JPH11503916A

JPH11503916A - 高力価組換えレトロウイルス調製物による細胞の高効率エクスビボ形質導入

Info

Publication number: JPH11503916A
Application number: JP8531997A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ジョリー，ダグラス
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 1999-04-06
Also published as: EP0871756A2; WO1996033282A3; WO1996033282A2; CA2216871A1; AU5568296A

Abstract

(57)【要約】Ｔ細胞、分裂中でない細胞、および高力価組換えレトロウイルス調製物に媒介される標準的な形質導入技術に耐性の細胞への、核酸の有効なエクスビボの導入のための組成物および方法を記載する。組換えレトロウイルス粒子が有する組換えベクター構築物は、１つ以上の対応する目的の遺伝子由来の、１つ以上の所望の遺伝子産物(その遺伝子産物のうち少なくとも１つは治療的適用を有する)の産生をコードする。患者への再導入の際に、形質導入された細胞は、特定の疾患状態を処置するに十分な量の所望の遺伝子産物を産生する。

Description

【発明の詳細な説明】高力価組換えレトロウイルス調製物による細胞の高効率エクスビボ形質導入技術分野本発明は、一般に、組換えレトロウイルスおよび遺伝子治療に関し、そしてより詳細には、種々の遺伝子治療の適用に適切な高力価組換えレトロウイルス粒子調製物に関する。発明の背景 1940年代のDNAの発見からつい最近まで続いてきた組換えDNA技術により、疾患の経過が、生存する生物の核酸との相互作用により影響され得る可能性を認識するために実質的な調査が行われてきた。最も最近では、体細胞組織の遺伝子（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノ随伴ウイルスに由来するウイルスベクターを含む(Jolly，Canc er Gene Therapy １(1): 51-64，1994を参照のこと)）の改変またはこれらに影響を及ぼすこと（時々「体細胞遺伝子治療」といわれるプロセス）、ならびに直接移入技術（例えば、リポフェクション（Felgnerら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 7413-7417,1989）、直接DNA注入(Acsadiら，Nature 352: 815-818，1991)、マイクロプロジェクタイルボンバードメント（Williamsら，PNAS 88: 2726-2730 , 1991）、数種の型のリポソーム（例えば、Wangら，PNAS 84: 7851-7855，1987 を参照のこと）および核酸単独の投与（WO 90/11092））について、多種多様な方法が記載されている。これらの技術の内、組換えレトロウイルス遺伝子送達方法は、最も広く利用されている。これは、一部には：(1)複製している細胞への遺伝物質（ベクターゲノム）の効率的な侵入；(2)標的細胞核への活性で効率的な侵入プロセス；(3)比較的高レベルの遺伝子発現；(4)ベクター−標的細胞結合の制御および遺伝子発現の組織特異的制御を介して特定の細胞サブタイプを標的化する可能性；(5)予め存在する宿主免疫の一般的な欠如；および(6)このようなベクターを用いて得られた実質的な知識および臨床経験に起因する。簡略には、レトロウイルスは、組み込まれたDNA中間体を介して複製する２倍体のポジティブ鎖RNAウイルスである。詳細には、RNAウイルスによる感染に際し、レトロウイルスゲノムは、ウイルスにコードされる逆転写酵素（これは、それぞれのレトロウイルス中にタンパク質として運ばれる）によりDNAに逆転写される。次いで、ウイルスDNAは、感染細胞の宿主細胞ゲノム中に偽似乱数的に組み込まれ、娘細胞に遺伝する「プロウイルス」を形成する。野生型レトロウイルスゲノム（およびそれらのプロウイルスコピー）は、３つの遺伝子（gag、pol、およびenv遺伝子）を含む。これらに先行してパッケージングシグナル（Ψ）および両方の末端が隣接する２つの長末端反復（LTR）配列がある。簡略には、gag遺伝子は、内部構造（ヌクレオカプシド）タンパク質をコードする。pol遺伝子は、RNAゲノムを逆転写するRNA依存性DNAポリメラーゼをコードし、そしてenv遺伝子は、レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。5'および3'LTRは、レトロウイルスRNAの転写およびポリアデニル化を促進するのに必要なシス作用性エレメントを含む。 5'LTRに隣接して、ゲノムの逆転写に必要な配列（tRNAプライマー結合部位）および粒子へのレトロウイルスRNAの効率的なカプシド化に必要な配列（ｙ配列）がある。パッケージングシグナルの除去は、ゲノムRNAのカプシド化（感染性ビリオンへのレトロウイルスRNAのパッケージング）を防ぐが、それにもかかわらず、得られた変異体は、なおウイルスゲノムにコードされる全てのタンパク質の合成を指向し得る。組換えレトロウイルスおよびそれらの種々の使用は、例えば、Mannら（Cell 3 3: 153，1983）、CaneおよびMulligan(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 81: 6349，198 4)、Millerら，Human Gene Therapy 1: 5-14，1990，米国特許第4,405,712号；同第4,861,719号；同第4,980,289号、およびPCT出願WO 89/02,468、同WO 89/05, 349、および同WO 90/02,806を含む多くの参考文献に記載されてきた。簡略には、目的の外来遺伝子が、正常なレトロウイルスRNAの一部のかわりにレトロウイルス内に取り込まれ得る。レトロウイルスがそのRNAを細胞中に注入する場合、外来遺伝子もまた細胞中に導入され、次いでまるでそれがレトロウイルス自身であるかのように宿主の細胞DNA中に組み込まれ得る。宿主内でのこの外来遺伝子の発現は、宿主細胞による外来タンパク質の発現をもたらす。しかし、組換えレトロウイルスの１つの欠点は、これらが、主として複製中の細胞にしか感染せず、そのため効率的な直接遺伝子移入が難しいか、または大部分複製中でないと特徴づけられる細胞では不可能なことである。さらに、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核球、および樹状細胞を含むいくつかの他の型の細胞は、従来、複製を刺激した場合でさえ、レトロウイルスベクターによる形質導入に困難であった。これは、特に一次細胞について典型的であった。実際、何人かの科学者は、このような細胞に核酸分子を導入するための、利用されるべき、他のより効率的な遺伝子移入法（例えば、純粋なプラスミドDNAの直接投与）を示唆してきた（D avisら，Human Gene Therapy 4: 733-740，1993）。組換えレトロウイルスの効力を増大させるために、示唆されてきた方法は、主として所望の標的細胞に複製、またはより効率的な複製を誘導し、それによりレトロウイルスを細胞に感染させることを目指してきた。このような方法には、例えば、鉱油中で10％四塩化炭素を用いる化学処理（Kalekoら，Human Gene Thera py 2: 27-32，1991）が含まれてきた。しかし、このような技術は動物細胞に治療的遺伝子産物をコードする核酸分子を導入するために設計されたエクスビボ技術における使用に好ましくない。Ｔ細胞に関して、インビトロの非特異的刺激の種々の方法（例えば、IL-2、アメリカヤマゴボウ有糸分裂促進物質、および抗CD 3抗体）が複製誘導に極めて効率的であり得る。しかし、臨床的および商業的用途に両立可能な方法を用いた効率的な形質導入を得ることの困難が残っている。動物のＴ細胞および複製中でない細胞への効率的な遺伝子移入は、種々の要因によって困難であることが判明している。このような細胞へのレトロウイルス形質導入の現在使用されている方法は、多くの実施制限を有する。このような制限は、ほとんどのレトロウイルスベクターで一般的に得られる比較的低い力価（代表的には１mlあたり10⁵〜10⁶の感染性ビリオンの範囲）によって大きくなる。レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターによって感染され得る宿主細胞の範囲は、部分的にウイルスエンベロープタンパク質によって決定される。従って、所定のエンベロープタンパク質のためのレセプターの欠失または欠損は、形質導入の効率を制限する。さらに、ウイルス結合、浸透、レトロウイルスベクターの脱皮、ウイルス複製、または組み込みに関与する、必要な細胞因子の欠失は、形質導入効率を制限する。さらに、低力価の利用可能なベクターが、ベクター産生細胞との同時培養を用いる方法に必要としている。あるいは、有用な形質導入頻度を達成するために、形質導入されるべき細胞を含む培養培地に、大容量のベクター調製物を添加する事が必要である。このことは、標的細胞の培養条件の妨害をもたらす。これらまたは他の問題が、本発明によって扱われる。本発明の目的は、Ｔ細胞、複製中でない細胞、および標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞に、目的の遺伝子をコードするベクター構築物を送達するための、高力価組換えレトロウイルス粒子の組成物を用いるための効率的なエクスビボの方法を提供することである。次いで、形質導入された細胞は、標準的な技術（例えば、所望の治療的利益を達成するための静脈内注入）によって患者に再投与され得る。発明の要旨本発明は、Ｔ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞を形質導入するための組成物および方法を提供する。この方法は、高力価組換えレトロウイルス粒子の調製物を含み、実質的に、複製可能なレトロウイルスの汚染のない、Ｔ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞の集団を得る工程を包含し、ここで、この組換えレトロウイルス粒子は目的の遺伝子をコードするベクター構築物を保有する。本発明の別の局面は、遺伝子にコードされる治療的有効量の遺伝子産物を発現する、移植可能なＴ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞を含有するインビボの送達ビヒクルを提供する。ここで、この遺伝子は、Ｔ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞内に存在しないか、またはこの遺伝子は、Ｔ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞に存在するが、生物学的に有意なレベルでこれらの細胞中で発現されないか、あるいはこの遺伝子は、Ｔ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞に存在し、かつＴ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞中で発現するように改変されているか、あるいはこの遺伝子は、Ｔ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞中で発現されるように改変され得る。本発明の別の実施態様において、ベクター構築物は、タンパク質、タンパク質の活性部分、および内因性の生物学的活性を有するRNA分子からなる群より選択される分子をコードする。このタンパク質またはタンパク質の活性部分は、サイトカイン、コロニー刺激因子、凝固因子、およびホルモンからなる群より選択される。なお別の実施態様において、Ｔ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞の集団は、動物から得られる。別の実施態様において、この動物は、遺伝的疾患、癌、感染性疾患、変性性疾患、炎症性疾患、心血管疾患、および自己免疫疾患からなる群から選択される疾患として特徴づけられる疾患に罹患したヒトである。なお別の実施態様において、治療的有効量の形質導入されたＴ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞の集団の組成物を患者に投与すること、またはこのような集団を再導入することによって、疾患（例えば、遺伝的疾患、癌、感染性疾患、変性性疾患、炎症性疾患、心血管疾患、または自己免疫疾患）を処置するための方法を提供する。別の別の実施態様において、Ｔ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞を、患者へのこれらの細胞の再導入の前にインビトロで拡大する。本発明の他の局面において、目的の遺伝子をコードする、形質導入されたＴ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞、および形質導入されたＴ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞の組成物が提供される。高力価組換えレトロウイルス粒子のエンベロープタンパク質は、レトロウイルスアンフォトロピックエンベロープタンパク質、レトロウイルスエコトロピックエンベロープタンパク質、レトロウイルスポリトロピックエンベロープタンパク質、レトロウイルスキセノトロピックエンベロープタンパク質、テナガザル（gibbon ape）白血病ウイルスエンベロープタンパク質、およびVSV-gタンパク質からなる群より選択されるエンベロープタンパク質である。当業者に公知の他のレトロウイルスエンベロープタンパク質もまた用いられ得る。用語の定義以下の用語が本明細書を通じて用いられる。他に示されない限り、これらの用語は以下のように定義される：「事象特異的プロモーター」は、転写プロモーター/エンハンサー、または遺伝子座規定エレメント（locus defining element）、または上記のような遺伝子発現を制御する他のエレメントをいう。その転写活性は、細胞性刺激に応答して変化される。このような事象特異的プロモーターの代表的な例として、チミジンキナーゼプロモーターまたはチミジレートシンターゼプロモーター、ａまたはｂインターフェロンプロモーター、およびホルモンの存在に応答するプロモーター（天然、合成、または他の非宿主生物由来のいずれか）が挙げられる。「組織特異的プロモーター」は、転写プロモーター/エンハンサー、または遺伝子座規定エレメント（例えば、遺伝子座制御エレメント）、または上記のような遺伝子発現を制御する他のエレメントをいう。これは、制限された数の造血組織型で選択的に活性である。このような造血組織特異的プロモーターの代表的な例には、IgGプロモーター、αまたはβグロビンプロモーター、およびＴ細胞レセプタープロモーターが挙げられるが、これらに制限されない。「形質導入」は、複製欠損の、組換えレトロウイルス粒子の細胞レセプターとの会合、その後のこの粒子が保有する核酸の細胞への導入を包含する。「トランスフェクション」は、レトロウイルス粒子が使用されない物理的な遺伝子移入の方法をいう。「ベクター構築物」、「レトロウイルスベクター」、「組換えベクター」、および「組換えレトロウイルスベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向し得る核酸構築物をいう。レトロウイルスベクターは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座規定エレメント、あるいは他の手段（例えば、別のスプライシング、核RNAの輸送、メッセンジャーの翻訳後修飾、またはタンパク質の転写後修飾）により遺伝子発現を制御する他のエレメントを含まなければならない。さらに、レトロウイルスベクターは、転写された場合に、目的の遺伝子に作動可能に連結され、そして翻訳開始配列として作用する核酸分子を含まなければならない。このようなベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、長末端反復（LTR）、またはそれらの部分、ならびに用いられるレトロウイルスに適切なポジティブ鎖およびネガティブ鎖プライマー結合部位（レトロウイルスベクター中に既に存在しない場合）を含まなければならない。随意に、ベクター構築物はまた、ポリアデニル化を指向するシグナル、ならびに１つ以上の制限部位および翻訳終結配列を含み得る。例としては、このようなベクターは、代表的には、5'LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖DNA合成の起点、および3'LTRまたはそれらの部分を含む。このようなベクターから所望の遺伝子産物を発現するために、所望の遺伝子産物をコードする目的の遺伝子もまた含まれる。「内因性の生物学的活性を有するRNA分子」は、アンチセンスRNA分子、およびリボザイム、ならびにタンパク質に結合するRNA分子を包含する。本明細書中で用いられる「標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞」は、標準的な力価決定細胞株（例えば、HT1080）において測定した場合に約10⁶cfu/mlの力価を有する本発明の組換えレトロウイルス粒子の存在下で、約５％より少ない細胞を形質導入する細胞である。このような細胞には、正常細胞、ならびに疾患細胞（例えば、特に、腫瘍細胞および感染細胞）が含まれ得る。高力価組換えレトロウイルス粒子の「調製物」は、このような粒子を含む液体または凍結乾燥の組成物をいう。好ましくは、この調製物は、その成分に関して薬学的組成物と等価であるが、当業者に認識されるように、後にヒトへの投与以外の細胞への投与の場合、このような調製物は薬学的品質である必要はなく、そして実際、本明細書中に記載の方法で産生された粗製の高力価レトロウイルスベクター上清のみを含有し得る。用語「Ｔ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞」としては、Ｔ細胞、、Ｂ細胞、単核球、樹状細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、腸幹細胞、骨幹細胞、腎幹細胞、皮膚幹細胞、毛髪幹細胞、分裂中でない幹細胞、分裂中でない脾臓細胞、分裂中でない腎細胞、生殖細胞、および標準的な形質導入技術に抵抗性の他の細胞が挙げられる。上記の細胞型の子孫細胞および前駆体細胞（Ｔ細胞前駆体およびＢ細胞前駆体を含む）もまた、この用語に包含される。本明細書中で用いられる用語、「Ｔ細胞前駆体」および「Ｂ細胞前駆体」は、それぞれＴ細胞分化経路またはＢ細胞分化経路に関わるが、造血幹細胞のような関連しない細胞を除く、すべての前駆体細胞をいう。本発明の多くの局面および利点が、以下の詳細な説明（これは、本発明の実施の解明を提供する）を考慮して、当業者に明らかである。発明の詳細な説明本発明は、１つ以上の目的の遺伝子を含むベクター構築物を保有する高力価の組換えレトロウイルス粒子が、Ｔ細胞、分裂中でない細胞、または標準的な形質導入技術に抵抗性の細胞をエクスビボで用いて、効率的に形質導入し得るという予期せぬ発見に基づく。結果として、本発明の組換えレトロウイルス粒子は、遺伝子治療の目的で、かつ以前レトロウイルスで形質導入する事が困難または不可能であると考えられていた細胞を形質導入するために用いられ得る。このような組換えレトロウイルス粒子、その産生およびパッケージング、およびその用途のより完全な記載を、以下に提供する。組換えレトロウイルスベクターの生成上記のように、本発明は、エクスビボの体細胞遺伝子治療における使用のための組換えレトロウイルス粒子を含む組成物および方法を提供する。組換えレトロウイルスベクターおよび粒子の構築は、「組換えレトロウイルス」と題する出願（米国特許出願第07/586,603号、1990年９月21日出願、これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）においてより詳細に記載される。形質導入可能な組換えレトロウイルス粒子の産生は、米国特許出願第07/800,921号および米国特許出願第07/800,921号（これらは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される。一般に、本明細書中に記載される組換えベクター構築物は、強力なプロモーター、およびこのプロモーターの下流に目的のDNA配列の挿入のための適切な制限部位を有するプラスミドを選択することによって調製される。本発明によれば、組換えベクター構築物は、組換えレトロウイルスによって送達される。レトロウイルスは、ポジティブの１本鎖ゲノムを有し、一般に非溶解性であるRNAウイルスである。感染の際、レトロウイルスは、そのRNAをDNAに逆転写し、宿主細胞ゲノムに挿入されるプロウイルスを形成する。レトロウイルスゲノムは、概念上、２つの部分に分けられる。「トランス作用性」部分は、ウイルス構造タンパク質をコードする領域からなる。これは、コア外殻タンパク質の合成のための特定の抗原（gag）遺伝子；逆転写酵素およびインテグラーゼ酵素の合成のためのpol遺伝子；およびエンベロープ糖タンパク質の合成のためのエンベロープ（env）遺伝子；を含む。「シス作用性」部分は、最終的にウイルス粒子中にパッケージングされるゲノム領域からなる。これらの領域には、パッケージングシグナル、プロモーターおよびポリアデニル化部位を有する長末端反復（LTR）、ならびにDNA複製のための２つの開始部位が含まれる。クローン化されたプロウイルスの内部または「トランス作用性」部分を、目的の遺伝子で置換して、「ベクター構築物」を作製する。ウイルスパッケージングタンパク質が存在する細胞（米国特許出願第07/800,921号を参照のこと）内にベクター構築物が配置される場合、転写されたRNAは、ウイルス粒子としてパッケージされ、次いで、細胞から出芽する。これらの粒子を用いて組織細胞を形質導入し、細胞ゲノム中にベクター構築物を組み込ませる。ベクター構築物はその遺伝子産物を発現するが、これを保有するウイルスは、複製欠損である。なぜなら、ウイルスゲノムのトランス作用性部分がないからである。任意の複製可能な感染性レトロウイルスの存在を検出するために、種々のアッセイが利用され得る。１つの好ましいアッセイは、以下に記載の拡大S⁺L^-アッセイである。最も広範な意味において、本発明のレトロウイルスベクターは、転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座規定エレメント、あるいは他の手段（別のスプライシング、核RNAの輸送、メッセンジャーの翻訳後修飾、またはタンパク質の転写後修飾）により遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。さらに、レトロウイルスベクターは、目的の遺伝子内で転写される場合に、目的の遺伝子に作動可能に連結され、そして翻訳開始配列として作用する核酸分子を含まなければならない。このようなベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、長末端反復（LTR）、またはそれらの部分、ならびに用いられるレトロウイルスに適切なポジティブ鎖およびネガティブ鎖プライマー結合部位（レトロウイルスベクター中に既に存在しない場合）を含まなければならない。随意に、ベクター構築物はまた、ポリアデニル化を指向するシグナル、および１つ以上の制限部位および翻訳終結配列を含み得る。例としては、このようなベクターは、代表的には、 5'LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖DNA合成の起点、および 3'LTRまたはそれらの部分を含む。このようなベクターは、１つ以上の完全なgag 、pol、またはenv遺伝子を含まず、それにより、それらは複製が不可能である。さらに、選択マーカーをコードする核酸分子は必要とされず、そして好ましくもない。好ましいレトロウイルスベクターは、gagコード配列を含み、好ましくは、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む部分である。このスプライスアクセプター部位は、目的の遺伝子に近接し、かつその上流に位置するように配置されている。特に好ましい実施態様において、gag転写プロモーターは、そこから開始されるRNA転写物が5'gag UTRおよび目的の遺伝子を含むように配置されている。目的の遺伝子の発現を制御するgagプロモーターの代替として、他の適切なプロモーター（そのうちのいくつかは以下に記載される）を使用し得る。さらに、目的の遺伝子の発現レベルを増加させるために、別のエンハンサーを使用し得る。本発明の好ましい実施態様において、レトロウイルスベクター（特に、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）を基礎としたレトロウイルスベクター）が使用される。MoMLVは、マウス細胞以外では感染性の低いマウスレトロウイルスである。関連のアンフォトロピックN2レトロウイルスは、ヒト、マウス、および他の生物由来の細胞に感染する。本発明の実施に用いられ得る他の好ましいレトロウイルスとしては、テナガザル白血病ウイルス（GALV）（Todaroら、Virology， 67:335，1975; Wilsonら、J．Vir.，63:2374，1989）、ネコ免疫不全ウイルス（ FIV）（Talbattら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA，86:5743，1984）、およびネコ白血病ウイルス（FeLV）（Leprevettら、J．Vir.，50:884，1984; Elderら、J ．Vir.，46:871，1983; Stewardら、J．Vir.，58:825，1986; Riedelら、J．Vi r.，60:242，1986）が挙げられるが、他のＣ型またはＤ型レトロウイルスあるいはレンチウイルスあるいはスプマウイルス（Weiss，RNA Tumor Viruses、第Ｉ巻および第II巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.）由来の本発明のレトロウイルスベクターもまた作製され得る。種々のプロモーターが、本発明のベクター構築物において使用され得る。これらには、サイトメガロウイルス主要即時初期プロモーター（CMV MIE）、初期および後期SV40プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、チミジンキナーゼまたはチミジレートシンターゼプローモーター、ａまたはｂインターフェロンプロモーター、事象特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターは、高レベルの発現を強力に駆動するか、または比較的弱い発現をもたらすように、所望のように選択され得る。当業者が認識するように、多くのRNAポリメラーIIおよびRNAポリメラーゼIII依存性プロモーターが、本発明の実施において使用され得る。１つの実施態様において、目的の遺伝子を含む組換えレトロウイルスベクターは、事象特異的プロモーターの転写制御下にあり、その結果、事象特異的プロモーターの活性化の際、この遺伝子が発現される。多くの事象特異的プロモーターが、本発明の文脈内で使用され得る。このようなプロモーターとして、例えば、細胞増殖によって活性化される（またはそうでなければ細胞周期依存性の）プロモーター（例えば、チミジンキナーゼまたはチミジレートシンターゼプロモーター（Merrill，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:4987，1989; Dengら、Mol．Cel l．Biol.，9:4079，1989））；またはトランスフェリンレセプタープロモーター（これは、目的の遺伝子から遺伝子産物を選択的に発現するこれらのプロモーターからの転写を活性化し得る因子を含む、急速に増殖する細胞（例えば、造血細胞）において主に転写的に活性である）；細胞がウイルスに感染した場合に活性化されるａまたはｂインターフェロンプロモーター（FanおよびManiatis，EMBOJ .，8:101，1989; Goodbournら、Cell，45:601，1986）のようなプロモーター；およびホルモンの存在によって活性化されるプロモーター（例えば、エストロゲン応答性プロモーター）（Tooheyら、Mol．Cell．Biol.，6:4526，1986を参照のこと）が挙げられる。別の実施態様において、組織特異的プロモーターの転写制御下で目的の遺伝子を含み、その結果組織特異的プロモーターの活性化の際、この遺伝子を発現する組換えレトロウイルスベクターが提供される。広範な種々の組織特異的プロモーターが本発明の文脈内で利用され得る。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下のものが挙げられる：Ｂ細胞特異的プロモーター（例えば、IgGプロモーター）；Ｔ細胞特異的プロモーター（例えば、Ｔ細胞レセプタープロモーター（Andersonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:3551，1988; WinotoおよびBaltimore，EMBO J.，8:29，1989））；骨特異的プロモーター（例えば、オステオカルシンプロモーター（Markoseら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:1701 , 1990; McDonnellら、Mol．Cell．Biol.，9:3517，1989; Kernerら、Proc．Nat l. Acad．Sci．USA，86:4455，1989））、IL-2プロモーター、IL-2レセプタープロモーター、およびMHCクラスIIプロモーター、ならびに造血組織特異的プロモーター（例えば、赤血球で活性な赤血球特異的転写プロモーター（例えば、ポルホビリノーゲンデアミナーゼプロモーター（Mignotteら、Proc．Natl．Acad．Sc i. USA，86:6458，1990）））、ａまたはｂグロビン特異的プロモーター（van A ssendelftら、Cell，56:969，1989，Forresterら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，86:5439，1989）、内皮細胞特異的プロモーター（例えば、vWfプロモーター）、骨髄巨核球（magakaryocyte）特異的プロモーター（例えば、b-トロンボグロブリン）、ならびに多くの他の組織特異的プロモーター。本発明のレトロウイルスベクターはまた、非LTRエンハンサーまたはプロモーターを含み得る（例えば、目的の遺伝子の発現を制御するのに用いられる他のエレメントに作動可能に結合されたCMVまたはSV40エンハンサー）。さらに、3'LTR エンハンサーが欠失し、それにより、宿主細胞ゲノム中への組み込みの際に5'LT Rが不活性化されたレトロウイルスベクターもまた、本発明に意図される。遺伝子発現を制御する種々の他のエレメントもまた、本発明の範囲内で利用され得る。このようなエレメントとしては、例えば、遺伝子座制御領域を含む遺伝子座規定エレメント（例えば、b-グロビン遺伝子、およびＴ細胞マーカーであるCD2由来のもの）が挙げられる。さらに、スプライシング、核輸送、および/または翻訳のレベルで発現を制御するエレメントもまたこのレトロウイルスベクターに含まれ得る。代表的な例としては、b-グロビンイントロン配列、HIV-1由来のrevおよびrreエレメント、マソン-ファイザーサルウイルス（MPMV）由来の構成的輸送エレメント（CTE）、revネガティブHIVプロウイルスクローンのrev非依存的複製を可能にする219ヌクレオチドの配列、およびコザック配列が挙げられる。revタンパク質は、スプライスされていないかまたは別々にスプライスされたHIV RNA分子の核輸送を可能にするように機能する。MPMVエレメントは、イントロンを含有するmRNAの核輸送を可能にする。CTEエレメントは、MPMVのヌクレオチド8022〜8 240ａにマッピングされる（Brayら、Biochemistry，91:1256，1994）。別の好ましい実施態様において、レトロウイルスベクターは、スプライスドナー（SD）部位およびスプライスアクセプター（SA）部位を含む。ここで、SAは目的の遺伝子が、組換えレトロウイルスベクター中に挿入される部位の上流に位置する。好ましい実施態様において、SDおよびSA部位は、短い（すなわち、400ヌクレオチド未満）のイントロン配列によって分けられる。このような配列は、RN A転写物の安定化に役立ち得る。このような安定化配列は、代表的に、目的の遺伝子の5'に位置するSD-イントロン-SAの配置を含む。本発明の組換えレトロウイルスベクターはまた、好ましくは、目的の遺伝子を含む得られる転写物が、目的の遺伝子の上流にさらに5'gag UTR（非翻訳領域）を含むように作動可能に配置された、gag領域由来の転写プロモーターを含む。本発明はまた、多効果のベクター構築物を提供する。この構築物は、２つのタンパク質が発現される場合、２つのプロモーターを必要とし得る。なぜなら、１つのプロモーターは、２番目の遺伝子の適切なレベルの遺伝子発現を確実にし得ないからである。詳細には、ベクター構築物がアンチセンスメッセンジャーまたはリボザイムを発現する場合、２番目のプロモーターは必要ではないかもしれない。特定の実施態様において、内部リボゾーム結合部位（IRBS）または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）プロモーターが、２番目の遺伝子の遺伝子発現のレベルをブーストするために、２番目の目的の遺伝子とともに配置される。簡略には、IRBSに関して、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質の上流非翻訳領域が、２シストロン性メッセージの内部連動を支持することが示されている（Jacejakら、Nature 353:90，1991）。この配列は小さく（約300塩基対）、そしてシストロンがこの配列で始まる多シストロン性メッセージからの多数の遺伝子を発現するために、ベクター中に容易に組み込まれ得る。本発明のレトロウイルスベクター構築物はしばしば、プラスミド（宿主細胞への導入の際、増殖、分離、および染色体外維持の可能な核酸分子）上にコードされる。当業者が理解するように、広範な既存のまたは新規のプラスミドのいずれもが本発明の実施において使用され得る。このようなプラスミドは複製起点を含み、そして代表的には、組換えの使用を容易にするための１つ以上のマルチクローニング部位を含むように改変されている。好ましくは、本発明に従って使用されるプラスミドは真核生物および原核生物の両方の宿主細胞において増殖可能である。パッケージング細胞の生成本発明の別の局面は、本明細書中に記載されたレトロウイルスベクターを組み込む、組換えキセノトロピックレトロウイルス粒子を産生する方法に関連する。１つの実施様態において、ベクターはパッケージング細胞を用いることによって、感染性ビリオンの中へパッケージングされる。簡単に述べれば、パッケージング細胞は、レトロウイルスゲノム（それが組換え（すなわち、レトロウイルスベクター）であってもなくても）を、パッケージングするのに必要な、レトロウイルス構造ポリペプチドをコードするさらなる核酸を、その本来の遺伝子補体に加えて、含有する細胞である。レトロウイルス粒子は、パッケージング細胞中で、レトロウイルスゲノムとカプシドおよびエンベロープとを合わせることによって作製され、その結果、形質導入に適した、好ましくは、複製欠損ビリオンを作製する。簡単に述べれば、これらおよび他のパッケージング細胞は、１つ、好ましくは、２つ以上の核酸分子を含む。これらの核酸分子は、レトロウイルスベクターを感染性ビリオンの中へパッケージングするのに必要な種々のポリペプチド、例えば、gag、pol、およびenvをコードする。レトロウイルスベクターをコードする核酸分子を導入する際、パッケージング細胞は感染性レトロウイルス粒子を産生する。本発明の、レトロウイルスベクターでトランスフェクトされたパッケージング細胞株（これは感染性ビリオンを産生する）は、「プロデューサー」細胞株と呼ばれる。非常に種々の動物細胞が、本発明のパッケージング細胞を調製するために利用され得る。それらには、制限なく以下のものが含まれる。上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、内皮細胞、筋芽細胞、星状膠細胞、リンパ球など。レトロウイルスベクター構築物、gag/pol発現カセットおよびenv発現カセットに相同であるゲノム配列を欠損する細胞株が、優先的に選択され、利用される。相同性を決定する方法は、例えば、ハイブリダイゼーション分析（Martinら、Proc．Natl．Acad．Sc i.、USA、vol．78:4892-96、1981;および米国特許出願第07/800,921号、前出）によって容易に達成され得る。 MoMLVベクター系（psi2、PA12、PA317）に用いられる最も一般的なパッケージング細胞株（PCL）は、マウスの細胞株に由来する。しかし、マウスの細胞株は、ヒトへの治療用途を意図したレトロウイルスベクターを産生するには特に好ましい選択ではない。なぜなら、そのような細胞株は以下の事が知られているからである：内在性のレトロウイルス（そのうちのいくつかは、配列およびレトロウイルス型において、MLVベクター系（これは、本発明の実施に用いるのに好ましい）に密接に関係している）を含むこと；効率良くパッケージングすることが知られている、非レトロウイルスまたは欠損レトロウイルス配列を含むこと；およびマウス細胞膜成分の存在に起因する有害な影響を生ずること。本発明において有用なパッケージング細胞株の開発において考慮すべき重要なことは、複製欠損ビリオンをその細胞株から産生すること、または複製可能レトロウイルス（RCR）産生を回避することである（Munchauら、Virology，vol.176: 262-65、1991）。これは、本発明の組換えレトロウイルスベクターを有する感染性レトロウイルス粒子が、インビトロ、インビボにかかわらず、標的細胞中で独立複製が不能であることを確実にする。独立複製が、もし起これば、野生型のウイルスの産生をもたらし得る。それは続いて、患者の細胞の染色体へ多重組み込み（multiple integration）をもたらし得、それによって挿入変異誘発およびそれに関連する問題の生ずる可能性を増大する。RCR産生は少なくとも２通りの方法で起こり得る。（１）治療用プロウイルスDNAとパッケージング細胞株に存在するレトロウイルス構造遺伝子（「gag/pol」および「env」）をコードするDNA との間の相同組換え；および（２）プロウイルスDNAと、マウスパッケージング細胞株において見出される非常に多数の内因性欠損プロウイルスとの相同組換えによる、複製可能なウイルスの産生。本発明の実施において好ましいように、マウスベースの組換えレトロウイルスの使用に付随する生来の安全性問題を避けるために、パッケージング細胞株は、種々の非マウス株に由来してもよい。これらには、種々の哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、サル、ミンク、ハムスター、およびラット）由来の細胞株が含まれる。当業者が認識するとおり、多数のパッケージング細胞株は、当該分野で公知の技術（例えば、米国特許出願第08/156,789号および米国特許出願第08/136,739号参照のこと）を用いて産生され得る。好ましい実施様態において、細胞株は、イヌまたはヒト細胞株に由来する。それらは、MoMLVのゲノム配列と相同なゲノム配列を欠損することが、ハイブリダイゼーション分析（Martinら、前出）によって知られている。特に好ましい親イヌ細胞株は、D17(A.T.C.C.受託番号CRL 8543 )である。HT-1080(A.T.C.C.受託番号CCL 121; Grahamら、Vir.、vol．52:456、1 973)および293細胞（Felgnerら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA 84:7413、1987 ）は特に好ましい親ヒト細胞株を示す。MoMLVベースの組換えレトロウイルスベクターとともに使用するための、これらの細胞株由来のパッケージング細胞株の構築は、米国特許出願番号第08/156,789号、前出に詳しく記載されている。従って、遺伝子治療におけるレトロウイルス使用のための望ましい必要条件は、複製可能、すなわち「野生型」ウイルスを産生することが不能なレトロウイルスパッケージング細胞株の利用可能性である。パッケージング細胞株は１つ以上の核酸分子（これらは、レトロウイルスベクターを感染性レトロウイルス粒子中に組込むのに必要な構造タンパク質をコードする）を含むので、これらの種々の構築物間の組換え事象は、複製可能なウイルス、すなわち、すべての構造遺伝子および制御エレメント（独立複製に必要なパッケージングシグナルを含む）をコードするゲノムを含む感染性レトロウイルス粒子を産生し得る。過去数年間、数多くの異なる構築物が、この危惧をなくすために開発されてきた。そのような構築物として以下のものが挙げられる：3'LTRおよび5'LTRの部分での欠失（Miller およびButtimore、Mol．Cell．Biol.、vol．6:2895-2902、1986）（ここでは、２つの組換え事象がRCRを形成するために必要である）；ヘルパーウイルス（２つの別々のプラスミド間で分配され、一方はgagおよびpolを含み、他方はenvを含む）の相補性部分の使用（Markowitzら、J．Virol.、vol．62:1120-124；および Markowitzら、Virology，vol 167:600-606、1988）（ここでは、３つの組換え事象がRCRを産生するために必要である）。 gag/pol機能およびenv機能を別々に発現する能力は、これらの機能を独立に操作することを可能にする。多くの量のgag/polを発現する細胞株は、例えば、env に関する力価の問題を提起するために使用され得る。低力価が測定される要因の１つは、標的細胞または組織上の適切なレセプター分子の密度である。第２要因は、レトロウイルスキセノトロピックエンベロープタンパク質のためのレセプターの親和力である。ある報告は、キセノトロピックベクターが、複製可能なキセノトロピックウイルスの存在下で、ヒト造血始原細胞をより効果的に感染し得ることを示唆している（Eglitisら、Biochem ．Biophys．Res．Comm. 151:201-206 、1988）。キセノトロピックベクターを含有する粒子はまた、複製可能なキセノトロピックウイルスの存在下で、アンフォトロピックウイルスにより容易に感染されない他の種由来の細胞（例えば、ウシ細胞、ブタ細胞、およびウマ細胞）を感染する（Delouisら、Biochem ．Biophys．Res．Comm. 169:80-14、1990）。本発明の好ましい実施様態において、キセノトロピックenv遺伝子を発現するパッケージング細胞株が提供される。詳細には、そのようなパッケージング細胞株から産生された組換えレトロウイルス粒子は、実質的に、複製可能なレトロウイルス（「RCR」）との結合からは自由である。より最近では、複製不能レトロウイルスの産生を阻害するための、さらに改善された方法および組成物が開発されている。1994年９月７日に出願された共同所有の米国特許出願第09/028,126号を参照のこと。簡単に述べれば、組換えレトロウイルスベクターと、レトロウイルス構造タンパク質をコードする、１つ以上の核酸構築物との間の組換え事象により産生された、複製可能なレトロウイルスの拡散は、以下のようなベクター：生物学的に不活性な阻害性分子をコードするが、そのような組換え事象において生物学的に活性な阻害性分子をコードする核酸分子を産生するベクター、を提供することによって回避され得る。阻害性分子の発現は、その事象が生じるプロデューサー細胞を傷害することによって、またはその中のレトロウイルスベクターの産生を抑制することによってのいずれかで、RC Rの産生を妨げる。種々の阻害分子が使用され得、リボザイム（これは、複製可能なウイルスのRNAの転写産物を切断する）、またはリシンＡのような毒素、破傷風毒素、またはジフテリア毒素、ヘルペスチミジンキナーゼなどが挙げられる。当業者に認識されるように、本明細書中の教示は、すぐに本発明に適合され得る。安全性の問題に加えて、パッケージング細胞株のための宿主細胞株の選択は重要である。なぜなら、レトロウイルス粒子の多くの生物学的特性（例えば、力価）および物理的特性（例えば、安定性）は、宿主細胞の特性によって決定される（dictate）からである。例えば、宿主細胞は、ベクターRNAゲノムを効率良く発現（転写）しなければばらず、第一鎖の合成のために細胞tRNAでベクターを感作しなければならず、MLV構造タンパク質を耐性化および共有結合的に修飾（タンパク質分解、糖鎖形成、ミリスチル酸付加（myristylation）、およびリン酸化）しなければならず、そして細胞膜からのビリオン出芽を可能にしなければならない。例えば、マウスパッケージング株PA317から作製されたベクターは、0.3ミクロンフィルターに保持されるのに対し、CA株から作製されたベクターは透過することが見出されている。さらに、霊長類（ヒトを含む）由来の血清は、非常に種々の下等哺乳動物または鳥類由来の血清とは異なり、抗体独立補体溶解法によってレトロウイルスを不活性化することが知られている。このような活性は、種々の遠縁のレトロウイルスに対して非選択的である。鳥類、マウス(MoMLVを含む )、ネコ、およびサル起源のレトロウイルスは、正常ヒト血清によって不活性化され、そして溶解される。Welshら、(1975)Nature，vol．257:612-614; Welshら、(1976)Virology、vol．74:432-440; Banapourら、(1986)Virology、vol．152: 268-271;およびCooperら、(1986)Immunology of the Complement System，Pub． American Press、Inc.、139-162頁を参照のこと。さらに、霊長類にインビボで静脈注射された複製可能なマウスアンフォトロピックレトロウイルスは、全過程または一部を霊長類補体によって媒介された工程によって、15分以内に排除（cl ear）される（Cornettaら、(1990)、Human Gene Therapy、vol．1:15-30; Corne ttaら、(1991)、Human Gene Therapy、vol．2:5-14）。しかし、最近、ヒト血清による補体不活性化に対するレトロウイルスの抵抗性は、少なくともいくつかの場合には、レトロウイルス粒子が産生されるパッケージング細胞株によって媒介されることが発見された。種々のヒトパッケージング細胞株から産生されたレトロウイルスは、ヒト血清の構成成分（おそらく補体）による不活性化に対し耐性であったが、ヒヒおよびマカク（macques）由来の血清に対しては感受性であった。1994年12月30日に出願された、共同所有の米国特許出願第08/367,071 号を参照のこと。従って、本発明の好ましい実施様態において、全長の第VIII因子をコードする組換えレトロウイルス粒子は、ヒトパッケージング細胞株中で産生され、HT1080細胞および293細胞由来のパッケージング細胞株が、特に好ましい。上記のような感染性の、複製欠損組換えレトロウイルスの産生に加えて、少なくとも２つの他の別のシステムが、ベクター構築物を有する組換えレトロウイルスを産生するために使用され得る。そのようなシステムの１方（Webbら、BBRC、 190:536、1993）は、昆虫ウイルス、バキュロウイルスを用いるが、他方は、哺乳動物ウイルスであるワシニアおよびアデノウイルスの利点を利用する（Pavira niら、BBRC、145:234、1987）。これらの系の各々は、遺伝子がクローン化された任意の所与のタンパク質を、多量に作製し得る。例えば、Smithら(Mol．Cell. Biol.、3:12、1983); Picciniら(Meth．Emzymology、153:545、1987);およびMa nsourら(Proc．Natl．Acad．Sci．USA、82:1359,1985)参照のこと。これらのウイルスベクターは、適切な遺伝子を挿入することによって、組織培養細胞中でタンパク質を産生するために用いられ得、従って、組織培養由来のレトロウイルスベクター粒子を作製するために適応され得る。アデノウイルス系においては、遺伝子はベクター中に挿入され得、そして哺乳動物細胞中で、インビトロ構築（Ba llayら、4:3861、1985）または細胞中での組換え（Thummelら、J.Mol．Appl．Ge netics、1:435、1982）のいずれかによって、タンパク質を発現するために使用し得る。別のアプローチは、無細胞パッケージング系を包含する。例えば、レトロウイルス構造タンパク質は、バキュロウイルス系（または他のタンパク質産生系、例えば、イーストまたはE．coli）中で、Smithら(前出)に記載と同様な様式で作製され得る。組換えレトロウイルスゲノムは、インビトロRNA合成によって作製される（例えば、FlamantおよびSorge、J．Virol.、62:1827、1988を参照のこと）。次いで、構造タンパク質およびRNAゲノムがtRNAと混合され、次いでリポソームが、包埋envタンパク質および細胞抽出物（代表的に、マウス細胞由来）、または精製成分（これは、envおよび他の必要なプロセシング、ならびに任意のまたは他の必要な細胞由来の機能を提供する）とともに添加される。次いで、その混合物は（例えば、超音波処理、温度操作、または回転式透析によって）処理され、発生期のレトロウイルス粒子のカプシド化が可能になる。この手順により、高力価の、複製不能組換えレトロウイルスの産生が、病原性レトロウイルスまたは複製可能なレトロウイルスの混入を伴うことなく可能になる。パッケージング細胞株の選択において考慮すべき別の重要な要素は、レトロウイルスベクターが産生される核酸分子の導入後の、そこから産生されたウイルスの力価である。多くの要素がウイルス力価を制限し得る。最も有意な制限要素の１つは、パッケージングタンパク質gag、pol、およびenvの発現レベルである。レトロウイルス粒子の場合、プロウイルスからのレトロウイルスベクターRNAの発現もまた、力価を有意に制限し得る。パッケージング細胞および得られる、高レベルの必要な産物を発現するプロデューサー細胞を選択するために、適切な力価アッセイが必要である。以下により詳しく記載するように、適切なPCRベースの力価アッセイが利用され得る。パッケージング細胞株およびパッケージングのためのタンパク質（これはウイルスベクターの骨格、例えばレトロウイルスベクターのパッケージングのためのレトロウイルスgag，pol、およびenvタンパク質と相同である）を供給するプロデューサー細胞株を調製するのに加えて、キメラウイルス粒子、例えば、DNAウイルスカプシド中にパッケージングされたMoMLVベースのレトロウイルスベクターを生じるパッケージング系およびプロデューサー系もまた利用され得る。他の多くのウイルスベースのパッケージング系およびプロデューサー系はまた、ウイルスベクター系とは無関係に、当業者が認識するように、利用され得る。組換えレトロウイルス粒子の宿主域の変更本発明の別の局面は、アンフォトロピックエンベロープタンパク質を含むレトロウイルス粒子と比較して、変化された宿主域を有する、組換えキセノトロピックレトロウイルス粒子に関する。レトロウイルスの宿主細胞域の特異性は、脂質エンベロープに存在するenv遺伝子産物によってある程度決定される。興味深いことに、１つのレトロウイルスからのエンベロープタンパク質は、しばしば、程度は変わるが、別のレトロウイルスのエンベロープタンパク質を代用し得、それによって、得られるベクターの宿主域を変化させる。従って、パッケージング細胞株(PCL)は、アンフォトロピック、エコトロピック、キセノトロピック、ポリトロピック、または他のエンベロープ親和性のいずれかを発現するために産生されてきた。さらに、「ハイブリッド」または「キメラ」キセノトロピックエンベロープタンパク質を含む本発明のレトロウイルスは、同様に産生され得る。これらの任意のパッケージング細胞株から産生されたレトロウイルス粒子は、対応の異なるレセプターを含む任意の細胞を感染するために使用され得る（Reinおよび Schultz，Virology、136:144、1984）。レトロウイルスのアセンブリは、レトロウイルスゲノムおよび補助タンパク質の、出芽レトロウイルス粒子への選択的封入によって特徴付けされる。興味深いことに、非マウスレトロウイルス供給源由来のエンベロープタンパク質は、その宿主域を変更するために、ベクターを偽型化（pseudotyping）する（すなわち、１つの種由来のウイルスRNAを、別の種のウイルスタンパク質によってカプシド化する）ために用いられ得る。細胞膜の１部は、レトロウイルスエンベロープを形成するために分離するために、通常膜中にある分子が、ウイルスエンベロープとともに運ばれ得る。従って、ベクターが産生されるパッケージング細胞株を操作することによって、または種々のタイプの細胞株を特定の表面マーカーを用いて選択することによって、多くの異なる潜在性リガンドをレトロウイルス粒子の表面に結合させ得る。簡単に述べれば、この局面において、本発明は、以下のものを含む、包膜された（envelope）レトロウイルス粒子を提供する：ヌクレオカプシド（レトロウイルスである最初のウイルス由来の起源を有するヌクレオカプシドタンパク質を含む）；ヌクレオカプシドと結合した目的の遺伝子をコードするパッケージング可能な核酸分子；および、宿主域を決める膜結合キセノトロピックタンパク質。本発明の別の好ましい形態において、ベクター粒子の膜結合エンベロープタンパク質は、以下のものを含むキメラまたはハイブリッドタンパク質である：キセノトロピックエンベロープタンパク質由来の外部レセプター結合ドメインおよび膜結合ドメイン。この外部レセプター結合ドメインの少なくとも一部が、膜結合ドメインの少なくとも一部とは異なる起源に由来する。そのキメラタンパク質は、好ましくは、２つの起源に由来し、ここで、２つの起源のうちの１つ以下がレトロウイルスである。本発明のこの局面の別の実施態様は、上記のベクター粒子を産生する細胞株に関する。好ましくは、このような細胞株は、膜結合タンパク質をコードする核酸分子で安定的にトランスフェクトされる。この膜結合タンパク質の発現は、誘導性プロモーターによって駆動される。本発明のレトロウイルス粒子は、レトロウイルス粒子内に、細胞型に特異的な細胞表面レセプターに結合する成分（非常に頻繁にポリペプチドまたは炭水化物）を含むことによって特定の細胞型に標的化され得る。このような標的化は、細胞特異的結合ドメインとともにウイルス粒子アセンブリに必要なenvタンパク質部分を含むキメラのenvタンパク質を発現するパッケージング細胞株を調製することによって達成され得る。別の実施態様において、１つより多くのウイルス型由来のenvタンパク質が用いられ得、その結果、得られるウイルス粒子は１つより多くのenvタンパク質種（species）を含む。さらに別の実施態様は、レトロウイルスカプシドまたはエンベロープへの細胞特異的なリガンドの封入を含み、標的特異性を提供する。本発明のこの局面の好ましい実施態様において、用いられるenv遺伝子は、標的化されるべき細胞型（例えば、Ｔ細胞）に制限された組織分布を有する細胞表面レセプターと相互作用することが知られているポリペプチドリガンドのレセプター結合ドメインとともに、レトロウイルスアセンブリに必要なenvタンパク質のすべてまたは一部をコードする。この点に関して、標的細胞表面上で高レベルで発現されるレセプターに結合するレセプター結合ドメインを利用することが好ましいかもしれない。患者のゲノムへの特異的な組み込み部位を制御するために（例えば、レトロウイルス感染の場合に生じるように、使用されるベクター構築物が、レシピエント細胞の染色体中にウイルスゲノムの組み込みをもたらす場合）、相同組換えまたは特定部位への挿入を指示する改変されたインテグラーゼ酵素の使用が利用され得る。部位特異的組み込みを指示するインテグラーゼタンパク質の使用に関するアプローチは、「標的細胞にベクター構築物を送達する組換えレトロウイルス」と題するWO 91/02805、および共同所有の米国特許出願第445,466号（1995年、５月22日出願）に記載される（これらの両方が、参考として本明細書中に援用される）。目的の遺伝子を保有するベクターのこのような部位特異的挿入は、遺伝子置換治療を提供し得、挿入変異誘発の機会を減少し得、患者のDNA中に存在する他の配列からの妨害を最小化し得、そして、特異的標的部位での挿入を可能にして、患者のDNA内の所望でない遺伝子（例えば、ウイルス性遺伝子または腫瘍形成性遺伝子）の発現を減少または排除し得る。非ウイルス性膜結合タンパク質はまた、組換えレトロウイルス粒子（キセノトロピックレトロウイルス粒子を含む）のＴ細胞への標的化を促進するために使用され得る。代表的な例としては、Ｔ細胞表面レセプターに対するリガンドとして作用するポリペプチドが挙げられる。問題のタンパク質に対するレセプターの組織分布に依存して、組換えキセノトロピックレトロウイルス粒子は、異なるＴ細胞サブセットに標的化され得る。エンベロープ内に含有されるべきリガンドが天然に存在する膜結合タンパク質でない場合、好ましくは、「ハイブリッド」または「キメラ」エンベロープタンパク質を作製することによって、そのリガンドを膜に会合させる必要がある。このようなハイブリッドエンベロープタンパク質が他のウイルスタンパク質またはレトロウイルスenvタンパク質以外のタンパク質由来の細胞外ドメインを含み得ることを理解することが重要である。これを達成するために、リガンドをコードする遺伝子は、envタンパク質の膜結合ドメインをコードする配列に機能的に結合され得る。「天然に存在する膜結合タンパク質」は、その本来の状態においてインビボで脂質膜と結合して存在し、その結果、細胞膜またはウイルスエンベロープと結合していることが判明しているタンパク質を意味する。envタンパク質の細胞外成分は特異的レセプター結合を担うので、このように、ハイブリッドエンベロープを用いて、本発明のレトロウイルスベクターの向性を調整し得る（そして力価を効果的に増加させ得る）。一方、これらのタンパク質の細胞質ドメインは、ビリオン形成において役割を果たす。本発明は、多数のハイブリッドenv 遺伝子産物（すなわち、詳細には、細胞質領域および細胞外結合領域（これらは天然には一緒に存在しない）を有するレトロウイルスenvタンパク質）が、作製され得、そして宿主範囲の特異性を変化させ得る。好ましい実施態様において、これは、所定のカプシドタンパク質と安定に会合するエンベロープタンパク質の膜結合ドメインのすぐ近くの、リガンド（またはレセプター結合活性を付与するその部分）をコードする遺伝子を組み換えることによって達成される。得られる構築物は、細胞標的化およびレトロウイルス脂質エンベロープ内への封入を促進し得る、２機能性のキメラタンパク質をコードする。本明細書中に記載の天然でない膜結合リガンドを有するベクター粒子は、好都合なことに、膜結合タンパク質のリガンド-レセプター相互作用によって決定される宿主範囲を有する。従って、Ｔ細胞に対する標的化送達のために、変化した宿主範囲を有するベクター粒子が、本発明の方法を用いて産生され得る。このリガンドは、Ｔ細胞を含む宿主範囲を提供するために選択される。多数の異なる標的化ストラテジーが、本発明のこの局面とともに使用され得る。選択された細胞型を標的化するために、抗体もまた利用され得る（例えば、CD 4+ T細胞を標的化するための抗CD4抗体、ならびにCD8+細胞を標的化するための抗CD8抗体（一般的に、Wilchekら、Anal．Biochem.，171:1，1988を参照のこと））。Ｔリンパ球またはＴ細胞は、非抗体産生リンパ球であり、これは、免疫系の細胞媒介性部門の一部を構成する。Ｔ細胞は骨髄から胸腺に移動する未成熟なリンパ球から生じる。胸腺で、Ｔ細胞は胸腺ホルモンの指示下で成熟プロセスを受ける。ここで、未成熟なリンパ球は急速に分裂して、莫大な数に増加する。成熟しているＴ細胞は、特定の抗原を認識し、そして結合する能力を有することによって免疫適格性になる。免疫適格性Ｔ細胞の活性化は、リンパ球の表面レセプターへの抗原結合によって誘発される。Ｔ細胞は当業者に既知の種々の手順により単離され得る。例えば、Ｔ細胞粗懸濁液を、ナイロンウールカラムにホモジネートを通すことにより、脾臓およびリンパ節から調製し得る(Current Protocols in Immunology，Coliganら(1992)Gre en Publishing Associates and Wiley-Interscience，New York)。この手順は、アクセサリー細胞およびＢ細胞の除去によりＴ細胞集団を富化する簡便な手段を提供する。マウス脾臓およびリンパ節由来のＴ細胞は、MHCクラスII遺伝子によりコードされる細胞表面糖タンパク質を発現しないが、ほとんどの非Ｔ細胞を発現する。それゆえ、Ｔ細胞富化は、抗MHCクラスIIモノクローナル抗体を用いる非Ｔ細胞の排除により達成され得る。同様に、他の抗体をまた非Ｔ細胞の特定の集団を涸渇させるために用い得る。例えば、Ｂ細胞に対するa-Igおよびマクロファージに対するa-MacI。Ｔ細胞は当業者に既知の技術により多くの異なる亜集団にさらに分画され得る。２つの主要な亜集団は細胞表面マーカーCD4およびCD8のそれらの異なる発現に基づいて単離され得る。例えば、上記のようなＴ細胞の富化に続いて、CD4⁺細胞はCD8に特異的な抗体を使用することにより富化され得る（Current Protocols i n Immunology、上述）。あるいは、CD4⁺細胞は、磁気ビーズのような固体支持体に結合するCD4に対して特異的な抗体を使用することにより富化され得る。逆に、CD8⁺細胞は、CD4に対して特異的な抗体を使用することにより富化され得るか、または固体支持体に結合するCD8抗体を使用することにより単離され得る。Wil sonら(J.Infect Dis 172:88,1995)により記載されるように、HIV-l感染患者由来のCD4リンパ球は、形質導入の前または後にエクスビボで拡大され得る。Ｔ細胞の精製後、当業者に既知の種々の形質導入法を行い得る。例えば、このようなアプローチの１つは、ベクター産生細胞由来の培養物上清を含有するベクターでの精製Ｔ細胞集団の形質導入を包含する。第２のアプローチは、精製Ｔ細胞と照射された単層のベクター産生細胞との同時培養を包含する。第３のアプローチは、同様の同時培養アプローチを包含するが、精製Ｔ細胞を、照射されたベクター産生細胞との同時培養の48時間前に、種々のサイトカインで予備刺激し、そして培養する。形質導入の前の予備刺激は効率のよい遺伝子移入を増加させる (Noltaら、Exp.Hematol.20:1065;1992)。理論により締られることを望まないが、形質導入の増加したレベルは、効率の良いレトロウイルス形質導入のために必要なＴ細胞の増殖の増加に帰する。これらの培養物を増殖するための刺激はまた、患者への再注入のための細胞集団の増加を提供する。同時培養に続いて、Ｔ細胞をベクター産生細胞の単層から回収し、拡大し、そして液体窒素中で凍結する。形質導入された細胞におけるベクターの発現は、当業者に既知の多くのアッセイにより評価され得る。例えば、ウェスタンブロット分析またはノザン分析は、目的の挿入された遺伝子の性質に依存して使用され得る。一旦発現が確立し、そして形質転換されたＴ細胞を二次的な因子の存在について試験したら、これらを末梢血管流を介して患者に注入して戻す。当業者はまた、外来的にリガンド分子をレトロウイルス粒子にも添加し得ることを認識する。このレトロウイルス粒子は、脂質エンベロープに組み込まれるか、または脂質あるいはタンパク質構成成分自身に化学的に結合し得るかのいずれかである。さらに、広範に多様な高親和性結合対を標的化エレメントとして使用し得る。代表的な例としては、10^-15Mの親和性(K_D)を有するビオチン／アビジン (Richards,Meth.Enz.,184:3,1990;Green,Adv．Protein Chem.,29:85,1985)および10^-14Mの親和性を有するシスタチン／パパイン(Bjorkら、Biochemistry,29:17 70,1990)が挙げられる。広範に多様な他の高親和性結合対はまた、例えば、選択されたＴ細胞抗原を高親和性で認識する抗体の調製および選択により、開発され得る（一般に、米国特許第RE32,011号、第4,902,614号、第4,543,439号、および第4,411,993号を参照のこと；またMonoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Di mension in Biological Analyses,Plenum Press,Kennett,McKearn,およびBechto l編、1980、およびAntibodies:A Laboratory Manual，HarlowおよびLane編、Col d Spring Harbor Laboratory Press,1988を参照のこと）。このような抗体に対する結合対（代表的には他の抗体または抗体フラグメント）は、組換え技術により産生され得る（Huseら、Science,246:1275,1989を参照のこと；また、Sastry ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:5728,1989;およびMichelle Alting-Meesら、St rategies,Molecular Biology,3:1,1990を参照のこと）。本明細書中に提供された開示が与えられれば、当業者に明らかなように、両方のメンバー（または分子）の親和性結合対がレトロウイルス粒子に結合され得る。それにもかかわらず、本発明の好ましい実施態様において、２つの親和性結合対のうちの大きい方（例えば、アビジン／ビオチン対のアビジン）が、レトロウイルス粒子に結合する。標的化の情況内で利用される場合、用語「結合した」は、一般には共有結合が好ましいが、非共有結合または共有結合相互作用のいずれを言及しても良い。多数のカップリング方法が利用され得、例えば、N-スクインイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(「SPDP」Carlsonら、J.Biochem., 173:723,1978)のような架橋剤、および当該分野で既知の他のこのような化合物の使用が挙げられる。本発明の特に好ましい実施態様において、高親和性結合対の１つのメンバーは、レトロウイルス粒子上で発現されるか、または必要不可欠な部分として、例えば、レトロウイルス脂質エンベロープ中に含まれる。例えば、高親和性結合対の１つのメンバーは、ハイブリッドタンパク質としてエンベロープタンパク質と同時発現され得るか、または正確な方向で、細胞膜に対して高親和性結合対のメンバーを標的化する適切なベクターから発現され得る。組換えレトロウイルス粒子の使用１つの局面において、本発明は、エクスビボで少なくとも１つの抗腫瘍剤の発現を指向するベクター構築物でＴ細胞を形質導入する工程を含む、ヒトにおける選択された腫瘍(「ガン」)の増殖を阻害するための方法を提供する。本発明の関係において、「選択された腫瘍の増殖を阻害する」は、(１)腫瘍細胞分裂の直接的な阻害、または(２)免疫細胞媒介性腫瘍細胞溶解のいずれか、または両方をいい、これは腫瘍細胞の正味の広がりの抑制を導く。これらの２つの機構のいずれかによる腫瘍増殖の阻害は、多くの周知の方法に基づき、例えば、経時的に腫瘍サイズを測定することにより(例えば、放射線医学的画像化法(例えば、シングルフォトンおよびポジトロンエミッションCT；一般に、「Nuclear Medicine in Cl inical Oncology」Winkler，C．（編）Springer-Verlag，New York，1986を参照のこと)によるか、あるいは、例えば、従来の画像化剤(例えば、クエン酸ガリウム67)または代謝産物画像化、レセプター画像化、または免疫学的画像化のための特殊化された試薬を含む種々の画像化剤による)により当業者に容易に決定され得る。さらに、超音波などの非放射活性法(「Ultrasonic Differential Diagn osis of Tumors」、KossoffおよびFukuda、(編)、Igaku-Shoin、New York，1984 を参照のこと)もまた、腫瘍サイズの評価のために利用され得る。あるいは、他のガンの形態については、腫瘍増殖の阻害は、腫瘍マーカー(例えば、前立腺ガンの検出のための前立腺特異抗原(「PSA」)(米国特許再発行第33,405号を参照のこと)、ならびに結腸直腸ガンおよび特定の乳ガンの検出のためのガン胎児抗原( 「CEA」))の存在下での変化に基づき決定され得る。白血病のようなさらに別のタイプのガンについては、腫瘍増殖の阻害は、代表的な血液細胞計数における白血病細胞の減少した数に基づき決定され得る。本発明に関連して、「抗腫瘍剤」は、腫瘍増殖を阻害する化合物または分子をいう。抗腫瘍剤の代表例は、免疫アクチベーターおよび腫瘍増殖インヒビターを含む。簡潔に記載すると、免疫アクチベーターは、腫瘍特異的抗原の免疫認識を改善することによって機能し、その結果、免疫系が「プライム」されるようになる。プライミングは、リンパ球の増殖、分化、またはより高い親和性の相互作用への進化からなり得る。このようにプライムされた免疫系はより有効に腫瘍細胞を阻害または傷害する。免疫活性化は、免疫モジュレーター(リンパ球と腫瘍細胞との間の相互作用に影響する分子)、および免疫エフェクター細胞を増殖、活性化、または分化するように作用するリンフォカインに細分類され得る。免疫モジュレーターの代表例として、CD3、ICAM-1、ICAM-2、LFA-1、LFA-3、b-2-ミクログロブリン、シャペロン、αインターフェロン、γインターフェロン、B7/BB1 および主要組織適合遺伝子複合体(MHC)、ならびにＴ細胞レセプタータンパク質または改変された認識部位を有するＴ細胞レセプターのような合成等価物が挙げられる。リンフォカインの代表例として、γインターフェロン、腫瘍壊死因子、 IL-１、IL-２、IL-３、IL-４、IL-５、IL-６、IL-７、IL-８、IL-９、IL-10、IL -11、GM-CSF、CSF-1、およびG-CSFが挙げられる。さらに、内因性の生物学的活性を有するRNA分子が、抗腫瘍剤として使用され得る。抗腫瘍剤をコードする配列は、種々の供給源から得られ得る。例えば、抗腫瘍剤をコードする配列を含むプラスミドは、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC,Rockville，Maryland)のような寄託機関から、またはBritish Bio-Te chnology Limited(Cowley，Oxford England)のような市販の供給源から得られ得る。あるいは、抗腫瘍剤をコードする公知のcDNA配列は、この配列を発現するかまたは含む細胞から得られ得る。さらに、特定の細胞供給源由来のcDNAまたはmR NAライブラリーは、そこから所望の配列が従来の技術(例えば、PCR増幅)によって容易にクローン化され得る市販の供給源から購入され得る。抗腫瘍剤をコードする配列はまた、例えば、Applied Biosystems Inc．DNAシンセサイザー(例えば、ABI DNAシンセサイザーモデル392、Foster City，California)で合成され得る。上記の抗腫瘍剤に加えて、本発明はまた、例えば、２つ以上のサイトカイン、免疫モジュレーター、毒素、または分化因子の融合タンパク質を含む抗腫瘍剤を提供する。この点で好ましい抗腫瘍剤としては、αインターフェロン-インターロイキン-２、GM-CSF-IL-4、GM-CSF-IL-2、GM-CSF-IL-3(米国特許第5,082,927号および同第5,108,910号を参照のこと)、GM-CSF-γインターフェロン、およびγ インターフェロン-IL-4が挙げられ、γインターフェロン-インターロイキン-２が特に好ましい。別の実施態様において、抗腫瘍剤はさらに膜アンカーを含み得る。膜アンカーは、例えば、周知のタンパク質の膜貫通ドメインを含む種々の配列から選択され得る。一般に、膜アンカー配列は、タンパク質を膜に固定する(anchor)タンパク質の領域である。慣例上、細胞膜の外表面にタンパク質を結合するアンカー配列には２つのタイプが存在する：(１)細胞膜の脂質二重層に広がる膜貫通領域（このような領域を含むタンパク質は内在性膜タンパク質といわれる）；および(２) 内在性膜タンパク質または膜の極性表面と相互作用するドメイン(このようなタンパク質は周辺、または外因性タンパク質といわれる)。内在性膜タンパク質由来の膜アンカーが好ましい。膜に広がる領域は、代表的には、膜内部に位置するほぼ全体に疎水性残基からなる20〜25アミノ酸残基を伴う類似した構造を有する(Eisenbergら、Ann．Rev．Biochem．53:595-623，1984 を参照のこと)。膜に広がる領域は、代表的にはαヘリック構造を有する(Eisenb ergら、前出；HeijneおよびManoil、前出を参照のこと)。好ましい実施態様において、膜アンカーはγインターフェロン融合タンパク質のC-末端に融合され、ここで、膜アンカーはFcレセプターのγ鎖を含む。抗腫瘍剤の腫瘍形成性を、種々のアッセイにより評価し得る。代表的なアッセイとして、ヌードマウスまたはラットにおける腫瘍形成、軟寒天におけるコロニー形成、およびトランスジェニックマウスのようなトランスジェニック動物の調製が挙げられる。腫瘍形成性の研究に加えて、一般に、抗腫瘍剤の毒性を決定することが好ましい。当業者に周知の種々の方法を、このような毒性の測定のために利用し得る。これは例えば、種々のタンパク質および酵素の全身レベル、ならびに血液細胞の容量および数を測定する臨床的化学アッセイを含む。一旦抗腫瘍剤が選択されると、これを本発明に従うベクター構築物内に配置する。次いで、このようなベクター構築物を組換えレトロウイルス内にパッケージングし得、そしてエクスビボでのＴ細胞の形質導入に使用し得、これは次いで患者に再導入される。本発明に関連して、取り出された細胞は、同一の患者に戻されるだけでなく、別の同種異系のヒトにおける選択された腫瘍細胞の増殖を「害するためにも利用され得ることが理解される。１つの実施態様において、組換えベクター構築物は、新しく合成されたMHCクラスＩ分子に細胞内で結合するタンパク質またはタンパク質の活性部分の発現を指向する。この結合は、小胞体からのMHCクラスＩ分子の移動を妨げ、その結果、末端のグリコシル化を阻害する。これは、これらの分子の細胞表面への輸送をブロックし、そしてCTLによる細胞認識および溶解を妨げる。例えば、E3遺伝子の産物の１つは、MHCクラスＩ分子の形質転換された細胞の表面への輸送を阻害するために使用され得る。より詳細には、E3は、アデノウイルス２ゲノムのE3領域から転写される、19kDの膜貫通糖タンパク質である、E3/19Kをコードする。本発明に関連して、多効果の組換えウイルスベクター構築物は、直接的または間接的に投与され、そして発現の際に、治療的タンパク質およびE3/19Kタンパク質を産生する、治療的タンパク質およびE3/19K配列をコードする遺伝子を含む。E3/1 9Kタンパク質は、治療的タンパク質のペプチドを結合したこれらのMHC分子を含む、MHCクラスＩ表面分子の表面発現を阻害する。その結果として、ベクターによって形質転換された細胞は、これらが産生する治療的タンパク質に対する免疫応答を回避する。本発明の別の実施態様において、多効果の組換えベクター構築物は、治療的タンパク質、およびβ2-ミクログロブリンを結合し得るタンパク質のタンパク質またはタンパク質の活性部分の発現を指向する。抗原提示のためのMHCクラスＩ分子の細胞表面への輸送は、β2-ミクログロブリンとの会合を必要とする。従って、β2-ミクログロブリンを結合し、そしてMHCクラスＩとのその会合を阻害するタンパク質は、MHCクラスＩ抗原提示を間接的に阻害する。適切なタンパク質は、H301遺伝子産物を含む。簡潔に記載すると、ヒトサイトメガロウイルス(CMV) から得られたのH301遺伝子は、MHCクラスＩ分子のＨ鎖上のβ2-ミクログロブリン結合部位と相同的な配列を有する糖タンパク質をコードする(Browneら、Natur e 347:770，1990)。H301は、β2-ミクログロブリンに結合し、それにより、MHC クラスＩ分子の成熟を妨げ、そして形質転換された細胞が細胞傷害性Ｔ細胞によって認識されないようにし、従ってMHCクラスＩ拘束性免疫監視を回避する。コードされる特定の外来タンパク質について、一般的または特異的のいずれかに、MHCクラスＩ抗原提示を阻害するかまたはダウンレギュレートするように機能する上記で議論されなかった他のタンパク質もまた、本発明に関連して同定され、そして利用され得る。このようなタンパク質を同定するために(特に、哺乳動物病原体由来のタンパク質(および、次いで、EBVウイルス由来のEBNA-1 gly-a la反復のようなその活性タンパク質))タンパク質またはその活性部分(分離した物質としてまたはMHCクラスＩ抗原提示を阻害し得ると推測される活性タンパク質に融合されてのいずれかで)を発現する組換えベクター構築物を、マウス細胞株BC10MEのような試験細胞株に形質転換する(WO91/02805、「細胞を標的化するための組換えレトロウイルス送達ベクター構築物」を参照のこと)。候補タンパク質をコードする配列を有するおよび有さない試験細胞株を、CTLアッセイにおいて、刺激細胞(stimulator)および／または標的と比較する。形質転換された試験細胞に対応する細胞溶解の減少により、候補タンパク質がMHC提示を阻害し得ることが示される。 MHCクラスＩ表面発現のダウンレギュレーションを決定ための別の方法は、FAC S分析による。より詳細には、細胞株を候補タンパク質をコードする組換えベクター構築物で形質転換する。薬物選択および拡大の後、細胞をMHCクラスＩ発現についてFACSによって分析し、そして非形質転換細胞のMHCクラスＩ発現と比較する。MHCクラスＩの細胞表面発現の減少は、候補タンパク質がMHC提示を阻害し得ることを示す。上記の遺伝子送達ビヒクルのいずれもが、１つ以上の異種配列を包含、含有( および／または発現)し得る。種々の異種配列(例えば、細胞傷害性遺伝子、疾患関連抗原、アンチセンス配列、細胞傷害性をほとんどまたは全く有しない化合物 (すなわち「プロドラッグ」)を毒性産物に活性化する遺伝子産物をコードする配列、疾患関連抗原の免疫原性部分をコードする配列、および免疫アクセサリー分子をコードする配列)を本発明に関連して使用し得る。細胞傷害性遺伝子の代表例として、以下のようなタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる：リシン(Lambら、Eur．J．Biochem．148:265-270,1985)、アブリン(Woodら、Eur．J．Biochem．198:723-732，1991; Evensenら、J．of Biol. Chem．266:6848-6852，1991: Collinsら、J．of Biol．Chem．265:8665-8669,19 90; Chenら、Fed．of Eur．Biochem Soc．309:115-118,1992)、ジフテリア毒素( Twetenら、J．Biol．Chem．260:10392-10394,1985)、コレラ毒素(Mekalanosら、 Nature 306:551-557,1983; SanchezおよびHolmgren、PNAS 86:481-485,1989)、ゲロニン(Stirpeら、J．Biol．Chem．255:6947-6953,1980)、ポークウィード(Ir vin，Pharmac．Ther．21:371-387,1983)、抗ウイルスタンパク質(Barbieriら、B iochem．J．203:55-59,1982; Irvinら、Arch．Biochem．& Biophys．200:418-42 5,1980; Irvin，Arch．Biochem．& Biophys．169:522-528,1975)、トリチン、Sh igella毒素(Calderwoodら、PNAS 84:4364-4368,1987; Jacksonら、Microb．Path . 2:147-153,1987)、およびPseudomonas外毒素Ａ(CarrollおよびCollier，J．Bi ol．Chem．262:8707-8711,1987)。本発明のさらなる実施態様において、アンチセンスRNAを、強力なクラスＩ拘束性反応を誘導するために細胞傷害性遺伝子として利用し得る。簡潔に記載すると、RNAを結合し、それにより特異的mRNAの翻訳を妨げることに加えて、高レベルの特異的アンチセンス配列を利用して、大量の二本鎖RNAの形成により、インターフェロン(γインターフェロンを含む)の発現の増加を誘導し得る。γインターフェロン(γ−IFN)の発現の増加は、次に、MHCクラスＩ抗原の発現を増大させる。この点での使用のために好ましいアンチセンス配列として、アクチンRNA、ミオシンRNA、およびヒストンRNAが挙げられる。アクチンRNAとのミスマッチを形成するアンチセンスRNAが、特に好ましい。本発明の他の実施態様において、細胞増殖に必要な不可欠なタンパク質の細胞性合成を妨げることによって、例えば、腫瘍細胞増殖、ウイルス複製、または遺伝的疾患を阻害するアンチセンス配列が提供される。このようなアンチセンス配列の例として、アンチセンスチミジンキナーゼ、アンチセンスジヒドロ葉酸レダクターゼ(MaherおよびDolnick，Arch．Biochem．& Biophys．253:214-220,1987; Bzikら、PNAS 84:8360-8364，1987)、アンチセンスHER2(Coussensら、Science 230:1132-1139,1985)、アンチセンスABL(Fainsteinら、Oncogene 4:1477-1481,1 989)、アンチセンスMyc(Stantonら、Nature 310:423-425,1984)およびアンチセンスras、ならびにヌクレオチド生合成経路における任意の酵素をブロックするアンチセンス配列が挙げられる。本発明の他の局面において、細胞傷害性をほとんどまたは全く有さない化合物 (すなわち、「プロドラッグ」)を毒性産物に活性化する遺伝子産物の発現を指向する遺伝子送達ビヒクルが提供される。このような遺伝子産物の代表例として、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(VZVTK)、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVTK)(Fieldら、J．Gen．Virol．49:115-124,1980)、およびE．col iグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(米国特許出願第08/155,944号、「条件的致死遺伝子の利用のための組成物および方法」、1993年11月18日出願を参照のこと；WO 93/10218、「外来遺伝子およびネガティブ選択マーカーを含むベクター」、WO 93/01281、「遺伝子移入技術および治療のためのシトシンデアミナーゼネガティブ選択システム」、WO 93/08843、「トラップされた細胞および薬物としてのそれらの使用」、WO 93/08844、「ウイルス、特に病原性レトロウイルスにより引き起こされる疾患の予防または処置のための形質転換細胞」、およびWO 90/07936、「感染および過剰増殖異常のための組換え療法」もまた参照のこと)が挙げられる。本発明の好ましい実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、病原性因子の存在下で、細胞傷害性をほとんどまたは全く有さない化合物を毒性産物に活性化する遺伝子産物の発現を指向し、それにより病原性因子に対する局在化された療法をもたらす(米国特許出願第08/155,944号を参照のこと)。本発明の１つの実施態様において、HIVプロモーター(HIVtatタンパク質によって活性化される場合以外は転写的にサイレントであるとして知られている)の下流、かつ転写制御下にあるHSVTK遺伝子の発現を指向する遺伝子送達ビヒクルが提供される。簡潔に記載すると、HIVで感染されそして遺伝子送達ビヒクルを有するヒト細胞におけるtat遺伝子産物の発現は、HSVTKの産生の増加を引き起こす。次いで、細胞を(インビトロまたはインビボのいずれかで)、ガンシクロビル、アシクロビル、またはそれらのアナログ(FIAU、FIAC、DHPG)のような薬物に曝露する。このような薬物は、HSVTKによって(しかし細胞性チミジンキナーゼによってではない)それらの対応する活性ヌクレオチド３リン酸形態にリン酸化されることが知られている。アシクロビルおよびFIAU３リン酸は一般に細胞性ポリメラーゼを阻害し、これはトランスジェニックマウスにおいてHSVTKを発現する細胞の特異的な破壊を導く(Borrelliら、Proc Natl．Acad．Sci．USA 85:7572,1988 を参照のこと)。遺伝子送達ビヒクルを含み、そしてHIV tatタンパク質を発現するこれらの細胞は、特定の用量のこれらの薬物の存在により選択的に傷害される。本発明のさらなる局面において、本発明の遺伝子送達ビヒクルは、疾患関連抗原の免疫原性部分をコードする１つ以上の配列の発現も指向し得る。本発明に関連して利用されるように、細胞(または器官)を病的にすることに関連する場合、または一般に疾患状態に関連するが、細胞を病的にすることに必要でも不可欠でもない場合のいずれかの場合、抗原は、「疾患関連」であると考えられる。さらに、抗原が適切な条件下で免疫応答(細胞媒介性または体液性のいずれか)を引き起こし得る場合、抗原は「免疫原性」であると考えられる。免疫原性「部分」は、種々のサイズであり得るが、好ましくは少なくとも９アミノ酸長であり、そして抗原全体を含み得る。例えば、通常は腫瘍細胞に関連する変化された細胞性成分の免疫原性、非腫瘍形成性形態を含む、広範な種々の「疾患関連」抗原が、本発明の範囲内であると意図される(米国特許出願第08/104,424号を参照のこと)。通常腫瘍細胞に関連する変化された細胞性成分の代表例として、ras^*(ここで、「^*」は、非腫瘍形成性の変化された抗原をいうと理解される)、p53^*、Rb^*、Wilms腫瘍遺伝子によりコードされる変化されたタンパク質、ユビキチン^*、ムチン、DCC，APC、および MCC遺伝子によりコードされるタンパク質ならびにneuのようなレセプターまたはレセプター様構造、胸腺ホルモンレセプター、血小板由来増殖因子(「PDGF」)レセプター、インスリンレセプター、表皮増殖因子(「EGF」)レセプター、およびコロニー刺激因子(「CSF」)レセプターが挙げられる。「疾患関連」抗原はまた、種々の真核生物(例えば、寄生虫を含む)、原核生物 (例えば、細菌)、またはウイルス病原体の全てまたは一部を含むと理解されるべきである。ウイルス病原体の代表例として、以下が挙げられる。Ｂ型肝炎ウイルス(「HBV」)およびＣ型肝炎ウイルス(「HCV」、米国特許出願第08/102/132号を参照のこと)、ヒト乳頭腫ウイルス(「HPV」、WO 92/05248; WO 90/10459; EPO 1 33,123を参照のこと)、エプスタイン-バーウイルス(「EBV」、EPO 173,254; JP1 ,128,788; および米国特許第4,939,088号および同第5,173,414号を参照のこと) 、ネコ白血病ウイルス(「FeLV」、米国特許出願第07/948,358号；EPO 377,842; WO 90/08832; WO 93/09238を参照のこと)、ネコ免疫不全ウイルス(「FIV」、米国特許第5,037,753号；WO 92/15684; WO 90/13573; およびJP 4,126,085)、HTLV IおよびII、およびヒト免疫不全ウイルス(「HIV」、米国特許出願第07/965,084 号を参照のこと)。本発明の他の局面において、上記の遺伝子送達ビヒクルはまた、１つ以上の免疫アクセサリー分子の発現を指向する。本明細書中で利用される用語「免疫アクセサリー分子」は、免疫応答(細胞媒介性または体液性のいずれか)の認識、提示、または活性化の増加または減少のいずれかをさせ得る分子をいう。免疫アクセサリー分子の代表例として、以下が挙げられる。IL-１、IL-２、IL-３、IL-４、 IL-５、IL-６、IL-７(米国特許第4,965,195号)、IL-８、IL-９、IL-10、IL-11、 IL-12、IL-13、IL-14、およびIL-15(Wolfら、J．Immun．46:3074,1991; Gubler ら、PNAS 88:4143,1991; WO 90/05147; EPO 433,827)、IL-13(WO 94/04680)、GM -CSF、M-CSF-1、G-CSF，CD3(Krissanenら、Immunogenetics 26:258-266,1987)、 CD8、ICAM-1(Simmonsら、Nature 331:624-627,1988)、ICAM-2(Singer，Science 255:1671，1992)、b2-ミクログロブリン(Parnesら、PNAS 78:2253-2257,1981)、 LFA-1(Altmannら、Nature 338:521,1989)、LFA-3(Wallnerら、J．Exp．Med．166 (4):923-932,1987)、HLAクラスI、HLAクラスII分子B7(Freemanら、J．Immun．14 3:271 4,1989)、およびB7-2。好ましい実施態様において、異種遺伝子はg-IFNをコードする。本発明の好ましい局面において、本明細書中に記載される遺伝子送達ビヒクルは、１つより多い異種遺伝子配列の発現を指向し得る。このような複数の配列は、単一のプロモーターによって、または好ましくはさらなる二次的なプロモーター(例えば、内部リボソーム結合部位または「IRBS」)によって制御され得る。本発明の好ましい実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、相乗的に作用する異種遺伝子の発現を指向する。例えば、１つの実施熊様において、IL-12、IL-２、 γ-IFNのような分子、または^TH¹経路において、細胞媒介性提示を増加させるように作用する他の分子の、疾患関連抗原の免疫原性部分と一緒の発現を指向する、レトロベクター構築物が提供される。このような実施態様において、免疫提示および疾患関連抗原のプロセシングは、免疫アクセサリー分子の存在に起因して増加する。本発明の別の局面において、「置換」遺伝子をコードする１つ以上の異種配列の発現を指向する遺伝子送達ビヒクルが提供される。本明細書で利用されるように、用語「置換遺伝子」は、遺伝性のまたは非遺伝性の遺伝的欠陥を防止、阻害、安定化、または、逆転させ得る治療的タンパク質をコードする核酸分子をいうことが理解されるべきである。このような遺伝的欠陥の代表例として、代謝異常、免疫調節異常、ホルモン調節異常、および酵素的または膜関連構造的機能の異常が挙げられる。このような欠陥によって引き起こされる疾患の代表例として、嚢胞性線維症(嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質(「CFTCR」)の欠失による、Do rinら、Nature 326:614を参照のこと)、パーキンソン病、アデノシンデアミナーゼ欠損(「ADA」、Hahmaら、J．Bact．173:3663-3672,1991)、β-グロビン異常、血友病ＡおよびＢ(VIII因子欠損；Woodら、Nature 312:330,1984を参照のこと) 、ゴーシェ病、糖尿病、痛風性関節炎、およびレッシュ-ハイナン病(Lesch-Nyla ndisease)(「HPRT」欠損に起因する；Jollyら、PNAS 80:477-481,1983)の形態、デュシェーヌ筋ジストロフィーおよび家族性高コレステロール血症(LDLレセプター変異；Yamamootoら；Cell 39:27-38,1984を参照のこと)が挙げられる。本明細書で記載されるように、種々の異なるタンパク質を発現するレトロウイルスベクターでエクスビボで形質導入されたＴ細胞集団が、種々の異なる異常を処置するために患者に再導入され得る。例えば、HIVおよび他のウイルスのＴ細胞の感染は、この方法によって処置され得、そしてHIV感染を含むＴ細胞のウイルス感染の処置において使用され得る。特にHIV感染に関して、多くの異なる治療アプローチを使用し得る。例えば、Ｔ細胞をHIV複製を干渉する核酸またはタンパク質を発現するレトロウイルスベクターの高力価調製物でエクスビボで形質導入し得る(Baltimore，D．Nature 335:395,1988)。特に、HIV感染および複製を干渉し得る変異体HIV核酸配列、リボザイム、アンチセンス分子、およびタンパク質を発現するレトロウイルスベクターを、WO 91/02805、「細胞を標的化するための組換えレトロウイルス送達ベクター構築物」、およびWO 92/05266、「パッケージング細胞」(これら両方の刊行物は本明細書中に参考として援用される) に記載のように生成し得る。種々の異常を有する患者から得たＴ細胞集団を、血流中に存在する場合に異常の処置に有効であるタンパク質を発現するレトロウイルスベクターの高力価調製物でエクスビボで形質導入し得る。組換えベクター構築物は、第VIII因子、第IX 因子、ヘモグロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、al-抗トリプシン、膜貫通調節タンパク質、およびグルコセレブロシダーゼからなる群より選択される、少なくとも１つの治療的タンパク質を発現し得る。次いで、形質導入されたＴ細胞を患者に再導入し得、ここで、Ｔ細胞は患者の血液中に有益なタンパク質を分泌するか、またはこのタンパク質の活性が、疾患の原因となる因子 (例えば、ADA欠損におけるアデノシン、またはゴーシェ症候群におけるグルコセレブロシド)を解毒する。このアプローチを、例えば、上記に列挙した異常を含む種々の遺伝的異常の処置において使用し得る。例えば、Ｔ細胞を血友病患者から得、そして第VIII因子を発現するレトロウイルスベクターでエクスビボで形質導入し得る。多くの異なる第VIII因子核酸構築物を使用し得る。例えば、全長の第VIII因子またはＢドメインを欠く機能的第VIII因子タンパク質を発現するレトロウイルスベクターを、本明細書中の実施例２に記載したように生成し得る。さらに、全長の第VIII因子タンパク質を発現する種々のの異なるレトロウイルスベクター構築物を、同時係属中の米国特許出願第08/366,851号（本明細書中に参考として援用される)に記載されるように生成し得る。本明細書中で記載されるように、Ｔ細胞、分裂中でない細胞、およびレトロウイルスベクターでの形質導入に従来的に耐性である他の細胞を、レトロウイルスベクターの高力価調製物でエクスビボでうまく形質導入し得る。特に、プロドラッグを毒性分子に変換するタンパク質を発現するレトロウイルスベクターを、単独または治療的タンパク質に加えて使用し得る。上記のように、このようなベクターで形質導入した細胞の再導入は、種々の異常の処置に有用である。さらに、このアプローチを、インビボでのプロドラッグの導入によって、患者に導入された場合に、形質導入されたＴ細胞または他の形質導入された細胞の活性を調節するために使用し得る。本明細書中で使用される用語「活性を調節する」は、プロドラッグ投与による細胞性機能の阻害を含む。この活性の調節は、例えば、活性化されたプロドラッグによって形質導入された細胞を傷害することにより達成され得る。例えば、同種異系骨髄移植物を、白血病のようなガンの処置に使用する。さらに、ドナー由来のＴ細胞を、移植を補助するためおよび抗腫瘍免疫応答を増加させるために注入する。しかし、一定の比率のこの同種異系移植で処置された患者は、対宿主性移植片病を発達させる。プロドラッグを活性化し得るタンパク質をコードするレトロウイルスベクターで形質導入したレトロウイルスベクターでの、エクスビボでのＴ細胞の形質導入は、Ｔ細胞が患者に導入された後にＴ細胞の活性を調節する機構を提供する。特に、生じる対宿主性移植片病は、患者へのプロドラッグの投与によって減少され得るかまたは排除され得る。ヘルペスチミジンキナーゼ( プロドラッグを毒性分子に変換し得る)のような種々の異なるタンパク質を使用し得る。このような遺伝子産物の代表例として、以下が挙げられる。水痘帯状疱疹チミジンキナーゼ(VZVTK)、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVTK)(F ieldら、J．Gen．Virol，49:115-124,1980)およびE．coliグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(米国特許出願第08/155,944号、「条件的致死遺伝子の利用のための組成物および方法」、1993年11月18日出願、本明細書中に参考として援用される；また、WO 93/10218、「外来遺伝子およびネガティブ選択マーカーを含むベクター、WO 93/01281、「遺伝子転入技術および治療のためのシトシンデアミナーゼネガティブ選択システム」、WO 93/08843、「トラップされた細胞および薬物としてのそれらの使用」、WO 93/08844、「ウイルス、特に病原性レトロウイルスにより引き起こされる疾患の予防または処置のための形質転換細胞」、およびWO 90/07936、「感染および過剰増殖異常のための組換え療法」を参照のこと)。上記の異種遺伝子をコードする配列は、種々の供給源から容易に得られ得る。例えば、免疫アクセサリー分子をコードする配列を含むプラスミドは、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC，Rockville，MD)の様な寄託機関から、またはBritish Bio-Technology Limited(Cowley，Oxford，England)のような市販供給源から得られ得る。上記の免疫アクセサリー分子をコードする配列の代表的な供給源として、以下が挙げられる。BBG 12(127アミノ酸の成熟タンパク質をコードするGM-CSF遺伝子を含む)、BBG 6(γ-IFNをコードする配列を含む)、ATCC 番号39656(TNFをコードする配列を含む)、ATCC番号20663(ａ-IFNをコードする配列を含む)、ATCC番号31902、31902および39517(b-IFNをコードする配列を含む) 、ATCC番号67024(IL-1をコードする配列を含む)、ATCC番号39405、39452、39452 、39516、39626、および39673(IL-2をコードする配列を含む)、ATCC番号59399、 59398、および67326(IL-3をコードする配列を含む)、ATCC番号57592(IL-4をコードする配列を含む)、ATCC番号59394および59395(IL-5をコードする配列を含む) 、およびATCC番号67153(IL-6をコードする配列を含む)。タンパク質の配列全体、またはタンパク質の生物学的に活性な部分をコードするそれらの適切な部分のいずれかを利用し得ることは、当業者に明らかである。あるいは、異種遺伝子をコードする公知のcDNA配列は、このような配列を発現するかまたは含む細胞から得られ得る。簡潔に記載すると、１つの実施態様において、目的の遺伝子を発現する細胞由来のmRNAは、オリゴdTまたはランダムプライマーを使用して、逆転写酵素で、逆転写される。次いで、一本鎖cDNAを、所望の配列の両側の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用して、PCR( 米国特許第4,683,202号、同第4,683,195号、および同第4,800,159号を参照のこと。また、PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplificati on、Erlich(編)、Stockton Press，1989、これらは全てその全体が本明細書中に参考として援用される)によって増幅され得る。特に、二本鎖DNAを、熱安定性Ta qポリメラーゼ、配列特異的DNAプライマー、ATP、CTP、GTP、およびTTPの存在下で、加熱によって変性させる。合成が完了すると、二本鎖が生成される。このサイクルは多数回繰り返され得、所望のDNAの階乗の増幅を生じる。上記の遺伝子をコードする配列はまた、例えば、Applied Biosystems Inc．DN Aシンセサイザー(例えば、ABI DNA シンセサイザーモデル392(Foster City，CA) )で合成され得る。組換えレトロウイルス粒子の調製および精製本発明の別の局面は、組換えレトロウイルス粒子の調製に関する。本発明による組換えレトロウイルス粒子を、当業者が認識しているような種々の方法で生成し得る。例えば、プロデューサー細胞、すなわち、レトロウイルスベクターパッケージングに必要な全ての成分（レトロウイルスベクターをコードする核酸分子を包含する）を含有する細胞を、ローラーボトル、バイオリアクター、中空ファイバー器具、および細胞ホテルで増殖し得る。細胞を、液体培地中の固体支持体上で維持するか、または懸濁液として増殖し得る。広範な種々のバイオリアクターの構成およびサイズが、本発明の実施に使用され得る。細胞ファクトリー（「細胞ホテル」とも呼ばれる）は、典型的に２、10、または40個のトレイを含み、そして未使用のポリスチレンから成型され、Nuclon Ｄ表面を提供するように処理され、そしてお互いを超音波接着することにより組み立てられる。一般に、これらのファクトリーは、試薬の添加または培養液の取り出しのためのチャンバーに接続可能な２つのポートチューブを有する。10層のファクトリーは、増殖細胞のための6000cm²の表面領域を提供し、これは27個のT-2 25フラスコにほぼ等しい。細胞ファクトリーは、種々の製造業者（例えば、Nunc を含む）から入手可能である。大部分の細胞型は、３〜６日間、高力価のベクターを産生し得、複数回の採取を可能にする。各細胞型を、播種後の最適採取時期、および最適採取日数を決定するために試験する。細胞を、典型的には、細胞ファクトリーに播種するために必要な細胞数が得られるまで、ローラーボトルにおいて２〜20％のFBSを補充したDMEM中で最初に増殖させる。次いで、細胞をファクトリーに播種し、そしてベクターを含む２リットルの培養物上清を、その後、適切な時期に採取する。新鮮な培地を用いて、培養物を再補充する。中空ファイバー培養法もまた使用され得る。簡単に述べれば、中空ファイバー培養を用いる高力価のレトロウイルス産生は、減少した容量の培地中で高密度まで細胞が培養されるように、ウイルス濃度の増加に基づく。細胞は栄養物を与えられ、そして老廃物は多数の毛細ファイバー管腔を通って循環する大容量の新鮮な培地を用いて希釈される。細胞を、細胞老廃物が毛細ファイバー中の30kD孔を通る拡散により栄養物に交換されるバイオリアクターチャンバー中の毛細ファイバーの外側の空間で培養する。細胞株から産生されるレトロウイルスは、非常に大きいのでこの孔の膜を通過できない。従って、このレトロウイルスは中空ファイバーバイオリアクター中の細胞側で濃縮される。細胞側で培養される培地の容量は、組織培養ディッシュまたはフラスコにおいて培養される細胞密度と等価であるために必要とされる容量よりも約10〜100倍少ない。中空ファイバーのレトロウイルス力価を組織培養ディッシュまたはフラスコでの力価と比較する場合、この容量の倍数減少は力価の倍数誘導と逆に相関する。個々のレトロウイルスプロデューサー細胞株が中空ファイバー増殖条件に適する場合、力価で10〜100倍の誘導が見られる。最大細胞密度を達成するために、個々の細胞株は非常に密接に近接し、そして互いに接するように増殖し得なければならない。多くの細胞株は、この様式で増殖せず、そしてこれらのタイプの細胞株に基づくレトロウイルスパッケージング細胞株は、力価において10倍の増加を達成しないかもしれない。非常に良好に増殖する細胞株は、非接着性の細胞株であり、そして非接着性の細胞株に基づくレトロウイルスプロデューサー株は、組織培養ディッシュおよびフラスコと比較して、力価において100倍の増加を達成し得る。レトロウイルス粒子および産生方法に関係なく、高力価（約10⁷〜10¹¹cfu/mL ）ストックが調製され得、これは適切な細胞へ導入されると所望の産物の高レベルの発現をもたらす。レトロウイルス粒子アセンブリに必要とされる全ての成分が存在するときに高レベル発現が生じ、その結果、高力価ストックを産生する。そして高力価ストックが好ましいが、約10³〜10⁶cfu/mLの範囲の力価を有するレトロウイルス調製物もまた利用され得る。しかし、レトロウイルス力価は、下記の種々の精製方法により増大され得る。適切な手段による産生後、感染性組換えキセノトロピックレトロウイルス粒子が粗形態または精製形態で保存され得る。粗レトロウイルス粒子は、培養感染細胞により産生され、ここでレトロウイルス粒子は細胞から培養培地中に放出される。ウイルスは、十分な量の処方緩衝液を、組換えウイルスを含む培養培地へ最初に添加して水性懸濁液を形成することにより粗形態で保存され得る。組換えレトロウイルス粒子はまた、精製形態で保存し得る。より詳細には、処方緩衝液の添加前に、上記の粗レトロウイルス調製物を、クロスフロー濃縮システム（Filtron Technology Corp.，Nortborough，MA）によるように、フィルターを通過させることにより澄明化し、次いで濃縮する。１つの実施態様において DNaseを濃縮物に添加して外来性DNAを消化する。次いで、消化物をダイアフィルトレートして過剰の培地成分を除去し、そしてより望ましい緩衝化溶液中で組換えレトロウイルスを確立する。次いで、ダイアフィルトレート物を、Sephadex S -500ゲルカラムのようなゲル濾過カラムに通過させ、そして精製組換えウイルスを溶出する。粗組換えキセノトロピックレトロウイルス調製物はまた、米国特許出願第08/0 93,436号により詳細に記載されるようにイオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製され得る。一般に、粗調製物をフィルターを通過させることにより澄明化し、そして濾過物を高度にスルホン化されたセルロースマトリックスを含むカラム上にロードする。１グラムのセルロース当たりの硫酸の量は約６〜15μgの範囲で変化する。組換えレトロウイルスを、高塩緩衝液を用いることによりカラムから精製形態で溶出する。次いで、溶出物を分子排除カラムを通過させることにより、高塩緩衝液をより好ましい緩衝液に交換する。次いで、精製調製物を処方し得るか、または好ましくは-70℃で保存し得る。さらに、本発明による組換えレトロウイルスを含む調製物を、組換えレトロウイルスの力価を増大するために、精製の間に濃縮し得る。広範な種々の方法（例えば、硫酸アンモニウムを用いる組換えレトロウイルスの沈澱、ポリエチングリコール(「PEG」)濃縮、PERCOLLのような勾配またはショ糖のような「緩衝物」の存在または非存在のいずれかでの遠心分離による濃縮、濃縮フィルターの使用 (例えば、Amicon濾過)、および２相分離）が、レトロウイルス濃度を増大するために利用され得る。簡単に述べると、硫酸アンモニウムを用いる組換えレトロウイルスの沈澱による濃縮を達成するために、硫酸アンモニウムを、ゆっくりと適切な濃度まで添加し、その後、遠心分離を行い、そして透析または疎水性カラムでの分離のいずれかによって硫酸アンモニウムを除く。あるいは、組換えレトロウイルスは、PEGを用いて培養培地から濃縮され得る( Greenら、PNAS 67:385-393，1970;Syrewiczら、Appl.Micro.24:488-494,1972)。このような方法は、迅速で、簡単で、そして費用がかからない。しかし、硫酸アンモニウム沈澱と同様に、PEGの使用はまた、溶液から他のタンパク質を濃縮する。他の実施態様において、組換えレトロウイルスは、遠心分離、さらに詳細には低速遠心分離により濃縮され得る。低速遠心分離は、高速遠心分離に伴うペレット化に関連する困難さを回避する（例えば、ウイルスの破壊または不活性化）。本発明による組換えレトロウイルスはまた、水性２相分離法により濃縮され得る。簡単に述べると、ポリマーの水性２相系は、水に２つの異なる非混和性ポリマーを溶解することにより調製され得る。多くの水溶性ポリマー対が、このような２相系の構築（例えば、ポリエチレングリコール(「PEG」)またはメチルセルロース、およびデキストランまたはデキストラン硫酸を含む）に利用され得る(W alterおよびJohansson,Anal.Biochem.155:215-242,1986;Albertsson,「Partitio n of Cell Particles and Macromolecules」Wiley,New York,1960を参照のこと) 。以下の実施例７においてさらに詳細に記載されるように、PEGは５％〜８％（好ましくは、6.5％）の濃度の範囲で、そしてデキストラン硫酸は0.4％〜１％（好ましくは、0.4％）の濃度の範囲で利用して、組換えレトロウイルスの精製に適した水性２相系が確立され得る。このような手順を利用して、約100倍の濃縮が、総出発レトロウイルスの約50％以上の収率とともに達成され得る。例示の目的のために、いくつかの濃縮工程を組み合わせる代表的な濃縮プロセスを以下に示す。簡単に述べると、組換えレトロウイルスは、濃縮の前に、ローラーボトル、細胞ファクトリー、またはバイオリアクターのいずれかから調製され得る。組換えレトロウイルスを含む取り出された培地は、-70℃で凍結され得るかまたは、さらに好ましくは、処理の前に大量にプールされたバッチにおいて２℃〜８℃で保存され得る。バイオリアクターから得られた物質については、組換えレトロウイルスプールが、最初に、0.65μmフィルターと直列に連結した0.8μmフィルター(1.2μmガラスファイバープレフィルター、0.8μmセルロースアセテート)を通して澄明化される。このフィルター配列は、約２平方フィートのフィルターを提供し、そして詰まる前に、約15〜20リットルのプールされた物質を処理し得る。ローラーボトルまたは細胞ファクトリーから得られた物質については、１個の0.65μmカートリッジ(２平方フィート)は、通常、40リットルまでの容量に十分である。80リットルの細胞ファクトリープロセスについては、５平方フィートフィルターが必要とされ得る。好ましくは、澄明化後、フィルターを緩衝液(例えば、150mM NaCl，25mM Tris (pH7.2〜7.5))でリンスする。澄明化後、組換えレトロウイルスを、300,000mwカットオフのカセットを利用して、タンジェンシャルフロー限外濾過により濃縮する。バイオリアクター物質（12％〜16％FBSを含む）については、４〜５Lの物質がカセットあたりで濃縮され得る。12〜16％FBSでのローラーボトルまたは細胞ファクトリーについては、５〜６Lの物質がカセットあたりで濃縮され得る。最終的に、10％FBSを含有する細胞ファクトリーについては、８〜９Lの物質がカセットあたりで濃縮され得る。このような手順を濾液と残留液との間の適切な圧力差で利用することにより、80リットルまでの物質が、２時間かからずに500mL未満の容量まで濃縮され得る。このプロセスはまた、約80％の収率を提供する。限外濾過工程に続いて、DNAseを50U/mLの濃度に添加し、そして30分間閉じられた濾過ラインを用いて、より低いポンプスピードで再循環し得る。次いで、不連続ダイアフィルトレーションは、さらなる緩衝液を添加し、そして上記の同じ交差差圧を利用することにより達成される。一般に、この工程後の回収は、約70 ％である。次いで、濃縮された物質を、最少の塩およびイオン強度の濃度として、50mM N aClおよび25mM Tris(pH7.2〜7.5)を利用して、Phamacia S-500 HGサイズ排除ゲルによるカラムクロマトグラフィーに供する。一般に、組換えキセノトロピックレトロウイルスは、最初のピークにおいて溶出する。タンジェンシャルフロー濾過を、もう１度、調製物の容量をさらに減少するために利用し得る。その後、濃縮された物質は、0.2μm Milliporeフィルターを通す濾過により滅菌される。インビボ産生の別法として、レトロウイルスパッケージングタンパク質を、適切な細胞から、一緒にまたは別々に、産生し得る。しかし、ウイルスベクターを産生し得る核酸分子の導入のかわりに、gag、pol、およびenvタンパク質、レトロウイルスベクター、tRNA、ならびに他の必要な成分を含むインビトロパッケージング反応を行う。次いで、得られたレトロウイルス粒子を精製し、所望であれば、濃縮し得る。薬学的組成物の処方本発明の別の局面は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて上記のレトロウイルスベクターを含む薬学的組成物に関する。一方、別の局面は、組換えレトロウイルスが再構成の際に哺乳動物細胞に感染し得るように、感染性組換えレトロウイルスを後の再構成のために保存する方法に関する。記載の方法を、テナガザル白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ならびにキセノ、ポリ、およびアンフォトロピックマウス白血病ウイルスのようなＣ型組換えレトロウイルスを含む種々の異なるウイルスの保存のために使用し得る（Weissら、RNA Tumor Viruses 、第２版、1985）。米国特許出願第08/153,342号を参照のこと。薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤は、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに対して非毒性である。注入し得る溶液のためのキャリアまたは希釈剤の代表的な例は、水、好ましくは生理学的pHに緩衝化された等張生理食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水またはトリス緩衝化生理食塩水）、マンニトール、デキストロース、グリセロール、およびエタノール、ならびにポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（HSA））を包含する。薬学的に好ましい組成物は、10mg/mLマンニトール、１mg/mL HSA、20mM T ri s(pH7.2)、および150mM NaCl中の組換えキセノトロピックレトロウイルスを含む。この場合、組換えキセノトロピックレトロウイルス粒子は約１μgの物質に相当し、それは高分子量物質の１％未満、そして全物質（水を含む）の1/100,000 未満であり得る。この組成物は、-70℃で少なくとも６ヶ月間安定である。本発明の薬学的組成物はまた、Ｔ細胞分裂を刺激する因子をさらに包含し得、それにより本発明によるベクター構築物を取り込みそして組み込む。組換えレトロウイルスの保存のために特に好ましい方法および組成物が、1993 年10月12日に出願された米国特許出願第08/135,938号および1993年11月15日に出願された米国特許出願第8/153,342号に記載される。患者を処置するのに有用なＴ細胞に形質導入するための組換えレトロウイルスの使用は、組換えレトロウイルスの感染性および生存性が維持されるように、産物が移送され、そして長期間、所望の温度で保存され得ることを必要とする。低温度での保存および移送を欠く組換えレトロウイルスの保存の困難性は、第３世界の国々における問題を示す。これらの国々では十分な冷却能がしばしば欠如する。抗毒素、抗原、および細菌の保存のための乾燥形態での物質の最初の安定化が記載された（Flosodortら、J.Immunol.，29:389，1935）。しかし、このプロセスにおける制限は、周囲温度で水性状態から乾燥した場合、タンパク質の部分変性を包含した。凍結状態からの乾燥はこの変性を減少するのに役立ち、そして他の生物学的物質（細菌およびウイルスを含む）の効率的な保存をもたらした（St ampら、J．Gen．Microbiol.，1:251，1947;Roweら、Virology，42:136，1970;およびRoweら、Cryobiology，8:153，1971）。より近年において、スクロース、ラフィノース、グルコース、およびトレハロースのような糖が、ウイルスの凍結乾燥前に、種々の組み合わせで安定剤として添加された。糖の使用は、いくらかのウイルスの生存のみを後の増殖のために必要とする調査目的のための生存ウイルスの回収を増大した。本発明による組換えレトロウイルスは液体で保存され得るか、または好ましくは、凍結乾燥形態で保存され得る。安定性に影響する因子は処方（液体、凍結乾燥、その成分など）および保存条件（温度、保存容器、光への曝露などを含む）を包含する。あるいは、本発明によるレトロウイルス粒子は低温で液体として保存され得る。好ましい実施態様において、本発明の組換えレトロウイルスが、上昇した温度で凍結乾燥形態で感染性を保存するために、そして再構成後の患者への注入に適切なこの形態に処方される。本発明によるレトロウイルスベクター構築物を含む組換えレトロウイルス粒子は、粗形態で、または好ましくは精製形態で処方され得る。粗レトロウイルス調製物は、種々の細胞培養方法により産生され得、ここでレトロウイルス粒子は細胞から培養培地中へ放出される。組換えレトロウイルス粒子は、粗製形態で十分な量の処方緩衝液の添加によって保存され得る。代表的には、処方緩衝液は、１つ以上のサッカライド、高分子量構造添加剤、緩衝成分、および／またはアミノ酸のような種々の成分を含む水溶液である。本明細書中に記載の組換えレトロウイルスはまた、精製された形態で保存され得る。例えば、処方緩衝液の添加の前に、上記の粗調製物は、濾過により澄明化され、次いで、例えば、交差フロー濃縮システム(Filtron Technology Corp.,No rtborough,MA)により濃縮され得る。DNaseが外来性DNAを消化するために濃縮物に添加され、その後、過剰な培地成分を取り除き、そしてさらに望ましい緩衝化溶液で置換するためにダイアフィルトレートされる。次いで、ダイアフィルトレートがSephadex^TM S-500ゲルカラムのようなゲル濾過カラムに通され、そして保持されたキセノトロピックレトロウイルス粒子が溶出され得る。次いで、十分な量の処方緩衝液がこの溶出物に添加され、所望の最終濃度の構成成分に達し、そしてレトロウイルス調製物を最小限に希釈し得る。次いで、水性懸濁液は保存され得る（好ましくは-70℃）かまたはすぐに処方され得る。別の手順において、粗調製物は、イオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製され得る。簡単に述べれば、粗組換えレトロウイルスは、濾過により澄明化され、次いで、高度にスルホン化されたセルロースマトリックスを含むカラムにロードされる。高度に精製された組換えキセノトロピックレトロウイルスは、高塩緩衝液を用いることによりカラムから溶出される。次いで、高塩緩衝液は、分子排除カラムに溶出物を通過することによりさらに所望の緩衝液に交換される。回収後、上記のように、次いで、処方緩衝液が最終濃度を調整するために添加され得、その後低い温度で保存（好ましくは-70℃）されるか、またはすぐに処方される。乾燥処方物が望まれる場合、粗製または精製レトロウイルス調製物を含む水性調製物が、凍結乾燥または蒸発により調製され得る。凍結乾燥は、ガラス転移温度未満または溶液の共融点温度未満で水性調製物を冷却する工程、および昇華により水を取り除く工程を含む。例えば、Phillipsら(Cryobiology，第18巻;414,1 981)に記載の多段階凍結乾燥手順を用いて、好ましくは-40℃〜-45℃の温度で、処方された組換えウイルスを凍結乾燥し得る。得られる組成物は、10重量％より少ない水を含むはずである。一旦凍結乾燥されると、このような調製物は、安定であり、そして-20℃〜25℃で保存され得る。蒸発方法において、水は、蒸発により周囲温度でレトロウイルス調製物水性懸濁液から除去される。蒸発は種々の技術により達成され得、この技術は、スプレー乾燥(EP 520,748を参照のこと)を包含する。スプレー乾燥手順において、調製物は、予熱されたガス（たいていは空気）の流れに送られ、ここで水は急速に懸濁液の飛沫から蒸発する。スプレー乾燥装置は、多くの製造者から入手可能である(例えば、Drytec,Ltd.,Tonbridge,England;Lab-Plant,Ltd.,Huddersfield,Eng land)。一旦脱水されると、組換えレトロウイルス調製物は安定であり、そして- 20℃〜25℃で保存され得る。乾燥または凍結乾燥された調製物の得られる水分含有量は、Karl-Fischer装置(EM Science Aquastar VIB容積測定タイトレーター、 Cherry Hill,NJ)の使用、または重力測定法により測定され得る。一旦脱水されると、組換えキセノトロピックレトロウイルスは安定であり、そして-20℃〜25 ℃で保存され得る。以前に記載のように、処方に用いられる本発明によるキセノトロピックレトロウイルスを含む水性調製物は、代表的には、１つ以上のサッカライド、高分子量構造添加剤、緩衝成分、および水からなり、１つ以上のアミノ酸も含み得る。これらの成分の組合せは、凍結および凍結乾燥、または蒸発による乾燥の際の組換えレトロウイルスの活性を保つように作用することが見出された。1993年11月15 日に出願された共同所有の米国特許出願第08/153,342号を参照のこと。種々のサッカライドが単独でまたは組み合わせで使用され得、サッカライドはスクロース、マンニトール、グルコース、トレハロース、イノシトール、フルクトース、マルトースおよびガラクトースを包含し、特にラクトースが好ましい。サッカライドの濃度は、0.1重量％〜30重量％で変化し得、好ましくは、約１重量％〜12重量％で変化する。特に好ましいラクトースの濃度は、３重量％〜４重量％である。さらに、サッカライドの組み合わせもまた使用し得、ラクトースおよびマンニトール、またはスクロースおよびマンニトールを包含する。凍結乾燥処方物を室温で保存することを意図する場合、水溶液中で特定のサッカライドを使用することが好ましくあり得ることはまた当業者に明らかである。詳細には、ラクトースまたはトレハロースのようなジサッカライドが、このような処方物に好ましい。１つ以上の高分子量構造添加剤は、凍結の間のレトロウイルス凝集の防止を促進するために使用され得る。そして凍結乾燥または乾燥状態の構造支持を提供する。本発明の文脈において、構造添加剤は、5000ダルトンより大きな場合、「高分子量」であるとみなされる。好ましい高分子量構造添加剤は、ヒト血清アルブミン（HSA）である。しかし、他の物質（例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、デキストラン、セルロース、ゼラチン、ポビドンなど）もまた使用され得る。好ましくは、高分子量構造添加剤の濃度は0.05重量％〜20重量％で変化し得、好ましくは0.1重量％〜10重量％であり、そして特に好ましいHSAの濃度は0.1重量％である。アミノ酸は、存在する場合、さらにレトロウイルス感染性を保存する傾向がある。さらに、アミノ酸は、冷却された水性懸濁液の昇華の間、および凍結乾燥状態の間、レトロウイルス感染性をさらに保つために機能する。好ましいアミノ酸は、アルギニンであるが、他のアミノ酸（例えば、リシン、オルニチン、セリン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸）もまた使用され得る。好ましくは、アミノ酸濃度は、0.1重量％〜10重量％で変化する。特に好ましいアルギニン濃度は、0.1重量％である。種々の緩衝成分は、比較的一定のpHを維持するために使用され得る。種々の緩衝液は、所望のpH範囲に依存して使用され得、pH範囲は好ましくは7.0と7.8との間である。適切な緩衝液は、リン酸緩衝液およびクエン酸緩衝液を含む。特に好ましい処方物のpHは、7.4であり、そして好ましい緩衝液はトロメタミンである。さらに、最終的な等張塩濃度に調節するための中性塩を処方物中に含むことが好ましくあり得る。適切な中性塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化マグネシウムを含む。好ましい塩は、塩化ナトリウムである。後の再構成のための凍結乾燥状態における組換えレトロウイルスの特に好ましい保存方法は、以下の工程を包含する：(a)水性組換えキセノトロピック調製物を調製する工程。この調製物は、組換えキセノトロピックレトロウイルスに加え、約(i)４重量％ラクトース、(ii)0.1重量％ヒト血清アルブミン、(iii)0.03重量％以下のNaCl、(iv)0.1重量％アルギニン、および約7.4のpHを提供するのに十分な量のトロメタミンを含む；(b)約-40℃〜-45℃の温度に調製物を冷却し、凍結調製物を形成する工程；および(c)昇華により凍結調製物から水を除去し、２重量％より少ない水を有する凍結乾燥組成物を形成する工程。組換えキセノトロピックレトロウイルスは複製欠損であり、そして再構成の際にヒト細胞への投与に適することが好ましい。本発明の凍結乾燥または脱水レトロウイルスは、種々の物質を用いて再構成され得るが、水を用いて再構成されることが好ましい。ある例において、最終処方物に等張性をもたらす希釈塩溶液がまた使用され得る。さらに、再構成されたウイルスの活性を増大することが知られている成分を含む水溶液を使用することは有利であり得る。このような成分は、サイトカイン(例えば、IL-2)、ポリカチオン（例えば、プロタミン硫酸）、または再構成ウイルスの形質導入効率を増大する他の成分を含む。凍結乾燥または脱水組換えウイルスは、任意の適切な容量の水、または実質的かつ好適に凍結乾燥または脱水サンプルを総可溶化し得る上記の再構成剤を用いて再構成され得る。組換えレトロウイルス粒子の投与本発明の別の局面において、種々の疾患を罹患するヒト患者の処置方法が提供される。種々の疾患は、遺伝性疾患、ガン、感染性疾患、自己免疫疾患、ならびに炎症性疾患、心血管疾患、および変性性疾患を包含する。これらの方法のそれぞれは、治療有効量の、ベクター構築物が保有する目的の遺伝子によりコードされる所望の遺伝子産物（単数または複数）が産生されるように、上記の組換えレトロウイルス粒子調製物をヒトに投与する工程を包含する。本明細書中で使用される、本発明によるベクター構築物から発現される遺伝子産物の「治療有効量」は、患者が遺伝子産物で処置されなかった場合に観察される治療効果を超える程度で患者に所望の治療効果を達成する量である。例えば、遺伝子産物が第VIII因子である場合、「治療有効量」は治療有効的凝固を生じるために必要とされる第 VIII因子の量をいい、従って、一般に、各患者の担当医により決定される量である。しかし、約0.2ng/mL（「通常」レベルの約0.1％）以上の血清レベルが、治療的に有効である。遺伝子産物が固有の生物学的活性を有するRNA分子（例えば、アンチセンスRNAまたはリボザイム）である場合、「治療有効量」は、有害な遺伝子産物（たいてい、タンパク質）の発現を減少させることにより、患者の状態に臨床的に関連する変化を達成するに十分な量である。好ましい実施態様において、固有の生物学的活性を有するRNA分子は、形質導入Ｔ細胞中で、標的化RNA 分子に対してモル過剰で発現される。異種および標的化RNAの発現レベルは、種々のアッセイ（例えば、PCR分析）により測定され得る。Ｔ細胞のエクスビボでの処理のための代表的な投与量は、一般に、約10⁵〜10¹ ² 感染性組換えレトロウイルス粒子で変化し、好ましくは、投与量は10⁷〜10¹⁰感染性粒子である。正確な投与量は、特定の臨床的指標に必要とされるＴ細胞数、ならびに形質導入されかつ選択されたＴ細胞のさらなる拡大が必要であるか否かに依存する。従って、特定の状態についての正確な投与量は、容易に実験的に測定され得る。高力価のレトロウイルス調製物が送達される容量は、細胞培養物の培養培地容量の10％を超えないことが好ましい。より好ましくは、高力価のレトロウイルス調製物の容量は、全細胞培養物容量の、１％未満であり、なおさらに好ましくは、0.1％未満であり、そしてなおさらに好ましくは0.01％未満である。さらに、レトロウイルスは、培養において形質導入細胞を阻害するか、またはこの細胞に毒性である物質を含まない培地（例えば、細胞培養培地の物質に類似する組成を有する水溶液）に送達される。Ｔ細胞および分裂中でない細胞本発明に従って、Ｔ細胞および分裂中でない（または「複製中でない」）細胞、または通常の形質導入方法に耐性である他の細胞が、エクスビボ手順で組換えレトロウイルス粒子を用いて高い効率で形質導入される。このような細胞は、好ましくは、動物細胞であり、特にヒト細胞である。患者に導入する際に、レトロウイルス粒子によって保有されるベクター構築物によりコードされる所望の遺伝子産物（単数または複数）が、治療効果を達成する。患者に投与される形質導入細胞は、好ましくは、同種細胞であり、特に好ましくは自己細胞である。種々の技術が、最初に特定された系統の細胞（「系統が決定づけられている」細胞）を除去することによって細胞を分離するために用いられ得る。モノクローナル抗体およびモノクローナル抗体フラグメントが、特定の細胞系統および／または分化段階に関連するマーカーを同定するために特に有用である。抗体（または抗体フラグメント）は固体支持体に結合されて粗分離を可能にし得る。用いられるこの分離技術は、回収される画分の生存能を最大にするべきである。実施例以下の実施例は本発明をより完全に例示するために挙げられる。さらに、これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を提供するものであり、そして本発明の範囲を制限することを意図しない。以下の実施例に記載される多くの手順または適切な他の手順に関する標準的方法は、例えば、「Molecular Cloning」第２版（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press,1987）および「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubelら編、Greene Associates/Wiley In terscience,NY,1990)のような、広く再編成されている分子生物学のマニュアル中に提供される。実施例１形質導入のためのＴ細胞の調製ヒト白血球細胞株を20％ウシ胎児血清；ペニシリン／ストレプトマイシン；NE AAおよびL-gluを補充したRPMI培地中で増殖した。細胞を約５×10⁵細胞／mlの密度まで増殖し、そして１×10⁵/mlに希釈した。細胞を、８μg/mlのポリブレンおよび示された感染多重度で添加されたベクターを含有する２ml容量で形質導入した。４〜５日後、細胞をペレット化し、そしてPBS中で洗浄した。ルシフェラーゼアッセイのために、細胞を溶解し、そして製造者(Tropix Inc.,Bedford,MA)の説明書に従ってアッセイした。β-galベクター形質導入細胞をX-galアッセイ(No lanら、19XX)を用いて解析した。Ａ．高力価レトロウイルスベクターによるヒト白血球の形質導入種々の白血球細胞株を異なる親和性のレトロウイルスベクターで機能的な形質導入（すなわち、遺伝子発現）について試験した。試験したベクターは、イヌ(D A;DX;CFA)およびヒト起源(2X)の２つの異なるアンフォトロピックおよびキセノトロピックプロデューサー細胞株由来のβ-galベクター（それぞれ[DA/CBβ gal (V);CFA/ND7(V);DX/ND7(V);2X/CBβ gal(V)]）、ならびにヒト293 2-3細胞から生成されたG-偽型CBβ-gal(V)(G-βgal)であった。アンフォおよびキセノベクターを同力価（すべて１×10⁸bfu/mlに希釈;moi=10)で試験し、一方でG-ベクターを10倍希釈より低い濃度(10⁷bfu/ml;moi=1)(bfu=青色細胞形成単位およびmoi=感染多重度)で使用した。各形質導入培養物中の青色細胞の頻度を以下に要約する。異なる親和性のベクターでの白血球細胞株のインビトロ形質導入細胞株をまたDA/luci(V)（細菌性ルシフェラーゼ遺伝子をコードするベクター調製物）で関連する遺伝子発現について試験した。この実験において、並行培養物をMAウイルスでスパイクしてルシフェラーゼ発現の欠失がレセプター親和性のレベル（すなわち、ヘルパーウイルスが細胞に感染し、ルシフェラーゼの非常に増加した発現を導くluci(V)の拡張が生じる）であるかどうかを確認した。培養物をluci(V)(moi=5)およびMAヘルパーウイルス(moi=1)で形質導入した。培養物へのヘルパーウイルスの添加は、大部分のタンパク質発現のレベルまたは細胞親和性の増加のレベルのどちらにおいてもルシフェラーゼ発現プロフィールを変化しなかった。Ｂ．高力価レトロウイルスベクターを用いる初代細胞の形質導入初代のマウス樹状細胞をluci(V)を用いて形質導入した。樹状細胞およびマクロファージからなる脾臓「樹状細胞」画分をGM-CSFを用いて刺激し、そしてマウス脾臓B+Tリンパ球をcon Aを用いて刺激した。24時間後、β-gal(V)およびluci( V)のいずれかをmoi=10で添加した。結果を相対的な光の単位を用いて以下に示す。これらの結果は脾臓画分が高力価のアンフォトロピックレトロウイルスベクターにより形質導入されたことを示す。実施例２レトロウイルスベクター骨格の調製以下の実施例は、KT-1、KT-3B、KT-3Cと称される３つのレトロウイルスベクター骨格の産生を記載する。ベクターKT-1は、KT-3Bにおいてはネオマイシン耐性であり、一方KT-3Cはフレオマイシン耐性を付与する選択マーカーを欠損することにおいて、KT-3BおよびKT-3Cと異なる。 Moloneyマウス白血病ウイルス(MoMLV)5'長末端反復(LTR)EcoRI-EcoRIフラグメント（N2ベクター由来のgag配列を包含する(Armentanoら、J.Vir.61:1647,1987; Eglitasら、Science 230:1395,1985)をプラスミドSK⁺(Stratagene,La Jolla,CA) に連結する。生じた構築物をN2R5と称する。N2R5構築物を部位特異的インビトロ変異誘発により変異し、ATG開始コドンをgag発現を抑制するATTに変化させる。この変異誘発されたフラグメントは200塩基対(bp)の長さであり、そしてPstI制限部位により平滑化されている。PstI-PstI変異フラグメントをSK⁺プラスミドから精製し、プラスミドpUC31中のN2 MoMLV 5'LTRのPstI部位に挿入して非変異200 bpフラグメントと置き換える。プラスミドpUC31は、ポリリンカーのEcoRIとSacI 部位との間に挿入されたさらなる制限部位XhoI、BgIII、BssHIIおよびNcoIが存在するpUC19(Stratagene,La Jolla,CA)由来である。この構築物をpUC31/N2R5gM と称する。 N2由来の1.0キロ塩基(Kb)MoMLV3'LTR EcoRI-EcoRIフラグメントをN2R3^-と称される構築物中に生じるプラスミドSK⁺へクローン化する。1.0Kb ClaI-Hindlllフラグメントをこの構築物から精製する。ネオマイシン(neo)ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を駆動するSV40初期プロモーターを含む、pAFVXMレトロウイルスベクター(Krieglerら、Cell 38:4 83,1984;St.Louisら、PNAS 85:3150,1988)由来のClaI-ClaI優性選択マーカー遺伝子フラグメントを、SK⁺プラスミドへクローン化する。この構築物をSK⁺SV₂-ne oと称する。1.3Kb ClaI-BstBI遺伝子フラグメントをSK⁺SV₂-neoプラスミドから精製する。 KT-3BまたはKT-1ベクターを目的の遺伝子を含むXhoI-ClaIフラグメント中の３つの部分の連結により構築し、そして1.0Kb MoMLV3'LTR ClaI-HindIIIフラグメントをpUC31/N2R5gMプラスミドのXhoI-HindIII部位へ挿入する。これにより、KT -1骨格を有するように示されるベクターが得られる。次いで、pAFVXMレトロウイルスベクター由来の1.3Kb ClaI-BstBI neo遺伝子フラグメントをこのプラスミドのClaI部位へセンス方向で挿入してKT-3B骨格を有するように示されるベクターを産生する。別の選択マーカー、フレオマイシン耐性(Mulsantら、Som.Cell and Mol.Gen., 14:243,1988,Cayla,Cedex,FRで市販されている)を用いてレトロウイルス骨格KT- 3Cを以下のように作製した。プラスミドpUT507(Mulsantら、上述)をNdeIで消化し、そして末端をクレノウポリメラーゼIで平滑化した。次いで、サンプルを、H paIでさらに消化し、フラグメントの混合物にClaIリンカーを連結し、次いでCla Iで消化して過剰のClaIリンカーを除去する。RSV LTRおよびフレオマイシン耐性遺伝子を保有する1.2Kb ClaIフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により単離し、続いてGene Clean(Bio101,San Diego,CA)を用いて精製する。このフラグメントを1.3Kb ClaI-BstBIネオマイシン耐性フラグメントの代わりに用いてKT-3 C骨格を作製する。実施例３タンパク質をコードするレトロウイルスベクター構築物の調製以下の実施例は、目的の、異なるヒト遺伝子をコードする種々のレトロウイルスベクター構築物の調製を記載する。より詳細には、(A)部ではE.coli由来のマーカー遺伝子βガラクトシダーゼをコードするベクター構築物の産生、(B)部ではヒトインターフェロン(hIFN)、(C)部ではヒトインターロイキン-2(hIL-2)をコードするレトロウイルスベクター構築物、および(D)部ではヒト第VIII因子をコードする２つのレトロウイルスベクター構築物の産生について記載する。第１の第VIII因子構築物はタンパク質のＢドメイン欠失形態をコードするが、第２の横築物は全長第VIII因子をコードする。Ａ．β-galベクターの調製 pCBβ-galをIrusinら(1994)J.Virolに記載のように調製する。pND7を、第VIII 因子遺伝子の切り出し後にE.coliβ-galをpND5（下記参照）ベクターへ挿入することにより得る。Ｂ．KT-rh γ-IFNの調製ヒトγ-IFN遺伝子を得るために、マウスホモログをまず以下のようにクローン化する：mγ-IFN cDNAを以下に本質的に記載するようにpUC1813のEcoRI部位にクローン化する。簡潔に言えば、pUC1813（γ-IFNをコードする配列を含有する）をKayら(Nucleic Acids Research 15:2778,1987;およびGrayら、PNAS 80:5842,1 983)により本質的に記載されるように調製する。mγ-IFN cDNAをpUC1813のEcoRI 消化により回収し、そして単離したフラグメントをホスファターゼ処理したpSP7 3(Promega,Madison,WI)のEcoRI部位へクローン化する。この構築物をSP mγ-IFN と称する。cDNAの方向を適切な制限酵素消化およびDNA配列決定により確かめる。センス方向において、cDNAの５'末端はpSP73ポリリンカーのXhoI部位に隣接し、そして３'末端はClaI部位に隣接する。センス方向またはアンチセンス方向のいずれかにおいてmγ-IFN cDNAを含有するXhoI-ClaIフラグメントを、SP mγ-IF N構築物から回収し、そしてKT-3レトロウイルス骨格のXhoI-ClaI部位へクローン化する。この構築物をKT mγ-IFNと称する。１．PCRを用いるhγ-IFNをコードする配列の調製 (a)Jurkat細胞のPHA刺激 Jurkat細胞(Ｔ細胞株ATCC No.CRL8163)を、158.0mlの最終容量になるように、５％ウシ胎児血清(FBS)を含有するRPMI増殖培地(Irvine Scientific,Santa Ana, CA)に、１×10⁶細胞／mlの濃度で再懸濁する。フィトヘモアグルチニン(「PHA」 )(Curtis Mathes Scientific,Houston,TX)を最終濃度１％になるように懸濁液に添加する。懸濁液を37℃で５％CO₂中で一晩インキュベートする。細胞を翌日回収し、そして３本の50.0mlの遠心管にアリコートする。３つのペレットを50mlの１×リン酸緩衝化生理食塩水(PBS、145mM、pH7.0)と合わせ、そして1000 rpmで５分間遠心分離する。上清をデカントし、そして細胞を50.0mlのPBSで洗浄する。細胞をRNA単離のために回収する。 (b)RNA単離 PHA刺激されたJurkat細胞を22.0mlのグアニジン溶液（4M グアニジンチオシアネート；20mM 酢酸ナトリウム(pH 5.2)；0.1M ジチオスレイトール、0.5％サルコシル）中に再懸濁する。次いで、この細胞-グアニジン懸濁液を細胞膜を粉砕するために、20ゲージ針に６回通過させる。次いで、CsCl溶液(5.7M CsCl、0.1M EDTA)を11.0mLの粉砕した細胞-グアニジン溶液で重層する。溶液を20℃で、SW2 8.1ローター(Beckman,Fullerton,CA)中で24時間28,000 rpmで遠心分離する。遠心分離後、上清を慎重に吸引し、そして管をブロットして乾燥する。ペレットをグアニジン-HCl溶液(7.4M グアニジン-HCl；25mM Tris-HCl(pH7.5)；5mM ジチオスレイトール）中に再懸濁し、最終容量を500.0μlにする。この溶液を微量遠心分離管に移す。12.5μlの濃縮氷酢酸(HAc)および250μlの100％エタノールを微量遠心分離管に添加する。溶液を混合し、そして−20℃で数日間保存してRNAを沈殿する。保存後、溶液を14,000 rpm、４℃で20分間遠心分離する。次いでペレットを75 ％エタノール中に再懸濁し、微量遠心分離機中で14,000 rpm、４℃で、10分間遠心分離する。ペレットを真空下の遠心分離により乾燥し、そして300Lの脱イオン (DI)H₂O中に再懸濁する。RNAの濃度および純度を260および280nmの光学密度を測定することにより決定する。 (c)逆転写反応使用直前に、5.01(3.4mg/mL)の精製Jurkat RNAを90℃で５分間熱処理し、次いで氷上に置く。10.0μlの10×PCR緩衝液(500mM KCl;200mM Tris-HCl(pH8.4);25m M MgCl₂;１mg/mlウシ血清アルブミン(BSA));10μlの10.0mM dATP、10μlの10.0m M dGTP、10μlの10.0mM dCTP、10μlの10.0mM dTTP、2.5μlのRNasin(40,000 U/ ml,Promega;Madison,WI)および33.0μlのDI H₂Oの溶液を熱処理したJurkat細胞R NAに添加する。この溶液に5.0μl(10⁸nmol/mL)の（配列番号１）、および5.0μl (200,000 U/ml)MoMLV逆転写酵素(Bethesda Research Laboratories,EC 3.1.27.5 ,MD)を、微量遠心分離管中で混合し、そして室温で10分間インキュベートする。室温でのインキュベーションに続いて、反応混合物を37℃で１時間インキュベートし、次いで、95℃で５分間インキュベートする。次いで逆転写反応混合物をPC Rのための調製に備えて氷上に置く。 (d)PCR増幅 PCR反応混合物は100.0μlの逆転写反応物；356.01 DI H₂O;40.0μl 10×PCR緩衝液；1.0μl(137nmol/mL)V-OLI#5（配列番号２）；0.5μl(320nmol/mL)V-OLI#6 （配列番号３）および2.5μl、5,000 U/ml、Taqポリメラーゼ(EC 2.7.7.7、Perk in-Elmer Cetus、CA)を含有する。100μlのこの混合物を５本の管それぞれにアリコートする。このプライマーは停止コドンの下流のmγ-IFN cDNA 30塩基対の配列に相補的である。このプライマーはATG開始コドンで始まるmγ-IFN遺伝子の５'コード領域に相補的である。このプライマーの５'末端はXhoI制限部位を含有する。このプライマーはTAA停止コドンで終わるmγ-IFN遺伝子の３’コード領域に相補的である。このプライマーの５'末端はClaI制限部位を含有する。各チューブに100.0μlのミネラルオイルを重層し、そしてPCR機（Ericomp Twi n Block System,Ericomp,CA)内に置く。PCRプログラムは反応容器の温度を、まず95℃で１分間、次に67℃で２分間、そして最後に72℃で２分間に調節する。このサイクルを40回繰り返す。最後のサイクルは反応容器の温度をまず95℃で１分間、次に67℃で２分間、そして最後に72℃で７分間に調節する。完了したPCR増幅反応物を、PCR DNA単離に備えて４℃で１カ月間保存する。 (e)PCR DNAの単離 PCR増幅反応物から水相を１本の微量遠心分離管に移す。50μlの3M 酢酸ナトリウムおよび500.0μlのクロロホルム：イソアミルアルコール(24:1)を溶液に添加する。この溶液をボルテックスし、次いで、14,000 rpmで室温で５分間遠心分離する。上部の水相を新しい微量遠心分離管に移し、そして1.0mLの100％エタノールを添加する。この溶液を4.5時間、−20℃でインキュベートし、次いで、14, 000 rpmで20分間遠心分離する。上清をデカントし、そしてペレットを500.0μl の70％エタノールでリンスする。このペレットを真空下の遠心分離により乾燥する。単離したhγ-IFN PCR DNAを10.0μlのDI H₂O中に再懸濁する。２．h-IFNレトロウイルスベクターの構築 (a)平滑末端hγ-IFN PCR DNAフラグメントの作製および単離 hγ-IFN PCR DNAをT4 DNAポリメラーゼを用いて平滑末端化する。詳細には、1 0.0μlのPCR増幅DNA;2.0μlの10×T4 DNAポリメラーゼ緩衝液(0.33M Tris-アセテート(pH7.9)、0.66M 酢酸カリウム、0.10M 酢酸マグネシウム、５mM ジチオスレイトール、１mg/mL ウシ血清アルブミン(BSA));1.0μlの2.5mM dNTP(等モル濃度のdATP、dGTP、dTTPおよびdCTPを含有する混合物)；7.0μlのDI H₂O;1.0μl 、5000 U/mLのクレノウフラグメント(EC 2.7.7.7、New England Biolabs,MA);および1.0μl、3000 U/mlのT4 DNAポリメラーゼ(EC 2.7.7,New England Biolabs,M A)をともに混合し、そして37℃で15分間インキュベートする。次いで、反応混合物を室温で40分間インキュベートし、そして続いて68℃で15分間インキュベートする。平滑末端化hγ-IFNをアガロースゲル電気泳動により単離する。詳細には、2.0 μlのローディング色素(0.25％ブロモフェノールブルー；0.25％キシレンシアノール；および50％グリセロール)を反応混合物に添加し、そして4.0μlをエチジウムブロマイドを含有する１％アガロース／Tris-ホウ酸-EDTA(TBE)ゲルの各５レーンにロードする。ゲルの電気泳動を100ボルトで１時間行う。hγ-IFNを含む所望のDNAバンド（約500塩基対の長さ）を紫外線下で可視化する。バンドをNA 45紙(Schleicher and Schuell,Keene,NH)上への電気泳動転移によりゲルから取り除く。紙を68℃で40分間、400μlの高塩NET緩衝液(1M NaCl;0.1m M EDTA;および20mM Tris(pH8.0))中でインキュベートしてDNAを溶出する。NA 45 紙を溶液から取り出し、そして400.0μlのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1)を添加する。溶液をボルテックスし、そして14,000rpmで５分間遠心分離する。上部の水相を新しいチューブに移し、そして400.0μlのクロロホルム：イソアミルアルコール(24:1)を添加する。混合物をボルテックスし、そして５分間遠心分離する。上部の水層を新しいチューブに移し（２回目）、そして700.0μlの100％エタノールを添加する。チューブを−20℃で３日間インキュベートする。インキュベーションの後、DNAを14,000 rpmで20分間遠心分離することによりチューブから沈殿させる。上清をデカントし、そしてペレットを 500.0μlの70％エタノールでリンスする。平滑末端化hγ-IFN DNAを含有するこのペレットを真空下の遠心分離により乾燥し、そして50.0μlのDI H₂O中に再懸濁する。この単離した平滑末端化hγ-IFNDNAをポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化する。詳細には、25.0μlの平滑末端化hγ-IFN DNA、3.0μlの10×キナーゼ緩衝液(0.5M Tris-HCl(pH 7.6);0.1M MgCl₂;50mM ジチオスレチイトール;1mM スペルミジン;1m MEDTA)、3.0μlの10mM ATP、および1.0μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼ(10,000 U/ml,EC 2.7.1.78,New England Biolabs,MD)を混合し、そして37℃で１時間45分インキュベートする。次いで、酵素を、68℃で30分間インキュベートすることにより熱失活させる。 (b)SK⁺ベクター中へのhγ-IFN PCR DNAの連結 SK⁺プラスミドをHincII制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして下記のようにアガロースゲル電気泳動により精製する。詳細には、5.9μl(1.7 mg/mL)SK⁺プラスミドDNA(Stratagene;San Diego,CA);4.0μl 10×ユニバーサル緩衝液(Strat agene,San Diego,CA);30.1μlのDI H₂O、および4.0μl HincII，10,000 U/mL、をチューブ内で混合し、そして37℃で７時間インキュベートする。インキュベーション後、4.0μlのローディング色素を反応混合物に添加し、そして4.0μlのこの溶液をエチジウムブロマイドを含有する１％アガロース／TBEゲルの各５レーンに添加する。ゲルの電気泳動を105ボルトで２時間行う。HincII切断SK⁺プラスミド(2958塩基対の長さ)を紫外線下で可視化する。消化したSK⁺プラスミドをゲル電気泳動により単離する。プラスミドのHincII切断部位の脱リン酸化を仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて行う。詳細には、50.0μlの消化SK⁺プラスミド;5.0μlの1M Tris(pH 8. 0);2.0μlの5mM EDTA(pH 8.0);43.0μlのH₂Oおよび2.0μlの1,000 U/mL，仔ウシ腸ホスファターゼ(「CIP」)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)をチューブ中で混合し、そして37℃で15分間インキュベートする。インキュベーション後、 2.0μlのCIPを添加する。そして、溶液を55℃で90分間インキュベートする。インキュベート後、2.5μlの20％ドデシル硫酸ナトリウム(「SDS」)、1.0μlの0.5 M EDTA(pH 8.0)、および0.5μl、20mg/mL、プロテイナーゼＫ(EC 3.4.21.14,Boe hringer Mannheim,Indianapolis,IN)を添加し、そしてこの溶液を55℃で２時間インキュベートする。この溶液を室温に冷却し、そして110.0μlのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1)を添加する。この混合物をボルテックスし、そして14,000 rpmで５分間遠心分離する。上部の水相を新しいチューブに移し、そして200.0μlの100％エタノールを添加する。この混合物を70℃ で15分間インキュベートする。チューブを遠心分離し、そしてペレットを500.0 μlの70％エタノールでリンスする。次いで、ペレットを真空下の遠心分離で乾燥した。脱リン酸化されたSK⁺プラスミドを40μlのDI H₂O中に再懸濁する。 hγ-IFN PCR DNAをT4 DNAリガーゼを用いてSK⁺プラスミド中へ連結する。詳細には、30.0μlの平滑末端化、リン酸化、hγ-IFN PCR DNA反応混合物、2.0μlの脱リン酸化SK⁺プラスミドおよび1.0μlのT4 DNAリガーゼをチューブ内で合わせ、そして16℃で一晩インキュベートする。DNAをミニプレップ手順を用いて単離した。より詳細には、DH5a細菌株(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を15.0μlの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリンおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル -β-D-ガラクトシド(X-gal,Gold Biotechnology;St.Louis,MO)を含有するLuria- Bertaniアガープレート(LBプレート)上にプレートし、そして37℃で一晩インキュベートする。Sambrookら(Molecular Cloning,Cold Springs Harbor Press,198 9)により記載された手順を用いてDNAを白色細菌コロニーから単離する。hγ-IFN 遺伝子の存在をXhoI、ClaI、AvaII、DraI、およびSspIでの制限エンドヌクレアーゼ切断により決定する。hγ-IFN遺伝子を含むプラスミドの予想されるエンドヌクレアーゼ制限切断フラグメントサイズを表２に表す。単離したDNAプラスミドをSK hγ-IFNと称し、そしてレトロウイルスベクターの構築に用いる。 (c)レトロウイルスベクター中へのhγ-IFN遺伝子の連結インターフェロン遺伝子を、XhoIおよびClaI制限エンドヌクレアーゼでの消化によりSK hγ-IFNベクターから取り除く。hγ-IFN遺伝子を含有する生じたフラグメントは約500bpの長さであり、そしてこれを１％アガロース／TBEゲル電気泳動で単離する。次いで、XhoI-ClaI hγ-IFNフラグメントをKT-3レトロウイルス骨格中へ連結する。この構築物をKT hγ-IFNと称する。hγ-IFNの構造および発現の有無をKT hγ-IFN構築物でDH5a細菌株を形質転換することにより決定する。詳細には、細菌を15.0μlの連結混合物で形質転換する。形質転換された細菌細胞をアンピシリンを含有するLBプレート上にプレートする。このプレートを37℃ で一晩インキュベートし、そして細菌コロニーを選択する。DNAを上記(b)のように単離し、そしてXhoI、ClaI，DraI，NdeI、およびSspIで消化する。hγ-IFN遺伝子を含有するプラスミドの予想されるエンドヌクレアーゼ制限切断フラグメントサイズを表３に表す。続くKT hγ-IFN（レトロウイルスベクター）の配列決定により、hγ-IFN遺伝子内の１塩基対の欠失の存在が示された。この欠失を、多工程PCR手順を用いて逆転させた。 i．配列選択配列を、IBI Pustell配列解析プログラム（Int．Biotech，Inc.，New Haven， CT）から得る。以下のhγ-IFNプライマー配列を使用する：このプライマーは、hγ-IFN遺伝子の上流７コドンに伸長する開始コドンATG領域に相補的なセンス配列であり、そしてhγ-IFN 1bと称する。このプライマーは、hγ-IFN遺伝子のコドン106〜120に相補的なアンチセンス配列であり、そしてhγ-IFN Rep Bと称する。このプライマーは、hγ-IFN遺伝子のコドン106〜120に相補的なセンス配列であり、そしてhγ-IFN Rep Aと称する。このプライマーは、終止コドンATT領域に相補的かつhγ-IFN遺伝子の上流７コドンに伸長するアンチセンス配列であり、そしてhγ-IFN 3bと称する。 ii．最初のPCR 398.0μlのDI H₂O中の１×10⁶ KT hγ-IFNプラスミド分子；50μlの10×PCR緩衝液（500 mM KClおよび200 mM Tris-HCl（pH8.4）；25 mM MgCl₂; 1.0 mg/mlBS A）;5.0μlの2.5 mM dATP；5.0μlの2.5 mM dGTP；5.0μlの2.5 mM dCTP；5.0μ lの2.5 mM dTTP；12.0μlの18.6 nmol/mlのオリゴヌクレオチドhγ-IFN 1b；15. 0μlの24.6 nmol/mlのオリゴヌクレオチドhγ-IFN RepB；および2.5μlのTaqポリメラーゼの溶液をマイクロ遠心チューブ中で混合し、そして50μlを10本のチューブにアリコートする。同様に、395.0μlのDI H₂O中の１×10⁶ KT hγ-IFNプラスミド分子；50.0μlの10×PCR緩衝液（500 mM KCl；200 mM Tris-HCl（pH8.4 ）；25 mM MgCl₂; １mg/ml BSA）；5.0μlの2.5 mM dATP；5.0μlの2.5 mM dGTP ；5.0μlの2.5 mM dCTP；5.0μlの2.5 mM dTTP；13μlの23.4 nmol/mlのオリゴヌクレオチドhγ-IFN RepA；17.0μlの18.0 nmol/mlのオリゴヌクレオチドhγ-I FN 3b；および2.5μlのTaqポリメラーゼの溶液をマイクロ遠心チューブ中で混合し、そして50.0μlを10本のチューブにアリコートする。この20本のチューブをPCR機（Model 9600，Perkin Elmer Cetus; Los Angeles，CA）中に入れる。PC Rプログラムは、94℃で２分間の第１のサイクルにおいて、反応容器の温度を調節する。次の35サイクルを、94℃で0.5分間、次いで55℃で0.5分間、そして最後に72℃で１分間に調節する。最後のサイクルを72℃で10分間に調節する。このサイクルプログラムをProgram 10と称する。 PCR増幅後、225.0μlの各反応チューブを25.0μlのローディング色素（0.25％ブロモフェノールブルー、0.25％キシレンシアノールおよび50％グリセロール、アガロースゲルローディング色素）と混合し、そしてエチジウムブロミドを含有する２％アガロースゲルのウェルにロードする。このゲルを約90 Vで１時間電気泳動する。紫外光を使用して、DNAバンド分離を可視化する。２つのバンド（サイズ250 bpの一方のフラグメントおよびサイズ150 bpの他方のフラグメント）を、NA 45ペーパーへの電気泳動転移により単離する。沈澱後、２つのDNAペレットの各々を20.0 1のDI H₂O中に再懸濁し、そしてさらなるPCR増幅のために調製する。 iii．アニーリングおよび第２回目のPCR 20.0μlの150 bp PCR DNA；20.0μlの350 bp PCR DNA；161.5μlのDI H₂O；25 .0μlの10×PCR緩衝液（500 mM KCl；200 mM Tris-HCl（pH 8.4）；25 mM MgCl₂ ; および１mg/ml BSA）；2.5μlの2.5 mM dATP；2.5μlの2.5 mM dGTP；2.5μl の2.5 mM dCTP；2.5μlの2.5 mM dTTP；および1.25μlのTaqポリメラーゼの溶液をマイクロ遠心チューブ中で混合し、そして47.3μlを５本のチューブにアリコートする。各々のチューブをPCR機（Model 9600，Perkin-Elmer-Cetus，CA）中に入れる。PCRプログラムは、94℃で0.5分間の５サイクルの間に、反応容器の温度を調節する。次サイクルを、55℃で１分間調節する。このサイクルの後、1.2 μlのhγ-IFN 1bおよび1.5μlのhγ-IFN 3bを反応混合物に添加する。次いで、このチューブを、プログラム10を使用してPCR増幅する。この産物をrhγ-IFNと称する。 iv．平滑末端化rhg-IFN PCR DNAフラグメントの作製および単離 PCR増幅したhγ-IFN DNAを、T4ポリメラーゼを使用して平滑末端化する。詳細には、120.0μlのrhγ-IFN PCR溶液を、1.25μlの2.5mM dATP；1.25μlの2.5mMd GTP；1.25μlの2.5mM dCTP；1.25lの2.5mM dTTP；１lのT4 DNAポリメラーゼ；および1.0μlのクレノウフラグメントと混合する。この混合物を、室温で10分間インキュベートする。インキュベーション後、13.0μlのアガロースゲルローディング色素を混合物に添加し、そしてこの溶液を１％アガロースゲル中にロードする。このゲルを約90 Vで１時間電気泳動する。紫外光を使用して、DNAバンド化を可視化する。上記のように、500 bpのバンドを、NA 45ペーパーへの電気泳動転移により単離する。沈澱後、DNAペレットを12.0 lのDI H₂O中に再懸濁する。単離した500bpのフラグメントを、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて平滑末端化する。詳細には、1.0 mgのこのフラグメントを、1.5μlの10×キナーゼ緩衝液（0.5 mM Tris-HCl（pH7.6）；0.1 mM MgCl₂；50 mMジチオスレオトール；１mMスペルミジン；１mM EDTA）；1.5μlの10 mM ATP；および1.0μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼと混合し、そして37℃で30分間インキュベートする。 v．rh γ-IFN PCR DNAのSK⁺ベクター中への連結 rhγ-IFN PCR DNAを、SK⁺ベクター中に連結する。2.0μlのhγ-IFN PCR DNA- キナーゼ反応混合物；2.0μlのCIP処理したSK⁺ベクター；および1.0μlのT4 DNA リガーゼの溶液を、16℃で４時間インキュベートする。DH5a細菌を上記のように形質転換する。 vi．h γ-IFN遺伝子のレトロウイルスベクター中への連結 hγ-IFN遺伝子のレトロウイルスベクター中への連結を、上記のように行う。新たなベクターはKT hγ-IFNと称する。Ｃ．KT-hIL-2 の調製 hIL-2のKT-3レトロウイルスベクター中へのクローン化のための方法は、hg-IF NのKT-3中へのクローン化のための手順と、異なるプライマーがhIL-2 DNA配列の増幅のために必要とされる以外、本質的に同一である。以下のhIL-2 PCRプライマー配列を使用する：このプライマーは、終止コドンの下流のhIL-2 cDNAの配列に相補的である。このプライマーは、ATG開始コドンで開始する5'コード領域に相補的なhIL-2遺伝子のセンス配列である。このプライマーの5'末端は、Xho I制限部位を含む。このプライマーは、TAA終止コドンで終結する3'コード領域に相補的なhIL-2遺伝子のアンチセンス配列である。このプライマーの5'末端は、Cla I制限部位を含む。Ｄ．第VIII因子ベクターの調製以下は、第VIII因子をコードするいくつかのレトロウイルスベクターの構築の記載である。完全長第VIII遺伝子のサイズ（7,056 bp）、レトロウイルスベクターのパッケージングの拘束に起因して、そして形質導入された細胞についての選択はエクスビボ造血幹細胞療法についての必要条件ではないので、選択マーカー遺伝子を欠くレトロウイルス（例えば、KT-1）を用いる。完全長第VIII因子をコードする遺伝子は、種々の供給源から得られ得る。１つのこのような供給源は、プラスミドpCIS-F8（EP 0 260 148 A2、1993年３月３日公開）である。これは、その発現がCMV主要即時初期（CMV MIE）プロモーターおよびエンハンサーの制御下にある完全長第VIII因子cDNAを含む。この第VIII因子 cDNAは、第VIII因子遺伝子由来の約80 bpの5'非翻訳配列および約500 bpの3'非翻訳領域を含む。さらに、CMVプロモーターと第VIII因子配列との間に、CMVイントロン配列、または「シス」エレメントが位置する。このシスエレメント（約28 0 bpにわたる）は、Ig可変領域イントロンにより供給される介在領域とともに、免疫グロブリン遺伝子由来のスプライスアクセプターの約140 bp上流に、CMV主要即時初期プロモーター由来のスプライスドナー部位を含む。 i．レトロウイルスベクターJW-2をコードするプラスミドの構築完全長第VIII因子の発現のためのレトロウイルスベクターをコードするプラスミドpJW-2を、pKT-1由来のKT-1骨格を用いて構築する。第VIII因子cDNAのpKT-1 中への方向性クローン化を容易にするために、唯一のXho I部位を、部位特異的変異誘発によりNot I部位に変換する。次いで、得られたプラスミドベクターをN ot IおよびCla Iを用いて開裂する。pCIS-F8をCla IおよびEag I（これについては、２つの部位が存在する）で完全に消化して、完全長第VIII因子をコードするフラグメントを放出させる。次いで、このフラグメントをNot I/Cla I制限したベクター中に連結して、pJW-2と称するプラスミドを生成させる。 ii．レトロウイルスベクターND-5をコードするプラスミドの構築第VIII因子cDNAの3'非翻訳領域の約80％（約370 bp）の短縮をコードするプラスミドベクター（pND-5と称する）を、以下のようにpKT-1ベクター中に構築する：pJW-2について記載したように、用いるpKT-1ベクターは、Not Iの制限部位により置換されたそのXho I制限部位を有する。第VIII因子インサートを、pCIS-F8 をCla IおよびXba I（後者の酵素は、第VIII因子の終止コドンの5'を切断する）で消化することにより生じさせる。次いで、第VIII因子遺伝子の3'コード領域以外の全てを含む約７kbのフラグメントを精製する。pCIS-F8をまた、Xba Iおよび Pst Iで消化して、この遺伝子の終止コドンを含む121 bpのフラグメントを放出させる。このフラグメントも精製し、次いで第VIII因子遺伝子の残りをコースミド（Stratagene，San Diego，CA）と三叉路連結（three way ligation）して、pND-2と称するプラスミドを生じさせる。次いで、pND-2中の唯一のSma I部位を、希釈された条件下でCla Iリンカー（N ew England Biolabs，Beverly，MA）をSma I消化により作製された平滑末端に連結することにより、Cla I部位に変化させる。再環状化および連結の後、２つのC la I部位を含むプラスミドを同定し、そしてこれをpND-3と称する。 pND-3中の第VIII因子配列（Cla I部位により境界付けられ、そして3'非翻訳領域の多くの短縮を有する完全長遺伝子を含む）を、以下のように、pJW-1[Xho I 部位での切断、クレノウでの平滑化、およびNot Iリンカー（New England Biola bs）の挿入によるpKT-1誘導体]（これは、5.2 kb Not I/Cla Iフラグメントを生じる）のNot I/Cla I消化物に由来するプラスミド骨格中にクローン化する。pCI S-F8をEag IおよびEco RVで切断し、そして得られる約4.2 kbのフラグメント（完全長第VIII因子遺伝子の5'部分をコードする）を単離する。pND-3をEco RVおよびCla Iで消化し、そして3.1 kbのフラグメントを単離する。次いで、第VIII 遺伝子の部分を含む２つのフラグメントをNot I/Cla I消化したベクター骨格中に連結して、pND-5と称するプラスミドを生じさせる。 iii．Ｂドメイン欠失第VIII因子ベクターの構築Ｂ欠失FVIIIのための前駆体DNAを、Miles Laboratoryから得る。この発現ベクターをp25Dと称し、そして上記のpCISF8と正確に同一の骨格を有する。p25D中の FVIII8 cDNAの3'におけるHpa I部位を、オリゴリンカーによりCla Iに改変する。Acc I〜Cla Iフラグメントを改変p25Dプラスミドから切り出す。このフラグメントは、Ｂドメイン欠失にわたり、そしてcDNAの3'側の2/3全体を含む。Acc I〜 Cla Iフラグメントを上記のpJW-2から除去し、そして直前で記載した改変Ｂドメイン欠失フラグメントで置換する。この構築物をB-del-1と称する。当業者が理解するように、レトロウイルスベクターをコードするプラスミド（例えば、上記したプラスミド）の構築後、次いで、このようなプラスミドを種々の細胞株（それから感染性組換えレトロウイルスが産生され得る）の生成において使用し得る。実施例４パッケージング細胞産生Ａ．MLV 構造遺伝子発現ベクター MLVプロウイルスベクターDNAとパッケージング細胞株（「PCL」）の構造遺伝子との間の遺伝的相互作用により生成される複製可能ウイルスの可能性を減少させるために、別々の発現ベクター（各々がウイルスLTRを欠失している）を生成して、gag/pol遺伝子およびenv遺伝子を独立して発現させた。MLVベクターとの相同組換えおよび生じる複製可能ウイルスの生成の可能性をさらに減少させるために、タンパク質コード配列以外の最少の配列を使用した。宿主細胞において高レベルのMLV構造タンパク質を発現させるために、強力な転写プロモーター（CMV 初期プロモーターおよびAd5主要後期プロモーター）を利用した。MoMLV gag/pol 発現ベクターpSCV10の構築の例は以下のとおりである：１．ヒトサイトメガロウイルス（CMV）初期転写プロモーターを含む0.7 Kb Hi nCII/XmaIIIフラグメント（Boshartら、Cell 41:521，1985）を単離した。２．gag/polコード領域の全体を含むMoMLVプロウイルスプラスミドMLV-K（Mil lerら、Mol．Cell Biol．5:531，1985）由来の5.3 Kb PstI（部分）/ScaIフラグメントを単離した。３．SV40後期転写終結シグナルを含むSV40 DNA（残基2717〜2363）由来の0.35 Kb DraIフラグメントを単離した。４．リンカーおよび他の標準的組換えDNA技術を使用して、CMVプロモーター-M oMLV gag/pol-SV40終結シグナルをbluescriptベクターSK⁺（Stratagene，San Di ego，CA）中に連結した。 MLVキセノトロピックエンベロープ発現ベクターの構築の例は以下のとおりである。１．クローンNZB9-1（O'Neilら、J．Virol．53:100，1985）から得たキセノトロピックエンベロープのコード領域を含む2.2 Kb NaeI/NheIフラグメントを単離した。２．リンカーおよび他の標準的組換えDNA技術を使用して、gag/pol発現について上記したCMV初期プロモーターおよびSV40後期終結シグナル（pSCV10）を、CMV プロモーター-キセノ（xeno）env-終結シグナルの順で連結した。Ｂ．宿主細胞選択宿主細胞株を、薬剤耐性レトロウイルスベクターAαN2（Armentanoら、J．Vir . 61:1647，1987；およびEglitasら、Science 230:1395，1985）を効率的に（高力価）レスキューするそれらの能力について、複製可能レトロウイルスを用いて gag/polおよびenv構造遺伝子を産生して（「MA」ウイルス）、スクリーニングした。力価を、コンフルエントな単層から、培地交換の16時間後に、濾過した上清（0.45μmフィルター）を６cm組織培養プレート上の５×10⁴ NIH 3T3 TK-細胞に、４μg/mlのポリブレンの存在下で添加し、次いでG418中で選択することにより測定した。非マウス細胞株の中で、高力価でMoMLVベースのベクターをパッケージングする能力を示したのは、細胞株CF2（イヌ）、D17（イヌ）、293（ヒト）、およびHT1080（ヒト）であった。これらの細胞株はパッケージングおよびプロデューサー細胞株の産生のために好ましいが、多くの他の細胞がこのような手段により試験および選択され得る。Ｃ．パッケージング細胞株の生成 (i) gag/pol中間体の調製 PCL産生のためのgag/pol中間体の生成の例として、D17細胞（ATCC番号CCL-183 ）、293細胞（ATCC番号1573）、およびHT1080細胞（ATCC番号CCL 121）を、１μ gのメトトレキセート耐性ベクターpFR400（Grahamおよびvan der Eb、Virology 52:456，1973）、および10μgのMoMLV gag/pol発現ベクターpSCV10（上記）を用いて、リン酸カルシウム共沈（D17およびHT1080、Grahamおよびvan der Eb、前出を参照のこと）、またはリポフェクション（293、Felgnerら、Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 84:7413，1987を参照のこと）により、同時トランスフェクトした。薬剤ジピリミドールおよびメトトレキセートの存在下でのトランスフェクトされた細胞についての選択後、個々の薬剤耐性細胞コロニーを拡大し、そして細胞外逆転写酵素（RT）活性（Goffら、J．Virol．38:239，1981より改変）、および抗p30抗体（ヤギ抗血清#77S000087、National Cancer Instisuteから）を用いるウエスタンブロットによる細胞内p30^gagにより、MoMLV gag/pol発現について分析した。この方法により、表４に示すように、パッケージング細胞株PA317のレベルに比較して10〜50倍高いレベルの両方のタンパク質を発現する、各細胞タイプの個々の細胞クローンが同定された。これらのタンパク質の生物学的活性を、アンフォトロピックエンベープおよび薬剤G418に対する耐性を与えるNeo⁺マーカーの両方を発現するレトロウイルスベクターLARNLを導入することにより試験した。全ての場合において、細胞株中におけるgag/polとベクターからのenvとの同時発現は、G418耐性の3T3細胞への無細胞移入（力価）により測定したところ、ベクターの効率的なパッケージングを可能にした。力価を、コンフルエントな単層から、培地交換の16時間後に、濾過した上清（0.45μmフィルター）を６cm組織培養プレート上の５×10⁴ NIH353 TK⁺ 細胞に、４μg/mlのポリブレンの存在下で添加し、次いでG418中で選択することにより測定した。重要なことに、細胞株由来のベクター力価は、p30^gagのレベルと相関した（表４）。envのレベルは各クローンにおいて同一であるはずであり、そしてPA317において見出されるレベルに匹敵するので（データは示さず）、このことは力価がこれらの細胞（PA317を含む）中におけるより低いレベルのgag /polにより制限されたことを示す。力価は、RTのレベルよりもp30^gagのレベルにより密接に相関した。 (ii) gag/pol株のキセノトロピックパッケージング細胞株への変換キセノトロピックPCLの生成の例として、D17（4-15）およびHT1080（SCV21）についてのgag/pol過剰発現体（over-expressor）を、１μgのフレオマイシン耐性ベクターpUT507（SCV21について）、またはハイグロマイシンＢ耐性マーカーp Y3（4-15について、BlochlingerおよびDiggelmann，Mol．Cell Biol．4:2929，1 984）のいずれか、および10μgのキセノトロピックエンベロープ発現ベクターpC MVxeno（上記）を使用した以外は、上記したと同一の技術により同時トランスフェクトした。それぞれフレオマイシンまたはハイグロマイシンの存在下でのトランスフェクトされた細胞についての選択後、個々の薬剤耐性細胞コロニーを拡大し、そして特異的抗血清を用いるウエスタンブロットによりMLV p30^gagおよびgp 75^envタンパク質の細胞内発現について分析した。比較的高いレベルのgag/polおよびキセノ（xeno）envの両方を発現するクローンを同定した。多数のこれらのキセノトロピックパッケージング細胞株を、レトロウイルスベクターをパッケージングするそれらの能力について、レトロウイルスベクターの導入後の力価を測定することにより、試験した。結果を以下の表５に示す。トランスフェクションと対照して、感染により、レトロウイルスベクターをパッケージング細胞株中に導入した場合に、最高の力価が得られる（Millerら、So mat．Cell Mol．Genet.，12:175，1986）。しかし、本明細書中に記載のキセノトロピックパッケージング細胞株は、組換えキセノトロピックレトロウイルス粒子により感染についてブロックされる。なぜなら、この細胞は、キセノトロピックenvタンパク質を発現するからである（すなわち、「ウイルス干渉」）。「ウイルス干渉」（それにより、キセノトロピックエンベロープタンパク質を発現する細胞株が、そうでなければそれらの細胞タイプに感染し得るキセノトロピック MLVベクターによる後の感染をブロックする）の問題を克服するために、他のウイルスエンベロープ（例えば、キセノトロピックレセプター以外の細胞レセプターに結合するVSV-gタンパク質（Florikiewiczら、J．Cell Bio．97:1381，1983 ；およびRomanら、Exp．Cell Res．175:376，1988））を含有するベクター粒子が、以下の方法で生成され得る。パッケージングされるべきレトロウイルスベクター構築物をコードするプラスミドDNA 10μgを、それからVSV-gタンパク質が発現されるDNA 10μgと、高レベルのgag/polを発現する細胞株中に同時トランスフェクトする。得られるベクター（VSV-gタンパク質を含む）を、同時トランスフェクトされた細胞において一時的に産生させる。トランスフェクションの２日後、無細胞上清を期待されるキセノトロピックパッケージング細胞株（gag、pol、およびenvを発現する）に添加する。次いで、無細胞上清をコンフルエントな単層から採集し、そしてPCRにより力価測定する。最高の力価を産生する細胞クローンを、パッケージング細胞株として選択する。この手順は、時々「Ｇホッピング（G-hopping）」と呼ばれる。 VII．別のウイルスベクターパッケージング技術いくつかのさらなる別の系を使用して、本発明によるベクター構築物を有する組換えレトロウイルス粒子を産生し得る。これらの系のいくつかは、昆虫ウイルスであるバキュロウイルス、および哺乳動物ウイルスであるワクシニアおよびアデノウイルスが、それに対応する遺伝子がクローン化されている任意の所定のタンパク質を大量に作製するように適合されているという事実を利用する。例えば、Smithら（Mol．Cell．Biol．3:12，1983）；Picciniら（Meth．Enzymology，1 53:545，1987）；およびMansourら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:1359，198 5）を参照のこと。適切な遺伝子の挿入により、これらおよび類似のウイルスベクターを用いて、組織培養細胞においてタンパク質を産生し得、従って、レトロウイルスベクター粒子を作製するように適合させ得る。アデノウイルスベクターは核の複製中のウイルスに由来し、そして欠損性であり得る。インビトロ構築（Ballayら、EMBO J．4:3861，1985）または細胞中組換え（Thummelら、J．Mol．Appl．Genetics 1:435，1982）のいずれかにより、遺伝子をベクター中に挿入し、そしてこれを用いて哺乳動物細胞においてタンパク質を発現させ得る。１つの好ましい方法は、(1)gag/pol、(2)env、(3)改変ウイルスベクター構築物を駆動するアデノウイルス主要後期プロモーター（MLP）を使用してプラスミドを構築することである。5'LTRのU3領域（これはウイルスベクタープロモーターを含む）を、他のプロモーター配列で置換し得るので（例えば、Hartman，Nuc l．Acids Res．16:9345，1988を参照のこと）、改変ウイルスベクター構築物が可能である。この部分は、3'LTRからU3での１回の逆転写の後に置換される。次いで、これらのプラスミドを使用して、アデノウイルスゲノムをインビトロで作製し得る（Ballyら、前出）。次いで、これを293細胞（アデノウイルスE1A タンパク質を作製するヒト細胞株）（このためにアデノウイルスベクターは欠損性である）中にトランスフェクトして、欠損アデノウイルスベクター中に別々に有されるgag/pol、envおよびレトロウイルスベクターの純粋なストックを得る。このようなベクターの力価は代表的には10⁷〜10¹¹/mlであるので、これらのストックを使用して、組織培養細胞を同時に高多重度で感染し得る。次いで、この細胞を、レトロウイルスタンパク質およびレトロウイルスベクターゲノムを高レベルで産生するようにプログラムする。アデノウイルスベクターは欠損性であるので、大量の直接的細胞溶解は生じず、そしてレトロウイルスベクターは細胞上清から回収され得る。無関係のレトロウイルスベクター（例えば、RSV、MMTVまたはHIV）由来のウイルスベクターのような他のウイルスベクターを同一の方法で使用して、初代細胞からベクターを生成させ得る。１つの実施態様において、これらのアデノウイルスベクターを初代細胞とともに使用して、初代細胞からレトロウイルスベクター調製物を生じさせる。組換えキセノトロピックレトロウイルス粒子を作製するための別の代替は、インビトロパッケージング系である。例えば、このような系は、以下の成分を用い得る：１．Smithら、前出に記載の方法と同じ方法でバキュロウイルス系において、または他のタンパク質産生系（例えば、酵母またはE．coli）において作製されたgag/polおよびenvタンパク質；２．T7またはSP6転写系あるいは他の適切なインビトロRNA生成系（例えば、Fl amantおよびSorge，J．Virol．62:1827，1988）を使用して作製されたベクター構築物；３．(2)におけるように作製された、または酵母または哺乳動物細胞から精製されたtRNA；４．リポソーム（好ましくは、包埋されたenvタンパク質を有する）；および５．envプロセッシング、および任意のまたは他の必要な細胞由来機能を提供するための、細胞抽出物または精製された成分（代表的には、マウス細胞由来）。この手順において、(1)、(2)、および(3)の成分を混合する。次いで、envタンパク質、細胞抽出物およびプレリポソーム混合物（適切な溶媒中の）を添加する。好ましい実施態様において、得られるリポソーム包埋envを(1)、(2)、および( 3)の混合物に添加する前に、envタンパク質をリポソーム中に包埋する。この混合物を処理して（例えば、超音波処理、温度操作、またはロータリー透析により）、Gould-Fogeriteら、Anal．Biochem．148:15，1985に記載のような、薬品のリポソーム包膜のための方法に類似の方法で、新生（nascent）ウイルス粒子を脂質＋包埋されたenvタンパク質で包膜させる。この手順は、病原性レトロウイルスまたは複製可能レトロウイルスでの汚染なしの、高力価の複製不能組換えレトロウイルスの産生を可能にする。Ｄ．複製可能レトロウイルス（RCR）の検出複製可能レトロウイルスを生成するための上記のパッケージング細胞の性質は、種々の方法によって厳密に試験され得る。その内の２つを以下に記載する。 i．拡大S⁺L^-アッセイ拡大S⁺L^-アッセイは、複製可能な感染性ウイルスが目的の細胞株の上清中に存在するかどうかを決定する。このアッセイは、感染性レトロウイルスが指示細胞株MiCl₁（ATCC受託番号第CCL 64.1号）上にフォーカスを生成するという経験的観察に基づいている。MiCl₁細胞株はマウス肉腫ウイルス（MSV）を用いる形質導入によってMv1Luミンク細胞株（ATCC受託番号第CCL 64号）から誘導される。これは、複製欠損マウス肉腫プロウイルスを含有する（S⁺）が、複製可能マウス白血病プロウイルスを含有しない（L-）非プロデューサー非形質転換復帰変異クローンである。複製可能レトロウイルスによるMiCl₁細胞の感染は、MSVゲノムを「活性化」してフォーカス形成をもたらす「形質転換」を誘発する。複製可能レトロウイルスの存在について試験すべき細胞株から上清を取り出し、そして0.45μmフィルターに通してすべての細胞を除去する。１日目に、Mv1Lu 細胞を、２mlのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％FBS、および８μg/m L ポリブレン中で1.0×10⁵細胞/ウェル（試験されるべき１サンプルあたり１ウェル）で６ウェルプレートに播種する。ポジティブおよびネガティブコントロールのために、Mv1Lu細胞を同じ方法で別の６ウェルプレートにプレーティングする。細胞を37℃、10％CO₂で一晩インキュベートする。２日目に、1.0mLの試験上清をMv1Lu細胞に加える。ネガティブコントロールプレートを、1.0mLの培地とともにインキュベートする。ポジティブコントロールは、MAウイルス（Millerら，Mo lec．and Cell Biol．5:431,1985）の３種類の希釈（それぞれ1.0mL培地中200フォーカス形成単位（ffu）、20ffu、および2ffu）からなり、これをポジティブコントロールウェル中の細胞に加える。細胞を一晩インキュベートする。３日目に、培地を吸引し、そして3.0mLの新鮮なDMEMおよび10％FBSを細胞に加える。細胞をコンフルエントまで増殖させ、そして６日目および10日目に１:10に分割して、いずれの複製可能レトロウイルスをも増幅する。13日目に、Mv1Lu細胞上の培地を吸引し、そして2.0mLのDMEMおよび10％FBSを細胞に加える。さらに、MiCl₁ 細胞を2.0mLのDMEM、10％FBS、および８μg/mLポリブレン中で1.0×10⁵細胞/ウェルで播種する。14日目に、Mv1Lu細胞由来の上清をMiCl₁細胞の対応するウェルに移し、そして37℃、10％CO₂で一晩インキュベートする。15日目に、培地を吸引し、そして3.0mLの新鮮なDMEMおよび10％FBSを細胞に加える。21日目に、細胞の単層上のフォーカス形成（単層を覆い、かつ付着したままの密集した屈折性細胞として現れる）について細胞を調べる。フォーカスがMiCl₁細胞上に現れれば、その試験物は複製可能レトロウイルスで汚染されていると決定される。 ii．プロデューサー株の同時培養およびMdHマーカーレスキューアッセイレトロウイルス粒子を産生する細胞株におけるRCRの存在を試験するための別の方法として、プロデューサー細胞を同数のMus dunni細胞（NIH NIAID Bethesd a，MD）とともに同時培養する。０日目に、5.0×10⁵のMus dunni細胞を5.0×10⁵ のプロデューサー細胞と混合し、そしてその混合物を10cmプレート（10mLの標準培養培地/プレート、４μg/mLポリブレン）中に播種することによって、小規模の同時培養を行なう。プロデューサー細胞株を効果的に希釈除去(dilute out)し、そしてRCRの最大増幅を提供するために、３〜４日毎に培養物を１:10の比率で分割し、そして5.0×10⁵のMus dunni細胞を各培養プレートに加える。14日目に、培養上清を収集し、0.45μmのセルロース-アセテートフィルターに通し、そして MdHマーカーレスキューアッセイで試験する。1.0×10⁸のMus dunni細胞と1.0×1 0⁸のプロデューサー細胞との混合物を合計20のT-150フラスコ（30mLの標準培養培地/フラスコ、4μg/mLポリブレン）に播種することによって、大規模の同時培養を行なう。培養物を、３、６、および13日目に１:10の比率で、そして９日目に１:20の比率で分割する。15日目に、最終上清を収集し、濾過し、そしてそれぞれの一部をMdHマーカーレスキューアッセイで試験する。 MdHマーカーレスキュー細胞株を、LHL（ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子をコードするレトロウイルスベクター）（Palmerら，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA，8 4:1055,1987）で形質導入されたMus dunni細胞のプールからクローン化する。このレトロウイルスベクターを、RCRによる細胞の感染時に、MdH細胞からレスキューし得る。４μg/mLポリブレンを含む標準培養培地（10％FBS、１％ 200mM L-グルタミン、１％非必須アミノ酸を含むDMEM）２mL中に１×10⁵のMdH細胞を含む６ウェルプレートのウェルに１mLの試験サンプルを加える。24時間後に、培地をポリブレンを含まない標準培養培地で置換する。２日後、MdH培養上清の全容量を0 .45μmのセルロース-アセテートフィルターに通し、そしてポリブレンを含む標準培養培地2mL中の5.0×10⁴のMus dunni標的細胞を含む６ウェルプレートのウェルに移す。24時間後、上清を250μg/mLのハイグロマイシンＢを含む標準培養培地で置換し、そしてその後２日目および５日目に、200μg/mLのハイグロマイシンＢを含む培地で置換する。ハイグロマイシンＢに耐性なコロニーが現れ、そして選択後９日目に、0.2％クーマシーブルーで染色することによってそれらを可視化する。実施例５組換えレトロウイルス粒子の産生上記実施例に記載の代表的な例である、ヒトキセノトロピックおよびイヌアンフォトロピックパッケージング細胞株HXおよびDAにそれぞれ由来の本発明のベクター構築物を保有する組換えレトロウイルス粒子の産生を以下に記載する。Ａ．パッケージング細胞株HXおよびDAの一過性プラスミドDNAトランスフェクション１日目に、パッケージング細胞株HXまたはDAを、DMEMおよび10％ウシ胎児血清（FBS）を有する10cm組織培養ディッシュに5.0×10⁵細胞で播種する。２日目に、トランスフェクションの４時間前に、培地を5.0mLの新鮮な培地に置換する。4 0.0μlの2.5M CaCl₂、パッケージングされるべきベクターをコードする10μgのプラスミド、および脱イオンH₂Oを混合して総容量を400μlにすることによって、標準的なリン酸カルシウム-DNA共沈を行なう。次いで、DNA-CaCl₂溶液を、一定に攪拌しながら400μlの沈澱緩衝液（50mM HEPES-NaOH，pH7.1; 0.25M NaCl, および 1.5mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄）に滴下する。これらの混合物を室温で10分間インキュベートする。得られた細かい沈殿物を細胞の異なる培養ディッシュに加える。細胞をDNA沈澱物とともに37℃で一晩インキュベートする。３日目に、培地を吸引し、そして新鮮な培地を加える。４日目に上清を取り出し、0.45μmのフィルターに通し、そして−80℃で保存する。Ｂ．パッケージング細胞株形質導入１日目に、DAパッケージング細胞を、２mLのDMEMおよび10％FBS、４μg/mLポリブレン（Sigma，St．Louis，MO）中に1.0×10⁵細胞/３cm組織培養ディッシュで播種する。２日目に、3.0mL、1.0mL、および0.2mLの所望のベクターを保有するVSV-g偽型レトロウイルス粒子を含有する新たに採集した上清をそれぞれHX細胞に加える。細胞を37℃で一晩インキュベートする。３日目に、細胞をプレートから取り出し、その細胞懸濁液を計数し、その細胞懸濁液を10細胞/mLに希釈し、そして96ウェルプレート（Corning，Corning，NY）の各ウェルに0.1mL（1細胞 /ウェル）を加えることによる限界希釈によって、細胞のプールをクローン化する。細胞を37℃、10％CO₂で14日間インキュベートする。所望の組換えキセノトロピックレトロウイルスを産生するいくつかのクローンを選択し、そして24ウェルプレート、６ウェルプレート、そして最終的に10cmプレートまで拡大し、この時点で、それらのクローンを適切なレトロウイルスベクターの発現についてアッセイし、そして上清を集め、そしてレトロウイルス力価についてアッセイする。パッケージング細胞株DAは、Ｇホッピングで作製した組換えレトロウイルスベクターを用いて同様に形質導入され得る。上記の手順を用いて、培養物中に１×10⁶cfu/mL以上の力価を有する組換えレトロウイルスベクターを産生するDAおよびHX細胞株を誘導し得る。Ｃ．力価アッセイベクター調製物の適切な希釈物を用いて、通常のベクター力価を、HD1080のような標的細胞の形質導入、続く抗生物質選択、および生存コロニーの計数（WO 9 1/02805）によって、決定した。しかし、所望のベクター構築物を保有する組換えキセノトロピックレトロウイルスベクターは、選択マーカーをコードする遺伝子を含まない場合がある（ベクター構築物が、目的の大きな遺伝子（例えば、全長第VIII因子）をコードする場合、薬物耐性コロニーの選択に基づく力価アッセイ以外の力価アッセイを必要とする場合のように）。このために、抗体アッセイおよびPCRアッセイ（後者は、以下に記載される）を使用し、レトロウイルスベクター力価（つまり、本発明のレトロウイルスベクターを含む感染性粒子の数）を決定し得る。選択マーカーを欠くベクターの文脈において、このようなPCRアッセイを必要とし得るが、このようなアッセイは、所定の任意のベクターについて使用され得ることを理解する。本発明のレトロウイルスベクターに独特な配列を増幅するためのPCRの使用のために、種々のプライマーを必要とする。このようなプライマーは、当業者により容易に設計され得、そして使用されるレトロウイルスベクター骨格およびその成分、増幅されることが望ましい設計された特定の領域（単数または複数）などに依存する。特定のプライマー対の代表的な例は、LTR配列、パッケージングシグナル配列、またはレトロウイルス骨格の他の領域に特異的なプライマー対を包含し、そしてベクター中の目的の遺伝子に特異的なプライマーもまた包含する。このようなPCR力価測定アッセイの使用におけるさらなる利点は、ゲノム再配列などをアッセイする能力を包含する。本発明の実施において、PCR力価測定アッセイを、回収前の少なくとも16時間の６ウエルプレートにおける、目的の遺伝子の発現を指向し得るレトロウイルスベクターを形質導入した既知の数（代表的には、１×10⁵個の細胞）のHT1080細胞の増殖により実施する。これらの形質導入に用いたレトロウイルスベクターは、好ましくは、細胞培養上清から得られる。プレートにつき１つのウェルを細胞計数のために指定する。他のウェル由来の細胞を、溶解し、そしてそれらの内容物を単離する。血液用のQIAmp Blood Kitおよび細胞培養PCR（QIAGEN,Inc.,Chat sworth,CA）を用いてDNAを調製する。DNAを、５×10⁶細胞等価物／mLに再懸濁する。ここで、１つの細胞等価物は、１つの細胞のDNA含有量に等しい。力価を算出するために、形質導入していないHT1080細胞（ネガティブコントロール）から単離されたDNA、および公知のベクターを用いて形質導入し、そして細胞ゲノム当たりそのベクターの１つのコピーを有するHT1080細胞（ポジティブコントロール）（例えば、選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性）をコードするレトロウイルスベクターを用いて形質導入されたパッケージング細胞株から調製され得る）を用いて、標準曲線を作成する。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの両方のために、DNAを、５×10⁶細胞等価物／mLに再懸濁する。DNAの全量を一定に保ちながら、異なる量のポジティブおよびネガティブコントロールDNAを組み合わせることにより、標準曲線を作成し、そしてレトロウイルスベクターの特定の領域に特異的なプライマーを用いるPCRによってそれらから特定の配列を増幅する。標準曲線を作成するための混合物の代表的な群は：である。各チューブからの5.0μLを、８個の反応チューブの１つに入れ（２連をまた調製する）、残りを-20℃で保存する。各サンプルDNA調製物からの5.0μLを、それら自身の反応チューブに２連で入れる。次いで、PCR反応（全量50μL）を、チューブあたり試験されるべき以下の成分を含む45.0μLの反応混合物を添加することにより開始する：24.5μLの水、５μLの10×反応PCR緩衝液、４μLの25 mM MgCl₂、４μLのdNTP（各2.5mMのdATP、dGTP、dCTP、およびdTTPを含有する）、５μLのプライマー混合物（100ngまたは各プライマー）、0.25μLのTaqStart モノクローナル抗体（Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA）、1.00μLの TaqStart緩衝液（Clontech Labs,Inc.）、および0.25μLのAmpliTaq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer,Inc.,Norwalk,CN）。反応混合物を反応チューブに等分する直前に、１μLのa-³²P dCTP（250μCi；3000 C/mmol、10mCi/mL、Amersham Co rp.,Arlington Heights,IL）を反応混合物中に添加する。45.0μLの反応混合物を各反応チューブに等分した後に、チューブに栓をし、そしてサーモサイクラー中に配置する。特定の変性、アニーリング、伸長の時間、および温度、ならびにサーモサイクルの数は、使用するプライマー対のサイズおよびヌクレオチド組成に依存して変化する。次いで、20〜25増幅サーモサイクルを実施する。次いで、５μLの各反応物をDE81イオン交換クロマトグラフィーペーパー（Whatman,Maids tone,England）上に滴下し、そして10分間風乾する。次いで、50mM Na₂PO₄（pH ７）、200mM NaCl 中で１回の洗浄につき100mLでフィルターを５回洗浄し、その後、風乾し、次いで、Saran Wrapに挟む。定量をPhosphoImager SI（Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA）上で行う。代表的には、フィルターをリン光体スクリーンに曝露する。これは電離放射線からのエネルギーを適切な時間（代表的には約120分）蓄積する。曝露後、リン光体スクリーンをスキャンし、それにより元のフィルター上の放射能に比例して光線が発せられる。次いで、スキャニングの結果を、ダウンロードし、そしてcpm（縦座標）対ポジティブコントロールDNAパーセント（横座標）として対数スケール上にプロットする。各サンプルの力価( 感染単位/mL)を、検出された放射能に基づいて標準曲線から決定された比率（十進法形式に換算された）に、DNAを単離した細胞数を掛け、細胞を形質導入するのに用いたレトロウイルスベクターの容積で割ることにより算出する。当業者で評価されるように、増幅した産物を標識するために、検出の他の方法（例えば、比色分析法）を使用し得る。実施例６組換えキセノトロピックレトロウイルスの大規模産生本発明の組換えキセノトロピックレトロウイルスを、種々の様式（例えば、回分様式または連続様式）で培養し得る。さらに、種々の細胞培養技術を使用して、商業的規模の量の本発明の組換えキセノトロピックレトロウイルスを産生し得る。当業者に公知の他の技術も同様に使用され得るが、いくつかのこのような技術を、以下に記載する。Ａ．中空ファイバー培養物からの組換えレトロウイルスの産生 i．培養の開始中空ファイバー培養を始めるために、播種の48時間前に、100〜200mLの完全な増殖培地を用いた37℃での運転条件で模擬試験することにより、中空ファイバーバイオリアクター(例えば、HFB；Cellco,Inc.,Germantown,MD)を初期条件設定をした。増殖培地は、好ましくは、この細胞株が適応していたものである。HFB中の初めに送られた全ての液体を、吸引し、そして完全な増殖培地で置換すべきである。バイオリアクターに播種する場合、この細胞を、48時間より早く分けるべきでなく、そしてこの細胞は、HFBの播種のための回収時に、対数増殖期であるべきである。代表的には、この細胞を、トリプシン処理により回収し、そして遠心分離によりペレット化する。次いで、この細胞ペレットを、25％の馴化前培地４mL中に再懸濁し、そしてHFB上に見いだされる側面のシリンジ口を用いてシリンジにより毛管外空間(extra-capillary space)へ送達する。HFBの播種後、循環ポンプを始動させる前に、20〜30分間細胞を付着させる。この時間中、HFBの馴化に用いた培地を、100〜200mLの25％の馴化前培地で置換する。循環送液ポンプを、25mL/分にセットした開始流速で開始する（２本の長いポンプの針で５にセットする）。ポンプのスイッチを入れた時点から１時間後、培地のサンプル１mL を、乳酸塩およびアンモニアの初期レベルを記録するために採取する。毎日の計画として、24時間毎に１mlのサンプルを採取し、毎日の乳酸塩およびアンモニアの生産をアッセイする。乳酸塩のレベルが2.0g/L（または、22mM/Lに等価）に達し始めたとき、最初の培地100〜200mLを、新鮮な培地と交換する。培養物が20mm ol/Lの毎日のレベルに達するまで、同じ容量の培地を置換する。毎日の乳酸塩レベルが20mmol/Lに達したとき、貯蔵ボトルサイズを500mLの新鮮な培地を含む500 mLボトルに増大する。次いで、培養物が、2.2mmol/日の乳酸塩を生産し始めたとき、送液流速を50mL/分に増加させる。500mLの容量が毎日20mmol/Lの乳酸塩に達したとき、元のCellcoに供給された貯蔵送液キャップを、チューブおよび錠の取り付け部品(male luer lock fitting)を付加することでCellcoシステムに適応させた、さらに大きな貯蔵キャップ(Unisyn-vender part #240820)に交換する。この貯蔵キャップは、２リットルのCorningボトルに適応する（培養運転中、貯蔵キャップの交換を避けるため、さらに小さなボトルサイズもまた支持し得る大きな貯蔵キャップで運転を開始する）。毎日の乳酸塩の読み取りをアッセイし、そして記録する場合、培養物が最大の細胞密度に達する時（すなわち、乳酸塩の割合が減少し、そしてレベルが消失した時）を決定するために、培養物の毎日の乳酸塩の生産レベルを使用し得る。 ii．2X- β-galに対する播種密度特定の播種必要条件を確立するために、２つの中空ファイバー運転を行う。１つの運転は、少数の細胞を播種し、そしてもう１つは、多数の細胞を播種する。各培養の進行を、毎日のグルコース消費および乳酸塩生産レベルを分析することにより追跡する。この実験において、１方のHFBには、1.3×10⁷細胞を播種し（低播種培養物を表わす）、他方のHFBには1.6×10⁸細胞を播種した。ここでは、細胞株2x-β-GAL_17-14 は、両方の播種条件下で良好な中空ファイバー運転を開始し得た。より少数の細胞を用いて運転を開始することは、培養を開始するために必要な細胞の数を生成するのに必要な労力を軽減するために主に便利である。しかし、より少数の細胞は、通常最も高い力価を生じる最適の細胞密度に到達するために要する時間を最初に延長する。2x-β-GAL_17-14は、毒性レベルの乳酸塩の蓄積を回避するために、最終的に500mLの培地交換を毎日必要とする中空ファイバー培養によく適応した。毎日の乳酸塩生産が安定水準に達し、そしてピークの力価産生の低下は、最大細胞密度および相対的な培地の健康状態に相関した。 iii．最適力価濃度、回収の頻度、および全回収量上記実験についてのβ-gal力価を、形質導入の48時間または72時間後にアッセイされた293細胞における凍結したサンプルから決定した。形質導入した細胞を、β-gal活性について染色し、そして血球計で計数し、青色細胞の数/mL(BCT/mL )に基づいて力価を得た。最適力価は、一般に、293細胞において、高播種培養物の７日目に、72時間青色細胞力価から1.8×10⁸BCT/mLで得られた。最初に10倍低い播種密度で播種した２連の培養物は、48時間青色細胞力価から5.2×10⁷BCT/mL でピークに達した。HT1080細胞（約５×10⁶BCT/mLであると計算されている）について48時間青色細胞力価を用いて力価決定された平面ストック培養（組織培養ディッシュまたはフラスコ由来）と比較して、中空ファイバー系を用いることによる力価の増加は、約10倍高い。観察されたこれらの最大力価には、次の週に生産される力価を減少させるようである20mmol/Lの乳酸塩レベルに達する前に到達した。粗製上清を、力価のいかなる損失をも伴わずに９時間毎に回収し得、そして１日あたり３回の回収が、最少の力価の損失で可能であるべきである。さらに、継続的な中空ファイバー培養物を、数週間維持し得る。力価を低播種培養物と高播種培養物との間で比較した場合、２つの播種培養物の間で、11日目までにほとんど差はなく、両方の平均は４×10⁷BCT/mLであった。実施例７組換えレトロウイルスの２相精製Ａ．DA/ND-7 組換え粒子の濃縮 1.25×10⁶cfu/mlの力価で、DX/ND-7ベクターを含む1400mlの培地（５％のウシ胎児血清を含むDMEM）を開始材料として使用する。300mlの２相分配成分（PEG-8 000(オートクレーブした)、硫酸デキストラン、およびNaCl）を、最終濃度が6.5 ％のPEG、0.4％の硫酸デキストラン、および0.3M NaClになるように添加する。得られた溶液を、２リットルの分液ロート中に入れ、そして24時間コールドルームで放置する（約６〜16時間の間隔で２回の混合工程を含む）。 24時間後、下層（約20mL）を慎重に抜き取り、そしてこの中間相（約１mL）を 15mLのコニカルFALCONチューブに回収する。ベクターを含む中間相を、PBSを添加することにより10mLに希釈し、そしてこの溶液を室温に戻すために37℃でインキュベートし、そしてミセルを不安定化する。希釈した中間相の半分に対して、KClを最終濃度が0.4Mになるまで添加し、そして、良く混合する。次いで、このチューブを氷上に10分間置き、そして卓上遠心分離機で2,000rpmで２分間スピンする。この上清を取り出し、そして0.45μm のシリンジフィルターにて濾過する。ベクターを含む中間相の他方の半分を、１ × PBSにおけるS-500 Sephadexクロマトグラフィーにより分離する。BCFUアッセイにおいて決定されたように、これらの濃縮プロセスの結果を以下の表６に示す：要約すると、KCl分離を最終工程として利用する場合、組換えレトロウイルス粒子を含む1.4リットルの粗製の研究グレードの上清を、10mLの容量まで減少し得、約50％(+/-20％)が回収される。S-500クロマトグラフィーを最終工程として利用する場合、最初の組換えレトロウイルス粒子のうちの約10％のみが14mLの中に回収される。レトロウイルスベクター粒子の濃縮を完全にするために、MYメンブレンAmicon フィルターを利用して、ベクター含有溶液をさらに濃縮に供し得、これにより、容量10〜14mLを１mL未満に減少させ得る。実施例８細胞ファクトリーを利用するDX/ND7B-GALクローン87由来のベクターの産生 DX/ND7bGALクローン87（発現ベクター）を、細胞ファクトリーで増殖させた。 20の10層細胞ファクトリー（NUNC）に1:3希釈で播種するために十分な細胞を得るまで、細胞をローラーボトル中でウシ胎児血清を補充したDMEMで増殖させた。各々の10層細胞ファクトリーを、約0.8リットルの細胞培地で播種する。懸濁液が均等に10層に満たされるように、ファクトリー内に細胞を含む培地を注入することにより、細胞ファクトリー内に細胞を播種した。次いで、このファクトリーを、懸濁液が共通のチューブ中に再分配するのを防ぐために、出入口側から離して慎重に傾斜させる。最後に、この細胞ファクトリーを、その最終的な直立位置で循環させる。hepaventフィルターを各々の出入口に取り付ける。次いで、このファクトリーをCO₂インキュベーター内に置いた。３日目および続く３日間それぞれに、ベクターを含む上清を回収した。細胞ファクトリーを、組織培養フード内に置く。１つのフィルターを取り出し、そして滅菌した輸送チューブを開口部に接続する。チューブ内に上清を排出するためにこのファクトリーを持ち上げる。約２リットルの上清を各々のファクトリーから回収する。新鮮なDMEM/FBSを用いて失われた培地を再補充する。輸送チューブを取り除き、そしてこのファクトリーをインキュベーター内に再び置く。20の細胞ファクトリーから約90リットルのベクター含有粗製上清を得た。ベクターの確認を、HT1080細胞の形質導入により実施した。これらの細胞を２日後に回収し、そしてb-galタンパク質について染色した。この上清の力価を２ ×10⁷/mlであると決定した。実施例９低速遠心分離による組換えレトロウイルスの濃縮Ａ．レトロベクター上清の調製プロデューサー細胞株DA/βgalおよびHX/DN-7を、10％ウシ胎児血清と1mM L- グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、および抗生物質を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む培養フラスコおよびローラーボトルでそれぞれ培養した。ウイルスの上清を、フラスコおよびローラーボトルから回収し、そして0.45μmシリンジフィルターを通して濾過した。この濾過した上清を、４℃(HX/ND7)または-70℃（DAβ-gal）での凍結のいずれかで保存を行った。 B. ウイルスの濃縮ウイルスの上清を、50mlの滅菌したOAKRIDGEスクリューキャップチューブに等分し、そしてSorvall遠心分離機内での使用のためのSS34ローター内に設置した。このチューブを16,000rpm(25,000g力)で１時間４℃でスピンした。スピンが完了した際、このチューブを取り出し、上清をデカントし、そして小さな不透明なペレットを上記のDMEM培地に再懸濁した。Ｃ．ウイルス力価決定濃縮したウイルスを、６ウェルプレートにウェルあたり２×10⁵細胞の細胞密度および4μg/mlポリブレンで、24時間前にプレーティングされたHT1080細胞において力価決定した。簡単に述べれば、ウイルス調製物を、1/10〜1/10,000に希釈し、そして50μlの各希釈物を用いて６ウェルプレート中の１ウェルに感染させた。プレートを、37℃で一晩インキュベートした。48時間後、細胞を固定し、そしてX-galで染色した。その結果を以下の表７に示す。表７から明らかなように、ウイルスの回収率は、30％〜99％の範囲であり、最も高い回収率は、ヒトプロデューサー細胞から得られた（HX/ND7;回収率は、91 ％〜99％の範囲であった）。実施例10 限外濾過による組換えレトロウイルスの濃縮組換えレトロウイルスDX/CB-bgalを発現するβ-galを含むS-500で精製した上清、および同一のウイルスを含む部分的に濃縮した上清を、各々0.45μmのフィルターで濾過し、そしてCENTRIPREP-100フィルター(製品 #4308,Amicon,MA)にロードした。この上清を、遠心分離の間を含むこの手順の間中４℃の温度に保った。CENTRIPREPフィルターを500×Gで３回、それぞれ45分間〜60分間スピンした。各々のスピンの間に濾過物をデカントした。このように、保持物を連続的に減少させ、その結果、最初の15mL（または10mL）の容量を、単位あたり約0.6mLに減少した。結果として生じた力価を、ウイルスサンプルの形質導入の24時間前に１ウェルあたり１×10⁵細胞の濃度に設定したHT1080標的細胞をアッセイすることにより決定した。細胞を、１ウェルあたり８μg/mlのポリブレンおよび２mLの増殖培地 (DMEM+10％FBS)の存在下で、形質導入した。以下の表８に示すように、この手順を利用して、約100％のウイルスを回収した（力価はBCFU/mlであることに注意すること）。実施例11 バイオリアクターにおける組換えレトロウイルスの調製Ａ．凍結プロトコル１×10⁷細胞/ml/バイアルの濃度で、プロデューサー細胞を、10％〜20％のFBS 、および５％〜15％のDMSOを含むDMEM培地中で凍結した。細胞を速度制御フリーザー（Series PC,Controlled Rate Freezing System,Custom Biogenic Systems, Warren MI）で１分間あたり１℃〜10℃の速度で凍結する。凍結細胞を液体窒素中で保存する。Ｂ．バイオリアクタープロトコル細胞を凍結バイアルから37℃で融解し、DMSOを除去するために培地で１度洗浄し、そして850cm²「FALCON」ローラーボトル（Corning,Corning,NY）中で拡大する。拡大した細胞培養物を用いて、「CELLIGEN PLUS」バイオリアクター(５リットル作動容量;New Brunswick,Edison,NJ)に接種する。この細胞を、３〜15g/Lマイクロキャリアの濃度でマイクロキャリア（すなわち、Cytodex 1またはCytodex 2;Pharmacia,Piscataway,N.J.）上で増殖させる。最初の接種密度は、２〜24時間について半分から全容量において４〜９細胞/ビーズである。ウイルス産物のためのこの培地構成成分は、FBS(10％〜20％)、グルタミン(8〜15mM)、グルコース(4.5〜6.5g/L)、非必須アミノ酸(1×)、RPMI 1640アミノ酸(0.2〜9.6×)、10m M HEPES、RPMI 1640ビタミン(0.2〜5×)を補充したDMEM高グルコース基礎培地（ Irvine Scientific,Santa Ana,CA.）である。培養の間、pH（6.9〜7.6）および溶存酸素（「DO」５〜90％）を、空気、酸素、窒素、および二酸化炭素を含む４つのガスシステムの使用により制御する。次いで、回分増殖の数日後、0.5〜2.5容量/日の灌流速度を段階的に増加させて、培養物を同時の連続回収により新鮮な培地で継続的に灌流する。細胞の保持は、デカントしたカラム中の細胞で覆われたビーズの差別的な沈降の結果である。操作の間、バイオリアクターを、生存細胞、力価、グルコース、乳酸塩、アンモニアレベル、および汚染がないかについてモニターする。生存細胞および力価は、１×10⁵細胞/ml〜１×10⁷細胞/mlの範囲である。グルコースは、６〜0.25g/ Lの範囲であり、乳酸塩は１〜25mMの範囲であり、そしてアンモニアは、0.5〜30 mMの範囲である。細胞を、バイオリアクター中で５〜25日間インキュベートする。＊＊＊本発明を、一般的に、および好ましい実施態様に関しての両方で記載したが、その変化および改変が、上記説明に照らして、当業者に考えられることが認識される。従って、添付の請求の範囲が、請求される本発明の範囲内にあるこのような全ての変化を包含することが意図される。さらに、本発明の背景を明らかにするため、特に、詳細な説明および実施例において記載されるように、その実施に関するさらなる詳細を提供するために引用される刊行物および他の資料は、本明細書中において、その全体が参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＮＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＮＡＤＵＡＤＵＡＤＹＡＤＹＡＤＺＡＤＺＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．形質導入された哺乳動物Ｔ細胞または分裂中でない細胞を生成するための方法であって、該方法は以下の工程：（ａ）患者から、Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団を得る工程；および（ｂ）複製可能なレトロウイルスが実質的に混入していない高力価組換えレトロウイルス粒子の調製物で該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団をエクスビボで形質導入する工程であって、ここで該組換えレトロウイルス粒子は、目的の遺伝子をコードするベクター構築物を有する工程、を包含する、方法。２．前記Ｔ細胞が単離されたCD4+Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。３．前記Ｔ細胞が単離されたCD8+Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。４．前記目的の遺伝子が、サイトカイン、コロニー刺激因子、凝固因子、およびホルモンからなる群より選択されるタンパク質またはタンパク質の活性部分をコードする、請求項１に記載の方法。５．前記凝固因子が、第VIII因子である、請求項４に記載の方法。６．前記患者が、遺伝的疾患、ガン、感染性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、変性性疾患、および炎症性疾患からなる群より選択される疾患に罹患しているヒトである、請求項１に記載の方法。７．複製可能なレトロウイルスが実質的に混入していない高力価組換えレトロウイルス粒子の調製物でエクスビボで形質導入された、哺乳動物Ｔ細胞または分裂中でない細胞の単離された集団を含有する組成物であって、該組換え粒子が目的の遺伝子をコードするベクター構築物を有する、組成物。８．前記Ｔ細胞が単離されたCD4+Ｔ細胞である、請求項７に記載の組成物。９．前記Ｔ細胞が単離されたCD8+Ｔ細胞である、請求項７に記載の組成物。１０．前記目的の遺伝子が、サイトカイン、コロニー刺激因子、凝固因子、およびホルモンからなる群より選択されるタンパク質またはタンパク質の活性部分をコードする、請求項７に記載の組成物。１１．前記凝固因子が第VIII因子である、請求項１０に記載の組成物。１２．前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項７に記載の組成物。１３．複製可能なレトロウイルスが実質的に混入していない高力価組換えレトロウイルス粒子の調製物でエクスビボで形質導入された、哺乳動物Ｔ細胞または分裂中でない細胞であって、該組換えレトロウイルス粒子が目的の遺伝子をコードするベクター構築物を有する、Ｔ細胞または分裂中でない細胞。１４．前記Ｔ細胞が単離されたCD4+Ｔ細胞の集団である、請求項１３に記載のＴ細胞。１５．前記Ｔ細胞が単離されたCD8+Ｔ細胞の集団である、請求項１３に記載のＴ細胞。１６．前記目的の遺伝子が、サイトカイン、コロニー刺激因子、凝固因子、およびホルモンからなる群より選択されるタンパク質またはタンパク質の活性部分をコードする、請求項１３に記載のＴ細胞または分裂中でない細胞。１７．前記凝固因子が第VIII因子である、請求項１６に記載のＴ細胞または分裂中でない細胞。１８．遺伝的疾患を有する患者を処置する方法であって、該方法は以下の工程：（ａ）該患者から、Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団を得る工程；（ｂ）複製可能なレトロウイルスが実質的に混入していない高力価組換えレトロウイルス粒子の調製物で該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団をエクスビボで形質導入する工程であって、ここで該組換えレトロウイルス粒子は、該遺伝的疾患を処置するのに有用な目的の遺伝子をコードするベクター構築物を有する工程；および（ｃ）形質導入された該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団の治療有効量を該患者に再導入する工程、を包含する、方法。１９．前記細胞集団が、Ｔ細胞集団である、請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記疾患がADA欠損症であり、そして前記目的の遺伝子がADAである、方法。２０．前記患者への前記形質導入されたＴ細胞、分裂中でない細胞の再導入の前に、該細胞の集団を拡大する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。２１．ガンを有する患者を処置する方法であって、該方法は以下の工程：（ａ）該患者から、Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団を得る工程；（ｂ）複製可能なレトロウイルスが実質的に混入していない高力価組換えレトロウイルス粒子の調製物で該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団をエクスビボで形質導入する工程であって、ここで該組換えレトロウイルス粒子は、ガンを処置するのに有用な目的の遺伝子をコードするベクター構築物を有する工程；および（ｃ）形質導入された該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団の治療有効量を該患者に再導入する工程、を包含する、方法。２２．感染性疾患を有する患者を処置する方法であって、該方法は以下の工程：（ａ）該患者から、Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団を得る工程；（ｂ）複製可能なレトロウイルスが実質的に混入していない高力価組換えレトロウイルス粒子の調製物で該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団をエクスビボで形質導入する工程であって、ここで該組換えレトロウイルス粒子は、該感染性疾患を処置するのに有用な目的の遺伝子をコードするベクター構築物を有する工程；および（ｃ）形質導入された該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団の治療有効量を該患者に再導入する工程、を包含する、方法。２３．前記細胞集団がＴ細胞集団である、請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記感染性疾患がAIDSであり、そして前記目的の遺伝子が変異体HIVタンパク質をコードする、方法。２４．前記細胞集団がＴ細胞集団である、請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記感染性疾患がAIDSであり、そして前記目的の遺伝子がリボザイムをコードする、方法。２５．前記細胞集団がＴ細胞集団である、請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記感染性疾患がAIDSであり、そして前記目的の遺伝子が合成または天然に存在するＴ細胞レセプターをコードする、方法。２６．炎症性疾患を有する患者を処置する方法であって、該方法は以下の工程：（ａ）該患者から、Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団を得る工程；（ｂ）複製可能なレトロウイルスが実質的に混入していない高力価組換えレトロウイルス粒子の調製物で該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団をエクスビボで形質導入する工程であって、ここで該組換えレトロウイルス粒子は、該炎症性疾患を処置するのに有用な目的の遺伝子をコードするベクター構築物を有する工程；および（ｃ）形質導入された該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団の治療有効量を該患者に再導入する工程、を包含する、方法。２７．変性性疾患を有する患者を処置する方法であって、該方法は以下の工程：（ａ）該患者から、Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団を得る工程；（ｂ）複製可能なレトロウイルスが実質的に混入していない高力価組換えレトロウイルス粒子の調製物で該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団をエクスビボで形質導入する工程であって、ここで該組換えレトロウイルス粒子は、変性性疾患を処置するのに有用な目的の遺伝子をコードするベクター構築物を有する工程；および（ｃ）形質導入された該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団の治療有効量を該患者に再導入する工程、を包含する、方法。２８．心血管疾患を有する患者を処置する方法であって、該方法は以下の工程：（ａ）該患者から、Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団を得る工程；（ｂ）複製可能なレトロウイルスが実質的に混入していない高力価組換えレトロウイルス粒子の調製物で該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団をエクスビボで形質導入する工程であって、ここで該組換えレトロウイルス粒子は、心血管疾患を処置するのに有用な目的の遺伝子をコードするベクター構築物を有する工程；および（ｃ）形質導入された該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団の治療有効量を該患者に再導入する工程、を包含する、方法。２９．前記細胞集団がＴ細胞集団である、請求項２６に記載の方法であって、ここで、前記心血管疾患が高脂血症であり、そして前記目的の遺伝子がアポリポタンパク質Ｅをコードする、方法。３０．自己免疫性疾患を有する患者を処置する方法であって、該方法は以下の工程：（ａ）該患者から、Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団を得る工程；（ｂ）複製可能なレトロウイルスが実質的に混入していない高力価組換えレトロウイルス粒子の調製物で該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団をエクスビボで形質導入する工程であって、ここで該組換えレトロウイルス粒子は、該自己免疫性疾患を処置するのに有用な目的の遺伝子をコードするベクター構築物を有する工程；および（ｃ）形質導入された該Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団の治療有効量を該患者に再導入する工程、を包含する、方法。３１．患者中のＴ細胞または分裂中でない細胞の集団の活性を調整する方法であって、該方法は以下の工程：（ａ）該患者から、Ｔ細胞または分裂中でない細胞の集団を得る工程；（ｂ）複製可能なレトロウイルスが実質的に混入していない高力価組換えレトロウイルス粒子の調製物で該細胞の集団をエクスビボで形質導入する工程であって、ここで該組換えレトロウイルス粒子は、プロドラッグを活性化し得るタンパク質をコードするベクター構築物を有する工程；（ｃ）該細胞の集団を該患者に再導入する工程；および（ｄ）該患者に該プロドラッグを投与する工程、を包含する、方法。３２．前記タンパク質がチミジンキナーゼである、請求項３１に記載の方法。３３．前記高力価組換えレトロウイルス粒子のエンベロープタンパク質が、Ｃ型レトロウイルスまたはＤ型レトロウイルス由来のエンベロープタンパク質である、請求項１に記載の方法。３４．前記高力価組換えレトロウイルス粒子のエンベロープタンパク質が、レトロウイルスアンフォトロピックエンベロープタンパク質、レトロウイルスエコトロピックエンベロープタンパク質、レトロウイルスポリトロピックエンベロープタンパク質、レトロウイルスキセノトロピックエンベロープタンパク質、テナガザル白血病ウイルスエンベロープタンパク質、およびVSV-gタンパク質からなる群より選択されるエンベロープタンパク質である、請求項１に記載の方法。