JPH10512243A

JPH10512243A - 遺伝子送達ビヒクルの非外傷性投与

Info

Publication number: JPH10512243A
Application number: JP8521148A
Authority: JP
Inventors: エス．ソング，エリザベス; ジェイ．コワル，キーロン; ジェイ．ジョリー，ダグラス; モンティサノ，ドミニク
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1994-12-30
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 1998-11-24
Also published as: WO1996020732A3; AU4743196A; EP0800403A2; WO1996020732A2

Abstract

(57)【要約】１つ以上の遺伝子送達ビヒクル（「GDV」）の動物への非外傷性投与。このような非外傷性投与は、以前の投与方法に対して顕著な利点を提供する。なぜなら、本発明の投与は、いかなる注射または患者への他の侵入をも必要とせず、それゆえ患者への損傷がずっと少ないためである。さらに、注射または侵入がないために、代表的には、GDVを投与するために非常に熟練した者の必要性がより少なく、滅菌状態の必要性はより少なく、そして感染、損傷、および他の副作用の危険性がより少ない。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子送達ビヒクルの非外傷性投与発明の分野本発明の分野は、所望の物質の発現または特定の核酸配列内に組み込む能力のような、所望の性質を有する核酸配列を含有する組換え核酸ベクターおよび他のビヒクルの動物内への投与である。発明の背景所望の核酸分子の操作を含むバイオテクノロジーの分野における最近の進歩は、例えば癌、遺伝的疾患、関節炎、およびAIDSのような疾患の処置において顕著な進歩を生じた。これらの進歩の多くは、被験体、特にヒト被験体への所望の核酸分子の投与を含む。このような核酸分子の、経口投与のような、非外傷性（非経口でない）投与は、簡便で、容易で、損傷の少ない分子の投与を提供し得、そしてまた無菌操作の必要性を減少させ得る。しかし、非外傷性投与の利点にもかかわらず、このような疾患または他の病原性状態の処置に適切な所望の核酸は、非外傷性経路によって投与されなかった。なぜなら、核酸は、不可欠な薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物と組み合わせるために適切な単離、精製、乾燥形態で得られず、その上、口、胃、および腸を通過する際の厳しさ（極端なpH）に耐えられ得なかったからである。例えば、錠剤およびカプセルのような送達系の物理的調製では、伝統的に、有効成分および賦形剤が無水の形態であることが要求される。残留水は、投薬調製物を攻撃して不安定な産物を生じる。さらに、送達系に加えて、核酸分子および産物は、全体として、乾燥状態において安定でなければならない。核酸分子が水性の環境で保存される場合、分子は代表的には低温においてのみ安定であるために、このことはこのような分子について特に重要である。従って、非外傷性投与に適切な所望の核酸分子を含有する組成物、およびこのような分子を非外傷的に投与する方法が必要である。本発明は、核酸分子を非外傷的に投与するこのような方法、錠剤の便利な製造を可能にするために十分に単離および精製されたこのような核酸分子を含有する組成物、および関連する他の利点を提供する。発明の要旨１つの局面において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物と組み合わせて遺伝子送達ビヒクルを含有する組成物を、動物に非外傷的に投与する工程を含む、動物または患者に核酸分子を導入する方法に関する。この遺伝子送達ビヒクルは、遺伝子送達ビヒクルを含む宿主細胞内で、少なくとも１つの物質の発現を指向する。この物質は、本来は遺伝子送達ビヒクルにより発現されない。別の局面において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物と組み合わせて遺伝子送達ビヒクルを含有する組成物を、動物に非外傷的に投与する工程を含む、動物または患者に核酸分子を導入する方法に関する。この遺伝子送達ビヒクルは、少なくとも１つの生物学的に活性な核酸配列を含有し、ここで、このような生物学的活性は、本来は遺伝子送達ビヒクルに含まれない。さらなる局面において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物と組み合わせて遺伝子送達ビヒクルを含有する組成物を、動物に非外傷的に投与する工程を含む、動物または患者に核酸分子を導入する方法に関する。この遺伝子送達ビヒクルは、本来は遺伝子送達ビヒクル内に含まれない核酸配列を含有する。好ましい実施態様において、本発明は、上に記載のような方法を包含し、ここでこの薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物は、遺伝子送達ビヒクルの非外傷性投与を促進する。他の好ましい実施態様において、上に記載の方法では、物質または生物学的活性は、非外傷性投与の前には、GDVを含有する宿主細胞において示されない。さらなる実施態様において、生物学的活性は、非外傷性投与の前には動物内では示されない。別の実施態様において、生物学的活性は、非外傷性投与の前には、動物内では、減少するかまたは最適状態に達しない。他の好ましい実施態様において、上に記載の方法では、生物学的活性は、非外傷性投与前の動物中の宿主細胞内に存在する生物学的活性を、補足、活性化、置換、および／または抑制する。さらなる局面において、本発明は、動物への核酸分子の非外傷性投与に適切な組成物を提供する。この組成物は、遺伝子送達ビヒクルを含む宿主細胞内で、少なくとも１つの物質の発現を指向するか、または生物学的に活性な核酸分子をコードする、無水の凍結乾燥した遺伝子送達ビヒクルを、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物と組み合わせて含有する。この物質または生物学的に活性な核酸分子は、遺伝子送達ビヒクルによって天然には発現されないが、またはこのビヒクル内に天然に含まれない。本発明のこれらまたは他の局面は、以下の詳細な説明を参照すれば明らかになる。さらに、特定の手順または組成物を詳細に記載する様々な参考文献が本明細書中に記載される；このような参考文献は、その全体が参考として援用される。図面の簡単な説明図１は、p31N2R5(+)の概略図である。図２は、pN2R3(-)の概略図である。図３は、p31N25Δ(+)の概略図である。図４は、pN2R3(+)の概略図である。図５は、pN2R5(-)の概略図である。図６は、p31N25Δ(+)の概略図である。図７は、pTKΔAの概略図である。図８は、pPrTKΔAの概略図である。図９は、pTK-1およびpTK-3の概略図である。図10は、CT26、CT26 β-galおよびCT26TK Neo細胞に対するガンシクロビルの効果を示す棒グラフである。図11は、CT26TK Neoを注入したマウスのガンシクロビル用量研究における腫瘍容量の経時的な効果を示すグラフである。図12は、腹膜内腫瘍増殖におけるガンシクロビルの異なる用量レジメンの効果を示すマウスの一連の４枚の写真である。図13は、皮下腫瘍増殖におけるガンシクロビルの異なる用量レジメンの効果を示すマウスの一連の４枚の写真である。図14は、CT26TK Neo細胞に対するCT26におけるガンシクロビルの効果を示すグラフである。図15は、マンニトールを含有する処方緩衝液内で凍結乾燥した代表的な組換えレトロウイルスの再構成の際のウイルス活性の保持を示すグラフである。図16は、ラクトースを含有する処方緩衝液内で凍結乾燥した代表的な組換えレトロウイルスの再構成の際のウイルス活性の保持を示すグラフである。図17は、トレハロースを含有する処方緩衝液内で凍結乾燥した代表的な組換えレトロウイルスの再構成の際のウイルス活性の保持を示すグラフである。図18A〜18Dは、種々の糖類を用いて−20℃で保存した凍結乾燥処方組換えレトロウイルスに対する−80℃で保存した液体の凍結乾燥していない組換えレトロウイルスの安定性を比較する代表的なグラフである。比較を容易にするために、力価を標準化した。発明の詳細な説明本発明は、動物への１つ以上の遺伝子送達ビヒクル（「GDV」）の非外傷性投与に関する。このような非外傷性投与は、以前の投与方法に対して顕著な利点を提供する。なぜなら、本発明の投与は、いかなる注射または患者への他の侵入をも必要とせず、それゆえ患者への損傷がずっと少ないためである。さらに、注射または侵入がないために、代表的には、GDVを投与するために非常に熟練した者の必要性がより少なく、滅菌状態の必要性はより少なく、そして感染、損傷、および他の副作用の危険性がより少ない。Ｉ．遺伝子送達ビヒクル「遺伝子送達ビヒクル」は、ウイルスベクター、核酸ベクター（例えば、プラスミドなど）のような組換え体ビヒクル、遺伝子のような裸の核酸分子、核酸分子上の負の荷電を中和して核酸分子をコンパクトな分子に凝集し得るポリカチオン性分子と複合体化した核酸分子、細菌、および生物において１つ以上の所望の特性を有する核酸分子を宿主細胞に送達し得るプロデユーサー細胞のような特定の真核生物細胞である。以下においてさらに説明するように、所望の特性としては、タンパク質、酵素または抗体などの所望の物質を発現する能力および／または生物学的活性を提供する能力が挙げられる。この生物学的活性とは、GDVに保有される核酸分子が所望の物質の発現を必要とせずにそれ自体、活性剤であることである。このような生物学的活性の一例は、送達された核酸分子を特定の遺伝子に組み込むことにより、この遺伝子を不活性化し、そして遺伝子が生成している産物を「停止（turn off）」する遺伝子療法である。代表的に、GDVは核酸分子（または配列）を保有する集合体であり、このような分子は、しばしば、目的の配列または遺伝子を発現し得る。タンパク質発現と関連して、GDVは、例えば、RNAポリメラーゼIIまたはRNAレプリカーゼのためのプロモーターエレメントを含んでいなければならず、そしてポリアデニル化を指向するシグナルを含み得る。さらに、GDVは、転写された場合、好ましくは、目的の分子または遺伝子に作動可能に連結され、そして翻訳開始配列として機能する分子を含む。GDVは、ネオマイシン、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノールまたはジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）のような選択マーカー、ならびに１つ以上の制限部位および翻訳終結配列を含み得る。さらに、GDVを使用してレトロウイルス粒子を産生する場合、GDVは、レトロウイルスパッケージングシグナルおよび使用するレトロウイルスに適したLTRが存在していなければ、これらを含まなければならない。GDVはまた、その他のウイルスベクターと組み合わせて使用されるか、または後述するように細胞または組織に物理的に挿入され得る。GDVは、タンパク質もしくはタンパク質の活性部分、アンチセンスまたはリボザイムをコードする配列を含有し得る。このような配列は、細胞傷害性Ｔリンパ球の移植組織に対する免疫応答を抑制するために、MH C抗原提示を阻害するように設計され得る。本発明において、GDVとして使用するのに特に好ましいウイルスベクターとしては、組換えレトロウイルスベクターおよび組換えアデノウイルスベクターが挙げられる。組換えレトロウイルスベクターの構築については、「組換えレトロウイルス」という名称の出願（本願で引用される当該引例およびすべての他の引例は、全体が本明細書中において援用される）により詳細に説明されている。これらの組換えレトロウイルスベクターを使用し、これを適切なパッケージング細胞株に導入することによって形質導入可能なレトロウイルスベクター粒子を生成し得る。同様に、本明細書中において提示される開示内容を考慮すれば、アデノウイルスベクターも容易に調製し利用し得る（Berkner，Biotechniques 6:616-627 ，1988およびRosenfeldら，Science 252:431-434，1991，WO 93/07283、WO 93/0 6223およびWO 93/07282も参照のこと）。別の好ましい実施態様では、GDVは、順に、シンドビスウイルスの転写を開始し得る5'配列、シンドビス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ウイルス接合領域、異種配列、シンドビスRNAポリメラーゼ認識配列、および25個の連続ポリアデニル酸残基のストレッチを含むシンドビスRNA発現ベクターである。種々の異種配列がGDVに含まれ得る。本発明の種々の実施態様において、GDV は２つ以上の異種配列を含有し得る（および特定の実施態様の範囲内で発現させ得る）。本発明で使用するに適切なその他のウイルスベクターとしては、例えばポリオウイルス（Evansら，Nature 339:385-388，1989およびSabin，J．of Biol．Stan dardization 1:115-118，1973）；ライノウイルス（Arnold，J．Cell．Biochem ．L401-405，1990）；カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルスのようなポックスウイルス（Fisher-Hochら，PNAS 86:317-321，1989; Flexnerら，A nn．N.Y．Acad．Sci．569:86-103，1989; Flexnerら，Vaccine ８:17-21，1990; 米国特許第4,603,112号および同第4,769,330号;WO 89/01973）、SV40（Mulliga nら，Nature 277:108-114，1979）；インフルエンザウイルス（Luytjesら，Cell 59:1107-1113，1989; McMichealら，The New England Journal of Medicine 30 9:13-17，1983; およびYapら，Nature 273:238-239，1978）；アデノ関連ウイルスのようなパルボウイルス（Samulskiら，Journal of Virology 63:3822-3828,1 989,およびMendelsonら，Virology 166:154-165，1988）；ヘルペス（Kit，Adv ．Exp．Med．Biol．215:219-236，1989）；HIV；麻疹（EP 0 440,219）；麻疹（ EP 0 440,219）；アストロウイルス（Munroe，S.S.ら，J．Vir．67:3611-3614， 1993）；セムリキ森林ウイルスおよびコロナウイルスならびにその他のウイルス系(例えば、EP 0,440,219; WO 92/06693; 米国特許第5,166,057号)が挙げられる。さらに、ウイルスキャリアは、同種で非病原性（不完全な）の複製可能ウイルス（例えば、Overbaughら，Science 239:906-910，1988）であり得る。 GDVがレトロウイルスベクターである好ましい実施態様において、このレトロウイルスベクターに保有されている核酸分子は、生ウイルスの産生を可能にするのに十分な大きさのものであるべきである。本発明に関して言えば、感受性単層上で感染性ウイルスの測定可能な任意の力価が生成すれば、「生ウイルスの産生」が考えられる。好ましい実施態様の範囲内において、レトロウイルスベクター GDV内の異種配列は、少なくとも100塩基、少なくとも２kb、3.5kb、５kbもしくは７kb、または少なくとも８kbの異種配列を含有する。ウイルスカプシドまたは細菌細胞膜のような任意の被覆のない核酸分子も本発明においてGDVとして使用するのに適している。このような「裸の」核酸には、プラスミド、被覆のないウイルスベクター、および任意の制御領域のない裸の遺伝子も含まれる。GDVはDNAまたはRNAのいずれであってもよく、またはこれら２つの組み合わせ（１つの分子にDNAとRNAとの両方を含む）であり得る。別の代わりの他の実施態様において、GDVはリポソームである。リポソームは、脂質二重層によって囲まれた水性画分からなる小さな脂質ベシクルであり、代表的には、球状またはわずかに細長い構造を有し、直径数百オングストロームである。リポソームは、いくつかの容易に利用される特徴を示す。適切な条件下で、リポソームは、標的細胞の原形質膜と、またはリポソームを内在化した細胞におけるエンドサイトーシスによるベシクルの膜と融合し得、これによってその内容物を細胞質に排出し得る。しかし、標的細胞の表面との相互作用の前に、リポソーム膜は、例えば、細胞質中の分解酵素からその内容物を隔離して保護する比較的不透過性の障壁として機能する。このため、リポソームは「マイクロピル（ micropill）」とも呼ばれる。さらに、リポソームは合成的な構造を有するため、特別に処方したリポソームは所望の特徴を有するように設計され得る（Stryer ，L.，Biochemistry，236-240頁 1975（W.H．Freeman，San Francisco）; Szoka ら，Biochim．Biophys．Acta．600: 1-18(1980); Bayerら，Biochim．Biophys． Acta．550:464(1979); Rivnayら，Meth．Enzymol．149:119(1987); Wangら，PNA S 84:7851，1987およびPlantら，Anal．Biochem．176:420(1989)。本発明において、GDVとして使用するに適した細菌細胞としては、抗腫瘍剤のような細胞傷害性物質を細菌の表面上で発現するか、または細菌から搬出される細胞傷害性物質を発現する細菌が挙げられる。代表的な例としては、BCG（Stove r，Nature 351:456-458，1991）およびサルモネラ（Newtonら，Science 244:70- 72，1989）が挙げられる。本発明において使用するに適切な真核細胞は、プロデューサー細胞およびエクスビボで形質導入された細胞を含む。本発明の１つの実施態様において、GDVは、事象特異的なプロモーターの活性化により核酸分子が発現されるような、事象特異的なプロモーターの転写制御条件下の核酸分子を含有する。本発明に関して数多くの事象特異的なプロモーターを利用し得、例えば、チミジンキナーゼまたはチミジル酸シンテターゼプロモーターのような細胞増殖によって活性化される（あるいはそうでなければ、細胞周期依存性）プロモーター（Merrill，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:4987-91， 1989; Dengら，Mol．Cell．Biol．９:4079-82，1989）；細胞がウイルスに感染した際に活性化されるα-またはβ-インターフェロンプロモーターのようなプロモーター（FanおよびManiatis，EMBO J．８(１):101-110，1989; Goodbournら C ell 45:601-610，1986）；およびホルモンが存在することで活性化されるプロモーター（例えば、エストロゲン応答プロモーター;Tooheyら，Mol．Cell．Biol．６:4526-38，1986を参照のこと）が挙げられる。好ましい実施態様において、組換えウイルスベクター（好ましいが、必ずしも必要ではない、組換えMLVレトロウイルス）は、細胞周期依存性プロモーター（例えば、ヒト細胞チミジンキナーゼまたはトランスフェリンレセプタープロモーター）のような事象特異的なプロモーターから発現される遺伝子を保有する。これは、主に腫瘍のような増殖細胞において転写的に活性なものである。このように、これらのプロモーターからの転写を活性化し得る因子を含む複製細胞は、GD Vによつて産生される物質によって優先的に影響を受ける（例えば破壊される）。本発明の別の実施態様において、GDVは、組織特異的なプロモーターの活性化により核酸分子が発現されるような、組織特異的プロモーターの転写制御条件下の核酸分子を含有する。本発明に関して、種々の組織特異的プロモーターが利用され得る。このようなプロモーターの代表的な例としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Hatzogiouら，J．Biol．Chem．263:17798-808，198 8; Benvenistyら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:1118-22，1989; Vaulontら，Mol．Cell．Biol．９:4409-15，1989）、アルブミンプロモーター、およびα フェトプロテインプロモーター(AFP)（Feuermanら，Mol．Cell．Biol．９:4204- 12，1989; CamperおよびTilghman，Genes Develop．３:537-46，1989）；IgGプロモーターのようなＢ細胞特異的プロモーター；ガン胎児性抗原（CEA）プロモーター（Schreweら，Mol．and Cell．Biol．10:2738，1990）のような乳癌腫または肝細胞癌腫に特異的なプロモーター；エラスターゼプロモーターのような膵臓腺房細胞特異的プロモーター（Swiftら，Genes Develop．３:687-96，1989）；カゼインプロモーターのような乳上皮特異的プロモーター（Dopplerら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86:104-08，1989）；ポルフォビリノーゲンデアミナーゼプロモーターのような、赤血球細胞において活性な赤血球特異的転写プロモーター（Mignotteら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:6458-52，1990）；α-またはβ-グロビン特異的プロモーター（van Assendelftら，Cell 56:969-77，1989 ，Forresterら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:5439-43，1989）；ミオＤ結合部位のような、骨格筋を調節するプロモーター（Burden，Nature 341:716，1989 ; Weintraubら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:5434-38，1989）；インスリンプロモーターのような、膵臓のβ細胞に特異的なプロモーター（Ohlssonら，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 85:4228-31，1988; Karlssonら，Mol．Cell．Biol．９:823-27，1989）；成長ホルモン因子プロモーターのような、脳下垂体に特異的なプロモーター（Ingrahamら，Cell 55:519-29，1988; Bodnerら，Cell 55:50 5-18，1988）；チロシンヒドロキシラーゼプロモーターのような、メラニン形成細胞に特異的なプロモーター；HER2/neuプロモーターのような乳癌腫特異的プロモーター（Talら，Mol．and Cell．Biol．7:2597，1987）；アルコール脱水素酵素プロモーター（Felder，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:5903-07，1989）のような肝臓特異的プロモーター；Ｔ細胞レセプタープロモーターのようなＴ細胞特異的プロモーター（Andersonら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:3551-54，1 988; W inotoおよびBaltimore，EMBO J．8:729-33，1989）；オステオカルシンプロモーターのような骨芽細胞または骨特異的プロモーター（Markoseら，Proc．Natl．A cad．Sci．USA 87:1701-1705，1990; McDonnellら，Mol．Cell．Biol．９:3517- 23，1989; Kernerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:4455-59，1989）、IL-2 プロモーター、IL-2レセプタープロモーター、乳清（WAP）プロモーターおよびM HCクラスIIプロモーターなどが挙げられる。本発明に関して、例えば、βグロビン遺伝子およびＴ細胞マーカーCD2のような遺伝子座規定エレメントを含む遺伝子発現を制御する種々の他のエレメントを利用し得る。さらに、スプライシングおよび核輸送レベルで発現を制御するエレメントは、βグロビンイントロン配列、HIV-1のrevおよびrreエレメント、Ｄ型アカゲザルレトロウイルスのCTEエレメントである。本発明の好ましい実施態様の範囲において、GDVはレトロウイルスベクターであり、遺伝子は腫瘍に対する物質を産生する。この遺伝子は、腫瘍由来の組織に対する特異性を有する組織特異的プロモーターの制御下にある。レトロウイルスベクターは複製中の細胞（例えば、正常な肝細胞はゆっくりと複製するのみであるが、肝細胞癌腫の細胞はより迅速に複製している）のゲノムに優先的に組み込まれるので、このような２種類の特異性レベル（ウイルス組み込み／複製および組織特異的転写調節）によって、腫瘍細胞が優先的に殺傷される。本発明のさらに別の関連する実施態様において、GDVは、事象特異的プロモーターおよび組織特異的プロモーターの両方の活性化により核酸分子が最大に発現されるような、事象特異的プロモーターおよび組織特異的プロモーターの両方の転写制御下の核酸分子を含有する。特に、このようなベクターを利用することで、核酸分子から発現された物質は、両方の特徴（例えば、上記の例では、組み合わされたプロモーターエレメントは急速に分裂する肝細胞においてのみ機能する）を満たす細胞型においてのみ発現される。本発明の好ましい実施態様の範囲において、細胞型特異性の厳密さを改善するために転写プロモーターエレメントの数を増し得る。上記の転写プロモーター／エンハンサーエレメントは、内部プロモーター（例えばレトロウイルスについてはウイルスLTR間に存在する）として存在する必要はないが、改変ウイルスLTRから条件特異的（すなわち、事象または組織特異的）転写発現が直接起こるように、転写制御エレメントを、それ自体が転写プロモーターであるウイルスLTRにおいて添加または置換し得る。この場合、最大発現させるための条件は、レトロウイルスパッケージング細胞株を模倣しているか（例えば、増殖条件を変える、必要な発現トランスレギュレータを供給する、または適切な細胞株をパッケージング株の親として使用する）、または、LTR改変を3 'LTR U3領域に限定し、最大の組換えウイルス力価を得るか、どちらかの必要がある。後者の場合、感染／組み込みが１回行われた後に、その時点で3'LTR U3が 5'LTR U3であれば、所望の組織特異的発現が得られる。同様に、その他のウイルスベクターについても、プロモーターは外因性であるか、または正常なウイルスプロモーターエレメントとのハイブリッドであり得る。また、本発明は真核細胞重層ベクターイニシエーション系も提供する。この系は、5'プロモーター、１つ以上の異種ヌクレオチド配列を発現し得、そして自律的または１つ以上の因子に応答して細胞を複製し得る構築物、ポリアデニル化配列、および転写終結配列を含む。簡単に言うと、真核細胞重層ベクターイニシエーション系によって、異種ヌクレオチド配列の発現を制御する二段階すなわち「層状の」機構が提供される。第１の層は第２の層の転写を開始し、5'プロモーター、ポリアデニル化部位、および転写終結部位、ならびに必要であれば、１つ以上のスプライス部位を含有する。このような目的で用いるに適切なプロモーターの代表的な例としては、CMV、レトロウイルスLTR、SV40、βアクチン、免疫グロブリンプロモーターのようなウイルスまたは細胞プロモーター、ならびにメタロチオネインプロモーターおよびグルココルチコイドプロモーターのような誘導プロモーターが挙げられる。第２の層は、１つ以上の異種ヌクレオチド配列を発現し得、自律的または１つ以上の因子に応答して細胞を複製し得る構築物を含む。本発明の１つの実施態様において、この構築物は上記のシンドビスGVDであり得る。好ましい実施態様において、本発明は、レトロウイルスベクターを包含するGD Vを提供する。このレトロウイルスベクターは、好ましくは、KT-1、KT-3、クロスレス(clossless)骨格ベクター、または組織特異的または事象特異的な発現を促進するプロモーターを用いるベクターを含む群から選択される。さらに、レトロウイルスベクターは、好ましくは、ネオマイシン耐性のようなマーカー遺伝子、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVTK)遺伝子のような「自殺遺伝子」の一方または両方を含む。次いで、これらのGDVは、適切なパッケージング細胞株に導入され、この細胞株は、GDVがそれぞれアンフォトロピック、ゼノトロピック、またはポリトロピックな特徴を示すような、特に所望の特徴を選択し得る。他の適切なパッケージング細胞株は、293 2-3 VSV-G系、および好ましい場所へ（例えば地域のリンパ節または特定の抗原を提示する細胞）ベクターの形質導入の標的化を容易にするために改変されたベクター構造タンパク質を示す細胞株を含む。次いでこの細胞株は、所望の組成物を含むことを確認するために試験され得る。次に、細胞培養物を調製し、レトロウイルスベクターを含む上清液を回収する。この液体はGDV潜在力について試験され得、これは典型的には、適切なコロニー形成単位(CFU)またはプラーク形成単位(PFU)を測定される。１つのアプローチにおいて、GDV自身は宿主細胞または宿主植物への投与の前にはそれ以上プロセスされない。好ましいアプローチにおいて、次いで、このGDVは、投与される前に濃縮、精製、および処方される。 II．非外傷性投与非外傷性投与は、伝統的な非外傷経路（例えば、頬/舌下、直腸、経口、鼻、局所（例えば、経皮および眼）、膣、ならびに肺投与）に従った、本発明のGDV 投与を含む。非外傷性投与はまた、尿道を通る膀胱への送達を含む。従って、GD Vは、切開、注射、または自然にはない開口部への器具の挿入によるような生体への侵入が必要な侵襲性経路を介しては投与されない。このような侵襲性投与経路の例として、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、眼内、および静脈内投与が挙げられる。本発明の組成物を投与するための考慮は、以下を含む。経口投与は、容易でかつ便利であり、経済的で（滅菌は必要とされない）、安全であり（ほとんどの場合において過剰投与量は処理され得る）、そしてこの組成物(GDV)の活性成分の制御された放出を可能にする。一方、局部的刺激（例えば、吐気、嘔吐または下痢、可溶性の乏しい薬物のための迷走性吸収）が存在し得、そしてGDVは肝臓代謝ならびに胃酸および酵素的分解による「初回通過効果」を受ける。さらに、緩慢な作用開始が存在し得、有効血漿レベルが達成されないおそれがあり、患者の協力を必要とし、そして食物は吸収に影響を与え得る。本発明の好ましい実施態様は、エリスロポエチン、インシュリン、GM-CSF、または他のサイトカイン、あるいは種々のポリペプチドまたはペプチドホルモン、それらのアゴニストまたはアンタゴニスト（ここで、これらのホルモンは、組織（例えば、下垂体、視床下部、腎臓、内皮細胞、肝臓、膵臓、骨、造血骨髄、および副腎）由来であり得る）をコードする遺伝子を含むレトロウイルスベクターを含むGDVの経口投与を含む。これらのポリペプチドは、成長の誘導、組織の退行、免疫応答の抑制、アポトーシス、遺伝子発現、レセプター-リガンド相互作用のブロック、免疫応答のために使用され得、そして特定の貧血、糖尿病、感染、高血圧、異常血液化学（例えば、増大した血液コレステロール、血液凝固因子欠損、低下したHDLに伴う増大したLDL）のための処置であり得る。このようなポリペプチドはまた、アルツハイマー関連アミロイドタンパク質のレベル、骨侵食/ カルシウム沈着のレベルを制御するため、および種々の代謝物（例えば、ステロイドホルモン、プリン、およびピリミジン）のレベルを制御するために用いられ得る。好ましくは、レトロウイルスベクターは、まず凍結乾燥され、次いでカプセルの中に満たされ、そして投与される。頬/舌下投与は、組成物の活性成分の急速な作用開始を提供する便利な投与方法であり、そして初回通過代謝を回避する。従って、胃酸または酵素的分解がなく、そしてペプチドを呈示するGDVの吸収が実行可能である。高い生物学的利用能が存在し、そして実質的に即時の処置停止が可能である。一方、このような投与は、比較的低い投与量に制限され（代表的には、約10〜15mg、本発明によって解消される問題）、そして同時に食物、飲み物または飲み込むものを摂取し得ない。本発明の好ましい実施態様は、口ガンの処置のために、自己および/または外来MHC、あるいは免疫モジュレーターをコードする遺伝子を含有するレトロウイルスベクターを含むGDVの頬/舌下投与を含む；シューグレン症候群の処置は、 IgAまたはIgEアンチセンス遺伝子を含むこのようなレトロウイルスベクターの頬 /舌下投与を介する；歯肉炎および歯周炎の処置は、IgGまたはサイトカインアンチセンス遺伝子の頬/舌下投与を介する；そして経口送達に関して上述した多くの適用が含まれる。直腸投与は、克服し得る初回通過代謝効果（良好な血管/リンパ管供給が存在し、そして吸収された物質は直接、下大静脈に排出する）を提供し、そしてこの方法は、子供、嘔吐患者、および無意識者に適する。この方法は、胃酸および酵素的分解を回避し、そして組成物のイオン化は、直腸液が緩衝能を有さないので変わらない（pH6.8;荷電組成物が最もよく吸収する）。一方、緩慢で、不完全かつ迷走的な吸収、刺激、細菌叢による分解が存在し得、そして小さな吸収表面が存在する(約0.05ｍ²)。さらに、親油性および水溶性の化合物は、直腸粘膜による吸収に好ましく、そして吸収増強剤(例えば、塩、EDTA、NSAID)が必要であり得る。本発明の好ましい実施態様は、大腸ガン抗原、自己および/または外来MHC 、あるいは免疫モジュレーターをコードする遺伝子を含有するレトロウイルスベクターを含むGDVの直腸投与を含む。鼻投与は、初回通過代謝、ならびに胃酸および酵素的分解を回避し、そして便利である。好ましい実施態様において、鼻投与は、GDV投与に有用であり、ここでGDVは上記のような特性を有するポリペプチドの発現を引き起こし得る。一方、このような投与は、局部的な刺激を引き起こし得、そして吸収は鼻粘膜の状態に依存し得る。肺投与もまた、初回通過代謝、ならびに胃酸および酵素的分解を回避し、そして便利である。さらに、肺投与は、全身性の副作用を最少にする限局性作用および有効性のために必要とされる投与量を可能にし、そして急速な作用開始および自己投薬が存在し得る。一方、時々、投与された組成物の小部分が細気管支/肺胞に達し、局部的な刺激が存在し得、そして過剰投与が起こり得る。さらに、患者の協力および理解が好ましく、そして投与のための推進剤は毒性作用を有し得る。本発明の好ましい実施態様は、喘息、枯草熱、アレルギー性肺胞炎、または線維組織形成肺胞炎のような状態の処置のためにIgAまたはIgE、嚢胞性線維症の処置のためにCFTR遺伝子、および肺気腫の処置のためにプロテアーゼおよびコラゲナーゼインヒビター（例えば、α-1-アンチトリプシン）をコードする遺伝子を含むレトロウイルスベクターを含むGDVの肺投与を含む。あるいは、経口投与について上述で列挙されたポリペプチドの同一の型の多くが、使用され得る。眼投与は、局部的作用を提供し、そして長期作用を可能にする。ここで投与は挿入物を介する。さらに、初回通過代謝、ならびに胃酸および酵素的分解を回避し、そして眼滴またはコンタクトレンズ様挿入物の使用による自己投与を可能にする。一方、投与は常に効果的であるとは限らない。なぜなら投与は流涙を誘導するからである。本発明の好ましい実施態様は、枯草熱結膜炎または春季結膜炎およびアトピー性(atomic)結膜炎の処置のためにIgAまたはIgEをコードする遺伝子を含むレトロウイルスベクターを含むGDVの眼投与；およびメラノーマ特異的抗原（例えば、高分子量メラノーマ関連抗原）、自己および/または外来MHC、あるいは免疫モジュレーターをコードする遺伝子をコードするレトロウイルスベクターの眼投与を含む。例えば、血管形成のインヒビターを発現するGDVが、眼の糖尿病病巣の処置のために用いられ得る。経皮投与は、急速な処置停止および長期作用を可能にし、良好なコンプライアンスを導く。さらに、局部的処置が可能であり、そして初回通過代謝、ならびに胃酸および酵素的分解を回避する。一方、このような投与は、局部的刺激を引き起こし得、特に耐性の発達を受けやすく、そして典型的には、非常に強力な組成物にとっては好ましくない。本発明の好ましい実施態様は、アトピー性皮膚炎および他の皮膚アレルギーのような状態の処置のためにIgAまたはIgEをコードする遺伝子を含むレトロウイルスベクターを含むGDVの経皮投与；およびメラノーマ特異的抗原（例えば、高分子量メラノーマ関連抗原）、自己および/または外来M HC、免疫モジュレーター、あるいは上述のポリペプチドのタイプをコードする遺伝子をコードするレトロウイルスベクターの経皮投与を含む。膣投与は、局部的処置およびホルモン投与のための１つの好ましい経路を提供する。さらに、このような投与は、初回通過代謝、ならびに胃酸および酵素的分解を回避し、そしてGDVがペプチドを呈示する場合における組成物の投与に好ましい。本発明の好ましい実施態様は、自己および/または外来MHC、あるいは免疫モジュレーターをコードする遺伝子を含むレトロウイルスベクターを含むGDVの膣投与を含む。他の好ましい実施態様は、精子特異的抗体の生成を促進し、それにより妊娠を妨げるような精子成分（例えば、ヒストン、フラジェリンなど）をコードする遺伝子の膣投与を含む。この効果は逆でもあり得、そして/または免疫グロブリンアンチセンス遺伝子（その遺伝子は、精子特異的抗体の生成を妨げる）をコードするレトロウイルスベクターを送達することにより、いく人かの女性における妊娠が増強され得る。膀胱内投与は、尿生殖器問題のための局部的処置を可能にし、全身性副作用を回避し、そして初回通過代謝、ならびに胃酸および酵素的分解を回避する。一方、この方法は、尿道カテーテル法を必要とし、そして高度に熟練したスタッフを必要とする。膀胱内投与の好ましい実施態様は、抗腫瘍遺伝子（例えば、キナーゼのようなプロドラッグ活性化遺伝子）（同時係属を参照のこと）または種々の免疫調節分子（例えば、サイトカイン）をコードするGDVの投与を含む。内視鏡逆行胆嚢膵臓撮影法（ERCP）（口を通過する；皮膚の貫通を必要としない）は、広範囲の胃鏡検査に有利であり、そして胆汁管および膵管への選択的な接近を可能にする。一方、この方法は、高度に熟練したスタッフを必要とし、そして患者に不快感を与える。好ましくは、投与方法は経口投与であり、これは、胃および肝臓を通過し、そして投与のために医療人員の存在を必要としない、無菌であるが非特異的な投与方法である。あるいは、この投与は、投与のために医療人員の存在を必要としない、無菌経路でもある他の非外傷性経路（例えば、頬/舌下、鼻、経皮、膣、直腸、眼、肺および腔内（interotic）（好ましくは、頬/舌下、鼻、膣または直腸）を通してもたらされる。他の適切な非外傷性投与経路として、十分な手術手順および入院を必要としないが、また医療人員の存在を必要とし得る胃鏡検査、EC RPおよび結腸鏡検査が挙げられる。本発明の非外傷性投与によれば、GDVはポリカチオン分子と複合体化されて、ポリカチオン補助非外傷性投与を提供し得る。このような遺伝子送達方法は、遺伝子転移の効率および特異性を増大させる複数の成分で構成される物理的粒子による媒介を介する遺伝子の送達を容易にする。詳細には、ポリカチオン分子（例えば、ポリリジンおよびヒストン）は核酸分子上の負電荷を中和し、そしてコンパクトな形態に分子を凝縮することが示されている。この分子形態は、細胞内で高い効率で、明らかにエンドサイトーシス経路を通って移される。宿主細胞中の核酸分子の発現における取り込みは、以下の一連の段階の後に生じる：（１）細胞表面への接着；（２）エンドサイトーシスまたは他の機構を介する細胞侵入；（３）エンドソーム放出の後の細胞質区画侵入；（４）核輸送；および（５）GD Vによって保有される核酸分子の発現。さらに好ましい実施態様において、多層技術が、１つ以上のこれらの段階の完了を容易にするためにポリカチオン核酸分子複合体に適用される。例えば、リガンド（例えば、アシアル糖タンパク質、トランスフェリンおよび免疫グロブリン）は細胞表面への細胞複合体の結合を容易にするために複合体に添加され得、エンドソーム破裂成分（例えば、ウイルスタンパク質、インフルエンザウイルス赤血球凝集素のn末端のような融合誘導性ペプチド、または不活性化ウイルス）はエンドソームからDNAの放出を容易にするために添加され、あるいは核タンパク質（または核局在化シグナルを含有するペプチド）は核へのDNAの輸送を容易にするために添加される。さらに好ましい実施態様において、この複合体を含む組成物は、不活性化アデノウイルス粒子を含む(Curiel,D.T.ら、PNAS 88:8850-8854,1991;Cristiano,R.J.,PNAS 90:2122-212 6 1993;Cotten,M.ら、PNAS 89:6094-6098 1992;Lozier,J.N.ら、Human Gene The rapy 5:313-322,1994;Curiel,D.T.ら、Human Gene Therapy 3:147-154,1992;Pla nk,C.ら、Bioconjugate Chem.3:533-539,1992;Wagner,E.ら、PNAS 88:4255-4259 ,1991)。多層複合体を含む類別された成分は所望となるように変えられ得、そのため所定の組織についての複合体の特異性、またはGDVから発現される遺伝子が特定の疾患または状態によりよく合うように変えられ得る。本発明の本実施態様の特性は、複合体のサイズが80〜100nmの範囲にある傾向があることであり（Wagner,E.、前出）、これはエンドソーム小胞中への容易な接近を可能にし（エンドソーム小胞の平均サイズは100〜200nmであり）、そして凝集粒子サイズは核酸分子の分子量に依存せず、48kbのDNA分子がより小さなサイズのDNA構築物と同じ効率で標的細胞中に移入される(Cotten,M.,1992)。エクソビボ手順が非外傷性投与をもたらすのであれば、GDVはまたエクソビボ手順の使用と組み合わせて投与され得る。このようなエクソビボ手順は、例えば、免疫応答を誘導する膣投与を用いた使用に特に有利である。このようなエクソビボ手順は、リン酸カルシウム沈澱(Dubenskyら、PNAS 81:7529-7533,1984)、完全な標的細胞へのDNAの直接マイクロインジェクション(Acsadiら、Nature 352:815 -818,1991)、およびエレクトロポレーション（これにより、膜を一過的に分極させるために伝導溶液中に懸濁された細胞を強度の電場にかけ、高分子を侵入させる）のような方法を介する宿主細胞中へのGDVの取り込みの物理的方法および化学的方法を含む。インビボおよびエクソビボの両方での使用に適切な他の手順は、リガンドに結合したDNA、不活性アデノウイルスに結合したDNA(Cottonら、PNA S 89:6094,1990)、リポフェクション(Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7 413-7417,1989)、マイクロプロジェクタイルボンバードメント（microprojectil e bombardment）(Williamsら、PNAS 88:2726-2730,1991)、ポリリジンのようなポリカチオン化合物、レセプター特異的リガンド、リポソームでトラップされた組換えGDV、スフェロプラスト融合（これによりGDV構築物を含有するE.coliは、その外側の細胞壁を取り除かれ、そしてポリエチレングリコールおよびウイルス形質導入を用いて動物細胞に融合される）(Clineら、Pharmac.Ther.29:69,1985; およびFriedmannら、Science 244:1275,1989)、およびDNAリガンド(Wuら、J.of Biol.Chem.264:16985-16987,1989)ならびにプソラレンで不活性化したウイルス（例えば、センダイまたはアデノウイルス）の使用を含む。次いで、これらの細胞は、本発明のGDVとなる。あるいは、上記のように構築物はウイルス（ワクシニア、シンドビスまたはコロナウイルス）により保持され得る。さらに、宿主細胞中にレトロウイルスベクターを含むGDVを導入する方法は、「組換えレトロウイルス」を名付けられた出願においてより詳細に記載される。エクソビボでの状況において、形質導入された細胞は動物に投与され、そして遺伝子発現についてモニターされ、またはさもなければ所望の活性についてスクリーニングされる。プロトコルは選択される組織細胞および活性に依存して変わる。簡単に述べると、１つの実施態様において、ある配列を有する組換えGDVが組織細胞に形質転換され、この配列の発現によりMHCクラスI提示が阻害される。好ましくは、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸〜10⁹個の組織細胞が形質転換される。これらの細胞は培養され、そして形質転換細胞は抗生物質耐性により選択され得る。細胞はウエスタンブロットおよびFACS分析、またはその他の手段により、遺伝子発現についてアッセイされる。形質導入され得る細胞は、線維芽細胞、骨髄細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、肝細胞、および甲状腺小胞細胞を含むが、これらに限定されない。本発明の別の実施態様において、動物中の病原性物質を破壊する方法が提供される。ここで、GDVはベクターを産生する細胞（「VCL」または「プロデューサー細胞」ともいう）を含み、病原性物質を破壊するために動物にVCLを投与する工程を含む。しかし、VCLの投与による１つの障害は、特定の場合、非常に強い免疫応答が生じ得、従って非常に短い期間（２週間未満）しかこのような治療を実行できないことである。従って、本発明の好ましい実施態様において、VCLに対する免疫応答は、自家細胞またはHLA適合ヒト細胞から作製されたパッケージングヒト細胞株を選択することにより最少にされ得る。さらに、VCLにより発現されるウイルス構造タンパク質に対する免疫応答をより限定するために、細胞は半透膜を有するビーズまたはバッグ(bag)のような構造物中に封入され得る。これは、ベクター粒子を動物中に拡散させ得るが、宿主免疫細胞が膜を通過し、それにより免疫応答が発生するのを妨げる。免疫応答を減少させる方法は、インビボ形質導入が生じるためのさらなる時間を可能にし、それにより治療が改善される。それぞれの場合において、細胞のインビボ形質導入におけるその役割が達成された後、好ましくは、VClはアシクロビルまたはガンシクロビルを用いた処置により破壊される。本発明の別の実施態様において、転移性の散在性ガンを有する患者もまた、本発明の方法に従って処置され得る。例えば、例えば肝臓に転移した原発性の膵臓癌腫または結腸直腸癌腫は、例えば、ウイルスベクターまたは本発明のVCLを用いて、経口投与により処置され得る。肺または大腸における腫瘍は、肺または直腸投与により同様に接近され得る。膀胱ガン腫瘍は、尿道を通して膀胱にGDVを導入することにより処置され得る。例えば、HSVTKを発現するベクターによりインビボで形質導入された腫瘍細胞は、次いで、患者にアシクロビルまたはガンシクロビルを投与することにより破壊され得、組合せ中に第２のGDVに起因して存在し得るサイトカインの存在下で増大した抗腫瘍応答を生じる。本発明の好ましい実施態様において、細胞傷害性遺伝子または上記のような遺伝子産物(例えば、HSVTK)の投与に加えて、病原性物質を阻害しまたは破壊するため、種々の付加的な治療組成物が温血動物に同時に投与され得るか、または続いて投与され得る。このような治療組成物は、直接投与されるか、または他の実施態様において独立したGDVから発現され得る。あるいは、細胞傷害性遺伝子または遺伝子産物および治療組成物をコードする遺伝子（上記のような非ベクター由来遺伝子）の両方の発現を指向する単一ベクターは、病原性物質を阻害するか、または破壊するために温血動物に投与され得る。特に好ましい実施態様において、HSVTK遺伝子および免疫アクセサリー分子（例えば、ヒトγ-IFN）をコードする遺伝子の両方を送達し、そして発現するベクターまたはVCLは、好ましくは別の治療ベクター（例えば、IL-2のような第２のサイトカインをコードする）の前に、または同時に患者に投与され得る。このような構築物では、ある遺伝子がベクターLTRから発現され得、そして他の遺伝子はLTR間で見出される付加的な転写プロモーターを利用し得るか、または内部リボソーム結合部位を利用するポリシストロンmRNAとして発現され得る。インビボ遺伝子転移の後、患者の免疫系は γ-IFNおよび/またはIL-2の発現により活性化される。これが生じた後、全腫瘍荷重（tumor burden）自身は、アシクロビルまたはガンシクロビルを用いて患者を処置することにより減少し得、さらに有効な腫瘍免疫攻撃を可能にする。炎症細胞を用いた末期腫瘍の浸潤は、順に免疫提示を増加させ、そして腫瘍に対する患者の免疫応答をさらに改善する。従っていくつかの実施態様において、GDVは、GDVが(a)正常で健康な細胞を形質導入し、そしてその細胞を治療タンパク質または全身に分泌される他の物質のプロデュサーに形質転換するか、あるいは(b)異常または欠陥細胞を形質導入し、その細胞を正常に機能している表現型に形質転換するかのいずれかであり得るように、このような様式で投与され得る。GDVを含有する組成物はまた、異なる部位に投与され得、この組成物はまた複数のGDVを含み得、そして組成物はまた高力価のウイルスを含み得、ここでGDVはウイルスである。 III．核酸分子本発明に従って動物に非外傷的に投与される核酸分子は、これを保有するGDV に本来存在せず、および不活性でもなく一般に動物に対して有害でもなく、むしろいくつかの所望の利益、典型的には、疾患またはその他の病原性物質と闘う能力を提供する。本明細書中において使用する「病原性物質」は、疾患状態を担う細胞をいう。病原性物質の代表的な例としては、腫瘍細胞、自己反応性免疫細胞、ホルモン分泌細胞、通常有する機能を欠損している細胞、通常であればその細胞型に生じない不適切な遺伝子発現を付加的に有する細胞、およびバクテリア、ウイルス、またはその他の細胞内寄生虫に感染した細胞などが挙げられる。さらに、本明細書中において使用する「病原性物質」はまた、レトロウイルスベクター（例えば、誤った細胞型）を過剰に発現するまたは不適切に発現する細胞、または宿主細胞ゲノムへの不適切な挿入に起因して腫瘍形成性になった細胞をいうこともある。広範に多様な核酸分子が本発明のGDVによって保有され得る。このような核酸分子の例としては、物質をコードする遺伝子およびその他の核酸分子、ならびに特定の細胞内核酸分子に組み込まれ、そしてその分子を不活性化する不活性化配列のような生物学的に活性な核酸分子が挙げられる。核酸分子は、物質の発現を必要とせずに、分子自体が所望の利点を提供する場合に、生物学的に活性である。例えば、生物学的に活性な核酸分子は、特定の細胞内核酸分子に組み込まれ、そしてその分子を不活性化する不活性化配列であり得るか、または、この分子は、結合能力を提供する構造を有するtRNA、rRNA、またはmRNAであり得る。物質としては、タンパク質（例えば、単鎖分子を含む抗体）、免疫刺激性分子（例えば、抗原）、免疫抑制分子、ブロッキング剤、および緩和剤（例えば、トキシン、アンチセンスリボ核酸、リボザイム、酵素、抗血管形成化合物、および病原性物質の機能を阻害し得るその他の物質）が挙げられる。抗血管形成化合物を、ガンを含む種々の障害の処置、および糖尿病の眼病変のような糖尿病病変の処置に使用し得る。物質としてはまた、サイトカインおよび種々のポリペプチドまたはペプチドホルモン、およびそのアゴニストまたはアンタゴニストが挙げられる。ここで、これらのホルモンは、組織（例えば、下垂体、視床下部、腎臓、内皮細胞、肝臓、膵臓、骨、造血髄、および副腎）に由来し得る。このような物質を、増殖の誘導、組織の退行、免疫応答の抑制、アポトーシス、遺伝子発現、レセプター-リガンド相互作用のブロック、免疫応答に対して使用し得、ならびに特定の貧血、糖尿病、感染症、高血圧、異常な血液化学（例えば、血中コレステロール値の上昇、血液凝固因子の欠如、HDL下降を伴うLDL上昇）に対する処置として使用し得る。このような物質をまた、アルツハイマー関連アミロイドタンパク質のレベル、骨の浸食／カルシウム沈着、およびステロイドホルモン、プリンおよびピリミジンのような種々の代謝物のレベルを制御するために使用し得る。本発明において「機能を阻害し得る」は、緩和剤が、例えば、細胞に存在する物質を病原性物質の機能を通常は阻害しない物質から阻害する物質へ変換することにより、機能を直接的または間接的のいずれかで阻害することを意味する。ウイルス疾患に対するこのような機能の例としては、吸着、複製、遺伝子発現、アセンブリ、感染細胞からのウイルスの排出が挙げられる。ガン性疾患に対するこのような機能の例としては、細胞複製、外部シグナルに対する感受性（例えば接触阻害）、および抗オンコジーンタンパク質の産生の欠損が挙げられる。本発明の１つの実施態様において、DNA分子として緩和剤の発現を指向する真核ウイルスcDNA発現ベクターのような種々のGDVを投与するための方法が提供される。本発明の別の実施態様において、RNA分子として緩和剤の発現を指向する種々のGDVを投与するための方法を提供する。細胞増殖の阻害に直接的に作用する緩和剤の代表的な例としては、以下のようなトキシンが挙げられる：リシン（Lambら，Eur．J．Biochem．148:265-270，19 85）、アブリン(Woodら，Eur．J．Biochem．198:723-732，1991; Evensenら，J ．of Biol．Chem．266:6848-6852，1991; Collinsら，J．of Biol．Chem．265:8 665-8669，1990; Chenら，Fed．of Eur．Biochem Soc．309:115-118，1992)、ジフテリアトキシン（Twetenら，J．Biol．Chem．260:10392-10394，1985）、コレラトキシン（Mekalanosら，Nature 306:551-557，1983; Sanchez & Holmgren，P NAS 86:481-485，1989）、ゲロニン(gelonln)（Stirpeら，J．Biol．Chem．255: 6947-6953，1980）、ヨウシュヤマゴボウ（Irvin，Pharmac．Ther．21:371-387 ，1983）、抗ウイルスタンパク質(Barbieriら，Biochem．J．203:55-59，1982; Irvinら，Arch．Biochem．& Biophys．200:418-425，1980; Irvin，Arch．Bioch em．& Biophys．169:522-528，1975)、トリチン(tritin)、赤痢トキシン（Calde rwoodら，PNAS 84:4364-4368，1987; Jacksonら，Microb．Path．2:147-153，19 87）、およびシュードモナスエクソトキシンＡ（CarrollおよびCollier，J．Bio l．Chem．262:8707-8711，1987）。本発明の他の局面において、GDVは、それ自体有毒ではないが、ウイルスまたはその他の病原体に特異的なプロテアーゼのようなタンパク質によって処理または修飾される場合、有毒な形態に変換される産物を特定する遺伝子を保有する。例えば、組換えレトロウイルスGDVは、プロタンパク質鎖をコードする遺伝子を保有し得るが、これはHIVプロテアーゼによって処理される際に毒性になる。より具体的には、HIVウイルスにコードされるプロテアーゼに対してアレンジして適当な「プロ」エレメントを認識して切断することによって、有毒なリシンまたはジフテリアＡ鎖の不活性な合成プロタンパク質形態を切断して活性な形態にし得る。本発明のさらに別の局面において、GDVは、そのままでは不活性な前駆物質を病原性物質の活性インヒビターまたは条件的な毒性緩和剤（これは、病原状態を発現する細胞に対して毒性である緩和剤である）に活性化し得る物質の発現を指向する。本願明細書中に提供された開示から当業者には明らかなように、広範に多様な不活性前駆物質を病原性物質の活性インヒビターに変換し得る。例えば、レトロウイルス逆転写酵素（従って、ウイルス複製）を特異的に阻害するために、細胞機構によって、抗ウイルスヌクレオシドアナログ（例えば、AZTまたはddI ）は、ヌクレオチド三リン酸形態に代謝される（Furmamら，Proc．Natl．Acad． Sci．USA 83:8333-8337，1986）。抗ウイルスヌクレオシドアナログのそれらの活性形態への代謝を補助する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）または水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(VZVTK)のような遺伝子産物（例えば、タンパク質）の発現を指向する組換えウイルスベクターは、それゆえ、ヌクレオシドアナログ前駆物質（例えばAZTまたはddC）をその活性形態に活性化するのに有用である。これによって、AZT治療またはddI治療は、より効果的であり、低用量、およびほとんどない全身性毒性、および生産的感染に対するより高い作用強度を可能にする。ヌクレオチド三リン酸形態がレトロウイルス逆転写酵素に対する選択性を示すが、細胞ヌクレオシドおよびヌクレオシドキナーゼの基質特異性の結果、リン酸化はされない別のヌクレオシドアナログが、より効果を生じる。本発明の一実施態様において、HSVTK遺伝子を、構成的なマクロファージまたはＴ細胞特異的プロモーターの制御下で発現させ得、およびマクロファージまたはＴ細胞に導入し得る。HSVTKの構成的な発現によって、AZTまたはddIのようなヌクレオチドアナログの、生物学的に活性なヌクレオチド三リン酸形態へのより効果的な代謝発現を生じ、これによってより優れた効力、より低用量の送達、ほとんどない全身性毒性、および生産的感染に対するより高い作用強度を提供する。ヌクレオチド三リン酸形態がレトロウイルス逆転写酵素に対して選択性を示すが、細胞ヌクレオシドおよびヌクレオチドキナーゼの基質特異性の結果としてリン酸化はされない別のヌクレオシドアナログはまた、本発明の文脈内で利用され得る。本発明の関連した局面において、GDVは、病原性物質の存在下で細胞傷害性をほとんどまたは全く有しない別の化合物を毒性産物へ活性化する物質の発現を指向し、それにより病原性物質に対して局所的な治療を達成する。この場合、GDV 由来の遺伝子産物の発現は、病原状態を同定する細胞間シグナルのような病原性物質に関連した実体が存在し、それにより非病原細胞の破壊を防止する状況に限定される。病原条件を有するかまたはこれに感受性である細胞に対するベクターを保有するGDVを標的化することによって、この細胞型特異性はまた、感染レベルで付与され得る。本発明の関連した局面において、GDVは、細胞傷害性をほとんどまたは全く有しない化合物を毒性産物へ活性化する遺伝子産物の発現を指向する。簡単に言うと、細胞傷害性をほとんどまたは全く有しない化合物を直接的または間接的に毒性産物へ活性化する広範に多様な遺伝子産物を、本発明の文脈内において利用し得る。このような遺伝子産物の代表的な例としては、特定のプリンアラビノシドおよび置換ピリミジン化合物を選択的に一リン酸化して、これらの化合物を細胞傷害性代謝物または細胞増殖抑制性代謝物に変換するHSVTKおよびVZVTKが挙げられる。より具体的には、ガンシクロビル、アシクロビル、またはそれらの全てのアナログ（例えば、FIAC、DHPG）のような薬物のHSVTKへの曝露は、この薬物を対応する活性ヌクレオチド三リン酸形態へリン酸化する。例えば、本発明の１つの実施態様において、GDVは、HIVプロモーター（HIV ta tタンパク質によって活性化される場合を除いて転写的にサイレントであるとして知られている）の転写制御下で、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（「 HSVTK」）遺伝子下流の発現を指向する。簡単に言えば、HIVに感染してGDVを保有しているヒト細胞におけるtat遺伝子産物の発現は、HSVTKの産生量の増加を引き起こす。次いで、（インビトロまたはインビボのいずれかで）細胞を、ガンシクロビル、アシクロビル、またはそのアナログ（FIAC、DHPG）のような薬物に曝露する。上述のように、これらの薬物はHSVTKによってリン酸化され（しかし、細胞チミジンキナーゼによってリン酸化されない）、対応する活性ヌクレオチド三リン酸形態になることが知られている。アシクロビル三リン酸は、一般に細胞ポリメラーゼを阻害し、トランスジェニックマウスにおいてHSVTKを発現している細胞の特異的な破壊に導く（Borrelliら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:75 72，1988を参照のこと）。組換えベクターを含有し、およびHIV tatタンパク質を発現しているそれらの細胞は、特定の用量のこれらの薬物の存在により選択的に殺傷される。本発明の１つの実施態様において、cis作用性エレメント（「CRS/CAR」）を転写産物中に含むことによって、HSVTK条件的致死遺伝子の発現を、より一層HIV特異的にし得、最適な活性のために、別のHIV遺伝子産物（米国特許出願第07/586, 603号を参照のこと）すなわちrevを必要とする（Rosenら，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 85:2071，1988）。より一般的には、mRNAに存在するcisエレメントはmR NA安定性または翻訳可能性を調節するためにいくつかの場合において示されている。この型の配列（すなわち、遺伝子発現の翻訳後調節）は、ベクター遺伝子発現の事象特異的調節または組織特異的調節に使用され得る。さらに、これらの配列（すなわち、HIVに対するrev-応答性「CRS/CAR」エレメントまたはtat-応答性「TAR」エレメント）の多量体化は、さらに優れた特異性を生じるために利用し得る。上述の実施態様の場合に類似の様式で、プリンまたはピリミジンベースの薬物のリン酸化、ホスホリボシル化、リボシル化、またはその他の代謝についての遺伝子を保有するGDVを生成し得る。このような遺伝子は、哺乳動物の細胞における等価物を有さず、ウイルス、細菌、真菌、または原生動物のような生物に由来し得る。代表的な例としては、チオキサンチンをチオキサンチン一リン酸に変換するE．coliグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（「gpt」）遺伝子産物（Besnardら，Mol．Cell．Biol．7:4139-4141，1987を参照のこと）；ミトマイシンホスフェートおよびドキソルビシンホスフェートのような不活性なリン酸化合物を毒性の脱リン酸化化合物に変換するアルカリホスファターゼ；5-フルオロシトシンを毒性化合物である5-フルオロウラシルに変換する真菌（例えばFusari um oxysporum）または細菌のシトシンデアミナーゼ（Mullen，PNAS 89:33，1992 ）、para-N-ビス(2-クロロエチル)アミノベンゾイルグルタミン酸からグルタミン酸を切断し、それによって毒性安息香酸マスタード(mustard)を生成するカルボキシペプチダーゼG2；およびドキソルビシンおよびメルファランのフェノキシアセタビド(phenoxyacetabide)誘導体を毒性化合物に変換するペニシリンＶアミダーゼなどが挙げられる。この型の条件的致死遺伝子産物は、現在知られているプリンまたはピリミジンベースの多くの抗ガン剤に適用されており、効果的な細胞傷害性剤となるために、細胞間リボシル化またはホスホリボシル化をしばしば必要とする。条件的致死遺伝子産物はまた、プリンまたはピリミジンアナログではない非毒性薬物を代謝して細胞傷害性の形態にし得る（Searleら，Brit．J．C ancer 53:377-384，1986を参照のこと）。アデノ関連ウイルスベクターおよびより短い期間の効果を有するベクター（例えば、アデノウイルスベクターおよび後述するその他のベクター）を含むウイルスベタターのようなGDVを用いて、不活性な前駆物質を細胞において活性な産物への数種類の条件的活性化が達成され得る。このようなベクターは、効果的に細胞に入り込み、２、３日〜１か月程度の期間にわたって、ベクターによってコードされるタンパク質を発現させ得る。この期間は病原細胞を殺傷するのに十分な期間でなければならない。さらに、物理的な遺伝子移入法も、同様に利用され得る。さらに、標的病原が哺乳動物ウイルスである場合、哺乳動物ウイルスが、一般に、他のウイルスプロモーターエレメントのその後の転写活性化に必要である「即時初期」遺伝子を有する傾向がある事実を利用してGDVを構築し得る。この性質の遺伝子産物は、ウイルス感染の細胞間シグナル（または「同定物質」）についての優れた候補である。従って、このような「即時初期」ウイルス遺伝子産物に応答性である転写プロモーターエレメントから転写された条件的致死遺伝子は、任意の特定のウイルスで感染した細胞を、特異的に殺傷し得る。さらに、ヒト αおよびβインターフェロンプロモーターエレメントは、広範に多様な非関連ウイルスによる感染に応答して転写的に活性化されるので、例えば、これらのウイルス応答性エレメント（VRE）から、HSVTKなどの条件的致死遺伝子産物を発現するベクターの導入により、多様な異なるウイルスで感染した細胞の破壊が生じ得る。本発明の別の実施態様において、ウイルスアセンブリを阻害する不完全な妨害ウイルス構造タンパク質の送達および発現に関与するインヒビター緩和剤のような物質を産生するための方法が提供される。この情況において、GDVは、ウイルス粒子のアセンブリを優先的な様式で阻害する不完全なgag、pol、env、またはその他のウイルス粒子タンパク質またはペプチドをコードする。このような阻害は、ウイルス粒子の正常なサブユニットの相互作用が、不完全なサブユニットとの相互作用によって破壊されるので生じる。阻害性緩和剤の効率を増加させる方法の１つは、問題のウイルスによる耐性細胞の感染の確率を増加させる遺伝子の発現と共に、ウイルス阻害性遺伝子のような阻害性遺伝子を発現させることである。結果は、産生性感染事象について拮抗する非産生性「行き止まり」事象である。HIVの特定の場合において、（上述のようにアンチセンスtatなどを発現することによって）HIV複製を阻害するGDVが非外傷的に投与され得、また、CD4のような感染に必要なタンパク質を過剰に発現させ得る。この方法において、比較的少数のベクター感染HIV耐性細胞が、フリーウイルスまたはウイルス感染細胞を有する複数の非産生性融合事象に対する「シンク」または「マグネット」として作用する。本発明の別の実施態様において、ウイルスプロテアーゼに特異な阻害ペプチドまたはタンパク質のような物質を発現させるための方法が提供される。ウイルスプロテアーゼはウイルスgagおよびgag/polタンパク質を、多数の小さなペプチドに切断する。全ての場合においてこの切断の失敗は、感染性レトロウイルス粒子の産生の完全な阻害に導く。HIVプロテアーゼはアスパルチルプロテアーゼとして知られており、そしてタンパク質またはアナログ由来のアミノ酸から作製されるペプチドによって阻害されることが知られている。HIVを阻害するGDVは、このようなペプチドインヒビターの１つまたは複数の融合コピーを発現する。上述のアプローチは、多くのウイルス関連疾患、ガン、またはその他の病原性物質に対して効果的であるべきである。本発明のさらに他の実施態様において、緩和剤を発現するGDVが提供される。ここで、緩和剤は膜アンカーを有し、抗腫瘍剤として作用する。このような緩和剤は、例えば、抗腫瘍剤-膜アンカー融合タンパク質として構築され得る。簡単に言えば、融合タンパク質の膜アンカーの局面は、例えば、周知の分子の膜貫通ドメインを含む多様な配列から選択され得る。一般に、膜アンカー配列は、タンパク質を膜に結合するタンパク質の領域である。通例、タンパク質を細胞膜の外面に付着させるアンカー配列の２つの型が存在する：（１）細胞膜の脂質二重層を通過し、そして疎水性中心領域と相互作用する膜貫通領域（このような領域を含有するタンパク質は、内在性膜タンパク質と呼ばれる）および、（２）膜の内在性膜タンパク質または極性表面と相互作用するドメイン（このようなタンパク質は、末梢タンパク質または外因性タンパク質と呼ばれる）である。本発明において用いられる膜アンカーは、膜を１回以上通過する膜貫通ドメインを含み得る。例えば、グリコホリンおよびグアニリルシクラーゼにおいて、膜結合領域は、膜を１回通過するのに対し、ロドプシンの膜貫通ドメインは、膜を７回通過し、Rhodopseudomonas viridisの光合成反応中心の膜貫通ドメインは膜を11回通過する（Rossら，J．Biol．Chem．257:4152，1982; Garbers，Pharmac ．Ther．50:337-345，1991; Engelmanら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:2023 ，1980; HeijneおよびManoil，Prot．Eng．4:109-112，1990を参照のこと）。タンパク質が膜を通過する回数には関係なく、膜通過領域は、一般に、類似の構造を有する。より具体的には、膜の内側に位置するドメインの20〜25個のアミノ酸残基部分は、一般に、ほとんど完全に疎水性残基からなる（Eisenbergら，Ann. Rev．Biochem．53:595-623，1984を参照のこと）。例えば、グリコホリンの膜通過領域における28〜34個の残基は、疎水性である（Rossら、前出；Tomitaら，Bi ochemistry 17:4756-4770，1978を参照のこと）。さらに、βシートおよびβバレルのような構造が生じるが、Ｘ線回折、結晶構造解析、および架橋研究によって決定されるように、膜通過領域は、一般に、αらせん構造を有する（Eisenber gら、前出; HeijneおよびManoil、前出を参照のこと）。所定の配列内におけるこれらの膜貫通らせんの位置は、疎水性プロットに基づいてしばしば予測され得る。Stryerら，Biochemistry，第３版 304，1988。本発明において使用するために特に好ましい膜アンカーとしては、膜シグナルアンカーとして機能することが示されている天然に存在する細胞タンパク質（これは、非免疫原性である）（例えば、グリコホリン）が挙げられる。本発明の好ましい実施態様において、膜アンカーγインターフェロン融合タンパク質をコードするDNA配列が提供される。１つの実施態様において、Fcレセプターのγ鎖の膜アンカーをコードする配列を、γインターフェロンをコードする配列に遺伝子融合することによって、この融合タンパク質は、構築され得る。さらに別の局面において、病原機能に対応するRNA分子を切断し、それゆえ不活性化する１つ以上のリボザイム（RNA酵素）（HaseloffおよびGerlach，Nature 334:585，1989）をコードすることによって、GDVは治療効果を提供する。リボザイムは、標的RNAにおける特異的な配列を認識することによって機能し、およびこの配列は、通常、12〜17bpであるので、これにより病原状態に対応する特定のRNA配列（例えば、HIV tat）の特異的な認識が可能となり、および毒性はこのような病原状態に対して特異的である。さらなる特異性が、いくつかの場合において、リボザイムを上述のような条件的毒性緩和剤にすることにより達成され得る。さらに別の局面において、GDVはアンチセンス配列である生物学的に活性な核酸分子を含む（アンチセンス配列はまた、核酸配列によってコードされ、次いで転写によって宿主細胞内で産生され得る）。好ましい実施態様において、アンチセンス配列は、インフルエンザウイルス、HIV、HSV、HPV、CMV、およびHBVをコードする配列からなる群から選択される。このアンチセンス配列はまた、病原性に必要なRNA配列に対して相補的なアンチセンスRNAであり得る。あるいは、生物学的に活性な核酸分子は、病原性に必要なRNA配列に相補的なセンスRNA（または DNA）であり得る。より特定すると、生物学的に活性な核酸分子はアンチセンス配列であり得る。簡単に言えば、アンチセンス配列は、RNA転写物に結合するよう設計され、それにより、特定のタンパク質の細胞合成を妨げるか、または細胞によるそのRNA配列の使用を妨げる。このような配列の代表的な例としては、アンチセンスチミジンキナーゼ、アンチセンスジヒドロ葉酸レダクターゼ（MaherおよびDolnick，Ar ch．Biochem．& Biophys．253:214-220，1987: Bzikら，PNAS 84:8360-8364，19 87）、アンチセンスHER2（Coussensら，Science 230:1132-1139，1985）、アンチセンスABL（Fainsteinら，Oncogene 4:1477-1481，1989）、アンチセンスMyc （Stantonら，Nature 310:423-425，1984）、およびアンチセンスras、ならびにヌクレオチド生合成経路における任意の酵素をブロックするアンチセンス配列が挙げられる。さらに、本発明のさらなる実施態様において、強力なクラスＩ拘束性応答を誘導するために、抗腫瘍剤としてアンチセンスRNAを利用し得る。簡単に言えば、R NAを結合し、およびそれにより特定のmRNAの翻訳を防止することに加え、高いレベルの特定のアンチセンス配列は、大量の二本鎖RNAの形成により、インターフェロンの増加した発現を誘導すると考えられている。γインターフェロンの増加した発現は、次にMHCクラスI抗原の発現を高める。これに関して用いられる好ましいアンチセンス配列としては、アクチンRNA、ミオシンRNA、およびヒストンRN Aが挙げられる。アクチンRNAとのミスマッチを形成するアンチセンスRNAは、特に好ましい。別の実施態様において、本発明の物質は、それ自体が治療的に有益である表面タンパク質を含む。例えば、特にHIVの場合において、特にHIV感染細胞におけるヒトCD4タンパク質の発現は、２通りで有益であり得る。１． CD4のHIV envへの細胞内結合は、可溶性CD4がフリーウイルスについて生ウイルス粒子形成を阻害し得るが、全身的なクリアランスおよび潜在的な免疫原性の問題を伴わないことが示されている。なぜなら、タンパク質は膜に結合したままであり、そして内因性CD4（患者はこれに対して免疫学的に耐性であるべきである）と構造的に同一であるからである。２．CD4/HIV env複合体は、細胞死の原因として関連するので、（HIV感染細胞に存在する過剰なHIV-envの存在下での）CD4のさらなる発現は、より迅速な細胞死に導き、従って、ウイルス播種を阻害する。これは、HIVで誘導される細胞傷害性に対するそれらの相対的屈折(relative refractility)（これは、次いで、細胞表面上のCD4の相対的欠損に明らかに起因する）の結果としてウイルス産生用のリザーバーとして作用する単球およびマクロファージに特に適用可能である。本発明のなおさらなる局面は、免疫刺激を行い得るGDVの非外傷性の投与に関する。外来性病原体を認識し、そしてこの病原体に対して防御する能力は、免疫系の機能に必須である。特に、免疫系は「自己」と「非自己」（すなわち外来性）とを区別し得なければならない。宿主の防御機構は宿主組織に対するのではなく侵入してくる実体に対して指向される。細胞溶解性Ｔリンパ球（CTL）は、典型的には、MHCクラスIまたはクラスII細胞表面タンパク質と共に結合して、細胞表面認識構造（例えば、プロセスされた病原特異的ペプチド）の提示により誘導されるか、または刺激される。治療に適した疾患としては、ウイルス感染（例えば、HIV、HBVおよびHPV）、ガン（例えば、メラノーマ、腎癌腫、乳ガン、卵巣ガン、およびその他のガン）、ならびに心臓疾患が挙げられる。１つの実施態様において、本発明は、感受性標的細胞において抗原またはその修飾形態の発現を指向するGDVを用いることにより、特異的な免疫応答を刺激し、そしてウイルス拡散を阻害するための方法を提供する。ここで、抗原は、(1) ウイルス抗原に対する免疫応答を開始し得るか、または(2)ウイルス相互作用に必要な細胞レセプターを占領することによってウイルス拡散を防止し得るかのいずれかである。タンパク質の発現は、一過的または経時的に安定であり得る。免疫応答が病原性抗原に対して刺激される場合、組換えウイルスベクターは、改変型の抗原（この抗原は免疫応答を刺激し、および天然の抗原に比べて病原性が軽減される）を発現するように、好ましくは設計される。この免疫応答は、細胞が、正しい様式（すなわち、CD3、ICAM-1、ICAM-2、LFA-1、またはこれらのアナログ（例えば、Altmannら，Nature 338:512，1989）のようなアクセサリー分子を伴う、MHCクラスIおよび／またはII分子の情況）において抗原を提示する場合に達成される。好ましい実施態様によれば、シンドビスウイルスベクターで感染した細胞は、これを効率よく行うことが予測される。なぜなら、シンドビスウイルスベクターは、真のウイルス感染を極めてよく模倣し、そして(a)非複製細胞に感染し得；(b)宿主細胞ゲノム中へ組み込めず；ならびに(c)生命を脅かす疾患に関連しないからである。本発明のこの実施態様は、同様の様式において機能することが予測され得た他の系よりも、提示細胞が完全に生存可能かつ健康であり、およびその他のウイルス抗原（これは、十分に免疫優勢であり得る）が発現されないという点で、さらに利点を有する。これは明瞭な利点である。なぜなら、抗原に対する遺伝子のサブフラグメントを、組換えシンドビスウイルスに選択的にクローン化することによって、発現される抗原性エピトープを変化させ得、そうでなければ免疫優勢エピトープによって隠され得る免疫原性エピトープに対する応答に導くからである。このようなアプローチは、１つ以上のエピトープが異なるタンパク質に由来する、複数のエピトープを有するペプチドの発現に延長し得る。さらに、本発明のこの局面は、抗原エピトープおよび遺伝子のサブフラグメントでコードされる抗原のペプチドフラグメントに対して指向された細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の効率的な刺激を、これらペプチドフラグメントの細胞間合成およびそのMHCクラスI分子との会合によって可能にする。このアプローチは、CTL誘導に対する主要な免疫優勢エピトープをマップするために利用され得る。免疫応答はまた、(a)（必要であれば、適切なMHC分子の情況において）問題の抗原を認識する特定のＴ細胞レセプターの遺伝子、(b)問題の抗原を認識する免疫グロブリンの遺伝子、または(c)MHC情況の非存在においてCTL応答を提供する２つのハイブリッドの遺伝子を、適切な免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球）に移入することによって、達成され得る。従って、GDVは、免疫刺激剤、免疫調節剤、またはワクチンなどとして使用され得る。 HIVに感染により生じた特定の疾患事例において、免疫刺激が望ましい場合、組換えレトロウイルスゲノムから生成された抗原は、HLAクラスIまたはクラスII 拘束性免疫応答のいずれか一方または両方を惹起する形態である。例えば、HIV エンベロープ抗原の場合、抗原は、その病原性を減少するように改変されたgp16 0、gp120、およびgp41から好ましくは選択される。特に、選択された抗原は、シンシチウムの可能性が減少し、免疫応答を増強する疾患に導くエピトープの発現を回避し、免疫優勢エピトープであるが、系統特異的エピトープを除去する（または、いくつかの系統特異的エピトープを提示する）ように改変され、HIVのほとんどまたは全ての系統に感染した細胞を排除し得る応答を可能にする。この系統特異的エピトープをさらに選択し、HIVのその他の系統に対して交差反応する動物において免疫応答の刺激を促進し得る。その他のHIV遺伝子または遺伝子の組み合わせ（例えば、gag、pol、rev、vif、nef、prot、gag/pol、gag protなど）はまた、特定の事例において防御を提供し得る。 HIVは一例にすぎない。このアプローチは、特徴的な抗原（膜タンパク質である必要はない）が発現される、多くのウイルス関連性疾患およびガン（例えば、 HPVおよび子宮頸椎癌腫、HTLV-I誘導性白血病、前立腺特異抗原（PSA）および前立腺ガン、変異p53および結腸癌腫およびメラノーマ、メラノーマ特異抗原（MAG E）、およびメラノーマ、ムチン、ならびに乳ガン）に対して効果的であるべきである。本発明の免疫刺激の局面によれば、本発明の物質はまた「免疫調節因子」（多くが上述されている）を含み得る。免疫調節因子は、免疫応答に関与する１つ以上の細胞により製造される場合、または細胞に対して外因的に添加される場合に、この因子の非存在において生じる免疫応答とは、質または作用強度が異なる免疫応答を生じる因子をいう。非GDV由来遺伝子から因子はまた発現され得るが、発現はGDVによって駆動または制御される。応答の質または強度は、例えば、細胞増殖を測定するインビトロアッセイ（例えば、³Hチミジン取り込み）、およびインビトロでの細胞傷害アッセイ（例えば、⁵¹Cr放出測定）を含む、当業者に公知の多様なアッセイによって測定され得る（Warnerら，AIDS Res.and Human Ret roviruses 7:645-655，1991を参照のこと）。免疫調節因子は、インビボおよびエクソビボの両方で活性であり得る。このような因子の代表的な例としては、IL-1、IL-2（Karupiahら，J．Immunol ogy 144:290-298，1990; Weberら，J．Exp．Med．166:1716-1733，1987; Gansba cherら，J．Exp．Med．172:1217-1224，1990; 米国特許第4,738,927号）、IL-3 、IL-4（Tepperら，Cell 57:503-512，1989; Golumbekら，Science 254:713-716 ，1991; 米国特許第5,017,691号）、IL-5、IL-6（Brakenhofら，J．Immunol．13 9:4116-4121，1987; 国際公開第90/06370号）、IL-7（米国特許第4,965,195号）、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13(cytokine Bullitein，Summer 1994 )、特にIL-2、IL-4、IL-6、IL-12、およびIL-13αインターフェロン（Finterら，Drugs 42(5):749-765，1991; 米国特許第4,892,743号; 米国特許第4,966,843 号; 国際公開第85/02862号; Nagataら，Nature 284:316-320，1980; Familletti ら，Methods in Enz．78:387-394，1981; Twuら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:2046-2050，1989; Faktorら，Oncogene 5:867-872，1990）、βインターフェロン（Seifら，J．Virol．65:664-671，1991）、γインターフェロン（Radford ら，The American Society of Hepatology 20082015，1991; Watanabeら，PNAS 86:9456-9460，1989; Gansbacherら，Cancer Research 50:7820-7825，1990; Ma ioら，Can．Immunol．Immunother．30:34-42，1989; 米国特許第4,762,791号; 米国特許第4,727,138号）、G-CSF（米国特許第4,999,291号および同第4,810,643 号）、GM-CSF（国際公開第85/04188号）、腫瘍壊死因子（TNF）（Jayaramanら， J．Immunology 144:942-951，1990）、CD3（Krissanenら，Immunogenetics 26:2 58-266，1987）、ICAM-1（Altmanら，Nature 338:512-514，1989; Simmonsら，N ature 331:624-627，1988）、ICAM-2、LFA-1、LFA-3（Wallnerら，J．Exp．Med ．166(4):923-932，1987）、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、B7.1-.3。β₂- ミクログロブリン（Parnesら，PNAS 78:2253-2257，1981）、シャペロン(例えば、カルネクシン(calnexin))、MHC結合輸送体タンパク質またはそのアナログ（Po wisら，Nature 354:528-531，1991）のようなサイトカインが挙げられる。１つの好ましい実施態様において、遺伝子はγインターフェロンをコードする。上記で引用した免疫調節因子の一例はB7ファミリー分子の一員である（例えば、B7.1-.3同時刺激因子）。簡単には、Ｔ細胞の完全な機能活性の活性化は２つのシグナルを必要とする。１つのシグナルは、抗原特異的Ｔ細胞レセプターと主要組織適合性複合体（MHC）分子に結合されるペプチドとの相互作用により提供され、そして同時刺激と呼ばれる第２のシグナルは、抗原提示細胞によってＴ細胞に送達される。第２のシグナルは、Ｔ細胞によるインターロイキン-２(IL-2)の産生に必要とされ、そして抗原提示細胞上のB7.1-.3分子とＴリンパ球のCD28およびC TLA-4レセプターとの相互作用を含むようである(Linsleyら、J.Exp.Med.,173:72 1-730,1991aおよびJ.Exp.Med.,174:561-570.1991)。本発明の１つの実施態様では、B7.1-.3は、CD8⁺T細胞が拡大し、そして完全に活性化されるに十分なIL-2を産生するように、CD8⁺T細胞の同時刺激を引き起こすために腫瘍細胞に導入され得る。同時刺激がもはやさらなるCTL機能には必要ではないので、これらのCD8⁺T 細胞は、B7を発現していない腫瘍細胞を死滅させ得る。同時刺激B7.1-.3因子および例えば、免疫原性HBVコアタンパク質の両方を発現するベクターは、本明細書中に記載の方法を利用して作製され得る。これらのベクターを形質導入された細胞は、より効果的な抗原提示細胞である。HBVコア特異的CTL応答は、同時刺激リガンドB7.1-.3により完全に活性化されたCD8⁺T細胞から増加される。 GDV中にどの免疫調節因子を含めるかの選択は、因子の既知の治療効果に基づき得るか、または実験的に決定され得る。例えば、慢性Ｂ型肝炎感染における既知の治療エフェクターは、アルファインターフェロンである。これは、患者の免疫不全を補い、そしてそれによって、疾患からの回復を補助するのに有効であることが見出されている。あるいは、適切な免疫調節因子を実験的に決定し得る。簡単に説明すると、肝疾患の患者からまず血液サンプルを採取する。自己細胞または肝炎抗原の免疫原性部分および免疫調節因子の発現を指向するGDVを形質導入したHLA適合細胞（例えば、EBV形質転換細胞）を用いてインビトロで抹消血リンパ球(PBL)を再刺激する。次いで、HLA適合形質導入細胞を標的として用いるCT Lアッセイのエフェクターとしてこれらの刺激されたPBLを使用する。HLA適合刺激物質および抗原のみをコードするベクターで形質導入した標的細胞を用いて行つた同じアッセイで見られるCTL応答の増加は、有用な免疫調節因子であることを示す。本発明の１つの実施態様では、免疫調節因子であるγインターフェロンが特に好ましい。本発明はまた所望の抗原の免疫原性部分も包含する。例えば、本明細書中に記載のGDVの１つにより投与されたときに免疫応答を示すように、HBV S抗原の種々の免疫原性部分を組合せ得る。さらに、HBVのS抗原のオープンリーディングフレームの異なる地域に見出される大きな免疫学的多様性のために、特定の地域では非外傷的な投与のために抗原の特定の組合せが好適であり得る。簡単に説明すると、全てのヒトＢ型肝炎ウイルスＳサンプル中に見いだされるエピトープは、抗原決定基「a」と定義される。しかし互いに排他的なサブタイプ抗原決定基がまた、二次元二重免疫拡散(Ouchterlony，Progr．Allergy 5：1，1958)により同定されている。これらの抗原決定基は「ｄ」または「ｙ」、および「ｗ」または「ｒ」と命名されている（LeBouvier，J．Infect．123：671，1971；Bancroftら、 J．Immunol．109：842，1972；およびCourouceら、Bibl．Haematol．42：1-158 ，1976）。この免疫学的多様性はＢ型肝炎ウイルスＳ抗原のオープンリーディングフレームの２つの領域の単一のヌクレオチド置換に起因し、以下のアミノ酸変化を引き起こす：（１）Ｂ型肝炎ウイルスＳ抗原のオープンリーディングフレーム中のリジン−122のアルギニンへの変換は、サブタイプをｄからｙにシフトさせる、そして（２）アルギニン−160のリジンへの変換は、サブタイプをｒからｗにシフトさせる。アフリカ黒人の間ではサブタイプaywが優性であり、一方米国および北ヨーロッパではサブタイプadw₂がより優性である(Molecular Biology of the Hepatitis B Virus，McLachlan 編、CRC Press，1991)。当業者には明らかなように、投与の地域において流行している特定のＢ型肝炎ウイルスサブタイプに適切な非外傷的な投与用のベクターを構築することが一般に好ましい。特定の地域のサブタイプは、二次元二重免疫拡散により決定され得るか、または；好ましくは、その地域の個体から単離されたHBVウイルスＳ抗原のオープンリーディングフレームを配列決定することにより決定され得る。 pol(「HBV pol」)、ORF5、およびORF6抗原がまた、HBVにより示される。簡単に説明すると、HBVのポリメラーゼオープンリーディングフレームは、感染した肝臓組織のビリオンおよびコア様粒子に見い出される逆転写酵素活性をコードする。ポリメラーゼタンパク質は少なくとも２つのドメインからなる：逆転写をプライムするタンパク質をコードするアミノ末端ドメイン、ならびに逆転写酵素およびRNase Ｈ活性をコードするカルボキシル末端ドメイン。HBV polの免疫原性部分は、動物（好ましくは温血動物）内で免疫応答を生成するために投与される GDVを利用する方法を用いて決定され得る。同様に、ORF5およびORF6（Millerら、Hepatology 9：322-327，1989）のような他のHBV抗原が、本明細書に記載のGD Vを利用して発現され得る。前述のように、Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分が、GDV中に取り込まれ得る。GDVに取り込まれる免疫原性部分は種々の長さであり得るが、一般的には少なくとも９アミノ酸の長さであることが好ましく、そして全抗原を含有し得る。特定の配列の免疫原性を予測することはしばしば困難であるが、Ｔ細胞のエピトープは、Falkら(Nature 351:290，1991)に記載されているHLA A2.1モチーフを利用して予測され得る。この解析から、ペプチドが合成され得、そしてインビトロの細胞傷害性アッセイで標的として使用され得る。しかし、他のアッセイもまた利用され得、例えば、新規に導入したベクターに対する抗体の存在を検出するELISA、ならびにγインターフェロンアッセイ、IL−２産生アッセイ、および増殖アッセイのようなＴヘルパー細胞を試験するアッセイが挙げられる。本発明の一つの実施態様では、Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分はGDVに取り込まれ得る。Ｃ型肝炎の好ましい免疫原性部分（単数または複数）はＣおよびNS3-NS4領域において見出され得る。なぜなら、これらの領域は、Ｃ型肝炎ウイルスの種々の型の間で最も保存されているからである(Houghtonら、H epatology 14:381-388,1991)。特に好ましい免疫原性部分は、多様な方法により決定され得る。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスに関して上述したように、ポリタンパク質の免疫原性部分の同定は、アミノ酸配列に基づいて予測し得る。簡単に説明すると、当業者に公知の様々なコンピュータプログラムを利用して、CTLエピトープを予測し得る。例えば、Falkらによって記載されている（Nature 351:290,1 991）HLA A2.1モチーフを利用して、HLA A2.1ハプロタイプに対するCTLエピトープを予測し得る。この分析から、ペプチドを合成してインビトロ細胞傷害性アッセイにおける標的として使用する。本発明の別の局面では、Ｂ型肝炎癌腫細胞を破壊するための方法が提供される。この方法は、免疫応答が生成されるように抗原Ｘの免疫原性部分の発現を指向するGDVを温血動物に非外傷的に投与する工程を含む。本明細書中に提示される開示から、当業者によってHBxAgをコードする配列は容易に入手され得る。簡単に説明すると、本発明の１つの実施態様では、ATCC 45020から642bpのNcoI-Taq I を回収し、他のＢ型肝炎抗原について上述したようにGDVに挿入する。しかし、Ｘ抗原は、他の潜在的なオンコジーン（例えば、E1A）と類似した様式で機能し得る既知のトランスアクチベーターである。このように、一般には最初に遺伝子産物が非腫瘍形成性になるようにＸ抗原を変化させた後、これをGDV に挿入するのが好ましい。例えば、短縮化（truncation）、点変異、成熟前終結コドンの追加、またはリン酸化部位の変化により、種々の方法を利用してＸ抗原を非腫瘍形成性にし得る。１つの実施態様の範囲において、Ｘ抗原をコードする、目的の配列または遺伝子を短縮化する。短縮化によって、種々のフラグメントが産生され得るが、一般にはコード化遺伝子配列の50%以上を保持しておくことが好ましい。さらに、いかなる短縮化の後も遺伝子産物の免疫原性配列の一部を完全なまま保持しておくことが必要である。あるいは、本発明の他の実施態様では、複数の翻訳終結コドンを遺伝子に導入し得る。終結コドンの挿入は、タンパク質の発現を成熟前に停止させ、従ってタンパク質の形質転換部分の発現は防止される。Ｘ遺伝子またはその改変バージョンの腫瘍形成性を種々の方法で試験し得る。代表的なアッセイとしては、ヌードマウスにおける腫瘍形成、軟寒天におけるコロニー形成、トランスジェニックマウスのようなトランスジェニック動物の調製が挙げられる。本発明の別の局面では、Ｃ型肝炎抗原の免疫原性部分の発現を指向するGDVを温血動物に投与する工程を含む、Ｃ型肝炎癌腫細胞を破壊するための方法が提供される。Ｃ型肝炎抗原の好ましい免疫原性部分は、コア抗原およびNS1〜NS5領域を含有するポリペプチドにおいて見出され得る（Chooら，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 88:2451-2455，1991）。特に好ましい免疫原性部分は種々の方法によって決定され得る。例えば、上述したように、アミノ酸配列に基づいて好ましい免疫原性部分を予測し得る。簡単に説明すると、当業者らに公知の様々なコンピュータプログラムを利用して、CTLエピトープを予測し得る。例えば、Falkらによって記載されている（Nature 351:290，1991）HLA A2.1モチーフを利用して、HL A A2.1ハプロタイプに対するCTLエピトープを予測し得る。免疫原性部分を予測するために利用し得る別の方法は、レトロウイルスベクターを利用してどの部分がCTL誘導特性を有しているかをマウスにおいて決定することである（Warnerら，AIDS Res．and Human Retroviruses 7:645-655，1991を参照のこと）。Warner らに記載されているように、マウスにおけるCTL誘導を利用してヒトにおける細胞免疫原性を予測し得る。ポリペプチド抗原またはペプチドのどのフラグメントが、対応する遺伝子のベクター形質導入後にフラグメントを発現する標的細胞の自己患者リンパ球（例えば、自己EBV-形質転換リンパ球）による溶解を誘導し得るかを決定することにより、好ましい免疫原性部分を推定し得る。好ましい免疫原性部分はまた、以下のようにして選択され得る。簡単に説明すると、どの抗原フラグメントが患者の血清中に存在するかを決定するために、HC Vのような標的疾患に羅患した患者から採取した血液サンプルを個々のHCVポリペプチド領域（例えば、HCVコア、E1、E2/SN1およびNS2〜NS5領域）に対する抗体で分析する。一時的な緩解を得るためにαインターフェロンで処置された患者では、いくつかの抗原決定基が消失し、その抗原に対する内因性抗体に代わる。このような抗原は、本発明の文脈において、免疫原性部分として有用である（Haya taら，Hepatology 13:1022-1028，1991; Davisら，N．Eng．J．Med．321:1501-1 506，1989）。コード配列を短縮化することによって、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎ウイルス由来のような、選択した抗原の別の免疫原性部分を入手し得る。例えば、HBVを用いると、以下の部位、すなわちBst UI、Ssp I，Ppu M1、およびMsp Iを短縮化し得る（Valenzuelaら，Nature 280:815-19，1979; Valenzuelaら，Animal Virus Ge netics: ICN/UCLA Symp．Mol．Cell Biol.，1980，B.N．FieldsおよびR．Jaenis ch(編)，57-70頁，New York: Academic）。適切な免疫原性部分および方法を決定するためのさらなる方法についてはまた、Ｃ型肝炎を例に挙げて後述する。 HBVの治療に関して、GDVに取り込ませるのに特に好ましい免疫原性部分としては、HBeAg、HBcAg、およびHBsAgsが挙げられる。さらに、１つ以上の免疫原性部分（および必要であれば免疫調節因子）をGDVに取り込ませ得る。例えば、１つの実施態様では、Ｂ型肝炎抗原の免疫原性部分およびＣ型肝炎ポリペプチドの免疫原性部分の両方の同時発現を指向するGDVを調製し得る。このような構築物は、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎のいずれかの急性感染または慢性感染を予防または処置するために非外傷的に投与され得る。同様に、他の実施態様では、Ｂ型肝炎Ｘ抗原の免疫原性部分およびＣ型肝炎ポリペプチドの免疫原性部分の両方の同時発現を指向するGDVを調製し得る。このような構築物は、同様にＢ型肝炎またはＣ型肝炎のいずれかに関連した肝細胞癌腫を処置するために非外傷的に投与され得る。さらに、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎を慢性的に感染した個体は、肝細胞癌腫が発達するリスクが高いため、このようなベクターはまた、この疾患に対する予防的処置として利用され得る。免疫原性部分はまた、他の方法によって選択され得る。例えば、HLA A2.1/K^b トランスジェニックマウスは、ウイルス抗原のヒトＴ細胞認識のモデルとして有用であることが示されている。簡単に説明すると、インフルエンザ系およびＢ型肝炎ウイルス系において、マウスＴ細胞レセプターレパートリーは、ヒトＴ細胞によって認識されるものと同一の抗原決定基を認識する。両方の系において、HL A A2.1/K^bトランスジェニックマウスにおいて生成されたCTL応答を、HLA A2.1ハプロタイプのヒトCTLによって認識されるものと実質的に同一のエピトープに指向する（Vitielloら，J.Exp．Med．173:1007-1015，1991; Vitielloら，Abstrac t of Molecular Biology of HePatitis B Virus Symposia，1992）。本発明の免疫原性タンパク質は、これらをより免疫原性の高いものにするために当該分野において公知の種々の方法によって操作され得る。このような方法の代表的な例としては：Ｔヘルパーエピトープに対応するアミノ酸配列を追加すること；疎水性残基を添加することによって細胞取り込みを促進すること；または粒子構造を形成することによって細胞取り込みを促進すること；またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる（一般的に、Hart，op．cit.，Milichら，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 85:1610-1614，1988; Willis，Nature 340:323-324，198 9; Griffithsら，J．Virol．65:450-456，1991を参照のこと）。本発明はまた、種々のネコの疾患（例えば、ネコ白血病ウイルス(「FeLV」)感染およびネコ免疫不全ウイルス(「FIV」)感染を含む）の処置のための組成物および方法、ならびにこれらの疾患の予防のためのワクチンを含む。これらのウイルスは、同時係属出願においてさらに十分に議論される。ネコ白血病ウイルス(FeLV)は、オンコルナウイルスサブファミリーのレトロウイルスである。現在、FeLVには、そのエンベロープ抗原gp70およびp15Eにより区別される３つのサブグループＡ、ＢまたはＣが存在すると考えられている。FeLV はまた、全てのFeLVサブグループで高度に保存される多くのコア抗原（p15、p12 、p27、およびp10を含む）から構成される(Geeringら、Vir.36:678-680,1968;Ha rdyら、JAVMA 158:1060-1069,1971;Hardyら、Science 166:1019-1021,1969を参照のこと)。本発明の１つの実施態様において、GDVは、p15gag、p12gag、p27gag 、p10gag、p14pol、p80pol、p46pol、gp70env、およびp15envからなる群より選択されるネコ白血病ウイルス抗原の少なくとも一部分の発現を導く。特に好ましい実施態様において、GDVは、gp85envの発現を導く。これらの抗原をコードする配列は、本細書中で提供された開示(Donahueら、J.Vir.62(3):722-731,1988;Ste wartら、J.Vir.58(3):825-834,1986;Kumarら、J.Vir.63(5):2379-2384,1989;Eld erら、J.Vir.46(3):871-880,1983;Berryら、J.Vir.62(10):3631-3641,1988;Lapr evotteら、J.Vir.50(3):884-894,1984を参照のこと)を与えれば、容易に得られ得る。ネコ免疫不全ウイルス(FIV)は、逆転写酵素(RT)のマグネシウム要求性およびウイルス粒子の形態に基づいて、レンチウイルスサブファミリーのレトロウイルスとして分類されている(Pederesenら、Science 235:790-793,1987を参照のこと )。ネコ免疫不全ウイルスは、形態学的かつ抗原的に他のネコレトロウイルス（ネコ白血病ウイルス、Ｃ型オンコルナウイルス(RD-114)、およびネコシンシチウム形成ウイルス(FeSFV)を含む）とは異なる（Yamamotoら、「Efficacy of exper imental FIV vaccines」,(要約)，First International Conference of Feline Immunodeficiency Virus Researchers,University of California,Davis,CA,Sep .4-7,1991を参照のこと）。本発明の１つの実施態様において、GDVは、p15gag、 p24gag、p10gag、p13pol、p62pol、p15pol、およびp36polからなる群より選択されるネコ免疫不全ウイルス抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を導く。特に好ましい実施態様において、GDVは、gp68env、gp27env、およびrevの発現を導く。本発明の情況において、「rev」は、revオープンリーディングフレームに対応する抗原をいうと理解される(Phillipsら、First International Conferenc e,前出)。これらの抗原をコードする配列は、本明細書中で提供された開示(Phil lipsら、J.Vir.64(10):4605-4613,1990;Olmstedら、PNAS 86:2448-2452,1989;Ta lbottら、PNAS 86:5743-5747,1989を参照のこと)を与えられた当業者により容易に得られ得る。さらに他の例は、非腫瘍形成性の変化したras（ras^*）遺伝子の発現を指向するGDVを包含する。簡単に説明すると、ras^*遺伝子は、新生物表現型に因果的に結びつけられるため魅力的な標的であり、確かに広範な明確なガン（例えば膵臓癌腫、大腸癌腫、および肺腺癌）の腫瘍形成の誘導および維持に必要であり得る。さらに、ras^*遺伝子は前新生物腫瘍において見いだされ、従って免疫介在療法が、悪性腫瘍の検出の前に適用され得る。正常ras遺伝子は非腫瘍形成性であり、そしてすべての哺乳動物に遍在する。これは進化の過程で高度に保存されており、そして細胞周期および正常な増殖特性の維持に重要な役割を果たすようである。正常rasタンパク質は、GTPに結合し GTPase活性を有するＧ−タンパク質であり、そして外部環境から細胞内部へシグナルを伝達するのに関与しており、それにより細胞が環境に応答することを可能にする。一方ras^*遺伝子は、細胞の挙動を環境から切り離すことにより新生物細胞の正常な増殖調節を変化させ、それにより新生物細胞の制御されない増殖を導く。ras遺伝子の変異は癌腫形成の初期の事象であると考えられ(Kumarら、「Act ivation of ras Oncogenes Preceding the Onset of Neoplasia」Science 248： 1101-1104，1990)、これは早期に処置されれば腫瘍形成を防止し得る。 ras^*遺伝子は広範なガン（例えば、膵臓腺癌、大腸腺癌、および肺腺腺癌を含む）に存在する。しかし、種々のガンで見られるras^*遺伝子に発生する変異の範囲は極めて限定されている。これらの変異は、正常なオン／オフスイッチを構成性のオンの位置に切り換えることにより、rasタンパク質のGTPase活性を変化させる。ras^*の腫瘍形成性変異は、（インビボでは）主に３つのコドン：12、13、および61にのみ起きる。ヒトおよび動物の腫瘍の両方において、コドン12の変異が最も多い。本発明の別の実施態様において、変化したp53(p53^*)遺伝子の発現を指向するG DVが提供される。簡単に説明すると、p53は当初形質転換した細胞の抽出物中に発見された核リンタンパク質であり、従って最初はオンコジーンとして分類された（LinzerおよびLevine，Cell 17：43-52，1979；LaneおよびCrawford，Nature 278：261-263，1979）。後に、元のp53 cDNAクローンはp53の変異体形態であることが発見された(Hindsら、J．Virol．63：739-746，1989)。今では、p53は細胞周期を負に制御する腫瘍抑制遺伝子であり、そしてこの遺伝子の変異が腫瘍形成を導き得るようである。研究された大腸癌腫のうち75％〜80％はp53の両方の対立遺伝子の欠損を示す（一方は欠失により、他方は点変異による）。肺ガンならびに脳腫瘍および乳腫瘍でも同様の変異が見られる。 p53変異の多く（例えば、p53^*1、p53^*2など）は、アミノ酸残基130〜290の間に集中している（Levineら、Nature 351：453-456，1991を参照のこと；および特異的変異をさらに詳細に説明する以下の文献も参照のこと：Bakerら、Science 244：217-221，1989；Nigroら、Nature 342：705-708，1989（p53変異は４つの高度に保存された遺伝子領域に適合する４つの「ホットスポット」に集中し、そしてこれらの変異はヒトの脳腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍、および大腸腫瘍で観察される）；Vogelstein，Nature 348：681-682，1990；Takahashiら、Science 246：4 91-494，1989；Iggoら、Lancet 335：675-679，1990；Jamesら、Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 86：2858-2862，1989；Mackayら、Lancet 11：1384-1385，1988； Kelmanら、Blood 74：2318-2324，1989；Malkinら、Science 250：1233-1238，1 990；Bakerら、Cancer Res．50：7717-7722，1991；Chibaら、Oncogene 5：1603 -1610，1990（初期の非小細胞肺ガンの病因は、コドン132〜283の間のp53遺伝子の体細胞性変異が関係している）；Prosserら、Oncogene 5：1573-1579，1990（アミノ酸126〜224をコードするp53遺伝子の変異が初期乳ガンで同定された）；C hengおよびHass、Mol．Cell．Biol．10：5502-5509，1990；Bartekら、Oncogene 5：893-899，1990；Rodriguesら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：7555-7559 ，1990；Menonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：5435-5439，1990；Mulliga nら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：5863-5867，1990；およびRomanoら、Onc ogene 4：1483-1488，1990（ヒトの骨肉腫由来細胞株HOS-SLのコドン156のp53変異の同定）。 p53遺伝子の特定の変化は、特定の特異的トキシンが原因であり得る。例えば、 Bressacら（Nature 350：429-431，1991）は、肝細胞癌腫を罹患した患者のコドン249の特異的なＧからＴへの変異を記載している。この変異の１つの示唆されている原因物質は、アフリカで食物汚染物質として知られている肝臓発ガン物質であるアフラトキシンＢ₁である。特に影響を受ける遺伝子の４つの領域は、残基132〜145、171〜179、239〜248 、および272〜286に存在する。特に興味深い３つの「ホットスポット」は、残基 175、248、および273に存在する(Levineら、Nature 351：453-456，1991)。これらの変化ならびに上述の他の変化により、新規のコード配列を含有するタンパク質が生成される。これらの配列によってコードされる新規タンパク質は腫瘍形成性細胞のマーカーとして使用され得、そしてこれらの新規コード領域に対して指向された免疫応答は、変化した配列(p53^*)を含有する腫瘍形成性細胞を破壊するのに使用され得る。本発明の別の実施態様において、変化したRb(Rb*)遺伝子の発現を指向するGDV が提供される。簡単に説明すると、網膜芽細胞腫は、染色体帯13q14に位置するR bと称される遺伝子座の欠損に関連している子供の眼のガンである。この領域由来の遺伝子がクローン化されており、これは、約110kdの核リンタンパク質を産生する（Friendら，Nature 323:643，1986; Leeら，Science 235:1394，1987;およびFungら，Science 236:1657，1987）。 Rbは細胞増殖の負の制御因子であると考えられており、そして転写制御および細胞周期調節において役割を有する。Rbは、核において見いだされる少なくとも７個のタンパク質と結合し、特にE2F（Bagchiら，Cell 62:659-669，1990）およびDRTF（ShivjiおよびLa Thangue，Mol．Cell．Biol．11:1686-1695，1991）と称される細胞転写因子と関与しているようである。Rbは、細胞増殖に関与している様々な核タンパク質を隔絶することによって細胞成長を制限すると考えられている。 Rb遺伝子内の欠失が検出されている。これは、Rb遺伝子が腫瘍形成性を担い得ることを実証する。これらの欠失には、例えば、前立腺ガンおよび膀胱ガン細胞株のエキソン21における欠失（Booksteinら，Science 247:712-715，1990; Horo witzら，Science 243:937，1989）、肺の小細胞ガンのエキソン16の欠失（Shew ら，Cell Growth and Diff．1:17，1990）、およびエキソン21と27との間の欠失（Shewら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:6，1990）が含まれる。これらのエキソンが欠失することで、欠失したエキソンの接合部に新規なコード配列を含有するタンパク質が生成される。この新規なタンパク質コード配列は腫瘍形成性細胞のマーカーとして利用され得、そしてこの新規なコード領域に対して指向された免疫応答は、Rbエキソン欠失のある腫瘍形成性細胞を排除し得る。本発明の別の実施態様において、ウィルムス腫瘍の原因となる変化した遺伝子の発現を指向するGDVが提供される。簡単に説明すると、ウィルムス腫瘍は代表的には16歳未満の子供に見られる。10,000人に一人の子供がこの腫瘍を発達させるが、これは子供のガンの約５％を占めている。この腫瘍は、通常、線維状の疑似嚢に囲まれた大きな腹部塊としてそれ自体を提示する。腫瘍の約７％は一方の腎臓において多巣性であり、そして5.4％は両方の腎臓と関与している。ウィルムス腫瘍遺伝子は染色体11p13に局在し、そして腫瘍抑制遺伝子に特徴的なcDNA クローン(wt1)が単離されている（Callら，Cell 60:509，1990; Gesslerら，Nat ure 343:744，1990; Roseら，Cell 60:495，1990; およびHaberら，Cell 61:125 7，1990）。wt1遺伝子は、４個の亜鉛フィンガーと、グルタミンおよびプロリンリッチのアミノ末端とを有するタンパク質をコードする。このような構造は、転写機能および調節機能に関与すると考えられる。ウィルムス腫瘍遺伝子の変異には、第３亜鉛フィンガーと第４亜鉛フィンガーとの間へのリジン、トレオニン、およびセリンの挿入が含まれる。このような挿入物を含有しているwt1タンパク質は、EGR-1部位とは結合しない。第２の別の変異が起こると、約17個のアミノ酸が亜鉛フィンガードメインのすぐNH₂末端側の領域に挿入される（Maddenら，Science 253:1550-1553，1991; Callら，Cell 60 :509，1990; Gesslerら，Nature 343:744，1990; Roseら，Cell 60:495，1990； Haberら，Cell 61:1257，1990;およびBucklerら，Mol．Cell．Biol．11:1707，1 991）。本発明の別の実施態様において、変化したムチンの発現を指向するGDVが提供される。ムチンは、約50％の炭水化物を含有する高分子量糖タンパク質である。多形性上皮ムチン（PEM）は、ガン患者の血清中に見いだされる腫瘍関連ムチン（Girlingら，Int．J．Cancer 43:1072-1076，1989）である。全長cDNA配列が同定されている（Gendlerら，J．Biol．Chem．265(25):15286-15293，1990; Lanら，J．Biol．Chem．265(25):15294-15299，1990;およびLigtenbergら，J．Biol． Chem．265:5573-5578，1990）。乳腫瘍および膵臓腫瘍はいずれも、20アミノ酸のタンデム反復（Jeromeら，Cancer Res．51:2908-2916，1991）を有する同一のコア配列を伴うムチンを発現する。膵臓腫瘍標的と交差反応する乳腫瘍に発達したCTL株は、さらに特定の20アミノ酸のタンデム反復（Jeromeら、前出）を特異的に認識するようである。20アミノ酸のタンデム反復のうちの１個以上をコードする配列が、この配列を有する腫瘍細胞に対する免疫応答を発達させるために、本発明のGDVによって発現され得る。本発明の別の実施態様において、変化したDCC（結腸直腸癌腫において欠失）遺伝子の発現を指向するGDVが提供される。簡単に説明すると、結腸直腸腫瘍における対立遺伝子欠損の極めて一般的な領域は染色体18qであり、これは癌腫の7 0％より多くで、および後期腺腫のほぼ50％で欠損している。この領域由来の推定的な腫瘍抑制遺伝子（DCC）が同定されている（Fearonら，1990）。これは、神経細胞接着分子（NCAM）およびコンタクチン(contactin)などの細胞表面接着分子に対し有意な相同性を有するタンパク質をコードする（Edelman，Biochem 2 7:3533-3543，1988によって概説される）。このタンパク質は、おそらく正常な細胞-細胞および／または細胞-細胞外マトリックス相互作用における変化によって、結腸直腸腫瘍の発達に役割を果たしていると考えられる。 DCC遺伝子は、正常な結腸粘膜において発現するが、その発現は結腸直賜癌腫の大部分では減少するか、または存在しない（Solomon，Nature 343:412-414，1 990）。この発現の欠損は、DCC遺伝子の体細胞性変異と関連している場合がある。370kbを有するDNAの連続ストレッチがクローン化されている。これは、およそ 750アミノ酸のタンパク質をコードする（Fearonら，「Identification of a Chr omosome 18q Gene That Is Altered in Colorectal Cancers」Science 247:49-5 6，1990）。本発明の別の実施態様において、MCC（結腸直腸ガンにおいて変異）またはAPC の発現を指向するGDVが提供される。MCCおよびAPCはいずれも腫瘍抑制遺伝子として同定されている（Kinzlerら，Science 251:1366-1370，1991）。これは、家族性腺腫ポリープ症（FAP）において変異するものである。FAPは、ガンを引き起こす最も一般的な常染色体優性疾患であると考えられており、そして米国では5, 000個体に少なくとも一人の割合で罹患している（Nishihoら，Science 253:665- 669，1991）。罹患個体では通常、結腸および直腸において数百から数千個の腺腫ポリープが発生し、これは癌腫に進行し得る。ガードナー症候群（「GS」、FA Pの変異体）は、類腱腫、骨腫、結腸および直腸の多発性腺腫と一緒の、その他の新生物を提示する。この増殖は、染色体5qにおいて見いだされる家族性腺腫ポリープ症遺伝子（特に、MCCおよびAPC）の欠損または不活性化によって誘導されると考えられる。例えば、Nishihoら（前出）において、FAPおよびGS患者においてAPC遺伝子の生殖系列の以下の変異が認められた：（１）コドン280、セリンから停止への変異（下顎骨腫の患者において）、（２）コドン302、２例の異なる患者（一方は類腱腫を有する）におけるアルギニンから停止への変異、（３）コドン414、下顎骨腫の患者におけるアルギニンからシステインへの変異、（５）コドン713、下顎骨腫の別の患者におけるセリンから停止への変異（Nishihoら，Science 253 :665-669，1991）。さらに、６つの点変異がMCCコドン番号12、145、267、490、 506、および698において同定され、そして、さらに４つの体細胞性変異がAPCにおいて同定された（コドン番号289、332、438、および1338）。本発明の他の実施態様において、「オン」または「オフ」モードで機能的に固定されたかまたは動かなくなった変化したレセプターの発現を指向するGDCが提供される。簡単に説明すると、多くの細胞レセプターが、外部環境をモニタリングし、そして細胞に適切に応答するようシグナルを送ることによって、細胞成長に関与している。モニタリングまたはシグナル送信機構のいずれか一方でも機能しない場合、細胞は外部環境にもはや応答しなくなり、そして制御されない成長を示し得る。多くの異なるレセプターまたはレセプター様構造が変化した細胞成分として機能し得る。これには、例えば、neuおよび変異型または変化型の甲状腺ホルモンレセプター、PDGFレセプター、インスリンレセプター、インターロイキンレセプター（例えばIL-1、-2、-3などのレセプター）、あるいはG-CSF、GM- CSF、またはM-CSFレセプターなどのCSFレセプターが含まれる。例えば、neu（ヒト表皮成長因子レセプター「HER」または表皮成長因子「EGF 」レセプターとも呼ばれる）は、乳ガンの女性の少なくとも28％に見られる変化したレセプターである。このタンパク質をコードするcDNAクローンが単離されている（Slamonら，Science 244:707-712，1989; Slamonら，Cancer Cells 7:371- 380，1989; Shihら，Nature 290:261，1981）。このクローンは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを有するタンパク質をコードし（Sc hechter，Nature 312:513，1984; Coussensら，Science 230:1132，1985）、従って、neuレセプターをコードすると考えられる。化学的に誘導した神経膠芽腫細胞から単離したラットneu遺伝子の研究は、その遺伝子が664位でバリンからグルタミン酸への単一の変異を含むことを示す（B argmannら，EMBO J．7:2043，1988）。他の研究では、N-エチル-N-ニトロソウレアで処置したベビーラットは神経系の悪性腫瘍を発生させた。発生した47個の三叉神経鞘腫および12個の神経鞘腫はいずれも、neu遺伝子の664位でのＴからＡへの塩基転換を保有していた（Nikitinら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:9939- 9943，1991）。その他の変化したレセプターもまた、選択された腫瘍細胞を破壊するために、 GDVによって発現され得る。例えば、染色体3p21〜p25における欠失は、小細胞肺ガンと関連している（Leducら，Am．J．Hum．Genet．44:282-287，1989）。欠失は、これが生じなければDNA結合甲状腺ホルモンレセプター（THR）をコードする ERBAb遺伝子において生じると考えられる。上述のようなレセプターの変化により、新規なコード配列を含むタンパク質（またはレセプター）が生成される。これらの配列によってコードされる新規なタンパク質は腫瘍形成性細胞のマーカーとして使用され得、そしてこれらの新規なコード領域に対して指向された免疫応答は、変化した配列または遺伝子を含有する腫瘍形成性細胞を破壊するのに用いられ得る。変化した細胞成分が細胞を腫瘍形成性にすることに関係しているならば、変化した細胞成分を非腫瘍形成性にすることが必要である。例えば、１つの実施態様において、変化した細胞成分をコードする目的の配列または遺伝子は、遺伝子産物を非腫瘍形成性にするために短縮化される。変化した細胞成分をコードする遺伝子は種々のサイズに短縮化され得るが、変化した細胞成分をできるだけ保持することが好ましい。さらに、短縮化されても、変化した細胞成分の免疫原性配列の少なくともいくつかは無傷であることが必要である。あるいは、複数の翻訳終結コドンを、変化した細胞成分をコードする遺伝子内の免疫原性領域の下流に導入し得る。終結コドンの挿入は、早期にタンパク質発現を終結させ、従ってタンパク質の形質転換部分の発現を防止する。１つの実施態様において、ras^*遺伝子はras^*タンパク質を非腫瘍形成性にするために短縮化される。簡単に説明すると、ras^*のカルボキシ末端のアミノ酸は、タンパク質を機能的に細胞膜に結合させる。これらの配列の短縮化は、変化した細胞成分を非腫瘍形成性にする。好ましくは、ras^*遺伝子はプリン環形成において、例えば、アミノ酸番号110をコードする配列の近辺で短縮化される。約20アミノ酸（変化したアミノ酸を含む）程度がGDVによりコードされるように、ras^* 遺伝子配列を短縮化し得るが、好ましくはできるだけ多くのアミノ酸が（非腫瘍形成性を維持しながら）発現されるべきである。別の実施態様において、細胞成分を非腫瘍形成性にするためにp53^*タンパク質を短縮化により改変する。前述のように、必ずしも、p53タンパク質のすべての変異が腫瘍形成性ではなく、従って必ずしもすべての変異を短縮化する必要はない。それにも関わらず、好適な実施態様では、p53^*はアミノ酸100〜300をコードし、それによって４つすべての主要な「ホットスポット」を含む配列に短縮化される。腫瘍形成性である他の変化した細胞成分もまた、それらを非腫瘍形成性にするために、短縮化され得る。例えば、neuおよびbcr/ablの両方を、これらを非腫瘍形成性にするために短縮化し得る。非腫瘍形成性は、前述のように短縮化された変化した細胞成分をアッセイすることにより確認され得る。しかし、変化した細胞成分が一般に非腫瘍形成性細胞に関連するのみで、そして細胞を腫瘍形成性にするのに必要でないか、または必須でない場合は、細胞成分を非腫瘍形成性にする必要がないことに注目すべきである。腫瘍形成性でないこのような変化した細胞成分の代表例は、Rb^*、ユビキチン^*、およびムチン^*を含む。前述のように、適切な免疫応答を生じさせるために、変化した細胞成分はまた免疫原性でなければならない。Ｔ細胞のエピトープはしばしば免疫原性で両親媒性のαらせん成分を有するが、多くの場合、特定の配列の免疫原性は予測することは難しい。しかし、一般に、アッセイにおいて免疫原性を決めることが好ましい。代表的なアッセイには、新規に導入したベクターに対する抗体の存在を検出するELISA、ならびにγインターフェロンアッセイ、IL−２産生アッセイ、および増殖アッセイのようにＴヘルパー細胞を試験するアッセイが含まれる。免疫原性を決定するための特に好ましい方法はCTLアッセイである。少なくとも１つの抗腫瘍剤をコードする配列がいったん得られたら、この配列が非腫瘍形成性タンパク質をコードすることを確認することが好ましい。特定の細胞成分の腫瘍形成性を評価する種々のアッセイが公知であり、そして容易に達成され得る。代表的アッセイには、ヌードマウスまたはラットにおける腫瘍形成、軟寒天中のコロニー形成、およびトランスジェニック動物（例えばトランスジェニックマウス）の調製などが含まれる。本発明のこの局面および多くの他の局面のために、ヌードマウスまたはラットにおける腫瘍形成は、抗腫瘍剤の腫瘍形成性を決定するのに特に重要でかつ高感度な方法である。ヌードマウスは機能的な細胞免疫系が欠如しており（すなわち、CTLを有さない）、従って細胞の腫瘍形成性の可能性を試験するのに有用なインビボのモデルを提供する。正常な非腫瘍形成性細胞は、ヌードマウス中で注入されても、制御されない増殖性質を示さない。しかし、形質転換細胞は、ヌードマウス中で急速に増殖し、そして腫瘍を発生させる。簡単に説明すると、１つの実施態様において、GDVは同系のマウスの細胞に送達され、次にヌードマウスに投与される。腫瘍の増殖を決定するために投与後の２〜８週間、マウスを肉眼で観察する。また腫瘍が存在するか否かを決定するために、マウスを屠殺し剖検し得る（Giovanellaら、J．Natl．Cancer Inst．48：1531-1533，1972；Fureszら、「Tumorigenicity testing of cell lines considered for production of bi ological drugs」Abnormal Cells，New Products and Risk，Hopps and Petricc iani編、Tissue Culture Association，1985；およびLevenbookら、J．Biol．St d． 13：135-141，1985）。腫瘍形成性はまた、軟寒天中のコロニー形成を可視化することによっても評価され得る(MacPhersonおよびMontagnier，Vir．23：291-29 4，1964)。簡単に説明すると、正常な非腫瘍形成性細胞の１つの性質は、「接触阻害」（すなわち、細胞は隣接する細胞に接触すると増殖を止める）である。細胞を半固体寒天支持培地中にプレートすると、正常な細胞は迅速に接触阻害されて増殖を止めるが、腫瘍形成性細胞は増殖し続けて軟寒天中でコロニーを形成する。トランスジェニックマウスのようなトランスジェニック動物はまた、抗腫瘍剤の腫瘍形成性を評価するために利用され得る（例えば、Stewartら，Cell 38:627 -637，1984; Quaifeら，Cell 48:1023-1034，1987;およびKoikeら，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 86:5615-5619，1989）。トランスジェニック動物においては、目的の遺伝子を動物の全ての組織において発現させ得る。トランスジーンのこの調節されない発現は、新たに導入した遺伝子の腫瘍形成化についてのモデルとして役立ち得る。腫瘍形成性に関する研究に加えて、一般に、非外傷性投与前に抗腫瘍剤のような有毒な緩和剤の毒性を決定することが好ましい。当業者間で周知の種々の方法を利用して、このような毒性を測定し得る。その一例として、例えば、種々のタンパク質および酵素の全身レベル、ならびに血液細胞の容量および数を測定する臨床化学アッセイが挙げられる。細胞媒介性および体液性応答が、上記の免疫原性部分を非外傷的に投与することによって、病原体、特にウイルス疾患および細菌疾患に対して誘導され得る。簡潔に記載すると、適切なエピトープを有する免疫原性部分は、化学合成（Berg otら，Applied Biosystems Peptide Synthesizer User Bulletin No．16，1986 ，Applied Biosystems，Foster City，California）、ならびに昆虫由来のバキュロウイルス系（Doerfler，Current Topics in Immunology 131:51-68，1986）、哺乳動物由来の系（例えばCHO細胞）（Bermanら，J．Virol．63:3489-3498，1 989）、酵母由来の系（McAleerら，Nature 307:178-180）、および原核生物系（ Burrelら，Nature 279:43-47，1979）のような組換え系におけるDNA発現を含む多数の公知の方法によって、産生され得る（EllisおよびGerety，J．Med．Virol ． 31:54-58，1990）。また、本発明は、免疫ダウンレギュレーション可能なGDVも提供する。不適切または不要な免疫応答の特異的なダウンレギュレーションが、自己免疫疾患、または疑似自己免疫疾患（例えば、慢性肝炎、糖尿病、慢性関節リウマチ、移植片対宿主疾患、およびアルツハイマー）、または骨髄のような異種組織の移植おいて、移植（MHC）抗原の表面発現を抑制する免疫抑制ウイルス遺伝子産物、またはその活性部分を用いて、操作され得る。本発明において、遺伝子産物の「活性部分」は、生物学的活性のために保持されていなければならない遺伝子産物のフラグメントである。このようなフラグメントまたは活性ドメインは、ヌクレオチド配列をそのタンパク質配列から系統的に除去し、得られる組換えGDVで標的細胞を形質転換し、FACS分析またはその他の免疫学的アッセイ（例えば、CTLアッセイ）を用いて、細胞表面上のMHCクラスI提示を測定することによって容易に同定され得る。これらのフラグメントは、タンパク質全体をコードする配列の大きさがウイルスキャリアのキャパシティを超える場合に特に有用である。あるいは、MHC抗原提示インヒビタータンパク質の活性ドメインは酵素的に消化され得、そして活性部分が生化学的な方法によって精製され得る。例えば、このタンパク質の活性部分をブロックするモノクローナル抗体が、切断されたタンパク質の活性部分を単離および精製するために用いられ得る（Harlowら，Antibodies: A La boratory Manual，Cold Springs Harbor，1988）。１つの実施態様において、その抑制は、アクセサリー分子（例えば、CD8、細胞内接着分子-1(ICAM-1)、ICAM-2、ICAM-3、白血球機能抗原-1(LFA-1)（Altmann ら，Nature 338:521，1989）、B7.1-.3分子（Freemanら，J．Immunol．143:2714 ，1989）、LFA-3（Singer，Science 255:1671，1992; Rao，Crit．Rev．Immunol ．10:495，1991）またはその他の細胞接着分子）と一緒に自己MHC分子に会合して処理済ペプチドを提示することにより、CTLの活性化を特異的に阻害することによって遂げられる。MHCクラスI分子に関連した抗原ペプチド提示は、CTL活性化を導く。生成物を発現し得る特定の配列の移入および安定的な組み込みは、MH C抗原提示を阻害し、CD8⁺CTLのようなＴ細胞の活性化をブロックし、それにより移植片拒絶を抑制することが予期される。標準的なCTLアッセイが、この応答を検出するために用いられる。抗原提示経路の成分は、45Kd MHCクラスI重鎖、β₂ -ミクログロブリン、プロテアーゼのようなプロセシング酵素、アクセサリー分子、カルネキシン(calnexin)(Gaczynskaら、Nature，365:264-282，1993)のようなシャペロン、およびPSF1、TAP1およびTAP2(Driscollら、Nature，365:262-263 ，1993)のような輸送体タンパク質を包含する。他の例において、組換えGDVは、β₂-ミクログロブリンに結合し得る遺伝子産物または遺伝子産物の活性部分の発現を指向する。抗原提示のためのMHCクラスI 分子の細胞表面への移動には、β₂-ミクログロブリンとの会合が必要である。このように、β₂-ミクログロブリンと結合しそして、これがMHCクラスIとの会合を阻害するタンパク質は、間接的にMHCクラスI抗原提示を阻害する。適したタンパク質としては、H301遺伝子産物を含む。簡潔に記載すると、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）から得られたH301遺伝子は、MHCクラスI分子の重鎖上のβ₂-ミクログロブリン結合部位と配列相同性のある糖タンパク質をコードする（Browneら，Nature 347:770，1990）。H301はβ₂-ミクログロブリンと結合し、それにより MHCクラスI分子の成熟が妨げられ、形質転換細胞を細胞傷害性Ｔ細胞によって認識できないようにし、MHCクラスI拘束性免疫監視を逃れる。別の実施態様において、組換えGDVは、新たに合成されたMHCクラスI分子と細胞内で結合するタンパク質またはタンパク質の活性部分の発現を指向する。この結合は、MHCクラスI分子の小胞体からの移入を妨げ、その結果末端グリコシル化の阻害が生じる。これは、これらの分子の細胞表面への移動をブロックし、そしてCTLによる細胞認識および溶解が防止する。例えば、E3遺伝子の生成物の１つが、MHCクラスI分子の形質転換細胞表面への移動を阻害するために使用され得る。より具体的には、E3は、アデノウイルス２ゲノムのE3領域から転写された19kD 膜貫通糖タンパク質であるE3/19Kをコードする。本発明に関して、組織細胞は、発現時にE3/19Kタンパク質を産生するE3/19K配列を含む組換えGDVで形質転換される。E3/19Kタンパク質は、MHCクラスI表面分子の表面発現を阻害し、GDVにより形質転換された細胞は免疫応答を逃れることになる。その結果、ドナー細胞は、より減少した移植片拒絶のリスクで移植され得、移植患者においても最小限の免疫抑制レジメンが要求されるのみである。これは、受容可能なドナー・レシピエントキメラ状態が、より少ない合併症で存在することを可能とする。同様の処置が、全身エリテマトーデス、多発性硬化症、慢性関節リウマチまたは慢性Ｂ型肝炎感染を含むいわゆる自己免疫疾患を処置するために使用され得る。別の免疫抑制法として、アンチセンスメッセージ、リボザイム、または他の天然に存在する自己反応性のＴ細胞クローンに特異的な他の遺伝子発現インヒビターを使用が挙げられる。これらは、自己免疫応答を担う特定の不要なクローンのＴ細胞レセプターの発現をブロックする。アンチセンス、リボザイム、またはその他の遺伝子が、ウイルスベクター送達系を用いて導入され得る。上述したものとは異なるその他のタンパク質のうち、MHCクラスI抗原提示を阻害、抑制、あるいはダウンレギュレーションする機能を有するタンパク質がまた、同定され、そして本発明の文脈内で利用され得る。このようなタンパク質、特に哺乳動物の病原体由来のタンパク質（および、代わりに、その活性部分）を同定するために、MHCクラスI抗原提示を阻害し得るタンパク質またはその活性部分を発現する、組換えGDVが、BCのようなテスター細胞株に形質転換される。このテスター細胞系を、その候補のタンパク質をコードする配列を有するおよび有さないテスター細胞株が、CTLアッセイにおけるスティミュレーターおよび／または標的と比較される。形質転換したテスター細胞に対応する細胞溶解の減少は、候補のタンパク質がMHC提示を阻害し得ることを示す。 MHCクラスI表面発現のダウンレギュレーションを測定するための別の方法は、 FACS分析によるものである。より具体的には、細胞株が候補のタンパク質をコードする組換えGDVで形質転換される。薬物選択そして拡大の後、その細胞がFACS によってMHCクラスI発現について分析され、そして非形質転換細胞の場合と比較される。MHCクラスIの細胞表面発現の減少は、候補のタンパク質がMHC提示を阻害し得ることを示す。本発明のこの局面については、優先権出願においてさらに考察される。多くの感染性疾患、ガン、自己免疫疾患、および他の疾患には、ウイルス粒子と細胞、細胞と細胞、または細胞と因子との相互作用を含む。ウイルス感染において、ウイルスは通常は感受性のある細胞表面のレセプターを介して細胞に入る。ガンにおいて、細胞は他の細胞または因子由来のシグナルに不適切に応答し得るかまたはまったく応答しない。自己免疫疾患において、「自己」マーカーの不適切な認識が存在する。本発明において、そのような相互作用は、相互作用におけるパートナーのいずれかに対するアナログをインビボで産生するGDVを利用することによりブロックされ得る。このようなアナログはブロッキング剤として公知である。このブロッキング作用は細胞内、細胞膜上、または細胞外で起こり得る。ブロッキング剤のための遺伝子を保有するウイルスGDV、または特にレトロウイルスG DVのブロッキング作用は、感受性細胞の内部から、または病原性相互作用を局所的にブロックするブロッキングタンパク質の一種を分泌することにより媒介され得る。例えば、HIVの場合、相互作用の２つの作用物質はgp120/gp41エンベロープタンパク質およびCD4レセプター分子である。従って適切なブロッカーは、病原作用を引き起こさずHIVの侵入をブロックするHIV envアナログ、またはCD4レセプターアナログのいずれかを発現するGDVである。CD4アナログは、分泌され、そして隣接する細胞を保護するように機能し、一方gp120/gp41はベクター含有細胞のみを保護するように、分泌されるかまたは細胞内でのみ産生される。安定性または補体溶解性を強化するために、CD4にヒト免疫グロブリン重鎖かまたは他の成分を添加することが有利であり得る。そのようなハイブリッド可溶性CD4をコードするレトロウイルスベクターの宿主への送達は、安定なハイブリッド分子の連続的な供給をもたらす。 HIV envの発現を導くベクター粒子がまた構築され得る。どの部分が明白な病原性の副作用なしにウイルス吸着を阻止することができるかは当業者に明らかである(Willeyら、J.Virol.62:139,1988;Fisherら、Science 233:655,1986)。本発明の別の局面では、細胞型の中で欠失、変異、または発現されない場合に、その細胞型の中で腫瘍形成を導く、抑制遺伝子の送達に関する。ウイルスベクターによる欠失した遺伝子の再導入は、これらの細胞における腫瘍の表現型の退縮を導く。悪性腫瘍は、細胞増殖に比較した細胞の末端分化の阻害と考えられ得るので、その送達、および腫瘍の分化を導く遺伝子産物の発現はまた、一般的には退縮を導くはずである。上記の変化した細胞成分をコードする配列は、種々の供給源から得られ得る。例えば、変化した細胞産物をコードする配列を含むプラスミドは、American Typ e Culture Collection（ATCC、Rockville、Maryland）のような寄託機関、またはAdvanced Biotechnologies（Columbia、Maryland）のような市販の供給源から得られ得る。前記の配列のいくつかを含むプラスミドの代表例として、ATCC No. 41000（rasの12番目のコドンにＧからＴへの変異を含む）、およびATCC No.4104 9（12番目のコドンにＧからＡへの変異を含む）を含む。あるいは正常な細胞成分をコードするプラスミドはまた、ATCCのような寄託機関から得られ得（例えば、ATCC No.41001、正常なrasタンパク質をコードする配列を含む；ATCC No.57103，ablをコードする；およびATCC No.59120またはNo.59 121，bcr座をコードする）、そして変化した細胞成分を形成するために変異させる。特定の部位を変異させる方法は、当該分野で公知の方法（例えば、Sambrook ら、前出、15.3以下を参照のこと）を用いて容易に実施され得る。特にrasのような正常な細胞成分の点変異は、特定のコドン（例えば、コドン12、13、または 61）の部位特異的変異誘発により容易に実施され得る。上記の物質をコードする他の核酸分子、ならびに本発明において使用するために有利な他の核酸分子は、種々の供給源、例えばAmerican Type Culture Collec tion（ATCC、Rockville、Maryland）、またはBritish Bio-Technology Limited （Cowley、Oxford、England）のような市販の供給源から容易に得られ得る。代表例として、BBG12（127アミノ酸の成熟タンパク質をコードするGM−CSF遺伝子を含有する）；BBG6(γインターフェロンをコードする配列を含有する)；ATCCNo .39656（TNFをコードする配列を含む）；ATCC No.20663(αインターフェロンをコードする配列を含む)；ATCC No.31902,31902およびNo.39517(βインターフェロンをコードする配列を含む)；ATCC No.67024(インターロイキン-1bをコードする配列を含む)；ATCC No.39405,No.39452、No.39516、No.39626、およびNo.3967 3(インターロイキン-２をコードする配列を含む)；ATCC No.59399、No.59398、およびNo.67326(インターロイキン-３をコードする配列を含む)；ATCC No.57592 (インターロイキン-４をコードする配列を含む)；ATCC No.59394およびNo.59395 (インターロイキン-５をコードする配列を含む)；そしてATCC No.67153 (インターロイキン-６をコードする配列を含む)が挙げられる。Ｂ型肝炎ウイルスをコードする分子をクローン化されたゲノムは、種々の供給源、例えばAmerican Type Culture Collection(ATCC,Rockville,Maryland)から入手され得る。例えばATCC No.45020は、pBR322(Moriartyら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 78：2606-2610，1981)のBam HI部位にＢ型肝炎の全ゲノムDNA(精製したDane粒子から抽出された)（Blumら、TIG 5（5）：154-158，1989 の図３を参照のこと）を含む。(修正可能な間違いがATCC No.45020の配列に生じることに注意のこと)。あるいは本発明の使用のためのcDNA配列は、その配列を発現するかまたは含む細胞から得られ得る。簡潔に記載すると、１つの実施態様において、目的の遺伝子を発現する細胞由来のmRNAは、オリゴdTまたはランダムプライマーを用いて逆転写酵素により逆転写される。次いでその１本鎖cDNAが、所望の配列のいずれかの側の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR（米国特許第4 ,683,202号；同第4,683,195号および同第4,800,159号を参照のこと。またPCR Te chnology：Principles and Applications for DNA Amplification，Erlich編、S tockton Press，1989も参照）により増幅し得る。特に２本鎖DNAは、熱安定性Ta qポリメラーゼ、配列特異的DNAプライマー、ATP、CTP、GTPおよびTTPの存在下で、加熱により変性される。合成が完了すると２本鎖DNA が産生される。このサイクルは何回も繰り返され得、所望のDNAが何乗倍も増幅される。本発明での使用に適切な核酸分子はまた、例えば、Applied Biosystems Inc．のDNA 合成機（例えば、APB DNA合成機モデル392(Foster City、California)）で合成され得る。 IV．遺伝子療法本発明の１つのさらなる局面は、治療効果または増強した治療効果を達成するための上述のようなベクターおよび核酸配列の非外傷性投与である。本発明の実施例のように、GDVはゴシェ病の処置に用いられ得る。ゴシェ病は酵素グリコセレブロシダーゼの欠損を特徴とする遺伝子障害である。この型の治療は、欠損細胞酵素を提供することによる単一の遺伝子置換療法の１例である。この酵素の欠損は、体内のすべての細胞のリソソーム中のグルコセレブロシドの蓄積を導く。しかし疾患の表現型は、この疾患の非常にまれな神経障害の形態を除いて、マクロファージにのみ現れる。この疾患は通常肝臓および脾臓の拡大ならびに骨の傷害を導く（総説については、Science 256：794，1992 およびThe M etabolic Basis of Inherited Disease、第６版、Scriver ら、第２巻、1677頁を参照のこと）。処置のための種々のアプローチには、免疫グロブリンでコートされた赤血球の再封およびリポソーム技術を含む種々のマクロファージ標的化技術を用いてヒト胎盤から精製された外因性の酵素の供給が挙げられるが、患者における臨床進歩は最小であった。ヒトグリコセレブロシダーゼが工業的な規模で精製され、マクロファージ標的化のために改変されるまで（aglucerase^TMとして商業的に公知である）、重要な臨床的進歩が観察されなかった。しかし、この処置には１患者あたり１年に平均＄765,000の費用がかかり得る（Science 256:794 ，1992の総説を参照のこと）。本発明の状況において、患者が発現する能力を有さないタンパク質に対する遺伝子で処置される場合、そのタンパク質に応答する抗体のみではなく、そのタンパク質を作る細胞に対する細胞免疫応答も生じ得る。これは、アデノウイルスE3 タンパク質のような免疫抑制遺伝子をコードするGDVと組み合わせて、グリコセレブロシダーゼをコードするGDVを投与することにより未然に防ぎ得るか、または最小化し得る。Ｖ．薬学的に受容可能なキャリアおよび希釈物薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物は、使用される投与量および濃度では、患者に対して非毒性である。好ましくは、キャリアは錠剤またはカプセル中の無水GDVの投与の促進に適切な固体キャリアである。 GDVの１つ以上、および好ましくは全てのGDVが、レトロウイルスベクターである実施態様においては、粗製なまたは精製形態のGDVを含む水性懸濁物を、凍結乾燥または室温での蒸発により乾燥させ得る。具体的には、凍結乾燥は、水溶性の懸濁物を、ガラス転移温度以下に、または水性懸濁物の共融点温度以下に冷却する工程、および冷却した懸濁物から凍結乾燥したウイルスを形成するために、昇華により水分を除去する工程を包含する。簡潔に記載すると、処方された組換えウイルスのアリコートが凍結乾燥機（Supermodulyo 12K）に取り付けたEdward s Refrigerated Chamber(3 shelf RC3S unit)に置かれる。Phillipsら(Cryobiol ogy，18:414，1981)により記載されたような多段階凍結乾燥手順が、処方された組換えウイルスを、好ましくは−40℃〜−45℃の温度で凍結乾燥するために用いられる。得られる組成物は、凍結乾燥ウイルスの10重量％未満の水を含む。いったん凍結乾燥されると、その組換えウイルスは安定であり、そして−20℃〜−25 ℃で保存され得る。蒸発法では、水分は室温で蒸発により水性懸濁物から除去される。１つの実施態様において、水分は噴霧乾燥により除去される（欧州特許第 520,748号）。噴霧乾燥プロセスにおいて、水性懸濁物は予め加熱された気体流（通常は空気流）の中に送達され、この際懸濁液の液滴から水分は急速に蒸発する。噴霧乾燥装置は、多くの製造業者から入手可能である（例えば、Drytec Ltd.,Tonbridge、Eng land；Lab-Plant，Ltd.，Huddersield、England）。一旦脱水されると、組換えウイルスは安定であり、そして、−20℃〜−25℃で保存され得る。本明細書に記載した方法において、得られる乾燥または凍結乾燥ウイルスの水分含量は、カール−フィッシャー装置（EM Science Aquastar^TMVIB 容積滴定機、Cherry Hill、 NJ）の使用により、または重量法により測定され得る。キャリアまたは希釈物の代表例として、水、好ましくは生理学的なpHに緩衝化される(例えば、リン酸緩衝化生理食塩水またはTris緩衝化生理食塩水)等張生理食塩水溶液、マンニトール、デキストロース、グリセロール、およびエタノール、ならびにヒト血清アルブミンのようなポリペプチドまたはタンパク質が挙げられ、ここでこの組成物は乾燥していない。好ましい組成物は、10mg/mlマンニトール、１mg/ml HSA、20mM Tris(pH7.2)、および150mM NaCl中のベクターまたは組換えウイルスを包む。この場合、GDVは約１mgの物質であるので、高分子量物質の１％未満であり得、そして総物質（水を含む）の1/100,000未満であり得る。この組成物は−70℃で少なくとも６カ月は安定である。いくつかの場合において、形質導入頻度を改良するために弱いポリカチオン（例えば、ポリプレンまたはDEAE-デキストラン）を１〜30μg/mlで添加することが必要であり得る。薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物は、液体溶液として、または投与前に溶液に再懸濁されてもよいが、好ましくは再懸濁されない固体の形態（例えば、凍結乾燥された）のいずれかとしての組成物を提供するためにGDVと組み合わせられ得る。さらに、組成物は口、鼻、または直腸投与のいずれかに適切なキャリアまたは希釈物、あるいはその組成物に適切な他の手法を用いて調製され得る。代表的にはGDVは、処方前に0.25％から25％に、そして好ましくは約５％から2 0％の範囲の濃度に精製される。次いで、GDVが組換えウイルスである組成物の調製後、組換えウイルスは、約10倍の物質量が存在する同時精製された汚染物質とともに、１投与量あたり約10ng〜１μgの物質から構成される。好ましくは、その組成物は、下記の様に処方された0.1〜1.0mlの水溶液中に調製される。本発明の薬学的に受容可能な組成物はまた、細胞分裂を刺激する因子をさらに含み得、そしてそれゆえ、組換えレトロウイルスベクターのようなGDVの取り込みおよび組み込みを刺激する。代表的な例として、メラノサイトに対するメラノサイト刺激ホルモン（MSH）、乳癌腫または上皮癌腫に対する上皮成長因子（EGF ）、および筋肉内注射用の麻酔ビプボカイン（bipuvocaine）（または関連化合物）が挙げられる。組換えウイルスを保存するための特に好ましい方法、および組成物は、「組換えウイルスを保存するための方法」と題された米国特許出願に記載される。前記のように、GDVは、所望の抗原の少なくとも１つの免疫原部分に加えて、免疫調節因子の発現を指向し得る。しかし、GDVがサイトカインである免疫調節因子を発現しない場合、このサイトカインは前記の組成物に含有され得るか、または前記組成物と分けて（同時にまたは続いて）投与され得る。簡潔に記載すると、このような実施態様においては、免疫調節因子は、好ましくはThe Physicia n's Desk Referenceに規定されたような標準的なプロトコルおよび投与量に従って投与される。例えば、αインターフェロンは、１日あたり100万から500万ユニットの投与量で、２〜４ヶ月間投与され得、そしてIL-2は、体重１kgあたり10,0 00〜100,000ユニットの投与量で１日あたり１〜３回で、２〜12週間投与され得る。γインターフェロンは、150,000〜1,500,000ユニットの投与量で１週間に２〜３回で、２〜12週間投与され得る。好ましい組成物は、10mg/mlマンニトール、1mg/ml HSA、20mM Tris(pH7.2)、および150mM NaCl中のベクターまたは組換えウイルスを含む。この場合において、組換えベクターは約１μgの物質を示すので、高分子量物質の１％未満、および総物質（水を含む）の1/100,000未満であり得る。この組成物は、−70℃で少なくとも６ヶ月間は安定である。好ましくは、組成物または組成物の代表的なサンプルは、最初に所望の経路を介して動物へ非外傷的に投与され、次いでこの動物を生物学的応答について試験する。このような試験は、HIV遺伝子産物およびHBV遺伝子産物に対する免疫応答の証拠のための免疫学的スクリーニングアッセイ（例えば、CTLアッセイ、抗体アッセイ）を含み得る。このような試験に基づいて、GDVの力価を所望の効果をさらに増大するように調整し得る。次に、この組成物は、適切な経路によりヒトに非外傷的に投与され、この後に組成物の効力を決定するためのスクリーニングアッセイおよび他の試験が続く。本発明の薬学的に受容可能な組成物はまた、細胞分裂を刺激する因子をさらに含み得、そしてそれゆえ、組換えレトロウイルスベクターのようなGDVの取り込みおよび組み込みを刺激する。代表的な実施例として、メラノーマに対するメラノサイト刺激ホルモン（MSH）、乳癌腫または他の上皮癌腫に対する上皮成長因子（EGF）が挙げられる。前記のように、GDVは、所望の物質に加えて、免疫調節補因子の発現を指向し得る。しかし、GDVがこのような免疫調節補因子（例えば、サイトカイン）を発現しない場合、この免疫調節補因子は前記の組成物に含有され得るか、または前記組成物と分けて（同時にまたは続いて）投与され得る。簡潔に記載すると、このような実施態様においては、免疫調節補因子は、好ましくはThe Physician's Desk Referenceに規定されるような標準的なプロトコルおよび投与量に従って投与される。例えば、αインターフェロンは、１日あたり100万〜500万ユニットの投与量で、２〜４ヶ月間、そしてIL-2は、体重１kgあたり10,000〜100,000ユニットの投与量で１日あたり１〜３回で、２〜12週間投与され得る。γインターフェロンは、150,000〜1,500,000ユニットの投与量で１週間に２〜３回で、２〜12 週間投与され得る。本発明の好ましい実施態様において、前記の細胞傷害性遺伝子または遺伝子産物(例えば、HSVTK)の非外傷性投与に加え、種々の付加的な治療的組成物が、病原性物質を阻害または破壊するために、温血動物に同時に非外傷的に投与されるか、または続いて投与され得る。このような治療的組成物は、直接投与され得るか、または別の実施態様によれば、独立のGDVから発現され得る。あるいは、細胞傷害性遺伝子または遺伝子産物、および治療的組成物をコードする遺伝子（例えば、前記のような非ベクター由来の遺伝子）の両方の発現を指向する単一のGD Vが、病原性物質を阻害または破壊するために、温血動物に投与され得る。特に好ましい実施態様において、HSVTK遺伝子およびヒトγ-IFNのような免疫アクセサリー分子をコードする遺伝子の両方を送達および発現するベクターまたはベクターVCLが、患者に投与され得る。このような構築物において、１つの遺伝子はベクターLTRから発現され得、そしてその他のものは、LTR間に見出される付加的な転写プロモーターを利用し得るか、または内部のリボソーム結合部位を利用して、ポリシストロン性のmRNAとして発現され得る。インビボの遺伝子転移の後、患者の免疫系はc-IFNの発現のために活性化される。これが起こった後に、全体の腫瘍荷重それ自体は、より効果的な腫瘍の免疫攻撃を可能とするアシクロビルまたはガンシクロビルを用いて患者を処置することにより減少し得る。引き続いて、炎症性細胞での死腫瘍の浸潤は、免疫提示を増大させ、そしてさらに腫瘍に対する患者の免疫応答を改善する。従って、いくつかの実施態様において、GDVが（a）正常の健康な細胞を形質導入し、そしてその細胞を全身に分泌される治療的タンパク質または他の物質のプロデューサーに形質転換するか、あるいは（b）異常または欠陥細胞を形質転換し、その細胞を正常な機能の表現型に形質転換するか、そのいずれかであり得るように、GDVは、このような様式で非外傷性投与され得る。 GDVは動物に投与され得る。好ましい実施態様において、動物は温血動物であり、さらに好ましくはマウス、ニワトリ、ウシ、ウマ、およびヒトからなる群より選択される。あるいは、動物は冷血動物であり得、好ましくは魚類、水生脊椎動物、および貝類・甲殻類からなる群より選択される。実施例実施例１レトロウイルスベクター骨格の調製レトロウイルス骨格KT-1およびKT-3Bの調製 N2ベクター（Armentanoら，J．Vir．61:1647-1650,1987；Eglitasら,Science 230:1395-1398,1985）由来のモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）5'長末端反復（LTR）EcoRI-EcoRIフラグメント（gag配列を含む）をプラスミドSK⁺（Stra tagene，La Jolla，CA）に連結する。得られた構築物をN2R5と名づける。このN2 R5構築物を、ATG開始コドンをATTに変える部位特異的インビトロ変異によって変異させ、gag発現を防止する。変異させたこのフラグメントは200塩基対（bp）長であり、PstI制限部位が隣接している。PstI-PstI変異フラグメントをSK⁺プラスミドから精製し、それをプラスミドpUC31中のN2 MoMLV5’LTRのPstI部位に挿入することによって、非変異200bpフラグメントを置換する。プラスミドpUC31はpU C19（Stratagene，La Jolla，CA）に由来し、追加の制限部位XhoI、BgIII、BssH IIおよびNcoIがポリリンカーのEcoRI部位とSacI部位との間に挿入されている。この構築物をpUC31/N2R5gMと名づける。 N2由来の1.0キロベース（Kb）のMoMLV3’LTR EcoRI-EcoRIフラグメントをプラスミドSK⁺中にクローン化して、N2R3^-と称する構築物を得る。1.0KbのClaI-Hind IIIフラグメントをこの構築物から精製する。ネオマイシン（neo）ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を駆動するSV40 初期プロモーターを含む、pAFVXMレトロウイルスベクター（Krieglerら，Cell 3 8: 483,1984; St．Louisら，PNAS 85:3150-3154,1988）由来のClaI-ClaI優性選択マーカー遺伝子フラグメントを、SK⁺プラスミド中にクローン化する。この構築物をSK⁺SV₂-neoと名づける。1.3KbのClaI-BstBI遺伝子フラグメントをSK⁺SV₂- neoプラスミドから精製する。目的の遺伝子を含むXhoI-ClaIフラグメントと1.0KbのMoMLV3'LTR ClaI-HindII IフラグメントとをpUC31/N2R5gMプラスミドのXhoI-HindIII部位に挿入する３部分連結によって、KT-3BまたはKT-1ベクターを構築する。これは、KT-1骨格を有すると称されるベクターを与える。次に、pAFVXMレトロウイルスベクター由来の 1.3KbのClaI-BstBI neo遺伝子フラグメントをこのプラスミドのClaI部位にセンス方向に挿入して、KT-3B骨格を有すると称されるベクターを得る。実施例２第VIII因子のレトロウイルスベクターの経口投与Ａ．全長およびＢドメイン欠失の第VIII因子cDNA RETROVECTOR^TMの構築ｉ．全長の第VIII因子をコードするプラスミドベクターの産生以下に、全長の第VIII因子cDNAをコードするいくつかのレトロウイルスベクターの構築を記載する。レトロウイルスベクターのパッケージング抑制により、そして形質導入細胞の選択は治療に必要とされないために、選択マーカー遺伝子を欠くレトロウイルス骨格（例えば、KT-1）を用いる。全長の第VIII因子をコードする遺伝子は、種々の供給源から入手し得る。ここで、この全長の遺伝子は、プラスミドpCIS-F8（1993年３月３日に公開された欧州特許第0 260 148 A2号を参照のこと）から得られる。このプラスミドは全長の第VIII因子cDNAを含み、その発現はCMV主要前初期（CMV MIE）プロモーターおよびエンハンサーの制御下にある。第VIII因子cDNAは、第VIII因子遺伝子由来の約 80bpの5'非翻訳配列および約500bpの3'非翻訳領域を含む。さらに、CMVプロモーターと第VIII因子配列のと間には、CMVイントロン配列、あるいは「シス」エレメントが存在する。このシスエレメントは、約280bpにわたり、Ig可変領域イントロンによって供給される介在領域を有する免疫グロブリン遺伝子由来のスプライスアクセプターの約140bp上流にCMV主要前初期プロモーター由来のスプライスドナー部位を含む。 ii．レトロウイルスベクターND-5をコードするプラスミドの構築第VIII因子cDNAの3'非翻訳領域の約80％（約370bp）の短縮物をコードするプラスミドベクター（pND-5と命名した）を、以下のようにpKT-1ベクターで構築する：pJW-2に関して以下に記載したように、用いたpKT-1ベクターのXhoI制限部位をNotIの制限部位に置き換える。第VIII因子の挿入物を、ClaIおよびXbaIでpCIS -F8を消化することにより作製する。後者の酵素は第VIII因子の停止コドンの5' を切断する。次に、第VIII因子の遺伝子のすべてであるがその3'コード領域を含む約７kbのフラグメントを精製する。pCIS-F8はまた、XbaIおよびPstIで消化して、その遺伝子の終止コドンを含む121bpフラグメントを遊離する。このフラグメントもまた精製し、そして次に、第VIII因子遺伝子の残り部分をコードするよド（Stratagene、前出）との３点連結(a three way ligation)で連結して、pND- 2を作製する。次に、pND-2内の唯一のSmaI部位を、希釈条件下で、ClaIリンカー（New Engla nd Biolabs，Beverly，MA）をSmaI消化により生じた平滑末端へ連結することによりClaI部位に変更する。再環状化および連結の後、２つのClaI部位を含むプラスミドを同定して、pND-3と称する。 pND-3内の第VIII因子配列（ClaI部位により結合させ、そして3'非翻訳領域の多くを短縮化した全長遺伝子を含有する）を、以下のように、pJW-1のNotI/ClaI 消化に由来するプラスミド骨格（XhoI部位で切断し、クレノウで平滑化し、そしてNotIリンカー（New England Biolabs）を挿入することによるpKT-1誘導体）にクローン化する。このプラスミド骨格は、5.2kbのNotI/ClaIフラグメントを生じる。pCIS-F8をEagIおよびEcoRVで開裂し、そして約4.2kbの生成フラグメント（全長の第VIII因子遺伝子の5'部分をコードする）を単離する。pND-3をEcoRVおよびClaIで消化し、そして3.1kbのフラグメントを単離する。次に、第VIII因子遺伝子の部分を含むこの２つのフラグメントをNotI/ClaI消化のベクター骨格に連結してpND-5と命名したプラスミドを得る。 pND-3内の第VIII因子配列（ClaI部位により結合させ、そして3'非翻訳領域の多くを短縮化した全長遺伝子を含有する）を、以下のように、pJW-1のNotI/ClaI 消化に由来するプラスミド骨格（XhoI部位で切断し、クレノウで平滑化し、そしてNotIリンカー（New England Biolabs）を挿入することによるpKT-1誘導体）にクローン化する。このプラスミド骨格は、5.2kbのNotI/ClaIフラグメントを生じる。pCIS-F8をEagIおよびEcoRVで開裂し、そして約4.2kbの生成フラグメント（全長の第VIII因子遺伝子の5'部分をコードする）を単離する。pND-3をEcoRVおよびClaIで消化し、そして3.1kbのフラグメントを単離する。次に、第VIII因子遺伝子の部分を含むこの２つのフラグメントをNotI/ClaI消化のベクター骨格に連結してpND-5を得る。当業者が評価するように、上記のようにレトロウイルスベクターをコードするプラスミドの構築後、次いで、このようなプラスミドを、感染性組換えレトロウイルスを産生し得る種々の細胞株の産生に使用し得る。このような細胞株の産生を以下の実施例に記載する。これらの構築物を、以下の実施例2Ca〜2Ccに記載のように感染ベクター粒子を作製するために使用する。 iii．レトロウイルスベクターJW-2をコードするプラスミドの構築全長の第VIII因子を発現させるためのレトロウイルスベクターをコードするプラスミド(pJW-2)をpKT-1由来のKT-1骨格を用いて構築する。pKT-1内の第VIII因子cDNAインサートの直接的クローン化を促進するために、部位特異的変異誘発により、唯一のXhoI部位をNotI部位に変換する。次いで、得られたプラスミドベクターをNotIおよびClaIで開く。pCIS-F8をClaIおよびEagIで完全に消化し（このため２つの部位が存在する）、全長の第VIII因子をコードするフラグメントを放出する。次いで、このフラグメントを、NotI/ClaI制限ベクター内に連結し、pJW -2を生成する。 iv．Ｂドメイン欠失ベクターの構築Ｂ欠失のFVIIIの先駆体DNAをMiles Laboratoryから入手する。この発現ベクターをp25Dと命名する。これは上記のpCISF8と全く同一の骨格を有する。p25D内の FVIII8 cDNAの3'でのHpaI部位をオリゴリンカーによりClaIに改変する。AccI〜C laIフラグメントを、改変したp25Dプラスミドから切り取る。このフラグメントはＢドメイン欠失におよび、そしてcDNAの完全な3'の３分の２を含む。AccI〜Cl aIフラグメントを上記のRetrovector^TM JW-2から除き、そして上記の改変したＢドメイン欠失フラグメントと置き換える。これを、B-del-1と命名する。Ｂ．ｉ．マウス細胞の一時的パッケージングおよび形質導入によるKT-ND5ベクター発現の有用性のアッセイ細胞株、L33（Dennert，USC Comprehensive Cancer Center，Los Angeles，CA 、Patekら、Int．J．of Cancer 24：624-628，1979）、BC10ME（Patekら、Cell Immunol 72：113，1982，ATCC番号TIB85）、L33env、およびBCenv（L33envおよびBCenvはHIV-1 IIIBenvを発現する、Warnerら、AIDS Res．and Human Retrovir us 7：645，1991）を、アンフォトロピックまたはVSVG外皮タンパク質を担うKT- ND5ベクターで形質導入し、第VIII因子の発現について調べる。非形質導入細胞も、第VIII因子発現について分析し、そしてKT-ND5形質導入細胞と比較してタンパク質発現に対する形質導入の効果を決定する。マウス細胞株、L33-KT-ND5、L33env-KT-ND5、L33env、L33、BC10ME、BC10ME-K T-ND5、BCenv、およびBCenv-KT-ND5を、KT-ND5分子の発現について試験する。細胞をサブコンフルエントな密度まで増殖させ、そしてその上清を200×ｇの遠心 rum Diagnostica，Molndal，Sweden）によりアッセイする。アッセイを以下のように実施する。100μlの培養培地サンプルを、キットに付属する作用緩衝液の200μlと混合する。この混合物を37℃で４〜５分間インキュベートし、その後、0.025Ｍ CaCl₂ストック溶液の100μLを添加する。その後、５分間37℃でインキュベートする。次に、200μLの発色試薬（10mL中に、20mgの S-2222、335μgの合成トロンビン阻害剤（I-2581））と混合する。37℃で５分のインキュベーション後、20％酢酸または２％クエン酸の100μLを添加して、反応を停止させる。次に、吸光度を、50mM Tris（pH 7.3）および0.2％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有するブランクに対して測定する。正常なヒト血漿（1.0IU第 VIII因子／mL）の希釈物に基づく標準曲線を使用する。そしてアッセイはプラスチックチューブ内で行うべきである。非血友病患者の第VIII因子の血清レベルは、200ng/mLの範囲内である。このアッセイを患者サンプルについて使用する場合、９容量の血液を、pH7.5 で１容量の0.1Ｍクエン酸ナトリウムと混合し、そして20〜25℃で５〜20分間2,0 00×ｇで遠心分離して細胞をペレット化する。第VIII因子は熱に不安定であるため、血漿サンプルを、単離の30分以内に試験すべきであり、あるいは、−70℃で直ちに保存すべきである。しかし、凍結および解凍中に、20％もの第VIII因子の活性が喪失し得る。 ii．ヒト細胞の一時的パッケージングおよび形質導入によるKT-ND5ベクター発現の有用性のアッセイ KT-ND5で形質導入した細胞株を、第VIII因子の発現について調べる。非形質導入細胞を分析してKT-ND5形質導入細胞と比較し、そして形質導入が発現に対して有する効果を決定する。２つのヒト細胞株（JYおよびJY-KT-ND5）をKT-ND5の発現について試験する。1 0⁶細胞／mlに増殖させた懸濁細胞を培養フラスコからピペットにより取り出し、そして200×ｇでの遠心分離によりペレット化する。その上清を除き、希釈し、そして上記の実施例2Biに記載のように、COATEST^R第VIII因子アッセイによりアッセイする。Ｃ．ベクター構築物KT-ND5によるパッケージング細胞株HXおよびDAの一過性のトランスフェクションおよび形質導入ａ．プラスミドDNAトランスフェクション１日目に、パッケージング細胞株HX（WO92/05266）を、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および10％ウシ胎児血清（FBS）を有する10cm組織培養ディッシュに5.0×10⁵細胞で播種する。２日目に、トランスフェクションの４時間前に、培地を5.0mlの新鮮な培地に置換する。40.0μlの2.5M CaCl₂、10μgのプラスミドDNAおよび脱イオンH₂Oを混合して総容量を400μlにすることによって、標準的なリン酸カルシウム-DNA共沈を行なう。400μlのDNA-CaCl₂溶液を、一定に攪拌しながら400μlの沈澱緩衝液（50mM HEPES-NaOH，pH7.1; 0.25M NaCl,および1.5 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄）に滴下する。この混合物を室温で10分間インキュベートする。得られた細かい沈澱物を細胞の培養ディッシュに加える。細胞をDNA沈澱物とともに37℃で一晩インキュベートする。３日目に、培地を吸引し、そして新鮮な培地を加える。上清を４日目に取り出し、0.45μlのフィルターに通し、そして−80℃で保存する。あるいは、29 2 3細胞（WO92/05266）（これらはgagおよびpolを発現する293 細胞である）をベクターDNAおよびプラスミドpMLP-VSVG（または他のVSVGをコードするプラスミド）でトランスフェクトして、VSVG偽型化（pseudotyped）ベクター粒子を得て、それを上記のように収集し、そして保存する。ｂ．パッケージング細胞株形質導入およびプロデューサー株の生成１日目に、DA（D17細胞株ATCC寄託番号第183号由来のアンフォトロピック細胞株,WO92/05266）細胞を、10ml DMEMおよび10％FBS、４μg/mlポリブレン（Sigma ，St．Louis，MO）中に5.0×10⁵細胞/10cm組織培養ディッシュで播種する。２日目に、3.0ml、1.0mlおよび0.2mlの新たに採集したウイルス含有HX培地を細胞に加える。細胞をそのウイルスとともに37℃で一晩インキュベートする。３日目に、培地を除去し、そして800μg/mlのG418を含む1.0mlのDMEM、10％FBSをそのプレートに加える。ベクターで形質導入され、そしてネオマイシン選択マーカーを含む細胞だけが生き残る。G418耐性プールを１週間かけて生じさせる。細胞をプレートから取り出し、その細胞懸濁物を計数し、その細胞懸濁物を10細胞/mlまで希釈し、そして96ウェルプレート（Corning，Corning，NY）の各ウェルに0.1m l（1細胞/ウェル）を加えることによって、この細胞のプールを希釈クローン化する。細胞を37℃、10％CO₂で14日間インキュベートする。24クローンを選択し、そして24ウェルプレート、６ウェルプレート、次いで10cmプレートまで拡大し、この時点で、それらのクローンを発現についてアッセイし、上清を集め、ウイルス力価についてアッセイする。個々のクローンの力価を、HT1080細胞（ATCC寄託番号第CCL 121号）の感染によって決定する。１日目に、5.0×10⁵のHT1080細胞を、3.0mlのDMEM、10％FBS、および４μg/mlポリブレン中で、６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにプレートする。２日目に、各クローン由来の上清を10倍に連続希釈し、そしてこれを用いて1.0mlアリコートでHT1080細胞を感染させる。培地を新鮮なDMEM、1 0％FBS培地に置換し、そして細胞をベクターとともに37℃、10％CO₂で一晩インキュベートする。３日目に、培地を800μg/ml G418を含む新鮮なDMEM、10％FBS 培地で置換することによって、形質導入細胞の選択を行なう。細胞を37℃、10％ CO₂で14日間インキュベートし、この時点で、各希釈におけるG418耐性コロニーを評価し、各クローンのウイルス力価をコロニー形成単位（cfu）/mlとして決定する。これらの手順を用いて、培養物中に10⁶cfu/ml以上を産生する細胞株を誘導する。 HX上清によるDA細胞の形質導入について記載したのと同じ方法で、DAベクターを産生する細胞株から生成したベクターを用いて、パッケージング細胞株HXを形質導入する。 neo選択マーカーを欠くベクターによるDAまたはHX細胞の形質導入（実施例１）を、上記のように行なった。しかし、３日目にG418を細胞に加える代わりに、細胞を限界希釈によってクローン化する。力価を上記のように分析する。ｃ．１つのパッケージング細胞株を介するプロデューサー細胞株の生成の別法ある状況では、プロデューサー株の生成プロセスにおいて、１より多い細胞株の使用を避けることが所望され得る。この場合は、１日目に、DA細胞を、DMEMおよび10％照射（最低2.5メガラド）FBSを有する10cm組織培養ディッシュに、5.0 ×10⁵細胞で播種する。２日目に、トランスフェクションの４時間前に、培地を5 .0mlの新鮮な培地に置換する。60μlの2.0M CaCl₂、10μgのMLP-Gプラスミド、1 0μgのKT-ND5レトロウイルスベクタープラスミド、および脱イオンH₂Oで混合し容量を400μlにすることによって、標準的なリン酸カルシウム-DNA共沈を行なう。400μlのDNA-CaCl₂溶液を一定に攪拌しながら400μlの２×沈澱緩衝液（50mM HEPES-NaOH,pH7.1,0.25M NaCl、および1.5mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄）に滴下する。この混合物を室温で10分間インキュベートする。得られた細かい沈澱物を、前日にプレートしたDA細胞の培養ディッシュに加える。細胞をDNA沈澱物とともに37℃ で一晩培養する。３日目に、培地を除去し、そして新鮮な培地を加える。G-偽型化ウイルスを含有する上清を４日目に取り出し、0.45μlのフィルターに通し、そしてDAパッケージング細胞を感染するために用いる。１日目に、DA細胞を、10mlのDMEMおよび10％FBS、4mg/mlポリブレン（Sigma， St．Louis，MO）中で5.0×10⁵細胞で10cm組織培養ディッシュに播種する。２日目に、2.0ml、1.0ml、または0.5mlの新たに採集し、そして濾過したG-偽型化ウイルス含有上清を細胞に加える。細胞をそのウイルスとともに37℃で一晩インキュベートする。３日目に、培地を除去し、そしてそのプレートに800μg/mlのG41 8を含む10mlのDMEM、10％照射FBSを加える。ベクターによって形質導入され、そしてneo選択マーカーを含有する細胞だけが生き残る。G418耐性プールを１〜２週間かけて生じさせる。そのプールを発現について試験し、次いで細胞をプレートから取り出し、その細胞懸濁物を計数し、その細胞懸濁物を10細胞/mlまで希釈し、そして96ウェルプレートの各ウェルに0.1ml（1細胞／ウェル）を加えることによって、希釈クローン化する。細胞を37℃、10％CO₂で２週間インキュベートする。24クローンを選択し、24ウェルプレート、次いで６ウェルプレート、そして最後に10cmプレートまで拡大し、この時点でクローンを発現についてアッセイし、上清を集め、そしてウイルス力価について上記のようにアッセイする。Ｄ．複製可能レトロウイルス（RCR）の検出ｉ．拡大S⁺L^-アッセイ拡大S⁺L^-アッセイは、複製可能感染性ウイルスが目的の細胞株の上清中に存在するかどうかを決定する。このアッセイは感染性レトロウイルスが指示細胞株Mi Cl₁（ATCC寄託番号第CCL 64.1号）上にフォーカスを生成するという経験的観察に基づいている。MiCl₁細胞株はマウス肉腫ウイルス（MSV）を用いる形質導入によってMv1Luミンク細胞株（ATCC寄託番号第CCL 64号）に由来する。これは、複製欠損マウス肉腫プロウイルスを含有する（S⁺）が、複製可能マウス白血病プロウイルスを含有しない（L^-）非プロデューサー非形質転換復帰変異クローンである。複製可能レトロウイルスによるMiCl₁細胞の感染は、MSVゲノムを「活性化」してフォーカス形成をもたらす「形質転換」を誘発する。複製可能レトロウイルスの存在について試験すべき細胞株から上清を取り出し、そして0.45μフィルターに通してすべての細胞を除去する。１日目に、Mv1Lu 細胞を、２mlのDMEM、10％FBS、および８μg/mlポリブレン中で1.0×10⁵細胞/ウェル（試験されるべき１サンプルあたり１ウェル）で６ウェルプレートに播種する。陽性および陰性コントロールのために、Mv1Lu細胞を同じ方法で別の６ウェルプレートにプレートする。細胞を37℃、10％CO₂で一晩インキュベートする。２日目に、1.0mlの試験上清をMv1Lu細胞に加える。陰性コントロールプレートを、1. 0mlの培地とともにインキュベートする。陽性コントロールは、MAウイルス（Mil lerら，Molec．and Cell Biol．5:431,1985においてpAMと呼ばれている）の３種類の希釈（それぞれ1.0ml培地中200フォーカス形成単位（ffu）、20ffu、および 2ffu）からなり、これを陽性コントロールウェル中の細胞に加える。細胞を一晩インキュベートする。３日目に、培地を吸引し、そして3.0mlの新鮮なDMEMおよび10％FBSを細胞に加える。細胞をコンフルエントまで増殖させ、そして６日目および10日目に１:10に分割して、いずれの複製可能レトロウイルスをも増幅する。13日目に、Mv1Lu細胞上の培地を吸引し、そして2.0mlのDMEMおよび10％FBS を細胞に加える。さらに、MiCl₁細胞を2.0mlのDMEM、10％FBS、および８μg/ml ポリブレン中で1.0×10⁵細胞/ウェルで播種する。14日目に、Mv1Lu細胞由来の上清をMiCl₁細胞の対応するウェルに移し、そして37℃、10％CO₂で一晩インキュベートする。15日目に、培地を吸引し、そして3.0mlの新鮮なDMEMおよび10％FBSを細胞に加える。21日目に、細胞を細胞の単層上のフォーカス形成（単層を覆い、かつ付着したままの密集した屈折性細胞として現れる）について調べる。フォーカスがMiCl₁細胞上に現れれば、その試験物は複製可能レトロウイルスで汚染されていると決定される。これらの手順を用いて、HBVコアプロデューサー細胞株が複製可能レトロウイルスで汚染されていないことを示し得る。 ii．プロデューサー株の同時培養およびMdHマーカーレスキューアッセイベクターを産生する細胞株におけるRCRの存在を試験するための別の方法として、プロデューサー細胞を同数のMus dunni（NIH NIAID，Bethesda，MD）細胞とともに同時培養する。０日目に、5.0×10⁵のMus dunni細胞を5.0×10⁵のプロデューサー細胞と混合し、そしてその混合物を10cmプレート（10mlの標準培養培地 /プレート、４μg/mlポリブレン）中に播種することによって、小規模の同時培養を行なう。プロデューサー細胞株を効果的に希釈除去(dilute out)し、そして RCRの最大増幅を提供するために、３〜４日毎に培養物を１:10の比率で分割し、そして5.0×10⁵のMus dunni細胞を各培養プレートに加える。14日目に、培養上清を収集し、0.45μのセルロース-アセテートフィルターに通し、そしてMdHマーカーレスキューアッセイで試験する。1.0×10⁸のMus dunni細胞と1.0×10⁸のプロデューサー細胞との混合物を合計20のT-150フラスコ（30mlの標準培養培地/フラスコ、4μg/mlポリブレン）に播種することによって、大規模の同時培養を行なう。培養物を、３、６、および13日目には１:10の比率で、そして９日目には１:20の比率で分割する。15日目に、最終上清を収集し、濾過し、そしてそれぞれの一部をMdHマーカーレスキューアッセイで試験する。 MdHマーカーレスキュー細胞株を、LHL（ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子をコードするレトロウイルスベクター）（Palmerら，PNAS 84:1055-1059,1987）で形質導入されたMus dunni細胞のプールからクローン化する。このレトロウイルスベクターを、RCRによる細胞の感染時に、MdH細胞からレスキューし得る。４μg/ml ポリブレンを含む標準培養培地（10％FBS、１％ 200mM L-グルタミン、１％非必須アミノ酸を含むDMEM）２ml中に10⁵のMdH細胞を含む６ウェルプレートのウェルに１mlの試験サンプルを加える。24時間後に、培地をポリブレンを含まない標準培養培地で置換する。２日後、MdH培養上清の全容量を0.45μのセルロース-アセテートフィルターに通し、そしてポリブレンを含む標準培養培地2ml中の5.0×10⁴ のMus dunni標的細胞を含む６ウェルプレートのウェルに移す。24時間後、上清を250μg/mlのハイグロマイシンＢを含む標準培養培地で置換し、そしてその後２日目および５日目に、200μg/mlのハイグロマイシンＢを含む培地で置換する。ハイグロマイシンＢに耐性なコロニーが現れ、そしてそれらは選択後９日目に、0.2％クーマシーブルーで染色することによって可視化される。Ｆ．FVIII を発現するレトロウイルスベクターによるHT1080ヒト線維芽細胞への発現アッセイの移入１日目に、HT1080細胞を、2mlの標準的な増殖培地（DME＋10％FBS）を含有する６ウェルの組織培養プレートにおいて２×10⁴細胞／ウェルに調整する。２日目に、コンフルエントなベクター産生細胞株由来のND-5 FVIIIレトロウイルスベクター粒子を、HX-ND-5クローンとして集める。それらを、0.45μｍのシリンジフィルターを通して濾過し、その後上清を試験する。（あるいは、濾過した培地上清を、その後の使用のためにアリコートで-80℃で凍結し得る。）ポリブレンを、最終濃度が８μg／mlであるように各ウェルに添加する。30分後、希釈または未希釈のいずれかのレトロウイルスベクター上清を、２連のウェルに添加する。代表的な容量および希釈は、0.5ml／ウェル、および増殖培地での４段階以上の１：３の連続希釈である。コントロールとして、２つのウェルを等容量の増殖培地のみで形質導入する。３日目に、ウェルに２mlの新鮮な培地を再供給し、そして細胞をコンフルエントに達するようにする。これは、代表的には、およそ４日目か５日目であり得る。その日に、細胞に、ウェル当たり１mlの新鮮な増殖培地を再供給する。24時間後、培地を集め、そして上記のように濾過する。Ｇ．FVIII についての形質導入ベクターの発現 FVIIIについてのベクター形質導入ヒト細胞株の発現を、実施例2Biに上記するように、COATEST^Rアッセイにより検出する。活性を、２つのコントロールウェルのウェル当たりの細胞を計数し、そして24時間当たり１×10⁶細胞当たりにFVIII 発現データを標準化することにより、コントロールウェルの上清に比較してアッセイする。Ｈ．ベクター構築物の投与ｉ．動物投与プロトコル腸の上皮細胞は、その迅速な増殖組織集団およびリーベルキューン(Lieberkuh n)陰窩内の幹細胞の位置が既知であることにより、遺伝子送達のための魅力的な部位である。この陰窩内の幹細胞の深い位置および粘液ゲル層の保護的役割のために、レトロウイルスは組織細胞に相対的に接近し得ない。しかし、レトロウイルスベクターのこれらの幹細胞への接近可能性は、動物モデルにおいてSandberg ,J.ら（Human Gene Therapy 5：3232-329，1994）のインビボ粘液除去法により改善され得る。 Charles River Breeding Laboratories（Portage，MD）から入手される雄性Sp rague-Dawleyラットを麻酔し、そして盲腸を腹膜腔を開いて確認する。３cmの回腸セグメントを末端回腸における最後のパイアー斑（last Peyer's patch）から単離し、そしてそれぞれの末端で結紮する。シリンジに接続したプラスティックカテーテルをこのセグメント内に挿入し、そして粘液溶解剤であるジチオスレイトール、およびN-アセチルシステインの２ミリリットルを２分間穏やかな圧力下で滴注し、次いで除く。この手順を再度繰り返し、その後、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹ 、10¹⁰（10⁶〜10¹⁰）cfu/mlの0.2〜2.0mlのレトロウイルスベクター粒子でセグメントを満たす。結紮糸を１〜４時間後に除き、そして腹腔を縫合する。コントロール動物を処方緩衝液のみで滴注する。血液を尾静脈から集め、そして（Zatloukal，K.ら、PNAS 91：5148-5152，199 4の改変手順に従い）ヒト第VIII因子に特異的なサンドイッチELISAにより第VIII 因子産生についてアッセイする。このELISAは、ヒト第VIII因子に対する２つのモノクローナル抗体（ESH4およびESH8：American Diagonistica）に基づく。ESH 4（1.0Ｍ NaHCO₃/0.5Ｍ NaCl（pH 9.0）中で25μg/ml）を４℃で一晩ELISAプレートに結合し、0.1％ Tween20を含むPBSで洗浄し、そして１％ BSAを含むPBSでブロックする。サンプルを、0.05Ｍ Tris-HCl/１Ｍ NaCl/２％ BSA（pH 7.5）中で、４時間にわたり室温でアプライする。プレートを洗浄し、そしてN-ヒドロキシスクシンイミドビオチン（Pierce，Rockford，IL）でビオチン化したESH8（0. 05Ｍ Tris-HCl/１Ｍ NaCl/２％ BSA、pH 7.5中で2.5μg/ml）を室温で２時間添加する。発色反応をペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Boehringer Man nheim，Indianapolis，IN）および基質としてのo-フェニレンジアミン二塩酸を用いて行なう。ヒト第VIII因子:ｃ標品（National Institute for Biological S tandards and Control，Hertfordshire，U.K.由来）および正常ラット血漿を対照として使用する。 ii．ヒト投与プロトコル第VIII因子発現のための遺伝子を含む凍結乾燥したレトロウイルスベタターを、当該分野で公知の方法に従い、腸溶性のコートされた錠剤またはゲルカプセルに処方する。これらは、以下の特許に記載される：US 4,853,230号、EP 225,189 号、AU 9,224,296号、AU 9,230,801号、およびWO 92144,52号。カプセルは好ましくは経口的に投与され、空腸に標的化される。カプセル化用量は、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、または10¹¹（10⁶〜10¹¹）cfuあるいは等価な単位である。レトロウイルスベクターの経口投与の１〜４日後に、第VIII因子の発現を、実施例2Biに記載のようにCOATEST^R第VIII因子アッセイにより血漿および血液において測定する。実施例３ TKを発現するレトロウイルスベクターの嚢内投与Ａ．TK ベクター構築物の構築ｉ．ベクターLTR配列を含有するプラスミドの構築以下のレトロウイルスベクターのすべては、N2ベクター（Kellerら、Nature 3 18：149-154，1985）に基づく。簡潔には、5'および3'のEcoRI LTRフラグメント（それぞれ、2.8Kbおよび1.0Kb）（Armentano，J．Vir．61：1647，1987；Eglit is，Science 230：1395，1985）を、最初にプラスミドSK⁺（Stratagene，San Di ego，CA）およびpUC31のEcoRI部位にサブクローン化する。pUC31は、ポリリンカーのEcoRI部位とSacI部位との間にさらなる制限部位（XhoI、BglII、BssHIIおよびNcoI）を有するpUC19（Stratagene，San Diego，CA）の改変物である。それにより、プラスミドN2R3+/-を、SK⁺プラスミドと1.0Kbの3'LTRフラグメントとの連結から作製する。プラスミドp31N2R5+/-およびp31N2R3+/-を、それぞれ、2.8Kb の5'LTRおよびパッケージングシグナル（Ｙ）、または1.0Kbの3'LTRフラグメントとpUC31との連結から構築する。各々の場合において、N2はベクター供給物を示し、ＲはフラグメントがEcoRIフラグメントであるという事実を示し、５および３は、5'LTRまたは3'LTRを示し、そして＋または−は、挿入物の方向を示す（ LTRサブクローンの実施例については図１〜６を参照のこと）。１つの場合において、N2由来の1.2KbのClaI/EcoRI 5'LTRおよびＷフラグメントをSK⁺ベクターの同じ部位にサブクローン化する。このベクターをpN2CR5と命名する。別の場合において、スプライスドナー配列の６bpの欠失を含む5'LTR（Y eeら、Cold Spring Harbor，Quantitative Biology，51：1021，1986）を1.8Kb のEcoRIフラグメントとしてpUC31にサブクローン化する。このベクターをp31N25 D[+]と命名する（図６）。 ii．HSVTK を含有するプラスミドの構築 HSV-1のチミジンキナーゼ遺伝子（HSVTK）のコード領域および転写終結シグナルを、プラスミド322TK（pBR322のBamHIにクローン化されたHSV-1の3.5KbのBamH Iフラグメント（McKnightら）（ATCC番号31344号））由来の1.8KbのBglII/PvuII フラグメントとして単離し、そしてこれをBglII/SmaI消化したpUC31にクローン化する。この構築物をpUCTKと命名する。ターミネーターシグナルの欠失を必要とする構築物については、pUCTKをSmaIおよびBamHIで消化し、そして(A)_nシグナルを含む0.3Kbのフラグメントを除く。残るコード配列および付着末端のBamHI突出を、以下のオリゴマーから作製される二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて再構成する： 5’GAG AGA TGG GGG AGG CTA ACT GAG 3’（配列番号１） 5’GAT CCT CAG TTA GCC TCC CCC ATC TCT C 3’（配列番号２）。生成される構築物をpTKD Aと命名する（図７）。診断目的のために、翻訳タンパク質を変化させることなく、AvaI部位を保持しながら、SmaI部位を破壊するようにオリゴヌクレオチドを設計する。プラスミドpPrTKDA（図８）（これは、HSVTKプロモーターおよびコード配列（ (A)_nシグナルを欠く）を含有する）を以下のように構築する。１．pTKD AをBglIIで線状化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてゲル精製する。２．HSVTK転写プロモーターを含む0.8Kbフラグメントを、p322TKからBamHI/Bg lIIフラグメントとして単離する。３．(1)および(2)からの産物を連結し、細菌に形質転換し、そして陽性クローンをプロモーター領域の適切な方向についてスクリーニングする。生成されるクローンをpPrTKDAと命名する（図８）。 iii．構成的プロモーターからHSVTKを発現するレトロウイルスプロベクターの構築レトロウイルスプロベクター（pTK-1およびpTK-3）を、本質的に以下に記載の通りに構築する。１．５KbのXhoI/HindIIIの5'LTRおよびプラスミド配列を、p31N2R5(+)から単離する（図１）。２．転写終結配列を欠くHSVTKコード配列を、pTKDAから1.2KbのXhoI/BamHIフラグメントとして単離する（図２）。３．3'LTR配列を、pN2R3(-)から1.0KbのBamHI/HindIIIフラグメントとして単離する（図２）。４．工程１〜３からのフラグメントを混合し、連結し、細菌に形質転換し、そして個々のクローンを制限酵素分析により同定する。この構築物をTK-1と命名する（図９）。５．pTK-3を、TK-1をBamHIで線状化し、5'突出をフィルインし、そしてpAFVXM レトロウイルスベクター（Kriegerら、Cell 39：483，1984；St．Louisら、PNAS 85：3150，1988）から得られる細菌のlac UV5プロモーター、SV40初期プロモーター、＋Tn5 neo^r遺伝子を含有する5'フィルインClaI/ClaIフラグメントを平滑末端連結することにより構築する。カナマイシン耐性クローンを単離し、そして個々のクローンを制限酵素分析により適切な方向についてスクリーニングする（図９）。これらの構築物を用いて、上記のDAのようなパッケージング細胞株と一緒に感染性の組換えベクター粒子を作製した。Ｂ．TK-3 ベクターの存在または非存在でのマウス結腸ガン細胞に対するガンシクロビルの効果の決定ガンシクロビルが、DA/TK-3で形質導入されたCT26細胞（結腸腫瘍26、Brattai n，Baylor College of Medicine，Houston，TX）に対して効果を有するか否かを決定するために実験を行った。CT26細胞をＧ偽型化TK-3ベクターで形質導入する。ウイルス上清の添加の24時間後、CT26細胞をG-418選択（450lg/ml）下に置く。1 0日のインキュベーション後、G-418選択プールを得、これをCT26 TK Neoと命名する。CT26 TK Neo細胞を、2.5×10⁶個／プレートの密度で６つの10cm²プレートに播種する。コントロールとして、他の２つの細胞型のそれぞれ、CT26およびCT 26β-gal（この細胞株は、E.coli由来のレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼを有するウイルスで形質導入された）もまた、コントロールとして、６つの10cm² プレートに播種した。各細胞タイプの５つのプレートを、100μg/ml、50μg/ml 、25μg/ml、12.5μg/ml、および6.25μg/mlの濃度のガンシクロビルを含む培地で４日間続けて１日に２回処理した。各細胞タイプの１つのプレートを未処理のままにした。その後、細胞を、トリプシン−EDTAを用いて各ディッシュから取り出し、10％FBSを有するDMEM中に再懸濁し、そして計数した。図10のデータは、最低用量のガンシクロビルでさえも、CT26 TK neo細胞に対して劇的な細胞傷害性効果を有したことを示す。この用量のガンシクロビル（6.25μg/ml）またはその次に高い用量（12.5μg/ml）でさえも、CT26細胞またはCT26β-gal細胞のいずれに対しても効果を有しなかった。しかし、25μg/mlのガンシクロビルの用量で開始すると、細胞増殖の用量依存的な減少が認められ得たが、CT26 TK Neo細胞は、常に薬剤に対してより感受性であった。Ｃ．CT26 TK Neo 細胞を注入したマウスの処置のためのガンシクロビル用量決定マウス腫瘍のインビボ形質導入を用いて疾患を処置し得るかどうかを試験するために、100％の形質導入を確実にするためにインビトロで形質導入し、そして選択した腫瘍の除去に必要なガンシクロビルの最適濃度を決定するために実験を行った。３匹ずつの12群のマウスに、２×10⁵個のCT26 TK Neo細胞を注射する。６群のマウスにはこれらの細胞を腹腔内（I.P.）で注射し、そして６群のマウスにはこれらの細胞を皮下（S.C.）で注射する。他の３匹ずつ２群のマウスには、２×10⁵個の未改変のCT26細胞（コントロールとして）をI.P.またはS.C.のいずれかで注射する。 CT26細胞またはCT26 TK Neo細胞のこれらの群のマウスへの注射の10日後、いくつかの濃度のガンシクロビル処置を開始する。各用量レジメンは、１日２回、午前および午後のガンシクロビルのI.P.注射からなる。実験を以下の表Ａに要約する。５日後、125mg/Kg、250mg/Kg、および500mg/Kg処置群のすべてのマウスは、ガンシクロビルの毒性効果のために死亡した。15.63mg/Kg、31.25mg/Kgおよび62.5 mg/Kg処置群のマウスをさらに７日間処置し、そしてこれらは処置に耐性であり得た。腫瘍測定を23日間行った（図11）。CT26 TK Neoの増殖は、ガンシクロビルの非存在下では、未改変CT26よりほんのわずかだけ遅かった。完全な腫瘍退縮が、62.5mg/Kgレジメンで処置したマウスの群において認められた。部分的な腫瘍退縮が、31.25mg/Kg処置群において認められた。15.63mg/Kg処置群では、２つの未処置コントロール群と比較して、効果はほとんどまたは全く認められなかった。62.5mg/Kg群においていくらかの毒性が観測されたとはいえ、これは生命を脅かすものではなく、そしてこの処置の中断に際して可逆的であった。そこで、この濃度をこの先の研究に用いた（図11）。24日後、I.P.注射動物を屠殺し、そして評価した。図12および13に示すように、抗腫瘍効果の最適濃度は、腫瘍をI. P.またはS.C.で増殖させても、同様であった。Ｄ．CT26 およびCT26TK Neoのインビボにおける腫瘍増殖に対する細胞傷害性の比較ガンシクロビルが、インビボで未改変CT26腫瘍細胞の増殖に対して効果を有するどうかを決定するために、７匹の２群のマウスにS.C.で２×10⁵個の未改変CT2 6細胞を注射し、そして７匹の２群のマウスにはS.C.で２×10⁵個のCT26TK Neo細胞を注射する。腫瘍移植の７日後、CT26注射マウスの１群およびCT26TK Neo注射マウスの１群に、62.5mg/Kgで毎日２回（午前および午後）I.P.ガンシクロビルのレジメンを施す。これらのマウスを12日間、またはCT26TK Neo注射動物が検出可能な腫瘍負荷を全く有しなくなるまで処置する。腫瘍増殖を３週間の期間にわたりモニターする。CT26を注射しそしてガンシクロビルで処置したマウスは、CT 26を注射した未処置マウスより幾分か小さい腫瘍を有した。このことは、腫瘍増殖に対するわずかなHSVTK依存性阻害を示す（図14）。しかし、CT26 TKneo含有マウスをガンシクロビルで処置した場合、およびそのような場合のみ、腫瘍負荷の劇的な減少が観測された(図14)。Ｅ．TK-3 ベクターを有するAY-27ラット癌腫細胞またはTK-3ベクターを有しないA Y-27 ラット癌腫細胞に対するガンシクロビルの効果の決定ガンシクロビルが、DA/TK-3で形質導入したAY-27細胞に対して効果を有するか否かを決定するための実験を実施する。AY-27細胞は、N-[4-(5-ニトロ-2-フリル )-2-チアゾリル]ホルムアミドにより誘導されたラットの癌腫細胞である(Selman ，S.ら、J Urol．136：141，1986)。AY-27細胞を、Ｇ偽型化TK-3ベクターで形質導入する。ウイルス上清の添加の24時間後、AY-27細胞をG-418選択（450μg /ml）下に置く。10日のインキュベーション後、G-418選択されたプールを得、そしてこれをAY-27TK Neoと命名する。AY-27TKNeo細胞を、６つの10cm²プレートに 2.5×10⁶個／プレートの密度で播種する。コントロールとして、他の２つの細胞型、AY-27およびAY-27β-gal（この細胞株は、E.coli由来のレポーター遺伝子β -ガラクトシダーゼを有するウイルスで形質導入される）のそれぞれもまた、６つの10cm²プレートにコントロールとして播種する。各細胞型の５つのプレートを、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、および6.25μg/mlのガンシクロビル濃度を含む培地で４日間続けて１日に２回処理する。それぞれの細胞型の１つのプレートを未処理のままにする。その後、細胞を、トリプシン−EDTAを用いて各ディッシュから取り出し、10％FBSを含むDMEM中に再懸濁し、そして計数する。得られたデータを用いて、AY-27、AY-27β-gal、またはAY-27TK Neo細胞に対して最高の細胞傷害性効果を有する濃度を決定し得る。Ｆ．AY-27TK Neo 細胞を注射したラットの処置のためのガンシクロビル用量の決定マウス腫瘍のインビボ形質導入が疾患を処置し得るかどうかを試験するために、100％の形質導入を確実にするように形質導入し、そしてインビトロで選択した腫瘍の除去に必要なガンシクロビルの最適濃度を決定するために実験を行った。３匹ずつ14群のラットに、細胞を注射する。３匹ずつ６群のラットに、２×10⁵ 個の未改変のAY-27細胞（コントロールとして）を嚢内注射し、そして６群のラットに２×10⁵個のAY-27TKNeo細胞を嚢内注射する。 AY-27細胞またはAY-27TKNeo細胞のこれらの群のラットへの注射の10日後、いくつかの濃度のガンシクロビル処置を開始する。各用量レジメンは、１日２回、午前および午後のガンシクロビルのI.P.注射からなる。実験を以下の表Ｂに要約する。ラットを12日間処置し、より高濃度のガンシクロビルにより死亡するラットを除く。腫瘍測定を、最適なガンシクロビル濃度を決定するために、腫瘍退縮を評価しながら20日間行なう。Ｇ．投与プロトコルｉ．ラット投与プロトコル AY-27ラット膀胱癌腫細胞を、20匹の雄性Fischer344ラット（Charles River B reeding Laboratories，Portage，MD）の膀胱内に移植する。移植の１〜14日後、腫瘍を有する、200グラムと300グラムとの間の体重のラットを麻酔し、それらの膀胱を外科的に体外に出し、27ゲージ針を用いて尿を排泄させる。ウイルスベクター粒子を、200〜2,000μlの処方緩衝液中の10⁶〜10¹⁰cfuで５匹のラットの膀胱内に滴注する。４〜８μg/mlのポリブレンの添加は、形質導入の効率を増加させ得る。漏出を防ぐために、膀胱切開を7-ゼロ（7-zero）の非吸収性縫合糸で修復する。動物を麻酔下に保ち、それにより、排泄されることを防ぐことでウイルスを、0.5〜1.0時間腫瘍細胞の存在下でインキュベートし得る。５匹のコントロールラットは、500μlの処方緩衝液のみ、および上記のベクターの効果的な用量を受ける。あるいは、類似の形式の実験において、尿排泄および生理食塩水での洗浄の後、200〜2,000μlのベクターを、尿道を通してのカテーテル導入により直接的に膀胱に滴注し得る。ベクター処置後の24〜72時間で、ラットを、４〜12日間、１日に２回（午前と午後）、先に決定した最適用量（例えば、62.5mg/Kg体重）でガンシクロビルのI .P.注射を行う。最後に、ラットは、実験の最後まで（１〜10週）、毎日１回の用量のガンシクロビルを受ける。膀胱全体を取り出し、そして腫瘍増殖を測定する。 ii．ヒト投与プロトコル尿（Foley）カテーテルを尿道を通して膀胱内に挿入し、そしてその位置に固定する。膀胱から尿を排泄し、そして膀胱を100〜500mlの滅菌生理食塩水で洗浄する。チミジンキナーゼ発現のための遺伝子を含むレトロウイルスベクター粒子を、10〜500mlの処方緩衝液（好ましくは４〜８μl/mlのポリブレンまたは他の増強賦形剤を含む）中に10⁵〜10¹¹cfuで、カテーテルを通して膀胱に滴注する。ウイルス粒子を0.25〜12時間インキュベートさせ、その後カテーテルを除く。１〜７日後、ガンシクロビルを、２〜21日間、12時間毎に、（１時間にわたり一定速度で）１〜５mg/Kg I.V.で投与する。ベクターを、複数回（２〜20）再投与し得る。その後、ガンシクロビルを投与する。ガンシクロビルが投与される患者における頻繁な顆粒球減少および血小板減少のために、薬物の投薬の間２日毎に好中球および血小板の計数を実施することが推奨される。腫瘍退縮を、ｘ線および／またはバイオプシーによりモニターし、そして必要ならば、処置を繰り返す。実施例４第VIII因子を発現するレトロウイルスベクターの複数投与Ａ．全長およびＢドメイン欠失の第VIII因子cDNAレトロベクター^TMの構築全長およびＢドメイン欠失の第VIII因子レトロベクターの構築は、実施例２Ａに記載される。Ｂ．第VIII因子を発現するレトロウイルスベクターのエアロゾル化４〜８μg/mlのポリブレンまたは他の形質導入増強賦形剤とともに処方緩衝液中のKT-ND5ウイルス上清を、0.3〜0.5μｍの粒子を生成するように設計されるDe Vilbiss＃15 Atomizer（DeVilbiss Health Care Division，Somerset，PA）を用いて霧状にする（Rousculp，M.，Human Gene Therapy 3：471-477，1992）。この噴霧器により生成されるエアロゾルは、層流フード内で圧縮空気を使用する。霧をポリプロピレンチューブ内に導き、そして濃縮した蒸気ならびにコントロールウイルス上清を、0.22μｍ濾過により再度滅菌する。ベクターは、機能的活性の有意な喪失を全くすることなくこのフィルターを通過する。Ｃ．ベクター構築物の投与ｉ．ラット投与プロトコルラットを麻酔し、そして気管を前方正中切開により露出させる。第VIII因子遺伝子産物を発現するレトロウイルスベクター粒子を、４〜８μg/mlのポリブレンまたは他の形質導入増強賦形剤の存在下または非存在下で、10⁵〜10¹⁰cfu/mlで3 00μlの処方緩衝液中に希釈し、そして小ゲージの針を通して気管内に滴注する。コントロール動物に、300μlの処方緩衝液のみを投与する。切開を縫合し、そしてラットを回復させる。ウイルス滴注の２〜14日後、血液を尾静脈から抜き取り、そして実施例２Ｈｉに記載するように、第VIII因子産生について調べる。 ii．ヒト投与プロトコルレトロウイルスベクターを、DeVilbiss＃15 Atomizer（上記）を用いて２〜60 分間で投与する。総投与量は、ポリブレンまたは他の形質導入増強剤の存在または非存在下で、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹または10¹⁰（10⁵〜10¹⁰）cfu/mlである。レトロウイルスベクター粒子の投与の２〜14日後、第VIII因子の発現を、Coat est^R第VIII因子アッセイにより血液および血漿において測定する（実施例2Biに記載のように）。実施例５ TK-3を発現するレトロウイルスベクターの経皮投与Ａ．TK-3 ベクター構築物の構築 TK-3ベクター構築物およびレトロウイルスベクター粒子の構築および確認は、実施例３Ａ〜３Ｆに記載される。ベクター構築物の投与ｉ．動物投与プロトコルワタオウサギ乳頭腫ウイルス（CRPV）を、高度に発ガン性のヒト乳頭腫ウイルス（HPV）のための動物モデルとして提供する。乳頭腫をワタオウサギにおいて誘導し得る。そして、ウイルス感染は、これらのウサギにおいて３つの異なる結果を導く（Lin，Y.ら、J Virol 67：382，1993）。第１は、乳頭腫が出現し、そしてウサギの生存中持続する；第２は、乳頭腫は、感染後、２〜３ヶ月で自然に退縮する；そして、第３は、乳頭腫は８〜15ヶ月後、ガンに進行する。この実験において、12羽のワタオウサギ（E．Johnson，Rago，KA）に、Steven s，J.ら（J Virol 30：891，1979）に記載のように、皮内注射によりCRPVのＢ株（Stevens，J.ら、J Virol 30：891，1979）を注射する。注射の４〜６ヶ月後（この時点で乳頭腫が形成される）、動物を２群に分ける。第１群では、４〜８μ g/mlのポリブレンまたは他の形質導入増強賦形剤の存在または非存在で、10⁵〜1 0¹⁰cfu/mlで小ゲージの針を通して25〜100μlの処方緩衝液を、６羽の動物の乳頭腫に注射する。第２群では、コントロール動物に、25〜100μlの処方緩衝液のみを投与する。ベクター処置後の24〜72時間で、ウサギに、４〜12日間、毎日２回（午前および午後）、先に決定した最適用量（例えば、62.5mg/Kg体重）でガンシクロビルのI.P.注射を施す。最後に、ウサギは、実験の最後まで（１〜10 週）、毎日単回用量のガンシクロビルを受ける。乳頭腫の退縮を、２〜14日間、視覚的にモニターする。 ii．ヒト投与プロトコルヒト乳頭腫ウイルス（HPV）に起因する臨床的皮膚病巣は、尋常性疣贅、糸状疣贅、足底疣、および肛門性器疣を含む（Cobb，M.ら、J．Am．Acad．Derm．22 ：547，1990に総説される）。この実験において、患者を２群に分ける。第１群では、100〜500μlのレトロウイルスベクター粒子を、処方された軟膏（好ましくは４〜８μg/mlのポリブレンまたは他の形質導入増強賦形剤を含む）中で10⁶ 〜10¹¹cfu/mlの濃度で、経皮送達系（TDS）を用いて疣に塗布する。経皮送達系（TDS）は、薬物が、治療的に有益である十分な量で全身循環に達するように、インタクトな皮膚を通して薬物を送達し得る。TDSは広範な利点を提供し、それには、胃腸吸収問題および肝臓の初期通過効果の除外、投薬量および投薬間隔の減少、ならびに改善された患者のコンプライアンスを含む。TDSの主要成分は、ポリマー、投与されるべき薬物、賦形剤、および増強剤からなる制御放出デバイス、ならびに皮膚に対してこのデバイスを固定するための固定系である。多数のポリマーが記載され、これには、ゼラチン、アラビアゴム、パラフィンワックス、およびセルロースアセテートフタレートが含まれる（Sogibayash i，K.ら、J．Controlled Release，29：177-185，1994）。第２群は、処方緩衝液中の100〜500μlのベクター粒子のみを受ける。領域を覆い、そしてウイルス粒子を0.25〜12時間インキュベートさせ、その後TDSを除く。１〜７日後、ガンシクロビルを、（好ましくは、１時間にわたり一定速度で）２〜21日間、12時間毎に、１〜５mg/Kg I.V.で投与する。FDAにより立証された場合、別の投与プロトコルが使用され得る。ベクターを複数回（２〜20）再度投与し得る。その後、ガンシクロビルを投与する。ガンシクロビルを受ける患者における顆粒球減少及び血小板減少の頻度のために、薬物の投薬中２日毎に好中球および血小板の計数を実施することが推奨される。疣の退縮を、２〜14日間、視覚的にモニターする。実施例６ E3/19Kのための組換えレトロウイルスベクターの眼投与Ａ．E3/19K 遺伝子のKT-3Bへのクローン化ｉ．アデノウイルスの単離および精製アデノウイルスの単離および精製は、Greenら（Methods in Enzymology 58：4 25，1979）により記載される。詳細には、５リットルのHela細胞（３〜6.0×10⁵ 細胞／ml）を、100〜500プラーク形成単位（pfu）/mlのアデノウイルス２型（Ad 2）ビリオン（ATCC番号VR-846）で感染させる。37℃で30〜40時間のインキュベーション後、細胞を氷上に置き、230×ｇで20分間、４℃での遠心分離により回収し、そしてTris-HCl緩衝液（pH 8.1）中に再懸濁する。ペレットを超音波により機械的に破砕し、そしてトリクロロトリフルオロエタン中でホモジナイズし、その後遠心分離を1,000×ｇで10分間行う。上の水層を取り出し、そして10mlのC sCl（1.43g/cm³）上に重層し、SW27ローター中で１時間20,000rpmで遠心分離する。乳白色のウイルスバンドを取り出し、そしてCsClで1.34g/cm³に調整し、そしてさらにTi50ローター中で16〜20時間30,000rpmで遠心分離する。勾配の中央の視認し得るウイルスバンドを取り出し、そしてアデノウイルスDNAの精製まで４℃で保存する。 ii．アデノウイルスDNAの単離および精製アデノウイルスバンドをプロテアーゼとともに１時間37℃でインキュベートして、タンパク質を消化する。7,800×ｇで10分間４℃での遠心分離後、粒子を、５％SDS中で室温で30分間可溶化し、その後、等容量のフェノールで抽出する。上の水層を取り出し、フェノールで再抽出し、エーテルで３回抽出し、そしてTr is緩衝液中で24時間透析する。ウイルスAd2 DNAをエタノールで沈澱させ、エタノールで洗浄し、そしてTris-EDTA緩衝液（pH 8.1）中に再懸濁する。約0.5mgのウイルスAd2 DNAが1.0Ｌの細胞において得られたウイルスから単離される。 iii．E3/19K 遺伝子の単離ウイルスAd2 DNAをEcoRIで消化し、そして１％アガロースゲルでの電気泳動により分離する。75.9〜83.4のAd2座標領域に位置する、E3/19K遺伝子を含む生成される2.7Kb Ad2 EcoRI Ｄフラグメント（Herisseら、Nucleic Acids Research 8：2173，1980、Cladarasら、Virology 140：28，1985）を、電気泳動により溶出し、フェノール抽出し、エタノール沈澱し、そしてTris-EDTA（pH 8.1）中に溶解する。 iv．E3/19K 遺伝子のKT-3Bへのクローン化 E3/19K遺伝子をPUC1813のEcoRI部位にクローン化する。PUC1813を、本質的に、Kayら（Nucleic Acids Research 15：2778，1987）およびGrayら（PNAS 80：5 842，1983）に記載の通りに調製する。E3/19KをEcoRI消化により回収し、そして単離したフラグメントを、ホスファターゼ処理したpSP73プラスミドのEcoRI部位にクローン化する。この構築物をSP-E3/19Kと命名する。SP-E3/19K cDNAの方向を、適切な制限酵素消化およびDNA配列決定を用いて確認する。センス方向で、c DNAの5'末端はpSP73ポリリンカーのXhoI部位に隣接し、そして3'末端はClaI部位に隣接する。センス方向またはアンチセンス方向のいずれかでE3/19K cDNAを含むXhoI〜ClaIフラグメントをSP-E3/19K構築物から回収し、そしてKT-3BBレトロウイルスのXhoI〜ClaI部位にクローン化する。この構築物を、KT-3B/E3/19Kと命名する。Ｂ．PCR 増幅されたE3/19K遺伝子のKT-3Bへのクローン化ｉ．E3/19K 遺伝子のPCR増幅 Ad2 DNA E3/19K遺伝子（アミノ末端シグナル配列と、その後に、E3/19Kタンパク質自身を小胞体(ER)内に埋め込ませる管腔内(intraluminal)ドメインおよびカルボキシ末端細胞質テールを含有する）は、ウイルスヌクレオチド28,812と29,2 88との間に位置する。ウイルスゲノムDNAからのAd2 E3/19K遺伝子の単離は、以下に示されるプライマー対を用いてPCR増幅により達成される： Ad2ヌクレオチド配列28,812〜28,835に対する正方向プライマー（配列番号３） 5'-TATATCTCCAGATGAGGTACATGATTTTAGGCTTG-3' Ad2ヌクレオチド配列29,241〜29,213に対する逆方向プライマー（配列番号４） 5'-TATATATCGATTCAAGGCATTTTCTTTTCATCAATAAAAC-3'。 Ad2の相補的配列に加えて、両方のプライマーは、PCRアンプリコン産物の効率的な酵素消化のための５ヌクレオチドの「緩衝配列」をその５’末端に含有する。正方向プライマーにおけるこの配列の後にはXhoI認識部位が続き、そして逆方向プライマーではClaI認識部位が続く。従って、５’から３’の方向で、E3/19K 遺伝子にはXhoIおよびClaI認識部位が隣接している。Ad2 DNAからのE3/19K遺伝子の増幅は、以下のPCRサイクルプロトコルを用いて達成される： ii．PCR 増幅されたE3/19K遺伝子のKT-3Bへの連結 SP-E3/19K構築物由来のE3/19K遺伝子（約780bpの長さ）を取り出し、そして１％アガロース／TBEゲル電気泳動により単離する。次いで、XhoI-ClaIのE3/19KフラグメントをKT-3Bレトロウイルス骨格に連結する。この構築物をKT-3B/E3/19K と称する。KT-3B/E3/19K構築物を、E.coli、DH5α細菌株(Bethesda Research La bs,Gaithersburg,Maryland)に形質転換することにより増幅する。詳細には、細菌を１〜100ngの連結反応混合物DNAで形質転換する。形質転換された細菌の細胞をアンピシリンを含むLBプレート上でプレートする。このプレートを37℃で一晩インキュベートし、細菌コロニーを選択し、それらからDNAを調製する。このDNA をXhoIおよびClaIで消化する。E3/19K遺伝子を含むプラスミドの予想されるエンドヌクレアーゼ制限切断フラグメントのサイズは780bpおよび1,300bpである。Ｃ．パッケージング細胞株DAの組換えレトロウイルスベクターKT-3B/E3/19Kによる形質導入ｉ．プラスミドDNAトランスフェクション 293 2-3細胞（293細胞由来の細胞株、ATCC寄託番号第CRL 1573号,(WO 92/0526 6)）の5.0×10⁵個の細胞を約50％のコンフルエントで６cm組織培養ディッシュ上に播種する。翌日、トランスフェクションの４時間前に、培地を４mlの新鮮な培地に取り替える。標準的なリン酸カルシウム-DNA共沈を10.0μgのKT-3B/E3/19K プラスミドおよび10.0μg MLP Gプラスミドを２M CaCl₂溶液と混合することにより行い、１×HEPES緩衝化生理食塩水溶液（pH6.9）を添加し、室温で15分間インキュベートする。リン酸カルシウム-DNA共沈物を293 2-3細胞に移し、次いで、3 7℃、５％CO₂で一晩インキュベートする。翌朝、細胞を１×PBS(pH7.0)中で３回洗浄する。新鮮な培地を細胞に加え、その後、37℃、10％CO₂で一晩インキュベーションする。翌日、細胞を含まないように培地を回収し、そして0.45μフィルターに通す。この上清をパッケージング細胞および腫瘍細胞株の形質導入に使用する。他のベクターのための一過性のベクター上清は、同様にして作製される。 ii．パッケージング細胞株の形質導入パッケージング細胞株の形質導入を、実施例2Cに記載のように行う。 iii．複製可能レトロウイルスの検出複製可能レトロウイルスの検出を、実施例2Dに記載のように行う。Ｄ．組換えレトロウイルスベクターKT-3B/E3/19Kによる細胞株の形質導入以下の付着性のヒトおよびマウス細胞株を、５×10⁵細胞／10cmディッシュで、４μg／mlのポリブレンとともに播種する：HT 1080、Hela、およびBC10ME。翌日、DA E3/19Kプール由来の濾過上清の1.0mlを各細胞培養プレートに添加する。翌日、800μg／mlのG418をすべての細胞培養の培地に添加する。この培養物を選択が完成するまで維持し、そして十分な細胞数を遺伝子発現について試験するために生成させる。形質導入された細胞株を、それぞれHT 1080-E3/19K、Hela-E3/19KおよびBC10ME-E3/19Kと称する。 EBV形質転換細胞株(BLCL)、および他の懸濁細胞株を、DA-E3/19Kのような照射したプロデューサー細胞株と同時培養することにより形質導入する。詳細には、照射(10,000 rad)プロデューサー細胞株を、４μg／mlのポリブレンを含む増殖培地中で5.0×10⁵個細胞／６cmディッシュでプレーティングする。細胞を２〜24 時間付着させた後、10⁶個の懸濁細胞を添加する。２〜３日後、懸濁細胞を取り出し、遠心分離によりペレット化し、１mg/mlのG418を含む増殖培地中に再懸濁し、そして丸底96ウェルプレートの10ウェルに播種する。この培養物を24ウェルプレートに、次いでT-25フラスコに拡大する。Ｅ．組換えレトロウイルスベクター構築物KT3B-E3/19KにおけるE3/19Kの発現ｉ．ウェスタンブロット分析放射免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解物を、E3/19K発現の分析のために選択された培養物から作製する。RIPA溶解物を、細胞のコンフルエントなプレートから調製する。詳細には、培地をまず細胞から吸い取る。細胞を含む培養プレートのサイズに依存し、100〜500ml容量の氷冷RIPA溶解緩衝液(10mM Tris,pH7.4;1% Nonide t P40;0.1% SDS;150 mM NaCl)を細胞に添加する。マイクロピペットを用いて細胞をプレートから取り出し、そして混合物をマイクロ遠心チューブに移す。このチューブを５分間遠心分離して細胞破片を沈澱させ、そして上清を別のチューブへ移す。この上清を10％SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。そしてタンパク質のバンドを、CAPS緩衝液（10mM CAPS(Aldrich,Milwaukee,WI),pH11.0;1 0%メタノール）中のImmobilonメンブレンに、２〜18時間で、10〜60ボルトで移す。このメンブレンを、CAPS緩衝液から５％Blotto(５％脱脂粉乳；50mM Tris,p H7.4;150mM NaCl;0.02%アジ化ナトリウム,および0.05%Tween 20)に移し、そして E3/19Kに対するマウスモノクローナル抗体でプローブする(Severinssonら、J.Ce ll.Biol.101:540-547,1985)。メンブレンへの抗体の結合を¹²⁵I-Protein Aの使用により検出する。 ii．非形質導入細胞と比較したクラスＩ発現の減少したレベルを証明するためのKT3B-E3/19Kベクター形質導入細胞のFACS分析 KT3b-E3/19Kベクターで形質導入した細胞株を、FACS分析によりMHCクラスＩ分子の発現について試験する。非形質導入細胞もまた、MHCクラスＩ分子の発現について分析し、そしてMHCクラスＩ分子の発現での形質導入効果を決定するためにE3/19K形質導入細胞と比較する。マウス細胞株、BC10ME、BC10ME-E3/19K、P815(ATCC番号TIB64号)、およびP815 -E3/19Kを、細胞表面上のH-2D^d分子の発現について試験する。サブコンフルエント密度まで増殖した細胞をVerseneを用いた処理により培養ディッシュから取り出し、そして１％BSAおよび0.02％アジ化ナトリウムを含む冷（４℃）PBS（洗浄緩衝液）を用いて、200gの遠心分離により、２回洗浄する。２百万個の細胞を微量遠心チューブ内に置き、そして上清を取り除く前に200gで微量遠心においてペレット化する。細胞ペレットを、H-2D^d特異的Mab34-2-12s(50mlの１:100希釈の精製抗体、ATCC番号HB87号）を用いて再懸濁し、そして時々混合しながら４℃で 30分間インキュベートする。抗体標識細胞を、１mlの洗浄緩衝液（４℃）で２回洗浄した後に、上清を取り除く。細胞をビオチン化ヤギ抗マウスκ軽鎖Mab(50ml の１:100希釈の精製抗体)(Amersham,Arlington Height,IL)を用いて再懸濁し、そして４℃で30分間インキュベートする。細胞を洗浄し、50mlのアビジン結合FI TC(Pierce,Rockford,IL)を用いて再懸濁し、そして４℃で30分間インキュベートする。細胞をさらに１回洗浄し、1mlの洗浄緩衝液中に再懸濁し、そしてFACStar 分析器(Becton Dickinson,Los Angeles,CA)での分析まで氷上で保持した。形質導入細胞の平均蛍光強度を、E3/19Kタンパク質が表面MHCクラスI分子の発現に対して有する効果を決定するために、非形質導入細胞の平均蛍光強度と比較する。Ｆ．ベクター構築物の投与ｉ．ラット投与プロトコルラットに麻酔をかけ、そして一方の眼に、４〜８μg/mlのポリブレンまたは他の形質導入増強賦形剤の存在または非存在下で、処方緩衝液中で10⁵〜10¹⁰cfu/m l の濃度での５〜100μlのレトロウイルスベクター粒子を滴注する。処方緩衝液のみを含有する５〜100μlの溶液を、コントロールとして使用するためにもう一方の眼に添加する。この溶液を１時間インキュベートさせ、その後それぞれの眼を 100μlの食塩水で３回リンスする。処理の２〜７日後、ラットを屠殺し、角膜を取り出し、そして２mlの氷冷RIPA溶解緩衝液中でホモジナイズする。E3/19Kの発現を実施例6Eiに記載するようにウエスタンブロット分析により検出する。 ii．ヒト投与プロトコル角膜移植拒絶反応率は比較的低いが、拒絶反応を有するものに対する現在の治療は、ステロイド化合物の連続的な処置を必要とする。これは、最終的に手術を必要とする白内障の形成を導く。従って、E3/19Kを発現するレトロウイルスベクターの導入は、このようなステロイドレジメンの必要性を妨げる。処方緩衝液において４〜８μg/mlのポリブレンまたは他の形質導入増強賦形剤の存在または非存在下で、処方緩衝液中で10⁵〜10¹⁰cfu/mlの濃度での10〜500μlのレトロウイルスベクター粒子を、うつ伏せに伏した患者の眼に投与する。この溶液を、15〜 30分間インキュベートし、その後食塩水で洗浄する。あるいは、角膜を、外科的な接着の直前に、４〜８μg/mlのポリブレンまたは他の形質導入増強賦形剤の存在または非存在下で、処方緩衝液中で10⁵〜10¹⁰cfu /mlの濃度での1mlのレトロウイルスベクター粒子で１時間インキュベートし得る。上記の場合のいずれにおいて、移植の進行を目視によって組織の生存性を観察することによりモニターする。実施例７第VIII因子を発現するレトロウイルスベクターの鼻腔内投与Ａ．全長およびＢドメイン欠失の第VIII因子cDNA Retrovector^TMの構築全長およびＢドメイン欠失の第VIII因子レトロベクターの構築は、実施例2Aに記載される。Ｂ．ベクター構築物の投与ｉ．ラット投与プロトコル鼻経路は、鼻腔粘膜下に位置する毛細管の広範囲なネットワークのため、多くの分子の投与に効果的であることが示されてきた。これは、効果的な全身性吸収を容易にし、そして薬物を吸収促進剤を用いて投与する場合、吸収は高い生物学的利用能を伴って急速に生じる(Gizurarsonら、Acta Pharm 2:105,1990において総説する) ６匹のFischer-344ラットの１群を、第VIII因子のレトロウイルスベクター粒子の鼻腔投与のために使用する。４〜８μg/mlのポリブレンまたは他の形質導入増強賦形剤の存在または非存在下で、処方緩衝液中で10⁶〜10¹¹cfu/mlでの１〜5 0μlのレトロウイルスベクター粒子を、各鼻孔に約３〜５mm挿入したピペットを用いて適用する。別の群に、同じようにベクターを含まない処方緩衝液を投与する。血液サンプルを、１〜14日後、頚静脈または尾静脈から回収し、そして実施例2Hiに記載するように第VIII因子産生についてアッセイする。 ii．ヒト投与プロトコル鼻腔についての数タイプの薬物送達デバイスが存在する(Chien,Yら、Crit Rev Therap Drug Carr Sys,4:67,1987において総説される)。これらの系は、鼻スプレー、鼻滴下、ぬれた綿ガーゼ、エアロゾルスプレー、および吸入器を含む。メートル投与噴霧器は、予め決められた容量の処方物を鼻腔に送達し得る。２群の患者がこの研究において使用される。患者の一方の群は、鼻スプレーまたは鼻滴下を介して各鼻孔に適用された、４〜８μg/mlポリブレンまたは他の形質導入増強賦形剤の存在または非存在下で、処方緩衝液中で10⁶〜10¹¹cfu/mlでの100〜500μlのレトロウイルスベクター粒子を受ける。もう一方の群は、同じように適用された処方緩衝液のみを受ける。血液サンプルを１〜14日後に回収し、そして実施例2Biで記載するように第VIII因子産生についてアッセイする。実施例８組換えレトロウイルスの保存Ａ．組換えレトロウイルスのラクトース処方粗製の組換えレトロウイルスを、バイオリアクターマトリックスのビーズに結合された、組換えレトロウイルスで形質転換されたDA細胞を含有するCelliganバイオリアクター（New Brunswick、New Brunswick、NJ）から得る。細胞は、連続的流れプロセス（continuous flow process）において細胞を横切る増殖培地の中に、組換えレトロウイルスを放出する。バイオリアクターを出る培地を集め、そして最初に0.8ミクロンフィルター、次いで0.65ミクロンフィルターに通過させて、粗製の組換えレトロウイルスを澄明化する。交差流濃縮システム（Filtro n，Boston,MA）を利用して、濾液を濃縮する。濃縮物の１mlあたり約50単位のDN ase（Intergen、New York,NY）を添加して、外因性DNA を消化する。消化物を、同一の交差流システムを用いて、150mM のNaCl，25mMのトロメタミン、pH7.2 に対してダイアフィルトレートする。50mMのNaCl，25mMのトロメタミン、pH7.4 中で平衡化した、Sephadex Ｓ−500ゲルカラム（Pharmacia，Piscataway,NJ）上にダイアフィルトレート物をロードする。精製組換えレトロウイルスを、50mMのNa Cl，25mMのトロメタミン、pH7.4 中でSephadex Ｓ−500 ゲルカラムから溶出する。ラクトースを含有する処方緩衝液を、２×濃縮ストック溶液として調製した。この処方緩衝液は、25mMのトロメタミン、70mMのNaCl，２mg/mlのアルギニン、1 0mg/mlのHSA、および 100mg/mlのラクトースを 100mlの最終容量で、pH7.4 において含有する。１部のＳ−500精製組換えレトロウイルスに１部の２×ラクトース処方緩衝液を添加することによって、精製組換えレトロウイルスを処方する。処方した組換えレトロウイルスを、−70℃〜−80℃において保存するか、または乾燥することができる。 Supermodulyo 12Ｋ凍結乾燥器（Edwards High Vacuum、Tonawanda,NY）に取り付けられたEdwards Refrigerated Chamber(3 Shelf RC3Sユニット)中で、処方したレトロウイルスを凍結乾燥する。凍結乾燥サイクルが完結したとき、わずかな窒素ガスの放出後、真空下でバイアルに栓をする。取り出す際に、バイアルをアルミニウムのシールでクリンプする。所定のラクトース研究において、処方された液体産物を−80℃および−20℃の循環フリーザーの両方で保存した。図15において、これらのサンプルのウイルス感染力を、凍結乾燥サンプルのウイルス感染力と比較した。凍結乾燥サンプルを、−20℃、冷蔵温度、および室温で保存した。再構成の際のサンプル活性を、力価アッセイにより決定する。凍結乾燥された組換えレトロウイルスを1.0mlの水で再構成する。再構成した組換えレトロウイルスの感染力を力価活性アッセイにより決定する。アッセイを、HT 1080線維芽細胞または3T3マウス線維芽細胞株(ATCC寄託番号第CCL 163号) において行った。詳細には、１×10⁵個の細胞を６cmプレート上にプレーティングし、そして37℃、10％CO₂にて一晩インキュベートする。再構成された組換えレトロウイルスの連続希釈物10マイクロリットルを、４mg/mLのポリブレン(Sigm a,St.Louis,MO)の存在下で細胞に添加し、そして37℃、10％CO₂にて一晩インキュベートする。インキュベーションに続いて、細胞をG418を含む培地中でネオマイシン耐性について選択し、そして37℃、10％CO₂にて５日間インキュベートする。最初の選択に続いて、これらの細胞にG418を含む新鮮な培地で再び栄養補給し、そして５〜６日間インキュベートする。最後の選択の後、コロニー検出のために、細胞をクーマシーブルーで染色する。サンプルの力価を、コロニーの数、希釈、および使用した容量から決定する。図15は、−20℃から冷蔵温度での凍結乾燥形態における保存が、−80℃から− 20℃において液体中で保存された組換えレトロウイルスと類似のウイルス活性を保持し、保存の間、よりストリンジェントでない温度コントロールを許容することを示す。Ｂ．組換えレトロウイルスのマンニトール処方この実施例で利用した組換えレトロウイルスを、実施例8Aに記載のように精製した。マンニトールを含有する処方緩衝液を、２×濃縮ストック溶液として調製した。この処方緩衝液は、25mMのトロメタミン、35mMのNaCl，２mg/mlのアルギニン、1 0mg/mlのHSA、および 80mg/mlのマンニトールを、100mlの最終容量で、pH7.4 において含有する。１部のＳ−500精製組換えレトロウイルスに、１部のマンニトール処方緩衝液を添加することによって、精製組換えレトロウイルスを処方する。処方した組換えレトロウイルスを、この段階で、−70℃〜−80℃において保存するか、または乾燥し得る。 Supermodulyo 12Ｋ凍結乾燥器に取り付けられたEdwards Refrigerated Chambe r(3 Shelf RC3Sユニット)中で、処方したレトロウイルスを乾燥する。凍結乾燥サイクルが完結したとき、窒素ガスの700mbarへの放出後、真空下でバイアルに栓をする。取り出す際に、バイアルをアルミニウムのシールでクリンプする。所定のマンニトールの研究において、処方された液体産物を−80℃および−20 ℃の循環フリーザーの両方で保存した。図16において、これらのサンプルのウイルス感染力を凍結乾燥サンプルのウイルス感染力と比較した。凍結乾燥サンプルを、−20℃、冷蔵温度、および室温で保存した。再構成の際のサンプルの活性を、実施例8Aに記載の力価アッセイを用いて決定する。図16は、−20℃から冷蔵温度での凍結乾燥形態における保存が、−80℃または −20℃において液体中で保存された組換えレトロウイルスに匹敵して、顕著なウイルス活性を保持し、保存の間、よりストリンジェントでない温度コントロールを許容することを示す。Ｃ．組換えレトロウイルスのトレハロース処方この実施例において利用した組換えレトロウイルスを、実施例8Aに記載のように精製した。トレハロースを含有する処方緩衝液を、２×濃縮ストック溶液として調製した。この処方緩衝液は、25mMのトロメタミン、70mMのNaCl，2.0mg/mlのアルギニン、10.0mg/mlのHSA、および 100mg/mlのトレハロースを、100mlの最終容量で、pH 7.2 において含有する。１部のＳ−500精製組換えレトロウイルスに１部のトレハロース処方緩衝液を添加することによって、精製組換えレトロウイルスを処方する。処方した組換えレトロウイルスを、この段階で、−70℃〜−80℃において保存するか、または乾燥し得る。 Supermodulyo 12Ｋ凍結乾燥器に取り付けられたEdwards Refrigerated Chambe r(3 Shelf RC3Sユニット)中で、処方したレトロウイルスを乾燥する。凍結乾燥サイクルが完結したとき、窒素ガスの700mbarへの放出後、真空下でバイアルに栓をする。取り出す際に、バイアルをアルミニウムのシールでクリンプする。所定のトレハロースの研究において、処方された液体産物を−80℃および−20 ℃の循環フリーザーの両方で保存した。図17において、これらのサンプルのウイルス感染力を、凍結乾燥サンプルのウイルス感染力と比較した。凍結乾燥サンプルを、−20℃、冷蔵温度、および室温で保存した。再構成の際のサンプル活性を、実施例8Aに記載の力価アッセイを用いて決定する。図17は、−20℃から冷蔵温度での凍結乾燥形態における保存が、−80℃から− 20℃において溶液中で保存された組換えレトロウイルスと比較して類似のウイルス活性を保持し、保存の間、よりストリンジェントでない温度コントロールを許容することを示す。 −80℃で保存された溶液処方された組換えレトロウイルスサンプルのウイルス感染力を、−20℃で保存された凍結乾燥処方された組換えレトロウイルスのウイルス感染力と比較した。最初に、大量の組換えレトロウイルスを得、そして以下に示すような４つの異なる方法で処方した。次いで、処方された組換えレトロウイルスを、大量に1.5ヶ月間凍結し、その後急速に解凍し、そして凍結乾燥する。陽性コントロールを−80℃で保存し、凍結乾燥後に−20℃で保存した凍結乾燥サンプルと比較する。処方を以下に列挙する：図18のグラフにおいて、４つのグラフ(A,B,C,D)それぞれにおけるＹ軸は、標準化した力価を表す。凍結乾燥後の開始時間点（t＝0）において力価の値を、− 80℃の液体サンプルおよび−20℃の凍結乾燥サンプルの両方について確立した。安定性の研究の各時間点において、得られた力価を、ゼロ時間点の力価の値で割り、そしてオリジナルのパーセントをグラフ上に記入した。このデータは、凍結乾燥後の活性が、液体サンプル（−80℃で保存）と匹敵して凍結乾燥サンプル（−20℃で保存）において維持されていることを実証する。この処方された凍結乾燥組換えレトロウイルスは、−20℃フリーザー（霜のない循環フリーザー）で保存された。−80℃で保存された処方された液体組換えレトロウイルスと匹敵して、凍結乾燥形態は、保存条件のよりストリンジェントでないコントロールを許容する。前記から、本発明の特定の実施態様が例示の目的のために本明細書中で記載されたが、種々の改変は本発明の意図および範囲を逸脱することなくなされ得ることが認識される。従って、本発明は、添付の請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＡＧ，ＡＺ，ＶＮ (72)発明者ジョリー，ダグラスジェイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 92024, ルーカディア，ヒルクレストドライブ 277 (72)発明者モンティサノ，ドミニクアメリカ合衆国カリフォルニア 92117, サンディエゴ，メリマックコート 5069

Claims

【特許請求の範囲】１．動物に核酸分子を導入する方法であって、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物と組み合わせて遺伝子送達ビヒクルを含有する組成物を、動物に非外傷的に投与する工程を包含し、該遺伝子送達ビヒクルは、該遺伝子送達ビヒクルを含む宿主細胞内で、少なくとも１つの物質の発現を指向し、該物質は、本来は該遺伝子送達ビヒクルにより発現されない、方法。２．動物に核酸分子を導入する方法であって、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物と組み合わせて遺伝子送達ビヒクルを含有する組成物を、動物に非外傷的に投与する工程を包含し、該遺伝子送達ビヒクルは、少なくとも１つの生物学的に活性な核酸配列を含有し、ここでこのような生物学的活性は、本来は該遺伝子送達ビヒクルに含まれない、方法。３．動物に核酸分子を導入する方法であって、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物と組み合わせて遺伝子送達ビヒクルを含有する組成物を、動物に非外傷的に投与する工程を包含し、該遺伝子送達ビヒクルは、本来は該遺伝子送達ビヒクル内に含まれない核酸配列を含有する、方法。４．前記薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物が、前記遺伝子送達ビヒクルの投与を促進する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。５．前記物質または前記生物学的活性が、前記投与の前の前記宿主細胞内では示されない、請求項１または３のいずれか１項に記載の方法。６．前記生物学的活性が、投与前の前記動物内では示されない、請求項２または３のいずれか１項に記載の方法。７．前記生物学的活性が、投与前の前記動物における宿主細胞内に存在する生物学的活性を補足する、請求項２または３のいずれか１項に記載の方法。８．前記生物学的活性が、投与前の前記動物における宿主細胞内で示されない生物学的活性を活性化する、請求項２または３のいずれか１項に記載の方法。９．前記生物学的に活性が、投与前の前記動物における宿主細胞内で示される生物学的活性を置換する、請求項２または３のいずれか１項に記載の方法。１０．前記生物学的活性が、投与前の前記動物における宿主細胞内で示される生物学的活性を抑制する、請求項２または３のいずれか１項に記載の方法。