JP2013176377A - 細胞増殖システムおよび使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】接着細胞ならびに非接着細胞の生育および種々の細胞の共培養のために使用できる、細胞増殖システムおよび使用方法の提供。
【解決手段】細胞増殖システムは、中空繊維細胞成長チャンバー(24)、ならびに第1の液体循環経路(12)のおよび第2の液体循環経路(14)(キャピラリー内ループおよびキャピラリー外ループ)を一般に含み、これらのループは、それぞれ中空繊維の内部および中空繊維の外側に連結される。液体流路の末端は前記細胞成長チャンバーの対向する末端に流動的に連結される着脱可能流れ回路。
【選択図】図1A
【解決手段】細胞増殖システムは、中空繊維細胞成長チャンバー(24)、ならびに第1の液体循環経路(12)のおよび第2の液体循環経路(14)(キャピラリー内ループおよびキャピラリー外ループ)を一般に含み、これらのループは、それぞれ中空繊維の内部および中空繊維の外側に連結される。液体流路の末端は前記細胞成長チャンバーの対向する末端に流動的に連結される着脱可能流れ回路。
【選択図】図1A
Description
本願は、細胞成長チャンバーに関連する細胞増殖システム(CES)およびその使用方法に関する。
本願は、米国法典第35巻第119条(e)の下、米国仮出願第60/892,908号(2007年3月5日出願);第60/892,966号(2007年3月5日出願);第60/892,911号(2007年3月5日出願);第60/892,977号(2007年3月5日出願);第60/911,393号(2007年4月12日出願);第60/911,594号(2007年4月13日出願);および第60/971,494号(2007年9月11日出願)の利益を請求し、これらの出願は、その全体が本願に援用される。
CESは、細胞を増殖させ、生育させおよび分化させるために使用される。いくつかの既知の細胞増殖システムが当該分野で既知である。例えば、米国特許第5,162,225号および米国特許第6,001,585号は、細胞増殖のために設計された細胞増殖システムについて一般的に記載している。
様々な潜在的な治療および療法における、幹細胞の可能性は特別な注目を得ている。ドナー細胞から増殖した幹細胞は、損傷を受けたまたは欠損のある組織を修復または交換するために使用でき、且つ、広範囲の疾病のための広い臨床応用を有する。再生医療分野における近年の前進は、幹細胞が、高い増殖速度および自己再生能力、非分化の状態の維持といったユニークな特性および特定の条件下で特殊化した細胞に分化する能力を有することを実証したことである。
細胞増殖システムは、幹細胞並びにその他の種の細胞を生育するために使用することができる。接着細胞ならびに非接着細胞の生育および様々な細胞種の共培養のために使用できる細胞増殖システムに対する必要性が存在する。柔軟なシステムにおいて、細胞に十分な栄養を供給し、代謝物質を除去し並びに細胞増殖の助けになる生理化学的環境を供給する能力は、継続する課題である。本願の開示は、これらおよびその他の必要性に取り組む。
一側面において、本願開示は、少なくとも対向する末端を備える第1の液体流路を有する第1の循環経路を含むCESに関する。第1の液体流路の対向する末端は、細胞成長チャンバーに配列された多くの中空繊維の対向する末端と流動的に連結されており、液体は、第1の循環経路を通って循環して流れることができる。第1の流れ制御器は、第1の液体流路に実施可能な状態で繋がっている。
細胞増殖システムはさらに第2の循環経路を含む。第2の循環経路は、少なくとも対向する末端を備える第2の液体流路を含む。第2の液体流路の第1および第2の末端は、細胞成長チャンバーと流動的に連結されている。第2の液体流路の一部は、細胞成長チャンバーにおいて、1以上の膜の対向する面と流動的に接触している。第2の液体制御器は、第2の閉回路経路に実施可能な状態で繋がっている。
細胞増殖システムは、さらに、第1の循環経路と流動的に連結され且つ第3の液体制御器に実施可能な状態でつながれた第1の液体補給ラインを含む。細胞増殖システムは、さらに、第1のまたは第2の循環経路と流動的に連結されている第1の液体排出路を含む。様々な実施態様において、第1の液体注入路または第1の液体排出路は、第3の液体流れ制御器に実施可能な状態で連結されている。
様々な実施態様において、CESは、第1の液体循環経路における液体培地が第2の液体流路における液体培地の方向と反対の方向に流れるように(「向流」)構成することができる。あるいは、CESは、第1の液体循環経路における液体培地が第2の液体流路における液体培地と同じ方向に流れるように(「並流」)構成することができる。
様々な付加的な側面において、CESは、CESを大気に暴露することなく培地を第1のまたは第2の液体循環経路に添加する構成にできる。
その他の側面において、CESはさらに酸素付加器を含む。特定の変形例において、酸素付加器は、酸素付加器ハウジングにおいて配列された、酸素付加器注入および排出口を含む。酸素付加器は、第1の循環経路または第2の循環経路の一部でありえる。酸素付加器は、これにより、酸素および/またはその他のガスを第1のまたは第2の液体循環経路に供給する。
その他の様々な側面において、本願開示は、細胞増殖システムにおける細胞を増殖する方法に関する。一般に、細胞はCESの第1の液体流路に添加される。細胞は、その後、増殖した細胞の集団を生産するのに適した条件下で培養される。その後、この増殖した集団を収集することができる。
(発明の詳細な説明)
本願の開示は、一般に、細胞増殖システムおよびその使用方法に関する。
本願の開示は、一般に、細胞増殖システムおよびその使用方法に関する。
細胞増殖システム(CES)の典型的な概略図は、図1Aに示される。CES10は、第1の液体循環経路12および第2の液体循環経路14を含む。第1の液体流路16は、中空繊維細胞成長チャンバー24(ここでは「バイオリアクター」とも言及される)と流動的に連結されている少なくとも対向する末端18および20を有する。特に、対向する末端18は、細胞成長チャンバー24の第1の注入22と流動的に連結されており、対向する末端20は、細胞成長チャンバー24の第1の出口28と流動的に連結されている。第1の循環経路12における液体は、細胞成長チャンバー24に配置された中空繊維膜50の中空繊維の内部を通って流れる。(細胞成長チャンバーおよび中空繊維膜は、以下に詳述する)。さらに、第1の液体流れ制御器30は、実施可能な状態で第1の液体流路16に接続され、第1の循環経路12における液体の流れを制御する。
第2の液体循環経路14は、第2の液体流路34、細胞成長チャンバー24および第2の液体流れ制御器3032を含む。第2の液体流路34は、少なくとも対向する末端36および38を有する。第2の液体流路34の対向する末端36および38は、それぞれ細胞成長チャンバー24の注入口40および排出口42に流動的に連結されている。細胞成長チャンバー24を通って流れる液体は、細胞成長チャンバー24中の中空繊維膜50の外部に接している。第2の液体循環経路14は、第2の液体流れ制御器32に実施可能な状態で接続される。
第1のおよび第2の液体循環経路12および14は、したがって、中空繊維膜50によって細胞成長チャンバー24内で分離されている。第1の液体循環経路12における液体は、細胞成長チャンバーにおける中空繊維のキャピラリー内(「IC」)の空間を流れる。第1の循環経路12は、したがって「ICループ」と言及される。第2の循環経路14における液体は、細胞成長チャンバーにおけるキャピラリー外(「EC」)の空間を流れる。第2の液体循環経路14は、したがって「ECループ」と言及される。第1の液体循環経路12における液体は、第2の液体循環経路14における液体の流れに対して、並流または向流の方向に流れることができる。
液体注入路44は、第1の液体循環経路12と流動的に連結されている。液体注入路44は第1の液体循環経路12へと液体を流し、一方、液体排出路46は液体をCES10から排出させる。第3の液体流れ制御器48は、液体注入路44と実施可能な状態で連結されている。あるいは、第3の液体流れ制御器48は、第1の排出路46に連結し得る。
ここに使用される液体流れ制御器は、ポンプ、バルブ、クランプまたはそれらの組み合わせでありえる。複数のポンプ、バルブおよびクランプは、任意の組み合わせで準備することができる。様々な実施態様において、液体流れ制御器は、蠕動ポンプであり、または、蠕動ポンプを含む。更なる実施態様において、液体循環経路、注入口および排出口は、任意の材料の管材料で構築することができる。
様々な構成要素は、ここにおいて、「実施可能な状態で連結されている」と言及される。ここに使用される「実施可能な状態で連結されている」とは、実施可能な様式で相互につながれた構成要素を指し、これは、構成要素が直接つながれた実施態様および付加的な構成要素が、2つのつながった構成要素の間に置かれる実施態様を包含する。「実施可能な状態で連結されている」構成要素は、「流動的に連結されている」状態でありえる。「流動的に連結されている」とは、構成要素が、それらの間を液体が輸送され得るように相互につながっていることを指す。「流動的に連結されている」とは、付加的な構成要素が2つの流動的に連結されている構成要素の間に配列されている実施態様並びに直接接続される構成要素を包含する。流動的に連結されている構成要素は、液体と接触しないがシステムを操作するその他の構成要素と接触する構成要素(例えば、チューブの外面を圧搾することでフレキシブルチューブを通して液体を送る蠕動ポンプ)を含むことができる。
一般に、緩衝液、タンパク質含有液および細胞含有液を含む、任意の種類の液体が、様々な循環経路、注入路および排出路を通って流れることができる。ここに使用される「液体」、「培地」および「液体培地」は互換的に使用できる。
細胞成長チャンバー
細胞増殖システムの細胞成長チャンバーは、一般に、第1のおよび第2の液体循環経路を分離する、多くの半浸透性の中空繊維で構成された中空繊維膜を含む。
細胞増殖システムの細胞成長チャンバーは、一般に、第1のおよび第2の液体循環経路を分離する、多くの半浸透性の中空繊維で構成された中空繊維膜を含む。
典型的な細胞成長チャンバーを図2に示す。当該図は、中空繊維細胞成長チャンバー200の断面側面図である。細胞成長チャンバー200は、細胞成長チャンバーハウジング202によって束ねられている。細胞成長チャンバーハウジング202はさらに、4つの口またはポート:注入口204、排出口206、注入口208および排出口210を含む。
第1の循環経路における液体は、注入口204を通って細胞成長チャンバー200に入り、多数の中空繊維のキャピラリー内側(様々な実施態様において、中空繊維膜のキャピラリー内(「IC」)側または「IC空間」と称される)へ入り且つ通過し、排出口206から細胞成長チャンバー200を出る。「中空繊維」、「中空繊維キャピラリー」および「キャピラリー」という用語は互換的に使用される。多数の中空繊維は総体として「膜」と言及される。第2の循環経路における液体は、注入口208を通って細胞成長チャンバーに入り、中空繊維の外側(膜の「EC側」または「EC空間」と言及される)に接触し、排出口206210を通って出口細胞成長チャンバー200から出る。細胞は、第1の循環経路または第2の循環経路内に包含させることができ、膜のIC側またはEC側のいずれかに存在し得る。
細胞成長チャンバーハウジング202は円筒形のものとして描かれているものの、それは当該分野で既知のその他の形とすることもできる。細胞成長チャンバーハウジング202は、任意の種類の生物学的適合性高分子材料で作ることができる。様々なその他の細胞成長チャンバーハウジングは、形およびサイズにおいて異なってよい。
当業者であれば、細胞成長チャンバーという用語は、CES中で生育または増殖される全ての細胞が、細胞成長チャンバーにおいて生育することを示唆しないということを認識できるだろう。多くの実施態様において、接着細胞は成長チャンバーに配置された膜に付着することができ、または、連結された管材料内で生育してもよい。非接着細胞(「懸濁細胞」とも言及される)も生育できる。細胞は、第1のまたは第2の液体循環経路内のその他の領域において生育できる。
例えば、中空繊維212の末端は、接続材料(ここにおいて「ポッティング」または「ポッティング材料」とも言及される)によって細胞成長チャンバーの側面に収める(be potted)ことができる。ポッティングは、中空繊維の中への培地および細胞の流れを妨害せず、IC注入口を通って細胞成長チャンバーに流れる液体が中空繊維にのみ流れる限り、中空繊維212を束ねるのに適した任意の材料であり得る。典型的なポッティング材料は、ポリウレタンまたはその他の適した結合または粘着性の構成要素を含むが、これらに限定されない。様々な実施態様において、中空繊維およびポッティングは、それぞれの末端において中空繊維の中心軸に垂直にカットし、IC側面へおよびIC側面から液体を流してよい。末端キャップ214および216は、細胞成長チャンバーの末端に配置される。
注入口208を介して細胞成長チャンバー200に入る液体は、中空繊維の外側に接する。中空繊維細胞成長チャンバーのこの部分は、「キャピラリー外(EC)空間」と言及される。小さな分子(例えば水、酸素、乳酸塩など)は、中空繊維の内部からEC空間へまたはEC空間からIC空間へ、中空繊維を通って拡散することができる。成長因子のような大きな分子量の分子は、典型的に、大きすぎるため中空繊維を通り抜けることができず、中空繊維のIC空間に残る。細胞がIC空間で生育する実施態様において、EC空間は、細胞に栄養素を供給する培地の貯蔵器として使用され、かつ細胞の新陳代謝の副産物を除去する。培地は必要に応じて交換されてよい。培地は、また、必要に応じて酸素付加器を通って循環し、ガスが交換されてよい。
様々な実施態様において、細胞は、シリンジの使用を含む様々な方法の何れによっても中空繊維に充填することができる。細胞は、また、細胞成長チャンバーと流動的に連結されているバッグといった液体容器から細胞成長チャンバーへ導入してよい。
中空繊維は、繊維のキャピラリー内空間(すなわち中空繊維内腔の内部)で細胞が増殖することを可能にする構成とされる。中空繊維は、実質的に中空繊維内腔を通る培地の流れを妨害することなく、内腔にて細胞接着ができる程度に十分大きい。様々な実施態様において、中空繊維の内径は、10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000、1000、900、800、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150または100ミクロン以上であり得る。同様に、中空繊維の外側の直径は、10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000、1000、900、800、700、650、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150または100ミクロン以下であり得る。中空繊維の肉厚は、小さな分子の拡散を可能にするために十分な程度である。
中空繊維が細胞成長チャンバーの注入および排出口と流動的に連結されている限り、任意の数の中空繊維を細胞成長チャンバー内で使用することができる。様々な実施態様において、細胞成長チャンバーは、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000または12000以上の多数の中空繊維を含むことができる。その他の実施態様において、細胞成長チャンバーは、12000、11000、10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000または2000以下の多数の中空繊維を含むことができる。その他の様々な実施態様において、中空繊維の長さは、100、200、300、400、500、600、700、800または900ミリメートル以上であり得る。特定の好ましい実施態様において、細胞成長チャンバーは、平均長295mm、平均内径215ミクロンおよび平均外径315ミクロンの約9000の中空繊維を含む。
中空繊維は、細胞成長チャンバー注入口から細胞成長チャンバー排出口まで液体を輸送することが可能な繊維の形成に十分なサイズを形成できる何れかの材料で構成することができる。様々な実施態様において、中空繊維は、接着幹細胞(例えばMSC)といった特定の種の細胞に結合可能なプラスチック製接着材料で構成することができる。様々なその他の実施態様において、中空繊維は、接着表面を形成するために、フィブロネクチンといった化合物で処理することができる。
特定の実施態様において、中空繊維は、半浸透性の生物学的適合性高分子材料で作られてよい。使用可能なそのような高分子材料の1つは、ポリアミド、ポリアリールエーテルスルホンおよびポリビニルピロリドンの混合物(ここにおいて「PA/PAES/PVP」と言及される)である。半透膜は、EC空間とIC空間との間における膜を介した、栄養素、廃棄物および溶解ガスの移動を可能にする。様々な実施態様において、中空繊維膜の分子移動の特徴は、成長因子、サイトカイニン等といった細胞増殖に必要な高価な試薬の中空繊維からの喪失を最小化し、一方で、代謝廃棄生成物が、膜を通って中空繊維内腔側へ拡散して除去されることを可能にするよう選択される。
特定の変形例において、それぞれのPA/PAES/PVP中空繊維の1つの外層は、定義された表面の粗さを有する均質で孔の開いた構造によって特徴付けられる。孔の口は0.5−3umのサイズの範囲であり、繊維の外表面上の孔の数は、1mm2あたり10,000から150,000の範囲である。この外層の厚さは約1〜10umである。それぞれの中空繊維における次の層は、スポンジ構造の形態を有した第2の層であり、本発明の好ましい実施態様において、約1〜15umの厚さである。この第2の層は、外層の支持として役立つ。第2の層の次の第3の層は、フィンガー様構造の形態を有する。この第3の層は、機械的安定性および高い空隙容量を提供し、これは、膜を通した分子の輸送に対する非常に低い抵抗性を膜に与える。使用の際、フィンガー様空隙は、液体で満たされ、液体は、より低い空隙容量を有するスポンジ充填構造のマトリックスよりも、拡散および対流のためのより低い抵抗性を与える。この第3の層は、20〜60umの厚さを有する。
更なる実施態様において、中空繊維膜は、65−95重量%の少なくとも1つの疎水性
ポリマーおよび5−35重量%の少なくとも1つの親水性ポリマーを含み得る。疎水性ポリマーは、ポリアミド(PA)、ポリアラミド(PAA)、ポリアリールエーテルスルホン(PAES)、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリスルホン(PSU)、ポリアリールスルホン(PASU)、ポリカーボネート(PC)、ポリエーテル、ポリウレタン(PUR)、ポリエーテルイミドおよび上記のポリマーのうちの任意の共重合体混合物、例えばポリエーテルスルホンまたはポリアリールエーテルスルホンおよびポリアミドの混合物から成る群から選択してよい。付加的な実施態様において、親水性ポリマーは、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリグリコールモノエステル、水可溶性セルロース化合物誘導体、ポリソルベートおよびポリエチレン−ポリプロピレン酸化物共重合体から成る群から選択してよい。
ポリマーおよび5−35重量%の少なくとも1つの親水性ポリマーを含み得る。疎水性ポリマーは、ポリアミド(PA)、ポリアラミド(PAA)、ポリアリールエーテルスルホン(PAES)、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリスルホン(PSU)、ポリアリールスルホン(PASU)、ポリカーボネート(PC)、ポリエーテル、ポリウレタン(PUR)、ポリエーテルイミドおよび上記のポリマーのうちの任意の共重合体混合物、例えばポリエーテルスルホンまたはポリアリールエーテルスルホンおよびポリアミドの混合物から成る群から選択してよい。付加的な実施態様において、親水性ポリマーは、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリグリコールモノエステル、水可溶性セルロース化合物誘導体、ポリソルベートおよびポリエチレン−ポリプロピレン酸化物共重合体から成る群から選択してよい。
細胞成長チャンバーにて増殖する細胞の種に応じて、重合体繊維は、細胞増殖および/または膜への細胞の接着の増強するために、フィブロネクチンといった物質で処理してよい。
細胞増殖システム
図2に示されるような細胞成長チャンバーは、細胞増殖システムのその他の構成要素と実施可能な状態で連結されている。
図2に示されるような細胞成長チャンバーは、細胞増殖システムのその他の構成要素と実施可能な状態で連結されている。
図1Bは、より詳細な細胞増殖システム100を示す。CES100は、第1の液体循環経路126(「キャピラリー内(IC)ループ」とも言及される」)および第2の液体循環経路166を含む。液体の流れの経路は管材料および管材料コンジット(Tygothane, St. Globain)から構築され、バルブ、ポンプ(TRIMA, Gambro)およびその他の構成要素と共に作動する。
細胞成長チャンバー102の排出口158は、管材料を介して注入口156と流動的に連結されており、細胞成長チャンバー102と共に第1の液体循環経路126を形成する。図1Bに示される実施態様において、第1の液体循環経路126は、細胞成長チャンバー102を通って液体が循環するよう構成される。第1の液体循環経路126は、液体が、細胞成長チャンバー102、サンプルコイル160、ポンプ142を通って流れ、細胞成長チャンバー102に戻るように構成することができる。細胞は、細胞成長チャンバー102から洗い出されまたは中空繊維膜に沿って再分配され得る。
第1の液体循環経路126は、さらにサンプルコイル160を含む。サンプルコイル160は、第1の液体循環経路126における液体のサンプルを取得し且つ試験することを可能とする。
CES100はさらに、第2の液体循環経路166(「キャピラリー外ループ」または「ECループ」とも言及される)を含む。第2の液体循環経路166は、ポンプ168、温度メーター170および酸素付加器104を含む。第2の液体流路は、酸素付加器注入口172に接続され、酸素付加器排出口174内に出る。酸素付加器排出口174は、注入口162によって細胞成長チャンバー102に連結しており、細胞成長チャンバー排出口164から細胞成長チャンバー102を出る。第2の液体循環経路166は、液体が、バルブ138を通ってドリップチャンバー186に流れ、ポンプ168に戻るように構成することができる。
第2の液体循環経路166は、細胞成長チャンバー102における細胞にガスを供給し、さらに細胞が作りだす廃棄代謝物の除去を可能にする。ガスは、フィルタ150および152を介して、酸素付加器104に流れ、且つそこから流れでる。フィルタ150および152は、酸素付加器または関連する培地の汚染を予防する。培地は、酸素付加器104に含まれる繊維を通して、酸素付加器注入口172に流れ込み、排出口174を通って出る。酸素は、ガス注入口176において酸素付加器104に入る。酸素付加器におけるガスの濃度は、所望の任意の濃度に出来る。ガスは酸素付加器における繊維を介して拡散する。
第2の液体循環経路166に含まれる液体培地は、ガス注入口176を通して中へ流れるガスと平衡状態にある。培地に入る酸素の量は、ガス濃度の制御により制御することができる。培地へ拡散する前の気相における酸素のモルパーセント(ここにおいて「体積モル濃度」とも言及される)は、典型的に0%、5%、10%または15%以上である。あるいは、ガス中の酸素の体積モル濃度モルパーセントは、20%、15%、10%または5%以下である。特定の好ましい実施態様において、酸素の体積モル濃度は5%である。当該分野にて既知の様々な酸素付加器を同様に使用することができる。任意の商用酸素付加器を使用することができる。好ましい特定の実施態様において、酸素付加器は、1820の数、280μmの繊維内径、386μmの繊維外径および16mLのキャピラリー内液体体積を有する中空繊維を有する。
CES100は第1の液体注入路124を含む。第1の液体注入路124は、ドリップチャンバー180およびポンプ182を含む。液体培地および/または細胞は、EC培地容器106から、バルブ107を通って;IC液体培地容器108からバルブ109を通って;通気バッグ110から、バルブ111を通って;または細胞注入バッグ112からクランプ113を通って流れる。IC液体培地容器108、EC培地容器106、通気バッグ110または細胞注入バッグ112のそれぞれは、ここに議論されるような液体培地容器である。IC培地は、一般に、第1の循環経路126において循環する培地を指す。EC培地は、一般に、第2の循環経路166において循環する培地を指す。
ドリップチャンバー180は、ガスのポケット(例えば気泡)の細胞成長チャンバー102への到達の予防を助ける。超音波センサーは、ドリップチャンバー180の入り口ポート128および出口ポート130の付近に配置することができる。入り口ポート128におけるセンサーは、ドリップチャンバー180における液体が、EC培地容器106、IC培地容器108、通気バッグ110、細胞注入バッグ112または関連する管材料に逆流することを防ぐ。出口ポート130におけるセンサーは、ガスがセンサーの底に達した場合にポンプ182を停止し、ガス泡が細胞成長チャンバー102に達することを予防する。
CES100はさらに第2の液体注入路114を含む。バルブ115が開らいたとき、ポンプ190は、第2の液体注入路114から第2の液体循環経路166へ液体をくみ出すことができる。接続路116は、第1の循環経路および第2の循環経路を接続する。ポンプ118は、接続路116を介して、第2の液体注入路114から第1の液体循環経路126へと液体をくみ出すことができる。あるいは、液体は、第1の液体循環経路126および第2の液体循環経路166の間で送り出されることができる。
当業者は、第1の液体循環経路126における液体は、第2の液体循環経路166における液体と同じ方向(並流)または第2の液体循環経路166の反対方向(すなわち向流)のいずれかで、細胞成長チャンバー102を通って流れることができるということを認
識するだろう。
識するだろう。
第1の液体循環経路126は、フラッシュライン132を通して第1の液体注入路12
4に連結している。フラッシュラインはバルブ133を含み、それはその他のバルブおよびポンプと共同して開閉することができ、培地を第1の液体注入路124にまたは第1の液体注入路124から流すことができる。
4に連結している。フラッシュラインはバルブ133を含み、それはその他のバルブおよびポンプと共同して開閉することができ、培地を第1の液体注入路124にまたは第1の液体注入路124から流すことができる。
同様に、第1のおよび第2の液体流路は液体接続路139によって接続されている。バルブ131は液体接続路139に配置される。バルブ131を開き、CES100中で1以上のポンプを使用することにより、液体は、第1の液体循環経路126と第2の液体循環経路166との間に移動することができる。
細胞は細胞収集路134を介して収集することができる。細胞収集路134は、ジャンクション188にて、細胞収集バッグ140および第1の液体循環経路126と流動的に連結されている。細胞収集路134はクランプ117を使用して閉じることができる。細胞成長チャンバー102からの細胞は、細胞収集路134を通して細胞収集バッグ140に送ることができる。当業者は、クランプ117は、様々な実施態様において、バルブ、ポンプまたはそれらの組み合わせで交換し、またはそれらと組み合わせることができると認識するだろう。
CESの様々な構成要素を、インキュベータ199内に含むことができる。インキュベータ199は、細胞および培地を一定温度に維持する。
液体排出路136はドリップチャンバー186に連結している。液体排出路136はドリップチャンバー186から廃棄物バッグ148に培地を送る。
ここで使用される「培地バッグ」、「通気バッグ」および「細胞注入バッグ」という用語は任意であり、それらの位置はその他のバッグと切り替えることができる。例えば、通気バッグ110は、IC培地容器108または細胞バッグ112と交換することができる。インプットおよびアウトプットのコントロールおよびパラメーターは、その後、変化に適応させるために調節することができ、その他の培地または構成要素を、明示される培地バッグ、通気バッグまたは細胞注入バッグにかかわらず、それぞれのバッグに添加することができる。さらに、ドリップチャンバーの位置、またはドリップチャンバーから独立したセンサーは、注入口156の前にCESの任意の位置に存在し得ることが留意される。
当業者はさらに、図1BのCESにおけるポンプおよびバルブは、液体流れ制御器として役立つことを認識するだろう。様々な実施態様において、第1の液体循環経路および第2の液体循環経路が液体を循環させるように構成され、流体インプット経路が液体を添加できるように構成されていれば、液体流れ制御器は、任意の順で、ポンプ、バルブまたはそれらの組み合わせとできる。
CESは付加的な構成要素を含むことができる。例えば、1以上のポンプループ(図示せず)を、CESの蠕動ポンプの位置に加えることができる。蠕動ポンプは、管材料の外面に実施可能な状態で接続され、管材料の外面を収縮させて管材料を通して液体を押し出すことで、流体の流れ経路を通して液体を送り出す。ポンプループは、ポリウレタン(PU)(Tygothane C−210Aとして入手可能)、ネオプレンベースの材料(例えばArmapure, St. Gobain)、またはその他の適切な材料で作ってよい。あるいは、管材料のラインのまとめ且つ蠕動ポンプのための管材料ループを含んでよいカセットを、使い捨て用品の一部として含めてもよい。CESの1以上の構成要素をカセットに含めて、管材料の組織化を助けることができる。
様々な実施態様において、CESは、pHといった培地特性並びにグルコース、乳酸塩および酸素といった細胞性代謝物質の検知のためのセンサーを含むことができる。センサーは、ICまたはECループの任意の位置にて、CESと実施可能な状態で連結できる。任意の様々な市販されるpH、グルコースまたは乳酸塩センサーを使用することができる。
図1Cは、CESのその他の実施態様を示す。CES300は、第1の液体循環経路302(「キャピラリー内(IC)ループ」とも言及される)および第2の液体循環経路304(「キャピラリー外ループ」または「ECループ」とも言及される)を含む。
第1の液体流路306は、細胞成長チャンバー308と流動的に連結され、第1の液体循環経路302を形成する。液体は、注入口310を通って細胞成長チャンバー308に流れ込み、細胞成長チャンバー308内で中空繊維を通り、排出口307から出る。圧力計317は、細胞成長チャンバー308を出る培地の圧力を測定する。培地は、培地の流速を制御するために使用されるバルブ313およびポンプ311を通って流れる。培地のサンプルは、作動中は、サンプルポート305またはサンプルコイル309から得ることができる。第1の液体循環経路に配置された圧力/温度計315は、作動中の培地の圧力および温度の検知を可能にする。その後、培地は注入口310に戻り、液体循環経路302が完成する。細胞成長チャンバー308内で増殖した細胞は、細胞成長チャンバー308から洗い流すことが可能であり、または、更なる増殖のために中空繊維内に戻すことができる。
第2の液体循環経路304は、ループで細胞成長チャンバー308と流動的に連結されている第2の液体流路312を含む。第2の液体循環経路304における液体は、注入口314を介して細胞成長チャンバー308に入り、排出口316を介して細胞成長チャンバー308を出る。培地は、細胞成長チャンバー308における中空繊維の外側に接し、小さな分子の中空繊維内へのおよび中空繊維からの拡散を可能にする。
第2の循環経路に配置された圧力/温度計319は、培地が細胞成長チャンバー308のEC空間に入る前における、培地の圧力および温度の測定を可能にする。圧力計321は、第2の循環経路における培地が細胞成長チャンバーを出た後における、当該培地の圧力の測定を可能にする。
細胞成長チャンバー308の排出口316を出た後、第2の液体循環経路304における液体は、ポンプ320およびバルブ322を通って酸素付加器318に向かう。第2の液体流路312は、酸素付加器注入口324および酸素付加器排出口326を介して、酸素付加器318と流動的に連結されている。作動中、液体培地は、酸素付加器注入口324を介して酸素付加器318に流れ込み、酸素付加器排出口326を介して酸素付加器318を出る。
酸素付加器318は、CESにおいて、培地に酸素を付与する。様々な実施態様において、第2の液体循環経路304における培地は、酸素付加器に入るガスと平衡状態にある。酸素付加器は当該分野で既知の任意の酸素付加器であり得る。ガスは、フィルタ328を介して酸素付加器318に流れ込み、フィルタ330を通って酸素付加器318から流れ出る。フィルタ328および330は、酸素付加器318および関連する培地の汚染を低減しまたは予防する。
CES300のために示された配置において、第1の循環経路302および第2の循環経路304における液体培地は、同じ方向(並流配置)で細胞成長チャンバー308を通って流れる。当業者は、CES300は向流の形態で構成することもできると認識するだろう。当業者は、それぞれの注入および排出口は、細胞成長チャンバーにおいて、任意の位置に配置できると認識するだろう。
細胞および液体培地は、第1の液体注入路332を介して液体循環経路302に導入することができる。液体容器334および液体容器336は、それぞれバルブ338および340を介して、第1の液体注入路332と流動的に連結されている。同様に、細胞容器342は、バルブ343を介して、第1の液体循環経路302と流動的に連結されている。細胞および液体は、熱交換器344、ポンプ346を通って進み、ドリップチャンバー348に入る。ドリップチャンバー348は、第1の循環経路302と流動的に連結されている。ドリップチャンバー348からのオーバーフローは、バルブ352を介してオーバーフローライン350から、ドリップチャンバー348を流れ出る。
付加的な液体は、液体容器354および液体容器356から、第1のまたは第2の液体循環経路302および304に添加できる。液体容器354は、バルブ358と流動的に連結されており、当該バルブは、第1の液体注入路360を介して第1の液体循環経路302と流動的に連結されている。第1の液体流路はバルブ364を含む。あるいは、液体容器354は、第2の液体注入路362と流動的に連結されている。同様に、液体容器356は、バルブ366と流動的に連結されており、当該バルブは、第1の液体注入路360を介して第1の液体循環経路302と流動的に連結されている。あるいは、液体容器364は、第2の液体注入路362と流動的に連結されている。
第2の液体注入路362は、液体がドリップチャンバー370に入る前にポンプ368を通って流れることができるように構成される。第2の液体注入路362は第2の液体循環経路304に続く。オーバーフロー液体は、オーバーフローライン372を経由し、バルブ374を通って廃棄物容器376に流れ出ることができる。
第2の液体注入路362は、液体がドリップチャンバー370に入る前にポンプ368を通って流れることができるように構成される。第2の液体注入路362は第2の液体循環経路304に続く。オーバーフロー液体は、オーバーフローライン372を経由して、バルブ374を通って廃棄物容器376に流れ出る。
細胞は細胞収集路378を介して収集できる。細胞成長チャンバー308からの細胞は、細胞を含む培地を、細胞収集路378を通して細胞収集バッグ380に送り出すことで収集できる。
第1のおよび第2の液体循環経路302および304は、接続路384によって接続される。バルブ386が開かれる場合、培地は、第1のおよび第2の循環経路302および304の間を、接続路384を通って流れることができる。同様に、ポンプ390は、第1のおよび第2の液体循環経路302および304の間を、別の接続路388を通って培地を送ることができる。
CESの様々な構成要素は、インキュベータ399内に含めることができる。インキュベータ399は、細胞および培地を一定温度に維持する。
当業者は、任意の数の液体容器(例えば培地バッグ)を、任意の組み合わせで、CESと流動的に連結することができると認識するだろう。ドリップチャンバーの位置、またはドリップチャンバーから独立したセンサーは、注入口310の前において、CESの任意の位置に置くことができることに留意される。
CESは付加的な構成要素を含むことができる。例えば、1以上のポンプループ(図示せず)を、CESの蠕動ポンプの位置に加えることができる。ポンプループはポリウレタン(PU)(Tygothane C−210Aとして入手可能)で作られていてよい。あるいは、管材料ラインを組織化し、蠕動ポンプのための管材料ループを含んでもよいカセットを、使い捨て物の一部として含めてもよい。
ロッキング装置
CESは、回転性および/または横方向性ロッキング装置に取り付けることで、細胞成長チャンバーを細胞増殖システムのその他の構成要素に対して動かすまたは「揺り動かす(rock)」よう形成される装置を含むことができる。図1Eはそのような装置の1つを示しており、この中で、バイオリアクター400は、回転するように、2つの回転性振盪構成要素および横方向振盪構成要素に接続されている。
CESは、回転性および/または横方向性ロッキング装置に取り付けることで、細胞成長チャンバーを細胞増殖システムのその他の構成要素に対して動かすまたは「揺り動かす(rock)」よう形成される装置を含むことができる。図1Eはそのような装置の1つを示しており、この中で、バイオリアクター400は、回転するように、2つの回転性振盪構成要素および横方向振盪構成要素に接続されている。
第1の回転性ロッキング装置構成要素402は、バイオリアクターの中心軸410を中心にバイオリアクターを回転させる。および、横方向性ロッキング装置404に、側面に接続されている。回転性ロッキング装置構成要素402は、バイオリアクター400に回転するよう連結している。回転性ロッキング装置は、そして、バイオリアクターの中心軸410を中心にバイオリアクター400を回転させる。回転は、時計回りまたは反時計回りに生じうる。バイオリアクター400は、時計回りまたは反時計回りの方向で、中心軸410を中心に単一の方向に連続的に回転できる。あるいは、バイオリアクター400は、中心軸410を中心に最初に時計回り、次に反時計回りのように、交互の様式で回転できる。
CESは、回転軸412を中心にバイオリアクター400を回転させる第2の回転性振盪構成要素を含むこともできる。回転軸412はバイオリアクター400の中点を通り、中心軸410に垂直である。バイオリアクター400は、時計回りまたは反時計回りの方向に回転軸412を中心に、単一の方向に連続的に回転することができる。あるいは、バイオリアクター400は、最初に時計回り、次に反時計回りで、交代の様式で回転軸412を中心に回転することができる。様々な実施態様において、バイオリアクター400は、回転軸412を中心に回転することができ、および、重力に対して水平または垂直の方向で位置することができる。
横方向振盪構成要素404は、バイオリアクター400の側面方向に連結している。横方向振盪構成要素404の平面は、xおよびy方向で、横方向に動く。それゆえ、中空繊維内の細胞含有培地の動きによって、バイオリアクターにおける細胞の沈降は低減される。
ロッキング装置の回転性および/または横方向性の移動は、装置内の細胞の沈降を低下させることができ、バイオリアクターの一部に細胞がトラップされる傾向を低下させることができる。細胞成長チャンバーに細胞が沈降する速度は、ストークスの法則に従って、細胞と懸濁培地との間の密度差に比例する。特定の実施態様において、上述するように繰り返される休止(総計時間は30秒)を有する180度の回転(高速)は、非接着性赤血球細胞を懸濁した状態に維持する(データは示さず)。約180度の最小回転が好ましい;しかしながら、360度以内またはそれ以上の回転も使用できる。異なる振盪構成要素を別々に使用でき、または任意の組み合わせで組み合わせることができる。例えば、中心軸410を中心にバイオリアクター400を回転させる振盪構成要素を、軸412を中心にバイオリアクター400を回転させる振盪構成要素と組み合わせることができる。同様に、異なる軸を中心とする時計回りおよび反時計回りの回転を、任意の組み合わせで独立して行なうことができる。
ロッカー(rocker)をインキュベーションシステム内に含むことができる。一般に、インキュベーションシステムは、特定の温度に構成要素を維持するよう設計される。
着脱可能流れ回路
さらに、着脱可能流れ回路(ここにおいて「着脱可能循環モジュール」とも言及される)が提供される。着脱可能流れ回路は、CESにおけるより常設的な固定された一部に備え付けられるよう構成された細胞増殖モジュールの一部である。一般に、CESの固定部分は蠕動ポンプを含む。様々な実施態様において、CESの固定部分はバルブおよび/またはクランプを含むことができる。
さらに、着脱可能流れ回路(ここにおいて「着脱可能循環モジュール」とも言及される)が提供される。着脱可能流れ回路は、CESにおけるより常設的な固定された一部に備え付けられるよう構成された細胞増殖モジュールの一部である。一般に、CESの固定部分は蠕動ポンプを含む。様々な実施態様において、CESの固定部分はバルブおよび/またはクランプを含むことができる。
着脱可能流れ回路は、少なくとも対向する末端を有する第1の液体流路を含むことができる。第1の末端は、細胞成長チャンバーの第1の末端と流動的に連結されるよう構成され、第1の液体流路の第2の末端は、細胞成長チャンバーの対向する末端と流動的に連結されるよう構成される。
同様に、着脱可能流れ回路は、少なくとも2つの対向する末端を有する第2の液体流路を含むことができる。着脱可能流れ回路の一部は、酸素付加器および/またはバイオリアクターと流動的に連結されるように構成することができる。着脱可能流れ回路は、酸素付加器および細胞成長チャンバーと流動的に連結されるように形成される第2の液体流路を含むことができる。
様々な実施態様において、着脱可能流れ回路は、液体流れ制御器に着脱可能で且つ使い
捨て可能なように取り付けられる。着脱可能流れ回路は、CESの一部に接続される着脱可能液体導管(例えばフレキシブルチューブ)を含み得る。図1B1Fに関して、着脱可能流れ回路は、第1の液体循環経路126の管材料を含むが、ポンプ142を含まない。着脱可能流れ回路は、さらにフラッシュライン132の管材料を含み得るが、バルブ133を含まない。着脱可能流れ回路はさらに、第1の循環経路126をフラッシュライン132および第1の液体注入路124に接続する管材料を含み得る。その他の様々な置換において、着脱可能流れ回路は、培地注入バッグ106および108、通気バッグ110および細胞注入バッグ112をドリップチャンバー180に接続する管材料を含み得る。着脱可能流れ回路は、第1の循環経路126に細胞収集バッグ140を接続する管材料を含むこともできる。
捨て可能なように取り付けられる。着脱可能流れ回路は、CESの一部に接続される着脱可能液体導管(例えばフレキシブルチューブ)を含み得る。図1B1Fに関して、着脱可能流れ回路は、第1の液体循環経路126の管材料を含むが、ポンプ142を含まない。着脱可能流れ回路は、さらにフラッシュライン132の管材料を含み得るが、バルブ133を含まない。着脱可能流れ回路はさらに、第1の循環経路126をフラッシュライン132および第1の液体注入路124に接続する管材料を含み得る。その他の様々な置換において、着脱可能流れ回路は、培地注入バッグ106および108、通気バッグ110および細胞注入バッグ112をドリップチャンバー180に接続する管材料を含み得る。着脱可能流れ回路は、第1の循環経路126に細胞収集バッグ140を接続する管材料を含むこともできる。
同様に、着脱可能流れ回路は、第2の循環経路166を構築する管材料を含むことができる。例えば、管材料は、細胞成長チャンバー102ならびにドリップチャンバー186に酸素付加器104を接続する管材料を含むことができる。着脱可能流れ回路は液体注入路114を含むこともできる。
更なる実施態様において、着脱可能流れ回路は、細胞成長チャンバー、酸素付加器ならびに培地および細胞を含むためのバッグを含むことができる。様々な実施態様において、構成要素は相互に接続させるまたは分離させることができる。あるいは、着脱可能流れ回路は、バルブ、ポンプといった液体流れ制御器およびそれらの組み合わせに接続されるよう構成される1以上の部分を含むことができる。蠕動ポンプが使用される変形例において、着脱可能循環モジュールは、管材料の蠕動部分の周囲に装着されるよう構成される蠕動性ループを含み得る。様々な実施態様において、蠕動性ループは、循環経路、注入路および排出路と流動的に連結されるよう構成できる。
着脱可能流れ回路は、キットにおいて、その組み立てのための指示書またはポンプおよびバルブといった液体流れ制御器への付属物と組み合わせることができる。
CESのプライミング(Priming)
細胞の添加の前に、CESは、CESの作動を準備するために培地で「プライミング(primed)」することができる。
細胞の添加の前に、CESは、CESの作動を準備するために培地で「プライミング(primed)」することができる。
CESのプライミングは、図1BのCES100をさらに参照して記述される。第1の液体循環経路126は、細胞成長チャンバー102がCES100に装着される前にプライミングされる。培地は、EC培地容器106からバルブ107を通って流れ、ドリップチャンバー180に入り、第1の液体注入路124を通ってジャンクション184に流れる。ドリップチャンバー180は、その後、培地で満たされる。
第1の液体循環経路126は、その後、ICEC培地でプライミングされる。培地は、ドリップチャンバー180からフラッシュライン132に送られる。培地は、また、第1の液体循環経路126を通り、ジャンクション184に流れる。
細胞成長チャンバー102は、次に、注入口156を下流方向へおよび排出口158を上流方向に向けることにより、システムに無菌的に接続される。培地は、第2の液体注入路114および第1の液体注入路124を通って送られる。空気は細胞成長チャンバー102から通気バッグ110へ送られる。特定のプロトコールが下記に述べられる。
第2の液体循環経路166は、その後プライミングされる。第2の液体循環経路166における培地は、酸素付加器104、注入口162、排出口164を通り、および、酸素付加器104を通って流れ、第2の循環経路166が完成する。特定のプロトコールが下記に述べられる。
CESのプライミングについての変形例を使用することができる。例えば、CESは、CES100に備えられた細胞増殖システムでプライミングすることができる。EC培地容器106またはIC培地容器108からの培地を使用することができる。一般に、ガスポケットがシステムで生ずるのを予防するために、培地がシステムに加えられる。
培地交換
ICまたはECループのいずれかで循環する培地は、CESから細胞を除去することなく、新鮮な培地と交換することができる。IC培地は新鮮なIC培地と交換することができ、EC培地は新鮮なEC培地と交換することができる。
ICまたはECループのいずれかで循環する培地は、CESから細胞を除去することなく、新鮮な培地と交換することができる。IC培地は新鮮なIC培地と交換することができ、EC培地は新鮮なEC培地と交換することができる。
一実施態様において、培地は、使用済み培地を細胞成長チャンバーにおける中空繊維膜を通して除去することで交換できる(ここにおいて「限外ろ過」と言及される)。好ましい様々な実施態様において、限外ろ過は、PA/PAES/PVPで構築される中空繊維を有する細胞成長チャンバーを使用して行われる。図1Bに関して、新鮮な培地はドリップチャンバー180に供給され、その後、ジャンクション184へと流される。使用済み培地の使用済みの少なくとも一部は、細胞成長チャンバー102の中空繊維を通って拡散して第2の循環経路166に入ることで(「ECループ」)、第1の循環経路126を出る。使用済み培地はドリップチャンバー186に入り、液体排出路136を介してシステムから廃棄物バッグ148に流される。限外ろ過は、接着および非接着細胞の両方に使用できるが、非接着細胞を増殖させる場合に好ましい方法である。一般に、タンパク質のような大きな分子は、大きすぎるため中空繊維膜を通り抜けることができない。限外ろ過法は、システムから大きな分子を除去する能力を制限することができる。
あるいは、使用済み培地は、コネクター流れ経路139を介して除去することができる。新鮮な培地はドリップチャンバー180に供給される。バルブ131を開き、使用済み培地は、コネクター流れ経路139を介して第1の循環経路139 126を出る。使用済み培地はドリップチャンバー186に集められる。使用済み培地は、その後、液体排出路136を介してシステムから廃棄物バッグ148に流しだされる。EC培地はドリップチャンバー186を通って廃棄物バッグ148に送ることができる。
使用済みEC培地は、新鮮なEC培地で交換することもできる。図1Bに関して、液体は、EC培地容器106からバルブ115を通して流れ、ポンプ190およびポンプ168を介してECループに流れる。
ICループおよびECループにおける全体積の培地は、システムから細胞を除去することなく、容易に交換することができる。小さな体積の培地またはその他の溶液相化合物も同様にシステムに添加することができる。培地交換の複数の方法は、さらに、細胞成長チャンバー中空繊維に付着した細胞を除去することなく、培地を交換することができる。
CESへの細胞の導入
細胞は、多数の方法によってCESに添加することができる。
細胞は、多数の方法によってCESに添加することができる。
第1の例示的方法では、上記の通り培地交換の限外ろ過と同様の様式で、細胞を限外ろ過(「ハイフラックス」とも言及される)によってCES100に添加できる。細胞注入バッグ112からの細胞は、ドリップチャンバー180に導入される。ECおよび/またはIC培地とともに、細胞成長チャンバー102に細胞含有培地を押し込んで、高い流量でドリップチャンバー180に添加される。続いて、過剰体積のECおよび/またはIC培地(「追培地」)をドリップチャンバー180に充填し、当該培地は、細胞成長チャンバー102を通って流れる。追培地は細胞に適した任意の培地であり得る(例えばIC培地、EC培地またはリン酸緩衝液溶液(PBS))。細胞は細胞成長チャンバー102の中空繊維中で分散される。
接着細胞(例えば間葉系幹細胞、またはMSC)は中空繊維内腔への接着に基づいて選択することができる。中空繊維内腔は接着材料で造ることができる。あるいは、中空繊維は細胞接着を引き起こすためのフィブロネクチンで処理することができる。
第2の典型的な方法において、培地上に細胞を「受動的に充填」することによってCESに導入することができる。細胞はドリップチャンバー180から細胞成長チャンバー102に導入される。培地の流れはジャンクション188で停止される。細胞および追培地の体積は、細胞が第1の液体循環経路126を出ないことを確認するためにモニターされる。
細胞増殖
細胞はICループまたはECループのいずれかの中で生育(「増殖」)させることができる。接着および非接着懸濁細胞を増殖させることができる。
細胞はICループまたはECループのいずれかの中で生育(「増殖」)させることができる。接着および非接着懸濁細胞を増殖させることができる。
一実施態様において、細胞成長チャンバー繊維の内腔はフィブロネクチンで覆うことができる。二価の陽イオンフリー(例えば、カルシウムおよびマグネシウムフリー)のPBSがシステムに添加される。接着細胞を細胞成長チャンバー102に導入した後、それらは中空繊維に接着するのに十分な時間、インキュベートされる。ICおよびEC培地は、十分な栄養素を細胞に確実に供給するために循環される。
ICループおよびECループの流速は特定の値に調節することができる。様々な実施態様において、ICループおよびECループの流速は、独立に、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400または500mL/分とすることができる。図1BのCESの様々な実施態様において、IC循環ループのための好ましい流速は10−20mL/分であり、EC循環ループの好ましい流速は毎分20−30mLである(培地を酸素付加器104を通して流し、酸素レベルを回復することを可能にする)。ポンプ190は、任意に、低い流速(例えば毎分0.1.mL)でCESに付加的な培地を送り込み、チューブおよび酸素付加器104を通って蒸発する培地を交換する。様々な実施態様において、ECループは細胞の廃棄物を除去し、ICループは培地中に成長因子を含む。
CESは、増殖条件および基準の変化において、多くの融通性を提供する。細胞は、培地を連続的に循環させることにより、ICループに懸濁した状態を維持することができる。あるいは、培地循環を停止し、細胞を沈降させることができる。新鮮な培地は、限外ろ過によってICループに添加し、細胞を除去することなく過剰量を提供することができる。EC培地の循環は、ガス、栄養素、廃棄生成物の交換を可能とし、細胞を除去することなく新たな培地の添加を可能にする。
増殖した細胞は、接着細胞、非接着細胞、または、当該分野における細胞の任意の組み合わせの共培養物を含む。
細胞収集
接着細胞の収集のために、ICおよびEC培地は、二価陽イオンフリー培地(例えば二価陽イオンフリーPBS)と交換される。その後、トリプシンが第1の循環経路126に充填され、一定時間(例えば9−10分)接着細胞とインキュベートされる。その後、トリプシンをシステムから洗い出す。細胞成長チャンバーを通る流速を上昇させることで、剪断力を細胞に適用し、細胞成長チャンバーから放出される接着細胞を、細胞収集路134を介して細胞収集バッグ140に送る。
接着細胞の収集のために、ICおよびEC培地は、二価陽イオンフリー培地(例えば二価陽イオンフリーPBS)と交換される。その後、トリプシンが第1の循環経路126に充填され、一定時間(例えば9−10分)接着細胞とインキュベートされる。その後、トリプシンをシステムから洗い出す。細胞成長チャンバーを通る流速を上昇させることで、剪断力を細胞に適用し、細胞成長チャンバーから放出される接着細胞を、細胞収集路134を介して細胞収集バッグ140に送る。
非接着細胞を増殖させる場合、細胞を、循環するIC回路から洗い流すことができる。接着細胞は細胞成長チャンバー102に残り、一方で非接着細胞は除去される。
CESは様々な細胞増殖方法を行なうために使用することができる。
一実施態様において、播種した細胞の集団を増殖することができる。細胞は、CESに導入されまたは接種される。特定の状況において、中空繊維の内腔は、細胞が接着できるように条件を整えることができる。その後、細胞を細胞成長チャンバーに添加し、接着細胞は中空繊維に接着し、一方非接着細胞(例えば造血性幹細胞、またはHSC)は接着しない。非接着細胞はシステムから洗い流すことができる。一定期間のインキュベーションの後、接着細胞を放出させ収集することができる。
幹細胞、前駆細胞および完全に文化した細胞は、いずれも増殖させることができる。
以下の非限定的な例は、CES操作の様々な側面を例示する。
例1
50mL骨髄を、図1Bに示されるCESの中空繊維グロースチャンバーに充填した。
50mL骨髄を、図1Bに示されるCESの中空繊維グロースチャンバーに充填した。
細胞注入バッグ108は、50mL骨髄をIC培地で1:1に希釈することで作製し、ドリップチャンバー180に接続した。300mLのEC培地を別々に準備した。
第2の循環経路166(すなわちECループ)を、第2の循環経路166にEC培地が循環する条件とし、一方で少量のEC培地を加えて、気泡の形成、またはシステムから蒸発する管材料交換液体の崩壊を予防した。循環システムのガス濃度、pHおよび温度を、適切な機能を確実にするために測定した。
細胞成長チャンバー102の中空繊維の内腔を、上記のとおり限外ろ過によってフィブロネクチンで覆った。その後、骨髄を含む溶液をシステムに添加した。細胞成長チャンバー102に実施可能な状態で接続されたロッカーを、細胞の損失を最小化するために作動させた。中空繊維が詰まるのを予防し、残留する細胞のドリップチャンバーからのすすぎを助けるため、残留する骨髄を収集バッグに洗い出した。
その後、骨髄細胞を毎分20mLでICループを通して循環させ、且つ、EC培地をECループを通して循環させた。システム内のガス泡の形成および気化によるチューブ崩壊を予防するために、少量の培地をICループおよびECループの両方に定期的に添加した。
培地を、培地交換により周期的に取り替えた。EC培地を作製し、EC培地容器106に置いた。ドリップチャンバー180はEC培地を注ぎ補充した。その後、EC培地を第1の液体循環経路126(すなわちICループ)に添加した。EC培地がドリップチャンバー180から完全に除去されるまで、細胞を収集バッグ140に洗い流した。
その後、IC培地でドリップチャンバー180を3回洗い流すことで、IC培地をCES100に添加した。
例2
MSCをCESに充填した。
MSCをCESに充填した。
CESを例1に記載されるとおりに作製した。培地を、CES100の第1および第2の循環経路126および166の両方に添加した。50mLのIC培地中に懸濁したMSCを含む細胞注入バッグ112を作製し、ドリップチャンバー180に備え付けた。EC培地容器106をドリップチャンバー180および第2の液体注入路114に接続した。細胞をドリップチャンバー180に充填した。ポンプ182を高い流速に設定し、細胞を細胞成長チャンバー102に流した。その後、タンパク質含有IC培地の50mLの追培地を、ドリップチャンバー182に充填し、細胞成長チャンバー102に充填した。
EC培地を、第2の循環経路166(ECループ)を通して20mL/分の流速で循環させた。第1の循環流れ経路126(ICループ)における培地は、毎分10mLの流速で循環させ、細胞集団を増殖させた。
例3
接着細胞をCESから収集した。
接着細胞をCESから収集した。
ICおよびEC培地は、上記の培地交換の節において記述したように、二価陽イオンフリーPBSと交換した。トリプシンを細胞成長チャンバー102に添加し、9−10分間、接着細胞とインキュベートさせた。トリプシンをシステムから急速に洗い出し、流速を増加させることで、細胞成長チャンバー126の中空繊維に剪断力を適用した。中空繊維から放出された接着細胞は、第1の循環経路を停止し、収集バッグ140への細胞を含む培地を送ることにより、細胞成長チャンバー126から洗い流した。
非接着細胞を収集するために、トリプシンを添加せず、細胞を第1の循環経路126から細胞収集バッグ140に洗い出した。接着細胞は細胞成長チャンバーの中空繊維に付着して残り、一方非接着細胞は収集された。
例4
非接着細胞をCESに充填した。
非接着細胞をCESに充填した。
図1Bに関して、細胞を、細胞注入バッグ112からドリップチャンバー180に向けて、培地中に充填した。その後、細胞を、ポンプ182により、細胞成長チャンバー102にゆっくりと送った。流速は、細胞が細胞成長チャンバー102の中空繊維に沈降できるよう調節した。すべての細胞がドリップチャンバー180から細胞成長チャンバー102に送られるまで、細胞が充填するにつれて、流速を降下させて着実に圧力を減少させた。
あるいは、非接着細胞を限外ろ過によってCESに充填する。細胞は細胞注入バッグ112からドリップチャンバー180へ移動した。ポンプ182は、細胞を細胞成長チャンバー102に送り、そこを通して第1の循環経路126に送る。
続いて、細胞を、培地交換によって細胞成長チャンバー中で濃縮する。IC培地をドリップチャンバー180から第1の循環経路126に添加する。ポンプ182は、培地を、注入口156を通して細胞成長チャンバー102へ送る。同時に、ポンプ142は、培地を、排出口158を通して細胞成長チャンバー102に送る。過剰な培地は、中空繊維を通して、第2の循環経路166に拡散する。非接着細胞は、このように、培地が両方向から細胞成長チャンバー102に流れることにより、細胞成長チャンバー102の中空繊維中で濃縮される。
好ましい流速は、細胞成長チャンバーの中空繊維に入ることができる合成ビーズを使用して試験することができる。ビーズは、異なる細胞種に対応する異なるサイズおよび密度を有し得る。循環速度をゆっくりと低下させ、細胞成長チャンバー102におけるビーズの分布を測定し、流速がビーズ分布を変化させたかどうか判断した。
様々な実施態様において、接着および非接着細胞を同時に生育することができる。1つの代わりの例において、接着細胞を充填し、細胞成長チャンバー102に接着させることができる。その後、懸濁細胞を、第1の循環経路126に添加する。第2の代わりの例において、懸濁細胞を、最初に細胞成長チャンバー102に充填し、細胞成長チャンバー126の中空繊維の表面を覆わせ、これによって接着細胞増殖および/または接着を促進する。第3の代わりの例において、懸濁細胞を、最初にCESに添加し、特定の期間生育させる。その後、懸濁細胞を除去し、接着細胞をシステムに添加し、CESの中空繊維への接着を行わせる。その後、新鮮な懸濁細胞を添加し、接着細胞と同時に生育する。
その他の代わりの例では、懸濁細胞および接着細胞を、細胞成長チャンバーの異なる側で生育する。例えば、接着細胞はIC側面で生育できおよび懸濁細胞はEC側面で生育でき、またはその逆とすることができる。接着および懸濁細胞(例えばMSCおよびHSC)は、このように、分離して維持できるが、膜を介した互いの液体のやりとりを維持できる。接着細胞および懸濁細胞は、さらに、細胞成長チャンバーのIC側およびEC側の両方で相互に生育できる。
例5
非接触細胞をCES内で増殖させた。
非接触細胞をCES内で増殖させた。
一連のプロトコールを、図1Dに示される中空繊維CESの実施態様の様々な機能のために開発した(図1Dに示されるCESの実施態様は、図1Bに示されるCESの実施態様に実質的に類似する)。図1Dは、特定のポンプ(P1−P5)、バルブ(V1a、V1b、V2a、V4、V6、V7、V8およびV9)、クランプ(C1およびC2)、サンプルポート(S1−S3)、ドリップチャンバー(D1およびD2)、温度計T1−T3、ならびに圧力計PR1およびPR2を有する実施態様を開示する。様々なプロトコールが、ドリップチャンバーのプライミング、排水および充填、第1および第2の液体循環
経路間での液体培地の交換、細胞の充填、増殖、収集、ならびに、システムからの空気の除去のために開発された。
経路間での液体培地の交換、細胞の充填、増殖、収集、ならびに、システムからの空気の除去のために開発された。
図6−17は、CESを使用する典型的な過程を示す流れ図を示す。それぞれのブロックダイヤグラムは、圧力(単位は毎分mL)、バルブの開閉、圧力計、および様々な構成要素の接続を示す。
図6は、図1DのCESのプライミングのための流れ図プロトコールを示す。CESを、最初にEC培地でプライミングした。EC培地を、ポンプP3およびP1によって、EC培地バッグからECループへ送った。ドリップチャンバーD1をEC培地で充填した。ポンプP4およびP5によって、ICループを通してEC培地を送り、過剰のEC培地をドリップチャンバーD2に流れ込ませた。バイオリアクターをシステムに取り付け、重力に対して垂直に方向づけ、ポンプP3およびP5によって、ICループ(バイオリアクターを含む)およびECループをEC培地で満たした。廃棄物バッグをCESの上に掛け、ポンプP2およびP3によって、ECループに培地を送り込んだ。その後、ポンプP1、P2、P3およびP5(高い流速で)によって、システムを通して培地を送り、過剰な培地を、バルブV7を通してドリップチャンバーD2に流れさせた。
図7は、図1DのCESに対してドリップチャンバーD1から培地を添加するための流れ図プロトコールを示す。ドリップチャンバーD1を、IC培地、EC培地および細胞を含む任意のソースから選ばれた培地で満たした。その後、3つの個々のプロトコールのうちの1つを行うことができる。第1のプロトコールでは、ドリップチャンバーD1から、新たな培地を、バルブV6を通してICループに送り、過剰な培地を、バルブV7を通してICループから排出する。第2のプロトコールでは、培地を、バイオリアクターを通して送り込み、バルブV7からシステムを出て、ドリップチャンバーD2に向かわせる。第3のプロトコールでは、高い流速でバイオリアクターの中空繊維膜を通して培地を送り込み、バルブV8を通してシステムから培地を排出してドリップチャンバーD2に送ることにより、新たな培地を限外ろ過により使用済み培地に交換する。その後、ドリップチャンバーD2における培地を、廃棄物バッグに流れさせた。
図8は、ドリップチャンバーD1を満たすプロトコールを示す。IC培地、EC培地または培地に含まれる細胞のいずれかを、それぞれ、IC培地バッグ、EC培地バッグまたは細胞注入バッグから添加した。選択した培地または細胞を含むバッグからドリップチャンバーD1を分離するバルブまたはクランプを開いた。その後、培地または細胞をドリップチャンバーD1に流した。ドリップチャンバーD1が満たされた時、IC培地、EC培地または細胞注入バッグへのバルブを閉めた。
図9は、図1DのCESにおける、ECおよびIC培地の間の培地交換のための流れ図プロトコールを示す。バルブV8、および任意にバルブV7およびV9を開いた。その後、ICまたはEC培地を、ポンプP2、P3、P4およびP5によってドリップチャンバーD1から送った。P2/P3およびP4/P5のポンプ速度比率を選択した。特定のIC体積を、ポンプP5によってICループに送った。あるいは、特定のEC体積を、ポンプP3によってECループに送った。新たな体積の培地を、ポンプP5によりバルブV8を通してICループのジャンクションAに向けてドリップチャンバーD1から洗い流した。あるいは、特定の体積の培地(この場合13.5mL)をシステムに加えた。その後、ポンプを作動し、培地を循環させた。
図10は、図1DのCESにおいて、限外ろ過方法によりバイオリアクターに細胞を充填するための流れ図プロトコールを示す。クランプC1を開き、細胞をドリップチャンバーD1に配置させた。ポンプP5により、細胞および培地をドリップチャンバーD1からICループに送った。過剰な培地が中空繊維膜を通して流れ、ドリップチャンバーD2を介してシステムを離れる。ICまたはEC追培地を選択し、バルブV2a(IC培地バッグに対する)またはV1bおよびV1a(EC培地バッグに対する)を開いた。一旦、追培地がシステムに充填されると、ポンプを停止する。
図11は、「受動的充填」法によりバイオリアクターに細胞を充填するための流れ図プロトコールを示す。ポンプP5を作動させ、ICまたはEC追培地を選択し、バルブV2a(IC培地バッグに対する)またはV1bおよびV1a(EC培地バッグに対する)を開いた。細胞注入バッグに対するクランプC1を開いた。ポンプP5は、低速で、ドリップチャンバーD1からバイオリアクターに対して細胞および関連する培地を送った。過剰な培地を、バルブV7を介してICループからドリップチャンバーD2に流した。続いて、追ICまたはEC培地をシステムに充填し、過剰な培地を、バルブV5を通してICループから流した。
図12は、図1DのCESにおける骨髄の洗い出しのための流れ図プロトコールを示す。ポンプP5の圧力を高い流速でセットし、ポンプP2およびP3を、P5に比べて低い流速にセットした。その後、細胞注入バッグ、IC培地バッグまたはEC培地バッグからの培地を、ドリップチャンバーD1に添加した。クランプC2を開放して、細胞収集バッグを開いた。ポンプP2、P3およびP5は、細胞収集バッグに細胞および関連する培地を送り込んだ。細胞収集バッグを密閉し除去し、V8およびV9を再度開いた。
図13は、図1DのCESにおいて、接着細胞を生育するための流れ図プロトコールを示す。バルブV8および任意にバルブV7およびV9を開いた。その後、ICまたはEC培地を、ポンプP2、P3、P4およびP5によってドリップチャンバーD1からくみ出した。その後、大量のICおよびEC培地を選択した。ICおよびEC培地を、P3またはP5のいずれかによってシステム送った。その後、バルブV8およびV9は開いた。
図14は、図1DのCESの第1の循環経路(すなわちバイオリアクターおよびポンプP4を含むICループ)からの接着または非接着細胞を収集するための流れ図プロトコールを示す。ポンプP2、P3、P4およびP5により、選択した流速で培地を送った。バルブV6を開き、クランプC2(細胞収集バッグに対する)を開いた。収集体積を選択し、収集バッグへの細胞を汲むのに必要な時間、ポンプを始動した。クランプC2を閉め、細胞収集バッグを除去した。
図15は、図1DのCESにおいて、バイオリアクターに付着した細胞を収集するための流れ図プロトコールを示す。ポンプP2、P3およびP5を、関連する流速で選択した。バルブV8を開き、クランプC2(細胞収集バッグに対する)を開いた。収集体積を選択し、収穫体積を汲むのに必要な時間、ポンプを始動した。クランプC2を閉め、細胞収集バッグを除去した。
図16は、図1DのCESにおいて、バイオリアクターに装着されるロッカーを制御するための流れ図プロトコールを示す。ロッカーは、あらかじめ選択された時間バイオリアクターを回転させ、および/または、あらかじめ選択された「ドウェル時間」設定できる。
図17は、図1DのCESから空気を除去するための流れ図プロトコールを示す。ポンプP5を逆に始動し、培地を、限外ろ過により中空繊維を通して流し、または、バルブV7を介してバイオリアクターを通して流した。培地はドリップチャンバーD1に集められた。
例6
中空繊維細胞成長チャンバーにおける間葉系幹細胞(MSC)の初期の付着性および成長率を、MSCの2つのソースを使用して研究した。
中空繊維細胞成長チャンバーにおける間葉系幹細胞(MSC)の初期の付着性および成長率を、MSCの2つのソースを使用して研究した。
生育の2日後に収集した新鮮な骨髄からのMSCの回復を測定し、トリプシン処理および収集の後における細胞成長チャンバー中の残りの細胞の数を推定した。細胞成長チャンバーに残る細胞を溶解し、次に、LDH量の測定を行った。LDH量を基準(すなわち、溶解したMSCに対するLDH)と比較し、細胞成長チャンバーに残るMSCの最大数を評価した。この方法は、細胞成長チャンバーに残るMSCの数の近似を与えた。
細胞は、自動細胞カウンターを使用して数えた。細胞の生存率は、色素(トリパンブルーまたはエリトロシンB)排除アッセイにより、または、生存率測定能を有した自動カウンターにて決定した。細胞の表現型は、FACSフローサイトメーターにおいて、それぞれのアイソタイプコントロールとともにCD34、CD45、CD90、CD105、CD73およびHLA−DRを使用して、ポストCES収集、単一色フローサイトメーター決定にて検出した。細胞の形態は、収集後に決定した。5,000細胞/cm2を24ウェルプレート(n=3)に播種した。細胞の形態を、接着の1日後および4日後に観察した。
3つの細胞成長チャンバーおよび2つのMSCソースを試験する4サイト無作為化試験を行った。3つの細胞成長チャンバーを試験した:1)1.7m2 PA/PAES/PVP膜、2)1m2 0.5%のDesmopan膜、および3)1m2 2%のDesmopan膜。2つのMSCソースは、a)骨髄の直接の播種(3つの全細胞成長チャンバーにて試験される)およびb)骨髄からのあらかじめ選択されたプラスチック接着MSC(最初の2つの細胞成長チャンバー上でのみ試験される)である。
研究設計は、MSCの初期の接着および生育、特に、細胞成長チャンバーにおける、初期の播種、接着および生育を観察した。測定された要素は以下を含む:
1.初期のMSC結合効率、
2.MSC倍加時間(α)、
3.一定のαおよび最初のMSC結合、治療量に対する計画された日数の仮定
4.MSCの質、特に純度、表現型およびMSC分化。
1.初期のMSC結合効率、
2.MSC倍加時間(α)、
3.一定のαおよび最初のMSC結合、治療量に対する計画された日数の仮定
4.MSCの質、特に純度、表現型およびMSC分化。
中空繊維膜およびMSCソースオプションは表1に示される。2%のDesmopan膜は、直接播種した骨髄(すなわち以前MSCに選択されていない骨髄)でのみ試験した。その他の膜は、両方の直接の播種した骨髄で、および骨髄由来のあらかじめ選択した接着(T−75)MSCで試験した。
表3は、T−25フラスコで作製したMSCのためのデータを示す。試験サイト3骨髄生成物を試験サイト3で集め、0日でCESにて使用した。試験サイト4骨髄生成物を試験サイト3によって集め、試験サイト4に一晩かけて送り、そこで、1日目にCESにて使用した。試験サイト1および試験サイト2の両方は、商業的に購入した骨髄生成物を使用し、一晩送り、1日目にCESにて使用した。
CESに使用する日において、2つの78μLサンプルの骨髄生成物を、2つのT−25フラスコにそれぞれプレーティングした。観察されたコロニーの数、総MSCおよびMSC生存率を、プレーティングから7日後に測定した。
一晩の貯蔵の効果を理解するために、両者の前増殖の日に(特に、試験サイト4に送られた骨髄生成物において、試験サイト3により)および実行後の日に(特に、50mL骨髄生成物全体、すなわち1m2 Desmopan細胞成長チャンバーを使用せずに実行した後に)データを測定した。
プロトコールでは、あらかじめ選択された接着MSCを播種する各々の細胞成長チャンバーに対し、2つのT−75フラスコに3x78μL(234μL)の骨髄をプレーティングすると定める。プレーティングの14日後、両T−75フラスコを標準的なトリプシン技術を使用して収集した。1つの収集物を細胞成長チャンバーに播種するために使用し、第2の収集物を計測した。(開放時における汚染の可能性を減少するために、サンプルを混合せず、その後分割をしなった)。
表4は、T−75フラスコ、直接播種した細胞成長チャンバーおよびあらかじめ選択されたMSC細胞成長チャンバーについての、MSCカウントデータを示す。表4は、さらに、直接播種した細胞成長チャンバーの収集についてのカウントデータおよびあらかじめ選択されたMSCによる細胞成長チャンバー収集についてのカウントデータを示す。すべての直接播種した細胞成長チャンバーは生存可能なMSCを生産することができた一方、試験サイト2はより低い量のMSCを生産した。より低い量の細胞を、T75フラスコ作製方法と比較して、0.5%desmopanを使用して試験サイト1および4で測定した。しかしながら全ての細胞が高い生存率を有していた。試験サイト4は、T75フラスコと比較して、同等の量の非常に生存率の高いMSCを生産した。
幹細胞を検出するために、2%のDesmopan、0.5%のDesmopanおよびPA/PAES/PVP中空繊維膜のそれぞれにおいて、様々な幹細胞マーカーを使用した。表5、6および7は、収集のための表現型データを示す。
表8は、T−25フラスコデータのために計算されたMSC倍加時間(α、アルファ)を示す。この表は、直接のプレーティング幹細胞研究の際に集められた78μLの骨髄を使用するT−25フラスコデータをも含む。これらのデータは図3にプロットされる。
約50以下のコロニー形成単位(CFU)を示す骨髄生成物のために、データは2つの群でクラスターに分けられる。より高いアルファを有するそれらのデータの大多数は、試験サイト3に由来する一方で、より低い群からのそれらのデータは、試験サイト3以外のサイトで優勢であったとことを例外として、一般的な特徴は明白ではない。
両CFUおよびMSC倍加時間に対する骨髄齢の効果を示すT−25フラスコのデータを、それぞれ図4および図5に図示する。これらのデータは、78μLの骨髄のプレーティングおよび7日後のCFUおよび合計MSCの計測に一致する。
図18は、図1DのCESにおける中空繊維バイオリアクターで生育した細胞のための異なる細胞増殖プロトコールを使用するために試験された、細胞表面マーカーの発現レベルを示す。「直接」は、細胞をバイオリアクターに直接充填したことを指す。「前選択」は、細胞をフラスコで生育し、その後中空繊維バイオリアクターを使用して成育した、MSC特徴のために予め選択したことを指す。0.5%は、0.5%のDesmopanが充填された中空繊維バイオリアクターにて生育した細胞を指す。2%は、2%のDesmopanが充填されたバイオリアクターで生育された細胞を指す。PA/PAES/PVPは、PA/PAES/PVP中空繊維バイオリアクターを使用して生育された細胞を指す。
細胞増殖システム(CES)の典型的な概略図は、図1Aに示される。CES10は、第1の液体循環経路12および第2の液体循環経路14を含む。第1の液体流路16は、中空繊維細胞成長チャンバー24(ここでは「バイオリアクター」とも言及される)と流動的に連結されている少なくとも対向する末端18および20を有する。特に、対向する末端18は、細胞成長チャンバー24の第1の注入口22と流動的に連結されており、対向する末端20は、細胞成長チャンバー24の第1の排出口28と流動的に連結されている。第1の循環経路12における液体は、細胞成長チャンバー24に配置された中空繊維膜50の中空繊維の内部を通って流れる。(細胞成長チャンバーおよび中空繊維膜は、以下に詳述する)。さらに、第1の液体流れ制御器30は、実施可能な状態で第1の液体流路16に接続され、第1の循環経路12における液体の流れを制御する。
第2の液体循環経路14は、第2の液体流路34、細胞成長チャンバー24および第2の液体流れ制御器32を含む。第2の液体流路34は、少なくとも対向する末端36および38を有する。第2の液体流路34の対向する末端36および38は、それぞれ細胞成長チャンバー24の第2の注入口40および第2の排出口42に流動的に連結されている。細胞成長チャンバー24を通って流れる液体は、細胞成長チャンバー24中の中空繊維膜50の外部に接している。第2の液体循環経路14は、第2の液体流れ制御器32に実施可能な状態で接続される。
液体注入路44は、第1の液体循環経路12と流動的に連結されている。液体注入路44は第1の液体循環経路12へと液体を流し、一方、液体排出路46は液体をCES10から排出させる。第3の液体流れ制御器48は、液体注入路44と実施可能な状態で連結されている。あるいは、第4の液体流れ制御器(図示せず)は、第1の液体排出路46に連結し得る。
第1の循環経路における液体は、注入口204を通って細胞成長チャンバー200に入り、多数の中空繊維のキャピラリー内側(様々な実施態様において、中空繊維膜のキャピラリー内(「IC」)側または「IC空間」と称される)へ入り且つ通過し、排出口206から細胞成長チャンバー200を出る。「中空繊維」、「中空繊維キャピラリー」および「キャピラリー」という用語は互換的に使用される。多数の中空繊維は総体として「膜」と言及される。第2の循環経路における液体は、注入口208を通って細胞成長チャンバーに入り、中空繊維の外側(膜の「EC側」または「EC空間」と言及される)に接触し、排出口210を通って出口細胞成長チャンバー200から出る。細胞は、第1の循環経路または第2の循環経路内に包含させることができ、膜のIC側またはEC側のいずれかに存在し得る。
横方向振盪構成要素404は、バイオリアクター400の側面方向に連結している。横方向振盪構成要素404の平面は、xおよびy方向で、横方向に動く。
生育の2日後に収集した新鮮な骨髄からのMSCの回復を測定し、トリプシン処理および収集の後における細胞成長チャンバー中の残りの細胞の数を推定した。細胞成長チャンバーに残る細胞を溶解し、LDH量の測定を行った。LDH量を基準(すなわち、溶解したMSCに対するLDH)と比較し、細胞成長チャンバーに残るMSCの最大数を評価した。この方法は、細胞成長チャンバーに残るMSCの数の近似を与えた。
Claims (27)
- 以下を含む、細胞増殖システム:
a)次を含む、第1の液体循環経路
i)少なくとも対向する末端を備える第1の液体流路、ここにおいて、前記第1の液体流路の第1の対向する末端は中空繊維膜を含む細胞成長チャンバーの第1のポートに流動的に連結されており、前記第1の液体流路の第2の末端は前記細胞成長チャンバーの対向する末端に流動的に連結されており、前記第1の液体流路は、前記中空繊維膜のキャピラリー内部分に流動的に連結されている、および
ii)前記第1の液体流路に実施可能な状態で連結する第1の流れ制御器;
b)次を含む、第2の循環経路
i)少なくとも対向する末端を備える第2の液体流路、ここにおいて、前記第2の液体流路の第1の対向する末端は前記細胞成長チャンバーの第3のポートに流動的に連結されており、前記第2の液体流路の第2の対向する末端は前記細胞成長チャンバーの第4のポートに流動的に連結されており、前記第2の液体流路は、前記中空繊維膜のキャピラリー外部分に流動的に連結されており;および
ii)前記第2の閉回路経路に実施可能な状態で連結する第2の液体制御器;
c)液体を前記第1の循環経路に流すための、前記第1の循環経路に流動的に連結する第1の液体注入路;および
d)少なくとも1つの前記第1のまたは第2の循環経路に流動的に連結する第1の液体排出路;および。 - 前記第1の液体注入路または前記第1の液体排出路の1つに実施可能な状態で連結されている第3の液体制御器を更に含む、請求項1に記載の細胞増殖システム。
- 請求項1に記載の細胞増殖システムであって、ここにおいて、前記第1の液体制御器および第2の液体制御器が、ポンプ、バルブならびにポンプおよびバルブの組み合わせから成る群からそれぞれ独立に選択される細胞増殖システム。
- 請求項21に記載の細胞増殖システムであって、ここにおいて、前記第3の液体制御器が、ポンプ、バルブまたはポンプおよびバルブの組み合わせから成る群から選択される細胞増殖システム。
- 請求項2に記載の細胞増殖システムであって、ここにおいて、前記第3の液体制御器が前記第1の液体注入路に実施可能な状態で連結し、前記第1の液体排出路に実施可能な状態で連結した第4の液体制御器をさらに含む細胞増殖システム。
- 請求項1に記載の細胞増殖システムであって、少なくとも対向する末端を備える第3の液体経路を更に含み、ここにおいて、前記第3の液体経路の第1の対向する末端は第1の循環経路に流動的に連結しており、第3の液体経路の第2の対向する末端は前記第2の循環経路に流動的に連結している細胞増殖システム。
- 請求項1に記載の細胞増殖システムであって、前記第3の液体制御器がポンプおよびバルブを含む細胞増殖システム。
- 請求項1に記載の細胞増殖システムであって、前記細胞成長チャンバーが、前記第1の液体流路における培地が、前記細胞成長チャンバーの前記第2の液体流路と反対の方向に流れるよう構成されている細胞増殖システム。
- 請求項1に記載の細胞増殖システムであって、前記細胞成長チャンバーが、前記第1の液体流路における培地が、前記細胞成長チャンバーの前記第2の液体流路と同一の方向に流れるよう構成されている細胞増殖システム。
- 請求項1に記載の細胞増殖システムであって、対向する末端を有するコネクター流れ経路を更に含み、前記コネクター流れ経路の一末端は前記第1の液体流路に流動的に連結しており、前記コネクター流れ経路の第2の末端は前記第2の液体流路に流動的に連結している細胞増殖システム。
- 請求項1に記載の細胞増殖システムであって、前記第2の循環経路に流動的に連結し、第5の液体制御器に実施可能な状態で連結している第2の液体補給ラインを更に含む細胞増殖システム。
- 請求項1に記載の細胞増殖システムであって、ここにおいて、前記第2の液体補給ラインは、前記第1の循環路経路に流動的に連結しており、第5の液体制御器に実施可能な状態で連結している細胞増殖システム。
- 請求項1に記載の細胞増殖システムであって、前記第1のまたは第2の液体流路はガス交換器を含む細胞増殖システム。
- 請求項13に記載の細胞増殖システムであって、前記第2の液体流路は前記ガス交換器を含む細胞増殖システム。
- 請求項13に記載の細胞増殖システムであって、前記ガス交換器が、ガス交換器ハウジングに配置されたガス交換器注入ポートおよびガス交換器排出ポート、前記ガス交換器注入ポートおよび前記ガス交換器排出ポートにそれぞれが流動的に連結した多数のガス交換器中空繊維、ならびに、前記ガス交換器中空繊維の外側と前記ガス交換器ハウジングとの間におけるガス交換器ガス空間を含む細胞増殖システム。
- 請求項13に記載の細胞増殖システムであって、前記ガス交換器が、ガスを前記ガス空間に流すための、前記ガス交換器ハウジングに設置されるガス注入ポートおよびガス排出ポートを更に含む細胞増殖システム。
- 更にロッカーを含む、請求項1に記載の細胞増殖システム。
- 請求項17に記載の細胞増殖システムであって、前記ロッカーが、前記細胞成長チャンバーを、前記細胞成長チャンバーの中心軸の周りに回転させる細胞増殖システム。
- 請求項17に記載の細胞増殖システムであって、前記ロッカーが、前記細胞成長チャンバーを、前記成長チャンバーの中心軸に垂直な軸の周りに回転させる細胞増殖システム。
- 以下を含む、細胞増殖システムの一部に装着されるよう構成される着脱可能流れ回路:
a)少なくとも対向する末端を備える第1の液体流路を含む第1の循環経路、ここにおいて、前記第1の液体流路の第1の末端は細胞成長チャンバーの第1の末端に流動的に連結するよう構成されており、前記第1の液体流路の第2の末端は前記細胞成長チャンバーの対向する末端に流動的に連結するよう構成されている;
b)少なくとも対向する末端を備える第2の液体流路、ここにおいて、前記第2の液体流路の一末端は前記細胞成長チャンバーに流動的に連結するよう構成されており、前記第2の液体流路の第2の対向する末端は前記細胞成長チャンバーに流動的に連結するよう構成されている。 - 前記液体流路に流動的に連結された第1の液体注入路を更に含む、請求項20に記載の流れ回路。
- 少なくとも1つの前記第1のまたは第2の液体流路に流動的に連結された第1の液体排出路を更に含む、請求項21に記載の流れ回路。
- 以下を含む、請求項1に記載の細胞増殖システムにおいて細胞の集団を増殖する方法:
請求項1に記載の細胞増殖システムの第1の液体流路に細胞を添加すること;
前記細胞をインキュベートし、増殖した細胞の集団を作製すること。 - 前記増殖した細胞の集団の少なくとも一部を収集することを更に含む、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞である請求項23に記載の方法。
- 前記細胞が接着性幹細胞である請求項23に記載の方法。
- 前記細胞が非接着性幹細胞である請求項23に記載の方法。
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