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Einführung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen neu identifizierte
rdgB-Proteine und dazugehörige Produkte
und Verfahren.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
folgende Diskussion des Hintergrunds der Erfindung und der hierin
zitierten Literaturnachweise sollen nicht als Beschreibung des Standes
der Technik der Erfindung angesehen werden.
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Die
zelluläre
Signalübertragung
ist ein fundamentaler Mechanismus bei dem externe Reize, die diverse
zelluläre
Abläufe
regulieren, in das Innere der Zelle weitergeleitet werden. Einer
der biochemischen Schlüsselmechanismen
der Signalübertragung
schließt
die reversible Phosphorylierung der Tyrosinreste von Proteinen ein.
Der Phosphorylierungszustand eines Proteins wird durch die wechselseitige
Wirkung der Tyrosinphosphatasen (TP's) und Tyrosinkinasen (TK's), einschließlich der
Rezeptor Tyrosinkinasen und Nichtrezeptor Tyrosinkinasen, modifiziert.
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Eine
Tyrosin-Proteinkinase, genannt PYK2, wird in der U.S. Patentanmeldung
Seriennr. 08/460,626, die am 2. Juni 1995 angemeldet wurde, die
eine teilweise Weiterbehandlung der U.S. Patentanmeldung Seriennr.
08/357,642 ist, die am 15. Dezember 1994 angemeldet wurde, beschrieben,
wobei beide als Referenz einschließlich aller Zeichnungen vollständig hierin aufgenommen
werden. PYK2 enthält
eine N-terminale Domäne,
eine katalytische Domäne,
zwei prolinreiche Bereiche, mögliche
Src-homologe 2(SH2) Bindungsbereiche und einen Bereich, der zur
fokalen Adhäsions-Zieldomäne (focal
adhesion targeting domain) homolog ist.
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Ein
Proteintyp, den man in Drosophila findet und der Drosophila Retinal
Degeneration B-Protein(rdgB) genannt wird, wird von Vihtelic et
al., J. of Cell Biology 122, 1013–1022, 1993, beschrieben. Die
in dieser Referenz beschriebene Sequenz enthält jedoch einen falschen Stopcodon-Sequenzierungsfehler,
und die Autoren waren sich deshalb nicht bewusst, dass das Drosophila
rdgB eine PYK-2-Bindungsdomäne enthält. Zusätzlich wurde
diese Sequenz fälschlicherweise
als ein Mitglied der 6-Transmembrandomänen-Familie von Proteinen identifiziert.
Diese rdgB-Proteine arbeiten in vielen sensorischen- und neuronalen
Zellen der Fliege und sind direkt mit dem Sehvermögen der
Fliege verbunden.
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Die
Sequenz eines genomischen Klons eines Teils von C. elegans wurde
in eine Computerdatenbank eingebracht, und diese Sequenz (obgleich
unbeachtet) enthält
eine rdgB-Sequenz mit Introns. Daher enthält die GENEBANK Datenbank Rohdaten
der Nukleotidsequenz einer Reihe von genomischen Klonen von C. elegans.
Unter Verwendung von Teilen der humanen rdgB-Sequenz, identifiziert die vorliegende
Erfindung einen offenen Leserahmen, der bis zu diesem Zeitpunkt
unbeachtet geblieben ist. Daher wurde ein rdgB in 14 Exons segregiert,
in zwei separaten Cosmiden C54C6 (assc. #Z77131) und MO1F1 (assc.
#Z46381) aufgefunden.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft rdgB-Polypeptide, Nukleinsäuren, die
für solche
Polypeptide kodieren, Zellen, Gewebe und Tiere, die solche Polypeptide
enthalten, Antikörper
für solche
Polypeptide, Assays, die solche Polypeptide verwenden und Verfahren
die sich auf alles vorhergehende beziehen. Solche rdgB-Polypeptide
sind in verschiedenen Signalübertragungswegen
involviert, und daher stellt die vorliegende Erfindung mehrere Agenzien
und Verfahren bereit, die für
das Diagnostizieren, das Behandeln und das Verhindern verschiedener
Erkrankungen und Zustände,
die mit Unregelmäßigkeiten
in diesen Wegen verbunden sind, verwendbar sind.
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Die
vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Identifikation und
Isolation einer Reihe von neuen Nichtrezeptor-Tyrosinkinase bindenden
Molekülen,
die hrdgB1, hrdgB2 und hrdgB3 genannt werden. Die Volllängen Nukleinsäuresequenzen,
die für
diese Proteine kodieren, werden entsprechend in SEQ ID NO: 1, SEQ ID
NO: 2 und SEQ ID NO: 3 dargestellt. Die Volllängen Aminosäuresequenzen werden entsprechend
in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 dargestellt. RDGB's bestehen im Allgemeinen
aus drei strukturellen Domänen.
Die hierin beschriebenen N-terminalen PIT-Domänen weisen etwa 45% Aminosäureidentität zum humanen
PPI1 und PPI2 auf. Die PIT-Domänen
des RDGB2 und RDBB3 (RDGB1 fehlt eine PIT-Domäne) weisen etwa 72% Identität miteinander
und etwa 62–65%
Identität
mit den Drosophila und C. elegans rdgB's auf. Die Volllängen Aminosäuresequenz für C. elegans
wird in SEQ ID NO: 7 dargestellt, und die Volllängen Drosophila-Nukleinsäuresequenz
wird in SEQ ID NO: 8 dargestellt, und die Volllängen Drosophila-Aminosäuresequenz
wird in SEQ ID NO: 9 dargestellt. Die PIT-Domänen der rdgB's weisen ein konserviertes,
putatives ATP-Bindungsmotiv auf, das denen in Proteinkinasen ähnelt.
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Die
zweite zentrale Domäne
ist in allen hierin beschriebenen humanen rdgB's vorhanden und weist keine Sequenzhomologie
zu irgendeiner anderen Domäne
auf. Die drei humanen rdgB's
teilen 43–47%
Identität über den
Abschnitt von 600–675
Aminosäuren
und zeigen 25–35%
Identität
zu den rdgB's der
Invertebraten. Diese große
Domäne
enthält
drei Subdomänen
mit viel höherer
Identität
(66–88%
in den humanen rdgB's und
35–75%
mit den rdgB's der
Invertebraten). Dieses hohe Konservierungsniveau, besonders über solch
einen diversen Satz von Spezies, legt eine wichtige funktionale
Rolle für
diese Bereiche nahe. Der N-terminale Abschnitt der zentralen Domäne ist ein
konservierter acidischer Bereich von 10–15 Aminosäuren, der fast nur aus Glutaminsäure und
Aspartat-Resten
besteht, die als calciumbindendes Motiv arbeiten können.
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Die
dritte rdgB-Domäne
ist besonders einzigartig für
diese Proteine und besteht aus den C-terminalen 343 bis 384 Resten
des Proteins. Es gibt 60–63%
Identität
zwischen den humanen rdgB's
und 40–60%
mit den rdgB's der
Invertebraten. Der Vergleich mit dem rdgB aus Drosophila basiert
auf dem einzigartigen Wissen über
diese Domäne
und ihrer funktionelle Bedeutung, wie sie hierin beschrieben wird.
Die veröffentlichte
Sequenz enthielt eine Leserahmen-Mutation (frameshift mutation),
so dass man von dem Protein zunächst
dachte, dass es auf weniger als dem halben Weg durch diese Domäne endet.
Durch Vergleich mit den humanen Sequenzen, stellt die vorliegende
Erfindung eine Sequenz bereit, die sich über das Ende der Drosophila-Sequenz
erstreckt und die Aminosäuren
1054–1249
einschließt.
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Innerhalb
der PYK2-bindenden Domäne
gibt es ein bestimmtes Motiv mit einer primären Sequenzhomologie zum nukleotidbindenden
Bereich der mit ras verwandten GTP-bindenden Proteine. Alle Mitglieder
dieser Familie (ras, rho, rac, rab, ran) enthalten eine Sequenz,
die durch die konservierte hydrophobe-hydrophobe-G-X-K-X-D-hydrophobe Aminosäuresequenz
gekennzeichnet ist. Das G-X-K-Motiv in den rdgB's liegt bei AS 614 (rdgB1), AS 898 (rdgB2),
AS 983 (rdgB3) und AS 987 (dm). Basierend auf den Analysen der dreidimensionalen
Struktur (durch Röntgenstrahlkristallographie)
dieses Bereiches aus ras und ran, erfasst dieses Motiv den Nukleotidring
von GDP/GTP als Teil des molekularen „Ein-Aus"-Schalters in diesen Proteinen. Den rdgb's fehlt jedoch der
stromaufwärts
liegende p-Schleife oder die A-Box, die in diesen kleinen G-Proteinen vorhanden
ist.
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RdgB-Proteine
sind in Schlüsselwegen
der Signalübertragung,
die mit der Signalübertragung
durch Neurotransmitter zusammenhängen,
eingebunden. Dies basiert zum Teil auf der Erkennung der Existenz
und der Bedeutung von Domänen,
die in rdgB-Proteinen gefunden werden (siehe 1). Zum
Beispiel demonstrieren die hierin beschriebenen Experimente, dass
die rdgB-Proteine eine PYK2-bindende Domäne enthalten. Man glaubt, dass
PYK2 für
die Regulation der Signalübertragung
durch Neurotransmitter verantwortlich ist. Die rdgB-Proteine enthalten
auch eine PIT-Domäne,
die in Drosophila in der PI-Übertragung
eingebunden ist. Die PI-Übertragung
bei Menschen ist beim Recycling von synaptischen Vesikeln eingebunden.
Demnach könnten im
Hinblick auf die Rolle der PYK2-bindenden Domäne und der PIT-Domäne, rdgB-Proteine bei der
Behandlung von Zuständen
des Nervensystems durch Verstärken
oder Hemmen einer solchen Signalübertragung
verwendbar sein.
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Daher
bietet die Erfindung in einem ersten Aspekt eine isolierte, gereinigte,
angereicherte oder rekombinante Nukleinsäure, die für ein rdgB-Polypeptid kodiert.
Bevorzugt kodiert eine solche Nukleinsäure für ein rdgB-Polypeptid von einem
Säugetier,
noch bevorzugter kodiert es für
ein humanes rdgB-Polypeptid.
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Mit „isoliert" in Bezug auf eine
Nukleinsäure,
ist ein Polymer aus zwei (bevorzugt 21, noch bevorzugter 39, am
meisten bevorzugt 75) oder mehr Nukleotiden, die miteinander verbunden
sind, gemeint, einschließlich DNA
oder RNA, das aus einer natürlichen
Quelle isoliert oder synthetisiert worden ist. Die isolierte Nukleinsäure der
vorliegenden Erfindung ist in dem Sinne einzigartig, dass sie in
der Natur nicht in einem reinen oder abgetrennten Zustand zu finden
ist. Die Verwendung des Begriffs „isoliert" weist darauf hin, dass eine natürlich auftretende
Sequenz aus ihrer normalen zellulären Umgebung entfernt worden
ist. Daher kann die Sequenz in einer zellfreien Lösung vorliegen
oder in einer anderen zellulären
Umgebung angeordnet sein. Der Begriff beinhaltet nicht, dass die
Sequenz die einzig vorhandene Nukleotidkette ist, weist jedoch darauf
hin, dass sie die vorherrschende Sequenz ist, die vorliegt (wenigstens
10–20%
mehr als jede andere Nukleotidsequenz) und im wesentlichen frei
ist (wenigstens etwa zu 90–95%
rein) von Nicht-Nukleotidmaterial,
das natürlicherweise
mit ihr verbunden ist. Daher umfasst der Begriff kein isoliertes
Chromosom, das für
ein oder mehrere rdgB-Polypeptide kodiert.
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Durch
die Verwendung des Begriffs „angereichert" in Bezug auf eine
Nukleinsäure,
ist gemeint, dass die spezifische DNA- oder RNA-Sequenz eine wesentlich
höhere
Fraktion (2–5-fach)
der in den Zellen oder der entsprechenden Lösung vorhandenen Gesamt-DNA
oder RNR ausmacht, als in normalen oder erkrankten Zellen oder in
den Zellen aus denen die Sequenz entnommen worden ist. Dies könnte von
einer Person bevorzugt durch Verringern der Menge an vorhandener
anderer DNA oder RNA, oder bevorzugt durch eine Erhöhung der
Menge der spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz oder durch eine Kombination
von beidem veranlasst werden. Es sollte jedoch betont werden, das
angereichert nicht impliziert, dass dort keine anderen DNA- oder
RNA-Sequenzen vorhanden
sind, nur dass die relative Menge der entsprechenden Sequenz auf eine
nützliche
Art und Weise und bevorzugt getrennt von der Sequenzbibliothek wesentlich
erhöht
wurde. Der Begriff signifikant, wird hier verwendet, um darauf hinzuweisen,
dass das Niveau der Erhöhung
für die
Person, die eine solche Erhöhung
durchführt,
nützlich
ist und im Allgemeinen eine Zunahme relativ zu anderen Nukleinsäuren von
etwa wenigstens dem 2-fachen, noch bevorzugter wenigstens 5 bis
10-fachen oder sogar mehr meint. Der Begriff impliziert auch nicht,
dass es dort keine DNA oder RNA aus anderen Quellen gibt. Die DNA aus
einer anderen Quelle, kann zum Beispiel DNA aus einer Hefe oder
aus einem bakteriellen Genom oder einem Klonierungsvektor, wie zum
Beispiel pUC19, umfassen. Dieser Begriff unterscheidet von natürlich auftretenden
Ereignissen, wie zum Beispiel einer viralen Infektion oder einem
tumorartigen Wachstum, bei denen die Menge einer mRNA auf natürliche Weise
relativ zu anderen mRNA-Spezies erhöht sein kann. Das heißt, dass
der Begriff nur solche Situationen abdeckt, in denen eine Person
eingegriffen hat, um den Anteil der gewünschten Nukleinsäure zu erhöhen.
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Für einige
Zwecke ist es auch von Vorteil, dass eine Nukleotidsequenz in gereinigter
Form vorliegt. Der Begriff „gereinigt" im Bezug auf eine
Nukleinsäure,
erfordert keine absolute Reinheit (wie zum Beispiel eine homogene
Herstellung); stattdessen stellt er einen Hinweis darauf dar, dass
die Sequenz relativ reiner ist als in der natürlichen Umgebung (verglichen
zur natürlichen
Menge, sollte diese Menge wenigstens um das 2–5-fache größer sein, z.B. im Sinne von
mg/ml). Individuelle Klone, die aus einer cDNA-Bibliothek isoliert wurden, können bis
zur elektrophoretischen Homogenität gereinigt werden. Die beanspruchten
DNA-Moleküle,
die aus diesen Klonen erhalten werden, könnten direkt aus der Gesamt-DNA
oder aus der Gesamt-RNA erhalten werden. Die cDNA-Klone treten nicht
natürlich
auf, sondern werden bevorzugt eher durch Manipulation einer teilweise
gereinigten natürlich
auftretenden Substanz (Boten-RNA) erhalten. Die Konstruktion einer
cDNA-Bibliothek aus mRNA schließt
die Bildung einer synthetischen Substanz (cDNA) ein, und reine einzelne
cDNA-Klone können aus
der synthetischen Bibliothek durch klonale Selektion der Zellen,
die die cDNA-Bibliothek tragen, isoliert werden. Daher erzielt das
Verfahren, dass die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus mRNA und
die Isolation von bestimmten cDNA-Klonen einschließt, eine
etwa 106-fache Reinigung der nativen Information.
Daher ist die Reinigung um wenigstens eine Größenordnung, bevorzugt zwei
oder drei Ordnungen und am meisten bevorzugt 4 oder 5 Größenordnungen
ausdrücklich
mit einbezogen.
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Mit
einem „rdgB-Polypeptid" sind neun oder mehr
benachbarte Aminosäuren,
die in der Volllängen Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt sind,
gemeint. Die rdgB-Polypeptide können
durch Volllängen
Nukleinsäuresequenzen
oder irgendeinen Teil einer Volllängen Nukleinsäuresequenz
kodiert werden, solange eine funktionelle Aktivität des Polypeptids
bestehen bleibt. Bevorzugte funktionelle Aktivitäten schließen die Fähigkeit ein, den N-terminalen
Abschnitt von PYK2 zu binden. Zum Beispiel umfasst die vorliegende
Erfindung Deletionsmutanten, isolierte Domänen und komplementäre Sequenzen,
die mit einem Volllängen
rdgB-Protein unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren
können.
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Im
bevorzugten Ausführungsformen
umfasst, besteht im Wesentlichen aus oder besteht die isolierte Nukleinsäure (aus)
eine(r) Nukleinsäuresequenz,
die in der Volllängen Nukleinsäuresequenz
der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3, oder durch wenigstens
27, 30, 45, 60 oder 90 benachbarte Nukleotide davon dargestellt
wird, und das rdgB-Polypeptid
umfasst, besteht im Wesentlichen aus oder besteht aus wenigstens
9, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 200 oder 300 benachbarte(n) Aminosäuren eines
rdgB-Polypeptids.
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Mit „umfassen" ist gemeint einschließlich, jedoch
nicht begrenzt auf was auch immer dem Wort „umfassen" folgt. Daher weist die Verwendung des
Begriffs „umfassen" darauf hin, dass
die aufgelisteten Elemente erforderlich oder zwingend sind, aber
das andere Elemente optional sind und vorliegen können oder
nicht. Mit „bestehen
aus" ist gemeint,
einschließlich
und begrenzt auf, was auch immer dem Ausdruck „bestehen aus" folgt. Daher weist
der Ausdruck „bestehen
aus" darauf hin,
dass die aufgelisteten Elemente erforderlich oder zwingend sind
und das keine anderen Elemente vorhanden sein können. Mit „bestehen im Wesentlichen
aus" ist gemeint,
einschließlich
aller Elemente, die nach dem Ausdruck aufgelistet sind und auf andere
Elemente begrenzt, die die Aktivität oder Wirkung, die für die aufgelisteten
Elemente in der Offenbarung spezifiziert ist, nicht beeinträchtigt oder
dazu beiträgt.
Daher weist der Ausdruck „bestehen
im Wesentlichen aus" darauf
hin, dass die aufgelisteten Elemente erforderlich oder zwingend
sind, dass jedoch andere Elemente optional sind und abhängig davon
ob oder ob sie nicht die Aktivität
oder Wirkung der aufgelisteten Elemente beeinflussen, vorhanden
sein können
oder nicht.
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Zusammensetzungen
und Sonden der vorliegenden Erfindung können humane Nukleinsäuren, die
für ein
rdgB-Polypeptid kodieren, enthalten, sind jedoch im Wesentlichen
frei von Nukleinsäure,
die nicht für
ein rdgB-Polypeptid kodieren. Die humane Nukleinsäure, die
für ein
rdgB-Polypeptid kodiert, weist wenigstens 18 benachbarte Basen der
Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID
NO: 3 dargestellt sind, auf und wird selektiv mit humaner genomischer
DNA, die für
ein rdgB-Polypeptid kodiert oder zu solch einer Sequenz komplementär ist, hybridisieren.
Die Nukleinsäure
kann aus einer natürlichen
Quelle durch cDNA-Klonierung
oder subtraktive Hybridisation isoliert werden; die natürliche Quelle
kann Blut, Samen und Gewebe aus verschiedenen Organismen, einschließlich Eukaryoten,
Säugetieren,
Vögeln,
Fischen, Pflanzen, Gorillas, Rhesusaffen, Schimpansen und Menschen
sein; und die Nukleinsäure
kann durch das Triester-Verfahren oder durch Verwendung eines automatischen
DNA-Synthetisierers synthetisiert werden. In noch anderen bevorzugten
Ausführungsformen
ist die Nukleinsäure
ein konservierter oder einzigartiger Bereich, zum Beispiel solche,
die für
das Design der Hybridisierungssonden verwendbar sind, um die Identifikation
und die Klonierung von zusätzlichen
Polypeptiden zu erleichtern, dass Design von PCR-Sonden verwendbar
sind, um das Klonieren von zusätzlichen
Polypeptiden zu erleichtern, und das Erhalten von Antikörpern für Polypeptidbereiche.
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Mit „konservierten
Nukleinsäurebereichen" sind Bereiche gemeint,
die auf zwei oder mehr Nukleinsäuren
vorhanden sind, die für
ein rdgB-Polypeptid kodieren, an die eine bestimmte Nukleinsäuresequenz
unter niedrig stringenten Bedingungen hybridisieren kann. Beispiele
für niedrig
stringente Bedingungen, die für
das Screening nach Nukleinsäuren,
die für
rdgB-Polypeptide kodieren, geeignet sind, werden von Abe et al.
J. Biol. Chem., 19: 13361 (1992) bereitgestellt (hiermit vollständig hierin
aufgenommen, einschließlich
aller Zeichnungen). Bevorzugt konservierte Bereiche unterscheiden
sich durch nicht mehr als 7 von 20 Nukleotiden.
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Mit „einzigartigem
Nukleinsäurebereich" ist eine Sequenz
gemeint, die in einer Volllängen
Nukleinsäure
vorhanden ist, die für
ein rdgB-Polypeptid kodiert, das nicht in einer Sequenz, die für irgendein
anderes natürlich
auftretendes Polypeptid kodiert, vorhanden ist. Solche Bereiche
umfassen bevorzugt 12 oder 20 benachbarte Nukleotide, die in der
Volllängen
Nukleinsäure,
die für
ein rdgB-Polypeptid kodiert, vorhanden sind.
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Die
Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäuresonde zur Detektion eines
rdgB-Polypeptids oder einer Nukleinsäure, die für ein rdgB-Polypeptid in einer
Probe kodiert. Die Nukleinsäuresonde
enthält
eine Nukleinsäure,
die mit wenigstens einer Sequenz, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
2 oder SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, hybridisieren wird.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
hybridisiert die Nukleinsäuresonde
mit einer Nukleinsäure,
die für wenigstens
12, 27, 30, 35, 40, 50, 100, 200 oder 300 benachbarte Aminosäuren der
Volllängen
Sequenz, die in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt
ist, kodiert. Verschiedene niedrig oder stark stringente Hybridisierungsbedingungen
können
verwendet werden, abhängig
von der gewünschten
Spezifität und
Selektivität.
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Mit „stark
stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Hybridisierungsbedingungen
gemeint, die (1) eine geringe Ionenstärke und hohe Temperaturen für das Waschen
verwenden, zum Beispiel 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1%
SDS bei 50°C;
(2) während
der Hybridisierung ein denaturierendes Agens, wie zum Beispiel Formamid,
verwenden, zum Beispiel 50% (vol/vol) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1%
Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer, bei
pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3)
50% Formamid, 5 × SSC
(0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt's Lösung,
beschallte Lachssperma DNA (50 g/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat
bei 42°C,
das bei 42°C
in 0,2 × SSC
und 0,1% SDS gewaschen wird. Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen
hybridisieren nur stark komplementäre Nukleinsäuresequenzen. Solche Bedingungen
verhindern bevorzugt die Hybridisierung von Nukleinsäuren mit
1 oder 2 Fehlpaarungen innerhalb von 20 benachbarten Nukleotiden.
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Verfahren
zum Verwenden der Sonden schließen
das Detektieren der Anwesenheit oder Menge von rdgB-RNA in einer
Probe durch in Kontakt bringen der Probe mit einer Nukleinsäuresonde
unter Bedingungen bei denen eine Hybridisierung auftritt und Detektieren
der Anwesenheit oder Menge der Sonde, die an die rdgB-RNA gebunden
ist, ein. Der Nukleinsäure-Duplex,
der zwischen der Sonde und der Nukleinsäuresequenz, die für ein rdgB-Polypeptid
kodiert, gebildet wird, kann zur Identifikation der Sequenz der
detektierten Nukleinsäure
verwendet werden (siehe zum Beispiel, Nelson et al., in Nonisotopic
DNA Probe Techniques, S. 275 Academic Press, San Diego (Kricka,
Hrsg., 1992); hierin in seiner Gesamtheit aufgenommen, einschließlich aller
Zeichnungen). Kits zum Durchführen
solcher Verfahren können
so konstruiert sein, dass sie ein Aufbewahrungsmittel aufweisen,
in dem eine Nukleinsäuresonde
angeordnet ist.
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Die
Erfindung beschreibt auch eine rekombinante Nukleinsäure, bevorzugt
in einer Zelle oder einem Organismus. Die rekombinante Nukleinsäure kann
eine Sequenz, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, und einen Vektor
oder einen Promotor, der die Transkription in einer Wirtszelle wirksam
initialisieren kann, enthalten. Die rekombinante Nukleinsäure kann
alternativ dazu einen in einer Zelle funktionalen Transkriptionsinitiationsbereich,
eine Sequenz komplementär
zu einer RNA-Sequenz, die für
ein rdgB-Polypeptid kodiert, und einen in einer Zelle funktionalen
Transkriptionsterminationsbereich enthalten.
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In
einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes, angereichertes
oder gereinigtes rdgB-Polypeptid.
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Mit „isoliert" in Bezug auf ein
Polypeptid, ist ein Polymer mit 2 (bevorzugt 7, noch bevorzugter
13, am meisten bevorzugt 25) oder mehr Aminosäuren gemeint, die miteinander
verbunden sind, wobei Polypeptide eingeschlossen sind, die aus einer
natürlichen
Quelle isoliert worden sind oder die synthetisiert worden sind. Die
isolierten Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind in dem Sinne
einzigartig, dass sie im reinen oder abgetrennten Zustand in der
Natur nicht vorgefunden werden. Die Verwendung des Begriffs „isoliert" weist darauf hin,
dass eine natürlich
auftretende Sequenz aus ihrer normalen zellulären Umgebung entfernt worden
ist. Demnach kann die Sequenz in einer zellfreien Lösung vorliegen
oder in einer anderen zellulären
Umgebung angeordnet sein. Der Begriff impliziert nicht, dass die
Sequenz die einzige Aminosäurekette
ist, die vorhanden ist, jedoch, dass sie die vorherrschende vorhandene
Sequenz ist (wenigstens 10–20%
mehr als von jeder anderen Sequenz) und im Wesentlichen frei (wenigstens
zu etwa 90–95%
rein) von Nicht-Aminosäurematerial ist,
das natürlicherweise
mit ihr verbunden ist.
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Durch
die Verwendung des Begriffs „angereichert" in Bezug auf ein
Polypeptid, ist gemeint, dass die spezifische Aminosäuresequenz
einen wesentlich höheren
Anteil (2–5-fach)
der gesamten Aminosäuren
ausmacht, die in den entsprechenden Zellen oder der Lösung vorhanden
sind, als in normalen oder erkrankten Zellen oder in den Zellen,
aus denen die Sequenz entnommen wurde. Dies könnte durch eine Person bevorzugt
durch Verringern der Menge an anderen vorhandenen Aminosäuren oder
bevorzugt durch eine Erhöhung der
Menge der gewünschten
spezifischen Aminosäuresequenz,
oder durch eine Kombination dieser beiden veranlasst werden. Es
sollte jedoch betont werden, dass angereicht nicht bedeutet, dass
es dort keine anderen Aminosäuresequenzen
mehr gibt, die vorhanden sind, nur dass die relative Menge der entsprechenden
Sequenz wesentlich erhöht
worden ist. Der Begriff wesentlich, wie er hier verwendet wird,
soll angeben, dass das Niveau der Erhöhung für eine Person nützlich ist,
die eine solche Erhöhung
vornimmt und im Allgemeinen eine Erhöhung relativ zu anderen Aminosäuren von
etwa wenigstens dem 2-fachen, noch bevorzugter wenigstens dem 5
bis 10-fachen oder sogar mehr bedeutet. Der Begriff impliziert auch
nicht, dass es keine Aminosäure aus
anderen Quellen gibt. Die andere Aminosäurequelle kann zum Beispiel
eine Aminosäure
umfassen, die von einem Hefe- oder einem baktierellem Genom oder
einem Klonierungsvektor, wie zum Beispiel pUC19 kodiert wird. Der
Begriff soll nur solche Situationen abdecken, in denen der Mensch
eingegriffen hat, um das Verhältnis
der gewünschten
Aminosäure
anzuheben.
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Für einige
Zwecke ist es auch von Vorteil, dass eine Aminosäuresequenz in gereinigter Form
vorliegt. Der Begriff „gereinigt" in Bezug auf ein
Polypeptid erfordert keine absolute Reinheit (wie zum Beispiel eine
homogene Herstellung); stattdessen stellt er einen Hinweis darauf
dar, dass die Sequenz relativ reiner ist als in der natürlichen
Umgebung (verglichen zum natürlichen
Niveau, sollte dieses Niveau wenigstens um das 2–5-fach größer sein, z.B. im Sinne von
mg/ml). Die Reinigung um wenigstens eine Größenordnung, bevorzugt zwei
oder drei Ordnungen und am meisten bevorzugt 4 oder 5 Größenordnungen
ist ausdrücklich
mit einbezogen. Die Substanz ist bevorzugt frei von Kontaminationen
auf einem funktionell wichtigen Niveau, zum Beispiel zu 90%, 95%
oder 99% rein.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
enthalten rdgB-Polypeptide
wenigstens 9, 10, 15, 20 oder 30 benachbarte Aminosäuren der
Volllängen
Sequenz, die in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt
werden.
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In
einem noch anderem Aspekt beschreibt die Erfindung einen gereinigten
Antikörper
(z.B., einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper) mit
einer spezifischen Bindungsaffinität für ein rdgB-Polypeptid. Der Antikörper enthält eine
Sequenz von Aminosäuren,
die an ein rdgB-Polypeptid
spezifisch binden kann.
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Mit „spezifischer
Bindungsaffinität" ist gemeint, dass
der Antikörper
bei einer bestimmten detektierbaren Menge an ein hrdgB-Polypeptid
binden wird, jedoch an andere Polypeptide unter identischen Bedingungen nicht
im gleichen Ausmaß binden
wird. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Antikörper, die
hrdgB1 von hrdgB2 oder hrdgB3 unterscheiden können oder auf sonstige Weise
zwischen den verschiedenen rdgB's
unterscheiden können.
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Antikörper mit
einer spezifischen Bindungsaffinität für ein rdgB-Polypeptid können in
Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit und/oder Menge eines rdgB-Polypeptids
in einer Probe durch in Kontakt bringen der Probe mit dem Antikörper unter
Bedingungen, unter denen sich ein Immunokomplex bildet, und detektieren der
Anwesenheit und/oder Menge des Antikörpers, der mit dem rdgB-Polypeptid
konjugiert ist, verwendet werden. Diagnostische Kits zur Durchführung solcher
Verfahren können
so konstruiert sein, dass sie ein erstes Aufbewahrungsmittel, dass
den Antikörper
enthält,
und ein zweites Aufbewahrungsmittel mit einem Konjugat eines Bindungspartners
des Antikörpers
und einem Marker, einschließen.
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In
einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Hybridom, das einen
Antikörper
mit einer spezifischen Bindungsaffinität für ein rdgB-Polypeptid herstellt.
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Mit „Hybridom" ist eine sich unbegrenzt
vermehrende Zelllinie gemeint, die einen Antikörper, zum Beispiel einen rdgB-Antikörper, sekretieren
kann.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
umfasst der rdgB-Antikörper eine
Sequenz von Aminosäuren,
die ein rdgB-Polypeptid
spezifisch binden kann.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Detektieren
der Anwesenheit oder der Menge einer Verbindung, die an ein rdgB-Polypeptid
binden kann. Das Verfahren schließt das Inkubieren der Verbindung
mit einem rdgB-Polypeptid und das Detektieren der Anwesenheit oder
Menge der Verbindung, die an das rdgB-Polypeptid gebunden ist, ein.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
hemmt die Verbindung die Aktivität
von rdgB. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verbindungen,
die ein rdgB-Polypeptid binden und hemmen können, die durch weiter oben beschriebene
Verfahren identifiziert werden.
-
In
einem anderem Aspekt beschreibt die Erfindung ein Verfahren zum
Screenen nach möglichen Agenzien,
die für
die Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes verwendbar
sind, die/der durch eine Abnormalität in einem Signalübertragungsweg,
der eine Wechselwirkung zwischen einem rdgB-Polypeptid und einem
natürlichen
Bindungspartner (NBP) beinhaltet, charakterisiert ist. Das Verfahren
schließt
das Untersuchen möglicher
Agenzien nach solchen ein, die in der Lage sind, die Wechselwirkung
als Hinweis auf ein verwendbares Agens zu fördern oder zu zerstören.
-
Mit „Screenen" ist das Untersuchen
eines Organismus auf die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Eigenschaft
gemeint.
-
Das
Verfahren kann das Messen oder Detektieren verschiedener Eigenschaften
einschließen,
einschließlich
des Niveaus der Signalübertragung
und des Niveaus der Wechselwirkung zwischen einem rdgB-Polypeptid
und einem NBP.
-
Mit
einer „Erkrankung
oder einem Zustand" ist
ein Status in einem Organismus, z.B. einem Menschen, gemeint, der
von Mitgliedern der medizinischen Gemeinschaft als abnormal anerkannt
wird. Die Erkrankung oder der Zustand kann durch eine Abnormalität in einem
oder mehreren der Signalübertragungswege
in einer Zelle, bevorzugt einer in Tabelle 1 aufgelisteten Zelle,
gekennzeichnet sein, wobei eine der Komponenten des Signalübertragungswegen
entweder ein rdgB-Polypeptid oder ein NBP ist.
-
Spezifische
Erkrankungen oder Störungen,
die abhängig
von den betroffenen Zellen behandelt oder verhindert werden können, schließen ein:
Erb-Goldflam-Syndrom; Neuroblastom; Erkrankungen, die durch Nervengifte,
wie zum Beispiel Choleratoxin, Pertussistoxin oder Schlangengift
verursacht werden; akute megakaryocytische Myelose; Thrombocytopenie;
solche des zentralen Nervensystems, wie zum Beispiel epileptische
Anfälle,
Apoplexie, Kopfverletzung, Rückenmarksverletzung,
durch Hypoxie induzierte Schädigung
der Nervenzelle, wie zum Beispiel bei einem Herzstillstand oder
bei neonatalen Leiden, Epilepsie, neurodegenerativen Erkrankungen,
wie zum Beispiel Alzheimersche Krankheit, Huntingtonsche und Parkinsonsche
Erkrankung, Demenz, Muskelverspannung, Depression, Beklemmung, Angstzustände, Zwangsneurose,
posttraumatisches Stresssyndrom, Schizophrenie, neuroeleptisches
malignes Syndrom und Tourette-Syndrom. Zustände, die durch rdgB-Hemmer
behandelt werden könnten,
schließen
Epilepsie, Schizophrenie, extreme Hyperaktivität bei Kindern, chronischen
Schmerzen und akute Schmerzen ein. Beispiele für Zustände, die durch Verstärker des
PYK2-rdgB-Weges behandelt werden könnten (zum Beispiel einen Phosphatasehemmer),
schließen
Apoplexie, Alzheimersche, Parkinsonsche, andere neurodegenerative
Erkrankungen und Migräne
ein.
-
Bevorzugte
Störungen
schließen
Epilepsie, Apoplexie, Schizophrenie und die Parkinsonsche Störung ein,
da es eine etablierte Beziehung zwischen diesen Störungen unter
Funktion der Kaliumkanäle
gibt. Siehe, McLean et al., Epilepsia 35: S5–S9 1994; Ricard-Mousnier et
al., Neurophysiologie Clinique 23: 395–421, 1993; Crit Rev. Neurobiol
7: 187–203,
1994; Simon und Lin, Biophys. J. 64: A100, 1993; Birnstiel et al.,
Synapse (NY) 11: 191–196,
1992; Coleman et al., Brain Res. 575: 138–142 1992; Popolip et al.,
Br. J. Pharmacol 104: 907–913,
1991; Murphy et al., Exp. Brain Res. 84: 355–358, 1991; Rutecki et al.,
Epilepsia 32: 1–2,
1991; Fisher und Coyle (Hrsg.), Frontiers of Clinical Neuroscience,
Vol. 11 "Neurotransmitters
and Epilepsy"; Meeting,
Woods Hole MA, USA IX + 260P. John Wiley and Sons, Inc. NY, NY;
Treherne und Ashford, Neuroscience 40: 523–532, 1991; Gehlert, Prog.
Neuro-Psychopharmacol.
Biol. Psychiatry 18: 1093–1102,
1994; Baudy, Expert Opin Ther. Pat. 1994 4/4: 343–378; Porter
und Rogawski, Epilepsia 33: S1–S6,
1992; Murphy, J. Physiol. 453: 167–183, 1992; Cromakalim, Drugs
Future 17/3: 237–239,
1992; Carmeliet, Eur. Heart J. 12: 30–37, 1991; Olpe et al., Experientia
47/3: 254–257,
1991; Andrade et al., Science 234/4781: 1261–1265, 1986; Forster, J. Neurosci.
Methods 13/3–4:
199–212,
1985.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
schließen
die hierin beschriebenen Verfahren das Identifizieren eines Patienten
der einer Behandlung bedarf ein. Der Fachmann wird erkennen, dass
verschiedene Techniken verwendet werden können, um solche Patienten zu
identifizieren. Zum Beispiel können
zelluläre
Kaliumniveaus gemessen werden oder die individuellen Gene können auf
einen Defekt hin untersucht werden.
-
Mit „Abnormalität" ist ein Niveau gemeint,
das sich statistisch von dem Niveau unterscheidet, das in Organismen
beobachtet wird, die nicht an einer solchen Erkrankung oder Zustand
leiden, und kann entweder als eine überschüssige Menge, Intensität oder Dauer
des Signals oder eine unzureichenden Menge, Intensität oder Dauer
des Signals charakterisiert werden. Die Abnormalität bei der
Signalübertragung
kann sich als Abnormalität
der Zellfunktion, Lebensfähigkeit
oder dem Differenzierungszustand darstellen. Die vorliegende Erfindung
basiert zum Teil auf der Bestimmung, dass eine solche Abnormalität in einem
Weg durch Einwirkung auf die PYK2-rdgB-Wechselwirkungsstelle des Weges gemildert
werden kann. Ein abnormales Wechselwirkungsniveau kann entweder
größer oder
auch geringer sein als das normale Niveau und kann die normale Durchführung oder
die Funktion des Organismus beeinträchtigen. Daher ist es auch
möglich,
nach Agenzien zu screenen, die für
die Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes, der durch
eine Abnormalität
im Signalübertragungsweg
gekennzeichnet ist, verwendbar sind, durch das Testen der Verbindungen
auf ihre Fähigkeit,
die Wechselwirkung zwischen einem rdgB-Polypeptid und PYK2 zu beeinflussen,
da der Komplex, der durch eine solche Wechselwirkung gebildet wird,
Teil des Signalübertragesweges
ist. Die Erkrankung oder der Zustand kann jedoch durch eine Abnormalität im Signalübertragungsweg
gekennzeichnet sein, sogar wenn das Niveau der Wechselwirkung zwischen
dem rdgB-Polypeptid
und NBP normal ist.
-
Mit „interagieren" ist jede physikalische
Verbindung zwischen Polypeptiden, ob kovalent oder nichtkovalent,
gemeint. Diese Verknüpfung
kann viele chemische Mechanismen einschließen, zum Beispiel die kovalente
Bindung, die Affinitätsbindung,
die Interkalierung, die koordinierte Bindung und die Komplexierung.
Beispiele für
nichtkovalente Bindungen schließen
die elektrostatischen Bindungen, die Wasserstoffbrückenbindungen
und die Van-der-Waals-Bindungen ein. Des Weiteren können die
Wechselwirkungen zwischen den Polypeptiden entweder direkt oder
indirekt sein. Daher kann die Verbindung zwischen zwei gegebenen
Polypeptiden mit einem intermediärem
Agens oder mehreren solcher Agenzien, die die zwei entsprechenden
Proteine verbinden (z.B., ein rdgB-Polypeptid und PYK2) erzielt werden.
Ein anderes Beispiel für
ein indirekte Wechselwirken ist die unabhängige Herstellung, Stimulation
oder Hemmung sowohl eines rdgB-Polypeptids als auch von PYK2 durch
ein regulatorisches Agens. Abhängig
von der Art der vorhandenen Wechselwirkung können verschiedene Verfahren
verwendet werden, um das Niveau der Wechselwirkung zu messen. Zum
Beispiel wird die Stärke
von kovalenten Bindungen häufig
in Form der Energie gemessen, die für das Berechnen einer bestimmten
Anzahl von Bindungen (d.h., kcal/mol) erforderlich ist. Nichtkovalente
Wechselwirkungen werden häufig
wie weiter oben beschrieben, und auch in Form der Distanz zwischen
den wechselwirkenden Molekülen.
Indirekte Wechselwirkungen können
auf vielfältige
Weise beschrieben werden, die die Anzahl von involvierten intermediären Agenzien,
oder den Grad der Kontrolle, der auf das rdgB-Polypeptid ausgeübt wird
relativ zur Kontrolle, die auf PYK2 oder ein anderes NBP ausgeübt wird,
einschließt.
-
Mit „zerstören" ist gemeint, dass
die Wechselwirkung zwischen dem rdgB-Polypeptid und PYK2 oder einem
NBP entweder durch Verhindern der Expression des rdgB-Polypeptids,
oder durch Verhindern der Expression von PYK2 oder NBP, oder durch
spezifisches Verhindern der Wechselwirkung der natürlich synthetisierten
Proteine oder durch Interferieren mit der Wechselwirkung der Proteine
verringert wird.
-
Mit „fördern" ist gemeint, dass
die Wechselwirkung zwischen einem rdgB-Polypeptid und PYK2 oder NBP
entweder durch Erhöhen
der Expression eines rdgB-Polypeptids, oder durch Erhöhen der
Expression von PYK2 oder einem NBP, oder durch Verringern der Dephosphorylierungsaktivität des entsprechenden
regulatorischen PTP (oder einer anderen Phosphatase, die auf andere
phosphorylierte Signalkomponenten wirkt) durch Fördern der Wechselwirkung des
rdgB-Polypeptids und PYK2 oder NBP, oder durch Verlängern der Dauer
der Wechselwirkung erhöht
wird. Die kovalente Bindung kann entweder durch direkte Kondensation
von existierenden Seitenketten oder durch den Einbau von externen
Brückenmolekülen gefördert werden.
Viele bivalente oder polyvalente Verknüpfungsagenzien sind beim Verbinden
von Polypeptiden, wie zum Beispiel einem Antikörper, an andere Moleküle verwendbar.
Zum Beispiel können
repräsentative
Agenzien zum Verbinden organische Verbindungen, wie zum Beispiel
Thioester, Carbodiimide, Succinimidester, Diisocyanate, Glutaraldehyde,
Diazobenzene und Hexamethylendiamine, einschließen. Diese Liste soll für die verschiedenen
Klassen von Agenzien zum Verbinden, die im Stand der Technik bekannt
sind, nicht erschöpfend
sein, sondern ist für
die gebräuchlicheren
Kopplungsagenzien eher exemplarisch. (Siehe Killen und Lindstrom
1984, J. Immunol. 133: 1335–2549;
Jansen, F. K., et al., 1982, Immunological Rev. 62: 185–216; und
Vitetta et al., siehe oben).
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Mit „NBP" ist ein natürlicher
Bindungspartner eines rdgB-Polypeptids gemeint, der sich natürlicherweise
mit einem rdgB-Polypeptid verbindet. Die Struktur (primär, sekundär oder tertiär) des jeweiligen
natürlichen Bindungspartners
wird den jeweiligen Wechselwirkungstyp zwischen dem rdgB- Polypeptid und dem
natürlichen
Bindungspartner beeinflussen. Wenn zum Beispiel der natürliche Bindungspartner
eine Sequenz von Aminosäuren
umfasst, die komplementär
zum rdgB-Polypeptid ist, kann die kovalente Bindung eine mögliche Wechselwirkung
sein. Auf vergleichbare Weise können
andere strukturelle Charakteristika andere entsprechende Wechselwirkungen
ermöglichen.
Die Wechselwirkung ist nicht auf bestimmte Reste begrenzt und kann spezifisch
Phosphotyrosin-, Phosphoserin- oder
Phosphothreoninreste einschließen.
Ein große
Vielfalt von Sequenzen kann mit den rdgB-Polypeptiden wechselwirken.
Ein Beispiel für
einen natürlichen
Bindungspartner kann PYK2 sein, die weiter oben beschrieben wird.
Mit im Stand der Technik gut bekannten Techniken kann man mehrere
natürliche
Bindungspartner für
rdgB-Polypeptide identifizieren, zum Beispiel durch Verwendung eines
Two-Hybrid-Screens.
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Mit „Signalübertragungsweg" ist die Sequenz
von Ereignissen gemeint, die die Übertragung einer Nachricht
von einem extrazellulären
Protein in das Cytoplasma durch eine Zellmembran einschließt. Das
Signal wird die Zelle unmittelbar dazu veranlassen, eine bestimmte
Funktion durchzuführen,
zum Beispiel sich unkontrolliert zu vermehren und dadurch Krebs
zu verursachen. Verschiedene Mechanismen des Signalübertragungsweges
(Fry et al., Protein Science, 2: 1785–1797, 1993) stellen mögliche Verfahren
zum Messen der Menge oder Intensität eines gegebenen Signals bereit.
Abhängig
von der jeweiligen Erkrankung, die mit der Abnormalität in einem
Signalübertragungsweg
verbunden ist, können
zahlreiche Symptome detektiert werden. Der Fachmann wird solche
Symptome, die mit den verschiedenen anderen Erkrankungen, die hierin
beschrieben werden, verbunden sind, erkennen. Da darüber hinaus
einige Adaptermoleküle
sekundäre
Signalübertragungsproteine
auf der Membran rekrutieren, ist die Konzentration und Lokalisation
von verschiedenen Proteinen und Komplexen eine Maß für die Signalübertragung.
Zusätzlich
können
Konformationsänderungen,
die bei der Übertragung
eines Signals involviert sind, unter Verwendung von Zirkulardichroismus-
und Fluoreszenzstudien beobachtet werden.
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In
einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren
eines Organismus auf eine Erkrankung oder einen Zustand, der durch
eine Abnormalität
in einem Signalübertragungsweg,
der eine Wechselwirkung zwischen einem rdgB-Polypeptid und PYK2
oder einem NBP enthält,
gekennzeichnet ist. Das Verfahren schliefst das Detektieren des
Wechselwirkungsniveaus als eine Indikation auf die Erkrankung oder
den Zustand ein.
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Mit „Organismus" ist jede lebende
Kreatur gemeint. Der Begriff schließt Säugetiere und besonders den Menschen
ein. Bevorzugte Organismen schließen Mäuse ein, da die Fähigkeit
zur Behandlung oder Diagnose von Mäusen häufig prädikativ für die Fähigkeit ist, in anderen Organismen,
wie zum Beispiel Menschen, zu funktionieren.
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Mit „Diagnose" ist jedes Verfahren
zum Identifizieren eines Symptoms, das normalerweise mit einer bestimmten
Erkrankung oder einem Zustand verbunden ist, gemeint. Demnach kann
eine anfängliche
Diagnose durch die Verwendung eines zusätzlichen bestätigenden
Beweises, wie zum Beispiel der Anwesenheit von anderen Symptomen,
endgültig
als korrekt bewiesen werden. Die gegenwärtige Klassifizierung von verschiedenen
Erkrankungen und Zuständen
verändert
sich fortlaufend, da mehr über
die Mechanismen, die die Erkrankungen oder Zustände verursachen, gelernt wird.
Daher kann die Detektion eines wichtigen Symptoms, wie zum Beispiel
der Detektion eines abnormalen Wechselwirkungsniveaus zwischen rdgB-Polypeptiden
und PYK2 oder NBP's,
die Basis zum Definieren und Diagnostizieren einer neu benannten
Erkrankung oder eines Zustandes bilden. Zum Beispiel werden die
konventionellen Krebsarten entsprechend der Anwesenheit eines bestimmten
Satzes von Symptomen klassifiziert. Jedoch kann ein Teil dieser
Symptome mit einer Abnormalität in
einem bestimmten Signalweg, wie zum Beispiel dem ras21-Weg,
verbunden sein, und in der Zukunft können diese Erkrankungen unabhängig von
den jeweiligen beobachteten Symptomen als ras21-Weg-Erkrankungen reklassifiziert
werden.
-
Ein
noch anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung
eines Organismus, der eine Erkrankung oder einen Zustand aufweist,
der durch eine Abnormalität
in einem Signalübertragungsweg gekennzeichnet
ist. Der Signalübertragungsweg
enthält
eine Wechselwirkung zwischen einem rdgB-Polypeptid und PYK2 oder
einem NBP, und das Verfahren schließt die Förderung oder das Zerstören der
Wechselwirkung, einschließlich
von Verfahren, die die rdgB:NBP-Wechselwirkung direkt zum Ziel haben,
als auch Verfahren, die auf andere Punkte entlang des Weges abzielen,
ein.
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Mit „dominantem
negativem Mutantenprotein" ist
ein Mutantenprotein gemeint, das mit dem normalen Signalübertragungsweg
interferiert. Das dominante negative Mutantenprotein enthält die entsprechende
Domäne
(z.B., ein rdgB-Polypeptid, oder PYK2 oder ein NBP), weist jedoch
eine Mutation auf, die das richtige Signalisieren, zum Beispiel
durch Verhindern der Bindung einer zweiten Domäne des gleichen Proteins, verhindert.
Ein Beispiel für
ein dominantes negatives Protein wird von Millauer et al., Nature
February 10, 1994 beschrieben. Das Agens ist bevorzugt ein Peptid,
das die Wechselwirkung des rdgB-Polypeptids und der PYK2 oder eines
anderen NBP blockiert oder fördert.
Das Peptid kann rekombinant, gereinigt oder in einem pharmazeutisch
geeigneten Träger
oder Verdünnungsmittel
vorliegen.
-
Ein
EC50 oder IC50 von
weniger als oder gleich 100 μM
wird bevorzugt, und sogar noch mehr bevorzugt weniger als oder gleich
50 μM und
am meisten bevorzugt weniger als oder gleich 20 μM. Solche niedrigeren EC50 oder IC50 sind
von Vorteil, da sie niedrigere Konzentrationen von in vivo oder
in vitro für
die Therapie oder Diagnose zu verwendenden Molekülen erlauben. Die Entdeckung
von Molekülen
mit einem solchen niedrigen EC50 und IC50 ermöglicht
das Design und die Synthese von zusätzlichen Molekülen mit
vergleichbarer Wirksamkeit und Effektivität. Zusätzlich kann das Molekül einen
EC50 oder IC50 von
weniger als oder gleich 100 μM bei
einer oder mehreren, jedoch nicht allen Zellen, die aus der Gruppe
ausgewählt
werden, die aus Parathyroidzellen, Knochenosteoclasten, Goormaghtigh'-Nierenzellen, Nierenzellen
des proximalen Tubulus, Nierenzellen des distalen Tubulus, Zellen
des dicken aufsteigenden Schenkels der Henle'-Schleife und/oder des Sammelkanals,
Zellen des zentralen Nervensystems, Keratinocyten in der Epidermis,
parafolliculäre
Zellen in der Schilddrüse
(C-Zelle), Intestinalzellen, Trophoblasten in der Plazenta, Thrombozyten,
vaskuläre
glatte Muskelzellen, Herz-Atriozellen,
Gastrin-sekretierende Zellen, Glucagon-sekretierende Zellen, Nierenmesangialzellen,
Zellen der Brust, Betazellen, Fett/Fettspeicherzellen, Immunzellen
und GI-Traktzellen besteht, aufweisen.
-
Mit „therapeutisch
wirksamer Menge" ist
eine Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer therapeutisch
relevanten Wirkung gemeint. Eine therapeutische relevante Wirkung
befreit bis zu einem gewissen Ausmaß von einem oder mehreren Symptomen
der Erkrankung oder des Zustandes beim Patienten; oder führt einen
oder mehrere physiologisch oder biochemische Parameter, die mit
der Erkrankung oder dem Zustand in Verbindung stehen oder Grund
dafür sind
entweder teilweise oder vollständig
auf das Normale zurück.
Im Allgemeinen liegt eine therapeutisch wirksame Menge zwischen
etwa 1 nmol und 1 μmol
des Moleküls,
abhängig
von seinem EC50 oder IC50,
und vom Alter, und der Größe des Patienten
und der Erkrankung, die mit dem Patienten im Zusammenhang steht.
-
In
einem anderen Aspekt beschreibt die Erfindung ein Polypeptid, das
ein rekombinantes rdgB-Polypeptid oder ein einzigartiges Fragment
davon umfasst. Mit „einzigartigem
Fragment" ist eine
Aminosäuresequenz
gemeint, die in einem Volllängen
rdgB-Polypeptid vorhanden ist, das in keinem anderen natürlich auftretenden
Polypeptid vorhanden ist. Bevorzugt umfasst eine solche Sequenz
6 benachbarte Aminosäuren,
die in der vollständigen
Sequenz vorhanden sind. Noch bevorzugter umfasst eine solche Sequenz
12 benachbarte Aminosäuren,
die in der vollständigen
Sequenz vorhanden sind. Am meisten bevorzugt umfasst eine solche Sequenz
18 benachbarte Aminosäuren,
die in der vollständigen
Sequenz vorhanden sind.
-
Mit
einem „rekombinanten
rdgB-Polypeptid" ist
gemeint, dass ein Polynukleotid enthalten ist, das durch rekombinante
DNA-Techniken hergestellt wird, so dass es sich von einem natürlich auftretendem
Polypeptid entweder in seiner Lokalisation (z.B., Anwesenheit in
einer anderen Zelle oder einem Gewebe, das dann in der Natur gefunden
wird), Reinheit oder Struktur unterscheidet. Im Allgemeinen wird
ein solches rekombinantes Polypeptid in einer Zelle in einer Menge
vorhanden sein, die sich von der normalerweise in der Natur beobachteten
unterscheidet.
-
In
einem anderen Aspekt beschreibt die Erfindung eine rekombinante
Zelle oder ein Gewebe, die/das eine gereinigte Nukleinsäure, die
für ein
rdgB-Polypeptid kodiert, enthält.
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In
solchen Zellen kann die Nukleinsäure
unter der Kontrolle seiner genomischen regulatorischen Elemente
stehen oder kann unter Kontrolle von exogenen regulatorischen Elementen,
einschließlich
eines exogenen Promotors, stehen. Mit „exogen" ist ein Promotor gemeint, der normalerweise
in vivo nicht transkriptionell mit der kodierenden Sequenz für das rdgB-Polypeptid gekoppelt
ist.
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In
einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein rdgB-Polypeptid bindendes
Agens, das an ein rdgB-Polypeptid binden kann. Das bindende Agens
ist bevorzugt ein gereinigter Antikörper, der ein Epitop wieder
erkennt, das auf einem rdgB-Polypeptid vorhanden ist. Andere Bindungsagenzien
schließen
Moleküle
ein, die an das rdgB-Polypeptid binden, und analoge Moleküle, die
an ein rdgB-Polypeptid binden.
-
Mit „gereinigt" in Bezug auf einen
Antikörper
ist gemeint, dass der Antikörper
von einem natürlich
auftretenden Antikörper
verschieden ist, wie zum Beispiel in einer gereinigten Form. Der
Antikörper
wird bevorzugt durch Standardtechniken als eine homogene Zubereitung
bereitgestellt. Die Verwendungen von Antikörpern gegen das klonierte Polypeptid
schließen
jene ein, die als Therapeutik oder als diagnostische Werkzeuge verwendet
werden.
-
In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül bereit,
das eine Nukleotidsequenz umfasst, die kodiert für: (a) ein Polypeptid mit einer
Aminosäuresequenz,
dargestellt in SEQ ID NO: 4, von den Aminosäureresten 1–616 oder 616–974; (b)
das Komplement der Nukleotidsequenz aus (a); (c) ein Polypeptid
mit einer Aminosäuresequenz,
dargestellt in SEQ ID NO: 5, von den Aminosäureresten 1–250, 250–900 oder 900–1243; (d)
das Komplement der Nukleotidsequenz aus (c); (e) ein Polypeptid
mit einer Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO: 6, von den Aminosäureresten
1–251,
251–985
oder 985–1349;
oder (f) das Komplement der Nukleotidsequenz aus (e). Die Verwendbarkeit
von solchen isolierten Domänen
beim Design von Proteinhemmern ist dem Fachmann gut bekannt.
-
Die
Erfindung stellt auch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, das eine Nukleotidsequenz
umfasst, die für
ein Polypeptid mit der Volllängen
Aminosäuresequenz,
dargestellt in SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6, kodiert,
mit der Ausnahme, das ihr wenigstens eine, jedoch nicht mehr als
zwei der Domänen
fehlen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus der PIT-,
der zentralen Domäne,
der PYK2-bindenden Domäne,
der calciumbindenden Domäne
und der nukleotidbindenden Domäne
besteht. Solche Deletionsmutanten sind für das Design von Assays für Proteinhemmer
verwendbar. Die oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle können zum Beispiel cDNA oder
genomische DNA sein und können
in einem rekombinanten Vektor oder Expressionsvektor angeordnet
sein. In einem solchen Vektor ist die Nukleinsäure bevorzugt operativ mit
der regulatorischen Nukleotidsequenz, die regulatorische Informationen
die Transkription und Translation betreffend enthält, die
die Expression der Nukleotidsequenz in einer Wirtszelle kontrollieren,
verbunden ist.
-
Daher
stellt die Erfindung auch eine genetisch veränderte Wirtszelle bereit, die
irgendeine der hierin beschriebenen Nukleotidsequenzen enthält, und
die Nukleinsäure
ist bevorzugt operativ mit der regulatorischen Nukleotidsequenz,
die regulatorische Informationen die Transkription und Translation
betreffend enthält, die
die Expression der Nukleotidsequenz in einer Wirtszelle kontrollieren,
verbunden. Solche Wirtszellen können
offensichtlich prokaryotisch oder eukaryotisch sein.
-
Andere
Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung
ihrer bevorzugten Ausführungsformen
und Ansprüche
deutlich.
-
Kurze Beschreibung der
Figuren
-
1 zeigt
die Domänen
einiger bevorzugter Volllängen
rdgB-Proteine.
-
Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft rdgB-Polypeptide, Nukleinsäuren, die
für solche
Polypeptide kodieren, Zellen, Gewebe und Tiere, die solche Nukleinsäuren enthalten,
Antikörper
gegen solche Polypeptide, Assays, die solche Polypeptide verwenden
und Verfahren, die alles vorgenannte betreffen. Der Fachmann wird erkennen,
dass viele der weiter unten beschriebenen Verfahren, die in Beziehung
zu rdgB, PYK2, einem NBP oder einen Komplex von rdgB mit PYK2 oder
einen NBP stehen, ebenfalls in Bezug auf die anderen Mitglieder dieser
Gruppe verwendet werden können.
-
Wir
beschreiben die Isolation und Charakterisierung eines neuen Nichtrezeptor-Tyrosinkinase
bindenden Proteins, das rdgB genannt wird. HrdgB1 wird im Gehirn,
der Milz und den Ovarien exprimiert. HrdgB2 wird in vielen menschlichen
Geweben, einschließlich
dem Gehirn, dem Herzen, dem Thymus und den peripheren Blutleukozyten,
exprimiert. HrdgB3 wird im Thymus stark exprimiert, wird jedoch
auch im Gehirn, im Herzen, in den Ovarien und in den Hoden exprimiert.
-
Die
für PYK2
dargestellten Beispiele, siehe oben, offenbaren einen neuen Mechanismus
für das
Koppeln zwischen G-Protein gekoppelten Rezeptoren und dem MAP-Kinase-Signalweg. Diese
Beispiele zeigten auch, dass der Calciumeinfluss, der durch eine
Membrandepolarisierung nach der Aktivierung des Nikotin-Acetylcholin-Rezeptors
stimuliert wird oder anderer Stimuli, die einen Calciumeinfluss
oder die Freisetzung aus internen Speichern zur Folge haben, zur
Aktivierung von PYK2, der Tyrosin-Phosphorylierung von Shc, der
Rekrutierung von Grb2/Sos und der Aktivierung des MAP-Kinase-Signalwegs
führen.
PYK2 kann auch extrazelluläre
Signale mit dem JNK/SAP-Kinase-Signalweg verknüpfen.
-
RdgB-Proteine
repräsentieren
eine Verknüpfung
in den weiter oben offenbarten Beobachtungen. Es wurde bei rdgB-Proteinen gezeigt,
dass sie an PYK2 sowohl in vitro als auch in vivo mit hoher Affinität binden. Ein
Beweis für
diese hochaffine Wechselwirkung wird in Experimenten dargestellt,
in denen PYK2 mit Glutathion-S-Transferase fusionierten rdgB-Proteinen aus einem
Zelllysat herausgezogen wird. Diese Experimente werden im unten
stehenden Abschnitt mit den Beispielen beschrieben. Zusätzlich enthalten
die Drosophila-Homologen
der rdgB-Proteine sowohl eine Phosphitidylinositol-Transferase-Domäne als auch
eine Ca2+-bindende Domäne. Obwohl die Phosphitidylinositol-Transferase-Domäne in einer
alternativ gespleißten
Variante fehlt, enthalten alle Formen der rdgB-Proteine eine Ca2+-bindende Domäne. Daher ist die Ca2+-bindende Domäne der rdgB-Proteine möglicherweise
in der Ca2+-Antwort, die beim PYK2 signalisieren
beobachtet wird, involviert.
-
Das
hierin dargestellte Model könnte
den Mechanismus darstellen, der der Calcium-vermittelten Regulation
der Genexpression in neuronalen Zellen, die durch den MMDA-Rezeptor oder spannungsempfindlichen
Calciumkanälen
induziert wird, unterliegt. Das Expressionsmuster von PYK2, der
externe Reiz, der die Kinase zusammen mit ihrer Rolle bei der Kontrolle
der MPA-Kinase- und JNK-Signalwege aktiviert, legt eine mögliche Rolle
für PYK2
und rdgB-Proteine bei der Kontrolle einer breiten Palette von Prozessen
im zentralen Nervensystem, einschließlich der neuronalen Plastizität, der starken örtlichen
Kontrolle der Ionenkanalfunktion als auch der örtlichen Aktivierung der MAP-Kinase-
und JNK-Signalwege, der Zellerregung und der synaptischen Wirksamkeit,
nahe.
-
Viele
andere Merkmale und Aspekte der Erfindung sind: Nukleinsäure, die
für ein
rdgB-Polypeptid kodiert; eine Nukleinsäuresonde für die Detektion von rdgB; ein
auf eine Sonde bezogenes Verfahren und ein Kit zur Detektion von
rdgB; DNA-Konstrukte, die ein rdgB-Nukleinsäuremolekül und Zellen, die diese Konstrukte enthalten,
umfassen; gereinigte rdgB-Polypeptide;
ein rdgB-Antikörper
und Hybridom; ein auf einem Antikörper basierendes Verfahren
und ein Kit zum Detektieren von rdgB; die Isolation von Verbindungen,
die mit rdgB wechselwirken; Zusammensetzungen; die Zerstörung von
Proteinkomplexen; Antikörper
gegen Komplexe; pharmazeutische Formulierungen und Arten der Verabreichung;
die Identifikation von Agenzien; die Reinigung und Herstellung von
Komplexen; Derivate von Komplexen und die Bestimmung von Erkrankungen.
All diese Aspekte und Merkmale werden im Detail in Bezug auf PYK-2
in der PCT-Veröffentlichung
WO 96/18738, die in ihrer Gesamtheit hierin aufgenommen wird, einschließlich aller
Zeichnungen, beschrieben. Der Fachmann wird einfach anerkennen,
dass eine solche Beschreibung auch auf rdgB leicht angepasst werden
kann und gleichermaßen
auf die vorliegende Erfindung anwendbar ist.
-
Beispiele
-
Die
unten stehenden Beispiele sind nicht begrenzend und dienen lediglich
der Darstellung der verschiedenen Aspekte und Merkmale der Verfahren,
die zum Identifizieren der Volllängen
Nuklein- und Aminosäuresequenzen
einer Reihe von rdgB-Proteinen verwendet werden. Experimente, die
die rdgB-Expression, Wechselwirkung
und Signalaktivitäten
beschreiben, werden ebenfalls bereitgestellt.
-
Material und Methoden
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Two-Hybrid-Screen
-
Der
Hefestamm L40, der die Reporter-Gene HIS3 und β-gal unter Kontrolle einer stromaufwärts liegenden
LexA-Bindungsstelle
enthält,
wurde als Wirt für
das Two-Hybrid-Screening
verwendet. Die PYK2-N-terminale Domäne (AS 2-245), PYKN-ΔI (AS 2-237),
PYK-NN (AS 2-285) und die Fak (AS 2-412) N-terminale Domäne (AS 2-412)
wurden im Leserahmen mit der LexA DNA-bindenden Domäne fusioniert.
Der Hefestamm, der das LexA-PKYN-Fusionsprotein exprimiert, wurde
mit der humanen Gehirn-cDNA-Bibliothek (Clontech #HL404AB), die
mit der GAL4 transkriptionalen Aktivierungsdomäne fusioniert ist, transfiziert.
Transformanten wurden auf Agarselektionsmedium, dem Uracil (Ura-),
Tryptophan (Trp-), Leucin (Leu-) und Histidin (His-) fehlt, ausplatiert.
Die sich daraus ergebenen Kolonien wurden isoliert und das Wachstum
auf -Ura-Trp-Leu-His-Platten
und auf β-Galaktosidase-Aktivität erneut
getestet. Die Plasmid-DNA wurde aus Kolonien gereinigt, die His+, β-Gal+ waren,
und für
die Retransformation von Hefestämmen,
die heterologe Köder exprimieren,
um die Spezifität
der Wechselwirkung zu bestimmen, verwendet.
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Isolation von cDNA aus
rdgB's
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hrdgB1:
menschliches Gehirn, Substania Nigra cDNA-Bibliothek (λgt10, Clontech HL1179a.) wurde mit
einer 32-p-markierten
Sonde, die von dem Hefe-Prey-Plasmid abstammt, das für GAL10-rdgB1
kodiert, gescreent. Vier unabhängige
Klone wurden isoliert, subkloniert und die Sequenz analysiert. Die
Sequenzanalysen ergaben, dass das 5'-Ende des Gens bei unseren Klonen fehlt.
Daher wurde die humane fötale
Gehirn cDNA-Bibliothek (λgt11,
Clontech HL3003b) mit einer Sonde gescreent, die vom größten 5'-Bereich unseres neuen
cDNA- Contig abstammt.
Sequenzanalysen von sechs unabhängigen
Klonen, die isoliert wurden, wiesen darauf hin, dass alle zum gleichen
Gen, hrdgB1, gehören,
ihnen jedoch das 5'-Ende
des Gens fehlt. Eine spezifisch geprimerte cDNA-Bibliothek wurde
in λZapII
konstruiert, wobei humane fötale
Gehirn Poly(A)+-RNA als
Matrize für
unsere cDNA-Synthese (Stratagene Kit) verwendet wurde. 15 unabhängige Klone
wurden isoliert und ermöglichten
die nachfolgende Isolation der Volllängen cDNA von hrdgB1.
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hrdgB2
und hrdgB3: Ein von einem EST-Fragment (T12574) abstammendes DNA-Fragment
wurde durch PCR aus humaner fötaler
Gehirn-cDNA amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde subkloniert, sequenziert und
als Sonde zum Screenen einer humanen fötalen Gehirn cDNA-Bibliothek
(λgt11,
Clontech H15015b) verwendet. Ein positiver Klon wurde aus diesem
Screen erhalten. Die Sequenzanalysen wiesen darauf hin, dass es
ein teilweiser cDNA-Klon eines neuen Gens ist, der zur humanen rdgB-Familie
gehört.
Das cDNA-Insert dieses Klons (1,8 kb) wurde als Sonde zum wiederholten
Screenen der gleichen cDNA-Bibliothek verwendet. Sieben unabhängige Klone
wurden erhalten, subkloniert und sequenziert. Die Sequenzanalysen
wiesen darauf hin, dass sie alle zum gleichen Gen, hrdgB2, gehören, sich
jedoch vom ursprünglichen
Klon, der aus der gleichen Bibliothek isoliert worden ist, unterscheiden.
Das 3'-Ende unseres
ersten Klons (1,8 kb) wurde als Sonde zum Screenen einer humanen
Herz cDNA-Bibliothek (Clontech 7759-1, 7760-1) verwendet und ermöglichte die
nachfolgende Isolation von zwei alternativ gespleißten Isoformen
von hrdgB3.
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Northern-Blot
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Mehrere
Northern-Blots von humanem Gewebe (Clontech HL11296) wurden unter
hochstringenten Bedingungen mit 32P-markierten cDNA-Fragmenten von hrdgB1
(EcoRI-Eco47III nuc# 245–511),
hrdgB2 (SacI-Eco47III nuc# 1540–2661)
und hrdgB3 Bst-X1 nuc# 912–1472
als Sonde gemäß den Anweisungen
des Herstellers hybridisiert.
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Plasmidkonstrukte Two-Hybrid-Konstrukte:
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Fusion
mit DNA-bindender Domäne
von LexA: Die PCR wurde verwendet, um unterschiedliche Bereiche
der PYK2 und Fak-cDNA wie angegeben zu amplifizieren, die amplifizierten
DNA-Fragmente wurden
in pBTM116 im Leserahmen amplifiziert, um ein Fusionsprotein mit
der DNA-bindenden Domäne
von LexA zu erzeugen.
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Fusion
mit der GAL4 Aktivierungsdomäne:
Die PCR wurde verwendet, um verschiedene Bereiche der hrdgB1, hrdgB2
oder hrdgB3 cDNA wie angegeben zu amplifizieren, die amplifizierten
DNA-Fragmente wurden in pGAD10 (Clontech) im Leserahmen subkloniert,
um ein Fusionsprotein mit der Aktivierungsdomäne von GAL4 zu erzeugen.
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Expressionsvektoren
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Die
Volllängen
cDNA's von hrdgB1,
hrdgB2 und hrdgB3 wurden in pCMP1 stromabwärts vom CMV-Promotor subkloniert.
Ein HA-Epitop-Tag (YPYDVPDYAS) SEQ ID NO: 10 wurde im Leserahmen
mit ihren Carboxy-terminalen Enden fusioniert. Die PYK2-bindende
Domäne
von hrdgB2 (Reste 911–1243)
wurde in pCMV-NEO, das für
ein Initiator-Methionin-Codon gefolgt von einem Myc-Epitop-Tag (EQKLISEEDL)
SEQ ID NO: 1 kodiert, direkt stromaufwärts der Klonierungsstelle subkloniert.
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Antikörper
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Antikörper gegen
rdgB1 wurden in Hasen gezüchtet,
die entweder mit einem synthetischem Peptid, dass den Aminosäuren 965–974 des
hrdgB1 (C-Ter Ab) entspricht, oder mit einem GST-Fusionsprotein, das die Reste 231–374 (N-Ter
Ab) enthält, immunisiert
wurden. Antikörper
gegen hrdgB2 wurden in Hasen gezüchtet,
die mit einem synthetischen Peptid, dass den Aminosäuren 152–163 des
hrdgB2 entspricht, immunisiert wurden. Antikörper gegen hrdgB3 wurden in
Hasen gegen das MBP-Fusionsprotein, das die Reste 7–116 des hrdgB3
enthält,
gezüchtet.
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Beispiel 1:
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Isolation von humanen
rdgB-Proteinen
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Das
Hefe-Two-Hybrid-System wurde verwendet, um Proteine zu identifizieren,
die mit der Amino-terminalen Domäne
des PYK2 wechselwirken. Die N-terminale Domäne des PYK2 wurde mit der DNA-bindenden Domäne von LexA
fusioniert und damit eine humane Gehirn-cDNA-Bibliothek gescreent.
Mit einem His-Synthetase-Gen
(HIS3) unter der Kontrolle von LexA-Operatoren als Reporter, wurden
124 His+-Kolonien aus einem anfänglichen
Screen von einer Million Transformanten identifiziert. Von diesen
waren 24 auch β-Galactosidase
positiv (gal+). Die Retransformation dieser Klone in einem Hefestamm,
der das LexA-PYK2-N-Fusionsprotein exprimiert, wies darauf hin,
dass nur einer mit der PYK2 N-terminalen Domäne (PYK2-N) wechselwirkt. Die
Spezifität
der Wechselwirkung wurde weiterhin durch Transformation dieses Klons
in einem Hefestamm, der heterologe Köder (engl. baits) exprimiert,
bestimmt. Es wurde eine Wechselwirkung in einem Hefestamm detektiert,
der entweder eine PYK-N-terminale Domäne oder eine kürzere Version
des PYK-N, der 48 Aminosäuren
von ihrem C-terminalen Ende fehlen, exprimiert. Es wurde jedoch
keine Wechselwirkung in Stämmen detektiert,
die entweder die PYK-NN (Aminosäuren
2–285)
oder die N-terminale Domäne
des Fak exprimieren, was nahe legt, dass diese Wechselwirkung sehr
spezifisch ist.
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Der
Klon, der eine spezifische Wechselwirkung mit PYK2-N erreichte,
enthielt eine partielle cDNA, die eine nachfolgende Isolation einer
3,1 kb cDNA mit einem offenen Leserahmen von 975 Aminosäuren ermöglichte.
Der kodierende Bereich war von 5' und
3' untranslatierten
Bereichen von 93 bzw. 149 bp flankiert. Der 5' untranslatierte Bereich enthält Dreifachwiederholungen
(CGG), ein Motiv, das in vielen neuropsychiatrischen Erkrankungen
identifiziert worden ist. Dieser Bereich zeigte eine Homologie zum
untranslatierten Bereich des humanen Fragile X Mental Retardation
FMR-1-Gens (66,3 Übereinstimmung)
beim Smith-Waterman Algorithmus.
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Eine
BLAST-Suche mit der Volllängen
cDNA-Sequenz offenbarte, dass dieses Protein zum retinal Degeneration
B-Protein (rdgB)
von Drosophila verwandt ist, und es wurde daher hrdgB1 genannt.
Das rdgB-Protein von Drosophila spielt eine wichtige Rolle im Fotoübertragungsweg.
Die rdgB-Mutante wurde anfänglich durch
Defekte im Komplexauge identifiziert, bei dem rdgB-mutante Fliegen
eine lichtverstärkte
Fotorezeptorzelldegeneration durchlaufen. Das rdgB-Protein von Drosophila
enthält
eine Phosphatidylinositolübertragungsdomäne (PI-TP)
in seinem N-terminalen Abschnitt und eine calciumbindende Stelle
stromabwärts.
Das Protein enthält
sechs hydrophobe Bereiche, die als Transmembrandomänen identifiziert
wurden. Die gleichen hydrophoben Bereiche sind in hrdgB1-Protein
konserviert, jedoch wiesen Analysen der rdgB1-Sequenz als auch des
Drosophila homologen mit verschiedenen Algorithmen (PROSITE) darauf
hin, dass sie keine klassischen Transmembrandomänen sind.
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Eine
ESTs-Datenbanksuche mit der rdgB-Sequenz von Drosophila ermöglichte
die Identifikation von zwei zusätzlichen
humanen Genen, die zur gleichen Gen-Familie gehören. Ein PCR-Fragment, das
von einem EST-Fragment (T12574) abstammt, wurde als Sonde verwendet,
um eine humane Gehirn-cDNA-Bibliothek zu screenen und nachfolgend
das hrdgB2-Gen zu isolieren. Die Volllängen cDNA von hrdgB2 (4186
bp) enthielt einen offenen Leserahmen von 1244 Aminosäuren, der
von einem 5' untranslatierten
Bereich von 174 bp und einem 3' untranslatierten
Bereich von 280 bp flankiert war. Die 257 Aminosäuren am N-terminalen Ende des hrdgB2-Proteins
weisen eine Ähnlichkeit
von 41% zum gesamten humanen PtdInsTP (M73704) auf.
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Die
Volllängen
cDNA von hrdgB3 wurde durch Screenen der humanen Gehirn- und Herz-cDNA-Bibliotheken
erhalten. Ein anfänglicher
Klon von 1,8 kb wurde aus einer humanen Gehirn-Bibliothek mittels des PCR-Produktes,
das vom EST-Fragment (T12574) abstammt, als Sonde isoliert. Ein
cDNA-Fragment, das von unserem 1,8 kb-Klon abstammt, wurde als Sonde
verwendet, um eine humane Herz-cDNA-Bibliothek zu screenen und um
die nachfolgende Isolation des hrdgB3-Gens zu ermöglichen.
Zwei Isoformen, die sich aus alternativem Spleißing ergeben, sind durch cDNA-Klonierung
identifiziert worden, wobei die längste für ein Protein von 1349 Aminosäuren mit
einem vorausgesagten Molekulargewicht von 150 kDa kodiert und ein
kürzeres,
dem die Aminosäuren
50–378
fehlen, mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 120 kDa. Die kodierende
Sequenz wird durch einen 79 bp 5' untranslatierten
Bereich und einen 945 bp 3' untranslatierten Bereich
flankiert. Der N-terminale Bereich von hrdgB3 enthält eine
PI-TP-Domäne,
die bei den alternativ gespleißten
Isoformen fehlt. Ein kurzer Abschnitt von Glycinen und Serinen wurde
innerhalb der Aminosäuren 612–634 (78%
Glycin, 22% Serin) identifiziert.
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Mehrere
Alignment-Analysen des neuen hrdgB1, hrdgB2 und hrdgB3 offenbarten
eine hohe Ähnlichkeit
in ihrer Primärstruktur:
eine PI-TP-Domäne
im Amino-terminalen Bereich, sechs konservierte hydrophobe Bereiche
und einen sehr konservierten C-terminalen Bereich. Anders als bei
den anderen Mitgliedern der rdgB-Familie, enthält hrdgB1 keine PtdInsTP-Domäne, dies
lässt vermuten,
dass unser Klon eine alternativ gespleißte Isoform darstellt.
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Beispiel 2:
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Verteilung von humanen
rdgB's im Gewebe
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Die
mRNA Expressionsniveaus von hrdgB1, hrdgB2 und hrdgB3 wurden durch
Northern-Analysen von verschiedenen humanen Geweben bestimmt. HrdgB1
weist ein sehr beschränktes
Expressionsmuster auf. Es wird im Gehirn, in der Milz und in den
Ovarien als eine Nachricht von etwa 7,5 kb exprimiert. Im Gegensatz dazu
wird hrdgB2 in vielen humanen Geweben als eine Nachricht von 4,5
kb exprimiert. Höchste
Expressionsniveaus wurden im Gehirn, im Herzen, im Thymus und in
den peripheren Blutleukozyten detektiert. HrdgB3 wird sehr stark
im Thymus exprimiert, wird jedoch auch im Herzen, im Gehirn, in
den Ovarien und in den Hoden exprimiert. Zwei Informationseinheiten
wurden für
hrdgB3 detektiert: eine 7,5 kb und eine 9,5 kb Informationseinheit,
die die zwei alternativ gespleißten
Isoformen, die isoliert wurden, darstellen könnten. Die oben diskutierten
Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Mitglieder der rdgB-Genfamilie
sehr unterschiedliche Expressionsmuster haben, wobei hrdgB1 sehr
selten ist, hrdgB2 im Überfluss
auftritt und hrdgB3 ein einzigartiges Expressionsmuster aufweist.
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Beispiel 3:
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Kartieren der minimal
wechselwirkenden Domäne
der rdgB-Proteine
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Um
die PYK2 wechselwirkende Domäne
innerhalb des hrdgB1-Proteins
zu kartieren, wurden eine Reihe von hrdgB1-Deletionsmutanten konstruiert, und es
wurde ihre PYK2-N Wechselwirkungsfähigkeit mittels des Two-Hybrid-Systems
getestet. Unser ursprünglicher
Two-Hybrid-Klon, der die Aminosäuren
627–975
des hrdgB1 enthält,
wurde als Positivkontrolle verwendet. Es wurden Deletionsmutanten
konstruiert und unter all diesen Mutanten wechselwirkte nur hrdgB1-ΔIV, die die
Aminosäuren
627–936
enthält,
mit der PYK2-N-terminalen Domäne.
Die Wechselwirkung dieser Domäne
mit PYK2 wurde des Weiteren durch ein in vitro Bindungsexperiment
bestätigt,
was das Binden von PYK2 an ein immobilisiertes GST-Fusionsprotein,
das den gleichen Abschnitt des hrdgB1 enthält, zeigt. Es wurde jedoch
keine Bindung an das GST-Protein alleine oder zwischen der hrdgB1-ΔIV-Mutante und der fokalen Adhäsionskinase
(focal adhesion kinase) detektiert.
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Da
hrdgB1 eine große
Homologie mit hrdgB2 und hrdgB3 in ihren C-terminalen Domänen teilt,
wurde untersucht, ob diese entsprechenden Bereiche dieser zwei Proteine
mit PYK2 wechselwirken. Zu diesen Zweck wurden die Aminosäuren 911–1244 und
996–1350
von hrdgB2 bzw. hrdgB3 im Leserahmen zur Aktivator-Domäne von Gal-4
fusioniert, und ihre Fähigkeit
mit der PYK2-N zu wechselwirken wurde mit dem Two-Hybrid-System
getestet. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass hrdgB2 stark mit
der PYK2-N-terminalen Domäne
bindet, während
die Wechselwirkung von rdgB3 mit PYK2 sehr schwach ist.
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Um
diese Wechselwirkung in vivo zu bestätigen wurden hrdgB2-HA oder
hrdgB3-HA entweder mit PYK2 oder mit Fak in COS-Zellen coexprimiert.
Nach der Zelllyse wurden hrdgB-Proteine
durch Anti-HA-Antikörper
immunopräzipitiert
und die Gegenwart von PYK2 oder Fak in den Immunokomplexen wurde
durch Immunoblotting mit Antikörpern
gegen PYK2 bzw. Fak bestimmt. Die Ergebnisse weisen darauf hin,
dass sowohl hrdgB2 als auch hrdgB3 mit PYK2 in vivo wechselwirken.
Es wurde jedoch keine Wechselwirkung mit der verwandten Kinase Fak
detektiert, was nahe legt, dass die hrdgB-Proteine stark und spezifisch
mit PYK2 wechselwirken.
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Um
herauszufinden, ob die 'PYK2-bindende
Domäne' der hrdgB's ausreichend ist,
um in vivo eine Verbindung dieser zwei Proteine zu ermöglichen,
wurde eine myc-markierte Version der hrdgB2 'PYK2 bindende Domäne' entweder mit PYK2 oder mit Fak in COS-Zellen
coexprimiert und ihre Wechselwirkung wurde analysiert. Die Ergebnisse
zeigten, dass diese Domäne
mit PYK2 in vivo wechselwirken kann und daher eine separate Domäne in dieser
Familie von Proteinen darstellt.
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Beispiel 4:
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In vivo Verbindung von
rdgB1 und PYK2
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Um
die Wechselwirkung von hrdgB1 und PYK2 in vivo zu bestätigen, wurde
mit Hämaglutinin
markiertes rdgB1 und PYK2 in 293 Zellen coexprimiert. Die Ergebnisse
weisen darauf hin, dass hrdgB1 mit PYK2 stark bindet. Eine Verbindung
von hrdgB1 mit der verwandten Kinase Fak konnte unter den gleichen
experimentellen Bedingungen nicht detektiert werden, was eine starke
und spezifische Wechselwirkung von hrdgB1 und PYK2 nahe legt.
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Um
die Wechselwirkung zwischen hrdgB und PYK2 weiter zu charakterisieren,
wurde das Gehirn einer ausgewachsenen Ratte als Quelle für diese
zwei Proteine verwendet. Wenn hrdgB1 unter Verwendung spezifischer
Antikörper
gegen hrdgB1 aus einem Rattengehirnhomogenat immunopräzipitiert
worden ist, konnte PYK2 im Immunokomplex detektiert werden. Jedoch
war die Stöchiometrie
der PYK2/rdgB1-Wechselwirkung nicht so hoch, wie es in transfizierten
Zellen gezeigt worden ist. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass PYK2
und rdgb1 in vivo unter physiologischen Bedingungen wechselwirken
und diese Wechselwirkung eine wichtige regulatorische Funktion im
Gehirn haben könnte.
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Andere
Ausführungsformen
werden von den folgenden Ansprüchen
umfasst.
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