DE69232832T3 - Bindungsdomänen in notch- und delta-proteinen - Google Patents

Bindungsdomänen in notch- und delta-proteinen Download PDF

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Alan Marc MUSKAVITCH
Grant Richard FEHON
Ilaria Rebay
Marie Christine BLAUMUELLER
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Description

  • Die Erfindung kam mit teilweiser Unterstützung der Regierung unter den Stipendien Nr. GM 19093 und NS 26084 zustande, die vom Department of Health und Human Services bewilligt wurden. Die Regierung hält bestimmte Rechte an der Erfindung.
  • 1. EINLEITUNG
  • Die Erfindung betrifft humane Notch-Gene und ihre codierten Produkte. Die Erfindung betrifft auch Sequenzen (hier als "adhäsive Sequenzen" bezeichnet), in den Proteinen, die von den humanen Notch-Genen codiert werden, die eine heterotypische Bindung an Sequenzen in von anderen toporhythmischen Genen codierten Proteinen vermitteln. Solche Gene umfassen Delta- und Serrate, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • 2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Genetische Analysen an Drosophila waren hinsichtlich der Auflösung der komplexen Entwicklungswege und der Identifizierung der wechselwirkenden Loci äußerst nützlich. Allerdings erfordert das Verständnis der exakten Natur der Prozesse, die den genetischen Wechselwirkungen zu Grunde liegen, eine Kenntnis der biochemischen Eigenschaften der Proteinprodukte der in Frage kommenden Gene.
  • Null-Mutationen in einem der zygotischen neurogenen Loci – Notch (N), Delta (DI), mastermind (mam), Enhancer of Split (E(spl), neuralized (neu), und big brain (bib) – führen auf Kosten ventraler und lateraler Epidermisstrukturen zu einer Hypertrophie des Nervensystems. Diese Wirkung beruht auf der Fehlleitung von Epidermis-Vorläuferzellen in einen neuronalen Weg und legt nahe, dass zur Diversifizierung der Zellen in der neurogenen Region von einer neuronalen Bestimmung zu einer epithelialen Bestimmung eine neurogene Genfunktion notwendig ist. Studien, die die Wirkungen der Laserablation von spezifischen embryonalen Neuroblasten in Heuschrecken bewertet haben (Doe und Goodman 1985, Dev. Biol. 111, 206-219), haben ergeben, dass zelluläre Wechselwirkungen zwischen Neuroblasten und den umgebenden accessorischen Zellen den Zweck haben, diese accessorischen Zellen am Einschlagen einer Neuroblasten-Bestimmung zu hindern. Zusammen haben diese genetischen und entwicklungsbezogenen Beobachtungen zu der Hypothese geführt, dass die Proteinprodukte der neurogenen Loci als Komponenten eines zellulären Wechselwirkungsmechanismus fungieren, der für eine entsprechende Epidermis-Entwicklung notwendig ist (Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends Genet. 4, 95-100).
  • Sequenzanalysen (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108; Vassin et al., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723–1735) haben gezeigt, dass zwei der neurogenen Loci, Notch und Delta, anscheinend Transmembranproteine codieren, die die Membran einmal überspannen. Das Notch-Gen codiert ein ca. 300-kd-Protein (wir verwenden "Notch" zur Bezeichnung dieses Proteins) mit einer großen extrazellulären N-terminalen Domäne, die 36 Epidermis-Wachstumsfaktor(EGF)-artige Wiederholungssequenzen in Tandemanordnung gefolgt von drei anderen Cystein-reichen Wiederholungssequenzen, die als Notch/lin-12 Wiederholungssequenzen bezeichnet werden, enthält (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6, 3094-3108; Yochem et al., 1988, Nature 335, 547-550). Delta codiert ein ca. 100-kd-Protein (wir verwenden "Delta" zur Bezeichnung von DLZM, das Proteinprodukt der vorherrschenden zygotischen und maternalen Transcripte; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735), das in seiner extrazellulären Domäne neun EGF-artige Wiederholungssequenzen aufweist (Vassin et al., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735). Obwohl wenig über die funktionelle Bedeutung dieser Wiederholungssequenzen bekannt ist, wurde das EGF-artige Motiv in einer Vielzahl von Proteinen, einschließlich derjenigen, die an der Blutgerinnungskaskade beteiligt sind (Furie und Furie, 1988, Cell 53, 505-518), festgestellt. Insbesondere wurde dieses Motiv in extrazellulären Proteinen, wie den Blutgerinnungsfaktoren IX und X (Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Furie und Furie, 1988, Cell 53, 505-518), in anderen Drosophila-Genen (Knust et al., 1987, EMBO J. 761-766; Rothberg et al., 1988, Cell 55, 1047-1059), und in einigen Zelloberflächen-Rezeptorproteinen, wie Thrombomodulin (Suzuki et al., 1987, EMBO J. 6, 1891-1897) und LDL-Rezeptor (Sudhof et al., 1985, Science 228, 815-822), gefunden. In Thrombomodulin und Urokinase wurde eine Protein-Bindungsstelle auf die EGF-Wiederholungsdomäne kartiert (Kurosawa et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 5993-5996; Appella et al., 1987, J. Biol. Chem. 262, 4437-4440).
  • Eine interessante Anordnung von Wechselwirkungen zwischen Notch- und Delta-Mutationen wurde bereits beschrieben (Vassin, et al., 1985, J. Neurogenet. 2, 291-308; Shepard et al., 1989, Genetics 122, 429-438; Xu et al., 1990, Genes Dev., 4, 464-475). Eine Reihe von genetischen Studien (zusammengefaßt bei Alton et al., 1989, Dev. Genet. 10, 261-272) hat angedeutet, dass die Gendosierungen von Notch und Delta in Relation zueinander für die normale Entwicklung essentiell sind. Eine 50%ige Verminderung der Dosis von Delta in einem Wild-Typ-Notch-Hintergrund führt zu einer Verbreiterung der Flügelvenen unter Erzeugung eines "Delta" an der Basis (Lindsley und Grell, 1968, Veröffentlichungsnummer 627, Washington, D.C., Carnegie Institute of Washington). Ein ähnlicher Phänotyp wird durch eine 50%ige Erhöhung der Dosis von Notch in einem Wild-Typ-Delta-Hintergrund verursacht ("konfluenter" Phänotyp; Welshons, 1965, Science 150, 1122-1129). Dieser Delta-Phänotyp wird durch eine Verminderung der Notch-Dosis teilweise unterdrückt. Neue Arbeiten in unseren Laboratorien haben ergeben, dass letale Wechselwirkungen zwischen Allelen, die mit Änderungen in den EGF-artigen Wiederholungssequenzen in Notch korrelieren, durch eine Dosis-Verminderung von Delta umgangen werden können (Xu et al., 1990, Genes Dev. 4, 464-475). Xu et al. (1990, Genes Dev. 4, 464-475) haben festgestellt, dass entweder Null-Mutationen an Delta oder mam die letalen Wechselwirkungen zwischen heterozygoten Kombinationen bestimmter Notch-Allele, die als Abruptex (Ax)-Mutationen bekannt sind, unterdrücken. Ax-Allele gehen mit Fehlsinnmutationen in den EGF-artigen Wiederholzungssequenzen der extrazellulären Notch-Domäne einher (Kelley et al., 1987, Cell 51, 539-548; Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417).
  • Notch wird bei axonalen Prozessen während des Auswachsens embryonaler Neuronen exprimiert (Johansen et al., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427-2440; Kidd et al., 1989, Genes Dev. 3, 1113-1129).
  • Eine Studie hat gezeigt, dass bestimmte Ax-Allele von Notch die Axon-Wegfindung während des Auswachsens sensorischer Neuronen in den Imaginalscheiben gravierend verändern können, obwohl bisher noch nicht bekannt ist, ob für diesen Defekt eine aberrante Notch-Expression im Axon selbst oder im Epithel, an dem es entlang wächst, verantwortlich ist (Palka et al., 1990, Development 109, 167-175).
  • 3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert. Bei einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist das adhäsive Fragment von Notch dasjenige Fragment, das die Notch-Sequenz enthält, die zu den EGF-artigen Drosophila-Notch-Wiederholungssequenzen 11 und 12 am meisten homolog ist.
  • Die vorliegende Spezifikation beschreibt die Nucleotidsequenzen der humanen Notch- und Delta-Gene und die Aminosäuresequenzen ihrer codierten Proteine sowie Fragmente hiervon, die eine Antigen-Determinante enthalten oder die funktionell wirksam sind. Die Beschreibung beschreibt auch Fragmente (hier als "adhäsive Fragmente" bezeichnet), und deren Sequenzen, der Proteine ("toporhythmische Proteine"), die von den toporhythmischen Genen codiert werden, die eine homotypische oder heterotypische Bindung an toporhythmische Proteine vermitteln.
  • Toporhythmische Gene, wie hier verwendet, bezieht sich auf die Gene Notch, Delta und Serrate sowie auf andere Mitglieder der Delta/Serrate-Familie, die z.B. durch die in Abschnitt 5.3, infra, beschriebenen Verfahren identifiziert werden können. Zusätzlich sind Antikörper gegen humanes Notch und gegen adhäsive Fragmente beschrieben. In der folgenden Beschreibung wird auf eine Anzahl von toporhythmischen Genen, einschließlich Notch, Delta und Serrate, Bezug genommen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich jedoch nur auf Proteine, Fragmente, chimere Proteine, Nukleinsäuren, Vektoren, Wirtszellen und Verfahren, die mit Notch verwandt sind, wie sie in den Ansprüchen definiert werden. Die anderen toporhythmischen Gene werden beschrieben, um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu unterstützen.
  • In speziellen Beispielen ist das adhäsive Fragment von Delta, das die heterotypische Bindung vermittelt, dasjenige Fragment, das die Sequenz enthält, die zu den Drosophila-Delta-Aminosäuren 1-230 am meisten homolog ist; das adhäsive Fragment von Delta, das die homotypische Bindung vermittelt, ist dasjenige Fragment, das die Sequenz enthält, die zu den Drosophila-Delta-Aminosäuren 32-230 am meisten homolog ist; und das adhäsive Fragment von Serrate ist dasjenige Fragment, das die Sequenz enthält, die zu den Drosophila-Serrate-Aminosäuren 85-283 oder 79-282 am meisten homolog ist.
  • 3.1. DEFINITIONEN
  • Wie hier verwendet, sollen die folgenden Begriffe die angegebenen Bedeutungen besitzen:
    • AA
    = Aminosäure
    EGF
    = Epidermis-Wachstumsfaktor
    ELR
    = EGF-artige (homologe) Wiederholungssequenz
    IC
    = intrazellulär
    PCR
    = Polymerasekettenreaktion
  • Wie hier verwendet, bedeutet eine Unterstreichung des Namens ein Gen, im Gegensatz zu seinem codierten Proteinprodukt, das durch den nicht unterstrichenen Namen des Gens angegeben ist. Beispielsweise bezeichnet "Notch" das Notch-Gen, wohingegen "Notch" das Proteinprodukt des Notch-Gens bezeichnet.
  • 4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1. Expressionskonstrukte und experimenteller Aufbau zur Überprüfung von Notch-Delta-Wechselwirkungen. S2-Zellen im log-Phasenwachstum wurden vorübergehend mit einem der drei gezeigten Konstrukte transfiziert. Notch, das von dem MG11a-Minigen (ein chimäres cDNA/Genomkonstrukt: die von cDNA stammenden Sequenzen sind punktiert, die aus Genomen stammenden Sequenzen sind diagonal schraffiert dargestellt (Ramos et al., 1989, Genetics 123, 337-348)) codiert wird, wurde im Anschluß an die Insertion in dem Metallothionein-Promotorvektor pRmHa-3 exprimiert (Bunch et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061). Delta, das von der Dl1-cDNA codiert wird (Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735), wurde nach Insertion in den gleichen Vektor exprimiert. Die extrazelluläre Notch (ECN1)-Variante wurde von einem genomischen Cosmid, das den vollständigen Notch-Locus enthält (Ramos et al., 1989, Genetics 123, 337-348), durch Weglassen der codierenden Sequenz für die Aminosäuren 1790-2625 aus der intrazellulären Domäne (bezeichnet mit δ; Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581) abgeleitet, wobei 25 Membran-proximale Reste aus der Wildtyp-Sequenz zurückbleiben, die mit einem neuen 59-Aminosäure-Schwanz verschmolzen werden (siehe experimentelle Verfahren, Abschnitt 6.1, infra). Dieses Konstrukt wurde unter der Kontrolle der Notch-Promotorregion exprimiert. Für Konstrukte, die den Metallothionein-Vektor enthalten, wurde die Expression nach der Transfektion mit CuSO4 ausgelöst. Anschließend wurden die Zellen gemischt, unter Aggregationsbedingungen inkubiert und unter Verwendung von spezifischen Antiseren und Immunfluoreszenzmikroskopie zur Sichtbarmachung der exprimierenden Zellen auf ihre Fähigkeit zur Aggregation bewertet. MT, Metallothionein-Promotor; ATG, Translationsstartstelle; Tm, Trans membrandomäne; 3'N, Notch-Gen-Polyadenylierungssignal; 3'Adh, Polyadenylierungssignal aus dem Adh-Gen; 5'N, Notch-Gen-Promotorregion.
  • 2. Expression von Notch und Delta in kultivierten Zellen. (A) Lysate von nicht transfizierten (S2) und Notchtransfizierten (N)-Zellen, ausgelöst mit 0,7 mM CuSO4 während 12-16 h, wurden für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) vorbereitet, auf 3- bis 15%igen Gradientengelen laufen gelassen und auf Nitrocellulose geblottet. Notch wurde unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (Mab C17.9C6) gegen die intrazelluläre Domäne von Notch sichtbar gemacht. Mehrere Banden unterhalb der Hauptbande bei 300 kd können Zersetzungsprodukte von Notch darstellen. (B) Lysate von nicht transfizierten (S2) und Deltatransfizierten (D1) Zellen wurden mit einem monoklonalen Antikörper (Mab 201) gegen Delta sichtbar gemacht. Eine Einzelbande von ca. 105 kd wird nachgewiesen. In beiden Fällen ist in den S2-Zellinien kein endogenes Notch oder Delta nachweisbar. Auch kreuzreaktive Spezies sind nicht vorhanden. Auf jede Spur wurden 10 μl Probe (hergestellt wie unter experimentelle Verfahren beschrieben) aufgegeben.
  • 3. S2-Zellen, die Notch und Delta exprimieren, bilden Aggregate. Auf allen Ansichten ist Notch grün und Delta rot gezeigt.
    • (A) Notch+-Einzelzelle. Zu beachten ist die hervortretende intrazelluläre Anfärbung, einschließlich Vesikelstrukturen, sowie ein offenbar nicht angefärbter Nucleus.
    • (A) Hellfeld-Mikrographie des gleichen Feldes, die die Spezifität der Antikörperanfärbung zeigt.
    • (B) Delta+-Einzelzelle. Die Anfärbung liegt hauptsächlich an der Zelloberfläche vor.
    • (B) Hellfeld-Mikrographie des gleichen Feldes.
    • (C) Aggregat von Delta+-Zellen aus einem 24-h-Aggregationsexperiment. Wiederum ist zu beachten, dass die Anfärbung hauptsächlich an der Zelloberfläche erfolgt.
    • (D)-(F) Aggregat von Notch+- und Delta+-Zellen, das aus einem 1:1-Gemisch von einzeln transfizierten Zellpopulationen gebildet worden ist, die man über Nacht bei Raumtemperatur aggregieren ließ. (D) zeigt die Notch+-Zellen in diesem Aggregat; (E) zeigt die Delta+-Zellen; und (F) ist eine Doppelansicht, die beide Zelltypen zeigt. Banden von Notch und Delta sind an den Kontaktpunkten zwischen Notch+- und Delta+-Zellen deutlich (Pfeile). In (F) erscheinen diese Banden aufgrund des Zusammenfallens von grün und rot an diesen Punkten gelb. Diese offenbar doppelt angefärbte Einzelzelle (*) besteht tatsächlich aus zwei Zellen (übereinander), wobei eine Notch und die andere Delta exprimiert.
    • (G) und (H) confokale Pseudofarbmikrographien von Notch+-Delta+-Zellaggregaten. Zu beachten ist, dass in (G) Ausweitungen (Pfeile), die von mindestens zwei Delta+-Zellen gebildet worden sind, die Notch+-Zellen vollständig in der Mitte des Aggregats einkreisen. (H) zeigt ein aus einem 2-h-Aggregationsexperiment, das bei 4° C durchgeführt wurde, gebildetes Aggregat. Die intensiven Banden von Notch sind in den Regionen des Kontakts mit Delta+-Zellen offensichtlich.
    • (I) Aggregat, bestehend aus Delta+-Zellen und Zellen, die nur die extrazelluläre Domäne von Notch (ECN1-Konstrukt) exprimieren. Maßstab = 10 μm.
  • 4. Notch und Delta sind zu cotransfizierten Zellen assoziiert. Die Anfärbung für Notch ist in der linken Spalte (A, C und E) gezeigt, und diejenige für Delta ist in der rechten Spalte (B, D und F) gezeigt.
    • (A) und (B) S2-Zellen, die sowohl mit Notch- als auch Delta-Konstrukten cotransfiziert wurden. In der Regel bestand zwischen Notch- und Delta-Lokalisierung an der Zelloberfläche eine gute Korrelation (Pfeile).
    • (C) und (D) die cotransfizierten Zellen wurden vor der Fixierung und Anfärbung mit spezifischen Antiseren 1 h bei Raumtemperatur gegenüber polyklonalem Anti-Notch-Antiserum (Verdünnung 1:250 jeweils eines Anti-Extrazellulärdomänen-Antiserums) exponiert. Zu beachten ist die Tüpfel-Anfärbung von Notch und Delta und die Korrelation ihrer entsprechenden Anfärbung (Pfeile).
    • (E) und (F) Zellen, die mit den extrazellulären Notch(ECN1)- und Delta-Konstrukten cotransfiziert und induziert und anschließend unter Verwendung von polyklonalen Anti-Notch-Antiseren zusammengeflickt wurden. Es bestand eine enge Korrelation zwischen ECN1- und Delta-Anfärbung an der Oberfläche, wie für das Notch-Vollängenprotein beobachtet. Maßstab = 10 μm.
  • 5. Immuncopräzipitation, zeigt, dass Delta und Notch in Lysaten aus transfizierten S2- und Drosophila-Embryonenzellen assoziiert sind. Bei sämtlichen Experimenten wurde Delta aus NP-40/Desoxycholat-Lysaten unter Verwendung eines polyklonalen Anti-Delta-Ratten-Antiserums, das mit fixierten Staph-A-Zellen ausgefällt wurde, ausgefällt, und die Proteine in der ausgefällten Fraktion wurden auf Western-Blots sichtbar gemacht (ausführliche Angaben, siehe experimentelle Verfahren). Spuren 1, 2, 3 und 5: Notch, das mit Mab C17.9C6 sichtbar gemacht wurde; Spuren 4 und 6: Delta, das unter Verwendung von Mab 201 sichtbar gemacht wurde.
    • In (A) sind die Spuren 1 und 2 die Kontrollen für diese Experimente. Spur 1 zeigt eine polyklonale Anti-Delta-Immunfällung aus Zellen, die nur Notch exprimieren, die für Notch sichtbar gemacht wurden. In dieser Probe war kein Notch nachweisbar, was zeigte, dass polyklonales Anti-Delta nicht mit Notch kreuzreagiert. Spur 2 zeigt Notch-Delta-cotransfizierte Zellen, die mit Staph-A ohne Anfangsbehandlung mit Anti-Delta-Antiserum immunpräzipitiert und für Notch sichtbar gemacht wurden, was zeigt, dass Notch durch den Staph-A- oder den sekundären Antikörper nicht unspezifisch ausgefällt wird. Spur 3 zeigt ein Protein, das mit Anti-Delta-Antiserum ausgefällt und für Delta (D1) sichtbar gemacht wurde, und Spur 4 zeigt die gleiche Probe, die für Notch (N) sichtbar gemacht wurde. Spur 4 zeigt, dass Notch mit immunpräzipitiertem Delta copräzipitiert. Zu beachten ist, dass Notch als Dublett auftritt, wie es für Notch in Immunfällungen typisch ist.
    • (B) zeigt das gleiche Experiment unter Verwendung von Embryonenlysaten statt transfizierter Zelllysate. Spur 5 zeigt Protein, das mit Anti-Delta-Antiserum ausgefällt und für Delta (D1) sichtbar gemacht wurde, und Spur 6 zeigt die gleiche Probe, die für Notch (N) sichtbar gemacht wurde. Diese Spuren zeigen, dass Notch und Delta in Embryonenlysaten stabil assoziiert sind. Die Banden (in sämtlichen Spuren) unterhalb der Deltabande entstammen Staph-A (SA) und der Anti-Delta-Antiserum-Schwer(H)- und -Leicht(L)-Kette.
  • 6. Notch-Expressionskonstrukte und die Deletionskartierung der Delta/Serrate-Bindungsdomäne. S2-Zellen im log-Phasenwachstum wurden vorübergehend mit der Serie von gezeigten Expressionskonstrukten transfiziert; die Zeichnungen stellen die vorhergesagten Proteinprodukte der verschiedenen erzeugten Notch-Deletionsmutanten dar. Sämtliche Expressionskonstrukte entstammten dem Konstrukt Nr. 1 pMtNMg. Vorübergehend transfizierte Zellen wurden mit Delta-exprimierenden Zellen aus der stabil transformierten Linie L49-6-7 oder mit vorübergehend transfizierten Serrate-exprimierenden Zellen gemischt, mit CuSO4 induziert, unter Aggregationsbedingungen inkubiert und anschließend unter Verwendung von spezifischen Antiseren und Immunfluoreszenzmikroskopie auf ihre Fähigkeit zur Aggregation bewertet.
  • Die Aggregate wurden als Cluster von vier oder mehr Zellen, die sowohl Notch- als auch Delta/Serrate-exprimierende Zellen enthielten, definiert. Die für die Aggregation angegebenen Prozentwerte beziehen sich auf den Prozentgehalt sämtlicher Notch-exprimierender Zellen, die in solchen Clustern entweder mit Delta (D1) (linke Spalte) oder mit Serrate (Ser) (rechte Spalte) festgestellt wurden. Die verschiedenen Notch-Deletionskonstrukte sind diagrammartig mit Spleißlinien gezeigt, die die Ligationsstellen zeigen. Jede EGF-Wiederholungssequenz ist als punktiertes rechteckiges Kästchen gezeigt, und die Anzahl der EGF-Wiederholungssequenzen auf jeder Seite einer Ligationsstelle sind bezeichnet. An den Ligationsstellen werden partielle, durch die verschiedenen Deletionen erzeugte EGF-Wiederholungssequenzen durch freie Kästchen und geschlossene Klammern (siehe beispielsweise Nr. 23 ΔCla+EGF(10-12)) bezeichnet. Die Konstrukte Nr. 3-13 stellen die ClaI-Deletionsserie dar. Wie diagrammartig gezeigt, durchbrechen vier der ClaI-Stellen in den Wiederholungsse quenzen 7, 9, 17 und 26 die Wiederholungssequenz in der Mitte, unmittelbar nach dem dritten Cystein (bezeichnet durch die Wiederholungssequenzen in den freien Kästchen; siehe 7 zur weiteren Erläuterung), während die fünfte und 3' am nächsten gelegene Stelle sauber zwischen den EGF-Wiederholungssequenzen 30 und 31 hindurchbricht (bezeichnet durch die geschlossene Kästchenwiederholungssequenz 31; siehe nochmals 7). In Konstrukt Nr. 15, Split, ist die EGF-Wiederholungssequenz 14, die die Split-Punktmutation trägt, als gestreiftes Kästchen gezeichnet. In Konstrukt Nr. 33, ΔCla+XEGF(10-13), werden die von Xenopus-Notch stammenden EGF-Wiederholungssequenzen von den Drosophila-Wiederholungssequenzen durch ein unterschiedliches Schattierungsmuster unterschieden. SP, Signalpeptid; EGF, Epidermis-Wachstumsfaktor-Wiederholungssequenz; N, Notch/lin-12-Wiederholungssequenz; TM, Transmembrandomäne; cdc10, cdc10/Ankyrin Wiederholungssequenzen; PA, vermeintliche nucleotidbindende Consensus-Sequenz; opa, Polyglutamin-Verlängerung, die opa genannt wird; D1, Delta; Ser, Serrate.
  • 7. Ausführliche Struktur der Notch-Deletionskonstrukte Nr. 19-24: sowohl die EGF-Wiederholungssequenz 11 als auch 12 sind zur Notch-Delta-Aggregation erforderlich. Die EGF-Wiederholungssequenzen 10-13 sind oben diagrammartig abgebildet und zeigen die regelmäßige Beabstandung der sechs Cysteinreste (C). PCR-Produkte, die für diese Konstrukte (Namen und Ziffern sind wie in 7 angegeben) erzeugt worden sind, sind durch die dicken schwarzen Balken dargestellt, und die exakten Endpunkte sind relativ zu den verschiedenen EGF-Wiederholungssequenzen bezeichnet. Die Fähigkeit zur Aggregation mit Delta ist für jedes Konstrukt als (+) oder (–) angegeben. Die PCR-Fragmente durchbrechen entweder die EGF-Wiederholungssequenzen in der Mitte unmittelbar nach dem dritten Cystein an der gleichen Stelle wie vier der fünf ClaI-Stellen oder genau zwischen zwei Wiederholungssequenzen an der gleichen Stelle wie die am meisten C-terminal gelegene ClaI-Stelle.
  • 8. Vergleich der Aminosäuresequenz der EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 von Drosophila- und Xenopus-Notch. Die Aminosäuresequenz der EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 von Drosophila-Notch (Wharton et al., 1985, Cell 43:567-581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6:3094-3108) ist mit derjenigen der beiden gleichen EGF-Wiederholungssequenzen von Xenopus-Notch ausgerichtet (Coffman et al., 1990, Science 249:1438-1441). Identische Aminosäuren sind eingerahmt. Die sechs konservierten Cysteinreste von jeder EGF-Wiederholungssequenz und die übereinstimmenden Ca++-Bindungsreste (Rees et al., 1988, EMBO J. 7:2053-2061) sind mit einem Stern (*) bezeichnet. Die Änderung von Leucin nach Prolin, die im Xenopus-PCR-Klon vorkommt, der nicht zu aggregieren vermag, ist darunter angegeben.
  • 9. Konstrukte, die bei dieser Studie eingesetzt werden. Gezeigt sind schematische Diagramme der Delta-Varianten, die in der Tabelle IV definiert sind. Der extrazelluläre Aminoproximale Terminus ist in jedem Falle links. S, Signalpeptid; "EGF", EGF-artige Motive; M, membranüberspannende Helix; H, Stop-Transfer-Sequenz; durchgezogene Linien, weitere Delta-Sequenzen; schraffierte Linien, Neuroglian-Sequenzen. Die Pfeilspitzen zeigen die Stellen der translatierbaren Linkerinsertionen. Sca, ScaI; Nae, NaeI; Bam, BamHI; Bgl, BglII; ELR, EGF-artige Wiederholungssequenz; Bst, BstEII, Dde, DdeI; Stu, Stuf; NG1-NG5, neurogliane Delta-Chimären.
  • 9A. Abhängigkeit der Aggregation von den DNA-Eingangsmengen. A, heterotypische Aggregation, beobachtet unter Verwendung von S2-Zellpopulationen, die vorübergehend mit variierenden Mengen von pMTDl1-DNA (2, 4, 10 bzw. 20 μg/Platte) transfiziert wurden und anschließend unter Aggregationsbedingungen mit S2-Zellpopulationen, die vorübergehend mit einer konstanten Menge von pMtNMg-DNA (20 μg/Platte) transfiziert wurden, inkubiert wurden. Die angegebenen Daten sind gemittelte Bruchteile (%) von Delta-Zellen in Aggregaten von vier oder mehr Zellen ± Standardabweichung für jede angegebene DNA-Menge (N = 3 Wiederholungen, mit Ausnahme der Eingaben 2 μg und 10 μg für die N = 2). Ein Minimum von 100 Delta-exprimierenden Zellen wurde für jede Wiederholung gezählt. B, homotypische Aggregation, beobachtet unter Verwendung von vorübergehend mit verschiedenen Mengen von pMTDl1-DNA (2, 4, 10 bzw. 20 μg/Platte) transfizierten S2-Zellpopulationen, die anschließend unter Aggregationsbedingungen inkubiert wurden. Die dargestellten Daten sind gemittelte Bruchteile (%) von Delta-Zellen in Aggregaten von vier oder mehr Zellen ± Standardabweichung für jede DNA-Eingabemenge (N = 3 Wiederholungen). Ein Minimum von 500 Delta-exprimierenden Zellen wurde für jede Wiederholung gezählt.
  • 10. Amino-terminale Delta-Serrate-Sequenzausrichtung. Die Reste sind auf der Basis eines Konzepts für die Translation von Delta (D1, obere Sequenz (SEQ-ID-NR. 3); beginnend bei Aminosäure 24, endend bei Aminosäure 226) – und Serrate (Ser, untere Sequenz (SEQ-ID-NR. 4); beginnend bei Aminosäure 85, endend bei Aminosäure 283) – codierenden Sequenzen numeriert. Die vertikalen Linien zwischen den beiden Sequenzen zeigen Reste an, die, wie ausgerichtet, innerhalb der Delta- und Serrate-Sequenzen identisch sind. Punkte stellen Lücken in der Ausrichtung dar. Kästchen umschließen Cystein reste innerhalb der ausgerichteten Regionen. N1, Aminoproximale Domäne 1; N2, Amino-proximale Domäne, 2; N3, Aminoproximale Domäne 3. Translatierbare Insertionen, die mit STU B[Ersatz von Delta-Aminosäure 132 (A) mit GKIFP]- und NAE B[Insertion von RKIF zwischen Delta-Aminosäure 197 und Aminosäure 198]-Konstrukten einhergehen, sind jeweils über der Delta-Wildtyp-Sequenz angegeben.
  • 11. Potentielle Geometrien der Delta-Notch-Wechselwirkungen. A, potentielles Register der Delta(links)- und Notch(rechts)-Moleküle, die zwischen gegenüberliegenden Plasmamembranen Wechselwirken. B, potentielles Register von Delta(links)- und Notch(rechts)-Molekülen, die innerhalb der gleichen Plasmamembranen Wechselwirken. ELR, EGF-artige Wiederholungssequenz; freie Kästchen, EGF-artige Wiederholungssequenzen; gepunktete Kästchen, LNR-Wiederholungssequenzen; durchgezogene Kästchen, Membran-überspannende Helices. Die Amino-terminale Delta-Domäne und die intrazelluläre Delta- und Notch-Domänen sind oval dargestellt.
  • 12. Potentielle Geometrie der Delta-Delta-Wechselwirkungen. A und B, potentielles Register der zwischen gegenüberliegenden Plasmamembranen wechselwirkenden Delta-Moleküle. B, potentielles Register der innerhalb der gleichen Plasmamembranen wechselwirkenden Delta-Moleküle. Freie Kästchen, EGF-artige Wiederholungssequenzen; ausgefüllte Kästchen, Membran-überspannende Helices. Die Amino-terminalen extrazellulären und intrazellulären Delta-Domänen sind oval dargestellt.
  • 13. Primäre Nucleotidsequenz der Delta-cDNA-Dl1 (SEQ-ID-NR. 5) und der Delta-Aminosäuresequenz (SEQ-ID-NR. 6). Gezeigt ist die DNA-Sequenz des 5'-3'-Strangs der Dl1-cDNA, die im Vergleich zu derjenigen, die bei Kopczynski et al. (1988, Genes Dev. 2, 1723-1735) dargestellt ist, eine Reihe von Korrekturen enthält.
  • 14. Primäre Nucleotidsequenz der Neuroglian-cDNA 1B7A-250 (SEQ-ID-NR. 7). D.h. die DNA-Sequenz eines Teils des 5'-3'-Strangs der 1B7A-250-cDNA (A.J. Bieber, pers. Mitt.; Hortch et al., 1990, Neuron 4, 697-709). Nucleotid 2890 entspricht dem ersten Nucleotid eines Isoleucin-Codons, das die Aminosäuren 952 des vorstellungsmäßig translatierten Neuroglian-Langformprote ins codiert.
  • 15. Nucleinsäuresequenzhomologien zwischen Serrate und Delta. Gezeigt ist ein Teil der Drosophila-Serrate-Nucleotidsequenz (SEQ-ID-NR. 8) mit der darunter aufgezeichneten codierten Serrate-Proteinsequenz (SEQ-ID-NR. 9) (Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4, 2188-2201 bei 2193-94). Die vier Regionen, die eine hohe Sequenzhomologie in der Drosophila-Delta-Sequenz zeigen, sind über der Zeile numeriert und mit Klammern gekennzeichnet. Die gesamte Homologie-Region umspannt die Nucleotide Nrn. 627 bis 1290 der Serrate-Nucleotid-Sequenz (Nummerierung, wie in 4 von Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4, 2188-2201).
  • 16. Primer, die bei der Klonierung von humanem Notch für die PCR verwendet werden. Gezeigt ist die Sequenz der drei Primer, die zur Amplifikation von DNA in einer humanen fetalen Gehirn-cDNA-Bibliothek für die PCR verwendet wurden. Die drei Primer, cdc1 (SEQ-ID-NR. 10), cdc2 (SEQ-ID-NR. 11), und cdc3 (SEQ-ID-NR. 12), waren zur Amplifikation entweder eines 200-bp- oder eines 400-bp-Fragments als Primerpaare cdc1/cdc2 bzw. cdc1/cdc3 ausgelegt. I: Inosin.
  • 17: Schematisches Diagramm von humanen Notch-Klonen. Ein schematisches Diagramm von humanen Notch ist gezeigt. Die fett gedruckten Balken unterhalb des Diagramms zeigen den Teil der Notch-Sequenz, der in jedem der vier cDNA-Klone enthalten ist. Die Lokation der bei der PCR verwendeten Primer und ihre Orientierung sind durch Pfeile angegeben.
  • 18. Humane Notch-Sequenzen, die mit Drosophila-Notch-Sequenzen ausgerichtet sind. Die numerierten vertikalen Linien entsprechen den Drosophila-Notch-Koordinaten. Die horizontalen Linien unterhalb jeder Kartierung geben an, wo die Klone relativ zu den Sequenzausdehnungen (dicke horizontale Balken) liegen.
  • 19. Nucleotidsequenzen von humanem Notch, das im Plasmid-cDNA-Klone hN2k enthalten ist. 19A: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 13) eines Teils des humanen Notch-Inserts, ausgehend von der EcoRI-Stelle am 3'-Ende und sich fortsetzend in Richtung 3' bis 5'. 19B: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 14) eines Teils des humanen Notch-Inserts, ausgehend von der EcoRI-Stelle am 5'-Ende und sich fortsetzend in Richtung 5' bis 3'. 19C: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 15) eines Teils des humanen Notch-Inserts, ausgehend von 3' der Sequenz, die in 19B gezeigt ist, und sich fortsetzend in Richtung 5' bis 3'. Die Sequenzen, die gezeigt sind, sind vorläufig und unterliegen noch der Bestätigung durch die Bestimmung der Überlappungssequenzen.
  • 20. Nucleotidsequenzen von humanem Notch, das im Plasmid-cDNA-Klon hN3k enthalten ist. 20A: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 16) eines Teils des humanen Notch-Inserts, ausgehend von der EcoRI-Stelle am 3'-Ende und sich fortsetzend in Richtung 3' bis 5'. 20B: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 17) eines Teils des humanen Notch-Inserts, ausgehend von der EcoRI-Stelle am 5'-Ende und sich fortsetzend in Richtung 5' bis 3'. 20C: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 18) eines Teils des humanen Notch-Inserts, ausgehend von 3' der in 20B gezeigten Sequenz und sich fortsetzend in Richtung 5' bis 3'. 20D: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 19) eines Teils des humanen Notch-Inserts, ausgehend von 5' der in 20A gezeigten Sequenz und sich fortsetzend in Richtung 3' bis 5'. Die gezeigten Sequenzen sind vorläufig und bedürfen noch der Bestätigung durch die Bestimmung der Überlappungssequenzen.
  • 21: Nucleotidsequenzen von humanem Notch, das im Plasmid-cDNA-Klon hN4k enthalten ist. 21A: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 20) eines Teils des humanen Notch-Inserts, beginnend an der EcoRI-Stelle am 5'-Ende und sich fortsetzend in Richtung 5' bis 3'. 21B: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 21) eines Teils des humanen Notch-Inserts, beginnend nahe am 3'-Ende und sich fortsetzend in Richtung 3' bis 5'. Die gezeigten Sequenzen sind vorläufig und bedürfen noch der Bestätigung durch die Bestimmung der Überlappungssequenzen.
  • 22: Nucleotidsequenzen von humanem Notch, das im Plasmid-cDNA-Klon hN5k enthalten ist. 22A: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 22) eines Teils des humanen Notch-Inserts, beginnend an der EcoRI-Stelle am 5'Ende und sich fortsetzend in Richtung 5' bis 3'. 22B: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 23) eines Teils des humanen Notch-Inserts, beginnend nahe am 3'-Ende und sich fortsetzend in Richtung 3' bis 5'. 22C: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 24) eines Teils des humanen Notch-Inserts, begin nend bei 3' der in 22A gezeigten Sequenz und sich fortsetzend in Richtung 5' bis 3'. 22D: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 25) eines Teils des humanen Notch-Inserts, beginnend bei 5' der in 22B gezeigten Sequenz und sich fortsetzend in Richtung 3' nach 5'. Die gezeigten Sequenzen sind vorläufig und bedürfen noch der Bestätigung durch Bestimmung der Überlappungssequenzen.
  • 23. DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 31) und Aminosäure (SEQ-ID-NR. 34)-Sequenzen von humanem Notch, die im Plasmid-cDNA-Klon hN3k enthalten sind.
  • 24. DNA-Sequenz (SEQ-ID-NR. 33) und Aminosäure (SEQ-ID-NR. 34)-Sequenzen von humanem Notch, die im Plasmid-cDNA-Klon hN5k enthalten sind.
  • 25. Vergleich von hN5k mit anderen Notch-Homologen. 25A. Schematische Darstellung von Drosophila-Notch. Angegeben sind die Signalsequenz (Signal), die 36 EGF-artigen Wiederholungssequenzen, die drei Notch/lin-12-Wiederholungssequenzen, die Transmembrandomäne (TM), die sechs CDC10-Wiederholungssequenzen, die OPA-Wiederholungssequenz und die PEST(Prolin, Glutaminsäure, Serin, Threonin)-reiche Region. 25B. Ausrichtung der von hN5k abgeleiteten Aminosäuresequenz mit Sequenzen anderer Notch-Homologen. Die Aminosäuren sind links nummeriert. Die cdc10- und PEST-reichen Regionen sind beide eingerahmt, und einzelne cdc10-Wiederholungen sind markiert. Aminosäuren, die in drei oder mehr Sequenzen identisch sind, sind unterstrichen. Die zur Klonierung von hN5k verwendeten Primer sind unter den Sequenzen angegeben, aus denen sie konstruiert wurden. Die Kern-Lokalisierungssequenz(NLS)-, die Caseinkinase II(CKII)-, und die cdc2-Kinase(cdc2)-Stellen des vermeitlichen CcN-Motivs der Vertebra ten-Notch-Homologe sind eingerahmt. Die mögliche zweiteilige Kern-Bestimmungssequenz (BNTS) und die proximalen Phosphorylierungsstellen von Drosophila-Notch sind ebenfalls eingerahmt.
  • 5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt Nucleotidsequenzen von humanen Notch-Genen und die Aminosäuresequenzen ihrer codierten Proteine bereit. Die Spezifikation beschreibt auch Nucleotidsequenzen von Delta-Genen und die Aminosäuresequenzen ihrer codierten Proteine. Die Spezifikation beschreibt weiterhin Fragmente (hier als "adhäsive Fragmente" bezeichnet) der durch togorhythmische Gene codierten Proteine, die eine homotypische oder heterotypische Bindung an togorhythmische Proteine oder die adhäsiven Fragmente hiervon vermitteln. Togorhythmische Gene, wie hier verwendet, soll die Gene Notch, Delta und Serrate sowie weitere Mitglieder der Delta/Serrate-Familie, die z.B. durch in Abschnitt 5.3, infra, beschriebene Verfahren identifiziert werden können, bezeichnen.
  • Die erfindungsgemäßen Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen und die Antikörper dagegen können zum Nachweis und zur Quantifizierung der mRNA für humane Notch-Moleküle, zum Studium der Expression hiervon, zur Erzeugung von humanen Notch-Sequenzen beim Studium und bei der Manipulation von Differenzierungsprozessen verwendet werden.
  • Zur Klarheit der Beschreibung, jedoch nicht als Einschränkung, wird die folgende ausführliche Beschreibung in die folgenden Unterabschnitte unterteilt:
    • (i) Identifizierung und Sequenzen der toporhythmischen Proteindomänen, die die Bindung an toporhythmische Proteindomänen vermittelt;
    • (ii) Klonierung und Sequenzierung von humanem Notch und Delta;
    • (iii) Identifizierung von weiteren Mitgliedern der Delta/Serrate-Familie;
    • (iv) Expression toporhythmischer Gene;
    • (v) Identifizierung und Reinigung des exprimierten Gen-Produkts; und
    • (vi) Erzeugung von Antikörpern gegen toporhythmische Proteine und die adhäsiven Sequenzen hiervon.
  • 5.1. IDENTIFIZIERUNG UND SEQUENZEN DER TOPORHYTHMISCHEN PROTEINDOMÄNEN, DIE DIE BINDUNG AN TOPORHYTHMISCHE PROTEINDOMÄNEN VERMITTELN
  • Toporhythmische Proteinfragmente, die homo- oder heterotypisches Binden vermitteln (und somit hier als "adhäsiv" bezeichnet werden), und die Nucleinsäuresequenzen, die die Vorgenannten betreffen, sind nachstehend beschrieben. In einem speziellen Beispiel ist das adhäsive Fragment von Notch, das der Teil der Erfindung ist, dasjenige, dass den Teil von Notch enthält, der zu ELR-11 und 12 am meisten homolog ist, das heißt die Aminosäuren Nrn. 447 bis 527 (SEQ-ID-NR. 1) der Drosophila-Notch-Sequenz (siehe 8). Bei einem weiteren speziellen Beispiel ist das adhäsive Fragment von Delta, das die homotypische Bindung vermittelt, dasjenige, das den Teil von Delta enthält, der etwa zu den Aminosäuren Nrn. 32 bis 230 der Drosophila-Delta-Sequenz (SEQ-ID-NR. 6) am meisten homolog ist. Bei noch einem weiteren speziellen Beispiel ist das adhäsive Fragment von Delta, das die Bindung an Notch vermittelt, dasjenige, das den Teil von Delta enthält, der etwa zu den Aminosäuren Nrn. 1-230 der Drosophila-Delta-Sequenz (SEQ-ID-NR. 6) am meisten homolog ist. Bei einem speziellen Beispiel für ein adhäsives Fragment von Serrate ist ein solches Fragment dasjenige, das den Teil von Serrate enthält, der etwa zu den Aminosäuren Nrn. 85-283 oder 79-282 der Drosophila-Serrate-Sequenz (siehe 10 (SEQ-ID-NR. 4) und 15 (SEQ-ID-NR. 9)) am meisten homolog ist.
  • Die Nucleinsäuresequenzen, die toporhythmische adhäsive Domänen codieren, können aus den Quellen Schwein, Rind, Katze, Vogel, Pferd oder Hund sowie Primaten und allen weiteren Spezies isoliert werden, in denen die Homologe bekannter togorhythmischer Gene [einschließlich jedoch nicht begrenzt auf die folgenden Gene (wobei die Veröffentlichung der Sequenzen in Klammern steht): Notch (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581), Delta (Vassin et al., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735; zu beachten sind die Korrekturen der Sequenz von Kopczynski et al., die in 13 hiervon dargestellt sind (SEQ-ID-NR. 5 und SEQ-ID-NR. 6)) und Serrate (Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4, 2188-2201)] identifiziert werden können. Solche Sequenzen können durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die funktionell äquivalente (adhäsive) Moleküle bereitstellen, verändert werden. Aufgrund der Degeneration von Nucleotidcodierenden Sequenzen können andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz codieren wie die adhäsiven Sequenzen, in der Praxis der Erfindung angewandt werden. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Nucleotidsequenzen, die alles oder Teile der Notch-Gene enthalten, die durch Ersatz verschiedener Codons, die einen funktionell äquivalenten Aminosäurerest in der Sequenz codieren, verändert werden und somit eine stumme Änderung erzeu gen. Gleichermaßen umfassen die adhäsiven Proteinfragmente oder die Derivate hiervon diejenigen, die als primäre Aminosäuresequenz alles oder einen Teil der Aminosäuresequenz der adhäsiven Domänen enthalten, die geänderte Sequenzen enthalten, in denen funktionell äquivalente Aminosäurereste in der Sequenz durch Reste ersetzt sind, die zu einer stummen Änderung führen, sie sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispielsweise können ein oder mehrere Aminosäurereste in der Sequenz durch eine andere Aminosäure einer ähnlichen Polarität ersetzt werden, die als funktionelles Äquivalent wirkt, was zu einer stummen Änderung führt. Ersatz-Aminosäuren für eine Aminosäure in der Sequenz können aus anderen Elementen der Klasse, der die Aminosäure angehört, gewählt werden. Beispielsweise umfassen die nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparagin- und Glutaminsäure.
  • Die adhäsiven Fragmente von toporhythmischen Proteinen und Peptiden, die mit toporhythmischen adhäsiven Proteinsequenzen verwandt sind, können z.B. durch die in vitro Aggregationstests, die in den Beispielen hier beschrieben sind, auf die gewünschte Bindungsaktivität gestestet werden. Adhäsive Fragmente von toporhythmischen Proteinen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen Peptide, die im wesentlichen zu den adhäsiven Fragmenten homolog sind, oder diejenigen, deren codierende Nucleinsäure zur Hybridisierung an die Nucleinsäuresequenz in der Lage ist, die die adhäsiven Fragmente codiert, und wobei die Peptide eine positive Bindungsaktivität aufweisen, z.B. wie durch einen Aggregations test, wie in den Beispielen in den Abschnitten, infra, beschrieben, in vitro getestet.
  • Die mit adhäsiven Proteinen verwandten Peptide können durch verschiedene, aus der Technik bekannte Verfahren erzeugt werden. Die Manipulationen, die zu ihrer Herstellung führen, können auf Gen- oder Proteinniveau erfolgen. Beispielsweise kann die klonierte Gensequenz, die adhäsive Proteine codiert, durch zahlreiche, aus der Technik bekannte Strategien (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) modifiziert werden. Die Sequenz kann an entsprechenden Stellen mit Restriktionsendonuklease(n) gespalten und anschließend, falls gewünscht, weiter enzymatisch modifiziert, isoliert und in vitro ligiert werden. Bei der Herstellung des Gens, das ein mit einer adhäsiven Domäne verwandtes Peptid codiert, sollte vorsichtig vorgegangen werden, um den Verbleib des modifizierten Gens im gleichen Translationsleseraster wie das adhäsive Protein, nicht unterbrochen von Translations-Stopsignalen in der Genregion, in der die gewünschte Adhäsionswirkung codiert wird, zu gewährleisten.
  • Zusätzlich kann die codierende adhäsive Nucleinsäuresequenz in vitro oder in vivo unter Erzeugung und/oder Zerstörung von Translations-, Start- und/oder Terminationssequenzen oder unter Erzeugung von Variationen in den codierenden Regionen und/oder unter Bildung neuer Restriktionsendonukleasestellen oder unter Zerstörung bereits existierender Restriktionsendonukleasestellen zur leichteren weiteren in vitro Modifikation mutiert werden. Jedes zur Mutagenese aus der Technik bekannte Verfahren kann angewandt werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, ortsgerichtete in vitro Mutagenese (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem 253, 6551), Verwendung von TAB®-Linkern (Pharmacia), etc.
  • Auch Manipulationen der adhäsiven Sequenz können auf Proteinniveau vorgenommen werden. Toporhythmische Proteinfragmente, Analoge oder Derivate können während oder nach der Translation, z.B. durch Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, proteolytische Spaltung, Verknüpfung mit einem Antikörpermolekül oder einem anderen Zell-Liganden, etc. differenziell modifiziert werden. Jede der zahlreichen chemischen Modifikationen kann durch bekannte Techniken, einschließlich jedoch nicht begrenzt auf, spezifische chemische Spaltung durch Cyanogenbromid, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, V8-Protease, NaBH4; Acetylierung, Formylierung, Oxidation, Reduktion; metabolische Synthese in Gegenwart von Tunicamycin; etc., durchgeführt werden.
  • Zusätzlich können Peptide, die mit den adhäsiven Fragmenten verwandt sind, chemisch synthetisiert werden. Beispielsweise kann ein Peptid, das einem Teil eines toporhythmischen Proteins, das die gewünschte Aggregationswirkung in vitro vermittelt, entspricht, unter Verwendung eines Peptidssynthesegeräts synthetisiert werden.
  • Ein weiteres spezielles, hier beschriebenes Beispiel betrifft Fragmente eines Delta-Proteins, die die Fähigkeit zur Bindung an ein zweites Delta-Protein oder an ein Fragment oder Derivat hiervon besitzen, die jedoch nicht an Notch binden. Ein solches Binden oder dessen Fehlen kann in vitro getestet werden, wie in Abschnitt 8 beschrieben. Beispielsweise, jedoch nicht einschränkend, ist ein solches Delta-Derivat, ein Derivat, das eine Insertion des Tetrapeptids Arg-Lys-Ile-Phe zwi schen den Deltaresten 198 und 199 des Drosophila-Proteins enthält.
  • 5.2. DIE KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG VON HUMANEM NOTCH UND DELTA
  • Die Erfindung betrifft ferner die Aminosäuresequenzen von humanem Notch und von Fragmenten hiervon, die eine Antigen-Determinante enthalten (d.h. sie können durch einen Antikörper erkannt werden) oder die funktionell wirksam sind, sowie Nucleinsäuresequenzen, die die Vorgenannten codieren. Ebenfalls hier beschrieben sind die Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen von Delta und von entsprechenden Fragmenten und Derivaten hiervon. "Funktionell wirksames" Material, wie hier verwendet, bezieht sich auf Material, das eine oder mehrere bekannte funktionelle Wirkungen zeigt, die mit dem Vollängen(Wild-Typ)-Proteinprodukt zusammenhängen, z.B. im Falle von Notch Binden an Delta, Binden an Serrate, Antigenität (Binden an einen Anti-Notch-Antikörper), etc.
  • Bei speziellen Ausführungsformen stellt die Erfindung Fragmente eines humanen Notch-Proteins bereit, bestehend aus mindestens 40 Aminosäuren oder aus mindestens 77 Aminosäuren. Bei anderen Ausführungsformen enthalten oder bestehen die erfindungsgemäßen Proteine im wesentlichen aus der intrazellulären Domäne, der Transmembranregion, der extrazellulären Domäne, der cdc10-Region, den Notch/lin-12-Wiederholungssequenzen oder den EGF-homologen Wiederholungssequenzen oder einer beliebige Kombination der Vorgenannten eines humanen Notch-Proteins. Fragmente oder Proteine, die Fragmente enthalten, denen etwas oder alles der EGF-homologen Wiederholungssequenzen von humanem Notch fehlt, werden ebenfalls bereitgestellt.
  • Bei anderen speziellen Ausführungsformen betrifft die Erfindung zudem Nucleotidsequenzen und Untersequenzen von humanem Notch, bestehend aus mindestens 25 Nucleotiden, mindestens 50 Nucleotiden oder mindestens 121 Nucleotiden. Ebenfalls bereitgestellt werden Nucleinsäuren, die die vorstehend beschriebenen Proteine und Proteinfragmente codieren, sowie Nucleinsäuren, die dazu komplementär sind und an solche Nucleinsäuren zu hybridisieren vermögen. Bei einer Ausführungsform kann eine solche Komplementärsequenz zu einer humanen Notch-cDNA-Sequenz von mindestens 25 Nucleotiden oder von mindestens 121 Nucleotiden komplementär sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung cDNA-Sequenzen, die humanes Notch oder einen Teil hiervon codieren. Bei einem bevorzugten Aspekt betrifft die Erfindung cDNA-Sequenzen, die humanes Notch oder einen Teil hiervon codieren. Bei einer speziellen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Nucleotidsequenz des humanen Notch-Gens oder cDNA, die insbesondere diejenigen Sequenzen, die in den 19, 20, 21 und/oder 22 (SEQ-ID-NR. 13 bis -NR. 25) beschrieben oder in den Plasmiden hN3k, hN4k oder hN5k (siehe Abschnitt 9, infra) enthalten sind, und die codierten Notch-Proteinsequenzen umfaßt. Wie leicht offensichtlich, soll, wie hier verwendet, eine "Nucleinsäure, die ein Fragment oder einen Teil eines Notch-Proteins codiert", so gemeint sein, dass sie sich auf eine Nucleinsäure bezieht, die nur das angegebene Fragment oder den angegebenen Teil des Notch-Proteins und keine weiteren Teile des Notch-Proteins codiert.
  • Bei einem bevorzugten, allerdings nicht einschränkenden Aspekt der Erfindung kann eine humane Notch-DNA-Sequenz durch das in Abschnitt 9, infra, beschriebene Verfahren kloniert und sequenziert werden.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Klonierung von humanem Delta, das als besonderes Beispiel, jedoch nicht als Einschränkung dargestellt ist, ist wie folgt:
    Eine menschliche Expressionsbibliothek wird durch aus der Technik bekannte Verfahren aufgebaut. Beispielsweise wird menschliche mRNA isoliert, cDNA wird hergestellt und in einen Expressionsvektor (z.B. ein Bakteriophagenderivat) so ligiert, dass er in der Lage ist, von der Wirtszelle exprimiert zu werden, in die er anschließend eingeschleust wird. Verschiedene Durchmusterungstests können zur Selektion des exprimierten humanen Delta-Produkts angewandt werden. Bei einer Ausführungsform kann die Selektion auf der Grundlage einer positiven Bindung an die adhäsive Domäne von humanem Notch (das heißt der Teil des humanen Notch, der zu Drosophila ELR-11 und 12 (SEQ-ID-NR. 1) am meisten homolog ist) durchgeführt werden. Bei einer alternativen Ausführungsform können zur Selektion Anti-Delta-Antikörper verwendet werden.
  • Bei einem weiteren bevorzugten Aspekt wird vor der Selektion die PCR zur Amplifikation der gewünschten Sequenz in der Bibliothek angewandt. Beispielsweise können Oligonucleotid-Primer, die Teil der adhäsiven Domänen darstellen, die von einem Homologen des gewünschten Gens codiert werden, als Primer bei der PCR angewandt werden.
  • Die obigen Verfahren sollen die folgende allgemeine Beschreibung der Verfahren, durch die Klone von humanem Notch und Delta erhalten werden können, nicht einschränken.
  • Jede menschliche Zelle kann potentiell als Nucleinsäurequelle für das molekulare Klonieren der Notch- und Delta-Gene die nen. Die DNA kann durch aus der Technik bekannte Standardverfahren aus klonierter DNA (z.B. DNA-"Bibliothek") durch chemische Synthese, cDNA-Klonierung oder durch Klonierung von genomischer DNA oder Fragmenten hiervon, die aus den gewünschten menschlichen Zellen gereinigt werden, erhalten werden (siehe beispielsweise Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Bd. I, II.). Klone, die aus genomischer DNA stammen, können zusätzlich zu den codierenden Regionen Regulator- und Intron-DNA-Regionen enthalten; Klone, die aus cDNA stammen, enthalten nur Exonsequenzen. Gleich welche Quelle, sollten die Gene zur Propagation des Gens molekular in einen geeigneten Vektor kloniert werden.
  • Beim molekularen Klonieren des Gens aus genomischer DNA werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige das gewünschte Gen codieren. Die DNA kann unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme an speziellen Stellen gespalten werden. Alternativ kann DNAse in Gegenwart von Mangan zur Fragmentierung der DNA verwendet werden, oder die DNA kann physikalisch geschert werden, wie beispielsweise durch Ultrabeschallung. Sodann können die linearen DNA-Fragmente der Größe nach durch Standardtechniken, einschließlich jedoch nicht begrenzt auf, Agarose- und Polyacrylamidgelelektrophorese und Säulenchromatographie aufgetrennt werden.
  • Nach Erzeugung der DNA-Fragmente kann die Identifizierung des speziellen DNA-Fragments, das das gewünschte Gen enthält, durch eine Anzahl von Wegen erreicht werden. Wenn beispielsweise eine Menge eines Teils eines Notch- oder Delta (von einer beliebigen Spezies)-Gens oder seiner speziellen DNA oder eines Fragments hiervon, z.B. die adhäsive Domäne, verfügbar ist und gereinigt und markiert werden kann, können die erzeugten DNA-Fragmente durch Nucleinsäurehybridisierung an die markierte Sonde durchmustert werden (Genton, W. und Davis, R., 1977, Science 196, 180; Grunstein, M. und Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961). Es hybridisieren diejenigen DNA-Fragmente mit einer zu der Sonde nennenswerten Homologie. Es ist auch möglich, das entsprechende Fragment durch Restriktionsenzymverdau(ungen) und Vergleich der Fragmentgrößen mit denjenigen, die nach einer bekannten Restriktionskarte erwartet werden, sofern eine solche verfügbar ist, zu identifizieren. Die weitere Selektion kann auf der Grundlage der Eigenschaften des Gens durchgeführt werden. Alternativ kann das Vorliegen des Gens durch Tests auf der Basis der physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften seines exprimierten Produkts nachgewiesen werden. Beispielsweise können cDNA-Klone oder DNA-Klone, die die richtigen mRNAs Hybrid-selektieren, selektiert werden, die ein Protein erzeugen, das z.B. eine ähnliche oder identische elektrophoretische Migration, ein ähnliches oder identisches isoelektrisches Fokussierungsverhalten, ähnliche oder identische proteolytische Abbaumuster, eine ähnliche oder identische in vitro Aggregationsaktivität ("Adhäsionsvermögen") oder ähnliche oder identische Antigen-Eigenschaften, wie sie für Notch oder Delta bekannt sind, aufweist. Wenn ein Antikörper gegen Notch oder Delta verfügbar ist, kann das Notch- oder Delta-Protein durch Binden des markierten Antikörpers an die vermeintlichen Notch- oder Delta-synthetisierenden Klone durch eine Art ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)-Verfahren identifiziert werden.
  • Das Notch- oder Delta-Gen kann auch durch mRNA-Selektion, Nucleinsäurehybridisierung und anschließende in vitro Trans lation identifiziert werden. Bei diesem Verfahren werden die Fragmente zur Isolierung komplementärer mRNAs durch Hybridisierung eingesetzt. Solche DNA-Fragmente können verfügbare, gereinigte Notch- oder Delta-DNA von weiteren Spezies (z.B. Drosophila) darstellen. Eine Immunfällungsananlyse oder Funktionstests (z.B. in vitro Aggregationsvermögen; siehe Beispiele infra) der in vitro Translationsprodukte der isolierten Produkte der isolierten mRNAs identifiziert die mRNA und darum die komplementären DNA-Fragmente, die die gewünschten Sequenzen enthalten. Zusätzlich können spezielle mRNAs durch Adsorption von aus Zellen isolierten Polysomen an immobilisierte Antikörper, die spezifisch gegen Notch- oder Delta-Protein gerichtet sind, selektiert werden. Unter Verwendung der selektierten mRNA (aus den adsorbierten Polysomen) als Templat kann eine radioaktiv markierte Notch- oder Delta-cDNA synthetisiert werden. Die radioaktiv markierte mRNA oder cDNA kann sodann als Sonde zur Identifizierung der Notch- oder Delta-DNA-Fragmente unter anderen genomischen DNA-Fragmenten identifiziert werden.
  • Alternativen zur Isolierung der Notch- oder Delta-Genom-DNA umfassen die chemische Synthese der Gensequenz an sich aus einer bekannten Sequenz oder die Überführung von cDNA in die mRNA, die das Notch- oder Delta-Gen codiert, sie sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispielsweise kann die RNA für die cDNA-Klonierung des Notch- oder Delta-Gens aus Zellen isoliert werden, die Notch oder Delta exprimieren. Weitere Verfahren sind möglich.
  • Anschließend kann das identifizierte und isolierte Gen in einen geeigneten Klonierungsvektor inseriert werden. Eine große Anzahl von Vektor-Wirts-Systemen, die aus der Technik bekannt sind, kann angewandt werden. Mögliche Vektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Plasmide oder modifizierte Viren, jedoch muß das Vektorsystem mit dem verwendeten Wirtszellensystem kompatibel sein. Solche Vektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Bakteriophagen, wie Lambda-Derivate oder Plasmide, wie die Plasmidderivate PBR322 oder pUC. Die Insertion in einen Klonierungsvektor kann beispielsweise durch Ligieren des DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor erreicht werden, der komplementäre klebende Enden aufweist. Wenn allerdings die komplementären, zur Fragmentierung der DNA verwendeten Restriktionsstellen nicht in dem Klonierungsvektor vorhanden sind, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Alternativ kann jede beliebige gewünschte Stelle durch Ligieren von Nucleotidsequenzen (Linker) an die DNA-Termini erzeugt werden; diese ligierten Linker können spezielle chemisch synthetisierte Oligonucleotide enthalten, die Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenzen codieren. Bei einem alternativen Verfahren kann der gespaltene Vektor und das Notch- oder Delta-Gen durch homopolymere Schwanzbildung modifiziert werden. Rekombinante Moleküle können über Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation etc. in Wirtszellen eingeschleust werden, so dass viele Kopien der Gensequenz erzeugt werden.
  • Bei einem alternativen Verfahren kann das gewünschte Gen nach Insertion in einen geeigneten Klonierungsvektor in einem "Schrotschuß"-Versuch identifiziert und isoliert werden. Die Anreicherung mit dem gewünschten Gen, beispielsweise durch Größenfraktionierung, kann vor der Insertion in den Klonierungsvektor erfolgen.
  • Bei speziellen Beispielen gestattet die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, die das isolierte Notch- oder Delta-Gen, cDNA oder synthetisierte DNA- Sequenzen enthalten, die Erzeugung von Mehrfachkopien des Gens. Somit kann das Gen durch Züchten von Transformanten, Isolieren der rekombinanten DNA-Moleküle aus den Transformanten und, wenn notwendig, Zurückgewinnen des inserierten Gens aus der isolierten rekombinanten DNA in großen Mengen isoliert werden.
  • Die erfindungsgemäß bereitgestellten humanen Notch-Sequenzen umfassen diejenigen Nucleotidsequenzen, die im wesentlichen die gleichen Aminosäuresequenzen wie sie in humanem Notch vorkommen codieren, und diejenigen codierten Aminosäuresequenzen mit den funktionell äquivalenten Aminosäuren, alle wie in Abschnitt 5.1 vorstehend für die adhäsiven Teile von toporhythmischen Proteinen beschrieben.
  • 5.3. IDENTIFIZIERUNG ZUSÄTZLICHER ELEMENTE DER DELTA/SERRATE-FAMILIE
  • Eine rationelle Suche nach zusätzlichen Elementen der Delta/Serrate-Genfamilie kann unter Anwendung eines Weges durchgeführt werden, der die Existenz konservierter Segmente einer starker Homologie zwischen Serrate und Delta ausnutzt (siehe 10, SEQ-ID-NR. 3 und -NR. 4). Beispielsweise können zusätzliche Mitglieder dieser Genfamilie durch Selektion aus verschiedenen Nucleinsäuresequenzen derjenigen Sequenzen, die sowohl zu Serrate als auch zu Delta homolog sind (siehe 13 (SEQ-ID-NR. 5) und 15 (SEQ-ID-NR. 8)) und durch weitere Identifizierung unter den selektierten Sequenzen derjenigen Sequenzen, die auch Nucleinsäuresequenzen enthalten, die zu Serrate und Delta nicht homolog sind, identifiziert werden. Der Begriff "nicht homolog" kann so zu verstehen sein, dass eine Region gemeint ist, die mindestens etwa 6 zusammen hängende Nucleotide enthält, in denen sich mindestens etwa 2 Nucleotide von der Serrate- und Delta-Sequenz unterscheiden.
  • Beispielsweise ist ein bevorzugtes Verfahren folgendes: entsprechend zwei konservierten Segmenten zwischen Delta und Serrate, Delta AA 63-73 und Delta AA 195-206 (siehe 13, SEQ-ID-NR. 6), können Serien von degenerierten Oligonucleotidsonden von etwa 10 bis etwa 20 Nucleotiden synthetisiert werden, die sämtliche der möglichen codierenden Sequenzen für die Aminosäuren darstellen, die entweder in Delta oder Serrate für etwa drei bis sieben zusammenhängende Codons gefunden werden. Bei einer anderen Ausführungsform können Oligonucleotide erhalten werden, die den Teilen der vier stark konservierten Regionen zwischen Delta und Serrate, die in 15 gezeigt sind (SEQ-ID-NR. 8 und -NR. 9), das heißt, denjenigen, die durch die Serrate-AA 124-134, 149-158, 214-219 und 250-259 dargestellt sind, entsprechen. Die synthetischen Oligonucleotide können als Primer zur Amplifikation von Sequenzen aus einer Quelle (RNA oder DNA) von potentiellem Interesse durch PCR verwendet werden. (die PCR kann zum Beispiel unter Verwendung eines Cetus-Wärmecyclisergeräts von Perkin Elmer und Taq-Polymerase (Gene AmpTM) durchgeführt werden). Diese könnte mRNA oder cDNA oder genomische DNA aus einer beliebigen eukaryotischen Spezies einschließen, die ein Polypeptid exprimieren könnte, das mit Serrate und Delta eng verwandt ist. Durch die Durchführung der PCR-Reaktionen kann der Nachweis eines Gens oder Genprodukts möglich sein, das Anteile der oben aufgeführten Segmenten der zwischen Serrate und Delta konservierten Sequenz aufweist. Falls die Synthese mehrerer verschiedener degenerierter Primer gewählt wird, kann immer noch die Durchführung einer vollständigen Suche mit einer annehmbar kleinen Anzahl von PCR-Reaktionen möglich sein. Es ist auch möglich, die restriktiven Hybridisierungsbedingun gen, die beim Starten der PCR-Reaktionen angewandt werden, zu verändern, um einen größeren oder kleineren Nucleotidsequenz-Ähnlichkeitsgrad zwischen dem unbekannten Gen und Serrate oder Delta zu ermöglichen. Wenn ein Segment eines bisher unbekannten Gliedes der Serrate/Delta-Genfamilie erfolgreich amplifiziert wird, kann dieses Segment molekular kloniert und sequenziert und als Sonde zur Isolierung einer vollständigen cDNA oder eines genomischen Klons verwendet werden. Dies wiederum gestattet die Bestimmung der vollständigen Nucleotidsequenz des unbekannten Gens, die Analyse seiner Expression und die Herstellung seines Proteinprodukts zur Funktionsanalyse. Auf diese Weise können zusätzliche Gene, die "adhäsive" Proteine codieren, identifiziert werden.
  • Die Serrate/Delta-Sequenzhomologien könnten bei der Konstruktion der neuen rekombinanten Moleküle, die Elemente der Serrate/Delta-Genfamilie sind, allerdings nicht in der Natur vorkommen, verwendet werden. Beispielsweise und uneingeschränkt kann ein rekombinantes Molekül konstruiert werden, das sowohl Teile des Serrate- als auch Delta-Gens enthält. Ein solches Molekül könnte Eigenschaften aufweisen, die sowohl mit Serrate als auch Delta zusammenhängen und ein neues Profil biologischer Aktivitäten aufzeichnen, einschließlich agonistischer sowie antagonistischer Aktivität. Die Primärsequenz von Serrate und Delta kann auch zum Vorhersagen der Tertiärstruktur der Moleküle unter Anwendung einer Computersimulation (Hopp und Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 3824-3828) verwendet werden; rekombinante chimäre Serrate/Delta-Gene könnten im Licht der Korrelationen zwischen Tertiärstruktur und biologischer Funktion konstruiert werden. Gleichermaßen können chimäre Gene, die Teile von einem oder von mehreren Mitgliedern der toporhythmischen Genfamilie (z.B. Notch) enthalten, konstruiert werden.
  • 5.4. DIE EXPRESSION TOPORHYTHMISCHER GENE
  • Die Nucleotidsequenz, die ein adhäsives Fragment eines toporhythmischen Proteins (vorzugsweise Notch, Serrate oder Delta) oder humanes Notch oder Delta oder ein funktionell wirksames Fragment hiervon codiert, kann in einen geeigneten Expressionsvektor, das heißt in einen Vektor, der die notwendigen Elemente zur Transkription und Translation der inserierten Protein-codierenden Sequenzen enthält, eingebaut werden. Die notwendigen Transkriptions- und Translationssignale können auch von dem nativen toporhythmischen Gen und/oder seinen flankierenden Regionen bereitgestellt werden. Eine Vielzahl von Wirt-Vektor-Systemen kann zur Expression der Protein-codierenden Sequenz verwendet werden. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Säuger-Zellsysteme, die Virus-infiziert sind (z.B. Vacciniavirus, Adenovirus, etc.); Insektenzellsysteme, die Virus-infiziert sind (z.B. Baculovirus); Mikroorganismen, wie Hefe, die Hefevektoren enthalten, oder Bakterien, die mit Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert worden sind. Die Expressionselemente von Vektoren variieren in ihren Stärken und Spezifitäten. In Abhängigkeit des eingesetzten Wirt-Vektor-Systems kann jede beliebige Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden. Bei einem speziellen Beispiel wird der adhäsive Teil des Notch-Gens, z.B. die codierenden EGF-artigen Wiederholungssequenzen 11 und 12, exprimiert. Bei einem anderen Beispiel wird der adhäsive Teil des Delta-Gens, das heißt der Teil, der die Aminosäuren 1-230 codiert, exprimiert. Bei weiteren speziellen Beispielen wird dass humane Notch- oder humane Delta-Gen oder eine Sequenz, die einen funktionell wirksamen Teil des humanen Notch oder Delta codiert, exprimiert. Bei noch einem weiteren Beispiel wird der adhäsive Teil des Serrate-Gens exprimiert.
  • Jedes der zuvor zur Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor beschriebenen Verfahren kann zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die ein chimäres Gen enthalten, das aus geeigneten Transkriptions/Translationskontrollsignalen und den Protein-codierenden Sequenzen besteht. Diese Verfahren können in vitro DNA-Rekombinationstechniken und Synthesetechniken und in vivo Rekombinationstechniken (genetische Rekombination) einschließen. Die Expression der Nucleinsäuresequenz, die ein toporhythmisches Protein oder Peptidfragment codiert, kann durch eine zweite Nucleinsäuresequenz reguliert werden, so dass das toporhythmische Protein oder Peptid in einem mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformierten Wirt exprimiert wird. Beispielsweise kann die Expression eines toporhythmischen Proteins durch jedes aus der Technik bekannte Promotor/Enhancer-Element gesteuert werden. Promotoren, die zur Steuerung der toporhythmischen Genexpression verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die frühe SV40-Promotorregion (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290, 304-310), den Promotor, der in der langen terminalen 3'-Wiederholungssequenz des Rous-Sarcomavirus enthalten ist (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22, 787-797), den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 1441-1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens (Brinster et al., 1982, Nature 296, 39-42); prokaryotische Expressionsvektoren, wie der β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 75, 3727-3731), oder der tac-Promotor (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 21-25); siehe auch "Useful Proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242, 74-94; pflanzliche Expressionsvektoren, die die Nopalinsynthetase-Promotorregion enthalten (Herrera-Estrella et al., Nature 303, 209-213), oder den Blumenkohlmosaikvirus-35S-RNA-Promotor (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9, 2871) und den Promotor der Photosyntheseenzym-Ribulosebiphosphatcarboxylase (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310, 115-120); Promotorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen, wie der Gal-4-Promotor, den ADC(Alkoholdehydrogenase)-Promotor, PGK(Phosphoglycerinkinase)-Promotor, den alkalischen Phosphatase-Promotor und die folgenden tierischen Transkriptionskontrollregionen, die Gewebespezifität aufweisen und in transgenen Tieren verwendet werden: die Elastase I-Gen-Kontrollregion, die in azinösen Pankreaszellen wirksam ist (Swift et al., 1984, Cell 38, 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, 399-409; Mac Donald, 1987, Hepatology 7, 425-515); die Insulin-Gen-Kontrollregion, die in pankreatischen β-Zellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315, 115-122), die Immunglobulin-Gen-Kontrollregion, die in Lymphoidzellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38, 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318, 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 1436-1444), die Maus-Säugertumorvirus-Kontrollregion, die in Hoden, Brust, Lymphoid- und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45, 485-495), die Albumingen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes und Devel. 1, 268-276), die Alpha-Fetoproteingen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235, 53-58); die Alpha-1-Antitrypsingen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes und Devel. 1, 161-171), die β-Globin-Kontrollregion, die in Myeloidzellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315, 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46, 89-94); die Myelinbasisproteingen-Kontrollregion, die in Oligodendrocytzellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48, 703-712); die Myosin-Leichtketten-2-Gen-Kontrollregion, die im Skelettmuskel aktiv ist (Sani, 1985, Nature 314, 283-286) und die Gonadotropinfreisetzungshormongen-Kontrollregion, die im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234, 1372-1378).
  • Expressionsvektoren, die toporhythmische Gen-Inserts enthalten, können durch drei allgemeine Möglichkeiten identifiziert werden: (a) Nucleinsäurehybridisierung, (b) An- oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen und (c) Expression von inserierten Sequenzen. Beim ersten Weg kann die Anwesenheit eines in einen Expressionsvektor inserierten Fremdgens durch Nucleinsäurehybridisierung unter Verwendung von Sonden nachgewiesen werden, die Sequenzen enthalten, die zu einem inserierten toporhythmischen Gen homolog sind. Beim zweiten Weg kann das rekombinante Vektor/Wirt-System auf der Basis der An- oder Abwesenheit bestimmter "Marker"-Genfunktionen (z.B. Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegenüber Antibiotika, Transformationsphänotyp, Occlusionskörperbildung in Baculovirus, etc.), die durch Insertion der Fremdgene in den Vektor verursacht werden, identifiziert und selektiert werden. Wenn das toporhythmische Gen beispielsweise in die Marker-Gensequenz des Vektors inseriert wird, können Rekombinanten, die das toporhythmische Inserts enthalten, durch Abwesenheit der Marker-Genfunktion identifiziert werden. Beim dritten Weg können rekombinante Expressionsvektoren durch Testen des von der Rekombinante exprimierten Fremdgenprodukts identifiziert werden. Solche Tests können beispielsweise auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des toporhythmischen Genprodukts in in vitro Testsystemen, z.B. Aggregati ons(Adhäsions)-Fähigkeit (siehe Abschnitte 6-8, infra) beruhen.
  • Ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül wird identifiziert und isoliert, mehrere bekannte Methoden aus der Technik können zu seiner Propagation angewandt werden. Nachdem ein geeignetes Wirtssystem und geeignete Wachstumsbedingungen erstellt worden sind, können rekombinante Expressionsvektoren propagiert und in Mengen hergestellt werden. Wie bereits erläutert, umfassen die Expressionsvektoren, die verwendet werden können, die folgenden Vektoren oder ihre Derivate, sind allerdings nicht darauf beschränkt: humane oder tierische Viren, wie Vacciniavirus oder Adenovirus; Insektenviren, wie Baculovirus; Hefevektoren; Bakteriophagenvektoren (z.B. Lambda), und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige wenige zu nennen.
  • Zusätzlich kann ein Wirtszellenstamm gewählt werden, der die Expression der inserierten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der speziellen gewünschten Weise modifiziert und weiter verarbeitet. Die Expression aus bestimmten Promotoren kann in Gegenwart bestimmter Induktoren gesteigert werden; somit kann die Expression des gentechnisch hergestellten toporhythmischen Proteins kontrolliert werden. Außerdem weisen verschiedene Wirtszellen charakteristische und spezifische Mechanismen zur Translations- und Posttranslationsprozessierung und Modifikation (z.B. Glycosylierung, Spaltung) von Proteinen auf. Geeignete Zellinien oder Wirtssysteme können zur Sicherstellung der gewünschten Modifikation und Prozessierung des exprimierten Fremdproteins gewählt werden. Beispielsweise kann die Expression in einem bakteriellen System zur Erzeugung eines unglycosylierten Kernproteinprodukts angewandt werden. Die Expression in Hefe erzeugt ein glycosy liertes Produkt. Die Expression in Säugerzellen kann zur Sicherstellung einer "nativen" Glycosylierung eines heterologen toporhythmischen Säugerproteins angewandt werden. Außerdem können verschiedene Vektor/Wirtsexpressionssysteme zu verschiedenen Ausmaßen Aufarbeitungsreaktionen, wie proteolytische Spaltungen, bewirken.
  • Bei weiteren speziellen Beispielen kann das adhäsive toporhythmische Protein oder Fragment als Fusionsprotein oder chimäres Proteinprodukt (das das an eine heterologen Proteinsequenz gebundene Protein oder Fragment enthält) exprimiert werden. Ein solches chimäres Produkt kann durch gegenseitige Ligation der entsprechenden Nucleinsäuresequenzen, die die gewünschte Aminosäuresequenz codieren, durch aus der Technik bekannte Verfahren, im richtigen codierenden Leseraster und durch Expression des chimären Produkts durch allgemein aus der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Alternativ kann ein solches chimäres Produkt durch Proteinsynthesetechniken, z.B. Verwendung eines Peptidsynthesegeräts, hergestellt werden.
  • Sowohl die cDNA als auch die Genomsequenzen können kloniert und exprimiert werden.
  • In anderen Beispielen kann eine humane Notch-cDNA-Sequenz chromosomal integriert und exprimiert werden. Aus der Technik bekannte homologe Rekombinationsverfahren können angewandt werden.
  • 5.4.1. IDENTIFIZIERUNG UND REINIGUNG DES EXPRIMIERTEN GENPRODUKTS
  • Nach der Identifizierung einer Rekombinante, die die toporhythmische Gensequenz exprimiert, kann das Genprodukt analysiert werden. Dies kann durch Tests auf der Basis der physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des Produkts, einschließlich radioaktiver Markierung des Produkts, und anschließende Analyse durch Gelelektrophorese erreicht werden.
  • Nach der Identifizierung des toporhythmischen Proteins kann es durch Standardverfahren, einschließlich Chromatographie (z.B. Innenaustausch-, Affinitäts- und Größenausschluß-Säulenchromatographie), Zentrifugation, differenzielle Löslichkeit, oder durch eine andere Standardtechnik zur Reinigung von Proteinen isoliert und gereinigt werden. Die funktionellen Eigenschaften können unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Tests, einschließlich jedoch nicht begrenzt auf, Aggregationstests (siehe Abschnitte 6 bis 8) bewertet werden.
  • 5.5. ERZEUGUNG VON ANTIKÖRPERN GEGEN TOPORHYTHMISCHE PROTEINE UND ADHÄSIVE SEQUENZEN HIERVON
  • Togorhythmische Proteinfragmente, die homo- oder heterotypische Bindung vermitteln, oder humane Notch- oder humane Deltaproteine oder Fragmente hiervon können als Immunogen zur Erzeugung antitoporhythmischer Protein-Antikörper verwendet werden. Solche Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Bei einer speziellen Ausführungsform können Antikörper, die auf die EGF-artigen Wiederholungssequenzen 11 und 12 von Notch spezifisch sind, hergestellt werden. Bei weiteren Ausführungsformen können Antikörper erzeugt werden, die mit dem "adhäsiven Teil" von Delta reaktiv sind. Ein Beispiel für solche Antikörper kann die Aggregation in einem in vitro Test verhindern. Bei einer anderen Ausführungsform werden Antikörper produziert, die auf humanes Notch spezifisch sind.
  • Verschiedene, aus der Technik bekannte Verfahrensweisen können zur Produktion polyklonaler Antikörper gegen ein toporhythmisches Protein oder Peptid verwendet werden. Bei einer speziellen Ausführungsform können polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen ein Epitop des humanen Notch-Proteins, das durch eine in den 19, 20, 21 oder 22 beschriebene Sequenz (SEQ-ID-NR. 13 bis -NR. 25) oder ein Untersequenz hiervon codiert wird, erhalten werden. Zur Antikörper-Produktion können durch Injektion des nativen toporhythmischen Proteins oder einer synthetischen Version oder eines Fragments hiervon verschiedene Wirtstiere, einschließlich jedoch nicht begrenzt auf Kaninchen, Mäuse, Ratten, etc., immunisiert werden. Verschiedene Hilfsstoffe können je nach Wirtsspezies zur Verstärkung der Immunantwort verwendet werden und umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, Freund's Medium (komplett und inkomplett), Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolectin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüssel-Schloß-Schnecken-Hämocyanine, Dinitrophenol, und potentiell für den Menschen nützliche Zusatzstoffe, wie BCG (Calmette-Guerin Bazillus) und Corynebacterium parvum.
  • Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die auf eine toporhythmische Proteinsequenz gerichtet sind, kann jede beliebige Technik, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in Kultur bereitstellt, eingesetzt werden. Beispielsweise die Hybridom-Technik, die ursprünglich von Kohler und Milstein (1975, Nature 256, 495- 497) entwickelt wurde, sowie die Triom-Technik, die menschliche B-Zellen-Hybridom-Technik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72) und die EBV-Hybridom-Technik zur Produktion humaner monoklonaler Antikörper (Cole et al., 1985, in Monoklonal Anitbodies and Cancer Therpy, Alan R. Liss, Inc., Ss. 77-96).
  • Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Beispielsweise umfassen solche Fragmente, sind jedoch nicht beschränkt auf: das F(ab')2-Fragment, das durch Pepsinabbau des Antikörpermoleküls produziert werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')2-Fragments erzeugt werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können.
  • Bei der Produktion von Antikörpern kann die Durchmusterung nach dem gewünschten Antikörper durch aus der Technik bekannte Verfahren, z.B. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), erreicht werden. Beispielsweise können zur Selektion von Antikörpern, die die adhäsive Domäne eines toporhythmischen Proteins erkennen, erzeugte Hybridome für ein Produkt getestet werden, das an ein Proteinfragment bindet, das eine solche Domäne enthält. Zur Selektion eines auf humanes Notch spezifischen Antikörpers kann auf der Grundlage der positiven Bindung an humanes Notch und einer fehlenden Bindung an Drosophila-Notch selektiert werden.
  • Die vorgenannten Antikörper können bei aus der Technik bekannten Verfahren, die die Lokalisierung und Aktivität der erfindungsgemäßen Proteinsequenzen betreffen, angewandt werden. Beispielsweise können verschiedene, aus der Technik be kannte Immuntests angewandt werden, einschließlich jedoch nicht begrenzt auf, kompetitive und nicht kompetitive Testsysteme unter Anwendung von Techniken, wie Radioimmuntests, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) "Sandwich"-Immuntests, Fällungsreaktionen, Geldiffusionsfällungsreaktionen, Immundiffusionstests, Agglutinationstests, Fluoreszenzimmuntests, Protein A-Immuntests und Immunelektrophoresetests, um nur einige wenige zu nennen.
  • 5.6. ABGABE VON AGENTIEN IN NOTCH-EXPRIMIERENDE ZELLEN
  • Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Abgabe von Agentien in Notch-exprimierende Zellen bereit. Wie in Abschnitt 8 infra diskutiert, wird beim Binden an ein Notch-Protein auf der Oberfläche einer Notch-exprimierenden Zelle anscheinend Delta-Protein in die Notch-exprimierende Zelle aufgenommen. Die Abgabe von Agentien in eine Notch-exprimierende Zelle kann erreicht werden durch Konjugation eines Agens an ein Delta-Protein oder ein adhäsives Fragment hiervon, die in der Lage sind, Notch zu binden, und durch Exposition einer Notch-exprimierende Zelle gegenüber dem Konjugat, derart, dass das Konjugat von der Zelle aufgenommen wird, bereit. Das konjugierte Agens kann ein Marker oder ein biologisch aktives Agens sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Das biologisch aktive Agens kann ein Therapeutikum, ein Toxin, ein Chemotherapeutikum, ein Wachstumsfaktor, ein Enzym, ein Hormon, ein Arzneimittel, eine Nucleinsäure (z.B. Antisinn-DNA oder – RNA), etc. sein. Bei einer Ausführungsform kann der Marker ein bilderzeugendes Mittel sein, einschließlich jedoch nicht begrenzt auf, Schwermetall-Kontrastmittel zur Röntgenbilderzeugung, Kernresonanz-Bilderzeugungsmittel und Radionuclide (z.B. Isotope) zur radioaktiven Bilderzeugung. Bei einem be vorzugten Aspekt ist das Agens mit einer Stelle in der aminoterminalen Hälfte des Delta-Moleküls konjugiert.
  • Das Delta-Agens-Konjugat kann durch Exposition der Notch-exprimierenden Zelle gegenüber Zellen, die das Delta-Agens-Konjugat exprimieren, oder durch Exposition der Notch-exprimierenden Zelle gegenüber dem Delta-Agens-Konjugat in einer Lösungssuspension oder in einem anderen Träger an die Notch-exprimierende Zelle abgegeben werden. Bei der Abgabe in vivo kann das Delta-Agens-Konjugat in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsstoff formuliert sein, so dass es eine pharmazeutische Zusammensetzung enthält. Der pharmazeutisch verträgliche Träger kann Salzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung etc. umfassen. Das Delta-Agens-Konjugat kann als Flüssigkeit, Tablette, Pille, Pulver oder in einer Depotform, in einem Liposom, etc. formuliert sein und kann, um einige wenige Wege zu nennen, oral, intravenös, intramuskulär, subkutan, intraperitoneal verabreicht werden, wobei dem Fachmann die bevorzugte Wahl leicht fällt.
  • 6. MOLEKULARE WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN DEN PROTEINPRODUKTEN DER NEUROGENEN LOCI, NOTCH UND DELTA, ZWEI EGF-HOMOLOGE GENE IN DROSOPHILA
  • Zur Überprüfung der Möglichkeit einer intermolekularen Assoziation zwischen den Produkten der Notch- und Delta-Gene studierten wir die Wirkungen ihrer Expression auf die Aggregation in Schneider 2-(S2)-Drosophila-Zellen (Fehon et al., 1990, Cell 61, 523-534). Wir stellen hier den direkten Nachweis der intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta vor und beschreiben ein zur Unterscheidung der Komponenten dieser Wechselwirkung angewandtes Testsystem. Wir zeigen, dass normalerweise nicht klebende Drosophila-S2-Kultur zellen, die Notch exprimieren, spezifisch an Zellen binden, die Delta exprimieren, und dass diese Aggregation Calciumabhängig ist. Obgleich Zellen, die Notch exprimieren, nicht aneinander binden, binden zudem Zellen, die Delta exprimieren, sehr wohl aneinander, was nahe legt, dass Notch und Delta um die Bindung an Delta an der Zelloberfläche konkurrieren können. Wir liefern auch den Beweis, der zeigt, dass Notch und Delta die Detergens-löslichen Komplexe sowohl in Kultur- als auch in Embryozellen bilden, was nahe legt, dass Notch und Delta direkt auf molekularem Niveau in vitro und in vivo Wechselwirken. Unsere Analysen legen nahe, dass Notch- und Deltaproteine an der Zelloberfläche über ihre extrazellulären Domänen Wechselwirken.
  • 6.1. EXPERIMENTELLE VERFAHREN
  • 6.1.1. EXPRESSIONSKONSTRUKTE
  • Für das Notch-Expressionskonstrukt wurde das 6-kb-HpaI-Fragment vom 5'-Ende der Notch-codierenden Sequenz im MgIIa (Ramos et al., 1989, Genetics 123, 337-348) mit glatten Enden in den Metallothionein-Promotorvektor pRmHa-3 ligiert (Bunch, et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061), nachdem der Vektor mit EcoRI geschnitten wurde und die Enden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt wurden (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory)). Es wurde eine einzige, inkorrekt orientierte Transformante isoliert. Anschließend wurde die DNA aus dieser Transformante mit SacI verdaut, und ein resultierendes 3-kb-Fragment wurde isoliert, das das 5'-Ende der Notch-codierenden Sequenz enthielt, die an den Polylinker von pRmHa-3 fusioniert war. Dieses Fragment wurde anschließend in der korrekten Orientierung in die SacI-Stelle von pRmHa-3 ligiert. Die DNA aus diesem Konstrukt wurde unter Entfernung des größten Teils der Notch-Sequenz und des gesamten Adh-Polyadenylierungssignal in pRmHa-3 mit KpnI und XbaI verdaut und an ein 11-kb-KpnI-XbaI-Fragment von MgIIa ligiert, das den Rest der Notch-codierenden Sequenz und die zur Polyadenylierung notwendigen 3'-Sequenzen enthielt. In dem resultierenden, als pMtNMg bezeichneten Konstrukt wird der Metallothionein-Promotor in pRmHa-3 ausgehend 20 Nucleotide stromabwärts von der Translationsstartstelle an die Notch-Sequenzen fusioniert.
  • Für das extrazelluläre Notch-Konstrukt (ECN1) wurde das CosP479BE-Notch-Cosmid (Ramos et al., 1989, Genetics 123, 337-348), das sämtliche, für die normale Notch-Funktion in vivo notwendigen genomischen Notch-Sequenzen enthält, teilweise mit AatII abgebaut. Die Fragment-Enden wurden unter Anwendung der Exonuklease-Aktivität von T4-DNA-Polymerase geglättet (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory)), und anschließend wurden die Fragmente nochmals vollständig mit StuI verdaut. Die resultierenden Fragmente wurden in einem niedrigschmelzenden Agarosegel (SeaPlaque, FMC BioProducts) aufgetrennt, und das größte Fragment wurde ausgeschnitten. Anschließend wurde dieses Fragment an den glatten Enden mit sich selbst ligiert. Dies ergab eine interne Deletion der Notch-codierenden Sequenzen von den Aminosäuren 1790 bis einschließlich 2625 (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581) und eine vorhergesagte Leseraster-Verschiebung, die einen neuen 59-Aminosäure-Carboxyl-Terminus erzeugte. (Die ligierte Verknüpfungsstelle dieses Konstrukts wurde noch nicht durch Sequenzierung überprüft.)
  • Für das Delta-Expressionskonstrukt wurde die Dl1-cDNA (Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735), die das vollständige Codierungsvermögen für Delta enthält, in die EcoRI-Stelle von pRmHa-3 inseriert. Dieses Konstrukt wurde als pMTDl1 bezeichnet.
  • 6.1.2. ANTIKÖRPER HERSTELLUNG
  • Die Hybridom-Zellinien C17.9C6 wurde aus einer Maus erhalten, die mit einem Fusionsprotein auf der Basis eines 2,1-kb-SalI-HindIII-Fragments immunisiert wurde, das die Codierungssequenzen für den größten Teil der intrazellulären Domäne von Notch (Aminosäuren 1791-2504; Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581) enthält. Das Fragment wurde in pUR289 subkloniert (Ruther und Muller-Rill, 1983, EMBO J. 2, 1791-1794) und anschließend als BglII-HindIII-Fragment in den pATH-1-Expressionsvektor transferiert (Dieckmann und Tzagoloff, 1985, J. Biol. Chem. 260, 1513-1520). Das lösliche Fusionsprotein wurde exprimiert, mit 25 % (NH4)2SO4 ausgefällt, in 6 M Harnstoff resuspendiert und durch präparative isoelektrische Fokusierung unter Verwendung eines Rotofor (Bio-Rad) gereinigt (genauere Angaben, siehe Fehon, 1989, Rotofor Review Nr. 7, Bulletin 1518, Richmond, California: Bio-Rad Laboratories).
  • Polyklonale Maus-Antiseren wurden unter Verwendung von vier BstY1-Fragmenten von 0,8 kb (Aminosäuren 237-501: Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581), 1,1 kb (Aminosäuren 501-868), 0,99 kb (Aminosäuren 868-1200) und 1,4 kb (Aminosäuren 1465-1935) Länge, die sich von der fünften EGF-artigen Wiederholungssequenz über Transmembrandomäne erstreckten (Smith und Johnson, 1988, Gene 67, 31-40) und die einzeln Leserasterintern in den entsprechenden pGEX-Expressionsvektor inseriert wurden, gezüchtet. Fusionsproteine wurden an Glutathion- Agaroseperlen (SIGMA) gereinigt. Maus- und Ratten-Antiseren wurden mit 50 % (NH4)2SO4 ausgefällt und in PBS (150 mM NaCl, 14 mM Na2HPO4, 6 mM NaH2PO4) mit 0,02 % NaN3 resuspendiert.
  • Die Hybridom-Zellinie 201 wurde aus einer Maus erhalten, die mit einem Fusionsprotein auf der Basis eines 0,54-kb-ClaI-Fragments immunisiert wurde, das Codierungssequenzen aus der extrazellulären Domäne von Delta enthält (Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735), die in die ClaI-Stelle innerhalb des lacZ-Gens von pUR 288 subkloniert wurde (Ruther und Muller-Hill, 1983, EMBO J. 2, 1791-1794). Dieses Fragment enthält Sequenzen, die von der vierten bis zur neunten EGF-artigen Wiederholungssequenz in Delta verlaufen (Aminosäuren 350-529). Das Fusionsprotein wurde durch Isolierung von Inklusionskörpern hergestellt (Gilmer et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2152-2156); die Inklusionskörper wurden vor der Verwendung bei der Immunisierung in Harnstoff solubilisiert (Carroll und Laughon, 1987, in DNA Cloning, Band III, D.M. Glover, Hrsg. (Oxford: IRL Press), Ss. 89-111).
  • Im Anschluß an die Immunisierung mit Antigen, das aus dem gleichen Fusionsproteinkonstrukt stammte, wurden polyklonale Ratten-Antiseren erhalten. In diesem Fall wurde das Fusionsprotein durch Lyse von IPTG-induzierten Zellen in SDS Laemmli-Puffer (Carroll und Laughon, 1987, in DNA Cloning, Band III, D.M. Glover, Hrsg. (Oxford: IRL Press), Ss. 89-111), Trennung der Proteine durch SDS-PAGE, Ausschneiden der entsprechenden Bande aus dem Gel und Elektroelution des Antigens aus der Gelscheibe zur Verwendung bei der Immunisierung (Harlow und Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory)) hergestellt.
  • 6.1.3. ZELLKULTUR UND TRANSFEKTION
  • Die S2-Zellinie (Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353-365) wurde in M3-Medium (hergestellt von Hazleton Co.), angereichert mit 2,5 mg/ml Bacto-Pepton (Difco), 1 mg/ml TC-Veastolate (Difco), 11 % Wärme-inaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS) (Hyclone) und 100 U/ml Penicillin-100 μg/ml-Streptomycin-0,25 μg/ml Fungizone (Hazleton), gezüchtet. Die in der log-Phase bei ca. 2 × 106 Zellen/ml wachsenden Zellen wurden mit 20 μg DNA-Calciumphosphat-Copräzipitat in 1 ml/5 ml Kultur transfiziert, wie bereits beschrieben (Wigler et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1373-1376), außer dass an Stelle des HEPES-Puffers BES-Puffer (SIGMA) verwendet wurde (Chen und Okayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752). Nach 16-18 h wurden die Zellen in konische Zentrifugenröhrchen übergeführt, bei voller Geschwindigkeit 30s in einer Klinikzentrifuge pelletisiert, einmal mit 1/4 Volumen frischem Komplettmedium gespült, in ihrem ursprünglichen Volumen an Komplettmedium resuspendiert und wieder in den ursprünglichen Kolben übergeführt. Sodann wurden die transfizierten Zellen vor der Induktion 24 h ruhen gelassen.
  • 6.1.4. AGGREGATIONSTEST
  • Die Expression der Notch- und Delta-Metallothionein-Konstrukte wurde durch Zugabe von CuSO4 bis auf 0,7 mM induziert. Die mit dem ECN1-Konstrukt transfizierten Zellen wurden gleichermaßen behandelt. Zwei Typen von Aggregationstests wurden angewandt. Beim ersten Test wurden insgesamt 3 ml Zellen (5 – 10 × 106 Zellen/ml) in einem 25-ml-Erlenmeyerkolben gegeben und bei 40-50 U/min auf einem Rotationsschüttler 24-48 h bei Raumtemperatur rotiert. Für diese Experimente wurden die Zellen 1-4 h nach Beginn der Induktion gemischt, und die Induk tion wurde während der Aggregationsdauer fortgesetzt. Im zweiten Test wurden nach einer Induktion über Nacht (12-16 h) bei Raumtemperatur ca. 0,6 ml Zellen in ein 0,6-ml-Eppendorfröhrchen (es wurde eine kleine Luftblase belassen) gegeben und 1-2 h bei 4 °C vorsichtig hin- und her bewegt. Die Antikörperhemmungs- und die Ca2+-Abhängigkeitsexperimente wurden unter Anwendung des folgenden Tests durchgeführt. Für die Ca2+-Abhängigkeitsexperimente wurden die Zellen zuerst gesammelt und in ausgewogener Salzlösung (BSS) mit 11% FCS (BSS-FCS; FCS wurde gegen 0,9 % NaCl, 5 mM Tris [pH 7,5] dialysiert) oder in Ca2+-freiem BSS-FCS, enthaltend 10 mM EGTA (Snow et al., 1989, Cell 59, 313-323), gespült und anschließend im gleichen Medium bis zum ursprünglichen Volumen resuspendiert. Für die Antikörperexperimente wurden Notch-transfizierte Zellen gesammelt und in M3-Medium gespült und anschließend vor der Aggregation 1 h bei 4 °C in M3-Medium mit einer 1:250-Verdünnung von Immun- oder Vorimmunserum von jeder der vier Mäuse, die mit Fusionsproteine immunisiert worden waren, die Segmente aus der extrazellulären Domäne von Notch enthalten, behandelt (siehe Antikörperherstellung vorstehend).
  • 6.1.5. IMMUNFLUORESZENZ
  • Durch Zentrifugation (3000 U/min, 20 s in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge) wurden Zellen gesammelt und in 0,6-ml-Eppendorf-Röhrchen mit 0,5 ml frisch hergestelltem 2%igen Paraformaldehyd in PBS 10 min bei Raumtemperatur fixiert. Nach der Fixierung wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, zweimal in PBS gespült und 1 h in ersten Antikörpern in PBS mit 0,1% Saponin (SIGMA) und 1 % normalem Ziegenserum (Pocono Rabbit Farm, Canadensis, PA) angefärbt. Die monoklonalen Antikörper-Überstände wurden 1:10 verdünnt, und Maus- oder Rattenseren wurden für diesen Schritt 1:1000 verdünnt. Anschließend wurden die Zellen einmal in PBS gespült und 1 h in spezifischen zweiten Antikörpern (Ziegen-Anti-Maus- und Ziegen-Anti-Ratten-Antikörper, Doppelmarkierungsqualität, Jackson Immunoresearch) in PBS-Saponin-normalem Ziegenserum angefärbt. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen zweimal in PBS gespült und in 90 % Glycerin, 10 % 1 M Tris (pH 8,0) und 0,5 % n-Propylgallat auf Objektträgern fixiert. Die Zellen wurden unter Epifluoreszenz in einem Leitz-Orthoplan-2-Mikroskop betrachtet.
  • Confokale Mikrographien wurden unter Verwendung des an ein Zeiss-Axiovert-Compound-Mikroskop angeschlossenen Bio-Rad MRC-500-Systems aufgenommen. Die Bilder wurden unter Verwendung der BHS- und GHS-Filterserie gesammelt, unter Anwendung des ALIGN-Programms ausgerichtet und unter Anwendung von MERGE übereinandergelegt. Die Fluoreszenz-Ausblutung vom grünen in den roten Kanal wurde unter Anwendung des BLEED-Programms (sämtliche Software wurde von Bio-Rad bereitgestellt) vermindert. Die Fotographien wurden unter Verwendung eines Kodak-Ektar-125-Films direkt vom Computermonitor erhalten.
  • 6.1.6. ZELLLYSATE, IMMUNFÄLLUNGEN UND WESTERN-BLOTS
  • Nichtdenaturierende Detergenslysate von Gewebekultur und Wild-Typ-Canton-S-Embryonen wurden auf Eis in ca. 10 Zellvolumina von Lysepuffer (300 mM NaCl, 50 mM Tris [pH 8,0], 0,5 % NP-40, 0,5 % Desoxycholat, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2) mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Diisopropylfluorphosphat, verdünnt 1:2500, als Proteaseinhibitoren hergestellt. Die Lysate wurden nacheinander unter Verwendung von 18G-, 21G- und 25G-Nadeln, die an 1 cc Tuberkulinspritzen angeschlossen waren, verrieben und sodann 10 min bei 4 °C in einer Mikrozentrifuge bei voller Geschwindigkeit unter Entfernung des unlöslichen Materials zentrifugiert. Die Immunfällung wurde durch Zugabe von ca. 1 μg Antikörper (1-2 μl polyklonales Antiserum) zu 250-500 μl Zelllysat und Inkubation für 1 h bei 4 °C unter Rühren durchgeführt. Zu diesem Gemisch wurden 15 μg Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (Jackson Immunoresearch; diese Antikörper erkannten sowohl Maus- als auch Ratten-IgG) hinzugefügt und 1 h bei 4 °C unter Rühren inkubieren gelassen. Darauf folgt die Zugabe von 100 μl fixierten Staphylococcus Aureus(Staph A)-Bakterien (Zysorbin, Zymed; resuspendiert nach den Anweisungen des Herstellers), die gesammelt, fünfmal in Lysepuffer gewaschen und noch eine weitere Stunde inkubiert wurden. Sodann wurden die Staph-A-Antikörper-Komplexe durch Zentrifugation pelletisiert und dreimal in Lysepuffer und anschließend zweimal für 15 min in Lysepuffer gewaschen. Nach Überführung in ein neues Röhrchen wurde das ausgefällte Material in 50 μl SDS-PAGE-Probenpuffer suspendiert, sofort 10 min gekocht, auf 3- bis 15%igen Gradientengelen laufen gelassen, auf Nitrocellulose geblottet und unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern und HRP-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Zweitantikörpern, wie zuvor beschrieben, nachgewiesen (Johansen et al., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427-2440). Für die auf Western-Bluts verwendeten Zellgesamtproteinproben (2) wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in 10 Zellvolumina Probenpuffer, der 1 mM PMSF enthielt, lysiert und sofort gekocht.
  • 6.2. ERGEBNISSE
  • 6.2.1. DIE EXPRESSION VON NOTCH UND DELTA IN KULTIVIERTEN ZELLEN
  • Zum Nachweis der Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta überprüften wir das Verhalten von Zellen, die diese Proteine an ihren Oberflächen exprimierten, unter Anwendung eines Aggregationstests. Aus mehreren Gründen wählten wir für diese Studien die S2-Zellinien (Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353-365). Erstens sind diese Zellen relativ nicht klebend, wachsen in Suspension und werden bereits bei einem ähnlichen Test zum Studium der Fascilin-III-Funktion eingesetzt (Snow et al, 1989, Cell 59, 313-323). Zweitens sind sie schnell transfizierbar, und ein induzierbarer Metallothionein-Promotorvektor, der zur Expression von exogenen Genen in Drosophila-Kulturzellen konstruiert worden ist, ist verfügbar (Bunch et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061). Drittens exprimieren S2-Zellen aufgrund einer Umlagerung des 5'-Endes der Notch-codierenden Sequenz eine aberrante Notch-Botschaft und kein nachweisbares Notch (siehe nachstehend). Diese Zellen exprimieren auch kein nachweisbares Delta (siehe nachstehend).
  • Schematische Zeichnungen von diesen verwendeten Konstrukten sind in 1 gezeigt (siehe experimentelle Verfahren, Abschnitt 6.1, für genaue Angaben). Zur Expression von Notch in kultivierten Zellen wurde das bei Ramos et al. (1989, Genetics 123, 337-348) beschriebene Notch-Minigen MG11a in den Metallothionein-Promotorvektor pRmHa-3 inseriert (Bunch et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061). Das Delta-Expressionskonstrukt wurde durch Insertion von Dl1-cDNA, die die gesamte codierende Sequenz für Delta aus dem embryonalen Delta-Haupttranskript enthielt, in den gleichen Vektor herge stellt (5.4Z; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735). Ein drittes, als ECN1 für "extrazelluläres Notch 1" bezeichnetes Konstrukt enthält die 5'-Notch-Promotorregion und das 3'-Notch-Polyadenylierungssignal zusammen mit dem Codiervermögen für die extrazellulären transmembranen Regionen des Notch-Gens auf den Genomsequenzen, allerdings fehlen ihm die codierenden Sequenzen für die 835 Aminosäuren der ca. 1000 intrazellulären Aminosäuredomänen. Aufgrund einer vorhergesagten Leserasterverschiebung sind zudem die restlichen 78 Carboxy-terminalen Aminosäurereste durch einen neuen Carboxy-terminalen 59-Aminosäure-Schwanz ersetzt (siehe experimentelle Verfahrensweisen).
  • Für sämtliche Experimente, die in diesem Artikel geschildert sind, wurden Expressionskonstrukte in S2-Zellen transfiziert und vorübergehend, statt in stabile Transformanten, exprimiert. Die Expressionszellen bestanden typischerweise aus 1-5 % der Gesamtzellenpopulation, wie durch Immunfluoreszenzanfärbung bewertet (Daten nicht gezeigt). Ein Western-Blot von nach Transfektion exprimierten Proteinen ist in 2 gezeigt. Nicht transfizierte Zellen exprimieren keine nachweisbaren Konzentrationen von Notch oder Delta. Allerdings sind die Proteine des vorhergesagten scheinbaren Molekulargewichts jeweils unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die auf jedes dieser Proteine spezifisch sind, nach der Transfektion leicht nachweisbar. Im Falle von Notch traten in transfizierten Zellen unterhalb des ca. 300-kd-Volllängenprodukts mehrere Banden auf. Wir wissen noch nicht, ob diese Banden einen Abbau von Notch während der Probenpräparation oder vielleicht Synthese- oder Aufarbeitungs-Zwischenstufen von Notch, die in der Zelle vorhanden sind, darstellen, allerdings haben wir sie in Proben von transfizierten Zellen und von Embryonen reproduzierbar nachgewiesen. Zusätzlich führten wir eine Immun fluoreszenzanfärbung der lebenden transfizierten Zellen mit Antikörpern durch, die für die extrazellulären Domänen von jedem Protein spezifisch waren, um die Zelloberflächen-Expression dieser Proteine zu testen. In jedem Fall fanden wir eine Oberflächenanfärbung, wie für ein Oberflächenantigen erwartet. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse eindeutig, dass die Notch- und Delta-Konstrukte die Expression von Proteinen von erwarteter Größe und subzellulärer Lokalisierung unterstützen.
  • 6.2.2. ZELLEN DIE NOTCH- UND DELTA-AGGREGATE EXPRIMIEREN
  • Um die Vorhersage zu testen, dass Notch und Delta Wechselwirken, erstellten wir einen einfachen Aggregationstest zum Nachweis dieser Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die auf der Oberfläche von S2-Zellen exprimiert werden. Wir nahmen an, dass, wenn Notch und Delta zur Bildung stabiler heterotypischer Komplexe an der Zelloberfläche in der Lage sind, die Zellen, die diese Proteine exprimieren, dann aneinander binden und unter entsprechenden Bedingungen Aggregate bilden könnten. Ein ähnliches Testsystem wurde neuerdings für das Fascilin-III-Protein beschrieben (Snow et al., 1989, Cell 59, 313-323).
  • S2-Zellen im Log-Phasenwachstum wurden getrennt, entweder mit dem Notch- oder Delta-Metallothionein-Promotorkonstrukt, transfiziert. Nach Induktion mit CuSO4 wurden die transfizierten Zellen in gleicher Anzahl gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur aggregieren gelassen (ausführliche Angaben, siehe experimentelle Verfahren, Abschnitt 6.1). Alternativ wurden die Zellen bei einigen Experimenten, die zur Verminderung der metabolischen Aktivität ausgelegt waren, bei 4 °C 1-2 h sachte gemischt. Um zu bestimmen, ob sich Aggregate ge bildet hatten, wurden die Zellen zur Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von Antikörpern, die auf jedes Genprodukt spezifisch waren, und verschieden markierten zweiten Fluoreszenzantikörpern aufgearbeitet. Wie bereits erwähnt, machten exprimierende Zellen in der Regel weniger als 5 der Gesamtzellpopulation aus, da wir transiente statt stabile Transformanten einsetzten. Die restlichen Zellen exprimierten entweder ein gegebenes Protein nicht oder exprimierten auf Niveaus, die zum Nachweis durch Immunfluoreszenzmikroskopie zu gering waren. Als Kontrolle führten wir Aggregationen nur mit einem einzigen Typ von transfizierter Zelle durch.
  • 3 zeigt repräsentative Fotomikrographien aus Aggregationsexperimenten, und Tabelle I stellt die Ergebnisse in numerischer Form dar. Obgleich Notch-exprimierende(Notch+)-Zellen bei unserem Test allein keine Aggregate bilden, ist dies für Delta-exprimierende (Delta+)-Zellen der Fall, wie es aus 3C und Tabelle I hervorgeht.
  • Figure 00600001
  • Die Neigung der Delta+-Zellen zur Aggregation war auch in nicht aggregierten Kontrollproben (Tabelle I) offensichtlich, wo in der Regel Zellcluster von 4-8 Zellen, die wahrscheinlich auf Grund einer Adhärenz zwischen mitotischen Schwesterzellen entstanden, auftraten. Allerdings waren die Cluster nach Inkubation unter Aggregationsbedingungen häufiger (z.B. 19 % Delta+-Zellen in Aggregaten vor der Inkubation vs. 37 % Delta+-Zellen in Aggregaten nach der Inkubation; Experiment 1 in Tabelle I), was anzeigt, dass bei diesem Test die Delta+-Zellen zur Bildung stabiler gegenseitiger Kontakte in der Lage sind. Es ist wichtig zu bemerken, dass, obgleich nicht anfärbende Zellen über 90 % der Zellen in unseren transienten Transfektionen ausmachten, wir sie niemals innerhalb von Aggregaten nachwiesen. In seltenen Fällen haben wir festgestellt, dass nicht färbende Zellen am Rand eines Aggregats auftraten. Aufgrund des allgemeinen Auftretens von schwach anfärbenden Zellen an den Rändern von Aggregaten ist es wahrscheinlich, dass diese anscheinend nicht-exprimierenden Zellen transfiziert wurden, allerdings Konzentrationen an Delta exprimierten, die zum Nachweis durch Immunfluoreszenz unzureichend waren.
  • Im bemerkenswerten Kontrast zu Kontrollexperimenten mit Notch+-Zellen allein ergab die Aggregation von Gemischen von Notch+- und Delta+-Zellen die Bildung von Clustern von bis zu 20 oder mehr Zellen (3D-3H, Tabelle I). Wie Tabelle I zeigt, reichte der Bruchteil der exprimierenden Zellen, die in Clustern von vier oder mehr angefärbten Zellen nach 24 h Aggregation gefunden wurden, von 32-54% in Gemischen von Notch+- und Delta+-Zellen. Dieser Bereich entsprach demjenigen, der für Delta+-Zellen allein (37-40 %) festgestellt wurde, allerdings war er sehr verschieden von dem Bereich für Notch+-Zellen allein (nur 0-5 %). Obwohl einige Cluster, die nur aus Delta+-Zellen bestanden, festgestellt wurden, wurden Notch+-Zellen niemals in Clustern von mehr als vier bis fünf Zellen festgestellt, wenn nicht auch Delta+-Zellen vorhanden waren. Wiederum exprimierten sämtliche Zellen in diesen Clustern entweder Notch oder Delta, obwohl transfizierte Zellen nur einen kleinen Bruchteil der Zellgesamtpopulation ausmachten. Nach 48 h (Tabelle I, Experimente 5 und 6) schien der Aggregationsgrad höher (63-71%), was nahe legt, dass die Aggregation nach 24 h unter diesen Bedingungen noch kein Maximum erreicht hatte. Ferner aggregierten mit Notch- und Delta-Konstrukten cotransfizierte Zellen (so dass sämtliche transfizierten Zellen beide Proteine exprimierten) auf ähnliche Weise unter den gleichen experimentellen Bedingungen.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die bei diesen Experimenten festgestellte Aggregation die Expression von Notch und Delta erfordert und nicht auf der zufälligen Expression eines weiteren wechselwirkenden Proteins in nicht transfizierten S2-Zellen beruht. Wir haben außerdem die Spezifität dieser Wechselwirkung durch zehnfaches Verdünnen von Notch+- und Delta-Zellen mit nicht transfizierten S2-Zellen und Aggregierenlassen 24 h bei Raumtemperatur getestet. Bei diesem Experiment wurden 39 der exprimierenden Zellen in Aggregaten mit anderen exprimierenden Zellen gefunden, obwohl sie weniger als 0,1 der gesamten Zellpopulation ausmachten. Allerdings waren diese Aggregate im Durchschnitt kleiner als diejenigen, die in Standard-Aggregationsexperimenten festgestellt wurden, was nicht überraschend ist. Zusätzlich mischten wir zur Überprüfung der Möglichkeit, dass Notch+-Zellen nicht spezifisch in die Delta+-Aggregate aufgenommen werden, da sie einen einzigen Typ von Protein auf der Zelloberfläche überexprimieren, Delta+-Zellen mit Zellen, die Neuroglian, ein Zelloberflächentransmembranprotein exprimieren (Bieber et al., 1989, Cell 59, 447-460), unter der Kontrolle des Metallothionein-Promotors (dieses Metallothionein-Neuroglian-Konstrukt wurde freundlicherweise von A. Bieber und C. Goodman bereitgestellt). Wir haben keine Neigung der Neuroglian+-Zellen zur Adhäsion an Delta+-Aggregaten festgestellt, was anzeigt, dass die Notch-Delta-Aggregation nicht primär das Ergebnis hoher Proteinexpressionskonzentrationen auf der Zelloberfläche ist.
  • Wir haben durch Überprüfung der Wirkung eines Gemisches von polyklonalen Antiseren, die gegen Fusionsproteine gerichtet waren, die fast die gesamte extrazelluläre Domäne von Notch umspannten, auf die Aggregation auch direkt die Beteiligung von Notch am Aggregationsprozeß überprüft (siehe experimentelle Verfahrensweisen, Abschnitt 6.1). Zur Minimierung der Artefakte, die möglicherweise aufgrund einer metabolischen Reaktion auf das Einflicken von Oberflächenantigenen auftreten, wurden bei diesen Experimenten eine Antikörperbehandlung und der Aggregationstest bei 4 °C durchgeführt. Notch+-Zellen wurden 1 h entweder mit Maus-Vorimmun- oder Maus-Immunserum inkubiert, Delta+-Zellen wurden zugesetzt, und die Aggregation wurde 1-2 h durchgeführt. Obgleich mit Vorimmunserum vorbehandelte Notch+-Zellen mit Delta+-Zellen aggregierten (bei einem von drei Experimenten waren 23 % der Notch+-Zellen in den Notch+-Delta+-Zellaggregaten vorhanden), war dies für die mit Immunserum behandelten Zellen nicht der Fall (nur 2 % der Notch+-Zellen befanden sich in den Aggregaten). Dieses Ergebnis legte nahe, dass die extrazelluläre Domäne von Notch für die Notch+-Delta+-Zellaggregation erforderlich ist, obwohl wir die Möglichkeit nicht ausschließen können, dass die verminderte Aggregation auf den inhibitorischen, sterischen oder mebranstrukturellen Effekten beruht, die aus der Exposition von Notch+-Zellen gegenüber dem Antiserum resultieren.
  • Drei weitere erwähnenswerte Beobachtungen gehen aus 3 hervor. Erstens war, obgleich Delta fast immer nur auf der Zelloberfläche auftrat (3B und 3C), die Notch-Anfärbung immer sowohl auf der Zelloberfläche als auch intrazellulär, häufig assoziiert mit Vesikulärstrukturen (3A), offenkundig. Zweitens haben wir reproduzierbar eine morphologische Differenz zwischen Delta+- und Notch+-Zellen in über Nacht inkubierten Aggregatgemischen festgestellt. Delta+-Zellen wiesen oft lange Ausweitungen auf, die danebenliegende Notch+-Zellen vollständig umgaben, während Notch+-Zellen im Aussehen fast immer abgerundet waren, ohne nennenswerte Cytoplasma-Ausweitungen (3G). Drittens schienen sich Notch und Delta oft in Regionen des Kontakts zwischen Notch+- und Delta+-Zellen zu sammeln und riefen in der Immunfluoreszenzanfärbung eine scharfe Bande hervor (3D-3F). Diese Banden waren in den optischen Abschnitten, die auf dem Confokalmikroskop betrachtet wurden, leicht sichtbar (3H), was zeigt, dass sie nicht bloß auf einem ganz fixierten Artefakt beruhen. Wir haben auch festgestellt, dass sich diese Banden schnell (innerhalb von 2 h des Zellmischens) und bei 4 °C bildeten, was anzeigt, dass ihre Bildung wahrscheinlich nicht vom Zellmetabolismus abhängt. Diese Beobachtungen würden erwartet werden, wenn innerhalb der Regionen des Zellkontakts Notch und Delta aneinander binden und darum immobilisiert werden. Dieses Expressionsmuster steht auch mit demjenigen im Einklang, das für andere Proteine beobachtet wird, die die Zellaggregation vermitteln (Takeichi, 1988, Development 102, 639-655; Snow et al., 1989, Cell 59, 313-323).
  • 6.2.3. DIE NOTCH-DELTA-VERMITTELTE AGGREGATION IST CALCIUMABHÄNGIG
  • Bisherige Studien haben nahe gelegt, dass EGF-artige Wiederholungssequenzen, die eine bestimmte Consensus-Sequenz enthalten, als Calcium (Ca2+)-Bindungsdomänen dienen können (Morita et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5698-5704; Sugo et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5705-5710; Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Handford et al., 1990, EMBO J. 9, 475-480). Für mindestens zwei dieser Proteine, C und C1, wurde die Ca2+-Bindung weiterhin als notwendige Komponente ihrer Wechselwirkungen mit anderen Proteinen nachgewiesen (Villiers et al., 1980, FERS Lett. 117, 289-294; Esmon et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 5548-5553; Johnson, et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 5554-5560). Viele der EGF-homologen Wiederholungssequenzen in Notch und die meisten von diesen in Delta enthalten die notwendige Consensus-Sequenz für die Ca2+-Bindung (Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Stenflo et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 368-372; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735; Handford et al., 1990, EMBO J. 9, 475-480), obwohl bisher nicht bestimmt worden ist, ob diese Proteine tatsächlich Calcium binden oder nicht. Wir haben darum die Fähigkeit von exprimierenden Zellen zur Aggregation in Anwesenheit oder Abwesenheit von Ca2+-Ionen getestet, um zu bestimmen, ob für die Notch-Delta-Aggregation ein Ca2 +-Ionen-Erfordernis besteht. Zur Minimierung möglicher nicht-spezifischer Wirkungen aufgrund der metabolischen Reaktionen auf die Entfernung von Ca2+ wurden diese Experimente bei 4 °C durchgeführt. Kontrollgemische von Notch+- und Delta+-Zellen, die unter Aggregationsbedingungen in einem Ca2+-haltigen Medium bei 4 °C inkubiert wurden, bildeten leicht Aggregate (im Durchschnitt 34 % ± 13 %, Mittelwert ± SD, n = 3; Tabelle II). Im Gegensatz dazu bildeten Zellen, die in dem Medium gemischt wurden, dem Ca2+-Ionen fehlten und das EGTA enthielt, wenig Aggregate (5 % ± 5 %). Diese Ergebnisse zeigen eindeutig eine Abhängigkeit der Notch-Delta-vermittelten Aggregation von exogenem Ca2+ und stehen im deutlichen Gegensatz zu den unlängst veröffentlichten Ergebnissen für die Drosophila-Fascilin-III- und Fascilin-I-Proteine in S2-Zellen (Snow et al., 1989, Cell 59, 313-323; Elkins et al., 1990, J. Cell Biol. 110, 1825-1832), die keine Wirkung der Ca2+-Ionen-Entfernung auf die von einem der beiden Proteine vermittelte Aggregation nachwiesen.
  • Figure 00670001
  • 6.2.4. NOTCH- UND DELTA WECHSELWIRKEN INNERHALB EINER EINZIGEN ZELLE
  • Durch Überprüfen der Verteilung von Notch und Delta in cotransfizierten Zellen haben wir die Frage gestellt, ob Notch und Delta innerhalb der Membran einer Zelle, die beide Proteine exprimiert, assoziiert sind. Wie in den 4A und 4B gezeigt, zeigen diese beiden Proteine an der Oberfläche der cotransfizierten Zellen oft sehr ähnliche Verteilungen. Zum Testen, ob die beobachtete Kolonisierung zufällig war oder eine stabile Wechselwirkung zwischen Notch und Delta darstellte, behandelten wir lebende Zellen mit einem Überschuß an polyklonalem Anti-Notch-Antiserum. Diese Behandlung bewirkte ein "Einflicken" von Notch an der Oberfläche von exprimierenden Zellen in diskreten Flicken, wie durch Immunfluoreszenz nachgewiesen. Es bestand eine distinkte Korrelation zwischen den Verteilungen von Notch und Delta auf den Oberflächen dieser Zellen nach dieser Behandlung (4C und 4D), was anzeigte, dass diese Proteine innerhalb der Membran assoziiert sind. Es ist wichtig anzumerken, dass diese Experimente nicht die Frage behandeln, ob diese Assoziation direkt ist oder über andere Komponenten, wie das Cytoskelett vermittelt wird. Zur Überprüfung der Möglichkeit, dass Delta bei diesem Experiment nicht spezifisch eingeflickt wird, cotransfizierten wir Zellen mit Notch und mit dem zuvor erwähnten Neuroglian-Konstrukt (A. Bieber und C. Goodman, unveröffentlichte Daten) und flickten mit Anti-Notch-Antiseren zusammen. In diesem Fall bestand keine offensichtliche Korrelation zwischen Notch und Neuroglian.
  • 6.2.5. WECHSELWIRKUNGEN MIT DELTA ERFORDERN NICHT DIE INTRAZELLULÄRE DOMÄNE VON NOTCH
  • Zusätzlich zu einer großen extrazellulären Domäne, die EGF-artige Wiederholungssequenzen enthält, weist Notch eine beträchtliche intrazelluläre(IC) Domäne von ca. 940 Aminosäuren auf. Die IC-Domäne enthält eine Phosphorylierungsstelle (Kidd et al., 1989, Genes Dev. 3, 1113-1129), eine vermeintliche Nucleotidbindungsdomäne, eine Polyglutamin-Ausweitung (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108) und Sequenzen, die zu dem Hefe- cdc10-Gen homolog sind, das an der Zellcyclus-Steuerung in Hefe beteiligt ist (Breeden und Nasmyth, 1987, Nature 329, 651-654). Angesichts von Größe und struktureller Komplexität dieser Domäne stellten wir die Frage, ob sie für die Notch-Delta-Wechselwirkungen erforderlich ist. Wir haben darum ein abgeändertes Notch-Konstrukt verwendet, aus dem die codierenden Sequenzen für die ca. 835 Aminosäuren der IC-Domäne, einschließlich sämtlicher vorstehend angemerkter Strukturmerkmale deletiert worden sind (zurück blieben 25 Membran-proximale Aminosäuren und ein neuer 59-Aminosäure-Carboxyl-Terminus; siehe experimentelle Verfahren und 1 wegen weiteren Angaben). Dieses als ECN1 bezeichnete Konstrukt wurde konstitutiv unter der Kontrolle des normalen Notch-Promotors in transfizierten Zellen auf einem Niveau exprimiert, das niedriger war als dasjenige, das für die Metallothionein-Promotorkonstrukte festgestellt wurde, allerdings durch Immunfluoreszenz immer noch leicht nachweisbar war.
  • In den Aggregationstests bildeten Zellen, die das ECN1-Konstrukt exprimierten, reproduzierbar Aggregate mit Delta+-Zellen (31% der ECN1-exprimierenden Zellen befanden sich bei einem von drei Experimenten in Aggregaten; siehe auch 3I), allerdings nicht mit sich selbst (in den Aggregaten nur 4 %), genau wie wir es für Zellen feststellten, die intaktes Notch exprimierten. Wir haben auch scharfe Banden einer ECN1-Anfärbung innerhalb von Regionen des Kontakts mit Delta+-Zellen festgestellt, was wiederum eine Lokalisierung von ECN1 innerhalb von Regionen des Kontakts zwischen den Zellen anzeigt. Zum Test auf Wechselwirkungen innerhalb der Membran wiederholten wir die Oberflächenantigen-Zusammenflick-Experimente unter Verwendung von Zellen, die mit den ECN1- und Delta-Konstrukten cotransfiziert waren. Wie wir für intaktes Notch festgestellt haben, haben wir gefunden, dass, wenn ECN1 unter Verwendung von polyklonalen Antiseren an die extrazelluläre Domäne von Notch angeflickt wurde, ECN1 und Delta die Zelloberfläche besiedelten (4E und 4F). Diese Ergebnisse zeigen, dass die festgestellten Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta innerhalb der Membran den deletierten Teil der IC-Domäne von Notch nicht erfordern und darum wahrscheinlich durch die extrazelluläre Domäne vermittelt werden. Es ist allerdings möglich, dass die verbleibenden Transmembran- oder IC-Domänensequenzen in ECN1 zur Vermittlung von Wechselwirkungen innerhalb einer einzelnen Zelle ausreichen.
  • 6.2.6. NOTCH UND DELTA BILDEN DETERGENS-LÖSLICHE INTERMOLEKULARE KOMPLEXE
  • Zusammen verwenden wir die vorgenannten Ergebnisse, um molekulare Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta zu zeigen, die innerhalb der gleichen Membran und zwischen diesen, auf verschiedenen Zellen exprimierten Proteinen vorhanden sind. Als weiteren Test für solche Wechselwirkungen haben wir die Frage gestellt, ob diese Proteine aus nicht denaturierenden Detergens-Extrakten von Zellen, die Notch und Delta exprimieren, copräzipitiert werden würden. Wenn Notch und Delta einen stabilen intermolekularen Komplex entweder zwischen oder innerhalb der Zellen bilden, dann sollte die Ausfällung beider Proteine aus Zellextrakten unter Verwendung spezifischer Antiseren, die gegen eines dieser Proteine gerichtet sind, möglich sein. Wir führten diese Analyse durch Immunfällung von Delta mit polyklonalen Antiseren aus NP-40/Desoxycholat-Lysaten von Zellen (siehe experimentelle Verfahren), die mit den Notch- und Delta-Konstrukten cotransfiziert wurden, die man über Nacht aggregieren ließ, oder von 0-24 h Wild-Typ-Embryonen durch. Wir waren nicht in der Lage, die umgekehrten Immunfällungen durchzuführen, da es nicht möglich war, unter den Staph-A-Hintergrundbanden unzweideutig eine schwache Delta-Bande zu unterscheiden. Wichtig ist anzumerken, dass wir dieses polyklonale Anti-Delta-Antiserum auf Kreuzreaktivität gegen Notch in Zelllysaten (5A, Spur 1) und durch Immunfluoreszenz (z.B. vergleiche 3D und 3E) testeten und keine Kreuzreaktivität gefunden haben. Nach wiederholtem Waschen zur Entfernung von nichtspezifisch anhaftenden Proteinen testeten wir unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (Mab C17.9C6) gegen Notch auf Western-Blots auf Mitfällung von Notch.
  • Wie 5 zeigt, wiesen wir eine Mitfällung von Notch in Delta-Immunfällungen aus cotransfizierten Zellen und Embryonen nach. Allerdings war die Notch-Mitfällung anscheinend in viel geringeren Mengen vorhanden als Delta und war darum schwer nachzuweisen. Diese Ungleichheit beruht höchstwahrscheinlich auf dem Aufbrechen der Notch-Delta-Komplexe während der Lyse- und Waschschritte des Verfahrens. Es ist allerdings auch möglich, dass diese Ungleichheit eine nicht äquimolare Wechselwirkung zwischen Notch und Delta oder eine stark unterschiedliche Affinität der zum Nachweis dieser Proteine verwendeten Antiseren widerspiegelt. Die Tatsache, dass die Immunfällung von Delta die Mitfällung von Notch bewirkt, stellt einen direkten Beweis dafür dar, dass diese beiden Proteine in transfizierten S2-Zellen und in Embryonenzellen stabile intermolekulare Komplexe bilden.
  • 6.3. DISKUSSION
  • Wir haben die Wechselwirkungen zwischen den Proteinprodukten von zwei der neurogenen Loci, Notch und Delta studiert, um ihre zellulären Funktionen besser zu verstehen. Unter Verwendung eines in vitro-Aggregationstests, der normal nicht adhäsive S2-Zellen einsetzt, zeigten wir, dass Zellen, die Notch und Delta exprimieren, spezifisch aneinander haften. Die Spezifität dieser Wechselwirkung geht aus der Feststellung hervor, dass Notch+-Delta+-Zellaggregate kaum nicht exprimierende Zellen enthielten, obwohl die nicht exprimierenden Zellen die große Mehrheit der gesamten Zellpopulation in diesen Experimenten ausmachten. Wir schlagen vor, dass diese Aggregation durch eine heterotypische Bindung zwischen den extrazellulären Domänen von Notch und Delta, die auf den Oberflächen der exprimierenden Zellen vorhanden sind, vermittelt wird. Im Einklang mit diesem Vorschlag stellen wir fest, dass Antiseren, die gegen die extrazelluläre Domäne von Notch gerichtet sind, die Notch-Delta-vermittelte Aggregation hemmen und dass die Notch-Variante ECN1, der fast die gesamte intrazelluläre Notch-Domäne fehlt, die Aggregation mit Zellen vermitteln kann, die Delta exprimieren. Wir haben auch gefunden, dass Zellen, die nur Delta exprimieren, untereinander aggregieren, während diejenigen, die nur Notch exprimieren, dies nicht tun. Diese Feststellungen legen nahe, dass Delta an einer homotypischen Wechselwirkung teilnehmen kann, wenn es auf ne beneinander liegenden Zelloberflächen vorhanden ist, dass aber Notch unter unseren Testbedingungen dies nicht vermag.
  • Der Vorschlag, dass Notch und Delta an der Zelloberfläche Wechselwirken, wird weiterhin durch drei Beweisführungen gestützt. Erstens stellen wir eine intensive Lokalisierung beider Proteine in Regionen des Kontakts mit Notch+- und Delta+-Zellen fest, was nahe legt, dass Notch und Delta direkt wechselwirken, auch wenn sie in verschiedenen Zellen exprimiert werden. Zweitens siedeln sich Notch und Delta auf der Oberfläche von Zellen an, die beide Proteine exprimieren, was nahe legt, dass diese Proteine innerhalb der Zellmembran Wechselwirken können. Drittens können Notch und Delta aus nicht denaturierenden Detergensextrakten kultivierter Zellen, die beide Proteine exprimieren, sowie aus Extrakten von embryonalen Zellen kopräzipitiert werden. Zusammen stützen diese Ergebnisse sehr stark die Hypothese, dass Notch und Delta bei Expression auf den Oberflächen entweder von gleichen oder verschiedenen Zellen heterotypisch Wechselwirken können.
  • Die zugrunde liegende Basis für die festgestellten genetischen Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta und zwischen Notch und mam (Xu et al., 1990, Genes Dev. 4, 464-475) kann eine Dosis-empfindliche Wechselwirkung zwischen den durch diese Gene codierten Proteinen sein.
  • Zwei Beweisführungen legen nahe, dass die Notch- und Delta-Proteine gleichermaßen in vitro und in vivo funktionieren. Erstens haben die genetischen Analysen ergeben, dass die Stöchiometrie von Notch und Delta für ihre Funktion bei der Entwicklung essentiell ist. Unsere Beobachtungen, dass Notch-Delta- und Delta-Delta-Assoziationen in vitro auftreten können, legen nahe, dass Notch und Delta um die Bindung an Delta konkurrieren können. Somit können Dosis-empfindliche genetische Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta das Ergebnis kompetitiver Bindungswechselwirkungen zwischen ihren Proteinprodukten sein. Zweitens konnten wir unter Anwendung der Immunfällung eine Notch-Delta-Assoziation in Lysaten von kultivierten Zellen und in Lysaten von Drosophila-Embryonen nachweisen. Zusammengenommen legen diese genetischen und biochemischen Analysen nahe, dass Notch und Delta in vivo in einer Weise Wechselwirken, die derjenigen entspricht, die wir auf der Grundlage unserer Aggregationstests vorschlagen.
  • Genetische und molekulare Analysen von Notch haben auch die Möglichkeit aufgezeigt, dass Wechselwirkungen zwischen einzelne Notch-Proteinen vorhanden sein können (Portin, 1975, Genetics 81, 121-133; Kelley et al., 1987, Cell 51, 539-548; Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends Genet. 4, 95-100). In der Tat haben Kidd et al. (1989, Genes Dev. 3, 1113-1129) vorgeschlagen, dass dieses Protein Disulfid-vernetzte Dimere bildet, obwohl dieser Punkt noch nicht exakt bewiesen wurde. Mit oder ohne Bildung kovalenter Vernetzungen könnten solche Wechselwirkungen vermutlich entweder innerhalb einer einzelnen Zelle oder zwischen den Zellen auftreten. Allerdings legt unsere Feststellung, dass Notch+-Zellen nicht homotypisch aggregieren, nahe, dass Notch-Notch-Assoziationen wahrscheinlich innerhalb einer einzelnen Zelle und nicht zwischen Zellen auftreten. Alternativ ist es möglich, dass homotypische Notch-Wechselwirkungen Genprodukte erfordern, die nicht in S2-Zellen exprimiert werden.
  • Die Notch-Delta-Wechselwirkungen, die sich bei unseren Analysen ergeben haben, werden wahrscheinlich durch die extrazellulären Domänen dieser Proteine vermittelt. Aggregationsexperimente unter Verwendung des ECN1-Konstrukts, aus dem fast die gesamte intrazelluläre Domäne von Notch entfernt oder durch in vitro Mutagenese verändert worden ist, bestätigte diese Schlußfolgerung. Weitere Experimente, die ECN1-Delta-Assoziationen innerhalb der Membran auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zum gegenseitigen Zusammenflicken aufzeigen, ergaben, dass diese Wechselwirkungen wahrscheinlich auch durch die extrazelluläre Domänen von Notch und Delta vermittelt werden, obwohl wir in diesem Fall die mögliche Beteiligung der Transmembrandomäne oder des restlichen Teils der intrazellulären Notch-Domäne nicht ausschließen können. Diese Ergebnisse sind besonders im Lichte der Tatsache interessant, dass sowohl Notch als auch Delta innerhalb ihrer extrazellulären Domänen EGF-artige Wiederholungssequenzen aufweisen (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6, 3094-3108; Vassin et al., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735).
  • Ein zweiter interessanter Punkt im Hinblick auf die EGF-Domänen ist der Vorschlag, dass diese als Ca2+-bindende Domänen dienen können, wenn sie in den konservierten Positionen innerhalb der EGF-artigen Wiederholungssequenzen eine Consensus-Sequenz, bestehend aus Asp-, Asp/Asn-, Asp/Asn- und Tyr/Phe-Resten, enthalten (Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Handford et al., 1990, EMBO J. 9, 475-480).
  • Vergleiche mit einer vorgeschlagenen Consensus-Sequenz für die Ca2+-Bindung haben ergeben, dass ähnliche Sequenzen in vielen der EGF-artigen Wiederholungssequenzen von Notch (Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061) und innerhalb der meisten der EGF-artigen Wiederholungssequenzen von Delta vorkommen (Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735). Außerdem haben Sequenzanalysen der Notch-Mutationen gezeigt, dass be stimmte Ax-Allele mit Änderungen in den Aminosäuren innerhalb dieser vermeintlichen Ca2+-Bindungsdomäne einhergehen (Kelley et al., 1987, Cell 51, 539-548; Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417; Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061). Beispielsweise ändert die AxE2-Mutation, die mit einer His-nach-Tyr-Änderung in der 29. EGF-artigen Wiederholungssequenz einhergeht, anscheinend diese Wiederholungssequenz in Richtung des Consensus für eine Ca2+-Bindung. Umgekehrt ändert die Ax9B2-Mutation als Ergebnis einer Asp-nach-Val-Änderung die 24. EGF-artige Wiederholungssequenz anscheinend in einer diesem Consensus entgegengesetzten Richtung. Somit lassen die genetischen Wechselwirkungen zwischen Ax-Allelen und Delta-Mutationen (Xu et al., 1990, Genes Dev., 4, 464-475) die Möglichkeit entstehen, dass Ca2+-Ionen bei den Notch-Delta-Wechselwirkungen eine Rolle spielen. Unsere Feststellung, dass exogenes Ca2+ für die Notch-Delta-vermittelte Aggregation transfizierter S2-Zellen notwendig ist, stützt diese Behauptung.
  • Wie wir auf der Grundlage der bisherigen molekularen und genetischen Analysen argumentiert haben (Johansen et al., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427-2440; Alton et al., 1989, Dev. Genet. 10, 261-272), konnte man die zelluläre Funktion entweder von Notch oder Delta über ihre Beteiligung an Zell-Zell-Wechselwirkungen hinaus nicht mit Sicherheit vorhersagen. Angesichts der vier dargestellten Ergebnisse ist allerdings nun anscheinend der Vorschlag begründet, dass Notch und Delta in vivo zur Vermittlung adhäsiver Wechselwirkungen zwischen den Zellen funktionieren können. Gleichzeitig ist es recht wahrscheinlich, dass die festgestellten Notch-Delta-Wechselwirkungen keine ausschließlich adhäsive Funktion, sondern zusätzlich Rezeptor-Liganden-Bindungswechselwirkungen Wiederspiegeln können, die in vivo auftreten. In der Tat kann das Vorliegen einer strukturell komplexen intrazellulären 1000-Aminosäuredomäne in Notch mehr mit einer Rolle bei der Signaltransduktion als mit rein adhäsiven Wechselwirkungen im Einklang stehen. Unter der Annahme, dass Notch zusammen mit Delta eine adhäsive Funktion aufweisen kann, kann die axonale Expression von Notch in der Axon-Lenkung eine gewisse Rolle spielen.
  • 7. DIE EGF-WIEDERHOLUNGSSEQUENZEN 11 UND 12 VON NOTCH SIND ZUR NOTCH-DELTA-VERMITTELTEN AGGREGATION ERFORDERLICH UND AUSREICHEND
  • Bei dieser Studie verwenden wir den gleichen Aggregationstest, wie in Abschnitt 6 beschrieben, zusammen mit Deletionsmutanten von Notch zur Identifizierung von Regionen innerhalb der extrazellulären Domäne von Notch, die für die Wechselwirkungen mit Delta notwendig sind. Wir liefern den Beweis, dass die EGF-Wiederholungssequenzen von Notch direkt an dieser Wechselwirkung beteiligt sind und dass anscheinend nur zwei der 36 EGF-Wiederholungssequenzen notwendig sind. Wir zeigen, dass diese zwei EGF-Wiederholungssequenzen zur Bindung an Delta ausreichen und dass die Calciumabhängigkeit der Notch-Delta-vermittelten Aggregation auch mit diesen beiden Wiederholungssequenzen zusammenhängt. Schließlich vermitteln auch die beiden entsprechenden EGF-Wiederholungssequenzen aus dem Xenopus-Homologen von Notch die Aggregation mit Delta, was nahe legt, dass nicht nur die Struktur von Notch, sondern auch seine Funktion evolutionär konserviert worden ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die extrazelluläre Domäne von Notch überraschenderweise modular ist und zusätzlich zu Delta potentiell eine Vielzahl von Proteinen binden könnte.
  • 7.1. EXPERIMENTELLE VERFAHREN
  • 7.1.1. EXPRESSIONSKONSTRUKTE
  • Die beschriebenen Konstrukte sind sämtliche Derivate des Notch-Volllängen-Expressionskonstrukts Nr. 1, pMtNMg (siehe Abschnitt 6, supra). Sämtliche Ligationen wurden unter Verwendung von DNA-Fragmenten durchgeführt, die aus niedrigschmelzenden Agarosegelen (Sea Plaque, FMC BioProducts) ausgeschnitten wurden. Das 6-kb-EcoRI-XhoI-Fragment aus pMtNMg, das die gesamte extrazelluläre Domäne von Notch enthält, wurde in die EcoRI-XhoI-Stellen des Bluescript-Vektors (Stratagene) ligiert und als RI/XBS bezeichnet. An diesem Subklon wurden sämtliche anschließenden Deletionen und Insertionen von EGF-Wiederholungssequenzen durchgeführt. Die Notch-Sequenz, die das EcoRI-XhoI-Fragment dieser RI/XBS-Derivate enthielt, wurde anschließend mit dem 5,5-kb-XhoI-XbaI-Fragment aus pMtNMg vermischt, das die intrazelluläre Domäne und die 3'-Sequenzen enthielt, die zur Polyadenylierung notwendig waren, und anschließend in einer Dreiteile-Ligation in die EcoRI-XbaI-Stelle von pRMHa-3 inseriert (Bunch et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061). Alle folgenden Zahlen beziehen sich auf die Nucleotidkoordinaten der Notch-Sequenz nach Wharton et al., (1985, Cell 43, 567-581).
  • Für das Konstrukt Nr. 2, DSph, wurde RI/XBS vollständig mit SphI abgebaut und anschließend rezirkularisiert, was eine Leseraster-interne 3,5-kb-Deletion von SphI(996) nach SphI(4545) ergab.
  • Für das Konstrukt Nr. 3, ΔCla, wurde RI/XBS vollständig mit ClaI abgebaut und anschließend unter Erzeugung einer Leseraster-internen 2,7-kb-Deletion von ClaI(1668) nach ClaI(4407) religiert. Die Ligationsverknüpfungsstelle wurde durch Doppelstrang-Sequenzierung (wie beschrieben von Xu et al., 1990, Genes Dev. 4, 464-475) unter Verwendung des Sequenase-Kit (U.S. Biochemical Corp., Cleveland) überprüft. Wir haben festgestellt, dass obwohl die ClaI-Stelle je nach Sequenz in Position 4566 existiert, sie unter unseren Bedingungen nicht durch das ClaI-Restriktionsenzym erkannt wurde.
  • Für die Konstrukte Nr. 4-12 wurde RI/XBS teilweise mit ClaI abgebaut und sodann unter Erzeugung sämtlicher möglicher Leseraster-interner Kombinationen von Deletionen religiert: Konstrukt Nr. 4, ΔEGF7-17, entfernte die Sequenz zwischen ClaI(1668) und ClaI(2820); Konstrukt Nr. 5, ΔEGF9-26, entfernte die Sequenz zwischen ClaI(1905) und ClaI(3855); Konstrukt Nr. 6, ΔEGF17-31, entfernte die Sequenz zwischen ClaI(2820) und ClaI(4407); Konstrukt Nr. 7, ΔEGF7-9, entfernte die Sequenz zwischen ClaI(1668) und ClaI(1905); Konstrukt Nr. 8, ΔEGF9-17, entfernte die Sequenz zwischen ClaI(1905) und ClaI(2820); Konstrukt Nr. 9, ΔEGF17-26, entfernte die Sequenz zwischen ClaI(2820) und ClaI(3855); Konstrukt Nr. 10, ΔEGF26-30, entfernte die Sequenz zwischen ClaI(3855) und ClaI(4407); Konstrukt Nr. 11, ΔEGF9-30, entfernte die Sequenz zwischen ClaI(1905) und ClaI(4407); Konstrukt Nr. 12, ΔEGF7-26, entfernte die Sequenz zwischen ClaI(1668) und ClaI(3855).
  • Für die Konstrukte Nr. 13, ΔCla+EGF9-17 und NR. 14, ΔCla+EGF17-26, wurde das ca. 0,9-kb-Fragment zwischen ClaI(1905) und ClaI(2820) bzw. das ca. 1,0-kb-Fragment zwischen ClaI(2820) und ClaI(3855) in die einzigartige ClaI-Stelle des Konstrukt Nr. 3, ΔCla, inseriert.
  • Für das Konstrukt Nr. 16, Split, wurde das 11-kb-KpnI/XbaI-Fragment von pMtNMg mit dem entsprechenden KpnI/XbaI-Fragment aus einem Notch-Minigen-Konstrukt, das die Split-Mutation in der EGF-Wiederholungssequenz 14 enthielt, ersetzt.
  • Für die Konstrukte Nr. 17-25 wurden zur Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Amplifikation von Strecken von EGF-Wiederholungssequenzen synthetische Primer konstruiert, während die EGF-Wiederholungssequenzen an den Enden des amplifizierten Stücks an der gleichen Stelle wie die üblichen ClaI-Stellen, unmittelbar nach dem dritten Cystein der Wiederholungssequenz, einbrechen (siehe 7). Die PCR-Produkte wurden wie üblich Gel-gereinigt und in die ClaI-Stelle des Konstrukts Nr. 3, ΔCla, ligiert, das durch Auffüllen mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I geglättet wurde (Maniatis et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Die korrekte Orientierung der Inserts wurde durch PCR unter Verwendung eines Sinnstrang-Primers in dem Insert zusammen mit einem Antisinnstrang-Primer in der EGF-Wiederholungssequenz 35 bestimmt. Sämtliche Primer waren 20mere und wurden mit der Nummer des Nucleotids an ihrem 5'-Ende nach den Nucleotidkoordinaten der Notch-Sequenz bei Wharton et al. (1985, Cell 43, 567-581) benannt, und S bezieht sich auf einen Sinnstrang-Primer, während sich A auf einen Antisinnstrang-Primer bezieht. Das Konstrukt Nr. 16, ΔCla+EGF(9-13), verwendete die Primer S1917 und A2367. Das Konstrukt Nr. 17, ΔCla+EGF(11-15), verwendete die Primer S2141 und A2591. Das Konstrukt Nr. 18, ΔCla+EGF(13-17), verwendete die Primer S2375 und A2819. Das Konstrukt Nr. 19, ΔCla+EGF(10-13), verwendete die Primer S2018 und A2367. Das Konstrukt Nr. 20, ΔCla+EGF(11-13), verwendete die Primer S2141 und A2367. Das Konstrukt Nr. 21, ΔCla+EGF(10-12), verwendete die Primer S2018 und A2015. Das Konstrukt Nr. 22, ACla+EGF(10-11), verwendete die Primer S2018 und A2322. Das Konstrukt Nr. 23, ΔCla+EGF(10-12), verwendete die Primer S2018 und A2322. Das Konstrukt Nr. 24, ΔCla+EGF(11-12), verwendete die Primer S2081 und A2322.
  • Für das Konstrukt Nr. 25, ΔEGF, wurde das Konstrukt R1/XBS mit SphI(996) vollständig und mit BamHI(5135) teilweise abgebaut. Die resultierenden inkompatiblen Enden wurden unter Verwendung eines synthetischen Linkers, der zur Erzeugung einer einzigartigen ClaI-Stelle erzeugt wurde, verknüpft. Dies erzeugte eine Leseraster-interne Deletion, die sämtliche 36 EGF-Wiederholungssequenzen mit Ausnahme der ersten Hälfte der Wiederholungssequenz 1 entfernte. Für die Konstrukte Nr. 26-29 wurden die EGF-Fragmente in diese ClaI-Stelle, wie zuvor für die entsprechenden Konstrukte Nr. 13, 16, 19 und 23 beschrieben, inseriert.
  • Für das Konstrukt Nr. 30, ΔECN, wurde das Konstrukt R1/XBS mit BglI, EcoRI und XhoI vollständig abgebaut. Das ca. 0,2-kb-EcoRI-BglI-Fragment (722-948) und die ca. 0,7-kb-BglI-XhoI (5873-6627)-Fragmente wurden mit dem EcoRI-XhoI-geschnittenen Bluescriptvektor und einem synthetischen Linker, der zur Erzeugung einer einzigartigen ClaI-Stelle konstruiert war, ligiert, was eine Leseraster-interne Deletion von BglI(941) zu BglI(5873) ergab, die sämtliche 36 EGF-Wiederholungssequenzen mit der Ausnahme des ersten Drittels der Wiederholungssequenz 1 sowie der 3 Notch/lin-12-Wiederholungssequenzen entfernte. Für die Konstrukte Nr. 31 und 32 wurden die EGF-Fragmente, wie zuvor für die Konstrukte Nr. 19 und 23 beschrieben, in die einzigartige ClaI-Stelle inseriert.
  • Für die Konstrukte Nr. 33 und 34 wurden die PCR-Primer S1508 und A1859 auf der Basis der Xenopus-Notch-Sequenz (Coffman et al., 1990, Science 249, 1438-1441; die Zahlen beziehen sich auf die in diesem Artikel verwendeten Nucleotidkoordinaten) zur Amplifikation der EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 aus einer Stadium 17-Xenopus-cDNA-Bibliothek verwendet (die Bibliothek wurde von D. Melton erstellt und freundlicherweise von M. Danilchek zur Verfügung gestellt). Das Fragment wurde in das Konstrukt Nr. 3 DCla ligiert und sequenziert.
  • 7.1.2. ZELLKULTUR UND TRANSFEKTION
  • Die Drosophila-S2-Zellinie wurde wie in Abschnitt 6, supra beschrieben, gezüchtet und transfiziert. Die Delta-exprimierende stabil transformierte S2-Zellinie L-49-6-7 (freundlicherweise erstellt von L. Cherbas) wurde in M3-Medium (hergestellt von Hazleton Co.), angereichert mit 11 % Hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (FCS) (Hyclone), 100 U/ml Penizillin-100 μg/ml Streptomycin-0,25 μg/ml Fungizone (Hazleton), 2 × 10–7-M-Methotrexat, 0,1 mM Hypoxanthin und 0,016 mM Thymidin, gezüchtet.
  • 7.1.3. AGGREGATIONSTESTS UND IMMUNFLUORESZENZ
  • Die Aggregationstests und die Ca++-Abhängigkeitsexperimente waren wie supra, Abschnitt 6, beschrieben. Die Zellen wurden mit dem monoklonalen Anti-Notch-Antikörper 9C6.C17 und polyklonalen Anti-Delta-Ratten-Antiseren (ausführliche Angaben in Abschnitt 6, supra) angefärbt. Die Oberflächenexpression von Notch-Konstrukten in nicht durchlässig gemachten Zellen wurden unter Verwendung von polyklonalen Ratten-Antiseren, die gegen das 0,8-kb(Aminosäuren 237-501; Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581)-BstYI-Fragment aus der extrazellulä ren Domäne von Notch gezüchtet wurden, getestet. Die Zellen wurden unter Epifluoreszenz auf einem Leitz-Orthoplan-2-Mikroskop betrachtet.
  • 7.2. ERGEBNISSE
  • 7.2.1. EGF-WIEDERHOLUNGSSEQUENZEN 11 UND 12 VON NOTCH SIND ZUR NOTCH-DELTA-VERMITTELTEN AGGREGATION ERFORDERLICH
  • Wir haben eine ausgedehnte Deletionsanalyse der extrazellulären Domäne des Notch-Proteins vorgenommen, von dem wir gezeigt haben (supra, Abschnitt 6), dass es an den Notch-Delta-Wechselwirkungen beteiligt ist, um die exakte Domäne von Notch zu identifizieren, die diese Wechselwirkungen vermittelt. Wir testeten die Fähigkeit von Zellen, die mit den verschiedenen Deletionskonstrukten transfiziert worden waren, zur Wechselwirkung mit Delta unter Anwendung des in Abschnitt 6 beschriebenen Aggregationstests. Kurz gesagt, wurden Notch-Deletionskonstrukte vorübergehend in Drosophila-S2-Zellen transfiziert, die mit CuSO4 induziert worden waren, und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur mit einer kleinen Menge an Zellen aus der stabil transformierten Delta-exprimierenden Zelllinie L49-6-7(Cherbas) aggregiert, was eine Population ergab, die typischerweise aus ca. 1 % Notch-exprimierenden Zellen und ca. 5 % Delta-exprimierenden Zellen zusammengesetzt war, wobei die restlichen Zellen keines der beiden Proteine exprimierte. Zum Testen des Aggregationsgrades wurden die Zellen mit für jedes Genprodukt spezifischen Antiseren angefärbt und mit Immunfluoreszenzmikroskopie geprüft (siehe experimentelle Verfahren zur genauen Angabe). Die Aggregate wurden als Cluster von vier oder mehr Zellen, die sowohl Notch- als auch Delta-exprimierende Zellen enthalten, definiert, und die in 6 gezeigten Werte stellen den Prozentgehalt sämtlicher Notch-exprimierenden Zellen dar, die in solchen Clustern festgestellt wurden. Sämtliche Zahlen spiegeln das durchschnittliche Ergebnis von mindestens zwei getrennten Transfektionsexperimenten wider, in denen mindestens 100 Notch-exprimierende Zelleinheiten (entweder einzelne Zellen oder Cluster) geprüft wurden.
  • Die schematischen Zeichnungen der getesteten Konstrukte und die Ergebnisse der Aggregationsexperimente sind in 6 gezeigt (siehe experimentelle Verfahrensweisen für genaue Angaben). Sämtliche Expressionskonstrukte waren Derivate des Notch-Vollängen-Expressionskonstrukts Nr. 1, pMtNMg, (beschrieben in Abschnitt 6, supra).
  • Die Ausgangskonstrukte (Nr. 2 DSph und Nr. 3 ΔCla) deletierten große Teile der EGF-Wiederholungssequenzen. Ihre Unfähigkeit zur Unterstützung der Notch-Delta-Aggregation legte nahe, dass die EGF-Wiederholungssequenzen von Notch an der Wechselwirkung mit Delta beteiligt waren. Zur weiteren Dissektion der Region zwischen den EGF-Wiederholungssequenzen 7 und 30 haben wir eine Reihe von sechs Raster-internen ClaI-Restriktionsstellen ausgenutzt. Aufgrund der Sequenzhomologie zwischen den Wiederholungssequenzen treten fünf der ClaI-Stellen an der gleichen relativen Stelle innerhalb der EGF-Wiederholungssequenz, unmittelbar nach dem dritten Cystein, auf, während die sechste Stelle unmittelbar vor dem ersten Cystein der EGF-Wiederholungssequenz 31 auftritt (7). Somit erhielten wir durch Durchführung eines teilweisen ClaI-Abbaus und anschließende Religation Deletionen, die nicht nur das offene Leseraster des Notch-Proteins bewahrten, sondern zusätzlich häufig die Strukturintegrität beibehielten und, zumindest theoretisch, den Abstand der drei Disulfidbindungen in den chimären EGF-Wiederholungssequenzen, der durch die Religation erzeugt wurde, konservierten (6, Konstrukte Nr. 4-14). Leider war die am meisten 3' gelegene ClaI-Stelle gegen den Abbau resistent, während die zu 3' nächst nähere ClaI-Stelle zwischen die EGF-Wiederholungssequenzen 30 und 31 einbricht. Bei erneuter Insertion verschiedener ClaI-Abbaufragmente in das Raster des vollständigen ClaI-Abbaus (Konstrukt Nr. 3 ΔCla) war darum die Gesamtstruktur der EGF-Wiederholungssequenzen offenbar an der 3'-Verknüpfungsstelle unterbrochen.
  • Mehrere Punkte an dieser Reihe von Konstrukten sind bemerkenswert. Erstens hob die Entfernung des ClaI-Restriktionsfragments, das in die EGF-Wiederholungssequenzen 9 und 17 (Konstrukt Nr. 8 ΔEGF9-17) einbricht, die Aggregation mit Delta auf, während die Reinsertion dieses Stücks in das Konstrukt Nr. 3, ΔCla, dem die EGF-Wiederholungssequenzen 7-30 fehlen, die Aggregation in etwa wieder auf die Wild-Typ-Niveaus (Konstrukt Nr. 13 ΔCla+EGF9-17) brachte, was nahe legt, dass die EGF-Wiederholungssequenzen 9 bis 17 Sequenzen enthalten, die zur Bindung an Delta von Bedeutung sind. Zweitens standen sämtliche Konstrukte in dieser Serie (Nr. 4-14) mit der Kartierung der Bindungsstellen auf die EGF-Wiederholungssequenzen 9 bis 17 im Einklang. Expressionskonstrukte, die diese Wiederholungssequenzen (Nr. 6, 7, 9, 10, 13) enthielten, beschleunigten die Notch-Delta-Wechselwirkungen, während Konstrukte, denen diese Wiederholungssequenzen (Nr. 4, 5, 8, 11, 12, 14) fehlten, dies nicht vermochten. Zur Bestätigung, dass die Unfähigkeit zur Aggregation mit Delta-Zellen nicht einfach auf einem Unvermögen des mutagenisierten Notch-Proteins zum Erreichen der Zelloberfläche beruhte, sondern tatsächlich die Deletion der notwendigen Bindungsstelle widerspiegelte, überprüften wir die Zelloberflächenexpression sämtlicher Konstrukte durch Immunfluoreszenzanfärbung von le benden transfizierten Zellen mit auf die extrazelluläre Domäne von Notch spezifischen Antikörpern. Sämtliche Konstrukte, die bei der Vermittlung von Notch-Delta-Wechselwirkungen versagten, erzeugten ein Protein, das anscheinend normalerweise an der Zelloberfläche exprimiert wird. Obwohl der Aggregationstest nicht quantitativ ist, aggregierten drittens zwei Konstrukte, die die EGF-Wiederholungssequenzen 9-17, Nr. 9, ΔEGF17-26, oder besonders bemerkenswert, Nr. 10, ΔEGF26-30, enthielten, offenbar auf einem scheinbar niedrigeren Niveau.
  • Zellen, die mit den Konstrukten Nr. 9, ΔEGF17-26, und 10, ΔEGF26-30, transfiziert waren, zeigten eine wesentlich geringere Oberflächenanfärbung als normal, obwohl fixierte und permeabilisierte Zellen mit dem gleichen, normal angefärbten Antikörper reagierten, was anzeigte, dass wir nicht einfach die Epitope, die von den Antiseren erkannt wurden, deletiert hatten. Durch Vergleich des Prozentgehalts an transfizierten Zellen in sowohl permeabilisierten als auch lebenden Zellpopulationen fanden wir, dass grob gesagt 50 % der transfizierten Zellen für das Konstrukt Nr. 9, ΔEGF17-26, und 10 % für das Konstrukt Nr. 10, ΔEGF26-30, nachweisbares Protein an der Zelloberfläche produzierten. Somit produzierten diese beiden Konstrukte Proteine, die oft nicht die Zelloberfläche zu erreichen vermochten, vielleicht aufgrund von Fehlfaltung, wodurch die Fähigkeit von transfizierten Zellen zur Aggregation mit Delta-exprimierenden Zellen vermindert, allerdings nicht beseitigt war.
  • Nach der Kartierung der Bindungsstelle auf die EGF-Wiederholungssequenzen 9 bis 17 überprüften wir, ob eine der Notch-Mutationen, deren molekulare Läsion bestimmt wurde, sich in diese Region verzeichnen ließ. Die einzige derartige Mutation war Split, ein semidominantes Notch-Allel, das mit einer Punktmutation in der EGF-Wiederholungssequenz 14 korrelierte (Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417; Kelley et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108). In der Tat ergab eine genetische Durchmusterung nach Sekundärstellen-Modifizierern von Split mehrere Allele von Delta, was eine spezielle Beziehung zwischen dem Split-Allel von Notch und Delta nahe liegt (Brand und Campus-Ortega, 1990, Roux's Arch. Dev. Biol. 198(5), 275-285). Zum Test der möglichen Wirkungen der Split-Mutation auf die Notch-Delta-vermittelten Aggregation wurde ein 11-kb-Fragment, das die mit Split einhergehende Fehlsinnmutation enthielt, in das Notch-Expressionskonstrukt (Nr. 15 Split) kloniert. Allerdings war die Aggregation mit Deltaexprimierenden Zellen in diesem Konstrukt unbeeinflußt, was, wie durch die folgenden Konstrukte bestätigt, nahe legt, dass die EGF-Wiederholungssequenz 14 von Notch nicht an den Wechselwirkungen mit Delta, die im Modell durch unseren Gewebekulturtest nachvollzogen wurden, beteiligt war.
  • Somit verwendeten wir zur weiteren Kartierung der Delta-Bindungsdomäne in der EGF-Wiederholungssequenzen 9-17 spezifische Oligonucleotid-Primer und die PCR-Technik zur Erzeugung mehrerer Unterfragmente dieser Region. Zur Konsistenz mit den Konstrukten Nr. 4-14, die Proteine produzierten, die in der Lage waren, mit Delta in Wechselwirkung zu treten, konstruierten wir die Primer zum Durchbrechen der EGF-Wiederholungssequenzen unmittelbar nach dem dritten Cystein an der gleichen Stelle, wie die übliche ClaI-Stelle (7). Die resultierenden PCR-Produkte wurden in die ClaI-Stelle des Konstrukts Nr. 3 ΔCla ligiert. Es wurden die überlappenden Konstrukte Nr. 16, 17 und 18 erzeugt, wovon nur eines, Nr. 16, ΔCla+EGF9-13, bei Transfektion in S2-Zellen die Aggregation mit Delta-Zellen erlaubte. Das Konstrukt Nr. 9, ΔCla+EGF(10-13), dem die EGF-Wiederholungssequenz 9 fehlte, definierte weiterhin die EGF-Wiederholungssequenzen 10-13 als die Region, die für die Notch-Delta-Wechselwirkungen notwendig war.
  • Die Konstrukte Nr. 20-24 stellten einen Versuch dar, diese Domäne unter Anwendung der gleichen PCR-Strategie (siehe 7) sogar noch weiter zu zerstückeln. Wir haben uns zunächst gefragt, ob sowohl die EGF-Wiederholungssequenzen 11 als auch 12 notwendig waren und zweitens ob die flankierenden Sequenzen aus den EGF-Wiederholungssequenzen 10 und 13 direkt an der Bindung an Delta beteiligt waren. Das Konstrukt Nr. 20, ΔCla+EGF(11-13), in dem die EGF-WiederholuflgSSequeflz 12 die einzige vollständige hinzugefügte Wiederholungssequenz ist, und das Konstrukt Nr. 21, ΔCla+EGF(10-12), in dem die EGF-Wiederholungssequenz 11 die einzige vollständige hinzugefügte Wiederholungssequenz ist, waren nicht zur Vermittlung der Aggregation in der Lage, was nahe legt, dass allein die Gegenwart entweder der EGF-Wiederholungssequenz 11 oder 12 für die Notch-Delta-Wechselwirkungen nicht ausreichte. Da allerdings die 3'-Ligationsverknüpfung dieser Konstrukte die Gesamtstruktur der EGF-Wiederholungssequenzen unterbrach, war es möglich, dass eine kurze "Puffer"-Zone benötigt wurde, damit ein normales Funktionieren der essentiellen Wiederholungssequenz möglich war. Somit könnte beispielsweise im Konstrukt Nr. 19, ΔCla+EGF(10-13), die EGF-Wiederholungssequenz 12 nicht direkt an der Bindung an Delta beteiligt sein, sondern könnte statt dessen zur minimalen Menge an Puffersequenz beitragen, die zum Schutz der Struktur der EGF-Wiederholungssequenz 12 benötigt wird, wodurch Wechselwirkungen mit Delta ermöglicht werden. Die Konstrukte Nr. 22-24 behandeln diesen Punkt. Wir konstruierten PCR-Primer, die am Ende der EGF- Wiederholungssequenz einbrachen und darum weniger wahrscheinlich die EGF-Disulfidbildung an der 3'-Verknüpfungsstelle unterbrachen. Das Konstrukt Nr. 22, ΔCla+EGF(10-11), das keine Aggregation vermittelte, und das Konstrukt Nr. 23, ΔCla+EGF(10-12), das die Aggregation vermittelte, legten wiederum nahe, dass beide Wiederholungssequenzen, 11 und 12, erforderlich sind, während die flankierende Sequenz aus der Wiederholungseinheit 13 eindeutig nicht erforderlich ist. Schließlich zeigte das Konstrukt Nr. 24, ΔCla+EGF(11-12), obwohl nun potentiell an der 5'-Verknüpfungsstelle strukturell unterbrochen, überzeugend, dass die Sequenzen aus der EGF-Wiederholungssequenz 10 nicht essentiell sind. Somit schlagen wir auf der Grundlage der vollkommen reproduzierbaren Daten aus 24 Konstrukten vor, dass die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 von Notch zusammengenommen die kleinste funktionelle, aus dieser Analyse erhältliche Einheit definieren, die die notwendigen Stellen zur Bindung an Delta in transfizierten S2-Zellen enthält.
  • 7.2.2. DIE EGF-WIEDERHOLUNGSSEQUENZEN 11 UND 12 VON NOTCH SIND ZUR NOTCH-DELTA-VERMITTELTEN AGGREGATION AUSREICHEND
  • Die große ClaI-Deletion, in die PCR-Fragmente inseriert waren (Nr. 3 ΔCla), behält ungefähr 1/3 der ursprünglichen 36 EGF-Wiederholungssequenzen, sowie die drei Notch/lin-12-Wiederholungssequenzen bei. Obgleich diese eindeutig nicht zur Unterstützung der Aggregation ausreichen, ist es möglich, dass sie einen notwendigen Rahmen bilden, in dem spezifische EGF-Wiederholungssequenzen mit Delta Wechselwirken können. Um zu testen, ob tatsächlich nur einige EGF-Wiederholungssequenzen zur Beschleunigung der Aggregation ausreichten, konstruierten wir zwei Konstrukte, Nr. 25, ΔEGF, das sämtliche 36 EGF- Wiederholungssequenzen mit der Ausnahme der ersten Zweidrittel der Wiederholungssequenz 1 deletierte, und Nr. 30, ΔECN, das den gesamten extrazellulären Teil von Notch, mit der Ausnahme des ersten Drittels der EGF-Wiederholungssequenz 1 und ca. 35 Aminosäuren unmittelbar vor der Transmembrandomäne deletierte. Fragmente, die die Notch-Delta-Aggregation im Hintergrund des Konstrukts Nr. 3, ΔCla, bei Insertion in das Konstrukt Nr. 25, ΔEGF, vermittelten, waren wiederum zur Beschleunigung der Wechselwirkungen mit Delta ( Konstrukte Nr. 26-30) in der Lage. Analoge Konstrukte (Nr. 31, 32), in denen die Notch/lin-12-Wiederholungssequenzen ebenfalls fehlten, vermittelten wiederum erfolgreich die Notch-Delta-Aggregation. Somit funktionieren auch in Abwesenheit des größten Teils der extrazellulären Domäne von Notch anscheinend die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 als unabhängige molekulare Einheiten, die zur Vermittlung von Notch-Delta-Wechselwirkungen in S2-Zellen ausreichen.
  • 7.2.3. DIE EGF-WIEDERHOLUNGSSEQUENZEN 11 UND 12 VON NOTCH BEHALTEN DIE CALCIUMABHÄNGIGKEIT DER NOTCH-DELTA-VERMITTELTEN AGGREGATION BEI
  • Wie in Abschnitt 6, supra beschrieben (Fehon et al., 1990, Cell 61, 523-534), zeigten wir, dass die Notch-Delta-vermittelte S2-Zellen-Aggregation Calcium-abhängig ist. Wir überprüften darum die Fähigkeit der Zellen, die bestimmte Deletionskonstrukte exprimieren, zur Aggregation mit Deltaexprimierenden Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von Ca++-Ionen. Wir testeten die Konstrukte Nr. 1, pMtNMg, als Kontrolle und Nr. 13, 16, 19, 23, 24, 26, 27 und 28 und stellten fest, dass Zellen, die in ein Ca++-haltiges Medium eingemischt wurden, bei 4 °C schnell Aggregate bildeten, wäh rend Zellen, die in ein Ca++-freies Medium eingemischt wurden, das EGTA enthielt, nicht aggregierten (Tabelle III). TABELLE III WIRKUNG VON EXOGENEM Ca++ AUF DIE NOTCH-DELTA-AGGREGATIONa
    ohne Ca++-Ionen mit Ca++-Ionen
    1. pMtNMg 0 37
    13. ΔCla+EGF(9-17) 0 31
    16. ΔCla+EGF(9-13) 0 38
    19. ΔCla+EGF(10-13) 0 42
    23. ΔCla+EGF(10-12) 0 48
    29. ΔEGF+EGF(10-12) 0 44
    32. ΔECN+EGF(10-12) 0 39
    33. ΔCla+XEGF(10-13) 0 34
    a Die Daten sind als Prozentgehalt von Notch-exprimierenden Zellen angegeben, die in Aggregaten festgestellt werden (wie in Figur 6).
  • Die Calciumabhängigkeit der Wechselwirkung wurde eindeutig auch im kleinsten Konstrukt beibehalten, was mit der Beobachtung im Einklang steht, dass die kleinsten Konstrukte, die die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 enthalten, an Delta auf eine Art binden, die derjenigen von Vollängen-Notch entspricht. Dieses Ergebnis ist auch im Lichte neuerer Studien interessant, die nahe legen, dass die EGF-artigen Wiederholungssequenzen mit einer bestimmten Consensus-Sequenz als Ca++-Bindungsdomänen wirken können (Morita et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5698-5704; Sugo et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5705-5710; Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Handford et al., 1990, EMBO J. 9, 475-480). Über die Hälfte der EGF-Wiederholungssequenzen in Notch, einschließlich der Wiederholungssequenzen 11 und 12, steht mit diesem Consensus in Einklang, was außerdem das Argument bekräftigt, dass die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 für die Beschleunigung der Notch-Delta-Wechselwirkungen verantwortlich sind.
  • 7.2.4. DIE DELTA-BINDUNGSFUNKTION DER EGF-WIEDERHOLUNGSSEQUENZEN 11 UND 12 VON NOTCH WIRD IN DEM XENOPUSHOMOLOGEN VON NOTCH KONSERVIERT
  • Nach Kartierung der Delta-Bindungsstelle auf die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 von Notch waren wir an der Frage interessiert, ob diese Funktion in dem Notch-Homologen konserviert wird, das in Xenopus identifiziert wurde (Coffman et al., 1990, Science 249, 1438-1441). Dieses Protein zeigt in der Gesamtstruktur und Gesamtorganisation eine auffallende Ähnlichkeit mit Drosophila-Notch. Beispielsweise wurden in der EGF-Wiederholungssequenzregion sowohl die Anzahl als auch die lineare Organisation der Wiederholungssequenzen konserviert, was auch eine mögliche funktionelle Konservierung nahe legt. Um dies zu testen, stellten wir PCR-Primer auf der Basis der Xenopus-Notch-Sequenz her (Coffman et al., 1990, Science 249, 1438-1441) und verwendeten diese zum Erhalt eines ca. 350-bp-Fragments aus einer Stadium-17-Xenopus-cDNA-Bibliothek, die die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12, flankiert von der Hälfte der Wiederholungssequenzen 10 und 13 auf jeder Seite, enthält. Dieses Fragment wurde in das Konstrukt Nr.3, ΔCla, kloniert, und drei unabhängige Klone wurden im Zellkultur-Aggregationstest auf die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit Delta getestet. Zwei der Klone, Nr. 33a&bΔCla+XEGF(10-13), waren bei Transfektion in S2-Zellen in der Lage, die Notch-Delta-Wechselwirkungen auf einem Niveau etwa entsprechend demjenigen des analogen Drosophila-Notch-Konstrukts Nr. 19, ΔCla+EGF(10-13), und wiederum Calciumabhängig zu vermitteln (Tabelle III). Allerdings gelang es dem dritten Klon Nr. 33, cΔCla+XEGF(10-13), nicht, die Notch-Delta-Wechselwirkungen zu vermitteln, obwohl das Protein normalerweise an der Zelloberfläche exprimiert wurde, wie durch Anfärben von lebenden nicht permeabilisierten Zellen bewertet. Der Sequenzvergleich des Xenopus-PCR-Produkts in den Konstrukten Nr. 33a und 33c ergab eine Fehlsinnmutation, die in der EGF-Wiederholungssequenz 11 des Konstrukts Nr. 33c zu einer Leucin-zu-Prolin-Änderung führte (Aminosäure, Nr. 453, Coffman et al., 1990, Science 249, 1438-1441). Obwohl dieser Rest zwischen dem Drosophila- und Xenopus-Notch nicht konserviert wird (8), könnte der Einbau eines Prolinrestes leicht die Struktur der EGF-Wiederholungssequenz unterbrechen und somit verhindern, dass es mit Delta ordnungsgemäß wechselwirkt.
  • Der Vergleich der Aminosäuresequenz der EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 von Drosophila- und Xenopus-Notch ergibt einen hohen Aminosäure-Identitätsgrad, einschließlich der Calcium-bindenden Consensus-Sequenz (8, SEQ-ID-NR. 1 und NR. 2). Allerdings ist das Homologieniveau nicht auffallend unterschiedlich zu demjenigen, das zwischen den meisten anderen EGF-Wiederholungssequenzen herrscht, das insgesamt eine etwa 50%ige Identität auf Aminosäureniveau aufweist. Diese 1:1-Entsprechung zwischen den einzelnen EGF-Wiederholungssequenzen legt nahe, dass sie vielleicht ebenfalls konservierte funktionelle Einheiten enthalten könnten. Die Delta-Wechselwirkungen wiederum in einer Calciumionenabhängigen Weise.
  • 7.3. DISKUSSION
  • Wir haben unsere Studie der Wechselwirkungen zwischen den Proteinprodukten der Gene Notch und Delta unter Anwendung des in vitro S2-Zellaggregationstest, der in Abschnitt 6, supra, beschrieben ist, fortgesetzt. Auf der Basis einer umfassenden Deletionsanalyse der extrazellulären Domäne von Notch zeigen wir, dass die Regionen von Notch, die EGF-homologe Wiederholungssequenzen 11 und 12 enthalten, für die Notch-Deltavermittelte Aggregation sowohl notwendig als auch hinreichend sind und dass dieses Delta-Bindungsvermögen in den beiden gleichen EGF-Wiederholungssequenzen von Xenopus-Notch konserviert wurden. Unsere Feststellung, dass sich die Aggregation auf die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 von Notch kartieren ließ, zeigt, dass die EGF-Wiederholungssequenzen von Notch auch als spezifische Proteinbindungsdomänen funktionieren.
  • Neuere Studien haben gezeigt, dass die EGF-Domänen, die eine spezifische Consensus-Sequenz enthalten, Ca++-Ionen binden können (Morita et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5698-5704; Sugo et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5705-5710; Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Handford et al., 1990, EMBO J. 9, 475-480). In der Tat stehen etwa die Hälfte der EGF-Wiederholungssequenzen in Notch, einschließlich der Wiederholungssequenzen 11 und 12, mit dieser Consens-Sequenz im Einklang. Wir haben gezeigt, dass exogenes Ca++ für die Notch-Delta-vermittelte Aggregation von transfizierten S2-Zellen notwendig war (siehe Abschnitt 6; Fehon et al., 1990, Cell 61, 525-534). Wir testeten eine Unterserie unserer Deletionskonstrukte und fanden, dass die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 allein (Nr. 32ΔECN+EGF(11-12)) zur Aufrechterhaltung der Ca++-Abhängigkeit der Notch-Delta-Wechselwirkungen ausreichend waren.
  • Eine Serie von Studien hat nahe gelegt, dass die genetischen Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta eine Dosis-empfindliche Wechselwirkung zwischen ihren Proteinprodukten widerspiegeln können. Die genetischen Studien haben gezeigt, dass die relative Gen-Dosierungen von Notch und Delta für die normale Entwicklung essentiell sind. Beispielsweise fanden Xu et al. (1990, Genes Dev. 4, 464-475), dass Null-Mutationen bei Delta letale Wechselwirkungen zwischen heterozygoten Kombinationen von Abruptex(Ax)-Allelen unterdrücken könnten, eine Klasse von Notch-Mutationen, die mit Fehlsinn-Mutationen innerhalb der EGF-Wiederholungssequenzen korrelieren (Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417; Kelley et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108). Die in vitro Wechselwirkungen, die wir beschrieben haben, in denen wir sowohl Notch-Delta- als auch Delta-Delta-Assoziationen feststellen (siehe Abschnitt 6), implizieren, dass zwischen Notch und Delta eine kompetitive Wechselwirkung um die Bindung an Delta die zugrundeliegende Basis für die beobachteten genetischen Wechselwirkungen widerspiegeln kann. Außerdem gelang uns die Coimmunpräzipitation von Notch und Delta sowohl aus Gewebekultur- als auch embryonalen Zellextrakten (siehe Abschnitt 6), was eine mögliche in vivo Assoziation der beiden Proteine anzeigt. Zusätzlich legen in situ mRNA-Analysen von Notch- und Delta-Expressionsmustern in dem Embryo nahe, dass die Expression von beiden überlappend, allerdings nicht identisch ist (Kopczynski und Muskavitch, 1989, Development 107, 623-636; Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417). Ausführliche Antikörperanalysen der Notch-Proteinexpression während der Entwicklung haben neuerdings ergeben, dass die Notch-Expression in Gewebe und auf subzellulären Niveaus eingeschränkter ist als es bisherige Studien gezeigt haben (Johansen et al., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427-2440; Kidd et al., 1989, Genes Dev. 3, 1113-1129).
  • Unsere Feststellung, dass die beiden gleichen EGF-Wiederholungssequenzen auf den Xenopus-Notch-Homologen auch Wechselwirkungen mit Delta-Gewebekulturzellen zu vermitteln vermögen, spricht stark dafür, dass eine ähnliche Funktion in vivo konserviert worden ist. Obwohl diese beiden EGF-Wiederholungssequenzen in vitro ausreichen, ist es natürlich möglich, dass in vivo mehr vom Notch-Molekül für leichtere Notch-Delta-Wechselwirkungen notwendig sein kann. In der Tat waren wir aus zwei Gründen etwas überrascht, als wir feststellten, dass sich die Delta-Bindungsstelle nicht auf die EGF-Wiederholungssequenzen kartieren ließen, von denen gezeigt wurde, dass in sie mehrere der Ax-Mutationen fallen, erstens auf Grund des genetischen Screenings (Xu et al., 1990, Genes Dev. 4, 464-475), das Wechselwirkungen zwischen Ax-Allelen und Delta-Mutationen zeigt, und zweitens aufgrund der Sequenzanalysen, die gezeigt haben, dass bestimmte Ax-Allele mit einzelnen Aminosäureänderungen innerhalb der vermeintlichen Ca-bindenden Consensus-Sequenz der EGF-Wiederholungssequenzen in Verbindung stehen. Beispielsweise bringt die AXB2-Mutation die EGF-Wiederholungssequenz 29 an eine Ca++-Bindungs-Consensussequenz heran, während die AX9B2-Mutation die EGF-Wiederholungssequenz 24 von diesem Consensus entfernt. Es ist möglich, dass diese Region des Notch-Proteins in vivo an Wechselwirkungen entweder mit Delta und/oder mit anderen Proteinen beteiligt sein kann, die durch unseren Zellkulturtest nicht exakt im Modell nachgebildet werden können.
  • Unsere in vitro Kartierung der Delta-Bindungsdomäne auf die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 von Notch stellt die erste Bewertung der Funktion einer strukturellen Domäne von Notch dar. In der Tat legen die verschiedenen Deletionskonstrukte nahe, dass diese beiden EGF-Wiederholungssequenzen, unabhängig vom unmittelbaren Zusammenhang, in den sie gestellt werden, als modulare Einheit funktionieren. Somit sind anscheinend weder die restlichen 34 EGF-Wiederholungssequenzen noch die drei Notch/lin-12-Wiederholungssequenzen zur Erstellung eines strukturellen Rasters notwendig, das für die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 zur Funktion erforderlich ist. Interessanterweise wurde fast der gegenteilige Effekt festgestellt: obwohl unser Aggregationstest nicht die Stärke der Wechselwirkung mißt, da wir die Bindungsstelle auf kleinere und kleinere Fragmente verschmälert haben, stellten wir eine Zunahme in der Fähigkeit der transfizierten Zellen zur Aggregation mit Deltaexprimierenden Zellen fest, was nahe legt, dass die normalen flankierenden EGF-Sequenzen in der Tat die Assoziation zwischen den Proteinen behindert. Für zwei getrennte Reihen von Konstrukten, entweder im Hintergrund von Konstrukt Nr. 3, ΔCla, (vergleiche Nr. 9, 16, 19, 23) oder im Hintergrund von Konstrukt Nr. 25, ΔEGF, (vergleiche Nr. 26, 27, 28), stellten wir eine Zunahme in der Fähigkeit zur Aggregation fest, derart, dass die kleinsten Konstrukte (Nr. 19, 23, 28, 29) reproduzierbar über die Wild-Typ-Niveaus (Nr. 1 pMtNMg) hinaus aggregierten. Die Ergebnisse legen nahe, dass die umgebenden EGF-Wiederholungssequenzen zur Beschränkung der Fähigkeit der EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 zum Zugang zu Delta dienen können und dadurch möglicherweise die Notch-Delta-Wechselwirkungen in vivo modulieren.
  • Notch codiert ein strukturell komplexes Transmembranprotein, von dem vorgeschlagen wurde, dass es während der gesamten Drosophila-Entwicklung eine pleotrope Rolle spielt. Die Tat sache, dass die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 offenbar mindestens in Zellkultur als unabhängige modulare Einheit für die Wechselwirkungen mit Delta ausreichend funktionieren, stellt unmittelbar die Frage nach der Rolle der Hypothese, die besagt, dass diese auch modulare Bindungsdomänen für andere Proteine bilden können, die mit Notch und zu verschiedenen Zeiten während der Entwicklung Wechselwirken.
  • Zusätzlich zu Xenopus-Notch codieren lin-12 und glp-1, zwei Gene, von denen angenommen wird, dass sie in Zell-Zell-Wechselwirkungen funktionieren, die an der Spezifizierung von bestimmten Zell-Werdegängen während der C. Eleganz-Entwicklung beteiligt sind, EGF-homologe Transmembran-Proteine, die zu Drosophila- und Xenopus-Notch strukturell recht ähnlich sind. Alle vier Proteine enthalten EGF-homologe Wiederholungssequenzen, auf die drei weitere cysteinreiche Wiederholungssequenzen (Notch/lin-12-Wiederholungssequenzen) in der extrazellulären Domäne, eine einzelne Transmembrandomäne und sechs cdc10/Ankyrin-Wiederholungssequenzen in der intrazellulären Region folgen. Im Gegensatz zu Xenopus-Notch, das auf der Basis eines Sequenzvergleichs sowie der Ergebnisse unseres Delta-Bindungstests anscheinend wahrscheinlich den direkten funktionellen Gegenspieler von Drosophila-Notch codiert, codieren lin-12 und glp-1 wahrscheinlich distinkte Elemente der gleichen Genfamilie. Der Vergleich der vorhergesagten Proteinprodukte von lin-12 und glp-1 mit Notch ergibt trotz einer ähnlichen Gesamtorganisation der Strukturmotive spezifische Unterschiede. Der offensichtlichste Unterschied besteht darin, dass lin-12- und glp-1-Proteine nur 13 bzw. 10 EGF-Wiederholungssequenzen enthalten, im Vergleich zu den 36 Wiederholungssequenzen sowohl für Xenopus- als auch Drosophila-Notch. Zusätzlich wird in den Nematoden-Genen die Aneinanderreihung von EGF-Wiederholungssequenzen nach der ersten EGF- Wiederholungssequenz durch eine distinkten Strecke der Sequenz, die bei Notch fehlt, unterbrochen. Bezüglich der Delta-Bindungsdomäne, die wir als EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 von Notch definierten, existieren ferner keine zwei zusammenhängenden EGF-Wiederholungssequenzen in den lin-12-oder glp-1-Proteinen, die die Ca++-bindende Consensus-Sequenz zeigen, und auch keine zwei zusammenhängenden Wiederholungssequenzen, die eine auffallende Ähnlichkeit mit den EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 von Notch aufweisen, was wiederum nahe legt, dass die lin-12- und glp-1-Genprodukte wahrscheinlich von Notch funktionell unterschiedlich sind.
  • Unsere Feststellung, dass die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 von Notch eine diskrete Delta-Bindungseinheit bilden, stellt den ersten konkreten Beweis dar, der die Idee unterstützt, dass jede EGF-Wiederholungssequenz oder kleine Untereinheit von Wiederholungssequenzen eine einzigartige Rolle während der Entwicklung, möglicherweise über direkte Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, spielen kann. Die zwischen der adhäsiven Domäne von Delta und Serrate festgestellten Homologien (siehe Abschnitt 8.3.4., infra) legen nahe, dass der homologe Teil von Serrate in sofern "adhesiv" ist, als er die Bindung mit anderen toporhythmischen Proteinen vermittelt. Zusätzlich kann das Gen Scabrous, das ein sezerniertes Protein mit Fibrinogen-Ähnlichkeit codiert, mit Notch Wechselwirken.
  • Zusätzlich zu der EGF-Wiederholungssequenz treten in der Regel mehrere Kopien anderer Strukturmotive in einer Vielzahl von Proteinen auf. Ein relevantes Beispiel ist das cdc10/Ankyrin-Motiv, von dem sechs Kopien in der intrazellulären Domäne von Notch festgestellt werden. Ankyrin enthält 22 dieser Wiederholungssequenzen. Vielleicht könnten wieder holte Aneinanderreihungen von Strukturmotiven in der Regel eine lineare Aneinanderreihung einer Serie von modularen Proteinbindungseinheiten darstellen. Angesichts dieser Ergebnisse in Verbindung mit der bekannten genetischen und entwicklungsbedingten strukturellen Komplexität von Notch kann Notch während der Entwicklung mit einer Anzahl von verschiedenen Liganden in einem exakt regulierten zeitlichen und räumlichen Muster Wechselwirken. Solche kontextspezifischen Wechselwirkungen mit extrazellulären Proteinen könnten durch die EGF- und Notch/lin-12-Wiederholungssequenzen vermittelt werden, während die Wechselwirkungen mit Cytoskelett- und Cytoplasma-Proteinen durch die intrazellulären cdc10/Ankyrin-Motive vermittelt werden könnten.
  • 8. DER AMINO-TERMINUS VON DELTA IST EINE EGF-BINDUNGSDOMÄNE, DIE MIT NOTCH UND DELTA WECHSELWIRKT
  • Die Aggregation kultivierter Zellen, die zur Expression von Wild-Typ- und diversen Delta-Proteinen programmiert sind, wurde zur Delinearisierung von Delta-Sequenzen eingesetzt, die für die heterotypische Wechselwirkung mit Notch und für die homotypischen Delta-Wechselwirkung erforderlich sind. Wir haben festgestellt, dass der Amino-Terminus der extrazellulären Delta-Domäne für die Beteiligung von Delta an heterotypischen (Delta-Notch) und homotypischen (Delta-Delta)-Wechselwirkungen notwendig und ausreichend ist. Angesichts der Tatsache, dass EGF-artige Notch-Sequenzen zur Vermittlung einer heterotypischen Wechselwirkung mit Delta ausreichen, folgern wir, dass der Amino-Terminus von Delta eine EGF-Motivbindende Domäne (EBD) ist. Die Delta-EBD weist anscheinend zwei Aktivitäten auf: die Fähigkeit zur Bindung EGF-verwandter Sequenzen und die Fähigkeit zur Selbstassoziation. Wir stellen auch fest, dass Delta von kultivierten Zellen aufgenommen wird, die Notch exprimieren, was eine Widergabe eines Mechanismus sein kann, über den diese Proteine in vivo Wechselwirken.
  • 8.1. MATERIALIEN UND METHODEN
  • 8.1.1. ZELLINIEN
  • Die Drosophila-S2-Zellinie (Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353-365), die bei diesen Experimenten verwendet wird, wurde gezüchtet, wie in Abschnitt 6 beschrieben.
  • 8.1.2. IMMUNOLOGISCHE SONDEN
  • Die Immunhistochemie wurde wie in Abschnitt 6, supra, beschrieben oder manchmal mit geringfügigen Modifikationen dieser Vorgehensweise durchgeführt. Die eingesetzten Antiseren und Antikörper umfaßten polyklonale Maus-Anti-Delta-Seren, die gegen ein Delta-ELR-Reihensegment gezüchtet wurden, das sich von der vierten bis zur neunten ELR-Sequenz (siehe Abschnitt 6) erstreckt; gegen das gleiche Delta-Segment gezüchtete polyklonale Anti-Delta-Ratten-Seren (siehe Abschnitt 6); polyklonale Ratten-Anti-Notch-Seren, die gegen ein Notch-ELR-Reihensegment gezüchtet wurden, das sich von der fünften bis zur dreizehnten ELR-Sequenz erstreckt; einen monoklonalen Maus-Antikörper C17.9C6 (siehe Abschnitt 6), der die intrazelluläre Notch-Domäne erkennt; und einen monoklonalen Maus-Antikörper BP-104 (Hortsch et al., 1990, Neuron 4, 697-709) der die lange Form von Drosophila-Neuroglian erkennt.
  • 8.1.3. EXPRESS IONVEKTOR-KONSTRUKTE
  • Die zur Programmierung der Expression von Wild-Typ-Delta (pMTDl1) und Wild-Typ-Notch (pMTNMg) eingesetzten Konstrukte sind in Abschnitt 6, supra, beschrieben. Die Konstrukte, die die Expression von Delta-Proteinvarianten steuern, wurden unter Verwendung von pMTDl1, der Dl1-cDNA, die in Bluescript+ kloniert wurde (pBSDl1; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735), und pRmHa3-104 (A.J. Bieber, pers. Mitteilung), der aus der Insertion der 1B7A-250-cDNA in den Metallothionein-Promotorvektor pRmHa-3 (Bunch et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061) besteht und die induzierbare Expression der langen Form von Drosophila-Neuroglian unterstützt (Hortsch et al., 1990, Neuron 4, 697-709), erzeugt.
  • Kurz gesagt, wurden die Konstrukte wie folgt hergestellt: Del(Sca-Nae) – Schneiden von pBSDl1 mit Sal1 (vollständiger Abbau) und ScaI (teilweise Abbau), Isolieren des vektorhaltigen Fragments. Schneiden von pBSDl1 mit NaeI (teilweise) und SalI (vollständig), Isolieren des Carboxyl-terminalen Delta-codierenden Fragments. Ligation der Fragmente, Transformation und Isolierung der Klone. Übertragung des EcoRI-Inserts in pRmHa-3.
  • Del(Bam-Bgl) – Schneiden von pBSDl1 mit BglII (vollständig) und BamHI (teilweise), Auffüllen der Enden mit Klenow-DNA-Polymerase, Ligation, Transformation und Isolierung der Klone. Übertragung des EcoRI-Inserts in pRmHa-3.
  • Del(ELR1-ELR3) – PCR-Amplifikation der Basenpaare 236-830 der Dl1-cDNA unter Verwendung von 5-ACTTCAGCAACGATCACGGG-3' (SEQ-ID-NR. 26) und 5'-TTGGGTATGTGACAGTAATCG-3' (SEQ-ID-NR. 27), Behandeln mit T4-DNA-Polymerase, Ligation in pBSDl1, Schnei den mit ScaI (teilweise) und BglII (vollständig) und Auffüllen der Enden mit Klenow-DNA-Polymerase, Transformation und Isolierung der Klone. Übertragung des Carboxyl-terminalen Delta-codierenden BamHI-SalI-Fragments in pRmHa-3.
  • Del(ELR4-ELR5) – pBSDl1 wurde mit BglII vollständig und mit PstI teilweise verdaut. Das Vektor-haltige 5,6-kb-Fragment wurde isoliert, unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in Gegenwart eines 100-fachen molaren Überschusses des Oligonucleotids 5'-GATCTGCA-3' zirkularisiert und transformiert, und die Klone wurden isoliert. Das resultierende EcoRI-Insert wurde anschließend in pRmHa-3 transferiert.
  • Ter(Dde) – Schneiden von pBSDl1 mit DdeI (teilweise), Enden Auffüllen mit Klenow-DNA-Polymerase, Ligation mit dem 100-fachen molaren Überschuß von 5'-TTAAGTTAACTTAA-3' (SEQ-ID-NR. 28), Transformation und Isolierung der Klone. Übertragung des EcoRI-Insert in pRmHa-3.
  • Ins(Nae)A – Schneiden von pMTDl1 mit NaeI (teilweise), Isolieren des vektorhaltigen Fragments, Ligation mit dem 100-fachen molaren Überschuß von 5'-GGAAGATCTTCC-3' (SEQ-ID-NR. 29), Transformation, und Isolierung der Klone.
  • NAE B – pMTDl1 wurde teilweise mit NaeI verdaut, und die Population der versuchsweise linearisierten Kreise von etwa 5,8-kb-Länge wurde isoliert. Die Fragmente wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in Gegenwart eines 100-fachen molaren Überschusses des Oligonucleotids 5'-GGAAGATCTTCC-3' (SEQ-ID-NR. 29) transformiert, und ein Klon (NAE A), der mehrere Inserts des Klinkers enthielt, wurde isoliert. NAE A wurde vollständig mit BglII abgebaut, und die resultierenden 0,4- kb- und 5,4-kb-Fragmente wurden isoliert, ligiert und transformiert, und die Klone wurden isoliert.
  • Ins(Stu) – Schneiden von pMTDl1 mit StuI (vollständig), Isolieren des vektorhaltigen Fragments, Ligation mit dem 100-fachen molaren Überschuß von 5'-GGAAGATCTTCC-3' (SEQ-ID-NR. 29), Transformation und Isolierung der Klone.
  • STU B – pMTDl1 wurde vollständig mit StuI verdaut, und das resultierende 5,8-kb-Fragment wurde isoliert. Das Fragment wurde unter Verwendung der T4-DNA-Ligase in Gegenwart eines 100-fachen molaren Überschusses des Oligonucleotids 5'-GGAAGATCTTCC-3' (SEQ-ID-NR. 29) rezirkularisiert und transformiert, und ein Klon (STU A), der mehrere Inserts des Linkers enthielt, wurde isoliert. STU B wurde mit BglII vollständig abgebaut, und die resultierenden 0,6-kb- und 5,2-kb-Fragmente wurden isoliert, ligiert und transformiert, und die Klone wurden isoliert.
  • NG1 – Schneiden von pRmHa3-104 mit BglII (vollständig) und EcoRI (vollständig), Isolieren des vektorhaltigen Fragments. Schneiden von Ins(Nae)A mit EcoRI (vollständig) und BglII (vollständig), Isolieren des Amino-terminalen Delta-codierenden Fragments. Ligation der Fragmente, Transformation und Isolierung der Klone.
  • NG2 – Schneiden von pRmHa3-104 mit BglII (vollständig) und EcoRI (vollständig), Isolieren des vektorhaltigen Fragments. Schneiden von Del(ELR1-ELR3) mit EcoRI (vollständig) und BglII (vollständig), Isolieren des Amino-terminalen Deltacodierenden Fragments. Ligation der Fragmente, Transformation und Isolierung der Klone.
  • NG3 – Schneiden von pRmHa3-104 mit BglII (vollständig) und EcoRI (vollständig), Isolieren des vektorhaltigen Fragments. Schneiden von pMTDl1 mit EcoRI (vollständig) und BglII (vollständig), Isolieren des Delta-Amino-terminalen codierenden Fragments. Ligation der Fragmente, Transformation und Isolierung der Klone.
  • NG4 – Schneiden von pRmHa3-104 mit BglII (vollständig) und EcoRI (vollständig), Isolieren des vektorhaltigen Fragments. Schneiden von Del(Sca-Nae) mit EcoRI (vollständig) und BglII (vollständig), Isolieren des Amino-terminalen Delta-codierenden Fragments. Ligation der Fragmente, Transformation und Isolierung der Klone.
  • NG5 – Erzeugen von Del(Sca-Stu) wie folgt: Schneiden von pMTdl1 mit ScaI (vollständig) und StuI (vollständig), Isolieren des Amino-terminalen ScaI-ScaI-codierenden Fragments und des Carboxyl-termialen StuI-ScaI-codierenden Fragments, Ligation, Transformation und Isolierung der Klone. Schneiden von Del(Sca-Stu) mit EcoRI (vollständig) und BglII (vollständig), Isolieren des Amino-terminalen Delta-codierenden Fragments. Schneiden von pRmHa3-104 mit BglII (vollständig) und EcoRI (vollständig), Isolieren des vektorhaltigen Fragments. Ligation der Fragmente, Transformation und Isolieren der Klone.
  • Die Sequenzgehalte der verschiedenen Delta-Varianten sind in Tabelle IV gezeigt. Die schematischen Diagramme der in Tabelle IV definierten Delta-Varianten sind in 9 gezeigt. TABELLE IV SEQUENZGEHALTE DER BEI DIESER STUDIE EINGESETZTEN DELTA VARIANTEN
    Nucleotide Aminosäuren
    Wild-Typ 1-2892A 1-833
    Del(Sca-Nae) 1-235/734-2892 1-31/W/199-833
    Del(Bam-Bgl) 1-713/1134-2892 1-191/332-833
    Del(ERL1-ELR3) 1-830/1134-2892 1-230/332-833
    Del(ERL4-ELR5) 1-1137/1405-2892 1-332/422-833
    Ter(Dde) 1-2021/TTAAGTTAACTTAAE/2227-2892 1-626/H
    Ins(Nae)A 1-733/(GGAAGATCTTCC)n F/734-2892B 1-197/(RKIF)n198-833
    NAE B 1-733/GGAAGATCTTCCF/734-2892 1-197/RKIF 198-833
    Ins(Stu) 1-535/(GGAAGATCTTCC)n F/536-2892B 1-131/G(KIFR)n-1 KIFP/133-833
    STU B 1-535/GGAAGATCTTCCF/536-2892 1-131/GKIFP 133-833
    NG1 1-733/GGAA/2889-3955(NG)C 1-198/K/952-1302D
    NG2 1-830/2889-3955(NG) 1-230/952-1302
    NG3 1-1133/2889-3955(NG) 1-331/952-1302
    NG4 1-235/734-1133/2889-3955(NG) 1-31/199-331/952-1302
    NG5 1-235/536-1133/2889-3955(NG) 1-31/S/133/952-1302
    • A Die Koordinaten für die Delta-Sequenzen entsprechen der Sequenz der Dl1-cDNA (12).
    • B Die exakte Anzahl von inserierten Linkern wurde für dieses Konstrukt noch nicht bestimmt.
    • C Koordinaten für Neuroglian-(Bieber et al., 1989, Cell 59, 447-460; Hortsch et al., 1990, Neuron 4, 697-709) Nucleotidsequenzen, die in Delta-Neuroglian-Chimären vorhanden sind, entsprechen der Sequenz der 1B7A-250-cDNA (13, SEQ-ID-NR. 5) und sind fett gedruckt.
    • D Die Neuroglian-Aminosäuresequenzen entstammen dem Translationskonzept der 1B7A-250-cDNA-Nucleotidsequenz (13), (SEQ-ID-NR. 5) und sind fett gedruckt.
    • E SEQ-ID-NR. 28
    • F SEQ-ID-NR. 29
  • 8.1.4. AGGREGATIONSPROTOKOLLE
  • Zelltransfektion und -aggregation wurden wie in Abschnitt 6, supra, beschrieben oder mit geringfügigen Modifikationen hiervon durchgeführt.
  • 8.2. ERGEBNISSE
  • 8.2.1. AMINOTERMINALE SEQUENZEN INNERHALB DER EXTRAZELLULÄREN DELTA-DOMÄNE SIND FÜR DIE HETEROTYPISCHE WECHSELWIRKUNG MIT NOTCH NOTWENDIG UND HINREICHEND
  • Da wir vermuteten, dass einige Delta-Varianten vielleicht nicht wirksam auf der Zelloberfläche lokalisiert sind, erforschten wir die Beziehung zwischen dem Expressionsniveau von Wild-Typ-Delta und dem Aggregationsgrad mit Notch-exprimierenden Zellen durch Variation der Eingabemenge des Delta-Expressionskonstrukts bei verschiedenen Transfektionen. Wir fanden, dass die heterotypische Delta-Notch-Wechselwirkung bei diesen Test über einen 10-fachen Bereich nur eine geringfügige Abhängigkeit von der Delta-Eingabekonzentration aufweist (9A). Angesichts der Robustheit der heterotypischen Wechselwirkung über den getesteten Bereich und unserer Beobachtungen, dass jeweils die Delta-Varianten, die wir einsetzten, eine nennenswerte Oberflächenakkumulation in transfizierten Zellen zeigten, schließen wir, dass die Unfähigkeit einer gegebenen Delta-Variante, die heterotypische Aggregation zu unterstützen, am wahrscheinlichsten ein Funktionsdefizit widerspiegelt, das von dieser Variante gezeigt wird, im Gegensatz zu dem Einfluß verminderter Oberflächen-Expressionsniveaus auf die heterotypische Aggregation.
  • Die Ergebnisse der heterotypischen Aggregationsexperimente, die durch Delta-Varianten und Wild-Typ-Notch vermittelt werden, sind in Tabelle V gezeigt.
  • Figure 01090001
  • Figure 01100001
  • Die Delta-Aminosäuren (AA) 1-230 sind das derzeitige minimale Sequenzintervall, das als zur Wechselwirkung mit Notch ausreichend definiert ist. Dies beruht auf dem Erfolg der NG2-Notch-Aggregation. Innerhalb dieses Intervalls sind die Delta-AA 198-230 kritisch, da ihre Deletion im NG1-Konstrukt die für das NG2-Konstrukt festgestellte Notch-Bindungsaktivität inaktivierte. Auch innerhalb dieses Intervalls sind die Delta-AA 32-198 kritisch, da ihre Deletion im NG4-Konstrukt ebenfalls die für das NG3-Konstrukt beobachtete Notch-Bindungsaktivität inaktivierte. Die Bedeutung der Delta-AA 192-230 wird auch durch die Beobachtung gestützt, dass die Del(ELR1-ELR3)-Variante, die sämtliche Delta-Aminosäuren außer AA 231-331 enthält, Notch-Bindungsaktivität aufwies, während die Del(Bam-Bgl)-Variante, die sämtliche Delta-Aminosäuren außer AA 192-331 enthält, offenbar für die Notch-Bindungsaktivität inaktiviert war.
  • Die Konformation und/oder Primärsequenz in der Nachbarschaft der Delta-AA 197/198 ist offenbar kritisch, da eine multimere Insertion des Tetrapeptids – Arg-Lys-Ile-Phe [im Ein-Buchstaben-Code (siehe z.B. Lehninger et al., 1975, Biochemistry, 2. Ausg., S. 72), RKIF] (SEQ-ID-NR. 30) – zwischen diesen beiden Resten, wie im Konstrukt Ins(Nae)A, die mit dem Wild-Typ-Delta festgestellte Notch-Bindungsaktivität inaktivierte.
  • Zusätzlich legt die Beobachtung, dass das Del(ELR1-ELR3)-Konstrukt die Aggregation stützt, nahe, dass ELR1-ELR3 nicht für die Delta-Notch-Wechselwirkung erforderlich sind; die Beobachtung, dass das Del(ELR4-ELR5)-Konstrukt die Aggregation stützt, legt nahe, dass ELR4 und ELR5 nicht für die Delta-Notch-Wechselwirkung erforderlich sind, und die Beobachtung, dass das Ter(Dde)-Konstrukt die Aggregation stützte, legt na he, dass die intrazelluläre Delta-Domäne nicht für die Delta-Notch-Wechselwirkung erforderlich ist.
  • 8.2.2. DIE AMINOTERMINALEN SEQUENZEN IN DER EXTRAZELLULÄREN DELTA-DOMÄNE SIND FÜR DIE HOMOTYPISCHE WECHSELWIRKUNG NOTWENDIG UND HINREICHEND
  • Die Ergebnisse der homotypischen, durch Delta-Varianten vermittelten Aggregationsexperimente sind in Tabelle VI gezeigt. TABELLE VI HOMOTYPISCHE, DURCH DELTA-VARIANTEN VERMITTELTE AGGREGATION
    Konstrukt aggregiert nicht-aggregiert Experiment-Nr.
    Wild-Typ 38(H)A 175 1
    48(H) 171 2
    13(H) 95 3
    33(H) 173 4
    134(B) 72 5
    Del(Sca-Nae) 0(H) 200 1
    0(H) 200 2
    0(H) 200 3
    Del(Bam-Bgl) 0(H) 200 1
    0(H) 200 2
    0(H) 200 3
    Del(ELR1-ELR3) 160(B) 62 1
    55(B) 80 2
    0(B) 200 3
    4(B) 203 4
    41(B) 234 5
    4(B) 366 6B
    23(B) 325 (1:20)
    0(B) 400 7B
    5(B) 347 (1:5)
    10(B) 228 (1:20)
    0(B) 400 8B
    16(B) 346 (1:5)
    4(B) 268 (1:20)
    4(B) 500 9C
    18(B) 500 (1:5)
    12(B) 271 (1:20)
    7(B) 128 (1:50)
    0(B) 500 10C
    0(B) 500 (1:5)
    0(B) 500 (1:20)
    21(B) 246 (1:50)
    0(B) 500 11C
    5(B) 500 (1:5)
    8(B) 177 (1:20)
    4(B) 69 (1:50)
    Del(ELR4-ELR5) 21(H) 175 1
    29(H) 243 2
    35(H) 179 3
    Ter(Dde) 53(H) 164 1
    33(H) 178 2
    36(H) 203 3
    Ins(Nae) A 0(B) 200 1
    0(B) 200 2
    0(B) 200 3
    • A (H) bedeutet, dass Zellen in einem 25-ml-Erlenmeyer-Kolben aggregiert wurden; (B) bedeutet, dass Zellen in einer Mikrotiterplatte mit 12 Vertiefungen aggregiert wurden (siehe Materialien und Methoden).
    • B Die transfizierten Zellen wurden über Nacht unter Aggre gationsbedingungen inkubiert, anschließend in dem entsprechenden Volumen von Log-Phasen-S2-Zellen in Gegenwart von Inducer verdünnt und unter Aggregationsbedingungen für zusätzliche 4 bis 6 h inkubiert.
    • C Die transfizierten Zellen, denen Inducer zugesetzt wurden, wurden mit dem entsprechenden Volumen von Log-Phasen-S2-Zellen verdünnt, zu denen Inducer gegeben wurde, und das Zellgemisch wurde über Nacht unter Aggregationsbedingungen inkubiert.
  • Die Deletion der Delta-AA 32-198[Del(Sca-Nae)] oder der Delta-AA 192-331[Del(Bam-Bgl)] aus dem Delta-Volllängenprotein hob die Delta-Delta-Wechselwirkung auf. Die Deletion der Delta-AA 231-331[Del(ELR1-ELR3)] hob die Delta-Delta-Wechsel- Wirkung nicht auf. Darum sind die Sequenzen innerhalb der Delta-AA 32-230 zur Delta-Delta-Wechselwirkung erforderlich.
  • Offenbar sind Konformation und/oder Primärsequenz in der Nachbarschaft der Delta-AA 197/198 für die Delta-Delta-Wechselwirkung kritisch, da eine multimere Insertion des Tetrapeptids – Arg-Lys-Ile-Phe-(SEQ-ID-NR. 30)- zwischen diesen zwei Resten, wie im Ins(Nae)A-Konstrukt, die Delta-Delta-Wechselwirkung inaktivierte.
  • Zusätzlich könnte die Beobachtung, dass das Del(ELR1-ELR3)-Konstrukt die Aggregation stützten könnten, nahe legen, dass die ELR1-ELR3 für die Delta-Delta-Wechselwirkung nicht erforderlich sind; die Beobachtung, dass das Del(ELR-ELR5)-Konstrukt die Aggregation unterstützte, legt nahe, dass ELR4 und ELR5 für die Delta-Delta-Wechselwirkung nicht erforderlich sind, und die Beobachtung, dass das Ter(Dde)-Konstrukt die Aggregation stützte, legt nahe, dass die intrazelluläre Delta-Domäne für die Delta-Delta-Wechselwirkung nicht erforderlich ist.
  • Eine Zusammenfassung der Ergebnisse der Tests für die heterotypische und homotypische Aggregation mit verschiedenen Konstrukten ist in Tabelle VI A gezeigt. TABELLE VI A
    DURCH WILD-TYP- UND DELTA-PROTEINVARIANTEN VERMITTELTE AGGREGATION
    KONSTRUKT HETEROTYPISCHE AGGREGATIONa HOMOTYPISCHE AGGREGATIONb
    DELTA NOTCH DELTA
    Wild-Typ 33 ± 12c 26 ± 11c 27 ±10c
    Del (Sca-Nae) 0 0 0
    Del(Bam-Bgl) 0,4 ± 0,4 0,6 ± 0,6 0
    Del(ELR1-ELR3) 25 ± 11d 15 ± 3d 32 ± 15d
    Del(ELR4-ELR5) 17 ± 2 18 ± 2 13 ± 2
    Ter(Dde) 22 ± 1 18 ± 2 18 ± 3
    NAE B 25 ± 5 0 27 ± 7
    STU B 0 0 0
    NG1 0 0 0
    NG2 13 ± 1 23 ± 6 4 ± 1d
    NG3 16 ± 1 13 ± 1 27 ± 17
    NG4 0 0 0,5 ± 0,3
    • a: Hauptfraktion (%) von Delta- oder Notchzellen in Aggregaten von vier oder mehr Zellen (± Standardabweichung). N = 3 Wiederholungen, wenn nicht anders angegeben.
    • b: Gemittelter Bruchteil (%) von Delta-Zellen in Aggregaten von vier oder mehr Zellen (± Standardabweichung). N = 3 Wiederholungen, wenn nicht anders angegeben.
    • c: N = 5 Wiederholungen
    • d: N = 4 Wiederholungen
  • 8.2.3. AN HETEROTYPISCHEN UND HOMOTYPISCHEN WECHSELWIRKUNGEN BETEILIGTE DELTA-SEQUENZEN SIND QUALITATIV UNTERSCHIEDLICH
  • Die entsprechenden Merkmale der Delta-Sequenzen, die für eine heterotypische und homotypische Wechselwirkung wieder gepaart wurden, wurden weiterhin unter Verwendung von Delta-Varianten definiert, in die, kurz gesagt, Leseraster-interne translatierbare Linkerinsertionen in den Delta-Aminoterminus eingebracht wurden (das heißt, NAE B und STU B; 9, Tabelle VI A). Der Ersatz des Delta-Restes 132 (A) durch das Pentapeptid GKIFP (STU-B-Variante) führt zur Inaktivierung von heterotypischen und homotypischen Wechselwirkungsaktivitäten des Delta-Aminoterminus. Dies legt nahe, dass einige Delta-Sequenzen, die für diese beiden distinkten Wechselwirkungen erforderlich sind, zusammenfallen und in der Nähe des Rests 132 lokalisiert sind. Andererseits hob die Insertion des Tetrapeptids RKIF zwischen den Delta-Resten 198 und 199 (NAE B-Variante) die Fähigkeit des Delta-Aminoterminus zur Vermittlung von heterotypischer Wechselwirkung mit Notch auf, hat allerdings keine offensichtliche Auswirkung auf die Fähigkeit des veränderten Aminoterminus zur Vermittlung der homotypischen Wechselwirkung. Die Feststellung, dass die NAE B-Insertion nur eine der beiden Aktivitäten des Delta-Aminoterminus beeinflußt, legt nahe, dass die Delta-Sequenzen, die die heterotypische und homotypische Wechselwirkungen vermitteln, qualitativ verschieden sind, obgleich sie zusammenfallen.
  • 8.2.4 DELTA WIRD VON ZELLEN AUFGENOMMEN, DIE NOTCH EXPRIMIEREN
  • Im Laufe von vielen heterotypischen Aggregationsexperimenten haben wir festgestellt, dass das Delta-Protein manchmal in Zellen gefunden werden kann, die zur Expression von Notch, allerdings nicht von Delta, programmiert worden sind. Wir führen die heterotypische Aggregationstests durch Mischen von zunächst getrennten Populationen von S2-Zellen durch, die unabhängig mit Expressionskonstrukten transfiziert wurden, die die Expression entweder von Delta oder Notch programmieren. Doch wir haben unter Verwendung von Delta-spezifischen Antiseren oft eine Punkt-Anfärbung von Delta innerhalb der Notch-exprimierenden Zellen, die in heterotypischen Aggregaten vorkommen, nachgewiesen. Unsere Beobachtungen stehen im Einklang mit einer direkten Delta-Bindung an Notch an der Zelloberfläche und mit der anschließenden Befreiung der Zelloberfläche von diesem Delta-Notch-Komplex über Endocytose.
  • 8.3. DISKUSSION
  • 8.3.1. AMINO-TERMINALE SEQUENZEN, DIE NICHT MIT EGF VERWANDT SIND, SIND AN DER WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN DELTA UND NOTCH BETEILIGT
  • Wir haben Zellaggregationstests zur Definition einer Region innerhalb der Amino-proximalen Region der extrazellulären Delta-Domäne angewandt, die zur Vermittlung der Delta-Notch-Wechselwirkung notwendig und hinreichend ist. Funktionsanalysen einer Kombination von Deletions- und Suffizienz-Konstrukten ergab, dass diese Region, maximal, von AA 1 bis AA 230 verläuft. Auffallend ist, dass diese Region keine der EGF-artigen Sequenzen enthält, die sich innerhalb der extrazellulären Delta-Domäne befinden. Es ist wahrscheinlich, dass die bestimmten Delta-Sequenzen innerhalb des ausreichenden Intervalls, das zur Wechselwirkung mit Notch erforderlich ist, die AA 198-230 enthalten, da die Deletion dieser Reste die Notch-Bindungsaktivität aufhebt. Die Tatsache, dass die Deletion der AA 32-198 auch die Notch-Bindungsaktivität inaktiviert, legt nahe, dass die Sequenzen, die zu AA198 Aminoproximal sind, ebenfalls erforderlich sind, obwohl der nachteilige Einfluss dieser Deletion von der Entfernung zusätzlicher Aminosäuren in unmittelbarer Nachbarschaft der AA 198 herrühren könnte.
  • Die Sequenzen innerhalb von Delta, die zur Wechselwirkung mit Notch ausreichen, können in drei Subdomänen gruppiert werden – N1, N2 und N3 – die sich in ihrem jeweiligen Gehalt an Cysteinresten unterscheiden (10, SEQ-ID-NR. 3). Die N1- und N3-Domäne enthalten jeweils sechs Cysteinreste, während die N2-Domäne keine enthält. Die in N1- bzw. N3 vorhandene gleiche Anzahl von Cysteinen läßt die Möglichkeit zu, dass die jeweiligen Strukturen dieser Subdomänen teilweise durch die Bildung bestimmter Disulfidbindungen vorgegeben werden. Das breite Organisationsmuster des Delta-Aminoterminus ist in der Regel auch zu demjenigen der extrazellulären Domäne des Vertebraten-EGF-Rezeptors analog (Lax et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 1970-1978), in dem Sequenzen, von denen eine Wechselwirkung mit EGF angenommen wird, über zwei cysteinreiche Subdomänen gebunden sind.
  • 8.3.2. DELTA-SEQUENZEN, DIE FÜR DIE HOMOTYPISCHE UND FÜR. DIE HOMOTYPISCHE-HETEROTYPISCHE WECHSELWIRKUNGEN ERFORDERLICH SIND, FALLEN ANSCHEINEND ZUSAMMEN
  • Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass Sequenzen, die für die homotypische Delta-Wechselwirkung wesentlich sind, sich im Intervall AA32-230 befinden. Die Deletion der Sequenzen oder die Insertion zusätzlicher Aminosäuren in diese Amino-proximale Domäne hebt die Fähigkeit solcher Delta-Varianten, die Zellaggregation allein zu beschleunigen, auf. Somit lassen sich Sequenzen, die für die Delta-Delta-Wechselwirkung erforderlich sind, in die gleiche Domäne des Proteins kartieren, wie diejenigen, die für die Delta-Notch-Wechselwirkung erforderlich sind.
  • 8.3.3. DER DELTA-AMINOTERMINUS STELLT EIN EGF-BINDUNGSMOTIV DAR
  • Die in den Beispielen supra beschriebene Arbeit hat ergeben, dass Notch-Sequenzen, die für die Delta-Notch-Wechselwirkung im Zellaggregationstest erforderlich sind, in der EGF-artigen Wiederholungsreihe der extrazellulären Notch-Domäne verzeichnet sind. Diese Feststellung legt nahe, dass Delta und Notch aufgrund der Bindung des Delta-Aminoterminus an die EGF-artigen Sequenzen in Notch Wechselwirken und dass darum der Aminoterminus der extrazellulären Delta-Domäne eine EGF-Bindungsdomäne darstellt (11).
  • Diese Ergebnisse lassen auch die Möglichkeit entstehen, dass an der homotypischen Delta-Wechselwirkung das Binden des Delta-Aminoterminus an EGF-artige Sequenzen innerhalb der extrazellulären Delta-Domäne beteiligt ist (12). Allerdings sind keine der EGF-artigen Wiederholungssequenzen innerhalb der extrazellulären Delta-Domäne zu einer der EGF-artigen Wiederholungssequenzen innerhalb der extrazellulären Notch-Domäne identisch (13, SEQ-ID-NR. 6; Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581). Falls homotypische Delta-Wechselwirkungen tatsächlich durch Wechselwirkung zwischen dem Delta-Aminoterminus und den EGF-artigen Delta-Wiederholungs sequenzen vermittelt werden, dann besitzt die Delta-EGF-Bindungsdomäne angesichts dieser Tatsache das Vermögen zur Wechselwirkung mit mindestens zwei distinkten EGF-artigen Sequenzen.
  • 8.3.4. DELTA-SEQUENZEN, DIE AN DER DELTA-NOTCH-WECHSELWIRKUNG BETEILIGT SIND, SIND IM SERRATE-PROTEIN KONSERVIERT
  • Die Ausrichtung der Aminosäuresequenzen aus den Aminotermini von Delta (13, SEQ-ID-NR. 6 und 15, SEQ-ID-NR. 9) und Serrate (Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4, 2188-2201; Thomas et al., 1991, Devel. 111, 749-761) deckt eine auffallende Konservierung des strukturellen Charakters und der Sequenzzusammensetzung auf. Die allgemeine N1-N2-N3-Subdomänenstruktur des Delta-Aminoterminus wird ebenso wie das spezifische Auftreten von sechs Cysteinresten in der Delta-N1- und Delta-N3-homologen Domäne des Serrate-Proteins auch im Serrate-Aminoterminus festgestellt. Zwei bemerkenswerte konservierte Blöcke entsprechen Delta-AA63-73 (8/11 Reste identisch) und Delta-AA195-206 (10/11 Reste identisch). Letzterer Block ist von besonderem Interesse, da die Insertion zusätzlicher Aminosäuren in dieses Intervall die Fähigkeit von Delta zur Bindung an Notch oder Delta aufheben kann.
  • 8.3.5. AN CIS- UND TRANS-WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN DELTA UND NOTCH KÖNNEN VERSCHIEDENE SEQUENZEN INNERHALB VON NOTCH BETEILIGT SEIN
  • Die Überprüfung der Gesamtstrukturen von Delta und Notch legt nahe, dass an der Delta-Notch-Wechselwirkung Kontakte zwischen der Delta-EGF-Bindungsdomäne mit einer der beiden Regionen innerhalb von Notch beteiligt sein könnte, in Abhängigkeit davon, ob die Wechselwirkung zwischen Molekülen bestand, die sich auf gegenüberliegenden Membranen oder innerhalb der gleichen Membranen (11) angesiedelt sind. Die Zellaggregationstests, die vermutlich die Wechselwirkung von Molekülen in gegenüberliegenden Membranen nachweisen, legen nahe, dass die Delta-EGF-Bindungsdomäne mit den Notch-EGF-artigen Wiederholungssequenzen 11 und 12 wechselwirkt (siehe Beispiele supra). Wenn Tandemanordnungen der EGF-artigen Motive innerhalb der Delta- und Notch-Proteine tatsächlich stäbchenartige Strukturen bilden (Engel, 1989, FERS Lett. 251, 1-7), dann wäre die geschätzte Verschiebung der Delta-EGF-Bindungsdomäne von der Zelloberfläche vermutlich ausreichend, um die starre Anordnung der EGF-artigen Notch-Wiederholungssequenzen 1-10 aufzunehmen. Es ist ebenfalls interessant festzustellen, dass die Verschiebung der Delta-EGF-Bindungsdomäne von der Zelloberfläche diese Domäne in der Nachbarschaft der Notch-EGF-artigen Wiederholungssequenzen (25-29) anordnen könnte, die von Abruptex-Mutationen beeinflußt sind (Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417; Kelley et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108) und die Wechselwirkung von in der gleichen Membran vorhandenen Delta und Notch-Proteinen zulassen könnte.
  • 8.3.6. WECHSELWIRKUNGEN, DIE ZU DER DELTA-NOTCH-WECHSELWIRKUNG IN VERTEBRATEN ANALOG SIND
  • Angesichts der Wechselwirkung zwischen Delta und Notch in Drosophila ist es recht wahrscheinlich, dass in Vertebraten ein Delta-Homologes (Helta?) existiert und dass die qualitativen und molekularen Aspekte der Delta-Notch- und Delta-Delta-Wechselwirkungen, die wir in Drosophila definiert haben, in Vertebraten, einschließlich Menschen, stark konserviert sind. Solche Homologe können, wie supra, in Abschnitt 5.2., beschrieben, kloniert und sequenziert werden.
  • 9. SEQUENZEN, DIE NOTCH-SERRATE-WECHSELWIRKUNGEN VERMITTELN
  • Wir berichten über eine neue molekulare Wechselwirkung zwischen Notch und Serrate und zeigen, dass die beiden EGF-Wiederholungssequenzen von Notch, die Wechselwirkungen mit Delta vermitteln, nämlich die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12, auch eine Serrate-Bindungsdomäne darstellen.
  • Zum Testen, ob Notch und Serrate direkt Wechselwirken, wurden S2-Zellen mit einem Serrate-Expressionskonstrukt transfiziert und in unserem Aggregationstest mit Notch-exprimierenden Zellen gemischt. Für das Serrate-Expressionskonstrukt wurde ein synthetischer Primer, der eine künstliche BamHI-Stelle unmittelbar 5' zum Starter AUG an Position 442 enthält (sämtliche Sequenznummerierungen nach Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4:2188-2201) und bis Position 464 homolog ist, in Verbindung mit einen zweiten Primer aus der Position 681-698 zur Erzeugung eines DNA-Fragments von ca. 260 Basenpaaren verwendet. Dieses Fragment wurde mit BamHI und KpnI geschnitten (Position 571) und in Bluescript KS+(Stratagene) ligiert. Dieses Konstrukt, BTSer5'PCR, wurde durch Sequenzieren überprüft, anschließend mit KpnI geschnitten. Das Serrate-KpnI-Fragment (571-2981) wurde inseriert und die richtige Orientierung zur Erzeugung von BTSer5'PCR-Kpn ausgewählt. Das 5'-SacII-Fragment von BTSer5'PCR-Kpn (SacII-Stellen in Bluescript-Polylinker und in Serrate (1199)) wurde isoliert und zum Ersatz des 5'-SacII-Fragments von cDNA C1 verwendet (Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4:2188-2201), wodurch die Volllängen-Serrate-cDNA abzüglich der nichttranslatierten 5'-Regionen regeneriert wurde. Dieses Insert wurde durch einen SalI- und teilweisen BamHI-Abbau isoliert und unter Erzeugung des Ex pressions-Endkonstrukts Ser-mtn in die BamHI und SalI-Stellen von pRmHa-3 eingeschleust.
  • Wir fanden, dass Serrate-exprimierende Zellen Calciumabhängig an Notch-exprimierenden Zellen haften (6 und Tabelle VII). Allerdings wechselwirkt Serrate im Gegensatz zu Delta unter den experimentellen getesteten Bedingungen anscheinend nicht homotypisch. Zudem weisen wir keine Wechselwirkungen zwischen Serrate und Delta nach. TABELLE VII
    Wirkung von exogenem Ca++ auf Notch-Serrate-Wechselwirkunga
    Notch-Serrate
    ohne Ca++ mit Ca++
    1. pMtNMg 0 15
    32. ΔECN+EGF(10-12) 0 13
    33. ΔCla+XEGF(10-13) 0 15
    • a die Daten sind als Prozentgehalt von Notch-exprimierenden Zellen, die in Aggregaten vorkommen, (wie in 6) dargestellt. Sämtliche Zahlen stammen aus Transfektions-Einzelexperimenten (statt gemittelter Werte aus mehreren getrennten Experimenten, wie in 6).
  • Zur Kartierung der Serrate-Bindungsdomäne haben wir eine Unterreihe unserer Notch-Deletionskonstrukte getestet und haben festgestellt, dass die EGF-Wiederholungssequenzen 11 und 12 zusätzlich zur Bindung an Delta auch Wechselwirkungen mit Serrate vermitteln (6; Konstrukte Nr. 1, 7-10, 13, 16, 17, 19, 28 und 32). Zusätzlich wurde die Serrate-Bindungsfunktion dieser Wiederholungssequenzen offenbar auch in den entsprechenden zwei EGF-Wiederholungssequenzen von Xenopus-Notch (Nr. 33ΔCla+XEGF(10-13)) konserviert. Die Ergebnisse zeigen unzweideutig, dass Notch sowohl mit Delta als auch Serrate wechselwirkt und dass die beiden gleichen EGF-Wiederholungssequenzen von Notch beide Wechselwirkungen vermitteln. Wir waren auch in der Lage, die für die Notch/Serrate-Aggregation essentielle Serrate-Region zu definieren. Die Deletion der Nucleotide 676-1287 (d.h. Aminosäuren 79-282) (siehe 15) hebt die Fähigkeit des Serrate-Proteins zur Aggregation mit Notch auf.
  • Notch und Serrate aggregieren offenbar nicht so effektiv wie Notch und Delta, vielleicht aufgrund der schwächeren Notch-Serrate-Wechselwirkung. Bei Bewertung beispielsweise der Notch-Delta-Aggregate wiesen wir ca. 40 % sämtlicher Notch-exprimierender Zellen in Clustern mit Delta-exprimierenden Zellen nach (6, Nr. 1 pMtNMg) und ca. 40 % sämtlicher Delta-exprimierenden Zellen in Kontakt mit Notch-exprimierenden Zellen. Für Notch-Serrate finden wir nur ca. 20 % sämtlicher Notch-exprimierender Zellen (6; pMtNMg) und ca. 15 % sämtlicher Serrate-exprimierender Zellen in Aggregaten. Für die verschiedenen getesteten Notch-Deletionskonstrukte wiesen wir reproduzierbar eine Verminderung in der Menge der Aggregation zwischen Notch und Serrate im Vergleich zu den entsprechenden Notch-Delta-Niveaus (6) nach, mit der möglichen Ausnahme der Konstrukte Nr. 9 und 10, die auch mit Delta sehr stark verminderte Aggregationsniveaus aufwiesen. Eine triviale Erklärung für diese verminderte Aggregationsmenge könnte darin liegen, dass unser Serrate-Konstrukt einfach nicht soviel Protein wie das Delta-Konstrukt an der Zelloberfläche exprimiert, wodurch die Stärke der Wechselwirkung herabgesetzt wird. Alternativ kann die unterschiedliche Stärke der Wechselwirkung einen fundamenta len funktionellen Unterschied zwischen Notch-Delta- und Notch-Serrate-Wechselwirkungen anzeigen, der in vivo signifikant sein könnte.
  • 10. KLONIERUNG, SEQUENZIERUNG UND EXPRESSION VON HUMANEM NOTCH
  • 10.1. ISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG VON HUMANEM NOTCH
  • Die Klone für die humane Notch-Sequenz wurden zunächst unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Amplifikation von DNA aus einer 17-18 Wochen alten humanen fetalen Hirn-cDNA-Bibliothek im Lambda-Zap-II-Vektor (Stratagene) erhalten. Die bei dieser Reaktion verwendeten degenerierten Primer wurden durch Vergleich der Aminosäuresequenzen des Xenopus-Homologen von Notch mit Drosophila-Notch konstruiert. Drei Primer (cdc1 (SEQ-ID-NR. 10), cdc2 (SEQ-ID-NR. 11) und cdc3 (SEQ-ID-NR. 12); 16) wurden entweder zur Amplifikation eines 200-bp- oder eines 400-bp-Fragments als Primerpaare cdc1/cdc2 bzw. cdc1/cdc3 konstruiert.
  • Anschließend wurde das auf diese Weise erhaltene 400-bp-Fragment als Sonde verwendet, mit der die gleiche Bibliothek nach menschlichen Notch-Klonen durchmustert wurde. Die erste Durchmusterung ergab drei einzelne Klone, hN3k, hN2k und hN5k, von denen durch anschließende Sequenzanalyse gezeigt wurden, dass sie alle in das 3'-Ende des humanen Notch fallen (17). Eine zweite Durchmusterung unter Verwendung des 5'-Endes von hN3k als Sonde wurde zum Screening nach Klonen, die das 5'-Ende von humanem Notch enthalten, verwendet. Aus diesem Screening wurde ein einzelner Klon, hN4k, erhalten, und die vorläufigen Sequenzierungsdaten zeigen, dass er den größten Teil des 5'-Endes des Gens enthält (17). Zusammen umfassen die Klone hN4k, hN3k und hN5k etwa 10 kb des hu manen Notch-Homologen, beginnend früh in den EGF-Wiederholungssequenzen und verlaufend bis zur nicht translatierten 3'-Region des Gens. Alle drei Klone sind cDNA-Inserts in der EcoRI-Stelle von pBluescript-SK– (Stratagene). Der Wirtsstamm E. coli ist XL1-Blue (siehe Maniatis T., 1990, Molekular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, S. A12).
  • Die Sequenz der verschiedenen Teile von Notch, die in den cDNA-Klonen enthalten waren, wurde bestimmt (unter Verwendung von Sequenase®, U.S. Biochemical Corp.) und ist in den 19-22 (SEQ-ID-NR. 13 bis Nr. 25) gezeigt.
  • Die vollständigen Nucleotidsequenzen der humanen Notch-cDNA, die in hN3k und hN5k enthalten sind, wurden durch das Disdesoxykettenterminationsverfahren unter Verwendung des Sequenase®-Kit (U.S. Biochemical Corp.) bestimmt. Diejenigen Nuc eotidsequenzen, die, im entsprechenden Leseraster, humanes Notch codieren, wurden leicht identifiziert, da die Translation in nur einem der drei möglichen Leseraster eine Sequenz ergibt, mit, verglichen mit der veröffentlichten abgeleiteten Drosophila-Notch-Aminosäuresequenz, einer Sequenz mit einem wesentlichen Grad an Homologie zur Drosophila-Notch-Sequenz. Da keine Introns vorhanden sind, war die Translation sämtlicher drei möglichen Leseraster und der Vergleich mit Drosophila-Notch leicht, was zur schnellen Identifizierung der codierenden Region führt. Die DNA und die abgeleiteten Proteinsequenzen der humanen Notch-cDNA in hN3k und hN5k sind in den 23 bzw. 24 dargestellt. Klon hN3k codiert einen Teil eines Notch-Polypeptids, ausgehend von ungefähr der dritten Notch/lin-12-Wiederholungssequenz bis mehrere Aminosäuren kurz vor der carboxyterminalen Aminosäure. Klon hN5k codiert einen Teil eines Notch-Polypeptids, beginnend unge fähr vor der cdc10-Region, bis zum Ende des Polypeptids und enthält auch eine nichttranslatierte 3'-Region.
  • Der Vergleich der cDNA und der Proteinsequenzen, die in 23 dargestellt sind (SEQ-ID-NR. 31 und NR. 32), mit denjenigen in 24 (SEQ-ID-NR. 33 und NR. 34) ergibt nennenswerte Unterschiede zwischen den Sequenzen, was nahe legt, dass hN3k und hN5k Teil der beiden distinkten Notch-homologen Gene darstellen. Unsere Daten legen somit nahe, dass das humane Genom mehr als ein Notch-homologes Gen beherbergt. Dies steht im Gegensatz zu Drosophila, wo Notch anscheinend ein Einzelkopie-Gen ist.
  • Der Vergleich der DNA und der Aminosäuresequenzen der humanen Notch-Homologe, die in hN3k und hN5k enthalten sind, mit den entsprechenden Drosophila-Notch-Sequenzen (wie veröffentlicht bei Wharton et al., 1985, Cell 43:567-581) und mit den entsprechenden Xenopus-Notch-Sequenzen (wie veröffentlicht bei Coffman et al., 1990, Science 249:1438-1441, oder erhältlich von Genbank® (Zugangsnummer M33874)) ergab ebenfalls Unterschiede.
  • Die in 23 gezeigte Aminosäuresequenz (hN3k) wurde mit der vorhergesagten Sequenz des TAN-1-Polypeptids, das in 2 gezeigt ist, von Ellisen et al., August 1991, Cell 66:649-661, verglichen. Zwischen den abgeleiteten Aminosäuren wurden einige Unterschiede festgestellt, allerdings ist die hN3k-Notch-Polypeptid-Gesamtsequenz zu 99 mit der entsprechenden TAN-1-Region identisch (TAN-1-Aminosäuren 1455 bis 2506). Es wurden vier Unterschiede festgestellt: in der Region zwischen der dritten Notch/lin-12-Wiederholungssequenz und dem ersten cdc10-Motiv ist ein Arginin (hN3k) anstelle eines X (TAN-1-Aminosäure 1763) vorhanden; (2) ein Prolin (hN3k) ist anstelle eines X (TAN-1-Aminosäure 1787) vorhanden; (3) es liegt eine konservative Änderung eines Asparaginsäurerests (hN3k) anstelle eines Glutaminsäurerestes (TAN 1-Aminosäure 2495) vor; und (4) die carboxylterminale Region unterscheidet sich wesentlich zwischen den TAN-1-Aminosäuren 2507 und 2535.
  • Die in 24 gezeigte Aminosäuresequenz (hN5k) wurde mit der vorhergesagten Sequenz des in 2 gezeigten TAN-1-Polypeptids von Ellisen et al. August 1991, Cell 66:649-661, verglichen. Zwischen den abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden Unterschiede festgestellt. Das abgeleitete Notch-Polypeptid von hN5k ist in der cdc10-Region, die sowohl das cc10-Motiv (TAN-1-Aminosäuren 1860 bis 2217) als auch die gut konservierten flankierenden Regionen (25) enthält, zu 79 % zum TAN-1-Polypeptid (64 % Identität mit Drosophila-Notch) identisch. Die cdc10-Region deckt die Aminosäuren 1860 bis 2217 der TAN-1-Sequenz ab. Zusätzlich ist das hN5k codierte Polypeptid am carboxyterminalen Ende des Moleküls, das eine PEST(Prolin-, Glutaminsäure-, Serin-, Threonin)-reiche Region (TAN-1-Aminosäuren 2482 bis 2551) (25B) enthält, zu 65 % zum TAN-1-Polypeptid (44 % identisch zu Drosophila-Notch) identisch. Die Strecke von 215 Aminosäuren, die zwischen den vorgenannten Regionen liegt, ist bei jedem der durch hN3k, hN5k und TAN-1 dargestellten Notch-homologen Klone nicht gut konserviert. Keines, weder das hN5k-Polypeptid noch Drosophila-Notch, zeigt in dieser Region mit den anderen Proteinen nennenswerte Niveaus einer Aminosäureidentität (z.B. hN5k/TAN-1 = 24 % Identität; hN5k/Drosophila-Notch = 11 % Identität; TAN-1/Drosophila-Notch = 17 % Identität). Im Gegensatz dazu weisen Xenopus-Notch (Xotch) (SEQ-ID-NR. 35), Ratten-Notch (SEQ-ID-NR. 36) und TAN-1 (SEQ-ID-NR. 37) weiterhin nennenswerte Niveaus einer Aminosäureidentität auf (z.B. TAN-1/Ratten-Notch = 75 % Identität, TAN-1/Xenopus- Notch = 45 % Identität, Ratten-Notch/Xenopus-Notch = 50 % Identität).
  • Schließlich zeigt die Überprüfung der Sequenz der intrazellulären Domänen der Vertebraten-Notch-Homologe, die in 25B gezeigt sind, eine unerwartete Feststellung: all diese Proteine, einschließlich hN5k, enthalten in der konservierten Region, die den letzten der sechs cdc10-Wiederholungssequenzen folgt, ein vermeintliches CcN-Motiv, zu dem eine Kern-Bestimmungsfunktion gehört (25B). Obwohl Drosophila-Notch ein solches definiertes Motiv fehlt, ergab eine nähere Überprüfung seiner Sequenz das Vorliegen einer möglichen zweiteiligen Kern-Lokalisierungssequenz (Robbins et al., 1991, Cell 64:615-623), sowie möglicher CK-II- und cdc2-Phosphorylierungsstellen, alle in relativer Nähe zueinander, die somit möglicherweise einen alternativen Typ von CcN-Motiv definieren (25B).
  • 10.2. EXPRESSION VON HUMANEM NOTCH
  • Unter Verwendung der in Abschnitt 10.1 vorstehend diskutierten humanen Notch-cDNA-Klone wurden Expressionskonstrukte hergestellt. In den Fällen von hN3k und hN2k wurde der gesamte Klon als EcoRI-Restriktionsfragment aus seinem Vektor ausgeschnitten und in die EcoRI-Restriktionsstelle von jedem der drei pGEX-Vektoren (Glutathion-S-Transferaseexpressionsvektoren; Smith und Johnson, 1988, Gene 7, 31-40) subkloniert. Dies gestattet die Expression des Notch-Proteinprodukts aus dem Subklon im korrekten Leseraster. Im Falle von hN5k enthält der Klon zwei interne EcoRI-Restriktionsstellen, die 2,6-, 1,5- und 0,6-kb-Fragmente erzeugen. Sowohl das 2,6-kb- als auch das 1,5-kb-Fragment wurden ebenfalls in jeden der pGEX-Vektoren subkloniert.
  • Das pGEX-Vektorsystem wurde zum Erhalt einer Expression von humanen Notch-Fusions-(chimären)-Proteinen aus den nachstehend beschriebenen Konstrukten verwendet. Die klonierte Notch-DNA wurde in jedem Fall in Phase in den entsprechenden pGEX-Vektor inseriert. Anschließend wurde jedes Konstrukt in Bakterien (E. coli) elektroporiert und als Fusionsprotein, das die an den Carboxylterminus von Glutathion-S-Transferaseprotein fusionierten Notch-Proteinsequenz enthält, exprimiert. Die Expression der Fusionsproteine wurde durch die Analyse bakterieller Proteinextrakten durch Polyacrylamidgelelektrophorese bestätigt, die Proteinextrakte vergleicht, die aus Bakterien erhalten wurden, die die pGEX-Plasmide mit und ohne die inserierte Notch-DNA enthalten. Die Fusionsproteine waren in wässriger Lösung löslich und wurden durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Glutathionbeschichteter Agarose (da der Carboxylterminus von Glutathion-S-Transferase an Glutathion bindet) aus Bakterienlysaten gereinigt. Die exprimierten Fusionsproteine wurden, wie durch Western-Blot getestet, über einen Antikörper an Drosophila-Notch gebunden.
  • Die Konstrukte, die zur Herstellung von humanen Notch-Glutathion-S-Transferasefusionsproteinen verwendet wurden, waren wie folgt:
    hNFPNR2 – PCR wurde zum Erhalt eines Fragments beginnend unmittelbar vor den cdc10-Wiederholungssequenzen bei Nucleotid 192 des hN5k-Inserts bis unmittelbar vor die PESTreichere Region bei Nucleotid 1694 verwendet. Anschlie-Send wurde die DNA mit BamHI und SmaI abgebaut, und das resultierende Fragment wurde in pGEX-3 ligiert. Nach der Expression wurde das Fusionsprotein durch Binden an Glutathionagarose gereinigt. Das gereinigte Polypeptid wurde auf einem 4- bis 15%igen Polyacrylamid-Gradientengel quantifiziert. Das resultierende Fusionsprotein besaß ein ungefähres Molekulargewicht von 83 kd.
    hN3FPNR1 – Das gesamte hN3k-DNA-Insert (Nucleotid 1 bis 3235) wurde durch Abbau mit EcoRI aus dem Bluescript-(SK)-Vektor ausgeschnitten. Die DNA wurde in pGEX-3 ligiert.
    hN3FPNR2 – Ein 3'-Segment von hN3k-DNA (Nucleotid 1847 bis 3235) plus einige Polylinker wurden durch Abbau mit XmaI aus dem Bluescript-(SK)-Vektor ausgeschnitten. Das Fragment wurde in pGEX-1 ligiert.
  • Nach der Reinigung werden diese Fusionsproteine zur Herstellung entweder polyklonaler und/oder monoklonaler Antikörper gegen humanes Notch verwendet.
  • 11. HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
  • Die folgenden Rekombinationsbakterien, die jeweils ein Plasmid tragen, das einen Teil des humanen Notch codiert, wurden am 2. Mai 1991 bei der American Type Culture Collection, 1201 Parklaven Drive, Rockville, Maryland 20852, nach den Vorschriften des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke der Patentbearbeitung hinterlegt.
    Bakterien die enthalten: Plasmid ATCC-Zugangs-Nr.
    E. coli XL1-Blue hN4k 68610
    E. coli XL1-Blue hN3k 68609
    E. coli XL1-Blue hN5k 68611
  • Die Erfindung ist nicht durch den Umfang der hinterlegten Mikroorganismen oder durch die speziellen hier beschriebenen Ausführungsformen begrenzt. In der Tat sind den Fachleuten zusätzlich zu den hier beschriebenen Modifikationen auf Grund der vorhergehenden Beschreibung und den beigefügten Figuren verschiedene Modifikationen der Erfindung geläufig. Solche Modifikationen sollen in den Umfang der beigefügten Ansprüche fallen.
  • Es sind hier verschiedene Veröffentlichungen zitiert, deren Offenbarungen hiermit in ihrer Gesamtheit als Referenz mit umfaßt sind.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (29)

  1. Gereinigtes humanes Notch-Protein, für das eine erste Nucleinsäure codiert, die aus humaner DNA oder cDNA erhältlich ist und mit einer zweiten Nucleinsäure hybridisierbar ist, die aus der humanen Notch-Sequenz, oder deren Komplement, besteht, die enthalten ist in (a) Plasmid hN3k, das bei ATCC hinterlegt ist und die Hinterlegungs-Nr. 68609 erhalten hat, oder (b) Plasmid hN5k, das bei ATCC hinterlegt ist und die Hinterlegungs-Nr. 68611 erhalten hat, wobei das Protein in der Lage ist, an ein Delta-Protein zu binden, oder in der Lage ist, an einen Antikörper zu binden, der spezifisch für humanes Notch-Protein ist.
  2. Gereinigtes Protein, das die Aminosäuresequenz aufweist, die in 23 gezeigt ist, oder die Aminosäuresequenz, die in 24 gezeigt ist.
  3. Gereinigtes Protein, das die Notch-Aminosäuresequenz aufweist – für die die humane Notch-DNA-Sequenz codiert, die im Plasmid hN3k enthalten ist, das bei ATCC hinterlegt ist und die Hinterlegungs-Nr. 68609 erhalten hat, oder – für die die humane Notch-DNA-Sequenz codiert, die im Plasmid hN5k enthalten ist, das bei ATCC hinterlegt ist und die Hinterlegungs-Nr. 68611 erhalten hat.
  4. Gereinigtes Protein, das ein Fragment eines humanen Notch-Proteins nach Anspruch 1 ist, wobei das Fragment in der Lage ist, an ein Delta-Protein zu binden, oder in der Lage ist, an einen Antikörper zu binden, der spezifisch für humanes Notch-Protein ist.
  5. Gereinigtes Protein-Fragment nach Anspruch 4, wobei das Fragment ein Teil der Notch-Protein-Sequenz ist, für die die humane cDNA-Sequenz codiert, die in dem Plasmid hN3k enthal ten ist, das bei ATCC hinterlegt ist und die Hinterlegungs-Nr. 68609 erhalten hat, oder im Plasmid hN5K, das bei ATCC hinterlegt ist und die Hinterlegungs-Nr. 68611 erhalten hat.
  6. Gereinigtes Protein-Fragment nach Anspruch 4, das aufweist: – ein Fragment eines humanen Notch-Proteins, das aus der extrazellulären Domäne des Proteins besteht; – ein Fragment eines humanen Notch-Proteins, das aus der intrazellulären Domäne des Proteins besteht; – ein Fragment eines humanen Notch-Proteins, das aus der extrazellulären sowie Transmembran-Domänen des Proteins besteht; – ein Fragment eines humanen Notch-Proteins, das aus dem Abschnitt besteht, der die cdc10-Wiederholungseinheiten des Proteins enthält; – einen Abschnitt eines humanen Notch-Proteins, der aus den zum Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF) homologen Wiederholungseinheiten des Proteins besteht; oder – einen Abschnitt eines humanen Notch-Proteins, der aus den Notch/lin-12-Wiederholungseinheiten des Proteins besteht.
  7. Gereinigtes Protein-Fragment nach Anspruch 6, bei dem für die Sequenz der intrazellulären Domäne des Proteins und die Sequenz des Abschnitts, der die cdc10-Wiederholungseinheiten enthält, ein Abschnitt des Plasmids hN3k codiert, das bei ATCC hinterlegt ist und das die Hinterlegungs-Nr. 68609 erhalten hat, oder ein Abschnitt des Plasmids hN5k, das bei ATCC hinterlegt ist und die Hinterlegungs-Nr. 68611 erhalten hat.
  8. Gereinigtes Protein-Fragment nach Anspruch 4, das den Abschnitt eines humanen Notch-Proteins nach Anspruch 1 mit der größten Homologie zu den EGF-ähnlichen Wiederholungseinheiten 11 und 12 der Drosophila-Notch-Sequenz aufweist, wie sie in 8 (SEQ ID No:1) gezeigt ist.
  9. Gereinigtes Protein-Fragment nach Anspruch 4, – das aus der intrazellulären Domäne des Proteins besteht, oder – das aus der extrazellulären Domäne des Proteins besteht, oder – das aus der extrazellulären und Transmembran-Domänen des Proteins besteht.
  10. Gereinigtes Protein nach Anspruch 2 oder 3 oder gereinigtes Protein-Fragment nach Anspruch 4, das durch die Fähigkeit charakterisiert ist, in vitro, wenn es auf der Oberfläche einer ersten Zelle exprimiert wird, an ein Delta-Protein zu binden, das auf der Oberfläche einer zweiten Zelle exprimiert wird.
  11. Gereinigtes Protein nach Anspruch 2 oder 3 oder gereinigtes Protein-Fragment nach Anspruch 4, wobei das Fragment in der Lage ist, von einem Antikörper gebunden zu werden, der spezifisch für humanes Notch ist.
  12. Chimäres Protein mit einem Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem Protein-Fragment nach einem der Ansprüche 4 bis 11, die mit einer heterologen Protein-Sequenz verknüpft sind.
  13. Gereinigte Nucleinsäure, die kodiert für: ein humanes Notch-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3; ein Protein-Fragment nach einem der Ansprüche 4 bis 11; oder ein chimäres Protein nach Anspruch 12.
  14. Gereinigte Nucleinsäure nach Anspruch 13, die eine Sequenz aufweist, die für die Aminosäuresequenz kodiert, die in 23 oder 24 gezeigt ist.
  15. Gereinigte Nucleinsäure, die die humane Notch cDNA aufweist, die im Plasmid hN3k enthalten ist, das bei ATCC hinterlegt ist und die Hinterlegungs-Nr. 68609 erhalten hat, oder im Plasmid hN3k, das bei ATCC hinterlegt ist und die Hinterlegungs-Nr. 68611 erhalten hat, oder eine dazu komplementäre Nucleotidsequenz.
  16. Gereinigte Nucleinsäure nach Anspruch 13, die eine cDNA Sequenz aufweist, die für das Protein-Fragment von Anspruch 6 kodiert.
  17. Gereinigte Nucleinsäure nach Anspruch 13, die für das Protein-Fragment von Anspruch 8 codiert.
  18. Nucleinsäure-Vektor, der eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 17 aufweist.
  19. Rekombinante Zelle, die den Nucleinsäure-Vektor von Anspruch 18 enthält.
  20. Verfahren zur Herstellung: eines humanen Notch-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3; eines Protein-Fragments nach einem der Ansprüche 4 bis 11; oder eines chimären Proteins nach Anspruch 12, das das Züchten einer rekombinanten Zelle nach Anspruch 19 auf eine solche Weise umfasst, dass das Protein, das Protein-Fragment oder das chimäre Protein durch die Zelle exprimiert wird; sowie das Isolieren des Proteins, des Protein-Fragments oder chimären Proteins, die von der Zelle exprimiert wurden.
  21. Antikörper, der für humanes Notch spezifisch ist und an ein humanes Notch-Protein nach Anspruch 1 oder ein gereinigtes Protein-Fragment nach Anspruch 4 bindet.
  22. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers nach Anspruch 21, das das Immunisieren eines Wirtstieres mit einem Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, mit einem Protein-Fragment nach einem der Ansprüche 4 bis 11 oder mit einem chimären Protein nach Anspruch 12 sowie die Selektion eines Antikörpers umfasst, der an das Protein, das Protein-Fragment oder das chimäre Protein bindet.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
  25. Fragment oder Derivat des Antikörpers nach Anspruch 21, die den Idiotyp des Antikörpers enthalten.
  26. Antikörper, der für humanes Notch spezifisch ist, wobei der Antikörper an die Notch-Aminosäure-Sequenz des Proteins nach Anspruch 3 bindet.
  27. Verfahren zum Isolieren einer humanen Notch-Nucleinsäure, das umfasst: (a) das Inkontaktbringen einer Probe, die Nucleinsäuren enthält, die humane Nucleotidsequenzen umfassen, mit einer Nucleinsäure-Sonde, wobei die Sonde die Nucleinsäure nach Anspruch 13 oder einen Teil davon aufweist, unter Bedingungen, unter denen es zu einer Hybridisierung kommen kann; und (b) Isolieren einer Nucleinsäure in der Probe, die mit der Sonde hybridisiert.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem die Probe humane Notch-cDNA enthält, wobei die cDNA die DNA-Sequenz aufweist, die in 23 oder in 24 gezeigt ist.
  29. Verfahren zur Identifizierung eines Analogen eines adhäsiven toporhythmischen Proteins, das umfasst: (a) Testen eines Moleküls auf eine Bindung an ein humanes Notch-Protein nach Anspruch 1 oder einen Teil davon, der EGF-ähnliche Wiederholungseinheiten 11 und 12 aufweist; und (b) Identifizierung eines Moleküls, das in Stufe (a) bindet; wobei das Binden an ein humanes Notch-Protein anzeigt, dass das Molekül ein Analoges eines adhäsiven toporhythmischen Proteins ist.
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