DE69233013T2

DE69233013T2 - Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt

Info

Publication number: DE69233013T2
Application number: DE69233013T
Authority: DE
Inventors: G. Ronald CRYSTAL
Original assignee: National Institutes of Health NIH
Current assignee: National Institutes of Health NIH
Priority date: 1991-08-20
Filing date: 1992-08-20
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2012-08-21
Also published as: ES2197145T3; EP0648271B1; EP0648271A1; JP3534749B2; AU663725B2; CA2115742A1; AU2500692A; EP0648271A4; DE69233013D1; ATE237694T1; DK0648271T3; WO1993003769A1; JPH06510665A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung von Adenovirus für die Übertragung von Genen in den Magen-Darm-Trakt. Im Speziellen betrifft die Erfindung die Verwendung eines rekombinanten, replikationsdefizienten Adenovirus bei der Herstellung eines Medikaments oder Behandlung eines Tieres durch Übertragung therapeutischer Gene zum Magen-Darm-Trakt des Tieres. zum Zwecke der lokalen oder systemischen Produktion therapeutischer Proteine.
Hintergrundinformationen
Die Verwendung von Proteinen als Therapeutika ist unter anderem durch die physiologische Barriere des Magen-Darm-Trakts eingeschränkt. Die Begriffe Protein, Polypeptid, Peptid oder Segment von Aminosäuren werden hierin wechselseitig verwendet, um ein Polymer aus durch Peptidbindungen verbundenen Aminosäuren zu definieren. Therapeutische Proteine sind hierin als für ein Individuum vorteilhafte Proteine definiert. Proteine können für therapeutische Zwecke nicht auf oralem oder rektalem Weg verabreicht werden, da sie im Allgemeinen den Kreislauf nicht in intakter Form in einer Konzentration erreichen können, die für eine Therapie erforderlich ist (da die Proteine abgebaut und/oder nicht absorbiert werden). Infolgedessen müssen therapeutische Proteine systemisch, z. B. auf intravenösem, subkutanem, intradermalem oder intramuskulärem Weg, verabreicht werden.
Dieses Problem der Verabreichung ist durch die Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie drastisch verstärkt worden, bei der es möglich ist, viele verschiedene therapeutische Proteine herzustellen, die allesamt systemisch verabreicht werden müssen. Obwohl dies für eine kurzfristige Anwendung kein großes Problem sein dürfte, ist für die Langzeitanwendung (was die typische Anwendungsform für die meisten rekombinanten Proteine ist) eine langfristige systemische Verabreichung mit all den mit dem Zu gangsweg verbundenen Begleitproblemen (z. B. verfügbare Venen, Mühen und Kosten) notwendig.
Es ist bekannt, dass rekombinante Adenoviren verwendet werden können, um Human-Protein in vivo zu produzieren (Beispiele umfassen intravenöse Injektion von rekombinantem Adenovirus in die Pfortader zur Leber und intratracheal zur Lunge (siehe M. Rosenfeld et al., Science 252, 431–434 (1991); H. A. Jaffe et al., Clin. Res. 39(2), 302A (1991); M. A. Rosenfeld et al., Clin. Res. 39(2), 311A (1991)). Jedoch sind alle diese Ansätze zur Anwendung bei der systemischen Verabreichung rekombinanten Proteine unbrauchbar, da sie die parenterale Verabreichung des rekombinanten Gens (d. h. intravenös, intraportal, intratracheal) erfordern.
Die vorliegenden Erfindung umgeht dies, indem sie die Verabreichung therapeutischer Proteine über enterale Wege durch Verwendung eines rekombinanten, replikationsdefizienten Adenovirus vorsieht, das die kodierenden Sequenzen des Gens für das therapeutische Protein enthält, um das Gen in die Wandzellen des Magen-Darm-Trakts zu insertieren und diesen Ort dazu zu nutzen, um das Protein zu produzieren und in den Kreislauf zu sekretieren, wo das therapeutische Protein für die systemische Anwendung verfügbar wäre. Als Alternative kann derselbe Ansatz verwendet werden, um Proteine für die lokale therapeutische Anwendung innerhalb des freien Raums des Magen-Darm-Trakts oder für die Verwendung innerhalb der Zellen oder der extrazellulären Matrix der Wände des Magen-Darm-Trakts in den Magen-Darm-Trakt zu sekretieren.
Untersuchungen in den Sechzigerjahren zeigten, dass in darmlöslich beschichteten Kapseln (um die Inaktivierung im Magen zu verhindern) untergebrachte und über den oralen Weg an Menschen verabreichte, lebende Adenoviren eine systemische Immunisierung gegen das Adenovirus verursachte (R. M. Chanock et al., JAMA 195, 151–158 (1966)). Dies ist nun ein standardmäßiges Immunisierungsverfahren gegen Adenovirus für Soldaten in den USA. Das dieser Immunisierungsstrategie zugrunde liegende Konzept ist, dass das Adenovirus die Kapsel bei deren Auflösung im Lumen des Darms ver lässt, die Darm-Epithelzellen infiziert, in den Epithelzellen repliziert und das verbreitete, neu replizierte Virus sich dem Immunsystem präsentiert, was eine systemische Immunität gegen das Adenovirus bewirkt.
Es ist früher gezeigt worden, dass das Adenovirus so modifiziert werden kann, dass es replikationsdefizient ist (d.h., es regt nicht die Produktion von neuem Virus an, nachdem es die Target-Zelle infiziert hat), und so, dass es neue Gene enthält (z. B. die kodierenden Sequenzen von Human-Genen von therapeutischem Interesse). Die Verwendung von rekombinanten DNA-Inserts unter direkter Kontrolle des frühen Promotors (EP) der E1a-Region des Adenovirus-Genoms ist von M. Perricaudet et al. (Pasteur-Institut) in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 185.573, veröffentlicht am 25. Juni 1986, beschrieben worden. Ein derart modifiziertes Virus kann verwendet werden, um das rekombinante Gen auf Target-Zellen zu übertragen (Beispiele finden sich bei M. Rosenfeld et al., Science 252, 431–434 (1991); K. L. Berkner, BioTechniques 6, 616–629 (1988)).
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist ein allgemeines Ziel dieser Erfindung, für die Produktion eines Proteins in den Zellen des Magen-Darm-Trakts eines Tieres zu sorgen.
Genauer gesagt stellt diese Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung bereit, die ein replikationsdefizientes Adenovirus umfasst, das ein DNA-Segment umfasst, das für ein biologisch aktives Protein und kein anderes Virus als das besagte replikationsdefiziente Adenovirus kodiert, und zwar zur Produktion des Proteins im Magen-Darm-Trakt eines Tieres für nichttherapeutische und nichtdiagnostische Zwecke.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines replikationsdefizienten Adenovirus bereit, das ein DNA-Segment umfasst, das für ein biologisch aktives therapeutisches Protein kodiert, und zwar bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung, bei der das Protein eine therapeutische Wirkung aufweist, durch Verabreichung an den Magen-Darm-Trakt eines Tieres zur Produktion des Proteins im Magen-Darm-Trakt, wobei das Medikament kein anderes Virus als das besagte replikationsdefiziente Virus enthält.
In Abhängigkeit von den jeweils in das rekombinante Adenovirus eingeführten Sequenzen wird das Protein für gewöhnlich zur systemischen Therapie in den Kreislauf, zur lokalen Therapie in das Lumen des Magen-Darm-Trakts oder in beide sekretiert. Die Konstruktion eines replikationsdefizienten Adenovirus der Erfindung kann vorzugsweise derart erfolgen, dass das Protein zur Verwendung innerhalb der Zellen des Magen-Darm-Trakts oder in den Wänden des Magen-Darm-Trakts abgegeben wird.
Weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nun folgenden Beschreibung.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1. Rekombinanter Adenovirus- (-Ad-) Vektor. Oben – Ad5-Genom der Wildform, wobei die E1a-, E1b- [Map-Units (mu) 1,3–11,2; 100 mu = 36 kb) und E3-Regionen (mu 76,6–86,0) gezeigt sind.
2. Anatomie der Dickdarmwand und des Modells der kultivierten Epithelzellen, das verwendet wurde, um die Polarität der Sekretion von α1-Antitrypsin zu beurteilen, das von mit dem rekombinanten Adenovirus Ad-α1AT (ATCC CCL 248) modifizierten T84-Human-Dickdarmkarzinom-Epithelzellen produziert wird.

A. Querschnitt der Dickdarmwand, wobei die Epithelzellen (14), das Lumen des Dickdarms (13), die apikale Oberfläche (12) des am Lumen angrenzenden Epithels, die basolaterale Oberfläche (11) des an der Submukosa angrenzenden Epithels und folglich die Kapillaren (19) und die Muskelschicht (20) gezeigt sind.
B. Kammer für Epithelzellen-Kulturen, wobei die mikroporöse Membran (17), die kultivierten Zellen (16) und die getrennten apikalen (15) und basolateralen (18) Kompartimente gezeigt sind.

3. Nachweis der De-novo-Synthese und Sekretion von Human-1α-Antitrypsin (α1AT) durch Ratten-Dickdarm, der dem rekombinanten Adenovirus Ad-α1AT ex vivo ausgesetzt wurde.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung betrifft die Herstellung therapeutischer Proteine im Magen-Darm-Trakt. Ein replikationsdefizientes Adenovirus (unten als „modifiziertes Adenovirus" bezeichnet) wird mit den kodierenden Sequenzen des therapeutischen Proteins von Interesse konstruiert. Als Beispiel wird das Adenovirus Ad-1αAT verwendet, das die kodierende Sequenz des Human-1αAT-Gens enthält (siehe 1 und M. Rosenfeld et al., Science 252, 431–434 (1991)). Das modifizierte Adenovirus – und kein anderes Virus – wird in eine enterische Kapsel gefüllt (oder alternativ über einen durch den Magen hindurch führenden Tubus verabreicht, oral oder mittels Tubus in den Magen, nachdem der auskleidende Magensaft so modifiziert worden ist, dass das Virus nicht verändert wird; oder auf rektalem Weg). Alternativ dazu kann eine spezielle Beschichtung auf das Virus aufgebracht werden, um die Freisetzung und Absorption des modifizierten Virus zu verhindern, bis die Tablette die basische (pH) Umgebung des Duodenums, Jejunums, Ileums oder Kolons erreicht. Für die orale Verabreichung sind Kapseln, Tabletten oder Pillen zweckdienliche Zufuhr-Vehikel; für die rektale Verabreichung kann ein Suppositorium bevorzugt werden. Die Verabreichung wird dann durchgeführt. Dann läuft das folgende Szenario ab: (1) die Zellen (vorzugsweise die Epithelzellen) des Magen-Darm-Trakts werden vom modifizierten Adenovirus infiziert; (2) das rekombinante Gen in der modifizierten Adenovirus-Sequenz steuert die Synthese des rekombinanten Proteins, das dann (abhängig davon, wie die Sequenzen im rekombinanten Gen konstruiert sind) in den Kreislauf, in das Lumen des Magen-Darm-Trakts, oder sowohl in den Kreislauf als auch in das Lumen des Magen-Darm-Trakts, oder innerhalb der Epithelzellen des Magen-Darm-Trakts oder in der lokalen Umgebung innerhalb der Wand des Magen-Darm-Trakts sekretiert werden kann; und (3) das therapeutische Protein ist dann verfügbar, um systemisch (wenn in den Kreislauf sekretiert) oder im Darm (wenn in das Lumen sekretiert), innerhalb der Zellen und/oder der extrazellulären Matrix der Wand des Magen-Darm-Trakts zu wirken.
Die vorliegenden Erfindung stellt eine brauchbaren, einfachen und sicheren Weg bereit, rekombinante Proteine an Menschen zu verabreichen. Durch Verwendung eines replikationsdefizienten Adenovirus ist das Verfahren sicher, da das Virus in den Target-Zellen nicht replizieren kann. Durch Verwendung eines rekombinanten Adenovirus werden die Zellen das therapeutische Human-Protein produzieren. Durch Wahl des Epithels des Magen-Darm-Trakts als Infektions-Target für das replikationsdefiziente Adenovirus ermöglicht die Erfindung eine einfache Verabreichung (vorzugsweise auf oralem Weg über darmlöslich beschichtete Kapseln) auf einem Weg, der wiederholt (beispielsweise täglich oder weniger häufig, abhängig von der Chronizität der Infektion durch das rekombinante Adenovirus in den Epithelzellen) und sicher benutzt werden kann.
Da die Epithelzellen des Magen-Darm-Trakts eine gewisse Menge des Produkts des rekombinanten Adenovirus durch die basolaterale Oberfläche der infizierten Epithelzellen sekretieren, ist die Erfindung für Anwendungen einsetzbar, die eine systemische Verwendung erfordern. Da diese Epithelzellen auch eine gewisse Menge des Produkts durch ihre apikale Oberfläche sekretieren, ist die Erfindung für Anwendungen einsetzbar, die eine luminale Verwendung erfordern (beispielsweise intraluminaler Magen-Darm-Krebs). Wenn das rekombinante Adenovirus in geeigneter Weise konstruiert ist, ist das therapeutische Protein für die therapeutische Verwendung innerhalb der Epithelzellen des Magen-Darm-Trakts oder in der lokalen Umgebung der Wand des Magen-Darm-Trakts verfügbar (beispielsweise für Magen-Darm-Trakt-Krebs oder Entzündungen Magen-Darm-Trakt-Störungen).
Für Störungen, die eine systemische Verabreichung erfordern, stellt dieser Ansatz eine einfache und sichere Art der Verabreichung rekombinanten Proteins an den Kreislauf bereit. Beispiele solcher Proteine umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf:

– α1-Antitrypsin – bei α1-Antitrypsin-Mangel;
– Faktor VIII – bei Hämophilie;
– andere Gerinnungsfaktoren – bei Blutungsstörungen;
– Wachstumshormon – bei Wachstumsstörungen;
– Insulin – bei Diabetes;
– andere Peptidhormone;
– andere Hypophysenhormone [Nebennierenrinden-stimulierendes Hormon (ACTH) und Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH) sind lediglich zwei Beispiele);
– andere Lymphokine und Cytokine für systemische Therapie;
– Interferon γ – bei kindlicher Granulomatose (und anderen gerade untersuchten Störungen);
– Interferon α – bei Leukämie und chronisch aktiver Hepatitis;
– Erythropoietin – bei chronischem Nierenversagen oder anderen markunterdrückenden Störungen;
– andere hämatologische Wachstumsfaktoren – bei markunterdrückenden Störungen;
– Verabreichung von z. B. Gewebeplasminogenaktivator zur Thromboseprävention in den Lungen-Koronararterien nach Reperfusionstherapie, insbesondere nach Ballon-Katheterung, oder von CD4 bei Human-Immunschwäche-Virus- (HIV-) Infektion und anderer Proteine, die eine systemische Verabreichung erfordern, ob sie nun kurzzeitig oder langfristig erfolgt;
– rekombinante Proteine bei anderen vererbten Störungen, wie z. B. Cerebrosidase-Defizienz oder Adenosindeaminase-Defizienz;
– Rezeptor-Agonisten oder Antagonisten – zur Beispiel zur Kontrolle der systemischen Hypertonie; Interleukin-1-Rezeptor-Antagonist bei septischem Schock, primärchronischer Polyarthritis und anderen Störungen;
– Bindungsproteine für Cytokine, Lymphokine und Hormone – zum Beispiel Tumornekrosefaktor-bindendes Protein (ein Teil des Tumornekrosefaktor-Rezeptors) zur Behandlung von Schock und Konsumptions-Störungen, die vom Tumornekrosefaktor vermittelt werden.

Für vererbte und erworbene Störungen des Magen-Darm-Trakts stellt dieser Ansatz ein Mittel des Verabreichens rekombinanter Proteine an der Oberfläche oder innerhalb von Zellen oder der extrazellulären Matrix des Magen-Darm-Trakts bereit. Beispiele möglicher Anwendungen umfassen:

– Pankreasenzyme bei Pankreas-Mangelstörungen, wie z. B. Zystofibrose;
– Lactase bei Lactose-Intoleranz und die geeigneten Enzyme für Dünndarm-Disaccharidase-Mangelerscheinungen;
– lokale Therapie für Magen-Darm-Trakt-Krebsformen mit Cytokinen, Tumor-Suppressor-Proteinen (z. B. p53 und Retinoblastom-Gene) und zytotoxische Proteine;
– Prävention von Krebs in Individuen, die für Magen-Darm-Trakt-Krebs anfällig sind (z. B. familiäre Polypose), mit Tumor-Suppressor-Proteinen (z. B. p53 und Retinoblastom-Gene).

Für Säugetiere und Vögel (im Speziellen Nutztiere, beispielsweise Schweine, Rinder, Schafe, Pferde, Hunden, Katzen und Hühner) stellt dieser Ansatz ein Mittel der Verabreichung rekombinanter Proteine (zum Beispiel Wachstumshormon) an diese Tiere bereit, und zwar zum Zwecke der Wachstumsförderung, was Eigenschaften für kommerzielle Ziele hervorbringt, und/oder für allgemeine therapeutische Zwecke und für die Herstellung von Proteinen aus gereinigten Fraktionen, die Menschen verabreicht werden, sowie von Antikörpern für Reagenzien, die mit Human-Protein reaktiv sind.
Die Verwendung von Proteinen und Polypeptiden als therapeutische Mittel wird gemäß vorliegender Erfindung stark erweitert, indem sie ein Mittel für die Zufuhr wirksamer Mengen von biologisch aktivem Protein an ein Empfänger-Individuum bereitstellt. Die Präparate dieser Erfindung werden geeigneterweise an Tiere verabreicht, die Säugetiere (einschließlich des Menschen), Fische und Vögel umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind. Die Präparate werden vorzugsweise an Nutzvieh (einschließlich Rinder, Pferde, Schweine, Schafe, Zeigen usw.), Haustiere (Katzen, Hunde, Kanarienvögel, Wellensittiche usw.), Fische (insbesondere in einer Aquariums- oder Aquakultur-Umgebung, z. B. tropische Fische, Goldfische und andere Zierfische, Karpfen, Wels, Forelle, Lachs usw.) und Vögel, insbesondere Geflügel, wie z. B. Hühner, Enten, Gänse usw. verabreicht.
In einer der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann das replikationsdefiziente Adenovirus mit Tierfutter (oder, bei schlechterer Regulierbarkeit, mit dem Trinkwasser der Tiere) angewendet werden, das als nicht-toxischer, pharmazeutisch annehm barer Träger für die Verabreichung an Tiere, z. B. Nutzvieh, Haustiere, Fische, Geflügel usw. dient. In einem ihrer Aspekte ist die Ausführungsform für die Produktion von Proteinen für die Reinigung an Human-Seren und für das Herstellen von Antikörpern für Reagenzien gegen Human-Proteine in einer anderen Spezies, z. B. Rind, Pferd, Schaf, Zeige, Kaninchen, Schwein usw., zweckdienlich. In einem weiteren Aspekt ist diese Ausführungsform bei der Behandlung von Störungen einsetzbar, bei denen Proteine oder Polypeptide als therapeutische Mittel zweckdienlich sind, insbesondere wenn das Gen, das für das therapeutische Protein kodiert, von einer behandelten Spezies hergeleitet ist oder sehr homologe Sequenzen aufweist, um Immunreaktionen zu verhindern.
Das replikationsdefiziente Adenovirus der vorliegenden Erfindung kann gleichermaßen im Gemisch mit herkömmlichen Exzipienten angewendet werden, das sind pharmazeutisch annehmbare organische oder anorganische Trägersubstanzen, die für enterale (z. B. orale) Anwendung geeignet sind und nicht nachteilig mit dem Virus reagieren. Geeignete pharmazeutische Träger sind im Fach allgemein bekannt. (Geeignete Vehikel umfassen jene, die ausreichend säureresistent und basenempfindlich sind, so dass der Transport durch den Magen ohne inakzeptablen Abbau bewirkt werden kann.) Sie umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Gummiarabicum, Pflanzenöle, Benzylalkohole, Polyethylenglykole, Gelatine, Kohlenhydrate, wie z. B. Lactose, Amylose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talkum, Kieselsäure, viskoses Paraffin, Duftöle, Fettsäure, Monoglyceride und Diglyceride, Pentaerythritol-Fettsäureester, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon usw. Wenn Vorkehrungen getroffen werden, das replikationsdefiziente Adenovirus nicht abzutöten, können die Präparate sterilisiert und, wenn nötig, mit Hilfsstoffen, z. B. Gleitmitteln, Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Netzmitteln, Emulgatoren, Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Drucks, Puffern, Farb-, Geschmacks- und/oder Aromastoffen und dergleichen vermischt werden, die nicht nachteilig mit dem aktiven Virus reagieren. Beispielsweise können Agenzien verwendet werden, um den pH-Wert des Magens entweder direkt (wie z. B. mit Puffern oder Basen) oder indirekt (wie z. B. mit Medikamenten) zu erhöhen, um dem Virus zu ermöglichen, den Magen leichter unbeschadet zu passieren. Sie können falls gewünscht auch mit anderen biologisch aktiven Mitteln, z. B. Antisense-DNA oder mRNA, kombiniert werden.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das replikationsdefiziente Adenovirus als Impfstoff angewendet werden, um Immunität gegen infektiöse Agenzien zu entwickeln. Die Strategie ist folgende. Das Gen, das für das Protein kodiert, gegen das Immunität zu entwickeln ist, wird in das replikationsdefiziente Adenovirus-Konstrukt kloniert; als Nächstes wird das das Gen von Interesse enthaltende, replikationsdefiziente Adenovirus dann an ein Tier (vorzugsweise einen Menschen) wie hierin beschrieben verabreicht. Die Gen-Sequenzen sind derart konstruiert, dass das Protein von den Epithelzellen des Magen-Darm-Trakts in den systemischen Kreislauf sekretiert wird, so dass Immunität gegen die fremden Proteine entwickelt wird.
Beispiele für diesen Ansatz umfassen die Entwicklung einer Immunität gegen Hepatitis-Viren, Human-Immunschwäche-Virus und alle anderen Viren, die eine tierische Erkrankung (insbesondere menschliche Erkrankung) verursachen. Diese Strategie kann auch angewendet werden, um Immunität gegen Bakterien, Pilze und andere infektiöse Agenzien zu entwickeln.
Ein besonders interessanter Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung des replikationsdefizienten Adenovirus als Zufuhrsystem für Chemotherapeutika, einschließlich Antisense-Verbindungen, insbesondere zur Verwendung in der Krebs-Chemotherapie. Die Verwendung mit herkömmlichen Chemotherapeutika erfolgt wie oben besprochen. Kurz gesagt umfasst die Verwendung mit Antisense-Verbindungen zur Verwendung gegen Tumorzellen im Darm die Wahl von mRNA als primäres Medikamenten-Target, wobei entweder ein anderes mRNA-Molekül oder ein synthetisches Oligodesoxynucleotid mit einer zur mRNA komplementären Besensequenz durch Wasserstoffbrückenbindungs-Basenpaarung eine Hybrid-Doppelhelix bildet. Diese Hybridisierung kann die Expression des Proteinprodukts der Target-mRNA verhindern, ein Vorgang, der „Translations-Arretierung" genannt wird. Die Inhibierung von mRNA ist wirk samer als die Inhibierung einer Enzym-Aktivstelle, da ein einzelnes mRNA-Molekül mehrere Proteinkopien bildet. Folglich liefert die selektive Inhibierung der Expression eines Genprodukts, das für die Zellfunktion erforderlich ist, das schwer fassbare, jedoch höchst wünschenswerte Ziel der Chemotherapie: den selektiven Zelltod. Solche Ansätze sind aus der Literatur bekannt, siehe z. B. J. S. Cohen, „Antisense Oligonucleotides as an Approach Toward Anti-Aids Therapy", auf den Seiten 195–224 von "Design of Anti-Aids Drugs", E. deClerg (Hrsg.), Elsevier Publishing Co. (1990); und S. L. Loke et al., Current Topics in Microbiology and Immunology 141, 282–289 (1988).
Für enterische Anwendungen sind Tabletten, Dragees, Flüssigkeiten, Tropfen, Suppositorien oder Kapseln besonders geeignet. Ein Sirup, Elixier oder dergleichen kann verwendet werden, wo ein gesüßtes Vehikel angewendet wird. Zusammensetzungen mit verzögerter oder gesteuerter Freisetzung können formuliert werden, z. B. Liposomen oder jene, worin das aktive Virus mit differenziell abbaubaren Beschichtungen, z. B. durch Mikroeinkapselung, Mehrfachbeschichtungen usw., geschützt ist. Gefriertrocknung der Zusammensetzungen und die Verwendung der erhaltenen Lyophilisate ist ebenfalls möglich.
Im Allgemeinen werden die Präparate dieser Erfindung in Einheitsdosisform zubereitet, die 10⁶–10^–4 pfu/ml des replikationsdefizienten Adenovirus in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger je Dosiseinheit, vorzugsweise 10¹⁰–10^–2 pfu/ml enthält. Die Dosierungen der biologisch aktiven Verbindungen, die gemäß dieser Erfindung verabreicht werden, sind im Fach allgemein bekannt, sind jedoch aufgrund des durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten verbesserten Zufuhrsystems häufig vermindert.
Die tatsächlich bevorzugten Mengen des im jeweiligen Fall verabreichten replikationsdefizienten Adenovirus variieren gemäß dem jeweils angewendeten Protein oder Polypeptid, den jeweilis formulierten Zusammensetzungen, der Verabreichungsart und dem jeweils behandelten Ort und Organismus.
Die jeweils angewendete Formulierung wird gemäß herkömmlichem Wissen in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Proteins oder Polypeptids und dem gewünschten Wirkungsort gewählt, um die Bioverfügbarkeit der aktiven Bestandteile zu gewährleisten, d. h., das Ausmaß, in dem das Medikament seinen Wirkungsort oder eine biologische Flüssigkeit, von der aus das Medikament Zugang zu seinem Wirkungsort hat, erreicht.
Dosierungen für einen gegebenen Wirt können unter Anwendung konventioneller Überlegungen ermittelt werden, z. B. durch herkömmlichen Vergleich der unterschiedlichen Aktivitäten der gegenständlichen Präparate mit einem bekannten, konventionellen pharmakologischen Protokoll.
Die vorliegenden Erfindung wird in den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen ausführlicher beschrieben.
BEISPIELE
Um die Umsetzbarkeit der Erfindung nachzuweisen, wurde das replikationsdefiziente rekombinante Adenovirus Ad-α1AT (1) verwendet, um die für Human-α1-Antitrypsin kodierende Sequenz auf die Epithelzellen des Kolons zu übertragen. Drei Modelle wurden angewendet: (1) T84-Human-Kolonkarzinomzellen in vitro; (2) intakter Ratten-Darm ex vivo; (3) Cotton-Ratten-Darm in vivo.
Auf die folgenden Vorschriften und experimentellen Details wird in den nachfolgenden Beispielen Bezug genommen:
Der rekombinante Vektor (Ad-α1AT) wird konstruiert, indem der Hauptteil der E3-Region und 2,6 mu vom linken Ende von Ad5 deletiert werden und am linken Ende die α1-Antitrypsin- (α1AT-) Expressionskassette aus dem Plasmid pMLP-α1AT, das regulatorische Sequenzen und ein rekombinantes Human-α1 AT-Gen enthält, angefügt wird
1). Ad5 ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, im Handel erhältlich. Die Herstellung der α₁AT-cDNA, der Expressionskassette und des endgültigen Vektor-Adenovirus erfolgt unter Anwendung der von M. Rosenfeld et al., Science 252, 431–434 (1991), beschriebenen Verfahren.
Das untere Ende der 1 stellt Details der α1AT-Expressionskassette dar. ITR, invertierte terminate Wiederholung. Um den rekombinanten viralen Vektor Ad-α1AT zu konstruieren, wurde die Expressionskassette mit Clal-vorgeschnittener Ad-d1327-DNA ligiert (um einen Teil der E1a-Region von Ad-d1327 zu entfernen). Die rekombinante Adenovirus-DNA wurde in die Zelllinie 293 transfiziert, wo sie repliziert, in ein infektiöses Virus eingekapselt und durch Plaque-Reinigung isoliert wurde. Einzelne Plaques wurden durch Vermehrung in 293-Zellen amplifiziert und die Virus-DNA extrahiert. Die Unversehrtheit der DNA des rekombinanten Virus wurde vor der Verwendung durch Restriktionsfragmentanalyse und Southern-Hybridisierung bestätigt. Vorräte von Ad-α1AT wurden vermehrt und in 293-Zellen titriert. Das Virus wurde 36 Stunden nach der Infektion durch 5 Einfrier/Auftau-Zyklen freigesetzt. Das Ad-α1AT wurde unter Verwendung von CsCI-Gradienten weiter gereinigt (für weitere Details siehe M. Rosenfeld et al., Science 252, 431–434 (1991)).
3A präsentiert einen Nachweis der De-novo-Synthese und Sekretion von Humanα1-Antitrypsin (α1AT) durch Ratten-Darm, der dem rekombinanten Adenovirus Ad-α1AT ausgesetzt war. Der Darm wurde gewaschen und das Ende abgebunden, um eine „Wurst" von 2-5 cm Länge herzustellen, und es wurden 50–100 Mikroliter Ad-alphalAT mit 10¹⁰–10¹² pfu/ml in LHC-8-Medium in den Lumen injiziert. Die „Wurst" wurde dann für 24 Stunden bei 37°C inkubiert, gewaschen, in 1-mm²-Stücke zerschnitten und ³²S-Methionin mCi/ml) in Methionin-Minus-LHC-8-Medium zugegeben. Nach Inkubation für 24 Stunden bei 37°C wurde die Flüssigkeit, in der die Stücke inkubiert worden sind, durch Immunpräzipitation, Natriumdodecylsulfat-Acrylamidgele und Autoradiographie auf Anwesenheit von Human-α1AT beurteilt. Die Ergebnisse sind in 3B dargestellt, worin: Spur 1 – nicht infizierter Darm; Spur 2 – mit Ad-α1AT infizierter Darm; und Spur 3, wie Spur 2, wobei jedoch der Antikörper unmarkiertem Human-α1AT ausgesetzt wurde (um die Spezifität des Antikörpers nachzuweisen). Das Human-α1AT mit 52 kDa ist mit dem Pfeil bezeichnet.
Beispiel 1
T84-Human-Kolonkarzinomzellen in vitro
Dieses Modell wurde verwendet, um zu zeigen, dass Human-Kolonepithelzellen durch Ad-α1AT infiziert werden können und dass die Infektion die Sekretion von Humanα1AT zur apikalen Oberfläche (d. h. zur Lumenseite des Epithels) und zur basolateralen Oberfläche (d. h. zur Kreislaufseite des Epithels) bewirkte. Um dies zu erzielen, wurde die T84-Zeltlinie an mikroporösen Membranen gezüchtet, bis sie zusammenflossen und feste Verbindungen bildeten (elektrischer Widerstand > 150 Ohm·cm² über das Epithel hinweg). Die mikroporöse Polycarbonatmembran (4,7 cm², Porendurchmesser 3,0 μm, Transwell Col., Coster, Cambridge, USA) mit den Epithelzellen trennen zwei Kammern, die Kulturflüssigkeit enthalten; das ist ein In-vitro-System, das das Epithel in vivo nachahmt. Die obere Kammer liegt an der apikalen Oberfläche, und die untere Kammer liegt an der basolateralen Oberfläche. Die Vereinigung der Zellen und die festen Verbindungen zwischen den Zellen trennen die Flüssigkeiten und die obere und untere Kammer physisch (entsprechend der In-vivo-Situation, wo die apikale Oberfläche an das innere Lumen des Darms angrenzt und die basolaterale Oberfläche an der Gewebeseite (und folglich an den Kreislauf) angrenzt; siehe 2). Die Zellen werden in DMEM, 2% fötales Kälberserum für 1,5 Stunden bei 37°C und dann in DMEM, 10% fötales Kälberserum für 24 Stunden bei 37°C ohne Adenovirus oder mit Ad-α1AT kultiviert (von der apikalen Seite, wie es in vivo auftreten würde). Drei verschiedene Infektionsstärken wurden eingesetzt [gemessen in Plaque-bildenden Einheiten (pfu), die Anzahl infektiöser Virus-Teilchen je ml Flüssigkeit; 5 × 10⁹; 10¹⁰ und 2,5 × 10¹⁰ pfu/Kultur]. Die Medien wurden dann gesammelt und unter Anwendung eines Enzyme-Linked-Immunoassays (M.D. Wewers et al., N. Engl. J. Med. 316, 1055–1062 (1987)) auf Gegenwart von Human-α1-Antirypsin hin beurteilt. Die Daten belegen, dass die Ad-α1AT-Infektion die Human- Darmepithelzellen dazu bringt, α1AT zu sekretieren und dass sie dieses in beide Richtungen sekretieren, d.h. zu den apikalen und basolateralen Oberflächen. Die zur apikalen Oberfläche im Vergleich zur basolateralen Oberfläche sekretierte Menge lag im Bereich von 3,98 bis 4,69 (im Mittel 4,43), d. h. auf 4,34 in das Lumen sekretierte Moleküle (wo sie letztlich in vivo sekretiert werden würden) kommt 1 in das Gewebe sekretiertes Molekül (wo es dem Kreislauf verfügbar wäre).
Die Ergebnisse des Beispiels 1 sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 Polarität der Sekretion von Human-a1-Antitrypsin durch die Human-T84-Kolonkarzinomzelllinie nach Infektion mit dem rekombinanten Adenovirus Ad-α1AT.
Beispiel 2
Intakter Ratten- und Cotton-Ratten-Darm in vivo
Dieses Modell wurde verwendet, um zu ermitteln, ob das rekombinante Adenovirus Darm-Epithelzellen unter Verhältnissen infizieren kann, bei denen die Zellen normal waren (d. h. nicht wie im T84-Modell vom Neoplasma hergeleitet waren) und in ihrer normalen architektonischen Struktur vorlagen. Um dies durchzuführen, wurde Ratten-Darm entfernt, gewaschen und ein 2–3 cm langer Abschnitt durch Abbinden beider Enden zu einer geschlossenen „Wurst" geformt (3). Ad-α1AT wurde in das Lumen injiziert (entsprechend lebendem rekombinantem Adenovirus, das aus darmlöslich beschichteten Kapseln freigesetzt wird). Die „Wurst" wurde für 24 Stunden bei 37°C in Kulturmedien eingelegt und dann auf zwei Arten beurteilt.
Erstens wurde der Darm in 1-mm²-Stücke zerteilt, ³⁵S-Methionin zugesetzt, die Kultivierung für 24 Stunden bei 37°C fortgesetzt und die Fähigkeit des Darms zur In-vitro-Synthese und Sekretion von Human-α1AT mittels Immunpräzipitation, Natriumdodecylsulfatgelen und Autoradiographie beurteilt (siehe M. Rosenfeld et al., Science 252, 431-434 (1991) bezüglich Einzelheiten und Verfahren). Die Ergebnisse zeigen, dass nicht infizierter Ratten-Darm kein Human-α1AT in vitro synthetisiert, dass jedoch Ad-α1AT-infizierter Ratten-Darm dies sehr wohl tut (3).
Eine ähnliche Technik wurde angewendet, um Cotton-Ratten-Darm zu beurteilen, jedoch mittels Enzyme-Linked-Immunoassay (ELISA) zur Quantifizierung der in das Lumen sekretierten α1AT-Menge (d. h. apikale Sekretion; es ist in diesem Modell nicht möglich, die basolaterale Sekretion zu beurteilen). 48 Stunden nach der Infektion mit ungefähr 10¹¹ pfu an in vitro in das Lumen der Cotton-Ratten-Darm-„Wurst" injiziertem Ad-α1AT wurden in der Lumenflüssigkeit 3,3 +/– 0,6 μg/ml Human-α1AT nachgewiesen.
Beispiel 3
Cotton-Ratten-Darm in vivo
Dieses Modell wurde verwendet, um zu zeigen, dass das Konzept in vivo in lebenden Tieren funktioniert. Zwei Strategien wurden angewendet, beide in Cotton-Ratten. Erstens wurde nach Vollnarkose und Laparotomie ein Teil des Darms an zwei Stellen abgeschnürt, um eine In-vivo-„Wurst" in einer Weise zu bilden, die normalen Blutfluss zu diesen Segmenten erlaubt. Ad-α1AT wurde in das Lumen injiziert und die Laparotomie geschlossen. Die Tiere wurden ohne Oralaufnahme gehalten. Nach 48 Stunden wurde eine Serumprobe abgenommen und mittels ELISA auf die Anwesenheit von Humanα1AT hin beurteilt. Zweitens wurden nach Vollnarkose und Laparotomie 10¹⁰–10¹² pfu Ad-α1AT in das Lumen des Darms ohne Abschnürung injiziert. Nach 48 Stunden wurde eine Serumprobe gezogen und mittels ELISA auf Human-α1AT beurteilt. In beiden Fällen war α1AT eindeutig vorhanden.
Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt.
Tabelle II Serumspiegel von Human-α1-Antitrypsin in Cotton-Ratten 48 Stunden nach In-vivo-Verabreichung von Ad-1αAT in das Lumen des Darms

Claims

Verwendung eines replikationsdefizienten Adenovirus, das ein DNA-Segment umfasst, das für ein biologisch aktives therapeutisches Protein kodiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung, worin das Protein therapeutische Wirkung aufweist, durch Verabreichung an den Magen-Darm-Trakt eines Tieres zur Produktion des Proteins im Magen-Darm-Trakt, wobei das Medikament kein anderes Virus als das replikationsdefiziente Adenovirus enthält.
Verwendung einer Zusammensetzung, die ein replikationsdefizientes Adenovirus, das ein für ein biologisch aktives Protein kodierendes DNA-Segment kodiert, und kein anderes Virus als das replikationsdefiziente Adenovirus umfasst, zur Produktion des Proteins im Magen-Darm-Trakt eines Tieres für nichttherapeutische und nichtdiagnostische Zwecke.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Adenovirus in einer enterischen Kapsel eingekapselt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Protein ein Gerinnungsfaktor, ein Hypophysenhormon, ein Peptidhormon, ein Zytokin, ein Tumorsuppressorprotein, ein hämatologischer Wachstumsfaktor, ein Rezeptoragonist oder ein Rezeptorantagonist ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Protein α1-Antitrypsin, Erythropoietin, Faktor VIII, Wachstumshormon, Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein, Interleukin-1-Rezeptorantagonist, Interferon-γ, Interferon-α oder Insulin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Adenovirus Ad-α1AT ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Tier ein Säugetier, Vogel oder Fisch ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin das Tier ein Säugetier ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin das Tier ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin das Tier ein Schwein, Schaf, Rind, Pferd, eine Katze oder ein Hund ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin das Tier ein Huhn ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Tier nach der Produktion des Proteins Immunität gegen das Protein entwickelt.
Enterische Kapsel, die ein replikationsdefizientes Adenovirus, das ein für ein therapeutisches Protein kodierendes DNA-Segment enthält, und kein anderes Virus umfasst, das die Replikation des Adenovirus fördern kann.
Enterische Kapsel nach Anspruch 13, worin das Protein ein therapeutisches Protein ist.
Enterische Kapsel nach Anspruch 13, worin das Protein ein Gerinnungsfaktor, ein Hypophysenhormon, ein Peptidhormon, ein Zytokin, ein Tumorsuppressorprotein, ein hämatologischer Wachstumsfaktor, ein Rezeptoragonist oder ein Rezeptorantagonist ist.
Enterische Kapsel nach Anspruch 13, worin das Protein α1-Antitrypsin, Erythropoietin, Faktor VIII, Wachstumshormon, Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein, Interleukin-1-Rezeptorantagonist, Interferon-γ, Interferon-α oder Insulin ist.
Enterische Kapsel nach Anspruch 13, worin das Adenovirus Ad-α1AT ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, Folgendes umfassend: ein replikationsdefizientes Adenovirus, das zumindest ein für ein therapeutisches Protein kodierendes DNA-Segment enthält, wobei das Adenovirus in einem säurebeständigen und basenempfindlichen Vehikel zur Abgabe an den Magen-Darm-Trakt enthalten ist, und kein anderes Virus, das die Replikation des Adenovirus fördern kann, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Verdünnen, Träger oder Exzipienten.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, worin das Adenovirus in einer enterischen Kapsel enthalten ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, worin das Protein ein therapeutisches Protein ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, worin das Protein ein Gerinnungsfaktor, ein Hypophysenhormon, ein Peptidhormon, ein Zytokin, ein Tumorsuppressorprotein, ein hämatologischer Wachstumsfaktor, ein Rezeptoragonist oder ein Rezeptorantagonist ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, worin das Protein a1-Antitrypsin, Erythropoietin, Faktor VIII, Wachstumshormon, Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein, Interleukin-1-Rezeptorantagonist, Interferon-γ, Interferon-α oder Insulin ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, worin das Adenovirus Ad-α1AT ist.
Verwendung eines replikationsdefizienten Adenovirus, das ein DNA-Segment umfasst, das für ein biologisch aktives therapeutisches Protein kodiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung, worin das Protein therapeutische Wirkung aufweist, durch Verabreichung an den Magen-Darm-Trakt eines Tieres zur Produktion des Proteins im Magen-Darm-Trakt, wobei das Medikament kein anderes Virus als das replikationsdefiziente Adenovirus enthält.
Verwendung einer Zusammensetzung, die ein replikationsdefizientes Adenovirus, das ein für ein biologisch aktives Protein kodierendes DNA-Segment kodiert, und kein anderes Virus als das replikationsdefiziente Adenovirus umfasst, zur Produktion des Proteins im Magen-Darm-Trakt eines Tieres für nichttherapeutische und nichtdiagnostische Zwecke.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Adenovirus in einer enterischen Kapsel eingekapselt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Protein ein Gerinnungsfaktor, ein Hypophysenhormon, ein Peptidhormon, ein Zytokin, ein Tumorsuppressorprotein, ein hämatologischer Wachstumsfaktor, ein Rezeptoragonist oder ein Rezeptorantagonist ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Protein α1-Antitrypsin, Erythropoietin, Faktor VIII, Wachstumshormon, Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein, Interleukin-1-Rezeptorantagonist, Interferon-γ, Interferon-α oder Insulin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Adenovirus Ad-α1AT ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Tier ein Säugetier, Vogel oder Fisch ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin das Tier ein Säugetier ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin das Tier ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin das Tier ein Schwein, Schaf, Rind, Pferd, eine Katze oder ein Hund ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin das Tier ein Huhn ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Tier nach der Produktion des Proteins Immunität gegen das Protein entwickelt.
Verfahren zur Herstellung einer enterischen Kapsel, die ein replikationsdefizientes Adenovirus, das ein für ein therapeutisches Protein kodierendes DNA-Segment enthält, und kein anderes Virus umfasst, das die Replikation des Adenovirus fördern kann.
Verfahren zur Herstellung einer enterischen Kapsel nach Anspruch 13, worin das Protein ein therapeutisches Protein ist.
Verfahren zur Herstellung einer enterischen Kapsel nach Anspruch 13, worin das Protein ein Gerinnungsfaktor, ein Hypophysenhormon, ein Peptidhormon, ein Zytokin, ein Tumorsuppressorprotein, ein hämatologischer Wachstumsfaktor, ein Rezeptoragonist oder ein Rezeptorantagonist ist.
Verfahren zur Herstellung einer enterischen Kapsel nach Anspruch 13, worin das Protein α1-Antitrypsin, Erythropoietin, Faktor VIII, Wachstumshormon, Tumornekrose- Faktor-Bindungsprotein, Interleukin-1-Rezeptorantagonist, Interferon-γ, Interferon-α oder Insulin ist.
Verfahren zur Herstellung einer enterischen Kapsel nach Anspruch 13, worin das Adenovirus Ad-α1AT ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, Folgendes umfassend: ein replikationsdefizientes Adenovirus, das zumindest ein für ein therapeutisches Protein kodierendes DNA-Segment enthält, wobei das Adenovirus in einem säurebeständigen und basenempfindlichen Vehikel zur Abgabe an den Magen-Darm-Trakt enthalten ist, und kein anderes Virus, das die Replikation des Adenovirus fördern kann, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Verdünner, Träger oder Exzipienten.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 18, worin das Adenovirus in einer enterischen Kapsel enthalten ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, worin das Protein ein therapeutisches Protein ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, worin das Protein ein Gerinnungsfaktor, ein Hypophysenhormon, ein Peptidhormon, ein Zytokin, ein Tumorsuppressorprotein, ein hämatologischer Wachstumsfaktor, ein Rezeptoragonist oder ein Rezeptorantagonist ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, worin das Protein α1-Antitrypsin, Erythropoietin, Faktor VIII, Wachstumshormon, Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein, Interleukin-1-Rezeptorantagonist, Interferon-γ, Interferon-α oder Insulin ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, worin das Adenovirus Ad-α1AT ist.