす細胞の定常流によって、排出管に回収される。

典型的な運転においては、第１８目に、チャンバ内の細断されたコラーゲンスポ ンジの支持体の上にＮＩＨ−３Ｔ３細胞を接種した。最初の４０日間、潅流速度 や他の運転変数を調整した。４０日目、妥当な安定状態が得られ、それを約２０ 日間維持した。６４日目、チャンバに３３ｘ１０＠個のヒト骨髄細胞を播種した 。最初のＩＯ日日間、回収した細胞数は減少したが、やがて３日置きに約７−８ ＸＩＯ’個の細胞を産生ずる安定状態に落ち着いた。フローサイトメトリーの解 析の結果、回収した細胞の一定の割合、約２０％はＨＬＡ−ＤＲ陽性であった。

９０日目、ポンプの故障が起き、−晩の間、ｐＨが６．９以下に低下した。

潅流速度が元に戻ると、非不着性細胞の生産は回復し、バクテリアによる汚染が 発生した時以前の安定した産生速度に近づいた。この時点で、研究を終了した。

上記の結果は、潅流チャンバは、生体外で造血を行うことができ、ｐＨの低下の 後、生体外において造血機能を回復できるであろうことを示した。また、グルコ ース濃度のデータは、酸素の供給が制限されていることを示す乳酸塩の濃度上昇 を伴うことなく、接種の後グルコースの濃度が低下していることを示した。これ により、造血細胞は、主にグルコース上で好気的に成長することが示された。

グルコース／乳酸塩（嫌気性）の代謝は、主にＮＩＨ−３Ｔ３の間質ベッドによ るものと考えられる。同様に、造血細胞数が一旦ならされると、グルタミンとア ンモニアの濃度が接種前のレベルに達することは、骨髄細胞によるグルタミンの 消費は、間質ベッドに比べてより少ないことを示唆している。

■６　代謝産物のモニター グルタミンおよびアンモニアと同様に、グルコースと乳酸塩の消費と生成の割合 を、トランスフェクト・されたＮＩＨ−３７３細胞について測定した。（培地は 、１ＭＤＭと２０％ＦＣ３てあった。）グルコースの消費の増加は、毎日供給さ れたＴフラスコに−）いてのみ観察され、一方、より少ない頻度で供給か行われ た培養は、徐々に減少する同じグルコース摂取率パターンを示した。１８日目に 、毎日５０％交換されていた培養を、毎日１００％交換するようにスケジュール を変更した。、二の結果、毎０１００％交換した時と同じ傾向で、第」８目から グルコースの消費が直ちに増加し、た。グルコースに対する乳酸塩の収率は本質 的に一定（０，９乳酸塩、／グルコース、主に嫌気性の間質代謝を示す）であり 、乳酸塩の生成率も同様なパターンを示した。

グルタミンとアンモニアの濃度は、グルコース／乳酸塩代謝と類似のパターンを 示す。３７゛Ｃてのグルタミンの化学分解を補正した値で計算すると、グルタミ ン消費率対グルフース消費率は一定の相対的摂取率、即ちグルタミン・グルコー ス−約１８を示している。

類似の結論が、通常の骨髄間質の繊維芽細胞から得られたグルコース／乳酸塩代 謝のデータによって裏付けられた。培地の交換をたまに行う条件下では、培養は 、主に嫌気性てあり、高い乳酸塩レベルの安定した状態が直ちに得られ、維持さ れた。培地の交換頻度か増えると、細胞の代謝はより速くなり、グルコースの消 費と乳酸塩の生成が増加する。データを自然化学分解産物に対して補正してみる と、グルタミンの検出可能な消費は見られなかった。３Ｔ３細胞と健常のヒト骨 髄細胞についてはいずれも、血清／培地の交換速度が、限界の交換スケジュール と思われる速度をに回っていた時、細胞が引き続いて分裂して群を作った。

さらに、血清の潅流速度と栄養分の潅流速度との間の相対的な重要性を確認する ため、下記の実験を行った：　（１）２０％血清を含有し、毎日交換される培地 を含む１組のＴフラスコ、（２）２ｍのＴフラスコで、その一方は２０％血清を 含有し、培地は１日おきに交換され、他方は１０％血清を含有し、培地は毎日交 換されるもの；　（３）２組のＴフラスコで、その一方は１０％血清を含有し、 培地は１０おきに交換され、他方は５％血清を含有し、培地は毎日交換されるも の：　（４）２組のＴフラスコで、その一方は５％血清を含有し、培地は１日お きに交換さｔｌ、他方は２．５％血清を含有し、培地は毎日交換されるもの。血 清の交換率は、各グループ内で同一であり、栄養素を含有する培地の交換率は異 なる。

これらの実験より、血清の交換率が重要であることが分かった。実験ｌ）におい ては、グルコースの消費が増加し、４日目までに、実質的に増加が止まり、約９ ．５ミリモル／日の割合になったのに対し、他のすべてのケースでは、グルコー スの消費量は、グループＩの最初のグルコース消費量よりも低い値から始まり、 ２倍の星の血清を使用して１日おきに交換したか、半分の量の血清を使用して毎 日交換したかに拘わらず、実質的に直線的に減少した。このことから、間質細胞 の代謝生育のあり方に影響を与える、血清、もしくは１つ以」二の血清成分の臨 界潅流速度の必要性が支持される。

上記の結果が示しているように、造血細胞はバイオリアクターの中で効率的に生 育てきることがわかる。同質細胞は、これが遺伝子でトランスフェクトされ、重 要な成長因子を提供する、同種もしくは異種の供給源から得ることができる。

この方法では、細胞の生育を助けるために、血清を培地に加える必要がない。支 持体に付着する同質細胞を、間質細胞から造血細胞が分離できる方法で提供する ことにより、造血細胞を連続的に回収して使用することができる。成長因子の組 合せを適切に選択することによって、造血細胞の特定の系統が生育できる。さら に、もし必要であれば、造血細胞への遺伝子の導入のためのトランスフェクトウ ィルスの貯蔵槽として間質細胞を提供してもよい。

実施例　１ 以下、平坦ベッド成膜バイオリアクター（前記１．　１参照）の−具体例とシス テム全体の機能を説明する。

操作方法 Ａ、潅流チャンバの起動 叩：　細胞をデクスター（Ｄｅｘｔｅｒ）培養を行う場合と同様にして、接種の 前に処理する。ドナーの単核細胞を吸引した後、非連続濃度勾配（Ｆｉｃｏｌ　 １−Ｐａｑｕｅ）−Ｆて分離し、培養培地内で数回洗浄した。濃い接種材料が必 要な場合には、この段階において、始原細胞と幹細胞を富化する方法を実施する 。この方法は通常約半日かかる。

１０％胎児ウシ血清、１０−’Ｍハイドロコルチゾン、およびＩＭＤＭである。

１１−３のような造血成長因子に加え、上記したような（Ｓｃｈｗａｒｔｓら、 １９９１）ＧＭ−Ｃ３ＦとＥｐｏ、およびＣ−キットリガンドを使用する。

潅流チャンバ　潅流チャンバの準備は接種１日前から開始する。６−ＩＯの潅流 のセットの組立には約６−８時間かかる。これには、管の寸法測定／切断、チャ ンバへの付属器具の取付け、培地瓶の準備等が含まれる。その日の終わりにチャ ンバ組立部分を全部（ガス交換のための配管や付属器具は除外されている）培地 なしで高圧滅菌する（部品は全て高圧滅菌可能である）。次いでチャンバのセッ トを、殺菌された培養フードの中に保存する。その後、フードの中で部品の完全 なセットを組み立て、培地を導入し、膜コーティングを塗布しく例えば、Ｐｅｐ Ｔｉｔｅ　２０００）　、細胞を接種し、チャンバをインキュベータに入れ、注 入器をポンプに装荷し、冷却装置に保存する。チャンバの準備、細胞の取扱い、 および接種は、通常まる２日かかる。潅流は、通常細胞がチャンバ内で落ち着い た後に始め、１２−２４時間行う。

謄二　本実施例では、シリコーン膜（仕様）、またはテフロン（商標）ＩＩ！（ 厚さ０．００１インチ）をガス交換膜として使用した。細胞育成と付着のために 、セラミック膜（アノチック（Ａｎｏｔｅｃ　；商標）、０．０２ミクロン、処 理せず）を使用した。

Ｂ、潅流チャンバの運転 注入器の交換：　この実施例では注入ポンプを使用した。注入器は、一定のスケ ジュールに従って交換される。例えば、チャンバの初期運転の間は、１０ｍｌ！ の注入器を、２ｍ！！／日の流速で使用した。注入器は５日おきに交換した。注 入ポンプを冷却装置からフード内へ移動し、無菌環境の中で注入器を交換する。

このポンプの移動は、上記の培地導入管の弛みによって可能となる。

顕微鏡観察：　潅流チャンバとガス交換チャンバの頂部と底部は透明である。

無機膜は、一度水和されると透明になり、運転の間、チャンバ内の細胞を顕微鏡 を通して観察できる。そのためには、長い焦点距離の対物レンズが必要である。

細胞のサンプリング　周期的な細胞のサンプリグのために２つの方法を使用した 。第１の方法では、２時間、重力反転（ｇｒａｖｉｔｙ　１ｎｖｅｒｓｉｏｎ） によって細胞を落ぢ着かせ、入口ボートから液体を押し込むことによって、チャ ンバ内の２ｍｌを入替え、取出しラインから回収する。第２の方法では、サンプ リングボートを介して直接２　ｍ、　ｆ取り出し、チャンバ内に空間を残す。こ の空間は、流入する培地により１日以内になくなる。２番目の方法はより侵襲的 であり、より多くの（約４倍）の数の細胞を回収できる。細胞のサンプリングは 、層流フードの中で行われる。チャンバのセットをインキュベータからフードへ 移動するため、培地導入管は、この移動を許容する長さでなければならない。付 着性の細胞は、トリプシン化を伴う処理の後、同様にして除去できる。

Ｃ１運転 次に、これらのバイオリアクターを用いた幾つかのテストの結果を説明する。

図６ａ−ｉに示された特定の寸法を持つ小さなバイオリアクターと同じものを複 数製作し、種々の条件下で同時に運転した。

実施例　２：　異なる酸素投与率におけるバイオリアクター内でのヒト骨髄の成 長 造血バイオリアクターのセットを成功裏に繰り返し運転した。

図６ａ−ｅに示された寸法のチャンバのセットを、異なる酸素率で運転したデー タを説明する。

バイオリアクターの準備 構造：　２チヤンバの設計、即ち、頂部区画に０．を、底部区画に培地の流れの ある構造とした。リアクターの底壁であるポリカーボネートの表面で細胞を生育 した。底の細胞区画を横切って培地を供給し、シリコーンのガスケット（医療用 品質）を通して挿入された注射針によって取り出した。

酸素投与膜：　酸素投与のためガス透過性膜によって２つの区画を仕切った。

ポリカーボネート表面上の細胞層に対する酸素投与率を最適化するため、３種類 の膜をテストした。テフロン１００（厚さ０．００１インチ）、シリコーン＋５ ００　（厚さ０．０１５インチ）、およびシリコーン３０００　（厚さ０１０３ インチ）。２つのシリコーン膜は、医療用の品質で、ダクロン（ｄａｃｒｏｎ） のネ・ソトで補強されていた。

寸法：　細胞成長チャンバの深さは３ｍｍで、ガス・フローのためのチャアノく の深さは１．．５ｍｍであった。チャンバの直径は何れもほぼ３０ｍｍであった 。

殺菌、　りアフターは、ボルトを締めずに組立てを行い、液体サイクルで３０分 間高圧滅菌を行った。層流フード内で一夜、冷却と乾燥を行った後、全てのねじ と付属器具を締めつけた。培地を導入する前に、リアクターをＩ　Ｏｍｌのノ１ ンクスの平衡食塩水（Ｉ（ＢＳＳ）を用いて濯いだ。

培地： デクスタ−（ＤＥＸＴＥＲ）培地の中で、成長因子を標準デクスター（Ｄｅｘｔ ｅｒ）培地、（即ち、１０％　Ｖ／Ｖ）胎児ウシ血清、１０％のウマ血清に８０ ％の培地を加えたものに添加した。培地はこの場合、アイスコープの変性ダルベ ・ノコ培地（ｌｓｃｏｖｅ’　ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃ’　ｓ　 Ｍｅｄｉｕｍ）で、ＩＬ−３（ｊ）ｔ：ｙト／ｍ１）、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　（５ｎｇ ／ｒｒ＋Ｊり　、Ｅｐｏ　（０，ｌユ＝ット／ｍＩりおよびＭＧＦ（ｌ　Ｏｎ　 ｇ／ｍｆ）を含有した。

バイオリアクターの運転： 上記した種々のガス透過性膜を有するバイオリアクターを、ガス区画内で異なっ た酸素濃度で運転した。テストした酸素のレベルは５％（５％のＣＯ２も含み、 Ｎ２で平衡）と、２０％（５％のＣＯ３を含む空気）であった。両方の気体は、 バイオリアクターに導入する前に、殺菌した水で飽和させた。それぞれの条件に ついて３回運転を行った（下記の表を参照）。各リアクターに通常のフィコール （Ｆｉｃｏｌｌ）法によって精製された７百万個の細胞を接種した。培地の潅流 速度は０．７５ｍ１７日で、細胞の培養は、暖かい部屋で３７℃で行った。

バイオリアクターの準備。

サンプリング・　−週間単位のサンプリング・スケジュールによった。第１週は 、０．　６−０．　８ｍｊ！の量の非付着性細胞をサンプリングした。２週間の インキュベーションの最後に、培地を回収するとともに、ＨＢＳＳで３回洗浄し く合計８−１８−１ｌ、非付着性細胞を収穫した。付着性細胞は、室温で１５− ２０分間、トリプシン化した。細胞サンプルは全て、メチルセルロース上で始原 細胞アッセイを行うために、第１週目のサンプルは２．５ＸＩＯ’個／ｍ！！、 第２週目のサンプルはｌＸｌ０’個／ｍＩ！の密度で、塗布した。

結果 結果は、ｌ）全細胞数、２）果粒球系マクロファージ始原細胞（ＧＭ−ＣＦＵ） 、および３）エリスロイドバースト形成ユニット（ＢＦＵ）の増殖として表に示 す（表１、および図１０ａ−ｃのグラフ）。増殖は、接種材料に対する累積生産 量として定義される。付着性細胞層の処理は以下の通り行った。

１、細胞の表面被覆：　第１週目の培養では、全てのりアクタ−において細胞が 表面の４０−５０％以上を覆った。最も多い被覆は、２０％Ｏ１でシリコーン１ ５００を用いたりアクタ−内で観察された。運転の第２週目の終わりでは、シリ コーン３０００の膜を備えたりアクタ−内の細胞ベッドが最も状態が良く見えた 。殆どの条件下において、被覆の割合は、リアクターの周囲に比べ、中央部が低 かった。

２、間質細胞：　非付着性細胞がコンフルエントとなる前に、ポリカーボネート 表面の細胞密度が低い領域において繊維芽細胞の付着が観察された。間質細胞は 、２週間後に完全にはコンフルエントにならなかったが、ある特定の領域ではフ ンフルエンドとなった。

結論 チャンバは、ヒト骨髄細胞の増殖を助ける。消費可能な酸素の量を増加させると 性能が向上した。２種類のシリコーン膜の何れかを使用し、酸素が２０％の時に 最良の結果が得られた。これらの条件の下で、細胞の総数は、はぼ係数で３だけ 増加した。全細胞集団におけるＧＭ−ＣＦＵの密度もほぼ係数で３だけ増加し、 ＧＭ−ＣＦＵをほぼ９倍増殖させた。

実施例　３：　１０倍の規模拡大 細胞の付着面積が１０倍のユニットにおいても上記の結果が得られた。垂直方向 の寸法は実施例２と同様にした。流体の流れのパターンを若干変更した。中央の ボートを導入口とし、３個のボートを外周に１２０°の間隔で設置した。これら ３個のボートは培地の排出用として使用した。

細胞生産のデータを表２に示す。チャンバに３，５００万個の細胞を接種したと ころ、累積の細胞生産量は３億個、即ち、細胞の全数が８．６倍に増殖した。

実施例１のように、ＧＭ−ＣＦＵの始原細胞密度の増加が観察され、３１倍以上 の良い増殖結果が得られた。産生したＧＭ−ＣＦＵの総数は２００万以上であっ た。典型的な移植体は、約１，０００万のＧＭ−ＣＦＵを有する。従って、本発 明のバイオリアクターは、単一の吸引液（ａｓｐｉｒａｔｅ）から臨床的に意義 のある数の造血始原細胞を生産できる。

表１一 本明細書において引用した全ての刊行物および特許出願については、それら個々 の刊行物または特許出願が、明確にかつ個別に示されているものであり、これら は本明細書の一部を構成するものとする。

図３および１１の実施例は、潅流培地の流れのパターンの形状の変更が革新的で あることにより、流体の流れパターンにおける“死んだ”領域を最小限にするこ とができ、潅流培地の全ての部分について、リアクター内での滞留時間を均一に することができる。

＊＊＊＊＊＊＊ 上記の教示に鑑み、本発明について種々の変形、変更を行うことが可能なことは 明らかである。したがって、本発明は、添付の請求の範囲の範囲内において、本 明細書で明確に述べた以外の方法で実施可能であることが理解される。

図３Ａ 図３Ｃ 図４Ａ 図４Ｂ 図５Ａ 図５Ｂ 図６ａ　図６ｂ 図６ｃ’　図ａ　Ｃｅ　１ 図６ｄ　図６ｅ 細胞 図６ｆ 図６ｇ 細胞 図６ｉ 液体入口 図７ｂ 図１０ａ 図１０ｂ 図１０ｃ フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ、　ＦＩ。

ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、 ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ、　ＵＳ （７２）発明者　スチュワード、リチャード、エム。

アメリカ合衆国　４８１０５　ミシガン州、アン　アーバー、ポルガス　サーク ル　３１８０

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト幹細胞またはヒト造血細胞を導入して培養する細胞培養チャンバを形成 する包囲部と、 液体細胞培養培地および細胞の呼吸性気体を、連続的または周期的に、細胞培養 チャンバを通して灌流させる手段と、細胞培養チャンバから非付着細胞を、連続 的、周期的または間欠的に回収する手段とを含有するヒト幹細胞またはヒト造血 細胞を培養するためのバイオリアクター。
2. ２．ガス透過性の、またはガス透過性で水非透過性の膜であって、包囲部を膜の 一方の側の細胞培養チャンバと膜の他方の側のガスチャンバとに分割するために 包囲部に取付けられた膜を含み、細胞培養を通して呼吸性気体を灌流する手段が 、ガスチャンバに呼吸性気体を供給して呼吸性気体に膜を通過させ、これによっ て細胞培養チャンバに浸透させる手段と、使用された呼吸性気体をガスチャンバ から排出する手段とを有する請求項１記載のヒト幹細胞またはヒト造血細胞を培 養するためのバイオリアクター。
3. ３．細胞培養チャンバを通して液体細胞培養培地を潅流させる手段が、新鮮な液 体細胞培養培地を細胞培養チャンバに供給する手段と、使用された液体細胞培養 培地を細胞培養チャンバから排出する手段とを有する請求項２記載のヒト幹細胞 またはヒト造血細胞を培養するためのバイオリアクター。
4. ４．細胞培養チャンバが、細胞の付着および生育に適した表面領域を含み、細胞 培養チャンバから非付着細胞を連続的、周期的または間欠的に回収する手段が、 細胞培養チャンバ内において液体細胞培養培地に円形の運動を誘導する手段を含 む請求項１記載のヒト幹細胞またはヒト造血細胞を培養するためのバイオリアク ター。
5. ５．細胞培養チャンバが、細胞の付着および生育に適した表面領域を含み、細胞 培養チャンバから非付着細胞を連続的、周期的または間欠的に回収する手段が、 非付着細胞を密度に基づいて選択的に回収する手段を含む請求項１記載のヒト幹 細胞またはヒト造血細胞を培養するためのバイオリアクター。
6. ６．細胞培養チャンバを形成する包囲部が、細胞の付着に適した表面領域を含む 請求項１記載のヒト幹細胞またはヒト造血細胞を培養するためのバイオリアクタ ー。
7. ７．細胞の付着に適した表面領域が、特定の細胞の付着のための生物学的に活性 な表面である請求項６記載のヒト幹細胞またはヒト造血細胞を培養するためのバ イオリアクター。
8. ８．付着細胞をサンプリングするための手段を含む請求項１記載のヒト幹細胞ま たはヒト造血細胞を培養するためのバイオリアクター。
9. ９．細胞培養チャンバに取り付けられ、ガス透過性で水非透過性の膜の上に量ね られた細胞付着／生育膜を含む請求項２記載のヒト幹細胞またはヒト造血細胞を 培養するためのバイオリアクター。
10. １０．ガス透過性で水非透過性の膜と細胞生育／付着膜であって、包囲部を膜の 間に位置する細胞培養チャンバと、ガス透過性で水非透過性の膜の細胞培養チャ ンバと反対の側に位置するガスチャンバと、細胞生育／付着膜の細胞培養チャン バと反対側に位置する液体培地区画に分割するために包囲部に取付けられた膜を 含む請求項２記載のヒト幹細胞またはヒト造血細胞を培養するためのバイオリア クター。
11. １１．包囲部に取付けられたガス透過性で水非透過性の膜と細胞生育／付着膜を 含み、これにより膜の間に淀んだ液体培地区画を形成し、これにおいて、細胞培 養チャンバは、細胞生育／付着膜の淀んだ液体培地区画とは反対の側に位置し、 ガスチャンバは、ガス透過性で水非透過性の膜の淀んだ液体培地区画とは反対の 側に位置する請求項２記載のヒト幹細胞またはヒト造血細胞を培養するためのバ イオリアクター。
12. １２．ヒト幹細胞またはヒト造血細胞を導入して培養する細胞培養チャンバを形 成する包囲部と、液体細胞培養培地および細胞の呼吸性気体を細胞培養チャンバ を通して灌流させる手段と、細胞培養チャンバから非付着細胞を、連続的、周期 的または間欠的に回収する手段とを含むヒト幹細胞またはヒト造血細胞を培養す るためのバイオリアクターと、 液体細胞培養培地を安定的に貯蔵する手段と、液体細胞培養培地を細胞培養チャ ンバを通して灌流させる手段と、細胞呼吸性気体の供給源と、 細胞呼吸性気体を細胞培養チャンバを通して灌流させる手段とを含むヒト幹細胞 またはヒト造血細胞を増殖するシステム。
13. １３．細胞呼吸性気体の供給源が、圧縮された混合気体である請求項１２記載の システム。
14. １４．細胞呼吸性気体の供給源が、インキュベータである請求項１２記載のシス テム。
15. １５．細胞培養チャンバを通して液体細胞培養培地を灌流させるポンプを含む請 求項１２記載のシステム。
16. １６．細胞培養チャンバを通して細胞呼吸性気体を灌流させるポンプを含む請求 項１５記載のシステム。
17. １７．細胞呼吸性気体を、培養チャンバに灌流する前に加湿する手段を含む請求 項１２記載のシステム。
18. １８．バイオリアクターが、ガス透過性で水非透過性の膜であって包囲部を膜の 一方の側の細胞培養チャンバと、膜の他方の側のガスチャンバとに分割するため に包囲部に取付けられた膜を含み、呼吸性気体を細胞培養を通して灌流する手段 が、ガスチャンバに呼吸性気体を供給して呼吸性気体を膜に通過させ、これによ って細胞培養チャンバに浸透させる手段と、使用された呼吸性気体をガスチャン バから排出する手段とを有する請求項１２記載のシステム。
19. １９．細胞培養チャンバを通して液体細胞培養培地を灌流させる手段が、新鮮な 液体細胞培養培地を細胞培養チャンバに供給する手段と、使用された液体細胞培 養培地を細胞培養チャンバから排出する手段とを有する請求項１８記載のシステ ム。
20. ２０．細胞培養チャンバに取り付けられ、ガス透過性で水非透過性の膜の上に重 ねられた細胞付着／生育膜を含む請求項１８記載のシステム。
21. ２１．細胞培養チャンバが、細胞の付着および生育に適した表面領域を含み、細 胞培養チャンバから非付着細胞を連続的、周期的または間欠的に回収する手段が 、細胞培養チャンバ内において液体細胞培養培地に円形の運動を誘導する手段を 含む請求項１２記載のシステム。
22. ２２．細胞培養チャンバが、細胞の付着および生育に適した表面領域を含み、細 胞培養チャンバから非付着細胞を連続的、周期的または間欠的に回収する手段が 、非付着細胞を密度に基づいて選択的に回収する手段を含む請求項１８記載のシ ステム。
23. ２３．ガス透過性で水非透過性の膜と細胞生育／付着膜であって、包囲部を膜の 間に位置する細胞培養チャンバと、ガス透過性で水非透過性の膜の細胞培養チャ ンバと反対の側に位置するガスチャンバと、細胞生育／付着膜の細胞培養チャン バと反対側に位置する液体培地区画に分割するために包囲部に取付けられた膜を 含む請求項１８記載のシステム。
24. ２４．包囲部に取付けられたガス透過性で水非透過性の膜と細胞生育／付着膜を 含み、これにより膜の間に淀んだ液体培地区画を形成し、これにおいて、細胞培 養チャンバは、細胞生育／付着膜の淀んだ液体培地区画とは反対の側に位置し、 ガスチャンバは、ガス透過性で水非透過性の膜の淀んだ液体培地区画とは反対の 側に位置する請求項１８記載のシステム。