DE60036548T2

DE60036548T2 - Neue kalium-kanäle und dafür kodierende gene

Info

Publication number: DE60036548T2
Application number: DE60036548T
Authority: DE
Inventors: Thomas J. Jentsch
Original assignee: Neurosearch AS
Current assignee: NTG Nordic Transport Group AS
Priority date: 1999-06-11
Filing date: 2000-05-29
Publication date: 2008-06-26
Anticipated expiration: 2020-05-30
Also published as: JP4833467B2; EP1194447B1; DE60036548D1; WO2000077035A2; JP2003527082A; ATE374212T1; AU4911000A; WO2000077035A3; EP1194447A2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft neue Kaliumkanäle und Gene, die diese Kanäle kodieren. Genauer gesagt stellt die Erfindung isolierte Polynucleotide bereit, welche die Kaliumkanaluntereinheit KCNQ5 kodieren, Zellen, die mit diesen Polynucleotiden transformiert sind, transgene Tiere, bei denen es sich nicht um Menschen handelt und die genetische Mutationen umfassen, und die Verwendung der transformierten Zellen für das in vitro-Durchmustern chemischer Verbindungen, die Kaliumkanäle beeinflussen, welche die Untereinheit KCNQ5 enthalten.
STAND DER TECHNIK
Kaliumkanäle nehmen an der Regulation von elektrischem Signalisieren in erregbaren Zellen teil und regulieren die Ionenzusammensetzung biologischer Flüssigkeiten. Mutationen in den vier bekannten Genen des KCNQ-Zweiges der K⁺-Kanal-Genfamilie liegen vererbten Herzrhythmusstörungen, die in manchen Fällen mit Taubheit, neonataler Epilepsie und der fortschreitenden Altersschwerhörigkeit (Presbyakusis) in Zusammenhang stehen, zugrunde.
Ionenkanäle spielen bedeutende Rollen bei der Signaltransduktion und bei der Regulation der Ionenzusammensetzung intra- und extrazellulärer Flüssigkeiten. KCNQ1 ist ein typisches Mitglied der Superfamilie spannungsgesteuerter Kaliumkanäle mit 6 Transmembrandomänen und einer Porenregion, die zwischen der fünften und der sechsten Transmembrandomäne liegt. Das minK Protein (auch als KCNE1 oder IsK bekannt) hat einen einzelnen Transmembranbereich und kann allein keine Kaliumkanäle bilden. Als β-Untereinheit verstärkt und modifiziert es jedoch Ströme, die durch KCNQ1 vermittelt werden. Diese heteromeren Kanäle nehmen an der Repolarisation des Aktionspotenzials des Herzens teil. Bestimmte Mutationen in entweder KCNQ1 oder KCNE1 verursachen eine Form des autosomalen dominanten Long QT-Syndroms (LQTS), eine Erkrankung, die durch Repolarisationsanomalien von Aktionspotenzialen des Herzens, die zu Rhythmusstörungen und plötzlichem Tod führen, gekennzeichnet ist. Interessanterweise führen andere Mutationen in einem der beiden Gene zu dem rezessiven Jervell-Lange-Nielsen-(JLN)Syndrom, das LQTS mit angeborener Taubheit verbindet. Um Taubheit zu verursachen, müssen KCNQ1/minK-Ströme unter Spiegel gesenkt werden, die schon ausreichend niedrig sind, um eine Herzrhythmusstörung zu verursachen.
Mutierte und nicht mutierte KCNQ2- und KCNQ3-Kaliumkanäle sind in WO 99/07832 , WO 99/21875 und WO 99/31232 offenbart worden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir haben nun KCNQ5 kloniert und charakterisiert, ein neues Mitglied der KCNQ-Familie von Kaliumkanal-Proteinen. KCNQ5 bildet heteromere Kanäle mit anderen KCNQ-Kanaluntereinheiten, insbesondere KCNQ3 und KCNQ4.
Die vorliegende Erfindung hat bedeutende Auswirkungen auf die Charakterisierung und Ausnutzung dieses interessanten Zweiges der Kaliumkanal-Superfamilie.
Demgemäß stellt die Erfindung in ihrer ersten Ausführungsform ein isoliertes Polynucleotid mit einer Nucleinsäuresequenz bereit, die fähig ist, unter Bedingungen von mindestens mittlerer/hoher Stringenz mit der als SEQ ID NO: 1 vorgelegten Polynucleotidsequenz oder deren komplementärem Strang zu hybridisieren, wobei die Hybridisierung in einer Lösung von 5 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter, sonifizierter Lachssperma-DNA 12 Stunden lang bei ungefähr 45°C stattfindet, gefolgt von zweimaligem, 30 Minuten langem Spülen in 2 × SSC, 0,5% SDS bei einer Temperatur von mindestens 65°C, und die eine Kaliumkanaluntereinheit kodiert.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein rekombinant hergestelltes Polypeptid bereit, das durch das erfindungsgemäße Polynucleotid kodiert wird.
In einer dritten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zelle bereit, die durch die Eingliederung eines heterologen erfindungsgemäßen Polynucleotids genetisch manipuliert ist.
In einer vierten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Durchmustern einer chemischen Verbindung auf ein Hemmen oder Aktivieren oder anderweitiges Modulieren der Aktivität an einem Kaliumkanal bereit, der mindestens eine KCNQ5-Kanaluntereinheit umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine erfindungsgemäße Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, der Wirkung der chemischen Verbindung zu unterwerfen; und das Membranpotenzial, den Strom, den Kaliumfluss oder den sekundären Calciumzufluss der Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, zu überwachen.
In einer fünften Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Polynucleotidsequenz zum Durchmustern genetischer Materialien von Menschen, die an neurologischen Erkrankungen leiden, auf Mutationen im KCNQ5 Gen.
In einer sechsten Ausführungsform stellt die Erfindung ein transgenes Tier bereit, bei dem es sich nicht um einen Menschen handelt, das eine Knockout-Mutation des endogenen KCNQ5 Gens, eine Ersetzung durch ein mutiertes KCNQ5 Gen oder eine zusätzliche Expression eines mutierten KCNQ5 Gens umfasst oder genetisch manipuliert ist, um das KCNQ5 Gen zu überexprimieren oder ein mutiertes KCNQ5 Gen zu überexprimieren.
Andere Aufgaben der Erfindung werden dem Fachmann aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und den Beispielen offensichtlich sein.
AUSFÜHRLICHE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue Kaliumkanäle und Gene, die diese Kanäle kodieren, bereit. Die Erfindung stellt auch Zellen bereit, die mit diesen Genen transformiert sind, transgene Tiere, bei denen es sich nicht um einen Menschen handelt, die genetische Mutationen umfassen, und die Verwendung der transformierten Zellen für das in-vitro- und in-vivo-Durchmustern von Arzneistoffen, die KCNQ5 enthaltende Kaliumkanäle beeinflussen.
Polynucleotide
In ihrer ersten Ausführungsform betrifft die Erfindung Polynucleotide, die fähig sind, unter Bedingungen von mindestens mittlerer/hoher Stringenz mit der als SEQ ID NO: 1 vorgelegten Polynucleotidsequenz oder deren komplementärem Strang zu hybridisieren, wobei die Hybridisierung in einer Lösung von 5 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter, sonifizierter Lachssperma-DNA 12 Stunden lang bei ungefähr 45°C stattfindet, gefolgt von zweimaligem, 30 Minuten langem Spülen in 2 × SSC, 0,5% SDS bei einer Temperatur von mindestens 65°C; und die eine Kaliumkanaluntereinheit kodieren.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide schließen DNA-, cDNA- und RNA-Sequenzen sowie Antisense-Sequenzen ein und schließen natürlich vorkommende, synthetische und absichtlich manipulierte Polynucleotide eine. Die erfindungsgemäßen Polynucleotide schließen auch Sequenzen ein, die als Ergebnis des genetischen Codes degeneriert sind.
Wie hierin definiert bezeichnet der Begriff „Polynucleotid" eine polymere Form von Nucleotiden mit einer Länge von mindestens 10 Basen, vorzugsweise einer Länge von mindestens 15 Basen. Mit „isoliertem Polynucleotid" ist ein Polynucleotid gemeint, das nicht unmittelbar mit den beiden kodierenden Sequenzen (eine am 5'-Ende und eine am 3'-Ende) zusammenhängt, mit denen es im natürlich vorkommenden Genom des Organismus, von dem es abgeleitet ist, unmittelbar zusammenhängt. Der Begriff schließt deshalb rekombinante DNA ein, die in einen Expressionsvektor, in ein autonom replizierendes Plasmid oder Virus oder in die genomische DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten eingegliedert ist, oder die als getrenntes Molekül, z. B. als cDNA, unabhängig von anderen Sequenzen existiert.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide schließen auch allelische Varianten und „mutierte Polynucleotide" mit einer Nucleotidsequenz ein, die sich von der als SEQ ID NO: 1 vorgelegten Sequenz an einer oder mehreren Nucleotidpositionen unterscheidet. Bei dem mutierten Polynucleotid kann es sich insbesondere um ein erfindungsgemäßes Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 1 handeln, wobei sich die Sequenz jedoch von SEQ ID NO: 1 unterscheidet, um die Expression eines varianten Polypeptids zu bewirken. Bei dem mutierten Polynucleotid kann es sich um ein erfindungsgemäßes Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz handeln, die einen Kaliumkanal mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die an einer oder mehreren Positionen verändert worden ist. Bei dem mutierten Polynucleotid kann es sich insbesondere um ein erfindungsgemäßes Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz handeln, die einen Kaliumkanal mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die an einer oder mehreren Positionen verändert worden ist, die in den wie durch Tabelle 1 definierten konservierten Regionen liegen.
Hybridisierungsprotokoll
Bei den erfindungsgemäßen Polynucleotiden handelt es sich um derartige Polynucleotide, die eine Nucleinsäuresequenz aufweisen, die fähig ist, mit der als SEQ ID NO: 1 vorgelegten Polynucleotidsequenz oder deren komplementärem Strang unter Bedingungen mindestens mittlerer/hoher oder hoher Stringenz, wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, zu hybridisieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisiert das Polynucleotid unter Bedingungen mindestens mittlerer/hoher oder hoher Stringenz, wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, an DNA, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid, vorzugsweise das Polypeptid mit der als SEQ ID NO: 2 vorgelegten Aminosäuresequenz, kodiert.
Geeignete experimentelle Bedingungen zum Bestimmen einer Hybridisierung von einer Nucleotidsonde mit einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz beziehen ein 10 Minuten langes Voreinweichen des Filters, der die zu hybridisierenden DNA-Fragmente oder zu hybridisierende RNA enthält, in 5 × SSC [Natriumchlorid/Natriumcitrat; vgl. Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989] und eine Vorhybridisierung des Filters in einer Lösung von 5 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung [vgl. Sambrook et al., op. cit.] 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter, sonifizierter Lachssperma-DNA [vgl. Sambrook et al., op. cit.], gefolgt von einer 12 Stunden langen Hybridisierung bei ungefähr 45°C in der gleichen Lösung, die eine Konzentration von 10 ng/ml einer mit ³²P-dCTP markierten (spezifische Aktivität > 1 × 10⁹ cpm/μg) Random-Primed-Sonde [Feinberg A P & Vogelstein B; Anal. Biochem. 1983, 132, 6–13] enthält, ein.
Der Filter wird dann zweimal 30 Minuten lang in 2 × SSC, 0,5% SDS bei einer Temperatur von mindestens 65°C (Bedingungen mittlerer/hoher Stringenz), stärker bevorzugt von mindestens 70°C (Bedingungen hoher Stringenz) und noch stärker bevorzugt von mindestens 75°C (Bedingungen sehr hoher Stringenz) gespült.
Moleküle, an welche die Oligonucleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, können unter Verwendung eines Röntgenfilms nachgewiesen werden.
DNA-Sequenzhomologie
In einer bevorzugten Ausführungsform zeigen die erfindungsgemäßen Polynucleotide einen Homologiegrad von mindestens 90%, starker bevorzugt mindestens 95%, mit der als SEQ ID NO: 1 vorgelegten Polynucleotidsequenz.
Wie hierin definiert kann die DNA-Sequenzhomologie als Identitätsgrad zwischen zwei DNA-Sequenzen bestimmt werden, der eine Ableitung der ersten Sequenz aus der zweiten anzeigt. Die Homologie kann auf geeignete Weise mittels Computerprogrammen bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel GAP, das in dem Programmpaket GCG bereitgestellt wird [Needleman S B und Wunsch C D, Journal of Molecular Biologe 1970, 48, 443–453], wobei hierin vorgeschlagene Voreinstellungsparameter verwendet werden.
Klonierte Polynucleotide
Bei dem erfindungsgemäßen isolierten Polynucleotid kann es sich insbesondere um ein kloniertes Polynucleotid handeln.
Wie hierin definiert bezeichnet der Begriff kloniertes Polynucleotid" ein Polynucleotid oder eine DNA-Sequenz, das bzw. die in Übereinstimmung mit derzeit in der
Gentechnik verwendeten Standard-Klonierungsverfahren zum Umlagern eines DNA- Segments kloniert ist, bei dem es sich insbesondere um eine cDNA, d. h. enzymatisch aus RNA abgeleitet, handeln kann, von seinem natürlichen Ort zu einer anderen Stelle, wo es reproduziert werden wird.
Das Klonieren kann durch Ausschneiden und Isolieren des gewünschten DNA- Segments, Einfügen des DNA-Stückes in das Vektormolekül und Eingliederung des rekombinanten Vektors in eine Zelle, wo mehrere Kopien oder Klone des DNA-Segments repliziert werden, durch reverse Transkription von mRNA (Reverse Transkriptase-Technik) und durch Verwendung von sequenzspezifischen Oligonucleotiden und DNA-Polymerase in einer Polymerasekettenreaktion (PCR-Technik) erreicht werden.
Das klonierte erfindungsgemäße Polynucleotid kann alternativ dazu als „DNA-Konstrukt" oder „isolierte DNA-Sequenz" bezeichnet werden und kann insbesondere eine komplementäre DNA (cDNA) sein.
Es ist gut etabliert, dass Kaliumkanäle als heteromere Kanäle gebildet werden können, die aus unterschiedlichen Untereinheiten zusammengesetzt sind. Es ist auch etabliert worden, dass die erfindungsgemäßen Kaliumkanäle Heteromere mit anderen KCNQs, insbesondere KCNQ3 und KCNQ4 bilden können, wenn sie mit diesen Untereinheiten koexprimiert werden. Zusätzlich können Kaliumkanäle mit nicht homologen Untereinheiten (β-Untereinheiten) assoziieren, z. B. der Untereinheit KCNE1 (auch als minK oder IsK bekannt), KCNE2 (auch als minK-verwandtes Peptid (MiRP1) bekannt), KCNE3 (auch als MiRP2 bekannt), KCNE4 (auch als MiRP3 bekannt) und/oder KCNE5 (auch als KCNE1L bekannt), die sich mit diesen Kanälen zusammen aufbauen und diese funktionell modulieren oder zu einer spezifischen Lokalisierung innerhalb der Zelle führen.
Deshalb wird das erfindungsgemäße Polynucleotid in einer bevorzugten Ausführungsform kloniert und entweder allein exprimiert oder mit Polynucleotiden koexpri miert, die andere Untereinheiten kodieren, insbesondere einem Polynucleotid, das eine Kanaluntereinheit KCNQ3 kodiert, oder einem Polynucleotid, das eine Kanaluntereinheit KCNQ4 kodiert.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können isolierte und gereinigte Antisense-Oligonucleotide für KCNQ5 hergestellt werden und ein Verfahren zum Vermindern des Expressionsspiegels von KCNQ5 durch eine Zelle kann benutzt werden, welches das Verabreichen von einem oder mehreren Antisense-Oligonucleotiden für KCNQ5 umfasst. Mit Antisense-Oligonucleotiden für KCNQ5 wird auf Oligonucleotide Bezug genommen, die eine Nucleotidsequenz aufweisen, die durch Basenpaarung mit einer spezifischen komplementären Nucleinsäuresequenz in Wechselwirkung tritt, die an der Expression von KCNQ5 beteiligt ist, so dass die Expression von KCNQ5 verringert wird. Vorzugsweise handelt es sich bei der Nucleinsäuresequenz, die an der Expression von KCNQ5 beteiligt ist, um ein genomisches DNA-Molekül oder mRNA-Molekül, das KCNQ5 kodiert. Dieses genomische DNA-Molekül kann regulatorische Regionen des Gens KCNQ5, die Prä- oder Pro-Anteile des Gens KCNQ5 oder die kodierende Sequenz für reifes KCNQ5-Protein umfassen.
Der Begriff "komplementär zu einer Nucleotidsequenz" im Zusammenhang von Antisense-Oligonucleotiden für KCNQ5 und Verfahren bedeutet deshalb ausreichend komplementär zu einer derartigen Sequenz, um Hybridisierung an diese Sequenz in einer Zelle, d. h. unter physiologischen Bedingungen, zu ermöglichen. Die Antisense-Oligonucleotide für KCNQ5 umfassen vorzugsweise eine Sequenz, die von etwa 8 bis etwa 100 Nucleotide umfasst, stärker bevorzugt von etwa 15 bis etwa 30 Nucleotide.
Die Antisense-Oligonucleotide für KCNQ5 können auch Derivate einschließen, die eine Vielfalt von Modifikationen umfassen, die Resistenz gegen nucleolytischen Abbau verleihen, wie zum Beispiel modifizierte Internucleosidbindungen, modifizierte Nucleinsäurebasen und/oder Zucker und dergleichen. Beispiele für derartige Derivate schließen Gerüstmodifikationen wie zum Beispiel Phosphotriester, Phosphorothioat, Methylphosphat, Phosphoramidat, Phosphorodithioat und Formacetal sowie Morpholino-, Peptid-Nucleinsäure-Analoga und sich wiederholende Dithioat-Einheiten ein.
Die Nützlichkeit von Antisense-Molekülen ist z. B. durch Toulme & Helene, Gene 1988, 72, 51–58; Inouye, Gene 1988, 72, 25–34; Uhlmann & Peyman, Chemical Reviews 1990, 90, 543–584; Robertson, Nature Biotechnologe 1997, 15, 209 und Gibbons & Dzau, Science 1996, 272, 689–693 beschrieben worden.
Biologische Quellen
Das isolierte erfindungsgemäße Polynucleotid kann aus jeder geeigneten menschlichen oder tierischen Quelle erhalten werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polynucleotid aus einer cDNA-Bank, z. B. der Retina, von Skelettmuskel oder Gehirn, insbesondere der Hirnrinde, des Okzipitalpols, der Frontal- und Temporallappen, des Putamen und des Hippocampus, und im piriformen Kortex, entorhinalen Kortex, der pontinen Medulla und dem Fazialiskern, und im Cerebellum, kloniert oder auf deren Grundlage hergestellt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polynucleotid aus einer cDNA-Bank des Thalamus kloniert oder auf deren Grundlage hergestellt. Kommerzielle cDNA-Banken sind z. B. von Stratagene und Clontech erhältlich.
Das erfindungsgemäße Gen KCNQ5 ist auf dem langen Arm von Chromosom 6 (6q14) lokalisiert worden.
Das isolierte erfindungsgemäße Polynucleotid kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, z. B. diejenigen, die in den nachstehenden Arbeitsbeispielen beschrieben sind, erhalten werden.
Bevorzugte Polynucleotide
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Polynucleotid die als SEQ ID NO: 1 vorgelegte Polynucleotidsequenz auf.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Polynucleotid um eine Sequenz, die zu KCNQ5-Kanaluntereinheiten führt, die eine oder mehrere Substitutionen umfassen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Polynucleotid um eine Sequenz, die zu KCNQ5-Kanaluntereinheiten führt, die eine oder mehrere Substitutionen in den konservierten Regionen umfassen, wie nachstehend ausführlicher definiert wird.
Es ist demonstriert worden, dass KCNQ Kanäle oft alternatives Spleißen zeigen und deshalb als Isoformen auftreten können, die vom gleichen Gen abstammen. Derartige Isoformen, sowie die unterschiedlichen cDNA-Sequenzen, aus denen sie entstanden, werden auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
Schließlich ist festgestellt worden, dass sich die Gene, die KCNQ Kanaluntereinheiten in anderen Arten kodieren, ein wenig von den menschlichen Genen unterscheiden. Gene anderer Arten, z. B. Maus, Ratte, Affe, Kaninchen usw., werden jedoch auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
Rekombinant hergestellte Polypeptide
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung neue KCNQ5-Proteine. Genauer gesagt betrifft die Erfindung im Wesentlichen reine funktionelle Polypeptide, welche die elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften eines KCNQ5-Kanals oder von KCNQ5-Kanaluntereinheiten aufweisen. Die neuen erfindungsgemäßen Polypeptide können unter Verwendung von rekombinanter Standard-DNA-Technik durch die erfindungsgemäßen Polynucleotide erhalten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei einem erfindungsgemäßen Polypeptid um den Kaliumkanal KCNQ5 mit der als SEQ ID NO: 2 vorgelegten Aminosäuresequenz.
Modifikationen dieser primären Aminosäuresequenz können zu Proteinen führen, die im Vergleich zu dem nicht modifizierten Polypeptid-Gegenstück eine im Wesentlichen äquivalente Aktivität aufweisen und somit als dem Ausgangsprotein funktionell analog angesehen werden können. Derartige Modifikationen können absichtlich sein, z. B. wie durch ortsspezifische Mutagenese, oder sie können spontan auftreten und Spleißvarianten, Isoformen, Homologe von anderen Arten und Polymorphismen einschließen. Derartige funktionelle Analoga werden auch gemäß der Erfindung in Betracht gezogen.
Darüberhinaus können Modifikationen dieser primären Aminosäuresequenz zu Proteinen führen, welche die biologische Aktivität des Ausgangsproteins nicht aufrechterhalten, einschließlich dominant negativer Formen usw. Ein dominant negatives Protein kann das Wildtyp-Protein stören, indem es an regulierende Mittel, wie zum Beispiel stromaufwärts oder stromabwärts liegende Komponenten, die normalerweise funktionell mit dem Polypeptid in Wechselwirkung treten, bindet oder sie auf andere Weise absondert.
Im Zusammenhang dieser Erfindung bedeutet der Begriff "variantes Polypeptid" ein Polypeptid (oder Protein) mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der als SEQ ID NO: 2 vorgelegten Sequenz an einer oder mehreren Aminosäurepositionen unterscheidet. Derartige variante Polypeptide schließen die vorstehend beschriebenen modifizierten Polypeptide sowie konservative Substitutionen, Spleißvarianten, Isoformen, Homologe aus anderen Arten und Polymorphismen ein.
Wie hierin definiert bezeichnet der Begriff "konservative Substitutionen" das Ersetzen eines Aminosäurerestes durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest. Beispiele für konservative Substitutionen schließen die Substitution eines hydrophoben Restes, wie zum Beispiel Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, für einen anderen oder die Substitution eines polaren Restes für einen anderen, wie zum Beispiel die Substitution von Arginin für Lysin, Glutamin- für Asparaginsäure oder Glutamin für Asparagin und dergleichen ein. Der Begriff konservative Substitution schließt auch die Verwendung eines substituierten Aminosäurerestes anstelle eines nicht substituierten Ausgangs-Aminosäurerestes ein, vorausgesetzt, dass Antikörper, die gegen das substituierte Polypeptid erzeugt werden, auch mit dem nicht substituierten Polypeptid immunreagieren.
KCNQ1-Nummerierungssystem
Im Zusammenhang dieser Erfindung werden Aminosäurereste (sowie Nucleinsäurebasen) unter Verwendung des etablierten Ein-Buchstaben-Symbols angegeben.
Durch Abgleichen der Aminosäuresequenzen eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit denjenigen der bekannten Polypeptide kann ein spezifisches Nummerie rungssystem für Aminosäuren verwendet werden, wobei es durch das System möglich ist, jedem Aminosäurerest in jedem KCNQ-Kanalprotein, dessen Aminosäuresequenz bekannt ist, eine Positionszahl für eine Aminosäure eindeutig zuzuweisen.
Ein derartiges Alignment wird in der nachstehenden Tabelle 1 vorgelegt. Unter Verwendung des Computer-Alignmentprogrammes ClustalX [Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, Jeanmougin F & Higgins D G: TheClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools; Nucleic Acids Res. 1997, 25(24), 4876–82] und der hierin vorgeschlagenen Ausgangsparameter werden die Aminosäuresequenz eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung (hKCNQ5) und die Aminosäuresequenzen der bekannten Polypeptide hKCNQ2–4 mit und relativ zu den Aminosäuresequenzen des bekannten Polypeptids hKCNQ1 (auch als KvLQT1 bekannt) abgeglichen. Im Zusammenhang dieser Erfindung wird dieses Nummerierungssystem als KCNQ1-Nummerierungssystem bezeichnet.
Beim Beschreiben der verschiedenen Enzymvarianten, die erfindungsgemäß hergestellt oder in Betracht gezogen werden, sind die folgenden Nomenklaturen zum einfacheren Bezug angepasst worden:
Ursprüngliche Aminosäure/Position/Substituierte Aminosäure
Gemäß dieser Nomenklatur wird die Substitution von Serin für Glycin an Position 329 von Tabelle 1 als „G329S" bezeichnet. Tabelle 1 Alignment mehrerer Sequenzen mit CLUSTAL X KCNQ1-Nummerierung

hKCNQ1:: Menschliches KCNQ1 [Wang, Q et al.; Nature Genet. 1996, 12, 17–23]
hKCNQ2:: Menschliches KCNQ2 [Biervert et al.; Science 1998, 279, 403–406]
hKCNQ3:: Menschliches KCNQ3 [Schroeder et al.; Nature 1998, 396, 687–690]
hKCNQ4:: Menschliches KCNQ4 [Kubisch et al.; Cell 1999, 96(3), 437–46]
hKCNQ5:: Menschliches KCNQ5; ein erfindungsgemäßes Protein
–: Keine Aminosäure an dieser Position.
*: Zeigt Positionen an, die einen einzelnen, vollständig konservierten Rest aufweisen (konservierte Regionen).

Bevorzugte Varianten sind die Spleißvarianten an den Positionen 432–476 (KCNQ1-Nummerierung), welche die folgenden Aminosäurereste aufweisen:
Eine andere bevorzugte Variante ist G329S (KCNQ1-Nummerierung) oder KCNQ5/G278S ("KCNQ5-Nummerierung").
Biologische Aktivität
Ionenkanäle sind ausgezeichnete Ziele für Arzneistoffe. Das erfindungsgemäße Polynucleotid kodiert einen Kaliumkanal, der KCNQ5 genannt worden ist.
KCNQ5 oder heteromere Kanäle, welche die Untereinheit KCNQ5 enthalten, können ein besonders interessantes Ziel für die Behandlung von Krankheiten oder nachteiligen Zuständen des ZNS sein, die affektive Störungen, die Alzheimer-Krankheit, Angst, Ataxie, durch ein Trauma verursachte ZNS-Schädigung, Schlaganfall oder neurodegenerative Krankheit, kognitive Defizite, zwanghaftes Verhalten, Demenz, Depression, die Huntington-Krankheit, Lerndefizite, Manie, Gedächtnisschwäche, Gedächtnisstörungen, Gedächtnisfehlfunktion, Bewegungsstörungen, motorische Störungen, Motoneuronerkrankungen, Myokymie, neurodegenerative Erkrankungen, die Parkinson-Krankheit und Parkinson-ähnliche motorische Störungen, Phobien, die Pick-Krankheit, Psychose, Schizophrenie, Anfälle einschl. epileptischer Anfälle, Schädigung des Rückenmarks, Schlaganfall, Tremor, Anfälle, Konvulsionen und Epilepsie einschließen.
Die neuen erfindungsgemäßen Polynucleotide können selbst als therapeutisches oder diagnostisches Mittel verwendet werden. Für eine Gentherapie kann der Fachmann Sense- oder Antisense-Nucleinsäuremoleküle als therapeutische Mittel für Indikationen verwenden, die mit KCNQ zusammenhängen.
Durch KCNQ-Untereinheiten gebildete Heteromere
Die bisher beschriebenen KCNQ-Kanäle funktionieren physiologisch als Heteromere. KCNQ1 assoziiert mit KCNE1 (auch als minK oder IsK bekannt); KCNQ2 und KCNQ3 bilden heteromere Kanäle, die dem M-Strom zugrundeliegen, einer wichtigen Determinante neuronaler Erregbarkeit, die durch einige Neurotransmitter reguliert wird, und von KCNQ4 nimmt man an, dass es sich mit KCNQ3 verbindet, um den I_M-ähnlichen Strom in den äußeren Haarzellen zu vermitteln.
Wie andere KCNQ-Kanaluntereinheiten kann KCNQ5 mit anderen Untereinheiten in Wechselwirkung treten, z. B. KCNE1 oder anderen KCNQ-Kanaluntereinheiten, und insbesondere mit KCNQ3 und mit KCNQ4. Ströme von homomerem KCNQ3 sind sehr klein und können oft nicht von Hintergrundströmen in einer Xenopus Oocyte unterschieden werden. Koexpression von KCNQ3 mit KCNQ5 erhöhte die Stromamplituden deutlich. Koexpression von KCNQ4 mit KCNQ5 senkte die Stromamplituden deutlich.
Antikörper
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können verwendet werden, um Antiköper herzustellen, die mit Epitopen dieser Polypeptide immunreagieren oder an sie binden. Polyklonale Antikörper, die im Wesentlichen aus vereinigten monoklonalen Antikörpern mit unterschiedlichen Spezifitäten bestehen, sowie getrennte monoklonale Antikörperpräparate können bereitgestellt werden. Polyklonale Antikörper, die aus vereinigten monoklonalen Antikörpern mit unterschiedlichen Spezifitäten hergestellt sind, sowie getrennte monoklonale Antikörperpräparate können bereitgestellt werden.
Die Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Polyklonale Antikörper können insbesondere wie z. B. durch Green et al.: „Production of Polyclonal Antisera" in Immunochemical Protocols (Manson, Hrsg.); Humane Press, 1992, Seiten 1–5; Coligan et al.: "Production of Polyclonal Antisera in rabbits, rats, Mice and Hamsters" in Current Protocols in Immunology, 1992, Abschnitt 2.4.1, und Ed Harlow und David Lane (Hrsg.) in „Antibodies; A laboratory manual", Cold Spring Harbor Lab. Press 1988, erhalten werden, wobei diese Protokolle hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Monoklonale Antikörper können insbesondere wie z. B. durch Kohler & Milstein, Nature 1975, 256, 495, Coligan et al. in Current Protocols in Immunology, 1992, Abschnitte 2.5.1–2.6.7; Harlow et al. in Antibodies; A laboratory manual; Cold Spring Harbor Pub. 1988, Seite 726, erhalten werden, wobei diese Protokolle hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Kurz gesagt, monoklonale Antikörper können erhalten werden, indem man z. B. Mäusen eine Zusammensetzung, die ein Antigen umfasst, injiziert, die Anwesenheit der Antikörperproduktion durch Entnehmen einer Serumprobe verifiziert, die Milz entnimmt, um B-Lymphozyten zu erhalten, die B-Lymphozyten mit Myelomzellen fusioniert, um Hybridome herzustellen, die Hybridome klont, positive Klone auswählt, welche die Antikörper gegen das Antigen produzieren, und die Antikörper aus den Hybridomkulturen isoliert.
Monoklonale Antikörper können aus Hybridomkulturen durch eine Vielfalt gut etablierter Techniken, einschließlich Affinitätschromatographie mit Protein A-Sepharose, Größenausschlusschromatographie und Ionenaustauschchromatographie, siehe z. B. Coligan et al. in Current Protocols in Immunology, 1992, Abschnitte 2.7.1–2.7.12 und Abschnitte 2.9.1–2.9.3, und Barnes et al.: „Purification of Immunoglobulin G (IgG)" in Methods in Molecular Biologe; Humane Press, 1992, Bd. 10, Seiten 79–104, isoliert und gereinigt werden.
Die polyklonalen oder monoklonalen Antikörper können gegebenenfalls weiter gereinigt werden, z. B. durch Bindung an eine und Elution von einer Matrix, an die das Polypeptid, gegen das die Antikörper erzeugt wurden, gebunden ist.
Antikörper, die das erfindungsgemäße Polypeptid binden, können unter Verwendung eines intakten Polypeptids oder von Fragmenten, die kleine Peptide von Interesse enthalten, als immunisierendes Antigen hergestellt werden. Das zum Immunisieren eines Tiers verwendete Polypeptid kann durch rekombinante DNA-Techniken oder durch chemische Synthese erhalten werden und kann gegebenenfalls an ein Trägerprotein konjugiert sein. Gewöhnlich verwendete Trägerproteine, die chemisch an das Peptid gekoppelt sind, schließen das Hämocyanin der Schlüssellochschnecke(KLH), Thyroglobulin, Rinderserumalbumin(BSA) und Tetanustoxoid ein. Das gekoppelte Peptid kann dann verwendet werden, um das Tier zu immunisieren, bei dem es sich insbesondere um eine Maus, eine Ratte, einen Hamster oder ein Kaninchen handeln kann.
Genetisch manipulierte Zellen
In einer dritten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zelle bereit, die durch die Eingliederung des heterologen erfindungsgemäßen Polynucleotids genetisch manipuliert ist. Die erfindungsgemäße Zelle kann insbesondere genetisch manipuliert sein, um eine KCNQ5-Kanaluntereinheit, wie vorstehend definiert, transient oder stabil zu exprimieren, zu überexprimieren oder zu koexprimieren. Verfahren zum transienten und stabilen Transfer sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Das erfindungsgemäße Polynucleotid kann in einen Expressionsvektor, z. B. ein Plasmid, ein Virus oder ein anderes Expressionsvehikel eingefügt sein und funktionell mit Expressionskontrollsequenzen durch Ligation auf eine Weise verbunden sein, dass eine Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Expressionskontrollsequenzen kompatibel sind. Geeignete Expressionskontrollsequenzen schließen Promotoren, Enhancer, Transkriptionsterminatoren, Startcodons, Spleißsignale für Introns und Stoppcodons ein, die alle im korrekten Leserahmen des erfindungsgemäßen Polynucleotids erhalten werden, um eine richtige Translation von mRNA zu gestatten. Expressionskontrollsequenzen können auch zusätzliche Komponenten wie zum Beispiel Leadersequenzen und Fusionspartnersequenzen einschließen.
Bei dem Promotor kann es sich insbesondere um einen konstitutiven oder einen induzierbaren Promotor handeln. Wenn man in bakteriellen Systemen kloniert, kann man induzierbare Promotoren, wie zum Beispiel pL des Bakteriophagen λ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-Hybridpromotor), verwenden. Wenn man in Säugersystemen kloniert, kann man vom Säugerzellgenom abgeleitete Promotoren, z. B. den TK-Promotor oder den Metallo thioneinpromotor oder von Säugerviren abgeleitete Promotoren, z. B. die lange terminale Wiederholung eines Retrovirus, den späten Promotor von Adenovirus oder den 7.5K-Promotor des Vaccinia-Virus verwenden. Promotoren, die durch rekombinante DNA- oder synthetische Techniken erhalten werden, können auch verwendet werden, um für die Transkription des erfindungsgemäßen Polynucleotids zu sorgen.
Geeignete Expressionsvektoren umfassen typischerweise einen Expressions ursprung, einen Promotor sowie spezifische Gene, die eine phänotypische Selektion der transformierten Zellen ermöglichen, und schließen Vektoren wie den auf T7 beruhenden Expressionsvektor zur Expression in Bakterien [Rosenberg et al.; Gene 1987, 56, 125], den Expressionsvektor pMSXND zur Expression in Säugerzellen [Lee und Nathans, J. Biol Chem. 1988, 263, 3521], von Baculovirus abgeleitete Vektoren zur Expression in Insektenzellen und den Oocyten-Expressionsvektor PTLN [Lorenz C, Pusch M & Jentsch T J: Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 13362–13366] ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Zelle um eine eukaryotische Zelle, insbesondere eine Säugerzelle, eine Oocyte oder eine Hefezelle. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Zelle um eine menschliche embryonale Nierenzelle (HEK-Zelle), eine HEK 293-Zelle, eine BHK21-Zelle, eine Eierstockzelle des chinesischen Hamsters (CHO-Zelle), eine Oocytenzelle aus Xenopus laevis (XLO-Zelle), eine COS-Zelle oder jede andere Zelllinie, die fähig ist, KCNQ Kaliumkanäle zu exprimieren.
Wenn es sich bei der erfindungsgemäßen Zelle um eine eukaryotische Zelle han delt, kann die Eingliederung des heterologen erfindungsgemäßen Polynucleotids insbesondere durch Infektion (indem man einen Virusvektor verwendet), durch Transfektion (indem man einen Plasmidvektor verwendet) oder durch Calciumphosphat-Präzipitation, Mikroinjektion, Elektroporation, Lipofektion oder andere auf dem Fachgebiet bekannte physikalisch-chemische Verfahren ausgeführt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Zeile genetisch manipuliert, um die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ2, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ3, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ4, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1 und KCNQ2, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1 und KCNQ3, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ2 und KCNQ3, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1 und KCNQ4, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ2 und KCNQ4, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ3 und KCNQ4, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1 und KCNQ2 und KCNQ3, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1 und KCNQ2 und KCNQ4, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1 und KCNQ3 und KCNQ4 oder die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ2 und KCNQ3 und KCNQ4 zu koexprimieren.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Membranpräparate bereitgestellt. Die erfindungsgemäßen Membranpräparate können typischerweise für Durchmusterungszwecke verwendet werden und können durch Standardtechniken erhalten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden gefrorene, ganze, erfindungsgemäße Zellen homogenisiert, während sie sich in einer Suspension in kaltem Wasser befinden, und ein Membranpellet wird nach Zentrifugation gewonnen. Das Pellet kann dann in kaltem Wasser gespült und dialysiert werden, um endogene Liganden zu entfernen, die um eine Bindung in den Assays kompetieren könnten. Die dialysierten Membranen können als solche oder nach Lagerung in lyophilisierter Form verwendet werden.
Durchmustern von Arzneistoffen
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zum Durchmustern auf KCNQ5-aktive Verbindungen bereit, d. h. chemische Verbindungen, die fähig sind, an Kaliumkanäle, die eine oder mehrere KCNQ5-Untereinheiten enthalten, zu binden und daran Aktivität zu zeigen. Bei der Aktivität, die bestimmt wird, kann es sich um eine hemmende Aktivität, stimulierende Aktivität oder andere modulatorische Aktivität handeln. Insbesondere kann die KCNQ5-aktive Verbindung eine second-Messenger-Reaktion induzieren, die eine Änderung der molekularen Kennzeichen der Zelle verursacht, z. B. den Ionenfluss, die Enzymaktivierung, Änderungen des Spiegels von intrazellulärem Ca²⁺ oder H⁺, Änderungen cyclischer Nucleotide wie zum Beispiel cAMP, cADP, cGMP und cGDP usw.
Deshalb stellt die Erfindung, in einer anderen Ausführungsform, ein Verfahren zum Identifizieren funktioneller Liganden für einen menschlichen Kaliumkanal bereit, der eine KCNQ5-Untereinheit enthält, wobei das Verfahren umfasst, die Zellen mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Polypeptiden zu transfizieren, die eine erfindungsgemäße KCNQ5-Untereinheit kodieren, und die Wirkung auf den Signaltransduktionsweg, der in diesen Zellen durch Bindung der Liganden an den Rezeptor verursacht wird, durch ein Reportersystem nachzuweisen.
Derartige chemische Verbindungen können durch eines der nachstehend beschriebenen Verfahren oder beide identifiziert werden.
Bindungsuntersuchungen
Bindungsuntersuchungen werden normalerweise ausgeführt, indem man das Ziel dem Binden an einen markierten, selektiven Agonisten (Bindungsmittel) unterwirft, um einen markierten Komplex zu bilden, gefolgt von der Bestimmung des Verdrängungsgrades, der durch die Testverbindung nach Zugabe zu dem Komplex verursacht wird.
In einer spezifischen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Durchmustern einer chemischen Verbindung auf die Fähigkeit hin, an einen Kaliumkanal zu binden, der mindestens eine erfindungsgemäße KCNQ5-Untereinheit umfasst, bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, (i) eine erfindungsgemäße Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, der Wirkung eines KCNQ5 bindenden Mittels zu unterwerfen, um einen Komplex mit der Zelle zu bilden, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, (ii) den Komplex von Schritt (i) der Wirkung der zu testenden chemischen Verbindung zu unterwerfen und (iii) die Verdrängung des KCNQ5 bindenden Mittels aus dem Komplex mit der Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, nachzuweisen.
Bei der Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, handelt es sich vorzugsweise um eine wie vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Zelle.
Bei dem KCNQ5 bindenden Mittel handelt es sich vorzugsweise um radioaktiv markiertes 1,3-Dihydro-1-phenyl-3,3-bis-(4-pyridylmethyl)-2H-indol-2-on(Linopirdin) oder 10,10-Bis-(4-pyridinylmethyl)-9-(10H)-anthracenon(XE991).
In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist das bindende Mittel mit ³H markiert und die Verdrängung des KCNQ5 bindenden Mittels aus dem Komplex mit der Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, wird durch Messen der Menge an Radioaktivität durch herkömmliche Flüssigszintillationszählung nachgewiesen.
Aktivitätsuntersuchungen
Die KCNQ5 Kanal-Agonisten können den Kaliumkanal auf verschiedene Weisen beeinflussen. Der Agonist kann insbesondere eine hemmende Aktivität, eine stimulierende Aktivität oder andere modulatorische Aktivität zeigen.
In einer spezifischen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Aktivität an Kaliumkanälen bereit, die eine oder mehrere KCNQ5-Untereinheiten enthalten. Gemäß diesem Verfahren wird eine erfindungsgemäße Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, der Wirkung der zu testenden chemischen Verbindung unterworfen und die Aktivität wird durch Überwachen des Membranpotenzials, des Stroms, des Kaliumflusses oder des sekundären Calciumzuflusses der Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, nachgewiesen, vorzugsweise einer wie vorstehend beschrieben genetisch manipulierten Zelle.
Das Membranpotenzial und der Strom können durch elektrophysiologische Verfahren einschließlich Patch-Clamp-Techniken, wie zum Beispiel der Current-Clamp-Technik und der Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Technik oder durch spektroskopische Verfahren, wie zum Beispiel Fluoreszenzverfahren, überwacht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Überwachen des Membranpotenzials der Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, durch Patch-Clamp-Techniken durchgeführt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das Überwachen des Membranpotenzials der Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, durch spektroskopische Verfahren, z. B. unter Verwendung von Fluoreszenzverfahren, durchgeführt. In einer spezifischeren Ausführungsform wird die Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, mit einem das Membranpotenzial anzeigenden Mittel gemischt, das eine Bestimmung von Änderungen des Membranpotenzials der Zelle ermöglicht, die durch die Zugabe der Testverbindung verursacht werden. Bei dem Mittel, welches das Membranpotenzial anzeigt, kann es sich insbesondere um einen Fluoreszenzindikator, vorzugsweise DiBAC₄(3), DiOC5(3) und DiOC2(3) handeln.
In noch einer bevorzugten Ausführungsform wird das Überwachen des Membranpotenzials der Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, durch spektroskopische Verfahren, z. B. unter Verwendung eines FLIPR-Assays(Fluoreszenzbild-Plattenlesegerät, erhältlich von Molecular Devices), durchgeführt.
Durchmustern von genetischem Material
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Polynucleotidsequenz zum Durchmustern genetischer Materialien. Durch dieses Verfahren können Individuen identifiziert werden, die ein Gen tragen, das mit einem erfindungsgemäßen Polynucleotid identisch oder zu ihm homolog ist.
In dem erfindungsgemäßen Durchmusterungsverfahren wird ein erfindungsgemäßes Polynucleotid oder jedes Fragment oder jede Untersequenz hiervon verwendet. Zur Identifikation von Individuen, die mutierte Gene tragen, werden vorzugsweise die mutierten Formen des durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Polynucleotids verwendet.
In dem erfindungsgemäßen Durchmusterungsverfahren brauchen nur kurze Sequenzen verwendet zu werden, je nach dem tatsächlichen verwendeten Verfahren. Für SSCA werden vielleicht einige hundert Basenpaare gebraucht, für Oligonucleotid- oder PCR-Hybridisierung werden vielleicht nur von etwa 10 bis etwa 50 Basenpaare gebraucht.
Das Durchmustern kann durch herkömmliche Verfahren einschließlich Hybridisierung, SSCA-Analyse und Microarray-Technologie (DNA Chip-Technologie) erreicht werden. Das vorstehend beschriebene Hybridisierungsprotokoll stellt ein geeignetes Protokoll zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Durchmusterungsverfahren dar.
Transgene Tiere
Transgene Tiermodelle, bei denen es sich nicht um Menschen handelt, stellen die Möglichkeit bereit, in vivo auf therapeutische Verbindungen zu durchmustern. Da KCNQ5 auch im Gehirn exprimiert wird, können sie hilfreich dabei sein, auf Arzneistoffe zu durchmustern, die bei ZNS-Störungen, z. B. Epilepsie, wirksam sind.
Mit Transgen ist jedes Polynucleotidstück gemeint, das künstlich in eine Zelle eingefügt wird, und somit Teil des Genoms des Organismus wird, der sich aus dieser Zelle entwickelt. Ein derartiges Transgen kann ein Gen einschließen, das zu dem transgenen Organismus teilweise oder ganz heterolog (d. h. fremd) ist, oder es kann ein Gen darstellen, das zu einem endogenen Gen des Organismus homolog ist.
Mit einem transgenen Tier ist jeder nicht menschliche Organismus gemeint, der eine Zelle enthält, die eine Polynucleotidsequenz einschließt, die künstlich in diese Zelle eingefügt ist, und wobei diese Zelle Teil des transgenen Organismus wird, der sich aus dieser Zelle entwickelt. Ein derartiges Transgen kann zu dem transgenen Tier teilweise oder ganz heterolog sein. Obwohl transgene Mäuse eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellen, können andere transgene Säuger, einschließlich transgener Nagetiere (z. B. Hamster, Meerschweinchen, Kaninchen und Ratten), und transgene Schweine, Rinder, Schafe und Ziegen durch Standardtechniken erzeugt werden und sind in der Erfindung eingeschlossen.
Vorzugsweise wird das Transgen künstlich in das Genom des Zellkerns eingefügt.
Knockout- und Knockin-Tiere
Die nicht menschlichen transgenen Knockout-Tiermodelle können durch homologe Rekombination embryonaler Stammzellen mit Konstrukten entwickelt werden, die eine genomische Sequenz des KCNQ5-Gens enthalten, die nach dem Einfügen in das endogene Gen zu einem Verlust der Funktion des Gens führen.
Mit Knockout-Mutation ist eine Veränderung der Polynucleotidsequenz gemeint, welche die biologische Aktivität des Polypeptids verringert, das normalerweise davon kodiert wird. Um ein echtes Knockout-Modell zu erzeugen, sollte die biologische Aktivität des exprimierten Polypeptids um mindestens 80% relativ zu dem nicht mutierten Gen verringert sein. Bei der Mutation kann es sich insbesondere um eine Substitution, eine Insertion, eine Deletion, eine Mutation, die den Leserahmen verschiebt, oder eine Missense-Mutation handeln. Vorzugsweise handelt es sich bei der Mutation um eine Substitution, eine Insertion oder eine Deletion.
Um die Rolle von KCNQ5 auf der Ebene des Organismus weiter abzuschätzen, ist die Erzeugung eines Tieres, vorzugsweise einer Maus, dem das intakte KCNQ5-Gen fehlt oder das ein mutiertes KCNQ5-Gen enthält, erwünscht.
Ein Targeting-Vektor des Typs, bei dem das Gen ersetzt wird, der verwendet werden kann, um ein Knockout-Modell zu erzeugen, kann unter Verwendung eines isogenen genomischen Klons konstruiert werden, z. B. von einem Mausstamm wie zum Beispiel 129/Sv (Stratagene Inc., La Jolla, CA). Der Targeting-Vektor kann in eine auf geeignete Weise abgeleitete Linie embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) durch Elektroporation eingeführt werden, um ES-Zelllinien zu erzeugen, die eine hochgradig verkürzte From des KCNQ5-Gens tragen. Die durch Targeting veränderten Zelllinien können dann in einen Mausembryo im Blastulastadium injiziert werden, um chimäre Gründermäuse zu erzeugen. Heterozygote Nachkommen können untereinander zur Homozygotie gekreuzt werden.
Tiermodelle zur Überexpression können durch Integrieren von einer oder mehreren erfindungsgemäßen Polynucleotidsequenzen in das Genom gemäß Standardtechniken erzeugt werden.
Die hierin offenbarten Verfahren, welche die molekulare Manipulation von Nucleinsäuren einbeziehen, sind Fachleuten bekannt und werden z. B. durch Fredrick M A et al. [Fredrick M A et al.: Short Protocols in Molecular Biology; John Wiley and Sons, 1995] und Sambrook et al. [Sambrook et al.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. Ausg., Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor, NY 1989] und in Alexandra L J (Hrsg.): Gene Targeting: A practical approach; Oxford University Press (Oxford, New York, Tokio), 1993, beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER BILDER
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die begleitenden Bilder veranschaulicht, wobei
1 die elektrophysiologischen Eigenschaften von KCNQ5-Strömen zeigt [I/μA gegen Zeit/Sekunden]. Aufzeichnungen des Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Stroms von einer Xenopus-Oocyte, der KCNQ5 cRNA injiziert wurde. Ausgehend von einem Haltepotenzial von –80 mV wurden Zellen in +10 mV Schritten 2 Sekunden lang an Spannun gen zwischen –80 und +40 mV angeschlossen, gefolgt von einem konstanten Testpuls auf –30 mV; und
2 die elektrophysiologischen Eigenschaften von Strömen, die aus der Koexpression von KCNQ5 mit KCNQ3 stammen [I/μA gegen Zeit/Sekunden] zeigt. Ausgehend von einem Haltepotenzial von –80 mV wurden Zellen in +10 mV Schritten 2 Sekunden lang an Spannungen zwischen –80 und +40 mV angeschlossen, gefolgt von einem konstanten Testpuls auf –30 mV; und
3 die elektrophysiologischen Eigenschaften von Strömen, die aus der Koexpression von KCNQ5 mit KCNQ4 (26) hervorgehen [I/μA gegen Zeit/Sekunden] zeigt. Ausgehend von einem Haltepotenzial von –80 mV wurden Zellen in +10 mV Schritten 2 Sekunden lang an Spannungen zwischen –80 und +40 mV angeschlossen, gefolgt von einem konstanten Testpuls auf –30 mV;
4A–G die elektrophysiologischen Eigenschaften von KCNQ5 zeigen. Sowohl die Spleißvariante I (die man im Gehirn findet) als auch die Spleißvariante III (die man im Muskel findet) wurden in Xenopus-Oocyten exprimiert und durch Zwei-Elektroden-Voltage-Clamping untersucht. Beide Varianten werden nach einer Depolarisation langsam aktiviert, aber die Form I (4A) wird anfangs langsamer als die Muskelform III (4B) aktiviert. Ausgehend von einem Haltepotenzial von –80 mV wurde die Spannung in Schritten von 10 mV 0,8 Sekunden lang schrittweise auf Werte zwischen –100 und +40 mV erhöht, gefolgt von einem Spannungsschritt auf –30 mV (siehe Einschub, Tafel A). Eine Kanalaktivierung durch Depolarisation wurde durch eine Summe von drei Exponentialfunktionen angepasst (für Schritte von 2 sec). Für einen Schritt auf + 20 mV betrugen die Geschwindigkeitskonstanten ô₁ = 37,2 ± 2,2 ms, ô₂ = 246 ± 17 ms und ô₃ = 1112 ± 91 ms für die Spleißvariante I, während diese Konstanten ô₁ = 24,5 ± 0,8 ms, ô₂ = 163 ± 6 ms und ô₃ = 1690 ± 46 ms (± SEM, n = 16) betrugen. Dieser Unterschied in der Kinetik führt auch zu unterschiedlichen Kurven, wenn ein typisches M-Strom-Protokoll verwendet wird (4C, Variante I; 4D, Variante III). Variante I induziert Ströme, die M-Strömen kinetisch ähneln. In diesem Protokoll wird die Membranspannung von einem Haltepotenzial von –30 mV aus in Schritten von –10 mV 1 Sekunde lang an Spannungen zwischen –30 und –90 mV angeschlossen. Diesem folgte ein Schritt auf –30 mV (Tafel C, Einschub). (4E, 4F) Scheinbare Offenwahrscheinlichkeiten von Variante I (4E) und Variante III (4F) als Funktion der Spannung, erhalten aus einer in den Verfahren beschriebenen Analyse des Tailstroms. Von 12 Oocyten erhaltene Mittelwerte werden gezeigt. Das Anpassen einer Boltzmann-Gleichung ergab V_1/2 = –46 ± 1 mV und eine scheinbare Gating-Ladung von z = 2,8 ± 0,1 für Isoform I und V_1/2 = –48 ± 1 mV und eine scheinbare Gating-Ladung von z = 2,5 ± 0,1 für Isoform III. Für diese Anpassung wurden Werte bei positiveren Potenzialen als +10 mV ausgeschlossen, da diese wahrscheinlich durch einen zweiten Gating-Vorgang (Inaktivierung) beeinflusst sind, der zu einer Abnahme des scheinbaren p_offen bei positiveren Potenzialen führt. (4G), Ionenselektivität von KCNQ5-Strömen (Variante I). Das extrazelluläre Natrium wurde durch äquimolare Mengen Kalium ersetzt. Das Umkehrpotenzial wird als Funktion der Kaliumkonzentration gezeigt. Dies ergab eine Steigung von 51 mV/Zehnerpotenz der Kaliumkonzentration, was einen hoch selektiven Kaliumkanal anzeigt. Die Ergebnisse stammen von 10 Oocyten aus 2 verschiedenen Ansätzen;
5A–C die Pharmakologie von KCNQ5- und KCNQ3/5-Heteromeren zeigen. (5A) Hemmung von KCNQ5-Homomeren durch extrazelluläres Linopirdin (nach unten zeigende Dreiecke), XE991 (nach oben zeigende Dreiecke) und TEA(Quadrate). IC₅₀-Werte von 51 ± 5 μM, 65 ± 4 μM beziehungsweise 71 ± 17 mM wurden aus den aufgetragenen Anpassungskurven erhalten. (5B) Niflumsäure ändert die Spannungsabhängigkeit des scheinbaren p_offen. In Anwesenheit von 500 μM Niflumsäure (offene Kreise) wird die Spannungsabhängigkeit etwa 20 mV auf negative Potenziale hin verschoben. (5C) Die TEA-Empfindlichkeit ist in KCNQ3/5-Heteromeren verändert. Koexpression von KCNQ5 und KCNQ3 (1:1)(Rauten) erhöhte den IC₅₀-Wert auf –200 mM, Koexpression mit der KCNQ3-Mutante (T323Y)(Kreise) senkte den IC₅₀-Wert auf –30 mM. Bei den Datenpunkten in den Tafeln A und C handelt es sich um die Mittelwerte ± SEM von 4 bis 12 einzelnen Messungen. p_offen wurde wie in 3 bestimmt;
6 die Hemmung von KCNQ5-Strömen durch Stimulieren von M1-Rezeptoren zeigt, die in Xenopus-Oocyten koexprimiert wurden:

(6A) Ströme vor dem Stimulieren des M1-Rezeptors;
(6B) Strom, der 3 Minuten nach Anwenden von 10 μM Muscarin beobachtet wird. Das Puls-Protokoll wird im Einschub von Tafel b gezeigt. Keine Wirkung von 10 μM Muscarin oder Oxotremorin-Methiodid wurde in Oocyten festgestellt, in die nur KCNQ5 injiziert wurde; und

7A–C die Wechselwirkungen zwischen KCNQ2 und KCNQ5 (7A, 7B) und KCNQ3 und KCNQ5 (7C) zeigen:

(7A) Ströme von Oocyten, denen unterschiedliche Kombinationen von KCNQ cRNAs injiziert wurden (immer 10 ng Gesamtmenge an RNA) am Ende eines Pulses von zwei Sekunden auf 0 mV von einem Haltepotenzial von –80 mV aus. Die durch Koinjizieren von KCNQ2 und KCNQ5 ausgelöste Stromamplitude konnte durch eine lineare Überlagerung von Strömen erklärt werden. Eine Koinjektion von KCNQ5 mit der dominant negativen Mutante KCNQ2 (G279S) oder von KCNQ2 mit der äquivalenten Mutante KCNQ5 (G278S) führte zu einer etwa 50%igen Verringerung der Stromamplitude, was mit einem Fehlen einer Wechselwirkung konsistent ist, da nur 50% WT cRNA injiziert wurde;
(7B) Aufzeichnungen normalisierter Ströme von Experimenten, die für Tafel (A) verwendet wurden. Ströme, die durch den depolarisierenden Puls auf 0 mV hervorgerufen wurden, werden gezeigt. KCNQ2 (als Q2 markiert) aktiviert schneller als KCNQ5 (Q5) und die Koepression von beiden ergab Ströme, die durch eine lineare Überlagerung erklärt werden können. Das Koinjizieren von KCNQ2 mit der dominant negativen (und ansonsten nicht funktionellen) Mutante KCNQ5 (G278S) ergab Ströme, die KCNQ2 kinetisch ähnlich waren, und Ströme von einer Koinjektion von KCNQ5/KCNQ2 (G279S) ähnelten KCNQ5-Strömen;
(7C) Wechselwirkungen zwischen KCNQ3 und KCNQ5, wie in Tafel (a) gemessen. KCNQ3 ergibt nur sehr kleine Ströme in Xenopus-Oocyten. Die Ströme wurden vergrößert, wenn KCNQ5 mit kleinen Mengen von KCNQ3 koexprimiert wurde, und verringert, wenn es mit größeren Mengen koexprimiert wurde. Die dominant negative Mutante KCNQ3 (G318S) senkte die Ströme signifikant auf unter 50% der WT KCNQ5-Ströme, die von den injizierten 50% der WT KCNQ5 cRNA in diesem Experiment erwartet würden.

BEISPIELE
Die Erfindung wird weiter mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele veranschaulicht, die in keiner Weise den Umfang der Erfindung, wie beansprucht, beschränken sollen.
Beispiel 1
Klonieren und Charakterisieren der KCNQ5-cDNA
Unter Verwendung einer cDNA von fast vollständiger Länge für den Kaliumkanal KCNQ3 als Sonde wurde eine λGT11-Phagen-cDNA-Bank von menschlichem Thalamus (Clontech, #HL5009b) durchmustert und ein partieller cDNA-Klon, der ein zu den KCNQ Kaliumkanälen homologes Proteinfragment kodiert, wurde isoliert. Er unterschied sich von den bekannten Mitgliedern KCNQ1 (KvLQT1), KCNQ2, KCNQ3 und KCNQ4. Wir nannten das neue Gen KCNQ5. Überlappende cDNAs, die den gesamten offenen Leserahmen enthalten, wurden durch erneutes Durchmustern der cDNA-Bank und durch Verlängern des 5'-Endes in RACE-Experimenten (schnelles Amplifizieren von cDNA-Enden) unter Verwendung eines Marathon-Kits (Clontech) mit cDNA aus menschlichem Gehirn erhalten. Eine vollständige cDNA wurde zusammengesetzt und in den Oocyten- Expressionsvektor PTLN kloniert [Lorenz C, Pusch M & Jentsch T J: Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 13362–13366].
Die cDNA kodiert ein Polypeptid von 897 Aminosäuren mit einer vorhergesagten Masse von 99 kDa (SEQ ID NO: 2). Seine gesamte Aminosäureidentität mit KCNQ1, KCNQ2, KCNQ3 und KCNQ4 beträgt 43%, 58%, 54% beziehungsweise 61%. Zusammen mit diesen Proteinen bildet es einen getrennten Zweig der Superfamilie spannungsgesteuerter Kaliumkanäle. Als typisches Mitglied dieser Familie hat KCNQ5 6 vorhergesagte Transmembrandomänen und eine P-Schleife zwischen den Transmembrandomänen S5 und S6. In Kaliumkanälen, bei denen es sich um Tetramere identischer oder homologer Untereinheiten handelt, verbinden sich vier dieser hoch konservierten P-Schleifen, um die innenselektive Pore zu bilden. Wie andere KCNQ-Kanäle hat KCNQ5 einen langen vorhergesagten cytoplasmatischen Carboxylterminus, der etwa die Hälfte des Proteins ausmacht. Eine in den Carboxyltermini von KCNQ1, –2, –3 und –4 vorliegende konservierte Region liegt auch in KCNQ5 vor.
Die Sequenz von KCNQ5 sagt einige mögliche Stellen für eine Phosphorylierung durch Proteinkinase C und eine für Proteinkinase A voraus. Im Gegensatz zu KCNQ1 und KCNQ2 fehlt ihr jedoch eine aminoterminale Konsensusstelle für eine cAMP-abhängige Phosphorylierung.
Ein Northern-Blot für mehrere menschliche Gewebe (Clontech, #7760-1) wurde mit einem cDNA-Fragment von KCNQ5 als Sonde untersucht. Das Fragment wurde unter Verwendung des Rediprime Markierungskits (Amersham) mit ³²P markiert. Die Hybridisierung wurde in ExpressHyb-Lösung gemäß den Anleitungen des Herstellers (Clontech) durchgeführt. Ein Kodak BioMax Film wurde dann 4 Tage lang dem Filter ausgesetzt.
Eine Northern-Analyse der Expression von KCNQ5 in menschlichen Geweben deckte eine Bande von ≈9 kb im Gehirn auf.
Beispiel 2
Funktionelle Expression von KCNQ5-Kaliumkanaluntereinheiten
KCNQ5 wurde in Xenopus-Oocyten exprimiert und dessen Aktivität wurde durch Zwei-Elektroden-Voltage-Clamping untersucht.
Nach einer Linearisierung des KCNQ5 enthaltenden Vektors pTLN mit HpaI wurde gecappte cRNA in vitro unter Verwendung des mMessage mMachine cRNA-Sythesekits (Ambion) transkribiert. Normalerweise wurden 5–15 ng cRNA in Xenopus-Oocyten injiziert, die zuvor durch manuelles Defollikulieren und kurze Kollagenase- Behandlung isoliert worden waren. In Koexpressionsexperimenten wurden cRNAs in einem Verhältnis von 1:1 injiziert. Oocyten wurden bei 17°C in modifizierter Barth-Lösung (90 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,41 mM CaCl₂, 0,33 mM Ca(NO₃)₂, 0,82 mM MgSO₄, 10 mM HEPES, 100 E Penicillin –100 μg Streptomycin/ml, pH-Wert 7,6) aufbewahrt.

Standard Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Messungen wurden bei Raumtemperatur 2–4 Tage nach der Injektion unter Verwendung eines Turbotec 05 Verstärkers (npi instruments, Tamm, Deutschland) und der Software pClamp 5.5 (Axon Instruments) durchgeführt. Ströme wurden normalerweise in ND98-Lösung aufgezeichnet (siehe Tabelle 2). Linopirdin (RBI, Natick, MA) wurde als Stammlösung von 100 mM in DMSO hergestellt und auf eine Endkonzentration von 200 μM zu ND98 zugegeben. Tabelle 2 Lösungsinhalte (Konzentrationen in mM)

ND98	ND100	KD100	Rb100	Cs100
98 NaCl	100 NaCl	100 KCl	100 RbCl	100 CsCl
2 KCl
0,2 CaCl₂	0,2 CaCl₂	0,2 CaCl₂	0,2 CaCl₂	0,2 CaCl₂
2,8 MgCl₂	2,8 MgCl₂	2,8 MgCl₂	2,8 MgCl₂	2,8 MgCl₂
5 mM HEPES, pH-Wert 7,4

Um die Spannungsabhängigkeit der scheinbaren Offenwahrscheinlichkeit zu bestimmen, wurden Oocyten 2 Sekunden lang in Schritten von 10 mV an Werte zwischen –80 mV und +40 MV angeschlossen, gefolgt von einem konstanten Testpuls bei –30 mV. Auf t = 0 extrapolierte Tailströme wurden von einer mono-exponentiellen Anpassung erhalten, auf den Wert bei 0 mV normalisiert und für die Analyse des scheinbaren p_offen verwendet. Für die Datenanalyse wurden PClamp6 und Microcal Origin 5.0 verwendet.
Ähnlich wie KCNQ1, KCNQ2, KCNQ3 und KCNQ4 ergab auch KCNQ5 Ströme, die sich nach einer Depolarisation aktivierten (1). Im Vergleich zu KCNQ1-, KCNQ2- und KCNQ2/3-Kanälen war die Stromaktivierung jedoch langsamer und trat mit einer Zeitkonstante in der Größenordnung von 600 ms bei +20 mV auf (KCNQ2/KCNQ3-Kanäle weisen eine entsprechende Zeitkonstante von ≈300 ms auf). Die Deaktivierung von Strömen bei physiologischen Ruhepotenzialen (≈ –30 mV) war deutlich schneller (1). Ähnlich wie bei KCNQ2 zeigten makroskopische Ströme oft eine gewisse Einwärtsgleichrichtung bei positiven Potenzialen. KCNQ5-Ströme wurden zu mehr als 80% durch 5 mM Ba⁺⁺ gehemmt.
KCNQ1 baut sich mit minK (auch als KCNE1 oder IsK bekannt) zusammen auf, um Kanäle zu bilden, die größere Ströme ergeben und viel langsamer aktiviert werden. Wir testeten deshalb durch Koexpression, ob minK KCNQ5 auch beeinflussst. Bei Konzentrationen (1 ng minK cRNA pro Oocyte), die zu drastischen Änderungen der KCNQ1-Ströme in parallelen Experimenten führen, gab es nur eine geringe Änderung der KCNQ5-Ströme.
Unterschiedliche KCNQ-Untereinheiten können heteromere Kanäle bilden. Eine Koexpression von KCNQ2 mit KCNQ3, aber nicht mit KCNQ1, ergab Ströme, die etwa zehnfach größer waren als diejenigen von homomeren Kanälen. Da auch KCNQ2, KCNQ3 und KCNQ4 im Gehirn exprimiert werden, untersuchten wir, ob diese Proteine funktionell in Wechselwirkung treten. Oocyten, in die cRNAs für KCNQ2 und KCNQ5 injiziert wurden (bei der gleichen cRNA-Gesamtkonzentration) ergaben Ströme, die sich von einer linearen Überlagerung von Strömen aus den jeweiligen homomeren Kanälen nicht zu unterscheiden schienen.
Im Gegensatz dazu ergab eine Koexpression von KCNQ3 mit KCNQ5 Ströme, die signifikant größer waren, als durch eine Überlagerung von Strömen aus den jeweiligen homomeren Kanälen erklärt werden konnte (2A). Ferner senkte eine Koexpression von KCNQ5 und KCNQ4 Ströme, wenn sie mit homomeren Kanälen verglichen wurden (2B).
Linopirdin, ein starker und ziemlich spezifischer Hemmstoff für M-Ströme, hemmt KCNQ2-/KCNQ3-Kanäle bei einer Konzentration von 200 μM nahezu vollständig.
Diese Konzentration von Linopirdin hemmte KCNQ5 um etwa 80%.
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynucleotid mit einer Nucleinsäuresequenz, die fähig ist, unter Bedingungen von mindestens mittlerer/hoher Stringenz mit der als SEQ ID NO: 1 vorgelegten Polynucleotidsequenz oder deren komplementärem Strang zu hybridisieren, wobei die Hybridisierung in einer Lösung von 5 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter, sonifizierter Lachssperma-DNA 12 Stunden lang bei ungefähr 45°C stattfindet, gefolgt von zweimaligem, 30 Minuten langem Spülen in 2 × SSC, 0,5% SDS bei einer Temperatur von mindestens 65°C; wobei das Polynucleotid eine Kaliumkanaluntereinheit kodiert.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei auf die Hybridisierung zweimaliges, 30 Minuten langes Spülen in 2 × SSC, 0,5% SDS bei einer Temperatur von mindestens 70°C folgt.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei auf die Hybridisierung zweimaliges, 30 Minuten langes Spülen in 2 × SSC, 0,5% SDS bei einer Temperatur von mindestens 75°C folgt.
Isoliertes Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1–3, das 90% Identität mit der als SEQ ID NO: 1 vorgelegten Polynucleotidsequenz zeigt.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 4, das mindestens 95% Identität mit der als SEQ ID NO: 1 vorgelegten Polynucleotidsequenz zeigt.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1 mit der als SEQ ID NO: 1 vorgelegten Polynucleotidsequenz.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, das eine Kaliumkanaluntereinheit von Mensch, Ratte oder Maus kodiert.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, das die Kaliumkanaluntereinheit KCNQ5 mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, das eine KCNQ5-Variante kodiert, wobei die Variante eine Aminosäuresequenz aufweist, die an einer oder mehreren Positionen, die in den wie durch Tabelle 1 definierten konservierten Regionen liegen, verändert worden ist.
Vektorkonstrukt, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1–9.
Rekombinant hergestelltes Polypeptid, das durch das Polynucleotid nach den Ansprüchen 1–9 kodiert wird.
Polypeptid nach Anspruch 11, bei dem es sich um eine KCNQ5-Kaliumkanaluntereinheit mit der als SEQ ID NO: 2 vorgelegten Aminosäuresequenz handelt.
Polypeptid nach einem der beiden Ansprüche 11–12, umfassend sechs Transmembrandomänen, eine P-Schleife und eine carboxylterminale konservierte cytoplasmatische Region (die „A-Domäne").
Polypeptid nach Anspruch 11, bei dem es sich um eine KCNQ5-Variante handelt, wobei die Variante eine Aminosäuresequenz aufweist, die an einer oder mehreren Positionen, die in den wie durch Tabelle 1 definierten konservierten Regionen liegen, verändert worden ist.
Zelle, die durch den Einbau eines heterologen Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1–9 oder eines Vektorkonstrukts nach Anspruch 10 genetisch manipuliert ist.
Zelle nach Anspruch 15, die durch den Einbau einer KCNQ5-Kaliumkanaluntereinheit mit der als SEQ ID NO: 2 vorgelegten Aminosäuresequenz genetisch manipuliert ist.
Zelle nach Anspruch 15, die durch den Einbau einer KCNQ5-Variante genetisch manipuliert ist, wobei die Variante eine Aminosäuresequenz aufweist, die an einer oder mehreren Positionen, die in den wie durch Tabelle 1 definierten konservierten Regionen liegen, verändert worden ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 15–17, die genetisch manipuliert ist, um eine oder mehrere KCNQ-Kanaluntereinheiten zu koexprimieren.
Zelle nach Anspruch 18, die genetisch manipuliert ist, um die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ2, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ3, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ4, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1 und KCNQ2, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1 und KCNQ3, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1 und KCNQ4, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ2 und KCNQ3, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ2 und KCNQ4, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ3 und KCNQ4, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1 und KCNQ2 und KCNQ3, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1 und KCNQ2 und KCNQ4, die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ1 und KCNQ3 und KCNQ4 oder die Kanaluntereinheiten KCNQ5 und KCNQ2 und KCNQ3 und KCNQ4 zu koexprimieren.
Zelle nach Anspruch 18, die genetisch manipuliert ist, um die Kanaluntereinheiten KCNQ2 oder KCNQ3 und KCNQ5 zu koexprimieren.
Zelle nach einem der Ansprüche 15–20, bei der es sich um eine eukaryotische Zelle, insbesondere eine Säugerzelle, eine Oocyte oder eine Hefezelle handelt.
Zelle nach Anspruch 21, bei der es sich um eine menschliche embryonale Nierenzelle (HEK-Zelle), eine HEK 293-Zelle, eine BHK21-Zelle, eine Eierstockzelle des chinesischen Hamsters (CHO-Zelle), eine Oocytenzelle aus Xaenopus laevis (XLO-Zelle), eine COS-Zelle oder jede andere Zelllinie handelt, die in der Lage ist, KCNQ-Kaliumkanäle zu exprimieren.
Verfahren zum Erhalten einer im Wesentlichen homogenen Quelle eines menschlichen Kaliumkanals, der eine KCNQ5-Untereinheit umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, einen zellulären Wirt, der ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1–9 oder ein Vektorkonstrukt nach Anspruch 10 exprimierbar darin eingebaut hat, zu züchten und dann die gezüchteten Zellen zu gewinnen.
Verfahren nach Anspruch 23, umfassend den anschließenden Schritt, von den gezüchteten Zellen ein Membranpräparat zu erhalten.
Verfahren zum Durchmustern einer chemischen Verbindung auf die Fähigkeit hin, an einen Kaliumkanal zu binden, der mindestens eine KCNQ5-Kanaluntereinheit umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, (i) die Zelle nach den Ansprüchen 15–22, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, der Wirkung eines KCNQ5 bindenden Mittels zu unterwerfen, um einen Komplex mit der Zelle zu bilden, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, (ii) den Komplex von Schritt (i) der Wirkung der zu testenden chemischen Verbindung zu unterwerfen und (iii) die Verdrängung des KCNQ5 bindenden Mittels aus dem Komplex mit der Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, nachzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei es sich bei dem KCNQ5 bindenden Mittel um (i) radioaktiv markiertes 1,3-Dihydro-1-phenyl-3,3-bis-(4-pyridylmethyl)-2H-indol-2-on (Linopirdin) oder (ii) radioaktiv markiertes 10,10-Bis-(4-pyridinyl-methyl)-9-(10H)-anthracenon (XE991) handelt.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Verbindungen mit ³H markiert worden sind.
Verfahren nach einem der beiden Ansprüche 26–27, wobei die Verdrängung des KCNQ5 bindenden Mittels aus dem Komplex mit der Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, durch Messen der Menge an Radioaktivität durch herkömmliche Flüssigszintillationszählung nachgewiesen wird.
Verfahren zum Durchmustern einer chemischen Verbindung auf eine Aktivität auf einen Kaliumkanal hin, der mindestens eine KCNQ5-Kanaluntereinheit umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, (i) die Zelle nach den Ansprüchen 15–22, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, der Wirkung der chemischen Verbindung zu unterwerfen und (ii) das Membranpotenzial, den Strom, den Kaliumfluss oder den sekundären Calciumzufluss der Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, zu überwachen.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Überwachen des Membranpotenzials der Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, durch Patch-Clamp-Techniken durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der beiden Ansprüche 29–30, wobei das Überwachen des Membranpotenzials der Zelle, die eine KCNQ5-Kanaluntereinheit enthält, unter Verwendung von Fluoreszenzverfahren durchgeführt wird.
Verwendung einer Polynucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1–9 oder eines Vektorkonstrukts nach Anspruch 10 zum Durchmustern von genetischen Materialien, die aus Säugergeweben, insbesondere menschlichen Geweben gewonnen sind, auf Individuen mit Mutationen in diesem Gen.
Transgenes Tier, bei dem es sich nicht um einen Menschen handelt, das eine Knockout-Mutation des endogenen Gens KCNQ5 nach den Ansprüchen 1–8 oder ein mutiertes Gen KCNQ5 nach Anspruch 9 umfasst oder genetisch manipuliert ist, um das Gen KCNQ5 nach den Ansprüchen 1–8 zu überexprimieren oder um das mutierte Gen KCNQ5 nach Anspruch 9 zu überexprimieren.
Transgenes Tier nach Anspruch 33, bei dem es sich um ein Knockout-Tier handelt, bei dem das Gen in einem homozygoten Zustand vollständig deletiert ist.
Transgenes Tier nach Anspruch 34, umfassend ein mutiertes Gen KCNQ5 nach Anspruch 9.
Transgenes Tier nach einem der Ansprüche 33–35, bei dem es sich um ein transgenes Nagetier, insbesondere einen Hamster, ein Meerschweinchen, ein Kaninchen oder eine Ratte, ein transgenes Schwein, ein transgenes Rind, ein transgenes Schaf oder eine transgene Ziege handelt.