ES2226850T3

ES2226850T3 - Diseño de biorreactor y procedimiento para preparar tejido a partir de celulas.

Info

Publication number: ES2226850T3
Application number: ES00936493T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey M. Macdonald; Stephen P. Wolfe
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; University of North Carolina System
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; University of North Carolina System
Priority date: 1999-06-03
Filing date: 2000-06-05
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2020-06-05
Also published as: CA2376039A1; JP4656789B2; WO2000075275A2; DE60013277T2; ZA200109939B; JP2003501078A; AU5180100A; EP1185612A2; WO2000075275A3; DE60013277D1; EP1185612B1; AU780160B2; ATE274571T1; HK1045323A1

Abstract

Biorreactor, que comprende: (a) un alojamiento que tiene un lado interno que comprende: medios de introducción de gas integral al alojamiento; y medios de espiración de gas integral al alojamiento; (b) una serie de una pluralidad de módulos de fibras huecas, que residen dentro del alojamiento, comprendiendo cada módulo: (i) una pluralidad de fibras huecas coaxiales, teniendo cada una un lado interno y un lado externo, que incluye una fibra hueca más interna y una fibra hueca más externa; (ii)una pluralidad de compartimentos, que comprende: un primer compartimento definido por el lado interno de la fibras hueca más interna; y (iii) al menos un compartimento adicional definido por un espacio anular respectivo entre fibras adyacentes de la pluralidad de fibras huecas coaxiales; y (c) un compartimento más externo definido por un espacio dentro del lado interno del alojamiento que no está ocupado por la pluralidad de módulos (d) en el que el primer compartimento, el al menos un compartimento adicional y el compartimento más externo comprenden además cada uno al menos un orificio de entrada; y al menos un orificio de salida, y (e) en el que el alojamiento comprende además: (i) al menos un colector interno y al menos un colector externo para el primer compartimento; y (ii)al menos un colector interno y al menos un colector externo para cada compartimento adicional.

Description

Diseño de biorreactor y procedimiento para preparar tejido a partir de células.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a dispositivos y a procedimientos de fabricación y uso de dispositivos para el cultivo celular. En particular, la presente invención se refiere a dispositivos y procedimientos de fabricación y uso de dispositivos para el crecimiento o mantenimiento de células eucariotas. Una realización de la invención lleva a cabo funciones del hígado humano.

2. Antecedentes de la invención y reconocimiento de los problemas

La insuficiencia hepática se clasifica en varios tipos principales, que incluyen la insuficiencia hepática aguda, enfermedad hepática crónica y fallo multiorgánico. Las etiologías principales de la insuficiencia hepática son la hepatitis vírica y la hepatotoxicidad inducida por fármacos y toxinas. La insuficiencia hepática avanzada da como resultado encefalopatía y coma y puede ser mortal. El tratamiento se centra en la estabilización del paciente hasta la recuperación espontánea de la función hepática o hasta el transplante de hígado. En total, la mortalidad anual atribuible a insuficiencia hepática sobrepasa las 27.000 personas cada año en los Estados Unidos.

Los órganos artificiales, que son dispositivos fabricados completamente a partir de materiales no biológicos, han hecho progresar enormemente la atención sanitaria. Los órganos artificiales y los sustitutos de tejido, incluyendo las máquinas de diálisis renal, respiradores mecánicos, marcapasos cardiacos y bombas cardiacas mecánicas han mantenido con vida a muchas personas con graves enfermedades potencialmente mortales. La utilidad de tales órganos artificiales se refleja en su uso generalizado. Por ejemplo, los marcapasos sirven perfectamente como sustitutos de sus análogos biológicos.

El riñón artificial, a veces denominado máquina de diálisis renal, ilustra tanto los beneficios como los defectos de los órganos puramente artificiales. Las máquinas de diálisis renal son eficaces en la eliminación de urea, creatinina, agua y sales en exceso de la sangre, realizando así parcialmente las principales funciones del riñón natural. Claramente, los riñones artificiales han pospuesto la muerte de pacientes con insuficiencia renal. Sin embargo, las máquinas de diálisis renal son insuficientemente selectivas y eliminan de manera inapropiada componentes biológicos, tales como hormonas esteroideas, lo que no hace un riñón natural en funcionamiento. En consecuencia, la diálisis durante un periodo prolongado puede dar como resultado pérdida ósea, irregularidades en la coagulación, inmunodeficiencias y esterilidad.

El paciente con insuficiencia hepática, a diferencia del paciente con insuficiencia renal, no puede tratarse específicamente. La diálisis renal, que revolucionó el tratamiento de la insuficiencia renal, no tiene en la actualidad un equivalente hepático. Actualmente, el único tratamiento disponible para la insuficiencia hepática que no responde a tratamiento es el transplante hepático. Muchos pacientes con insuficiencia hepática no cumplen los requisitos para un transplante debido infección concomitante o insuficiencia de otro órgano. Debido a la escasez de órganos y a las largas listas de espera, incluso aquellos que cumplen los requisitos para el transplante de hígado a menudo mueren mientras esperan un aloinjerto. La UCLA (Universidad de California en Los Ángeles) informó de que una cuarta parte de sus candidatos para transplante murieron antes de que pudieran obtener un hígado. Los órganos adecuados para el transplante en el grupo de edad pediátrica son incluso más escasos (Busuttil, R. W. et al. Ann Surg 1987, 206, 387).

El hígado natural tiene cuatro clases principales de funciones bioquímicas. En primer lugar, el hígado biosintetiza una amplia gama de proteínas, incluyendo componentes acelulares principales de la sangre, tales como la albúmina sérica, alfa-antitripsina, alfa-macroglobulina, enzimas, factores de coagulación, moléculas portadoras para oiligoelementos y las apolipoproteínas. Después, el hígado libera estos componentes a la circulación sanguínea. El hígado también mantiene las concentraciones plasmáticas apropiadas de aminoácidos y ácidos grasos. En segundo lugar, el hígado desempeña un importante papel en las reacciones de desintoxicación. El hígado oxida o conjuga muchas sustancias venenosas nocivas externas, procesos que normalmente, pero no siempre, disminuyen el carácter venenoso de las toxinas. El hígado también destruye la hemoglobina en exceso, metaboliza las moléculas de porfirina de la hemoglobina y recircula el componente de hierro. En tercer lugar, los productos de desecho, tales como la bilirrubina, se conjugan y excretan a través del árbol biliar. En cuarto lugar, el hígado sintetiza y secreta las sales biliares, que sirven como detergentes que promueven la emulsificación y digestión de los lípidos. La multiplicidad y el carácter bioquímico de la función hepática aumentan infinitamente la complejidad del soporte hepático extracorpóreo.

Los órganos bioartificiales son órganos artificiales diseñados para contener y mantener un componente biológico viable. Muchas funciones biológicas son incluso más complejas que simplemente generar un potencial de tensión a intervalos regulares, tal como se produce en el marcapasos más sencillo. Los ejemplos incluyen la biosíntesis de componentes sanguíneos y el tratamiento catabólico de agentes nocivos. El hígado, las glándulas endocrinas, la médula ósea y el riñón desempeñan un papel destacado en tales funciones bioquímicas especializadas. Los órganos artificiales sin un componente biológico no pueden reproducir las complejas funciones bioquímicas ejercidas por éstos órganos.

Históricamente, los sustitutos de hígado artificial no biológicos han dependido de hemodiálisis y hemoperfusión, pero han sido de beneficio a muy corto plazo y sumamente restringido (Abe, T. et al., Therapeutic Apheresis 2000, 4:26). A diferencia de los órganos puramente artificiales, un sustituto de hígado eficaz debe tener un componente biológico. El hígado es el órgano de mayor masa del cuerpo humano, excluyendo los órganos distribuidos, tales como la piel, intestino, sistema hematopoyético y vasculatura. Mantener una gran masa de células hepáticas en funcionamiento in vitro presenta varios obstáculos. Pueden describirse al menos ocho problemas principales para desarrollar un hígado bioartificial funcional: 1) hacer crecer u obtener células apropiadas y viables; 2) proporcionar una masa mínima, crítica de células; 3) suministrar oxígeno a las células; 4) suministrar nutrientes a las células y eliminar los productos de desecho celulares de manera eficaz; 5) limitar las fuerzas de corte y las presiones hidrostáticas; 6) inducir o mantener un fenotipo celular diferenciado con la capacidad para la biosíntesis y la biotransformación de las toxinas; 7) mantener la esterilidad; y 8) evitar el rechazo del tejido hepático o la lisis por el complemento.

1) Hacer crecer u obtener células apropiadas y viables

Las células hepáticas para su uso potencial en hígados bioartificiales pueden ser líneas celulares establecidas, aislados primarios dehígados humanos o animales, o células hepáticas primordiales; sin embargo, la secreción de factores tumorigénicos está afectando negativamente a la aprobación por parte de la FDA de los diseños de BAL (hígado bioartificial) que incorporan líneas celulares (Xu, A. S. L. et al., 2000 en Lineage Biology and Liver, Lanza, R. P., Langer R. y Vacanti, J. (Ed.), Academic Press, San Diego, págs. 559-597). Están disponibles líneas celulares de hígado, por ejemplo HepG2 y C3A, que expresan muchas funciones de un hígado diferenciado. Las líneas celulares ofrecen la posibilidad de hacer crecer un número suficiente de células en un sistema de cultivo celular en masa extracorporal, o biorreactor, para mantener a un paciente, porque el crecimiento de las líneas celulares no está limitado por la senescencia celular, sino por la disponibilidad de nutrientes. También pueden obtenerse células hepáticas primarias, humanas o animales, en el número requerido para un hígado bioartificial funcional. Sin embargo, el uso de un hígado humano para la preparación celular está limitado por su falta de disponibilidad y el uso de un hígado animal para la preparación celular padece cierto grado de incompatibilidad celular. La incompatibilidad celular aguda resulta de la unión de anticuerpos que reconocen células foráneas seguido por la unión de proteínas del sistema del complemento y la lisis de las células foráneas. También existen mecanismos de incompatibilidad celular a más largo plazo, pero no deben presentar ningún problema para el uso de biorreactores como productos médicos intermedios o "puente". Una posible alternativa a la inoculación inicial con una masa grande de células diferenciadas es la expansión de células madre hepáticas que son progenitoras de las células hepáticas maduras. Informes recientes sugieren que las células progenitoras hepáticas se ven sometidas a múltiples divisiones celulares en el camino hacia la mutación y la diferenciación (Brill, S. et al., Differentiation 1995, 59, 95; Sigal S. H. et al., Differentiation 1995, 59, 35). El control adecuado de los procesos de crecimiento y diferenciación con la aplicación por etapas de citocinas apropiadas puede permitir la preparación de una cantidad clínicamente útil de células.

2) Proporcionar una masa mínima, crítica de células

El hígado humano adulto tiene una masa de aproximadamente 1400 - 1600 gramos, y ofrece una reserva considerable o capacidad redundante. Se estima que la supervivencia humana puede mantenerse con aproximadamente el
15 - 20% de la masa total del hígado. La cifra del 20% de la masa del hígado corresponde a aproximadamente 5 x 10^{5} células (Kasai et al. Artif organs 1994, 18, 348). La mayoría, si no todos, los diseños previos de hígado bioartificial tienen una capacidad celular lamentablemente inadecuada. Es decir, tales dispositivos pueden mantener bastante menos de 5 x 10^{5} células, a menudo órdenes de magnitud inferiores de células. Sin la masa celular crítica para la biosíntesis de los componentes plasmáticos y las reacciones de desintoxicación, estos otros diseños tienen poca utilidad clínica.

3) Suministrar oxígeno a las células

Las unidades funcionales de la mayoría de los órganos, tales como la nefrona, ácino, alvéolos, microvellosidades, piel, etc., consisten en un lecho capilar a cuyo través existe un gradiente físico-químico. Estos gradientes se controlan mediante efectos de transferencia de masa. El oxígeno es el principal nutriente que es limitante en los cultivos celulares (MacDonald, J. M. et al. NMR Biomed 1998, 11, 1; Glacken M. W. et al. Ann NY Acad Sci 1983, 413, 355). La oxigenación "integral" o la aireación dentro del biorreactor que contiene el material biológico o químico de interés, aumenta mucho la transferencia de masa de oxígeno y ácido carbónico. La formación de éste último puede utilizarse para controlar el pH.

El documento EP-A-0 113 328 describe un biorreactor para mantener células en estado de proliferación y secreción continua de productos, que comprende (i) un alojamiento cilíndrico que define una cámara y que tiene una entrada y una salida para el suministro de un gas que contiene oxígeno integral a él, (ii) un primer tubo hueco permeable a los líquidos para el suministro del medio de nutrientes alojado en él, (iii) un segundo tubo hueco permeable a los líquidos con diferente permeabilidad para la salida de productos celulares dispuesto de manera coaxial alrededor del primer tubo, (iv) un tubo permeable a los gases dispuesto en la cámara y enrollado alrededor de ambos tubos coaxiales; y (v) un compartimento definido en la cámara por el espacio que no está ocupado por los tubos, en el que se proporciona una matriz semirrígida para contener las células.

El documento US-A-4.833.083 describe un biorreactor que comprende (i) un alojamiento, y (ii) una pluralidad de módulos de elementos tubulares porosos, en los que cada módulo comprende dos elementos tubulares porosos y en los que cada módulo comprende dos elementos tubulares porosos dispuestos de manera coaxial.

Sin embargo, ni el biorreactor del documento EP-A-0 113 328 ni el biorreactor del documento US-A-4.833.083 están dotados de ningún medio para regular el flujo de los líquidos que fluyen a través de los diferentes compartimentos del módulo.

El documento EP-A-0 909 811 describe un biorreactor para cultivar hepatocitos humanos que comprende (i) un alojamiento que tiene al menos una entrada y una salida; (ii) una estructura macroporosa, cilíndrica, hueca dispuesta en él, cuya superficie interna y externa está cubierta con dos membranas semipermeables; por tanto, dichas membranas se disponen de manera coaxial y definen tres espacios anulares dentro del alojamiento, y (iii) dos orificios para introducir células en la estructura macroporosa. Este biorreactor comprende sólo un módulo de fibra hueca y el alojamiento no está dotado ni con ningún medio para la introducción / espiración de gas, ni con ningún medio para regular el flujo de los líquidos que fluyen a través de los diferentes compartimentos del módulo.

El oxígeno es generalmente el nutriente limitante en los hígados bioartificiales de fibra hueca (Catapano, G. et al. Int J Art Organs 1996, 19, 61) principalmente porque los hepatocitos son células sumamente aerobias, lo que produce problemas en la transferencia de masa de oxígeno. El oxígeno tiene un coeficiente de difusión relativamente alto y su transferencia de masa desde la sangre en los sinuosides hepáticos hasta los hepatocitos está dominada por la difusión en lugar de por la convección (es decir, se producen convección y perfusión por gradientes de presión). Estos efectos son debidos a que una molécula de oxígeno es mucho más pequeña que otros nutrientes, tales como la molécula de glucosa o que productos biosintéticos tales como las proteínas, o debidos a que los hepatocitos generan bruscos gradientes de concentración en los hígados bioartificiales. Con tasas conocidas de difusión de oxígeno y consumo de oxígeno, y estimaciones razonables de la densidad celular, la distancia de difusión en la que la utilización de oxígeno se convierte en un factor limitante de la tasa para el crecimiento es de aproximadamente 200 \mum (MacDonald, J. M. et al., 1999, en Cell Encapsulation Technology and Therapeutics, Kuntreiber, W., Lanza, R. P. y Chick, W. L. (Eds.) Birkhauser Boston, Cambridge, págs. 252-286. En los hígados bioartificiales con oxigenación en serie aireados con aire, el oxígeno se vuelve limitante de manera axial en los medios de perfusión a 25 mm (MacDonald et al., 1999, citado anteriormente).

Los hepatocitos tienen una elevada tasa metabólica y requieren un suministro de oxígeno continuo. La tasa de consumo de oxígeno oscila desde 0,59 hasta 0,7 nmoles/s/10^{6} células para las células HepG2 (Smith, M. D. et al Int J Artif Organs 1996, 19, 36) y es de 0,42 nmoles/s/10^{6} células para los hepatocitos aislados (Rotem, A. et al Biotech Bioeng 1992, 40, 1286). La oxigenación integral, es decir, el suministro continuo de oxígeno a lo largo de la trayectoria de suministro de los medios a las células, es esencial para suministrar oxígeno a células hepáticas. La oxigenación en serie, que es la oxigenación en uno o algunos sitios en la tubería de fluido de suministro de medios no puede mantener la masa de células hepáticas necesaria para un hígado bioartificial eficaz. Una dificultad con la oxigenación en serie es que la solubilidad del oxígeno en medios acuosos no complementados con portadores de oxígeno es tan baja que todo el oxígeno presente se agotará rápidamente por el metabolismo celular. De hecho, en un flujo longitudinal a lo largo de una membrana semipermeable de un biorreactor convencional, los hepatocitos agotan el oxígeno en 2,5 centímetros a lo largo de la trayectoria y, por tanto, se mejora la transferencia de masa de oxígeno convectiva por medio del aumento del flujo Starling. El aumento de las velocidades de flujo a través de los biorreactores convencionales puede producir bifurcaciones de las fibras y afectar de manera adversa a la función de los hepatocitos (Callies, R. et al., Bio/Technology 1994 12:75). Por tanto, los diseños de hígado bioartificial que no proporcionan un suministro de oxígeno adecuado sólo pueden soportar un número limitado de células. Además, el flujo de oxígeno en un sistema de difusión limitada obliga a las células a crecer muy próximas (a menos de aproximadamente 0,2 mm) al suministro de oxígeno. Por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.622.857 concedida a Goffe, describe un biorreactor con algunas fibras huecas, semipermeables coaxiales y algunas paralelas. El diseño de Goffe permite la oxigenación integral pero no restringe el espesor del compartimento para células. El espaciado de fibra a fibra en ese diseño es de
3 - 5 mm, de modo que no hay un control estricto de la distancia de difusión del oxígeno. De manera similar, la patente de los EE.UU. número 5.183.566 concedida a Darnell et al. describe un biorreactor con haces de fibras huecas en paralelo. El diseño de Darnell et al. no permite que se construyan múltiples haces de fibras multicoaxiales individuales con distancias de difusión precisas y reproducibles y el diseño no se amplía a escala fácilmente. El diseño de Darnell et al. utiliza haces de fibras paralelas, de nuevo sin tratar de manera eficaz la cuestión de la difusión del oxígeno. Por tanto, sigue habiendo la necesidad de un biorreactor que se ocupe eficazmente del espesor limitado por la difusión de la masa celular proporcionando una masa crítica de células, y suministrando oxígeno en toda la longitud del biorreactor sin efectos de fuerzas de corte adversos.

4) Suministrar nutrientes a las células y eliminar los productos de desecho celulares de manera eficaz

El problema de suministrar nutrientes tales como hidratos de carbono, lípidos, minerales y vitaminas se ha resuelto satisfactoriamente mediante varias variantes de la tecnología de fibra hueca y estas características deben incorporarse satisfactoriamente a cualquier diseño de hígado bioartificial u órgano bioartificial viable. De manera similar, el problema de eliminar los residuos metabólicos se trata mediante el mismo sistema que suministra los nutrientes. Las tasas de consumo para el glutamato, piruvato y glucosa están normalmente en el intervalo de 0,03 a 0,3 nmoles/s/10^{6} células, con suposiciones razonables para la densidad celular y la tasa de crecimiento (Cremmer, T. et al. J Cell Physiol 1981, 106, 99; Imamura, T. et al. J Anal Biochem 1982, 124, 353; Gacken, M. Dissertation 1987). Las tasas de difusión del oxígeno en el tejido son similares a las del piruvato en agua y superiores a las de la glucosa. Como estas tasas de consumo son inferiores a la tasa de consumo de oxígeno, el oxígeno es el nutriente limitante en la mayoría de las condiciones.

5) Limitar las fuerzas de corte y la presión hidrostática

Para un biorreactor dado, existe un equilibrio óptimo de convección y difusión para una transferencia de masa de oxígeno adecuada, sin la creación de grandes gradientes de oxígeno. Por ejemplo, utilizando un intervalo de oxígeno no tóxico, < 0,4 mM (la constante de solubilidad es de 1,06 mM/atm, para la solubilidad del aire es de 0,2 mM a 37ºC), la componente convectiva de la transferencia de masa de oxígeno debe aumentar a medida que las células estén cada vez más alejadas de 0,2 mm del suministro de oxígeno (MacDonald et al., 1999, citado anteriormente). Aunque la presión parcial de oxígeno en el sinuoside hepático es de aproximadamente 70 mm Hg cerca de la tríada portal, cayendo hasta 20 mm Hg cerca de la vena central, que corresponde a un intervalo de 0,096 a 0,027 mM de oxígeno libre, el oxígeno unido a hemoglobina oscila desde 6,26 hasta 2,91 mM. La velocidad del flujo sanguíneo en el sinusoide hepático es de aproximadamente 0,02 cm/s, mientras que el coeficiente de difusión de oxígeno es de aproximadamente 4 órdenes de magnitud inferior, o de 2 x 10^{-6} cm^{2}/s. Sin embargo, la función hepática se ve afectada adversamente con fuerzas de corte crecientes y los hepatocitos in vivo están protegidos por una capa de endotelio y matriz extracelular en el espacio de Disse. Fuerzas de corte suficientes destruirán los hepatocitos. Otras personas han encontrado que las fuerzas de corte inducen citocromos P450 específicos (Mufti N. A. y Shuler, M. L., Biotechnol. Prog., 1995, 11, 659). Un estudio reciente ha mostrado que el hígado se regenera más rápido con un 90% de hepatectomía que con un 70% y esto se atribuyó a fuerzas de corte superiores (Sato, Y. et al., Surg. Today, 1997, 27, 518). Sin embargo, esta regeneración más rápida también podría deberse a un aumento de la transferencia de masa de oxígeno, nutrientes y agonista. Por tanto, existe cierto nivel máximo de fuerza de corte que pueden sostener los hepatocitos en tanto que muestran una función óptima. Este nivel máximo puede aumentarse si una capa de endotelio protege los hepatocitos.

Para aumentar la convección, se aumentan los gradientes de presión hidrostática. Presiones hidrostáticas elevadas pueden implosionar los hepatocitos. Por tanto, es importante permanecer por debajo de estas presiones. Es posible producir una mortalidad del 100% de los hepatocitos aislados de rata generando presiones hidrostáticas superiores a 7 psi (> 300 mm Hg) durante más de 2 minutos, mientras se inoculan estas células en un biorreactor coaxial utilizando una jeringa.

6) Inducir o mantener un fenotipo celular diferenciado con la capacidad para la biosíntesis y la biotransformación de las toxinas

El uso del fenotipo diferenciado de las células hepáticas es necesario para producir un hígado artificial útil debido a que las funciones especializadas del hígado, que incluyen la biosíntesis de componentes sanguíneos y la desintoxicación de toxinas, están asociadas con el fenotipo diferenciado. Estas funciones especializadas se pierden en su totalidad, o en parte, según se diferencian las células, lo que ocurre a menudo en el cultivo celular primario aislado. Por el contrario, la forma de células hepáticas que puede tener un rápido crecimiento es el fenotipo diferenciado, lo que deja al médico que equilibre dos necesidades opuestas (Enat, R. et al. Proc. Natl Acad Sci USA, 1984, 81, 1411). Algunos informes sugieren que el fenotipo de las células hepáticas puede modularse mediante la presencia de citocinas y componentes de la matriz extracelular. En particular, los componentes de la matriz extracelular ricos en colágeno IV y laminina, producidos por las células de sarcoma de Engelbrech-Holm (EHS) y disponibles comercialmente como MATRIGEL^{MR}, cuando se utilizan con medios definidos hormonalmente inducen un fenotipo diferenciado (Enat, R. et al., citado anteriormente; Bissell, D. M. Scan J Gasterenterol-Suppl 1988, 151, 1; Brill, S. et al. Proc. Soc Exp Biol Med, 1993, 204, 261).

7) Mantener la esterilidad

La puesta en práctica de procedimientos de esterilización sencillos para los biorreactores y componentes asociados es esencial para la utilidad clínica de los órganos bioartificiales extracorporales. Afortunadamente, los procedimientos de esterilización están bien establecidos, incluyendo los métodos habituales tanto para la esterilización de dispositivos extracorporales como para el mantenimiento de la asepsia mediante filtros en línea habituales.

8) Evitar el rechazo del tejido hepático o la lisis por el complemento

Puede producirse el rechazo de tejido foráneo mediante un rápido proceso conocido como lisis mediada por el complemento que supone la unión de anticuerpos circulantes a la superficie celular foránea, unión de las proteínas del sistema del complemento y lisis de la célula causal. El sistema inmunitario mediado por células es responsable de las reacciones de rechazo retrasadas. Sin embargo, el sistema inmunitario mediado por células no debe desempeñar un papel principal en los sistemas de biorreactor que no permiten el contacto directo de las células del donante y el huésped. Las reacciones ante cuerpos extraños, por ejemplo, frente a los componentes estructurales de los biorreactores, están también mediadas por células y, por tanto, no deben constituir obstáculos sustanciales.

Mejoras necesarias

A la vista de lo anterior, existe una clara necesidad de hígados artificiales para mantener pacientes con insuficiencia hepática. Específicamente, existe la necesidad de una versión mejorada de un hígado artificial que tuviese una elevada capacidad celular biológica en capas muy finas de células, fácilmente accesibles para el oxígeno y los nutrientes. Existe la necesidad de un aparato o biorreactor, que proporcione un suministro eficaz de oxígeno a grandes masas de células en cultivo celular y que permita la transferencia de productos celulares biosintéticos beneficiosos al paciente. De manera similar, existe la necesidad de métodos eficaces de uso de tal aparato.

Los problemas de los diseños de biorreactor existentes incluyen la inadecuada oxigenación, mínima capacidad para el componente celular biológico, limitada capacidad de eliminación de toxinas, excesivas fuerzas de corte e hidrostáticas y dificultad para la transferencia de los productos celulares biosintéticos para su uso por el paciente. Además, los diseños de biorreactor existentes no han tratado eficazmente el espesor limitado por la difusión de la masa celular, lo que proporciona una masa crítica de células, ni el suministro de oxígeno en toda la longitud del biorreactor.

3. Sumario de la invención

Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar realizaciones variables de un aparato que proporcione un suministro eficaz de oxígeno a grandes masas de células en un cultivo celular en un biorreactor y métodos para el uso del mismo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un aparato que permita que se contengan células en un espacio anular delgado adyacente a un medio de nutrientes continuamente oxigenado y que fluye, que proporcione el oxígeno y los nutrientes esenciales y se lleve los productos metabólicos.

Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar un aparato para la recogida de los productos biosintéticos de grandes masas de células en un biorreactor.

Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar un aparato para el montaje de un dispositivo para desintoxicar sangre o plasma de un paciente que no puede eliminar o inactivar estas toxinas.

Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar un aparato para que sirva como un hígado sustituto.

La presente invención proporciona un biorreactor de fibra hueca multicoaxial, ampliado a escala, que tiene: un alojamiento que tiene un lado interno; y una serie de aproximadamente 20 a aproximadamente 400 módulos de fibras huecas, teniendo cada módulo al menos tres fibras huecas semipermeables, coaxiales. El módulo de fibras huecas tiene una primera fibra encajada dentro de una segunda fibra; la segunda fibra encajada dentro de una tercera fibra; etcétera. Cada fibra tiene un lado interno y un lado externo. Un primer compartimento está definido por el lado interno de la primera fibra y tiene al menos un primer orificio de entrada y al menos un primer orificio de salida. Un segundo compartimento está definido por un primer espacio anular entre el lado externo de la primera fibra y el lado interno de la segunda fibra, y tiene al menos un segundo orificio de entrada y al menos un segundo orificio de salida. Un tercer compartimento está definido por un segundo espacio anular entre el lado externo de la segunda fibra y el lado interno de la tercera fibra, y tiene al menos un tercer orificio de entrada y al menos un tercer orificio de salida; y los compartimentos sucesivos están definidos por las fibras adyacentes. El compartimento superior, para permitir la aireación integral, está definido por un espacio anular entre el lado externo de la fibra superior y el lado interno del alojamiento y tiene al menos un orificio superior de entrada y al menos un orificio superior de salida. El alojamiento tiene al menos un colector de entrada y al menos un colector de salida para cada compartimento.

Una realización adicional de la presente invención ofrece un biorreactor conectado en serie con múltiples biorreactores de fibra hueca multicoaxiales, ampliados a escala, en los que dos o más compartimentos están conectados de una manera continua y en serie. Esta puesta en práctica es particularmente útil tanto para la biotransformación de toxinas en plasma de un paciente como para la biosíntesis de componentes plasmáticos para complementar la sangre del paciente.

Otra realización de la presente invención incluye un biorreactor unilateral de fibra hueca multicoaxial que está adaptado particularmente para estudios de RMN y usos en los que es necesario el acceso a todos los orificios desde un lado o un extremo.

Aún otra realización de la presente invención incluye un biorreactor bilateral de fibra hueca multicoaxial que está adaptado particularmente para investigaciones a pequeña escala.

Todavía otra realización de la presente invención incluye un biorreactor de fibra hueca empaquetadas de forma apretada. Esta puesta en práctica es particularmente útil para un cultivo de células de alta densidad en una disposición compacta y es adecuada tanto para la transformación de toxinas en plasma como para la biosíntesis de componentes plasmáticos para utilizarse como complemento de la sangre de un paciente.

El biorreactor de la presente invención, cuando se utiliza como un hígado artificial, tiene un diseño modular para permitir un fácil ajuste de la capacidad funcional del hígado dependiendo del peso del paciente, de si el paciente es un bebé, niño, adolescente o adulto, hombre o mujer, y del grado de función hepática que le queda al paciente. El biorreactor de la presente invención tiene además compartimentos tanto para plasma como para el medio de nutrientes, para permitir la biotransformación de toxinas en el plasma del paciente y para facilitar medios del biorreactor para aumentar la transferencia eficaz de productos biosintéticos desde el hígado artificial hasta el paciente. Cuando se utiliza con células hepáticas u otras, esta invención es útil en la preparación de productos biosintéticos para pacientes, en uso experimental, y para su uso como aparato de biotransformación complementario para la desintoxicación de sangre. Las toxinas en la sangre pueden incluir, pero no están en modo alguno limitadas a ellas, desechos metabólicos, productos de la descomposición de células o eritrocitos, sobredosis de agentes farmacológicos de prescripción médica tales como el paracetamol y sobredosis de agentes farmacológicos ilícitos. La facilidad de fabricación de la invención facilita el desarrollo comercial rentable.

Por tanto, se ha explicado resumidamente, en vez de ampliamente, las características más importantes de la invención con el fin de que pueda entenderse mejor la descripción detallada de la misma que sigue, y con el fin de que pueda apreciarse mejor la presente contribución a la técnica. Por supuesto, existen características adicionales de la invención que se describirán más adelante en el presente documento y que formarán el contenido objeto de las reivindicaciones adjuntas al mismo.

Como tal, los expertos en la técnica apreciarán que la concepción, en la que se basa esta descripción, puede utilizarse fácilmente como base para el diseño de otras estructuras, métodos y sistemas para llevar a cabo los diversos fines de la presente invención.

Éstos junto con otros objetos de la presente invención, junto con las diversas características de novedad que caracterizan la invención, se señalan con particularidad en la reivindicaciones adjuntas y que forman parte de esta descripción. Para una mejor comprensión de la invención, sus ventajas de funcionamiento y los objetos específicos conseguidos con sus usos, debe hacerse referencia a los dibujos y material descriptivo adjuntos, en los que se ilustran realizaciones preferidas de la invención.

4. Breve descripción de los dibujos

La figura 1A ilustra una vista parcial de una unidad de fibras multicoaxial que comprende una pluralidad de compartimentos.

La figura 1B ilustra una representación gráfica de las concentraciones radiales de oxígeno.

La figura 1C ilustra una representación gráfica de las concentraciones axiales de oxígeno.

La figura 2A ilustra una vista en alzado de un biorreactor de fibras multicoaxial.

La figura 2B ilustra una vista ampliada de un detalle de una unidad de fibras multicoaxial.

La figura 3A ilustra un conjunto de componentes para centrar las fibras.

La figura 3B ilustra un detalle del espaciador.

La figura 3C ilustra las bridas de fibra.

La figura 3D ilustra un detalle de la disposición de colectores para el biorreactor.

La figura 3E proporciona una ilustración alternativa de los colectores.

La figura 4 ilustra las cuatro etapas principales de dos procedimientos utilizados para construir biorreactores multicoaxiales.

La figura 5 ilustra un procedimiento general de soldado termoplástico de fibras huecas.

La figura 6A ilustra una vista en perspectiva de una realización bilateral de un biorreactor.

La figura 6B ilustra un detalle del lado delantero del primer colector.

La figura 6C ilustra un detalle del lado trasero del primer colector.

La figura 6D ilustra una vista ampliada del primer colector y sus elementos asociados.

La figura 6E ilustra un detalle del lado delantero del segundo colector.

La figura 6F ilustra un detalle del lado delantero del segundo colector.

La figura 6G ilustra un detalle del lado trasero del segundo colector.

La figura 6H ilustra un collar y un detalle del colector.

La figura 6I es una sección transversal del segundo colector.

La figura 6J ilustra un detalle del lado delantero del tercer colector.

La figura 6K ilustra una vista en perspectiva del tercer colector.

La figura 6L ilustra una vista trasera del tercer colector.

La figura 6M es una sección transversal del segundo y tercer colectores.

La figura 6N proporciona una vista en planta del montaje completo para un biorreactor bilateral.

La figura 7 ilustra una base para biorreactores de producción en serie.

La figura 8 ilustra una vista en perspectiva de un biorreactor unilateral.

La figura 9 ilustra un pequeño biorreactor unilateral con oxigenación integral.

La figura 10A ilustra un biorreactor conectado en serie con una vista en alzado.

La figura 10B ilustra el flujo radial del hígado bioartificial conectado en serie con una vista detallada.

La figura 10C ilustra el flujo radial del hígado bioartificial conectado en serie con una vista detallada.

La figura 11A ilustra las variables utilizadas en la puesta en práctica de la ley de Darcy.

La figura 11B ilustra una relación entre la tasa de flujo radial y un diferencial de presión.

La figura 11C ilustra una relación entre la tasa de flujo radial y la presión en un compartimento para células.

La figura 12 ilustra el algoritmo para la selección de las características de la fibra hueca, para conseguir una función fisiológica y una viabilidad celular superiores.

La figura 13A ilustra una sección transversal de un biorreactor multicoaxial.

La figura 13B ilustra una sección transversal de una realización alternativa de un biorreactor multicoaxial.

La figura 14 ilustra una vista en perspectiva de una realización de un biorreactor.

La figura 15 ilustra una vista en perspectiva de un dispositivo utilizado en la construcción de un biorreactor.

5. Descripción de las realizaciones preferidas 5.1 Definiciones

Espacio anular. La distancia radial que separa dos fibras huecas adyacentes.

BAL. Hígado bioartificial. También, realizaciones específicas de la presente invención: el biorreactor de fibra hueca multicoaxial, ampliado a escala, el biorreactor de fibras huecas empaquetadas de manera apretada o el biorreactor conectado en serie con un complemento de células hepáticas, medio de nutrientes y gases.

Módulo del biorreactor. Fibras huecas semipermeables, dispuestas de manera coaxial. Un módulo forma el núcleo del biorreactor de fibra hueca multicoaxial mientras que el biorreactor de fibra hueca multicoaxial, ampliado a escala, comprende muchos módulos.

Biotransformación. La desintoxicación metabólica de sangre o plasma por tejidos o células.

Cuarto compartimento. El compartimento, si está presente, en un biorreactor que está delimitado por el exterior de la tercera fibra hueca y el interior de la cuarta fibra hueca, es decir, adyacente y está conectado a dos orificios, el orificio de entrada del cuarto compartimento y el orificio de salida del cuarto compartimento.

Primer compartimento. El compartimento en cualquiera de las realizaciones de biorreactor que está delimitado en parte por el interior de la primera y más interna fibra hueca coaxial y está conectado a dos orificios, el orificio de entrada del primer compartimento y el orificio de salida del primer compartimento.

Aireación integral. Exposición a un gas, normalmente aire u oxígeno con dióxido de carbono, en casi todos los puntos a lo largo de una trayectoria. La aireación integral se diferencia de la aireación en serie, en la que se inserta un dispositivo de burbujeo o de intercambio de gas en un punto en el circuito del fluido.

Colector. Una parte del biorreactor situada en un extremo de las fibras y que pretende separar físicamente los compartimentos y dividir el flujo de fluidos.

Microfibra o fibra hueca de microcalibre ("microbore"). Una fibra hueca semipermeable de 200 a 500 micrómetros de d.e. (diámetro externo).

Biorreactor de fibra hueca multicoaxial. El biorreactor que comprende tres o más fibras huecas semipermeables, dispuestas de manera coaxial, recubiertas por un alojamiento hueco.

Medio de nutrientes. Las disoluciones equilibradas de electrolitos enriquecidas con azúcares, oligominerales, vitaminas y potenciadores del crecimiento. Cada formulación particular se nombra por o para el formulador, a veces con designaciones caprichosas o poco esclarecedoras. Los medios de nutrientes incluyen, pero sin limitarse a ellos: RPMI 1640 (formulación nº 1640 del Roswell Park Memorial Institute), F-12 de Ham (la duodécima formulación del Dr. Ham en su serie F), DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) y CMRL-1415 (formulación nº 1415 del Connaught Medical Research Laboratory). Los medios de nutrientes se mejoran de manera rutinaria con la adición de hormonas, minerales y factores conocidos para los expertos en la técnica, incluyendo pero en modo alguno limitados a ellos, insulina, selenio, trasferrina, suero y plasma.

Biorreactor de fibra hueca multicoaxial unilateral. La versión del biorreactor de fibra hueca multicoaxial que tiene ambos orificios de entrada y salida en la misma placa terminal. Esta versión está adaptada particularmente para estudios de RMN y para estudios en los que es necesario el acceso a todos los orificios desde un lado.

Compartimento más externo. El compartimento en cualquiera de los biorreactores que está delimitado por el exterior de las fibras huecas más externas y el interior del alojamiento, y está conectado a dos orificios, el orificio de entrada del compartimento más externo y el orificio de salida del compartimento más externo.

Encapsulado. Un término de la técnica que significa la unión de elementos, tal como mediante pegado, o cualquier otro medio adecuado.

Biorreactor de fibra hueca multicoaxial, ampliado a escala. El biorreactor que comprende series de desde aproximadamente 20 módulos hasta aproximadamente 400 módulos de fibras huecas semipermeables, dispuestas de manera coaxial, en el que el conjunto completo de módulos se reviste mediante un alojamiento hueco.

Segundo compartimento. El compartimento en una realización de biorreactor que está delimitado por el exterior de la primera y más interna fibra hueca y el interior de la segunda fibra hueca coaxial, es decir, adyacente, y está conectado a dos orificios, el orificio de entrada del segundo compartimento y el orificio de salida del segundo compartimento. En un biorreactor de fibra hueca multicoaxial, unilateral y en algunos diseños de fibra de extremo cerrado, sólo un orificio proporciona acceso al compartimento 2.

Biorreactor conectado en serie. El sistema que comprende una pluralidad de biorreactores de fibra hueca multicoaxiales, ampliados a escala, o de biorreactores de fibras huecas empaquetadas de manera apretada, o una combinación en la que dos o más compartimentos están conectados de una manera continua y en serie. En este contexto, cada biorreactor ampliado a escala se denomina como una unidad de biorreactor.

Tercer compartimento. El compartimento en cualquiera de las realizaciones de biorreactor que está delimitado por el exterior de la segunda fibra hueca y el interior de la tercera fibra hueca coaxial, es decir, adyacente, y está conectado a dos orificios, el orificio de entrada del tercer compartimento y el orificio de salida del tercer compartimento.

Biorreactor de fibras huecas empaquetadas de manera apretada. El biorreactor ampliado a escala que comprende series de desde aproximadamente 20 módulos hasta aproximadamente 400 módulos de fibras huecas semipermeables, dispuestas de manera coaxial. Para la aireación, se disponen microfibras paralelas y adyacentes a los módulos y la totalidad se reviste mediante un alojamiento hueco.

5.2. Elementos del aparato

La presente invención incluye un biorreactor multicoaxial modular que no tiene, en teoría, límite para el número de fibras coaxiales. En una realización preferida, un biorreactor multicoaxial, ampliado a escala, comprende al menos dos conjuntos de colectores, al menos tres tamaños de fibra hueca, al menos dos conjuntos de tapas terminales y un alojamiento. Esta realización de biorreactor contiene al menos cuatro compartimentos separados. El diseño modular está compuesto por dos conjuntos de colectores, estando conectado cada par de colectores a cada extremo de las fibras. Existe una serie de aproximadamente 20 a aproximadamente 400 agujeros dispuestos de manera coaxial a través de los conjuntos de colectores y que alinean de manera coaxial las fibras. Los colectores incluyen opcionalmente distribuidores de flujo de modo que las tasas de flujo de la fase de fluido y de gas a través de las fibras son aproximadamente iguales. Los conjuntos de colector de fibra se unen de manera axial desde las fibras del diámetro mayor hasta las del diámetro menor y de manera axial desde las fibras del diámetro menor hasta las del diámetro mayor. Las fibras de menor diámetro se insertan en el interior de las fibras de mayor diámetro y los colectores respectivos se sellan entre sí. Para alinear las fibras, se insertan dos o más espigas a través de agujeros perforados de manera precisa en los tres colectores o conectando entre sí machihembrados de colectores adyacentes.

Los biorreactores de la invención actual combinan ventajosamente la oxigenación "integral" con distancias de difusión definidas, tienen orificios para alojar la formación potencial de un conducto biliar y/o se puede modificar a escala fácilmente. La oxigenación integral permite la transferencia de masa eficaz de gases disueltos y el control del pH. Las distancias de difusión definidas permiten tener parámetros físico-químico-biológicos predecibles, axiales y radiales, tales como las fuerzas de corte, disponibilidad de los nutrientes y pH. En uso con pacientes, pueden utilizarse uno o más de los al menos cuatro compartimentos para el plasma sanguíneo del paciente, mientras puede utilizarse otro para perfundir células con medios oxigenados de manera integral. Opcionalmente, se pueden conectar en serie dos o más unidades de biorreactor, de modo que las toxinas puedan perfundirse fuera del plasma, de manera radial a través de la masa celular en una unidad e infundir factores sintéticos en la siguiente unidad. Existe la posibilidad de desarrollar el sistema biliar utilizando los orificios como los orificios de salida del conducto biliar.

La figura 1A ilustra una unidad de fibra multicoaxial según la presente invención, que comprende una pluralidad de compartimentos. La fibra 102 más interna proporciona un espacio intercapilar o primer compartimento 104 para la recepción de los medios habituales o plasma. La fibra 106 intermedia proporciona un espacio anular o primer compartimento 108 intermedio para la contención de células tales como células hepáticas. La fibra 110 externa proporciona un espacio extracapilar o segundo compartimento 112 intermedio para la recepción de los medios. El alojamiento 114 define el perímetro más externo de la unidad de fibra multicoaxial. El espacio o compartimento 116 más externo entre el alojamiento 114 y la fibra 110 externa permite la recepción de un gas. La distancia 118 de difusión es la mitad de la anchura del primer compartimento 108 intermedio. La perfusión 120 radial es el flujo radial de, por ejemplo, oxígeno disuelto a través de la primera unidad de fibra, mientras que la perfusión 122 axial es el flujo axial de, por ejemplo, oxígeno disuelto a través de la primera unidad de fibra.

La figura 1B muestra un gradiente radial de oxígeno a través del primer compartimento 108 intermedio de un biorreactor coaxial que tiene células viables y oxigenación integral, en el que la concentración de oxígeno es igual en el primer compartimento 104 y el segundo compartimento 112 intermedio y un espacio 126 anular de 0,4 mm (milímetros) entre los separadores 102 y 106. Tal como se muestra, el porcentaje 124 de oxígeno se aproxima a cero cuando la distancia 126 se aproxima a la distancia 118 de difusión de 0,2 mm. Según se aproxima la distancia a 0,4 mm, el porcentaje 124 de oxígeno se aproxima al 100 por cien, de nuevo debido a la difusión de oxígeno desde el segundo compartimento 112 intermedio.

La figura 1C muestra los gradientes axiales de oxígeno obtenidos mediante el uso de diseños de biorreactor de hígado bioartificial que tienen oxigenación, o bien "en serie" o bien "en paralelo". Tal como se muestra, el porcentaje de oxígeno 128 disminuye con la distancia 130 cuando se utiliza la oxigenación "en serie" 132, pero permanece casi constante cuando se utiliza la oxigenación "en paralelo" 134, demostrándose así la disminución del gradiente axial de oxígeno debida a la oxigenación integral.

Esta invención permite el control preciso de las distancias de difusión deseadas junto con la oxigenación integral, y el diseño modular junto con el material de encapsulado permite que se dispongan fibras de cualquier composición en un orden multicoaxial deseado. Los expertos en la técnica conocen los materiales de encapsulado; tales como los descritos en la patente de los EE.UU. número 4.227.295 concedida a Bodnar et al. Cuando se utilizan fibras termoplásticas, tales como polipropileno, polietileno, polisulfona, etc., entonces los biorreactores pueden construirse utilizando un método de unión térmica tal como el descrito por Robinson en la patente de los EE.UU. número 5.015.585.

La figura 2A ilustra un biorreactor multicoaxial, ampliado a escala, que comprende una pluralidad de unidades de fibra multicoaxial. En una realización preferida, el biorreactor comprende desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 400 módulos de fibra multicoaxial contenidos en el alojamiento 202. Sin embargo, en teoría, no existe límite para el número de fibras coaxiales. Tal como se muestra, el alojamiento 202 tiene 17 centímetros de longitud 204 con un diámetro 206 de 8 centímetros, aunque se prevén dimensiones alternativas. Por ejemplo, la longitud de las fibras puede ser desde aproximadamente 2 centímetros hasta aproximadamente 50 centímetros y el diámetro puede ser desde aproximadamente 1 centímetro hasta aproximadamente 100 centímetros. Por ejemplo, el alojamiento 202 comprende tres conjuntos de colectores 208 y un conjunto de tapas 210 terminales, una para cada extremo respectivo del biorreactor. Se necesita un conjunto de colectores para cada tamaño de fibra hueca. El alojamiento se construye de vidrio, policarbonato, polipropileno, polietileno, Delrin (resina acetálica), teflón, acero, latón, material cerámico o cualquier otro adecuado. Los colectores 208 y las tapas 210 terminales pueden mecanizarse o formarse de material acrílico, termoplástico, cerámico o cualquier otro adecuado. Las fibras huecas que comprende cada módulo de fibra multicoaxial son preferiblemente semipermeables y están en cada uno de, por ejemplo, 3 tamaños: polisulfona de aproximadamente 5 milímetros de diámetro externo (d.e.); polisulfona de aproximadamente 3 milímetros de d.e.; y acetato de celulosa de aproximadamente 1 milímetro de d.e. Por tanto, existen tres fibras por unidad de fibra coaxial y tres colectores por módulo de fibras, estando los colectores conectados a cada extremo de las fibras. También puede crearse el \DeltaP deseado restringiendo la tasa de flujo efluente desde el orificio 212, por ejemplo, mediante el uso de una válvula de aguja. La invención también prevé realizaciones que tienen más de tres fibras coaxiales en cada módulo de fibra, con colectores y orificios correspondientes.

Cada biorreactor de las dimensiones enumeradas anteriormente o similares puede soportar hasta aproximadamente 160 gramos de tejido. Además, en otra realización se soporta una mayor capacidad de masa celular utilizando un compartimento anular más grande para el compartimento para células y/o utilizando fibras más largas. Un diseño anular para el compartimento para células tiene una ventaja adicional sobre el uso de tubos individuales debido a que puede obtenerse una biomasa órdenes de magnitud mayores. Por ejemplo, un hígado artificial descrito por Hu et al., patente de los EE.UU. número 5.605.835, en el que se encapsulan hepatocitos en colágeno en el compartimento intracapilar más interno, requeriría 44.860 fibras huecas de acetato de celulosa de 200 micras de diámetro para conseguir los aproximadamente 120 gramos de tejido necesarios para un hígado extracorporal. Por el contrario, la realización de la presente invención ilustrada en la figura 2 utiliza fibras en un factor de 150 veces inferior.

Las aberturas que conducen a los orificios permiten el movimiento de materiales. Los orificios 212 más internos permiten el flujo de medios o plasma a través del biorreactor. Los primeros orificios 214 intermedios permiten la inoculación de células en el interior, o el flujo de células a través, del biorreactor. Los segundos orificios 216 intermedios permiten el flujo de medios a través del biorreactor. Por último, los orificios 218 más externos permiten el flujo de gas a través del biorreactor. También se prevén usos de orificios alternativos. Por ejemplo, pueden fluir medios a través de los orificios 218, células en el interior, o a través, de los orificios 216, medios o plasma a través de 214 y oxígeno u otros gases a través de 212.

La figura 2B ilustra una vista ampliada de una unidad de fibra multicoaxial que comprende una pluralidad de compartimentos situados dentro del biorreactor multicoaxial. Tal como se muestra, los medios o el plasma que residen dentro del primer compartimento 104 pueden fluir hasta o recibirse desde el orificio 212 más interno. De manera similar; (1) las células que residen dentro del primer compartimento 108 intermedio pueden fluir hasta o recibirse desde el primer orificio 214 intermedio; (2) los medios situados dentro del segundo compartimento 112 intermedio pueden fluir hasta o recibirse desde el segundo orificio 216 intermedio; y (3) el gas que reside dentro del compartimento 116 más externo puede fluir hasta o recibirse desde el orificio 218 más externo. También se representa un módulo de fibras huecas que consiste en la fibra 220 más interna, la fibra 222 intermedia y la fibra 224 más externa. También se prevén realizaciones que comprenden módulos con más de una fibra intermedia.

La figura 3A ilustra además un conjunto de colectores 208, que incluye un primer colector 302, un segundo colector 304 y un tercer colector 306. Los colectores consisten cada uno en una región circular de aproximadamente 15 centímetros de diámetro, cada uno con aproximadamente de 20 a aproximadamente 400 agujeros, aunque es posible cualquier número de agujeros. Los agujeros son de tres diámetros diferentes correspondientes al diámetro externo de las fibras respectivas. Esto permite 20 fibras por fila con un espacio de 2 mm entre los agujeros, aunque los modelos de agujeros óptimos se basan en el número de módulos de fibra deseados. Estas fibras pueden consistir en cualquier fibra hueca o tubo deseado con los cambios apropiados en las especificaciones de diseño de las partes respectivas para que se ajusten a los respectivos diámetros de fibra.

Se describen dos procedimientos de encapsulado a modo de ejemplo: uno que da como resultado fibras coaxiales centradas y otro que no. En ambos procedimientos, se insertan las fibras en respectivos colectores 208. La fibra 110 externa puede estar compuesta por cualquier material permeable al aire tal como silicona, material cerámico, vidrio, etc. Como ejemplo, pueden utilizarse fibras huecas externas de polipropileno junto con soldado termoplástico.

El procedimiento de encapsulado utilizado para centrar la fibra requiere tres conjuntos adicionales de piezas mostrados en las figuras 3A, 3B y 3C: (1) una primera guía 314 de fibra hueca para el primer colector, una segunda guía 316 de fibra hueca para el segundo colector y una tercera guía 314 de fibra hueca para el tercer colector, (2) espaciadores 320 y (3) bridas de fibra hueca (externa 322, intermedia 324 e interna 326) para cada tamaño de fibra hueca respectivo (externo 110, intermedio 106 e interno 102). Las guías de fibra hueca pueden estar compuestas por cualquier material que mantenga rigidez con un espesor de 3 mm. El colector y la guía de fibra hueca se sitúan uno contra el otro, se alinean los agujeros de colector secuenciales con las espigas y se insertan las fibras 110 externas a través de los agujeros del colector y luego de la guía de fibra hueca, extendiéndose los extremos de las fibras al menos 1 cm más allá de la guía de fibra hueca. Las fibras se insertan en el alojamiento 202 y el otro extremo de las fibras externas se inserta en el siguiente primer colector 302 y primera guía de fibra hueca. La guía de fibra hueca se extiende hacia fuera del colector una distancia que permite que el par de espaciadores 320 se deslice entre el colector y la guía de fibra hueca. Los espaciadores 320 se pegan sobre los lados respectivos a extensiones 330 de colectores adyacentes. Una vez que se sujetan los colectores 208, el espaciador 320 y la guía de fibra hueca, las fibras huecas se sujetan con cinta adhesiva o bridas. Las bridas de fibra externa 322, intermedia 324 e interna que ajustan cada tamaño de fibra se insertan a través de cada fila de fibras, lo que sirven para conservar las fibras tirantes, para mantener la coaxialidad y para apretarlas cerca del lumen interno, de modo que la resina epoxídica no obstruirá la fibra hueca durante el encapsulado. Por tanto, las bridas de fibra tienen longitudes variables dependiendo de la longitud de la fila. Las fibras, espaciador y guía de fibra hueca sujetos se insertan en un crisol 312 de colada que se rosca en o se sella al colector 208 y sirve para contener la resina epoxídica durante el proceso de encapsulado. El montaje se coloca vertical con el crisol 312 de colada sobre la parte inferior y con una inclinación descendente de 10 a 45 grados hacia el orificio 305, se inyecta material de encapsulado, por ejemplo resina epoxídica, en el orificio 305 lateral y discurre hacia abajo por el lado del colector 208 a través de los agujeros 332, rellenado los huecos 334 contenidos en el orificio 312 de colada. La parte inferior del crisol 312 de colada se sangra para eliminar las burbujas de aire. Se añade una cantidad apropiada de resina epoxídica para llenar los huecos 334 y hasta un nivel que cubra ambos lados del colector 308. Una vez que la resina epoxídica casi se ha curado, la guía de fibra hueca, el espaciador 320, el crisol 312 de colada y la resina epoxídica se cortan dejando una capa muy pequeña de resina 308 epoxídica sobre el colector. Por tanto, los espaciadores 320, las guías 314, 316, 318 de fibra hueca y las bridas 322, 324 y 326 de fibra sirven para dos fines: mantienen las fibras tirantes y centradas cuando se encapsulan y (2) crean una región para que se cure la resina epoxídica entre los intersticios de la fibra hueca que pueden cortarse dejando una capa de resina 308 epoxídica sobre los colectores 208.

Pueden utilizarse otros métodos para centrar la fibra interna. En un primer ejemplo, se inserta una varilla rígida en el interior del lumen de la fibra interna para centrarla. Luego, se mezclan las células con una matriz gelificante dependiente de la temperatura, tal como colágeno, y la matriz se induce a formar un gel. Después, se retira la varilla. En un segundo ejemplo, una fibra de monofilamento con un diámetro igual al espaciado entre fibras necesario actúa como un espaciador. El monofilamento fabricado de polipropileno, polietileno u otro material apropiado se devana de forma helicoidal alrededor de la fibra interna con una revolución completa cada centímetro o así. La fibra interna con su devanado de monofilamento se inserta entonces en el interior de la fibra intermedia. Esto permite que las fibras interna e intermedia sean axisimétricas. Por tanto, las células inoculadas experimentan una trayectoria de tipo sacacorchos. El monofilamento se encapsula con la fibra interna utilizando el elemento 306.

La figura 3D ilustra una vista en corte y ampliada de una unidad de fibra multicoaxial que comprende una pluralidad de compartimentos situados dentro de un biorreactor multicoaxial y formado mediante el procedimiento de fibra coaxial centrada. Por tanto, el primer colector 302 está delimitado en la parte superior e inferior por resina 308 epoxídica y define parcialmente el compartimento 116 más externo y el segundo orificio 216 intermedio. El segundo colector 304 está delimitado en la parte superior e inferior por resina 308 epoxídica y define parcialmente el segundo orificio 216 intermedio y el primer orificio 214 intermedio. El tercer colector 306 está delimitado en la parte superior e inferior por resina 308 epoxídica y define parcialmente el orificio 212 más interno.

El procedimiento de encapsulado que da como resultado fibras no centradas no requiere guías de fibra hueca, monofilamento ni espaciadores, pero requiere una centrífuga. La figura 3E es una ilustración de tres conjuntos de colectores 208, que muestra un primer colector 302, un segundo colector 304, un tercer colector 306 y un crisol 312 de colada. Obsérvense que el segundo colector 304 y el tercer colector 306 no tienen agujeros y no alinearán fibras de manera coaxial. El procedimiento de encapsulado con resina epoxídica se describe por Bodnar et al. (patente de los EE.UU. número 4.227.295). Este procedimiento supone insertar los extremos de la fibra en dos colectores respectivos. Los extremos de la fibra se juntan y luego se sujetan con cinta adhesiva, cuerda o algún otro material. Después, se unen los crisoles 312 de colada a ambos extremos. El montaje se une a un rotor de centrífuga en el centro axial del montaje. Se coloca un pequeño recipiente plano encima del montaje y que tiene agujeros en cada extremo, que se unen a los orificios 305 en cada extremo del montaje. Según rota la centrífuga, se sitúa la resina epoxídica en el centro del recipiente y se ve forzada a salir hacia los extremos del recipiente, hacia debajo de los agujeros del recipiente, a través de los orificios 305 y al interior de los crisoles 312 de colada, llenando los intersticios del haz de fibras. Una vez que ha fluido la cantidad apropiada de resina epoxídica hasta los crisoles 312 de colada, el montaje continúa girando hasta que se cura parcialmente la resina epoxídica. Luego, se cortan la resina epoxídica en exceso y los crisoles 312 de colada en ambos extremos dejando agujeros abiertos de fibra hueca en ambos extremos del montaje y se realiza la siguiente etapa de encapsulado con resina epoxídica. Para garantizar que no se producen fugas entre los colectores, se sueldan o unen con resina epoxídica los colectores a lo largo de sus bordes.

La figura 4 es una ilustración que describe las cuatro etapas principales de ambos procedimientos para el montaje de un módulo de la presente invención, que está compuesto por tres conjuntos de fibras. El procedimiento es, en primer lugar la etapa 401 de insertar los extremos de la fibra 110 externa en los agujeros de los primeros colectores 302, luego unir el primer colector 302 al alojamiento 202 y encapsular los extremos de la fibra. La siguiente etapa 402 consiste en insertar un segundo conjunto de fibras, o fibras 106 intermedias, en el interior de la fibra 110 externa, insertar los extremos de la fibra en los agujeros de los segundos colectores 304 y encapsular los extremos de la fibra. La siguiente etapa 403 consiste en insertar las fibras 102 internas en el interior de las fibras 106 intermedias e insertar los extremos de la fibra en los agujeros de los terceros colectores 306 y encapsular los extremos de la fibra. La última etapa 404 consiste en unir tapas terminales. Se insertan al menos dos espigas en colectores adyacentes durante las etapas segunda 402 y tercera 403 a través de los agujeros 310 de espiga, para alinear los agujeros de colectores adyacentes. El segundo colector 304 tiene cuatro agujeros 310 de espiga porque al menos 2 se llenan con una fibra hueca que mantiene el hueco 310 del agujero de espiga una vez que el procedimiento de encapsulado es completo, de modo que pueda insertarse la espiga y el segundo colector 304 pueda alinearse adecuadamente con el tercer colector 306. Puede realizarse una soldadura termoplástica en materiales similares, por tanto, en la presente invención el primer colector 302 se fabrica de polipropileno con el fin de soldar fibras de polipropileno.

La figura 5 ilustra el proceso general de soldadura. Se inserta un tapón 501 de teflón en el diámetro interno de la fibra 502 hueca forzando las paredes de la fibra contra la pared de los agujeros 503 en el colector 208. Se utiliza una pistola de aire caliente, o una soldadora 504 termoplástica, para fundir la pared 502 de la fibra y la pared de los agujeros 503 juntos. Una vez que se enfría el montaje, se retira el tapón de teflón. Se utiliza un brazo de tapones de teflón que coinciden con los agujeros del primer colector 302 para soldar los extremos de las fibras externas a los respectivos primeros colectores 302. Ambos extremos del alojamiento 313 tienen una rendija en la que encaja el primer colector 302. Puede utilizarse un segundo brazo de tapones de teflón que encajan en el segundo colector 304 y el tercer colector 306 para soldar de forma termoplástica los tres conjuntos de fibras, si las fibras están compuestas por del mismo material que el colector, y más probablemente dará como resultado fibras coaxiales no centradas. En la primera etapa 401, se suelda el primer colector 302 al alojamiento 313. En la segunda etapa 402, se suelda el segundo colector 304 al colector 302. En la tercera etapa 403, el tercer colector 306 se suelda al segundo colector 302. En la cuarta etapa 404, se sueldan las tapas 210 terminales al tercer colector 306.

La figura 6A ilustra un biorreactor de fibra hueca multicoaxial bilateral. El biorreactor se monta utilizando piezas mecanizadas o formadas a partir de polipropileno o cualquier otro material mecanizado o formado utilizando dos de cada pieza, una para cada extremo respectivo del biorreactor, tres fibras huecas semipermeables y un tubo para resonancia magnética nuclear (RMN) de aproximadamente ocho a diez milímetros de diámetro (disponible, por ejemplo, de Wilmad Inc., Buena, N. J.). Las fibras huecas utilizadas para construir el biorreactor son de aproximadamente 8 milímetros de d.e. con un espesor de pared de 0,5 milímetros, 2,6 milímetros de d.e. con un espesor de pared de 0,4 milímetros y 0,8 milímetros de d.e. con un espesor de pared de 0,2 milímetros y compuestas por polipropileno de un tamaño de poro de 0,2 micrómetros (disponibles, por ejemplo, de Azko-Nobel, Alemania). Las fibras respectivas pueden estar compuestas por un tubo de silicona de 8 milímetros de d.e. (disponible, por ejemplo, de Dow Corning, Midland, MI) y fibras huecas de polisulfona de 3 y 1,3 milímetros de d.e. (disponibles, por ejemplo, de AG/Technologies, Inc., Wilmington, DE) con un espesor de pared de 0,4 y 0,2 milímetros, respectivamente, y con tamaños de poro de 0,1 y 0,65 micrómetros, respectivamente. Alternativamente, puede utilizarse un tubo de silicona de d.e. menor y pared más delgada para la fibra 110 externa y estirado sobre un tubo rígido perforado para darle rigidez estructural. La difusión de oxígeno es inversamente proporcional al espesor de pared y, por tanto, los tubos de silicona de pared más delgada permitirán una transferencia de masa de oxígeno superior. La fibra de polipropileno de 2,6 milímetros de d.e. puede sustituirse y construirse con una fibra de polisulfona de 3 milímetros de d.e. con un espesor de pared de 0,5 milímetros y con un tamaño de poro de 0,65 micrómetros. Estas fibras pueden consistir en cualquier fibra o tubo hueco deseado con cambios apropiados en la especificación de diseño de las partes respectivas para que encajen con la fibra respectiva. Las fibras se cortan para que sean al menos 2 milímetros más largas que su longitud final cuando se montan.

La fibra 110 externa puede recubrirse con un polímero perfluorado para tender un puente u obstruir los poros para evitar la "humectación" o saturación con agua, de los poros y eliminando de manera eficaz la evaporación de agua desde los medios utilizando un proceso facilitado por Compact Membrana Systems (Wilmington, Delaware) u otro proceso de llenado de poros similar. El recubrimiento también puede realizarse en el biorreactor multicoaxial, ampliado a escala, descrito en la figura 3. Para los fines de transferencia de masa, el recubrimiento se produce en los medios a los lados de la fibra. Si no se realiza el recubrimiento, el compartimento de aire debe tener una presión superior al compartimento para medios adyacente para evitar la humectación de los poros y la corriente de gas debe ser más caliente que la corriente de medios para que disminuyan la evaporación y la condensación.

En la presente invención, el biorreactor multicoaxial bilateral se monta con la fibra 110 externa mayor (por ejemplo, 5 milímetros de d.i. (diámetro interno), 8,1 milímetros de d.e.) y el primer colector 302. Se utilizan medios de sujeción tales como soldadura termoplástica o resina epoxídica de poliuretano o una combinación de los mismos para fijar las fibras a las piezas respectivas. El alojamiento, un tubo 604 para RMN, se sujeta a los primeros colectores 302 mediante collares 606 y juntas 602 tóricas.

Las figuras 6B, 6C y 6D ilustran adicionalmente el primer colector. Tal como se muestra en la figura 6B, el lado delantero comprende la primera zona 610 circular rebajada, mientras que tal como se muestra en la figura 6C, el lado posterior comprende la primera zona 612 circular elevada. Tanto la primera zona 610 circular rebajada como la primera zona 612 circular elevada definen parcialmente el primer hueco 614. Tal como se muestra en la figura 6D, se coloca la junta 602 tórica en la primera zona 610 circular rebajada. Se une a la misma el collar 606. También se muestra el orificio 218 más externo.

Las figuras 6E, 6F, 6G y 6H ilustran adicionalmente el segundo colector. Tal como se muestra en la figura 6F, el lado delantero comprende la segunda zona 620 circular rebajada, mientras que tal como se muestra en la figura 6G, el lado posterior comprende la segunda zona 622 circular elevada. Tanto la segunda zona 620 circular rebajada como la segunda zona 622 circular elevada definen parcialmente el segundo hueco 624. Con el fin de garantizar que las células no se acumulan en el espacio entre el segundo colector 302 y el tercer colector 304, puede deslizarse un collar 326 sobre la fibra 106 intermedia y que encaja de manera ajustada en el segundo hueco 624 y en el hueco 636 delantero del tercer colector 304. También se muestra el segundo orificio 216 intermedio. La figura 6C también ilustra el modo en que el primer colector 302 comunica con el segundo colector 304.

La figura 6I proporciona una vista en perspectiva del segundo colector, que ilustra el segundo hueco 624, el segundo orificio 216 intermedio y el primer orificio 214 intermedio.

Las figuras 6J, 6K y 6L ilustran adicionalmente el tercer colector. Tal como se muestra en las figuras 6J y 6K, el lado delantero comprende la tercera zona 630 circular rebajada que define parcialmente el tercer hueco 634. También se muestra el primer orificio 214 intermedio en la figura 6L. La figura 6M también ilustra una sección transversal del montaje completo, que muestra cómo comunica el segundo colector 304 con el tercer colector 306.

La figura 6N es una vista desde arriba del montaje completo de un biorreactor bilateral con todos sus cuatro orificios de entrada y salida en un lado del colector, que ilustra el primer colector 302, el segundo colector 304, el tercer colector 306, el orificio 212 para medios, el orificio 214 para células, el orificio 216 para medios, el orificio 218 para gas y el collar 606.

El biorreactor puede producirse en serie utilizando la base o soporte 702 ilustrado en la figura 7. La base soporta el colector 208 y el eje 703 de la fibra en una ranura 701, de modo que el eje de la fibra 703 está a 90 grados, perpendicular al plano del colector 704 que contiene la abertura 705 del agujero para fibra. Entonces, se fijan las fibras llenando el espacio 706 de fibra / colector con resina epoxídica o con un proceso de soldadura termoplástica, según se representa en la figura 5. Si se utiliza resina epoxídica, entonces se cura rápidamente la resina epoxídica en un horno y luego se encapsula el otro lado, y se repite el procedimiento entero representado en la figura 7. La fabricación puede automatizarse para la producción en serie, en la que el proceso de montaje del biorreactor mostrado en la figura 4 se realiza robóticamente. En un biorreactor bilateral producido en serie, las juntas 602 tóricas y los collares 610 y las roscas del primer colector 302, que se utilizan para realizar un cierre hermético con el tubo 604 para RMN de vidrio de 10 mm, se sustituyen mediante el uso de un tubo compuesto por polipropileno o un material apropiado para sustituir el tubo 604 para RMN de 10 mm de vidrio y se sueldan de forma termoplástica o se unen con resina epoxídica para crear un cierre hermético. En una realización preferida, la fibra 110 externa se suelda y las dos fibras 102 y 106 internas se unen con resina epoxídica. Con respecto a las fibras coaxiales, los montajes de colector 208 de fibra (figura 6) se unen de manera radial desde las fibras del diámetro mayor hasta las del diámetro menor y de manera axial desde las fibras del diámetro menor hasta las del diámetro mayor. La fibra 110 externa se inserta en 2 juntas 602 tóricas, 2 collares 606, un tubo 604 para RMN de 10 mm y luego en el interior del primer colector 302. Los dos collares se ajustan y después los primeros colectores 302 se insertan en ambos extremos del montaje de biorreactor en las ranuras 701 de la base 702. Las fibras 110 externas se sueldan de forma termoplástica en su sitio utilizando, por ejemplo, el proceso descrito en la figura 5. El biorreactor, que ahora adquiere una forma de pesa, está listo para unirse al segundo colector 304.

Una segunda fibra de polipropileno de aproximadamente 2,6 milímetros de d.e. o de polisulfona de 3 milímetros de d.e. se inserta en el interior de la fibra externa de 5 mm de d.e. de dimensión y se fija al segundo colector 304 mediante el proceso con resina epoxídica representado en la figura 7. El primer colector 302 y el segundo colector 304 se sueldan a lo largo de sus bordes. Se inserta una tercera fibra de 0,8 milímetros de d.e. en el interior de la segunda fibra de fibras huecas de polipropileno de 1,8 milímetros de d.i. o de polisulfona de 2 milímetros de d.i. y se fija al tercer colector 306 tal como se ha descrito anteriormente. Durante la unión de las fibras al colector sólo en el segundo extremo del biorreactor, las fibras se cortan alineadas con sus respectivos colectores o números de pieza. La tapa 210 terminal, o una abrazadera para manguito roscado, se pega a, o se rosca en el tercer colector 306 en cada
extremo.

La figura 8 describe un biorreactor coaxial con un orificio 802 de entrada y orificios 804 de salida en un lado del biorreactor. En una realización preferida, este biorreactor es de manera axial inferior a 40 milímetros de largo y las fibras se sujetan con colectores o tapas terminales que tienen agujeros avellanados coaxiales que encajan diámetros de fibra en el intervalo de \pm 5 milésimas de pulgada. Opcionalmente, los hepatocitos centran la fibra interna, haciendo así la construcción más fácil y permitiendo la ampliación a escala axial. El biorreactor puede llenarse parcialmente dependiendo del procedimiento de inoculación. El biorreactor se monta con una fibra 102 interna, una fibra 106 intermedia, una fibra 110 externa y colectores 208 de un modo similar al biorreactor de fibra hueca multicoaxial, bilateral, excepto en que sólo existe una entrada y una salida. El biorreactor multicoaxial, unilateral de la figura 8 utiliza las mismas fibras y el tubo para RMN descritos anteriormente para el biorreactor de fibra hueca multicoaxial, bilateral. En esta realización, el alojamiento 114 es un tubo para RMN. El diseño específico puede insertarse en una sonda para RMN de 10 milímetros utilizada con imanes con agujero verticales habituales. El sentido 806 de flujo puede cambiarse mediante el cambio del orificio 802 de entrada y los orificios 804 de salida. La velocidad de flujo en el anillo externo se controla parcialmente mediante el diámetro y el número de agujeros 808 alineados como un círculo alrededor de los tres colectores. Los colectores y las fibras se montan tal como se ha descrito anteriormente para el biorreactor de fibra hueca multicoaxial, bilateral. También se muestra un orificio 810 de inoculación y un flujo 812 de aire.

Puede construirse un diseño adicional de biorreactor de fibra hueca multicoaxial, unilateral, cerrando los extremos de la fibra 102 interna y omitiendo los agujeros 808 en el colector 812 inferior. Esto cambia la configuración del flujo forzando la trayectoria de flujo desde el compartimento 104 interno a través del primer compartimento 108 intermedio, en el que residen las células, y saliendo a través del segundo compartimento 112 intermedio, o viceversa. Puesto que la oxigenación se produce en el compartimento externo en la presente invención, se prefiere el flujo desde el segundo compartimento 112 intermedio hacia el compartimento 104 interno, de modo que los medios se oxigenen apropiadamente antes de entrar en la masa celular.

Para aumentar la sensibilidad de RMN, el biorreactor unilateral puede hacerse que encaje dentro de un tubo para RMN de menor diámetro, tal como de 8 a 15 mm. Con el fin de obtener un diámetro menor, en una realización de la presente invención, una fibra de aireación de microcalibre de 200 \mum a 500 \mum de d.e. sirve como fibra 102 interna, fibra 106 intermedia de 1 a 1,3 milímetros de d.e. y fibra 110 externa de 3 a 4 milímetros de d.e. Produciéndose la oxigenación por medio del compartimento 104 interno, el flujo preferido es desde el primer compartimento 108 intermedio, a través de la masa celular en el segundo compartimento 112 intermedio y saliendo por medio del compartimento 116 externo. La cámara de gas, del compartimento 104 interno, tiene los extremos cerrados y el gas se hace fluir desde los compartimentos por medio de difusión hasta una corriente de aire que fluye, conectada a la cámara de gas por medio de un conector en T en la parte superior del biorreactor. Con el fin de tener aire que circula a través del biorreactor, se necesita el diseño con flujo de aire a su través. La fibra 102 interna en la figura 9 se une al colector en la parte inferior del biorreactor y al menos una fibra 902 de aireación de microcalibre de retorno de 200 \mum a 500 \mum se une con resina epoxídica en los agujeros 808 de los colectores que bordean el compartimento 116 externo y se utiliza para el retorno de los medios. Alternativamente, se construye un biorreactor coaxial de dos fibras a partir de un minioxigenador de fibra interna compuesto por fibras de polipropileno de 0,8 milímetros, que se coloca en línea con el biorreactor unilateral y se calienta gas mediante camisas de agua para evitar la desgasificación debida a cambios y/o diferencias de temperatura entre el dispositivo de oxigenación y el biorreactor.

La figura 10A ilustra el hígado bioartificial conectado en serie. Incluye al menos dos subunidades de hígado artificial, potencialmente con hasta aproximadamente 160 mg de tejido por subunidad. Las suspensiones celulares se introducen en los compartimentos anulares respectivos por medio de los orificios 1006 y/o 1014 y 1024 y/o 1032 y se permite que se anclen a los compartimentos anulares. Se utiliza una dinámica de flujo radial para perfundir los medios desde el plasma hasta las células para las funciones de biotransformación. El esquema de flujo se cambia en la segunda subunidad de modo que los factores sintéticos puedan fluir desde las células de vuelta al plasma. El flujo radial se trata adicionalmente, más adelante.

Tal como se muestra en la figura 10A, el plasma 1001 del paciente entra en la primera subunidad 1002 de hígado bioartificial a través del primer orificio 1004 de entrada de plasma, los medios entran 1054 en la primera subunidad 1002 de hígado bioartificial a través del primer orificio 1008 de entrada de medios y el gas entra en la primera subunidad 1002 de hígado bioartificial a través del primer orificio 1010 de entrada de gas. El flujo radial se produce seleccionando fibras huecas con características de tamaño de poro y número de poros tales que la permeabilidad hidráulica de la fibra sea relativamente alta y teniendo un gradiente de presión sustancial a través de las fibras, según se determina en el modelo hidrodinámico tratado más adelante. La figura 10B representa el flujo de plasma en condiciones en las que el compartimento 1042 de plasma tiene una presión superior a la del compartimento 1044 para células y el compartimento 1046 para medios. En estas condiciones, parte del plasma fluye de manera radial desde el orificio 1004 de entrada hasta el compartimento 1042 para plasma, a través de la masa celular contenida en el compartimento 1044 para células, en el compartimento 1046 para medios y hacia fuera del orificio 1016 de salida de medios. El plasma restante sale entonces de la primera subunidad 1002 de hígado bioartificial a través del primer orificio 1012 de salida de plasma y el plasma se divide por la unión 1048 en T. Los medios salen de la primera subunidad 1002 de hígado bioartificial a través del primer orificio 1016 de salida de medios y el gas sale de la primera subunidad 1002 de hígado bioartificial a través del primer orificio 1018 de salida de gas. La presión elevada en el compartimento 1042 para plasma necesaria para producir el \DeltaP para dirigir el flujo radial, se crea dividiendo la corriente de plasma en la unión 1048 en T y recirculando rápidamente el plasma a través del compartimento 1042 para plasma por medio de la bomba 1013 de recirculación que conecta el orificio 1004 de entrada de plasma con el orificio 1012 de salida de plasma. Las tasas o velocidades de flujo crean una presión de descarga suficiente en el orificio 1004 de entrada de plasma y las velocidades de la bomba se ajustan para obtener el \DeltaP deseado, que se mide mediante manómetros 1048 en los orificios 1004 y 1008. El \DeltaP deseado también puede crearse mediante a inserción de una válvula 1054 de aguja en la tubería entre el orificio 1012 de salida de plasma y la unión 1048 en T. De esta manera, la velocidad de flujo del plasma puede permanecer constante a través de la primera subunidad 1002 de hígado bioartificial y se obtiene el \DeltaP deseado modulando el flujo a través de la válvula de aguja. Puede utilizarse el mismo principio para controlar el flujo radial en la segunda subunidad 1020 de hígado bioartificial. En una realización alternativa, el compartimento 1042 para plasma se cierra en los extremos eliminando el orificio 1012 de salida de plasma.

El esquema de flujo se cambia entonces en la segunda subunidad de tal manera que el fluido procedente del orificio 1016 de salida entre en la segunda subunidad 1020 de hígado bioartificial a través del segundo orificio 1022 de entrada de medios, el plasma entre a la segunda subunidad 1020 de hígado bioartificial a través del segundo orificio 1026 de entrada de plasma y el gas entre en la segunda subunidad 1020 de hígado bioartificial a través del segundo orificio 1028 de entrada de gas. Una parte de los medios fluye de manera radial desde el orificio 1022 de entrada a través de la capa anular de células y al interior del componente plasmático. Los medios restantes salen entonces de la segunda subunidad 1020 de hígado bioartificial a través del segundo orificio 1030 de salida de medios y la corriente de fluido se divide en la unión 1050 en T y una parte se conduce a un medio para devolverlo al paciente 1052. Opcionalmente, las células pueden salir de la segunda subunidad 1020 de hígado bioartificial a través del segundo orificio 1032 de salida de células, el plasma sale de la segunda subunidad 1020 de hígado bioartificial a través del segundo orificio 1034 de salida de plasma y el gas sale de la segunda subunidad 1020 de hígado bioartificial a través del segundo orificio 1036 de salida de gas. La figura 10C representa el flujo de medios que contienen plasma en el que el compartimento 1046 para medios se cambia ahora con el compartimento 1042 para plasma. Tal como se ha descrito anteriormente, el \DeltaP se establece en el compartimento 1046 para medios mediante la rápida recirculación de los medios que contienen plasma mediante la bomba 1031 para crear una presión de descarga suficiente. El \DeltaP se mide mediante manómetros 1049 en los orificios 1022 y 1026. En una realización alternativa, se crea una presión de descarga suficiente eliminando o restringiendo (utilizando una válvula de aguja u otro dispositivo similar) el flujo a través del segundo orificio 1030 de salida de medios.

Con el fin de crear un flujo radial, son posibles varias configuraciones. Las diferencias en la velocidad de flujo en dos compartimentos dan como resultado una diferencia de presión (\DeltaP) que produce un flujo radial a través del espacio anular, que está gobernado por la ley de Darcy:

(I)v_{r} = k \DeltaP / \etaL

en la que v_{r} es la velocidad de flujo radial, k es la permeabilidad hidráulica, una constante que depende de las características físicas de la fibra hueca (incluyendo el tamaño de poro y el número de poros), el disolvente y el soluto, \eta es la viscosidad de la disolución y L es la longitud del contacto entre los dos compartimentos, en el presente documento, esencialmente la longitud de la fibra. Puede seleccionarse cualquier variedad de tamaños de poro, incluyendo pero sin limitarse a ello, 10^{-6} m, 0,1 x 10^{-6} m y 0,05 x 10^{-6} m. Por tanto, el flujo radial puede aumentarse mediante una elección adecuada de fibras con una alta permeabilidad hidráulica y mediante la modulación de las velocidades de flujo.

Un modelo basado en la ley de Darcy nos permite estimar la correlación entre la diferencia de presión y el flujo radial dado por las permeabilidades hidráulicas de la fibra 102 interna y la fibra 106 intermedia. El modelo supone un fluido incompresible y newtoniano y que el gradiente de presión axial es insignificante, y que la velocidad de flujo a través de las fibras era constante. Derivando esta ecuación para dos fibras huecas concéntricas, se obtiene la siguiente relación:

1

La figura 11A define las variables utilizadas en la ecuación. Q es la velocidad de flujo radial desde el compartimento 1102 caracterizado por una presión hidrostática P_{1}, a través de los poros de la fibra 1104 caracterizada por una permeabilidad K_{1}, a través del compartimento 1106 intermedio, luego a través de los poros de la segunda fibra 1108 caracterizada por una permeabilidad hidráulica K_{2} hasta el compartimento 1110 caracterizado por una presión hidrostática P_{2}. Las distancias radiales desde una línea central hasta el interior de la fibra 1114 es r_{a}, hasta la fibra 1104 exterior es r_{b}, hasta la fibra 1108 interior es r_{c} y hasta el exterior de la fibra 1108 es r_{d}. Debe entenderse que el sentido de flujo radial de cualquier constituyente químico particular, incluyendo pero no limitándose a ellos, oxígeno, medio de cultivo, plasma y productos biosintéticos, depende del sentido del diferencial de presión. Los sentidos de flujo y de la correspondiente velocidad de flujo radial pueden ser positivos o negativos y están representados por el signo del flujo y de Q. La invención contempla valores de Q correspondientes al flujo desde los compartimentos internos hasta los compartimentos externos e igualmente contempla valores de Q correspondientes al flujo desde los compartimentos externos hasta los compartimentos internos. La figura 11B compara los datos experimentales de flujo radial desde el segundo compartimento 112 intermedio hasta el compartimento 104 interno como una función de la diferencia de presión con los datos modelados utilizando los valores de K_{1} y K_{2} determinados experimentalmente. La figura 11C ilustra la presión en el compartimento 1106 para células correspondiente al experimento mostrado en la figura 11B. La comparación de la figura 11B con la 11C muestra que la mayoría de la diferencia de presión transmembrana se produce a través de la fibra 106 intermedia y esto es debido a la permeabilidad hidráulica y al espesor de pared relativamente grandes de la fibra 106 intermedia. Por tanto, las células se protegen de los efectos adversos de la alta presión creada en el segundo compartimento 112 intermedio y según aumenta la permeabilidad hidráulica de la fibra 106 intermedia, la presión se transmite más fácilmente al primer compartimento 108 intermedio y las células se vuelven menos protegidas de la presión en el segundo compartimento 112 intermedio. Por tanto, este modelo puede utilizarse generalmente en el funcionamiento del biorreactor para predecir la diferencia de presión apropiada para permeabilidades hidráulicas dadas de las fibras 102 interna y 106 intermedia. En la realización preferida, el dispositivo incluye un programa de software basado en este modelo predictivo que ayuda en la selección de las condiciones de cultivo, con respecto a las velocidades de flujo radial y las presiones hidrostáticas en el compartimento para células.

Un método de selección de una velocidad de flujo radial en un biorreactor que comprende fibras semipermeables, para aumentar la viabilidad celular, que comprende: medir una primera presión hidráulica asociada con una primera fibra semipermeable y una segunda presión hidráulica asociada con una segunda fibra semipermeable, para obtener un diferencial de presión y ajustar la primera presión hidráulica, la segunda presión hidráulica o una combinación de las mismas para seleccionar una o más velocidades de flujo radial, de modo que se mejore la viabilidad celular.

Por tanto, en una realización, la invención comprende un método de selección de una velocidad de flujo radial en un biorreactor que comprende fibras semipermeables, para aumentar la viabilidad celular, que comprende: medir una primera presión hidráulica asociada con una primera fibra semipermeable y una segunda presión hidráulica asociada con una segunda fibra semipermeable, para obtener un diferencial de presión y ajustar la primera presión hidráulica, la segunda presión hidráulica o una combinación de las mismas para seleccionar una o más velocidades de flujo radial, de modo que se mejore la viabilidad celular. La primera fibra y la segunda fibra pueden ser coaxiales. En una realización particular, el método de selección de una velocidad de flujo radial comprende seleccionar la velocidad de flujo radial basándose en la fórmula:

2

en la que \DeltaP es el diferencial de presión, Q es la velocidad de flujo radial, L es la longitud de las más corta entre las longitudes de la primera y la segunda fibra, r_{a} es la distancia radial desde la línea central del biorreactor hasta la superficie interna de la primera fibra, r_{b} es la distancia radial desde la línea central del biorreactor hasta la superficie externa de la primera fibra, r_{c} es la distancia radial desde la línea central del biorreactor hasta la superficie interna de la segunda fibra, r_{d} es la distancia radial desde la línea central del biorreactor hasta la superficie externa de la segunda fibra, K_{1} es la permeabilidad hidráulica de la primera fibra y K_{2} es la permeabilidad hidráulica de la segunda
fibra.

El software puede estar en la forma de un algoritmo tal como se ilustra en la figura 12 y se utiliza para seleccionar las condiciones de transferencia de masa para tipos celulares específicos. Los valores de \DeltaP iniciales se obtienen a partir del conocimiento de las características del biorreactor, incluyendo la distancia 118 de difusión y la longitud de la fibra, así como las condiciones fisiológicas conocidas en el tejido de interés.

En la figura 12, se proporciona una descripción detallada del algoritmo para el flujo radial. La primera etapa mostrada en un bloque S20 comienza con la entrada de los parámetros del biorreactor, incluyendo la geometría y dimensiones del birreactor, y los parámetros de las células, incluyendo la resistencia a las presiones hidrostáticas y la tensión de corte. Entonces, en el bloque S22, se toman muestras del diferencial de presión. La siguiente etapa requiere una determinación de si el diferencial de presión está dentro de los límites de presión hidrostática que concuerdan con la viabilidad continuada de las células utilizadas en el sistema, tal como se muestra en el bloque S24. Si el diferencial de presión no está dentro de los límites permisibles, se ajusta el diferencial de presión, tal como se muestra en el bloque S26. Luego, se mide de nuevo la presión hidrostática para determinar si está dentro de los límites permisibles, tal como se muestra en el bloque S28.

Si la determinación del bloque S24 o el bloque S28 es que la presión hidrostática es compatible la viabilidad celular, entones se mide el flujo radial, tal como se muestra en el bloque S30.

La siguiente etapa requiere una determinación de si las fuerzas de corte asociadas con el flujo radial están dentro de los límites de viabilidad para el tipo celular de interés, tal como se muestra en el bloque S32. Si las fuerzas de corte no están dentro de los límites permisibles, se aplica la fórmula II, anteriormente, que relaciona \DeltaP y la velocidad de flujo radial Q, tal como se ilustra en el bloque S34. Como resultado del cálculo del bloque S34, se determina una permeabilidad hidráulica K_{1} y/o permeabilidad hidráulica K_{2}, según sea necesario en S36.

Con el cambio de una o más permeabilidades hidráulicas, como en el bloque S34, el sistema vuelve al bloque S24 para la evaluación adicional de la presión hidrostática en primer lugar y de la fuerza de corte después.

Cuando la presión hidrostática está dentro de los límites que concuerdan con la viabilidad celular, como en el bloque S24 o en el bloque S28, luego se mide la velocidad de flujo radial Q, como en el bloque S30. Si las fuerzas de corte asociadas con el flujo radial concuerdan con la viabilidad celular, entonces hay establecidas condiciones para la supervivencia celular, tal como se ilustra en el bloque S38. Estableciendo límites restringidos de manera adecuada para la presión hidrostática y la fuerza de corte permisibles, se obtiene una condición óptima para la supervivencia celular prolongada.

En otra realización, la invención puede comprender un medio legible por ordenador que incluye instrucciones en él para calcular la velocidad de flujo radial en un biorreactor que comprende fibras semipermeables, incluyendo dichas instrucciones las etapas de: (a) recibir medidas de permeabilidad hidráulica para cada una de al menos dos fibras semipermeables, (b) recibir medidas de presión hidráulica asociadas con un diferencial de presión para al menos dos fibras semipermeables coaxiales y (c) estimar dicha velocidad de flujo radial entre dichas fibras semipermeables coaxiales.

La figura 13A ilustra una sección transversal de un biorreactor multicoaxial que comprende tres fibras huecas coaxiales encajadas unas dentro de otras. La figura 13A representa la fibra 102 más interna, la fibra 106 intermedia, la fibra 110 externa y el alojamiento 114.

La figura 13B ilustra una sección transversal de una realización alternativa de un biorreactor multicoaxial. La figura 13B representa la fibra 102 más interna, la fibra 106 intermedia, la fibra 1302 de aireación más pequeña y el alojamiento 114. La fibra 1302 de aireación habitual más pequeña se coloca en los espacios formados al apilar fibras coaxiales que comprenden la fibra 102 más interna y la fibra 106 intermedia. Por tanto, se forma un primer compartimento por la pared interna de la fibra 102 más interna. Se define un segundo compartimento por la pared externa de la fibra 102 más interna y la pared interna de la fibra 106 intermedia. Se define un tercer compartimento por la pared externa de la fibra 106 intermedia y el alojamiento 114. Se forma un cuarto compartimento por la pared interna de las fibras 1302 de aireación más pequeñas. En realizaciones alternativas, puede producirse un quinto compartimento para fines de aireación insertando una cuarta fibra de aireación pequeña dentro de la fibra 102 más interna.

La figura 14 ilustra una realización del biorreactor. Se muestran los siguientes componentes: primer colector 302, segundo colector 304, tapa 210 terminal, entrada 1408 del compartimento interno, salida 1410 del compartimento interno, compartimento 1412 para células, entrada 1414 para gas, salida 1416 para gas, entrada 1418 del compartimento más externo, salida 1420 del compartimento más externo y alojamiento 202.

La figura 15 ilustra un dispositivo utilizado en la construcción de un biorreactor. Los componentes mostrados incluyen una pluralidad de fibras 1502, segundo colector 304, primer colector 302, alojamiento 202, junta 416 tórica, carga 1504 de vacío y malla 1506. El vacío permite la rápida inserción de fibras más pequeñas en el interior de fibras más grandes. La malla 1506 conserva las fibras en su sitio.

En versiones ampliadas a escala del biorreactor multicoaxial, los colectores consisten en múltiples agujeros coaxiales para las diversas fibras, y se colocan espigas en los agujeros, situadas de manera precisa en los colectores para garantizar que todas las unidades de múltiples fibras son coaxiales. Puesto que las unidades de múltiples fibras se reproducen de manera exacta debido al diseño coaxial, los parámetros experimentales de una única unidad de múltiples fibras se aplican directamente al biorreactor ampliado a escala.

La construcción del biorreactor puede tener muchas variaciones que serán evidentes para el médico. Como ejemplo, las fibras huecas pueden variar en tamaño de poro, longitud, espesor de pared y composición y el modelo hidrodinámico mostrado anteriormente y en la figura 11 puede utilizarse para determinar las características óptimas de la fibra hueca. Las fibras huecas pueden estar compuestas por cualquiera de varios materiales incluyendo, pero sin limitarse a ellos, polisulfona, acetato de celulosa, esteres mixtos de celulosa, celulosa regenerada, poli(alcohol vinílico), poliuretano, polivinilideno, polipropileno, policarbonato y poliamida. El acetato de celulosa es más permeable a los medios de nutrientes y el polipropileno es más permeable a los gases y los expertos en la técnica seleccionarán las fibras apropiadas basándose en éstas y otras propiedades. El medio de formación de poros y control del tamaño de poro será obvio para un experto en la técnica y puede incluir, pero en modo alguno limitarse a, bombardeo de neutrones, polimerización controlada e incorporación de agentes que pueden filtrarse. Puede utilizarse cualquiera de varios adhesivos incluyendo resina epoxídica de poliuretano para encapsular las fibras y los expertos en la técnica conocen adhesivos apropiados.

6. Ejemplos

Se proporcionan los siguientes ejemplos específicos para ayudar mejor al lector en los diversos aspectos de la puesta en práctica de la presente invención. Como estos ejemplos específicos son meramente ilustrativos, no debe interpretarse nada de las descripciones siguientes como limitante de la invención en modo alguno. Tales limitaciones solamente se definen, por supuesto, mediante las reivindicaciones adjuntas.

6.1 Análisis por RMN de la función celular hepática en el biorreactor de fibra hueca multicoaxial, unilateral

Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley con pentobarbital (50 mg/kg por vía intraperitoneal). El hígado se expone mediante una incisión en la línea media ventral y se inserta una cánula en la vena porta para la infusión de disoluciones de disociación celular. Las células hepáticas se disocian mediante infusiones consecutivas de ácido etilendiaminotetraacético (50 mM) y colagenasa (de 1 a 20 mg/ml) en tampón de Krebs-Henseleit, pH 7,4. La perfusión adecuada del hígado está indicada por el blanqueo uniforme del hígado. Se recogen las células aisladas y se introducen en el compartimento para células (compartimento 2) del biorreactor de fibra hueca multicoaxial, unilateral.

Se realiza la resonancia magnética nuclear (RMN) utilizando un diseño de sonda para RMN compuesta por dos bobinas de Helmholtz fotograbadas sobre un material compuesto flexible recubierto con cobre. Las dos bobinas, adecuadamente aisladas, se enrollan alrededor del biorreactor y se orientan de forma ortogonal entre sí. La bobina interna se ajusta hasta 81 MHz para estudiar el metabolismo energético medido por los cambios en el espectro de ^{31}P. La sonda y el montaje de biorreactor se colocan en un soporte de centrado en el isocentro del imán para la comparación óptima de los espectros. Se suministra el medio de nutrientes aireado al orificio de entrada del primer compartimento del biorreactor. Se proporciona una oxigenación integral mediante un flujo de una mezcla con un 95% de aire y un 50% de CO_{2} a través del orificio 4 de entrada, asociado con el cuarto compartimento, o más externo, del biorreactor. Se bombea medio de nutrientes F-12 de Ham a través del compartimento 3 con una bomba peristáltica. La temperatura del depósito de medio se mantiene en 42ºC con un baño de agua de temperatura controlada, de modo que se mantenga la temperatura del biorreactor en 37ºC. Se analizaron la señal de RMN procedente de nucleótidos trifosfato marcados en posición \gamma con ^{31}P y nucleótidos difosfato marcados en \beta con ^{31}P, otros componentes celulares del metabolismo energético y la biosíntesis. Se monitoriza la señal de RMN como una función de la transferencia de masa dictada por la velocidad de flujo de gas y el porcentaje de oxígeno, las velocidades de flujo del medio de nutrientes y las densidades de carga celular.

6.2 Flujo de oxígeno en ausencia de células

Se conectan microelectrodos de oxígeno a un transductor y software Workbench® y luego se calibran frente a patrones conocidos. Los microelectrodos de oxígeno calibrados se colocan a intervalos a lo largo de la longitud de la fibra en el compartimento 2 del biorreactor de fibra hueca multicoaxial. Se une un depósito de plasma al orificio de entrada del compartimento 1, el compartimento más interno del biorreactor de fibra hueca multicoaxial. Se une un depósito de medio de nutrientes RPMI 1640 al orificio de entrada del compartimento 3. Se disponen bombas peristálticas en línea para hacer circular el plasma y el medio de nutrientes. El compartimento 2 también se llena con medio de nutrientes. Se obtiene la señal de cada microelectrodo a intervalos de diez segundos y se tratan por el software para la conversión en presiones de oxígeno. La fase gaseosa se cambia entre un 95% de aire con un 5% de CO_{2} y un 95% de N_{2} con un 5% de CO_{2} a intervalos seleccionados. Se miden las tasas de reducción y recuperación de la presión de oxígeno a diferentes velocidades de flujo para evaluar el flujo de oxígeno en ausencia y en presencia de células.

6.3 Uso como dispositivo de asistencia hepática extracorporal para la evaluación de la bilirrubina

Antecedentes. El modelo con rata Gunn, que es el modelo animal para el síndrome de Crigler-Najjar en seres humanos, es un modelo ideal para demostrar la eficacia del biorreactor como dispositivo de asistencia hepática extracorporal. La rata Gunn tiene un defecto heredado como un rasgo autosómico en ratas Wistar. El defecto, presente en animales homocigóticos recesivos, se encuentra en el gen que codifica para UDP-glucuronosiltransferasa, una enzima necesaria para la conjugación y la excreción biliar de la bilirrubina (un producto de degradación de la hemoglobina en los glóbulos rojos senescentes). Por tanto, la rata Gunn no puede conjugar ni excretar la bilirrubina y se vuelve hiperbilirrubinémica, teniendo niveles de bilirrubina sérica de aproximadamente 5 - 20 mg/dl, comparado con 1 mg/dl en ratas normales.

Protocolo experimental. Se utiliza un biorreactor de fibra hueca multicoaxial, ampliado a escala, para el montaje de un dispositivo que actúa como un dispositivo de asistencia hepática extracorporal con ratas Gunn. Los hígados de ratas Gunn heterocigóticas (de fenotipo normal) se perfunden y se aíslan las células. Las células se suspenden en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y se introducen 10^{9} células en el segundo compartimento del biorreactor. Se perfunde sangre de la arteria femoral de una rata Gunn (un volumen de sangre medio total de aproximadamente 10 a 12 ml) a través del compartimento 3 del biorreactor, separado del espacio anular de células hepáticas por la pared de la fibra hueca, a una velocidad de flujo de aproximadamente 0,6 - 0,8 ml/min con la ayuda de una bomba peristáltica. Al mismo tiempo, se hace fluir DMEM a través del compartimento uno del biorreactor a una velocidad de flujo de aproximadamente 0,5 ml/min. La sangre que fluye hacia fuera del biorreactor se devuelve a la rata Gunn.

Se determinan los niveles de bilirrubina conjugada y no conjugada en la sangre que sale del biorreactor durante el transcurso de seis horas utilizando el sistema de ensayo de bilirrubina directa y total de Sigma, según las instrucciones suministradas por Sigma Chemical Company (Procedimiento nº 522/553 de Sigma).

6.4 Función biosintética del hepatocito en un biorreactor de fibra hueca multicoaxial, ampliado a escala / BAL

Células hepáticas aisladas como en el ejemplo I se separan adicionalmente mediante centrifugación zonal en gradientes de densidad de sacarosa. Las fracciones de densidad correspondientes a las células parenquimatosas se recogen e introducen en el compartimento aséptico para células (compartimento 2) del biorreactor multicoaxial, ampliado a escala.

Las células parenquimatosas se mantienen haciendo circular medio de nutrientes F-12 de Ham caliente a través de los compartimentos 1 y 3, y un 95% de aire con un 5% de CO_{2} a través del compartimento 4. Se recoge el efluente del compartimento 1 y se analizan las fracciones para determinar los parámetros de la función hepática de biosíntesis. Se mide la síntesis de albúmina mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima.

6.5 Función de biotransformación en un biorreactor de fibra hueca multicoaxial, ampliado a escala / BAL

Células hepáticas aisladas como en el ejemplo I se separan adicionalmente mediante centrifugación zonal en gradientes de densidad de sacarosa. Las fracciones de densidad correspondientes a las células de Kupffer se recogen e introducen en el compartimento 2 (compartimento para células) del biorreactor de fibra hueca multicoaxial, ampliado a escala.

Las células se mantienen en el biorreactor haciendo circular DMEM (sin rojo de fenol) a través de los orificios de entrada y de salida de los compartimentos 1 y 3, y un 95% de aire con un 5% de CO_{2} a través de los orificios del compartimento 4. Se permitió que las células se adhiriesen dentro del compartimento, seguido por la introducción de hemoglobina libre (1 - 10 mg/ml) en el compartimento 1. Se monitorizan la aparición de hemoglobina y los productos metabólicos en el compartimento 3 con un espectrofotómetro en línea.

6.6 El biorreactor conectado en serie, con células humanas

Se cultivaron células C3A de hepatoma humano tal como se ha descrito (Mickelson, J. K. et al., Hepatology, 1995, 22, 866) y se introducen en todos los segundos compartimentos del biorreactor conectado en serie. Se bombean el medio de nutrientes y 95% de aire con un 5% de CO_{2} a través del compartimentos tercero y más externo, respectivamente, y se monitoriza el crecimiento celular mediante la utilización de glucosa. Cuando las células han alcanzado la fase de crecimiento estacionario, o meseta, se monitoriza la producción de albúmina.

La sangre de un paciente que padece insuficiencia hepática se separa en plasma y células mediante plasmaféresis y el plasma se bombea al interior del primer compartimento de la primera subunidad de hígado bioartificial. Una parte del plasma fluye de manera radial desde el primer compartimento, a través del compartimento para células, hasta el tercer compartimento para formar un efluente biotransformado. El plasma sale del primer compartimento de la primera subunidad de hígado bioartificial y fluye al interior del tercer compartimento de la segunda subunidad de hígado bioartificial. El efluente biotransformado procedente del tercer compartimento de la primera subunidad de hígado bioartificial fluye al interior del primer compartimento de la segunda subunidad de hígado bioartificial. El flujo radial en la primera subunidad de hígado bioartificial desintoxica una parte del plasma y el flujo radial en la segunda subunidad de hígado bioartificial contribuye con productos biosintéticos al plasma para formar plasma complementado. Se monitorizan los signos vitales, la ictericia y el nivel sanguíneo de toxinas a intervalos regulares. Se ajustan las velocidades de flujo del plasma y el medio para maximizar la biotransformación de las toxinas circulantes. Se mide la supervivencia del paciente.

6.7 Efectos de la matriz extracelular sobre la diferenciación de los hepatocitos en el biorreactor de fibra hueca multicoaxial, ampliado a escala

Se aíslan células parenquimatosas mediante centrifugación zonal como en el ejemplo IV, anteriormente, suspendidas en matriz basal reconstituida procedente de sarcoma de Englebreth-Holm-Swarm de ratón y se introducen en el compartimento 2 (compartimento para células) del biorreactor multicoaxial, ampliado a escala. Los hepatocitos se detienen en un estado G_{0} mediante su adhesión a la matriz basal y se mantienen en el fenotipo hepático normal (rana et al., 1994). El estado sumamente diferenciado se caracteriza por la síntesis de albúmina y factores de transcripción hepáticos tales como C/EBP. Las células parenquimatosas se mantienen haciendo circular medio de nutrientes F-12 de Ham caliente a través de los compartimentos 1 y 3 y 95% de aire con un 5% de CO_{2} a través del compartimento 4. Ese recoge el efluente del compartimento 1 y se analizan las fracciones para determinar los parámetros de la función hepática de biosíntesis. Se mide la síntesis de albúmina mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima.

6.8 Crecimiento y diferenciación de hepatocitos humanos en el reactor de fibra hueca multicoaxial, ampliado a escala

Se aíslan hepatocitos del parénquima humano mediante el método de (Block, G. D., et al. J Cell Biol, 1996, 132, 1133) y se introducen en el compartimento 2 del biorreactor de fibra hueca multicoaxial, ampliado a escala. Las células parenquimatosas se propagan mediante exposición a factor de crecimiento hepático (HGF/SF), factor epidérmico y factor transformador de crecimiento alfa en medio de nutrientes, se introduce HGM (hemoglobina globular media) en el compartimento 3 y se introduce aire:CO_{2} (19:1) en el compartimento 4. La razón del factor de transcripción C/EBP con respecto a C/EBP disminuye con este proceso y también disminuye la síntesis celular de albúmina. Se modifica el medio que fluye a través del compartimento 3 para que incluya factor transformador de crecimiento y factor de crecimiento epidérmico, para inducir la diferenciación de las células y las síntesis de albúmina, en la formulación descrita (Sanchez, A. et al., Exp Cell Res, 1998 ,242, 27).

6.9 Biosíntesis de hormonas y factores en el biorreactor de fibra hueca multicoaxial, ampliado a escala

Se extraen las glándulas paratiroideas de manera aséptica, se muelen y se tratan con colagenasa tal como se ha descrito (Hornicek, F. L. et al. Bone Miner, 1988, 4, 157). Las células dispersas se suspenden en medio de nutrientes CMRL-1415 complementado con suero bovino fetal y se introducen en el compartimento 2 del biorreactor multicoaxial ampliado a escala. Se bombea una mezcla del 95% de aire con un 5% de CO_{2} a través del orificio 4. Se bombea medio caliente a través de los orificios 1 y 3 y el efluente de la cámara se concentra mediante ultrafiltración para la recogida de la hormona paratiroidea, el factor hipertensivo paratiroideo y otros productos celulares. Las hormonas y los factores se purifican mediante inmunoprecipitación y cromatografía.

6.10 El biorreactor conectado en serie de cinco compartimentos con células humanas

Se hacen crecer células C3A de hepatoma humanos como en el ejemplo VI, anteriormente, excepto por el tercer compartimento de un biorreactor conectado en serie de cinco compartimentos. En el compartimento más interno (compartimento 1) y el compartimento más externo (compartimento 5) se difunde la mezcla gaseosa, 95% de aire con un 5% de CO_{2}. Se bombea el medio de nutrientes a través de los compartimentos segundo y cuarto, respectivamente, y se monitoria el crecimiento celular mediante la utilización de glucosa. Cuando las células han alcanzado la fase de crecimiento estacionario, o meseta, se monitoriza la producción de albúmina.

La sangre de un paciente que padece insuficiencia hepática se separa en plasma y células mediante plasmaféresis y el plasma se bombea a través de los segundos compartimentos conectados en serie del biorreactor. Se monitorizan los signos vitales, la ictericia y el nivel sanguíneo de toxinas a intervalos regulares. Se ajustan las velocidades de flujo del plasma y el medio para maximizar la biotransformación de las toxinas circulantes. Se mide la supervivencia del paciente.

6.11 Construcción del biorreactor conectado en serie de cinco compartimentos con una disposición de fibras empaquetadas de manera apretada y su uso con células humanas

Se construyen subunidades de biorreactor con 300 fibras coaxiales más externas (3 milímetros de d.e.) formando parte del límite externo de los compartimentos anulares para células. Se inserta una fibra hueca de 1,3 milímetros de d.e. en el interior de cada una de las fibras de 3 milímetros, formando parte del límite interno de los compartimentos anulares para células y parte del límite externo de los compartimentos número 2. Se inserta una fibra hueca de microcalibre (300 \mum de d.e.) en el interior de cada una de las fibras de 1,3 milímetros como el compartimento más interno de cada módulo de fibra coaxial y otro conjunto de 300 microfibras se sitúa paralelo y adyacente a los módulos coaxiales. Ambos conjuntos de microfibras llevan gas de aireación para oxigenar el plasma y el medio. El compartimento más externo es el compartimento número 4 y se forma por el exterior de las fibras coaxiales más externas (de 3 milímetros de d.e.), el exterior de las fibras que están adyacentes a los módulos coaxiales y el interior del alojamiento.

Se esterilizan el biorreactor conectado en serie y las tuberías y conexiones asociadas.

Se aíslan hepatocitos humanos como en el ejemplo VIII y se introducen en los compartimentos anulares para células, compartimentos 3, de cada una de las dos subunidades de biorreactor. Las células de hepatocito se propagan mediante su exposición al medio de nutrientes y los factores de crecimiento descritos en el ejemplo VIII, hasta que la densidad celular es suficiente para el tratamiento de un paciente con insuficiencia hepática. Las subunidades de biorreactor con un complemento de células hepáticas viables se denominan ahora subunidades BAL.

Cuando se utiliza el biorreactor para el montaje de un dispositivo para el tratamiento del paciente, el plasma del paciente entra en el compartimento número 2 de la primera subunidad BAL, a través del primer orificio de entrada de plasma, los medios entran en el compartimento número 4 del primer BAL a través del primer orificio de entrada de medios y el gas entra en el primer BAL a través del primer orificio de entrada de gas. El flujo radial en la primera subunidad se produce mediante un gradiente de presión a través de las fibras, de tal manera que la presión hidráulica en el compartimento para plasma es superior que la presión en los compartimentos para células o medios. En consecuencia, parte del plasma fluye desde el compartimento número 2, a través del compartimento anular para células, al interior del compartimento número 4. En el proceso, las células hepáticas en el compartimento para células pueden desintoxicar biológicamente el plasma que pasa a través del compartimento para células. Según fluye el plasma desintoxicado al interior del compartimento 4, el medio se modifica con un componente del plasma desintoxicado. Entonces, el plasma restante sale de la primera subunidad BAL a través del primer orificio de salida de plasma, los medios salen de la primera subunidad de BAL a través del primer orificio de salida del compartimento número 4 y el gas sale de la primera subunidad BAL a través del primer orificio de salida de gas. El esquema de flujo se cambia entonces en la segunda subunidad de tal manera que el fluido (medio que contiene plasma desintoxicado) procedente del primer orificio de salida del compartimento número 4 entra en la segunda subunidad BAL, a través del segundo orificio de entrada del compartimento número 2. De manera similar, el plasma procedente del primer orificio de salida del compartimento 2 entra en la segunda unidad BAL a través del segundo orificio de entrada del compartimento 4 y el gas entra en la segunda subunidad BAL a través del segundo orificio de entrada de gas. Una parte de los medios fluyen de manera radial desde el orificio de entrada del compartimento número 2, a través de la capa anular de células y al interior del segundo compartimento número 4. Las células hepáticas añaden proteínas y otros productos biosintéticos al medio que fluye a través del compartimento para células en la subunidad 2. Según fluye este medio enriquecido al interior del plasma restante, el plasma modificado resultante se desintoxica en parte y se enriquece en parte con proteínas biosintéticas. El medio restante sale entonces de la segunda subunidad BAL a través del segundo orificio de salida del compartimento 2, el plasma modificado sale de la segunda subunidad BAL a través del segundo orificio de salida del compartimento 4 y el gas sale de la segunda subunidad BAL a través del segundo orificio de salida de gas. El plasma modificado, efluente procedente del segundo compartimento 4, se conduce a un medio para su devolución al paciente, para preservarle la vida.

6.12 Fabricación de un biorreactor de fibra hueca multicoaxial, ampliado a escala

Se utiliza un aparato para montar un biorreactor, en el que una carga de vacío, que está unida según sea necesario a una fuente de presión negativa, sujeta un haz de fibras huecas contra una malla para la rápida inserción de fibras más pequeñas. El extremo opuesto de las fibras huecas se inserta en un colector y se coloca en un recipiente. Se aplica resina epoxídica de poliuretano para unir las fibras huecas al colector y el montaje de colector, resina epoxídica y fibras huecas se somete a una fuerza centrífuga para eliminar la resina epoxídica del interior de las fibras. Tras el curado, los extremos libres de las fibras huecas se recortan con una sierra. El proceso se repite para la inserción del siguiente conjunto más pequeño de fibras huecas, aplicando el vacío, pegando los extremos al siguiente colector, centrifugando y recortando.

Claims

1. Biorreactor, que comprende:

(a) un alojamiento que tiene un lado interno que comprende: medios de introducción de gas integral al alojamiento; y medios de espiración de gas integral al alojamiento;

(b) una serie de una pluralidad de módulos de fibras huecas, que residen dentro del alojamiento, comprendiendo cada módulo:

(i): una pluralidad de fibras huecas coaxiales, teniendo cada una un lado interno y un lado externo, que incluye una fibra hueca más interna y una fibra hueca más externa;

(ii): una pluralidad de compartimentos, que comprende: un primer compartimento definido por el lado interno de la fibras hueca más interna; y

(iii): al menos un compartimento adicional definido por un espacio anular respectivo entre fibras adyacentes de la pluralidad de fibras huecas coaxiales; y

(c) un compartimento más externo definido por un espacio dentro del lado interno del alojamiento que no está ocupado por la pluralidad de módulos

(d) en el que el primer compartimento, el al menos un compartimento adicional y el compartimento más externo comprenden además cada uno al menos un orificio de entrada; y al menos un orificio de salida, y

(e) en el que el alojamiento comprende además:

(i): al menos un colector interno y al menos un colector externo para el primer compartimento; y

(ii): al menos un colector interno y al menos un colector externo para cada compartimento adicional.

2. Biorreactor según la reivindicación 1, en el que las fibras huecas son semipermeables.

3. Biorreactor según la reivindicación 2, en el que las fibras huecas comprenden un material seleccionado del grupo que consiste en polisulfona, polipropileno, nylon, poliéster, politetrafluoroetileno, acetato de celulosa y ésteres mixtos de celulosa.

4. Biorreactor según la reivindicación 1, en el que el biorreactor comprende además al menos 10^{9} células.

5. Biorreactor según la reivindicación 4, en el que las células son células hepáticas.

6. Biorreactor según la reivindicación 5, en el que las células hepáticas se seleccionan del grupo que consiste en células hepáticas porcinas y células hepáticas humanas.

7. Biorreactor según la reivindicación 1, en el que el al menos un colector comprende además un distribuidor de flujo.

8. Biorreactor según la reivindicación 7, en el que el al menos un compartimento comprende además una matriz extracelular.

9. Biorreactor según la reivindicación 1, en el que el al menos un espacio anular es de aproximadamente 0,2 milímetros a aproximadamente 0,8 milímetros.

10. Biorreactor según la reivindicación 1, en el que el biorreactor se esteriliza con un medio seleccionado del grupo que consiste en tratamiento en autoclave, óxido de etileno y radiación gamma.

11. Biorreactor según la reivindicación 1, en el que la fibra hueca más interna tiene una longitud de aproximadamente 2 centímetros a aproximadamente 50 centímetros.

12. Biorreactor según la reivindicación 1, en el que el alojamiento tiene un primer extremo y un segundo extremo y en el que cada orificio de entrada y cada orificio de salida están en el primer extremo del alojamiento.

13. Biorreactor según la reivindicación 1, que comprende además: microfibras sustancialmente paralelas a los módulos de fibras huecas.

14. Biorreactor según la reivindicación 13, en el que las microfibras comprende además al menos un orificio de entrada de aireación y al menos un orificio de salida de aireación.

15. Biorreactor según la reivindicación 1, en el que al menos una fibra hueca coaxial se satura con perfluorocarbono.

16. Biorreactor según la reivindicación 1, en el que al menos una fibra hueca coaxial tiene un tamaño de poro inferior a 1 x 10^{-6} m.

17. Biorreactor según la reivindicación 1, en el que al menos una fibra hueca coaxial tiene un tamaño de poro inferior a 0,1 x 10^{-6} m.

18. Biorreactor según la reivindicación 1, en el que al menos una fibra hueca coaxial tiene un tamaño de poro inferior a 0,05 x 10^{-6} m.

19. Biorreactor según la reivindicación 1, en el que al menos un compartimento comprende además células mezcladas con una matriz extracelular.

20. Uso del biorreactor según la reivindicación 1, para el montaje de un dispositivo para suministrar productos biosintéticos celulares a un paciente que necesita los mismos y que comprende: medios para el bombeo de una disolución nutritiva intravenosa a través de un compartimento de dicho biorreactor; medios para la recogida de la producción y medios para suministrar por vía intravenosa dicha producción al paciente.

21. Biorreactor conectado en serie, que comprende una pluralidad de subunidades de biorreactor, comprendiendo cada unidad de biorreactor:

(ii): una pluralidad de compartimentos, que comprende: un primer compartimento definido por el lado interno de la fibras hueca más interna; y al menos un compartimento adicional definido por un espacio anular respectivo entre fibras adyacentes de la pluralidad de fibras huecas coaxiales; y

(c) un compartimento más externo definido por un espacio dentro del lado interno del alojamiento que no está ocupado por la pluralidad de módulos; y

(d) en el que el primer compartimento, el al menos un compartimento adicional y el compartimento más externo comprenden además cada uno al menos un orificio de entrada; y al menos un orificio de salida,

(e) en el que el alojamiento comprende además:

(i): al menos un colector interno y al menos un colector externo para el primer compartimento, y

(ii): al menos un colector interno y al menos un colector externo para cada compartimento adicional, y

(f) al menos un compartimento de una subunidad de biorreactor conectado en serie a al menos un compartimento de al menos otra subunidad de biorreactor.

22. Biorreactor según la reivindicación 21, en el que cada subunidad de biorreactor comprende además al menos 10^{9} células.

23. Biorreactor según la reivindicación 22, en el que las células son células hepáticas.

24. Biorreactor según la reivindicación 23, en el que las células se seleccionan del grupo que consiste en células hepáticas humanas y células hepáticas porcinas.

25. Biorreactor según la reivindicación 22, en el que al menos un compartimento de cada subunidad de biorreactor comprende además una matriz extracelular.

26. Uso del biorreactor conectado en serie según la reivindicación 21, para el montaje de un dispositivo para proporcionar productos de plasma complementado a un paciente que necesita los mismos, que comprende:

(a) medios para introducir plasma de un paciente en una subunidad de biorreactor del biorreactor conectado en serie según la reivindicación 21,

\newpage

(b) medios para forzar al menos una parte del plasma a que fluya de manera radial a través de un compartimento para células de la subunidad de biorreactor, para formar un efluente biotransformado;

(c) medios para introducir el efluente biotransformado en una segunda subunidad de biorreactor del biorreactor según la reivindicación 21;

(d) medios para forzar al menos una parte del efluente biotransformado a que fluya de manera radial a través de un compartimento para células de la segunda subunidad de biorreactor, para formar plasma complementado; y

(e) medios para devolver el plasma complementado al sistema circulatorio del paciente.

27. Biorreactor de fibra hueca multicoaxial, que comprende:

(a) un alojamiento que tiene un lado interno; y

(b) un módulo de fibras huecas, que comprende: al menos tres fibras huecas semipermeables coaxiales, que incluyen una fibra hueca más interna que tiene un lado interno, definiendo el lado interno un primer compartimento que comprende al menos un orificio de entrada más interno y al menos un orificio de salida más interno; una pluralidad de compartimentos, cada compartimento definido por un espacio anular respectivo entre fibras adyacentes de las al menos tres fibras huecas, incluyendo al menos un orificio de entrada externo y al menos un orificio de salida externo,

en el que cada compartimento comprende un medio de comunicación de flujo entre el espacio anular respectivo, el orificio de entrada externo respectivo y el orificio de salida externo respectivo y en el que uno de los espacios anulares contiene células eucariotas; y

(c) un compartimento más externo definido por un espacio entre el lado externo de la fibra más externa de dichas al menos tres fibras huecas, y el lado interno del alojamiento, y que comprende al menos un orificio de entrada más externo y al menos un orificio de salida más externo;

(d) comprendiendo el alojamiento al menos un colector interno y al menos un colector externo para cada uno de los compartimentos; y

(e) en el que al menos uno de los compartimentos contiene células eucariotas.

28. Uso del biorreactor según la reivindicación 27, para el montaje de un dispositivo para el cultivo celular que comprende:

medios para introducir células viables en un compartimento de dicho biorreactor; y

medios para hacer pasar un medio de nutrientes a través de las fibras huecas adyacentes de manera coaxial.