DE69933877T2

DE69933877T2 - Stabiler hypoxie-induzierbarer faktor-1 alpha und verfahren zur verwendung

Info

Publication number: DE69933877T2
Application number: DE69933877T
Authority: DE
Inventors: L. Gregg Towson SEMENZA
Original assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Priority date: 1998-08-25
Filing date: 1999-08-25
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2019-08-26
Also published as: US6124131A; AU5691499A; NO20010920L; CA2340328A1; IL141494A; EP1107768A1; NZ510002A; EP1107768A4; DE69933877D1; AU758627B2; IL141494A0; WO2000010578A1; EP1107768B1; US6562799B1; NO20010920D0; CA2340328C; ATE344043T1; JP2002523028A; US20030176349A1

Description

Diese Erfindung betrifft allgemein durch Hypoxie induzierbare DNA-bindende Proteine und noch spezifischer DNA-bindende Proteine, die modifiziert sind, so dass sie unter nicht-hypoxischen sowie unter hypoxischen Bedingungen stabil sind.
Säuger benötigen molekularen Sauerstoff (O₂) für die lebenswichtigen Stoffwechselprozesse einschließlich der oxidativen Phosphorylierung, bei der O₂ als Elektronenakzeptor während der ATP-Bildung dient. Systemische, lokale und intrazelluläre homöostatische Antwortreaktionen, die durch Hypoxie (der Zustand, bei dem der Bedarf an O₂ das Angebot übersteigt) hervorgerufen werden, umfassen die Erythropoiese in Individuen, die anämisch sind oder sich in großer Höhe aufhalten (Jelkmann, Physiol. Rev. 72:449–489, 1992), die Gefäßneubildung im ischämischen Myokard (White et al., Circ. Res. 71:1490–1500, 1992) und die Glycolyse in Zellen, die bei verminderter O₂-Spannung kultiviert werden (Wolfe et al., Eur. J. Biochem. 135:405–412, 1983). Diese adaptiven Antwortreaktionen erhöhen entweder die Anlieferung von O₂ oder aktivieren alternative Stoffwechselwege, die kein O₂ benötigen. Hypoxie-induzierbare Genprodukte, die an diesen Antwortreaktionen beteiligt sind, umfassen Erythropoietin (EPO) (Übersichtsartikel in Semenza, Hematol. Oncol. Clinics N. Amer. 8:863–884, 1994), den vaskulären Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF) (Shweiki et al., Nature 359:843–845, 1992; Banai et al., Cardiovasc. Res. 28:1176–1179, 1994; Goldberg & Schneider, J. Biol. Chem. 269:4355–4359, 1994) und glycolytische Enzyme (Firth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6496–6500, 1994; Semenza et al., J. Biol. Chem. 269:23757–23763, 1994).
Die molekularen Mechanismen, die die genetischen Antwortreaktionen auf Hypoxie vermitteln, wurden intensiv für das EPO-Gen untersucht, das einen Wachstumsfaktor codiert, der die Erythropoiese und somit die Aufnahmekapazität des Blutes für O₂ reguliert (Jelkmann, 1992, vorstehend; Semenza, 1994, vorstehend). Cis-wirkende DNA-Sequenzen, die für die Aktivierung der Transkription als Antwortreaktion auf Hypoxie erforderlich sind, wurden in der 3'-flankierenden Region des EPO-Gens identifiziert, und ein trans-wirkender Faktor, der an den Enhancer bindet, der Hypoxie-induzierbare Faktor 1 (HIF-1), erfüllte die Kriterien für einen physiologischen Regulator der Transkription des EPO-Gens. Insbesondere induzierten die Induktoren der EPO-Expression (1% O₂, Kobaltchlorid [CoCl₂] und Desferrioxamin [DFX]) ebenfalls die DNA-bindende Aktivität des HIF-1 mit ähnlichen Kinetiken. Darüber hinaus blockierten Inhibitoren der EPO-Expression (Actinomycin D, Cycloheximid und 2-Aminopurin) die Induktion der HIF-1-Aktivität. Des Weiteren eliminierten Mutationen in der 3'-flankierenden Region des EPO-Gens, die die HIF-1-Bindung eliminierten, auch die Enhancer-Funktion (Semenza, 1994, vorstehend). Diese Ergebnisse sprechen für einen Signalübertragungsweg, der eine fortlaufende Transkription, Translation erfordert, und Proteinphosphorylierung ist an der Induktion der DNA-bindenden Aktivität des HIF-1 sowie an der Transkription des EPO-Gens in hypoxischen Zellen beteiligt ist (Semenza, 1994, vorstehend).
Die EPO-Expression ist zelltypspezifisch, aber die Induktion der HIF-1-Aktivität durch 1% O₂, CoCl₂ oder DFX wurde in vielen Säuger-Zelllinien nachgewiesen (Wang & Semenza, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4304–4308, 1993). Der EPO-Enhancer steuert die durch Hypoxie induzierbare Transkription von Reportergenen, die in Zellen transfiziert worden waren, welche EPO nicht produzierten (Wang & Semenza, 1993, vorstehend; Maxwell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2423–2427, 1993). RNAs, die verschiedene glycolytische Enzyme codieren, wurden durch 1% O₂, CoCl₂ oder DFX in EPO produzierenden Hep3B- oder in EPO nicht produzierenden HeLa-Zellen induziert, wohingegen Cycloheximid ihre Induktion blockierte, und Sequenzen von Glycolysegenen, die HIF-1-Bindestellen enthielten, vermittelten die durch Hypoxie induzierbare Transkription in Transfektions-Testansätzen (Firth et al., 1994, vorstehend; Semenza et al., 1994, vorstehend). Diese Experimente unterstützen die Rolle von HIF-1 bei der Aktivierung homöostatischer Antwortreaktionen auf Hypoxie.
Der Hypoxie-induzierbare Faktor-1 (HIF-1) ist ein Transkriptionsfaktor in Säugern, der ausschließlich als Antwortreaktion auf physiologisch relevante Grade der Hypoxie exprimiert wird (Wang, G.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5510–5514, 1995; Wang, G.L. und Semenza, G.L. J. Biol. Chem. 270:1230–1237, 1995; US-Patent Nr. 5,882,914). HIF-1 ist ein basisches Helix-Schleife-Helix-Protein, das an die cis-wirkenden, auf Hypoxie reagierenden Elemente von Genen bindet, die durch Hypoxie induziert werden (Wang, G.L. und Semenza, G.L., Curr. Opin. Hematol. 3:156–162, 1992; Jiang, B.H. et al., J. Biol. Chem. 272:19253–19260, 1997). Die Gene, die durch HIF-1 in Zellen, die einer Hypoxie unterworfen wurden, aktiviert werden, umfassen EPO, das vaskuläre Endothel-Wachstumshormon (VEGF), die Hämoxygenase-1, die induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase und die Glycolyseenzyme Aldolase A, Enolase 1, Lactat-Dehydrogenase A, Phosphofructokinase I und Phosphoglycerat-Kinase 1 (Semenza, G.L. et al., Kid. Int. 51:553–555, 1997). Die DNA-bindende Aktivität des HIF-1 und die HIF-1-Proteinkonzentration erhöhen sich exponentiell, wenn die Zellen abnehmenden O₂-Konzentrationen ausgesetzt werden (Jiang, B.H. et al., Am. J. Physiol. 271:C1172–C1180, 1996).
HIF-1 aktiviert ebenfalls die Transkription des VEGF-Gens in hypoxischen Zellen (Forsythe et al., 1996; lyer et al., 1998). Wenn kultivierte Zellen mit dem Plasmid pCEP4/HIF-1alpha unter Bedingungen, die die Expression von HIF-1alpha durch den Cytomegalievirus-Promotor erlauben, und einem Reporterplasmid, das das auf Hypoxie reagierende Element des VEGF-Gens enthält, transfiziert werden, wird die Expression des Reportergens in den Zellen unter nicht-hypoxischen Bedingungen erhöht, und es gibt eine dramatische Überinduktion unter hypoxischen Bedingungen, die von der Anwesenheit einer intakten HIF-1-Bindestelle abhängig ist (Forsythe et al., 1996). In embryonalen Stammzellen aus einer Knock-out-Maus, in denen keine Expression von HIF-1alpha erfolgt, erfolgt keine Expression der VEGF-mRNA als Antwortreaktion auf Hypoxie (lyer et al., 1998).
HIF-1 ist ein Heterodimer aus zwei Untereinheiten, HIF-1alpha und HIF-1beta. Die HIF-1alpha-Untereinheit liegt nur in HIF-1 vor, wohingegen HIF-1beta (auch als Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor-Kern-Translokator („aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator"), ARNT, bekannt) mit anderen Proteinen Dimere bilden kann.
Die Konzentrationen der HIF-1alpha- und der HIF-1beta-RNA und der HIF-1alpha- und HIF-1beta-Polypeptide erhöhen sich in den Zellen, die hypoxischen Bedingungen ausgesetzt werden (Wiener, C.M. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 225:485–488, 1996; Yu, A.Y. et al., Am. J. Physiol. 275:L818–L826, 1998).
Die Strukturanalyse von HIF-1alpha offenbarte, dass die Dimerisierung zwei Domänen erfordert, die als HLH und als PAS bezeichnet werden. Die DNA-Bindung wird durch eine basische Domäne vermittelt (Semenza, G.L. et al., Kid. Int. 51:553–555, 1997). In HIF-1alpha sind zwei Transaktivierungsdomänen enthalten, die zwischen den Aminosäuren 531 und 826 lokalisiert sind. Die minimalen Transaktivierungsdomänen befinden sich zwischen den Aminosäureresten 531-575 und 786-826 (Jiang, B.H. et al., 1997, vorstehend; Semenza G.L. et al., 1997, vorstehend). Die Aminosäuren 1-390 sind für eine optimale Heterodimerisierung mit HIF-1beta (ARNT) und DNA-Bindung erforderlich. Darüber hinaus vermindert eine Deletion des Carboxy-Terminus von HIF-1alpha (Aminosäuren 391-826) die Fähigkeit von HIF-1alpha, die Transkription zu aktivieren. HIF-1alpha (1-390) wurde jedoch sowohl in hypoxischen als auch in nicht-hypoxischen Zellen in hohen Spiegeln exprimiert, dies erfolgte im Gegensatz zu dem Volllängen-HIF-1alpha (1-826), der in hypoxischen Zellen in viel höheren Spiegeln relativ zu nicht-hypoxischen Zellen exprimiert wurde (Jiang, B.-H., et al., J. Biol. Chem. 271:17771–17778, 1996). Somit besitzt die Hypoxie zwei unterschiedliche Wirkungen auf die Aktivität des HIF-1alpha: (1) die Hypoxie erhöht den Fließgleichgewichts-Spiegel des HIF-1alpha-Proteins, indem sie es stabilisiert (d. h. seinen Abbau vermindert) und (2) die Hypoxie steigert die spezifische Transkriptionsaktivität des Proteins (d. h. unabhängig von der Proteinkonzentration).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung basiert auf der Entdeckung und der Isolierung einzigartiger varianter Formen des HIF-1alpha-Polypeptids, die unter hypoxischen und unter nicht-hypoxischen Bedingungen stabil sind. Die Erfindung umfasst weiterhin chimäre Proteine, die die DNA-Bindedomäne und die Dimerisierungsdomänen von HIF-1alpha sowie eine heterologe Transaktivierungsdomäne enthalten. Aufgrund der strukturellen und funktionellen Ähnlichkeiten zwischen HIF-1alpha, HIF-2alpha (auch bekannt als EPAS1, HLF, HRF und MOP2) und HIF-3alpha (vergleiche mit Gu, Y.-Z. et al., Gene Expr. 7:205–213, 1998) sollte dies so verstanden werden, dass HIF-1alpha für erläuternde Zwecke beschrieben wird, dass aber alle dieser HIFs hierin mit eingeschlossen sind.
Ein stabiles HIF-1alpha- (sHIF-1alpha-) Protein der Erfindung umfasst die folgenden Eigenschaften: (1) sHIF-1alpha wird die basische Helix-Schleife-Helix-PAS-Domäne von HIF-1alpha enthalten, welche die Dimerisierung mit HIF-1beta (ARNT) und die Bindung an HIF-1-Erkennungstellen auf der DNA vermittelt, d. h. z. B. die Sequenz 5'-TACGTGCT-3' des menschlichen EPO-Gens (die verwendet wurde, um HIF-1 ursprünglich zu isolieren) oder die Sequenz 5'-TACGTGGG-3' des menschlichen VEGF-Gens (Forsythe et al., 1996; Semenza und Wang, Mol. Cell. Biol. 12:5447–5454, 1992); (2) sHIF-1alpha wird Deletionen oder Aminosäureaustausche enthalten, die seine Halbwertszeit in Zellen unter nicht-hypoxischen Bedingungen deutlich erhöhen, so dass das sHIF-1alpha-Protein in viel höheren Spiegeln akkumulieren kann als das Wildtyp-HIF-1alpha-Protein unter den gleichen Bedingungen. Es gibt viele unterschiedliche Deletionen und/oder Aminosäureaustausche, die diese Wirkung herbeiführen können; es werden mehrere Beispiele beschrieben, aber diese stellen keine Einschränkung dar; (3) sHIF-1alpha enthält eine oder mehrere Transkriptionsaktivierungsdomänen, die entweder aus HIF-1alpha oder aus einem anderen eukaryontischen oder viralen Transkriptionsfaktor stammen. In Abhängigkeit von der verwendeten Aktivierungsdomäne kann die Transkriptionsaktivität von sHIF-1alpha durch die Sauerstoffkonzentration reguliert werden, oder sie kann unabhängig von der Sauerstoffkonzentration konstitutiv aktiv sein. sHIF-1alpha vermittelt eine erhöhte Transkription von Hypoxie-induzierbaren Genen, die normalerweise durch HIF-1 reguliert werden.
In einer Ausführungsform umfasst die Erfindung eine isolierte Nucleinsäuresequenz, die ein stabiles HIF-1alpha-Protein codiert, das einen chimären Transaktivator darstellt. Dieser chimäre Transaktivator umfasst: a) eine Nucleotidsequenz, die eine DNA-Bindedomäne und eine Dimerisierungsdomäne eines durch Hypoxie induzierbaren Faktors (z. B. HIF-1alpha, HIF-2alpha oder HIF-3-alpha) codiert, und b) eine Nucleotidsequenz, die eine Transkriptionsaktivierungsdomäne codiert. Der bevorzugte durch Hypoxie induzierbare Faktor der Erfindung ist HIF-1alpha.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung nicht-chimäre stabile HIF-1alpha-Polypeptide bereit. Solche Polypeptide umfassen die HIF-1alpha-Aminosäureste 1-391 und 521-826 der SEQ ID NO: 1; die Aminosäurereste 1-391 und 549-826 der SEQ ID NO: 1; die Aminosäurereste 1-391 und 576-826 der SEQ ID NO: 1; die Aminosäurereste 1-391 und 429-826 der SEQ ID NO: 1, in denen 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; die Aminosäurereste 1-391 und 469-826 der SEQ ID NO: 1, in denen 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; die Aminosäurereste 1-391 und 494-826 der SEQ ID NO: 1, in denen 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; die Aminosäurereste 1-391 und 508-826 der SEQ ID NO: 1, in denen 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; die Aminosäurereste 1-391 und 512-826 der SEQ ID NO: 1, in denen 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; und die die Aminosäurereste 1-391 und 517-826 der SEQ ID NO: 1, in denen 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Die Erfindung stellt weiterhin ein in vitro-Verfahren bereit, das die konstitutive Expression eines Hypoxie-induzierbaren Faktors in einer Zelle unter hypoxischen oder unter nicht-hypoxischen Bedingungen ermöglicht. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen der Zelle mit einer Nucleinsäuresequenz, die ein chimäres Transaktivator-Protein, wie hierin beschrieben, oder ein stabiles HIF-1alpha-Protein, wie hierin beschrieben, codiert, unter zwar Bedingungen, die die Expression der Nucleinsäuresequenz erlauben, wodurch eine konstitutive Expression des Hypoxieinduzierbaren Faktors bereitgestellt wird.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein in vitro-Verfahren für die Steigerung der Expression eines durch Hypoxie induzierbaren Gens in einer Zelle bereit. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Expressionsvektor, der ein Polynucleotid enthält, das ein stabiles HIF-1alpha-Protein der Erfindung oder ein chimäres Transaktivator-Protein, wie hierin beschrieben, codiert, unter Bedingungen, die die Expression der Nucleinsäuresequenz erlauben, die in dem Vektor enthalten ist, wodurch eine gesteigerte Expression der durch Hypoxie induzierbaren Gene in der Zelle bereitgestellt wird. Solche Gene umfassen zum Beispiel das VEGF-Gen.
In der Erfindung ist weiterhin die medizinische Verwendung für die Verminderung von Hypoxie- oder Ischämie-bedingten Gewebeschädigungen in einem Individuum mit eingeschlossen, das solche Schädigungen aufweist oder gefährdet ist, solche Schädigungen aufzuweisen. Die Verwendung umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Nucleinsäuresequenz, die ein chimäres Transaktivatorprotein, wie hierin beschrieben, oder ein stabiles HIF-1alpha-Protein, wie hierin beschrieben, codiert, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger an ein Individuum, wodurch die Genexpression induziert wird, welche Gewebeschäden vermindert oder verhindert oder repariert. Beispiele für Genprodukte, deren Expression durch sHIF-1alpha induziert wird und die zu einer therapeutischen Wirkung führen, umfassen den VEGF und andere Vermittler der Angiogenese sowie den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 2 (IGF-2) und andere Faktoren, die das Überleben der Zelle fördern (lyer et al., 1998; Feldser, D. et al., Cancer Res. 59:3915, 1999).
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die medizinische Verwendung für eine vorbeugende Therapie für Gewebe in einem Individuum bereit, das ihrer bedarf, umfassend die Verabreichung an das Individuum einer Menge eines Polypeptids, das durch ein Polynucleotid codiert wird, welches ein chimäres Transaktivator-Protein, wie hierin beschrieben, oder ein stabiles HIF-1alpha-Protein, wie hierin beschrieben, codiert, so dass die Angiogenese in einem Ausmaße induziert wird, das höher ist als vor der Verabreichung des Polypeptids, wodurch eine vorbeugende Therapie bereitgestellt wird.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein im Wesentlichen gereinigtes Polypeptid bereit, das eine Sequenz besitzt, wie sie in der SEQ ID NO: 1 angegeben ist, wobei die Aminosäuren 392 bis 428 deletiert sind, die Aminosäure 551 von Serin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist, und die Aminosäure 552 von Threonin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist. Isolierte Polynucleotide, die ein solches Polypeptid codieren, sowie Antikörper, die an dieses Polypeptid bevorzugt binden, werden ebenfalls in einer besonderen Ausführungsform bereitgestellt, wobei Serin 551 zu Glycin und Threonin 552 zu Alanin geändert ist.
In einer Ausführungsform wird eine Verwendung zur Behandlung einer durch Hypoxie bedingten Gewebeschädigung in einem Individuum bereitgestellt, dies erfolgt durch die Verabreichung an das Individuum einer therapeutisch wirksamen Menge einer Nucleotidsequenz, die eine Expressions-Kontrollsequenz umfasst, welche mit einem Polynucleotid funktionell verknüpft ist, das eine Sequenz aufweist, wie sie in der SEQ ID NO: 1 angegeben ist, wobei die Aminosäuren 392 bis 428 von der Sequenz deletiert sind, die Aminosäure 551 von Serin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist und die Aminosäure 552 von Threonin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verwendung zur Behandlung einer durch Hypoxie bedingten Gewebeschädigung in einem Individuum bereit, dies erfolgt durch die Verabreichung an das Individuum einer therapeutisch wirksamen Menge eines Polypeptids, das eine Sequenz aufweist, wie sie in der SEQ ID NO: 1 angegeben ist, wobei die Aminosäuren 392 bis 428 von der Sequenz deletiert sind, die Aminosäure 551 von Serin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist und die Aminosäure 552 von Threonin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Formulierung zur Verabreichung des stabilen menschlichen Hypoxie-induzierbaren Faktor 1- (HIF-1alpha) Polypeptids an einen Patienten bereit, der eine durch Hypoxie bedingte Gewebeschädigung aufweist. Das Verfahren umfasst ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das eine Sequenz aufweist, wie sie in der SEQ ID NO: 1 angegeben ist, wobei die Aminosäuren 392 bis 428 von der Sequenz deletiert sind, die Aminosäure 551 von Serin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist und die Aminosäure 552 von Threonin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist; sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine Formulierung zur Verabreichung eines Polynucleotids, das den stabilen menschlichen Hypoxie-induzierbaren Faktor 1 (HIF-1alpha) codiert, an einen Patienten bereit, der eine durch Hypoxie bedingte Gewebeschädigung aufweist, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Nucleinsäuresequenz, die eine Expressionskontrollsequenz umfasst, welche mit einem Polynucleotid funktionell verknüpft ist, das ein Polypeptid codiert, welches eine Sequenz aufweist, wie sie in der SEQ ID NO: 1 angegeben ist, wobei die Aminosäuren 392 bis 428 von der Sequenz deletiert sind, die Aminosäure 551 von Serin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist und die Aminosäure 552 von Threonin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist; sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A–H ist die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1) des Wildtyp-HIF-1alpha.
2 zeigt eine Analyse der Auswirkungen von carboxyterminalen Deletionen auf die regulierte Expression des HIF-1alpha.
3 zeigt eine Analyse der Auswirkungen von internen Deletionen auf die regulierte Expression des HIF-1alpha-Polypeptids. Die Regulation eines HIF-1alpha-Polypeptids durch Sauerstoff, das eine der angegebenen internen Deletionen enthält, ist in der „Wt"-Säule angegeben, wobei ein „+" anzeigt, dass das Polypeptid reguliert wird und daher unter nicht-hypoxischen Bedingungen instabil ist. Jede der angegebenen internen Deletionen des HIF-1alpha wurde mit einer doppelten Punktmutation kombiniert (eine Serin-zu-Glycin-Mutation an der Aminosäure 551 und eine Threonin-zu-Alanin-Mutation am Rest 552). Die Sauerstoff-Regulation des Polypeptids, das sowohl die angegebene interne Deletion als auch die doppelte Punktmutation enthält, ist in der „Mut"-Säule angegeben, wobei ein „+" anzeigt, dass das Polypeptid reguliert wird und daher unter nicht-hypoxischen Bedingungen instabil ist.
4 zeigt ein Modell der regulierten Expression des HIF-1alpha. Mögliche regulatorische Sequenzen, die innerhalb des HIF-1alpha-Proteins durch die Deletionsanalyse identifiziert wurden, sind angegeben. Mögliche Wechselwirkungen mit regulatorischen Proteinen wie z. B. einer Phosphatase, Kinase oder Protease werden ebenfalls gezeigt.
5 ist ein Balkendiagramm, das die Luciferase-Aktivität nach einer Kotransfektion menschlicher 293-Zellen mit einem Reportergen, welches ein auf Hypoxie reagierendes Element (das eine HIF-1-Bindestelle umfasst) enthält, und mit dem Expressionsvektor pCEP4 illustriert, der (1) kein Protein; (2) das Volllängen-HIF-1alpha (Aminosäuren 1-826); (3) HIF-1alpha (1-391/429-826, nur die Deletion); (4) HIF-1alphaDP (Deletion und die Serin-zu-Glycin-Mutation an der Aminosäure 551 und die Threonin-zu-Alanin-Mutation am Rest 552) codiert. Die Expression des Reportergens wird bei 1% (schwarze Balken) und bei 20% (weiße Balken) O₂ gezeigt.
6 ist ein Balkendiagramm, das die Luciferase-Aktivität nach einer Kotransfektion von Hep3B-Zellen mit einem Reportergen, welches ein auf Hypoxie reagierendes Element (das eine HIF-1-Bindestelle umfasst) enthält, und mit dem Expressionsvektor pCEP4 illustriert, der (1) kein Protein; (2) HIF-1alpha; (3) HIF-1alpha (1-391/429-826, nur die Deletion); (4) HIF-1alphaDP (Deletion und die Serin-zu-Glycin-Mutation an der Aminosäure 551 und die Threonin-zu-Alanin-Mutation am Rest 552) codiert. Die Expression des Reportergens wird bei 1% (schwarze Balken) und bei 20% (weiße Balken) O₂ gezeigt.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es sollte angemerkt werden, dass, wie hierin und in den angehängten Ansprüchen verwendet, die Singularformen „ein/eine" und „der/die/das" auch eine Bezugnahme auf den Plural beinhalten, soweit der Text dies nicht eindeutig anders diktiert. Daher umfasst der Bezug auf „eine Zelle" zum Beispiel eine Vielzahl solcher Zellen, und der Bezug auf „das Plasmid" umfasst den Bezug auf ein oder mehrere Plasmide und Äquivalente davon, die den Fachleuten bekannt sind, und so weiter.
Sofern nicht anders definiert, besitzen alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, wie sie hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie im Allgemeinen die Fachleute in dem Gebiet verstehen, zu dem diese Erfindung gehört. Obwohl beliebige andere Verfahren, Vorrichtungen und Materialien, die denjenigen, die hierin beschrieben werden, ähnlich oder äquivalent sind, bei der Durchführung oder dem Austesten der Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren, Vorrichtungen und Materialien jetzt beschrieben.
Die Erfindung stellt ein im Wesentlichen reines, stabiles durch Hypoxie induzierbares Faktor 1- (sHIF-1alpha) Protein oder Mutein bereit. Das Wildtyp-Volllängen-HIF-1alpha-Protein wird in nicht-hypoxischen Zellen im Vergleich zu hypoxischen Zellen in niedrigeren Spiegeln exprimiert (Wang, G.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5510–5514, 1995; Wang, G.L. und Semenza, G.L., J. Biol. Chem. 270:1230–1237, 1995; Jiang, B.H. et al., J. Biol. Chem. 272:19253–19260, 1997), während sHIF-1alpha unter nicht-hypoxischen sowie unter hypoxischen Bedingungen stabil ist. Das Wildtyp-HIF-1alpha-Protein und das sHIF-1alpha-Protein sind dadurch charakterisiert, dass sie in der Lage sind, mit HIF-1beta Heterodimere zu bilden, um ein DNA-bindendes Protein zu bilden, d. h. den Hypoxie-induzierbaren Faktor 1 (HIF-1), einen Transkriptionsfaktor in Säugern. HIF-1 aktiviert die Transkription vieler Gene, einschließlich derjenigen, die Erythropoietin (EPO), den vasculären Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF), Glucose-Transporter und Enzyme der Glycolyse codieren.
Der Begriff „Mutein", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine unterschiedliche Form des HIF-1alpha-Polypeptids, die unter hypoxischen oder nicht-hypoxischen Bedingungen stabil ist. Das HIF-1alpha-Polypeptid stellt nach der Dimerisierung mit HIF-1beta ein DNA-bindendes Protein dar, das dadurch charakterisiert ist, dass es die Genexpression aktiviert, wobei die Promotorregion des Zielgens eine HIF-1-Bindestelle enthält (Semenza, G.L. et al., Kid. Int. 51:553–555, 1997; lyer, N.V. et al., Genes Dev. 12:149–162, 1998). Beispiele für solche Strukturgene umfassen Erythropoietin (EPO), das vasculäre Endothel-Wachstumshormon (VEGF) und Enzyme der Glycolyse. HIF-1alpha wandert bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit einer scheinbaren molekularen Masse von 120 kDa und besitzt im Wesentlichen die Aminosäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NO: 1 angegeben ist. Der Begriff HIF-1alpha umfasst das Polypeptid, wie es in der SEQ ID NO: 1 angeführt ist, und konservative Variationen der Polypeptidsequenz. Der Begriff „konservative Variante", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet den Austausch eines Aminosäurerests durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest. Beispiele für konservative Variationen umfassen den Austausch eines hydrophoben Restes wie z. B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch einen anderen oder den Austausch eines polaren Restes durch einen anderen wie z. B. den Austausch von Arginin für Lysin, von Glutaminsäure für Asparaginsäure oder von Glutamin für Asparagin und ähnliche. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt HIF-1alpha die Sequenz, wie sie in der SEQ ID NO: 1 angegeben ist. HIF-1alpha wird in Einzelheiten in der ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung, Serien-Nr. 08/480,473 (die WO 96/39426 entspricht) beschrieben.
Im Allgemeinen besitzt ein Mutein eine Aminosäuresequenz, die sich von der nativen Sequenz dadurch unterscheidet, dass sie zum Beispiel Austausche, Insertionen und/oder Deletionen enthält. Muteine können unter Verwendung der modernen Clonierungsverfahren leicht hergestellt werden, oder sie können durch Festphasen-Verfahren mittels ortsgerichteter Mutagenese synthetisiert werden. Ein Mutein kann dominant-negative Formen eines Polypeptids umfassen.
Die Erfindung stellt ein im Wesentlichen reines, stabiles durch Hypoxie induzierbares Faktor-1- (sHIF-1alpha) Mutein bereit. Das sHIF-1alpha-Polypeptid besitzt eine Sequenz, wie sie in der SEQ ID NO: 1 angegeben ist, wobei die Aminosäuren 392 bis 428 von der Sequenz deletiert sind, die Aminosäure 551 von Serin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist und die Aminosäure 552 von Threonin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist. In einer Ausführungsform sind die Aminosäuren 392 bis 428 von der SEQ ID NO: 1 deletiert, und die Aminosäure 551 ist von Serin zu Glycin geändert. In einer anderen Ausführungsform sind die Aminosäuren 392 bis 428 von der SEQ ID NO: 1 deletiert, und die Aminosäure 552 ist von Threonin zu Alanin geändert. In einer noch anderen Ausführungsform sind die Aminosäuren 392 bis 428 von der Sequenz deletiert, und die Aminosäure 551 ist von Serin zu Glycin geändert, und die Aminosäure 552 ist von Threonin zu Alanin geändert.
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, zwei Regionen in dem Volllängen-HIF-1alpha-Protein identifiziert wurden, die für die stabile Expression des HIF-1alpha-Proteins wichtig sind. Die Region AB ist in etwa von der Aminosäure 392 bis zu der Aminosäure 552 lokalisiert. Innerhalb dieser Region wurden die zwei Sequenzen A und B identifiziert. Im Besonderen erstreckt sich die Sequenz A von der Aminosäure 392 bis zu der Aminosäure 428 der SEQ ID NO: 1, und die Sequenz B erstreckt sich in etwa von der Aminosäure 429 bis zu 552 der SEQ ID NO: 1. Die Region C ist in etwa von der Aminosäure 703 bis zu der Aminosäure 726 der SEQ ID NO: 1 lokalisiert. Eine „Mutation" in der SEQ ID NO: 1 bezieht sich auf eine Deletion, Insertion, Mutation oder einen Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren. Das stabile HIF-1alpha-Protein kann eine Mutation oder eine Deletion sowohl in Region A als auch in B umfassen. Alternativ kann das stabile HIF-1alpha-Protein eine Deletion in der Region C enthalten. Zum Beispiel können die Regionen A und B deletiert sein, die Regionen A und B können mutiert sein, oder die Region A kann mutiert sein und die Region B kann deletiert sein, oder die Region A kann deletiert sein und die Region B kann mutiert sein, oder die Region C kann mutiert sein, oder die Region C kann deletiert sein. In einem nicht einschränkenden Beispiel ist der stabile HIF-1alpha aus einer Deletion der Aminosäure 392 bis zu der Aminosäure 520 der SEQ ID NO: 1 zusammengesetzt. In einem anderen, nicht einschränkenden Beispiel enthält der stabile HIF-1alpha aus einer Deletion der Aminosäure 392 bis zu der Aminosäure 428 der SEQ ID NO: 1, kombiniert mit einer Punktmutation entweder der Aminosäure 551 oder 552 oder kombiniert mit einer Punktmutation in den beiden Aminosäuren 551 und 552. Die Punktmutationen) können mit der Deletion der Aminosäure 392 bis zu der Aminosäure 428 der SEQ ID NO: 1 kombiniert werden, oder die Punktmutationen) können mit einer Deletion der Aminosäure 392 bis zu einer beliebigen Aminosäure zwischen der Aminosäure 429 und der Aminosäure 550 einschließlich der SEQ ID NO: 1 kombiniert sein.
In einem noch anderen, nicht einschränkenden Beispiel, das nicht Teil der Erfindung ist, enthält der stabile HIF-1alpha aus einer Deletion der Aminosäure 704 bis zu der Aminosäure 826 der SEQ ID NO: 1. Diese Deletion eliminiert die Transaktivierungsdomäne (Aminosäure 786 bis Aminosäure 826) und kann daher zu einem Verlust der biologischen Aktivität führen. In einer Ausführungsform, die nicht Teil der Erfindung ist, kann der stabile HIF-1alpha durch eine Deletion der Aminosäure 704 bis zu der Aminosäure 826 der SEQ ID NO: 1 und der Hinzufügung einer heterologen Transaktivierungsdomäne gebildet werden, die auf die Aminosäure 704 folgt. Die „heterologe" Transaktivierungsdomäne ist eine Transaktivierungsdomäne, die aus einem anderen Polypeptid als dem HIF-1I stammt. In einer Ausführungsform, die nicht Teil der Erfindung ist, wird die Aktivität der heterologen Transaktivierungsdomäne nicht durch die Sauerstoffkonzentration beeinflusst. In einem nicht einschränkenden Beispiel, das nicht Teil der Erfindung ist, stammt die heterologe Transaktivierungsdomäne aus dem VP16-Protein (Aminosäuren 413-490) des Herpes-Simplex-Virus (HSVC). Bei dieser Ausführungsform wird die Deletion der Aminosäuren 391 bis 704 mit einer Deletion der Aminosäure 704 bis zu der Aminosäure 826 kombiniert. Die Transaktivierungsdomäne des HSV-VP16-Proteins wird dann mit den Aminosäuren 1 bis 390 des HIF-1alpha-Polypetids fusioniert. In einer noch anderen Ausführungsform, die nicht Teil der Erfindung ist, wird die Transaktivierungsdomäne aus HIF-1alpha (Aminosäuren 786-826) mit den Aminosäuren 1-390 fusioniert (Jiang et al., 1997). Weitere Kombinationen der Regionen, die als signifikant für die Bildung des sHIF-1alpha-Muteins identifiziert wurden, werden Fachleuten leicht ersichtlich sein.
Ein stabiler HIF-1alpha ist ein HIF-1alpha-Polypeptid, das unter nicht-hypoxischen Bedingungen im Vergleich zu dem Wildtyp-HIF-1alpha eine verlängerte Halbwertszeit aufweist. In einer Ausführungsform hat in einer bestimmten Zelle der sHIF-1alpha die gleiche Halbwertszeit unter hypoxischen oder unter nicht-hypoxischen Bedingungen und liegt in der gleichen Konzentration in den Zellen vor, die nicht-hypoxischen Bedingungen ausgesetzt sind, wie in den Zellen, die hypoxischen Bedingungen ausgesetzt sind. Hypoxie ist ein Zustand, in dem der Bedarf an Sauerstoff in einem Gewebe die Anlieferung von Sauerstoff in diesem Gewebe übersteigt. Die Begriffe „hypoxisch" und „nicht-hypoxisch" sollten als relative Begriffe verstanden werden, die im Hinblick auf die Sauerstoffkonzentration gelten, die in einem bestimmten Gewebe typischerweise beobachtet wird.
Die Fähigkeit des Wildtyp-HIF-1alpha, die Transkription zu aktivieren, wird durch die Sauerstoffkonzentration unabhängig von der Wirkung des Sauerstoffs auf die HIF-1alpha-Proteinstabilität reguliert (Jiang et al., 1997, vorstehend. Die Region des sHIF-1alpha, die zwischen den Aminosäuren 576-785 lokalisiert ist, stellt eine negative regulatorische Domäne dar, die, wenn sie deletiert ist, zu einer gesteigerten Transkription unter nicht-hypoxischen Bedingungen führt (Jiang et al., J. Biol. Chem. 272:19253, 1997). Daher führt, ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, eine Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren in dieser Sequenz, bei der die Aminosäure durch eine Bindung ersetzt wird, zu einer höheren Transkriptionsaktivität, die von der Halbwertszeit des Proteins unabhängig ist. Daher kann die Deletion der Aminosäuren 576-785 des HIF-1alpha-Proteins mit der Deletion der Aminosäuren 392-428 und der Punktmutation der Aminosäure 551 von Serin zu Glycin sowie der Punktmutation der Aminosäure 552 von Threonin zu Alanin kombiniert werden, um ein stabiles HIF-1alpha-Polypeptid zu bilden. Die Deletion der Aminosäure 576 bis zu der Aminosäure 785 des HIF-1alpha kann auch mit einer Deletion der Aminosäuren 392 bis 520 kombiniert werden, um ein stabiles HIF- 1alpha-Polypeptid zu erhalten. Alternativ kann die Deletion der Aminosäure 576 bis zu der Aminosäure 785 des HIF-1alpha auch mit der Deletion der Aminosäuren 704 bis 826 kombiniert werden (was zu der Deletion der Aminosäuren 576 bis 826 des HIF-1alpha führt), um ein stabiles HIF-1alpha-Polypeptid zu ergeben. Solche Kombinationen werden den Fachleuten rasch ersichtlich sein.
Der Begriff „im Wesentlichen rein", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein HIF-1alpha-Protein, das im Wesentlichen frei ist von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Materialien, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist. Fachleute können den HIF-1alpha unter Verwendung von Standardverfahren zur Proteinreinigung reinigen, wie z. B. der DNA-Affinitäts-Chromatographie (z. B. Wang, G.L. und Semenza, J., J. Biol. Chem. 270:1230–1237, 1995) und der Immunpräzipitation (z. B. Jiang, B.H. et al., J. Biol. Chem. 271:17771–17778, 1996). Das im Wesentlichen reine Polypeptid wird auf einem nicht reduzierenden Polyacrylamidgel eine einzelne Bande ergeben. Die Reinheit des HIF-1alpha-Polypeptids kann auch durch die aminoterminale Aminosäure-Sequenzanalyse bestimmt werden. Das HIF-1alpha-Protein umfasst funktionelle Fragmente des Polypeptids, so lange die Aktivität und die Stabilität von sHIF-1alpha unter nicht-hypoxischen Bedingungen beibehalten wird. Kleinere Peptide, die die biologische Aktivität von sHIF-1alpha aufweisen, sind daher in der Erfindung mit eingeschlossen.
Die Erfindung stellt Polynucleotidsequenzen bereit, die das sHIF-1alpha-Polypeptid codieren, das die die in der SEQ ID NO: 1 angeführte Sequenz besitzt, wobei die Aminosäuren 392 bis 428 von der Sequenz deletiert sind, die Aminosäure 551 von Serin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist und die Aminosäure 552 von Threonin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist. Diese Polynucleotide umfassen DNA-, cDNA- und RNA-Sequenzen, die den sHIF-1alpha codieren. Dies sollte auch so verstanden werden, dass alle Polynucleotide, die das vollständige oder einen Teil des sHIF-1alpha-Proteins codieren, hierin mit eingeschlossen sind, so lange sie ein Polypeptid mit HIF-1alpha-Aktivität codieren, das unter hypoxischen und unter nicht-hypoxischen Bedingungen stabil ist. Solche Polynucleotide umfassen natürlich vorkommende, synthetische und mit Absicht manipulierte Polynucleotide. So kann zum Beispiel das sHIF-1alpha-Polynucleotid einer ortsgerichteten Mutagenese unterzogen werden. Die Polynucleotidsequenz des sHIF-1alpha umfasst auch Antisense-Sequenzen. Die Polynucleotide der Erfindung umfassen Sequenzen, die aufgrund des genetischen Codes degeneriert sind. Es gibt 20 natürliche Aminosäuren, von denen die meisten durch mehr als ein Codon spezifiziert sind. Daher sind alle degenerierten Nucleotidsequenzen in die Erfindung mit eingeschlossen, so lange die Aminosäuresequenz des HIF-1alpha-Polypeptids, die durch die Nucleotidsequenz codiert wird, funktionell unverändert ist.
Kleinere Modifikationen der primären Aminosäuresequenz des sHIF-1alpha können zu Proteinen führen, die unter nicht-hypoxischen Bedingungen stabil sind und die im Wesentlichen eine äquivalente Aktivität im Vergleich zu dem hierin beschriebenen sHIF-1alpha-Polypeptid aufweisen. Diese kleineren Modifikationen umfassen die geringfügigen Unterschiede, die in den Sequenzen von HIF-1alpha-Polypeptiden gefunden werden, die aus unterschiedlichen Arten isoliert werden können (z. B. das HIF-1alpha-Polypetid aus Mensch, Maus und Ratte). Solche Proteine umfassen diejenigen, wie sie durch den Ausdruck „besitzen im Wesentlichen die Aminosäuresequenz" des sHIF-1alpha der Erfindung definiert werden. Solche Modifikationen können willkürlich vorgenommen werden, wie z. B. durch ortsgerichtete Mutagenese, oder sie können spontan auftreten, wie diejenigen, die in den unterschiedlichen Arten gefunden werden. Alle Polypeptide, die durch diese Modifikationen hergestellt werden, sind hierin mit eingeschlossen, so lange die biologische Aktivität des sHIF-1alpha weiter bestehen bleibt und das Polypeptid im Vergleich zu dem Wildtyp-HIF-1alpha unter nicht-hypoxischen Bedingungen stabil ist. Des Weiteren können Deletionen einer oder mehrerer Aminosäuren ebenfalls zu Modifikationen der Struktur des so erhaltenen Moleküls führen, ohne dass dabei seine biologische Aktivität signifikant verändert wird. Dies kann zu der Entwicklung eines kleineren aktiven Moleküls führen, das eine breitere Verwendbarkeit aufweisen könnte. Zum Beispiel kann man die amino- oder carboxyterminalen Aminosäuren entfernen, die für die biologische Aktivität des sHIF-1alpha nicht erforderlich sind.
Hierin wird spezifisch eine DNA-Sequenz offenbart, die das menschliche sHIF-alpha-Mutein codiert. Die Erfindung stellt Polynucleotidsequenzen bereit, die ein stabiles HIF-1alpha-Mutein codieren, das eine Sequenz besitzt, wie sie in der SEQ ID NO: 1 angeführt wird, wobei die Aminosäuren 392 bis 428 von der Sequenz deletiert sind, die Aminosäure 551 von Serin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist und die Aminosäure 552 von Threonin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist. Das Wildtyp-HIF-1alpha-Protein besitzt ein offenes Leseraster, das ein Polypeptid mit einer Länge von 826 Aminosäuren codiert. Wenn die Aminosäure 551 (Serin) der SEQ ID NO: 1 durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, wie z. B. durch Glycin, oder die Aminosäure 552 (Threonin) der SEQ ID NO: 1 durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, wie z. B. durch Alanin, und eine oder mehrere der von der Aminosäure 392 bis zu der Aminosäure 429 der SEQ ID NO: 1 durch eine Bindung ersetzt werden, wird das Polynucleotid ein Polypeptid codieren, das in der Länge um die entsprechende Zahl an Aminosäuren vermindert ist.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Polynucleotide bereit, die sHIF-1alpha codieren. Die Begriffe Polynucleotid oder Nucleinsäuresequenz beziehen sich auf polymere Formen von Nucleotiden mit einer Länge von mindestens 10 Basen. Mit isoliertem Polynucleotid ist ein Polynucleotid gemeint, das mit den beiden codierenden Sequenzen nicht direkt zusammenhängt, mit denen es in dem unter natürlichen Bedingungen vorkommenden Genom des Organismus, aus dem es stammt, unmittelbar zusammenhängt (eine am 5'-Ende und eine am 3'-Ende). Der Ausdruck umfasst daher zum Beispiel eine rekombinante DNA, die in einen Vektor; in ein sich autonom replizierendes Plasmid oder Virus oder in die genomische DNA eines Prokaryonten oder eines Eukaryonten eingebaut ist oder die als ein separates Molekül (z. B. als eine cDNA) unabhängig von anderen Sequenzen vorliegt. Bei den Nucleotiden der Erfindung kann es sich um Ribonucleotide, Desoxyribonucleotide oder um modifizierte Formen beider Nucleotid(e) handeln. Der Begriff umfasst einzel- und doppelsträngige Formen der DNA.
Eine komplementäre Sequenz kann ein Antisense-Nucleotid umfassen. Wenn es sich bei der Sequenz um RNA handelt, sind die Desoxynucleotide A, G, C und T in dem Polynucleotid, das das HIF-1alpha codiert, durch die Ribonucleotide A, G, C beziehungsweise U ausgetauscht. In die Erfindung ebenfalls mit eingeschlossen sind Fragmente der vorstehend identifizierten Nucleinsäuresequenzen, die eine Länge von mindestens 15 Basen aufweisen, die ausreicht, um es dem Fragment zu ermöglichen, unter physiologischen Bedingungen selektiv mit einer Nucleinsäure zu hybridisieren, die sHIF-1alpha codiert, aber nicht SEQ ID NO: 1. Spezifisch sollten die Fragmente selektiv mit der Nucleinsäure hybridisieren, die das sHIF-1alpha-Polypeptid codiert. Der Ausdruck „selektiv hybridisieren" bezieht sich auf eine Hybridisierung unter moderaten oder unter hoch stringenten Bedingungen, wobei nicht verwandte Nucleotidsequenzen ausgeschlossen sind.
Bei Nucleinsäure-Hybridisierungsreaktionen werden die Bedingungen, die verwendet werden, um einen bestimmten Grad an Stringenz zu erreichen, in Abhängigkeit von der Natur der Nucleinsäuren variieren, die hybridisiert werden sollen. So können zum Beispiel die Länge, der Grad an Komplementarität, die Zusammensetzung der Nucleotidsequenz (z. B. GC- vs. AT-Gehalt) und die Art der Nucleinsäure (z. B. RNA vs. DNA) in den hybridisierenden Regionen der Nucleinsäuren in Betracht gezogen werden, wenn die Hybridisierungsbedingungen ausgewählt werden. Des Weiteren kann man berücksichtigen, ob eine der Nucleinsäuren immobilisiert vorliegt, zum Beispiel auf einem Filter.
Ein Beispiel für schrittweise höher stringente Bedingungen ist wie folgt: 2 × SSC/0,1% SDS bei etwa Zimmertemperatur (Hybridisierungsbedingungen); 0,2 × SSC/0,1% SDS bei etwa Zimmertemperatur (niedrig stringente Bedingungen); 0,2 × SSC/0,1% SDS bei etwa 42°C (moderat stringente Bedingungen) und 0,1 × SSC/0,1% SDS bei etwa 68°C (hoch stringente Bedingungen). Die Waschungen können unter Verwendung von nur einer dieser Bedingungen durchgeführt werden, wie z. B. unter hoch stringenten Bedingungen, oder es kann jede dieser Bedingungen verwendet werden, z. B. jeweils für 10–15 Minuten in der vorstehend angeführten Reihenfolge, wobei einer oder alle der angeführten Schritte wiederholt werden. Wie vorstehend erwähnt, werden die optimalen Bedingungen jedoch in Abhängigkeit von der bestimmten vorgenommenen Hybridisierungsreaktion variieren, und sie können empirisch bestimmt werden.
Wenn man eine für sHIF-1alpha-spezifische Sonde verwendet, kann es nötig sein, die Nucleinsäure vor der Bindung an eine für sHIF-1alpha spezifische Sonde zu amplifizieren. Dazu wird vorzugsweise die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet, es können jedoch auch andere Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren verwendet werden, wie z. B. die Ligase-Kettenreaktion (LCR), die durch Ligierung aktivierte Transkription (LAT) und die auf Nucleinsäuresequenz basierende Amplifikation (NASBA).
Das sHIF-1alpha-Polynucleotid der Erfindung kann aus einem Säuger-Organismus stammen, und am stärksten bevorzugt stammt es aus dem Menschen. Die Durchmusterungsverfahren, die auf der Nucleinsäure-Hybridisierung basieren, machen es möglich, eine beliebige Gensequenz aus einem beliebigen Organismus zu isolieren, vorausgesetzt, dass eine geeignete Sonde verfügbar ist. Oligonucleotid-Sonden, die einem Teil der Sequenz entsprechen, die das in Frage stehende Protein codiert, können chemisch synthetisiert werden. Dazu ist erforderlich, dass kurze Oligopeptid-Stücke der Aminosäuresequenzen bekannt sind. Die DNA-Sequenz, die das Protein codiert, kann aus dem genetischen Code abgeleitet werden, dabei muss jedoch die Degeneriertheit des genetischen Codes berücksichtigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Sonde zwischen sHIF-1alpha und Wildtyp-HIF-1alpha unterscheiden.
Es ist möglich, eine gemischte Additionsreaktion durchzuführen, wenn die Sequenz degeneriert ist. Dies umfasst ein heterogenes Gemisch aus denaturierter doppelsträngiger DNA. Bei einer solchen Durchmusterung wird die Hybridisierung bevorzugt entweder an einzelsträngiger DNA oder an denaturierter doppelsträngiger DNA durchgeführt. Die Hybridisierung ist besonders nützlich bei dem Nachweis von cDNA-Clonen, die aus Quellen stammen, in denen extrem niedrige Mengen der mRNA-Sequenzen vorliegen, die mit dem Polypeptid von Interesse in Beziehung stehen. Mit anderen Worten ist es durch die Verwendung von stringenten Hybridisierungsbedingungen, die darauf abzielen, eine unspezifische Bindung zu vermeiden, zum Beispiel möglich, eine autoradiographische Sichtbarmachung eines spezifischen cDNA-Clons durch die Hybridisierung der Ziel-DNA mit der einzigartigen Sonde in dem Gemisch zu erreichen, die ihr vollständiges Komplement darstellt (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1998).
Die Entwicklung spezifischer DNA-Sequenzen, die den sHIF-1alpha codieren, kann auch durch ortsgerichtete Mutagenese einer Nucleinsäuresequenz erfolgen, die die SEQ ID NO: 1 codiert, oder durch die chemische Herstellung einer DNA-Sequenz, um die nötigen Codons für das Polypeptid von Interesse bereitzustellen.
Die Synthese von DNA-Sequenzen ist häufig das Verfahren der Wahl, wenn die vollständige Sequenz der Aminosäurereste des gewünschten Polypeptid-Produkts bekannt ist.
Eine cDNA-Expressions-Genbank, z. B. in dem Phagen Lambda gt11, kann indirekt auf sHIF-1alpha-Peptide hin durchmustert werden, die mindestens ein Epitop enthalten, dies erfolgt unter Verwendung von Antikörpern, die für sHIF-1alpha spezifisch sind. Solche Antikörper können entweder polyclonal oder monoclonal sein, und sie können verwendet werden, um das Expressionsprodukt nachzuweisen, das ein Indiz für das Vorliegen einer sHIF-1alpha-cDNA darstellt.
Die DNA-Sequenzen, die sHIF-1alpha codieren, können durch eine Übertragung der DNA in eine geeignete Wirtszelle in vitro exprimiert werden. „Wirtszellen" sind Zellen, in denen ein Vektor vermehrt und seine DNA exprimiert werden kann. Wirtszellen umfassen sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Zellen. Der Begriff umfasst auch die vollständige Nachkommenschaft der betreffenden Wirtszelle. Dies sollte so verstanden werden, dass nicht die gesamte Nachkommenschaft mit der Elternzelle identisch zu sein braucht, da viele Mutationen vorliegen können, die während der Replikation auftreten können. Eine solche Nachkommenschaft ist jedoch mit eingeschlossen, wenn der Begriff „Wirtszelle" verwendet wird. Verfahren für eine stabile Übertragung, was bedeutet, dass die Fremd-DNA in dem Wirt aufrechterhalten wird, sind im Fachgebiet bekannt.
Es können „modifizierte" Versionen des spezifischen HIF-1alpha-Proteins konstruiert werden, um die Stabilität, die biologische Aktivität, die Herstellung, die Reinigung oder die Ausbeute des exprimierten Produkts weiter zu steigern. So kann zum Beispiel die Expression eines Fusionsproteins oder eines spaltbaren Fusionsproteins, das den sHIF-1alpha und ein heterologes Protein umfasst, konstruiert werden. Ein solches Fusionsprotein kann durch Aftinitäts-Chromatographie leicht isoliert werden, z. B. durch die Immobilisierung an einer Säule, die für das heterologe Protein spezifisch ist. Wenn eine Spaltstelle zwischen die HIF-1alpha-Einheit und dem heterologen Protein konstruiert wurde, kann das HIF-1alpha-Polypeptid von der Chromatographie-Säule durch die Behandlung mit einem geeigneten Enzym oder einem Mittel, das die Spaltstelle verdaut, freigesetzt werden (Booth et al., Immunol. Lett. 19:65–708, 1988; Gardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854–15859, 1990).
Die Erfindung stellt eine isolierte Nucleinsäuresequenz, die ein Fusionsprotein codiert, nicht bereit. Das Fusionsprotein wird durch eine Nucleotidsequenz codiert, die eine DNA-Bindedomäne und eine Dimerisierungsdomäne eines durch Hypoxie induzierbaren Faktors, bevorzugt HIF-1alpha, codiert; sowie eine Nucleotidsequenz, die eine Transkriptionsaktivierungsdomäne codiert. Dieser „chimäre" Transaktivator ist nützlich für die Beeinflussung der Genexpression von Zielgenen, wie z. B. des VEGF, und für die Gefäßneubildung in ischämischem Gewebe. Die Nucleotidsequenz, die eine DNA-Bindedomäne und eine Dimerisierungsdomäne eines durch Hypoxie induzierbaren Faktors codiert, ist nützlich für die Bereitstellung einer konstitutiven Aktivierung von Genen, was unabhängig von der Sauerstoffkonzentration in der Umgebung ist. Ein chimärer Transaktivator stellt die spezifische Aktivierung der Expression von Hypoxie-induzierbaren Genen bereit, die auf Hypoxie reagierende Elemente (HREs) enthalten, wodurch hohe Spiegel der Genexpression erreicht werden. Jedes der HREs enthält eine Bindestelle für HIF-1, die durch den chimären Transaktivator aufgrund des Vorliegens der HCF-1alpha-Dimerisierungs- und DNA-Bindedomäne erkannt wird. Chimäre transaktivierende Proteine funktionieren in Vertebratenzellen und können natürlich vorkommende, die Transkription transaktivierende Proteine oder Domänen von Proteinen aus eukaryontischen Zellen, einschließlich Vertebratenzellen, sowie virale transaktivierende Proteine oder eine beliebige synthetische Aminosäuresequenz umfassen, die in der Lage ist, die Transkription von einem Vertebraten-Promotor zu stimulieren.
Eine Transaktivierungsdomäne des chimären Transaktivators stammt aus einem transaktivierenden Protein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf VP16 aus HSV, eines Hitzeschock-Faktors, p53, fos, v-jun, Faktor EF-C, tat aus HIV, E2 aus HPV, E1A aus Ad, Sp1, AP1, CTF/NF1, E2F1, HAP1, HAP2, MCM1, PHO2, GAL4, GCN4 und GAL11 und NFκB sowie andere heterologe Proteine, die eine solche Transaktivierungsdomäne besitzen. Fachleute werden erkennen, dass eine Transkriptionsaktivierungsdomäne aus einem natürlich vorkommenden Protein stammen kann oder synthetisch sein kann, d. h. zum Beispiel auf einer Sequenz basieren kann, die in einem natürlich vorkommenden Protein nicht enthalten ist. Die Identifizierung einer Transaktivierungsdomäne kann durch die funktionelle Verknüpfung der gewünschten Domäne aus einem Protein mit einer geeigneten Sequenz und die Untersuchung der Expression der Reportersequenz bestimmt werden.
Ein rekombinantes Nucleinsäurekonstrukt, das ein chimäres Transaktivatorprotein codiert, kann unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors und/oder von anderen, die Expression kontrollierenden regulatorischen Sequenzen gestellt oder damit „funktionell verknüpft" werden. Es kann wünschenswert sein, dass das Transaktivatorprotein unter die Kontrolle einer konstitutiv aktiven Promotorsequenz gestellt wird, obwohl das Transaktivatorprotein auch unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt werden kann, wie z. B. des Metallothionin-Promotors oder eines gewebespezifischen Promotors. Ein induzierbarer Promotor erlaubt die kontrollierte Steigerung oder Verminderung der Expression eines bestimmten Gens, wohingegen die konstitutive Expression die kontinuierliche Expression eines Gens ermöglicht, zum Beispiel für die Herstellung eines Genprodukts in Kultur oder in einem transgenen Tier. Andere Promotorsequenzen, die nützlich sind, umfassen die Region des frühen Promotors von SV40; RSV oder andere retrovirale LTRs; den Herpes-Thymidinkinase-Promotor oder den sehr frühen Promotor/Enhancer des menschlichen Cytomegalievirus (CMV), sind aber nicht auf diese beschränkt. Weitere Promotoren, die für diesen Zweck verwendet wurden, umfassen die Kontrollregion des Elastase 1-Gens; die Kontrollregion des Insulin-Gens; die Kontrollregion eines Immunglobulin-Gens; die Kontrollregion des Maus-Mamma-Tumor-Virus, die Kontrollregion des Albumin-Gens; die Kontrollregion des alpha-Fetoproteins; die Kontrollregion des alpha-1-Antitrypsin-Gens und die Kontrollregion des beta-Globin-Gens.
Die Nucleinsäuresequenz, die die DNA-Bindedomäne und die Dimerisierungsdomäne des HIF-1alpha codiert, und die heterologe Transaktivierungsdomäne werden funktionell verknüpft, so dass die strukturellen und funktionellen Aktivitäten jeder Region beibehalten werden (d. h. die DNA-Bindungs-, die Dimerisierungs- und die Transaktivierungs-Aktivität). Die 2 und 3 zeigen die Ergebnisse verschiedener Deletionen in HIF-1alpha und die Auswirkungen auf die Regulation der Genexpression. Basierend auf den in den Figuren und in dem US-Patent Nr. 5,882,914 gezeigten Ergebnissen, kann der chimäre Transaktivator eine DNA-Binde- und eine Dimerisierungs-Region enthalten, die zum Beispiel durch die HIF-1alpha-Aminosäuren 1-703 der SEQ ID NO: 1; die Aminosäuren 1-681 der SEQ ID NO: 1; die Aminosäuren 1-608 der SEQ ID NO: 1 oder die Aminosäuren 1-391 der SEQ ID NO: 1 codiert werden.
Die Erfindung umfasst auch Expressionsvektoren, die eine Nucleinsäuresequenz enthalten, die einen chimären Transaktivator, wie hierin beschrieben, codiert. Die Vektoren umfassen das Adenovirus, AAV, Lentivirus, Herpes-Virus, Vaccinia-Virus, Baculovirus, Retroviren, Bakteriophagen, Cosmide, Plasmide, Phosmide, Pilz-Vektoren und andere im Fachgebiet bekannte Vektoren, die für die Expression in eukaryontischen und prokaryontischen Wirtszellen verwendet werden, und sie können zum Beispiel in vivo für die Gentherapie oder in vitro bei der Zellkultur verwendet werden.
Stabile HIF-1alpha-Proteine der Erfindung umfassen ebenfalls die HIF-1alpha-Aminosäureste 1-391 und 521-826 der SEQ ID NO: 1; die Aminosäurereste 1-391 und 549-826 der SEQ ID NO: 1; die Aminosäurereste 1-391 und 576-826 der SEQ ID NO: 1; die Aminosäurereste 1-391 und 429-826 der SEQ ID NO: 1; in denen 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; die Aminosäurereste 1-391 und 469-826 der SEQ ID NO: 1, in denen 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; die Aminosäurereste 1-391 und 494-826 der SEQ ID NO: 1, in denen 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; die Aminosäurereste 1-391 und 508-826 der SEQ ID NO: 1, in denen 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; die Aminosäurereste 1-391 und 512-826 der SEQ ID NO: 1, in denen 551 nicht mehr Serin und 552 Threonin ist und die Aminosäurereste 1-391 und 517-826 der SEQ ID NO: 1, in denen 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist, sind aber nicht auf diese beschränkt. Wenn Serin 551 verändert wird, kann der Aminosäurerest 551 zum Beispiel Glycin sein. Weiterhin, wenn Threonin 552 verändert wird, kann der Aminosäurerest 552 Alanin sein. Neben diesen Polypeptiden umfasst die Erfindung Nucleinsäuresequenzen, die solche Polypeptide codieren, und Expressionsvektoren, die solche Nucleinsäuresequenzen enthalten.
Dies sollte so verstanden werden, dass Fachleute die Aminosäure- oder die Nucleinsäuresequenzen, die hierin bereitgestellt werden, durch Deletion oder Hinzufügung von Aminosäureresten beziehungsweise von Nucleotiden manipulieren können, so lange die den Sequenzen zugeschriebene Aktivität beibehalten wird, wie z. B. die konstitutive Transaktivierung oder die stabilen Eigenschaften des HIF-1alpha, wie sie hierin beschrieben werden. Fachleute können die hierin angeführten Lehren verwenden, um solche Aktivitäten zu auszutesten (vergleiche mit den Beispielen).
In der vorliegenden Erfindung können die sHIF-1alpha-Polynucleotidsequenzen in einen Expressionsvektor eingebaut werden. Der Begriff „Expressionsvektor" bezieht sich auf ein Plasmid, ein Virus oder auf ein anderes Vehikel, das im Fachgebiet bekannt ist und das durch die Insertion oder die Aufnahme der sHIF-1alpha-Gensequenzen manipuliert wurde. Polynucleotidsequenzen, die sHIF-1alpha codieren, können mit Expressions-Kontrollsequenzen funktionell verknüpft werden. „Funktionell verknüpft" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, bei der die so beschriebenen Komponenten in einer solchen Beziehung zueinander angeordnet sind, die es ihnen erlaubt, in der beabsichtigten Weise zu funktionieren. Eine Expressions-Kontrollsequenz, die mit einer codierenden Sequenz funktionell verknüpft ist, wird so ligiert, dass die Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht werden kann, die mit den Expressions-Kontrollsequenzen zusammenpassen. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Expressions-Kontrollsequenzen" auf Nucleinsäuresequenzen, die die Expression einer Nucleinsäuresequenz, mit der sie funktionell verknüpft sind, regulieren. Expressions-Kontrollsequenzen sind mit einer Nucleinsäuresequenz funktionell verknüpft, wenn die Expressions-Kontrollsequenzen die Transkription und ggf. auch die Translation der Nucleinsäuresequenz kontrollieren und regulieren. Somit können Expressions-Kontrollsequenzen geeignete Promotoren, Enhancer und Transkriptions-Terminatoren, ein Start-Codon (d. h. ATG) am Anfang eines Protein-codierenden Gens, Spleiß-Signale für Introns, Aufrechterhaltung des korrekten Leserasters für das Gen, um eine korrekte Translation der mRNA zu ermöglichen, und Stopp-Codons enthalten. Der Begriff „Kontrollsequenzen" beabsichtigt mindestens diejenigen Komponenten zu umfassen, deren Anwesenheit die Expression beeinflussen kann, kann aber auch weitere Komponenten beinhalten, deren Anwesenheit vorteilhaft ist, wie zum Beispiel Leader-Sequenzen und Sequenzen eines Fusionspartners. Expressions-Kontrollsequenzen können einen Promotor umfassen.
Mit „Promotor" ist eine minimale Sequenz gemeint, die ausreicht, um die Transkription zu steuern. In die Erfindung ebenfalls mit eingeschlossen sind diejenigen Promotorelemente, die ausreichen, um die Promotor-abhängige Genexpression für Zellart-spezifische oder Gewebe-spezifische Signale und Agenzien kontrollierbar oder für externe Signale oder Agenzien induzierbar zu machen; solche Elemente können in der 5'- oder in der 3'-Region des Gens lokalisiert sein. Sowohl konstitutive als auch induzierbare Promotoren sind in die Erfindung mit eingeschlossen (vergleiche z. B. mit Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516–544, 1987). So können zum Beispiel bei der Clonierung in bakteriellen Systemen induzierbare Promotoren wie z. B. pL des Bakteriophagen λ, plac, ptrp, ptac (ptrp-plac-Hybrid-Promotor) und ähnliche verwendet werden. Bei der Clonierung in Säugerzell-Systemen können Promotoren verwendet werden, die aus dem Genom von Säugerzellen (z. B. der Metallothionein- oder der Elongationsfaktor 1alpha-Promotor) oder aus Säuger-Viren stammen (z. B. die lange terminale Wiederholungssequenz eines Retrovirus; der späte Promotor des Adenovirus; der 7.5K-Promotor des Vaccinia-Virus; der Cytomegalievirus-Promotor). Promotoren, die durch rekombinante DNA- oder durch synthetische Verfahren hergestellt wurden, können ebenfalls verwendet werden, um die Transkription der Nucleinsäuresequenzen der Erfindung bereitzustellen.
In der vorliegenden Erfindung kann das Polynucleotid, das sHIF-1alpha codiert, in einen Expressionsvektor inseriert werden, der eine Promotorsequenz enthält, welche die effiziente Transkription der inserierten Gensequenz durch den Wirt erleichtert. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung und einen Promotor sowie spezifische Gene, die eine phänotypische Selektion der transformierten Zellen ermöglichen. Vektoren, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen auf T7-basierende Expressionsvektoren für die Expression in Bakterien (Rosenberg et al., Gene 56:125, 1987), den pMSXND-Expressionsvektor für die Expression in Säugerzellen (Lee und Nathans, J. Biol. Chem. 263:3521, 1988) und von Baculoviren abgeleitete Vektoren für die Expression in Insektenzellen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Das DNA-Segment, das in dem Vektor vorhanden ist, kann mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft sein, zum Beispiel mit einem Promotor (z. B. dem CMV-, dem T7-, dem Metallothionein I- oder dem Polyhedrin-Promotor).
Es können Säuger-Expressionssysteme konstruiert werden, die rekombinante Viren oder virale Elemente verwenden, um die Expression zu steuern. Wenn zum Beispiel Adenovirus-Expressionsvektoren verwendet werden, kann die codierende Sequenz des sHIF-1alpha mit dem Adenovirus-Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex, z. B. mit dem späten Promotor und der dreiteiligen Leader-Sequenz, oder mit einem heterologen (z. B. CMV) Promotor ligiert werden, der in einen Replikations-defizienten Adenovirus cloniert wurde (Armentano, D. et al., Hum. Gene Ther. 6:1343–1353, 1995; Hehir, K.M. et al., J. Virol. 70:8459–8467, 1996). Alternativ kann der 7.5K-Promotor des Vaccinia-Virus verwendet werden (vergleiche z. B. mit Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415–7419, 1982; Mackett et al., J. Virol. 49:857–864, 1984; Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927–4931, 1982). Vektoren, die auf dem Rinder-Papillom-Virus basieren, besitzen die Fähigkeit, sich als extrachromosomale Elemente zu replizieren (Sarver et al., Mol. Cell. Biol. 1:486, 1981). Kurz nach dem Eintritt dieser Nucleinsäure in Mauszellen repliziert sich das Plasmid bis zu etwa 100 bis 200 Kopien pro Zelle. Die Transkription der inserierten cDNA erfordert keine Integration des Plasmids in das Wirtschromosom, wodurch ein hoher Expressionsspiegel erhalten wird. Diese Vektoren können für eine stabile Expression verwendet werden, indem man einen selektierbaren Marker in das Plasmid mit einbaut, wie zum Beispiel das neo-Gen. Alternativ kann ein retrovirales Genom zur Verwendung als Vektor modifiziert werden, der in der Lage ist, das sHIF-1alpha-Gen in die Wirtszellen einzubauen und seine Expression zu steuern (Cone & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349–6353, 1984). Die Expression in hohen Spiegeln kann auch unter Verwendung von induzierbaren Promotoren erreicht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf den Metallothionein IIA-Promotor und Hitzeschock-Promotoren.
In Abhängigkeit von dem verwendeten Vektor können die Polynucleotidsequenzen, die sHIF-1alpha codieren, entweder in Prokaryonten oder in Eukaryonten exprimiert werden. Die Wirte können Mikroben-, Hefe-, Insekten- und Säuger-Organismen umfassen. Verfahren zur Expression von DNA-Sequenzen, die eukaryontische oder virale Sequenzen umfassen, in Prokaryonten, sind im Fachgebiet wohlbekannt. Biologisch funktionelle virale und Plasmid-DNA-Vektoren, die zur Expression und zur Replikation in einem Wirt in der Lage sind, sind im Fachgebiet bekannt. Solche Vektoren werden verwendet, um DNA-Sequenzen der Erfindung aufzunehmen.
Für eine langfristige Produktion der rekombinanten Proteine mit hoher Ausbeute wird die stabile Expression bevorzugt. Statt der Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Replikationsursprünge enthalten, können die Wirtszellen mit der sHIF-1alpha-cDNA, die durch geeignete Expressions-Kontrollsequenzen (z. B. Promotor- und Enhancer-Sequenzen, Transkriptions-Terminatoren, Polyadenylierungstellen usw.) kontrolliert wird, sowie einem selektierbaren Marker transformiert werden. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht Resistenz gegenüber der Selektion und erlaubt den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren, sowie zu Herden zu wachsen, die darauf hin cloniert und zu Zelllinien erweitert werden können. So kann zum Beispiel nach der Einbringung der fremden Nucleinsäure den gentechnisch veränderten Zellen für 1–2 Tage das Wachstum in einem angereicherten Medium erlaubt werden, und anschließend werden sie auf ein Selektionsmedium umgesetzt. Es kann ein Reihe von Selektionssytemen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Thymidinkinase-Gen des Herpes-Simplex-Virus (Wigler et al., Cell 11:223, 1977), das Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Gen (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026, 1962) und das Adenin-Phosphoribosyltransferase-Gen (Lowy et al., Cell 22:817, 1980), welche in tk^–-, in hgpt^–- bzw. in aprt^–-Zellen verwendet werden können. Darüber hinaus kann die Antimetaboliten-Resistenz als Grundlage der Selektion auf das dhfr-Gen, das Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567, 1980; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527, 1981); das gpt-Gen, das Resistenz gegenüber Mycophenolsäure verleiht (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 1981; das neo-Gen, das Resistenz gegenüber dem Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1, 1981) und das hygro-Gen verwendet werden, das Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht (Santerre et al., Gene 30:147, 1984). Vor kurzem wurden weitere selektierbare Gene beschrieben, insbesondere trpB, das den Zellen ermöglicht, Indol anstelle Tryptophan zu nutzen; hisD, das den Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin zu nutzen (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047, 1988) und ODC (Ornithin-Decarboxylase), die Resistenz gegenüber dem Ornithin-Decarboxylase-Inhibitor 2-(Difluormethyl)-DL-ornithin, DFMO, verleiht (McConlogue, L., in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg, 1987).
Mit „Transformation" ist eine genetische Veränderung in einer Zelle gemeint, die nach der Aufnahme einer neuen DNA (d. h. einer für die Zelle exogenen DNA) induziert wird. Wenn es sich bei der Zelle um eine Säugerzelle handelt, wird die genetische Veränderung im Allgemeinen durch die Einführung der DNA in das Genom der Zelle erreicht (d. h. stabilen).
Mit „transformierter Zelle" ist eine Zelle gemeint, in die (oder in deren Vorläufer) mittels rekombinanter DNA-Verfahren ein DNA-Molekül eingebracht wurde, das den sHIF-1alpha codiert. Die Transformation einer Wirtszelle mit rekombinanter DNA kann durch herkömmliche Verfahren erfolgen, die den Fachleuten wohlbekannt sind. Wenn es sich um einen prokaryontischen Wirt handelt, wie z. B. um E. coli, können kompetente Zellen, die in der Lage zur Aufnahme von DNA sind, aus Zellen hergestellt werden, die nach der exponentiellen Wachstumsphase geerntet wurden und die anschließend mit dem CaCl₂-Verfahren unter Verwendung von im Fachgebiet wohlbekannten Verfahren behandelt wurden. Alternativ können MgCl₂ oder RbCl verwendet werden. Die Transformation kann, wenn gewünscht, auch nach der Herstellung eines Protoplasten der Wirtszelle erfolgen.
Wenn es sich bei dem Wirt um einen Eukaryonten handelt, können solche DNA-Transfektionsverfahren wie z. B. die Calciumphosphat-Kopräzipitation, die herkömmlichen mechanischen Verfahren wie z. B. Mikroinjektion, Elektroporation oder der Einbau eines Plasmids, das in Liposomen eingeschlossen ist, oder virale Vektoren verwendet werden. Eukaryontische Zellen können auch mit DNA-Sequenzen kotransformiert werden, die den sHIF-1alpha der Erfindung codieren, und mit einem zweiten, fremden DNA-Molekül, das einen selektierbaren Phänotyp codiert, wie z. B. dem Herpes simplex-Thymidinkinase-Gen. Ein weiteres Verfahren besteht in der Verwendung eines eukaryontischen viralen Vektors wie z. B. des Affen-Virus 40 (SV40), des Adenovirus oder des Rinder-Papillom-Virus, um eukaryontische Zellen transient zu infizieren oder zu transformieren und das Protein zu exprimieren (vergleiche zum Beispiel mit Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman, Hrsg. 1982).
Die Isolierung und die Reinigung eines in Mikroben exprimierten Polypeptids oder von Fragmenten davon, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, kann durch die üblichen Mittel erfolgen, einschließlich der präparativen Chromatographie und immunologischer Trennverfahren, an denen monoclonale oder polyclonale Antikörper beteiligt sind.
Die HIF-1alpha-Polypeptide der Erfindung können auch verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die mit den Epitopen der sHIF-1alpha-Polypeptide immunreaktiv sind oder selektiv an sie binden. Ein Antikörper, der an sHIF-1alpha „selektiv bindet", ist ein Antikörper, der an sHIF-1alpha mit einer höheren Affinität bindet als an den Wildtyp-HIF-1alpha. Daher können die Antikörper der Erfindung verwendet werden, um zwischen der Anwesenheit des sHIF-1alpha-Muteins und der des Wildtyp-HIF-1alpha-Polypeptids zu unterscheiden. Es werden Antikörper bereitgestellt, die im Wesentlichen aus zu einem Pool vereinigten monoclonalen Antikörpern mit unterschiedlichen Epitop-Spezifitäten bestehen, sowie einzelne monoclonale Antikörper-Präparate. Monoclonale Antikörper werden gegen ein Antigen hergestellt, das Fragmente des Proteins enthält; dies erfolgt durch Verfahren, die im Fachgebiet wohlbekannt sind (Köhler et al., Nature 256:495, 1975; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., 1989).
Der Begriff „Antikörper", wie er in dieser Erfindung verwendet wird, umfasst intakte Moleküle sowie Fragmente davon wie z. B. Fab, F(ab')₂ und Fv, die in der Lage sind, die Epitop-Determinante zu binden. Diese Antikörperfragmente behalten ein gewisse Fähigkeit zur selektiven Bindung an ihre Antigene oder Rezeptoren bei und sind wie folgt definiert:

(1) Fab, dieses Fragment, das ein einwertiges Antigen-bindendes Fragment eines Antikörpermoleküls enthält, kann durch einen Verdau des vollständigen Antikörpers mit dem Enzym Papain hergestellt werden; dabei erhält man eine intakte leichte Kette und einen Teil einer schweren Kette;
(2) Fab', dieses Fragment eines Antikörpermoleküls kann durch eine Behandlung des vollständigen Antikörpers mit Pepsin, gefolgt von einer Reduktion, erhalten werden; dabei erhält man eine intakte leichte Kette und einen Teil der schweren Kette; es werden zwei Fab'-Fragmente pro Antikörpermolekül erhalten;
(3) (Fab')₂, dieses Fragment eines Antikörpers kann durch eine Behandlung des vollständigen Antikörpers mit dem Enzym Pepsin ohne eine anschließende Reduktion erhalten werden; F(ab')₂ ist ein Dimer aus zwei Fab'-Fragmenten, die durch zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden;
(4) Fv ist als ein gentechnisch hergestelltes Fragment definiert, das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region einer schweren Kette enthält, die als zwei Ketten exprimiert werden; und
(5) ein Einzelketten-Antikörper („SCA") ist als ein gentechnisch hergestelltes Molekül definiert, das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region einer schweren Kette enthält, die durch einen geeigneten Polypeptid-Linker zu einem gentechnisch fusionierten Einzelketten-Molekül miteinander verbunden sind.

Verfahren zur Herstellung dieser Fragmente sind im Fachgebiet bekannt. Vergleiche zum Beispiel mit Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988.
Wie in dieser Erfindung verwendet, bedeutet der Begriff „Epitop" eine antigene Determinante auf einem Antigen, an die das Paratop eines Antikörpers bindet. Epitop-Determinanten bestehen in der Regel aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen wie z. B. Aminosäuren oder Zucker-Seitenketten und besitzen im Allgemeinen spezifische dreidimensionale Struktureigenschaften sowie spezifische Ladungseigenschaften.
Antikörper, die an das sHIF-1alpha-Polypeptid der Erfindung selektiv binden, können unter Verwendung des intakten Polypeptids oder von Fragmenten, die kleine Peptide von Interesse enthalten, als immunisierende Antigene hergestellt werden. Das Polypeptid oder das Peptid, das verwendet wird, um ein Tier zu immunisieren, kann von der translatierten cDNA abgeleitet werden oder durch chemische Synthese erhalten werden, und es kann, wenn gewünscht, mit einem Trägerprotein konjugiert werden. Solche üblicherweise verwendeten Träger, die an das Peptid chemisch gekoppelt werden, umfassen („keyhole limpet hemocyanin") KLH, Thyroglobulin, Rinderserumalbumin (BSA) und das Tetanus-Toxoid. Das gekoppelte Peptid wird dann zur Immunisierung eines Tieres verwendet (z. B. einer Maus, einer Ratte oder eines Kaninchens).
Wenn gewünscht, können die polyclonalen oder die monoclonalen Antikörper weiter gereinigt werden, zum Beispiel durch Bindung an und Elution von einer Matrix, an die das Polypeptid oder das Peptid, gegen das die Antikörper erzeugt wurden, gebunden ist. Fachleuten werden verschiedene Verfahren bekannt sein, die im immunologischen Fachgebiet für die Reinigung und/oder die Konzentrierung polyclonaler sowie monoclonaler Antikörper üblich sind. Vergleiche zum Beispiel mit Coligan et al., Einheit 9, Current Protocols in Immunolopy, Wiley Interscience, 1994.
Es ist auch möglich, das anti-Idiotyp-Verfahren zu verwenden, um monoclonale antikörper herzustellen, die ein Epitop nachbilden. Zum Beispiel wird ein monoclonaler anti-Idiotyp-Antikörper, der gegen einen ersten monoclonalen Antikörper hergestellt wurde, eine Bindedomäne in der hypervariablen Region aufweisen, die das „Abbild" des Epitops darstellt, das durch den ersten monoclonalen Antikörper gebunden wird.
Zum Zwecke der Erfindung kann ein Antikörper oder eine Nucleinsäure-Sonde, die für sHIF-1alpha spezifisch ist, verwendet werden, um das sHIF-1alpha-Polypeptid oder das Polynucleotid in biologischen Flüssigkeiten, kultivierten Zellen oder in Geweben nachzuweisen. Der Antikörper, der mit sHIF-1alpha reagiert, oder die Nucleinsäure-Sonde wird bevorzugt mit einer Verbindung markiert, die den Nachweis einer Bindung an sHIF-1alpha erlaubt. Es kann jede Probe verwendet werden, die eine nachweisbare Menge des Antigens oder des Polynucleotids enthält.
Die Erfindung stellt die Verwendung von sHIF-1alpha-Muteinen für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von durch den HIF-1 vermittelten Störungen bereit, einschließlich einer Hypoxie- oder Ischämie-bedingten Gewebeschädigung, die durch eine Modulierung der HIF-1-Expression oder der HIF-1-Aktivität verbessert oder gelindert werden. Mit dem Begriff „modulieren" wird beabsichtigt die Induktion oder die Verstärkung der Expression des HIF-1 zu beschreiben, wenn dies passend ist. Der Begriff „lindern" beschreibt eine Verminderung der schädlichen Wirkung der assoziierten Erkrankung in dem Individuum, das die Therapie erhält. Wenn die Expression oder die Verstärkung der Expression von HIF-1 gewünscht wird, umfasst das Verfahren zur Behandlung die Verabreichung eines im Wesentlichen gereinigten sHIF-1alpha-Polypeptids oder eines Polynucleotids, das es codiert.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird das im Wesentlichen gereinigte sHIF-1alpha-Mutein oder die Polynucleotidsequenz, die sHIF-1alpha in einem geeigneten Vektor codiert, in einen menschlichen Patienten zur Behandlung oder zur Vorbeugung einer Hypoxie- oder Ischämie-bedingten Gewebeschädigung eingebracht. Nicht einschränkende Beispiele umfassen Patienten mit Koronar-, Hirn- oder peripheren Arterien-Erkrankungen und Patienten mit einer oder mehreren nicht heilenden Wunden.
Die relevanten klinischen Bedingungen, die durch die Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden, umfassen Ischämie aufgrund einer Erkrankung des Hirn-, Koronar- oder peripheren Kreislaufs. Ein therapeutisches Ziel ist die Förderung der Angiogenese in dem ischämischen Gewebe durch die Überexpression von sHIF-1alpha, der mit dem endogenen HIF-1beta dimerisiert, dann an spezifische DNA-Sequenzen bindet und die Transkription von Hypoxie-induzierbaren Genen aktiviert, die für die Angiogenese von Bedeutung sind, wie z. B., aber nicht beschränkt auf, das Gen, das den vaskulären Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF) codiert, der ein bekanntes Zielgen für den HIF-1 darstellt (J.A. Forsythe et al., Mol. Cell. Biol. 16:4604, 1996; N.V. lyer et al., Genes Dev. 12:149, 1998). Der Grund für die Verwendung von HIF-1alpha ist, dass er einen Transkriptionsfaktor darstellt, der die Expression vieler Gene kontrolliert, die an der Angiogenese beteiligt sind, und daher wird er zu einem besseren klinischen Resultat im Vergleich zu einer Behandlung mit einem einzelnen angiogenen Faktor wie z. B. dem VEGF führen. Das Verfahren zur Anlieferung der DNA an die Gewebestelle wird jedoch in keiner Weise durch die Identität des bestimmten Gens beeinflusst, das angeliefert wird. Des Weiteren weisen viele Patienten mit einer Erkrankung der koronaren Arterien keinen verminderten Myokard-Blutfluss oder eine Hypoxie auf, wenn sie sich in Ruhe befinden. Nur wenn sie aktiv sind und einen erhöhten Blutfluss im Myokard benötigen, leiden sie unter anginalen Symptomen, die von einer Myokard-Ischämie herrühren. Alternativ kann ein verengtes Koronargefäß entweder durch einen Krampf oder durch einen Blutklumpen vollständig verschlossen werden, was zu einem Myokardinfarkt (Herzattacke) führt. Daher besteht das Ziel der Behandlung mit der stabilen Form des HIF-1alpha bei diesen Patienten in der Induktion der Angiogenese sogar dann, wenn zu diesem Zeitpunkt keine Hypoxie vorliegt, um eine Herzattacke zu verhindern. Dementsprechend stellen die stabilen HIF-1alpha-Zusammensetzungen der Erfindung vorbeugende sowie therapeutische Behandlungsprotokolle bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von Polynucleotiden, die sHIF-1alpha codieren, für die Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Hypoxie-bedingten Störungen bereit, welche durch die Expression des HIF-1alpha-Polypeptids verbessert oder gemildert werden. Eine solche Therapie erreicht ihre therapeutische Wirkung durch die Einbringung des sHIF-1alpha-Polynucleotids in die Zellen, die hypoxischen Bedingungen ausgesetzt sind. Der HIF-1alpha wird daher sowohl in den hypoxischen als auch in den umgebenden nicht-hypoxischen Geweben exprimiert, so dass er mit dem HIF-1beta (der im Überschuss in hypoxischen und in nicht-hypoxischen Zellen vorhanden ist) dimerisieren und die Transkription der nachgeschalteten Zielgene aktivieren kann. Beispiele für Gene, die durch den HIF-1 aktiviert werden können, sind der vasculäre Endothel-Wachstumsfaktor, Glucose-Transporter, Enzyme der Glycolyse und der Insulinähnliche Wachstumsfaktor 2. Diese Gene vermitteln wichtige adaptive Antwortreaktionen auf Hypoxie, einschließlich der Angiogenese und der Glycolyse, und die Verhinderung des Zelltods.
Aufgrund des Vorstehenden stellt die Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Steigerung der Expression eines Hypoxie-induzierbaren Gens in einer Zelle bereit. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen einer Zelle mit einem Expressionsvektor, der ein Polynucleotid enthält, das ein stabiles HIF-1alpha-Protein der Erfindung oder ein chimäres Transaktivator-Protein codiert, wie hierin beschrieben wird, und zwar unter Bedingungen, die die Expression der Nucleinsäuresequenz erlauben, die in dem Vektor enthalten ist, wodurch eine gesteigerte Expression eines Hypoxie-induzierbaren Gens in der Zelle bereitgestellt wird. Solche Gene umfassen zum Beispiel diejenigen, die den VEGF, Glucose-Transporter, Glycolyse-Enzyme, IGF-1, IGF-Bindeproteine und ähnliche codieren.
Die Erfindung stellt weiterhin ein in vitro-Verfahren für die Bereitstellung der konstitutiven Expression eines Hypoxie-induzierbaren Faktors in einer Zelle unter hypoxischen oder nicht-hypoxischen Bedingungen bereit. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen der Zelle mit einer Nucleinsäuresequenz, die ein chimäres Transaktivator-Protein, wie hierin beschrieben, oder ein stabiles HIF-1alpha-Protein codiert, wie hierin beschrieben, und zwar unter Bedingungen, die die Expression der Nucleinsäuresequenz erlauben, wodurch eine konstitutive Expression des Hypoxieinduzierbaren Faktors bereitgestellt wird.
Weiterhin in die Erfindung mit eingeschlossen ist die medizinische Verwendung zur Verminderung von Hypoxie- oder Ischämie-bedingter Gewebeschädigung in einem Individuum, welches solche Schädigungen aufweist oder gefährdet ist, solche Schädigungen aufzuweisen. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Nucleinsäuresequenz, die ein chimäres Transaktivator-Protein, wie hierin beschrieben, oder ein stabiles HIF-1alpha-Protein codiert, wie hierin beschrieben, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger an ein Individuum, wodurch die Gewebeschädigung vermindert wird.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung einer vorbeugenden Therapie für Gewebe in einem Individuum bereit, das ihrer bedarf, umfassend die Verabreichung einer Menge eines Polypeptids, das durch ein Polynucleotid codiert wird, welches ein chimäres Transaktivator-Protein, wie hierin beschrieben, oder ein stabiles HIF-1alpha-Protein codiert, wie hierin beschrieben, an ein Individuum, so dass die Angiogenese in einem Maße induziert wird, das höher ist als vor der Verabreichung des Polypeptids, wodurch eine vorbeugende Therapie bereitgestellt wird.
Die Anlieferung des Polynucleotids kann durch die Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors wie z. B. eines chimären Virus oder durch ein kolloidales Dispersions-System erreicht werden. Besonders bevorzugt für die therapeutische Anlieferung von Sequenzen wird die Verwendung von zielgerichteten Liposomen.
Die verschiedenen viralen Vektoren, die für die Gentherapie verwendet werden können, wie sie hierin gelehrt wird, umfassen das Adenovirus, das Adenoassoziierte Virus, das Herpes-Virus, das Vaccinia-Virus oder bevorzugt ein RNA-Virus wie z. B. ein Retrovirus. Der retrovirale Vektor ist bevorzugt ein Derivat eines murinen oder eines Vogel-Retrovirus. Beispiele für retrovirale Vektoren, in die ein einzelnes fremdes Gen inseriert werden kann, umfassen das Moloney-Maus-Leukämie-Virus (MoMuLV), das Harvey-Maus-Sarkom-Virus (HaMuSV), das Maus-Mamma-Tumor-Virus (MuMTV) und das Rous-Sarkom-Virus (RSV), sind aber nicht auf diese beschränkt. Wenn es sich bei dem Individuum um einen Menschen handelt, wird bevorzugt ein Vektor wie der Gibbonaffen-Leukämie-Vektor (GaLV) verwendet. In eine Reihe von weiteren retroviralen Vektoren können mehrere Gene eingebaut werden. Alle diese Vektoren können ein Gen für einen selektierbaren Marker übertragen oder aufnehmen, so dass transduzierte Zellen erzeugt und identifiziert werden können. Durch Insertion einer sHIF-1alpha-Sequenz von Interesse in den viralen Vektor, zusammen mit einem anderen Gen, das zum Beispiel einen Liganden für einen Rezeptor auf einer spezifischen Zielzelle codiert, ist der Vektor nun zielspezifisch. Retrovirale Vektoren können auch zielspezifisch gemacht werden, indem man zum Beispiel einen Zucker, ein Glycolipid oder ein Protein anheftet. Die bevorzugte Zielansteuerung wird durch die Verwendung eines Antikörpers erreicht, um den retroviralen Vektor auf das Ziel auszurichten. Fachleute werden spezifische Polynucleotidsequenzen kennen oder leicht, ohne übermäßige Experimente durchführen zu müssen, herausfinden können, die in das retrovirale Genom eingebaut werden können oder die an die Hülle eines Virus angeheftet werden können, um die zielgerichtete spezifische Anlieferung des retroviralen Vektors, der das sHIF-1alpha-Polynucleotid enthält, zu ermöglichen.
Da rekombinante Retroviren einen Defekt aufweisen, benötigen sie Hilfe, um infektiöse Vektorpartikel herzustellen. Diese Hilfe kann zum Beispiel durch die Verwendung von Helfer-Zelllininen bereitgestellt werden, die Plasmide enthalten, welche alle Strukturgene des Retrovirus unter der Kontrolle regulatorischer Sequenzen innerhalb des LTR codieren. Diesen Plasmiden fehlt eine Nucleotidsequenz, die es dem Verpackungsmechanismus ermöglicht, ein RNA-Transkript für die Verkapselung zu erkennen. Helfer-Zelllinien, die Deletionen in dem Verpackungssignal aufweisen, umfassen zum Beispiel 2,PA317 und PA12, sind aber nicht auf diese beschränkt. Diese Zelllinien stellen leere Virionen her, da kein Genom verpackt wird. Wenn ein retroviraler Vektor, in dem das Verpackungssignal intakt ist, aber die Strukturgene durch andere Gene von Interesse ersetzt worden sind, in solche Zellen eingebracht wird, kann der Vektor verpackt und das Vektor-Virion hergestellt werden.
Alternativ können NIH-3T3- oder andere Gewebekultur-Zellen mit Plasmiden direkt transfiziert werden, die die retroviralen Strukturgene gag, pol und env codieren; dies kann durch die herkömmliche Calciumphosphat-Transfektion erfolgen. Diese Zellen werden dann mit dem Vektor-Plasmid transfiziert, das die Gene von Interesse enthält. Die so erhaltenen Zellen setzen den retroviralen Vektor in das Kulturmedium frei.
Ein anderes zielgerichtetes Anlieferungssystem für die HIF-1-Polynucleotide ist ein kolloidales Dispersionssystem. Kolloidale Dispersionssysteme umfassen Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrosphären, Kügelchen und auf Lipiden basierende Systeme einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Micellen, gemischter Micellen und Liposomen. Das bevorzugte kolloidale System dieser Erfindung ist ein Liposom. Liposomen sind künstliche Membranvesikel, die als Anlieferungsvehikel in vitro und in vivo nützlich sind. Es ist gezeigt worden, dass große unilamelläre Vesikel (LW), die in der Größe von 0,2–4,0 μm liegen, einen wesentlichen Prozentanteil an einem wässrigen Puffer einkapseln können, der große Makromoleküle enthält. RNA, DNA und intakte Virionen können innerhalb des wässrigen Innenraums eingekapselt werden und an die Zellen in einer biologisch aktiven Form angeliefert werden (Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6:77, 1981). Neben Säugerzellen wurden Liposomen auch für die Anlieferung von Polynucleotiden in Pflanzen-, Hefe- und Bakterienzellen verwendet. Damit ein Liposom ein wirksames Gentransfervehikel darstellen kann, sollten die folgenden Eigenschaften vorhanden sein: (1) Verkapselung der Gene von Interesse mit hoher Effizienz, ohne dabei ihre biologische Aktivität zu beeinträchtigen; (2) bevorzugte und wesentliche Bindung an eine Zielzelle im Vergleich zu Nicht-Zielzellen; (3) Anlieferung des wässrigen Inhalts des Vesikels in das Cytoplasma der Zielzelle mit hoher Effizienz und (4) exakte und effiziente Expression der genetischen Information (Mannino et al., Biotechniques 6:682, 1988).
Die Zusammensetzung des Liposoms besteht gewöhnlich aus einer Kombination von Phospholipiden, insbesondere von Phospholipiden mit hoher Phasenübergangs-Temperatur, in der Regel in Kombination mit Sterolen, insbesondere mit Cholesterin. Es können auch andere Phospholipide oder andere Lipide verwendet werden. Die physikalischen Eigenschaften der Liposomen hängen von dem pH-Wert, der Ionenstärke und der Anwesenheit zweiwertiger Kationen ab.
Beispiele für Lipide, die bei der Herstellung von Liposomen nützlich sind, umfassen Phosphatidyl-Verbindungen wie z. B. Phosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Sphingolipide, Cerebroside und Gangloside. Besonders nützlich sind d-lacylphosphatidyl-glycerine, in denen die Lipidgruppe 14–18 Kohlenstoffatome enthält, insbesondere 16–18 Kohlenstoffatome, und gesättigt ist. Beispiele für Phospholipide umfassen Phosphatidylcholin aus Eiern, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylcholin.
Die gezielte Anlieferung von Liposomen kann aufgrund anatomischer und mechanistischer Faktoren klassifiziert werden. Die anatomische Klassifizierung basiert auf dem Grad der Selektivität, d. h. zum Beispiel organspezifisch, zellspezifisch und organellspezifisch. Mechanistisch kann die gezielte Anlieferung nach der Frage unterschieden werden, ob sie passiv oder aktiv erfolgt. Die passive gezielte Anlieferung verwendet die natürliche Tendenz von Liposomen, sich in den Zellen des retikulo-endothelialen Systems (RES) in Organen zu verteilen, die sinusoidale Kapillaren enthalten. An der aktiven gezielten Anlieferung andererseits, ist eine Veränderung der Liposomen beteiligt; dies erfolgt durch Kopplung des Liposoms an einen spezifischen Liganden wie z. B. einen monoclonalen Antikörper, einen Zucker, ein Glycolipid oder ein Protein oder durch die Veränderung der Zusammensetzug oder der Größe des Liposoms, damit eine gezielte Anlieferung an Organe und andere Zellarten als die natürlich vorhandenen Stellen der Lokalisierung erreicht werden kann.
Die Oberfläche des zielgerichteten Anlieferungssystems kann auf vielfältige Weise modifiziert werden. Im Falle eines zielgerichteten liposomalen Anlieferungssystems können Lipidgruppen in die Lipid-Doppelschicht des Liposoms eingebaut werden, um den auf das Ziel gerichteten Liganden in einer stabilen Verbindung mit der Liposomen-Doppelschicht zu halten. Es können verschiedene verbindende Gruppen für die Verbindung der Lipidketten mit dem zielgerichteten Liganden verwendet werden.
Das sHIF-1alpha-Polypeptid kann für eine therapeutische Verabreichung verwendet werden. Für eine solche Verabreichung muss das Polypeptid steril sein. Die Sterilität wird leicht durch eine Sterilfiltration durch (z. B. 0,2 μm) Membranen erreicht. Die Verbindung der Erfindung wird in der Regel in Einheits- oder Mehrfach-Dosierungs-Behältern aufbewahrt, zum Beispiel in versiegelten Ampullen oder Gefäßen, und zwar als wässrige Lösung, da sie gegenüber einer thermischen und oxidativen Denaturierung sehr stabil ist. Gefriergetrocknete Formulierungen zur Rekonstitution sind ebenfalls akzeptierbar. Das Polypeptid wird als Arzneimittel verabreicht (vergleiche mit dem Nachfolgenden).
Die Erfindung beschreibt auch, beansprucht jedoch nicht, ein Verfahren für die Behandlung eines Individuums, das eine Hypoxie-bedingte Störung aufweist; dies erfolgt durch die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von Zellen, die sHIF-1alpha exprimieren, an das individuum. „Therapeutisch wirksam", wie hierin verwendet, bezieht sich auf diejenige Menge an Zellen, die eine ausreichende Menge darstellt, so dass ein Symptom der Erkrankung gelindert wird oder dass die Hypoxie-bedingte Störung gemildert wird. Die wirksame Menge führt zu der Expression des biologisch aktiven stabilen HIF-1alpha-Proteins über einen Zeitraum, so dass eines oder mehrere Symptome der Erkrankung/Störung abgeschwächt werden. Solche Verfahren sind nützlich, um die Expression von HIF-1alpha und/oder von Hypoxie-induzierbaren Genen in Geweben unter hypoxischen oder nicht-hypoxischen Bedingungen zu steigern oder aufrechtzuerhalten.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen der Verfahren der Erfindung, die vorstehend beschrieben wurden, jedoch nicht beansprucht werden, wird der sHIF-1alpha lokal (z. B. interläsional) und/oder systemisch verabreicht. Der Begriff „lokale Verabreichung" bezieht sich auf eine Anlieferung an einen definierten Bereich oder eine Region des Körpers, wie z. B. bei nicht heilenden Wunden, während der Begriff „systemische Verabreichung" so gemeint ist, dass er die Anlieferung an das Individuum auf oralem Wege oder durch intramuskuläre, intravenöse, intraarterielle, subcutane oder intraperitoneale Injektion umfasst.
Der Begriff „pharmazeutisch verträglich" bedeutet ein nicht toxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des/der aktiven Bestandteils(e) nicht beeinträchtigt. Der Begriff „physiologisch verträglich" bezieht sich auf ein nicht toxisches Material, das mit einem biologischen System verträglich ist, wie z. B. einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe oder einem Organismus.
Die sHIF-1alpha-Zusammensetzungen der Erfindung können als Teil eines Arzneimittels verwendet werden, wenn sie mit einem physiologisch und/oder pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert werden. Die Eigenschaften des Trägers werden von dem Weg der Verabreichung abhängen. Eine solche Zusammensetzung kann neben dem synthetischen Oligonucleotid und dem Träger Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisatoren und andere Materialien enthalten, die im Fachgebiet wohlbekannt sind. Das Arzneimittel der Erfindung kann auch andere aktive Faktoren und/oder Agenzien enthalten, die die Expression steigern oder die bei der Stimulierung der Angiogenese helfen. So kann zum Beispiel der sHIF-1alpha in Kombination mit dem VEGF in den Arzneimitteln der Erfindung verwendet werden.
Die Arzneimittel der Erfindung können in Form eines Liposoms vorliegen, in dem die sHIF-1alpha-Zusammensetzungen der Erfindung zusätzlich zu anderen pharmazeutisch verträglichen Trägern mit amphipathischen Agenzien kombiniert sind, wie z. B. mit Lipiden, die in aggregierter Form als Micellen, unlösliche Einzelschichten, Flüssigkristallen oder lamelläre Schichten vorliegen, die sich in einer wässrigen Lösung befinden. Geeignete Lipide für die Formulierung von Liposomen umfassen ohne Einschränkung Monoglyceride, Diglyceride, Sulfatide, Lysolecithin, Phospholipide, Saponin, Gallensäuren und ähnliche. Ein besonders nützlicher Lipidträger ist Lipofectin. Die Herstellung solcher Liposomen-Formulierungen befindet sich im Rahmen des Stands des Fachgebiets, wie zum Beispiel in dem US-Patent Nr. 4,235,871; dem US-Patent Nr. 4,501,728; dem US-Patent Nr. 4,837,028 und dem US-Patent Nr. 4,737,323 offenbart wird. Die Arzneimittel der Erfindung können weitere Verbindungen enthalten, wie z. B. Cyclodextrine und ähnliche, welche die Anlieferung von Nucleinsäuremolekülen in die Zellen steigern, oder Polymere, die eine langsame Freisetzung ermöglichen.
Wenn eine therapeutisch wirksame Menge einer Zusammensetzung der Erfindung durch intravenöse, subcutane, intramuskuläre, intraarterielle, intraokuläre oder intraperitoneale Injektion verabreicht wird, wird die Zusammensetzung in Form einer Pyrogen-freien, parenteral verträglichen wässrigen Lösung vorliegen. Die Herstellung solcher parenteral verträglichen Lösungen, bei denen der pH-Wert, die Isotonität, die Stabilität und ähnliches berücksichtigt werden, befindet sich im Rahmen des Fachgebiets. Eine bevorzugtes Arzneimittel für die intravenöse, subcutane, intramuskuläre, intraperitoneale oder intraokuläre Injektion sollte zusätzlich zu der sHIF-1alpha-Zusammensetzung ein isotonisches Vehikel enthalten, wie z. B. Natriumchlorid-Injektionslösung, Ringer-Injektionslösung, Dextrose-Injektionslösung, Dextrose- und Natriumchlorid-Injektionslösung, Ringer-Lactat-Injektionslösung oder ein anderes Vehikel, das im Fachgebiet bekannt ist. Das Arzneimittel der Erfindung kann ebenfalls Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Puffer, Antioxidationsmittel oder andere Zusatzstoffe enthalten, die den Fachleuten bekannt sind.
Die Menge der sHIF-1alpha-Zusammensetzung in dem Arzneimittel der vorliegenden Erfindung wird von der Natur und der Schwere des zu behandelnden Zustands abhängen, sowie von der Natur vorangegangener Behandlungen, die der Patient durchlaufen hat. Letztendlich wird der behandelnde Arzt über die Menge der sHIF-1alpha-Zusammensetzung entscheiden, mit der ein individueller Patient behandelt wird. Zu Beginn wird der behandelnde Arzt niedrige Dosen der sHIF-1alpah-Zusammensetzung verabreichen und die Antwortreaktionen des Patienten beobachten. Es können höhere Dosen der sHIF-1alpha-Zusammensetzung verabreicht werden, bis die optimale therapeutische Wirkung bei dem Patienten erreicht ist, und an diesem Punkt wird die Dosierung nicht weiter erhöht. Es wird beabsichtigt, dass die verschiedenen Arzneimittel, die verwendet werden, um das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu praktizieren, etwa 10 μg bis etwa 20 mg der sHIF-1alpha-Zusammensetzung pro kg Körper- oder Organgewicht enthalten sollten.
Die Dauer einer intravenösen Therapie, die die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung verwendet, wird variieren, und zwar in Abhängigkeit von der Schwere der Erkrankung, die behandelt wird, und dem Zustand und den möglichen idiosynkratischen Antwortreaktionen jedes individuellen Patienten. Letztendlich wird der behandelnde Arzt über die geeignete Dauer der intravenösen Therapie entscheiden, in der die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung angewendet werden.
Eine Transduktion der Zellen in vitro wird im Allgemeinen mit isolierten Zellpopulationen oder Zelllinien durchgeführt. Die Zellen können xenogen, allogen, syngen oder autolog sein, bevorzugt sind sie autolog, um nachteilige Immunantworten zu vermindern. Die Zellen können in jedem physiologisch verträglichen Medium verabreicht werden, dies erfolgt normalerweise intravasculär, obwohl sie auch in das Gewebe, das ein Gefäß umgibt, oder an einer anderen bequem erreichbaren Stelle eingebracht werden können, an der die Zellen einen geeigneten Ort für die Expansion und die Differenzierung vorfinden.
„Lindern" bezieht sich auf die Abschwächung oder Verminderung der nachteiligen Wirkungen der Krankheiten oder Störungen in dem Patienten, der die Therapie erhält.
Es kann jedes beliebige Transplantations- oder Implantationsverfahren, das im Fachgebiet bekannt ist, verwendet werden. Zum Beispiel können die ausgewählten Zellen oder die Zellen von Interesse in den Empfänger oder in das Individuum chirurgisch implantiert werden. Die Transplantation oder Implantation wird typischerweise mittels einer einfachen Injektion durch eine hypodermische Nadel durchgeführt, die einem Innendurchmesser besitzt, der ausreicht, um den Durchtritt einer Suspension von Zellen zu ermöglichen, ohne dass dabei die Zellen oder die Gewebebeschichtung beschädigt werden. Für eine Implantation werden die typischerweise verkapselten oder beschichteten Zellen als Arzneimittel zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger formuliert. Solche Zusammensetzungen enthalten eine ausreichende Zahl an beschichteten Transplantat-Zellen, die in ein Individuum injiziert oder durch ein Laparoskop einem Individuum verabreicht werden können. In der Regel werden mindestens etwa 1 × 10⁴ bis 1 × 10⁵ Zellen verabreicht, bevorzugt sind es 1 × 10⁶ oder mehr. Die Zellen können bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs eingefroren und über lange Zeiträume aufbewahrt werden, wobei sie nach dem Auftauen für die Verwendung bereit sind. Einmal aufgetaut, können die Zellen vermehrt werden. Weiterhin können die Zellen in einer verkapselten oder einer nicht verkapselten Form verabreicht werden. Die Zellen werden bevorzugt verkapselt.
Obwohl nicht erforderlich, kann es wünschenswert sein, ein das Immunsystem unterdrückendes Mittel einem Empfänger der Zellen vor, gleichzeitig mit und/oder nach der Transplantation zu verabreichen. Ein immununterdrückendes Mittel kann insbesondere bei xenogenen oder allogenen Zellen verwendet werden, die den sHIF-1alpha exprimieren. Ein Mittel wie z. B. Cyclosporin A (CsA) wird bevorzugt, es können jedoch auch andere immununterdrückende Mittel verwendet werden, wie z. B. Rapamycin, Desoxyspergualin, FK506 und ähnliche. Diese Agenzien werden verabreicht, um eine immununterdrückende Wirkung in dem Individuum hervorzurufen, so dass die transplantierten Zellen nicht durch das Immunsystem des Individuums abgestoßen werden. Das immununterdrückende Agenz wird typischerweise kontinuierlich über den ganzen Transplantations-Behandlungszeitraum verabreicht, d. h. in der Regel über einen Zeitraum von Tagen oder Wochen; zum Beispiel erstreckt sich die Behandlung mit CsA von etwa 2 bis etwa 20 Tage mit einem Dosierungsbereich von etwa 5 bis 40 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag. Das Agenz kann über eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden, einschließlich der parenteralen, subcutanen, intrapulmonären, oralen, intranasalen Verabreichung und ähnlichen. Bevorzugt erfolgt die Dosierung über orale Verabreichung.
Die den HIF-1alpha exprimierenden Zellen können vor der Transplantation auch verkapselt werden. Obwohl die Zellen typischerweise in Mikrokapseln verkapselt werden, können sie auch in verschiedenen Arten von Hohlfasern oder in einem Block aus einkapselndem Material eingeschlossen werden. Im Fachgebiet sind eine Vielzahl von Mikroverkapselungsverfahren und -Zusammensetzungen bekannt. Eine Reihe an Mikroverkapselungsverfahren für die Verwendung bei der Transplantat-Therapie konzentriert sich auf die Verwendung von Alginat-Polymeren oder Agarose für die Bereitstellung der Verkapselungs-Zusammensetzungen. Alginate sind lineare Polymere aus Mannuron- und Guluronsäureresten, die in Blöcken von mehreren benachbarten Guluronsäureresten, welche Guluronat-Blöcke bilden, sowie in Blöcken von benachbarten Mannuronsäureresten, welche Mannuronat-Blöcke bilden, angeordnet sind, in die gemischte oder heterogene Blöcke aus alternierenden Guluron- und Mannuronsäureresten eingestreut sind. Im Allgemeinen sind die einwertigen Kationen-Alginatsalze löslich, wie z. B. Na-Alginat.
Zweiwertige Kationen wie z. B. Ca⁺⁺, Ba⁺⁺ oder Sr⁺⁺ tendieren dazu, mit Guluronat in Wechselwirkung zu treten, und die kooperative Bindung dieser Kationen innerhalb der Guluronat-Blöcke stellt die primäre intramolekulare Kreuzvernetzung bereit, die für die Bildung von stabilen, Ionen-gepaarten Alginatgelen verantwortlich ist. Alginat-Verkapselungsverfahren nutzen im Allgemeinen den Vorteil, dass das Alignat bei Anwesenheit dieser zweiwertigen Kationenlösungen gelieren kann. Insbesondere umfassen diese Verfahren die Suspension des Materials, das eingekapselt werden soll, in einer Lösung von Alginatsalzen mit einwertigen Kationen, wie z. B. Natrium. Dann werden in der Luft Tröpfchen der Lösung erzeugt und in einer Lösung mit zweiwertigen Kationen wie z. B. CaCl₂ gesammelt. Die zweiwertigen Kationen treten mit dem Alginat an dem Phasenübergang zwischen dem Tröpfchen und der Lösung der zweiwertigen Kationen in Wechselwirkung, was zur Bildung einer stabilen Alginat-Gelmatrix führt, die gebildet wird. Die Erzeugung von Alginat-Tröpfchen ist vorher bereits durch eine Reihe an Verfahren durchgeführt worden. Zum Beispiel wurden die Tröpfchen durch das Herauslaufen von Alginat aus einem Schlauch durch die Gravitationskraft in eine Lösung mit zweiwertigen Kationen erzeugt. Es wurden ebenfalls elektrostatische Tröpfchengeneratoren beschrieben, die auf der Erzeugung eines elektrostatischen Differenzials zwischen der Alginatlösung und der Lösung mit den zweiwertigen Kationen basieren. Das elektrostatische Differenzial führt dazu, dass die Alginatlösung durch einen Schlauch in die Lösung mit den zweiwertigen Kationen gezogen wird. Es wurden auch Verfahren beschrieben, bei denen die Tröpfchen aus einem Strom der Alginatlösung unter Verwendung eines laminaren Luftstrom-Extrusionssystems erzeugt wurden. Spezifisch umfasst diese Vorrichtung eine Kapillarröhre innerhalb einer äußeren Ummantelung. Die Luft wird durch die äußere Ummantelung hindurchgepresst und der Zufluss der Polymerlösung wird durch die innere Röhre reguliert. Der Luftstrom aus der äußeren Ummantelung bricht den Flüssigkeitsstrom aus der Kapillarröhre in kleine Tröpfchen auf (vergleiche mit dem US-Patent Nr. 5,286,495). Hinsichtlich einer allgemeinen Diskussion über die Erzeugung von Tröpfchen bei Verkapselungsprozessen vergleiche z. B. mit M.F.A. Goosen, Fundamentals of Animal Cell Encapsulation and Immobilisation, Kap. 6, ff., 114–142 (CRC Press, 1993).
Versuche, Organgewebe in genetisch unterschiedliche Wirte ohne eine Unterdrückung des Immunsystems zu transplantieren, werden im Allgemeinen durch das Immunsystem des Wirts zurückgewiesen. Daher wurden Versuche unternommen, andere wirksame schützende Barrierebeschichtungen bereitzustellen, wie z. B. durch die Mikroverkapselung, um das transplantierte Gewebe von dem Immunsystem des Wirts zu isolieren. Erfolgreiche Zell- oder Gewebetransplantate erfordern im Allgemeinen eine Beschichtung, die ihre Zerstörung durch das Immunsystem des Wirtes verhindert, eine Fibrose verhindert, und die durchlässig ist und eine freie Diffusion von Nährstoffen in das beschichtete Transplantat sowie die Entfernung der sekretorischen und der Abfallprodukte aus dem beschichteten Transplantat erlaubt. Lebensfähiges) Gewebe und Zellen wurden in Alginatkapseln erfolgreich immobilisiert, die mit Polylysin beschichtet waren (vergleiche mit dem Vorstehenden und mit J. Pharm. Sci. 70:351–354, 1981). Die Entwicklung von Transplantaten, die in Calciumalginat-Kapseln verkapselt wurden, die mit Polylysin zur Reaktion gebracht wurden, wurde ebenfalls beschrieben, wie z. B. in dem US-Patent Nr. 4,673,566; 4,689,293; 4,789,550; 4,806,355 und 4,789,550. Das US-Patent Nr. 4,744,933 beschreibt Verkapselungslösungen, die biologisch aktive Materialien in einer Membran aus miteinander zur Reaktion gebrachten Alginat und Polyaminosäuren enthalten. Das US-Patent Nr. 4,696,286 berichtet über ein Verfahren für die Beschichtung von Transplantaten, die für eine Transplantation in genetisch unterschiedliche Individuen geeignet ist. Das Verfahren umfasst die Beschichtung des Transplantats mit einer sich an die Oberfläche, anpassenden Bindungsbrücke eines multifunktionellen Materials, das an einen Oberflächenbestandteil des Transplantats chemisch bindet, welches in eine halbdurchlässige, biologisch verträgliche Schicht aus einem Polymer eingehüllt wird, das an die Bindungsbrückenschicht chemisch bindet. Ein Verfahren für die Einbringung einer zweiten Alginat-Gelbeschichtung auf Zellen, die bereits mit Polylysinalginat beschichtet sind, wird in dem US-Patent 5,227,298 beschrieben. Bei diesem Verfahren erfordern sowohl die erste als auch die zweite Beschichtung eine Stabilisierung durch Polylysin.
Verkapselungsverfahren, die angewendet wurden, um diese Materialien herzustellen, umfassen ein Verfahren zur Bildung von Tröpfchen des einkapselnden Mediums und des biologischen Materials sowie ein Verfahren für die Verfestigung des einkapselnden Mediums. Mit Agarose verkapselte Materialien wurden durch die Abkühlung einer Emulsion von Agarosetröpfchen gebildet, die biologische Materialien enthielten, wie durch Nilsson et al., Nature 302:629–630 (1983) und Nilsson et al., Eur: J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:319–326 (1983) gezeigt wurde. Die Injektion von Tröpfchen aus Polymeren, die biologische Materialien enthalten, in einem Körper aus Kühlmittel wie z. B. einem gleichzeitigen Flüssigkeitsstrom wurde von Gin et al., J. Microencapsulation 4:329–242 (1987) berichtet.
Diese Erfindung umfasst, beansprucht jedoch nicht, die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis eines Arzneimittels, das die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält, an ein Individuum. Die „Verabreichung" des Arzneimittels der vorliegenden Erfindung kann durch beliebige Mittel vorgenommen werden, die den Fachleuten bekannt sind.
Die Arzneimittel werden bevorzugt in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht. Feste Dosierungseinheiten sind Tabletten, Kapseln und Zäpfchen. Für die Behandlung eines Patienten werden in Abhängigkeit von der Aktivität der Verbindung, der Weise der Verabreichung, der Natur und der Schwere der Störung, dem Alter und dem Körpergewicht des Patienten unterschiedliche tägliche Dosen benötigt. Unter bestimmten Umständen können jedoch höhere oder niedrigere tägliche Dosen geeignet sein. Die Verabreichung der täglichen Dosis kann sowohl durch eine einzige Verabreichung in Form einer individuellen Dosiseinheit oder ansonsten durch mehrere kleinere Dosiseinheiten als auch durch die mehrfache Verabreichung unterteilter Dosen in spezifischen Intervallen erfolgen.
Die Arzneimittel gemäß der Erfindung werden im Allgemeinen örtlich, oral, intravenös oder über andere parenterale Wege verabreicht, oder als Implantate, im Prinzip ist sogar eine rektale Verwendung möglich. Geeignete feste oder flüssige pharmazeutische Präparatformen sind zum Beispiel Granula, Pulver, Tabletten, beschichtete Tabletten, (Mikro)kapseln, Zäpfchen, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen, Cremes, Aerosole, Tropfen oder eine injizierbare Lösung in Ampullenform und auch Präparate mit einer verzögerten Freisetzung der aktiven Verbindungen, bei deren Herstellung Excipienten und Zusatzstoffe und/oder Hilfsstoffe wie z. B. Zerfallsmittel, Bindemittel, Beschichtungsmittel, Schwellmittel, Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßstoffe oder Solubilisatoren üblicherweise verwendet werden, wie vorstehend beschrieben. Die Arzneimittel sind für die Verwendung in einer Vielzahl von Arzneistoff-Anlieferungssystemen geeignet. Hinsichtlich einer kurzen Übersicht über die derzeitigen Verfahren für die Anlieferung von Arzneistoffen vergleiche mit Langer, Science 249:1527–1533, 1990.
Für die Anlieferung des sHIF-1alpha-Muteins werden die Formulierungen durch einheitliches und enges Inkontaktbringen des sHIF-1alpha-Muteins mit den flüssigen Trägern oder den fein verteilten festen Trägern oder mit beidem hergestellt, und dann wird, ggf. das Produkt in die gewünschte Formulierung gebracht. Der Träger ist bevorzugt ein parenteraler Träger, noch bevorzugter eine Lösung, die mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Beispiele für solche Trägervehikel umfassen Wasser, Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextrose-Lösung und 5 %iges menschliches Serumalbumin. Nicht-wässrige Vehikel wie z. B. fette Öle und Ethyloleat sind hierbei ebenfalls nützlich, ebenso wie Liposomen. Im Allgemeinen kann der Träger kleinere Mengen an Zusatzstoffen enthalten, wie z. B. Stoffe, die die Isotonität und die chemische Stabilität steigern, wie z. B. Puffer und Konservierungsstoffe, sowie Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als 10 Reste), Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate, einschließlich Glucose oder Dextrane, Chelat-bildende Mittel wie z. B. EDTA oder andere Excipienten.
Die hierin beschriebene Zusammensetzung kann in geeigneter Weise auch durch anhaltende Freisetzungssysteme verabreicht werden. Geeignete Beispiele für anhaltende Freisetzungssysteme umfassen halbdurchlässige Polymermatrices in Form von vorgeformten Artikeln wie z. B. Filme, Mikrokapseln oder Mikrosphären. Anhaltende Freisetzungssysteme umfassen zum Beispiel Polyactide (US-Patent Nr. 3,773,919), Kopolymere aus L-Glutaminsäure und Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22:547–556, 1983), oder Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133,988 ). Anhaltende Freisetzungssysteme umfassen auch eine oder mehrere in Liposomen eingeschlossene Verbindungen der Formel I. Solche Zusammensetzungen werden durch Verfahren hergestellt, die als solche bekannt sind, z. B. wie in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688–3692, 1985 gelehrt wird. Gewöhnlich gehören die Liposomen dem kleinen (200–800 Å) unilamellären Typ an, in dem der Lipidgehalt mehr als etwa 30 Mol-% Cholesterin beträgt, wobei der gewählte Anteil für die optimale Therapie eingestellt wird.
Die Arzneimittel gemäß der Erfindung können lokal oder systemisch verabreicht werden. Mit einer „therapeutisch wirksamen Dosis" ist diejenige Menge einer Verbindung gemäß der Erfindung gemeint, die nötig ist, um die Symptome der Störung und ihre Komplikationen zu verhindern, zu kurieren oder zumindest teilweise aufzuhalten. Die Mengen, die für diese Verwendung nötig sind, werden natürlich von der Schwere der Erkrankung und dem Gewicht und dem allgemeinen Zustand des Patienten abhängen. Typischerweise können die in vitro verwendeten Dosierungen nützliche Richtwerte für die Mengen bereitstellen, die für die in situ-Verabreichung des Arzneimittels verwendet werden, und es können Tiermodelle verwendet werden, um die wirksame Dosierung für die Behandlung von bestimmten Störungen zu bestimmen. Die verschiedenen Punkte, die berücksichtigt werden sollten, sind z. B. in Gilman et al., Hrsg., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, B. Aufl., Pergamon Press, 1990 und in Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Aufl., Mack Publishing Co., Easton, Pa.,1990 beschrieben.
Der stabile HIF-1alpha und die chimären Transaktivator-Zusammensetzungen der Erfindung können auch in Form von nackter DNA angeliefert werden, wie z. B. durch die Verfahren, die in dem US-Patent Nr. 5,589,466 beschrieben werden.
Mit den folgenden Beispielen wird beabsichtigt, die Erfindung zu erläutern, aber nicht sie einzuschränken. Obwohl sie für diejenigen Verfahren, die verwendet werden können, typisch sind, können alternativ auch andere Verfahren verwendet werden, die den Fachleuten bekannt sind.
BEISPIEL 1
ERZEUGUNG EINER KONSTITUTIV EXPRIMIERTEN FORM DES HIF-1alpha
Vor kurzem wurde gezeigt (Jiang et al., J. Biol. Chem. 272:19253, 1997; Pugh of al., J. Biol. Chem. 272:11205), dass ein Fusionsprotein, das aus der GAL4-DNA-Bindedomäne, die mit den HIF-1alpha-Resten 531-826 fusioniert ist, besteht, ein konstitutiv exprimiertes Protein darstellt, welches die Transkription von Reportergenen, die GAL4-Bindestellen besitzen, aktivieren kann. Diese GAL4/HIF- 1alpha-Konstrukte aktivieren jedoch nicht die normalen Zielgene, die durch den HIF-1 reguliert werden. Umgekehrt wurde gezeigt, dass die Aminosäuren 1-390 des HIF-1alpha für eine Dimerisierung des HIF-1alpha mit HIF-1beta und für die Bindung an Ziel-DNA-Sequenzen ausreichen, jedoch für eine optimale Aktivierung der Gentranskription nicht ausreichend sind (Jiang, B.H. et al., J. Biol. Chem. 271:17771–17778, 1996; US-Patent Nr. 5,882,914).
Um eine konstitutiv exprimierte Form des HIF-1alpha zu erzeugen, wurden zwei Reihen an Deletionskonstrukten hergestellt, d. h. eine, in der die Deletionen an dem carboxyterminalen Ende des Moleküls (Aminosäure 826) begannen und sich in Richtung des Aminoterminus erstreckten, und eine, in der die Deletionen an der Aminosäure 392 begannen und sich in Richtung des Carboxyterminus erstreckten.
Jedes dieser Konstrukte wurde in Säugerzellen unter nicht-hypoxischen (20% O₂) oder unter hypoxischen (1% O₂) Bedingungen exprimiert, und die Expression des endogenen Volllängen-HIF-1alpha- und des transfizierten deletierten HIF-1alphawurde mittels eines Immunblot-Testansatzes unter Verwendung affinitätsgereinigter anti-HIF-1alpha-Antikörper quantifiziert. Diese Studien offenbarten, dass der endogene HIF-1alpha eine regulierte Expression aufwies (d. h. es wurde mehr Protein in den Zellen bei 1% O₂ exprimiert, als in den Zellen bei 20% O₂). Darüber hinaus zeigten die Untersuchungen, dass die C-terminale Deletion bis zu der Aminosäure 726 keine Auswirkung auf die Regulation der Expression des HIF-1alpha-Proteins durch die O₂-Konzentration hatte, wohingegen eine Deletion bis zu der Aminosäure 703 oder darüber hinaus zu einem Verlust der Regulation führte (d. h. konstitutive Expression, vergleiche mit 2). Interne Deletionen, die sich von Aminosäure 392 bis zu 517 erstreckten, hatten keine Auswirkung auf die Expression, wohingegen die Deletion der Aminosäure 392 bis zu der Aminosäure 521 zu einem Verlust der Regulation führte (vergleiche mit 3). Darüber hinaus führten die Misssense-Mutationen S551G/T552A (d. h. der Austausch eines Serins zu einem Glycin und eines Threonins zu einem Alanin an den Positionen 551 beziehungsweise 552) zum Verlust der Regulation bei den internen Deletionskonstrukten, die ansonsten eine Regulation zeigten (d. h. die Deletionen, die sich von der Aminosäure 392 bis irgendwo zwischen die Aminosäuren 429 und 517 erstreckte). Die Misssense-Mutationen alleine verursachten keine Störung der Regulation des Volllängen-HIF-1alpha (Aminosäuren 1-826, vergleiche mit 3).
Diese Ergebnisse legten nahe, dass in HIF-1alpha zwei Regionen vorhanden sind, die für eine regulierte Expression erforderlich sind, so dass die Deletion jeder Region zu einer fehlregulierten Expression führt (vergleiche mit 4). Die erste dieser Regionen ist die Region AB (Aminosäuren 392-552). Innerhalb dieser internen Region wurden zwei Sequenzen (A und B) identifiziert, die funktionell redundant erscheinen, da die Anwesenheit von nur einer Sequenz für die Regulation ausreichte. Eine dieser Sequenzen (A) wurde durch die 392-428-Deletion identifiziert, und die andere Sequenz (B) wurde durch die 392-520-Deletion oder durch die S551G/T552A-Punktmutationen identifiziert. Dieses letzte Ergebnis legte nahe, dass der Serin- und/oder der Threonin-Rest einer Phosphorylierung/Dephosphorylierung unterliegt, die durch die 392-520-Deletion zerstört werden kann. Da der Verlust der Serin/Threonin-Sequenz die Hypoxie nachbildete, lassen diese Ergebnisse vermuten, dass eine Phosphorylierung von Serin 551 und/oder von Threonin 552 unter nicht-hypoxischen Bedingungen und eine Dephosphorylierung unter hypoxischen Bedingungen erfolgt. Aufgrund der Redundanz von A und B ist es möglich, dass eine Phosphatase auch an die A-Stelle binden und einen in der Nähe gelegenen Serin- oder Threoninrest dephosphorylieren kann.
Die Region C ist durch die unterschiedlichen Auswirkungen von Deletionen definiert, die die Aminosäuren 704 bis 826 umfassen, und zwar im Vergleich zu Deletionen, die die Aminosäuren 727 bis 826 umfassen. Ein Verlust der Region C ist mit dem Verlust der Region AB nicht redundant, daher ist es wahrscheinlich, dass diese Region an einer anderen Funktion beteiligt ist, die mit der Regulation der HIF-1alpha-Stabilität in Beziehung steht. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, ist es möglich, dass diese Region an der Ubiquitinylierung oder an der Proteolyse beteiligt ist.
Zwischen den Aminosäuren 786 und 826 ist eine starke Transaktivierungsdomäne lokalisiert. Dies hat zu Folge, dass, obwohl der HIF-1alpha (Aminosäuren 1-703) konstitutiv exprimiert wird, er biologisch nicht so aktiv ist wie der Volllängen-HIF-1alpha. Um zu bestimmen, ob der sHIF-1alpha eine erhöhte biologische Aktivität im Vergleich zu dem Vollllängen-HIF-1alpha zeigt, wurden Kotransfektions-Experimente unter Verwendung der Deletions-/Punkt-HIF-1alpha-Mutante (1-391/512-826/S551G/T552A), eines stabilen HIF-1alpha, durchgeführt. Es wurden entweder 293-Zellen (vergleiche mit 5) oder Hep3B-Zellen (vergleiche mit 6) mit einem Reportergen, das ein Hypoxie-induzierbares Element enthielt, das eine HIF-1-Bindestelle umfasste, sowie mit dem Säuger-Expressionsvektor pCEP4 (Invitrogen) kotransformiert, der entweder (1) kein Protein, (2) HIF-1alpha (1-826), (3) HIF-1alpha (1-391/429-826) (nur die Deletion) oder (4) stabilen HIF-1alpha (HIF-1alphaDP, eine Form von sHIF-1alpha, die 1-391/512-826/S551G/T552A enthält) enthielt. Der endogene HIF-1beta wird in diesen Zellen in einem Spiegel konstitutiv exprimiert, der über der Expression des HIF-1alpha liegt. In beiden Zellarten vermittelte der HIF-1alphaDP (sHIF-1alpha) eine signifikant höhere Expression des Reportergens in den Zellen, die 20% O₂ ausgesetzt waren, und zwar aufgrund der Anwesenheit von höheren Spiegeln des biologisch aktiven HIF-1alpha (man bemerke, dass HIF-1alpha normalerweise nur bei 1% O₂ exprimiert wird). Diese Ergebnisse zeigen, dass eine konstitutiv exprimierte und biologisch aktive Form des HIF-1alpha erzeugt wurde.
Sequenzprotokoll
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polypeptid bestehend aus Aminosäureresten 1–391 und 521–826 von SEQ ID NO:1; (b) einem Polypeptid bestehend aus Aminosäureresten 1–391 und 549–826 von SEQ ID NO:1; (c) einem Polypeptid bestehend aus Aminosäureresten 1–391 und 576–826 von SEQ ID NO:1; (d) einem Polypeptid bestehend aus Aminosäureresten 1–391 und 429–826 von SEQ ID NO:1, wobei 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; (e) einem Polypeptid bestehend aus Aminosäureresten 1–391 und 469–826 von SEQ ID NO:1, wobei 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; (f) einem Polypeptid bestehend aus Aminosäureresten 1–391 und 494–826 von SEQ ID NO:1, wobei 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; (g) einem Polypeptid bestehend aus Aminosäureresten 1–391 und 508–826 von SEQ ID NO:1, wobei 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; (h) einem Polypeptid bestehend aus Aminosäureresten 1–391 und 512–826 von SEQ ID NO:1, wobei 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; (i) einem Polypeptid bestehend aus Aminosäureresten 1–391 und 517–826 von SEQ ID NO:1, wobei 551 nicht mehr Serin und 552 nicht Threonin ist; und (j) dem Polypeptid nach (d), das weiterhin eine Deletion der Aminosäuren 576-785 oder einen Teil dieser Deletion umfasst.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 (a), (b) und (d) bis (i), wobei der Aminosäurerest 551 Glycin ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 (a), (b) und (d) bis (i), wobei der Aminosäurerest 552 Alanin ist.
Nucleinsäuresequenz, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert.
Nucleinsäure nach Anspruch 4, die weiterhin eine damit funktionell verknüpfte Expressionskontrollsequenz umfasst.
Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 5, wobei die Expressionskontrollsequenz ein Promotor ist.
Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 6, wobei der Promotor gewebespezifisch ist.
Expressionsvektor, der eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 4 umfasst.
Vektor nach Anspruch 8, wobei der Vektor ein Plasmid ist.
Vektor nach Anspruch 8, wobei der Vektor ein viraler Vektor ist.
Vektor nach Anspruch 10, wobei der Vektor ein retroviraler Vektor ist.
Wirtszelle, die den Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 11 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei die Zelle eine eukaryontische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei die Zelle eine prokaryontische Zelle ist.
Antikörper, der selektiv das Polypeptid nach Anspruch 1 (d) bindet.
Antikörper nach Anspruch 15, wobei der Antikörper monoclonal ist.
Antikörper nach Anspruch 15, wobei der Antikörper polyclonal ist.
Arzneimittel, umfassend: (a) ein Polypeptid mit einer Sequenz wie sie in SEQ ID NO:1 dargestellt ist, wobei Aminosäuren 392 bis 428 deletiert sind, Aminosäure 551 von Serin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist und Aminosäure 552 von Threonin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist, oder eine Nucleinsäuresequenz die eine Expressionskontrollsequenz umfasst, die funktionell verknüpft ist mit einem Polynucleotid, das ein Polypeptid mit einer Sequenz wie sie in SEQ ID NO:1 dargestellt ist codiert, wobei die Aminosäuren 392 bis 428 deletiert sind, Aminosäure 551 von Serin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist und Aminosäure 552 von Threonin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist; und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Arzneimittel nach Anspruch 18, wobei der Träger ein Liposom ist.
Arzneimittel nach Anspruch 18, wobei Aminosäure 551 ein Glycin ist.
Arzneimittel nach Anspruch 18, wobei Aminosäure 552 ein Alanin ist.
Verwendung einer Nucleotidsequenz, umfassend eine Expressionskontrollsequenz, die funktionell verknüpft ist mit einem Polynucleotid, das ein Polypeptid mit der Sequenz wie sie in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist codiert, wobei Aminosäuren 392 bis 428 deletiert sind, Aminosäure 551 von Serin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist und Aminosäure 552 von Threonin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist, oder eines Polypeptids mit einer Sequenz wie sie in SEQ ID NO:1 dargestellt ist, wobei Aminosäuren 392 bis 428 deletiert sind, Aminosäure 551 von Serin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist und Aminosäure 552 von Threonin zu einer beliebigen anderen Aminosäure geändert ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hypoxie-bedingter Gewebeschädigung.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei Aminosäure 551 ein Glycin ist.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei Aminosäure 552 ein Alanin ist.
Verwendung einer Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 4 und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers für die Herstellung eines Arzneimittels zur Reduzierung oder Verhinderung von Hypoxie- oder Ischämie-bedingter Gewebeschädigung, in einem Individuum, welches solche Schädigungen aufweist oder gefährdet ist, solche Schädigungen aufzuweisen, so dass die Gewebeschädigung reduziert wird.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Hypoxie- oder Ischämie-bedingte Gewebeschädigung durch eine Störung der zerebralen, koronaren oder peripheren Durchblutung verursacht wird.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Bereitstellung einer prophylaktischen Therapie für Gewebe in einem Individuum mit koronarer Herzerkrankung oder ischämischer Gewebeschädigung, so dass Angiogenese in einem Maß induziert wird, dass der Spiegel höher ist als vor der Verabreichung des Polypeptids, wodurch eine prophylaktische Therapie für das Individuum mit koronarer Herzerkrankung oder ischämischer Gewebeschädigung bereitgestellt wird.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei das Individuum gefährdet ist, eine koronare Herzerkrankung oder ischämische Gewebeschädigung zu bekommen.
In vitro-Verfahren zur Anhebung des Expression eines Hypoxie-induzierbaren Gens in einer Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 8 unter Bedingungen, die die Expression der Nucleinsäuresequenz, die in dem Vektor enthalten ist, erlauben, wodurch eine erhöhte Expression eines Hypoxie-induzierbaren Gens in der Zelle bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Hypoxie-induzierbare Faktor HIF-1alpha ist.
In vitro-Verfahren zur Bereitstellung von konstitutiver Expression eines Hypoxieinduzierbaren Faktors in einer Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einer Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 4 unter Bedingungen, die die Expression der Nucleinsäuresequenz erlauben, wodurch eine konstitutive Expression von Hypoxie-induzierbarem Faktor bereitgestellt wird.