JPH06500927A - 高力価の組換えウイルスベクターおよび遺伝子療法に用いられる形質導入標的細胞の持続的及び連続的生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 高力価の組換えウィルスベクターおよび遺伝子療法に用いられる形質導入標的細 胞の持続的及び連続的生産発明の分野 本発明は中空諧維バイオリアクター中インビトロで高力価のウィルスベクターを 生産するための方法、高多重度で標的細胞に感染して高濃度の形質導入標的細胞 を生産するための方法とその方法で生産された形質導入標的細胞に関する。その 方法は遺伝子療法に用いられる形質導入標的細胞を生産する上で特に適する。

発明の背景 遺伝子療法 後天性及び先天性疾患の治療のための遺伝子療法は、これらの疾患の治療分野に とって最近高度に有望な手法である。多数の先天的遺伝子異常及び後天性疾患は 遺伝子療法による治療になじむだろうと期待される。遺伝子療法は、罹患個体か ら選択細胞、即ち標的細胞、を取出し、治療上有効な産物をコードする異種ＤＮ Ａを導入することで細胞を修正し、修正された細胞を個体に戻すことにより実施 される。最終的には、標的細胞のいかなるインビトロ操作もなしに、肺の内側を 覆う内皮細胞のような細胞内に直接異種ＤＮＡをインビボで導入することが可能 かもしれない。

このような治療の候補である疾患としては、正常には酵素、ホルモン又は他のタ ンパク質をコードする遺伝子の欠失又は欠陥に起因する疾患がある。このような 疾患の例としてはアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコードするＤＮＡの欠陥 に起因する重度混合免疫不全障害〔例えば、Ｋｒｅｄｉｃｈら（１９８３）　、 Ｉ）、１１５７゜Ｔｈｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｆｃ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｒ　Ｉｎｈｅｒ ｉｔｅｄ　Ｄｊｓｅａｓｅ　（先天性疾患の代謝基礎）　（５ｔｈ　ｅｄ、）、 ｅｄｓ、５ｔａｎｂｕｒｙら、ＭｃＧｒａｗ−旧＋１゜Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ参照〕 　；酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰ ＲＴ）の欠陥に起因するレッシューナイハン（Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ）疾患； 各欠陥遺伝子が最近確認された嚢胞性繊維症及びデュシェーヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎ ｅ）筋ジストロフィー；テイサックス（Ｔａｙ　５ａｃｈｓ）病；β−サラセミ アのようなヘモグロビン障害がある。

加えて、遺伝子療法は、癌治療用の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）とエイズ治療用のＣ Ｄ４レセプタータンパク質のような治療産物をデリバリ−するための手段として も提案されてきた（例えば、ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９０１０１８７０号明細書参 照）。

遺伝子療法は、異種ＤＮＡでコードされる産物が宿主で発現されるように宿主生 物の少くとも一部の細胞中に異種ＤＮＡを導入することからなる。宿主細胞内へ の導入で、異種ＤＮＡは宿主細胞のゲノム中に組込まれるか又はそれはエビソー ム要素の一部として維持及び複製される。異種ＤＮＡは欠陥もしくは不在遺伝子 又は正常には低レベルで発現される遺伝子の産物に置き代わるか、又はそれらを 補う産物をコードし、あるいはそのＤＮＡは疾患を治療する上で有効である治療 産物をコードする。

異ＦＪＤＮＡは宿主細胞で発現されつるようにＲＮＡポリメラーゼ１１のような 宿主細胞エフェクター分子により認識されるプロモーター及び／又は他の転写及 び翻訳調節要素に機能的に結合される。疾患についての基本的な遺伝的基礎の理 解が増すに従い、遺伝子産物の発現をコントロールする上で遺伝子転写又は翻訳 のレベルで機能するか又はフィードバック阻害のようなメカニズムに依存する調 節コントロールが宿主細胞にも与えられるように、遺伝子療法の方法を洗練させ ることができるであろう。

例えば、異種ＤＮＡは宿主細胞遺伝子の発現又は生化学プロセスを媒介するＲＮ Ａ又はタンパク質産物についても媒介又はコードする。それにより異種ＤＮＡの 発現は罹患宿主の必要性に応じて微調整できる。

個体の細胞及びゲノム中に異種ＤＮＡを導入するための多くの手段が開発及び洗 練されることも予想される。

現在、真核細胞に感染するウィルスに由来する組換えウィルスベクターの使用は 、遺伝子療法を実施する上で最も有望な手段を提供する。通常、真核宿主の感染 により、ウィルスは宿主細胞の転写及び翻訳機構を利用する。それを行う上でプ ロモーターのようなウィルス調節シグナル、特に感染初期に認識されるものは高 度に効率的である傾向があり、その結果このようなプロモーター及び調節シグナ ルと機能的に結合したＤＮＡは高レベルで効率的に発現される。したがって、真 核ウィルスは真核細胞における異種ＤＮＡのクローニング及び発現用ベクターと して用いられてきた。

異種ＤＮＡデリバリ−用の組換え真核ウィルス組換えウィルスベクターが組立て られた真核ウィルスとしてはＳＶ４０、アデノウィルス及び牛パピローマウィル スのようなりＮＡウィルス〔例えば、ＧＩｕｚＩａｎ、Ｙ、。

ｅｄ、Ｅｕｋａｒｙｏｔｊｃ　ｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｌｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ、ＮＹ（１９１１２）　；　５ａｒｖｅｒら（１９１１１１）、Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１：４８６　；　Ｈｏｖｌｅｙの米国特許第４゜４１９． ４４６号明細書参照〕並びにモロニーネズミ白血病ウィルス（ＭｏＭＬＶ）、マ ウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）　、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳ　Ｖ）と他の白血 病及び腫瘍ウィルスのようなＲＮＡウィルス、レトロウィルス〔例えば、Ｍａｎ ｎら（１９８３）、Ｃｅ１ｌ、３３：１５３−１５９　；　Ｍｉｌｌｅｒら（１ ９８６）、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、８：２１ｔ９５−２９０２　；　Ｍｏ ｒｇａｎらの米国特許第４，８６８．１１６号；　Ｋｏｐｃｈｉｃｋらの米国特 許第４．６８６，０９８号；Ｈ目１ｅｒの米国特許第４，８６１゜７１９号明細 書参照〕の双方がある。

遺伝子療法で用いられるレトロウィルスベクターのブザ１之 レトロウィルスベクターが現在遺伝子療法用に好ましいベクターであるが〔例え ば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９ｇ４）、５ｃｊｅｎｃｅ。

２２８　：　４０１−４０９参照〕、それはレトロウィルス感染が高度に効率的 であってレトロウィルスベクターが容易１こ修正でき、その結果このようなベク ターで運搬される異種ＤＮＡが宿主細胞ゲノムに安定的に組込まれるからである 。レトロウィルスベクターが十分に高い濃度、即ち接触標的細胞の事実上１００ ％で生産できるならば、罹患宿主に由来する細胞は感染して、組込みプロウィル ス及び異種ＤＮＡを発現できるであろう。レトロウィルス感染時に適切な条件下 で、単一コピーのプロウィルスが細胞ごとに組込まれる。プロウィルス組込みは それ自体細胞に有害でない。しかもレトロウィルス組込みのサイズ及びメカニズ ムのおかげで、ＤＮＡが組込まれたことを正確に知ることができる。そして、広 範な宿主範囲を有するレトロウィルスベクター系は容易に入手できる。

レトロウィルスはコアタンパク質及びＲＮＡを被包するタンパク質エンベロープ から主になる。レトロウィルスのＲＮＡはプロモーター及びエンハンサー領域を 含みゲノムに隣接する２つの長末端反復配列（ＬＴＲ）；ＣＡＰ部位及びポリア デニル化シグナルを含めた転写を調節して逆転写及びプロウィルス複製を調節す る様々な調節シグナル；エンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子、ウ ィルスコアタンパク質をコードするｇａｇ遺伝子及び逆転写酵素をコードするｐ ｏｌ遺伝子を含めた構造遺伝子をコードする。レトロウィルスＲＮＡはｔ　ＲＮ Ａ結合部位（マイナスＤＮＡ鎖合成の複製開始部位）、プラスＤＮＡ鎖合成の複 製部位及びパッケージ化シグナル、ｐｓｉ部位のようなシグナル配列も含む。

レトロウィルスエンベロープタンパク質は哺乳動物細胞表面レセプターを認識し てそれと特異的に結合する領域を含む。一部のレトロウィルスエンベロープタン パク質は制限的範囲の宿主細胞のみと結合する；このようなエンベロープで被包 されたウィルスはエコトロヒック（ｅｃｏｔｒｏｐｊｃ）宿主範囲を有するとい われる。他のエンベロープタンパク質は様々な哺乳動物細胞に結合する；このよ うなエンベロープで被包されたウィルスはアンホトロピソク（ａｍｐｈｏｔｒｏ ｐｉｃ）宿主範囲を有するといわれる。

宿主細胞レセプターの特異的認識及び結合でウィルスは細胞に侵入する。レトロ ウィルス逆転写酵素は翻訳され、ウィルスはプロウィルスと称されるＤＮＡ中間 体に逆転写され、染色体ＤＮＡ中に入る。プロウィルスＤＮＡも複製されて、感 染ピリオン中でパッケージ化することができる。

レトロウィルス後装用の要素はシスで作用するもの及びトランスで作用するもの に分けられる。トランス作用因子としては標的細胞中へのウィルスの包膜、結合 及び侵入、逆転写と標的細胞ゲノム中への逆転写ＤＮＡの組込みに必要なウィル スタンパク質がある。ツク・ンケージ化シグナルのようなシス作用因子としては ウィルス複製時にトランス作用タンパク質及び他のタン／ぐり質と相互作用スル モノカアル〔例工ば、Ｃｏｆｆ’ｉｎ、Ｊ、（１９８５）ｉｎ　ＲＮＡＴｕｍｏ ｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、ｖｏｌ、２．ｐｐ、１７−７４．Ｒ，Ｗｅｉｓｓらｅｄｓ 、、ｃｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ参照〕。

一部のシス及びトランス作用機能はレトロウィルスから欠失させて、適正に組合 せれば別々に提供すること力（できる。一部又は全部のトランス作用機能を欠失 させたウィルスは複製不適格であるが、但し必要な機能を含むヘルパーウィルス との同時トランスフェクション等で欠失機能が得られるならばバ・ソケージ化さ れた欠陥感染ウィルス粒子が生産できる。一方、欠失機能はそのゲノム中このよ うな機能の安定的取込みで修正された細胞系、即ちパッケージ化細胞系により得 ることもできる。ある機能は欠失され、ヘルパーウィルスにより又は）くツケー ジ化細胞系の一部として得ることかできるため、後で宿主細胞ＤＮＡに安定に組 込まれる異種ＤＮＡをプリ／くリーするためのレトロウィルスベクターが組立て うる。加えて、パッケージ化細胞系及びレトロウィルスベクターの慎重なデザイ ンによりヘル／（−ウィルスを生産せずζこ感染複製不適格レトロウィルスベク ターを７寸・ノケージ化し、それによりそのベクターと感染レトロウィルス粒子 を生産できるヘルパーウィルスとの組換え現象の付随的リスクなしに宿主細胞ゲ ノムにＤＮＡを組込むためのベクターを提供することができる。

レトロウィルスベクターは、レトロウィルスＲＮＡのＤＮＡコピーを製造して全 部又は一部のｅｎｖ、ｐｏｌ及びｇａｇ遺伝子を欠失させることにより組立てら れる。

異種ＤＮＡは、内在異種プロモーターもしくは宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼ１１ により認識される他のプロモーター又はレトロウィルス５−ＬＴＲのコントロー ル下で欠失遺伝子の代わりに挿入される。このためレトロウィルスベクターは複 製用の遺伝子を含まない。それらがこのようなレトロウィルス配列を含まない細 胞中にヘルパーウィルスの不存在下で形質導入された場合、レトロウィルスベク ターは複製できず、適正に組立られるとそれらは宿主細胞ゲノム中に安定的に取 り込まれる。ＬＴＲ配列及び他のシス作用調節配列に加えて、レトロウィルスベ クターは、適切な真核プロモーターのコントロール下である抗生物質耐性を付与 するネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする細菌遺伝子ｎｅｏのよ うな選択マーカー遺伝子とスプライスドナー及びアクセプタ一部位も通常含む。

パッケージ化レトロウィルスベクターの宿主範囲は、パッケージ化細胞系中に取 り込まれるｅｎｖ遺伝子の選択によりコントロールできる。アンホトロビ・ツク 宿主範囲が望まれるならば、ベクターはアンホトロビ、ツク宿主範囲を有するレ トロウィルスに由来するｅｎｖ配列を含むパッケージ化細胞系にツク・ノケージ 化される。例えば、ＭｏＭＬＶ　（例えば、Ｍａｎｎら（１９８３）、Ｃｅ１１ ，３３：１５３−１５９及びＭｊ　Ｉ　Ｉｅｒら（１！Ｊ８Ｂ）、Ｍｏ１．Ｃｅ １ｌ　Ｂｌｏｌ、６：２８９５−２９０２参照）番よアンホトロピックレトロウ イルスである；そのｅｎｖタンパク質はほとんどのヒト細胞に存在するレセプタ ーに結合する。

レトロウィルスベクターは標的宿主細胞で複製しなＬ）ため、レトロウィルスベ クターは、ツク・ンケージ化及び複製に必要であるベクターに存在しない機能を コードするＤＮＡを含む細胞系で、複製及び／り・ツケージ化される。

レトロウィルスが染色体ＤＮＡに組込まれ及びそこから切除されて組換えをうけ る容易性のために、ベクター（こ由来するＤＮＡとパッケージ化細胞系のＤＮＡ との組換えはウィルス複製に必要な機能をコードするツク・ソケージ化復製適格 ウィルス及び／又はヘル／く一ウィルスを生産する。標的宿主細胞内形質導入で 、ベル／シーウィルス存在下において、組換えから宿主細胞で感染レトロウィル ス粒子を生産させることができる。結果的に、臨床用として、レトロウィルスベ クターは複製不適格でなけれ（ｆならないばかりか、パッケージ化細胞系及びベ クターｉｔ複製適格又はヘルパーウィルスを生産しうる組換えの可能性が事実上 ないようにデザインされねばぼらない。これはレトロウィルスベクターとパッケ ージ化細胞系とのいかなる望ましくない組換え現象についても高度に非現実的又 は不可能にする欠失及び変異を含むベクター及びパッケージ化細胞系の双方を慎 重にデザインすることにより達成される〔例えば、Ｍａｎｎら（１９８３）、Ｃ ｅ１１．３３：１５３−１５９　；　Ｍｉｌｌｅｒら（１９ｇＢ）、Ｍｏ１．Ｃ ｅ１ｌ　Ｂｌｏｌ、６：２８９５−２９０２及び（１９ｇ５）、Ｍｏ１．Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｌ、５：４３１　；　Ｍｉｌｌｅｒの米国特許第４，８６１．７１９ 号明細書参照〕。しかしながら、ヘルパーウィルスの生産又は細胞性癌遺伝子の 活性化を行える宿主細胞ゲノム上に保有される配列とベクターとの間で望ましく ない組換え現象の可能性がわずかにある。しかしながら、これらのリスクはわず かであり、このような現象の確率を微々たるものにするレトロウィルスベクター がデザインされた。

臨床上有用な組換えレトロウィルスベクターの生産用パッケージ化細胞系のデザ イン このため、ウィルスゲノムの操作により複製適格ウィルス及びヘルパーウィルス 双方の不存在下で比較的多量のウィルスベクターを生産できるレトロウィルスパ ッケージ化細胞系を組立てた。これらの細胞系は広範囲の標的宿主細胞に感染で きるが、但しこのような細胞の感染後に複製できないピリオン中にレトロウィル スベクターＲＮＡをパッケージ化する。パッケージ化細胞系はウイルスパッケー ジ化のためｅｎｖ遺伝子のような必要遺伝子機能を与えるレトロウィルス由来Ｄ ＮＡを含む。はとんどのこのようなパッケージ化細胞系はパッケージ化シグナル の欠失により修正されたヘルパーウィルスＤＮＡを含む。しかしながら、パッケ ージ化シグナルのみが欠失されたパッケージ化細胞系は低頻度でヘルツく一ウィ ルスを生産し、一部のレトロウィルスベクターと相互作用して低レベルで複製適 格ウィルスも生じることがわかった。このため、追加変異がヘルパーウィルス及 び／又は複製適格ウィルスの生産確率を更に減少させるためツク・ソヶージ化細 胞系でレトロウィルスＤＮＡ中に導入される〔例えば、Ｘ目Ｉｅｒら（１９１１ ６）、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、［ｔ：２８９５−２９０２及び旧１ｌｅｒ の米国特許第４，８６１，７１９号明細書参照〕。

パッケージ化細胞系はＮＩＨ３Ｔ３細胞のような形質転換又は不死化細胞系、特 にＮ　Ｉ　Ｈ３Ｔ３チミジンキナーゼ（ＴＫ−）細胞に由来する。望ましい欠失 及び変異をうけたレトロウィルス配列を含むプラスミドのようなりＮＡ組立体と 単純ヘルペスウィルス（ＨＳ　Ｖ）チミジンキナーゼ（Ｔ　Ｋ）遺伝子のような 選択マーカーがＮＩＨ３Ｔ３　ＴＫ−細胞のような細胞系中に導入され、選択培 地で培養される。選択培地で増殖する細胞が選択され、必要なパッケージ化機能 の存在に関して試験される。

レトロウィルスベクターを生産しヘルツく一ウィルスを生産しないものが選択さ れ、感染複製不適格レトロウィルスベクターを生産するパッケージ化細胞系とし て用いられる。

標的細胞及び遺伝子療法におけるそれらの用途遺伝子移入用に適した標的細胞は 繊維芽細胞、免疫細胞、特にリンパ球及び上皮細胞のような容易に得られて移植 後も残存するものである〔例えば、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓら（ＩＨ８）　、　Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔ　Ｉ　、＾ｃａｄ、ｓｃ１．８５：３１５０−５４　；　Ｋｅｌ　Ｉ ｅｒら（１９８５）　、Ｎａｔｕｒｅ、　３１ｇ：　１４９−１５４；Ｘｉ　Ｉ 　Ｉｅｒら（１９Ｈ）、Ｊ、ＶＩｒｏｌ。

８２：４３３７−４３４５；Ｍｏｒｇａｎら（１９！１９）の米国特許第４，８ ６８゜１１６号明細書参照〕。

ヒトにおける遺伝子療法の最初の使用では標的細胞として腫瘍侵入リンパ球（Ｔ 　Ｉ　Ｌ）を要したＣ　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９９０）、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ 、Ｊ、Ｍｅｄ、９：５７０−５７８参照〕。ＴＩＬは腫瘍部位への抗癌療法剤デ リバリ−用ビヒクルとして有望性を示すリンパ球副集団である。これらのリンパ 球は宿主免疫系による試みの一部として腫瘍中に侵入して免疫応答を開始する。

遺伝子療法用の標的細胞として有用なＴＩＬ細胞はインターロイキン−２（ＩＬ −２）を含有する適切な組織培地で腎臓、結腸又は胸部腫瘍、メラノーマ及び肉 腫のような切除されたヒト腫瘍をインビトロでインキュベートすることによりイ ンビトロで生産できる。培地中のＩＬ−２は腫瘍内Ｔ細胞、”ＩＩＬ細胞の拡張 及び活性化と腫瘍細胞又は組織の破壊を起こす。培養２〜３週間後に腫瘍細胞は 破壊され、培養物は細胞溶解Ｔリンノく球（ＣＴＬ）の表現型を有するリンＩく 系細胞を主１こ含有する〔例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８ｇ）　、Ｎ、 Ｅｎｇｌ、Ｊ、ＭｅｄＪ１９：１８７６−１６ＨＨＭｕｕｌら（１９１ｉ７）　 、Ｊ、　１ｓｉｕｎｏ１．１３ｇ＋９８’ｌ−９９５；Ｔｏｐａｌｉａｎら（１ ９８９）、　Ｊ、　ｌ５Ｉｌｕｎｏｌ　、１４２：３７１４−３７２５参照〕。

ＴＩＬ細胞も遺伝子療法、特に癌療法の方法で使用上有望性を示すが〔例えば、 Ｃｕ１ｌｊｔｏｎ（１９８９）、−Ｎｅｗｓ　ａｎｄＣｏｍｍｅｎｔ”　ｉｎ　 ５ｃｉｅｎｃｅ、２４４＋１４３０−１４３３及びＫａｓｌｄら（１９９０）　 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、ＡｃａｄＪｃｉ　、８７：４７３−４７７参照〕、それ 【よそれらが腫瘍を標的にして望ましいタン、＜り質をコードするＤＮＡの挿入 により修正され、培養して患者１こ再導入されつる自家細胞源を与えるからであ る。最近、細菌マーカー遺伝子をコードするＤＮＡ、即ちネイマイシンホスホト ランスフエラーゼをコードするｎｅｏを含むＴＩＬが患者に注入後ＴＩＬの運命 を追跡するためメラノーマ患者の血管内に注入された（　ｆ？ｏｓｅｎｂｅｒｇ ら（１９９０）、Ｎｅｖ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、９：５７０−５７８参照〕。

その遺伝子はレトロウィルスベクター中１こ挿入され、しかる後レトロウィルス バツケージ化細胞系中１こ導入された〔旧１１ｅｒら（１９８６）、Ｍｏ１．Ｃ ｅ１ｌ　Ｂｌｏｌ、６：２８９５−２９０２）。

パッケージ化細胞系は培養され、約１．３〜２．３の対細胞ピリオン感染多重度 でＴＩＬ細胞に形質導入するために十分な力価でパッケージ化欠陥ピリオンを生 じた。

形質導入後に細胞は一夜培養され、感染細胞数を増加させる努力をするためＴＩ Ｌは再度ウィルスに接触せしめられた。細胞の１〜１１％のみが形質導入された が、少くとも６４日間にわたり治療患者で注入されたＴＩＬを位置決定して確認 することができた。

進行メラノーマ患者からのＴＩＬはＴＮＦをコードするＤＮＡの挿入により修正 され、置細胞の抗腫瘍活性を高める努力をするため患者に再注入される。

遺伝子障害、即ち重度混合免疫不全疾患の治療用遺伝子療法に関する最初の実験 が現在進行中である。重度混合免疫不全疾患に関連したＡＤＡ不全は致命的症状 であるが、それはＴ及びＢリンノく球に毒性であるＡＤＡ基質のデオキシアデノ シン及びアデノシンが罹患個体の血清中に蓄積するからである。この障害を治療 する希望をもって、アデノシンデアミナーゼ（以下、ＡＤＡ）をコードするＤＮ Ａを含むレトロウィルスベクターＣＨｏｃｋら（１９８９）、　Ｂｌｏｏｄ、７ ４：８７Ｂ−８８１）が子供ＡＤＡ不全から得られたリンパ球中に導入された。

レトロウィルスベクターはヘル、＜−ウィルスの付随的生産なしにＡＤＡ遺伝子 を含む比較的高力価のレトロウィルスを生産するために示された細胞系を用いて インビトロでパッケージ化された。／＜・ソケージ化細胞で生産された力価は比 較的高いが、それらは約１ピリオン／標的リンパ球の感染多重度で感染する上で 十分高（１だけであって、これはパッケージ化レトロウィルスベクターへの標的 細胞の反復接触後に多くて約１０％の接触標的細胞に形質導入する上で十分であ った。次いで形質導入されたリンパ球は子供に注入された。同様に形質導入され たリンパ球の反復注入後に、十分なレベルのＡＤＡは毒性代謝産物の濃度を減少 させてそれにより正常に整った免疫細胞を発育させるように発現されることが期 待される。

リンパ球は限られた寿命を有するため、形質導入リンパ球の注入は規則的間隔で 繰り返されねばない。このような各注入毎にリンパ球が形質導入されねばならず 、各形質導入では比較的低力価のレトロウィルスベクターが得られるだけである ためパッケージ化レトロウィルスベクターへのリンパ球の多数回接触を要する。

リンパ球がパッケージ化レトロウィルスベクターに６回も接触した場合であって も、培養リンパ球の約１０％が形質導入されるだけである。したがって、この操 作は高価であり、改善されないならば一般的臨床用に利用できない。

レトロウィルス粒子はこわれやすいため、それらは当業者に知られるいかなる手 段でも濃縮できない。得られる形質導入標的細胞の濃度（形質導入細胞／標的細 胞の総数Ｘ１００）及び総数はパッケージ化細胞系で生産されるレトロウィルス 粒子の力価により制限され、更にこれはパッケージ化細胞系をいれた培地中に放 出されるパッケージ化粒子の濃度により制限される。通常、わずか７×１０〜５ 　ｘ　１０５ＣＰＵ／ｍｌの力価が得られるだけであり〔例えば、Ｘｉ　ｌ　ｌ ｅｒの米国特許第４，８６１，７１９号明細書参照〕、これは遺伝子療法におけ るそれらの有用性をかなり制限する。しかしながら、十分な数の標的細胞に形質 導入するためには、少くとも１０６〜１ｏ７ＣＰＵ／ｍ　Ｉの力価を有すること が必要である〔Ｘ目Ｉｅｒら（１９＋＋８＞、Ｊ４ｊｒｏ１．６２：４Ｈ７−４ ３４５３゜したがって、本発明の目的は組換えウィルスベクター、特に組換えレ トロウィルスベクターを高力価で生産するための方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は高感染多重度で標的細胞に本発明のもう１つの目的は 高感染多重度で効率的に標的細胞に形質導入するための二重バイオリアクター系 及び方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は遺伝子療法に用いることのできる高濃度の形質導入標 的細胞を提供することである。

発明の概要 中空繊維バイオリアクターで生産細胞を培養することによる組換えウィルスベク ターの力価生産方法が提供される。特に、中空繊維バイオリアクターでパッケー ジ化細胞系を培養することによる高力価の組換え真核ウィルスベクター、特に組 換えレトロウィルスベクターの持続的及び連続的生産を生じる方法が提供される 。　高力価の組換えレトロウィルスベクターが中空繊維バイオリアクターで培養 された生産細胞、即ちパッケージ化細胞により積層培地、即ち余剰繊維スペース （以下、ＥＦＳ）培地中に分泌される方法も提供される。

高力価の組換えウィルスベクターを生産しうる能力があれば、遺伝子療法に有用 である十分な濃度で標的細胞に形質導入できる。標的細胞は生産細胞が培養され たバイオリアクターからのＥＦＳ培地と標的細胞を接触させることで形質導入さ れる。

好ましい態様において、レトロウィルスベクターに由１）の感染パッケージ化レ トロウィルスベクターがＥＦＳ培地に蓄積される。ＥＦＳ培地が回収されて新鮮 培地と取替えられると、生産細胞は高率で、通常少くとも約１０８レトロウイル ス粒子／１／日でウィルスベクターを分泌し続ける。ＥＦＳ培地は何度も回収で き、組換えレトロウィルスベクターの生産が続き、高レベルで持続さ組換えレト ロウィルスベクターを含有するＥＦＳ培地は、約１０ＣＰＬＩ／標的細胞もの高 い感染多重度において選択された標的細胞、特にリンパ球、と接触させられる。

次いで標的細胞は第二バイオリアクターで培養される。

標的細胞はパッケージ化細胞系からの多数回ＥＦＳ培地回収物と接触させてもよ い。１００％までの標的細胞に形質導入することが可能であるはずである。

好ましい態様において、二重バイオリアクターでは生産細胞が培養されている第 一バイオリアクターからのＥＦＳが、標的細胞が培養されている第二バイオリア クターのＥＦＳと接続させられる。この構成は第一バイオリアクターからのＥＦ Ｓ中における培地を第二バイオリアクターのＥＦＳ中に導入することで標的細胞 を効率的かつ連続的に形質導入する。第二バイオリアクターで消費されたＥＦＳ を集め、また、第一バイオリアクターのＥＦＳに新鮮培地を加えるための手段も その系に含まれる。

パッケージ化細胞系の中空繊維培養物から得られたＥＦＳ培地が、ＡＤＡをコー ドする核酸を含む高力価のレトロウィルスベクターＬＡＳＮを生産することを実 証する例が示される。パッケージ化ＬＡＳＮレトロウィルスベクターはＡＤＡ欠 乏リンパ系細胞を効率的に形質導入するために用いられ、しかる後ＡＤＡ活性を 発現した。

図面の簡単な説明 図１ａはバイオリアクターにおける培養期間の関数として力価（ベクター粒子／ １）を示す。培養５０日後にウィルスベクター粒子の力価は１０６粒子／１以上 で安定化した。

図１ｂは培養時間の関数として１日当たりのバッケ−ジ化レトロウィルスベクタ ー粒子生産として表示される同様のデータについて示す。１日当たりのベクター 粒子生産は実質上培養期間の経過に従い増加する。

図２は標的細胞を含有する中空繊維バイオリアクターのＥＦＳ中へのウィルスパ ッケージ化又は生産細胞系を含有する中空繊維バイオリアクターからのＥＦＳの 直接及び連続接種用二重潅流回路の概略図について示す。潅流回路はリザーバー （ａ）、接続チューブ（ｂ）、培地ポンプ（Ｃ）及び中空繊維バイオリアクター （ｄ）を含む。細胞は充填側口（ｒ）からＥＦＳ中に注入される。

ウィルス生産中空繊維バイオリアクターのＥＦＳからの培地は、標的細胞中空繊 維バイオリアクターのＥＦＳ中に連続的、周期的又は断続的にいずれかでポンプ 導入される。回路はウィルス生産バイオリアクター用のＥＦＳ代替培地（１）を 含有するりザーバーボトルも含み、標的細胞バイオリアクターから消費ＥＦＳ培 地（２）を集めるためいくつかの小さなリザーバーボトル（４）が２つのバイオ リアクターのＥＦＳ間とりザーバ−（１）及び（２）間の接続ライン中に含まれ る。小さなボトルはサンプル回収、接種又はいずれかのバイオリアクター中ＥＦ Ｓ培地の無菌空気での置換に用いてもよい。リザーバー及び小さなボトルの各々 にフィルター（ｒ）がある。クランプ（Ｘ）は培地の流れを指定するため様々な ラインに存在する。ラインのいずれにおかれてもよいコネクター（Ｃｏ）は回路 のあらゆる要素の取外し及び置換を可能にする。ペリスタポンプ（Ｐ）が作動さ れたときに開き及びポンプが作動していないときに閉じる自動ピンチバルブも回 路に含めてよい。

好ましい態様の説明 特にことわらないかぎり、ここで用いられるすべての技術及び科学用語は本発明 が属する当業者により通常理解される場合と同じ意味を有する。ここで言及され たすべての公開文献は本明細書の開示の一部とされる。ここで言及されたすべて の米国特許はそれら全体が本明細書の開示の一部とされる。

定義 ここで用いられる遺伝子療法とはこのような療法がめられる障害に罹患した個体 のある細胞、即ち標的細胞への異種ＤＮＡの移入に関する。ＤＮＡは異種ＤＮＡ が発現されそれによってコードされた産物が生産されるように選択された標的細 胞中に導入される。一方、異種ＤＮＡは治療産物をコードするＤＮＡの発現をあ る様式で媒介しても、それは治療産物の発現を直接又は間接的にある様式で媒介 するペプチド又はＲＮＡのような産物をコードしてもよい。遺伝子療法は宿主で 正常に産生されないか又は治療上有効な量でもしくは治療上有用なときに生産さ れないＴＮＦのような治療化合物を導入するために用いてもよい。治療産物をコ ードする異種ＤＮＡは産物又はその発現を高めるか又はそうでなく変えるために 罹患宿主の細胞への導入前に修正してもよい。

ここで用いられる異種ＤＮＡとはそれが発現される細胞によりインビボで正常に 生産されないＲＮＡ及びタンパク質をコードするかあるいは転写、翻訳又は他の 調節生化学プロセスに影響を与えることで内在ＤＮＡの発現を変える媒介物質を 媒介又はコードするＤＮＡである。

異種ＤＮＡは外来ＤＮＡと称してもよい。当業者が、発現される細胞にとり異種 又は外来として認識又は考えるいかなるＤＮＡもここでは異種ＤＮＡに包含され る。異種ＤＮＡの例としては格別限定されず、薬物耐性を付与するタンパク質の ような追跡しうるマーカータンパク質をコードするＤＮＡ、抗癌剤、酵素及びホ ルモンのような治療上有効な物質をコードするＤＮＡと抗体のような他のタイプ のタンパク質をコードするＤＮＡがある。異種ＤＮＡでコードされる抗体は異種 ＤＮＡが導入された細胞の表面上で分泌又は発現される。

ここで用いられる治療上有効な産物とは宿主中ＤＮＡの導入で先天性又は後天性 疾患の症状、発現を有効に改善又は除去するかあるいは上記疾患を治癒させる産 物が発現される異種ＤＮＡでフードされた産物である。

典型的には、望ましい異種ＤＮＡをコードするＤＮＡはプラスミドベクターに組 み込まれてクローニングされ、リン酸カルシウム媒介ＤＮＡ取込み（（１９８１ ）Ｓｏｓａｔ。

Ｃｅ１１．Ｍｏ１．Ｇｅｎｅｔ、７：８０３−８１６　参照〕のようなルーチン 方法又はパッケージ化細胞のような生産細胞中への＠量注入により導入される。

生産細胞で増幅後、異ＩＪＤＮＡを含むベクターは選択された標的細胞中に導入 される。

ここで用いられるプロモーター、エンハンサ−１転写及び翻訳停止部位と他のシ グナル配列のようなヌクレオチドの異種ＤＮＡ調節及びエフェクター配列の機能 的結合とはこのようなりＮＡとヌクレオチドのこのような配列との関係に関する 。例えば、異種ＤＮＡとプロモーターとのａ！能的結合とはこのようなりＮＡの 転写が特異的にプロモーターを認識してそれに結合し、このようなりＮＡを転写 するＲＮＡポリメラーゼによりこのようなプロモーターから開始されるようにＤ ＮＡ及びプロモーターが空間的に関連していることを意味する。異種ＤＮＡは当 業者に公知のいかなる方法で細胞中に導入されてもよい。

ここで用いられる標的細胞とは異種ＤＮＡが治療される宿主において発現用に導 入される細胞である。このような異種ＤＮＡは、ある個体が発現しないか又は欠 陥がある形で発現する酵素のような遺伝産物をコードする。

適切な標的細胞は当業者に知られており、それには格別限定されないが！１ｍ芽 細胞〔例えば、Ｓｔ、ＬｏｕｉＳら（１９８１１）。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、１１５：３１５０−５４参照〕及び免 疫細胞〔例えば、Ｋｅｌｌｅｒら（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ、３１８：１４９ −１５４及びＭＮＩｅｒら（１９Ｈ）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２：４３３７−４３ ４５参照〕がある。

標的細胞は治療される個体から取出され、異種ＤＮＡをインビトロで導入するこ とにより修正してもよい。例えば、リンパ球のような標的細胞は生産細胞により 生産されたレトロウィルスベクターで形質導入してもよい。一方、肺の内側を覆 う内皮細胞のような標的細胞を、インビボで修正することもできる。

ここで用いられる形質導入標的細胞とは、異種ＤＮＡを含む組換えベクターと標 的細胞を接触させた後で異種ＤＮＡを含むか又は異種ＤＮＡを含んで異１１’Ｄ ＮＡでコードされる産物を発現する標的細胞の一部に関する。遺伝子工学処理標 的細胞、即ち異種ＤＮＡを含む標的細胞は、先天性又は後天性遺伝欠陥を有する 個体中にそれらを導入することにより、格別限定されないが、ある免疫不全疾患 、β−サラセミア、ゴシエ病、血友病及び嚢胞性繊維症のような遺伝障害を直す ために遺伝子療法で用いられる。加えて、標的細胞はこのようなりＮＡが発現さ れた場合に、細胞がインビボで選択的に拡張又は破壊されるようにメトトレキセ ート耐性のような薬物耐性又は薬物感受性をコードするＤＮＡも発現して、抗体 及びＷ１瘍壊死因子を含めた治療上有効な物質を発現するように遺伝子工学処理 してもよい。

ここで用いられる形質導入とは、ウィルスベクターが特異的に細胞表面レセプタ ーと結合して細胞に侵入するプロセスである。それはウィルス感染に似たプロセ スであるが、但しウィルスベクターは修正されたウィルスであって、標的細胞内 導入時に通常生産的感染を起こさない。例えば、レトロウィルスベクターは複製 不適格であるように通常デザインされる。

ここで用いられる形質導入標的細胞の濃度とは形質導入標的細胞の数／ベクター と接触した標的細胞の総数に関する。その濃度はパーセンテージとして表示して もよい（形質導入標的細胞の数／標的細胞の総数Ｘ１００）。

ここで用いられる組換えウィルスベクターとはＲＮＡ又はＤＮＡウィルスに由来 するＤＮＡを含みかつ異ＭＤＮＡも含むベクターであるが、これはこのようなベ クターが、由来するウィルスが複製できる宿主細胞により認識されるプロモータ ーと他の転写及び翻訳調節配列又はシグナルと通常機能的に結合している。組換 えベクターはエピソーム要素として独立に複製する部分として留められても又は 宿主細胞のゲノム中に組み込まれてもよい。

遺伝子療法に有用な組換えウィルスベクターは典型的には真核細胞で感染及び複 製するウィルスに由来し、それにより真核細胞中に異種ＤＮＡを導入するための 手段として役立つ。エビソーム性を留める組換えウィルスベクターは複製源を含 み、それによりＤＮＡ合成が開始できる。ゲノム中に入った組換えベクターは組 換えを行う上で必要なりＮＡ配列を含まねばならない。遺伝子療法で用いられる 好ましい組換えウィルスベクターは宿主細胞ゲノム中に入るものの中から通常選 択される。

ここで用いられる生産細胞とは、その中で組換えウィルスが複製されてそれによ り増幅されるものである。一部の生産細胞はその細胞が培養された培地中に組換 えウィルスもパッケージ化して分泌する。生産細胞で生産される組換えウィルス ベクターは標的細胞を形質導入する上で用いられる。生産細胞とは典型的にはイ ンビトロで培養されて最大量の組換えベクターを生産するようにデザインされた 不死化又は形質転換細胞系である。例えば、レトロウィルスパッケージ化細胞系 は欠陥レトロウィルスベクターをパッケージ化する上で必要なトランス作用因子 を含む生産細胞である。

ここで用いられる獲得免疫療法とは免疫系の細胞が個体から取り出され、インビ トロで培養及び／又は操作され、後天性又は先天性疾患用治療処置の一部として 同−又は異なる個体に導入される治療方法である。免疫細胞及び獲得免疫治療法 は異種ＤＮＡのデリバリ−用ビヒクルとして遺伝子療法の方法で使用のため適合 化させてもここで用いられる免疫細胞には免疫系の機能に関与するいかなる細胞 も含まれる。リンパ系細胞としては、このような細胞が存在するあらゆる組織に 由来するリンパ球、マクロファージ及び単球がある。一般にリンパ系細胞が治療 される個体から取り出される。

ここで用いられる増殖促進物質とは、ある様式で直接又は間接的に細胞に関与し 、それを誘導するか又はそうでなければ細胞を活性化して分化又は増殖させる可 溶性又は不溶性である物質である。増殖促進物質としては当業者に知られるイン ターロイキン、コロニー刺激因子及びいずれか他のこのような因子を含めた分裂 促進因子及びサイトカインがある。例えば、インビトａでＩＬ−２を要するリン パ球のような標的細胞を含めた多くのタイプの細胞はある増殖促進物質について 絶対必要性を有する。増殖促進物質は当業者に周知である。インターロイキン１ 〜７のような多（のこのような物質はインビトロでクローニング及び発現された 。バイオリアクターで生産細胞及び標的細胞の双方を培養するために適切な増殖 因子を選択することは当業界の技術レベル内に属する。

プロタミンのようなポリカチオン類を含めた他の物質も、例えば標的細胞表面へ のウィルス吸着を高めることでウィルス感染力を促進するためにバイオリアクタ ーに加えここで用いられる治療上有効な量の形質導入標的細胞とは、遺伝子療法 のため個体中このような細胞の少くとも１回の注入にとり十分な濃度及び数の形 質導入標的細胞である。治療上有効な量の形質導入標的細胞の注入で、形質導入 細胞により生産される十分量の産物が発現されて、先天性又は後天性疾患の症状 又は発現を改善又は除去する。疾患の症状又は発現の治癒又は実質的軽減を行う ためには、多数回注入を繰返し実施する及び／又はこのような注入を周期的に繰 返すことが必要であろう。

ここで用いられる中空繊維培養系は中空繊維バイオリアクターと潅流培地をポン プ導入及び回収するための手段からなる。中空繊維バイオリアクターは培地が潅 流される多数の半透過性繊維を包込む中空外郭である。

ここで用いられる余剰繊維スペース（Ｅ　Ｆ　Ｓ）とは細胞が増殖するスペース であって、半透過性繊維の外にあり、中空繊維バイオリアクターの外郭以外と接 せられる。

一方ＥＦＳは余剰キャピラリースペース（Ｅ　ＣＳ）とも称される。

ここで用いられるＥＦＳ細胞培地とは細胞がＥＦＳ中で増殖している培地である 。それはＥＦＳ上澄とも称される。それは分泌ウィルス粒子、拡散性栄養素とＥ ＦＳ培地に加えられたリンホカイン及びサイトカイン又は清流組織培地に加えら れた拡散性産物のような増殖促進又は抑制物質を含むいずれか他の化合物を含め た分泌細胞産物を含有する。ＥＦＳ中に含有される具体的成分はそこに接種され たものだけでなく選択された中空繊維の特性にも依存する。

このため、ここで用いられる中空繊維バイオリアクター又は中空繊維バイオリア クターカートリッジは哺乳動物細胞の増殖に適した外部外郭鋳型、上又は近くで 哺乳動物細胞の増殖に適した外郭内に包込まれた多数の半透過性中空繊維と細胞 及びＥＦＳ細胞上澄を含有するＥＦＳからなる。

ここで用いられる組織培地としては、インビトロで哺乳動物細胞の増殖又は維持 に適したあらゆる培地がある。

このような培地の例としては格別限定されず、ＡＩＭ−Ｖ、ＲＰＭＩ及びイスコ ープ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ）培地〔ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、グランドアイランド、 ＮＹ）がある。

ここで用いられる完全ＡＩＭ−Ｖは有標処方ＡＩＭ−■（ギブコ、グランドアイ ランド、ＮＹ）からなる組織培地であり、ゲンタマイシン１０μｇ／ｍｌ　（ギ ブコ）、ストレプトマイシン５０μｇ／■１（ギブコ）、ペニシリン５０μｇ／ 腸Ｉ（ギブコ）、フンギシン１．２５μｇ７ｍＩ　Ｃフロー・ラボラトリーズ（ Ｐｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マクリーン。

ＶＡ）も含有する。

他の適切な組織培地は当業者に周知で容易に入手でき、ＡＩＭ−Ｖの代わりに容 易に使用できる。

中空繊維バイオリアクター及び中空繊維培養系中空繊維（以下、ＨＦと略記）バ イオリアクター及び）ＨＦ細胞培養系は当業者に公知である〔例えば、Ｋｎａｚ ｅｋ　’ら、米国特許第４，２２０，７２５号、第４，２０６゜０１５号、第４ ，２００．６８９号、第３，８８３．３９３号及び第３．８２１，０８７号、公 開国際出願節Ｗ０　９０１０２１７１号明細書参照；それらの開示は参考のため ここに組み込まれる〕。ＨＦ細胞培養系はＨＦバイオリアクター、系に培地を潅 流するためのポンプ手段、培地を供給及び回収するためのリザーバ一手段と電子 制御、記録及び検出装置を含めた他の要素を含む。

ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９０１０２１７１号明細書で記載されたセルマックス（Ｃ ＥＬＬＭ＾ＸＴＭ）１００ＨＦ細胞培（Ｃｅｌ！ｃｏ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂｉ ｏｒｅａｃｔｏｒｓ、ｌｎｃ、）、ケンシントン。

ＭＤ）のような典型的ＨＦ細胞培養系はリザーノく−として役立つ標準ガラス培 地ボトル、ステンレススチール／ライドン（１７ｙｔｏｎ）ギヤポンプ、繊維及 び細胞が培養される外郭鋳型を含むオートクレーブ処理ＨＦバイオリアクターと 培地の適切なｐＨ及びｐ　Ｏ２を維持する上でガス交換器として役立つ医療用シ リコーンゴムチューブ又は他の接続手段からなる。すべての要素は４つのこのよ うな系を標準組織培養インキュベーター室内と合うようにできるほど十分に小さ な寸法のステンレススチールトレーに固定される。ポンプ速度及び流動方向の自 動反転はインキュベーターの外側におかれ、インキュベータードアのガスケット を通過する平坦なリボンケーブルでポンプモーターに接続された電子制御ユニッ トにより決定される。ポンプモーターはポンプに磁気的に連結され、スチームオ ートクレーブ処理前に系から上げられる。組織培地はリザーバーから吸引され、 中空繊維の管腔からポンプ導入され、しかる後ガス交換チューブを通過するが、 そこでそれは再酸素導入され、そのｐＨは後の再循環のためリザーバーに戻る前 に再調整される。

ＨＦ細胞培養系の一要素であるＨＦバイオリアクターは中空シェル内に包込まれ た多数の半透過性チューブ形繊維を含むカートリッジである。ＨＦリアクター及 びＨＦバイオリアクターという用語は互換的に用いられる。

ＨＦバイオリアクターは哺乳動物細胞の増殖及びそれにより分泌された生物活性 産物の生産のために用いられ〔例えば、Ｋｎａｚｅｋら、前掲参照；更にＹｏｓ ｈｉｄａら米国特許第４，３９１，９１２号明細書参照〕、単純ヘルペスウィル ス、肝炎ウィルス、ウマ脳炎ウィルス、マウス乳癌ウィルス及びヒト免疫不全ウ ィルスを含めたウィルスを培養するためにも用いられた〔例えば、Ｍｅｙｅｒｓ ら、米国特許第４，５４６，０８３号；　Ｍａｒｋｕｓら、米国特許第４．３０ １，２４９号ＨＪｏｈｎｓｏｎら（１９７ｇ）ＡｐｐＩ　、Ｅｎｖｉｒ。

３５：４３１；Ｔｓａｎｇら、ｐｕｂｌｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ’　Ｐｏ５ｔｅｒ 　ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｔ　Ｂｉｏ−Ｅｘｐｏ、１９８Ｂ、Ｂｏｓｔｏｎ 　ＨＡ参照〕。しかしながら、ＨＦバイオリアクターは遺伝子療法で用いられる 標的細胞に形質導入する上で適した形で組換えウィルスベクターを含めた組換え ベクターを生産するためにこれまで用いられたことがなかった。

当業者に周知であるＩＦバイオリアクターカートリツジ〔例えば、ＰＣＴ国際出 願第ＷＯ９０１０２１７１号明細書参照〕は中空シェルに包込まれた多数のチュ ーブ形半透過性膜（以下、繊維と称される）を含有する。

培養細胞は増殖して繊維間のスペースを埋め、繊維の管腔で潅流される培地から 繊維壁を経る栄養素の通過により給餌される。当業者に知られるいかなるＨＦバ イオリアクターも本発明を実施する上で使用に適するであろう。

本発明に従う使用上好ましいＨＦバイオリアクターとしてはＢ３及びＢ４バイオ リアクターがある（セルフ・アドバンスト・バイオリアクターズ社、ケンシント ン、ＭＤ）［ＰＪえば、Ｂ３及びＢ４バイオリアクターの完全な記載に関するＰ ＣＴ国際出願第ＷＯ９０１０２１７１号明細書参照〕。

Ｂ３バイオリアクターカートリッジは約１．　１ｒＴＩ′の表面積を示す数千の チューブ形半透過性膜を含有する。Ｂ４バイオリアクターカートリッジはＢ３カ ートリッジよりもやや大きく、約１．６ゴの繊維表面積を示す。径が各々約２５ ０μｍである繊維は長さが約１２インチ（約３０　ｃｍ）であるポリカーボネー トチューブ中に引き込まれ、余剰繊維容量は液体が繊維の管腔を流動してシェル の反対端で出られるようにポリマー物質で各端部が満たされる。繊維壁は望まし い分画範囲以下の分子量を有する物質の通過を名目上制限する。選択される繊維 はＥＦＳ中に栄養素を通過させるため半透過性であって、ＤＥＡＥセルロース又 はポリプロピレンのような物質であるべきであり、そこで又はその近くで哺乳動 物細胞は増殖できる。例えば、Ｂ３及びＢ４カートリッジで用いられる繊維はセ ルロース中空繊維であって、その壁は３０００〜４０００ドルトン範囲内の分子 量を有する物質に対する拡散を名目上制限する。この分画分子量範囲はＥＦＳか らのパッケージ化組換えウィルスベクターの拡散を妨げるほど十分に小さいこと から本発明を実施する上で使用に適する。繊維は余剰キャピラリー又は外郭サイ ドスペースとも称されるＥＦＳにカートリッジを分割し、その中で最少容積流の 潅流培地が繊維壁による限外濾過で生じる。Ｂ３カートリッジのＥＦＳ容量は約 ５０１、Ｂ４カートリッジの場合は約１００ｇ＋である。

使用のために選択される具体的なカートリッジは、培養されている細胞の要求、 繊維の管腔内を潅流する物質と回収される細胞産物及び組換えベクターを含めた 様々なパラメーターに依存する。適切なバイオリアクターカートリッジと更にＨ Ｆ培養系を選択することは当業界の技術レベル内に属する。繊維、ひいてはカー トリッジ及びＨＦ細胞培養系はそれらが透過性及び／又は不透過性でなければな らない潅流培地の成分の関数として及びＥＦＳの成分の関数として選択される。

本発明によれば、繊維はそれらがウィルスベクター、パッケージ化ウィルスベク ター又はＥＦＳでその濃度を最大化してこのようなベクターもしくはピリオンに よる潅流培地の望ましくない汚染を防ぐために生産されるどんな形のベクターに も不透過性であるように通常選択される。

組織培地は繊維の管腔内を潅流し、上記繊維周囲のＥＦＳ内にも含まれる。これ ら２つの区画で異なる組織培地は細胞成長及び増殖を持続化できる拡散性成分を 含有する。通常酸素導入された組織培地はリザーバーに供給され、そこからそれ が繊維を経てポンプ導入される。流速はポンプ速度の変更によりコントロールで きる。加えて、潅流培地の流動方向は逆転させることができる〔例えば、ＰＣＴ 国際出願第ＷＯ９０１０２１７１号明細書参照〕。

ＥＦＳ及び／又は潅流培地は培養細胞、特にリンパ球のような選択標的細胞の拡 張又は抑制を特異的に促進するＩＬ−２のような少くともＩＰｉの増殖促進又は 抑制物質の有効量を更に含有してもよく、その場合に有効量とは、細胞がインビ トロで維持又は増殖される上で十分な量である。ＥＦＳ及び／又は潅流培地は血 清、血清タンパク質及び遺伝子工学処理又は修正細胞を選択するための選択剤を 含めた追加成分で補給してもよい。選択される方法は他の可変要素の中で特に細 胞のタイプ、それらの意図された用途及びそれらが繊維に付着する程度の関数で ある。

流速は細胞数が経時的に増加するに従い増加できる。

典型的には、培地の初期流速は約３０〜４０　ｍｌ／ｗｉｎｌ：：Ｉ４整され、 しかる後細胞数が経時的に増加するに従い約３００　ｇｌｂｊｎ以内で増加され る。中空繊維の管腔内における培地の潅流方向は栄養供給物、廃棄希釈物及び中 空繊維周囲スペース内の細胞を更に均一に分布させるため典型的には１０分間毎 に周期的かつ自動的に逆転させてもよい。

全系は細胞接種前に滅菌され、標準空気−ＣＯ２組織培地インキュベーター内操 作用にデザインされる。接種により細胞が中空繊維の表面上につき、そこから栄 養素が通過して細胞に給餌し、そこから代謝廃棄産物が通過して多量の再循環潅 流液中に希釈される。細胞の懸濁液は通常２側口の一方からＨＦバイオリアクタ ーの余剰繊維スペース（ＥＦＳ）中に接種される。その管腔は細胞培地で潅流さ れ、細胞は望ましい時間にわたりインビトロで維持される。細胞が培養されると 、潅流培地はグルコース濃度に関して周期的にモニターされる。潅流培地はグル コース濃度がその初期値の約３０〜４０％まで低下するたびにリザーバーボトル で培地を入れ替えることにより補充される。

細胞を培養した後、ＥＦＳ及び／又は細胞は回収してもよい。本発明によれば、 生産細胞を含有したバイオリアクターからのＥＦＳは回収されて、第二バイオリ アクターで培養される標的細胞に形質導入するために用いられる。多数回繰返し てもよい形質導入とインキュベートの後に、標的細胞が回収される。当業者に知 られるどんな適切な手段もＥＦＳを回収して標的細胞を回収するために用いてよ い。例えば、ＥＦＳを回収するため、バイオリアクターカートリッジがインキュ ベーターから取り出され、層流フード内におがれる。通常約３０〜４０％の細胞 を懸濁した標的細胞を含むバイオリアクターカートリッジは１回穏やかに振盪さ れ、ばらばらにされた細胞を含むＥＦＳの内容物は側口ボトル中に排出される。

新鮮培地がＥＦＳに加えられ、標的細胞のインキュベートが継続できる。

パッケージ化ベクター生産はＥＦＳが周期的に回収されて新鮮培地と入れ替えら れるかぎり高率で継続される。

バイオリアクターからＥＦＳ及び培養細胞を取出すために当業者に知られる他の 方法も用いてよい。

組換えウィルスベクターの選択とその高力礁生産少くとも１つの遺伝子産物をコ ードする組換えウィルスベクターＤＮＡの製造及び選択は当業界の技術レベル内 に属する。一般に、選択される組換えウィルスベクターは複製されて、選択標的 細胞ではなく選択生産細胞によりパッケージ化できるベクターである。、それは ５Ｖ−４０由来又はレトロウィルス由来ベクターのような宿主細胞ゲノム中に組 み込まれるベクターでも又は複製源を含ミ、エビソーム性を留めたエプスタイン ・パールウィルスに由来するベクターのようなものでもよい。

遺伝子産物は抗癌又は抗ウィルス剤のような治療産物でもよい：それは受容者が 生産できないが又は遺伝的欠陥のために変異欠陥形で生産するアデノシンデアミ ナ−１ゼ又は免疫グロブリンのような産物でもよい；それはネオマイシン又はメ トトレキセート耐性をコードするＤＮＡのようなマーカーでもよい（それにより 、再注入され］　た標的細胞が選択又は検出されてもよい）：それはもう１つの 遺伝子産物の発現を調節する産物をコードしてもよい。組換えウィルスベクター 中への異種ＤＮＡの選択、クローニング及び挿入は当業界の技術レベル内に属し 、そのためいかなる周知の方法で行ってもよい。

真核細胞で複製できるウィルスに由来するいがなる組換えウィルスベクターも用 いてよい。選択された異種ＤＮＡは組換えウィルスベクター中に挿入され、しが る後当業者に知られる何らかの手段で生産細胞中に導入される。次いでトランス フェクトされた生産細胞は組換えベクターの複製及び生産にとり十分な時間にゎ たりＨＦバイオリアクター中で培養され、それにより高力価の組換えベクターが 生産される。好ましい態様ではパッケージ化複製不適格感染レトロウィルス粒子 をＨＦバイオリアクターのＥＦＳ中に分泌するパッケージ化細胞系により生産さ れる組換えレトロウィルスベクターを用いる。

好ましいレトロウィルスベクターは遺伝子療法に適したものである。遺伝子療法 で使用上の適合には組換えが複製適格レトロウィルスを生産するか又は細胞性癌 遺伝子を活性化する可能性を最少化することを要し、レトロウィルスベクターは ヘルパーウィルスを付随的に生産しないパッケージ化細胞系でパッケージ化でき ねばならない。このようなレトロウィルスベクターは当業者に知られる手段で組 立てても、当業者に知られるレトロウィルスベクターでも又はそれに由来しても よい。

典型的には、適切なレトロウィルスベクターとしてはＬＴＲ、プロウィルスＤＮ Ａを生産して宿主細胞ゲノム中に組込むために必要な調節シグナル及びレトロウ ィルス配列；検出マーカー及び／又は選択マーカーをコートするＤＮＡを含む異 種ＤＮＡがある。異種ＤＮＡは標的細胞でＲＮＡポリメラーゼにより認識される ５　−ＬＴＲ又は内在プロモーターのようなプロモーターを含む転写及び翻訳調 節配列と機能的に結合させてレトロウィルス構造遺伝子のすべて又は一部の代わ りに挿入される。

レトロウィルスベクターはｃＤＮＡを製造することで通常組立てられ、ｐＢＲ３ ２２のような便利なプラスミド°中に挿入される。望ましい挿入及び欠失は標準 法を用いて行われ、プラスミドはレトロウィルス粒子を形成させるため選択され たパッケージ化細胞系中に導入される。

パッケージ化細胞系中へのプラスミドの導入は当業者に知られるいかなる方法で 行ってもよい。例えば、ＤＮＡはリン酸Ｃａ媒介トランスフエクシジン〔例えば 、ＰＣＴ国際出願第Ｗ０　９０１０１８７０号明細書参照〕、ＤＥＡＥ−デキス トラン媒介トランスフェクション法、リゾチーム融合、直接取込み又は当業者に 知られるいずれか他の方法でトランスフェクトしてよい。典型的には、プラスミ ドは最初に感染パッケージ化粒子を生産するためエコトロピック細胞系中に導入 され、しかる後アンホトロビックパッケージ化細胞系中に形質導入され、選択培 地で培養され、細胞クローンが選択される。選択されたクローンは付随的ヘルパ ーウィルス生産なしにパッケージ化レトロウィルスベクターを生産する能力に関 して試験される。ヘルパーウィルス及び／又は′ａ製適格パッケージ化レトロウ ィルスベクターを生産しないものが遺伝子療法で用いられる形質導入標的細胞で パッケージ化ウィルスを生産させるために使用上適する。異ＭＤＮＡの挿入によ り修正できる臨床上有用な組換えレトロウィルスベクターを含めたレトロウィル スベクターの例としては格別限定されず、レトロウィルス組立体：　ｐＮ２〔例 えば、Ｋｅｌｌｅｒら（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ、３１ｇ＋１４９−１５４及 び旧１１ｅｒの米国特許第４，８６１．７１９号明細書参照〕　；Ｎ２に由来す るｐＬｆ（Ｌ　Ｃ例えば、Ｍｉｌｌｅｒら（１９Ｈ）。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　５ｙｉｐ、ｏｎ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔ ｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。

ＶｏｌｕＩＩｅ　Ｌｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ、ｐｐ、ＬＯｌｇ−１０１９参照］　；Ｇ４１８耐性を付与するネオマ イシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎ　ｅ　ｏ）をコードする細菌マーカ ー遺伝子を含むｐ　Ｓ　Ｄ　ＨＴ　［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）、Ｓｏｍａｔ 、Ｃｅ１１．）４ｏＩＪｅｎｅｔ、１２：１７５−ＩＪ１３）　；選択マーカー のヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼＨＧＰＲＴをコ ードする遺伝子を含むｐＬＰ　Ｌ　［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ、１１０：４７０９−４７１３］がある。

興味ある異種遺伝子を含むようなこれらベクターの誘導体は、標的細胞ＲＮＡポ リメラーゼと他の転写及び翻訳調節シグナルにより認識されるプロモーターと機 能的に結合させて、選択異種ＤＮＡをレトロウィルスベクター中に挿入すること により組立ててもよい。例えば、Ｎ２に由来するレトロウィルスベクターＳＳＣ 及び５ＳＣＸ１各々ＡＴＣＣ胤６７７６０及び６７７６１はエイズ療法で使用の ため提案されたような可溶形の糖タンパク質レセプターＣＤ４をコードする。Ｓ ＳＣ及び５ｓｃｘはＰＡ３１７細胞系（ＡＴＣＣ受理胤ＣＲＬ９０７Ｂ）を用い てパッケージ化された。組立体ｐＬＰＬ２　（例えば、Ｈ目１ｅｒの米国特許第 ４，８６１，７１９号明細書参照〕は３″ＬＴＲにおける第二パッケージ化シグ ナルの欠失のような追加欠失を含めることでｐＬＰＬから誘導され、ｐＢＲ３２ ２ＤＮＡのパッケージ化を妨げる。

好ましい態様において、ｐＬＰＬ６誘導体、Ｎ２誘導体ｆ　Ｂｅｎｄｅｒら（１ ９８７）、ノ、ＶＩｒｏ１．６１：１６３９参照〕であってＡＤＡをコードする レトロウィルスベクターＬＡＳＮＣＨｏｃｋら（１９８９）　、Ｂｌｏｏｄ、７ ４：８７Ｂ−８８１参照〕はＰＡ３１７（ＡＴＣＣ受理ＴｈＣＲＬ９０７８）に 由来するパッケージ化細胞系によりＨＦバイオリアクターで高力価で生産される 。ＬＡＳＮプラスミドベクターはｇａｇタンパク質コード配列を含むが、但しＡ ＴＧがらＴＡＧに変えていかなるｇａｇコード配列の翻訳も妨げることで修正さ れた５−ＬＴＲ，ｐｓｉ”パッケージ化シグナルついてコードするＤＮＡ　［例 えば、Ｂｅｎｄｅｒら（１９１１７）　、　Ｊ、ＶＩｒｏｌ。

８１：１８３９参照］　、５−ＬＴＲと機能的に結合されたＡＤＡ遺伝子をコー ドするｃＤＭＮＡ；ＳＶ４０初期領域プロモーター及びエンハンサ−と機能的に 結合されたｎｅＯ遺伝子；ポリアデニル化部位を含む３−　ＬＴＲを含む。

ＡＤＡ　ｍＲＮＡに関するＡＵＧ開始コドンはＬＴＲで始まり、ＡＤＡ配列、Ｓ Ｖ４０配列及びｎｅｏ配列に続き、３−ＬＴＲで終わる。ＬＡＳＮプラスミドベ クターはアンホトロピック宿主範囲を有するパッケージ化ＬＡＳＮレトロウィル ス粒子を生産するが（）ｌｏｃｋら（１９１ｉ９）、Ｂｌｏｏｄ、７４：８７６ −８８１参照〕、但し検出しうるヘルパーウィルスを生産しないパッケージ化系 ＰＡ３１７　（ＡＴＣＣ受理１ｋｃＲＬ９０７８）中にトランスフェクトされた 。

好ましい態様において、ＬＡＳＮ生産ＰＡ３１７細胞系はＨＦバイオリアクター のＥＦＳ中に接種され、条件下で培養され、それによりパッケージ化ＬＡＳＮレ トロウィルス粒子が高力価でＥＦＳ培地に蓄積する。検出しうるヘルパーウィル スは生産されない。

的細胞に感染できねばならないが、但し宿主を害すべきでない。したがって、そ れらが由来するウィルスはそれらが標的細胞及び／又は標的細胞が導入される宿 主１こ害を与えて標的細胞生化学経路を利用しないように修正されるべきである 。その結果、興味ある異種ＤＮＡを含む組換えウィルスベクターを増幅させるた め、組換えベクターはそれらが複製可能な生産細胞中インビトロで培養されねば ならない。

好ましい態様において、組換えウィルスベクターは／ずッケージ化細胞系と称さ れる生産細胞系で増幅される力く、これはＨＦバイオリアクターで培養され、組 換えベクターが標的細胞中に導入できる形で組換えベクターをＥＦＳ中に分泌す る。特に、異種ＤＮＡを含む感染複製不適格組換えレトロウィルスベクターを生 産する。＜ツケージ化細胞系はＩ（Ｆバイオリアクターで培養され、高力価のパ ッケージ化レトロウィルスベクター粒子がＥＦＳ中書こ蓄積する。

このようなりＮＡ、１４１立体を含むＰＡ３１７のような細胞系は、ウィルスＲ ＮＡがパッケージ化シグナルのような適正なシス作用要素を含むかぎり、異種Ｄ ＮＡをコ−できる。ＰＡ３１７で生産されるパッケージ化ウィルス粒子はアンホ トロビックであり、このため広範囲の楠乳動物標的細胞に感染できる。

適切なパッケージ化細胞系は容易に入手できる周知系から組立てても又は由来し てもよく、それには格別限定されないが、ｐＳ　ｉ　”　ＣＭａｎｎら（１９８ ３，ｃｅｌｌ、３３：１５３−１５９））、ＮＩＨ３Ｔ３　ＴＫ−（旧ｌ１ｅｒ ら（１９１１Ｂ）、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。

Ｂｊｏｌ、６：２８９５−２９０２）　；　Ｐ　Ａ　３１７　（Ａ　Ｔ　ＣＣ受 理ｋｃＲＬ９０７８）［例えば、米国特許第４，８６１，７１９号明細書参照］ 、ＰＡ３１７と類似するが、但しエコトロピック宿主範囲を有するパッケージ化 レトロウィルス粒子を生産するＰＥ５０１ＣＨｏｃｋら（１９１１９）、Ｂｆｏ ｏｄ、７４：８７８−８８１参照〕がある。

好ましい態様において、レトロウィルスベクターＬＡＳＮはＰＡ３１７に由来し たパッケージ化細胞系により生産される。ＰＡ３１７の組立ては旧１１ｅｒの米 国特許第４．８６１．７１９号明細書で記載され、ＰＡ３１７のＬＡＳＮ生産誘 導体の組立てはＨａｃｋら（１９８９）　、Ｂｆｏｏｄ、７４：８７Ｂ−８８１ で記載されている。

簡単には、ｐＢＫ３２２で保存されかつすべてのシス作用要素がｔ　ＲＮＡ結合 部位を除いて欠失されたＤＮＡ組立体は、選択マーカーＨＳＶ　ＴＫｉｌｉ伝子 との同時形質転換でＮＩＨ３Ｔ３　ＴＫ−細胞中に導入された。

ＴＫ＋細胞クローンが選択され、プロモーターと機能的に結合されたＨＧＰＲＴ 遺伝子を含むレトロウィルスベクターｐＬＰＬ２をパッケージ化及び伝達する能 力に関して試験された。レトロウィルスベクターはリン酸カルシウム媒介トラン スフェクションにより導入され、細胞が培養された。数日後に積層組織培地がＫ ＧＰＲＴ生産ウィルスの存在に関して試験された。最大力価のＥＩＧＰＲＴウィ ルス（６Ｘ　１０４ＣＦＵ／ｍｌ）をパブケージ化した細胞系ＰＡ３１７が選択 された。

レトロウィルスベクターＬＡＳＮは、ＡＤＡをコードするｃＤＮＡを導入するこ とにより組み立てられ、Ｎ２由来ベクターであるレトロウィルスＬＮＬ６を含む ブラースミドＤＮＡに挿入されたＣ　Ｂｅｎｄｅｒら（ｌＨ７）、Ｊ。

ＶＩｒｏｌ、８１：１８３９　）　、　Ｌ　Ａ　Ｓ　Ｎにおいて、ＡＤＡ）−ド ｍＲＮＡは５−ＬＴＲで始まり、ＡＤＡ、ＳＶ４０及びｎｅｏ配列に続き、３− ＬＴＲで終わる〔例えば、Ｈｏｃｋら（１９８９）、Ｂｌｏｏｄ、７４：８７６ −８８１参照〕。レトロウィルス組立体を含むｐＢＲ３２２由来プラスミドはエ コトロビ・ツクパッケージ化細胞系中にトランスフェクトされた。エコトロピッ ク細胞系からのバ・ツケージ化レトロウィルス粒子はＰＡ３１７中に形質導入さ れ、Ｇ−４１８耐性クローンが選択され、ヘルパーウィルス生産に関して試験さ れた。ヘルパーウィルスを生産しないものは標的細胞の形質導入用にパッケージ 化ＬＡＳＮを生産するために用いられた。

異種ＤＮＡを含む他のレトロウィルス組立体及びパッケージ化細胞系も、本発明 に従い同様に組立てて用いて使用前に、セルマックスＴＭ１００のようなＨＦ細 胞培養系はスチームオートクレーブ処理され、再循環脱イオン水で連続的に潅流 され、排出され、フラッシングされ、ＥＦＳ及び潅流液双方の経路において選択 組織培地で潅流される。すべての操作は無菌層流フードのような無菌条件下で行 われる。

バイオリアクターカートリッジのＥＦＳを満たす上で十分な容量で十分量、通常 約１０〜２ｘ１０６生産細胞／■Ｉの細胞がＢ３又はＢ４バイオリアクターカー トリッジ（セルフ・アドバンストψバイオリアクターズ社。

ケンシントン、ＭＤ）のような前滅菌カートリッジ中に接種される。接種された バイオリアクターは標準インキュベーターに移され、適切な温度、通常約３２〜 約３７℃で培地により潅流され、これらの条件下で維持される。

細胞が沈降した後、培地はポンプのような外部適用圧力によりＨＦバイオリアク ターで連続的に潅流される。

組織培地を含有したリザーバー、ＨＦバイオリアクターカートリッジ及びポンプ 手段は酸素導入器としても役立つチューブ、典型的にはシリコーンゴムで接続さ れる。

培地は当業者に知られるいかなる手段で酸素導入してもよい。シリコーンゴムチ ューブは酸素を満たす上で及び培地が炭酸水素塩で緩衝化されるならば潅流培地 中への時に役立つ。炭酸水素塩以外の系で緩衝化された培地はインキュベーター 中で必ずしもＣＯ２を要しな（１゜潅流は十分な時間及び条件下で継続され、そ れによりベクターがＥＦＳ中に放出され、しかる後それは高力価の組換えベクタ ーを含有する。組織培地、インキュベート温度及びインキュベート時間を含めた 条件は生産細胞及び組換えウィルスベクターの要求の関数として選択される。こ のような条件の決定及び最適化は当業界の技術レベル内に属する。

インキュベート期間中に、潅流培地を含有するりザーバーは十分に高濃度のグル コース及び他の拡散性栄養素をＥＦＳ中で維持するため及び廃棄物除去のために 取り替えられる。典型的には、潅流液はリザーノく一ボトルを新鮮培地含有ボト ルと取り替えることで１週間に数回充填される。インキュベートは少くとも約１ 〜３０日間又１−Ｌ　Ｌれ以上にわたり続ける。インキュベート期間中に、ＥＦ Ｓは周期的に回収され、標的細胞と接触せしめられる。細胞が１ないし数日間〜 １週間くらいインキュベートされた後、ＥＦＳは回収できる。ＥＦＳは当業者に 知られるバッチ式、周期的、連続的又はそのいずれかの／くリエーションで回収 できる。それは例えば図２で示されるように標的細胞を含有する第二バイオリア クターのＥＦＳに接続してもよい。

好ましい態様において、組織培地に懸濁されたＬＡＳＮ生産ＰＡ３１７細胞は側 口からＢ３又はＢ４バイオリアクター（セルフ・アドバンスト・バイオリアクタ ーズ社、ケンシントン、ＭＤ）中に接種される。バイオリアクターは潅流回路に 取り付けられ、細胞は潅流が開始される約１５分〜数時間前に繊維上に静置され る。−夜叉は１もしくは２日間潅流した後、ＥＦＳは二重潅流回路を用いて第二 バイオリアクター中にそれを直接導入することにより又はバッチ式で回収でき、 新鮮ＥＦＳ培地が加えられて、潅流が続く。ＥＦＳが周期的に１日約１回回収さ れるならば、ＬＡＳＮ生産細胞は少くとも６〜７週間以内にわたり少くとも約１ ０５０ＰＵ／＋Ｉで高力価を生産し続ける。

ウィルス力価は当業者に知られるいかなる方法で測定してもよい〔例えば、Ｘｉ 　ｌ　ｌｅｒの米国特許第４．８６１゜７１９号及びＭｏｒｇａｎらの米国特許 第４，８６８，１１６号明細書参照〕。典型的にはウィルス力価はコロニー形成 単位／１として測定される。

繊維芽細胞〔例えば、Ｐａ１ｅｅｒら（１９１１７）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、ｓｃ１．８４：Ｌ０５５Ｈ８ｔ、Ｌｏｕｉｓら（１９ｇｇ）、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃ１．８５：３１５０−５４　；　Ｐ　ＣＴ国際出願箱ＷＯ９０１０１８７０ 号明細書参照〕、上皮細胞ＣＭｏｒｇａｎらの米国特許第４．８６８，１１６号 明細書参照〕及びリンパ球等の免疫細胞のような標的細胞は、先天性もしくは後 天性疾患を有する患者又は他のドナーのいずれかから得られる。

選択された標的細胞は、形質導入標的細胞を生産するため、ＨＦバイオリアクタ ーで生産された回収組換えウィルスベクターと接触させられる。ウィルスベクタ ーの感染力を高めるために、プロタミンのようなポリカチオン類が約５〜１０μ ｇｅｔｓ　Ｉの濃度で回収ウィルスベクター又は生産細胞が培養されたバイオリ アクターに加えられてもよい。接触は当業者に知られるいかなる方法で行っても よい。次いで標的細胞は生産細胞に関して前記されたようにオートクレーブ処理 及び製造された第二バイオリアクターのＥＦＳ中に接種され、前記のようにイン キュベートされる。

標的細胞は第二バイすりアクタ−のＥＦＳ中に接種前又は後のいずれかで生産細 胞を含有する第一バイオリアクターからのＥＦＳ培地と接触させることにより形 質導入してもよい。標的細胞は回収ＥＦＳ培地とミックスしても、回収ＥＦＳ培 地が接種された第二バイオリアクター中に導入しても又は第二バイオリアクター のＥＦＳは生産細胞を含有する第一バイオリアクターのＥＦＳに接続させて、連 続的又は断続的に接種してもよい。標的細胞は回収ベクター含有ＥＦＳ培地と１ 回以上接触させら標的細胞はバイオリアクターを穏やかに振盪して側口ボトル中 に懸濁細胞を注ぐことにより回収できる。通常約１０１０標的細胞が１回の処理 で用いられ、理想的には１００％が形質導入されるべきである。

好ましい態様において、リンパ球が第二バイオリアクター中に接種され、しかる 後パッケージ化感染複製不適格レトロウィルスベクターを含有する第一バイオリ アクターからのＥＦＳ培地で形質導入される。

好ましい態様において、形質導入はレトロウィルスベクター生産細胞が接種され た第一バイオリアクターのＥＦＳに第二バイオリアクターのＥＦＳを接続するこ とで下記図２で示されるように二重潅流回路を用いて連続的又は断続的に行われ る。次いで標的細胞が第一バイオリアクターからのＥＦＳ培地に繰返し接触させ られる。それにより高率の標的細胞が形質導入できる。

二重バイオリアクター潅流回路 組換えレトロウィルスベクターによる標的細胞の連続的又は断続的接種は標的細 胞で接種された第二バイオリアクターのＥＦＳ中に生産細胞を含有する第一バイ オリアクターからのＥＦＳを直接ポンプ導入することで行つてもよい。これは図 ２で示された二重潅流回路を用０て行ってもよい。

図２で示されるように、２つのノくイオリアクターの潅流回路は（図２において Ｈで表示される）ピンチクランプで分離される。ペリスタポンプは生産細胞を含 有するバイオリアクター中に新鮮培地を導入するために用〜１られる。ペリスタ ポンプが作動されたときピンチクランプは開き、それにより側口から第一／イイ オリアクターのＥＦＳを側口から第二バイオリアクターの場合と接続する。

組換えレトロウィルスベクターを含有するＥＦＳ培地ｉｔ第一バイオリアクター から接続チューブ及びピンチクランプを経て第二バイオリアクターに移される。

新鮮培地は生産バイオリアクターの第二側口から導入される。血中白血球を取出 せるようにデザインされたフィルター＋１２つのバイオリアクター間のチューブ におかれ、ピンチクランプと第二バイオリアクターとの間にさしＧｔさまれる。

これは生産細胞による標的細胞の汚染を防止する。

第二バイオリアクターのＥＦＳからの過剰培地は第二側口から流出フラスコ中に 移される。ペリスタポンプｌよ連続的でも又は周期的に操作してもよい。好まし くＸ態様１こおいて、ポンプは標的細胞を含有する第二ノくイオリアクターのＥ ＦＳ中に約Ｌｏａｆのベクター含有ＥＦＳ培地を導入する上で十分な圧力で約１ 分間／ｈｒで操作される。

下記例は説明目的のみで含まれ、発明の範囲を制限するためではない。

例　Ｉ ＡＤＡを含むレトロウィルス粒子の生産ＬＡＳＮ生産細胞はダステイー・ミラー 博士（Ｄｒ、　Ｄｕｓｔｙ　ＭＮＩｅｒ）の提供によった。Ｌ、ＴＲと作用的に 結合したＡＤＡ遺伝子を含むＬＡＳＮレトロウィルスベクターの構築およびパッ ケージングされたＬＡＳＮレトロウィルスベクター粒子を生産する非ヘル、＜− 細胞系統は、旧ｔｉｅｒに与えられた米国特許第４．８６１．７１０号に記載さ れたＨｏｃｋら（１９８９）　、ＢＬｏｏｄ　７４：　８７Ｂ−８８１で議論さ れている。パッケージング細胞系統およびＬＡＳＮベクターは、公に利用されて いる周知の出発物質を用０て調製した。

簡潔には、ＬＡＳＮは、ベクターＬ　Ｎ　Ｌ　６　（Ｂｅｎｄｅｒら（１９８７ ）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、６１：　１８３９　）に由来し、ＬＮＬ６は周知のベク ターＮ　２　（Ｎａｔｕｒｅ　３１８：１４９−１５４参照、またＡｒＩｅｎｔ ａｎＯら（１９８７）　Ｊ、　Ｖｌｒｏｌ、［ｉｌ：　１Ｂ３９参照）に由来す る。ＬＡＳＮは、５′側で開始するＬＴＲ，すなわちＭｏＭＬＶ　ＬＴＲ，伸長 したパッケージングシグナル、ｐ　ｓ　ｉ”　、ＬＴＲ５ｉａ下１．ニオケルＡ ＤＡ　ｃ　ＤＮＡ、　Ｓ　Ｖ２Ｏの初期領域のプロモーターおよびエン／１ンサ ー、ＳＶ４０プロモーター調節下における細菌ｎｅｏ遺伝子、第２のＬＴＲ並び にポリアデニル化部位を含む。ＡＤＡをコードする配列は、ＳＶ４０およびｎｅ ｏを通じて並びに３’　ＬＴＲへと及んでいる。ＬＡＳＮ配列を含むプラスミド は、エコトロピック（ａｃｏｔｒｏｐｌｃ　）パッケージング細胞系統、ＰＥ５ ０１に導入され、これらの細胞由来のウィルスはＰＡ３１７　（ＡＴＣＣ寄託番 号ＣＲＬ９０７８）を感染するのに用い、Ｇ４１８耐性ＬＡＳＮ生産ＰＡ３１７ 細胞が単離された。

ＬＡＳＮ生産ＰＡ３１７細胞はＴ−１５０フラスコで成長させ、融合性の単層を 生産するよう培養した。３つのＴ−１５０培養フラスコ由来の細胞（約４．５Ｘ １０７ＬＡＳＮ生産ＰＡ３１７細胞）は、トリプシン処理し、完全組織培養培地 （ｃＴＣＭ）（すなわち１０％熱不活性致死小牛血清（Ｆ　ＣＳ　）　（Ｈｙｃ Ｉｏｏｎｅ社、ローガン、ユタ）を含むもの）に再び懸濁し、室温下で１０分間 ８００ｘｇで遠心した。細胞沈殿物を１００ｍ１のｃＴＣＭに懸濁し、８４　Ｉ Ｆカートリッジ（Ｃａｌｉｃｏ　ＡｄｖａｎｃｅｄＢＩＯｒｅａｅｔＯｒＳ社、 ケンシントン、ＭＤ）に片方の口から植え込んだ。全ての操作は滅菌層流フード 中で行った。

使用に先立ってバイオリアクター培養系からのシリコンゴム管の流路はポンプお よび貯蔵器に接続され、側口の管とびんを約１２１℃で２０分間蒸気でオートク レーブした。滅菌技術を用いて、Ｂ４バイオリアクターカートリッジをその包装 から取り除き、滅菌シリコンゴムの管経路に挿入した。びんの側口を、８４　Ｈ Ｆ細胞バイオリアクターの側口に接続した。バイオリアクターのＥＦＳにおける 蒸留水は、空の一口びんに排出され捨てられた。この系は３７℃で一晩０．８リ ットルの脱イオン水を用いて潅流された。次いで潅流流路および各々の系の繊維 外の空間は、ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）最小必須組織培養培地（Ｄ　Ｍ　 Ｅ　Ｍ　、　Ｇｌｂｃｏ社、グランドアイランド、ＮＹ）　、次いで排出され代 わりにｃ　Ｔ　ＣＭ　ｓすなわち４５ｍｇグルコース／リットル　ＤＭＥＭ、１ ０％熱不活性ＦＣＳ、５０単位ペニシリン／ｍｌ、５０．ｃｃｇストレプトマイ シン／ｍｌおよび２．５μｇアンホテリシンＢ／　ｍ　１　、で排出され洗い流 され、これらは潅流回路の貯蔵器中で交換された。次いでバイオリアクター培養 系を３７℃に維持され空気雰囲気下加湿した５％ＣＯ２を含む標準組織培養イン キュベーターに移した。潅流は約１００ｍ１／分の速さで開始した。−晩潅流し た後、バイオリアクターをインキュベーターから取り出し、ＥＦＳに懸濁したＬ ＡＳＮ生産ＰＡ３１７細胞１００ｍ１を一口びんから植えこんだ。次いで完全な ＣＥＬＬＭＡＸ（商品名）バイオリアクターユニットをインキュベーターに設置 し、細胞が繊維に容易に接着するように４時間潅流した。その後の潅流は約４０ ｍ１／分の速さで開始し、細胞が十分に酸素を与えられることを保証するために 培養期間中約３００ｍ１／分に徐々に速さを増加させた。潅流培地の流れの方向 は逆にはしなかった。

潅流培地のグルコース濃度は約１〜４日毎に監視した。

グルコース濃度が最初の値である約４．５ｇｒ／す、ットルの約３０〜５０％に 低下したときに潅流培地を交換した。培地の交換は層流フード中で行った。

予想したように、潅流液をコロニー形成分析でウィルスの分析をしたところ、検 出できるようなウィルスは含まれていなかった。ウィルス粒子は直径約１５０〜 ２００ｎｍであり、直径が大きいため繊維の壁を通して拡散することができない 。指示された時（図１８および１ｂ参照）にＥＦＳ中の培地、すなわちウィルス 粒子を含んでいる培地を採収し、新しいｃＴＣＭで置き換えた。採収された培地 はウィルス含量の分析まで−７０〜−８０℃で保存された。

図１ａはバイオリアクターにおける培養日数の関数としてウィルスの力価を示し たものである。ＩＭｌｂは、培養日数の関数として１日あたり生産されたウィル ス粒子の全数を示したものである。

例　２ ＥＦＳを採収し置き換えることの全ウィルス量およびウィルス力価／ｍｌに与え る効果 連続した三日間、すなわちｔ日目およびｔ＋１日目において、バイオリアクター 由来のＥＦＳ培地、すなわち例１に記載したように植えこみインキュベートした 培地、を採収し力価を測定した。ＥＦＳは、ＥＦＳの内容物をバイオリアクター からびんのもう一方の口に取り出すために、びんの一方のａを０９２ミクロンの フィルターを通して穏かに圧力を加えることによって採収した。

最初のＥＦＳ採収物、すなわちＥＦＳ培地が導入された後、２２．５時間経過し たものは、７．０ＸＩＯ５ＣＦＵ／ｍｌの滴定を生じた。これは１日あたり５． ２×１０７ウイルス粒子の生産率と等しかった。全てのＥＦＳ培地が取り除かれ る採収の後、新しい培地がＥＦＳに加えられ、インキュベートがもう４時間続け られ、その後金てのＥＦＳ培地が採収され滴定された。この滴定は２Ｘ１０　で あり、１日当り１２．０ＸＩＯ７粒子の生産率と等しかった。残っている全ての ＥＦＳ培地は取り除かれ、新しい培地によって完全に置き換えられた。次いでＥ ＦＳ培地は１７時間後に採収され、新しい培地で完全に置き換えられ、それは７ 時間後に採収された。結果は表１に示されるとおりである。

１つのバイオリアクターから１０〜１０６のウィルス力価および１日あたり１０ ８ウイルス粒子以上のウィルス生産率を達成することができた。更にＥＦＳ採収 の頻度が増加すると全ウィルス収量が増加することがわがった。

比較のために融合前の単層である（約１０７細胞）ＬＡＳＮ生産ＰＡ３１７細胞 を含む２つのＴ−１５０フラスコを加湿した５％Ｃ０２雰囲気下、３７℃でイン キュベートした。細胞が融合したときに単層培養由来の培地を採収し力価を測定 した。結果は表ＩＩに示されるとおりであり、単層培養においては約１０３粒子 ／ｍｌの範囲の力価しか達成できないことが示された。

表■ ＨＦバイオリアクターにおけるウィルス粒子の生産連続した　期　間　滴　定　 ＥＦＳ　ウィルス生産率サンプル　時　開本　Ｘｌ０−５＃体積　Ｘｌ０−７− １４２　４．０　２．０　１００　１２．０４　７．０　８．９　７０　２１． ３ ネ　ＥＦＳを置き換え採収するまでの時間林　滴定−組み換えウィルス粒子／ｍ ｌ噂組み換えウィルス粒子生産率− 組み換えウィルス粒子／ｍｌ／日ＸＥＦＳ培地体積表月 単層培養におけるウィルス粒子の生産 フラスコ番号／　期間　滴　定　体積　ウィルス生産率採収番号　時間＊　Ｘｌ ０−３”ｍｌ　ｘｌｏ−５＊＃１／２　２７１　９０　．８０ ２／１　２９　１．１１　９２　．８４’　２／２　２７　．５６　９０　．４ ４本　フラスコ中の栄養を与えてから全ての培地を採収するまでの時間林　滴定 −組み換えウィルス粒子／ｍ＋…組み換えウィルス粒子生産率− 組み換えウィルス粒子／ｍｌ／日Ｘ上清の体積例　３ レトロウィルス粒子のリンパ球への導入ＬＡＳＮ生産ＰＡ３１７培養は、Ｂ３バ イオリアクター　（Ｃｅｌｌｃｏ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ 社ケンシントン、ＭＤ）に８．４Ｘ１０８個の細胞、１００％生存している、を 植えこむことにより開始した。

Ｂ３カートリッジはＢ４カートリッジと同様のものであるが、Ｂ４カートリッジ よりも小さい。このＥＦＳの体積は約５０ｍ１である。内側が培地への酸素輸送 を増加させるために、三層の薄い壁になっている管を力！トリッジの出口を貯蔵 器に接続することに用いた。培地の潅流の方向を国際出願ＷＯ９０１０１２７１ に記載されるように周期的に逆転させた。

Ｂ３バイオリアクターは、１０％熱不活性ＦＣ８，２ｍＭグルタミン（Ｐｌｏｗ 　ＬａｂＯｒａｔＯｒｉｅＳ社）、５０ユニット／ｍ１ペニシリンおよび５０μ ｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで潅流した。この装置を例１に記載 されるようにインキュベーターに設置し、細胞を約１５分間で接着させた。潅流 は１００ｍ１／分よりも遅い流速で開始し、３００ｍ１／分まで徐々に増加させ た。

このＥＦＳは例２に記載されるように周期的に採収され、細胞および細胞片を取 り除くため約８００ｘｇで約１０分間遠心した。採収されたＥＦＳは後の分析の ために−７０〜−８０℃で保存した。

培養開始後約５週間は、約６０ｍ１のＥＦＳを採収し、新しい培地と置き換えた 。約１０ｍ１の採収されたＥＦＳを取り出し、希釈し、そしてｍ菌の混入がない ことおよび細胞が健全な状態を示していることを確認した。残りの５０ｍ１はフ ィルターとして１μの大きさの穴をもつナイロン　ポリデスク（商品名）　（Ｗ ＨＡＴＭＡＮ社、マジソン、英国）を用いて濾過した。この濾液を標的細胞の形 質導入を用いた。

選ばれた標的細胞は、ヒ）Ｔ細胞白血病ウィルスＩ（ＨＴＬＶ　ｌ）で形質転換 され、ＡＤＡに欠陥があり’ＩＬ−２依存性で、ヒトリンパ細胞系統である、Ｔ ＪＦ−２であった。ＴＪ　Ｆ−２はＡＤＡに欠陥のある患者を起源として得られ 、次いでＨＴＬＶ　Ｉで形質転換されたものである。

第２のバイオリアクター、Ｂ４バイオリアクター（Ｃｅ１１ｃｏ　Ａｄｖａｎｃ ｅｄ　Ｂｌｏｒｅａｃｔｏｒｓ社、ケンシントン、ＭＤ）に１．３ｘｌＯ８ＴＪ Ｆ−２細胞を植菌した。この細胞は、１０％熱不活性ＦＣ５，ペニシリン、スト レプトマイシン、２ｍＭグルタミン（Ｐｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　） および１０００ユニツト／ｍｌインターロイキン−２（ＩＬ〜２）（シータス社 、エメリービル、ＣＡの提供による）を補ったＲＰＭＩ　１６４０組織培養培地 ＣＢｌｏｆｌｕｉｄｓ社、ロックビル、ＭＤ）中、このバイオリアクターで培養 した。１０００ユニツト／ｍｌのＩＬ−２はまたＥＦＳに含まれていた。貯蔵器 中の培地は１〜４日毎に交換した。またさらにＴＪＦ−２８胞を細胞の密度を増 加させるためにＥＦＳ中に周期的に注入した。培養が確立した後バイオリアクタ へカートリッジを一回温やかに振ることにより、７．２Ｘ１０８個の細胞を層流 フード中で取り出した。次いで約３０〜４０％の細胞は一口びんに排出された。

この細胞は約６５％が生存していた。約２０％の細胞を取り出し、非転換コント ロールとして用いた。残った細胞をベレット化し、上記のように４５ｍ１　ＬＡ ＳＮ濾液に再び懸濁した。

第２のバイオリアクターのＥＦＳは、残りのＴＪ　Ｆ−２細胞を含んでおり、こ れに懸濁した細胞を再び植えこんだ。上記のように調製したＲＰＭＩ　１６４０ 完全培地を加えてＥＦＳを満たし、装置をインキュベーターに設置し、そして潅 流を開始した。２８後形質転換の操作が第２のＬＡＳＮ濾液で繰り返された。さ らに２日後、形質転換操作が再び繰り返された。それぞれＬＡＳＮで形質転換す る前に、細胞のサンプルが分析のために取出された。培養を約８日後に終了させ た。培養は１，０２Ｘ１０１Ｏ個の細胞を含んでおり、８２％が生存していた。

サンプル形質転換細胞のうちいくつかは軟寒天中に導入され、Ｇ４１８の存在下 で培養した。コロニーの形成によって細胞がＬＡＳＮベクター中に存在するｎｅ ｏ遺伝子を発現していることが示された。

さらに形質導入前、最初の形質導入後２日目、そして二回目の形質導入後２日目 に第二のバイオリアクターから取り出したＴＪＦ−２細胞のサンプルを、ｎｅｏ 遺伝子の存在を示すためにポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）によって分析し 、形質導入後の遺伝子の存在を証明した。

ＰＣＲ法は、ＧｅｎｅＡｍｐ　（商品名）試薬およびＤＮＡサーマルサイクラ− （Ｔｈｅｒｓａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ）　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｅｅｒ　Ｃｅｔｕｓ 社、エメリービル、ＣＡ）を用いて行った。

ＤＮＡを形質転換および非形質転換ＴＪＦ−２細胞から単離し、ＰＣＲ法を下記 の配列を有するｎｅｏ遺伝子プライマーとともに１〜２μｇのゲノムＤＮＡを用 いて開始した。

ＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴ ＣＧＴＣ反応混合物をＤＮＡサーマルサイクラ−中、９４℃で２分間加熱し、５ ６℃で２分間アニーリングさせ、７２℃で３分間伸長させ、これを３０回繰返し た。反応生産物をゲルにかけ、ｎｅｏ特異的なプローブで標識した。

形質転換した細胞由来のゲノムＤＮＡはｎｅｏＤＮＡを含んでいた。一方弁形質 転換細胞は含んでいなかった。

従って標的細胞は、ＬＡＳＮで形質転換され、ゲノムＤＮＡに挿入されたＬＡＳ Ｎ由来のＤＮＡを有する。

例　４ 二重潅流バイオリアクター回路を用いたＬＡＳＮによる初期、非形質転換、ＡＤ Ａ欠陥リンパ球の形質転換例１において記載されたように準備されたＢ３カート リッジに、３．５Ｘ１０８個の初期、非形質転換、ＡＤＡ欠陥リンパ球を植え込 み、連続して採収されたＬＡＳＮを含むＥＦＳ培地８４ｍ　ｌを適用した。Ｉ、 ＡＳＮを含むＥＦＳ培地は、その前４８時間のうちに採収され、１０００−Ｌ　 ニット／ｍｌ　ＩＬ−２（シータス社、エメリービル、ＣＡ）を補った。バイオ リアクターは、１０００　ユニー／ト／ｍ１ＩＬ−２を含むＡＩＭ−Ｖで約１０ ０ｍ１／分の速さで順方向に一晩潅流した。

第一のバイオリアクターのＥＦＳ、ＬＡＳＮ生産ＰＡ３１７細胞を有するもの、 は次いで図２に示されるような二重潅流回路の配置において標的細胞バイオリア クターのＥＦＳに接続された。ペリスタポンプは新しい培地、すなわち１０％Ｆ 　ＣＳ　（ＨｙＣｌｏｎｅ社、ローガン、ユタ）および１０００１ニット／ｍ１ ｌＬ−２を含むＤＭＥＭ培地を第一のバイオリアクターの入口に送り込む。ペリ スタポンプは１時間毎に１分間作動させた。新しい培地は５ｍ１／分の速さでＥ ＦＳ中に送り込んだ。ＬＡＳＮ生産ＰＡ３１７カートリツジを２％ＦＣ５を含む ＤＭＥＭで３００ｍ１／分の速さで潅流する。

比較的早い流速の潅流および断続的な入り口開数の結果として、潅流液のいくら かは繊維の壁を通って約５１／分の概算速度でＥＦＳに限界濾過された。血清タ ンパク質は有意な大きさまで限界濾過されないので、ＥＦＳ中におけるＦＣＳタ ンパク質の最終濃度は約５％ＦＣＳと概算される。新しいＥＦＳ培地を入り口に 送り込まないと潅流液は限界濾過されない。

二つのバイオリアクターのＥＦＳを区分するピンチクランプは、ポンプが静止し ているときは自動的に閉じる。

血液の白血球を取り除くフィルターであるＲＣ−５０Ｐａｌｌフイルター（Ｐａ ｉｌ　ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃ　を社、グレン　コープ、ＮＹ）は、 ＬＡＳＮを含むＥＦＳ培地を有するバイオリアクターのＥＦＳ力゛ら取り出した いずれかのＬＡＳＮ生産細胞を取り除くために、最初のバイオリアクターとクラ ンプの間に挿入される。

２つのバイオリアクターを滅菌管溶接（ｓｔｅｒｉｌｅ　Ｔｕｂｉｎｇ　Ｖｅｌ ｄｅｒ　）　（ＳＣＤＩＩＢ　Ｄｕｐｏｎ社ウイルミつトン、ＤＥ）を用いて滅 菌的に結びつけた。第二のバイオリアクターの一方の入口は、第一のバイオリア クターのＥＦＳからの入力に接続し、もう一方はフラスコ、流出液を収集する、 に接続した。

約３．５Ｘ１０８のリンパ級を第二のバイオリアクターに植え込み１０００ユニ ツト／１１のＩ　Ｌ−２を含むＡＩＭ−Ｖで一晩、５０１７分の速さで分ごとに 方向を逆転させて潅流した。第二のバイオリアクターにおける潅流の流速が比較 的遅いため、流出フラスコに実質的に限界濾過させることはなかった。

第二のバイオリアクターに細胞が植え込まれてから約１９時間後、ペリスタポン プ（約５１７分の速さで送り出している）を１分間始動させ、第一のバイオリア クターからＥＦＳ培地約１０−１を第二のバイオリアクターのＥＦＳに導入した 。この１０１１は、貯蔵器からの新しい培地５１１と比較的速い流速の潅流によ って起こるＥＦＳへの潅流液の限界濾過から生ずる５１とを含んでいる。

インキュベートを続行し、１時間に１度ペリスタポンプを自動的に１分間作動さ せた。培養約４８時間（最初の１９時間を含む）後第二のバイオリアクター由来 の約０．５Ｘ１０８個のリンパ球が、ＥＦＳからそれらを排出させることによっ て採集された。

第二のバイオリアクターにリンパ球を２つの２４穴Ｃｏ５ｔａｒ　（商品名）プ レートの各々の穴に導入した。プレートに導入するのに先立ってリンパ球は連続 的に採取されたＬＡＳＮを含むＥＦＳ培地、ｆｌｌおよび２において記載された ように採収されたもの、ｌＮに懸濁された。

次いで２０００ユニツト／１１のＩ　Ｌ−２を含むＡＩＭ−Ｖ　１ｍｌを各々の 穴に加えた。細胞をＣＯ２インキユベ一ター中３７℃で８７時間インキュベート した。約１．６８１０８ｍの細胞は、第二のバイオリアクターにおけるリンパ球 が採収されたと同時にプレートから採収された。

プレートおよびバイオリアクターの両方由来の約１０７個のリンパ球を一部ごと に遠心管に入れ、８００Ｘｇで１０分間延伸して沈殿させ、Ｈａｎｋｓ　Ｂ　Ｓ 　Ｓで洗浄し、再び沈殿させ、そしてその後のＡＤＡタンパク分析用に一８０℃ で凍結させた。

例５ 形質導入されたリンパ球によるＡＤＡ生産の測定例４で調製したリンパ球のサン プルをＡＤＡ生産について分析した。細胞のペレットを温め、フリーズソウ（ｒ 　ｒｅｅｚｅ−ｔｈａｖｌｎｇ）法によって溶解させた。ＡＤＡの基質である１ ４ｃｍアデノシンを加え、混合物を３７℃で１時間インキュベートし、９５℃で ５分間加熱し反応を止めた。混合物を遠心し、その一部を薄層クロマトグラフィ ー（Ｔ　Ｌ　Ｃ）紙に点在させ、リン酸ナトリウム、飽和硫酸アンモニウムおよ びＮ−プロピルアルコールを含む溶媒中で１時間実施した。ＴＬＣ紙を一晩かけ て乾燥させた。スポットを切り出し、シンチレーション液が入ったシンチレーシ ョンバイアルに入れ、シンチレーションカウンターでカウントした。

２４穴プレートにおいて培養した単一の形質転換リンパ球によるＡＤＡ生産率は 、５５　、　２　ｎｇｏｌｅｓ／分／１０８個リンパ球であった。第二のバイオ リアクターから採収された連続的に形質転換されたリンパ細胞によるＡＤＡの生 産は７３　、　２　ｎ５ｏｌｅｓ／分／１０８ｍリンパ球であった。このＡＤＡ 生産率は、ＡＤＡ生産に欠陥のない通常のリンパ球によるＡＤＡ生産率、５０〜 ｂ分／１０８個リンパ球に匹敵する。

比較すると、単層培養したＬＡＳＮ生産ＰＡ３１７細胞から得られた上清を用い 上清に６回さらして形質導入されたリンパ球によるＡＤＡ生産率は、１１．　６ ｒｖｏｌｅｓ／分／１０８個リンパ球しかなかった。ＡＤＡ欠陥、患者由来の非 形質転換リンパ球のＡＤＡ活性は０　、６　ｒｖｏｌｅｓ／分／１０８個リンパ 球であった。

当業者にとって改変を行うことは自明であるため、本発明は、添付した請求の範 囲内に限定されるものではない。

ＦＩＧ、１ａ ＬＡＳＮレトＯウィルスベクターの生産培養日数 ＦＩＧ、ｌｂ ＃１！　Ｂ　般 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，Ｓ　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　７１０Ｌ ９／２６　９１６１−４Ｂ ／／ＣＣ１２Ｎ　９／２６ Ｃ１２Ｒ１：９２） ９２８１−４Ｂ （７２）発明者　ナツェク、リチャード　ニー。

アメリカ合衆国メリーランド州、ロックビル、ブリュワー、ハウス、ロード、１ ０９２２Ｉ Ｃ１２Ｎ　５１００　Ｂ （７２）発明者　ブリーズ、アール、マイケルアメリカ合衆国メリーランド州、 ロックビル、ランカシャー、１９８６

Claims (52)

【特許請求の範囲】
1. １．高力価の組換えウィルスベクターを生産する方法であって、 （ａ）中空繊維バイオリアクターの繊維外空間（ＥＦＳ）に、組換えウィルスベ クターをＥＦＳ培地中に放出する生産細胞を植え込み、そして （ｂ）前記組換えウィルスベクターの力価が、標的細胞あたり１組換えウィルス ベクター以上の多重度感染で標的細胞を形質導入するのに十分な程度に高くなる ような条件下で、前記バイオリアクター中で前記生産細胞をインキュベートする ことを含んでなる方法。
2. ２．ＥＦＳ培地を収集することによって前記組換えウィルスベクターを採収する ことを更に含んでなる、請求項１に記載の方法。
3. ３．新しい培地を上記バイオリアクターのＥＦＳに導入し、そして前記新しい培 地における前記ウィルスベクターの力価が標的細胞あたり１組換えウィルスベク ター以上の多重度感染で標的細胞を感染させるのに十分となるような条件下で、 前記生産細胞をインキュベートするとを更に含んでなる、請求項２に記載の方法 。
4. ４．高力価のパッケージされた組換えウィルスベクターを生産する方法であって 、 （ａ）中空繊維バイオリアクターの繊維外空間（ＥＦＳ）に、パッケージされた 組換えウィルスベクターをＥＦＳ培地中に放出するパッケージ細胞系統を植え込 み、そして （ｂ）前記組換えウィルスベクターの力価が、標的細胞あたり１組換えウィルス ベクター以上の多重度感染で標的細胞を形質導入するのに十分な程度に高くなる ような条件下で、前記バイオリアクター中で前記細胞をインキュベートする ことを含んでなる方法。
5. ５．前記ＥＦＳ培地を収集することによって前記ベクターを採収することを更に 含んでなる、請求項１に記載の方法。
6. ６．新しい培地を上記バイオリアクターのＥＦＳに導入し、そして前記新しいＥ ＦＳにおける前記ウィルスベクターの力価が標的細胞あたり１組換えウィルスベ クター以上の多重度感染で標的細胞を感染させるほど十分となるような条件下で 、前記パッケージ細胞をインキュベートするとを更に含んでなる、請求項４に記 載の方法。
7. ７．前記採収、導入、そしてインキュベートする段階を複数回繰り返すことを更 に含んでなる、請求項６に記載の方法。
8. ８．高力価の組換えウィルスベクターを生産する方法であって、 （ａ）中空繊維バイオリアクターの繊維外空間（ＥＦＳ）に、組換えウィルスベ クターをＥＦＳ培地中に放出する生産細胞を植え込み、そして （ｂ）ＥＦＳ培地中の前記ベクターの力価が、単層培養で培養された場合に前記 細胞によって生産されたものより少なくとも約１０倍高くなるような条件下で、 前記バイオリアクター中で前記生産細胞をインキュベートすること を含んでなる方法。
9. ９．前記力価が少なくとも約１０５コ口ニ形成ユニット／■１である、請求項８ に記載の方法。
10. １０．前記ＥＦＳ培地を収集することによって前記ベクターを採収することを更 に含んでなる、請求項８に記載の方法。
11. １１．新しい培地を前記バイオリアクターのＥＦＳに導入し、そしてＥＦＳ培地 における組換えウィルスベクターの力価が、単層培養で培養された場合に前記細 胞によって生産されたものより少なくとも約１０倍高くなるような条件下で、前 記細胞をインキュベートすることを更に含んでなる、請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記採収、導入、そしてインキュベートする段階を複数回操り返すること を更に含んでなる、請求項１１に記載の方法。
13. １３．高力価の組換えレトロウイルスベクターを生産する方法であって、 （ａ）中空繊維バイオリアクターの繊維外空間（ＥＦＳ）に、組換えレトロウィ ルスベクターをＥＦＳ培地中に放出するパッケージ細胞系統を植え込み、そして （ｂ）前記ベクターの力価が、単層培養で培養された場合に前記細胞によって生 産されたものより少なくとも約１０倍高くなるように、前記バイオリアクター中 で前記生産細胞をインキュベートすること を含んでなる方法。
14. １４．前記力価が少なくとも約１０５コロニー形成ユニット／■１である、請求 項１３に記載の方法。
15. １５．前記バッケージベクターの生産率が約１０５ＣＦＵ／■１／日以上である 、請求項７に記載の方法。
16. １６．前記ベクターが組換えレトロウイルスベクターである、請求項４に記載の 方法。
17. １７．前記レトロウイルスベクターがＬＡＳＮである、請求項１６に記載の方法 。
18. １８．前記ベクターがＬＡＳＮである、請求項１３に記載の方法。
19. １９．前記パッケージ細胞系統がＰＡ３１７由来である、請求項４に記載の方法 。
20. ２０．高濃度の形質導入標的細胞を生産する方法であって、 （ａ）第一の中空繊維バイオリアクターの繊維外空間（ＥＦＳ）に、組換えウィ ルスベクターをＥＦＳ培地中に放出する生産細胞を植え込み、 （ｂ）標的細胞あたり１紐換えウィルスベクター以上の多重度感染で標的細胞を 感染させるのに十分な程度に高い前記組換えウィルスベクターの力価を前記ＥＦ Ｓ培地中で生ずるために十分な時間、前記バイオリアクター中で前記生産細胞を インキュベートし、そして（ｃ）前記ベクターが前記標的細胞を形質導入する条 件下で標的細胞と前記ＥＦＳ培地とを接触させることを含んでなる方法。
21. ２１．前記ベクターが総換えレトロウイルスベクターである、請求項２０に記載 の方法。
22. ２２．前記組換えレトロウイルスベクターがＬＡＳＮである、請求項２１に記載 の方法。
23. ２３．前記接触が組換えベクターを含むＥＦＳ培地を前記標的細胞と混合するこ とにより行なわれる、請求項２０に記載の方法。
24. ２４．前記接触が複数回繰り返される、請求項２３に記載の方法。
25. ２５．前記標的細胞を第二の中空繊維バイオリアクターに導入し、そして形質転 換された標的細胞の治療上の有効量が生産される条件下で前記細胞をインキュベ ートすることをさらに含んでなる、請求項２４に記載の方法。
26. ２６．前記接触が、標的細胞を含む第二のバイオリアクターのＥＦＳに、生産細 胞を含む第一のバイオリアクター由来のＥＦＳ培地を植え込むことによって行わ れる、請求項２０に記載の方法。
27. ２７．形質導入された標的細胞の治療上の有効量が生産される条件下で前記標的 細胞をインキュベートすることをさらに含んでなる、請求項２６に記載の方法。
28. ２８．細胞が少なくとも維持される条件下で前記標的細胞とをインキュベートし 、前記第二のバイオリアクターからＥＦＳ培地を取り除き、そして前記植え込み 段階を繰り返すことを更に含んでなる、請求項２６に記載の方法。
29. ２９．前記除去および植え込み段階を標的細胞の治療上の有効量が生産されるま で複数回操り返す、請求項２６に記載の方法。
30. ３０．前記除去および植え込み段階を前記標的細胞が実質的に全て形質導入され るまで複数回繰り返す、請求項２６に記載の方法。
31. ３１．二重潅流回路において前記バイオリアクターを接続することによって前記 第二バイオリアクターの前記ＥＦＳに第一のバイオリアクター由来の前記ＥＦＳ 培地を植え込み、それによって第一バイオリアクターのＥＦＳを第二バイオリア クターのＥＦＳに接続する、請求項２６に記載の方法。
32. ３２．前記植え込みが断続的に行われる、請求項３１に記載の方法。
33. ３３．前記植え込みが連携的に行われる、請求項３２に記載の方法。
34. ３４．前記生産細胞がレトロウイルスベクターをパッケージした細胞系統である 、請求項２０に記載の方法。
35. ３５．前記組換えウィルスベクターが治療上有効な生産物をコードする異種ＤＮ Ａを含有するものである、請求項１に記載の方法。
36. ３６．前記組換えウィルスベクターが治療上有効な生産物をコードする異種ＤＮ Ａを含有するものである、請求項４に記載の方法。
37. ３７．前前記組換えウィルスベクターが治療上有効な生産物をコードする異種Ｄ ＮＡを含有するものである、請求項２０に記載の方法。
38. ３８．前記生産物が、アデノシンデアミナーゼ、腫瘍壊死因子、第ＶＩＩＩ因子 、第１Ｘ因子、インターロイキン−２、可溶性ＣＤ４糖タンパク質受容体タンパ ク質、抗体、グルコースセレブロシダーゼおよび嚢胞性繊維症、ＴａｙＳａｃｈ ｓ症、またはデュシェーヌ筋ジストロフィーに重要な遺伝子の通常の生産物から なる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
39. ３９．前記生産物が、アデノシンデアミナーゼ、腫瘍壊死因子、第ＶＩＩ１因子 、第１Ｘ因子、インターロイキン−２、可溶性ＣＤ４糖タンパク質受容体タンパ ク質、抗体、グルコースセレブロシダーゼおよび嚢胞性繊維症、ＴａｙＳａｃｈ ｓ症、またはデュシェーヌ筋ジストロフィーに重要な遺伝子の通常の生産物から なる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
40. ４０．前記パッケージ細胞がＰＡ３１７由来である、請求項２０に記載の方法。
41. ４１．前記標的細胞が、繊維芽細胞、免疫細胞および上皮細胞からなる群から選 択される、請求項２０に記載の方法。
42. ４２．前記細胞がリンパ球である、請求項４１に記載の方法。
43. ４３．形質導入された標的細胞を含んでなる組成物であって、前記標的細胞が組 換えレトロウイルスベクターで形質導入され、前記形質導入された標的細胞の濃 度が１０％以上である、組成物。
44. ４４．前記標的細胞が、繊維芽細胞、免疫細胞および上皮細胞からなる群から選 択される、請求項４３に記載の組成物。
45. ４５．形質導入された標的細胞の割合が１０％以上である、請求項２０に記載さ れる方法によって生産される高濃度の形質導入された標的細胞。
46. ４６．形質導入された標的細胞の割合が１０％以上である、請求項３１に記載さ れる方法によって生産される高濃度の形質導入された標的細胞。
47. ４７．請求項３０に記載される方法によって生産される、高濃度の形質導入され た標的細胞。
48. ４８．形質導入された標的細胞を治療上の有効濃度含んでなる、組成物。
49. ４９．第一の中空繊維バイオリアクターおよび第二の中空繊維バイオリアクター からなる二重バイオリアクター潅流回路であって、前記第一のバイオリアクター の繊維外空間（ＥＦＳ）と前記第二のバイオリアクターとを、前記回路を断続的 に開き前記第一のバイオリアクターのＥＦＳ培地を前記第二のバイオリアクター のＥＦＳに導入することによって接続することを特徴とする、回路。
50. ５０．前記第一のバイオリアクターのＥＦＳ由来のいずれの細胞をも前記第二の バイオリアクターのＥＦＳ中に導入しないために、前記バイオリアクターの間に 挿入された濾過手段を更に含んでなる、請求項４９に記載の二重バイオリアクタ ー潅流回路。
51. ５１．高濃度の形質導入細胞を生産する方法であって、中空繊維バイオリアクタ ー中において培養し、そして組換えウイルスベクターの懸濁液を前記バイオリア クターのＥＦＳ中に連続的に導入することを含んでなり、これによって前記細胞 の十分な割合が前記ベクターによって形質導入される、方法。
52. ５２．前記組換えウイルスベクターが真核細胞に感染するウイルス由来である、 請求項５１に記載の方法。