DE60029791T2

DE60029791T2 - Rezeptor eines neurotrophen faktors (gfr-alpha-4)

Info

Publication number: DE60029791T2
Application number: DE60029791T
Authority: DE
Inventors: Stefan Leo Jozef Masure; Miroslav Cik; Evert Wilhelmus Hoefnagel
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 1999-06-29
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2020-05-27
Also published as: NZ515569A; EP1196560B1; US20060069242A1; NO20020012D0; US7476720B2; AU5810200A; IL147350A; ZA200110475B; WO2001002557A1; CA2377607A1; DE60029791D1; ATE335079T1; PT1196560E; IL147350A0; US7022818B1; KR20020069373A; KR100676229B1; GB9915200D0; CA2377607C; JP4810036B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Klonen und die Expression eines neuartigen Rezeptorproteins aus Säugern, das im vorliegenden Text als GFRα-4 bezeichnet wird, und insbesondere eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für das GFRα-4-Protein codiert, einen Expressionsvektor, der diese Nukleinsäuresequenz umfasst, eine Wirtszelle, die mit diesem Vektor transformiert oder transfiziert wird, isoliertes GFRα-4-Protein, Verbindungen, die als Agonisten oder Antagonisten in Bezug auf das GFRα-4 agieren, und Verfahren zu ihrer Identifizierung, zusammen mit pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die isolierte Nukleinsäure, das Rezeptorprotein oder diesen Agonisten oder Antagonisten umfassen.
Neurotrophe Wachstumsfaktoren sind an der neuronalen Differenzierung, Entwicklung und Aufrechterhaltung beteiligt. Diese Proteine können eine Degenerierung verschiedener Arten von neuronalen Zellen verhindern und ihr Überleben fördern und sind somit potenzielle therapeutische Mittel für neurodegenerative Krankheiten. Von einer Gliazelllinie abgeleiteter neurotropher Faktor (Glial cell-line Derived Neurotrophic Factor-GDNF) war das erste Mitglied einer wachsenden Unterfamilie neurotropher Faktoren, die sich strukturell von den Neurotrophinen unterschieden. GDNF ist ein entfernter Verwandter der Wachstumsfaktoren-Oberfamilie des aus transformierten Zellen gebildeten Wachstumsfaktors β (TGF-β), gekennzeichnet durch ein spezifisches Muster von sieben hoch-konservierten Cysteinresten innerhalb der Aminosäuresequenz (Kingsley, 1994). GDNF wurde ursprünglich mittels eines Assays gereinigt, basierend auf seiner Fähigkeit, das Überleben und die Funktion embryonischer ventraler dopaminerger Mittelhirnneuronen in vitro aufrecht zu erhalten (Lin et al., 1993). Es wurde nachgewiesen, dass andere neuronale Zelltypen im zentralen Nervensystem (ZNS) oder im peripheren Nervensystem (PNS) auf die überlebensfördernde Wirkung von GDNF ansprechen (Henderson et al., 1994, Buj-Bello et al., 1995, Mount et al., 1995, Oppenheim et al., 1995). GDNF wird durch Zellen in einer inaktiven Proform gebildet, die an einer RXXR-Erkennungsstelle spezifisch gespalten wird, wodurch aktives GDNF entsteht (Lin et al., 1993). Angesichts seiner Wirkungen auf dopaminerge Neuronen wurde GDNF in klinischen Versuchen als eine mögliche Behandlung für die Parkinsonsche Krankheit befunden, eine häufige neurodegenerative Störung, die durch den Verlust eines hohen Prozentsatzes (bis zu 70%) an dopaminergen Zellen im schwarzen Kern des Gehirns gekennzeichnet ist. Die exogene Verabreichung von GDNF hat potente Schutzwirkungen in Tiermodellen der Parkinsonschen Krankheit (Henderson et al., 1994, Beck et al., 1995, Tomac et al., 1995, Yan et al., 1995, Gash et al., 1996, Choi-Lundberg et al., 1997, Bilang-Bleuel et al., 1997, Mandel et al., 1997).
Unlängst wurden drei neue Mitglieder der GDNF-Familie der neurotrophen Faktoren entdeckt. Aus konditioniertem Medium aus Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) wurde Neurturin (NTN) unter Verwendung eines Assays gereinigt, basierend auf der Fähigkeit, das Überleben sympathischer Neuronen in Kultur zu fördern (Kotzbauer et al., 1996). Das reife Neurturin-Protein ähnelt zu 57% dem reifen GDNF. Persephin (PSP) wurde durch degenerierte Primer-PCR unter Verwendung genomischer DNA entdeckt. Das reife Protein, wie reifes GDNF, fördert das Überleben von ventralen dopaminergen Mittelhirnneuronen und von Motorneuronen in Kultur (Milbrandt et al., 1998). Die Ähnlichkeit des reifen Persephin-Proteins mit reifem GDNF und Neurturin beträgt 50%. Erst vor kurzem wurde ein viertes Mitglied unter Verwendung genomischer DNA-Informationen in der öffentlichen EMBL-Datenbank geklont und erhielt den Namen Enovin (EVN) (Masure et al., 1999) oder Artemin (ARTN) (Baloh et al., 1998b). Dieser Faktor ähnelt zu ±57% dem NTN und PSP und wirkt überwiegend auf periphere Neuronen.
Alle vier Mitglieder der GDNF-Familie erfordern einen heterodimeren Rezeptorkomplex, um eine nachgeordnete intrazelluläre Signaltransduktion auszuführen. GDNF bindet sich an die Rezeptor-Untereinheit alpha 1 der GDNF-Familie (GFRα-1; auch als GDNFRα, RETL1 oder TrnR1 bezeichnet; GFRα Nomenclature Committee, 1997), ein Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol (GPI)-verankertes Membranprotein (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Sanicola et al., 1997). Der GDNF/GFRα-1-Komplex bindet sich anschließend an das cRET-Protoonkogen – eine membrangebundene Tyrosinkinase – und aktiviert es (Durbec et al., 1996, Trupp et al., 1996), was zur Phosphorylierung von Tyrosinresten in cRET und anschließender Aktivierung von nachgeordneten Signaltransduktionswegen führt (Worby et al., 1996). GFRα-2 (auch als RETL2, NTNR-α, GDNFR-β oder TrnR2 bezeichnet), das dem GFRα-1 ähnelt, wurde durch eine Anzahl verschiedener Gruppen identifiziert (Baloh et al., 1997, Sanicola et al., 1997, Klein et al., 1997, Buj-Bello et al., 1997, Suvanto et al., 1997). Die menschlichen Rezeptor-Untereinheiten GFRα-1 und GFRα-2 sind im Hinblick auf die Proteinsequenz mit 30 der 31 konservierten Cysteinresten zu 49% identisch und zu 63% ähnlich. Beide Rezeptoren enthalten eine hydrophobe Domäne an ihren Carboxy-Termini, die an der GPI-Verankerung an der Membran beteiligt sind. GFRα-1 und GFRα-2 sind weithin in fast allen Geweben exprimiert, und die Expression kann in ihrer Entwicklung reguliert werden (Sanicola et al., 1997, Widenfalk et al., 1997).
GFRα-1 ist der bevorzugte Rezeptor für GDNF, wohingegen GFRα-2 vorzugsweise Neurturin bindet (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Klein et al., 1997). Es ist jedoch auch klar, dass es eine gewisse Überlappung zwischen diesen Wachstumsfaktoren und Rezeptoren gibt, weil sich GDNF in Gegenwart von cRET an GFRα-2 binden kann (Sanicola et al., 1997), und Neurturin kann sich mit geringer Affinität an GFRα-1 binden (Klein et al., 1997). GDNF und Neurturin sind somit Teil eines neurotrophen Signalisierungssystems, wodurch verschiedene ligandbindende Untereinheiten (GFRα-1 und GFRα-2) mit derselben Tyrosinkinase-Untereinheit (cRET) in Wechselwirkung treten können.
Unlängst wurde ein drittes Mitglied der GFRα-Familie von Korezeptoren, GFRα-3, -beschrieben (Jing et al., 1997, Masure et al., 1998, Worby et al., 1998, Naveilhan et al., 1998, Baloh et al., 1998a). Die Aminosäuresequenz dieses Rezeptors ist sowohl mit GFRα-1 als auch GFRα-2 zu 35% identisch. GFRα-3 wird im ZNS eines Heranwachsenden oder eines Erwachsenen nicht exprimiert, wird aber in verschiedenen sensorischen und sympathischen Knoten des PNS eines Heranwachsenden oder eines Erwachsenen stark exprimiert (Widenfalk et al., 1998, Naveilhan et al., 1998, Baloh et al., 1998a). Es wurde nachgewiesen, dass GFRα-3 der bevorzugte Korezeptor für Enovin/Artemin ist und auch über cRET signalisiert (Masure et al., 1999, Baloh et al., 1998b). Überlappung zwischen EVN/ARTN und GFRα-1 scheint auch möglich, zumindest in vitro.
Ein viertes Mitglied der GFRα-Familie wurde im Huhn identifiziert (Thompson et al., 1998), und es wurde nachgewiesen, dass es die Signalisierung von Persephin über cRET vermittelt (Enokido et al., 1998). Ein funktionelles Homolog aus Säugern, das für einen Persephin-Rezeptor aus Säugern codiert, muss erst noch entdeckt werden.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben überraschend einen weiteren neuartigen Rezeptor der GDNF-Familie aus Säugern identifiziert, der im vorliegenden Text als GFRα-4 bezeichnet wird. Die DNA- Sequenz wurde geklont, und eine Anzahl von Spleißvarianten, die für den Rezeptor codieren, wurde ebenfalls identifiziert.
Dementsprechend wird durch die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure in isolierter oder weitgehend reiner Form bereitgestellt, die für einen Rezeptor α-4 der GDNF-Familie aus Säugern codiert, der als GFRα-4 bezeichnet wird. Der Rezeptor, der durch dieses Nukleinsäuremolekül codiert wird, hat die Aminosäuresequenz, die unter den Sequenz-Kennnummern 8 oder 9 dargestellt ist.
Zwar wurde zunächst angesichts der Tatsache, dass nur 4 Mitglieder der GFRαs bekannt waren, der neue Rezeptor als GFRα-5 bezeichnet. Er wurde nun aber in α-4 umbenannt, um die bestehende Nomenklatur für Mitglieder der GFRα-Familie zu erfüllen und um anzuzeigen, dass der GFRα-Rezeptor der vorliegenden Erfindung das Säuger-Ortholog des GFRα-4-Rezeptors vom Huhn ist.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das für einen Rezeptor α-4 (GFRα-4) der GDNF-Familie aus Säugern oder ein immunologisch und/oder biologisch aktives Fragment dieses Rezeptors codiert, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) Nukleotidsequenzen, die für das Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz umfasst, die unter der Sequenz-Kennnummer 8 oder 9 gezeigt ist;
(b) Nukleotidsequenzen, die die Codierungssequenz umfassen, die unter der Sequenz-Kennnummer 5 oder 6 gezeigt ist;
(c) Nukleotidsequenzen, die für ein Polypeptid codieren, das von dem Polypeptid, das durch eine Nukleotidsequenz von (a) oder (b) codiert wird, mittels Substitution, Deletion und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren der Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz von (a) oder (b) codiert wird, abgeleitet ist;
(d) Nukleotidsequenzen, deren komplementärer Strang mit einer Nukleotidsequenz gemäß (a) bis (c) hybridisiert;
(e) Nukleotidsequenzen, die für ein Polypeptid codieren, dessen Aminosäuresequenz eine Identität von wenigstens 30% mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweist, das durch eine Nukleotidsequenz gemäß (a) bis (d) codiert wird;
(f) Nukleotidsequenzen, die für ein Polypeptid codieren, das Persephin binden kann, das ein Fragment oder einen epitoptragenden Abschnitt eines Polypeptids umfasst, das durch eine Nukleotidsequenz gemäß (a) bis (e) codiert wird;
(g) Nukleotidsequenzen, die mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide einer Nukleotidsequenz gemäß (a) bis (f) umfassen und für ein Polypeptid codieren, das Persephin binden kann; und (h) Nukleotidsequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die infolge des genetischen Codes zu einer Nukleotidsequenz gemäß (a) bis (g) degeneriert ist.

Vorteilhafterweise kann das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül für die Expression des GFRα-4-Proteins zum Beispiel in einer Wirtszelle oder dergleichen unter Verwendung eines entsprechenden Expressionsvektors verwendet werden. Bevorzugt ist das Nukleinsäuremolekül ein DNA-Molekül und besonders bevorzugt ein cDNA-Molekül mit einer Sequenz, wie sie unter den Sequenz-Kennnummern 5 bis 7 veranschaulicht ist, oder deren Komplement.
Alternativ ist das Nukleinsäuremolekül in der Lage, mit den erfindungsgemäßen Sequenzen unter Bedingungen hoher Stringenz oder mit deren Komplement zu hybridisieren. Stringenz der Hybridisierung meint im Sinne des vorliegenden Textes Bedingungen, unter denen Polynukleinsäuren stabil sind. Die Stabilität von Hybriden spiegelt sich in der Schmelztemperatur (Tm) der Hybride wider. Tm lässt sich durch folgende Formel approximieren: 81,5°C + 16,6 (log10[Na+] + 0,41 (%G&C) – 6001/1wobei 1 die Länge der Hybride in Nukleotiden ist. Tm nimmt mit jedem Prozent Abnahme der Sequenzhomologie um ungefähr 1–1,5°C ab.
Die Nukleinsäure, die mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen hybridisieren kann, ist im Allgemeinen mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80 oder 90% und besonders bevorzugt mindestens 95% zu den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen homolog.
Vorteilhafterweise lässt sich das Antisense-Molekül als eine Sonde oder als ein Medikament oder in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff verwenden.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein DNA-Expressionsvektor bereitgestellt, der das erfindungsgemäße DNA-Molekül umfasst. Dieser Vektor kann vorteilhafterweise zum Transformieren oder Transfizieren einer Wirtszelle verwendet werden, um eine Expression des GFRα-4 gemäß der Erfindung zu erreichen. Bevorzugt ist die DNA in einem Plasmid für eine anschließende Transfektion oder Transformation der Wirtszelle enthalten.
Ein Expressionsvektor gemäß der Erfindung enthält einen Vektor mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, die mit Regulierungssequenzen wirkverbunden ist, wie zum Beispiel Promoter-Regionen, die eine Expression der DNA-Fragmente bewirken können. Der Begriff "wirkverbunden" meint eine Nebeneinanderstellung, bei der die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die es ihnen ermöglicht, in der ihnen zugedachten Weise zu funktionieren. Solche Vektoren können zu einer geeigneten Wirtszelle transformiert werden, um die Expression eines Polypeptids gemäß der Erfindung auszuführen. Somit stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt einen Prozess zum Herstellen von Rezeptoren gemäß der Erfindung bereit, der Folgendes umfasst: Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, wie oben beschrieben, unter Bedingungen transformiert oder transfiziert wurde, die eine Expression einer Codierungssequenz, die für die Rezeptoren codiert, durch den Vektor ermöglichen; und Gewinnen der exprimierten Rezeptoren.
Die Vektoren können zum Beispiel Plasmid-, Virus- oder Phagenvektoren sein, die mit einem Replikationsstartpunkt, optional einem Promoter für die Expression des Nukleotids und optional einem Regulator des Promoters ausgestattet sind. Die Vektoren können einen oder mehrere auswählbare Marker enthalten, wie zum Beispiel Ampicillinresistenz.
Zu Regulationselementen, die für die Expression benötigt werden, gehören Promotersequenzen zum Binden von RNA-Polymerase und Transkriptionsinitiierungssequenzen zur Ribosombindung. Zum Beispiel kann ein bakterieller Expressionsvektor einen Promoter wie zum Beispiel den Lac-Promoter und für die Transkriptionsinitiierung in der Shine-Dalgarno-Sequenz und den Startcodon AUG enthalten. Gleichermaßen kann ein eukaryotischer Expressionsvektor einen heterologen oder homologen Promoter für RNA-Polymerase II, ein nachgeordnetes Polyadenylierungssignal, den Startcodon AUG und einen Terminierungscodon zum Abtrennen des Ribosoms enthalten. Solche Vektoren können auf dem freien Markt bezogen werden oder können aus den beschriebenen Sequenzen mittels einschlägig bekannter Verfahren assembliert werden.
Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung können in einer Antisense-Orientierung in die beschriebenen Vektoren eingefügt werden, um die Bildung von Antisense-RNA zu ermöglichen. Antisense-RNA oder sonstige Antisense-Nukleinsäuren können auf synthetische Weise hergestellt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung enthält eine definierte Nukleinsäure nicht nur die identische Nukleinsäure, sondern auch jegliche Aminobasisvariationen, einschließlich insbesondere Substitutionen in Basen, die infolge des degenerierten Codes in konservativen Aminosäuresubstitutionen zu einem synonymen Codon führen (ein anderer Codon, der den gleichen Aminosäurerest spezifiziert). Der Begriff "Nukleinsäuresequenz" beinhaltet auch die komplementäre Sequenz zu jeder gegebenen einsträngigen Sequenz im Hinblick auf Basisvariationen.
Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren vorteilhafterweise Nukleinsäuresequenzen von mindestens ungefähr 10 aneinandergrenzenden Nukleotiden einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung und bevorzugt 10 bis 50 Nukleotiden bereit. Diese Sequenzen können vorteilhafterweise als Sonden oder Primer zum Initiieren einer Replikation oder dergleichen verwendet werden. Solche Nukleinsäuresequenzen können gemäß einschlägig bekannten Techniken gebildet werden, wie zum Beispiel auf rekombinante oder synthetische Weise. Sie können auch in Diagnosekits oder dergleichen zum Detektieren des Vorhandenseins einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung verwendet werden. Diese Tests umfassen im Allgemeinen das Inkontaktbringen der Sonde mit der Probe unter Hybridisierungsbedingungen und das Detektieren des Vorhandenseins einer Duplex- oder Triplexformation zwischen der Sonde und einer Nukleinsäure in der Probe.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können diese Sonden an einem festen Träger verankert werden. Bevorzugt befinden sie sich auf einem Array, so dass mehrere Sonden gleichzeitig mit einer einzelnen biologischen Probe hybridisieren können. Die Sonden können auf das Array gespotted sein oder können in situ auf dem Array synthetisiert werden. (Siehe Lockhart et al., Nature Biotechnology, Band 14, Dezember 1996, "Expression monitoring by hybridisation into high density oligonucleotide arrays"). Ein einzelnes Array kann mehr als 100, 500 oder sogar 1.000 verschiedene Sonden an diskreten Stellen enthalten.
Die Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung können auf eine solche rekombinante oder synthetische Weise gebildet werden, wie zum Beispiel unter Verwendung von PCR-Klonungsmechanismen, die im Allgemeinen Folgendes beinhalten: Bilden eines Paares Primer, die ungefähr 10 bis 50 Nukleotide umfassen können, zu einer Region des Gens, das geklont werden soll; Inkontaktbringen der Primer mit mRNA, cDNA, oder genomischer DNA von einer menschlichen Zelle; Ausführen einer Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen, die zu einer Verstärkung der gewünschten Region führen; Isolieren der verstärkten Region oder des verstärkten Fragments; und Gewinnen der verstärkten DNA. Im Allgemeinen sind die im vorliegenden Text beschriebenen Techniken einschlägig bekannt, wie zum Beispiel in Sambrook et al. beschriebenen (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989).
Die Nukleinsäuren oder Oligonukleotide gemäß der Erfindung können eine Erkennungsmarkierung tragen. Zu geeigneten Markierungen gehören Radioisotope wie zum Beispiel ³²P oder ³⁵S, Enzymmarkierungen oder sonstige Protein-Markierungen wie zum Beispiel Biotin oder Fluoreszenzmarker. Solche Markierungen können den Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden gemäß der Erfindung hinzugefügt werden und können unter Verwendung von an sich bekannten Techniken detektiert werden.
In den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung fallen auch Proteine oder Polypeptide, die durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung codiert werden.
Bevorzugt umfasst das Protein die Aminosäuresequenz der Sequenz-Kennnummern 8 und 9.
Ebenfalls beschrieben werden hybride und modifizierte Formen des GFRα-4-Rezeptors gemäß der Erfindung, einschließlich Fusionsproteinen und Fragmenten. Zu hybriden und modifizierten Formen gehört zum Beispiel, wenn bestimmte Aminosäuren einer Modifikation oder Ersetzung unterzogen wurden, wie zum Beispiel durch Punktmutation, und dennoch ein Protein entsteht, das die gleiche Rezeptorspezifität besitzt wie der GFRα-4-Rezeptor gemäß der Erfindung.
In diesem Kontext versteht es sich, dass die Begriffe "biologische Aktivität", "Rezeptorspezifität" und "funktioneller Rezeptor (Fragment)" bevorzugt die Fähigkeit beinhalten, Persephin zu binden, bevorzugt spezifisch, und dass das GFRα-4 der Erfindung keine oder im Wesentlichen keine Bindungsaktivität an GDNF, NTN und/oder EVN/ART aufweisen. Die biologische Aktivität, die Rezeptorspezifität und/oder Funktionalität, zum Beispiel Bindungsaktivität, des GFRα-4 gemäß der Erfindung, seiner Varianten, Derivate und Fragmente lassen sich mit Hilfe einschlägig bekannter Verfahren bestimmen, bevorzugt solchen, die in den angehängten Beispielen beschrieben sind. Bevorzugt ist der K_D-Wert des GFRα-4 gemäß der Erfindung für Persephin 1 bis 10 × 10^–9, besonders bevorzugt 5,9 ± 2,8 × 10^–9, wenn er gemäß den unten beschriebenen Beispielen bestimmt wird; siehe die Beschreibung zu Tabelle 6.
Proteine oder Polypeptide gemäß der Erfindung enthalten des Weiteren Varianten solcher Sequenzen, einschließlich natürlich vorkommender alleler Varianten, die zu diesen Proteinen oder Polypeptiden weitgehend homolog sind. In diesem Kontext wird eine weitgehende Homologie als eine Sequenz betrachtet, die mindestens 90% Aminosäurehomologie mit den Proteinen oder Polypeptiden aufweist, die durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung codiert werden.
Unter weitgehender Homologie ist zu verstehen, dass die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des erfindungsgemäßen GFRα-4 einen bestimmten Grad von Sequenzidentität aufweisen. Sie haben untereinander eine Identität von mehr als 90%, und in Bezug auf die Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen, die jeweils unter den Sequenz-Kennnummern 5 bis 9 gezeigt sind, sind mehr als 95% gewünscht. Ein bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der besten Gesamtübereinstimmung zwischen einer Abfragesequenz (einer Sequenz der vorliegenden Erfindung) und einer Subjektsequenz, auch als eine globale Sequenzanordnung bezeichnet, ist zum Beispiel die Verwendung des FASTDB-Computerprogramms auf der Grundlage des Algorithmus' von Brutlag et al.n (Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237–245). Bei einer Sequenzanordnung ist sowohl die Abfrage- als auch die Subjektsequenz eine DNA-Sequenz. Eine RNA-Sequenz kann durch Umwandeln von Us in Ts verglichen werden. Das Ergebnis der globalen Sequenzanordnung ist eine prozentuale Identität. Weitere Programme, die zur Bestimmung der Homologie/Identität verwendet werden können, sind unten und in den Beispielen beschrieben. Die Sequenzen, die zu den oben beschriebenen Sequenzen homolog sind, sind zum Beispiel Variationen der Sequenzen, die Modifikationen darstellen, welche die gleiche biologische Funktion haben, insbesondere codierende Proteine mit der gleichen oder im Wesentlichen der gleichen Rezeptorspezifität, d. h. Bindungsspezifität. Sie können natürlich vorkommende Variationen, wie zum Beispiel Sequenzen von anderen Säugern, oder Mutationen sein. Diese Mutationen können natürlich vorkommen oder können durch Mutagenesetechniken erhalten werden. Die allelen Variationen können natürlich vorkommende allele Varianten sowie synthetisch gebildete oder gentechnische Varianten sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Sequenzen von der Maus, besonders bevorzugt vom Menschen abgeleitet. Diese Sequenzen können auch aus bestehenden Datenbanken mit Nukleotidsequenzen von noch unbekannter Funktion abgerufen werden. Zum Beispiel erbrachte eine BLAST-Suche in der EMBL-Datenbank unter Verwendung der identifizierten GFRα-4-Sequenzen von der Ratte als Abfragesequenz eine genomische Maussequenz (Neuzugangsnummer AF155960) und eine genomische menschliche Sequenz (Neuzugangsnummer AC017113; die Contigs enthielt, die von menschlicher genomischer DNA abgeleitet wurden), wobei Teile nahezu identisch mit Teilen der GFRα-4-Sequenz der Ratte waren (Exons 2, 3 und 4).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst die Wirtszelle selbst, die mit dem im vorliegenden Text beschriebenen DNA-Expressionsvektor transformiert wird, wobei diese Wirtszelle bevorzugt eine eukaryotische Zelle umfasst, bei der es sich zum Beispiel um eine Säugerzelle, eine Insektenzelle oder eine Hefezelle oder dergleichen handeln kann. Bei einer Ausführungsform umfasst die Zelle eine Zelle der HEK293-Zelllinie. Alternativ kann die Zelle NIH/3T3-Mausfibroblasten oder Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-7-Zellen umfassen.
Des Weiteren wird durch die vorliegende Erfindung eine nichtmenschliche transgene Zelle, ein nichtmenschliches transgenes Gewebe oder ein nichtmenschlicher transgener Organismus bereitgestellt, umfassend ein Transgen, das zur Expression von GFRα-4 gemäß der Erfindung oder zur Expression eines funktionellen Äquivalents, Derivats oder Biovorläufers des Rezeptors befähigt ist. Die Begriff "zur Expression befähigtes Transgen" im Sinne des vorliegenden Textes meint eine geeignete Nukleinsäuresequenz, die zur Expression eines menschlichen Rezeptors führt, der die gleiche Funktion und/oder Aktivität hat wie GFRα-4. Das Transgen kann zum Beispiel genomische Nukleinsäure, die von Rattenzellen isoliert wurde, oder synthetische Nukleinsäure, einschließlich cDNA, enthalten, die in das Genom integriert wurde oder sich in einem extrachromosomen Zustand befindet. Bevorzugt umfasst das Transgen die Nukleinsäuresequenz, die für GFRα-4 gemäß der Erfindung codiert, oder ein funktionelles Fragment der Nukleinsäure. Unter einem funktionellen Fragment der Nukleinsäure ist ein Fragment des Gens oder der cDNA zu verstehen, das für den GFRα-4-Rezeptor oder ein funktionelles Äquivalent oder einen Biovorläufer des GFRα-4 codiert, wobei dieses Fragment exprimiert werden kann, so dass ein funktionelles Rezeptorprotein entsteht. Zum Beispiel kann das Gen Deletionen von Mutationen umfassen, aber immer noch für einen funktionellen Rezeptor codieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren das Inhibieren von GFRα-4 in vivo mittels Antisense-Technologie. Antisense-Technologie kann zum Steuern der Genexpression durch Tripelhelixformation oder Antisense-DNA oder -RNA verwendet werden, wobei diese beiden Verfahren auf dem Binden eines Polynukleotids an DNA oder RNA basieren.
Zum Beispiel wird der 5'-Codierungsabschnitt der reifen Proteinsequenz, der für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, für das Gestalten eines Antisense-RNA-Oligonukleotids von 10 bis 40 Basispaaren Länge verwendet. Ein DNA-Oligonukleotid wird so gestaltet, dass es zu einer Region des Gens komplementär ist, die an der Transkription beteiligt ist (Tripelhelix – siehe Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); und Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991), wodurch Transkription und die Bildung von GFRα-4 verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonukleotid hybridisiert mit der mRNA in vivo und blockiert die Translation eines mRNA-Moleküls zu dem GFRα-4-Rezeptor.
Es werden auch Antikörper zu dem GFRα-4-Rezeptor gemäß der Erfindung bereitgestellt, die in einem Medikament oder in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden können.
Antikörper zu dem GFRα-4 gemäß der Erfindung können vorteilhafterweise durch einschlägig bekannte Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel können polyklonale Antikörper durch Inokulation eines Wirtstieres, wie zum Beispiel einer Maus, mit dem Polypeptid gemäß der Erfindung oder einem Epitop davon und Gewinnen von Immunserum hergestellt werden. Monoklonale Antikörper können gemäß bekannten Techniken hergestellt werden, wie sie zum Beispiel von Kohler, R. und Milstein, C., Nature (1975) 256, 495–497, beschrieben werden.
Antikörper gemäß der Erfindung können auch in einem Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins von GFRα-4 verwendet werden, indem man den Antikörper mit einer Probe reagieren lässt und jegliches daran gebundene Protein identifiziert. Es kann auch ein Kit zum Durchführen dieses Verfahrens bereitgestellt werden, das einen Antikörper gemäß der Erfindung und ein Mittel zum Reagieren des Antikörpers mit dieser Probe umfasst.
Vorteilhafterweise kann der Antikörper gemäß der Erfindung auch als ein Medikament oder bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, bei denen sich die Expression des GFRα-4 gemäß der Erfindung vollzieht. Die Erfindung stellt des Weiteren eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die diesen Antikörper zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff umfasst.
Proteine, die mit dem Polypeptid der Erfindung interagieren, können durch Untersuchen von Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung des Doppelhybridvektorsystems identifiziert werden, das zuerst von Chien et al.n (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9578–9582, vorgeschlagen wurde.
Diese Technik basiert auf der funktionellen Rekonstitution in vivo eines Transkriptionsfaktors, der ein Reportergen aktiviert. Genauer gesagt, umfasst die Technik das Bereitstellen einer entsprechenden Wirtszelle mit einem DNA-Konstrukt, das ein Reportergen unter der Kontrolle eines Promoters umfasst, der durch einen Transkriptionsfaktor reguliert wird, der eine DNA-Bindungsdomäne und eine Aktivierungsdomäne aufweist; Exprimieren – in der Wirtszelle – einer ersten hybriden DNA-Sequenz, die für eine erste Fusion eines Fragments oder der Gesamtheit einer Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung und entweder dieser DNA-Bindungsdomäne oder dieser Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors codiert; Exprimieren – in dem Wirt – mindestens einer zweiten hybriden DNA-Sequenz, wie zum Beispiel eine Bibliothek oder dergleichen, die für vermeintliche Bindungsproteine, die zu untersuchen sind, zusammen mit der DNA-Bindungs- oder Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors, der nicht in der ersten Fusion enthalten ist, codiert; Detektieren jeglicher Bindung der zu untersuchenden Proteine mit einem Protein gemäß der Erfindung durch Detektieren des Vorhandenseins eines Reportergenprodukts in der Wirtszelle; und optional das Isolieren zweiter hybrider DNA-Sequenzen, die für das Bindungsprotein codieren.
Proteine, die sich an den GFRα-4-Rezeptor binden, können unter Verwendung dieser Technik identifiziert werden. Die identifizierten Proteine können auch zum Identifizieren von Verbindungen verwendet werden, die als Agonisten/Antagonisten dieser Proteine wirken. Die Struktur des Rezeptors kann auch zum Gestalten von Agonisten oder Antagonisten des Rezeptors verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Agonisten oder Antagonisten des menschlichen GFRα-4-Rezeptors gemäß der Erfindung, wobei dieser Agonist oder Antagonist vorteilhafterweise auch als ein Medikament oder in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff verwendet werden kann.
Agonisten oder Antagonisten können identifiziert werden, indem man eine Zelle, die GFRα-4 exprimiert, mit einer zu testenden Verbindung in Kontakt bringt und den Grad einer GFRα-4-vermittelten funktionellen oder biologischen Antwort überwacht, wie zum Beispiel durch Überwachen des Grades der Phosphorylierung in dieser Zelle, oder durch Cytosensor- oder Ligandbindungsassays in Gegenwart von cRET oder ähnlicher Proteine im Signaltransduktionsweg. Bevorzugt kann die Zelle eine Wirtszelle oder Transgen-Zelle gemäß der Erfindung, wie im vorliegenden Text definiert, sein. Agonisten und Antagonisten von GFRα-4 können auch identifiziert werden, indem man zum Beispiel ein Membranpräparat, das GFRα-4 umfasst, mit der zu testenden Verbindung in Gegenwart von cRET oder sonstigen ähnlichen Proteinen in Kontakt bringt, die an dem Signaltransduktionsweg beteiligt sind, wovon GFRα-4 eine Komponente ist, und Überwachen der Wechselwirkung von GFRα-4 mit cRET oder diesen ähnlichen Proteinen. Vorteilhafterweise können jegliche Verbindungen oder Moleküle, die als Agonisten oder Antagonisten in Bezug auf das GFRα-4 identifiziert werden, selbst in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie oben definiert, oder als ein Medikament verwendet werden.
Ebenfalls beschrieben werden Moleküle oder Verbindungen, die auf den Signaltransduktionsweg wirken, zu dem GFRα-4 oder ein funktionelles Äquivalent gehören. Alternativ können die Moleküle mit komplexer Bildung oder Wechselwirkung von GFRα-4 oder seinem funktionellen Äquivalent mit cRET oder einem ähnlichen Protein im Signaltransduktionsweg, wovon GFRα-4 eine Komponente ist, interferieren.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen eines Antagonisten oder Agonisten von GFRα-4 gemäß der Erfindung, das die Schritte eines der oben beschriebenen Screening-Verfahren umfasst, und außerdem:

(i) Synthetisieren der Verbindung, die mit dem Verfahren erhalten oder identifiziert wurde, oder eines physiologisch unbedenklichen Analogs oder Derivats davon in einer Menge, die ausreicht, um diesen Antagonisten oder Agonisten in einer therapeutisch wirksamen Menge für einen Patienten bereitzustellen; und/oder
(ii) Kombinieren der Verbindung, die mit dem Verfahren erhalten oder identifiziert wurde, oder eines Analogs oder Derivats davon mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff.

Die durch die obigen Verfahren isolierten Verbindungen dienen auch als Leitverbindungen für die Entwicklung von Analogverbindungen. Die Analoge sollten eine stabilisierte Elektronenkonfiguration und molekulare Konformation haben, die es ermöglicht, dem GFRα-4-Rezeptor funktionelle Schlüsselgruppen in weitgehend der gleichen Weise zu präsentieren wie die Leitverbindung. Genauer gesagt, haben die Analogverbindungen räumliche Elektroneneigenschaften, die mit der Bindungsregion vergleichbar sind, können aber kleinere Moleküle als die Leitverbindung haben, häufig mit einem Molekulargewicht unter etwa 2 kD und bevorzugt unter etwa 1 kD. Die Identifizierung von Analogverbindungen kann mittels Techniken wie zum Beispiel der Self-Consistent Field (SCF)-Analyse, der Configuration Interaction (CI)-Analyse und der Normal Mode Dynamics-Analyse erfolgen. Computerprogramme zum Implementieren dieser Techniken sind verfügbar, zum Beispiel Rein, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions (Alan Liss, New York, 1989). Verfahren für die Herstellung von chemischen Derivaten und Analogen sind einschlägig bekannt und sind zum Beispiel bei Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York, Inc., 175 Fifth Avenue, New York, New York 10010, USA, und Organic Synthesis, Wiley, New York, USA, beschrieben. Des Weiteren können diese Derivate und Analoge gemäß einschlägig bekannten Verfahren getestet werden auf ihre Wirksamkeit; siehe auch oben. Des Weiteren können auch Peptidomimetik und/oder Computer Aided Design von entsprechenden Derivaten und Analogen verwendet werden.
Verbindungen, die als Agonisten oder Antagonisten in Bezug auf das GFRα-4 oder als Liganden oder Verbindungen, die mit dem Signaltransduktionsweg interferieren, von dem GFRα-4 ein Teil ist, identifiziert werden, können vorteilhafterweise bei der Herstellung eines Medikament zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten verwendet werden, wie zum Beispiel der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit, der Motorneuronerkrankung, peripherer Neuropathie, Rückenmarksverletzungen, familiäre Hirschsprung-Krankheit, zusätzlich zu verschiedenen Karzinomen, wie zum Beispiel bei Magen-Darm-Krebs, und auch zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer GFRα-4-Dysfunktion verbunden sein können. Verbindungen, die als Antagonisten identifiziert werden, können vorteilhafterweise bei der Herstellung eines Medikament zur Behandlung von Karzinomen oder zur Schmerzlinderung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren auch ein Verfahren zum Identifizieren von Liganden von GFRα-4 gemäß der Erfindung, wobei dieses Verfahren umfasst, den Rezeptor mit entweder einem Zellenextrakt oder alternativ einer Verbindung in Kontakt zu bringen, die auf ihr Potenzial als ein GFRα-4-Ligand getestet werden soll, und Isolieren aller Moleküle, die an das GFRα-4 gebunden sind.
Durch die vorliegende Erfindung wird auch ein Diagnosekit bereitgestellt, das eine Sonde umfasst, die Folgendes enthält: ein Nukleinsäuremolekül, das für ein GFRα-4-Protein gemäß der Erfindung codiert, oder ein Molekül, das unter Bedingungen hoher Stringenz damit hybridisieren kann, oder ein Fragment dieser Nukleinsäuren, oder ein Antisense-Molekül gemäß der Erfindung, zusammen mit einem Mittel zum Inkontaktbringen von zu testendem biologischem Material mit dieser Nukleinsäuresonde. Ein Diagnosekit gemäß der Erfindung kann auch einen Agonisten oder Antagonisten in Bezug auf das GFRα-4 oder einen Antikörper, bevorzugt einen monoklonalen Antikörper zu GFRα-4, umfassen. Somit kann das Kit vorteilhafterweise je nach Zweckmäßigkeit verwendet werden, um zum Beispiel Zellen, die diesen Rezeptor exprimieren oder nicht aufweisen, oder genetische Defekte oder dergleichen zu identifizieren oder um zu bestimmen, ob eine Verbindung ein Agonist oder ein Antagonist des GFRα-4-Rezeptors ist. Kits zum Bestimmen, ob eine Verbindung ein Agonist oder ein Antagonist in Bezug auf das GFRα-4 ist, können Folgendes umfassen: ein Zellen- oder Membranpräparat, das diesen Rezeptor gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, ein Mittel zum Inkontaktbringen dieser Zelle mit dieser Verbindung und ein Mittel zum Überwachen des Grades einer GFRα-4-vermittelten funktionellen oder biologischen Antwort, zum Beispiel durch Messen des Grades der Phosphorylierung in dieser Zelle oder durch Cytosensor- oder Ligandbindungsassays in Gegenwart von cRET oder ähnlichen Proteinen, die an dem Signaltransduktionsweg beteiligt sind, wovon GFRα-4 eine Komponente ist.
Die vorliegende Erfindung kann anhand der folgenden beispielhaften Ausführungsform unter Bezug auf die begleitenden Figuren besser verstanden werden. In diesen Figuren ist Folgendes dargestellt:
1 ist eine Veranschaulichung der Struktur des GFRα-4-Gens der Ratte. Die oberste Linie zeigt eine Skala in bp. Die Linie darunter zeigt die genomische Struktur des GFRα-4-Gens der Ratte. Exons sind durch Kästchen dargestellt und nummeriert, und Intronsequenzen sind als Linien dargestellt. Die Größen (in bp) von Introns and Exons sind über dem Schaubild angegeben. Der Translationsstartcodon ist durch einen Pfeil angezeigt, und der Stoppcodon ist durch ein Sternchen angezeigt. Die cDNA-Sequenzen der Varianten A und B, die durch Herausspleißen der Intronsequenzen erhalten werden, sind unter der genomischen Sequenz gezeigt. Alternatives Spleißen von Intron 5 führt zu einem früheren Stoppcodon in Spleißvariante B. Die vorhergesagten Proteinsequenzen der Varianten A und B sind unten gezeigt. Die vorhergesagten Signalpeptide, eine vermeintliche N-Glycosylierungsstelle und eine hydrophobe COOH-Terminalregion, der eine oder zwei mögliche Stellen zur GPI-Spaltung (nur in Variante A) vorangehen, sind in den Schaubildern angezeigt.
2 ist eine Anordnung der vorhergesagten Proteinsequenzen der Spleißvarianten A und B des GFRα-4 der Ratte. Die Sequenzen der Spleißvarianten A und B des GFRα-4 der Ratte wurden unter Verwendung des Anordnungsprogramms ClustalW (EMBL, Heidelberg, Deutschland) angeordnet. Aminosäurereste, die zwischen den beiden Varianten konserviert sind, sind in den schwarzen Bereichen enthalten. Aminosäurereste sind rechts nummeriert. Die Minusstriche bezeichnen Lücken, die in die Sequenz eingefügt wurden, um die Anordnung zu optimieren.
3 ist eine Anordnung der vorhergesagten Proteinsequenzen von Mitgliedern der GFRα-Familie. Die Sequenz der Varianten A und B des GFRα-4 der Ratte, des GFRα-1 der Ratte EMBL-Neuzugangsnummer U59486), des GFRα-2 der Ratte EMBL-Neuzugangsnummer AF003825), des GFRα-3 der Maus EMBL-Neuzugangsnummer AB008833) und des GFRα-4 vom Huhn EMBL-Neuzugangsnummer AF045162) wurden unter Verwendung des Anordnungsprogramms ClustalW (EMBL, Heidelberg, Deutschland) angeordnet. Aminosäurereste, die zwischen allen 6 Proteinen konserviert sind, sind in den schwarzen Bereichen enthalten. Reste, die zwischen 4 oder 5 der Sequenzen konserviert sind, sind grau schattiert. Cysteinreste, die zwischen allen sechs GFRαs konserviert sind, sind mit einem Sternchen über der Sequenz angezeigt. Aminosäurereste sind rechts nummeriert. Die Minusstriche bezeichnen Lücken, die in die Sequenz eingefügt wurden, um die Anordnung zu optimieren.
4: Northern-Blot-Analyse einer GFRα-4-mRNA-Expression vom Nager. Die Expression der GFRα-4-mRNA von Ratte und Maus in verschiedenen Geweben wurde unter Verwendung einer Sonde beurteilt, die der Codierungssequenz des GFRα-4 der Ratte entsprach, um Blots von poly(A)-reicher RNA zu analysieren. (A) Multiple Tissue Northern (MTN)-Blot von der Ratte; (B) MTN-Blot von der Maus und (C) MTN-Blot vom Mausembryo. Die scheinbaren Größen sind (in Kilobasispaaren) durch horizontale Linien links neben jedem Panel angezeigt.
5. Das GFRα-4-Gen der Ratte ist auf Chromosom 3q36 positioniert. Eine Mischung zweier Sonden aus GFRα-4 der Ratte wurde für die FISH-Analyse verwendet. (A) Doppel-Spot-FISH-Signale auf dem mittig-distalen Abschnitt des Chromosoms 3 der Ratte (Pfeile). (B) Position der GFR-4-Gen-Stelle auf dem Chromosom 3q36 der Ratte.
Oligonukleotid-Synthese für PCR- und DNA-Sequenzierung
Alle verwendeten Oligonukleotid-Primer wurden bei Eurogentec (Seraing, Belgien) bestellt. Insertionsspezifische Sequenzierungsprimer (15- und 16-mer) und Primer zur Verwendung in PCR-Reaktionen wurden manuell gestaltet. DNA wurde auf Qiagen-tip-20 oder -100-Anionenaustausch- oder Qiaquick-Spinsäulen hergestellt (Qiagen GmbH, Düsseldorf, Deutschland) und aus den Säulen in 30 μl TE-Puffer aufgefangen (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (Natriumsalz), pH 8,0). Sequenzierungsreaktionen erfolgten an beiden Strängen unter Verwendung des ABI Prism BigDye Terminator Cycle-Sequenzierungs-Kits und wurden auf einem Sequenzierer 377XL von Applied Biosystems ausgeführt (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, Kalifornien, USA). Zur Sequenzassemblierung und zum manuellen Editieren wurde die Sequencher^TM-Software verwendet (GeneCodes, AnnArbor, Michigan, USA).
Identifizierung einer cDNA-Sequenz, die für ein neuartiges Mitglied der GFRα-Familie codiert Unter Verwendung der menschlichen GFRα-1-, GFRα-2- oder GFRα-3-DNA- oder -Proteinsequenzen als Abfragesequenz wurden BLAST-Suchen (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., 1990) in den täglichen Aktualisierungen der öffentlichen EMBL-Datenbank angestellt. Eine EST-Sequenz (Expressed Sequence Tag) der Maus mit der EMBL-Neuzugangsnummer AU035938 zeigte Homologie zu GFRα-1, GFRα-2 und GFRα-3. Die mittels der BLAST-Analysen erhaltenen Wahrscheinlichkeiten der kleinsten Summe (Smallest Sum Probabilities-SSP) sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1: BLAST-Ergebnisse
AU035938 (Sequenz 1) ist eine Sequenz von 792 bp, die von einer Mäusehirn-cDNA-Bibliothek abgeleitet ist. Um eine gleichbleibende Homologie mit anderen Mitgliedern der GFRα-Familie bei Translation zu erhalten, muss ein Frameshift nahe der Position 165 in der DNA-Sequenz eingefügt werden. Es ist nicht klar, ob das die Folge eines Sequenzierungsfehlers ist oder ob es dafür eine andere Erklärung gibt. Unter Verwendung dieser EST-Sequenz als die Abfragesequenz wurde die BLAST-Suche in der öffentlichen EMBL-Datenbank wiederholt. Ein zusätzlicher Klon (Neuzugangsnummer AA823200; Sequenz 2) erbrachte eine signifikante SSP von le-18. Bei Inspizierung dieses 497-bp-Klons, der von einer Mausmilchdrüsen-cDNA-Bibliothek abgeleitet wurde, waren nur die ersten 61 bp mit einem Teil von AU035938 identisch (Position 353 bis 415). Der Rest der Sequenz von AA823200 unterschied sich von AU035938, aber enthielt Teile, von denen die translatierte Aminosäuresequenz Homologie mit den übrigen GFRαs aufweist. Darum wurde die Hypothese aufgestellt, dass AU035938 und AA823200 zwei variante Formen des gleichen Rezeptors darstellen könnten, der als GFRα-4 bezeichnet wurde.
Klonen von Maus-GFRα-4-cDNA
Zuerst versuchten wir, ein Fragment der Maus-GFRα-4-cDNA in Marathon Ready^TM-cDNAs (Clontech Laboratories, Palo Alto, Kalifornien, USA) zu verstärken, die von Mäusehirn und Mausembryo abgeleitet war. Es wurden Primer unter Verwendung der EST-Sequenzen (EMBL-Neuzugangsnummer AU035938 und AA823200) gestaltet, um ein 274-bp-Fragment von Maus-GFRα-4 zu verstärken. Die Primer, die zur Verstärkung von Maus-GFRα-4 verwendet wurden, sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Tabelle 2: Primer, die für die Verstärkung von Maus-GFRα-4-DNA-Sequenzen verwendet wurden
PCR-Reaktionen erfolgten unter Verwendung des Taq-Polymerase-Systems (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland). PCR-Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das Folgendes enthielt: 1 × Taq-PCR-Reaktionspuffer, 0,25 mM dNTP, 0,5 μM der Primer MOUSE-GFRα4-sp2 und MOUSE-GFRα4-ap2, 1 μl Taq-Polymerase und 2 μl Mausembryo- oder Mäusehirn-Marathon Ready^TM-cDNA. Die Proben wurden 5 min lang auf 95°C erwärmt, und das Zyklieren erfolgte 30 s lang bei 94°C, 1 min bei 60°C und 45 s bei 72°C über 35 Zyklen, mit einem abschließenden Schritt von 7 min bei 72°C. Eine halb-ineinandergesetzte PCR wurde dann an 1 μl der primären PCR-Reaktion mit den Primern MOUSE-GFRα4-sp3 und MOUSE-GFRα4-ap2 ausgeführt. Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das Folgendes enthielt: 1 × Taq-PCR-Reaktionspuffer, 0,25 mM dNTP, 0,5 μM Primer MOUSE-GFRα4-sp3 und MOUSE-GFRα4-ap2, 1 μl Taq-Polymerase und 1 μl primäres PCR-Produkt. Die Proben wurden 5 min lang auf 95°C erwärmt, und das Zyklieren erfolgte 30 s lang bei 94°C, 1 min bei 60°C und 45 s bei 72°C über 35 Zyklen, mit einem abschließenden Schritt von 7 min bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden auf einem Agarosegel (1 Volumengewichts-%) in 1 × TAE-Puffer (40 mM Trisacetat, 1 mM EDTA (Natriumsalz), pH 8,3) analysiert. Ein PCR-Fragment der erwarteten Größe (270 bp) wurde von dem Gel exzidiert und mit dem Qiaquick-Gelextraktionskit gereinigt (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland). Die PCR-Fragmente wurden sequenziert, um ihre Identität zu bestätigen. Die erhaltene Sequenz entsprach den EST-Datenbank-Sequenzen.
Um die vorangehenden und nachgeordneten Codierungssequenzen von Maus-GFRα-4 zu bestimmen, wurden 5'- und 3'-RACE-Experimente durchgeführt. Weil diese Experimente nicht wie erwartet funktionierten und weil an einigen Punkten Frameshifts in die Maus-GFRα-4-Sequenz eingefügt werden mussten, um eine gleichbleibende Homologie mit anderen GFRαs nach der Translation zu erhalten, entschieden wir, zum Klonen des Rattenhomologs von Maus-GFRα-4 überzugehen.
Identifizierung und Klonen von Ratten-GFRα-4-cDNA-Sequenzen
Die oben beschriebenen cDNA-Sequenzen mit der Neuzugangsnummer AU035938 und AA823200 wurden als die Abfragesequenz in BLAST-Suchen in den proprietären LifeSeq- und ZooSeq-Datenbanks (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Kalifornien, USA) verwendet. Zwei Rattenklone mit hoher Homologie zu den Maus-GFRα-4-Sequenzen wurden identifiziert: Nummer 701290919H1 (270 bp; Treffer mit AU035938 (SSP = 1,1e-32) und mit AA823200 (SSP = 1,3e-21)) und Nummer 701291473H1 (250 bp; Treffer nur mit AA823200 (SSP = 4,3e-42)). Aus dem Vergleich der translatierten Proteinsequenzen, die von Klonen 701291473H1 und 701290919H1 abgeleitet waren, mit den bekannten GFRα-Proteinsequenzen konnte geschlussfolgert werden, dass die Sequenz 701290919H1 wahrscheinlich 5' zur Sequenz 701291473H1 positioniert war und dass diese Sequenzen in der vollen GFRα-4-cDNA-Sequenz fast nebeneinander lagen. Darum wurden zwei Vorwärts-Primer (RAT-GFRα4-sp1 und RAT-GFRα4-sp2) in der 5'-Region von Sequenz 701290919H1 gestaltet, und zwei Rückwärts-Primer (RAT-GFRα4-ap1 und RAT-GFRα4-ap2) wurden in der 3'-Region von Sequenz 701291473H1 gestaltet. Alle Primer-Sequenzen, die in den PCR-Experimenten verwendet wurden, sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3: Primer, die für die Verstärkung von Ratten-GFRα-4-Sequenzen verwendet wurden. Die Primer RACE-ap1 und RACE-ap2 sind im Marathon Ready^TM-cDNA-Kit enthalten.
Anschließend wurde eine PCR unter Verwendung der Primer RAT-GFRα4-sp1 und RAT-GFRα4-ap1 auf Rattenhirn-Quickclone-cDNA (Clontech Laboratorien, Palo Alto, Kalifornien, USA) durchgeführt, um das Vorhandensein von Ratten-GFRα-4 in Hirn-abgeleiteter cDNA zu bestätigen. Da die DNA-Sequenzcodierung für die Ratten-GFRα-4-Sequenz einen hohen G+C-Gehalt in dieser Region aufweist, wurden PCR-Reaktionen unter Verwendung des Advantage-GC-PCR-Kit (Clontech) ausgeführt. Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das Folgendes enthielt: 1 × GC-cDNA-PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELTä, 200 nM Primer RAT-GFRα4-sp1 und RAT-GFRα4-ap1, 1 μl Advantage-KlenTaq-Polymerase-Mischung und 1 μl Rattenhirn-Quickclone-cDNA. Die Proben wurden 1 min lang auf 95°C erwärmt, und das Zyklieren erfolgte 1 min lang bei 95°C, 1 min bei 56°C und 1 min bei 72°C über 30 Zyklen, mit einem abschließenden Schritt von 7 min bei 72°C. Dann wurde eine ineinandergesetzte PCR in 1 μl der primären PCR-Reaktion mit den Primern RAT-GFRα4-sp2 und RAT-GFRα4-ap2 durchgeführt. Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das Folgendes enthielt: 1 × GC-cDNA-PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELTä, 200 nM Primer RAT-GFRα4-sp2 und RAT-GFRα4-ap2, 1 μl Advantage-KlenTaq-Polymerase-Mischung und 1 μl primäres PCR-Produkt. Die Proben wurden 1 min lang auf 95°C erwärmt, und das Zyklieren erfolgte 30 s lang bei 95°C, 1 min bei 56°C und 1 min bei 72°C über 25 Zyklen, mit einem abschließenden Schritt von 7 min bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden auf einem Agarosegel (1 Volumengewichts-%) in 1 × TAE-Puffer (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA (Natriumsalz), pH 8,3) analysiert. Zwei PCR-Fragmente von ungefähr 1100 bzw. 200 bp wurden von dem Gel exzidiert und mit dem Qiaquick-Gelextraktionskit gereinigt (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland). Die PCR-Fragmente wurden sequenziert, um ihre Identität zu bestätigen. Das kleinste Fragment erbrachte eine Sequenz von 211 bp, was den verbundenen Sequenzen 701290919H1 und 701291473H1 entsprach. Das größte Fragment erbrachte eine Sequenz von 1049 bp, wovon 18 bp am 5'-Ende, 59 by am 3'-Ende und ein interner Abschnitt von 92 bp der Sequenz des 211-bp-Fragments entsprachen, die aber zusätzliche Sequenzabschnitte dazwischen aufwiesen. Dieses Fragment stellte eine Variante des Ratten-GFRα-4 dar.
Beide Klone 701291919H1 und 701291473H1 wurden bei Incyte Pharmaceuticals erworben, und die Einschübe wurden vollständig sequenziert. Die Sequenzen sind in dieser Anmeldung enthalten (Sequenz 3 = 701290919H1 und Sequenz 4 = 701291473H1). Beide Klone wurden von derselben 7 Tage alten Rattenhirnkortex-cDNA-Bibliothek abgeleitet. Beide Klone unterscheiden sich in ihren 5'-Enden (die ersten 134 bp in 701291473H1 und die ersten 227 bp in 701290919H1), sind aber danach identisch. Beide enthalten einen Teil der GFRα-4-Codierungssequenz bis zu einem Stoppcodon (Position 184–186 in 701291473H1 und 277–279 in 701290919H1). Eine untranslatierte 3'-Region von 549 bp, gefolgt von einem poly(A)-Schwanz, ist dann in beiden Klonen vorhanden. Wir stellten die Hypothese auf, dass beide Klone verschiedene Varianten des Ratten-GFRα-4-Gens sind. Es wurden Primer (RAT-GFRα4-ap3 und RAT-GFRα4-ap4) auf einem Teil der Sequenz gestaltet, der beiden Varianten gemein war, um 5'-RACE-Experimente auszuführen, um das 5'-Ende der Ratten-GFRα-4-cDNA zu bestimmen.
Zuerst wurde eine 5'-RACE-PCR in Rattenhirn-Marathon ReadyTM-cDNA (Clontech) ausgeführt. Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das Folgendes enthielt: 1 × GC-cDNA-PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M oder 1,5 M GC-MELTä, 200 nM Primer RAT-GFRα4-ap3 und RACE-ap1, 1 μl Advantage-KlenTaq-Polymerase-Mischung und 5 μl Rattenhirn-Marathon ReadyTM-cDNA. Die Proben wurden 30 s lang auf 95°C erwärmt, und das Zyklieren erfolgte 30 s lang bei 95°C, 4 min bei 72°C über 5 Zyklen, dann 30 s bei 95°C, 4 min bei 70°C über 5 Zyklen, dann 30 s bei 95°C, 4 min bei 68°C über 25 Zyklen, mit einem abschließenden Schritt von 7 min bei 68°C. Dann wurde eine ineinandergesetzte PCR in 1 μl der primären PCR-Reaktion mit den Primern RAT-GFRα4-ap4 und RACE-ap2 ausgeführt. Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das Folgendes enthielt: 1 × GC-cDNA-PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M oder 1,5 M GC-MELTä, 200 nM Primer RAT-GFRα4-ap4 und RACE-ap2, 1 μl Advantage-KlenTaq-Polymerase-Mischung und 1 μl primäres PCR-Produkt. Das Zyklieren erfolgte unter Verwendung exakt der gleichen Parameter wie für die primäre PCR. Die PCR-Produkte wurden auf einem Agarosegel (1 Volumengewichts-%) in 1 × TAE-Puffer (40 mM Trisacetat, 1 mM EDTA (Natriumsalz), pH 8,3) analysiert.
Ein Fragment von ungefähr 350 bp wurde von dem Gel exzidiert und unter Verwendung des TOPO TA-Klonkits gemäß den Herstelleranweisungen (Invitrogen BV, Leek, Niederlande) in den Plasmidvektor pCR2.1-TOPO geklont. Einer der resultierenden Klone erbrachte eine Einschubsequenz von 387 bp, welche die Ratten-GFRα-4-Sequenz in der 5'-Richtung verlängerte. Nach der Translation erbrachte diese zusätzliche cDNA-Sequenz eine Proteinsequenz ohne interne Stoppcodons und mit weitgehender Homologie zu den anderen bekannten GFRα-Sequenzen. Da kein vermeintlicher ATG-Startcodon innerhalb dieser zusätzlichen Sequenz detektiert werden konnte, wurden neuartige Primer (RAT-GFRα4-ap5 und RAT-GFRα4-ap6) an das 5'-Ende dieser Sequenz gestaltet, um zusätzliche 5'-RACE-Experimente auszuführen. Zuerst wurde eine 5'-RACE-PCR in Rattenherz-Marathon Ready^TM-cDNA (Clontech) ausgeführt. Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das Folgendes enthielt: 1 × GC-cDNA-PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELTä, 200 nM Primer RAT-GFRα4-ap5 und RACE-ap1, 1 μl Advantage-KlenTaq-Polymerase-Mischung und 5 μl Rattenherz-Marathon Ready^TM-cDNA. Die Proben wurden 30 s lang auf 95°C erwärmt, und das Zyklieren erfolgte 30 s lang bei 95°C, 4 min bei 72°C über 5 Zyklen, dann 30 s bei 95°C, 4 min bei 70°C über 5 Zyklen, dann 30 s bei 95°C, 4 min bei 68°C über 25 Zyklen, mit einem abschließenden Schritt von 7 min bei 68°C. Dann wurde eine ineinandergesetzte PCR in 1 μl der primären PCR-Reaktion mit den Primern RAT-GFRα4-ap6 und RACE-ap2 ausgeführt. Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das Folgendes enthielt: 1 × GC-cDNA-PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELTä, 200 nM Primer RAT-GFRα4-ap6 und RACE-ap2, 1 μl Advantage-KlenTaq-Polymerase-Mischung und 1 μl primäres PCR-Produkt. Das Zyklieren erfolgte unter Verwendung exakt der gleichen Parameter wie für die primäre PCR. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%-igen Agarosegel analysiert. Ein Fragment von ungefähr 200 by wurde von dem Gel exzidiert und unter Verwendung des TOPO TA-Klonkits in den Plasmidvektor pCR2.1-TOPO geklont, wie oben beschrieben. Die Sequenzierung von zwei resultierenden Klonen verlängerte die Ratten-GFRα-4-Sequenz um weitere 128 bp in der 5'-Richtung. Auf der Grundlage dieser Sequenz wurde ein weiterer Primer-Satz (RAT-GFRα4-ap7 und RAT-GFRα4-ap8) gestaltet, um zusätzliche 5'-RACE-Experimente auszuführen. Die RACE-PCR wurde in Rattenhirn-, -herz- und -nieren-Marathon Ready^TM-cDNA ausgeführt. Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das Folgendes enthielt: 1 × GC-cDNA-PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELTä, 200 nM Primer RAT-GFRα4-ap7b und RACE-ap1, 1 μl Advantage-KlenTaq-Polymerase-Mischung und 5 μl Rattenhirn-, -herz- und -nieren-Marathon Ready^TM-cDNA. Die Proben wurden 30 s lang auf 95°C erwärmt, und das Zyklieren erfolgte 30 s lang bei 95°C, 4 min bei 72°C über 5 Zyklen, dann 30 s bei 95°C, 4 min bei 70°C über 5 Zyklen, dann 30 s bei 95°C, 4 min bei 68°C über 25 Zyklen, mit einem abschließenden Schritt von 7 min bei 68°C. Dann wurde eine ineinandergesetzte PCR in 1 μl der primären PCR-Reaktion mit den Primern RAT-GFRα4lap8 und RACE-ap2 ausgeführt. Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das Folgendes enthielt: 1 × GC-cDNA-PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELTä, 200 nM Primer RAT-GFRα4-ap8 und RACE-ap2, 1 μl Advantage-KlenTaq-Polymerase-Mischung und 1 μl primäres PCR-Produkt. Das Zyklieren erfolgte unter Verwendung exakt der gleichen Parameter wie für die primäre PCR. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%-igen Agarosegel analysiert. Verschiedene Fragmente, deren Größe von ungefähr 200 bp bis 1200 bp reichte, waren auf dem Gel sichtbar und wurden exzidiert und unter Verwendung von TOPO-TA-Klonen in den Vektor pCR2.1-TOPO geklont. Die Einschübe von verschiedenen Klonen wurden sequenziert. Von diesen Klonen konnte die Sequenz von Ratten-GFRα-4 in der 5'-Richtung verlängert werden. Zwei verschiedene Sequenzen wurden identifiziert. Eine Sequenz verlängerte die Ratten-GFRα-4-Sequenz um 215 by in der 5'-Richtung und enthielt einen Frame-internen Startcodon, dem ein Frame-interner vorangehender Stoppcodon voranging. Die resultierende vorhergesagte Proteinsequenz (52 zusätzliche Aminosäurereste) enthält ein vorhergesagtes Signalpeptid von 29 Aminosäureresten (gemäß Feststellung durch das SPScan-Programm, das in dem Wisconsin-Paket, Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin, USA, enthalten ist; Score 7,0, Wahrscheinlichkeit 1,171e-02). Die andere Sequenz, die durch diese 5'-RACE-Experimente bestimmt wurde, verlängerte die Ratten-GFRα-4-Sequenz um 552 by in der 5'-Richtung und enthielt auch einen Frameinternen Startcodon, dem ein Frame-interner vorangehender Stoppcodon voranging. Die am nächsten bei 3' liegenden 79 Basispaare dieser neuartigen Sequenz waren mit den bei 3' liegenden 79 Basispaaren der 215 bp-Sequenz identisch, aber der Rest der Sequenz war verschieden. Die resultierende vorhergesagte Proteinsequenz (113 zusätzliche Aminosäurereste) hatte jedoch keine vorhergesagte Signalpeptidsequenz am NH₂-Terminus (SPScan, GCG-Paket). Die verschiedenen partiellen cDNA-Sequenzen, die aus den anschließenden 5'-RACE-Experimenten resultieren, wurden zusammen mit den Sequenzen aus der Incyte-Datenbank verglichen und in verschiedene mögliche Ratten-GFRα-4-Varianten verschmolzen. Um zu identifizieren, welche der identifizierten Varianten echt sind, wurden Primer 5' vom Translationsstartcodon (Primer RAT-GFRα4-sp4 und RAT-GFRα4-sp5 für die "lange" 5'-Variante, die aus dem 552 bp-RACE-Fragment resultiert, und RAT-GFRα4-sp6 für die "kurze" 5'-Variante, die aus dem 215 bp-RACE-Fragment resultiert) und 3' vom Translationsstoppcodon (RAT-GFRα4-ap9 und RAT-GFRα4-ap10) gestaltet. Diese Primer wurden dann verwendet, um die vollen GFRα-4-Codierungssequenzen unter Verwendung von cDNA, die von verschiedenen Geweben der Ratte abgeleitet war, zu verstärken.
Zuerst wurden Sequenzen, die für die "lange" 5'-Variante codieren, durch PCR verstärkt. Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das Folgendes enthielt: 1 × GC-CDNA-PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELTä, 200 nM Primer RAT-GFRα4-sp4 und RAT-GFRα4-ap9, 1 μl Advantage-KlenTaq-Polymerase-Mischung und 5 μl Rattenhirn-, -herz- und -nieren-Marathon Ready^TM-cDNA. Die Proben wurden 1 min lang auf 95°C erwärmt, und das Zyklieren erfolgte 45 s lang bei 95°C, 1 min bei 57°C und 1 min bei 72°C über 35 Zyklen, mit einem abschließenden Schritt von 7 min bei 72°C. Dann wurde in der primären PCR-Reaktion eine ineinandergesetzte PCR mit den Primern RAT-GFRα4-sp5 und RAT-GFRα4-ap10 ausgeführt. Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das Folgendes enthielt: 1 × GC-cDNA-PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELTä, 200 nM Primer RAT-GFRα4-sp5 und RAT-GFRα4-ap10, 1 μl Advantage-KlenTaq-Polymerase-Mischung und 1 μl primäres PCR-Produkt. Das Zyklieren erfolgte unter Verwendung exakt der gleichen Parameter wie für die primäre PCR, außer dass 30 PCR-Zyklen anstelle von 35 ausgeführt wurden. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%-igen Agarosegel analysiert. Verschiedene Fragmente, deren Größe von ungefähr 1000 bis 1250 bp reichte, wurden von dem Gel exzidiert und unter Verwendung von TOPO-TA-Klonen in den Vektor pCR2.1-TOPO geklont. Die Einschübe von verschiedenen Klonen wurden sequenziert. Als nächstes wurden Sequenzen, die für die "kurze" 5'-Variante codieren, durch PCR verstärkt. Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 50 μl, das Folgendes enthielt: 1 × GC-cDNA-PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELTä, 200 nM Primer RAT-GFRα4-sp6 und RAT-GFRα4-ap9, 1 μl Advantage-KlenTaq-Polymerase-Mischung und 5 μl Rattenherz-Marathon Ready^TM-cDNA. Die Proben wurden 5 min lang auf 95°C erwärmt, und das Zyklieren erfolgte 30 s lang bei 94°C, 1 min bei 57°C und 2 min 30 s bei 72°C über 35 Zyklen, mit einem abschließenden Schritt von 7 min bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%-igen Agarosegel analysiert. Verschiedene Fragmente, deren Größe von ungefähr 1500 bis 2200 bp reichte, wurden von dem Gel exzidiert und unter Verwendung von TOPO-TA-Klonen in den Vektor pCR2.1-TOPO geklont. Die Einschübe von verschiedenen Klonen wurden sequenziert. Eine Analyse aller erhaltenen Sequenzen (16 resultierende Klone wurden vollständig sequenziert) gestattete eine Teilung der Ratten-GFRα-4-DNA-Sequenz in 6 Sequenzabschnitte, die allen identifizierten Varianten gemein waren, und je nach Variante mit 5 vorhandenen oder fehlenden Sequenzabschnitten dazwischen. Alle 5 dazwischenliegenden Sequenzen enthalten 5'- und 3'-Spleißstellen-Consensusstellen (GT am 5'-Ende und AG am 3'-Ende der Intron-Sequenz) (Senapathy et al., 1990) (siehe Tabelle 4 unten) und könnten somit möglicherweise ungespleißte Introns darstellen.
Um die Hypothese zu untermauern, dass die identifizierten Varianten aus der Konservierung ungespleißter Introns in bestimmten mRNA-Transkripten resultieren könnten, wurde die Ratten-GFRα-4-Sequenz mit der genomischen Sequenz von menschlichem GFRα-1 verglichen (Angrist et al., 1998). Aus dieser Analyse ging hervor, dass die GFRα-4-Sequenzen, die allen Transkripten gemein sind, mit Exons in GFRα-1 übereinstimmten (siehe Tabelle 4 unten). Die dazwischenliegenden Sequenzen, die in einigen Transkripten fehlen, stimmten mit Intron-Sequenzen in menschlichem GFRα-1 überein. Darum erachteten wir alle dazwischenliegenden Sequenzen als ungespleißte Introns. Das Intron, das sich zwischen Exon 5 und Exon 6 befindet, kann auf zwei verschiedene Arten herausgespleißt werden, und führt zum Vorhandensein zweier verschiedener Spleißvarianten von Ratten-GFRα-4, die wir als Variante A und Variante B bezeichnet haben.
Sequenz 5 zeigt die Consensus-Sequenz für Ratten-GFRα-4 einschließlich der Intron-Sequenzen (Intron 1: bp 125 bis 684; Intron 2: bp 1040 bis 1088; Intron 3: bp 1199 bis 1278; Intron 4: bp 1414 bis 2154; Intron 5A: bp 2247 bis 2385 und Intron 5B: bp 2231 bis 2314). Ein Polymorphismus wurde an Position 2244 in der Sequenz 5 detektiert, wobei T in 50% der sequenzierten Klone und C in den anderen 50% festgestellt wurden. Dieser Polymorphismus führt zu einer Aminosäureänderung in dem Protein (Variante A) von W bis R in der hydrophoben Region, die an der GPI-Verankerung beteiligt ist. 1 zeigt schematisch die Struktur des Ratten-GFRα-4-Gens zusammen mit der abgeleiteten cDNA für Spleißvarianten A und B nach dem Herausspleißen der Intron-Sequenzen und die translatierten Proteinsequenzen der Varianten A und B mit ihren Charakteristika. Tabelle 4 zeigt die DNA-Sequenz an den Intron-Exon-Grenzen zusammen mit den Größen identifizierter Introns und Exons. Die rechte Spalte zeigt die Größen der entsprechenden Exons in der genomischen Sequenz von menschlichem GFRα-1 (aus Angrist et al., 1998). Tabelle 4: Intron-Exon-Struktur von Ratten-GFRα-4
Die Consensus-Sequenz, die durch Entfernen der Introns 1 bis 4 und Intron 5A (Sequenz 6; Variante A) erhalten wurde, führt zu einem Protein von 273 Aminosäureresten mit einer errechneten molekularen Masse von 29,7 kDa und einem isoelektrischen Punkt von 8,92 (Sequenz 8). Die Consensus-Sequenz, die durch Entfernen der Introns 1 bis 4 und Intron 5B (Sequenz 7; Variante B) erhalten wurde, führt zu einem Protein von 258 Aminosäureresten mit einer errechneten molekularen Masse von 28,0 kDa und einem isoelektrischen Punkt von 8,91 (Sequenz 9). 2 zeigt die Anordnung der Varianten A und B von Ratten-GFRα-4. Die Proteinsequenzen sind beide ähnlich den bekannten GFRα-Sequenzen und unterscheiden sich voneinander nur in einem kleinen Aminosäureabschnitt am Carboxy-Terminus. Diese zwei Sequenzen stellen wahrscheinlich biologisch aktive GFRα-4-Varianten dar. Da alle anderen sequenzierten Varianten eine oder mehrere Intron-Sequenzen enthalten, sind sie wahrscheinlich Zwischenprodukte der RNA-Verarbeitung. Es ist nicht klar, warum alle diese Zwischenprodukte in cDNA vorliegen, die von gereinigter mRNA abgeleitet ist, und warum es so schwierig ist, eine cDNA-Sequenz zu verstärken, die vom einem vollständig gespleißten mRNA-Transkript abgeleitet ist. GFRα-1 bis -4 sind durch eine COOH-Terminalsequenz gekennzeichnet, die für ein Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol (GPI)-verankertes Protein typisch ist, das aus einer hydrophoben Region von 17–31 Aminosäureresten besteht, der eine hydrophile Sequenz vorangeht, die einen Abschnitt aus drei kleinen Aminosäuren wie zum Beispiel Asp, Cys, Ala, Ser, Gly oder Asn enthält (Gerber et al., 1992). Die Proteinsequenz der Ratten-GFRα-4-Variante A hat einen hydrophoben Carboxy-Terminus von 21 Aminosäureresten (Position 253 bis 273), dem zwei mögliche GPI-Spaltungsstellen vorangehen (DSS an Position 234 bis 236 oder NAG an Position 250–252). Variante B hat einen kürzeren hydrophilen Carboxy-Terminus, was impliziert, dass keine GPI-Verankerung für diese Variante möglich ist. Das könnte bedeuten, dass Variante B eine lösliche Form des Ratten-GFRα-4-Rezeptors ist. Ein vorhergesagtes Signalpeptid von 29 Aminosäuren liegt in beiden Varianten vor (gemäß Feststellung durch das SPScan-Programm, das in dem GCG-Paket enthalten ist; Score 7,0, Wahrscheinlichkeit 1,171e-02). Außerdem ist eine mögliche Stelle für N-verknüpfte Glycosylierung vorhanden (NVS an Position 192 bis 194 in dem Protein).
Unlängst wurde ein Modell für die Domänenstruktur von GFRαs auf der Grundlage des Vergleichs der Sequenzen von Maus-GFRα-1 bis -3 und Huhn-GFRα-4 vorgeschlagen (Airaksinen et al., 1999). Das Modell enthält drei konservierte Cystein-reiche Domänen, die durch weniger konservierte Adaptorsequenzen zusammengefügt sind. Die Moleküle sind durch einen GPI-Anker an der Membran verankert. GFRα-4 der Ratte entspricht teilweise diesem Modell, da es auch die zweite und dritte Cystein-reiche Region und einen möglichen GPI-Anker enthält (wenigstens für Variante A). Es unterscheidet sich aber signifikant von den anderen GFRαs insofern, als die erste Cysteinreiche Region fehlt. 3 zeigt die Anordnung der Varianten A und B von Ratten-GFRα-4 mit Ratten-GFRα-1 (EMBL-Neuzugangsnummer U59486), Ratten-GFRα-2 (EMBL-Neuzugangsnummer AF003825), Maus-GFRα-3 (EMBL-Neuzugangsnummer AB008833) und Huhn-GFRα-4 (EMBL-Neuzugangsnummer AF045162). Die Anordnung erfolgte unter Verwendung des Anordnungsprogramms ClustalW (EMBL, Heidelberg, Deutschland). Die prozentuale Identität und prozentuale Ähnlichkeit zwischen Mitgliedern der GFRα-Familie wurde durch paarweisen Vergleich der Sequenzen unter Verwendung des GeneDoc-Softwaretools (Version 2.5.000) errechnet, und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 unten dargestellt.
Tabelle 5: % Identität und % Ähnlichkeit (in Klammern) zwischen Mitgliedern der GFRα-Familie. Neuzugangsnummern der Sequenzen, die in der Analyse verwendet wurden, sind im Text genannt.
Bisher wurden vier Mitglieder der GDNF-Familie aus neurotrophen Faktoren identifiziert (GDNF, NTN, PSP, EVN/ARTN). Alle vier signalisieren durch Bindung an einen spezifischen GPI-verknüpften GFRα-Rezeptor (GFRα-1 für GDNF, GFRα-2 für NTN, GFRα-3 für EVN/ARTN und (Huhn-)GFRα-4 für PSP) in Kombination mit einer gemeinsamen Transmembran-Tyrosin-Kinase, cRET. GFRα-4, der Korezeptor für PSP, wurde bis jetzt nur im Huhn identifiziert, und es wurde noch kein Gegenstück von Säugern gefunden.
Die Ähnlichkeit zwischen dem in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen GFRα-4 der Ratte und dem GFRα-4 vom Huhn beträgt 37% (27% Identität), was nahe legt, dass das GFRα-4 der Ratte ein neuartiges Mitglied der GFRα-Familie ist. GFRα-4 könnte der Persephin-Rezeptor aus Säugern sein oder könnte alternativ der Rezeptor für ein unidentifiziertes Mitglied der GDNF-Familie sein.
Spezifische Bindung von Persephin an GFRα-4
Konstrukte für die Expression von löslichem GFRα-IgG-Fc-Fusionsprotein wurden folgendermaßen hergestellt. cDNA-Regionen von menschlichem GFRα-1, GFRα-2 und GFRα-3, Huhn-GFRα-4 und Ratten-GFRα-4 der Variante A (Codierung für Aminosäurereste 27 bis 427, 20 bis 431, 28 bis 371, 20 bis 399 bzw. 29 bis 252), mit Ausnahme der Sequenzen, die für die Signalpeptide und für die hydrophobe COOH-Terminalregion codieren, die an der GPI-Verankerung beteiligt ist, wurden Frameintern in den Expressionsvektor Signal pIg plus (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Großbritannien) geklont. Die Einschübe aller Konstrukte wurden durch vollständige DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Die resultierenden Proteine, die aus diesen Konstrukten exprimiert wurden, enthalten ein CD33-Signalpeptid mit 17 Aminosäureresten und NH₂-Terminal, die jeweilige GFRα-Proteinregion und eine Fusionsdomäne für menschliches IgG₁-FC mit 243 Aminosäureresten und COOH-Terminal. Fusionsproteine wurden wie beschrieben in CHO-Zellen exprimiert und gereinigt. Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) wurden routinemäßig in DMEM/F12-Medium kultiviert, das mit 10% wärmeinaktiviertem Kalbsfötusserum ergänzt war. Zellen wurden unter Verwendung eines optimierten Lipofectamin-Plus-Verfahrens mit GFRα-IgGFc-Fusionskonstrukten transfiziert. Dafür wurde eine Gesamtmenge von 6,5 μg DNA mit 17,5 μl PLUS-Reagens in 750 μl serumfreiem Medium 15 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Lipofectamin wurde 50-fach in serumfreiem Kulturmedium verdünnt. 750 μl dieses Gemischs wurden der DNA-Lösung zugegeben. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden 3,5 ml serumfreies Medium zugegeben, und das Gemisch wurde (in einer 100 mm durchmessenden Petrischale) auf die Zellen aufgebracht. Die Zellen wurden 3 h lang bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert, woraufhin 5 ml Kulturmedium, das 20% wärmeinaktiviertes Kalbfötusserum enthielt, beigegeben wurde. 24 h später wurde das Medium zu regulärem Kulturmedium gewechselt. Die Transfektionseffizienzen bei diesen optimierten Bedingungen lagen in der Regel bei 50–60%. Für permanente Transfektionen enthielt das Auswahlmedium entweder 800 μg G418 oder 800 μg G418 und 800 μg Hygromycin. Antibiotika-resistente Klone wurden erweitert und unter Verwendung spezifischer Antikörper einem Assay zur Expression unterzogen. GFRα-IgGFc-Fusionsproteine wurden aus dem Medium von permanent oder vorübergehend transfizierten CHO-Zellen durch Protein-A-Chromatografie gereinigt. Gebundenes Protein wurde mit 0,1 M Na-citrat, pH 3,0, eluiert und in 1 M Tris-Puffer, pH 8,4 (Verdünnungsverhältnis 1:6), aufgefangen. Die Proteinkonzentration wurde durch Extinktion bei 280 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,5 geschätzt. Oberflächenplasmonresonanz (OPR)-Experimente wurden bei 25°C unter Verwendung eines BIACORE 3000-Instruments (Biacore AB, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Der Sensorchip CM5, das Aminkopplungskit und die Puffer, die verwendet wurden, wurden ebenfalls bei Biacore AB bezogen. Rekombinantes PSP, NTN, EVN/ART und GDNF wurden als immobilisierte Liganden verwendet. Rekombinantes menschliches GDNF wurde bei R&D Systems Europe Ltd. (Abingdon, Großbritannien) bezogen. NH₂-terminal 6His-markiertes rekombinantes menschliches NTN, PSP der Ratte und menschliches EVN/ART wurden in E. coli gebildet, wie zuvor beschrieben (Creedon et al., 1997). Die carboxylierte Matrix eines CM5-Sensorchips wurde zuerst mit einem 1:1-Gemisch aus 400 mM N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid und 100 mM N-Hydroxy-succinimid 10 min lang aktiviert. Rekombinante neurotrophe Faktoren wurden auf die aktivierte Oberfläche in 10 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,5 mit einer Strömungsrate von 5 μl/min aufgebracht. Nicht-reagierte Carboxyl-Gruppen wurden mit 1 M Ethanolamin-HCl blockiert. Für Bindungsexperimente wurden lösliche GFRα-IgGFc-Fusionsproteine unter Verwendung des Kinject-Programms mit 30 μl/min übergossen. Die Konzentrationen des GFRα-IgGFc, das in kinetischen Experimenten verwendet wurde, lagen zwischen 1 und 100 nM in Hepes-gepufferter Salzlösung (150 mM NaCl, 3,5 mM EDTA-Natriumsalz, 0,005 Polysorbat 20, 10 mM Hepes, pH 7,4). Die Assoziation der GFRα-Rezeptoren an die immobilisierten Liganden wurde 3 min lang und die Dissoziation 1 min lang überwacht, gefolgt von einer Regeneration mit 10 mM Glycin-Puffer. Die Dissoziation wurde durch Übergießen mit Hepes-gepufferter Salzlösung initiiert. Um die Qualität von Sensordaten zu verbessern, wurde Doppelreferenzierung verwendet (Myszka, 1999). Die Daten wurden mittels einer Globalanalyse mit der BIACORE-Auswertungssoftware (Version 3.0.1) analysiert. Eine Globalanalyse berechnet die Assoziationsrate (k_a) und die Dissoziationsrate (k_d) gleichzeitig, woraufhin die scheinbare Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K_D) als k_d/k_a berechnet wird. Für die Anpassung der Daten wurde ein einfaches 1:1-Langmuir-Modell verwendet. Eine spezifische Bindung an PSP konnte sowohl bei Rattenals auch bei Huhn-GFRα-4-IgGFc-Fusionsproteinen detektiert werden. Die beobachtete Bindung von GFRα-4-IgGFc war spezifisch, da keine Bindung an GDNF, NTN oder EVN/ART vorlag. Kontrollexperimente bestätigten die Bindung von GFR-1 an GDNF, von GFRα-2 an NTN und von GFRα-3 an EVN/ART. Anhand der Bindungskurven, die mittels dreier Bestimmungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ratten- und Huhn-GFRα-4-IgGFc erhalten wurden, wurden die Bindungskonstanten k_a (Assoziationsrate) und k_d (Dissoziationsrate) abgeleitet (Tabelle 6).
Tabelle 6: Persephin-Bindung an GFRα-4 vom Huhn und GFRα-4 der Ratte
Bindungskonstanten für Huhn-GFRα-4-IgGFc und Ratten-GFRα-4-IgGFc, die sich an immobilisiertes Persephin binden, gemäß Bestimmung durch OPR. Die mittlere Assoziationsrate (k_a), Dissoziationsrate (k_d) und scheinbare Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K_D) ± Standardfehlern wurden von den Bindungskurven abgeleitet, die mittels dreier Bestimmungen mit unterschiedlichen Konzentrationen der jeweiligen löslichen Rezeptoren erhalten wurden.
Obgleich die scheinbaren K_D-Werte für beide Fusionsproteine sehr ähnlich waren, waren die R_Max-Werte signifikant verschieden. Die Bindungsgrade von 1000 relativen Einheiten (RE) wurden routinemäßig mit Huhn-GFRα-4-IgGFc erhalten, wohingegen die Bindungsgrade von Ratten-GFRα-4-IgGFc ungefähr 20-mal geringer waren, etwa 50–60 RE. Das könnte an den Unterschieden in der Konzentration an aktivem Huhn-GFR-4-IgGFc- und Ratten-GFRα-4-IgGFc-Fusionsprotein liegen. Die errechnete Gleichgewichtsdissoziationskonstante K_D von 5,9 ± 2,8 nM (n = 3) legt nahe, dass GFRα-4 der Ratte ein für Persephin spezifischer Rezeptor ist.
Northern-Blot-Analyse
Northern-Blots, die 2 μg poly(A)-reiche RNA enthielten, die von verschiedenen Nagergeweben (Maus-MTN^TM-Blot, Mausembryo-MTN^TM-Blot und Ratten-MTN^TM-Blot; Clontech Laboratories) abgeleitet war, wurden gemäß den Herstelleranweisungen mit einem 948 bp langen, mittels Random Priming markierten (HighPrime-Kit, Roche Diagnostics) α-[³²P]-dCTP-Fragment hybridisiert, das von der Ratten-GFRα-4-Codierungssequenz (wie unter Sequenz-Kennnummer 6) abgeleitet war. Es wurden Stringenz-Wäschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 50°C (die zwei Maus-Blots) oder 55°C (der Ratten-Blot) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. In der Ratte konnte ein sehr schwaches Signal mit etwa 2,3 kb in Herz, Hirn, Leber und Testis detektiert werden. Ein noch schwächeres zweites Transkript war mit etwa 1,4 kb in denselben Geweben vorhanden. In der Maus war ein 1,35 kb-Transkript in Hirn und Testis am intensivsten, wobei ein viel schwächeres Signal mit etwa 2 kb vorhanden war. Eine sehr geringe mRNA-Expression des 1,35 kb-Transkripts war auch in 15 und 17 Tage altem Mausembryo vorhanden. Die Größe des kleineren Transkripts stimmt mit der vorhergesagten Größe der GFRα-4-Codierungssequenz überein (± 880 bp + die untranslatierte 3'-Region von 570 bp).
Chromosomale Positionierung von GFRα-4 von Ratte, Maus und Mensch
Ein Ratten-GFRα-4-cDNA-Fragment mit 0,95 kb (das die komplette Ratten-GFRα-4-Codierungssequenz von Variante A enthielt) und ein 2,3 kb-Fragment, das der genomischen Sequenz des GFRα-4 der Ratte entsprach (siehe Sequenz-Kennnummer 5), wurden als Sonden in der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs (FISH)-Analyse an Rattenchromosomen verwendet. Diese Sonden überlappten sich teilweise. Ein Gemisch der zwei Sonden (1 μg Gesamt-DNA) wurde mit Digoxigenin-11-dUTP (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) durch Nick-Translation (Life Technologies) markiert, was eine abschließende Sonden-Fragment-Größe von 200–400 by ergab. Die markierte Sonde wurde mit Hybridisierungspuffer vermischt (50% Formamid, 2 × SSC, 10% Dextransulfat). Nach der Denaturierung wurde das Gemisch auf Metaphasen-Rattenchromosom-Objektträger (Islam und Levan, 1987, Helou et al., 1998) gelegt, die bei 72°C 2 min lang in 70% Formamid, 2 × SSC, denaturiert worden waren. Nach der Hybridisierung über 48 h bei 37°C wurden Präparate 15 min lang in 50% Formamid, 2 × SSC, gewaschen. Die Detektion von markierten Chromosomen erfolgte durch standardmäßiges FITC-Antidigoxigenin. Die Chromosomausbreitungen wurden mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gegengefärbt. Die Ergebnisse wurden aus Mikrodiagrammen von 100 verschiedenen Zellen abgeleitet. Infolge der geringen Größe der Sonden gab es erhebliches Hintergrundrauschen. Die meisten untersuchten Zellen jedoch wiesen einen Marker an Position RNO3q36 auf (5). Etwa 35% der Metaphasen-Untersuchungen wiesen eine "Doppel-Spot"-Markierung bei beiden Homologen von RNO3 auf, wohingegen etwa 50% Doppel-Spots auf nur einem der Homologe oder eine "Einzel-Spot"-Markierung auf beiden Homologen aufwiesen. Keine andere Chromosomstelle wies eine Markierung in mehreren Zellen auf. Auf der Grundlage einer Vergleichsabbildung würde man erwarten, dass sich die entsprechende Maus-Position bei MMU2 (Band F) befindet, wohingegen eine mögliche menschliche Position für das Gen HSA2, HSA15 oder HSA20 wäre. In Übereinstimmung damit sind die genomischen GFRα-4-Sequenzen von Maus und Mensch, die in der EMBL-Datenbank identifiziert wurden (Neuzugangsnummer AF155960 für Maus und AC017113 für Mensch), von Maus-Chromosom 2 (BAC-Klon 389B9) bzw. von menschlichem Chromosom 2 (EMBL-Neuzugangsnummer AC013324; BAC388 K 24map2) abgeleitet.
Referenzen

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Liste der Abkürzungen

ARTN

Artemin

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

bp

base pairs

cDNA

complementary DNA

CNS

Central Nervous System

EST

Expressed Sequenz Tag

EVN

Enovin

GDNF

Glial cell-line Derived Neurotrophic Factor

GFRα

GDNF Family Receptor α

GPI

Glycosyl Phosphatidyl Inositol

NTN

Neurturin

PCR

Polymerase Chain Reaction

PNS

Peripheral Nervous System

PSP

Persephin

SSP

Smallest Sum Probability

TGF-β

Transforming Growth Factor β

Sequenzauflistung

Claims

Nukleinsäuremolekül in isolierter oder weitgehend reiner Form, codierend für einen Rezeptor α-4 der GDNF-Familie (GFRα-4) aus Säugern, wobei das Nukleinsäuremolekül eine unter einer der SEQ ID Nr. 5, 6 oder 7 dargestellte Sequenz aufweist oder mehr als 90% Sequenzidentität mit diesen Sequenzen teilt.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, codierend für einen Rezeptor α-4 der GDNF-Familie (GFRα-4) aus Säugern, der die unter Sequenz-ID Nr. 8 oder 9 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich um ein DNA-Molekül handelt.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem DNA-Molekül um ein cDNA-Molekül handelt.
Isolierter GFRα-4-Rezeptor, codiert von einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
DNA-Expressionsvektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit dem Vektor nach Anspruch 6.
Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei es sich um eine eukaryontische Zelle handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 7 oder 8, wobei es sich bei der Zelle um eine Säugerzelle handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei es sich um eine menschliche embryonale Nierenzelle HEK293 oder um eine Cos-7-Zelle handelt.
Nichtmenschliche transgene Zelle, nichtmenschliches transgenes Gewebe oder nichtmenschlicher transgener Organismus, umfassend ein zur Expression eines GFRα-4-Rezeptorproteins fähiges Transgen, wobei dieses ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfaßt.
Antisense-Molekül, das zur Verhinderung der Transkription und Produktion von GFRα-4 fähig ist, umfassend eine Nukleinsäure, die zur Hybridisierung an die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 fähig ist.
Molekül nach Anspruch 12 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines Moleküls nach Anspruch 13 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Schmerz- oder Krebsbehandlung.
Isolierter GFRα-4-Rezeptor aus Säugern, der die Aminosäuresequenz, wie sie unter einer der SEQUENZ-ID Nr. 8 oder 9 dargestellt ist, oder die Aminosäuresequenz, die wenigstens 90% Aminosäuresequenzhomologie mit den Sequenzen, wie sie unter SEQ ID Nr. 8 oder 9 dargestellt sind, besitzt, aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, Verdünnungs- oder Hilfsmittel dafür.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12 oder einen Rezeptor nach Anspruch 15 zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, Verdünnungs- oder Hilfsmittel dafür.
Verfahren zur Bestimmung davon, ob es sich bei einer Verbindung um einen Agonisten oder einen Antagonisten in Bezug auf einen Rezeptor GFRα-4 nach einem der Ansprüche 5 oder 15 handelt, wobei man in dem Verfahren eine den Rezeptor exprimierende Zelle mit der zu testenden Verbindung in Kontakt bringt und die Stärke einer eventuellen GFRα-4-vermittelten funktionellen oder biologischen Antwort verfolgt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei es sich bei der Zelle um eine Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 10 handelt.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei die GFRα-4-vermittelte funktionelle oder biologische Antwort das Phosphorylierungsniveau in der Zelle umfaßt.
Verfahren zur Bestimmung davon, ob es sich bei einer Verbindung um einen Agonisten, Antagonisten oder einen Liganden in Bezug auf einen GFRα-4-Rezeptor nach Anspruch 5 oder 15 handelt, wobei man in dem Verfahren eine Membranpräparation aus den GFRα-4 exprimierenden Zellen mit der Verbindung in Gegenwart von cRET oder eines ähnlichen, mit GFRα-4 in dem Signaltransduktionsweg, zu dem GFRα-4 als eine Komponente gehört, wechselwirkenden Proteins in Kontakt bringt und die Stärke einer eventuellen Wechselwirkung von GFRα-4 mit cRET oder dem ähnlichen Protein verfolgt.
Antikörper, spezifisch für das GFRα-4-Rezeptorprotein mit einer Aminosäuresequenz, wie sie unter SEQ ID Nr. 8 oder 9 dargestellt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper nach Anspruch 22 zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, Verdünnungs- oder Hilfsmittel dafür.
Verfahren zur Identifizierung von Liganden für GFRα-4-Rezeptorprotein, wobei man einen Rezeptor nach Anspruch 5 oder 15 mit einem Zellextrakt oder einer zu testenden Verbindung in Kontakt bringt und eventuell an den Rezeptor gebundene Moleküle isoliert.
Verfahren zur Bestimmung davon, ob es sich bei einer Verbindung um einen Liganden für den GFRα-4-Rezeptor handelt, wobei man in dem Verfahren eine den Rezeptor exprimierende Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 10 mit der Verbindung in Kontakt bringt und die Stärke einer eventuellen GFRα-4-vermittelten funktionellen oder biologischen Antwort verfolgt.
Verfahren nach Anspruch 25, bei dem man das Phosphorylierungsniveau in der Zelle verfolgt.
Kit zur Bestimmung davon, ob es sich bei einer Verbindung um einen Agonisten oder einen Antagonisten eines GFRα-4-Rezeptorproteins handelt, wobei der Kit eine Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 10, Mittel zum Inkontaktbringen der Zelle mit der Verbindung sowie Mittel zum Verfolgen der Stärke einer GFRα-4-vermittelten funktionellen oder biologischen Antwort in der Zelle umfaßt.
Kit nach Anspruch 30, wobei die GFRα-4-vermittelte funktionelle oder biologische Antwort das Phosphorylierungsniveau in der Zelle umfaßt.
Diagnostischer Kit, beinhaltend eine Sonde, die ein Mitglied der Gruppe Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder Antisense-Molekül nach Anspruch 12 umfaßt, sowie Mittel zum Inkontaktbringen von zu testendem biologischem Material mit der Sonde.
Kit zur Bestimmung davon, ob es sich bei einer Verbindung um einen Liganden des GFRα-4-Rezeptorproteins handelt, wobei der Kit eine Membranpräparation aus den Rezeptor exprimierenden Zellen nach einem der Ansprüche 7 bis 10, Mittel zum Inkontaktbringen der Präparation mit der Verbindung in Gegenwart von cRET oder eines ähnlichen, an dem Signaltransduktionsweg, zu dem GFRα-4 als eine Komponente gehört, beteiligten Proteins sowie Mittel zum Messen einer eventuellen Wechselwirkung zwischen GFRα-4 und cRET oder dem ähnlichen Protein umfaßt.