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Technischer
Bereich
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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen pharmazeutischen Wirkstoff,
der im pharmazeutischen Bereich nutzvoll ist, in dem spezifische
Proteinkonzentrationen in Krebszellen und den sie umgebenden Geweben
oder in Geweben des nicht erkrankten Teils verstärkt werden, wodurch das Krebswachstum
unterdrückt wird.
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Stand der
Technik
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In
den vergangenen Jahren zeigten sich signifikante Fortschritte in
therapeutischen Verfahren für Krebs
wie Chemotherapie für
Krebs, obwohl Krebs noch immer eine Krankheit ist, die in der ganzen
Welt eine bedeutende Position als Todesursache einnimmt. Folglich
besteht ein starker Bedarf an der Entwicklung eines neuen und wirklich
effektiven therapeutischen Verfahrens für Krebs.
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Neben
Immunglobulin als Blutgruppen erkennender Antikörper gibt es eine Gruppe von
funktionellen Proteinen in tierischem Gewebe und Körperflüssigkeiten,
die allgemein als "tierisches
Lectin" bezeichnet
werden, als Protein, das Zucker erkennt.
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Im
Verlaufe von Untersuchungen zum tierischen Lectin haben die Erfinder
der vorliegenden Erfindung Lectin vom Typ C gefunden, das sich calciumabhängig an
Mannose (Man) oder N-Acetylglucosamin (GlcNAc) bindet, aus Leber
und Serum von Säugern,
das "mannan-bindendes
Protein" (MBP) genannt
wird [Biochemical and Biophysical Research Communications, 81(1),
1018–1024
(1978); Biochemical and Biophysical Research Communications, 95(2),
658–664
(1980); und andere].
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Es
gelang ferner, das MBP aus Leber und Serum des Menschen zu gewinnen
und ebenso Gene dafür [Journal
of Biochemistry, 115(6), 1148-1154
(1994)]. Übrigens
wird das mannan-bindende Protein manchmal "mannose-bindendes Protein" oder "mannan-bindendes
Lectin" genannt.
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In
WO9207579 werden Peptide offenbart, die aus einem extrazellulären Teil
des Mannoserezeptorproteins gewonnen sind, und es wird deren Verwendung
in Zielzellen, die freiliegende Mannosereste aufweisen, vorgeschlagen.
Im Jpn. J. Cancer Res. 86, 1995, 187–192 ist die Bindung von Mannose
bindendem Protein an Gliomzellen in vitro offenbart.
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Im
Verlaufe der Untersuchungen bezüglich
Struktur und Funktion des MBP haben die Erfinder der vorliegenden
Erfindung geklärt,
dass das Serum-MBP ein komplementäres System aktiviert, über einen
klasischen Weg oder einen Lectinweg, ohne Abhängigkeit von einem Antikörper oder
C1q, das eine komplementäre
Komponente ist. Es ist auch bekannt, dass das Serum-MBP eine direkte
Biophylaxewirkung zeigt. Es ist zum Beispiel bekannt, dass Infektion
als Folge der Bindung von MBP mit Zuckerketten vom Oligomannosetyp an
Hüllglycoprotein
des humanen Immundefektvirus unterdrückt wird oder MBP die Eliminierung
von Hefen oder einem bestimmten Typ von gram-negativen Bakterien
durch Phagocyten fördert.
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Bisher
ist jedoch noch gar nichts bekannt über die Wirkung von MBP auf
Krebszellen oder Krebsgewebe.
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Durch die
Erfindung zu lösende
Probleme
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist, einen pharmazeutischen Wirkstoff
zur Verfügung
zu stellen, der in der Lage ist, das Wachstum von Krebs in Krebszellen
und den sie umgebenden Geweben oder in Gewebe des nicht erkrankten
Teils zu unterdrücken.
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Mittel zum
Lösen der
Probleme
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Um
die obigen Ziele zu erreichen, haben die Erfinder der vorliegenden
Erfindung verschiedene Untersuchungen vorgenomen und ganz unerwartet
gefunden, dass beim Vergleich von Tumor tragenden Tieren, denen
das für
MBP kodierende Gen verabreicht wurde und denen, denen das für MBP kodierende
Gen nicht verabreicht wurde, die Wachstumsfähigkeit von Krebszellen bei
den Tumor tragenden Tieren, denen das für MBP kodierende Gen verabreicht
wurde, deutlich unterdrückt
ist, worauf die vorliegende Erfindung gemacht wurde.
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Zusammengefasst
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Gens, das
für Mannose bindendes
Protein kodiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung
bei der Behandlung von Krebs.
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Kurze Erläuterung
der Zeichnungen
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1 ist
eine Zeichnung, die eine Restriktionsenzymkarte des Vacciniavirusvektors
pBSF2-16 zeigt.
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2 ist
eine Zeichnung, die eine Typdarstellung des MBP-Expressionsplasmids
pBSF2-16/MBP zeigt.
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3 ist
eine Zeichnung, die das Ergebnis der Versuche zur Bestimmung des
Antikrebseffekts in vivo zeigt.
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Beste Art
zur Ausführung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung wird nun nachfolgend spezieller erläutert.
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Bei
der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck MBP nicht nur
einen natürlichen
Typ, sondern deckt auch jegliches Protein ab, bei dem die Aminosäuresequenz
des natürlichen
Typs modifiziert ist, zum Beispiel mittels Substitution, Deletion,
Addition oder Insertion der Aminosäurereste, so fern ein solches
Protein noch die Aktivität
wie MBP zeigt. Beispiele des hier genannten MBP eines natürlichen
Typs sind die, die vom Menschen und Kaninchen gewonnen sind, obwohl
die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist, sondern auch diejenigen
abdeckt, die von anderen Organismen gewonnen sind, wie Tieren und
Pflanzen und auch diejenigen, die von Mikroorganismen gewonnen sind,
wie Bakterien, Hefen, Actinomycetes, Fadenpilze, Ascomycetes und
Basidiomycetes.
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Bei
der vorliegenden Offenbarung gibt es keine besondere Einschränkung bei
dem Gen, das für
MBP kodiert, so fern das Gen für
das MBP kodiert und das Protein die MBP-Aktivität wie oben genannt aufweist. Daher
wird das Gen, das für
das Protein mit einer MBP-Aktivität kodiert, von der vorliegenden
Erfindung abgedeckt, selbst wenn dieses Gen einer Modifizierungsbehandlung
unterzogen ist, die in der Gentechnik verwendet wird, wie Substitution,
Deletion, Addition und Insertion.
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Bei
der vorliegenden Erfindung kann das Ziel durch Einführen des
MBP in Krebszellen und das sie umgebende Gewebe oder in Gewebe eines
nicht erkrankten Teils erreicht werden. Beim Einführen des
MBP kann es mittels einer Direktverabreichung an Krebszellen direkt
in Krebszellen eingeführt
werden, wie nach einem Mikroinjektionsverfahren, wobei die Aktivität des MBP
erhalten bleibt oder mittels eines subkutanen Verabreichungsverfahrens
oder eines intravenösen
Verabreichungsverfahrens, wobei die Aktivität des MBP erhalten bleibt.
Darüber
hinaus kann ein Ziel der vorliegenden Erfindung zum Beispiel erreicht
werden durch Einführen
des Gens, das für
MBP kodiert, unter Verwendung eines Virus oder dergleichen oder
durch Einführen des
Gens, das für
MBP kodiert, mittels eines subkutanen Verabreichungsverfahrens oder
dergleichen, wodurch MBP exprimiert wird.
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Wenn
daher der pharmazeutische Wirkstoff der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, ist es nun möglich,
das MBP oder das für
MBP kodierende Gen in Krebszellen und das sie umgebende Gewebe oder
in Gewebe eines nicht erkrankten Teils einzuführen, wodurch das Wachstum
von Krebs unterdrückt
werden kann.
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MBP
oder ein Gen, das für
MBP kodiert, kann auch direkt in den erkrankten Teil an der Gewebeoberfläche oder
das sie umgebende Gewebe injiziert werden. Es ist auch möglich, direkt
in den erkrankten Teil im Gewebe oder das sie umgebende Gewebe zu
injizieren und es kann ebenso ein Wirkstoffabgabesystem (DDS, drug
delivery system) verwendet werden. Es kann jegliches DDS angewendet
werden, so fern es ein System ist, das für Krebszellen spezifisch ist,
zum Beispiel kann es aus üblichen
Systemen ausgewählt
sein, die Krebszellrezeptoren, krebsspezifische Antikörper usw.
verwenden. Es ist auch möglich,
dass Liganden oder Rezeptoren, die für Organe oder Zellen um die
umgebenden Gewebe spezifisch sind, verwendet werden, wodurch das
MBP spezifisch in diese Organe eingeführt wird. Übrigens ist es ein sehr effektives
Verfahren zur Unterdrückung
des Wachstums von Mikrokrebs, die Krebsgewebe mittels eines chirurgischen
Eingriffs auszuschneiden, gefolgt von der Anwendung des pharmazeutischen
Wirkstoffs der vorliegenden Erfindung bei den nicht kanzerösen Teilen.
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Wenn
ein pharmazeutischer Wirkstoff, bei dem das MBP der vorliegenden
Erfindung oder ein Gen, das für
das MBP kodiert, eine wirksame Komponente ist, bei Krebszellen und
dem sie umgebenden Gewbe oder Gewebe eines nicht erkrankten Teils
verwendet wird, versteht es sich von selbst, dass der pharmazeutische Wirkstoff
in solcher Weise zu verwenden ist, dass die Substanz am effektivsten
wirkt. Das Antikrebs mittel der vorliegenden Erfindung ist so vorgesehen,
dass es das MBP oder das Gen, das für das MBP kodiert, in einem pharmazeutisch
akzeptablen Maß enthält und in
pharmazeutische Präparate
eingebracht werden kann, in der selben Weise wie bei üblichen
genetischen Heilmitteln oder Protein enthaltenden Substanzen. Die
Präparate können Vehikel,
Füllstoffe,
Stabilisatoren, Verdicker usw. darin enthalten.
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Eine
Dosis des MBP oder des Gens, das für das MBP kodiert, das als
Antikrebsmittel der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann
in geeigneter Weise festgelegt und eingestellt werden, indem die
Dosierungsform, Anwendungsverfahren und Alter, Körpergewicht, Grad des Krankheitsfortschritts
usw. des betreffenden Patienten berücksichtigt werden. Zum Beispiel
kann im Falle von Protein, die Dosis für Erwachsene 0,01 μg-1 g/kg
für jede
Verabreichung betragen. Wenn rekombinanter Virus zur Expression
des Proteins verwendet wird, beträgt die Dosis für Erwachsene
1 × 102 bis 1 × 1012 PFU (Plaque Forming Unit) für jede Verabreichung.
Es erübrigt
sich darauf hinzuweisen, dass die Dosis in Abhängigkeit von verschiedenen
Bedingungen variieren kann, und daher eine geringere Dosis als oben
in einigen Fällen
ausreichend sein kann oder eine höhere Dosis als oben in anderen
Fällen
erforderlich sein kann.
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MBP
oder ein Gen, das für
MBP kodiert, das im Antikrebsmittel der vorliegenden Erfindung enthalten ist,
ist eine Substanz, die in vivo gefunden wird und keine Toxizität aufweist.
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Bezüglich des
bei der vorliegenden Erfindung verwendeten MBP wurden seine detaillierten
chemischen Proteineigenschaften schon geklärt und es kann zum Beispiel
aus menschlichem Serum in den in der folgenden Tabelle 1 gezeigten
Schritten nach dem Verfahren von Kawasaki et al. hergestellt werden
[Journal of Biochemistry, 94(3), 937–947 (1983)]. Tabelle
1
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Die
Bindungsaktivität
von MBP kann unter Verwendung von mit 125I
markiertem Mannan (125I-Mannan) gemäß einem
im Journal of Biochemistry, 94(3), 937–947 (1983) genannten Verfahren
gemessen werden. Die spezifische Aktivität von MBP wird in gebundenem 125I-Mannan (ng)/Gewicht Protein (μg) ausgedrückt. Die Menge
an Protein wird nach dem Verfahren von Lowry unter Verwendung von
Rinderserumalbumin als Standard gemessen.
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Das
Gen, das für
MBP kodiert, kann zum Beispiel aus einer cDNA-Bibliothek der menschlichen
Leber nach einem Verfahren von Kurata et al. [Journal of Biochemistry,
115(6), 1148-1154 (1994)] erhalten werden.
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Die
nach dem Verfahren ermittelte Aminosäuresequenz des reifen Proteins
des menschlichen MBP ist in SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls gezeigt
und die Nukleotidsequenz für
das dafür
kodierende Gen ist in SEQ ID NO:2 des Sequenzprotokolls gezeigt.
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Wenn
ein solches Gen oder ein Teil davon als Sonde verwendet wird, ist
es möglich,
ein Gen herzustellen, das zu dem Gen hybridisiert oder für ein Protein
kodiert, das eine MBP-Aktivität
aufweist. Wenn außerdem
ein Primer aus dem Gen oder einem Teil davon konstruiert wird, und dann
eine PCR (Polymerasekettenreaktion) unter Verwendung des Primers
durchgeführt
wird, ist es möglich,
ein Gen herzustellen, das für
Protein mit einer MBP-Aktivität
kodiert.
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Ein
Beispiel für
die Hybridisierung ist, dass eine Polyamidmembran hergestellt wird,
worauf eine aus Organismus, Mikroorganismus usw. gewonnene Genom-DNA
oder eine cDNA-Bibliothek immobilisiert ist, und bei 65°C in einer
Vorhybridisierungslösung
blockiert wird, die 0,5 SDS, 5 × Denhardt-Lösung [mit
0,1% Rinderserumalbumin (BSA) 0,1 Polyvinylpyrrolidon und 0,1% Ficoll
400], 100 μg
Lachssperm und 6 × SSC
(1 X SSC enthält
0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat; pH 7,0) enthält. Danach
wird jede Sonde mit 32P markiert zugesetzt,
gefolgt von Inkubation bei 65°C über vier
Stunden bis über
Nacht. Die Polyamidmembran wird mit 6 X SSC zehn Minuten lang bei
Raumtemperatur gewaschen und mit 0,1% SDS 30 Minuten lang bei 45°C und die
DNA, die mit der Sonde hybridisiert, kann durch eine Autoradiographie
erfasst werden. Übrigens
können Gene
mit verschiedenen Homologien unter Verwendung verschiedener Bedingungen,
wie Waschen, hergestellt werden.
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Es
ist auch möglich,
dass, wenn eine Modifizierungsbehandlung mittels Gentechnik wie
Substitution, Deletion, Addition und Insertion am durch SEQ ID NO:2
des Sequenzprotokolls dargestellten Gen vorgenommen wird, das Gen,
das zum Gen hybridisiert wird, das von SEQ ID NO:2 des Sequenzprotokolls
dargestellt ist und für
das Protein mit einer MBP-Aktivität kodiert, erhalten wird.
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Beispiele
des anwendbaren Verfahrens zum Ausführen der Modifizierung sind
ein Verfahren unter Verwendung einer Ambermodifikation [Gapped-Duplex-Verfahren;
siehe Nucleic Acids Research, 12(24), 9441-9456 (1984)], ein Verfahren
unter Verwendung einer Restriktionsenzymstelle [Analytical Biochemistry, 200,
81–88
(1992); und Gene, 102, 67–70
(1991)], ein Verfahren unter Verwendung von dut (dUTPase) und ung
(Uracil-DNA-Glucosylase) Modifikation [Kunkel-Verfahren; siehe Proceedings
of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 82, 488–492 (1985)],
ein Verfahren unter Verwendung einer Ambermodifikation mit DNA-Polymerase
und DNA-Ligase [Oligonucleotid-dirigiertes Dual-Amber-Verfahren
(ODA); siehe Gene, 152, 271–275
(1995)] und ein Verfahren nach einer PCR unter Verwendung von zwei
Arten von Primern zum Einführen
einer Modifikation, an der die Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms
hinzugefügt
ist (US-Patent Nr. 5,512,463).
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Es
ist auch möglich,
handelsübliche
Kits zu verwenden, wie Mutan®-G (hergestellt von Takara
Shuzo) mit einem Gapped-Duplex-Verfahren, MutanO-K (hergestellt
von Takara Shuzo) mit einem Kunkel-Verfahren, Mutan®-Express
Km (hergestellt von Takara Shuzo) mit einem ODA-Verfahren, QuikChangeTM Site-dirigiertes Mutegenese
Kit (hergestellt von Stratagene) unter Verwendung eines Primers
zum Einführen
einer Modifikation und Pyrococcus furiosus, TaKaRa LA-PCR in vitro
Mutagenese-Kit (hergestellt von Takara Shuzo) mit einer PCR und
Mutan®-Super
Express Km (hergestellt von Takara Shuzo).
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Es
ist möglich,
durch Messen der MBP-Aktivität
nach einem im Journal of Biochemistry 94(3), 937–947 (1983) oder Journal of
Biochemistry, 115(6), 1148-1154 (1994) beschriebenen Verfahren zu
bestätigen,
ob das derart hergestellte Gen ein Gen ist, das für das Protein
kodiert, das eine MBP-Aktivität
besitzt.
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Diese
Gene und exprimiertes Protein, das durch die genannten Gene erhalten
ist, können
ebenso als pharmazeutischer Wirkstoff der vorliegenden Erfindung
verwendet werden
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Wenn
der pharmazeutische Wirkstoff der vorliegenden Erfindung unter Verwendung
des Gens an sich, das für
MBP kodiert, in Krebszellen ein geführt wird, kann die Einführung des
für MBP
kodierenden Gens leicht ausgeführt
werden, wenn zum Beispiel das für
MBP kodierende Gen und der rekombinante Vektor, der ein dem zugeordnetes
regulatorisches Gen aufweist, verwendet werden. In Bezug auf das
regulatorische Gen ist es möglich,
zusätzlich
zu einem Vektor, der einen Promotor für das Gen aufweist, das an
sich für
MBP kodiert, jene zu verwenden, die andere effektive Promotoren
aufweisen, wie den ATI-Promotor (Vaccinia-Virus-A-Inclusion), SV 40 Promotor,
LTR-Promotor gewonnen vom Retrovirus, Hitzeschockpromotor, Metallothioneinpromotor
und Actinpromotor.
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Diese
Vektoren können
in Krebs oder in die Zellen eingeführt werden, die noch nicht
tumorgenetisch transformiert sind, in Form eines Vektors, der außerhalb
der Chromosomen in den Zellen bleibt. Unter solchen Bedingungen
ist es möglich,
dass das Gen von Zellen von der Position außerhalb des Chromosoms exprimiert wird,
das MBP produziert und die MBP-Konzentration in der Zelle erhöht, worauf
ein Ziel der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann.
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Es
sind Vektoren für
extrachromosomale Retention im Stand der Technik bekannt und es
kann ein geeigneter Vektor verwendet werden. In Hinblick auf ein
Verfahren zum Einführen
des Vektors in Zellen sind ein Elektroporationsverfahren, ein gemeinsames
Fällungsverfahren
mit Calciumphosphat, ein Virustransduktionsverfahren usw. im Fachbereich
bekannt und es liegt im Bereich der täglichen Arbeit, welches Verfahren
auszuwählen
ist.
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Es
ist ferner möglich,
dass das für
MBP kodierende Gen in Krebs oder in Zellen eingeführt wird,
die noch nicht tumorgenetisch transformiert sind, in Form eines
Vektors, der in das Chromosom integriert wird. Unter solchen Bedingungen
ist es möglich,
dass das Gen im Chromosom gehalten wird, von Zellen exprimiert wird,
das MBP produziert und die MBP- Konzentration
in der Zelle erhöht,
worauf ein Ziel der vorliegenden Erfindung erreicht wird.
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Beim
Einführen
des MBP-Gens in Zellen kann der das Gen enthaltende Vektor effizient
unter Verwendung eines Virusvektors eingeführt werden. In Hinblick auf
einen solchen Vektor ist es möglich,
den zu verwenden, von dem bekannt ist, dass er die gewünschte DNA
in Zellen transportiert und eine hohe Infektionseffizienz aufweist,
wie ein Vacciniavirusvektor, Retrovirusvektor, Adenovirusvektor,
adenoassoziierter Virusvektor oder nicht proliferierender Rekombinantenvirusvektor.
Insbesondere im Falle des nicht proliferierenden Rekombinantenvektors
wächst
der Rekombinantenvektor nach Einführung in die gewünschten
Zellen nicht, und deshalb muss er alle zwei Wochen bis alle zwei
Monate frisch verwendet werden, aber er hat den Vorteil, dass die Verabreichungsmenge
bei jeder dieser Gelegenheiten eingestellt werden kann. Es ist auch
möglich,
ein künstlich
hergestelltes kugelförmiges
Kapselliposom zu verwenden, das ein nicht viraler Vektor ist, wie
ein membrangebundenes Liposom und kationisches Liposom.
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Ein
Beispiel eines Verfahrens für
die Konstruktion des Rekombinantenvirus, der als pharmazeutischer Wirkstoff
der vorliegenden Erfindung wünschenswert
ist, wird wie folgt beschrieben. Auf diese Weise wird cDNA von menschlichem
MBP in Smal- und SacI-Stellen des Vaccianiavirusvektors pBSF2-16
(1) eingeführt,
der nach einem in Archives of Virology, 138, 315–330 (1994) genannten Verfahren
konstruiert ist, um einen rekombinanten Vektor pBSF2-16/MBP (2)
herzustellen, wobei MBP durch einen ATI-Hybridpromotor geregelt
wird (ein Promotor, bei dem der ATI-Promotor mit verschiedenen 7,5
kDa Promotoren kombiniert ist, die in Serie angeordnet sind). Der
rekombinante Vektor pBSF2-16/MBP
und Vacciniavirus-DNA eines Wildtyps werden in COS-7-Zellen co-transfektiert
und der rekombinante Vacciniavirus wird zum Beispiel mittels Expressionsmenge
von MBP oder einem Hämagglutininphänotyp ausgewählt, worauf
Rekombinationsvacciniavirus mit MBP-Expression erhalten werden kann.
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In
Hinblick auf eine Antikrebswirkung kann eine Wirkung zur Unterdrückung des
Wachstums von Krebs zum Beispiel in der Weise bestimmt werden, dass
menschliche Krebszellen in eine nackte Maus eingeimpft werden, der
pharmazeutische Wirkstoff der vorliegenden Erfindung dann verabreicht
wird und die Wachstumsfähigkeit
des Krebsgewebes danach gemessen wird. Auf diese Weise wird der
Kolonkrebszellstamm des Menschen SW1116 subkutan in eine KSN-Nacktmaus übertragen
und drei Wochen später
wird der oben genannte MBP exprimierende rekombinante Vacciniavirus
in den Tumor verabreicht oder subkutan in den nicht erkrankten Teil
verabreicht. Nach zwei Wochen wird der MBP exprimierende rekombinante
Vacciniavirus erneut auf die selbe Weise verabreicht und die Größe des Tumors
nach der Verabreichung wird gemessen, wodurch die Wirkung zur Unterdrückung des
Wachstums von Krebszellen bestimmt werden kann.
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird nun spezieller durch die folgenden Beispiele
erläutert.
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Beispiel 1. Konstruktion
des Expressionsvektors und des Rekombinantenvacciniavirus
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cDNA-Klon
H-3-1, der die volle Länge
der Kodierregion des menschlichen MBP enthält [Journal of Biochemistry,
115(6), 1148-1154 (1994)] wird in Smal- und SacI-Stellen subkloniert,
die unmittelbar nach dem ATI-Hybridpromotor (ein Promotor, bei dem
der ATI-Promotor und verschiedene Promotoren von 7,5 kDa in Serie
angeordnet kombiniert sind) des Vacciniavirusvektors pBSF2-16 liegen
[Archives of Virology, 138, 315–330
(1994)], so dass ein MBP-Expressionsplasmid pBSF2-16/MBP geregelt
vom ATI-Hybridpromotor ausgebildet wird.
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1 zeigt
eine Restriktionsenzymkarte des Vacciniavirusvektors pBSF2-16, während 2 eine
typische Darstellung des MBP-Expressionsplasmids pBSF2-16/MBP zeigt.
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Danach
wird ein IBT-abhängiger
Vacciniavirusstamm (IBT = Isatin-β-thiosemicarbazon)
[Virology, 155, 97–105
(1986)] in COS-7-Zellen infiziert (ATCC CRL 1651). Dann werden pBSF2-16/MBP
und Genom-DNA aus dem Virion eines Vacciniavirus-Wildtypstamms WR
unter Verwendung eines DOTA-Reagens (hergestellt von Boehringer
Mannheim), in die COS-7-Zellen eingeführt, die mit dem IBT-abhängigen Vacciniavirusstamm infiziert
sind, worauf ein MBP-Rekombinationsvacciniavirus ausgebildet wird.
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Ferner
wird der rekombinante Vacciniavirus gemäß einem Hämagglutininphänotyp nach
einem in Archives of Virology, 138, 315–330 (1994) genannten Verfahren
ausgewählt
und in RK-13-Zellen (ATCC CCL 37) mittels eines ELISA erfasst. Der
Virustiter wird nach einem Plaquebildungsverfahren gemessen und
als Plaquebildungseinheit (PFU, Plaque Forming Unit) ausgedrückt.
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Beispiel 2. Bestimmung
der Antikrebswirkung
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Die
Bestimmung der Antikrebswirkung in vivo wird wie folgt ausgeführt.
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Menschliche
Kolonkrebszellen des Stamms SW 1116 (ATCC CCL 233) werden subkutan
in einer Menge von 107 Zellen pro Maus (KSN-Nacktmaus;
hergestellt von Japan SLC) übertragen
und drei Wochen später der
MBP-Rekombinantenvacciniavirus von Beispiel 1 in den Tumor des erkrankten
Teils verabreicht oder subkutan in den nicht erkrankten Teil in
einer Menge von 5 X 106 PFU pro Maus verabreicht.
Als Kontrolle wird die selbe Menge an Vacciniavirusstamm WR eines
Wildtyps in den Tumor des erkrankten Teils verabreicht.
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Nach
zwei Wochen werden der MBP-Rekombinantenvacciniavirus oder der Wildtyp-Vacciniavirusstamm
WR in der selben Menge und auf die selbe Weise verabreicht und die
Größe des Tumors
nach der Verabreichung gemessen, wodurch die Wirkung zur Unterdrückung des
Wachstums von Krebszellen bestimmt wird.
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Als
Kontrolle wurde eine Gruppe verwendet, bei der physiologische Kochsalzlösung in
den nicht erkrankten Teil subkutan verabreicht wurde. Das Ergebnis
ist in 3 gezeigt. Somit ist 3 eine Abblidung, die
das Ergebnis der Experimente zur Bestimmung der Antikrebswirkung
in vivo zeigt, wobei die Ordinate die Größe des Tumors (mm) angibt,
während
die Abszisse die Anzahl Wochen nach Transplantation der Krebszellen
angibt. In der Abbildung geben schwarze Quadrate eine Gruppe an,
bei der eine physiologische Kochsalzlösung in den nicht erkrankten
Teil subkutan verabreicht wurde, offene Kreise geben eine Gruppe
an, bei der Vacciniavirus Stamm WR eines Wildtyps in Tumoren des
erkrankten Teils verabreicht wurde, geschlossene Kreise geben eine
Gruppe an, bei der ein MBP-Rekombinantenvacciniavirus in Tumoren
des erkrankten Teils verabreicht wurde und schwarze Dreiecke geben
eine Gruppe an, bei der ein MBP-Rekombinantenvacciniavirus in den
nicht erkrankten Teil subkutan verabreicht wurde. Die Pfeile in
der Abbildung geben die Wochen an, in denen der MBP-Vacciniavirus,
Vacciniavirus Stamm WR des Wildtyps und physiologische Kochsalzlösung verabreicht
wurden.
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Aus 3 ist
ersichtlich, dass wenn der MBP-Rekombinantenvacciniavirus der vorliegenden
Erfindung in Tumoren des erkrankten Teils verabreicht wird, die
Tumoren deutlich kleiner werden und dass, selbst wenn subkutan in
den nicht erkrankten Teil verabreicht wurde, eine signifikante Unterdrückung des
Wachstums von Krebszellen im Vergleich zu den Kontrollen beobachtet
wird, bei denen Vacciniavirus des Stamms WR oder ein Wildtyp und
physiologische Kochsalzlösung
verabreicht wurden.
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Vorteile der
Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Antikrebsmittel, das die MBP-Konzentration in
Krebszellen und dem sie umgebenden Gewebe oder im Gewebe von nicht
erkrankten Teilen erhöht,
mit anderen Worten ein Mittel, das ein Gen enthält, das für ein MBP kodiert, als Wirkkomponente
angeboten. Das Antikrebsmittel ist für den Bereich der Krebstherapie
geeignet. SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL
