JP2003510068A - 細胞を培養するための方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞を有する複数の中空ファイバ、その内部で細胞が増殖し、分化し、及び/又は遺伝的修飾されるのに必要な少なくとも１の蛋白質、及び任意に、少なくとも１の代謝産物を準備し、中空ファイバのキャピラリ外側に、細胞の増殖に必要な少なくとも１の物質を準備する工程を含む、細胞培養方法を提供する。この方法においては、中空ファイバは、半透過性であり、無細胞側の培地が、その半透過性のファイバへ再循環されることが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、細胞を培養するための方法および装置に関する。本発明は、特に、
細胞をインビトロで高い細胞密度で増殖および維持するための、および、前記細
胞を治療に使用するための、または、工学操作したタンパク質およびウイルスの
製造における、および化合物の生合成および分解のための、方法および装置に関
する。

【０００２】 （背景） 細胞培養は、細胞生物学および免疫学的研究に、および、細胞治療などの医学
治療に使用するのに重要である。細胞治療の具体例は、癌の高用量治療後の血液
産生を再生するための血液幹細胞移植；残留癌細胞を排除するための、または、
ウイルスに対する免疫を復元するための細胞免疫治療；および、遺伝子およびウ
イルス疾患（例えば血友病、ＨＩＶ）の治癒法としての体細胞遺伝子治療を含む
。

【０００３】 細胞増殖技術の１つの即座の適用は、ＣＤ３４⁺細胞を生体外培養および増殖
して、癌（白血病）および遺伝子治療のための高用量化学治療および幹細胞移植
後の低い白血球数（好中球減少症および血小板減少症）を抑止することである。
幹細胞移植後の入院についての医療サービス提供者に対する費用は、患者１人あ
たり４０，０００Ａドルである。幹細胞移植の適用は、年間１０％の割合で増え
ている。なぜなら、移植片拒絶および移植片対宿主疾患などの重篤な合併症が予
防されるからである。患者が幹細胞移植後に入院を必要とする主な理由は、好中
球減少症および血小板減少症に関連しており、これにより、粘膜炎（粘膜の破壊
）、敗血症および出血が引き起こされる。好中球減少症および血小板減少症は、
臍帯幹細胞移植ではより長い（小児でそれぞれ１ヶ月および３ヶ月）。

【０００４】 初期の研究により、インビトロでＣＤ３４⁺細胞から、造血増殖因子（Ｇ−Ｃ
ＳＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンドおよびトロンボポエチン）を使用して産生さ
れた大量の好中球前駆体は、好中球減少症を予防できることが示された。慣用的
には、細胞をガス透過性バッグ（例えば、バクスター、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌ
ｕｒｏｓｉｌ）中で増殖した。

【０００５】 少なくとも５Ｘ１０⁹個の細胞が成人患者に必要であることが明らかとなった
。フラスコまたはバッグ組織培養などの慣用的な技術は比較的無駄が多い。これ
らの技術を使用して、哺乳動物細胞は、最大密度１-２Ｘ１０⁶細胞/ｍｌまで増
殖する。この細胞濃度で、培地を補充しなければならない。なぜなら、グルコー
ス枯渇およびラクテート蓄積により細胞代謝が阻害されるからである。このプロ
セスは、タンパク質のレベルが枯渇していなくてもタンパク質を廃棄するので、
無駄が多い。臨床試験に使用するのに適した無血清培地の現在の費用は、１リッ
トルあたり少なくとも２０００-３０００Ａドルであり；費用の大部分は、臨床
等級のヒトアルブミン、低密度リポタンパク質および組換え成長因子に関する。
従って、１０¹⁰個までの細胞の移植を必要とする臨床適用では、培地のみの費用
でも法外に高い。

【０００６】 大量の細胞を産生するための、よりコスト効率的な技術が必要である。米国特
許第５，７６３，１９４号（この開示を本明細書に参考として取込む）において
、我々は、所望の細胞タイプと反応性のリガンドを内部に備えた中空ファイバア
レイの、半透過性基体の使用に基づいた、細胞分離装置および方法を記載する。
米国特許第５，７６３，１９４号はまた、細胞増殖のための細胞分離装置の使用
を開示する。我々は、グルコースおよびラクテートなどの代謝産物をその生理的
範囲内に維持し、タンパク質成分がリサイクルまたは保持されている培養系では
、細胞は高密度で増殖するだろうという仮説に基づいて、さらなる研究を実施し
た。タンパク質成分のリサイクルまたは保持は、よりコスト効率的である可能性
のある、高密度培養系を提供する。

【０００７】 特に、本発明らは、半透過性基体の透過度を適切に選択することにより、半透
過性基体内に捕獲および増殖した細胞は、慣用的な培養系（Ｔフラスコまたはテ
フロン（登録商標）バッグ）で支持できる細胞濃度よりも４０-５０倍までの高
濃度まで増殖できることを発見した。

【０００８】 （発明の開示） 第一の態様において、本発明は、１つ以上の細胞タイプ（群）を培養する方法
を提供し、前記方法は、 細胞を、半透過性基体の一方の側（細胞側）に細胞を有する、半透過性基体を
提供し、ここでの半透過性基体は、栄養素、調節因子および代謝産物からなる群
から選択された少なくとも１つの物質に透過性であるが、細胞の増殖、分化およ
び/または遺伝子修飾に必要な少なくとも１つのタンパク質には実質的に不透過
性であり； 細胞を、細胞の増殖、分化および/または遺伝子修飾に必要な少なくとも１つ
のタンパク質、および所望により細胞の増殖に必要な少なくとも１つの物質を含
む培養培地に接触させ；そして 半透過性基体の無細胞側に、細胞の増殖に必要な少なくとも１つの物質を提供
することを含む。

【０００９】 細胞は、下記したように、付着していなくても、または半透過性基体上に固定
されていてもよい。

【００１０】 本発明の好ましい形において、少なくとも１つの無細胞物質が培地に含まれ、
これは半透過性膜の無細胞表面の少なくとも一部に流動（環流：灌流）している
。特に好ましい本発明の形において、無細胞培地は、半透過性基体に循環してい
る。無細胞培地灌流速度は、好ましくは、細胞バイオマスに応答性である。バイ
オマスは、例えば、細胞培地中の酸素取込み、グルコース取込みおよび/または
ラクテート生産量を測定することによるなどの、任意の適切な手段により決定し
得る。好ましくは、灌流速度は、バイオリアクターの下流でのこれらの成分の１
つ以上の有意な枯渇または蓄積を防ぐように制御する。無細胞側に循環する培地
は、連続的にまたはバッチ式で補充し、上流での１つ以上の成分の枯渇または蓄
積を防ぎ得る。

【００１１】 細胞の増殖、分化および/または遺伝子修飾に必要な少なくとも１つのタンパ
ク質は、静置培地に含まれ得るか、または、細胞空間を灌流している培地に含ま
れ得る。

【００１２】 半透過性基体が透過性である、栄養素、調節因子または代謝産物から選択され
た少なくとも１つの物質は、細胞増殖、分化または遺伝子修飾に必要とされる、
予め選択したタンパク質または他の大分子以外の任意の物質であり得る。当該少
なくとも１つの物質は、代謝産物または同化産物として細胞により使用される、
任意の物質であり得る。それは、代謝の補因子または調節因子であり得る。当該
少なくとも１つの物質は、細胞による代謝分解により産生された異化産物であり
得る。

【００１３】 少なくとも１つの物質は、細胞により消費される任意の物質、例えば、グルコ
ース、アミノ酸、ビタミンまたは酸素であり得る。少なくとも１つの物質は、低
分子量の増殖または分化因子、例えば、ステロイド、一酸化窒素等であり得る。

【００１４】 細胞の増殖に必要とされる少なくとも１つの物質は、細胞増殖に必要とされる
任意の物質であり得る。それは、栄養素、調節因子または代謝のために細胞によ
り必要とされる物質であり得る。

【００１５】 半透過性基体は、少なくとも約１０，０００の分子量、好ましくは少なくとも
８，０００の分子量、最も好ましくは少なくとも約５，０００の分子量を有する
分子に不透過性であり得る。半透過性基体によって、少なくとも１つの無細胞物
質が、細胞の使用のために、基体の無細胞側から細胞側に通過できるだけでなく
、細胞により産生される低分子量の廃棄産物（例えばラクテート）が、基体の無
細胞側に通過できるようになる。

【００１６】 特に好ましい実施形態において、半透過性基体は、少なくとも１つの中空ファ
イバまたはキャピラリーの形である。好ましくは、中空ファイバは、約１００-
４００ミクロンの範囲の半径および約６-５０μｍの範囲の壁厚を有する。約７
μｍの壁厚が特に好ましい。前記の半透過性中空ファイバの使用により、グルコ
ース、ラクテートおよび他の代謝産物を、キャピラリー外側にこれらの低分子量
物質を含む培地の灌流により、生理的範囲内に維持することが可能である。キャ
ピラリー外培地を、細胞増殖に必要な同じタンパク質で補充する必要はなく、そ
れ故、消費される量はかなり減少する。さらに、これらのタンパク質の消費は低
いので、繊維内を培地で灌流することは必ずしも常に必要ではない。

【００１７】 好ましくは、中空ファイバは、セルロースから形成される。酢酸セルロースま
たはポリスルホンからなる透析および超ろ過中空ファイバ膜を含む、他の型の中
空ファイバも使用し得る。前記の超ろ過膜を使用する場合、典型的には、膜の透
過性が代謝産物に選択的であるような条件下で膜を使用することが必要である。

【００１８】 １０，０００以下の分子量を有するペプチド（例えばインスリン）は膜を横切
ることができるので、その分子を無細胞培地に含めることが必要であり得る。１
０，０００分子量より大きい分子により引き起こされる浸透圧を等しくし、半透
過性基体を横切って水が、細胞培地に流入するのを防ぐことが必要であり得る。
これは、多くの方法で行なうことができる。第一に、細胞区画への培地の流入お
よび流出を調節するバルブを閉じることにより、浸透圧に等しいまたは逆の無細
胞側での圧力の選択により、または、細胞膜を横切らない分子を無細胞培地に含
めることによる。我々は、細胞内培地中で細胞増殖および成長に使用するタンパ
ク質よりも有意に安価な分子を、この目的に使用できることを発見した。例えば
、血清アルブミン（ＢＳＡ）またはデキストラン（治療等級、分子量７０，００
０）などのより安価な分子を、無細胞培地に含め、半透過性基体を横切る浸透圧
を等しくし得る。基体の無細胞側での圧力或いはＢＳＡまたはデキストランなど
の分子の使用は、現在の組織培養技術よりも有意に安価なプロセスを提供する。

【００１９】 すでに記載したように、細胞を、半透過性膜の一方の側に固定し得る。好まし
くは、細胞を、１つ以上のリガンドにより、半透過性基体に結合する。リガンド
は、抗体、レクチン、成長因子および受容体からなる群から選択し得る。リガン
ドはモノクローナル抗体であり得る。リガンドは、セルロース結合ドメインキメ
ラ分子であり得る。

【００２０】 本発明の方法を使用して、１つの細胞タイプを培養しても、２つ以上の細胞タ
イプを培養してもよい。細胞は共培養の形であり得る。

【００２１】 細胞は、１つ以上の動物細胞、植物細胞、真菌細胞または微生物から選択し得
る。細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞であるが、本発明の方法を使用して、他
の細胞タイプ、例えば昆虫細胞、植物細胞、酵母または細菌を増殖し得る。細胞
は、遺伝子工学により修飾される任意の細胞タイプであり得る。

【００２２】 本発明の方法を使用して増殖し得る哺乳動物細胞の例は、造血細胞（ＣＤ３４ ⁺ ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、肝細胞、骨髄細胞、膵島細胞、胚性幹細胞ま
たは遺伝子修飾細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または
ハイブリドーマを含むがこれに限定されない。

【００２３】 細胞増殖、分化および/または遺伝子修飾に必要とされる少なくとも１つのタ
ンパク質は、成長因子、コロニー刺激因子、サイトカイン、サイトカイン受容体
、ケモカイン、アルブミン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質および遺
伝子導入ベクタからなる群の１つ以上から選択し得る。成長因子の例は、ＩＬ−
１、ＩＬ−２、ＩＬ３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、Ｆｌｔ−３リガンド、インスリン、
トロンボポエチン、エリスロポエチン、ＥＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、
ＮＧＦ、ＦＧＦ等である。コロニー刺激因子の例は、ＧＣＳＦおよびＧＭＳＣＦ
である。ケモカインの例は、ＭＡＰ１α、ＳＤＦ−１およびインスリン様成長因
子である。遺伝子導入ベクタの例は、非複製型の、レトロウイルスおよびアデノ
随伴ウイルスベクタ、リポプレックスおよびファージベクタである。好ましくは
、分子または多分子複合体は過剰に存在し、よって、細胞消費または生物分解に
より有意に枯渇しない。これは、培養液中の特定の分子および細胞タイプに応じ
て変化する。アルブミンは、約１０から５０ｍｇ/ｍｌの範囲、好ましくは約１
０ｍｇ/ｍｌの濃度で存在し得る。

【００２４】 無細胞培地はまた、細胞により産生された廃棄産物を補足する分子（群）も含
み得る。好ましくは、半透過性基体は、これらの捕捉分子（群）に不透過性であ
る。捕捉分子はタンパク質であり得る。特に好ましい捕捉分子は、酸素ラジカル
による傷害を減少するものである。酸素ラジカルは、光および酸素と、培養培地
内での疎水性アミノ酸および脂質の相互作用により産生される。これらは、不飽
和脂質を酸化し、並びに、ストレス細胞代謝にストレスを与える。ビタミンＥ、
アルブミン、およびメルカプトエタノールなどのフリーラジカル捕捉剤を、捕捉
剤として使用し得る。

【００２５】 無細胞培地はまた、無細胞培地を所定のｐＨに維持するための緩衝系も含み得
る。ｐＨは、ＣＯ₂/重炭酸塩およびＨＥＰＥＳ緩衝系を使用して調節し得る。

【００２６】 好ましくは、無細胞培地の酸素および二酸化炭素含量を制御する。これは、例
えば、シリコン膜を横切るガス交換によるなどのガス交換により行ない得る。

【００２７】 好ましくは、無細胞培地は、所定の温度で維持する。好ましくは、所定の温度
は、約３０から４０℃の範囲、より好ましくは３７℃である。

【００２８】 本発明の方法は、コンピューター制御下であり得る。

【００２９】 本発明の第一の態様の方法は、２つ以上の細胞タイプの細胞を含む試料から、
所望の細胞タイプを分離する予備段階を含み得る。分離段階は、所望の細胞タイ
プを、半透過性基体に固定し、半透過性基体を処理し、よって基体に結合してい
ない細胞を除去することにより行ない得る。予備分離段階は、米国特許第５，７
６３，１９４号に記載の細胞分離装置などの分離装置で実施し得る。この実施形
態において、分離段階は、本発明の第一の態様の細胞培養法を実施するのに使用
したのと同じ装置で実施し得る。

【００３０】 第二の態様において、本発明は、半透過性膜を含む、細胞の増殖および成長の
ためのバイオリアクターを提供し、ここで、前記の半透過性基体は、栄養素、調
節因子および代謝産物からなる群から選択された少なくとも１つの物質に透過性
であるが、前記細胞の増殖、分化および/または遺伝子修飾に必要とされる少な
くとも１つのタンパク質には実質的に不透過性であり、中空ファイバアレイであ
る。

【００３１】 別の実施形態において、第二の態様は、特定の細胞を分離できる。

【００３２】 半透過性基体は、好ましくは、約１０，０００より大きいかまたはそれに等し
い、より好ましくは８，０００より大きいかまたはそれに等しい分子量を有する
分子に不透過性である。５，０００のカットオフ分子量が特に好ましい。

【００３３】 本発明のバイオリアクターの特に好ましい実施形態において、中空ファイバは
セルロース中空ファイバである。上記したように、ポリスルホンからなる超ろ過
中空ファイバ膜を含む、他の型の中空ファイバも使用し得る。

【００３４】 本発明の第二の態様のさらに好ましい実施形態において、中空ファイバは、栄
養培地を含めるためのハウジング内に位置し、中空ファイバモジュールを生じる
。ハウジングは、円柱であり得る。ハウジングは、入口および出口ポートを有し
得、これからキャピラリー外の栄養培地を導入および取り出し得る。ハウジング
は、入口および出口ポートを含み得、これからキャピラリー内の培地を導入およ
び取り出し得る。中空ファイバモジュールは、標準的な透析配置であり得る。

【００３５】 好ましくは、ハウジングは、キャピラリー外の栄養培地を供給するための供給
手段、および、キャピラリー内の栄養培地を供給するための供給手段と、流体で
伝達している。ハウジングモジュールへの流動は、ポンプ手段の使用により行な
い得る。

【００３６】 本発明のバイオリアクターは、１つ以上のガスおよび熱交換器を含み得、これ
を通して、培地、特に無細胞培地が流動する。

【００３７】 本発明の第二の態様のバイオリアクターは、供給手段に含まれる培地の環境変
数（群）、例えば温度およびＣＯ₂濃度を制御する手段を含み得る。

【００３８】 好ましくは、本発明のバイオリアクターの種々の操作はコンピューター制御下
である。

【００３９】 本発明のバイオリアクターのさらに別の実施形態において、中空ファイバは、
細胞に反応性のリガンドと共に内部に提供される。本発明のバイオリアクターに
使用するに適切なリガンドの例は、上記している。

【００４０】 本発明のバイオリアクターは、容易にスケールアップできる。例えば２つ以上
の中空ファイバモジュールを使用して、例えば細胞治療中に必要な細胞数を提供
し得る。

【００４１】 本発明のバイオリアクターは、携帯用の寸法とし得、よって患者に特異的なバ
イオリアクターとして使用し得る。

【００４２】 本発明の方法およびバイオリアクターは、細胞治療およびバイオテクノロジー
における適用を有する。例またはこれらの適用は、 １．細胞拡大（cell expansion） ２．工学操作したタンパク質またはウイルスの製造 ３．生合成または生物分解。

【００４３】 細胞増殖 既に上記したように、細胞増殖は、ＤＮＡ複製および細胞分裂による細胞増殖
のプロセスとして定義される。細胞増殖は、細胞分化（表現型の変化）と関連し
得、これは、細胞培養培地の構成成分（成長因子レベルおよび他の因子）により
支配される。細胞増殖が必要な適用を以下に要約する。

【００４４】 展開される主な臨床適用は、好中球および血小板前駆体の生体外増殖である。
これらは、高用量化学放射線治療および造血幹細胞移植後の、長期間の好中球減
少症および血小板減少症を予防するのに必要である。好中球および血小板前駆体
は、インビトロで、造血幹細胞（ＣＤ３４⁺）を刺激し、造血増殖因子を用いて
増殖および分化することにより作成した。脊髄切断治療後の低白血球数（好中球
減少症および血小板減少症）の期間は、大量の生体外で産生された造血細胞を、
幹細胞移植片と共に灌流することにより短縮または消失する。

【００４５】 別法として、共培養系を使用して、造血細胞を作成し得る。ここで、造血幹細
胞増殖を支持する骨髄間質細胞層を確立する（Ｄｅｘｔｅｒ培養系）。このプロ
セスは、中空ファイバモジュール内に確立できる。

【００４６】 細胞免疫治療は、免疫細胞を養子移入して、感染性および悪性疾患を処置する
ことである。細胞毒性Ｔ細胞（これは悪性またはウイルス関連組織の排除を統合
する）は、Ｔ細胞受容体の関与（engagement)および架橋により生じる。このプ
ロセスの駆動に必要な他の刺激分子は、サイトカインＩＬ−２、および、抗原提
示細胞上に見出されるＢ７−１およびＢ７−２分子によるＴ細胞（ＣＤ２８）上
の補助分子の関与である。

【００４７】 抗原提示細胞（ＡＰＣ）の役割は、腫瘍細胞またはウイルスをペプチド抗原に
消化することであり、この抗原は、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）に結合して
、特異的Ｔ細胞クローン上の補助的Ｔ細胞受容体に提示できる。この相互作用は
、「ロックと鍵」の適合であり、ポリクローナルＴ細胞個体群からのＴ細胞クロ
ーンの選択を必要とする。一旦選択し増殖すると、いわゆる抗原特異的Ｔ細胞は
感作され、腫瘍またはウイルス感染細胞を排除する能力はより高くなる。

【００４８】 抗原特異的Ｔ細胞クローンの選択および増殖のプロセスは、インビトロで、共
培養系を使用して行なわれた。ＡＰＣ（樹状細胞、単球または繊維芽細胞）の単
層は、ペプチド抗原を、ポリクローナルＴ細胞に提示する。Ｔ細胞受容体を介し
てＡＰＣ上のＭＨＣ提示ペプチドに結合したＴ細胞クローンのみを、ＩＬ−２を
用いて増殖するために選択する。

【００４９】 このアプローチを使用して、ＨＩＶおよびＣＭＶなどのウイルスに対する免疫
を復元した。ＡＰＣは、インビトロで、ＣＤ３４⁺細胞から、サイトカインを使
用して作成できる。

【００５０】 バイオリアクターは、遺伝子治療に使用するレトロウイルス遺伝子導入ベクタ
による、造血または免疫細胞の形質導入に使用し得る。細胞増殖は、導入遺伝子
が、安定に細胞のゲノムに挿入されるのに必要である。細胞は、高密度で増殖さ
れ、大容量のレトロウイルス上清を必要としない。

【００５１】 工学操作したタンパク質またはウイルスの産生 この適用において、細胞タイプを遺伝子修飾して、バイオテクノロジーまたは
医薬適用を有する生物学的分子を分泌する。典型的には、細胞発現系を使用して
、別の生物から単離した遺伝子によりコードされる、タンパク質、ペプチド、ま
たはウイルスベクタを産生する。細胞系で発現されたタンパク質の例は、モノク
ローナル抗体またはその断片、特異的結合ドメイン、酵素、サイトカイン、成長
因子、細胞表面受容体等を含む。２つ以上のドメインを合わせて、キメラタンパ
ク質を形成し得、これは、遺伝子修飾した細胞系により発現される。例えば、ヒ
ト遺伝子治療に使用する複製欠損レトロウイルスは、修飾したマウス繊維芽細胞
により産生された。哺乳動物または酵母細胞系を使用して、完全な生物活性のた
めの追加の炭水化物側鎖の合成を必要とするタンパク質を発現し得る。

【００５２】 生合成および生物分解 いくつかの生物で発達した独特な代謝経路を使用して、有機化合物を合成また
は分解した。簡単な例は、酵母発酵を使用して、炭水化物および糖からアルコー
ルを生成するものである。細菌の分解経路を使用して、窒素含有有機化合物を分
解した。

【００５３】 本発明はここで、以下の非制限的な実施例を参照して記載する。

【００５４】 （本発明の実施形態） 実施例１ セルロース中空ファイバを使用した高密度培養液の実行可能性 高密度バイオリアクターは、コンパクトな構造を使用した、哺乳動物細胞また
はその産物の産生技術を提供する。別の可能性ある高密度培養の利点は、ヒトア
ルブミン、レトロウイルス上清または成長因子などの、高価または希少な培地成
分の消費の減少である。

【００５５】 以下の実験は、セルロース中空ファイバを使用した、高密度の造血細胞培養の
実行可能性を確立する。

【００５６】 目的 １．キャピラリー外空間中に過剰の培地を与えてセルロース中空ファイバ内で
増殖した場合に、最終濃度の細胞が得られることを確立する。 ２．どの因子が、セルロース中空ファイバ内の臍帯血ＣＤ３４⁺細胞の増殖を
制限するかを確立する。 ３．セルロース中空ファイバ培養系を使用して高価な成分（成長因子およびア
ルブミン）の消費を最小限にする。 ４．装置を使用して、臍帯血ＣＤ３４⁺細胞の増殖のための最適なキャピラリ
ー外および内の培地組成を決定する。

【００５７】 方法 単一の繊維モジュール 単一の繊維モジュールを、臍帯血ＣＤ３４⁺細胞の増殖の培養条件を最適化す
るように展開した。これらは、ポリスチレン組織培養皿の底に置いた、１つの中
空ファイバからなる。繊維の末端を、サイラスチック入口および出口チューブに
接着剤でつけ、これにより、繊維の内部に細胞を接種できるようにした。モジュ
ールは、エタノールおよびＵＶ光照射を使用して滅菌した。単一の繊維モジュー
ルに、１ｍｌあたり、凍結した１-２Ｘ１０⁶個の臍帯血ＣＤ３４⁺細胞を接種し
た。これらの細胞を、臍帯血供与（Ｄｒ Ｍａｒｃｕｓ Ｖｏｗｅｌｓ、オース
トラリア臍帯血バンク）から、ＭＡＣＳキット（ベクトンディッキンソン、豪州
）を使用して強化し、解凍前に低温保存した。

【００５８】 １つの繊維の接種後、サイラスチックチューブを、真鍮クリップを使用してと
めた。組織培養皿の底を、キャピラリー外培地で充填した。繊維の内部容量は、
僅か１．３μＬ（πＸ１００μｍ²Ｘ４ｃｍ）であり、キャピラリー外培地の容
量は２ｍｌであった。

【００５９】 それ故、キャピラリー外培地は過剰であった（約１５００：１）。キャピラリ
ー内細胞濃度は以下のように計算した。

【００６０】 細胞数 繊維セグメントの容量 ここで、繊維セグメントの容量＝πｒ²ｌ ここで、ｒ＝１００ミクロンであり、ｌは、計測した繊維セグメントの長さで
ある。

【００６１】 イメージ解析および細胞計測 中空ファイバ内の細胞の増殖は、直接、倒立顕微鏡を使用して観察できる。

【００６２】 細胞は、デジタル捕獲（ＰｕｌｎｉｘＣＣＤカメラ、ＴＭ１００１）およびイ
メージ解析ソフトウェア（Ｗｉｔ５．１）により計測した。繊維内で増殖してい
る細胞のイメージおよび細胞数は、培養の０、２、５および８日目に行なった。
細胞濃度は、繊維に沿って異なる位置でとった４つのイメージの平均から計算し
た。

【００６３】 キャピラリー外および内培地 表１および２は、キャピラリー内および外培地の構成成分を示す。細胞を、成
長因子（ＩＬ−３、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦｌｔ−３リガンドを、２０または１
００ｎｇ/ｍｌで）を含む無血清培地（ＳｔｅｍＰｒｏ培地および栄養補充物、
ギブコ）中で培養した。キャピラリー内および外培地の構成成分のいくつかは、
実験の目的に応じて変化した。

【００６４】

【表１】

【００６５】

【表２】

【００６６】 第一実験において、我々は、付着因子としてポリ−リジンを使用して、臍帯血
ＣＤ３４⁺細胞の増殖に対する付着の効果を決定した。ポリ−Ｌ−リジン（１０
０μｇ/ｍｌ）を、室温で一晩インキュベートすることにより、中空ファイバモ
ジュールの管腔表面に物理的に付着した。モジュールを、細胞の注射前の次の日
に培地で洗浄した。

【００６７】 第二実験は、同じ浸透圧で（１ｍｌあたり１０ｍｇのタンパク質に等しい）、
キャピラリー外培地中のＳｔｅｍＰｒｏ培地補充物を、ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）またはデキストラン（治療等級、分子量７０，０００）で置換する影響を
調べた。ＢＳＡ、デキストランまたはＳｔｅｍＰｒｏ培地の相対費用は、培地１
００ｍｌあたり、１．５６ドル、０．８９ドルおよび８０．００ドルである。デ
キストランは、ヒト注入に認可されているので、調節利点を有し得る。

【００６８】 第三の実験は、キャピラリー外培地に成長因子またはインスリンを含めない実
行可能性を調べた。成長因子の費用は、培地１００ｍｌあたり、約２００Ａドル
である。

【００６９】 最終実験は、成長に対する、キャピラリー内成長因子濃度の影響を調べた（２
０ｎｇ/ｍｌ対１００ｎｇ/ｍｌ）。

【００７０】 結果 細胞付着の影響 臍帯血ＣＤ３４⁺細胞は、繊維をポリ−Ｌ−リジンでコーティングすると、一
過性（１-２日）に付着する。これにより、２日目に初期増殖の遅延が生じるが
、５日目または８日目の臍帯血細胞の増殖には有意な変化はなかった。

【００７１】 繊維に沿った細胞の分布は、細胞が付着している場合には、より均一であった
。付着していない細胞は、繊維に沿って塊を形成する傾向があった。中空ファイ
バ装置を使用して、固定抗体を使用してＣＤ３４⁺細胞の付着により臍帯血を予
め富化する場合、成長に対する効果は、有意ではないようである。

【００７２】 細胞は組織培養フラスコ培養の最大密度を超えて増殖することを注記すること
は重要である。中空ファイバ中の細胞は、２０-４０Ｘ１０⁶/ｍｌの密度まで増
殖した（表３）。組織培養フラスコ中で増殖した臍帯血ＣＤ３４⁺細胞は、２Ｘ
１０⁶細胞/ｍｌを超えて増殖しない。

【００７３】 成長因子濃度の効果 キャピラリー外培地から成長因子を除去することは、臍帯血ＣＤ３４⁺細胞の
増殖に対して有害な作用を及ぼさなかった。これに対し、成長因子のキャピラリ
ー内濃度は、細胞の増殖に顕著な影響を及ぼした。図２は、成長因子濃度の５倍
の増加（２０ｎｇ/ｍｌ対１００ｎｇ/ｍｌ）が、少なくとも２倍だけ、細胞数を
増加したことを示す。より高い細胞濃度では、中空ファイバ中に多層の細胞が沈
着し、よって、イメージ解析ソフトウェアを使用して細胞数を見積もる（図３）
。

【００７４】 ３２+/-９Ｘ１０⁶細胞/ｍｌの最大濃度は、１００ｎｇ/ｍｌの成長因子を使用
して８日目で到達した。細胞数は、多層細胞沈着のために、この数値の２倍であ
り得ると予測される。

【００７５】 キャピラリー外培地中のインスリン、デキストランまたはＢＳＡの影響 これらの実験の目的は、ＳｔｅｍＰｒｏ培地補充物へのより安価な代替物を、
キャピラリー外培地に置換できるかどうかを決定することであった。ＳｔｅｍＰ
ｒｏなどの完全に規定した培地は、ヒトアルブミン、トランスフェリン、インス
リン、および低密度タンパク質などの添加物を含む。インスリンなどのペプチド
（分子量８，０００）は、膜を横切ることが可能であるので、インスリンをキャ
ピラリー外培地に含めることが必要であり得る。また、５，０００分子量より大
きい分子により引き起こされる浸透圧を等しくして、中空ファイバへの水の流入
を防ぐことが必要であり得る。これは、細胞膜を横切らない分子（分子量＞５，
０００）を使用して行なうことができる。別法として、浸透圧は、キャピラリー
外側培地での培地の圧力の適切な選択により等しくし得る。

【００７６】 図４は、このシリーズの実験の増殖曲線を示す。ＳｔｅｍＰｒｏ培地補充物は
、最善のキャピラリー外培地であるが、ＢＳＡそれ自体は、僅かな増殖の減少（
統計学的に有意ではない）を伴い、ＳｔｅｍＰｒｏ培地補充物と置換できる。驚
くべきことに、キャピラリー外培地のインスリンは、細胞増殖を減少するようで
あった（ｐ＜０．０５）。デキストランをキャピラリー外培地中で置換した場合
には、僅かな増殖および細胞壊死が生じた。

【００７７】 アルブミンの重要な機能は、カルシウムおよび小分子、例えばインスリンと結
合することである。デキストランはこれらの分子に結合せず、キャピラリー内遊
離カルシウムレベルが生理的範囲内となるようにカルシウムを調整することが必
要であり得る。

【００７８】 実施例２ バイオリアクターの態様の、本発明のバイオリアクターの実施形態を図５に示
す。バイオリアクターは、細胞選択および増殖の組合せのために設計されている
。細胞添加および収集に必要な成分、または灌流培養液を、それぞれボックスＡ
およびＢに示す。オートクレーブ可能な中空ファイババイオリアクターモジュー
ル１０は、細胞選択プロセスに加えて、高密度の灌流培養液の環境的変数（培地
灌流速度、温度およびＣＯ₂）を制御する、目的別のインキュベーター（４２Ｘ
４０Ｘ４７ｃｍ）内に配置されている。この場合のインキュベートチャンバーは
、３７℃の温度および５％のＣＯ₂を維持する。

【００７９】 中空セルロース繊維１８は、標準的な腎透析構造を使用して、円柱状シェル２
１のモジュール内に配置されている。中程度の規模の中空ファイバモジュールは
、１０⁸細胞/２００ｃｍ²を産生するのに使用できるものであり、大規模のセル
ロース中空ファイバモジュールは、１０¹⁰細胞/ｍ²の産生に適したものであり得
る。

【００８０】 バイオリアクターモジュールハウジング２１は、それぞれキャピラリー内培地
および細胞の導入のための入口ポート２および３、および、キャピラリー内廃棄
物の除去のための出口ポート４を有する。ハウジングはまた、キャピラリー外培
地およびキャピラリー外廃棄物の導入のための出口ポート６および８を有する。
装置は、ガスおよび熱交換器４０を含み、これを通してキャピラリー外培地が通
過する。

【００８１】 キャピラリー内培地および廃棄物は、容器３２および３４にそれぞれ保存する
。キャピラリー外培地および廃棄物は、それぞれ容器３６および３８に保存する
。細胞は容器３９に保存する。

【００８２】 装置の流動制御は、ＩＢＭコンパティブルＰＣと連動した、ステッパーモータ
ー駆動シリンジポンプ２２および蠕動ポンプ２４により行なわれる（示していな
い）。ユニットを通る流動経路は、ＩＢＭコンパティブルＰＣと連動した、ソレ
ノイドピンチバルブ２６により制御する。モジュールは、ステッパーモーター駆
動回転盤により回転する（示していない）。

【００８３】 システムは、ＩＢＭコンパティブルＰＣ上で作動する、Ｌａｂｖｉｅｗ（登録
商標）ソフトウェアを使用して制御する。このソフトウェアプラットフォームは
、装置操作の全態様（ポンプ速度、流動経路、リザーバ容量、温度およびＣＯ₂
）をモニタリングおよび制御する、「バーチャル装置」インターフェースを創造
する手段を提供する。グラフィックなユーザーインターフェースを使用して、細
胞分離および培養プロセスをプログラム化および自動化する。

【００８４】 システムは容易にスケールアップし、すでに確立したセルロース腎透析技術を
使用して、１０⁸から１０¹⁰個の細胞を処理できる。これらの装置は、身体外使
用（直接血液と接触）に認可され、これにより規制当局の許可は非常に簡単にす
る。

【００８５】 本発明のバイオリアクターのこの実施形態の利点は、１つのプラットフォーム
としての、細胞分離および培養の統合、および、キャピラリー内空間での細胞の
増殖である。細胞は、閉じた無菌環境内で処理され、細胞取扱いは自動化されて
いるので、装置は、医薬品の製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）下
での細胞の処理に理想的に適している。他の利点は、中空ファイバ透析器（１モ
ジュールあたり１-２Ｘ１０¹⁰個の細胞）のコンパクトな構造を使用したスケー
ルアップの容易さ、並びに、成長因子およびアルブミンの消費の減少に関連した
可能性あるコスト節約を含む（下記参照）。

【００８６】 使用では、中空ファイバ１８は、抗体で内部がコーティングされている。例え
ば、ＣＤ３４⁺細胞を増殖するために、中空ファイバは、抗ＣＤ３４ｍｏＡｂで
内部がコーティングされている。単核細胞濃縮液からのＣＤ３４⁺細胞の捕獲後
に、細胞を、組織培養培地内のキャピラリー外空間の灌流により中空ファイバ内
で増殖する。

【００８７】 細胞を、ポート４からの液体を取り出し、次いでポート２により液体を注射し
、モジュールのヘッダーからの残留細胞を中空ファイバ中に洗浄することにより
、ポート３を介してモジュールに注射する。ポート２、３および４は、これらの
ポートに至るバルブを閉じることにより封をし、モジュールを３０分間回転し、
その間に細胞は中空ファイバに付着する。非結合細胞を、モジュール１０から、
低い剪断ストレス（１０-２５ダイン/ｃｍ²）でリザーバ３９に洗浄して出す。

【００８８】 細胞を、培地をモジュールを通して、キャピラリー外回路（ポート６および８
）を介してポンピングすることにより１から２週間培養する。流速は、約２ｍｌ
/時間/１０⁶個の細胞である。培地は、リザーバ３６からリザーバ３８に培地を
ポンピングし、培地再充填リザーバからの培地を補充することにより、一定の間
隔で交換する。培養期間中、リザーバ４３からのキャピラリー内培地を、はるか
に遅い速度（１ｍｌ/１０⁸個の細胞/ｍｌ未満）で注射することが必要であり得
る。

【００８９】 培養の終了時に、細胞を中空ファイバから収集バッグ（リザーバまたは細胞バ
ッグ３９）へと置換する速度で培地を注射することにより、細胞を収集する。酵
素、ＥＤＴＡまたは他の細胞放出剤が、依然として結合している細胞を脱着する
のに必要であり得る。

【００９０】 上記の装置は、移動末梢血を使用して試験し、他のＣＤ３４⁺細胞選択技術に
類似またはより優れた性能を有する（富化１２００倍、収率６１％）。

【００９１】 実施例３ 本発明に記載のバイオリアクターのさらなる実施形態を図６に示す。この実施
形態の典型的な成分を表４に示す。主な物理的必要条件は、システムが携帯性（
＜２０ｋｇ）およびサイズ（＜３００ｍｍの高さＸ＜４５０ｍｍの幅Ｘ＜４５０
ｍｍの深さ）であるものである。システムは、除去可能なプラスチックフード（
示していない）を有し、これは、ＵＶ光をフィルターするためにダークブラウン
であり、インキュベート領域を閉じる。

【００９２】 最初に図６を参照すると、円柱ハウジング（群）にセルロース中空ファイバキ
ャピラリーを含む１つ以上のモジュール１１０を使用して、細胞を分離および増
殖する。入口ポート８３を介して細胞リザーバ８１から添加した細胞に含まれる
ＣＤ３４⁺細胞を、セルロース結合タンパク質と共にセルロース基体に連結した
、固定モノクローナル抗体により、中空ファイバの内表面に捕獲される。細胞リ
ザーバと、モジュールの入口ポート８３の間に位置する、超音波バブル検出器８
４は、細胞のモジュールへの添加を補助する。細胞を、バブル検出器がガス界面
を感知するまでモジュールに取り出す。

【００９３】 富化細胞をインサイチュで放置し、キャピラリー外空間を、無細胞入口ポート
９０を介して、リザーバ１２７からの無細胞培養培地を用いて灌流した。同様に
、キャピラリー内入口８３を介してキャピラリー内培地リザーバ９１からの培地
のキャピラリー内流動が存在し得る。細胞を、液体剪断および細胞放出剤を必要
であれば使用して、増殖の１-３週間後に収集した。

【００９４】 セルロース膜の分子量カットオフは、１０，０００より大きい。それ故、培養
培地の低および高分子量成分の供給（および除去）を脱共役することが可能であ
る。アルブミンおよび成長因子の消費は、それらをキャピラリー外培地に含めな
いことにより最小限となり、これにより、全ての低分子量基体（グルコース、酸
素、アミノ酸等）が供給される。

【００９５】 ソレノイドピンチバルブ（１-８）は流動経路を制御する。２つの蠕動ポンプ
４２、４４は、キャピラリー外およびキャピラリー内流動をそれぞれ制御する。
表５は、この実施形態のバイオリアクターの典型的なバルブおよびポンプ状態を
示す。

【００９６】 バルブ８を介してキャピラリー外およびキャピラリー内回路の間に伝達があり
、よって、より高い流速を、細胞収集のためにキャピラリー内回路に供給し得る
。この伝達により、分解したキャピラリー外培地の廃棄物８２への除去、および
、培養プロセス中にならし培地の流れを中断することなく新しい培地で補充する
ことを容易にする。

【００９７】 バイオマスの酸素取込みを使用して、キャピラリー外灌流速度を制御した。バ
イオマスの酸素取込みを、上流（時計回りの循環）および下流（反時計回りの循
環）測定の比較により、ポーラログラフ電極の形で酸素センサー１２０を用いて
、キャピラリー外回路で測定した。酸素、グルコースおよびラクテートの代謝取
込みは、システムを使用して測定し、表３に示す。キャピラリー外流速は、これ
らの速度に追いつく必要があり、これらの成分の有意な枯渇または蓄積を防ぐ。

【００９８】

【表３】

【００９９】 重炭酸塩/ＨＥＰＥＳ緩衝系を使用してｐＨを制御し、インラインｐＨ電極１
２４を使用してｐＨをモニタリングした。

【０１００】 ガスを、サイラスチックチューブ１２７の長さを使用して（これを通してガス
を通す）キャピラリー外培地と交換した。使用したガス混合物は、二酸化炭素（
５％）、酸素（５-２０％）および窒素（７５-９０％）であった。

【０１０１】 バイオリアクターシステムを閉じ、ヒーターおよびファンエレメント（示して
いない）を使用して３７±０．１℃の温度で維持する。点線領域３００は、どの
成分が３７℃で維持するかを規定する。システム内の流体を１００ｍｍＨｇまで
加圧し、モジュールおよびチューブ内のガスバブルの形成を防ぐことが必要であ
る。

【０１０２】 モジュールそれ自体は、２００ｃｍ²（小スケール）または１．４ｃｍ²（大ス
ケール）の表面積を有する。繊維直径は２００μｍであり、モジュール長は３０
ｃｍである。

【０１０３】

【表４】

【０１０４】

【表５】

【０１０５】 実施例４ 灌流バイオリアクターを使用したＫＧ１ａ細胞の増殖 中空ファイバセルロースミニ透析器（キャピラリー内容量＝１ｍｌ）を使用し
て、図５に示したバイオリアクター系を使用してＫＧ１ａ細胞を増殖した。培地
を、モジュールのキャピラリー外側で循環し、その間にキャピラリー内の流動は
なかった。

【０１０６】 目的 １．腫瘍細胞系ＫＧ１ａ細胞を使用したシステムの「ベースライン」性能を決
定する ２．グルコースおよび酸素取込み、およびラクテート産生を測定する。 ３．フラスコ組織培養対照と、増殖速度を比較する。

【０１０７】 方法 表６は、このシリーズの実験のバイオリアクター作動パラメータを示す。全て
のバイオリアクター操作は、同じ酸素緊張度ｐＣＯ₂および培地添加物（ウシ胎
児血清）を有した。操作間で異なっている変数は、キャピラリー外の灌流速度お
よび接種した細胞数であった。

【０１０８】

【表６】

【０１０９】 結果 図７は、バイオリアクター操作中のＥＣ培地中のグルコースおよびラクテート
レベルを示す。ＥＣ培地は、２月２９日に交換し、よって、グルコースは枯渇し
、ラクテートは増加する。ＫＧ１ａ細胞は、増殖の６日後に収集し（＞９５％生
存度）、６．９のみ増加した（平均倍加時間＝５２時間）。

【０１１０】 操作５で、中空ファイバモジュールの出口で、ＥＣ酸素濃度およびｐＨを測定
できた。図８は、これらの測定並びにＥＣ流速を示す。

【０１１１】 酸素ランプはダウンし、ＥＣ灌流速度の増加による増加であり得る。ｐＨは、
２および３日目（５月４日-５日）で減少し、培地は５月６日に交換した。細胞
を収集した後、ＥＣ酸素濃度は、段階的に増加した。なぜなら、酸素を消費する
バイオマスがもはや存在しないからである。ＫＧ１ａ細胞は、増殖の４日後に収
集し（＞９５％の生存度）、６．４だけ増加した（平均倍加時間＝３５時間）。

【０１１２】 操作８の結果を表７に要約する。この実験では、正確な増殖速度を、１０μの
ポリスチレンビーズを有するモジュールを、細胞で接種し、ビーズと細胞の比を
フローサイトメトリーにより増殖の前後で決定することにより推定した。この場
合、細胞は、操作５（倍化時間＝３５時間）および静止組織培養対照に類似した
速度で増殖した。

【０１１３】

【表７】

【０１１４】 結論 灌流バイオリアクターは、静止組織培養フラスコの少なくとも９０倍高い濃度
で、ＫＧ１ａ細胞を増殖できる（９０Ｘ１０⁶細胞/ｍｌ対１０⁶細胞/ｍｌ）。達
成された増殖速度は、静止フラスコ培養液に類似し、キャピラリー外灌流速度に
依存するようである。灌流速度が低い場合、酸素枯渇は、バイオリアクターの出
口近くで起こり得る。逆に、操作４により、高い灌流速度は、ＫＧ１ａ細胞の増
殖に有害であり得ることが実証された。なぜなら、ＫＧ１ａ細胞は、「低い」細
胞密度および比較的高い灌流速度では同様に増殖しないからである。増殖速度は
、キャピラリー外灌流速度を低くすることにより向上した（操作８＝０．２ｍｌ
/分対操作４＝０．９ｍｌ/分）。

【０１１５】 本明細書を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」なる語または「含む（ｃｏ
ｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる」などの変形は、記載のエレメント、整
数または段階、またはエレメント、整数または段階の群を包含することを意味す
ると理解されるが、任意の他のエレメント、整数または段階、またはエレメント
、整数、または段階の群を排除するものではない。

【０１１６】 多くの変形および/または修飾を、広く記載したような本発明の精神または範
囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示したように本発明に施し得る。本
発明の実施形態は、それ故、全ての点において、説明的であり限定的ではないと
考える。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＣＤ３４⁺細胞の増殖に対する、細胞付着の効果を示したグラフであ
る（平均±ＳＥＭ）。

【図２】 図２は、キャピラリー内の成長因子の濃度の効果を示したグラフである（平均
±ＳＥＭ）**ｐ＜０．００５。

【図３】 図３は、キャピラリー内の成長因子の効果を示した、１つの中空ファイバの顕
微写真である。

【図４】 図４は、キャプラリー外培地でのインスリン、ＢＳＡおよびデキストランの影
響を示したグラフである（平均±ＳＥＭ）*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。

【図５】 図５は、本発明に従って、バイオリアクターの１つの実施形態を図示した図解
である。

【図６】 図６は、本発明に従って、バイオリアクターのさらなる実施形態を図示した図
解である。

【図７】 図７は、実施例４に記載のバイオリアクター操作中のＥＣ培地中のグルコース
およびラクテートレベルを示したグラフである。

【図８】 図８は、実施例４に記載したバイオリアクター操作中の、ＥＣ酸素濃度、中空
ファイバモジュールの出口のｐＨ、および、ＥＣ流速を示したグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (70)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １以上のタイプの細胞を培養する方法であって、 -１の側面（細胞側）に細胞を有する半透過性基体を準備する工程であって、当
   該半透過性基体は、栄養素、制御因子、代謝産物からなる群より選択される少な
   くとも１の物質に対して透過性であるが、細胞の、増殖、分化、及び/又は遺伝
   的修飾に必要な少なくとも１の蛋白質に対しては実質的に不透過性である工程；
   -当該細胞を、増殖、分化、及び/又は遺伝的修飾に必要な少なくとも１の蛋白質
   、並びに任意に、細胞の増殖に必要な少なくとも１の物質を含む培地に接触させ
   る工程；そして -当該半透過性基体の無細胞側に、細胞の増殖に必要な少なくとも１の物質を準
   備する工程； を含む方法。
2. 【請求項２】 前記の、細胞の増殖に必要な少なくとも１の物質が、前記半
   透過性膜の無細胞側の表面の少なくとも一部の上に環流する培地中に含まれてい
   る、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記の無細胞側の培地が、前記半透過性基体へ再循環される
   、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記の無細胞側の培地の環流速度が、細胞のバイオマスに応
   答性のものである、請求項２又は３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記のバイオマスが、酸素の取込み、グルコースの取込み、
   及び/又は細胞培地中へのラクテートの産出により測定される、請求項４に記載
   の方法。
6. 【請求項６】 前記の環流速度が、酸素の取込みにより測定される、請求項
   ５に記載の方法。
7. 【請求項７】 環流速度を制御して、無細胞空間における、細胞の増殖に必
   要な少なくとも１の物質及び/又は老廃物の、顕著な枯渇又は蓄積を防止する、
   請求項４乃至６の何れか一項に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記の無細胞培地が、予め設定した速度で交換される、請求
   項３乃至７の何れか一項に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記の予め設定した速度が、約２ｍｌ/ｈ/１０⁶ｍｌ以下で
   ある、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記の半透過性基体が、少なくとも約１０，０００の分子
    量を有する分子に対して不透過性である、請求項１乃至９の何れか一項に記載の
    方法。
11. 【請求項１１】 前記の半透過性基体が、少なくとも８，０００の分子量を
    有する分子に対して不透過性である、請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記の半透過性基体が、５０００の分子量を有する分子に
    対して不透過性である、請求項１０に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記の半透過性基体が、少なくとも１の中空ファイバの形
    態をとる、請求項１乃至１２の何れか一項に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記の中空ファイバが、約１００乃至４００ミクロンの範
    囲の半径、及び約６乃至５０μｍの範囲の壁厚を有する、請求項１３に記載の方
    法。
15. 【請求項１５】 前記の中空ファイバが、セルロース、セルロースアセテー
    ト、及びポリスルホンからなる群より選択される半透過性物質から形成される、
    請求項１２乃至１４の何れか一項に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記の中空ファイバが、セルロースより形成される、請求
    項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記の細胞が、少なくとも１のリガンドにより、前記の半
    透過性基体に結合している、請求項１乃至１６の何れか一項に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記のリガンドが、抗体、レクチン、成長因子、及び受容
    体からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記のリガンドが抗体である、請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記のリガンドがモノクローナル抗体である、請求項１９
    に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記の細胞が、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、及び微生
    物からなる群より選択される、請求項１乃至２０の何れか一項に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記の細胞がほ乳類の細胞である、請求項１乃至２１の何
    れか一項に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記の細胞が、造血細胞（ＣＤ３４⁺）、Ｔ細胞、Ｂ細胞
    、樹状細胞、肝細胞、骨髄細胞、膵島細胞、胚性幹細胞、及び遺伝的に修飾され
    た細胞からなる群より選択される、請求項１乃至２２の何れか一項二記載の方法
    。
24. 【請求項２４】 前記の細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
    胞、又はハイブリドーマである、請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記の細胞が共培養系中にある、請求項１乃至２４の何れ
    か一項に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記の、細胞の増殖、分化、及び/又は遺伝的修飾に必要
    な少なくとも１の蛋白質が、成長因子、コロニー刺激因子、サイトカイン、サイ
    トカイン受容体、ケモカイン、アルブミン、トランスフェリン、低密度リポ蛋白
    質、及び遺伝子トラスファーベクタからなる群より選択される、請求項１乃至２
    ５の何れか一項に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記の、細胞の増殖、分化、及び/又は遺伝的修飾に必要
    な少なくとも１の蛋白質が、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＳＣＦ、ＩＬ-６、Ｆ
    ｌｔ-３リガンド、インスリン、トロンボポイエチン、エリスロポイエチン、Ｅ
    ＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＮＧＦ、及びＦＧＦからなる群より選択さ
    れる少なくとも１の成長因子である、請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記の、細胞の増殖、分化、及び/又は遺伝的修飾に必要
    な少なくとも１の蛋白質が、ＧＣＳＦ又はＧＭＣＳＦである、請求項２６に記載
    の方法。
29. 【請求項２９】 前記のケモカインが、ＭＩＰ１α、ＳＤＦ-１、及びイン
    スリン様成長因子からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記の遺伝子トランスファーベクタが、非複製型の、レト
    ロウイルスベクタ及びアデノ随伴ウイルスベクタ、リポ複合体（lipoplexes）、
    並びにファージベクタからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記の、増殖に必要な少なくとも１の物質が、グルコース
    、アミノ酸、ビタミン、及びステロイドホルモンからなる群より選択される、請
    求項１乃至３０の何れか一項に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記の細胞が、所望のタイプの細胞を含むサンプルより分
    離された、当該所望の細胞である、請求項１乃至３１の何れか一項に記載の方法
    。
33. 【請求項３３】 前記の所望の細胞を含むサンプルを、当該所望のタイプの
    細胞と反応性のリガンドとともに準備された半透過性基体が含まれる装置へ導入
    し、当該所望のタイプの細胞を、リガンドへ沈着して結合するようにしてインキ
    ュベーションし、当該半透過性基体を、リガンドへ結合していない細胞が除去さ
    れるように処理し、任意に、当該半透過性基体を、当該リガンドへ結合していな
    い細胞が除去されるようにして処理することにより、当該所望のタイプの細胞を
    、当該サンプルより除去する、請求項３２に記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記の細胞分離及び細胞培養が、単一のバイオリアクター
    中で実行される、請求項３２又は３３の何れか一項に記載の方法。
35. 【請求項３５】 細胞拡大（expansion of the cell）用に使用する、請求
    項１乃至３４の何れか一項に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記の細胞が、好中球及び血小板前駆細胞を産生するため
    に使用される、請求項３５に記載の方法。
37. 【請求項３７】 前記の好中球及び血小板前駆細胞が、造血幹細胞（ＣＤ３
    ４⁺）を造血増殖因子で刺激して、増殖分化させることにより産生する、請求項
    ３６に記載の方法。
38. 【請求項３８】 前記の細胞が、共培養系中で造血細胞を産生するために使
    用される、請求項３６に記載の方法。
39. 【請求項３９】 骨髄ストローマ細胞層が、造血幹細胞の増殖を支持する前
    記の中空ファイバ内に確立される、請求項３８に記載の方法。
40. 【請求項４０】 細胞傷害性T細胞が、Ｔ細胞受容体の関与及びクロスリン
    クにより生じる、請求項３５に記載の方法。
41. 【請求項４１】 前記の細胞用培地が、抗原提示細胞上に見られるＢ７-１
    及びＢ７-２分子、並びにＩＬ-２を含む、請求項４０に記載の方法。
42. 【請求項４２】 前記の細胞が、共培養系中の抗原特異的Ｔ細胞クローンで
    ある、請求項３５に記載の方法。
43. 【請求項４３】 前記の共培養系が、樹状細胞、単球、及び線維芽細胞から
    なる群より選択される細胞のモノレイヤーを使用する、請求項４２に記載の方法
    。
44. 【請求項４４】 前記の細胞が、細胞用培地中において、少なくとも１のレ
    トロウイルス遺伝子トランスファーベクタにより形質導入された造血細胞又は免
    疫細胞である、請求項３５に記載の方法。
45. 【請求項４５】 細胞の増殖及び成長用のバイオリアクターであって、 -内部に細胞を保持するための複数の中空ファイバであって、栄養素、制御因子
    、及び代謝産物からなる群より選択される少なくとも１の物質に対しては透過性
    である半透過性物質より形成され、増殖、分化、及び/又は遺伝的修飾に必要な
    少なくとも１の蛋白質に対しては実質的に不透過性であり、無細胞空間を規定す
    るハウジング内に配置された中空ファイバ； -ハウジング注入手段及びハウジング排出手段であって、前記の無細胞空間と連
    結していて、無細胞の流路を規定するもの； -液流回路であって、前記のハウジング注入手段とハウジング排出手段とを連結
    するもの；そして -前記の液流回路と連結した循環手段であって、培地を前記の無細胞空間を通し
    て循環させるものであり、当該循環手段が、前記の細胞のバイオマスに応答する
    もの； を含むバイオリアクター。
46. 【請求項４６】 前記の中空ファイバが、細胞、及び細胞の増殖、分化、及
    び/又は遺伝的修飾に必要な少なくとも１の蛋白質を、その内腔内に含む、請求
    項４５に記載のバイオリアクター。
47. 【請求項４７】 前記の無細胞空間が、細胞の増殖に必要な少なくとも１の
    物質が含まれる培地を含む、請求項４５又は４６に記載のバイオリアクター。
48. 【請求項４８】 前記の少なくとも１の物質が、グルコース、アミノ酸、ビ
    タミン、ステロイドホルモン、及びこれらの二つ以上の混合物からなる群より選
    択される、請求項４７に記載のバイオリアクター。
49. 【請求項４９】 前記の中空ファイバが、セルロース、セルロースアセテー
    ト、及びポリスルホンからなる群より選択される半透過性物質から形成される、
    請求項４５乃至４８の何れか一項に記載のバイオリアクター。
50. 【請求項５０】 前記の半透過性物質が、セルロースである、請求項４９に
    記載のバイオリアクター。
51. 【請求項５１】 前記の中空ファイバが、約１００乃至４００μｍの直径、
    及び約６乃至５０μｍの範囲の壁厚を有する、請求項５０に記載のバイオリアク
    ター。
52. 【請求項５２】 前記の循環手段が、少なくとも１のポンプである、請求項
    ４５乃至５１の何れか一項に記載のバイオリアクター。
53. 【請求項５３】 前記の細胞のバイオマスが、酸素の取込み、代謝産物の取
    込み、及び/又はラクテートの産出の測定手段で決定される、請求項４５乃至５
    ２の何れか一項に記載のバイオリアクター。
54. 【請求項５４】 前記のバイオマス測定手段が、無細胞培地中における酸素
    の取込みを測定する、請求項５３に記載のバイオリアクター。
55. 【請求項５５】 無細胞培地中の酸素及び二酸化炭素の含有量を制御するた
    めのガス制御手段を更に含む、請求項４５乃至５４の何れか一項に記載のバイオ
    リアクター。
56. 【請求項５６】 前記のガス制御手段がガス交換手段である、請求項５５に
    記載のバイオリアクター。
57. 【請求項５７】 前記のガス交換手段がシリコーン膜を含む、請求項５６に
    記載のバイオリアクター。
58. 【請求項５８】 前記のガス交換手段が、前記の液流回路と流動的に連結さ
    れていて、且つガスチャンバー内を通っているシリコーンチューブである、請求
    項５７に記載のバイオリアクター。
59. 【請求項５９】 前記の液流回路内を流れる培地の温度を制御する手段を更
    に含む、請求項４５乃至５９の何れか一項に記載のバイオリアクター。
60. 【請求項６０】 前記の液流回路が、無細胞培地を無細胞空間へと再循環さ
    せる、請求項４５乃至５９の何れか一項に記載のバイオリアクター。
61. 【請求項６１】 前記の無細胞培地を、予め設定した速度で新鮮な培地と交
    換するための手段を更に含む、請求項４５乃至６０の何れか一項に記載のバイト
    リアクター。
62. 【請求項６２】 前記の中空ファイバが、少なくとも１のリガンドを内部に
    含んで提供されている、請求項４５乃至６１の何れか一項に記載のバイオリアク
    ター。
63. 【請求項６３】 前記のリガンドが、抗体、レクチン、成長因子、及び受容
    体からなる群より選択される、請求項６２に記載のバイオリアクター。
64. 【請求項６４】 前記のリガンドが抗体である、請求項６３に記載のバイオ
    リアクター。
65. 【請求項６５】 前記のリガンドがモノクローナル抗体である、請求項６４
    に記載のバイオリアクター。
66. 【請求項６６】 前記の細胞が、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、及び微生
    物からなる群より選択される、請求項４５乃至６５の何れか一項に記載のバイオ
    リアクター。
67. 【請求項６７】 前記の細胞がほ乳類細胞である、請求項６６に記載のバイ
    オリアクター。
68. 【請求項６８】 前記の細胞が、造血細胞（ＣＤ３４⁺）、Ｔ細胞、Ｂ細胞
    、樹状細胞、肝細胞、骨髄細胞、膵島細胞、胚性幹細胞、又は遺伝的に修飾され
    た細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びハイブリドー
    マからなる群より選択される、請求項６７に記載のバイオリアクター。
69. 【請求項６９】 前記のバイオリアクターが、細胞の分離及び細胞の培養の
    両方を行うことができる、請求項４５乃至６８の何れか一項に記載のバイオリア
    クター。
70. 【請求項７０】 持ち運び可能な、請求項４５乃至６９の何れか一項に記載
    のバイオリアクター。