DE69725856T2

DE69725856T2 - Neuritin, ein neurogen

Info

Publication number: DE69725856T2
Application number: DE69725856T
Authority: DE
Inventors: Eyde Lars THEILL; Scott Gregory NAEVE; Yoav Citri
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; Amgen Inc
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; Amgen Inc
Priority date: 1996-08-09
Filing date: 1997-08-07
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2017-08-08
Also published as: ES2210551T3; CA2262465A1; PT920501E; WO1998006843A1; US5859197A; DE69725856D1; DK0920501T3; KR20000029912A; HUP9904414A3; HUP9904414A2; CA2262465C; EP0920501B8; AU3829597A; EP0920501B1; ATE253115T1; CN1232500A; IL128411A0; JP2000516093A; EP1361272A1; AU714968B2

Description

Hintergrund
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue DNA-Sequenzen, welche ein Polypeptid mit Namen Neuritin kodieren, welches primär in bestimmten Geweben des Gehims als Antwort auf bestimmte Stimuli exprimiert wird.
Verwandter Stand der Technik
Eine Reihe neurologischer Funktionsstörungen und Krankheiten werden zumindest teilweise durch Degeneration oder Absterben bestimmter Klassen von Neuronen verursacht. Zum Beispiel ist die Parkinsonsche Erkrankung charakterisiert durch Verlangsamung von bewusst gesteuerter Muskelbewegung, durch muskuläre Starrheit und Zittern. Solche Symptome sind zumindest teilweise einer fortschreitenden Degenenerung von Dopamin produzierenden Neuronen zuzuordnen, welche in einer spezifischen Region des Gehirns lokalisiert sind, die Substantia nigra genannt wird. Degenerierung dieser Neuronen ("dopaminerge Neuronen") führt zu einer Verminderung des Dopamin-Spiegels in einer angrenzenden Region des Gehirns, genannt das Striatum. Das Striatum beinhaltet Neuronen, welche Rezeptoren für Dopamin ausprägen; diese Neuronen sind in die Kontrolle der motorischen Aktivität involviert. Die Ursache für die Degeneration von dopaminergen Neuronen ist unbekannt, wird aber freien Radikalen zugeordnet, übermäßigem Eisengehalt, Umweltgiften, stimulierender Aminosäureneurotoxizität, und möglicherweise einer Defizienz von bestimmten neurotropischen Faktoren (Jenner, Neurology, Suppl. 3: S6–S12 [1995]; Adams and Victor, eds. Principles of Neurology, Chapter 42: Degenerative Diseases of the Nervous System, McGraw Hill, NY [1993]).
Krankheiten, wie z. B. amyotrophe laterale Sklerose (ALS), progressive muskuläre Atrophie, und erbliche motorische und sensorische Neuropathie (Charcot-Marie-Tooth- Syndrom) resultieren alle zumindest teilweise in einem Zerfall motorischer Neuronen, welche alle im so genannten Vorderhorn des Rückenmarks lokalisiert sind.
Der Hippokampus, eine wohl definierte Struktur, welche Teil der Großhirnrinde des Gehirnsist, ist wichtig in der Ausprägung des Langzeitgedächtnisses. Zerstörung des Hippokampus, z. B. durch Ischämie, kann in einer Unfähigkeit zur Ausbildung neuer Erinnerungen resultieren. Degenerierung von pyramidalen CA1-Neuronen, welche in der CA1-Region des Hippokampus lokalisiert sind, ist ein Charakteristikum von Alzheimers Erkrankung. Diese gleichen Neuronen sind selektiv verletzbar durch ischämische und anoxische Schädigung, welche unter Bedingungen, wie z. B. Schlaganfall oder Schädeltrauma, auftreten. Darüber hinaus werden die CA1-pyramidalen Neuronen des Hippokampus wie auch die pyramidalen Neuronen, welche in der CA3-Region des Hippokampus lokalisiert sind, selektiv bei Epilepsie geschädigt.
Das Striatum ist die Innervierungsregion der Nervenenden von dopaminergeenthaltenden Neuronen der Substantia nigra. Die Mehrheit der Neuronen des Striatums verwenden GABA (4-aminobutyrische Säure) als ihre Neurotransmitter. Das Striatum ist das hauptsächliche Ziel der voranschreitenden Neurodegeneration, welche in Huntingtons Krankheit auftritt, bei welcher der hauptsächliche Verlust von Neuronen derjenige von GABA-verwendenden Neuronen des Striatums ist.
Die Serotonin enthaltenden Neuronen sind in Gruppen dicht zusammengedrängt um die Mittellinie des Rautenhirns angeordnet. Diese Neuronen sind in die Kontrolle der Körpertemperatur, von Stimmung und Schlaf involviert. Erkrankungen des Serotonin beinhaltenden Neuronensystems schließen z. B. Depression, andere Stimmungserkrankungen, und Schlafstörungen mit ein.
Fotorezeptorzellen stellen eine spezialisierte Untereinheit von Retinaneuronen dar und sind verantwortlich für die Sehkraft. Verletzung und/oder Absterben von Fotorezeptorzellen können zu Blindheit führen. Degenerierung der Netzhaut, wie z. B. durch Retinitis pigmentosa, altersabhängige makulare Degeneration und stationäre Nachtblindheit, sind alle durch die progressive Atrophie und den Verlust der Funktion der äußeren Fotorezeptorsegmente, welche spezialisierte Strukturen sind, die die Sehpigmente enthalten, welche Lichtanregung in elektrisches Potenzial umwandeln, charakterisiert.
Während einige Therapien zur Behandlung der Symptome und zur Verminderung der Schwere solcher Erkrankungen (z. B. L-Dopa zur Behandlung der Parkinsonschen Krankheit) verfügbar sind, gibt es derzeit keine effektive Behandlungsmethode zur Verhinderung oder Verminderung der Degeneration der meisten der oben erwähnten Klassen an betroffenen Neuronen oder zur Förderung ihrer Reparatur.
Vor kurzem wurden einige natürlich vorkommende proteinartige Moleküle, basierend auf ihrer trophischen Aktivität gegenüber verschiedenen Neuronen, identifiziert. Diese Moleküle werden als "neurotrophische Faktoren" bezeichnet: Neurotropische Faktoren sind endogene; lösliche Proteine, die das Überleben, Wachstum; und/oder die morphologische Plastizität von Neuronen regulieren (siehe Fallon und Laughlin, Neurotrophic Factors, Academic Press; San Diego, CA [1993]).
Die bekannten neutrophischen Faktoren gehören zu einer Reihe verschiedener Proteinsuperfamilien von polypeptidischen Wachstumsfaktoren, je nach ihrer Aminosäuresequenzhomologie und/oder ihrer dreidimensionalen Struktur (MacDonald und Hendrikson, Cell, 73: 421–424 [1993]). Eine Familie von neurotropischen Faktoren ist die Neurotrophin Familie: Diese Familie besteht zur Zeit aus NGF (nerve growth factor), BDNF (brain derived neurotrophic factor), NT-3 (Neurotrophin-3), NT-4 (Neurotrophin-4) und NT-6 (Neurotrophin-6).
CNTF (ciliary neurotrophic factor) und LIF (leukemia inhibitory factor) sind Zytokinpolypeptide, welche neurotropische Aktivität aufweisen. Aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften und Rezeptorkomponenten sind diese Polypeptide verwandt zu einer Familie von blutbitdenden Zytokinen, welche IL-6 (Interleukin-6), IL-11 (Interleukin-11), G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor} und Onkostatin-M beinhalten:
GDNF (glial derived neurotrophic factor) ist ein neurotropischer Faktor, der zu der TGF-beta (transforming growth factor Beta) Superfamilie gehört. GDNF zeigt starkes überlebens- und differenzierungsförderndes Potenzial für dopaminerge und motorische Neuronen (Lin et al., Science, 260: 1130–1132 [1993]; Yan et al., Nature, 373: 341–344 [1995]).
Während von diesen neurotropischen Faktoren bekannt ist, dass sie Wachstum und/oder das Überleben von Neuronen fördern, ist wenig bekannt über die Moleküle, welche in Verbindung mit diesen Faktoren arbeiten. Ein Verfahren, durch welche zusätzliche Neurotrophine und verwandte Moleküle identifiziert werden können, besteht in der Verabreichung von einer oder mehreren Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie einen Effekt auf das Nervensystem haben, an ein Versuchstier und in der anschließenden Analyse des Gewebes im Hinblick auf die Induktion von Genen, welche in der neuronalen Antwort auf diese Verbindungen eine Rolle spielen. Zum Beispiel kann man nach Genen screenen, welche in. bestimmten Geweben des Nervensystems induziert werden, z. B. in der hippokampalen Region des Gehirns. Diese Technik wurde von Nedivi et al. angewandt (Nature, 363: 718–722 [1993]; Nedivi et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93: 2048–2053 [1996]), um neue Gene zu identifizieren, welche im Abschnitt des Gyrus dentatum des Hippokampus als Antwort auf die Gabe eines Neurotransmitter-Analogons von Glutamat, genannt Kainat (Kaininsäure), induziert wurden.
Die Expression von vielen neurotropischen Faktoren, wie z. B. NGF, BDNF, NT3, GDNF, bFGF, IGF-1 und TGF-Beta wird durch afferente neuronale Aktivität und/oder durch neuronale Verletzung reguliert. Starke Induktion einiger dieser Gene kann im Gyrus dentatum des Hippokampus als Antwort auf das Glutamat Analogon Kainat beobachtet werden (Isackson, Current Opinions in Neurobiology 5: 50–357 [1995]). Die Behandlung mit Kainat erscheint die Freisetzung neuer Verbindungen aus dem Hippokampus von Versuchsratten zu verstärken. Diese Aktivität erscheint im Vergleich zur Aktivität bekannter neurotropischer Faktoren unterschiedlich zu sein (Humpel et al., Science, 269: 552–554 [1995]).
Angesichts der Tatsache, dass es für viele Störungen und Krankheiten des Nervensystems kein bekanntes Heilmittel gibt, besteht eine Notwendigkeit, in diesem Gebiet neue Verbindungen zur Behandlung neurologischer Zustände und Erkrankungen, wie z. B. der Parkinsonschen Krankheit, der amyotrophischen laterale Sklerose (ALS), von Alzheimers Krankheit, Schlaganfall und verschiedenen degenerativen Störungen, die sich auf das Sehvermögen auswirken, zu identifizieren.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen bereitzustellen, welche nützlich bei der Förderung der Regeneration von Neuronen und der Wiederherstellung neuraler Funktionen sein können.
Diese und andere Aufgaben werden für den gewöhnlichen Fachmann aus der folgenden Offenbarung offensichtlich.
Zusammenfassung der Erfindung
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäuremolekül bereit, welches ein Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) dem Nukleinsäuremolekül mit der SEQ ID Nr. 1;
(b) dem Nukleinsäuremolekül mit der SEQ ID Nr. 2;
(c) einem Nukleinsäuremolekül, kodierend für das Polypeptid mit der SEQ ID Nr. 3;
(d) einem Nukleinsäuremolekül, kodierend für das Polypeptid mit der SEQ ID Nr. 4;
(e) einem Nukleinsäuremolekül, welches für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 70 Prozent identisch ist mit dem vollständigen Polypeptid mit SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4; und
(f) einem Nukleinsäuremolekül, das das Komplement irgendeiner Nukleinsäure von (a)–(e) oben ist.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Vektoren bereit, welche die Nukleinsäuremoleküle wie oben dargestellt umfassen.
In noch einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Wirtszellen bereit, welche diese Vektoren umfassen.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Neuritin-Polypeptids bereit umfassend die folgenden Schritte:

(a) Expression eines Polypeptids, kodiert durch die Nukleinsäure von Anspruch 1 in einem geeigneten Wirt; und
(b) Isolieren des Polypeptids.

Optional ist das Neuritin-Polypeptid dasjenige mit der SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Neuritin-Polypeptid bereit, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) dem Polypeptid mit der SEQ ID Nr. 3;
(b) dem Polypeptid mit der SEQ ID Nr 4; und
(c) einem Polypeptid, das zumindest 70 Prozent homolog mit dem Polypeptid von (a) oder (b) ist.

Optional kann das Neuritin-Polypeptid ein biologisch aktives Fragment von Neuritin sein, z. B. ein solches mit den Aminosäuren 25–115, 25–143, mit den Aminosäuren 1–115 oder dergleichen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 stellt eine cDNA-Sequenz von Ratten-Neuritin (SEQ ID Nr. 1) dar.
2 stellt eine cDNA-Sequenz von menschlichem Neuritin (SEQ ID Nr. 2) dar.
3 stellt die in Gesamtlänge translatierte Aminosäuresequenz von Ratten-Neuritin dar (SEQ ID Nr. 3).
4 stellt die in Gesamtlänge translatierte Aminosäuresequenz von menschlichem Neuritin (SEQ ID Nr. 4) dar.
5 stellt zwei Northern-Blots dar. 5A ist ein Northern-Blot, in welchem verschiedene von Ratten stammenden Gewebe einer Neuritin-Probe getestet wurden. Abkürzungen sind h (Herz); br (brain/Gehirn); sp (spleen/Milz); lu (Lunge); li (liver/Leber); m (Muskel); k (kidney/Niere); t (testis/Hoden). 5B ist ein Nor them-Blot aus verschiedenen Regionen des Gehirns, entweder von im Kontrollexperiment-verwendeten Ratten (–) oder von mit Kaininsäure behandelten Ratten (+). Abkürzungen sind Zereb (Zerebellum); Hipp (Hippokampus); DG (Gyrus dentatum). Dieser Blot wurde mit einer Neuritin-Probe getestet.
6 stellt verschiedene Northern-Blots dar. 6A zeigt einen Northern-Blot von hippokampalen und kortikalen Neuronen von Ratten behandelt mit BDNF, NT-3, FGF, AMPA, NMDA oder KCl. Kontrollproben "0" wurden keiner Behandlung unterzogen. 6B zeigt einen Northem-Blot mit RNA, stammend aus Hippokampus und Kortex, welche aus Ratten erhalten wurden, die mit Salzlösung ("S") oder BDNF ("B") induziert wurden. "0" steht für keine Behandlung.
7 ist ein Graph, welcher die zeitliche Entwicklung der Induktion des NeuritinmRNA-Spiegels in Ratten-E-18-Neuronen des Hippokampus als Antwort auf die Behandlung mit entweder BDNF oder KCl zeigt.
8 stellt zwei Western-Blots dar, welche mit Antikörpern gegen Neuritin durchgeführt wurden. 8A zeigt einen Western-Blot durchgeführt mit CHO-Zellen, welche entweder mit Kontrollplasmid ("parental") oder mit Plasmid, welches das Gen, das für das menschliche Neuritin in Gesamtlänge kodiert (Zelllinie mit "CHO 15.4" bezeichnet), transfiziert wurden. "PI-PLC" bezieht sich auf Phosphinositol-phosphoüpase C und "+" und "=" beziehen sich auf die An- oder Abwesenheit von PI-PLC. 8B stellt einen Western-Blot aus verschiedenen Geweben von Ratten dar. Der Blot wurde durchgeführt mit einem Neuritin-Antikörper. Abkürzungen für die Gewebe, welche in diesem Blot untersucht wurden, finden sich im Text.
9 stellt Kulturen des Hippokampus ("Hipp") und Kortex ("Cort") von Neuronen von Rattenembryonen dar, welche in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) vonNeuritin inkubiert wurden. "Dil" beziehen sich auf die Behandlung mit dem lipophilen fluoreszierenden Farbstoff Dil.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Neuritin", wenn sie verwendet wird, um ein Nukleinsäuremolekül zu beschreiben, auf ein Nukleinsäuremolekül oder Fragment davon, das (a) die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 dargestellt, aufweist; (b) eine Nukleinsäuresequenz aufweist, welche für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 70 Prozent identisch ist, aber zumindest zu 80 Prozent oder 90 Prozent identisch sein kann mit dem Polypeptid, welches durch eine der Sequenzen mit SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 kodiert wird; (c) eine natürlich vorkommende allele Variante von (a) oder (b) ist; (d) eine Nukleinsäurevariante zu (a)–(c) ist, welche, wie hierin zur Verfügung gestellt, hergestellt wird; und/oder (e) komplementär zu Sequenz (a)–(d) ist.

Prozentuale Sequenzidentität kann bestimmt werden durch Standard Verfahren, welche üblicherweise verwendet werden, um Ähnlichkeit in der Position der Aminosäuren von zwei Polypeptiden zu vergleichen. Mit einem Computerprogramm, wie z. B. BLAST oder FASTA, werden zwei Polypeptide für das optimale Zusammenbringen ihrer entsprechenden Aminosäuren ausgerichtet (entweder entlang der Gesamtlängen einer oder beider Sequenzen oder entlang eines vorbestimmten Teils von einer oder beiden Sequenzen). Die Programme wählen eine "Standardeinstellung" Anfangswert und eine "Standardeinstellung" Lückenwert bereit, und eine Ergebnismatrix, wie z. B. PAM 250 (eine Standardergebnismatrix; siehe Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, Supp. 3 [1978]) kann in Verbindung mit einem Computerprogramm verwendet werden. Die prozentuale Identität kann dann wie folgt berechnet werden:

Polypeptide, welche mindestens 70 Prozent identisch sind, werden typischerweise eine oder mehrere Aminosäurensubstitutionen, Deletionen und/oder Insertionen aufweisen. Üblicherweise werden die Substitutionen konservativ sein, so dass sie wenig oder keinen Effekt auf die Gesamtnettoladung, Polarität oder Hydrophobizität des Proteins ha ben, aber optional die Aktivität von Neuritin vergrößern können. Konservative Substitutionen werden in der Tabelle I unten dargestellt. Tabelle I Konservative Aminosäuresubstitionen

Basisch:	Arginin Lysin Histidin
Sauer:	Glutaminsäure Aspartinsäure
Polar:	Glutamin Asparaginsäure
Hydrophob:	Leucin Isoleucin Valin
Aromatisch:	Phenylalanin Tryptophan Tyrosin
Klein:	Glycin Alanin Serin Threonin Methionin

Die Bezeichnung "stringente Konditionen" bezieht sich auf die Hybridisation und das Waschen unter Konditionen, welche nur die Bindung von einem Nukleinsäuremolekül, wie z. B. einem Oligonukleotid oder einer cDNA-Molekül einer cDNA-Molekülprobe an eine hochhomologe Sequenz erlauben. Eine stringente Waschlösung besteht aus 0.15 M NaCl, 0.005 M NaCitrat und 0.1 Prozent SDS verwendet bei einer Temperatur von 55°C–65°C. Eine andere stringente Waschlösung besteht aus 0.2 × SSC und 0.1 Prozent SDS verwendet bei der Temperatur zwischen 50°C und 65°C. Wo Oligonukleotidproben verwendet werden, um cDNA oder genomische Bibliotheken zu screenen, kön nen die folgenden stringenten Waschbedingungen verwendet werden. Eine Vorschrift verwendet 6 × SSC mit 0.05 Prozent Natriumpyrophosphat bei einer Temperatur von 35°C–62°C, abhängig von der Länge der Oligonukleotidprobe. Zum Beispiel werden 14 Basenpaare lange Proben bei 35–40°C gewaschen, 17 Basenpaare lange Proben werden bei 45-50°C gewaschen, 20 Basenpaare lange Proben werden bei 52–57°C gewaschen und 23 Basenpaar lange Proben werden bei 57–63°C gewaschen. Die Temperatur kann um 2–3°C erhöht werden, wo der nicht-spezifisch bindende Hintergrund hoch erscheint. Ein zweites Protokoll verwendet Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) zum Waschen von Oligonukleotidproben. Eine stringente Waschlösung besteht aus 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 und 0.2 Prozent SDS. Die Waschtemperatur verwendend diese Lösung ist eine Funktion von der Länge der Probe. Zum Beispiel wird eine 17 Basenpaar lange Probe bei 45–50°C gewaschen.
Die Bezeichnung "Neuritin-Protein" oder "Neuritin-Polypeptid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jegliches Protein oder Polypeptid, welches die Eigenschaften aufweist, die hierin für Neuritin beschrieben werden. Das Neuritin-Polypeptid kann ein Aminoterminales Methionin aufweisen oder auch nicht, abhängig von der Art und Weise, in der es hergestellt wird. Zur besseren Illustration: Neuritin-Protein oder Neuritin-Polypeptid bezieht sich auf (1) eine Aminosäuresequenz, welche durch das Nukleinsäuremolekül, wie oben in irgendeinem Abschnitt (a)–(e) dargelegt, kodiert wird und Peptide oder Polypeptidfragmente abgeleitet davon, (2) die Aminosäuresequenz welche in SEQ ID Nr. 3 oder 4 dargelegt wird und/oder (3) chemisch modifizierte Derivate sowohl als auch Nukleinsäure- und/oder Aminosäuresequenzvarianten davon, wie sie hierin zur Verfügung gestellt werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Neuritin-Fragment" auf ein Peptid oder auf ein Polypeptid, welches weniger als die Aminosäuresequenz des natürlich vorkommenden Neuritin-Proteins in ihrer Gesamtlänge ist, aber substanziell die gleiche biologische Eigenschaft wie das Neuritin-Polypeptid oder Neuritin-Protein wie oben beschrieben aufweist. Solch ein Fragment kann am Aminosäureende, am Carboxylende (wie z. B. an der GPI-Ankerdomäne, welche in etwa die letzten 27 Aminosäuren des Neuritin-Polypeptids ausmacht) und/oder internal gekappt sein und kann chemisch modifiziert sein. Bevorzugt wird das Neuritin-Fragment eines sein, welches zumindest alle 6 Cysteinreste aufweist. Solche Neuritin-Fragmente können mit oder ohne ein Aminoterminales Methionin hergestellt werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Neuritin-Derivativ" oder "Neuritin-Variante" auf ein Neuritin-Polypeptid oder ein Neuritin-Protein, welches 1) chemisch modifiziert wurde, wie z. B. durch Addition von Polyethylenglykol oder andere Verbindungen und/oder 2) eine oder mehrere Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzsubstitutionen, Deletionen und/oder Insertionen im Vergleich zu Neuritin, wie in 3 oder 4 dargestellt, enthält. Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "biologisch aktives Polypeptid" und "biologisch aktives Fragment" auf ein Peptid oder Polypeptid, welches Neuritin-Aktivität aufweist, z. B. Neuritogenesis im hippokampalen oder kortikalen neuronalen Kulturen fördert.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Bezeichnungen "effektive Menge" und "therapeutisch effektive Menge" auf die Menge an Neuritin, welche notwendig ist, um eine oder mehrere biologische Aktivitäten von Neuritin, wie oben dargelegt, zu erhalten.
Neuritin-Polypeptide, welche bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, können natürlich vorkommende Peptide in Gesamtlänge oder gekappte Polypeptide oder Peptide (d. h. "Fragmente") sein. Die Polypeptide oder Fragmente können chemisch modifiziert, d. h. glykosyliert, phosphoryliert und/oder, wie unten beschrieben, an ein Polymer gebunden sein, und sie können ein Amino-endständiges Methionin aufweisen, je nachdem wie sie hergestellt werden. Darüber hinaus können die Polypeptide oder Fragmente Varianten von natürlich vorkommendem Neuritin-Polypeptid sein (d. h. können eine oder mehrere Aminosäuredeletionen, Insertionen und/oder Substitutionen beinhalten, verglichen mit dem natürlich vorkommenden Neuritin).
Das Polypeptid in Gesamtlänge oder ein Fragment davon kann unter Verwendung wohl bekannter rekombinanter DNA-Technologie-Verfahren hergestellt werden, wie z. B. derjenigen, die in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboraton Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]) und/oder Ausubel et al.; eds. (Current protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. und Wiley and Sons, NY [1994]) dargelegt sind. Ein Gen oder eine cDNA kodierend für das Neuritin-Protein oder Fragment davon kann z. B. durch Screening einer genomischen oder cDNA-Bibliothek oder durch PCR-Amplifikation erhalten werden. Alternativ kann ein Gen kodierend für das Neuritin-Polypeptid oder Fragment durch chemische Synthese unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, welche dem Fachmann wohl bekannt sind, wie z. B. denjenigen, die von Engels et al. beschrieben werden (Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716-734 [1989]). Diese Verfahren beinhalten u. a. die Phosphotriester-, Phosphoramidit- und N-Phosphonat-Verfahren zur Nukleinsäuresynthese. Ein bevorzugtes Verfahren für eine solche chemische Synthese ist die Polymer-gestützte Synthese, welche Standardphosphoramiditchemie verwendet. Typischerweise wird die DNA, welche das Neuritin-Polypeptid kodiert, mehrere 100 Nukleotide lang sein. Nukleinsäuren, welche größer als ungefähr 100 Nukleotide sind, können als mehrere Fragmente unter Verwendung dieses Verfahrens synthetisiert werden. Die Fragmente können dann miteinander ligiert werden, um das Gesamtlängen-Neuritin-Polypeptid zu bilden. Üblicherweise wird das DNA-Fragment kodierend für das Aminoende des Polypeptids ein ATG aufweisen, welches einen Methioninrest kodiert. Dieses Methionin kann in der reifen Form des Neuritin-Polypeptids gegenwärtig sein oder auch nicht, je nachdem, ob das Polypeptid, welches in der Wirtszelle produziert wurde, von dieser Zelle abgesondert wird.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Nukleinsäure- und/oder Aminosäurevarianten natürlich vorkommenden Neuritins herzustellen. Nukleinsäurevarianten (in denen ein oder mehrere Nukleotide entworfen werden, um sich vom Wildtyp natürlich vorkommenden Neuritins zu unterscheiden) können unter Verwendung von site-directed-Mutagenese oder PCR-Amplifikation hergestellt werden, wo der/die Primer die gewünschte Punktmutationen aufweisen (siehe Sambrook et al., supra, und Ausubel et al., supra, für Beschreibungen der Mutagenese Techniken). Chemische Synthese unter der Verwendung von Verfahren, beschrieben von Engels et al., supra, können auch durch zur Herstellung solcher Varianten verwendet werden. Andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können ebenso verwendet werden. Bevorzugte Nukleinsäurevarianten sind solche, welche Nukleotidsubstitutionen enthalten, welche Kodonpräferenz in der Wirtszelle begründen, welche zur Herstellung von Neuritin verwendet wird. Andere bevorzugte Varianten sind solche, welche für konservative Aminosäureänderungen, wie oben beschrieben, im Vergleich zum Wildtyp kodieren (wie z. B. worin Ladung oder Polarität der natürlich vorkommenden Aminosäurenseitenkette nicht substanziell durch Substitution mit einer unterschiedlichen Aminosäure verändert ist) und/oder solche, welche designed wurden, um entweder (eine) neue Glykosylierungs- und/oder (ei ne) Phosphorylierungsstelle(n) in Neuritin zu generieren, oder solche, welche designed wurden, um (eine) exisitierende Glykosylierungs- und/oder Phosphorylierungsstelle(n) in Neuritin zu deletieren.
Das Neuritin-Gen oder die Neuitin-cDNA können in einen geeigneten Expressionsvektor zur Expression in einer Wirtszelle insertiert werden. Der Vektor ist so gewählt, dass er in einer bestimmten Wirtszelle funktionell eingesetzt wird (d. h. der Vektor ist kompatibel mit dem Mechanismus der Wirtszelle, so dass Amplifikation des Neuritin-Gens und/oder Expression des Gens eintreten kann). Das Neuritin-Polypeptid oder Fragment davon kann in einer prokaryontischen, Hefe-, Insekten- (Baculovirussysteme) und/oder eukaryontischen Wirtszelle amplifiziert oder exprimiert werden. Die Selektion der Wirtszelle wird zumindest entscheidend davon abhängen, ob das Neuitin-Polypeptid oder Fragment davon glykosyliert sein soll. Wenn ja, sind Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen bevorzugt; Hefezellen werden das Polypeptid glykosylieren und Insekten- und Säugerzellen können das Polypeptid, wie es natürlich beim Neuritin-Polypeptid vorkommt (d. h. "native" Glykosylierung und/oder Phosphorylierung), glykosylieren und/oder phosphorylieren.
Typischerweise werden diese Vektoren, welche in einer der Wirtszellen verwendet werden, 5'-flankierende Sequenzen (bezeichnet als "Promotor") und ebenso andere regulatorische Elemente enthalten, wie z. B. (einen) Enhancer, einen Ursprung eines Replikationselements, ein transkriptionales Terminationselement, eine vollständige Intronsequenz beinhaltend eine Donor- und Akzeptorsplicesite, eine Signalpeptidsequenz, ein Ribosom bindendes Siteelement, eine Polyadenylierungssequenz, eine Polylinkerregion zur Insertierung der Nukleinsäure, welche das zu exprimierende Polypeptid kodiert, und ein wählbares Markerelement. Jedes dieser Elemente wird unten erläutert. Optional kann der Vektor eine "Tag"-Sequenz, d. h. eine Oligonukleotidsequenz lokalisiert am 5'oder 3'-Ende der für Neuritin kodierenden Sequenz, welche PolyHis kodiert (wie z. B. HexaHis), enthalten oder eine andere kleine immunogene Sequenz. Dieses Tag wird zusammen mit dem Protein exprimiert und kann als Affinitätsmarkierung zur Reinigung des Neuritin-Polypeptids aus der Wirtszelle dienen. Optional kann das Tag anschließend von dem aufgereinigten Neuritin-Polypeptid auf verschiedene Arten entfernt werden, wie z. B. unter Verwendung einer ausgewählten Peptidase.
Die 5'-flankierende Sequenz kann homolog sein (d. h. von derselben Spezies und/oder demselben Stamm wie die Wirtszelle), heterolog (d. h., von einer Spezies verschieden von der Wirtszellenspezies oder dem Wirtszellenstamm), ein Hybrid (d. h. eine Kombination von 5'-flankierenden Sequenzen aus mehr als einer Quelle), synthetisch oder sie kann die natürliche Neuritin-5'-flankierende Sequenz sein. Als solche kann die Quelle der 5'-flankierenden Sequenz ein unizellulärer prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus sein, ein Wirbeltier- oder Nichtwirbeltierorganismus, eine Pflanze, vorausgesetzt, dass die 5'-flankierende Sequenz darin funktioniert, und kann durch die Mechanistik der Wirtszelle aktiviert werden.
Die 5'-flankierende Sequenz für den Gebrauch in den Vektoren der vorliegenden Erfindung kann durch eine der etlichen Verfahren, welche im Stand der Technik hinlänglich bekannt sind, erhalten werden. Typischerweise werden hierbei brauchbare 5'flankierende Sequenzen, welche verschieden von der Neuritin-5'-flankierenden Sequenz sind, zuvor durch Kartierung und/oder durch Restriktionsendonuklease-Aufschluß identifiziert worden sein und können daher von der geeigneten Gewebequelle unter Verwendung von geeigneten Restriktionsendonukleasen isoliert werden. In einigen Fällen kann die gesamte Nukleotidsequenz der 5'-flankierenden Sequenz bekannt sein. Hier kann die 5'-flankierende Sequenz unter der Verwendung der oben beschriebenen Verfahren zur Nukleinsäuresynthese oder zum Klonen synthetisiert werden.
Wo alle oder nur ein Abschnitt der 5'-flankierenden Sequenz bekannt sind, kann sie unter der Verwendung von PCR und/oder durch Screenen einer genomischen Bibliothek mit geeigneten Oligonukleotiden und/oder 5'-flankierenden Sequenzfragmenten derselben oder einer anderen Art erhalten werden.
Wo die 5'-flankierende Sequenz nicht bekannt ist, kann ein DNA-Fragment enthaltend eine 5'-flankierende Sequenz aus einem größeren Stück DNA isoliert werden, die z. B. eine kodierende Sequenz oder sogar ein anderes Gen oder andere Gene enthalten kann. Die Isolierung kann durch Aufschließen mit Restriktionsendonuclease abgeschlossen werden, wobei ein oder mehrere sorgsam ausgewählte Enzyme verwendet werden, um das richtige DNA-Fragment zu isolieren. Nach Aufschluss kann das gewünschte Fragment durch Agarosegelaufreinigung, Qiagen^®Säule oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren isoliert werden. Die Wahl geeigneter Enzyme zum Erreichen dieses Ziels wird einem gewöhnlichen Fachmann sofort offensichtlich sein.
Die Replikationselemente stammen ursprünglich typischerweise von einem Teil von prokaryontischen Expressionsvektoren, welche kommerziell erworben werden, und Hilfsmitteln zur Amplifikation des Vektors in der Wirtszelle. Die Amplifikation des Vektors in einer bestimmten Kopienzahl kann in einigen Fällen für die optimale Expression des Neuritin-Polypeptids wichtig sein. Falls der Vektor der Wahl keinen Ursprung für eine Replikationssite beinhaltet, kann eine solche chemische Stelle basierend auf einer bekannten Sequenz synthetisiert werden und in einen Vektor ligiert werden.
Das Transkriptionsterminationselement ist typischerweise lokalisiert am 3'-Ende der Neuritin-Polypeptid-kodierten Sequenz und dient zur Terminierung der Transkription des Neuritin-Polypeptids. Üblicherweise ist das Transkriptionsterminationselement in prokaryontischen Zellen ein G-C-reiches Fragment, auf welches eine Poly-T-Sequenz folgt. Obwohl das Element leicht aus einer Bibliothek geklont oder sogar als Teil eines Vektors kommerziell gekauft wird, kann es auch leicht unter Verwendung von Verfahren für die Nukleinsäuresynthese, z. B. die oben beschriebenen, synthetisiert werden.
Ein selektives Markergenelement kodiert ein Protein, welches für das Überleben und Wachstums einer Wirtszelle in einem ausgewählten Nährmedium notwendig ist. Typische Selektionsmarkergene kodieren Proteine, weiche (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, wie z. B. Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin für prokaryontische Wirtszellen, vermitteln, (b) auxotrophe Mängel der Zelle kompensieren; oder (c) kritische Nährstoffe bereitstellen, welche nicht in komplexen Medien verfügbar sind. Bevorzugte wählbare Marker sind das Kanamycinresistenzgen, das Ampicillinresistenzgen und das Tetracyclinresistenzgen.
Das ribosombindende Element, allgemein Shine-Dalgarno-Sequenz (Prokaryonten) oder die Kozak-Sequenz (Eukaryonten) genannt, ist notwendig zur Initiation der Translation von mRNA. Das Element ist typischerweise 3' vom Promotor und 5' zur kodierenden Sequenz des Neuritin-Polypeptids, welches synthetisiert werden soll, lokalisiert. Die Shine-Dalgarno-Sequenz variiert, ist aber typischerweise ein Polypurin (d. h. hat einen hohen A-G-Anteil). Viele Shine-Dalgamo-Sequenzen sind identifiziert worden, wobei jede davon einfach unter der Verwendung von Vrfahren, wie oben dargelegt, synthetisiert und in prokaryontischen Vektoren werden kann.
In den Fällen, wo es wünschenswert ist, dass Neuritin von der Wirtszelle sekretiert wird, kann eine Signalsequenz verwendet werden, um das Neuritin-Polypeptid aus der Wirtszelle, in der sie synthetisiert wird, herauszuleiten, und der Carboxy-endständige Teil des Proteins kann deletiert werden, um Membranverankerung zu verhindern. Typischerweise ist die Signalsequenz in der kodierenden Region der Neuritin-Nukleinsäuresequenz positioniert oder direkt am 5'-Ende der für Neuritin kodierenden Region. Viele Signalsequenzen sind identifiziert worden und jede davon, welche in der ausgewählten Wirtszelle funktionell ist, kann in Verbindung mit dem Neuritin-Gen verwendet werden. Im diesem Zusammenhang kann die Signalsequenz homolog oder heterolog zum Neuritin-Polypeptid sein und kann homolog oder heterolog zu dem Neuritin-Polypeptid sein. Darüber hinaus kann die Signalsequenz chemisch unter Verwendung von Verfahren, wie oben dargestellt, synthetisiert werden. In den meisten Fällen wird die Sekrektion des Polypeptids aus der Wirtszelle über die Präsenz eines Signalpeptids in der Entfernung des Amino-endständigen Methionins vom Polypeptid resultieren. Um die Absonderung zu ermöglichen, kann die C-terminale Region des Neuritin-Polypeptids entfernt werden. Diese C-terminale Region ist ungefähr 27 Aminosäuren lang und viele der Aminosäuren sind hydrophob; desweiteren gibt es eine übereinstimmende Spaltungssignalsequenz, welche in vielen Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerten Proteinen in dieser Region gefunden wird.
In vielen Fällen wird die Transkription des Neuritin-Polypeptids durch die Gegenwart von einem oder mehreren Introns auf dem Vektor vergrößert; dies trifft besonders für eukaryontische Wirtszellen zu, speziell für Säugetierwirtszellen. Das Intron kann natürlich in der Neuritin-Nukleinsäuresequenz, speziell wo die Neuritin-Sequenz als genomische Sequenz in Gesamtlänge oder Fragment davon verwendet wird, vorkommen. Wo das Intron nicht natürlicherweise innerhalb der Neuritin-DNA-Sequenz (wie bei den cDNAs) vorkommt, können das/die Intron(s) aus einer anderen Quelle erhalten werden. Die Position des Introns im Verhältnis zu der 5'-flankierenden Sequenz und der für Neuritin kodierenden Sequenz ist wichtig, da das Intron transkribiert werden muss, um effektiv zu sein. Wo die Neuritin-Nukleinsäuresequenz eine cDNA-Sequenz ist, ist die bevorzugte Position als solche für das Intron 3' zur Transkriptionsstartsite und 5' zu der Poly-A- Transkriptionsterminationssequenz. Bevorzugt für Neuritin-cDNAs wird das Intron auf der einen oder anderen (d. h. 3' oder 5') zu der Neuritin-kodierenden Sequenz so lokalisiert sein, dass es nicht diese kodierenden Sequenz unterbricht. Jedes Intron aus jeder Quelle, einschließlich jedes viralen, prokaryontischen oder eukaryontischen (Pflanze oder Tier) Organismus kann verwendet werden, um diese Erfindung zu praktizieren, vorausgesetzt, dass es kompatibel mit der/den Wirtszelle(n) ist, in welche es insertiert ist. Ebenfalls eingeschlossen hierbei sind synthetische Introns. Optional kann mehr als ein Intron in dem Vektor verwendet werden.
Wo ein oder mehrere der Elemente, wie oben dargestellt, noch nicht im Vektor, welcher verwendet werden soll, vorhanden sind, können diese individuell erhalten und in den Vektor legiert werden. Verfahren, welche zum Erhalt eines jeden dieser Elemente verwendet werden, sind dem Fachmann wohl bekannt und sind vergleichbar zu den Verfahren, wie oben dargestellt (d. h. Synthese der DNA, Bibliothekenscreening, usw.).
Die letztendlichen Vektoren, welche zum Ausführen dieser Erfindung verwendet werden, sind typischerweise konstruiert aus einem Ausgangsvektor, z. B. einem kommerziell verfügbaren Vektor. Solche Vektoren können einige der Elemente enthalten, welche in dem fertigen Vektor enthalten sein sollen oder auch nicht. Wenn keines der gewünschten Elemente im Ausgangsvektor enthalten ist, kann jedes Element individuell in den Vektor durch Schneiden des Vektors mit geeigneter (geeigneten) Restriktionsendonuclease(n) ligiert werden, so dass die Enden des hineinzuligierenden Elements und die Enden des Vektors kompatibel für die Ligation sind. In manchen Fällen kann es nötig sein, die aneinander zu ligierenden Enden „abzustumpfen", um eine zufriedenstellende Ligation zu erhalten. Das Abstumpfen wird durch ein erstes Einfüllen von "klebrigen Enden" unter der Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase oder T4-DNA-Polymerase in der Gegenwart von allen vier Nukleotiden bewerkstelligt. Dieses Verfahren ist im Stand der Technik wohl bekannt, wie z. B. in Sambrook et al., supra.
Alternativ können zwei oder mehr der in den Vektor zu insertierenden Elemente zuerst aneinander ligiert werden (wenn sie nebeneinander in Position gebracht werden sollen), dann in den Vektor ligiert werden.
Ein anderes Verfahren zur Konstruktion des Vektors ist es, alle Ligationen der verschiedenen Elemente gleichzeitig in einer Reaktionsmischung durchzuführen. Damit werden viele unsinnige und nicht funktionelle Vektoren durch unsachgemäße Ligation oder Insertion von Elementen erzeugt, jedoch können die funktionellen Vektoren identifiziert werden und durch Aufschließen mit Restriktionsendonuklease ausgewählt werden.
Bevorzugte Vektoren zur Durchführung dieser Erfindung sind solche, welche kompatibel mit bakteriellen, von Insekten und Säugetieren stammenden Wirtszellen sind. Solche Vektoren schließen u. a. pCRII (Invitrogen Company, San Diego, CA), pBSII (Stratagene Company, LaJolla, CA) und pETL (BlueBacII; Invitrogen) ein.
Nachdem der Vektor konstruiert worden ist und eine Neuritin-Nukleinsäure an der richtigen Stelle in den Vektor insertiert worden ist, kann der fertige Vektor in eine geeignete Wirtszelle zur Amplifikation und/oder Neuritin-Polypeptid-Expression eingesetzt werden.
Wirtszellen können prokaryontische Wirtszellen sein (wie z. B. E. coli) oder eukaryontische Wirtszellen (wie z. B. eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Wirbeltierzelle). Die Wirtszelle kann, wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, Neuritin-Protein synthetisieren, welches in der Folge aus dem Kulturmedium (wenn die Wirtszelle es in das Medium sekretiert) oder direkt aus der es produzierenden Wirtszelle (wenn es nicht sekretiert wird) gesammelt werden kann. Nach Sammeln kann das Neuritin-Protein unter Verwendung von Verfahren wie z. B. Molekularsiebchromatografie, Affinitätschromatografie und dergleichen gereinigt werden.
Die Wahl der Wirtszelle wird teilweise davon abhängen, je nachdem, ob das Neuritin-Protein glykosyliert werden soll oder phosphoryliert werden soll (in diesem Fall sind eukaryontische Wirtszellen bevorzugt), und von der Art und Weise, in welcher die Wirtszelle in der Lage ist, das Protein in eine native Tertiärstruktur (z. B. richtige Orientierung der Disulfidbrücken etc.) "zu falten", so dass das biologisch aktive Protein in der Zelle hergestellt wird. Wo jedoch die Wirtszelle biologisch aktives Neuritin nicht synthetisiert, kann das Neuritin nach der Synthese unter der Verwendung geeigneter chemischer Bedingungen, wie unten diskutiert, "gefaltet werden".
Geeignete Zellen oder Zelllinien können Säugetierzellen, wie z. B. Chinesische Hamster-Eierstockzellen (CHO) oder 3T3-Zellen sein. Die Auswahl geeigneter Säugetierzellen und Verfahren zur Transformation, Kultivierung, Amplifikation, Screenen und Produktherstellung und Reinigung sind im Stand der Technik bekannt. Andere geeignete Säugetierzellen sind die Affenzelllinien COS-1 und COS-7 und die CV-1-Zelllinie. Weitere exemplarische Säugetierzellen schließen Primatenzelllinien und Nagetierzelllinien, einschließlich transformierte Zelllinien, ein. Normale diploide Zelllinien, abgeleitet von in vitro Kulturen von primärem Gewebe, als auch von primären Explantaten, sind ebenso geeignet. Kanditatenzellen können in dem Selektionsgen genotypisch unzulänglich sein oder können ein dominant agierendes Selektionsgen beinhalten. Andere geeignete Säugetierzelllinien schließen HeLa-Zellen, Maus-L-929-Zellen, 3T3-Linien, abgeleitet aus Swiss-, Balb-c- oder NIH-Mäusen, BHK- oder HaK-Hamsterzelllinien ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ähnlich nützlich als Wirtszellen geeignet für die vorliegende Erfindung sind Bakterienzellen. Zum Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E, coli (z. B. HB101, DH5α, DH10 und MC1061) als Wirtszellen im Feld der Biotechnologie wohl bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas spp., andere Bacillus spp., Streptomyces spp. und dergleichen können auch für dieses Verfahren eingesetzt werden.
Viele Stämme von Hefezellen, welche dem Fachmann bekannt sind, sind auch als Wirtszellen für die Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung verfügbar. Darüber hinaus können, wo gewünscht, Insektenzellen als Wirtszellen in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden (Miller et al., Genetic Engineering 8: 277-298 [1986]).
Insertion (auch gekennzeichnet als "Transformation" oder "Transfektion") des Vektors in die ausgewählte Wirtszelle kann unter der Verwendung solcher Verfahren wie Kalziumchlorid, Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektion oder der DEAE-Dextranmethode vollendet werden. Das gewählte Verfahren wird teilweise eine Funktion des Typs der Wirtszelle, welche verwendet wird, sein. Diese Verfahren oder andere geeigneten Verfahren sind dem Fachmann wohl bekannt und sind z. B. in Sambrook et al., supra, dargestellt.
Die Wirtszellen, welche den Vektor (d. h. transformiert oder transfektiert) enthalten, können unter Verwendung von Standardmedien, welche dem Fachmann wohl bekannt sind, kultiviert werden. Diese Medien werden üblicherweise alle Nährstoffe enthalten, welche notwendig für das Wachstum und Überleben dieser Zellen sind. Geeignete Medien zur Kultivierung von E. coli-Zellen sind z. B. Luria Broth (LB) und/oder Terrific Broth (TB). Geeignete Medien zur Kultivierung von Eukaryontenzellen sind RPMI 1640, MEM, DMEM, von denen alle um Serum und/oder Wachstumsfaktoren ergänzt werden können, wie es von besonderen Zelllinien zur Kultivierung benötigt wird. Ein geeignetes Medium der Insektenkulturen ist das Grace-Medium, ergänzt um Yeastolat, Lactalbuminhydrolysat und/oder je nach Bedarf fötales Kälberserum.
Typischerweise wird ein Antibiotikum oder ein anderer Wirkstoff geeignet für das selektive Wachstum transformierter Zellen nur als Ergänzung zum Medium hinzugefügt. Der Wirkstoff, welcher verwendet werden soll, wird diktiert durch das selektierbare Markerelement, welches in dem Plasmid vorhanden ist, mit welchem die Wirtszelle transformiert wurde. Wo das wählbare Markerelement beispielsweise Kanamycinresistenz ist, wird der Wirkstoff, welcher zum Kultivierungsmedium hinzugefügt wird, Kanamycin sein.
Die Menge von Neuritin-Polypeptid, welche in der Wirtszelle produziert wird, kann unter Verwendung von Standardverfahren, welche im Stand der Technik wohl bekannt sind, ausgewertet werden. Solche Verfahren schließen ohne Einschränkung Western-Blot-Analyse, SDS-Polyacrylamidgeielektrophorese, nicht-denaturierende Gelelektrophorese, HPLC-Separation, Immunopräzipitation und/oder Aktivitätsassays, wie DNA-bindende Gelshiftassays, ein.
Wenn das Neuritin-Polypeptid so designed wurde, dass es von der Wirtszelle sekretiert wird, wird Polypeptid zum größten Teil wahrscheinlich im Zellkulturmedium zu finden sein. Polypeptide, welche auf diese Weise hergestellt werden, werden typischerweise kein Amino-endständiges Methionin besitzen, da dieses bei der Sekretion aus der Zelle entfernt wird. Wenn jedoch Neuritin-Polypeptid nicht aus der Wirtszelle sekretiert wird, wird es im Zytoplasma vorliegen (für eukaryontische grampositive Bakterien- und Insektenwirtszellen) oder im Periplasma (für gramnegative Bakterienwirtszellen) und kann ein Amino-endständiges Methionin haben.
Für intrazelluläres Neuritin-Protein werden die Wirtszellen üblicherweise zuerst mechanisch oder osmotisch zerstört, um den Inhalt des Zytoplasmas in eine gepufferte Lösung freizusetzen. Neuritin-Polypeptid kann dann aus dieser Lösung isoliert werden.
Die Reinigung von Neuritin-Polypeptid aus der Lösung kann unter der Verwendung einer Reihe von Techniken vollendet werden. Wenn das Polypeptid so synthetisiert worden ist, dass es ein Tag beinhaltet, z. B. Hexahistidin (Neuritin/HexaHis) oder andere kleine Peptide an entweder seinem Carboxyl- oder Aminoende, kann es notwendigerweise in einem einstufigen Prozess durch Passieren der Lösung durch eine Affinitätssäule gereinigt werden, wobei die Säulenmatrix eine hohe Affinität für das Tag oder für das Polypeptid direkt (d. h. ein monoklonaler Antikörper, welcher spezifisch Neuritin erkennt) aufweist. Zum Beispiel bindet Polyhistidin mit großer Affinität und spezifisch an Nickel, und deshalb kann eine Affinitätssäule aus Nickel (wie z. B. Qiagennickelsäulen) zur Reinigung von Neuritin/PolyHis verwendet werden. (Siehe z. B. Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).
Wo das Neuritin-Polypeptid kein Tag aufweist und keine Antikörper verfügbar sind, können andere wohl bekannte Verfahren zur Aufreinigung genutzt werden. Solche Verfahren schließen ohne Einschränkung Ionenaustauscher-Chromatographie, Molekularsieb-Chromatografie, HPLC, native Gelelektrophorese in Kombination mit Geleluienung und präparative elektrische Fokussierung ("Isoprime"-Maschine/Technik, Hoefer Scientific) mit ein. In einigen Fällen können zwei oder mehrere dieser Techniken kombiniert werden, um einen höheren Reinheitsgrad zu erreichen. Bevorzugte Verfahren zur Reinigung schließen PolyHistidin-Tagging und Ionenaustauscher-Chromatografie in Kombination mit präparativer isoelektrischer Fokussierung ein.
Wenn es zu erwarten ist, dass Neuritin-Polypeptid in erster Linie im periplasmatischen Raum der Bakterien oder im Zytoplasma von eukaryontischen Zellen zu finden ist, können die Inhalte des periplasmatischen Raumes oder des Zytoplasmas, einschließlich Einschlusskörper (z. B. gramnegative Bakterien), wenn das prozessierte Polypeptid Komplexe gebildet hat, aus der Wirtszelle unter Verwendung jeglicher Standardtechnik , welche der Fachmann kennt, extrahiert werden. Zum Beispiel kann die Wirtszelle lysiert werden, um die Inhalte des Periplasmas durch Französische Presse, Homogenisation und/oder Auflösen in Ultraschallbad freizusetzen. Das Homogenat kann dann zentrifugiert werden.
Wenn das Neuritin-Polypeptid Einschlusskörper im Periplasma gebildet hat, können die Inklusionskörper oft an innere und/oder äußere zelluläre Membranen binden und werden daher in erster Linie nach der Zentrifugation im Niederschlag gefunden werden. Das Niederschlagsmaterial kann dann mit einem chaotropen Agens, wie z. B. Guanidin oder Harnstoff behandelt werden, um Einschlusskörper freizusetzen, aufzubrechen und in Lösung zu bringen. Das Neuritin-Polypeptid in seiner jetzt löslichen Form kann dann unter Verwendung von Gelelektrophorese, Immunopräzipitation oder dergleichen analysiert werden. Wenn es gewünscht ist, das Neuritin-Polypeptid zu isolieren, kann die Isolation unter der Verwendung von Standardverfahren bewerkstelligt werden, wie z. B. diejenigen, die weiter unten und in Marston et al. (Meth. Enz., 182: 264–275 [1990]) dargestellt sind.
Wenn Neuritin-Polypeptid-Einschlusskörper nicht in einem signifikanten Ausmaß im Periplasma der Wirtszelle gebildet werden, wird das Neuritin-Polypeptid in erster Linie nach der Zentrifugation des Zellhomogenats im Überstand zu finden sein und das Neuritin-Polypeptid kann aus dem Überstand unter der Verwendung von Vertahren, wie unten dargestellt, isoliert werden.
In denjenigen Situationen, wo es bevorzugt ist, das Neuritin-Polypeptid partiell oder komplett zu isolieren, kann die Aufreinigung unter Verwendung von Standardverfahren , welche dem Fachmann wohl bekannt sind, vervollständigt werden. Solche Verfahren schließen ohne Einschränkung Trennung durch Elektrophorese, gefolgt von Elektroeluierung, verschiedene Typen von Chromatografie (Immunoaffinität, Molekularsieb und/oder Ionenaustauscher) und/oder Hochdruckflüssigkeits-Chromatografie ein. In solchen Fällen kann es bevorzugt sein, mehr als eines dieser Verfahren zur vollständigen Aufreinigung zu verwenden.
Zusätzlich zur Herstellung und zur Reinigung von Neuritin-Polypeptid unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken können Neuritin-Polypeptidfragmente und/oder Derivate davon durch chemische Syntheseverfahren (wie z. B. Festphasenpeptidsynthese) unter der Verwendung von Vektoren, welche im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden wie diejenigen, die von Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 [1964]), Houghten et al. (Proc Natl Acad. Sci. USA, 82: 5132 [1985]) und Stewart und Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem Co., Rockford, IL [1984]) dargestellt wurden. Solche Polypeptide können mit oder ohne Amino-endständiges Methionin synthetisiert werden. Chemisch synthetisierte Neuritin-Polypeptide oder Fragmente können unter Verwendung von Verfahren, wie in diesen Verweisen dargestellt, oxidiert werden, um Disulfidbrücken zu bilden. Die Neuritin-Polypeptide oder Fragmente können als biologisch aktive oder immunologische Substitute für natürliches, aufgereinigtes Neuritin-Polypeptid in therapeutischen und immunologischen Verfahren eingesetzt werden.
Chemisch modifizierte Neuritin-Verbindungen (d. h. "Derivate"), in denen das Neuritin-Polypeptid mit einem Polymer verknüpft ist ("Neuritin-Polymere"), sind im Umfang der vorliegenden Erfindung miteingeschlossen. Das gewählte Polymer ist typischerweise wasserlöslich, so dass das Protein in wässriger Umgebung, wie in einer physiologischen Umgebung, nicht ausfällt. Das gewählte Polymer ist üblicherweise modifiziert, so dass es eine einzelne reaktive Gruppe hat, wie z. B. eine aktive Estergruppe zur Acylierung oder ein Aldehyd zur Alkylierung, so dass der Grad der Polymerisation, wie er in den vorliegenden Verfahren bereitgestellt wird, kontrolliert werden kann. Ein bevorzugter reaktiver Aldehyd ist Polyethylenglykolpropionaldehyd, welcher wasserstabil ist, oder Mono-C₁-C₁₀-alkoxy- oder -aryloxy- Derivate davon (siehe US-Patent 5,252,714). Das Polymer kann verzweigt oder unverzweigt sein. Eingeschlossen im Umfang der Neuritin-Polymere ist eine Mischung aus Polymeren. Bevorzugt für die therapeutische Verwendung der Endprodukt Präparation wird das Polymer pharmazeutisch aufnehmbar sein. Das wasserlösliche Polymer oder eine Mischung davon kann aus der Gruppe bestehend aus z. B. Polyethylenglykol (PEG), Monomethoxy-polyethylenglykol, Dextran, Cellulose oder anderen kohlenhydratbasierten Polymeren, Poly-(N-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, Propylenglykolhomopolymeren, einem Polypropylenoxid/ethylenoxidcopolymer, polyoxyethylierten Polyolen (z. B. Glycerol) und Polyvinylalkohol ausgewählt werden. Für die Acetylierungsreaktion sollten die ausgewählten Polymere eine einzelne reaktive Estergruppe haben. Für die reduktive Alkylierung sollten das/die gewählte(n) Polymer(e) eine einzelne reaktive Aldehydgruppe haben. Das Polymer kann jegliches Molekulargewicht haben und kann verzweigt oder unverzweigt sein.
Pegylierung von Neuritin kann durch jegliche der im Stand der Technik bekannten Pegylierungsreaktionen durchgeführt werden, wie z. B. in den folgenden Verweisen beschrieben: Focus on Growth Factors 3: 4–10 (1992); EP 0 154 316 ; und EP 0 401 384 . Vorzugsweise wird die Pegylierung über eine Acylierungsreaktion oder eine Alkylierungsreaktion mit einem reaktiven Polyethylenglykolmolekül (oder einem analog reaktiven wasserlöslichen Polymer), wie unten beschrieben, durchgeführt.
Pegylierung durch Acetylierung involviert generell die Reaktion eines aktiven Esterderivats von Polyethylenglykol (PEG) mit einem Neuritin-Protein.. Jedes bekannte oder nachfolgend entdeckte reaktive PEG-Molekül kann verwendet werden, um die Pegylierung von Neuritin durchzuführen. Der bevorzugter aktivierter PEG-Ester ist PEG, welcher mit N-Nydroxysuccinimid ("NHS") verestert ist. Wie hierin verwendet, beachtet man "Acylierung" als ohne Einschränkung die folgenden Typen von Verknüpfungen zwischen Neuritin und einem wasserlöslichen Polymer, wie z. B. PEG, einschließend: Amid, Carbamat, Urethan und dergleichen, wie beschrieben in Bioconjugate Chem. 5: 133–140 (1994). Die Reaktionsbedingungen können aus irgendwelchen derjenigen der im Stand der Technik zur Pegylierung bekannten Bedingungen ausgewählt werden oder solchen, die nachfolgend entwickelt werden, unter der Voraussetzung, dass Bedingungen, wie Temperatur, Lösungsmittel und pH, welche die Neuritin-Spezies, welche modifiziert werden soll, inaktivieren würden, vermieden werden.
Pegylierung durch Acylierung resultiert üblicherweise in einem polypegylierten Neuritin Produkt, in welchem die Lysin-ε-aminogruppen über eine Acylverknüpfungsgruppe pegyliert sind. Bevorzugt wird , die verknüpfende Bindung ein Amid sein. Ebenso bevorzugt wird das resultierende Produkt mindestens zu ungefähr 95 Prozent mono-, dioder tripegyliert sein. Jedoch werden normalerweise einige Vertreter mit höheren Pegylierungsgraden in Ausneuten gebildet werden (bis zur Maximalzahl der Lysin-ε-aminosäuregruppen von Neuritin plus eine α-Aminogruppe am Aminoterminus von Neuritin), welche von den spezifischen Reaktionsbedingungen abhängen, welche verwendet werden. Wenn gewünscht kann mehr aufgereinigte pegylierte Spezies, besonders nicht reagierte Spezies, aus der Mischung unter Verwendung von Standardaufreinigungstechniken, welche u. a. Dialyse, Aushalten, Ultrafiltration, lonenaustauscher, Chromatografie, Gelfiltrationschromatografie und Elektrophorese einschließen, abgetrennt werden.
Pegylierung durch Alkylierung involviert generell das Reagieren eines endständigen Aldehydderivats von PEG mit einem Protein, wie Neuritin, in der Gegenwart eines reduzierenden Agens. Unabhängig vom Grad der Pegylierung werden die PEG-Gruppen bevorzugt an ein Protein über CH₂-NH- -Gruppen gebunden. In besonderer Bezugnahme auf die -CH₂- -Gruppe wird dieser Bindungstypus hierin als eine "Alkyl"-Bindung bezeichnet.
Derivatisierung über reduktive Alkylierung zur Herstellung eines monopegylierten Produkts nutzt die unterschiedliche Reaktivität von verschiedenen Typen von primären Aminogruppen (Lysin versus N-Terminus) aus, welche zur Derivatisierung von Neuritin verfügbar sind. Typischerweise wird diese Reaktion unter einem pH (siehe unten) durchgeführt, welcher die Möglichkeit bietet, pK_a-Unterschiede zwischen den ε-Aminogruppen der Lysinreste und den α-Aminogruppen des N-terminalen Rests. des Proteins auszunutzen. Für eine solche selektive Derivatisierung wird die Verknüpfung eines wasserlöslichen Polymers, welches eine reaktive Gruppe, wie z. B. ein Aldehyd, enthält, an ein Protein wie folgt kontrolliert: die Verknüpfung tritt überwiegend am N-Terminus des Proteins auf ohne signifikante Modifizierung anderer reaktiver Gruppen, wie den Lysin-Seitenketten Aminogruppen auf. Die vorliegende Erfindung stellt eine substanziell homogene Herstellung von Neuritin-Monopolymer-Protein-verknüpften Molekülen (d. h. dass an das Neuritin-Protein nur ein Polymermolekül angeknüpft ist (d. h. zumindest zu über 95%)) an einer einzigen Stelle auf dem Neuritin-Protein bereit. Im Speziellen stellt die vorliegende Erfindung, wenn Polyethylenglykol verwendet wird, auch pegyliertes Neuritin-Protein bereit, welches möglicherweise keine Antigenbindungsstellen aufweist und in welchem das Polyethylenglykol-Molekül direkt an das Neuritin-Protein gebunden ist.
Ein besonders bevorzugtes wasserlösliches Polymer für die Verwendung hierin ist Polyethylenglykol, abgekürzt PEG. Wie hierin verwendet, schließt der Begriff Polyethylenglykol alle Formen von PEG ein, welche für die Derivatisierung von anderen Proteinen verwendet wurden, wie Mono-(C₁-C₁₀)alkoxy- oder -aryloxy-Polyethylenglykol.
Generell kann chemische Derivatisierung unter jeglichen geeigneten Bedingungen durchgeführt werden, welche zur Reaktion einer biologisch aktiven Substanz mit einem aktivierten Polymermolekül verwendet werden. Verfahren zur Herstellung pegylierten Neuritins werden generell folgende Schritte umfassen: (a) Reaktion des Neuritin-Polypeptids mit Polyethylenglykol (wie einem reaktiven Ester oder Aldehydderivat von PEG) unter Bedingungen, in denen Neuritin an ein oder mehrere PEG-Gruppen gebunden wird und (b) Erhalten der oder des Endprodukts(e). Generell werden die optimalen Versuchsbedingungen für die Acetylierungsreaktionen basierend auf bekannten Parametern und dem erwünschten Resultat bestimmt. So ergibt z. B. ein größeres Mengenverhältnis von PEG: Protein eine größere prozentuale Ausbeute des polypegylierten Produkts.
Reduktive Alkylierung zur Herstellung der substanziell homogenen Population von Monopolymer/Neuritin-Protein-Konjugatmolekül wird generell die folgenden Schritte umfassen: (a) Reaktion eines Neuritin-Proteins mit einem reaktiven PEG-Molekül unter reduktiven Alkylierungsbedingungen bei einem pH, geeignet, um die selektive Modifikation von α-Aminogruppen am Aminoende das besagten Neuritin-Proteins zu erlauben und (b) Erhalten des/der Reaktionsprodukts(e).
Für eine substanziell homogene Population von Monopolymer/Neuritin-Protein-Konjugatmolekülen sind die reduktiven Alkylierungsreaktionsbedingungen diejenigen, welche selektive Anbindung der wasserlöslichen Polymergruppen an dem N-Tenninus von Neuritin erlauben. Solche Reaktionsbedingungen berücksichtigen generell pK_a-Unterschiede zwischen den Lysinaminogruppen der α-Aminogruppe am N-Terminus (pK_a ist der pH, an welchem 50% der Aminogruppen protoniert und 50% nicht protoniert sind). Der pH wirkt sich auch auf das Verhältnis von Polymer in verwendeten Proteinen aus. Generell wird, wenn der pH niedriger ist, ein größerer Überschuss von Polymer im Verhältnis von Proteinen benötigt (d. h. wenige reaktiv die N-terminale α-Aminogruppe umso mehr Polymer wird benötigt, um optimale Bedingungen zu erreichen). Wenn der pH höher ist, muss das Polymer: Protein-Verhältnis nicht so groß sein (d. h. je mehr aktive Gruppen verfügbar sind, umso weniger Polymermoleküle werden benötigt. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung fällt der pH generell in den Bereich von 3–9, bevorzugt 3–6.
Ein weiterer wichtiger Gesichtspunkt ist das Molekulargewicht des Polymeres. Generell gilt: je größer das Molekulargewicht des Polymers ist, umso weniger ist die Zahl der Polymermoleküle, welche an das Protein geknüpft werden kann. In ähnlicher Weise sollte auch die Verzweigung des Polymers bei der Optimierung dieser Parameter in Betracht gezogen werden. Generell gilt: das bevorzugte durchschnittliche Molekulargewicht für Pegylierungsreaktionen, welche hier in Frage kommen, ist etwa 2 kDa bis etwa 100 kDa ist (der Begriff "etwa" deutet auf ± 1 kDa hin). Das bevorzugte durchschnittliche Molekulargewicht liegt bei etwa 5 kDa bis etwa 50 kDa, besonders bevorzugt bei etwa 12 kDa bis etwa 25 kDa. Das Verhältnis von wasserlöslichen Polymer zu Neuritin-Protein wird generell von 1 : 1 bis 100 : 1 reichen, bevorzugt (für Polypegylierung) bei 1 : 1 bis 20 : 1 und (für Einfachpegylierung) bei 1 : 1 bis 5 : 1.
Bei Verwendung der oben gezeigten Bedingungen wird die reduktive Alkylierung die selektive Anbindung des Polymers an jedes Neuritin-Protein gewährleisten, welche eine α-Aminogruppe am Aminoende hat und wird eine substanziell homogene Herstellung des Monopolymer/Neuritin-Protein-Konjugats ermöglichen. Die Bezeichnung "Monopolymer/Neuritin-Protein-Konjugat" wird hier verwendet, um eine Verbindung zu bezeichnen, welche ein einzelnes Polymermolekül angeknüpft an ein Neuritin-Proteinmolekül umfasst. Das Monopolymer/Neuritin-Protein-Konjugat wird bevorzugt ein Polymermolekül, welches am N-Terminus lokalisiert ist, aufweisen, aber keine Lysin-Amino-Seitengruppen. Die Präparation wird bevorzugt mehr als 90% Monomer/Neuritin-Protein- Konjugat Ausbeute haben und noch mehr bevorzugt mehr als 95% Monomerpolymer/Neuritin-Protein-Konjugat mit einem Rest an merklich unreagierten Molekülen (d. h., Proteine ohne Polymergruppe). Die Beispiele unten ermöglichen eine Präparation mit mindestens 90% Monopolymer/Protein-Konjugat und ungefähr 10% unreagiertem Protein. Das Monopolymer/Protein Konjugat weist biologische Aktivität auf.
Für die vorliegende reduktive Acetylierung sollte das reagierende Agens in wässriger Lösung stabil sein und bevorzugt in der Lage sein, nur die Schiffsche Base, welche zu Beginn des Verfahrens der reduktiven Acetylierung gebildet wird, zu reduzieren. Bevorzugte reduzierende Agenzien können aus der Gruppe gewählt werden bestehend aus Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid, Dimethylaminoboran, Trimethylaminboran und Pyridinboran. Ein besonders bevorzugtes reduzierendes Agens ist Natriumcyanoborhydrid.
Andere Reaktionsparameter, wie Lösungsmittel, Reaktionszeit, Temperaturen, etc., und Mittel zur Aufreinigung des Produktes können basierend auf der veröffentlichten Infor mation bestimmt werden, welche sich auf die Derivatisierung von Proteinen mit wasserlöslichen Polymeren bezieht.
Eine Mischung aus Polymer-Neuritin-Protein-Konjugatmolekülen kann durch Acylierungs- und/oder Alkylierungsverfahren, wie oben beschrieben, hergestellt werden und man kann das Verhältnis von Monomer/Protein Konjugat, welches in der Mischung enthalten sein soll, wählen. Folglich kann man, wenn gewünscht, eine Mischung aus verschiedenen Proteinen mit einer unterschiedlichen Anzahl von angeknüpften Polymermolekülen (d. h., di-, tri-, tetra-, etc.) herstellen, kombinieren mit der unter Verwendung der vorliegenden Verfahren hergestellten Substanz an Monomer/Neuritin-Protein-Konjugat.
Allgemein schließen Zustände, welche durch die Gabe des vorliegenden Polymer/Neuritins gelindert oder moduliert werden können, solche ein, welche hier für Neuritin-Moleküle im Allgemeinen beschrieben werden. Jedoch können die Polymer/Neuritin-Moleküle, welche hierin offenbart werden, zusätzliche Aktivitäten haben, im Vergleich zu den nichtderivatisierten Molekülen verstärkte oder reduzierte Aktivitäten, oder andere Eigenschaften.
Neuritin-Nukleinsäuremoleküle, Fragmente und/oder Derivate, welche nicht selbst Polypeptide, welche in Aktivitätsassays aktiv sind, kodieren, können als Hybridisierungsproben in diagnostischen Assays verwendet werden, um entweder qualitativ oder quantitativ auf die Gegenwart von Neuritin-DNA oder RNA in Säugetiergewebe oder Körperflüssigkeitsproben zu testen.
Neuritin-Polypeptid-Fragmente und/oder Derivate, welche nicht selbst aktiv in Aktivitätsassays sind, werden als Modulatoren der Neuritin-Rezeptoren in vitro oder in vivo (z. B. Inhibitoren oder Stimulantien) oder zur Herstellung von Antikörpern für Neuritin-Polypeptide verwendet werden.
Die Neuritin-Polypeptide und Fragmente davon, egal ob chemisch modifiziert oder nicht, können allein oder in Kombination mit anderen pharmazeutischen Verbindungen, z. B. mit neurotrophischen Faktoren, Zytokinen, Interferonen, Interleukinen, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Antiinflammatorien, Neurotransmittenezeptoragonisten oder – antagonisten und/oder Antikörpern, für die Behandlung der Erkrankungen des neurologischen Systems eingesetzt werden.
Die Neuritin-Polypeptide und/oder Fragmente davon können zur Herstellung von Antikörpern, die durch Standardmethoden erzeugt werden, verwendet werden. Folglich werden Antikörper, welche mit den Neuritin-Polypeptiden reagieren, als auch reaktive Fragmente solcher Antikörper als ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen betrachtet. Die Antikörper können polyklonal, monoklonal, rekombinant, chimes, einkettig und/oder bispezifisch sein. Typischerweise können die Antikörper oder Fragmente davon "humanisiert" werden, d. h. so präpariert werden, dass eine Immunreaktion von Antikörpern, wenn er dem Patienten verabreicht wird, vermieden oder uriniert wird. Das Antikörperfragment kann jedes Fragment sein, welches reaktiv mit dem Neuritin der vorliegenden Erfindung ist, wie z. B. Fab, Fab', etc. Ebenfalls von dieser Erfindung bereitgestellt werden die Hybridome, welche durch Präsentieren von Neuritin oder einem Fragment davon als Antigen für ein ausgewähltes Säugetier, gefolgt von Fusionierung von Zellen (z. B. Milzzellen) des Tieres mit bestimmten Krebszellen erzeugt werden, um immortalisierte Zelllinien durch bekannte Techniken zu erhalten. Die Verfahren, welche zum Erhalt solcher Zelllinien und Antikörper, welche gegen ganze oder Teile des menschlichen Neuritin-Polypeptids der vorliegenden Erfindung gerichtet sind, eingesetzt werden, sind ebenfalls von dieser Erfindung umfasst.
Die Antikörper können therapeutisch eingesetzt werden, wie z. B. zur Inhibition der Bindung von Neuritin an seinen Rezeptor. Die Antikörper können des Weiteren in vivo und in vitro für diagnostische Zwecke verwendet werden, z. B. in gelabelter Form, um die Gegenwart zu Neuritin in Blutflüssigkeit nachzuweisen.
Therapeutische Verbindungen und Verabreichung
Therapeutische Verbindungen zur Behandlung verschiedener Erkrankungen des neurologischen Systems liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Solche Verbindungen können eine therapeutisch effektive Menge von Neuritin-Polypeptid oder eines Fragments davon (wobei jedes von beiden chemisch modifiziert sein kann) in Beimischung mit einem pharmazeutisch aufnehmbaren Träger umfassen. Das Trägermaterial kann für Injektionen Wasser, bevorzugt ergänzt mit weiteren Substanzen, wel the üblich für die Administration für Säugetiere sind, sein. Typischerweise wird ein therapeutischer Neuritin-Wirkstoff in Form einer Verbindung, welche das gereinigte Protein (welches chemisch modifiziert sein kann) in Verbindung mit einem oder mehreren physiologisch aufnehmbaren Trägem, Bindemitteln oder Verdünnungsmitteln verabreicht. Neutral puffernde Salze oder Salze gemischt mit Serumalbumin sind beispielsweise geeignete Träger. Bevorzugt wird das Produkt als ein Lyophilisat unter Verwendung geeigneter Bindemittel (z. B. Sucrose) formuliert. Andere Standardträger, Verdünnungsmittel und Bindemittel können wie gewünscht enthalten sein. Andere exemplarische Verbindungen umfassen Tris-Puffer mit etwa pH 7.0–8.5 oder Acetat-Puffer von etwa pH 4.0-5.5, welche desweiteren Sorbitol oder ein anderes geeignetes Substitut dafür enthalten können.
Die Neuritin-Verbindungen können systemisch parenteral verabreicht werden. Alternativ können die Verbindungen intravenös oder subkutan verabreicht werden. Bei systemischer Verabreichung können die therapeutischen Verbindungen zur Verwendung im Rahmen dieser Erfindung in Form von pyrogenfreier, parenteral aufnehmbarer wässriger Lösung sein. Die Herstellung solcher pharmazeutisch aufnehmbarer Proteinlösungen unter angemessener Berücksichtigungen von pH, Isotonizität, Stabilität und dergleichen, ist Stand der Technik.
Die therapeutische Formulierung von Neuritin-Verbindungen, brauchbar für die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung, kann für zwecke der Lagerung durch Vermischen der ausgewählten Verbindung, welche den gewünschten Reinheitsgrad aufweist, mit optional physiologisch aufnehmbaren Trägem, Bindemitteln oder Stabilisatoren (Remingtons Pharmacdutical Sciences, 18th Edition, A. R. Genaro, ed., Mack Publishing Company [1990]) in Form eines lyophilisierten Kuchens oder einer wässrigen Lösung hergestellt werden. Aufnehmbare Träger, Bindemittel oder Stabilisatoren sind nicht toxisch für den Empfänger und sind bei den angewandten Dosierungen und Konzentrationen bevorzugt inert und schließen Puffer, wie Phosphat; Citrat oder andere organische Säuren; Antioxidantien, wie Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide; Proteine, wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunoglobuline; hydrophile Polymere, wie Polyvinylpyrrolidone; Aminosäuren, wie Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glycose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie EDTA; Zuckeralkohole, wie Mannitol oder Sorbitol; salzbildenden Gegenione, wie Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG) ein.
Die Neuritin-Verbindung, welche für in vivo Anwendung verwendet wird, muss steril sein. Dies erreicht man leicht durch Filtration durch sterile Filtertrationsmembrane. Wo die Neuritin-Verbindung lyophylisiert ist, kann Sterilisation unter Verwenden dieser Verfahren entweder vor oder nach Lyophilisation oder Rekonstitution durchgeführt werden. Verbindung zur parenteralen Verabreichung werden üblicherweise in lyophylisierter Form oder in Lösung gelagert.
Therapeutische Verbindungen werden generell in einem Behälter gelagert, welcher eine sterile Zugangsöffnung hat, z. B. eine intravenöse Lösung in Beutel oder Viole, welche einen Stöpsel haben, der durch eine Injektionsnadel durchstochen werden kann.
Der Weg der Verabreichung der Verbindung ist im Einklang mit bekannten Verfahren, z. B. oral, Injektion oder Infusion auf intravenösen, intraperitonealen, intrazerebralen (intraparenchymalen), intrazerebroventrikularen, intramuskulären, intraokularen, intraarteriellen oder intraläsionalen Wegen, oder durch fortwährende Abgabesysteme oder Implantationseinheit, welche optional die Verwendung eines Katheders miteinschließen können. Wo gewünscht können die Verbindungen kontinuierlich verabreicht werden durch Infusion, Bolusinjektion oder durch Implantationseinheit. Alternativ oder in additiv kann Neuritin lokal verabreicht werden via Implantation in das betroffene Gebiet einer Membran, eines Schwamms oder eines anderen geeigneten Materials, auf welchen Neuritin-Polypeptid absorbiert wurde.
Wo eine Implantationseinheit verwendet wird, kann die Einheit in jegliches geeignetes Gewebe oder Organ implantiert werden, wie z. B. in eine zerebrale Höhlung oder in ein Gehimparenchym, und die Abgabe des Neuritins kann direkt durch die Einheit via Bolus oder kontinuierliche Verabreichung oder über einen Katheder unter Verwendung einer kontinuierlichen Infusion erfolgen.
Neuritin-Polypeptid kann in einer fortwährend abgebenden Formulierung oder Präparation verabreicht werden. Geeignete Beispiele für fortwährend freisetzende Herstellungen schließen semipermeable Polymermatrizen in Form von geformten Artikeln, z. B. Filmen, oder Mikrokapseln ein. Kontinuierlich freisetzende Matrizen schließen Polyester, Hydrogele, Polylactide ( US 3,773,919 , EP 58,481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gammaethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547–556 [1983]), Poly(2-hydroxyethyl-methacrylat)(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167–277 [1981] und Langer, Chem. Tech., 12: 98–105 [1982], Ethylenvinylacetat (Langer et al., supra) oder Poly-D(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133,988 ) ein. Kontinuierlich freisetzende Verbindungen können auch Liposomen einschließen, welche durch eine der verschiedenen im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden können (z. B., DE 3,218,121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688–3692 (1985]; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030–4034 [1980]; EP 52,322 ; EP 36,676 ; EP 88,046 ; EP 143,949 ).
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Neuritin-Verbindungen in einem ex vivo Verfahren, zu verwenden, d. h., Zellen oder Gewebe zu behandeln, welche vom Patienten entnommen worden sind und anschließend zurück in den Patienten implantiert werden.
In anderen Fällen kann Neuritin durch Implantierung bestimmter Zellen, welche genetisch (unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren) hergestellt wurden, um Neuritin-Polypeptid zu exprimieren und sekretieren, in die Patienten zugeführt werden. Solche Zellen können menschliche Zellen sein und können vom eigenen Gewebe des Patienten stammen oder aus einer anderen Quelle, welche entweder human oder nichthuman ist. Optional können die Zellen immortalisiert sein. Die Zellen können in das Gehirn, die Nebennierenrinde oder andere Körpergewebe oder Organe implantiert sein.
In bestimmten Situationen kann es wünschenswert sein, Gentherapiemethoden zur Verabreichung von Neuritin an Patienten, welche unter bestimmten neurologischen Erkrankungen leiden, zu verwenden. In diesen Situationen werden genomische DNA, cDNA und/oder synthetische DNA kodierend für Neuritin oder ein Fragment oder eine Variante davon funktionsfähig mit einem konstitutiven oder induzierbaren Promotor verknüpft, welcher aktiv im Gewebe ist, in welches die Verbindung injiziert werden wird. Dieses Neuritin-DNA-Konstrukt, welches entweder in einen Vektor insertiert oder allein ohne Vektor ist, kann direkt ins Gehirn oder andere Gewebe, entweder neuronal oder nichtneuronal, injiziert werden.
Alternativ kann ein Neuritin-DNA-Konstrukt direkt in Muskelgewebe injiziert werden, wo es in die Zellenaufgenommen werden kann und in den Zelten unter der Voraussetzung exprimiert werden kann, dass die Neuritin-DNAfunktionsfähig mit einem Promotor ver knüpft ist, welcher in Muskelgewebe aktiv ist, wie z. B. Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, Rous-Sarkoma-Virus (RSV)-Promotor oder Muskelkreatinkinase Promotor. Typischerweise kann das DNA Konstrukt (über die Neuritin-DNAund einen Promotor hinaus) eine Vektorsequenz erhalten von Vektoren, wie Adenovirus, dem Adenovirus vektor; dem adenoassoziierten Vektor, einem retroviralen Vektor und/oder einem Herpesvirusvektor enthalten: Das Vektor/DNA Konstrukt kann mit pharmazeutisch auf nehmbaren Träger (Trägern) zur Injektion vermischt werden.
Eine effektive Menge der Neuritin-Kompositionen) in therapeutischen Anwendung wird z. B. abhängig sein von therapeutischen Aufgaben, wie der Indikation, für welche Neuritin verwendet werden wird, dem Weg der Verabreichung, und dem Zustand des Patien- ten. Entsprechend wird es für dem Therapeuten notwendig sein; die Dosierung zu titern und den Weg der Verabreichung, wie gefordert, zu modifizieren, um den optimalen therapeutischen Effekt zu erhalten. Eine typische tägliche Dosis kann von etwa 0.1 μg/kg bis zu 100 mg/kg oder mehr reichen, abhängend von den oben erwähnten Faktoren. Üblicherweise wird ein Krankenhausarzt die Neuritin-Verbindung verabreichen, bis eine Dosis erreicht wird, welche den gewünschten Effekt erzielt. Die Neuritin-Verbindung kann dafür in Form einer einfachen Dosis verabreicht werden oder in Form von zwei oder mehr Dosen (welche die gleiche Menge an Neuritin enthalten können oder nicht) im Lauf der Zeit oder als eine kontinuierliche Infusion via Implantationseinheit oder Katheder.
Mit der Durchführung weiterer Studien wird neue Information in Bezug auf geeignete Dosierungsspiegel zur Behandlung von verschiedenen Zuständen in verschiedenen Patienten generiert werden, und der gewöhnliche Fachmann wird in der Lage sein eine geeignete Dosierung unter Berücksichtigung des therapeutischen Kontextes des Typus der zu behandelnden Krankheit, des Alters und des generellen Zustandes des Patienten zu bestimmen. Im Allgemeinen wird die Dosierung zwischen 0.01 μg/kg Körpergewicht (unter Berechnung der Masse allein des Proteins ohne chemische Modifikation) und 300 μg/kg (auf derselben Grundlage) sein.
Die Neuritin-Proteine, Fragmente und/oder Derivate davon können zur Behandlung von Erkrankungen und Störungen des zentralen und peripheren Nervensystems verwendet werden, welche mit Veränderungen im Muster der Neuritin-Expression einhergehen oder welche von der Exposition des Neuritins oder anti-Neuritin-Antikörpers profitieren.
Neuritin-Protein und/oder Fragmente oder Derivate davon können zur Behandlung von Patienten verwendet werden, in welchen verschiedene Zellen des zentralen, autonomen oder peripheren Nervensystems degeneriert sind und/oder durch erblich bedingte Erkrankung, Trauma, mechanische Verletzung, Operation, Schlaganfall, Ischämie, Infektion, metabolischer Erkrankung, Ernährungsmangel, bösartigen Tumor und/oder toxische Agentien beschädigt wurden. Noch genauer; können Neuritin-Protein-Spiegel für solche Indikationen wie Alzheimers, Parkinsons, amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Tooth-Syndrom, Huntingtons Krankheit, periphere Neuropathie, ausgelöst durch Diabetes oder andere metabolische Erkrankungen, und/oder Dystrophien oder Schädigung der neuralen Retina, wie Retinitis pigmentosa, medikamentenvermittelte Retinopathie, stationäre Formen von Nachtblindheit, fortschreitende Cone-Rod-Degenerierung und dergleichen moduliert (hoch- oder tiefreguliert) werden.
In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können Neuritin-Protein oder Peptid oder Fragmente oder Derivate davon, in Verbindung mit operativer Implantierung von Gewebe in der Behandlung von Erkrankungen, in welchen Gewebsimplantation angezeigt ist, verwendet werden.
Hinterlegung von DNA
E. coli-Zellen, welche das Plasmid pCRScript SK+ enthalten, in welche die cDNA kodierend für das voillängenmenschliche Neuritin (Aminosäuren 1–142) insertiert worden ist, wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drtve, Rockville, MD, USA) am 9. August 1996 unter der Zulassungsnummer 98134 hinterlegt.
Die folgenden Beispiele sind allein für Zwecke der Illustration gedacht und sollen nicht als limitierend für den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise ausgelegt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Klonierung von Neuritin-cDNA
Männliche Ratten (Wistar) von einem ungefähren Alter von 8–10 Wochen (mit einem ungefähren Gewicht von 230–300 Gramm) wurde intraperitoneal etwa 8 mg/kg Körpergewicht an Kainat (hergestellt in einer Stammlösung von 5 mg/ml Kainat) in Phosphatsalzpuffer [PBS]) injiziert. Etwa sechs Stunden später wurden die Tiere geopfert, und das Gebiet des Gyrus dentatum (DG) wurde entfernt und in Flüssigstickstoff aufbewahrt. DG-Gewebe von etwa 100 Tieren wurde gepoolt und RNA in diesem Gewebe wurde durch eine Modifikation des Guanidinthiocyanat Verfahren ("GTC"; Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162: 156 [1987]) hergestellt. Nach Lyse des Gewebes in GTC wurden 2 Phenolextraktionen, gefolgt von einer Chloroformextraktion durchgeführt und die RNA wurde ausgefällt und Wasser resuspendiert. Poly (A) + RNA wurden abgetrennt unter Verwendung von Oligo-(dt)-Zellulosesäulen (Clontech, Palo Alto, CA). Diese RNA (und korrespondierende cDNA) wird hier als "aktivierte DG"-RNA oder -cDNA bezeichnet.
Für Abzugsanalyse, Bibliothekenkonstruktion und cDNA-Prüfung (alle diese Verfahren werden unten beschrieben) wurde die DNA mit DNase (freie RNase; Promega, Madison, WI) behandelt, um jegliche verunreinigende genomische DNA zu eliminieren. Das gleiche oben dargestellte Protokoll wurde zur Herstellung von Poly (A) + RNA von normalem Gewebe des Gyrus dentatum und vollständigem Gehirngewebe von männlichen Ratten desselben Alters, die nicht mit Kainat behandelt wurden, verwendet.
Die Erststrang-cDNA wurde in zwei 50 μl-Reaktionen unter Verwendung aktivierter DG-Poly (A) + RNA synthetisiert, welche wie oben beschrieben hergestellt wurde. Jede Reaktion beinhaltet ungefähr 5 μg RNA in etwa 30 μl an Reverse Transkriptase – Puffer (Gubler et al., Gene, 25: 263–269 [1983]), ungefähr 1 μl RNase (4 μ/μl; Promega, Madison, WI), ungefähr 1 μg Oligo-(dT)-Xbal-Primeradapter (Promega, Madison, WI), ungefähr 30 μCi ³²P dCTP (ungefähr 3000 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL) und ungefähr 400 μ MLV klonierte Reverse Transkriptase (BRL; Grand Island, NY). Nach ungefähr 60 Minuten bei 37°C wurde die RNA für ungefähr 20 Minuten bei etwa 68°C durch Zugabe von etwa 10 μl NaOH (1 N), ungefähr 2 μl EDTA (0.5 M) und bis zu unge fähr 100 μl H₂O hydrolysiert. Die RNA wurde dann auf Eis gestellt und anschließend mit etwa 10 μl von 1 M HCl neutralisiert. Ungefähr 5 μg von Transfer-RNA wurde hinzugegeben und die Mischung durch eine Sephadex G-50-Spin-Säule geschleudert. Die Rückgewinnung der cDNA wurde durch Vergleich der Radioaktivität im Eluat der Säule zur Reaktivität der ursprünglich in die Säule aufgebrachten Probe bestimmt. Die beiden cDNA-Proben wurden gepoolt, Ethanol gefällt mit NH₄-Acetat, und mit etwa 10 ng/μl in H₂O resuspendiert.
Die cDNA wurde mit gleichem Volumen vom Gesamtrattengehim Poly (A) + RNA (1 μg/μl), welche zuvor an Biotin unter Verwendung zweier Fotobiotinylierungrunden (Clontech, Palo Alto, CA; siehe Sive et al., Nucleic Acids Res., 16: 10937 [1988]) gekoppelt wurde und dann Ethanol gefällt mit NH₄-Acetat. Nach Wiederaufschlämmung auf etwa 100 ng/μl cDNA und ungefähr 10 μg/μl RNA in Formamid Puffer (40% Formamid, 50 mM Hepes, pH 7.6, 0.5 M NaCl, 2 mM EDTA), wurde die Lösung in Glaskapillaren eingefüllt (25 μl jede), welche versiegelt wurden. Die Kapillaren wurden etwa 3 Minuten bei 68°C und dann für zwei Tage bei 52°C inkubiert. Die Kapillaren wurden aufgebrochen und der Inhalt einer jeden wurde zu ungefähr 180 μl Puffer hinzugefügt (Hepes pH 7.6 50 mM, NaCl 0.5 M, EDTA 2 mM). Streptavidin (Vector Labs, Burlingame, CA) wurde etwa in einer Menge von 1 μg pro μl an biotinylierter RNA zugegeben, und die Mischung wurde ungefähr 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Inkubation wurden zwei Phenol/Chloroform-Extraktionen (Volumenverhältnis 1 : 1) und eine Chloroform-Extraktion durchgeführt. Die zurückgewonnene wässrige Phase enthielt typischerweise 10–20% der vollständigen cDNA, welche zum Subtraktionsklonieren verwendet wurde. Diese einsträngige cDNA wurde Ethanol gefällt und in etwa 16 μl Wasser resuspendiert.
Ungefähr 1 μl dATP (10 mM) und ungefähr 4 μl 5 × TdT-Puffer (Boehringer Mannheim) wurden zur cDNA hinzugefügt. Nach ungefähr 3 Minuten bei 100°C und Abkühlen auf Eis, wurde terminale Desoxynukleotidyltransferase (17 μl, Boehringer, Mannheim, Deutschland) hinzugefügt und die Mischung wurde für etwa 2 Stunden bei etwa 37°C inkubiert. Zwei Mikrogramm von Oligo-(dT)-Xbal (Promega, Madison, WI) Primeradapter wurden hinzugefügt und die Mischung wurde für ungefähr 5 Minuten bei 60°C inkubiert. Die Synthese des zweiten Stranges wurde in etwa 50 μl Totalvolumen, enthaltend 90 mM Hepespuffer pH 6.6, MgCl 10 mM, alle 4-Desoxynukleotidtriphosphate bei einer Konzentration von jeweils etwa 0.5 mM, etwa 10 mM DTT und 10 U Klenow (Boehringer Mannheim, Sequenzierungsgrad) durchgeführt. Nach ungefähr 6 Stunden bei Raumtemperatur wurde ein weiteres Aliquot an Enzym hinzugefügt und die Mischung wurde weitere drei Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde mit Phenol und Chlorofonnextraktion gestoppt, nach welcher 5 μg Transfer-RNA hinzugefügt wurde, und die cDNA mit NH₄-Acetat Ethanol gefällt wurde. Die doppelsträngige cDNA wurde in etwa 9.6 μl H₂O resuspendiert und für 5 Stunden bei 37°C mit 10 U des Restriktionsenzyms Xbal (Boehringer) aufgeschlossen, worauf es auf ein dünnes 1% Agarosegel aufgetragen wurde und elektrophoresiert wurde. Ein Gel-Schnitt enthaltend cDNA-Moleküle in einer Ausdehnung größer als ungefähr 550 Basenpaare ("bp") wurde entfernt, die cDNA wurde unter Verwendung von QIAEX extrahiert (Qiagen Corp., Chatsworth, CA) und die Ausbeute (ungefähr 10% der gesamtsubstrahierten cDNA) wurde durch Radioaktivitätsmessung bestimmt. Diese cDNA wurde in Lambda-ZAP (Stratagene, La Jolla, CA) Vektoranne ligiert, welche zuvor mit Xbal aufgeschlossen und mit fötaler Kälberdarm Phosphatase (Boehringer Mannheim) behandelt worden waren. Ligationen wurden unter Verwendung von ungefähr 1 μl Phagenarmen und verschiedenen Konzentrationen von cDNA (3–20 ng) durchgeführt. Die Ligationen wurden verpackt (Gigapack, Stratagene, La Jolla, CA); Phagentiter wurde bestimmt. Die Bibliothek wurde mit geringe Dichte ausplattiert, individuelle Platten wurden einzeln gewählt und Plasmide in dem Vektor pBluescript wurden aus dem Phagen unter Befolgung des Herstellerprotokolls ausgeschnitten (siehe Short et al., Nucleic Acids Res. 16: 7583–7600 [1988]). Die Plasmid-DNA wurde dann von E. coli-Zellen, welche zuvor mit dem pBluescript-Plasmiden transformiert worden waren, unter Verwendung von Standard-Minipräparationsvorschriften hergestellt (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]). Ungefähr zwei bis vier μg von Plasmid-DNA, erhalten aus der Minipräparation wurden mit Xbal aufgeschlossen und im Rahmen eines Southernblots auf Hybond N+-Filtern (Amersham, Arlington Heights, IL) unter Verwendung von Standardprozeduren aufgebracht.
Zur Herstellung von Proben zum Screenen der cDNA-enthaltenden Filter-wurden etwa 100 ng von Einzelstrang-cDNA jeden Typs (kontroll- und DG-aktiviert) durch ihre Zugabe zu einer Mischung, enthaltend ungefähr 12 μl an zufälligen Primem (Boehringer; ungefähr 90 A₂₆₀ U/ml), ungefähr 22 mCi ³²P-dCTP (3000 Ci/mmol; Amersham, Arlington Heights, IL), ungefähr 0.6 mM jeweils von dATP, dTTP und dGTP und 40 μl Klenow (Boehringer; ungefähr 2 U/μl) in 800 μl des Puffers, welcher zur Synthese der Doppel strang-cDNA verwendet wurde (siehe oben), radiogelabelt. Inkubation wurde über Nacht bei Raumtemperatur in 2 400 μl Aliquots durchgeführt. Diese Reaktion lieferte Proben von ungefähr 1.2 × 10⁹ cpm.
Nach mindestens 6 Stunden Prähybridisierung bei ungefähr 42°C in Hybridisierungspuffer (siehe unten), wurden die cDNA-Blots an die Proben hybridisiert. Ein Blot wurde an aktivierte DG-Proben hybridisiert und ein Duplikatblot wurde zur Kontrolle (normale DGcDNA) hybridisert. Die Hybridisierungen wurden in einer Lösung durchgeführt, welche 50% Formamid, 5 × SSCPE (Sambrook et al., 1989), 10 × Denhardts, 0.5% SDS, 0.5 mg/ml Heringspermien-Träger-DNA und die cDNA-Probe bei einer Konzentration von etwa 1 × 10% cpm/ml enthielt. Die Blots wurden für ungefähr 48 Stunden in einem Schüttlerwasserbad bei 42°C inkubiert. Nach Inkubation wurden die Blots jeweils mit 0.1 × SSC, 0.2% SDS, 3 mal für 1 Stunde bei 68°C gewaschen. Nach Filmexposition wurden diejenigen cDNA-Klone, welche stärker an die aktivierten DG-Proben hybridisierten als an die Kontrollproben ausgewählt und erneut unter Verwendung eines zweiten Sets von aktivierten DG-Kontrollproben, welche wie oben beschrieben, hergestellt wurden, gescreent. Diejenigen Klone, welche stärker an die aktivierten DG-Proben als an die Kontrollproben in zwei unabhängigen Screenen hybridisierten, wurden von beiden Seiten (ungefähr 200–300 bp von jeder Seite aus) unter Verwendung von Standardsequenzierungsmethoden sequenziert, und diese Sequenzen wurden durch FASTA-Analyse (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2444–2448 [1988]) in Genbanken oder anderen öfentlichen DNA-Datenbanken gesucht. Basierend auf Sequenzvergleich schienen mehrere Klone neu zu sein. Die Klone, welche zur vorliegenden Erfindung gehören, wurden wie folgt benannt: #784, #1441, #2090; #2268; #2282; #7547; #8032; #6734; und #7761.
Um Volllängen-cDNA-Klone zu erhalten, wurde eine zweite cDNA-Bibliothek aus aktivierter DG-RNA unter Verwendung ähnlicher Verfahren, wie oben beschrieben, kon struiert. Die Bibliothek wurde wie oben beschrieben unter Verwendung aktivierter DG-Poly A-RNA und Oligo-(dt)-Xbal-Primern (Promega) gemacht, aber nur cDNAs größer als 1.5 kb wurden als Inserts ausgewählt. Diese Bibliothek wurde in hoher Dichte ausplattiert und auf Nylonfilter (S&S, Keene, NH) aufgebracht. Eine Probe wurde in dem ungefähr 0.5 kbp Xbal Insert von Klon #1441 durch Isolieren dieses Xbal begrenzten Fragments unter Verwendung des Qiagenreinigungskits (Qiagen, Chatsworth, CA) und unter Befolgung der Empfehlungen des Herstellers generiert. Das Fragment wurde dann mit α-³²P-dCTP unter Verwendung von Standardmethoden (RediVue, Amersham, Arlington Heights, IL) radioaktiv gelabelt. Die Filter wurden unter Verwendung von Bedingungen wie oben beschrieben hybridisiert. Verschiedene positive Klone wurden in diesem Screening identifiziert. Zwei der positiven Klone, 1441-10 und 1441-13 wurden ausgewählt, weil sie die längsten Inserts (ungefähr 1.6 kbp bzw. 1.4 kbp) aufwiesen. Diese beiden Klone wurden einer DNA-Sequenzanalyse auf beiden Strängen unter Verwendung der Didesoxykettenterminationsmethode mit fluoreszierenden Didesoxynukleotiden unterzogen (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). Die Nukleotidsequenz wurde unter Verwendung von Genetics Computer Group Software analysiert (University of Wisconsin, Biotechnology Center, Madison, WI).
Klon #1441-10 wies, wie sich herausstellte, ein Insert von etwa 1604 bp auf, und beherbergt einen langen offenen Leserahmen (ORF), welcher ein 142-Aminosäuren Protein kodiert. Die Volllängen-DNA dieses Klons erhalten aus Rattengewebe, genannt Neuritin, ist in 1 (SEQ ID NO: 1) dargestellt. Die Aminosäurensequenz von Ratten-Neuritin ist in 3 dargestellt (SEQ ID NO: 3).
Menschliche Neuritin-cDNA wurde unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (Pwo DNA Polymerase und Puffer; Boehringer Mannheim) unter Standardbedingungen geklont, welche wie folgt waren: 5 Minuten Denaturierung bei 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von: 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 56°C und 30 Sekunden bei 72°C unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide:
Das Templat für diese PCR-Reaktion war döppelsträngige cDNA, welche aus etwa 2 μg menschlicher kortikaler mRNA (Clontech, Palo Alto, CA) unter Verwendung eines Marathon-cDNA-Amplifikationskits (Clontech, Palo Alto, CA) unter Beachtung der Empfehlungen des Herstellers erzeugt wurde. Die amplifizierten Produkte der vorhergesagten Größe (ungefähr 435 bp) wurden in den pCR-Script Amp SK (+) Klonierungs Vektor (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert, und beide Stränge wurden unter Verwendung von Standard Sequenzierungsmethoden sequenziert. Die menschlichen Neuritin-cDNA-Sequenz ist in 2 dargestellt (SEQ ID NO: 2). Die vorhergesagte Aminosäuresequenz von menschlichem Neuritis basierend auf der Übersetzung der cDNA-Sequenz, ist in 4 dargestellt (SEQ ID NO: 4).
Die Analyse von Ratten- und menschlichem Neuritin-Protein fördert ein Aminoendständiges hydrophobes putatives Signalpeptid von ungefähr 24 Aminosäuren zutage. Der C-terminale 27-Aminosäuren Schwanz ist reich an hydrophoben Resten und beinhaltet ein übereinstimmendes Cleavagesignal, welches typischerweise in GPI (Glykosylphosphotidylinositol)-membranverankerten Protein gefunden wird. Das reife membrangebundene Protein umfasst 91 Aminosäuren (ungefähr 12 Kilodaltons) und 6 Cysteinreste. Jedoch beinhaltet auch diese Aminosäurensequenz keine übliche Sequenz oder gar motivische Homologie zu irgendeinem bekannten Protein wie durch Sequenzabsuchen in öffentlichen DNA- und Proteindatenbanken festgestellt wurde (SWISS-PROT, PROSITE, GENBANK und PIR), was den Verdacht nahe legt, dass sie eine neue Klasse oder Familie von Molekülen repräsentiert.
Beispiel II: Herstellung von Neuritin-Protein und Antikörpern
Eine Ratten Neuritin-cDNAkodierend für Aminosäuren 30 bis 113 von Neuritin ("Neuritin 30-113") wurde in den Hitze-induzierbaren bakteriellen Expressionsvektor pCFM1656 (ATCC-Zulassungsnummer 669576) zur Amplifikation und Expression von Neuritin 30-113 subkloniert. Inklusionskörper, welche das Neuritin 30-113 beinhalteten, wurden durch Lyse der Bakterien in 3 ml Lysepuffer (50 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA und 100 mM NaCl, enthaltend 10 mg Lysozym und 10 mg Na-Desoxycholat) pro Gramm an Bakterien isoliert. Lysierte Bakterien wurden mit 400 μg DNase I für 30 min bis 1 Stunde behandelt und dann bei ungefähr 12000 × g für 15 Minuten bei ungefähr 4°C zentrifugiert. Die gefällten Inklusionskörper wurden 2–4 mal in 9 Volumina von Lysepuffer, enthaltend 0.5% NP-40 gewaschen. Die Reinheit von Neuritin 30-113 in den Inklusionskörpernwurde per SDS-PAGE bestimmt. Gereinigte Inklusionskörper wurden in 8 M Hamstoff, 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl und 5 mM Dithiothreitol (DTT) für 1–2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) in Lösung gebracht (1 : 20). Nichtlösliche Substanz wurde durch Zentrifugation bei etwa 14 kg für 10 Minuten bei RT entfernt. Harnstoff wurde langsam gegen 1 I des Puffers, wie oben beschrieben, dialysiert unter der Verwendung folgenden Zeittabelle und Konzentrationen von Harnstoff (die gesamte Dialyse wurde bei 4°C durchgeführt): 8 M bis 6 M Harnstoff, 1 Stunde; 6 M bis 4 M, über Nacht; 4 M bis 2 M, 1 Stunde; 2 M bis 1 M, 1 Stunde; 1 M bis 0.5 M, 1 Stunde; 0.5 M bis 0.25 M, 1 Stunde, 0.25 M bis 0 M, 1 Stunde. Das zurückgefaltete Neuritin 30-113 wurde auf nicht reduzierenden SDS-PAGE-Gelen analysiert.
Zur Herstellung von Antikörpern gegen Neuritin wird das Neuritin-Fragment:
beinhaltend eine internale Region von reifem Neuritin-Protein mit Hilfe von Standardmethoden synthetisiert und für die Immunisierung von Kaninchen (hergestellt von Berkeley Antibody Company, Berkeley, CA) verwendet, was in der Produktion von polyklonalem Antiserum, genannt AS419, resultierte. Ein zweites polyklonales Kanichenantiserum (genannt AMG20) wurde gegen das bakteriell exprimierte Neuritin 30-113-Fragment, welches von gelösten Inklusionskörpern, wie oben beschrieben, gereinigt war, ebenfalls hergestellt (Cocalico Biologficals Inc., Reamstown, PA). Antisera, welche spezifisch in Western-Blots-Analysen von rekombinantem Neuritin, hergestellt in CHO-Zellen, reagierten, wurden unter Verwendung von Sepharosebeads, welche das geeignete immobilisierte Neuritin-Peptid (Pierce Chemicals, Rockford, IL) enthielten, affinitätsgereinigt, gefolgt von einer Protein-A/G-Säule (Pierce Chemicals) zur Konzentrierung der Antikörperpräparation.
Ratten- und menschliches rekombinantes Neuritin, welche Aminosäuren 1–115 umfassten, wurden in Chinesischen Hamster Ovarzellen (CHO-Zellen; ATCC-Zulassungsnummer CRL-9096) durch Transfektion der Zellen mit dem Plasmid pGREG, enthaltend entweder Ratten- oder menschlichen Neuritin-cDNA, exprimiert. pGREG wurde aus dem Säugetierexpressionsvektor pDSRa2 hergestellt (beschrieben in PCT-Patentanmeldung Nr. WO 90/14363, veröffentlicht am 29. November 1990).
pGREG beinhaltet von 5' nach 3' eine Sequenz, kodierend für eine Xhol-Restriktionsenzymsite, eine Thrombincleavagesite (siehe SEQ ID NO: 8), ein Herpes simplex-Virusepitop, erkannt von Novagens (Madison, WI) monoklonalem Antikörper (siehe SEQ ID NO: 9), ein Hexahistidinepitop für die Metallchelat-Chromatografie, ein Stoppkodon und eine SaII-Restriktionsenzymesite.
Das HSV/His-Tag wurde in den pDSRα2 durch schrittweise PCR unter Verwendung von 4 überlappenden Oligonukleotiden an dem 3'-Ende von Neuritin und dem oben beschriebenen 5'-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 5) inkorporiert. Als Templat für die PCR wurde p1441-10 verwendet. Ein initiales Oligonukleotid spezifisch für das 3'-Ende der Ratten Neuritin kodierenden Region verband das Xhol und die Thrombincleavagesite. Drei folgende PCR-Reaktionen verbanden sukzessive die Tag-Sequenz mit dem Ctenninalen Ende von Ratten-Neuritin. Das resultierende Produkt wurde in die Xbal- und Sall-Sites von pDSRα2 subkloniert. Weitere getaggte Konstrukte wurden unter Verwendung von PCR-Produkten, welche Xbal- und Xhol-Restriktionssites beinhalteten, hergestellt.
Die menschliche cDNA, kodierend für Aminosäuren 1–115 (und ein carboxyterminales GPI-Signalpeptid aufweisend) wurde zur Expression sekretierten menschlichen Neuritins, beinhaltend die Thrombincleavagesite, Herpes simplex-Virus (HSV)- und hexa-Histidin(HIS)- Epitope an seinem C-Terminus, verwendet. Menschliche Neuritin-cDNA, die das GPI-Signalpeptid nicht aufwies (d. h., kodierend für die Aminosäuren 1–115) wurde durch PCR unter Verwendung von Standardbedingungen und den folgenden Oligonukleotiden hergestellt:
Das resultierende 373 bp-Produkt wurde in die Xbal- und Xhol-Sites von pGREG subkloniert. Der resultierende Vektor wurde pDSRαhv15Tag.1 genannt. Das hexa-Histin-Tag erlaubte einfache Aufreinigung von Neuritin auf Nickel (Ni²⁺)-beinhaltendem Harz (Qiagen Inc., Chatsworth, CA).
CHO/Neuritin-konditionierte Medien wurden wie folgt hergestellt. Rollerflaschen beinhaltend CHO-Zellen, welche die menschliche getaggte Version von Neuritin 1–115 (genannt hu15t36) stabil exprimierten, wurden auf ungefähr 80 Prozent Rückfluss (ungefähr 48 Stunden) in serumfreien Dulbeccos Minimum Essentiell Medium (DMEM) inkubiert. Das konditionierende Medium wurde durch Ausfällen des zellulären Rückstandes per Zentrifugation bei ungefähr 2500 g geerntet; der Überstand wurde bei –20°C gelagert. Neuritin wurde schubweise durch Inkubation von 1 ml an PBS äquilibriertem NI²⁺/NTA-Harz/100 ml von konditioniertem Medium (Ni²⁺/NTA-Harz Lieferant: Qiagen Inc., Chatsworth, CA) aufgereinigt. Nichtspezifische Proteine wurden durch Waschen des Harzes mit Waschlösungen (20 mM Na-Phosphat, pH 6.0 und 500 mM NaCl) enthaltend ansteigende Mengen von Imidazol (20, 40, 80 und 100 mM) entfernt. Spezifisch gebundenes HSV-HIS-getaggtes Neuritin wurde mit 500 mM Imidazol eluiert. Das aufgereinigte Protein (Reinheit mehr als 95 Prozent in Silberfleck-SDS-PAGE [BioRad Laboratories, Hercules, CA]) wurde ungefähr 10fach aufkonzentriert und in 1 × PBS diafiltriert (Millipore Corp., [Ultrafree 15,5 K mw cutoff] Bedford, MA). Die Endkonzentration des Proteins wurde zu 30–50 ng/ml unter Verwendung des Bio-Rad/Lowry-Proteinassays mit Bovin Serum Albumin als einem Standard abgeschätzt.
Beispiel III: Gewebe-Expression von Neuritin
A. Northern-Blot Analyse
Um das Expressionsmuster von Neuritin zu bestimmen, wurde ein Northem-Blot enthaltend RNA von verschiedenen Rattengeweben, einschließlich Herz, Gehirn, Milz, Lungen, Leber, Muskel, Niere und Hoden von Clontech erworben (Palo Alto, CA) und wurde mit ³²P-gelabelten cRNA Proben untersucht. Die cRNA Proben wurden aus Ratten Neuritin-cDNAhergestellt, welche in pBluescript (Strategene, La Jolla, CA) wie folgt subkloniert wurde. Ein ungefähr 430 bp-Fragment des Neuritin-Klons 1441-10 wurde durch Aufschließen des Klons mit PvuII und Smal erhalten. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert, welches dann cpg15subclone#2 genannt wurde. Zur Herstellung von Antisense-RNA-Proben wurde das Plasmid linearisiert mit BamHI, wonach in vitro Transkription unter Verwendung von T7-Polymerase (Promega, Madison, WI) und ³²P-UTP durchgeführt wurde.
Die Menge an RNA auf jedem Blot wurde durch Sichtbarmachung mit Ethidiumbromidanfärbung von größenseparierter RNA bestimmt und durch Hybridisierung von Blots mit einem zufällig primär gelabelten cDNA-Fragment von Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) bestätigt.
Die Northern (RNA)-Analyse, wie in 5A dargestellt, identifizierte eine einzelne mRNA-Bande von ungefähr 1.6 Kilobasen, exprimiert in Ratten-Gehirn; eine Bande von weit geringerer Intensität wurde in Lungengewebe beobachtet, und es traten wenig oder kaum Hybridisierungen an mRNA aus anderen Geweben auf.
Zur Bestimmung der Expression von Neuritin in verschiedenen Regionen des Gehirns wurden erwachsene Ratten intraperitoneal mit 8 mg/kg einer Stammlösung mit 10 mg/ml an Kaininsäure in PBS injiziert. Nach ungefähr sechs Stunden wurden die Ratten geopfert und das Gehirn-Gewebe seziert. RNA wurde aus verschiedenen Regionen des Gehirns unter der Verwendung von ungefähr 1 ml von Guanidinisothiocyanat Lyse-Puffer (Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162: 156 [1987]) pro 100 mg von pulverisiertem Gewebe isoliert. Nach Lyse wurde die Lösung über Silicagel-Membransäulen passiert (RTNeasy spin columns, Qiagen, Chatsworth, CA). Die RNA wurde durch Auftrennung auf 0.8–1 Prozent Formaldehyd Agarosegelen größenfraktioniert und auf Nylonmembranen (Hybond-N, Amersham, Arlington Heights, IL) kapillargeblottet. Die Northern-Blots wurden mit ³²P-gelabelten cRNA Proben wie oben beschrieben sondiert. Wie in 5B dargestellt, hatte die Region des Gyrus dentatum den höchsten Spiegel der Neuritin-Expression.
B. In situ-Hybridisierung und Immunohistochemie
In situ-Hybridisierung und Immunohistochemie wurden an Schnitten von Ratten Embryogewebe und Gehirngewebe von Erwachsenen Ratten, welche mit Parafonnaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet waren wie folgt durchgeführt. Embryos von trächtigen Ratten wurden isoliert und über Nacht in frischem 4%igen Paraforrnaldehyd in PBS (4 % PFA/PBS) bei 4°C vor Dehydrierung und Paraffineinbetten fixiert. Erwachsene Ratten-Gehirne wurden durch transkardiale Perfusion von anästhesierten Tieren mit 4%igem Paraforrnaldehyd in PBS präpariert. Die sezierten Gehirne wurden dann über Nacht bei 4°C in 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert, dehydriert und in Paraffin eingebettet. In situ-Hybridisierung an diesen Gewebeabschnitten wurde entsprechend den etablierten Verfahren (Simonet et al., J. Biol. Chem., 11: 8221–8229 [1993]) unter Verwendung einer Ratten-Neuritin-cRNA-Probe, hergestellt wie für die oben beschrieben Northem-Blots, außer dass ³⁵S-UTP anstelle von ³²P-UTP vennrendet wurde, durchgeführt. Hybridisierte Schnitte wurden einer Kodak-fotografischen Emulsion ausgesetzt und nach 3–6 Wochen entwickelt. Nach dieser Zeit wurden die Schnitte mit Hämatoxylin gegengeschwärzt und Silberflecke wurden unter Verwendung von Dunkelfeld-Optik sichtbar gemacht.
Immunohistochemische Lokalisierung von Neuritin wurde unter Verwendung verschiedener Verdünnungen von affinitätsgereinigten Antiseren (AS419 oder AMG20, oben beschreben), welche spezifisch für menschliches rekombinantes Neuritin sind, hergestellt in Säugetierzellen, auf deparaffinisiertem PFA-fixierten Gewebeschnitten durchgeführt. Gebundene Neuritin-Antikörper wurden mit biotinyliertem Goat-Anti-Rabbit-Immunoglobulin und Meerrettich Peroxidase gelabeltem Avidin unter Verwendung des Vectastain Elite ABC-Stainingkits (Vector Labs, Burlingame, CA) entsprechend den Instruktionen des Herstellers detektiert.
In situ-Hybridisierungsanalyse zeigte, dass Neuritin-mRNA an der Grenze zwischen dem Neuroepithelium und der Differenzierungszone des sich entwickelnden Ratten-Gehims mit dem 14. Tag des Embryos (E14) auftritt. Das Signal wurde auch in sich entwickelnden neuronalen Strukturen in- der Peripherie lokalisiert, einschließlich der Dorsalwurzelganglien und der Trigeminal Ganglien. Die Expression schien sich mit der Entwicklung zu vergrößern und scheint innerhalb der differenzierenden Zone in dem Maße, in dem die individuellen Strukturen innerhalb des ZNS definierter werden, höher konzentriert zu werden,.
Neuritin-mRNA wurde in den meisten Strukturen von Erwachsenen Gehirn delektiert. Die meisten anderen reichlich vorhandenen Signale wurden in den Layern II-IV des Kortex, der hippokampalen Formation, von Thalamus, Habenula und Stammhirn gefunden. Im Hippokampus war die Expression in Neuronen der pyramidalen und granulären Zellschichten konzentriert, wobei angereicherte Spiegel in Neuronen der Subikulum- und Hilarregion des Gyrus dentatum konzentriert waren. Im Zerebellum wurden die niedrigen Spiegel an Neuritin-Signal in der granulären Zellschicht mit Punktstreulabeling von Purkinje Zellen lokalisiert.
Immunohistochemisches Färben von Gehirngeweben unter Verwendung der Neuritin-Antikörper AS419 oder AMG20, wie oben beschrieben, zeigt, dass Neuritin auf neuronalen Zellkörpern konzentriert ist und entlang der neuritischen Projektionen in die nichtmyelinierten Regionen des Gehirns ungleich verteilt ist. Die ungleiche Färbung hat eine granuläre Erscheinung der immunoreaktiven Regionen zur Folge und ist besonders entlang der Projektionen der Neuronen im subikularen Komplex des Hippokampus evident. Die Konzentration von Neuritin entlang von Neuriten wird ebenfalls in der Anfärbung der dendritischen Dornen von positiven Purkinje Zellen dokumentiert. Die Hilarregion des DG beinhaltet gestreut stark immunoreaktive Zellen, welche mit dem Muster, welches in der In-situ-Hybridisierung von Neuritin-mRNA beobachtet wurde, korrelieren. Die unregelmäßige Anfärbung von Purkinje Neuronen korreliert auch mit der punktierten Signal Lokalisierung.
Beispiel IV: Neuritin Biochemie und Regulierung der Expression
Die Aminosäuresequenz des Carboxylterminus von Neuritin legt die Möglichkeit nahe, dass Neuritin membranverankert ist. Zur Untersuchung dieser Möglichkeit wurden ungefähr 1 × 10⁶ CHO-Zellen transfiziert mit entweder einem leeren Plasmid (genannt "parental" und beinhaltend kein Neuritinogen) oder mit einem Plasmid, enthaltend das Gen für menschliches Neuritin mit entweder ungefähr 0.4 U/ml von PI-PLC (Phosphatidylinositol-phospholipase C; Calbiochem, La Jolla, CA), präpariert in 0.5 ml Freisetzungspuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 10 mM Glucose, 250 mM Sucrose), oder mit Freisetzungspuffer allein (kein PI-PLC) unter Befolgung veröffentlichter Verfahren (Kodukula et al., J. Cell Biol. 120: 657 [1993]) behandelt. Nach Inkubation wurden die Zellen zentrifugiert, um zellulären Rückstand auszufällen. Der Überstand wurde mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. Nach Eiektrophorese wurden die Gele auf Nitrozellulose Papier geblottet und mit Neuritin spezifischen affinitätsgereinigten Antisera getestet. Die Ergebnisse sind in 8A gezeigt. Wie zu sehen ist, wurde das gesamte detektierbare Neuritin im Überstand der CHO-Zellen gefunden, welche Neuritin exprimierten, das mit PI-PLC behandelt worden war, was nahelegt, dass Neuritin tatsächlich GPI verankert ist.
Die Analyse dieses endogenen GPI-verankerten Neuritins wurde durch Extraktion des Gewebes mit dem Reagens Triton X-114 (Calbiochem, San Diego, CA) in Übereinstimmung mit dem Verfahren beschrieben von Borchelt et al. (Glycobiol. 3: 319 [1993]) durchgeführt, um natives Neuritin zu erhalten. Ungefähr 100 mg pulverisiertem Gewebe wurden in 0.5 ml von 1 × TNE-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) mit Proteaseinhibütoren (0.5 mM Benzamidin, 1 mM PMSF und 1 μg/ml jeweils von Pepstatin, Leupeptin, Aprotinin) suspendiert und unter 4°C mit ungefähr 0.25 Volumen von Triton X-114, prääquilibriert mit 1 × TNE, vermischt. Die Triton X-114-löslichen Proteine wurden aus der Lösung durch Inkubieren der Mischung bei 30°C für etwa 15 Minuten extrahiert, gefolgt von Zentrifugation bei ungefähr 3000 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die großen, lipophiles Protein enthaltenden Detergenzien-Mizellen zu fällen. Diese Extraktion wurde wiederholt und die Detergenz enthaltenden löslichen Fraktionen wurden gepoolt. Um die extrahierten Proteine mit Western-Blot zu analysieren, wurden 20–40 μl Aliquots der Detergenzfraktionen gefällt durch Inkubieren jedes Aliquots mit 10 Volumen von Methanol (10 Minuten bei 4°C gefolgt von Schleudern bei 14000 g für 15 Minuten bei 4°C). Der gefällte Rückstand wurde in etwa 40 μl von SDS-PAGE-Samplepuffer resuspendiert (enthaltend Beta-mercaptoethanol) und größenfraktioniert auf einem 16 Prozent SDS-PAGE-Gel (Novex, San Diego, CA). Nach Elektrophorese wurden die Proteine auf Nitrocellulosepapier transferiert unter Verwendung von Standard Western-Blot Verfahren. Neuritin wurde unter Verwendung von Neuritin spezifischen affinitätsgereinigten Antiseren (AS419 oder AMG20, wie oben beschrieben) als einem ersten Antikörper und Meerrettich Peroxidase-konjugiertem Goatanti-rabbit-Antiserum als zweitem Antikörper (verdünnt ungefähr 1 : 10⁴, erhalten von Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama) detektiert. Antikörper wurden unter Verwendung von Peroxidase-sensitiver verstärkter Chemilumineszenz detektiert ("ECL", Amersham, Arlington Heights, IL). Die Resultate sind in 8B gezeigt. Wie offensichtlich ist, exprimierten Kortex- und Hippokampus-Regionen des Ge hirns die höchsten Spiegel an Neuritin. Neuritin aus rekombinanten CHO-Zellen, wie oben hergestellt, präpariert unter Verwendung von PI-PLC ist in in Spalte 1 zum Vergleich gezeigt. Der Unterschied in der Wanderung von Neuritin in den Spalten des Western-Blots rührt vermutlich von der veränderten Mobilität von Neuritin, an welches etwas Lipid gebunden ist.
Zur Untersuchung der Regulation von Neuritin-mRNA Expression wurde rekombinantes menschliches BDNF, NT-3, NGF oder FGF (ungefähr 10 ng/ml), KCl (ungefähr 50 mM) oder die Kalziumkanal-Blocker AMPA oder NMDA (ungefähr 10 μM) zu 7DIV E18 Ratten- hippokampalen oder -kortikalen Kulturen, wie unten in Beispiel V hergestellt, hinzugefügt. RNA wurde aus jeder Kultur nach etwa sechs Stunden Inkubationszeit durch das RNeasy Verfahren (Qiagen, Chatsworth, CA) isoliert. Ungefähr 5 μg dieser RNA wurden auf ein Gel geladen, durch Elektrophorese aufgetrennt und dann Northern geblottet. Der Blot wurde dann mit einer Ratten Neuritin-cDNAProbe, umspannend die kodierende Region (wie oben beschrieben) sondiert. Die Resultate sind in 6A. gezeigt. Wie zu sehen ist, resultiert NMDA- und AMPA-Behandlung in ungefähr 5facher Verstärkung des Neuritin-mRNA-Spiegels, und eine ähnliche Größenordnung wurde mit depolarisierenden Konzentrationen von KCl beobachtet.
Zu Evaluierung des Effekts von BDNF auf Neuritin-Expressionsspiegel in vivo wurde BDNF (1–2 μl von 10 mg/ml) oder Salzlösung (Kontrolle) intraventrikulär in 4 Tage alte Ratten Welpen injiziert. Ungefähr sechs Stunden nach Verabreichung von BDNF oder Salzlösung wurden die Welpen geopfert und die gesamte RNA aus dem Kortex oder dem hippokampalen Gehirn Gewebe isoliert. Wie in 6B gesehen werden kann, induzierte BDNF ein Neuritin-Signal in vivo eher im Hippokampus und zu einem kleineren . Grad im Kortex.
Beispiel V: Neuritin Bioaktivitätsassays
Kulturen von primären hippokampalen und kortikalen embryonischen Ratten Neuronen wurden durch Dissoziierung von sezierten Gehirnregionen von 18 Tagen alten Embryos hergestellt. Dissoziierung und Aufreinigung von embryonischen Neuronen wurde unter Verwendung eines Papain basierten Gewebe-Dissoziationskits (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) durchgeführt. Seziertes Gewebe von 10–30 Embryonen wurden in 2.5 ml Earles physiologischer Salzlösung (Earles Balanced-Salt-Solution; EBSS) re- suspendiert, enthaltend: 50 Einheiten Papain, 1 mM L-Cystein, mit 0.5 mM EDTA und 500 Einheiten DNase I). Das Gewebe wurde für 10–15 Minuten mit mildem Schütteln dissoziiert. Die dissoziierten Zellen wurden bei 300 g für 5 Minuten ausgefällt, in 2.7 ml EBSS, 0.3 ml Ovomukoid-Inhibitorlösung (10 mg/ml Ovomukoid Protease-Inhibitor und 10 mg/ml Bovin Serum Albumin) und 250 Einheiten DNase I resuspendiert. Die Suspen sion wurde auf 5 ml überschichtet mit Ovomukoid-Inhibitorlösung und bei 70 g für 6 Minuten ausgefällt. Die gefällten Zellen wurden in 10 ml B27-enthaltenden Neurobasal Medium (Gibco/BRL, Grand Island, NY) resuspendiert und durch ein 40 μm-Nylonmaschenzellsieb (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) passiert. Zur RNA-Analyse wurden die dissoziierten Neuronen auf 6-Well-Falcon-Gewebe-Kultur-Platten gebracht (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ), welche mit Poly-L-Omithin vorbeschichtet wurden (erhalten von Sigma, St..Louis, MO, und bei einer Konzentration von ungefähr 0.1 mg/ml in 150 mM Na-Borat, pH 8.4) und Laminin (erhalten von Gibco/BRL, Grand Island, NY, und verwendet bei einer Konzentration von ungefähr 1 μg/ml in PBS) verwendet wurden. Das Aufbringen der Neuronen auf Platten wurde mit einer Dichte von ungefähr 2 x 105 pro cm² für hippokampale Neuronen und ungefähr 3 × 10⁵ pro pro cm² für kortikale Neuronen durchgeführt. Die Zellen wurden in Neurobasalmedium (Gibco/BRL, Grand Island, NY) ergänzt mit 1 × B-27-Supplement (Gibco/BRL, Grand Island, NY) und 50 mg/ml Gentamycinsulfat (Gibco/BRL, Grand Island, NY) gezüchtet. Der Anteil an glialen Zellen jeder Kultur war nach sieben Tagen Kultivierung weniger als fünf Prozent, wie durch Auszählen von glialfibrillarsaurem Protein (GFAP)-positiven Zellen, welche durch indirekte Immunofluoreszenzfärbung unter Verwendung eines Antikörpers, spezifisch für diese glialzellspezifischen Marker, festgestellt wurde. Zellen wurden wie beschrieben nach 7 bis 8 Tagen der Kultivierung behandelt.
Der Neuriten-Auswuchsassay wurde unter Verwendung hippokampaler und kortikaler Neuronen, welche wie oben hergestellt wurden, durchgeführt. Die Zellen wurden auf Polylysin (20 μg/ml in PBS) beschichteten 35 mm-Platten mit einer Dichte von ungefähr 5 × 10³-Zellen pro cm² in Gegenwart oder Abwesenheit von Ni²⁺-gereinigtem Neuritin (wie oben dargestellt, hergestellt wurde) aufgebracht. Neuriten-Auswuchs wurde nach vier Tagen der Kultur durch Anfärben mit dem nichtspezifischen lipophilen Farbstoff Dil (10 μM, visualisiert mit 565 nm-Filter) für ungefähr 30 Minuten bei 37°C, gefolgt von 3 Waschungen in B-27-ergänzten neurobasalen Medien (siehe oben) vor der Analyse nachgewiesen.
Um die biologische Funktion von Neuritin zu überprüfen, wurde eine Histidin-getaggte Version von Neuritin, welche die 27 carboxylterminalen Aminosäuren nicht aufwies, in Chinesichen Hamster Ovar (CHO) Zellen hergestellt und gegen serumfrei konditioniertes Medium durch Ni²⁺-Affinitätschromatografie auf mehr als neunzig Prozent Homoge nität gereinigt, wie durch Silberanfärbung des SDS-Polyacrylamidgels (siehe oben) bestimmt wurde. Hippokampale und kortikale Neuronen von E18-Rattenembryonen wurden auf Polylysin gewatete Platten in der Gegenwart von 150 ng/ml dieses rekombinanten Neuritins aufgebracht. Das gleiche Volumen wurde zu den Kontrollproben zugegeben unter Verwendung einer äquivalenten Ni²⁺-Affinitätsfraktion, welche aus konditioniertem Medium von CHO-Zellen transfektiert mit dem leeren Expressionsvektor erhalten wurde. Nach vier Tagen in Kultur zeigten die Neuronen auf den Platten in Gegenwart von Neuritin umfangreiche Neuritogenese über die Kontrollkulturen hinaus, wie in 9 gezeigt ist. Neuritin behandelte Zellen hatten längere, höher verzweigte Neuriten Domen und eine erhöhte Zahl an Neuriten ausbreitend vom Soma her, im Vergleich zu den Kontrollzellen. Zellen, welche nichtspezifisch angefärbt wurden mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff Dil, zeigten einen entscheidenden Unterschied in der Organisation der Soma- und Neuriten-Lamellapodia (9). Unbehandelte Kontrollzellen hatten flache Zellkörper und breite, offensichtlich unfokussierte, Lamellapodia entlang der Längsrichtung oder am Ende von vielen Neuriten, wohingegen Neuritin behandelte Zellen gut differenzierte Zellkörper mit dünnen, wohl definierten Ausdehnungen aufwiesen. Ähnliche neuritogene Aktivität wurde mit gereinigtem bakteriellen Neuritin beobachtet.
Hinterlegung von Neuritin-cDNA
Die cDNA, kodierend für menschliches Neuritin in Gesamtlänge, wurde bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 9. August 1996 mit der Zulassungsnummer 98134 hinterlegt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Nukleinsäuremolekül, welches für ein Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) dem Nukleinsäuremolekül mit SEQ ID NO: 1; (b) dem Nukleinsäuremolekül mit SEQ ID NO: 2; (c) einem Nukleinsäuremolekül, welches für das Polypeptid mit SEQ ID NO: 3 kodiert; (d) einem Nukleinsäuremolekül, welches für das Polypeptid mit SEQ ID NO: 4 kodiert; (e) einem Nukleinsäuremolekül, welches für ein Polypeptid kodiert, das mindestens zu 70 Prozent zum vollständigen Polypeptid mit SEQ ID NO: 3 oder mit SEQ ID NO: 4 identisch ist; und (f) einem Nukleinsäuremolekül, das komplementär ist zu irgendeiner Nukleinsäure von (a) bis (e) oben.
Das Nukleinsäuremolekül mit SEQ ID NO: 1.
Das Nukleinsäuremolekül mit SEQ ID NO: 2.
Ein Nukleinsäuremolekül, welches für das Polypeptid mit SEQ ID NO: 3 kodiert.
Ein Nukleinsäuremolekül, welches für das Polypeptid mit SEQ ID NO: 4 kodiert.
Ein Vektor, welcher das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 1 umfasst.
Ein Vektor, welcher das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 2 umfasst.
Ein Vektor, welcher das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 3 umfasst.
Ein Vektor, welcher das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 4 umfasst.
Ein Vektor, welcher das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 5 umfasst.
Eine Wirtszelle, welche den Vektor von Anspruch 6 umfasst.
Eine Wirtszelle, welche den Vektor von Anspruch 7 umfasst.
Eine Wirtszelle, welche den Vektor von Anspruch 8 umfasst.
Eine Wirtszelle, welche den Vektor von Anspruch 9 umfasst.
Eine Wirtszelle, welche den Vektor von Anspruch 10 umfasst.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Neuritin Polypeptids, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Expression eines Polypeptids kodiert von der Nukleinsäure von Anspruch 1 in einem geeigneten Wirt; und (b) Isolierung des Polypeptids.
Das Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das Polypeptid das Polypeptid mit SEQ ID NO: 3 oder mit SEQ ID NO: 4 ist.
Ein Neuritin Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) dem Polypeptid mit SEQ ID NO: 3; (b) dem Polypeptid mit SEQ ID NO: 4; und (c) einem Polypeptid, das mindestens zu 70 Prozent identisch ist zu dem Polypeptid aus (a) oder (b).
Ein Neuritin Polypeptid, welches das Polypeptid ist mit SEQ ID NO: 4 oder ein biologisch aktives Fragment davon, welches neuritogene Aktivität aufweist.
Das Neuritin Polypeptid gemäß Anspruch 19, welches kein amino-endständiges Methionin besitzt.
Das Neuritin Polypeptid gemäß Anspruch 20 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Aminosäuren 25–115; Aminosäuren 1–115; und Aminosäuren 1–113.
Ein Antikörper oder Fragment davon, welcher spezifisch das menschliche Neuritin Polypeptid mit SEQ ID NO: 4 bindet.
Der Antikörper gemäß Anspruch 22, welcher ein monoklonaler Antikörper ist.