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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Molekularbiologie und insbesondere
Nukleinsäuren
und die von diesen kodierten Proteine. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodieren
neue Ataxin-2-bindende Proteine. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren
zur Herstellung und Verwendung solcher Nukleinsäuren und Proteine, beispielsweise
um bestimmte Erkrankungen zu behandeln.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Zahlreiche
Erkrankungen, die durch einen abnormalen oder unerwünschten
Zelltod oder ein abnormales oder unerwünschtes Zellwachstum gekennzeichnet
sind, sind das Ergebnis einer abnormalen Gen-Expression oder Gen-Aktivität. Zelluläre degenerative
und hyperproliferative Störungen,
wie beispielsweise die Alzheimer-Erkrankung und Krebs sind zwei
besondere Beispiele. Obwohl einige Gene identifiziert worden sind, die
zu degenerativen und hyperproliferativen Störungen beitragen, werden die
Signal-Transduktionswege, welche die Entwicklung solcher Störungen vermitteln,
gegenwärtig
nicht hinlänglich
verstanden.
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Die
spinocerebellare Ataxie des Typs 2 ist ein Beispiel für eine Gruppe
von klinisch ähnlichen,
erblichen, degenerativen Störungen
mit spätem
Beginn, die das Gehirn und das Zentralnervensystem betreffen. Ein
einzelnes auf dem Chromosom 12 lokalisiertes Gen SCA2 ist mit der
Entwicklung von spinocerebellarer Ataxie des Typs 2 in Verbindung
gebracht worden; SCA2 kodiert Ataxin-2, ein Protein von 140 kDa,
dessen Funktion bislang unbekannt ist. Klinisch ähnliche neurodegenerative Störungen umfassen
beispielsweise die spinocerebellaren Ataxien des Typs 1 und 6, die
spinobulbare muskuläre
Atrophie, die Huntington-Erkrankung und die Machado-Joseph-Erkrankung
(Trottier et al., Nature 378: 403–406 (1995)). Obwohl die Entwicklung dieser ähnlichen
Störungen
durch verschiedene Gene vermittelt wird, löst eine gemeinsame genetische
Veränderung
den Beginn der Erkrankungen aus. Im Falle der spinocerebellaren
Ataxie des Typs 2 zeigen betroffene Individuen beispielsweise eine
Ausdehnung (expansion) des CAG-Trinukleotids im SCA2 sowie eine
entsprechende Zunahme der Anzahl von Glutamin-Resten im kodierten
Ataxin-2-Protein (Pulst et al., Nat. Genet. 14: 269–276 (1996)). Üblicherweise
weisen Betroffene eine Polyglutamin-Sequenz von etwa 35–39 Resten auf,
wohingegen normale Individuen über
etwa 22 zusammenhängende
Glutamin-Reste im Ataxin-2 verfügen. In ähnlicher
Weise korreliert die Ausdehnung von CAG-Wiederholungen in Genen,
die mit den spinocerebellaren Ataxien des Typs 1 und 6, der spinobulbaren
muskulären
Atrophie, der Huntington-Erkrankung sowie der Machado-Joseph-Erkrankung
in Zusammenhang stehen, mit der Entwicklung dieser Störungen.
Aufgrund dieser gemeinsamen genetischen Veränderung werden die Erkrankungen
gemeinsam als Glutamin-Wiederholungs-Störungen (glutamine
repeat disorders) bezeichnet.
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Trotz
dieser genetischen Erkenntnisse wird die Funktion der Gene, wie
beispielsweise SCA2 im Allgemeinen, sowie die Rolle der Ausdehnung
der CAG-Wiederholung und der entsprechenden Ausdehnung der Glutamin-Sequenz
bei der Entwicklung von degenerativen Störungen, wie beispielsweise
der spinocerebellaren Ataxie des Typs 2 im Besonderen, nicht verstanden.
Die Glutamin-Wiederholungs-Sequenz von SCA3 liegt bei normalen Individuen
im gleichen Größenbereich
wie die der Glutamin-Wiederholungs-Sequenz
von SCA2 in Individuen, die von spinocerebellarer Ataxie des Typs
2 betroffen sind. Gleichermaßen
sind die molekularen Komponenten, die die zelluläre Degeneration regulieren
oder vermitteln, sowie die Mechanismen, durch die diese am Signal-Transduktionsweg
teilnehmen, nicht verstanden.
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Es
besteht somit eine Notwendigkeit, die molekularen Komponenten, die
an diesem Signal-Transduktionsweg teilnehmen, wie beispielsweise
Proteine, welche in vivo an Ataxin-2 binden, zu identifizieren und
zu charakterisieren. Ferner besteht ein Bedürfnis, die Nukleinsäure- und
Aminosäuresequenzen
der jeweiligen Gene und Genprodukte, ihre Aktivitäten und
die funktionalen Domänen
solcher bindenden Proteine zu identifizieren. Soweit solche Moleküle identifiziert
werden, können
sie die Basis für
die Entwicklung von diagnostischen Protokollen oder klinischen Therapien
bilden, die für
die Diagnose oder Behandlung von Störungen nützlich sind, welche durch zelluläre Degeneration
oder Hyperproliferation gekennzeichnet sind. Die vorliegende Erfindung
erfüllt
dieses Bedürfnis
und stellt darüber
hinaus weitere Vorteile bereit.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden neue isolierte Nukleinsäuren bereitgestellt, die für Ataxin-2-bindende
Proteine (A2BPs) oder funktionale Fragmente derselben kodieren.
Die Erfindung stellt ferner Vektoren bereit, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfassen,
sowie rekombinante Zellen, die mit diesen transformiert sind, Antisense-Nukleinsäuren zu
diesen sowie damit in Verbindung stehende Zusammensetzungen. Ferner
werden Oligonukleotide bereitgestellt, die in der Lage sind, mit
den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zu
hybridisieren, wobei solche Oligonukleotide ferner markiert sind.
Die vorliegend beschriebenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind
als Sonden für
die Untersuchung einer Menge von A2BP-mRNA in einer Probe sowie
zur Identifizierung von Nukleinsäuren,
die ein A2BP kodieren, nützlich.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind
ferner zur Expression in Zellen zum Zwecke der Identifizierung von
Agonisten oder Antagonisten der A2BP-Funktion nützlich.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden ferner neue isolierte Ataxin-2-bindende Proteine
(A2BPs) bereitgestellt, die die Fä higkeit haben, Ataxin-2 zu
binden, oder die Fähigkeit
haben, an ein Nukleinsäuremolekül zu binden.
Verfahren zur Expression von A2BP oder funktionalen Fragmenten derselben
werden ebenfalls bereitgestellt. Proteine und Fragmente derselben
sind nützlich
in Bioassays, als therapeutische Zusammensetzungen sowie als Immunogene
zur Herstellung von Anti-A2BP-Antikörpern. Ferner
werden transgene nicht-humane Säugetiere
bereitgestellt, die das erfindungsgemäße A2BP oder Mutanten desselben
exprimieren. Transgene nicht-humane Säugetiere, die kein endogenes
A2BP exprimieren, werden ebenfalls bereitgestellt.
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Antikörper mit
spezifischer Reaktivität
gegen A2BP werden ebenfalls bereitgestellt. Diese Antikörper sind
nützlich
zur Detektion von A2BP in einer Probe in diagnostischen Assays oder
zur Identifizierung von Genen, die Proteine mit ähnlicher Immunreaktivität gegen
A2BP kodieren. Die erfindungsgemäßen Antikörper können ferner
verwendet werden, um ein A2BP aus einer biologischen Flüssigkeit,
Geweben, Zellen o.ä.
zu reinigen.
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Verfahren
zur Identifizierung von A2BP-bindenden Proteinen werden ebenfalls
bereitgestellt. Ein Verfahren umfasst das Inkontaktbringen einer
Probe, die ein A2BP-bindendes Protein umfasst, und die Identifizierung
des daran bindenden Proteins. Ferner werden Verfahren zur Identifizierung
eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt,
das an A2BP bindet. Ein Verfahren umfasst das Inkontaktbringen einer
Probe, die Nukleinsäuren enthält, und
die Identifizierung des daran bindenden Nukleinsäuremoleküls.
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Verfahren
zum Modulieren der Aktivität
eines Proteins oder einer RNA, das/die A2BP bindet, werden ebenfalls
bereitgestellt. Ein Verfahren umfasst das Inkontaktbringen eines
A2BP-bindenden Proteins
oder Nukleinsäuremoleküls mit einem
im We sentlichen reinen A2BP oder einem funktionalen Fragment desselben.
Ein Verfahren zum Modulieren der Aktivität von Ataxin-2 wird ebenfalls
bereitgestellt.
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Verfahren
zur Behandlung einer degenerativen oder hyperproliferativen Störung werden
ebenfalls bereitgestellt. Ein Verfahren der Erfindung verwendet
eine Antisense-A2BP-Nukleinsäure in einer
Menge, die wirksam ist, um die Expression eines humanen A2BP zu
inhibieren. Ein Verfahren verwendet A2BP oder ein funktionales Fragment
desselben oder Agonisten oder Antagonisten zu diesen, die an ein
Subjekt verabreicht werden.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
ein Diagramm der Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit
und -Identität
zwischen einem erfindungsgemäßen A2BP
und dem Nematoden-Homolog CE04910.
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2 zeigt
das Ergebnis der in Beispiel 2 beschriebenen Polyglutamin-Ausdehnungs-Untersuchungen.
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3 zeigt
eine Kartierung der in Beispiel 2 beschriebenen Ataxin-2-Deletionskonstrukte.
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4 zeigt
die Ergebnisse des in Beispiel 4 beschriebenen Northern-Blot-Assays.
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5 zeigt
die Ergebnisse des in Beispiel 5 beschriebenen Co-Immunpräzipitations-Assays.
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6 zeigt
die Wirkung der Injektion von RNAi des Ataxin-2 auf frühe Embryos
von C. elegans (n = 36 Würmer).
Die Eier pro Wurm (Ordinate) sind als Funktion der Zeit in Stunden
(h) nach Injektion (Abszisse) gezeigt. Eine RNA-Interferenz führt zu einer
frühzeitigen
embryonischen Letalität.
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7 zeigt
die Wirkung der Injektion von RNAi des Ataxin-2-bindenden Proteins auf frühe Embryos von
C. elegans (n = 40 Würmer).
Die Eier pro Wurm (Ordinate) sind als Funktion der Zeit in Stunden
(h) nach Injektion (Abszisse) gezeigt. Eine RNA-Interferenz führt zu einer
frühzeitigen
embryonischen Letalität.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden isolierte Nukleinsäuren bereitgestellt, die neue
Ataxin-2-bindende Proteine (A2BPs) aus Säugetieren sowie funktionale
Fragmente derselben kodieren. Wie vorliegende verwendet sind erfindungsgemäße A2BPs
diejenigen, die die Fähigkeit
haben (vorzugsweise in vivo) an mindestens eine Form eines von einem
SCA2-Gen kodierten Ataxin-2-Proteins, an Ataxin-2-ähnliche-Proteine
oder an ein Nukleinsäuremolekül zu binden.
Der Begriff "A2BP" bezeichnet ein im
Wesentlichen reines, natives A2BP oder rekombinant hergestellte
Proteine, einschließlich
natürlich
vorkommender allelischer Varianten derselben, wie beispielsweise
mRNA, die durch alternatives Spleißen des primären Transkripts
erzeugt wurde, Fragmente derselben, welche mindestens eine native
biologische Aktivität
beibehalten haben, einschließlich
einer Fähigkeit,
an Ataxin-2 zu binden, einer Fähigkeit,
an ein Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise
eine RNA, zu binden, oder die Immunogenität aufweisen. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
sind die vorliegend angesprochenen A2BPs diejenigen Polypeptide,
die spezifisch durch einen Antikörper
erkannt werden, welcher ebenfalls spezifisch ein A2BP (vorzugsweise
humanes) erkennt, einschließlich
einer Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 2 aufgeführt
ist. Die gemäß der Erfindung
iso lierten A2BPs sind frei von zellulären Bestandteilen oder Kontaminationen,
die normalerweise mit einer nativen in vivo-Umgebung assoziiert sind.
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Ataxin-2
ist mit der Entwicklung von spinocerebellarer Ataxie des Typs 2
assoziiert; eine Mutation von Ataxin-2 durch Ausdehnung einer Polyglutamin-Wiederholungs-Sequenz
führt zur
Entwicklung eines neurodegenerativen Phänotyps. Aus diesem Grund wird
angenommen, dass andere, dem Ataxin-2 ähnliche Glutamin-Wiederholungs-Gene
(z.B. das Gen der Machado-Joseph-Erkrankung,
das Gen der Huntington-Erkrankung u.ä.) eine Funktion bei dem die
Zelldegeneration regulierenden Signal-Transduktionsweg aufweisen.
Die Bindung von A2BP mit Ataxin-2 verweist darauf, dass A2BP ein
Bestandteil dieses Signal-Transduktionswegs ist
und folglich ein Bestandteil der Regulation der Zelldegeneration
ist.
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Darüber hinaus
ist durch Identifikation der erfindungsgemäßen, bindenden Proteine von
Ataxin-2 entdeckt worden, dass Ataxin-2 eine Rolle. bei der Gen-Regulation
zu haben scheint. Beispielsweise binden die erfindungsgemäßen A2BPs,
die SEQ ID NO: 2 umfassen, an RNA, wodurch für die Regulation der Genexpression
auf den selektiven Transport von RNA abgestellt wird. Ferner spielt
die Bindung von A2BPs an RNA eine wichtige Rolle bei der Kontrolle
der Genexpression. A2BP1 beispielsweise ist ein Gen, das sehr früh in der
Embryonalentwicklung durch selektiven Transport von spezifischen
RNAs agiert, was durch die RNA-bindenden Domänen in A2BP1
(siehe Beispiel 6) vermittelt wird. Dieser neue Prozess ist für die Funktionstüchtigkeit
von adulten Nervenzellen und für
Prozesse wie Lernen und Gedächtnis
von Bedeutung.
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Die
vorliegend beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können beispielsweise nützlich sein,
um erfindungsgemäße Proteine
herzustellen, wenn solche Nukleinsäuren in eine Vielzahl von dem
Fachmann bekannten Expressionssystemen eingebracht werden. Darüber hinaus
können
die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder
Fragmente derselben mit einer detektierbaren Markierung markiert
werden und beispielsweise als Hybridisierungs-Sonden für die Untersuchung
des Vorhandenseins oder der Menge eines erfindungsgemäßen A2BP-Gens
oder einer A2BP-mRNA in einer gegebenen Probe verwendet werden.
Die vorliegend beschriebenen Nukleinsäuremoleküle oder Fragmente derselben
sind ferner auch als Primer oder Matrizen (templates) in einer PCR-Reaktion
zur Amplifikation von Genen nützlich,
die die vorliegend beschriebenen erfindungsgemäßen Proteine kodieren.
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Der
Begriff "Nukleinsäure", der auch als Polynukleotid,
Oligonukleotid oder Primer bezeichnet wird, umfasst Ribonukleinsäure (RNA)
und Desoxyribonukleinsäure
(DNA), die doppelsträngig
oder einzelsträngig sein
können.
RNA kann ungespleißt
oder gespleißt
sein (d.h. mRNA), tRNA oder rRNA, und die DNA kann komplementäre DNA (cDNA)
oder genomische DNA sein, wie beispielsweise eine Nukleinsäure, die
ein A2BP-Polypeptid kodiert, oder ein Antisense-Molekül zu dieser.
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Die
Verwendung der Begriffe "isoliert" oder "gereinigt" als Modifikationsmittel
von DNA, RNA, Polypeptiden oder Proteinen bedeutet im Rahmen der
vorliegenden Beschreibung und der vorliegenden Ansprüche, dass
die so bezeichneten DNA, RNA, Polypeptide oder Proteine in einer
solchen Form durch menschliche Einwirkung hergestellt worden sind
und folglich von ihrer nativen zellulären in vivo-Umgebung getrennt
sind und im Wesentlichen frei von anderen Arten von Nukleinsäure oder
Protein vorliegen. Als Folge dieser menschlichen Intervention sind
die rekombinanten DNAs, RNAs, Polypeptide oder Proteine der Erfindung
auf eine der vorliegend beschriebenen Arten nützlich, während die DNAs, RNAs, Polypeptide
oder Proteine in ihrer natürlichen
Erscheinungsform dies nicht sind.
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Ein
Mittel zur Isolierung einer Nukleinsäure, die ein A2BP-Polypeptid kodiert,
ist das Durchsuchen (Screening) einer Nukleinsäure-Bibliothek mit einer natürlichen
oder einer künstlich
erstellten Sonde (z.B. DNA, Antikörper, und Ähnlichem) unter Verwendung
von Verfahren, die im Stand der Technik hinlänglich bekannt sind (siehe
beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). DNA-Sonden,
die von einem A2BP-Gen aus einem Säugetier abgeleitet wurden,
sind für
diesen Zweck besonders nützlich.
DNA- und cDNA-Moleküle,
die A2BP-Polypeptide kodieren, können
verwendet werden, um komplementäre
genomische DNA, cDNA oder RNA aus Säugetieren (z.B. aus Mensch, Affe,
Maus, Ratte, Kaninchen, Schwein, Kuh und Ähnlichem) oder aus anderen
tierischen Quellen zu erhalten, oder, um verwandte cDNA oder genomische
Klone durch Screening von cDNA-Bibliotheken oder genomischen Bibliotheken
mittels der im Folgenden näher
beschriebenen Verfahren zu isolieren. Beispiele für solche Nukleinsäuren sind
RNA, cDNA oder isolierte genomische DNA, die ein A2BP-Polypeptid
kodieren. Solche Nukleinsäuren
umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Nukleinsäuren, die
im Wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz wie die in SEQ ID NO:
1 aufgeführte
umfassen.
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Wie
vorliegend verwendet bezeichnet "Säugetier" eine Vielzahl von
Arten, von denen das erfindungsgemäße A2BP abgeleitet ist, z.B.
humanes, Ratten-, Maus-, Kaninchen-, Affen-, Pavian-, Rinder-, Schweine-, Schaf-,
Hunde-, Katzen-A2BP und Ähnliche.
Ein vorliegend bevorzugtes A2BP ist humanes A2BP.
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Gemäß einer
Ausführungsform
umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren im
Wesentlichen dieselbe Nukleinsäuresequenz
wie die in SEQ ID NO: 1 aufgeführte.
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform umfassen
die A2BP kodierenden, erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle im Wesentlichen
dieselbe Nukleinsäurese quenz,
wie die Nukleotide 1987–1979
von SEQ ID NO: 1. Bevorzugte Nukleinsäuremolekül-cDNAs, die die erfindungsgemäßen Proteine
kodieren, umfassen dieselbe Nukleotidsequenz wie die Nukleotide 1987–1979 von
SEQ ID NO: 1.
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Wie
vorliegend verwendet, bedeutet "im
Wesentlichen dieselbe" in
Bezug auf eine Nukleotidsequenz eine Nukleinsäure mit ausreichender Identität zu dem
Referenz-Polynukleotid, sodass es unter moderat stringenten Hybridisierungsbedingungen
an das Referenz-Nukleotid binden wird (z.B. Bedingungen, unter denen Polynukleinsäure-Hybride
stabil sind). Gemäß einer
Ausführungsform
kodiert eine DNA-Sequenz mit einer Nukleotidsequenz, die im Wesentlichen
der Referenz-Nukleotidsequenz gleicht, im Wesentlichen dieselbe
Aminosäuresequenz
wie die in SEQ ID NO: 1 aufgeführte.
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
weist eine DNA-Sequenz mit im Wesentlichen derselben Nukleotidsequenz
wie die Referenz-Nukleotidsequenz mindestens 60% Identität in Bezug
auf die Referenz-Nukleotidsequenz auf. DNA mit mindestens 70%, vorzugsweise mit
mindestens 90% und darüber
hinaus bevorzugt mit mindestens 95% Identität zu der Referenz-Nukleinsäure ist
bevorzugt.
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Diese
Erfindung umfasst darüber
hinaus Nukleinsäuren,
die von den in SEQ ID NO: 1 aufgeführten Nukleinsäuren abweichen,
jedoch denselben Phänotyp
aufweisen. Solche Nukleinsäuren
unterscheiden sich in Bezug auf ihre Nukleotidsequenz, sind jedoch
verwandt und werden von Fachmann als "funktional äquivalente Nukleinsäuren" angesehen. Daher
umfasst der Begriff "funktional äquivalent" in Bezug auf Nukleinsäuremoleküle Nukleinsäuren mit
leichten oder folgenlosen (non-consequential) Sequenzabweichungen,
solange diese im Wesentlichen in derselben Weise funktionieren,
um im Wesentlichen dasselbe (dieselben) Proteinprodukt(e) zu bilden
wie die vorliegend offenbarten Nukleinsäuren. Beispielsweise kodieren
funktional äquivalente
Nukleinsäuremoleküle insbesondere
Polypeptide, die dieselben sind wie diejenigen, die durch die vorliegend
offenbarten Nukleinsäuren
kodiert werden, oder Nukleinsäuren,
die beispielsweise konservative Aminosäure-Austausche kodieren. Konservative
Austausche umfassen beispielsweise den Austausch eines nicht-polaren
Restes gegen einen anderen nicht-polaren Rest, oder den Austausch
eines geladenen Restes gegen einen geladenen Rest. Funktional äquivalente
Nukleinsäuremoleküle umfassen
ferner geringfügige
Modifikationen, die vom Fachmann als solche angesehen werden, die
die Tertiärstruktur
des kodierten Proteins im Wesentlichen nicht verändern, wie beispielsweise interne
Deletionen oder Trunkierungen, welche beispielsweise geringfügige Deletionen
am Carboxy- oder Aminoterminus erzeugen.
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Darüber hinaus
werden Nukleinsäuren
bereitgestellt, die A2BP-Polypeptide
kodieren, welche aufgrund der Degeneration des genetischen Codes
nicht notwendigerweise an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren hybridisieren.
Dennoch sind solche Nukleinsäuren
funktionale Äquivalente,
da sie im Wesentlichen dasselbe (dieselben) Proteinprodukt(e) erzeugen.
Bevorzugte Nukleinsäuren,
die die erfindungsgemäßen A2BPs
kodieren, bestehen aus Nukleotiden, die im Wesentlichen dieselbe
Aminosäuresequenz
kodieren wie in SEQ ID NO: 1 aufgeführte.
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Eine
beispielhafte Nukleinsäure,
die ein erfindungsgemäßes A2BP
kodiert, kann somit ausgewählt sein
aus:
- (a) DNA, welche die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte Aminosäuresequenz
kodiert,
- (b) DNA, welche mit der DNA von (a) unter moderat stringenten
Bedingungen hybridisiert, wobei die DNA biologisch aktives A2BP
kodiert, oder
- (c) DNA, welche entweder im Hinblick auf das obige (a) oder
(b) degeneriert ist, wobei die DNA biologisch aktives A2BP kodiert.
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Hybridisierung
bezeichnet die Bindung von Nukleinsäuremolekülen, die in Bezug zueinander
eine Komplementärität aufweisen,
mittels Wasserstoff-Bindungen, die den Bindungen ähnlich sind,
welche natürlicherweise
in chromosomaler DNA (d.h. Sense:Antisense-Stränge oder Sonde:Ziel-DNA) vorkommen.
Das Ausmaß der
Stringenz, das angewendet wird, um eine gegebene Nukleinsäuresonde
mit Ziel-DNA zu hybridisieren, sodass das Hybrid stabil ist, kann
vom Fachmann problemlos bestimmt und (falls gewünscht) verändert werden.
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Wie
vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "stringente Hybridisierung" Bedingungen, unter
denen Polynukleinsäure-Hybride stabil sind.
Wie dem Fachmann bekannt ist, spiegelt sich die Stabilität eines
Hybrids in der Schmelztemperatur (Tm) von
Hybriden wieder, die durch den G:C-Gehalt der Sequenz, die Sequenzlänge und
andere im Stand der Technik bekannte physikalische Eigenschaften
und Hybridisierungsbedingungen bestimmt wird (Sambrook et al., siehe
oben, 1989). Beispielsweise beeinflusst die Menge der vorhandenen
Natrium-Ionen die Stabilität
eines Hybrids. Üblicherweise
wird die Hybridisierung oder der Bindungsschritt unter Bedingungen
von geringerer Stringenz durchgeführt, gefolgt von Waschvorgängen von
veränderter,
jedoch höherer
Stringenz. Der Verweis auf das Ausmaß der Hybridisierungs-Stringenz
betrifft solche Waschbedingungen.
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Der
Ausdruck "moderat
stringente Hybridisierung" bezieht
sich auf Bedingungen, die es Ziel-DNA erlauben, an eine komplementäre Nukleinsäure zu binden,
welche etwa 60% Identität,
vorzugsweise etwa 75% Identität,
stärker
bevorzugt etwa 85% Identität
zu der Ziel-DNA aufweist; wobei mehr als etwa 90% Identität zur Ziel-DNA
besonders bevorzugt sind. Moderat stringente Bedingungen sind vorzugsweise
Bedingungen, die beispielsweise einer Hybridisierung in 50% Formamid,
5 × Denhardt-Lösung, 5 × SSPE,
0,2% SDS bei 42°C
gefolgt von Waschen in 0,2 × SSPE,
0,2% SDS bei 65°C
entsprechen.
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Der
Ausdruck "Hybridisierung
von hoher Stringenz" bezeichnet
Bedingungen, die eine Hybridisierung von nur denjenigen Nukleinsäuresequenzen
erlauben, die in 0,018 M NaCl bei 65°C stabile Hybride bilden (d.h. wenn
ein Hybrid in 0,018 M NaCl bei 65°C
nicht stabil ist, wird es unter den vorliegend vorgeschlagenen Bedingungen
hoher Stringenz nicht stabil sein). Bedingungen von hoher Stringenz
können
beispielsweise durch Hybridisierung in 50% Formamid, 5 × Denhardt-Lösung, 5 × SSPE,
0,2% SDS bei 42°C
gefolgt von Waschen in 0,1 × SSPE
und 0,1% SDS bei 65°C
geschaffen werden.
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Der
Ausdruck "Hybridisierung
von geringer Stringenz" bezeichnet
Bedingungen, die einer Hybridisierung in 10% Formamid, 5 × Denhardt-Lösung, 6 × SSPE,
0,2% SDS bei 42°C
gefolgt von Waschen in 1 × SSPE,
0,2% SDS bei 50°C
entsprechen.
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Denhardt-Lösung und
SSPE sind dem Fachmann hinlänglich
bekannt, wie auch andere geeignete Hybridisierungs- und Wasch-Puffer (Sambrook
et al., siehe oben, 1989).
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Wie
vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "degeneriert" Triplet-Codons, die in mindestens einem
Nukleotid von einer Referenz-Nukleinsäure abweichen, jedoch dieselbe
Aminosäuresequenz
wie die Referenz-Nukleinsäure
kodieren. Beispielsweise sind Codons, die durch die Triplets "UCU", "UCC", "UCA", und "UCG" in. Bezug zueinander
degeneriert, da alle vier Codons dieselbe Aminosäure Serin kodieren. Nukleinsäuren, die
in Bezug auf die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren degeneriert
sind, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung ausdrücklich vorgeschlagen.
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Bevorzugte
Nukleinsäuren
kodieren ein erfindungsgemäßes Polypeptid
(erfindungsgemäße Polypeptide),
das (die) unter moderat stringenten, vorzugsweise unter Bedingungen
von hoher Stringenz mit im Wesentlichen der gesamten Sequenz oder
wesentlichen Teilen (d.h. üblicherweise
mindestens 15 Nukleotiden) der in SEQ ID NO: 1 aufgeführten Nukleinsäuresequenz
mit den Nukleotiden 987–1979
hybridisiert (hybridisieren).
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können durch
eine Vielzahl von im Stand der Technik hinlänglich bekannten Verfahren
hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung der vorliegend
beschriebenen Verfahren, wie beispielsweise PCR-Amplifikation unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern.
aus verschiedenen Bereichen von SEQ ID NO: 1. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren können synthetisch
durch kommerzielle Anbieter hergestellt werden, wobei solche Nukleinsäuren zusätzlich modifiziert
oder mit Nukleotid-Analoga substituiert sein können.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung können
wahlweise markierte A2BP-kodierende cDNAs oder Fragmente derselben
als Sonden verwendet werden, um eine Bibliothek (Bibliotheken),
wie beispielsweise (eine) cDNA-, genomische, EST-Bibliothek(en), auf zusätzliche
Nukleinsäuresequenzen
zu untersuchen, die neue Säugetier-A2BPs
kodieren. Solche Bibliotheken sind kommerziell verfügbar oder
können
unter Verwendung von im Stand der Technik hinlänglich bekannten Verfahren
konstruiert werden. Das Screening einer Bibliothek mit einer DNA-Sonde wird zunächst unter
Bedingungen von geringer Stringenz durchgeführt, die eine Temperatur von
weniger als 42°C,
eine Formamid-Konzentration von weniger als 50% und eine moderate
bis geringe Salzkonzentration umfassen.
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Gegenwärtig bevorzugte
Screening-Bedingungen bezüglich
der Nukleinsäurehybridisierung
umfassen eine Temperatur von etwa 37°C, eine Formamid-Konzentration
von etwa 20% und eine Salzkonzentration von 5 × Standard Salz-Citrat-Lösung (standard
saline citrate, SSC; 20 × SSC
enthält
3 M Natriumchlorid, 0,3 M Natrium-Citrat, pH 7,0). Solche Bedingungen
erlauben die Identifizierung von Sequenzen mit einem wesentlichen
Grad an Ähnlichkeit
zu der Sequenz einer DNA-Sonde, wobei keine perfekte Homologie erforderlich
ist. Der Begriff "wesentliche Ähnlichkeit" bezeichnet Nukleotidsequenzen,
die eine Homologie von mindestens etwa 50% gemeinsam haben. Vorzugsweise
werden Hybridisierungsbedingungen ausgewählt werden, die die Identifizierung
von Sequenzen mit mindestens etwa 70% Homologie zu der Sonde erlauben,
während
Sequenzen mit geringerer Homologie zu der Sonde unterschieden werden.
Als Ergebnis können
Nukleinsäuren
erhalten werden, die im Wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz aufweisen
wie die in SEQ ID NO: 1 aufgeführte.
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Wie
vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "Sonde" ein Molekül, wie beispielsweise eine
Nukleinsäure
(z.B. eine DNA) oder ein Protein (z.B. ein Antikörper), die/das zum Identifizieren,
Isolieren oder Quantifizieren eines Gens, eines Genprodukts oder
eines Proteins verwendet werden kann. Eine Nukleinsäure-Sonde
ist im Allgemeinen beispielsweise eine einzelsträngige DNA oder RNA, oder ein
Analog derselben, mit einer Nukleotidsequenz aus mindestens 14,
mindestens 20, mindestens 50, mindestens 100, mindestens 200, mindestens
300, mindestens 400 oder mindestens 500 zusammenhängenden
Basen, die beliebigen in SEQ ID NO: 1 aufgeführten zusammenhängenden
Basen entsprechen oder komplementär zu diesen sind. Bevorzugte Bereiche,
aus denen eine solche DNA-Sonde konstruiert werden soll, umfassen
5'- oder 3'-kodierende Bereiche
von SEQ ID NO: 1. Sofern es erwünscht
ist, kann der gesamte kodierende Bereich der cDNA eines erfindungsgemäßen A2BP
oder die gesamte der SEQ ID NO: 1 entsprechende Sequenz als Sonde
verwendet werden. Die Sonden können
wie nachfolgend beschrieben nach im Stand der Technik bekannten
Verfahren markiert werden, und sie können in verschiedenen kommerziell
verfügbaren
diagnostischen Kits wie nachfolgend beschrieben verwendet werden.
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Wie
vorliegend verwendet bezeichnen die Begriffe "Markierung" und "nachweisendes Mittel" in ihren verschiedenen grammatikalischen
Formen einzelne Atome und Moleküle,
die entweder direkt oder indirekt an der Erzeugung eines nachweisbaren
Signals beteiligt sind. Jede Markierung oder jedes nachweisende
Mittel kann mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sonden,
den exprimierten Proteinen, Polypeptidfragmenten oder Antikörper-Molekülen verbunden
sein. Diese Atome oder Moleküle
können
allein oder in Verbindung mit zusätzlichen Reagenzien verwendet
werden. Gemäß einer
Ausführungsform
ist die nachweisende Gruppe ein Enzym, wie beispielsweise Meerrettich-Peroxidase
(HRP), Glucose-Oxidase und Ähnliches.
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
werden radioaktive Elemente, wie beispielsweise 32P, 33P, 35S, 125I und Ähnliches,
als Markierungen verwendet. Zusätzliche
Arten von Markierungen sind im Bereich der experimentellen und klinisch-diagnostischen
Chemie hinlänglich
bekannt.
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Die
Markierungsmittel können
fluoreszente Markierungsmittel sein, die ohne Denaturierung chemisch an
Antikörper
oder Antigene binden, wobei ein Fluorochrom (Farbstoff) gebildet
wird, und sie können
nützlich sein,
um einen immunfluoreszenten Tracer zu bilden. Die Beschreibung von
immunfluoreszenten analytischen Methoden kann in DeLuca, "Immunofluorescence
Analysis", in Antibody
As a Tool, Marchalonis et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Ltd., Seiten
189–231
(1982), gefunden werden.
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Das
Anbinden einer Markierung an ein Substrat, wie Beispielsweise Nukleinsäuren, Antikörper, Polypeptide
und Proteine, ist im Stand der Technik hinlänglich bekannt. Beispielsweise
kann ein erfindungsgemäßer Antikörper unmittelbar
durch Iodierung markiert werden, oder er kann durch metabolischen
Einbau von radiomarkierten Aminosäuren markiert werden, die im
Kulturme dium bereitgestellt werden (vgl. beispielsweise Galfre et
al., Meth. Enzymol. 73: 3–46
(1981)). Herkömmliche
Mittel der Protein-Konjugation oder -Kopplung durch aktivierte funktionale
Gruppen sind insbesondere verwendbar (vgl. Aurameas et al., Scand.
J. Immunol. Vol. 8, Ergänzungsband
7: 7–23
(1978); Rodwell et al., Biotech. 3: 889–894 (1984) und US-Patent Nr. 4,493,795).
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Im
Einklang mit einer weiteren Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden isolierte Säugetier-Ataxin-2-bindende Proteine
(A2BPs) und funktionale Fragmente derselben bereitgestellt. Der
Begriff "A2BP" betrifft im Wesentlichen
reine, native A2BP sowie natürlich
vorkommende, allelische Varianten derselben. oder rekombinant produzierte
Proteine, wie beispielsweise diejenigen, die durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren hergestellt
wurden. A2BP umfasst ferner Fragmente derselben, die mindestens
eine native biologische Aktivität
beibehalten haben, wie beispielsweise die Fähigkeit, an ein Ataxin-2 zu
binden, die Fähigkeit
an ein Nukleinsäuremolekül (wie beispielsweise
RNA) zu binden, oder die eine Immunogenität aufweisen. Erfindungsgemäße A2BPs
umfassen zusätzlich
A2BPs und funktionale Fragmente derselben, die in einer größeren Aminosäuresequenz
enthalten sind.
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Gemäß einer
Ausführungsform
sind die erfindungsgemäßen A2BPs
durch den Besitz der Fähigkeit charakterisiert,
an mindestens eine Form des vom SCA2-Gen kodierten Ataxin-2-Proteins
zu binden. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
sind die vorliegend bezeichneten A2BPs diejenigen Polypeptide, die
spezifisch von einem Antikörper
erkannt werden, welcher ebenfalls spezifisch ein A2BP (vorzugsweise
humanes) erkennt, einschließlich
der in SEQ ID NO: 2 aufgeführten
Aminosäuresequenz.
Erfindungsgemäß isolierte A2BPs
sind frei von zellulären
Bestandteilen oder Kontaminationen, die normalerweise mit einer
nativen in vivo-Umgebung
assoziiert sind.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung binden A2BPs RNA in einer Weise, die die Expression
der Proteine, welche von der gebundenen RNA kodiert werden, reguliert.
Beispielsweise ist herausgefunden worden, dass sowohl Ataxin-2 von
C. elegans als auch A2BP1 von C. elegans essentielle zelluläre Gene
in der frühen
Entwicklung von C. elegans sind. Da sowohl Ataxin-2 als auch A2BP1
auch in Säugetieren stark
konserviert ist, wird erwartet, dass humanes Ataxin-2 und A2BP1 ähnliche
biologische Funktionen aufweisen. Die Tatsache, dass beide Gene
zu einem frühzeitigen
letalen Phänotyp
führen,
wenn sie zum Ziel von RNA-Interferenz-Untersuchungen gemacht werden,
unterstreicht die vorliegend beschriebenen Ergebnisse hinsichtlich
der Interaktion von Ataxin-2 und A2BP1. Da beide RNA-bindende Eigenschaften
aufweisen, bilden sie essentielle Bestandteile des RNA-Lokalisierungsnetzwerks,
das die zelluläre
Polarität
festlegt. Ataxin-2 und A2BP1 haben gleichermaßen in polarisierten Zellen
höherer
Differenzierung, wie beispielsweise in Neuronen, eine ähnliche
Funktion und werden für
die neuronale Plastizität
benötigt.
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Die
erfindungsgemäßen Proteine
sind ferner dadurch charakterisiert, dass sie ubiquitär exprimiert
werden, einschließlich
einer Expression im Säugetier-Gehirn.
Spleißvarianten
von cDNA-Transkripten, die durch alternatives Spleißen von
Primärtranskripten
erzeugt worden sind, sowie allelische Varianten, die die A2BP-Familie
von Proteinen kodieren, werden ebenfalls im Rahmen der vorliegenden
Erfindung vorgeschlagen.
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Gegenwärtig bevorzugte
A2BPs der Erfindung umfassen Aminosäuren, die im Wesentlichen dieselbe Sequenz
wie die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte
Proteinsequenz umfassen, sowie biologisch aktive, modifizierte Formen
derselben. Wie oben erörtert
wurde, bindet jedes der erfindungsgemäßen A2BP-Proteine an Ataxin-2, an
Ataxin-2-ähnliche
Proteine oder an Nukleinsäure.
Das in SEQ ID NO: 2 aufgeführte
A2BP wurde im Rahmen eines Screenings nach bindenden Proteinen unter
Verwendung von Ataxin-2 identifiziert; es wird vorgeschlagen, dass
diese an dem Signal-Transduktionsweg
beteiligt sind, der sich auf das Zellüberleben auswirkt. Darüber hinaus
weist das SEQ ID NO: 2 entsprechende, erfindungsgemäße A2BP-Protein
stark konservierte RNA-bindende
Motive auf, die den Aminosäuresequenzen
119–124
und 156–162
von SEQ ID NO: 2 entsprechen (als RNP-1 bzw. RNP-2 bezeichnet),
und es wird demgemäß im Rahmen
der Erfindung gleichermaßen, vorgeschlagen,
dass diese eine Rolle im Signal-Transduktionsweg
spielen, der sich auf das Zellüberleben
auswirkt.
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Der
Fachmann wird erkennen, dass zahlreiche Reste der oben beschriebenen,
erfindungsgemäßen Proteine
gegen andere ausgetauscht werden können (chemisch, sterisch und/oder
elektronisch ähnliche
Reste), ohne die biologische Aktivität der resultierenden Species
wesentlich zu verändern.
Darüber
hinaus werden größere Polypeptidsequenzen
vorgeschlagen, die im Wesentlichen dieselbe Sequenz wie die in SEQ
ID NO: 2 aufgeführte
enthalten. (z.B. Spleißvarianten
und allelische Polymorphismen). Wie vorliegend verwendet bezeichnet
der Begriff "im
Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz" Aminosäuresequenzen
mit mindestens etwa 70% Identität
bezüglich
der Referenz-Aminosäuresequenz,
die vergleichbare funktionale und biologische Aktivitäten beibehalten,
welche für
das durch die Referenz-Aminosäuresequenz
definierte Protein charakteristisch sind. Vorzugsweise werden Proteine
mit im Wesentlichen derselben Aminosäuresequenz mindestens etwa
80%, vorzugsweise 90% Aminosäureidentität bezüglich der
Referenz-Aminosäuresequenz
aufweisen, wobei mehr als etwa 95% Aminosäuresequenz-Identität besonders bevorzugt sind.
Es ist jedoch verständlich, dass
Polypeptide (oder die zuvor erwähnten
Nukleinsäuren),
die weniger als das beschriebene Ausmaß an Sequenzidentität aufweisen,
und die als Spleißvarianten
oder allelische Varianten vorkommen, oder die durch geringfügige Deletionen, durch
konservative Aminosäure-Austausche,
durch Austausch von degenerierten Codons modifiziert sind, ebenfalls
im Bereich der vorliegenden Erfindung liegen.
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Der
Begriff "biologisch
aktiv" oder "funktional", sofern vorliegend
als Modifikationsmittel des (der) erfindungsgemäßen A2BP(s) oder eines Polypeptidfragments
desselben (derselben) verwendet, bezeichnet ein Polypeptid, das
eine oder mehrere dem A2BP ähnliche
Eigenschaften aufweist. Biologisch aktives A2BP kann beispielsweise
die Fähigkeit
aufweisen, vorzugsweise in vivo an mindestens eine Form von Ataxin-2
zu binden, das durch ein SCA2-Gen kodiert wird. Ataxin-2-bindende
Aktivität
kann beispielsweise unter Verwendung der in Beispiel I, II und III
beschriebenen Verfahren untersucht werden. Biologisch aktives A2BP
kann ferner die Fähigkeit
haben, Nukleinsäure
(wie beispielsweise RNA) zu binden, und daher weist ein erfindungsgemäßes Polypeptid
eine RNA-bindende Fähigkeit
auf. RNA-bindende
A2BP-Fragmente umfassen die in SEQ ID NO: 2 aufgeführten Aminosäuresequenzen.
Eine Bindung von Nukleinsäure
durch erfindungsgemäße A2BPs
oder Fragmente derselben kann unter Verwendung von im Stand der
Technik bekannten Verfahren, wie beispielsweise elektrophoretische
Gel-Shift-Analyse, bestimmt werden. Beispielhafte funktionale Fragmente,
die an Nukleinsäure
wie beispielsweise RNA binden, umfassen Aminosäuren 119–124 und/oder 156–162 von
SEQ ID NO: 2.
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Ebenfalls
umfasst vom Begriff A2BP sind funktionale Fragmente oder Polypeptid-Analoga
derselben. Der Begriff "funktionales
Fragment" bezeichnet
ein Peptid-Fragment, das ein Teil eines A2BP-Proteins vollständiger Länge ist,
vorausgesetzt, dass der Teil wie oben beschrieben biologisch aktiv
ist (d.h. eine Eigenschaft des entsprechenden Proteins vollständiger Länge aufweist).
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Gemäß einer
Ausführungsform
weist ein funktionales Fragment eines erfindungsgemäßen A2BP-Proteins,
wie beispielsweise ein in SEQ ID NO: 2 enthaltener Bereich, die
Fähigkeit
auf, Ataxin-2 zu binden, wobei ihm jedoch eine Signal-Transduktions-Funktion fehlt. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
weist ein funktionales Fragment von A2BP die Fähigkeit auf, RNA zu binden,
wobei ihm jedoch eine Signal-Transduktions-Funktion fehlt. Solche
funktionalen Fragmente, die Ataxin-2 oder RNA binden, jedoch kein
Signal (wie beispielsweise ein Zell-Degenerations-Signal oder ein Überlebens-Signal)
transduzieren, können
beispielsweise als dominant-negativer Inhibitor nützlich sein.
Ein solcher Inhibitor kann in vivo die Bindung von nativem (d.h. endogenem)
A2BP an Ataxin-2 oder RNA inhibieren und kann in einem erfindungsgemäßen Verfahren
nützlich sein.
Ein dominant-negativer Inhibitor, der den Signal-Transduktionsweg der Zelldegeneration
inhibiert, kann beispielsweise nützlich
sein, um Störungen
zu behandeln, die durch eine Zelldegeneration charakterisiert sind.
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Biologisch
aktive A2BP-Polypeptide, wie beispielsweise ein dominant-negatives
Fragment, können unter
Verwendung hinlänglich
bekannter Verfahren identifiziert werden, beispielsweise unter Verwendung.
der vorliegend beschriebenen Bindungs-Assays. Solche Verfahren umfassen
beispielsweise Hefe- oder Säugetier-2-Hybrid-Assay-Systeme,
in vitro-Nukleinsäure-Bindungs-Assays
und andere kompetitive Bindungs-Inhibitions-Assay, die im Stand
der Technik bekannt sind. Solche 2-Hybrid-Assay-Systeme können insbesondere verwendet
werden, um funktionale Fragmente von A2BP zu identifizieren, die
die Bindung eines A2BP an ein Ataxin-2 in vivo inhibieren.
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Funktionale
Fragmente von A2BP können
darüber
hinaus eine Immun-Antwort auslösen,
die nützlich ist,
um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erhalten, welche spezifisch
an ein erfindungsgemäßes A2BP
binden. Daher wird eine erfindungsgemä ße Nukleinsäure, die ein A2BP kodiert,
ein Polypeptid kodieren, das spezifisch von einem Antikörper erkannt
wird, der ebenfalls spezifisch das A2BP-Protein (vorzugsweises humanes)
erkennt, einschließlich
der in SEQ ID NO: 2 aufgeführten
Aminosäure.
Solche immunologische Aktivität
kann durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren untersucht werden.
Beispielsweise kann ein Test-Polypeptid, das von einer A2BP-cDNA
kodiert wird, verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, welche anschließend auf
ihre Fähigkeit
untersucht werden, an ein erfindungsgemäßes A2BP-Protein zu binden, einschließlich an
die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte
Sequenz. Wenn der Antikörper
an das Test-Polypeptid und an das Protein, das die in SEQ ID NO:
2 aufgeführte
Sequenz umfasst, mit im Wesentlichen derselben Affinität bindet,
so ist das Polypeptid biologisch aktiv, da es immunogene Aktivität besitzt.
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Die
Aminosäurelänge von
funktionalen Fragmenten oder Polypeptid-Analoga der vorliegenden
Erfindung kann von etwa 5 Aminosäuren
bis zur Proteinsequenz eines erfindungsgemäßen A2BP vollständiger Länge reichen.
In einigen Ausführungsformen
umfassen die Aminosäurelängen beispielsweise
mindestens etwa 10 Aminosäuren,
mindestens etwa 20, mindestens etwa 30, mindestens etwa 40, mindestens
etwa 50, mindestens etwa 75, mindestens etwa 100, mindestens etwa
150, mindestens etwa 200, mindestens etwa 250 oder mehr Aminosäuren hinsichtlich
ihrer Länge
bis zur A2BP-Proteinsequenz vollständiger Länge. Exemplarische funktionale
Fragmente, die an eine Nukleinsäure,
wie beispielsweise eine RNA, binden, umfassen die Aminosäuren 119–124 und/oder
156–162
von SEQ ID NO: 2.
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Die
erfindungsgemäßen A2BPs
können
mittels einer Vielzahl von im Stand der Technik hinlänglich bekannten
Verfahren isoliert werden, beispielsweise mittels der vorliegend
beschriebenen rekombinanten Expressionssysteme, Präzipitation,
Gelfiltrations-, Ionenaustausch-, Reverse-Phase- und Affinitäts- Chromatographie und Ähnliche.
Andere hinlänglich
bekannte Verfahren werden in Deutscher et al., (Guide to Protein
Purification: Methods in Enzymology Vol. 182, Academic Press (1990))
beschrieben. Alternativ dazu können
die isolierten Polypeptide der vorliegenden Erfindung unter Verwendung
hinlänglich
bekannter Verfahren erhalten werden, beispielsweise durch Expressions-Screening,
z.B. unter Verwendung von erfindungsgemäßen Antikörpern.
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Ein
Beispiel für
ein Mittel zur Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids (der erfindungsgemäßen Polypeptide)
besteht darin, Nukleinsäuren,
die ein A2BP kodieren, in einer geeigneten Wirtszelle, wie beispielsweise
in einer bakteriellen Zelle, einer Hefe-Zelle, einer Insektenzelle,
einer Amphibien-Zelle
(d.h. Oozyte) oder einer Säugetier-Zelle,
unter Verwendung im Stand der Technik hinlänglich bekannter Verfahren
zu exprimieren, und die exprimierten Polypeptide wiederum unter
Verwendung hinlänglich
bekannter Verfahren zu gewinnen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide
können
unmittelbar aus Zellen isoliert werden, die mit den Expressionsvektoren
transformiert wurden, wie vorliegend im Folgenden beschrieben wird.
Das erfindungsgemäße Polypeptid,
die funktionalen Fragmente und funktionalen Äquivalente derselben können darüber hinaus durch
chemische. Synthese hergestellt werden. Synthetische Polypeptide
können
beispielsweise unter Verwendung des automatischen Peptid-Synthesegeräts von Applied
Biosystems, Inc., Modell 430A oder 431A (Foster City, CA) unter
Anwendung der vom Hersteller bereitgestellten Chemie hergestellt
werden.
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Der
Begriff "Polypeptidanalog" umfasst jedes Polypeptid
mit einer Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen dieselbe ist wie eine vorliegend spezifisch
gezeigte Sequenz, und in dem ein oder mehrere Reste konservativ
gegen einen funktional ähnlichen
Rest ausgetauscht worden sind, und welches die Fähigkeit zeigt, ein wie vorliegend
beschriebenes A2BP funktional nach zuahmen. Beispiele für konservative
Austausche umfassen den Austausch eines nicht-polaren (hydrophoben)
Restes, wie beispielsweise Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin,
gegen einen anderen; den Austausch eines polaren (hydrophilen) Restes
gegen einen anderen, wie beispielsweise zwischen Arginin und Lysin,
zwischen Glutamin und Asparagin, zwischen Glycin und Serin; den.
Austausch eines basischen Restes, wie beispielsweise Lysin, Arginin
oder Histidin gegen einen anderen oder den Austausch, eines sauren
Restes, wie beispielsweise Asparaginsäure oder Glutaminsäure gegen
einen anderen.
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Wie
vorliegend beschrieben umfasst der Begriff "konservativer Austausch" die Verwendung eines
chemisch derivatisierten Restes anstelle eines nicht-derivatisierten
Restes, vorausgesetzt, dass ein Polypeptid, das einen solchen Rest
enthält,
die erforderliche Bindungsaktivität zeigt. Der Begriff "chemisches Derivat" bezeichnet ein Polypeptid
mit einem oder mehreren chemisch derivatisierten Resten, die durch
eine Reaktion, beispielsweise einer funktionalen Seitenkette, hergestellt
worden sind. Solche derivatisierten Moleküle umfassen diejenigen Moleküle, in denen
freie Aminogruppen derivatisiert worden. sind, wobei Aminhydrochloride, p-Toluen-Sulfonyl-Gruppen,
Carbobenzoxy-Gruppen, t-Butyloxycarbonyl-Gruppen, Chloracetyl-Gruppen oder Formyl-Gruppen
gebildet werden. Freie Carboxyl-Gruppen
können
derivatisiert werden, wobei Salze, Methyl- und Ethyl-Ester oder
andere Arten von Estern oder Hydraziden gebildet werden. Freie Hydroxyl-Gruppen
können
derivatisiert werden, wobei O-Acyl- oder O-Alkyl-Derivate entstehen.
Der Imidazol-Stickstoff von Histidin kann derivatisiert werden,
wobei N-im-Benzylhistidin entsteht. Ferner sind Peptide als chemische
Derivate umfasst, die ein oder mehrere natürlich vorkommende Aminosäurederivate
der 20 Standard-Aminosäuren
enthalten, wie beispielsweise 4-Hydroxyprolin ausgetauscht gegen
Prolin; 5-Hydroxylysin ausgetauscht gegen Lysin; 3- Methylhistidin ausgetauscht
gegen Histidin; Homoserin ausgetauscht gegen Serin; und Ornithin
ausgetauscht gegen Lysin.
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Die
Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen jedes Polypeptid
mit einem oder mehreren deletierten Resten in Bezug auf die Sequenz
eines Polypeptids, dessen Sequenz vorliegend gezeigt ist, solange die
erforderliche Aktivität
beibehalten wird. Gleichermaßen
werden Zufügungen
an die erfindungsgemäßen Polypeptide
vorgeschlagen, solange die erforderliche biologische Aktivität beibehalten
wird.
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Ein
Beispiel für
eine Zufügung
an ein erfindungsgemäßes Polypeptid
ist eine heterologe Domäne.
Wie vorliegend verwendet wird der Begriff "heterologe Domäne" breit verwendet und bedeutet eine Einheit,
die kovalent mit einem erfindungsgemäßen Protein verknüpft ist
und diesem eine bestimmte Funktion vermittelt, wobei eine Chimäre gebildet
wird. Wie vorliegend verwendet bedeutet der Begriff "Chimäre" ein erfindungsgemäßes A2BP
oder funktionales Fragment desselben, das kovalent mit einem oder
mehreren heterologen Domänen
verknüpft
ist.
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Eine
heterologe Domäne
kann im Wesentlichen jedes kleine Molekül, Makromolekül oder jede
mikrogefertigte Vorrichtung (microfabricated device) sein, solange
dieses dem erfindungsgemäßen Protein
(den erfindungsgemäßen Proteinen)
ohne wesentliche Beeinflussung der biologischen Funktion eine bestimmte Funktion
vermittelt. Solche heterologen Domänen umfassen beispielsweise
diejenigen, die eine Funktion für das
gezielte Aufsuchen (targeting) bereitstellen oder die die Aktivität von A2BP
verstärken,
supprimieren oder modulieren, oder nützlich bei der Aufreinigung
oder im Rahmen der vorliegend beschriebenen Bioassays (z.B. beim
Hefe-2-Hybrid-Assay-System) sind. Beispielsweise sorgen Liganden
von Zelloberflächenproteine,
die den Eintritt in die Zelle ermöglichen, für das gezielte Aufsuchen (targeting),
wie beispielsweise Antikörper,
virale Hüll proteine,
Wachstumsfaktoren, Fragmente derselben und Ähnliche. Regulatorische Domänen, wie
beispielsweise dereprimierbare Steroidhormon-Bindungsdomänen und Ähnliche,
können
für das
Modulieren der Aktivität
der erfindungsgemäßen A2BP-Polypeptide
nützlich
sein. Eine heterologe Domäne,
die eine RNAse ist, kann auf RNA-Moleküle abstellen, die A2BP zum
Zwecke des Abbaus binden. Anhänge
(tags), wie beispielsweise Biotin, T7, Polyhistidin und Ähnliche
können
für die
Detektion von Proteinen oder Nukleinsäuren nützlich sein, welche die erfindungsgemäßen Polypeptide
binden, oder die Reinigung von verbundenen erfindungsgemäßen Proteinen
kann für
die Reinigung oder für
diagnostische Assays nützlich
sein. Der Fachmann kann die Art einer heterologen Domäne in Abhängigkeit
von der Verwendung und der einzelnen gewünschten Funktion problemlos
bestimmen. Die Erfindung stellt somit Chimäre bereit, die A2BP oder funktionale
Fragmente desselben sowie eine oder mehrere heterologe Domänen umfassen.
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Die
vorliegende Erfindung. stellt ferner Zusammensetzungen bereit, die
einen akzeptablen Träger
und ein beliebiges isoliertes, gereinigtes reifes A2BP-Protein oder
funktionale Polypeptid-Fragmente desselben oder Chimäre enthalten,
allein oder in Kombination miteinander. Solche Polypeptide oder
Proteine können
rekombinant erhalten, chemisch synthetisiert oder ausgehend von
nativen Quellen gereinigt werden. Wie vorliegend verwendet bezeichnet
der Begriff "akzeptabler
Träger" jeden gewöhnlichen
pharmazeutischen Träger, der
für die
therapeutische Verabreichung geeignet ist, wie beispielsweise Phosphatgepufferte
Salz-Lösung, Wasser
und Emulsionen, wie beispielsweise Öl/Wasser- oder Wasser/Öl-Emulsion,
sowie verschiedene Arten von Befeuchtungsmitteln. Solche pharmazeutischen
Träger
umfassen darüber
hinaus Träger,
die in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schranke zu überqueren.
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Die
vorliegend beschriebenen A2BP-Zusammensetzungen können beispielsweise
bei Verfahren zum Modulieren der Expression oder Aktivität von Ataxin-2-Proteinen
nützlich
sein oder anderen Proteinen, die am Signal-Transduktionsweg von
Glutaminverwandten Erkrankungen beteiligt sind (z.B. Ataxin-1, Huntington,
Machado-Joseph und Ähnliche).
Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Ausdruck "moduliert die Aktivität" oder grammatikalische
Abwandlungen desselben entweder das Inhibieren der Aktivität (wie mit
einem Antagonisten) oder die Aktivierung der Aktivität (wie mit
einem Agonisten). Die vorliegend vorgeschlagene Ataxin-2-Aktivität beispielsweise
umfasst das Inhibieren oder Aktivieren des Signal-Transduktionswegs,
der mit der Zellgeneration assoziiert ist. Somit werden gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung Verfahren zum Modulieren der Aktivität eines
Proteins bereitgestellt, das A2BP bindet, vorzugsweise Ataxin-2-Protein,
die das Inkontaktbringen von Ataxin-2 mit einem im Wesentlichen
reinen A2BP oder einem funktionalen Fragment desselben umfassen.
-
Ferner
werden Antisense-Nukleinsäuren
bereitgestellt, die eine Sequenz enthalten, welche in der Lage ist,
spezifisch eine Nukleinsäure
vollständiger
Länge oder
jeden Teil einer solchen Nukleinsäure zu binden, der ein A2BP-Polypeptid
kodiert. Eine solche Antisense-Zusammensetzung kann beispielsweise
nützlich sein,
um die Translation einer mRNA zu inhibieren, welche ein A2BP kodiert.
Eine Antisense-Nukleinsäure kann
eine Sequenz aufweisen, die in der Lage ist, spezifisch jeden Teil
der Sequenz einer cDNA zu binden, die A2BP-Polypeptide kodiert.
Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "bindet spezifisch" eine Nukleinsäuresequenz, die ein Nukleinsäuremolekül erkennt,
welches eine Sequenzkomplementarität aufweist, und mit diesem
durch Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Basenpaaren
doppelt-helikale Segmente ausbildet. Ein Beispiel für eine Antisense-Nukleinsäure ist
eine An tisense-Nukleinsäure,
die chemische Analoga von Nukleotiden umfasst.
-
Ferner
werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die eine wie oben beschriebene
Antisense-Nukleinsäure
in einer Menge umfassen, welche ausreicht, um die Expression eines
humanen A2BP-Polypeptids
zu verringern, sowie einen akzeptablen hydrophoben Träger, der
in der Lage ist, eine Zellmembran zu durchqueren, indem er die Zellmembran
durchquert und spezifisch an Nukleinsäure bindet, welche ein A2BP-Polypeptid kodiert.
Geeignete hydrophobe Träger
werden beispielsweise in den US-Patent-Nrn. 5,334,761; 4,889,953; 4,897,355
und Ähnlichen
beschrieben. Der akzeptable hydrophobe Träger, der in der Lage ist, die
Zellmembran zu durchqueren, kann ferner einen Rezeptor-Bestandteil
oder ähnliche
Strukturen umfassen, die an Zellen binden, um den Eintritt zu ermöglichen.
Beispielsweise kann ein Rezeptor-Bestandteil
oder eine ähnliche Struktur
in einem Lipid-Vesikel-Träger spezifisch
für einen
ausgewählten
Zell-Typ sein, wodurch eine Antisense-Nukleinsäure gezielt zu dem ausgewählten Zell-Typ
gebracht wird. Die Struktur kann Teil eines Proteins sein, von dem
bekannt ist, dass es an einen Zell-Typ-spezifischen Rezeptor bindet.
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Antisense-Nukleinsäure-Zusammensetzungen
können
nützlich
sein, um die Translation einer mRNA zu inhibieren, welche erfindungsgemäße Polypeptide
kodiert. Gleichermaßen
können
synthetische Oligonukleotide oder andere chemische Antisense-Strukturen so gestaltet
werden, dass sie an mRNA binden, welche A2BP-Polypeptide kodiert,
und die Translation der mRNA inhibieren. Solche Zusammensetzungen
können nützlich sein,
um die Expression eines A2BP-assoziierten Gens in einer Gewebeprobe
oder in einem Subjekt zu inhibieren.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung werden Kits zur Detektion von Mutationen, Duplikationen,
Deletionen, Umla gerungen und Aneuploidien in A2BP-Genen bereitgestellt,
die mindestens eine erfindungsgemäße Sonde oder ein erfindungsgemäßes Antisense-Nukleotid
umfassen.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die zum Modulieren
der Expression von A2BP-Polypeptiden nützlich sind. Beispielsweise
können
synthetische Antisense-Nukleinsäure-Zusammensetzungen
(nachfolgend SANZ) verwendet werden, um die Translation von mRNA
zu inhibieren, die erfindungsgemäße Polypeptide
kodiert. Synthetische Oligonukleotide oder andere chemische Antisense-Nukleinsäure-Strukturen,
die so gestaltet werden, dass sie mRNA erkennen und selektiv an
diese binden, werden so konstruiert, dass sie komplementär zu der
gesamten Länge
oder zu Teilen eines A2BP-kodierenden Strangs sind, einschließlich zu
der in SEQ ID NO: 1 aufgeführten
Sequenz. Die. SANZ wird so gestaltet, dass sie für die Verabreichung durch Injektion
in ein Subjekt im Blut-Strom stabil ist, oder unter Labor-Zellkulturbedingungen
stabil ist. Die SANZ wird so gestaltet, dass sie in der Lage ist,
die Zellmembran zu durchqueren, um durch physikalische und chemische
Eigenschaften der SANZ, welche es ihr ermöglichen, die Zellmembran zu
durchqueren, in das Cytoplasma der Zelle einzutreten, beispielsweise
durch Gestalten von kleinen, hydrophoben, chemischen Strukturen
der SANZ, oder durch spezifische Transportsysteme in der Zelle,
welche die SANZ erkennen und in die Zelle transportieren. Darüber hinaus
kann die SANZ für
das gezielte Aufsuchen (targeting) von bestimmten, ausgewählten Zellpopulationen
gestaltet sein, beispielsweise durch Verwendung einer SANZ, die
von spezifischen zellulären
Aufnahme-Mechanismen innerhalb der ausgewählten Zellpopulation erkannt
wird. Beispielsweise kann die SANZ so gestaltet werden, dass sie
an einen Rezeptor bindet, der (wie oben besprochen) nur in einem
bestimmten Zell-Typ vorgefunden wird. Gemäß einer besonderen Ausführungsform
ist die SANZ ein Antisense-Oligonukleotid.
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Die
SANZ kann ferner so gestaltet sein, dass sie eine Ziel-mRNA-Sequenz, die
einer Sequenz entsprechen kann, welche in den in SEQ ID NO: 1 aufgeführten Sequenzen
enthalten ist, erkennt und selektiv bindet. Die SANZ ist so gestaltet,
dass sie die Ziel-mRNA-Sequenz entweder durch Bindung an diese und
Induzieren des Abbaus der RNA, beispielsweise durch RNAse I-Verdau, oder durch
Inhibieren des Spleißens von
prä-mRNA,
oder durch Inhibieren der Translation der Ziel-mRNA durch Interferieren
mit der Bindung von Translations-regulierenden Faktoren oder Ribosomen,
oder durch Einschluss von anderen chemischen Strukturen, wie beispielsweise
von Ribozym-Sequenzen oder von reaktiven chemischen Gruppen, die
entweder die Ziel-mRNA abbauen oder chemisch modifizieren, inaktiviert.
Es wurde gezeigt, dass SANZ zu solche Eigenschaften in der Lage
sind, wenn sie sich gegen mRNA-Ziele richten (vgl. Cohen et al.,
Trends Pharmacol. Sci. 10: 435–437
(1989) und Weintraub, Sci. American, Januar (1990), Seite 40).
-
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur rekombinanten Herstellung
von erfindungsgemäßen A2BPs
durch Expression der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen in geeigneten
Wirtszellen bereitgestellt. Rekombinante DNA-Expressionssysteme,
die geeignet sind, die vorliegend beschriebenen A2BPs herzustellen,
sind im Stand der Technik hinlänglich
bekannt. Die oben beschriebenen Nukleotidsequenzen können beispielsweise
für eine
weitere Manipulation, Vermehrung und Protein-Expression in Vektoren
eingebracht werden. Wie vorliegend beschrieben bezeichnet der Begriff "Vektor" (oder Plasmid) eigenständige Elemente,
die verwendet werden, um heterologe DNA in Zellen für eine Vielzahl
von Zwecken einzubringen.
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Geeignete
Expressionsvektoren sind im Stand der Technik hinlänglich bekannt
und umfassen beispielsweise Vektoren, die in der Lage sind, DNA
zu exprimieren, welche in funktionsfähiger Weise an eine regulatorische
Sequenz, wie beispielsweise eine Promotor-Region, gekoppelt ist,
welche in der Lage ist, die Expression einer solchen DNA zu steuern.
Somit bezieht sich ein Expressionsvektor auf ein rekombinantes DNA- oder
RNA-Konstrukt, wie
beispielsweise ein Plasmid, ein Phage, ein rekombinantes Virus oder
andere Vektoren die – bei
Einbringen in eine geeignete Wirtszelle – zu einer Expression der insertierten
DNA führen.
Geeignete Expressionsvektoren sind dem Fachmann hinlänglich bekannt
und umfassen diejenigen, die sich in hohen oder niedrigen Kopienzahlen
in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen replizieren, diejenigen,
die episomal verbleiben, sowie diejenigen, die in das Genom der
Wirtszelle integrieren können.
-
Wie
vorliegend verwendet bezeichnet eine Promotor-Region ein Segment
aus DNA, das die Transkription von DNA kontrolliert, an die es in
funktionsfähiger
Weise gekoppelt ist. Der Promotor-Bereich umfasst spezifische Sequenzen,
die für
die RNA-Polymerase-Erkennung,
Bindung und Transkription-Initiation ausreichen. Darüber hinaus
umfasst der Promotor-Bereich Sequenzen, die die Initiation der Transkription
modulieren, wie beispielsweise cis-wirkende Elemente, die auf trans-wirkende
Faktoren reagieren können.
Promotoren können in
Abhängigkeit
von der Art der Regulation konstitutiv oder reguliert sein. Solche
regulierten Promotoren können
induzierbar oder reprimierbar sein, sodass die Expression von DNA
verstärkt
oder reprimiert werden kann. Beispielhafte Promotoren die im Rahmen
der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen werden, umfassen den SV40-Early-Promotor,
den Cytomegalie-Virus (CMV)-Promotor, den Steroid-induzierbaren
Maus-Mammary-Tumor-Virus (MMTV)-Promotor, den Moloney-Murine-Leukemia-Virus
(MMLV)-Promotor, das Tetracyclin-regulierte Expressionssystem und Ähnliche.
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Wie
vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "in funktionsfähiger Weise gekoppelt" die funktionale Beziehung
von DNA mit regulatorischen und Effektor-Nukleotidsequenzen, wie
beispielsweise Promotoren, Enhancern, transkriptionalen und translationalen
Start- und Stopp-Stellen sowie anderen Signalsequenzen. Die funktionsfähige Kopplung
von DNA an ein Promotor bezieht sich beispielsweise auf die physikalische
und funktionale Beziehung zwischen der DNA und dem Promotor, sodass
die Transkription einer solchen DNA vom Promotor durch eine RNA-Plymerase
initiiert wird, die die DNA spezifisch erkennt, an diese bindet
und sie transkribiert.
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Wie
vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "Expression" jede Anzahl von Schritten, die den
Vorgang umfasst, durch welchen Polynukleinsäuren in RNA transkribiert und
in Peptide, Polypeptide oder Proteine translatiert werden. Wenn
die Polynukleinsäure
von genomischer DNA abgeleitet ist, kann die Expression das Spleißen von
RNA umfassen, sofern eine geeignete eukaryotische Wirtszelle oder
ein geeigneter eukaryotischer Organismus ausgewählt wurde. In ähnlicher
Weise soll die Expression eine posttranslationale Prozessierung
umfassen, wie beispielsweise eine proteolytische Spaltung und Glykosylierung
von Polypeptiden.
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Transformationsvektoren,
die für
die Expression und Vermehrung in Prokaryoten geeignet sind, sind im
Stand der Technik hinlänglich
bekannt und umfassen pBluescript, ZAP-Vektoren des Phagen Lambda
(Stratagene, La Jolla, CA) und Ähnliche.
Andere geeignete. Vektoren und Promotoren werden detailliert, in
US-Patent Nr. 4,798,885 beschrieben.
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Vektoren,
die zur Transformation von E. coli-Zellen geeignet sind, umfassen
die pET-Expressionsvektoren, wie beispielsweise pET11a, der den
T7-Promotor, den T7-Terminator, einen induzierbaren E. coli-lac-Operator
und ein lac-Repressorgen umfasst, sowie pET12a-c, der den T7-Promotor,
den T7-Terminator und ein ompT-Sekretionssignal aus E. coli umfasst
(siehe US-Patent Nr. 4,952,496). Andere geeignete Vektoren umfassen
beispielsweise pIN-IIIompA2, der einen lpp-Promotor, einen lacUV5-Promotor-Operator,
ein ompA-Sekretionssignal und ein lac-Repressorgen umfasst (siehe
Duffaud et al., Meth. Enzymol. 153: 492–507 (1987)).
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Eukaryotische
Transformationsvektoren, einschließlich z.B. das klonierte Genom
des Rinder-Papilloma-Virus, die klonierten Genome der murinen Retroviren
sowie eukaryotische Kassetten, wie beispielsweise das pSV-2 gpt-System
(beschrieben durch Mulligan und Berg, Nature 277: 108–114 (1979)),
das Okayama-Berg-Klonierungssystem
(Mol. Cell Biol. 2: 161–170
(1982)), und der Expressions-Klonierungsvektor, der von Genetics
Institute (US-Patent Nr. 4,912,040) beschrieben wurde, sind verfügbar und
gewährleisten
zumindest einen gewissen Grad an Expression des betreffenden Proteins
in der transformierten eukaryotischen Zelllinie.
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Besonders
bevorzugte Basis-Vektoren, die regulatorische Elemente umfassen,
welche an die erfindungsgemäßen A2BP-kodierenden DNAs
für die
Transfektion von Säugetierzellen
gekoppelt werden können, sind
auf dem Zytomegalie-Virus (CMV)-Promotor
basierende Vektoren, wie beispielsweise pcDNA1 (Invitrogen, San
Diego, CA), auf dem MMTV-Promotor basierende Vektoren, wie beispielsweise
pMAMNeo (Clontech, Palo Alto, CA) und pMSG (Pharmacia, Piscataway,
NJ), und auf dem SV40 Promotor basierende Vektoren, wie beispielsweise
pSVβ (Clontech,
Palo Alto, CA).
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden somit "rekombinante Zellen" bereitgestellt, die die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden
Erfindung umfassen. Verfahren zur Transformation von geeigneten
Wirtszellen, vorzugsweise von bakteriellen Zellen und insbesondere
von E. coli-Zellen sowie Verfahren, die sich zur Kultivierung der Zellen
eignen, welche ein Gen umfassen, das für ein heterologes Protein kodiert,
sind im Stand der Technik im Allgemeinen bekannt (siehe beispielsweise
Sambrook et al., siehe oben 1989).
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Beispielhafte
Verfahren der Transformation umfassen z.B. die Transformation unter
Verwendung von Plasmiden, viralen oder bakteriellen Phagen-Vektoren,
Transfektion, Elektroporation, Lipofektion und Ähnliche. Die heterologe DNA
kann wahlweise Sequenzen umfassen, die es ihr erlauben, extrachromosomal
(z.B. episomal) zu verbleiben, oder die heterologe DNA kann dazu
gebracht werden, in das Genom des Wirts zu integrieren (als ein
alternatives Mittel, um das stabile Verbleiben im Wirt zu gewährleisten).
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Wirtszellen,
die zur Verwendung bei der Ausführung
der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen werden, umfassen diejenigen
Organismen, in denen die rekombinante Herstellung von heterologen
Proteinen ausgeführt
worden ist. Beispiele solcher Wirts-Organismen umfassen Bakterien
(z.B. E. coli), Hefe (z.B. S. cerevisiae, C. tropicalis, H. polymorpha
und P. pastoris; vgl. beispielsweise US-Patent Nrn. 4,882,279; 4,837,148; 4,929,555
und 4,855,231), Säugetier-Zellen
(z.B. HeLa, HEK293, MDCK, BHK, CHO und LtK–-Zellen),
Insekten-Zellen und Ähnliche.
Gegenwärtig
bevorzugte Wirts-Organismen sind Bakterien. Die am meisten bevorzugten
Bakterien sind E. coli.
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Gemäß einer
Ausführungsform
können
Nukleinsäuren,
die die erfindungsgemäßen A2BPs
kodieren, entweder in vivo oder in vitro unter Verwendung geeigneter
viraler Vektoren, die im Stand der Technik hinlänglich bekannt sind, in Säugetier-Zellen
eingebracht werden. Geeignete retrovirale Vektoren, insbesondere
diejenigen, die für
die "Gen-Therapie"-Verfahren entworfen
wurden, werden beispielsweise in den US-Patent Nrn. 5,624,820; 5,693,508
und 5,674,703 sowie in den WIPO-Veröffentlichungen WO 92/05266
und WO 92/14829 beschrieben, und stellen eine Beschreibung von Verfahren
zum effizienten Einbringen von Nukleinsäuren in humane Zellen bereit.
Darüber
hinaus wird in Fällen,
in denen es erwünscht
ist, die Expression der erfindungsgemäßen A2BPs in vivo zu begrenzen
oder zu reduzieren, die Einbringung eines Antisense-Strangs der
erfindungsgemäßen Nukleinsäure vorgeschlagen.
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Auf
Viren basierende Systeme stellen den Vorteil bereit, dass sie relativ
große
Mengen heterologer Nukleinsäure
in eine Vielzahl von Zellen einbringen können. Darüber hinaus können solche
Viren heterologe DNA in Zellen einbringen, die sich nicht teilen.
Geeignete virale Vektoren für
die Einbringung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, die
ein A2BP-Protein kodiert, in. Säugetierzellen
(z.B. vaskuläre
Gewebe-Segmente) sind im Stand der Technik hinlänglich bekannt. Diese viralen
Vektoren umfassen beispielsweise Herpes simplex-Virus-Vektoren (US-Patent
Nr. 5,501,979), Vaccinia-Virus-Vektoren (US-Patent Nr. 5,506,138);
Zytomegalie-Virus-Vektoren (US-Patent Nr. 5,561,063), modifizierte
Moloney-Murine-Leukemia-Virus-Vektoren
(US-Patent Nr. 5,693,508), Adenovirus-Vektoren (US-Patent Nrn. 5,700,470
und 5,731,172), Adeno-assoziierte Virus-Vektoren (US-Patent Nr.
5,604,090), konstitutive und regulierbare Retrovirus-Vektoren (US-Patent
Nrn. 4,405,712; 4,650,764 bzw. 5,739,018), Papilloma-Virus-Vektoren
(US-Patent Nrn. 5,674,703 und 5,719,054). Besonders bevorzugte virale
Vektoren sind die Adenovirus-Vektoren und retrovirale Vektoren.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden Adenovirus-Transferrin/Polylysin-DNA
(TfAdpl-DNA)-Vektor-Komplexe (Wagner et al., PNAS, USA 89: 6099–6103 (1992),
Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147–154 (1992) und Gao et al.,
Hum. Gene Ther. 4: 14–24
(1993)) verwendet, um Säugetier-Zellen
mit heterologer A2BP-Nukleinsäure
zu transfizieren. Jeder der vor liegend beschriebenen Plasmid-Expressionsvektoren
kann in einem TfAdpl-DNA-Komplex verwendet werden.
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Wie
vorliegend verwendet bezeichnet "retroviraler
Vektor" hinlänglich bekannte
Gen-Transfer-Plasmide, die eine Expressionskassette aufweisen, welche
ein heterologes Gen kodiert, das zwischen zwei retroviralen LTRs
lokalisiert ist. Retrovirale Vektoren enthalten üblicherweise geeignete Verpackungs-Signale, die es dem
retroviralen Vektor (oder der RNA, die unter Verwendung des retroviralen
Vektors als Matrize transkribiert wurde) ermöglichen, in einer geeigneten
Verpackungs-Zelllinie.
in ein virales Virion verpackt zu werden (siehe beispielsweise US-Patent
Nr. 4,650,764).
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Geeignete
retrovirale Vektoren für
die vorliegende Verwendung werden beispielsweise in US-Patent Nr.
5,252,479 und in den WIPO-Veröffentlichungen
WO 92/07573, WO 90/06997, WO 89/05345, WO 92/05266 und WO 92/14829
beschrieben, die eine Beschreibung für Verfahren zum effizienten
Einbringen von Nukleinsäure
in humane Zellen unter Verwendung solcher retroviralen Vektoren
bereitstellen. Andere retrovirale Vektoren umfassen beispielsweise
die MMTV-Vektoren (US-Patent Nr. 5,646,013) und Vektoren die oben beschrieben
sind.
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Im
Einklang mit einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden Anti-A2BP-Antikörper mit
spezifischer Reaktivität
gegenüber
einem A2BP-Polypeptid der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
Aktive Fragmente von Antikörper,
wie beispielsweise Fab-Fragmente, sind ebenfalls von der Definition "Antikörper" eingeschlossen.
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Erfindungsgemäße Antikörper können gemäß im Stand
der Technik bekannten Verfahren unter Verwendung erfindungsgemäßer Polypeptide,
Proteine oder Teilen derselben als Antigene hergestellt werden. Beispielsweise
können
polyklonale und monoklo nale Antikörper mittels hinlänglich im
Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt werden, wie beispielsweise
in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring
Harbor Laboratory (1988), beschrieben ist. Erfindungsgemäße Polypeptide
können
als Immunogene bei der Erzeugung solcher Antikörper verwendet werden. Alternativ
können
synthetische Peptide als Immunogene verwendet werden. Aminosäuresequenzen
können
nach im Stand der Technik hinlänglich
bekannten Verfahren analysiert werden, um zu bestimmen, ob diese
hydrophobe oder hydrophile Domänen
des entsprechenden Polypeptids aufweisen. Veränderte Antikörper wie
beispielsweise chimäre,
humanisierte, CDR-ausgetauschte (CDR grafted) oder bifunktionale
Antikörper
können
ebenfalls nach im Stand der Technik hinlänglich bekannten Verfahren
hergestellt werden. Solche Antikörper
können
darüber
hinaus durch Hybridoma, chemische Synthese oder rekombinante Verfahren
erzeugt werden, die beispielsweise in Sambrook et al., siehe oben,
1989, und in Harlow und Lane, siehe oben, 1988, beschrieben sind.
Sowohl Anti-Peptid-Antikörper als
auch Anti-Fusionsprotein-Antikörper
können
verwendet werden (siehe beispielsweise Bahouth et al., Trends Pharmacol.
Sci. 12: 338–343
(1991) und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley and Sons, NY (1989)).
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Derart
hergestellte Antikörper
können
unter anderem in diagnostischen Verfahren und Systemen verwendet
werden, um eine Menge von A2BP nachzuweisen, die in einer Körperprobe
eines Säugetiers,
vorzugsweise in einer humanen Körperprobe,
wie beispielsweise in einem Gewebe (z.B. Gehirn) oder in einer biologischer
Flüssigkeit
(z.B. cerebrospinaler Flüssigkeit)
vorhanden ist. Solche Antikörper
können
darüber
hinaus bei der Immunaffinitäts-
oder Affinitäts-Chromatographie-Reinigung
von erfindungsgemäßem A2BP
verwendet werden. Darüber
hinaus werden vorliegend Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins
eines erfindungsgemäßen A2BP-Proteins
in einer Probe, wie beispiels weise in einer Zelle oder in einem
Kompartiment des Körpers
oder in einer biologischen Flüssigkeit,
vorgeschlagen. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen der Probe
mit einem Antikörper,
der unter Bedingungen, welche die Bindung des Antikörpers an
das A2BP-Polypeptide erlauben, spezifisch an A2BP-Polypeptide bindet,
den Nachweis des Vorhandenseins des an das A2BP-Polypeptid gebundenen
Antikörpers,
und das dadurch erfolgende Nachweisen des Vorhandenseins des erfindungsgemäßen Polypeptids
in der Probe. Beim Nachweis solcher Polypeptide können Antikörper für die in
vitro-Diagnostik oder für
in vivo-bildgebende
Verfahren verwendet werden.
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Verfahren,
die zum in vitro-Nachweis von A2BP-Polypeptiden in einer Probe nützlich sind,
umfassen Immunoassays, die einen nachweisbaren Antikörper verwenden.
Solche Immunoassays umfassen beispielsweise ELISA, den Pandex-mikrofluorimetrischen
Assay, Agglutinations-Assays, Durchflusszytometrie, serumdiagnostische
Assays und immunhistochemische Färbungsverfahren,
die im Stand der Technik hinlänglich
bekannt sind. Ein Antikörper
kann auf verschiedene Arten, die im Stand der Technik hinlänglich bekannt
sind, zu einem nachweisbaren Antikörper gemacht werden. Beispielsweise
kann eine nachweisbare Markierung direkt oder indirekt an den Antikörper gekoppelt
werden. Nützliche
Markierungen umfassen wie oben beschrieben beispielsweise Radionukleotide,
Enzyme, Fluorogene, Chromogene und chemilumineszente Substanzen.
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Vorliegend
werden erfindungsgemäße Anti-A2BP-Antikörper vorgeschlagen,
um die Aktivität
eines A2BP-Polypeptids in lebenden Tieren, wie beispielsweise in
Menschen, oder in biologischen Geweben oder Flüssigkeiten derselben zu modulieren.
Der Begriff "modulieren" bezeichnet die Fähigkeit
einer Verbindung, die biologische Aktivität eines erfindungsgemäßen A2BP-Proteins, wie beispielsweise
die Ataxin-2-bindende Aktivität
oder die RNA-bindende Aktivität
eines A2BP, zu verstärken (z.B. über einen
Agonisten) oder zu inhibieren (z.B. über einen Antagonisten). Demgemäß werden
vorliegend Zusammensetzungen vorgeschlagen, die einen Träger und
eine Menge eines Antikörpers
mit Spezifität
für A2BP-Polypeptide
umfassen, welche wirksam ist, um natürlich vorkommende Liganden
oder A2BP-bindende
Proteine (z.B. Ataxin-2) daran zu hindern, an die erfindungsgemäßen A2BP-Polypeptide
zu binden. Beispielsweise kann zu diesem Zweck ein monoklonaler
Antikörper
nützlich
sein, der gegen ein Epitop eines erfindungsgemäßen A2BP-Polypeptids gerichtet ist (einschließlich einer
Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 2 aufgeführt
ist). Solche Anti-A2BP-Antikörper können darüber hinaus
nützlich
zum Inhibieren oder Verstärken,
des Signal-Transduktionswegs sein, der mit der Zelldegeneration
assoziiert ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt darüber
hinaus transgene nicht-humane Säugetiere
bereit, die in der Lage sind, exogene Nukleinsäuren zu exprimieren, welche
A2BP-Polypeptide kodieren. Wie vorliegend verwendet bedeutet der
Begriff "exogene
Nukleinsäure" eine Nukleinsäuresequenz,
die in Bezug auf den Wirt nicht nativ ist, oder die in dem Wirt
nicht in ihrer nativen Umgebung vorliegt, beispielsweise als Teil
eines genetisch erstellten DNA-Konstrukts, das in den Wirt eingebracht
worden ist. Zusätzlich
zu den natürlich
vorkommenden Mengen von A2BP können
die erfindungsgemäßen A2BPs überexprimiert
werden, wie beispielsweise in transgenen Säugetieren.
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Ferner
werden nicht-humane, transgene Säugetiere
bereitgestellt, in denen natives A2BP unterexprimiert oder überhaupt
nicht exprimiert wird (z.B. ein A2BP-Knockout). Gemäß einer
weiteren Ausführungsform werden
transgene nicht-humane Säugetiere
bereitgestellt, die in der Lage sind, Nukleinsäuren zu exprimieren, die A2BP-Polypeptide
kodieren, welche so mutiert sind, dass sie nicht in der Lage sind,
native Aktivität
zu zeigen, d.h. sie exprimieren kein natives A2BP.
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Transgene
Säugetiere,
in denen ein Genlocus für
natives A2BP ausgeschaltet worden ist (knocked out) oder durch ein
mutiertes A2BP-Gen ersetzt worden ist, um. die Expression oder die
Struktur der exprimierten A2BP-Polypeptide zu verändern, können nach
im Stand der Technik bekannten Verfahren erzeugt werden. Homologe
Rekombination ersetzt ein natives (endogenes) Gen gegen ein mutiertes
Gen, ein rekombinantes Gen oder ein unverwandtes Gen, wobei ein
Tier erzeugt wird, das kein natives (endogenes) Protein exprimieren
kann, jedoch beispielsweise ein mutiertes Protein exprimieren kann,
was zu einer Expression von veränderten
A2BP-Polypeptiden führt.
Das Expressionsmuster eines solchen ersetzten Gens kann das des
nativen (endogenen) Gens nachahmen, was beispielsweise für die Bestimmung
der Auswirkung von A2BP-Mutationen auf verschiedene biologische
Funktionen, wie beispielsweise auf Entwicklungswege, nützlich sein
kann. Homologe Rekombinationsverfahren sind im Stand der Technik
hinlänglich
bekannt (siehe beispielsweise US-Patent Nrn. 5,721,367; 5,695,977;
5,650,298 und 5,614,396).
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung nicht-humane transgene Säugetiere mit einem Genom bereit,
das Antisense-Nukleinsäuren
umfasst, die komplementär
zu Nukleinsäuren
sind, welche für
A2BP-Polypeptide kodieren, und so angeordnet sind, dass sie in Antisense-mRNA
transkribiert werden, welche komplementär zu mRNA ist, welche für A2BP-Polypeptide kodiert,
und welche an die mRNA hybridisiert und dadurch die Translation
derselben inhibiert. Die Nukleinsäure kann darüber hinaus
einen regulierbaren Promotor oder Gewebespezifische regulatorische
Elemente umfassen, sodass die Expression induziert, reprimiert oder
auf spezifische Zelltypen beschränkt
werden kann. Beispiele für
Nukleinsäuren
sind DNA oder cDNA, die eine kodierende Sequenz aufweisen, welche
im Wesentlichen dieselbe ist wie die kodierende Sequenz, die in
SEQ ID NO: 1 gezeigt ist. Ein Beispiel eines nicht-humanen transgenen
Säugetiers
ist eine transgene Maus. Beispiele für Expressionselemente, die
die Gewebespezifität
bestimmen, sind der Metallothionein-Promotor und der L7-Promotor.
Protokolle zur Herstellung transgener Säugetiere, die Antisense-Nukleinsäuren exprimieren,
welche in der Lage sind, die Translation einer Sense-Nukleinsäure zu inhibieren
sind im Stand der Technik bekannt (US-Patent Nr. 5,661,016).
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Tiermodellsysteme,
die die biologischen Aufgaben von A2BP-Polypeptiden aufklären, werden ebenfalls bereitgestellt,
und sie werden hergestellt, indem man unter Verwendung einer Vielzahl
von Verfahren wie oben beschrieben transgene Tiere erzeugt, beispielsweise
solche, in denen die Expression von A2BP-Polypeptiden verändert ist.
Methoden für
das Einbringen von normalen oder mutierten Versionen von Nukleinsäuren, die
ein A2BP-Polypeptid kodieren, umfassen Mikroinjektion, retrovirale
Infektion oder andere Mittel, die dem Fachmann hinlänglich bekannt
sind, in geeignete befruchtete Embryos, wobei ein transgenes Tier
erzeugt wird (vgl. beispielsweise Hogan et al., Manipulating the
Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
(1986)).
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Im
Gegensatz zur homologen Rekombination kann die Mikroinjektion einem
Wirts-Genom Gene zufügen,
ohne ein natives A2BP-Gen zu entfernen. Somit kann die Mikroinjektion
ein transgenes Tier erzeugen, welches in der Lage ist, sowohl endogenes
(natives) als auch exogenes A2BP zu exprimieren. Regulierbare Promotoren
können
an den kodierenden Bereich der Nukleinsäuren gekoppelt. werden, um
ein Mittel bereitzustellen, um die Expression des Transgens zu induzieren
oder zu reprimieren. Sofern es erwünscht ist, können Gewebe-spezifische
regulatorische Elemente an den kodierenden Bereich gekoppelt werden,
um eine Gewebe-spezifische Expression des Transgens zu erlauben.
Transgene Tiermodellsysteme sind darüber hinaus für das in
vivo-Screening von Verbindungen zur Identifikation von spezifischen
Liganden, wie beispielsweise Agonisten oder Antagoni sten, welche
die Proteinantworten aktivieren oder inhibieren, nützlich.
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Zusätzlich zum
in vivo-Sreening, können
die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren (einschließlich Antisense),
Oligonukleotide, Vektoren, die dieselben enthalten, transformierte
Wirtszellen, Polypeptide und Kombinationen derselben sowie die erfindungsgemäßen Antikörper dazu
verwendet werden, Verbindungen in vitro zu untersuchen, um zu bestimmen,
ob eine Verbindung als potentieller Agonist oder Antagonist zu den
erfindungsgemäßen Polypeptiden
fungiert. Diese in vitro-Screening-Assays stellen Informationen über Funktion und
Aktivität
der erfindungsgemäßen Polypeptide
bereit, die zur Identifizierung und Gestaltung von Verbindungen
führen
können,
welche in der Lage sind, spezifisch mit einer oder mehreren Arten
von Polypeptiden, Peptiden oder Proteinen zu interagieren.
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Die
funktionalen Eigenschaften der erfindungsgemäßen A2BPs sprechen für eine Rolle
von Ataxin-2 und den erfindungsgemäßen A2BPs beim Signal-Transduktionsweg,
der die Zelldegeneration beeinflusst. Ataxin-2 und die erfindungsgemäßen A2BPs
stellen somit auch Ziele zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen
dar, bei denen es erwünscht
ist, die Zelldegeneration zu erhöhen
oder zu verringern. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen A2BPs
sowie Agonisten oder Antagonisten zu diesen verwendet werden, um neurodegenerative
Störungen,
wie beispielsweise spinocerebellare Ataxie des Typs 2, zu behandeln.
Gemäß bestimmter
Aspekte der vorliegenden Erfindung, wie beispielsweise abnormale
oder ungewünschte
Zellproliferation, können
erfindungsgemäße A2BPs,
Agonisten oder Antagonisten zu diesen verwendet werden, um Störungen wie
beispielsweise Krebs zu behandeln.
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Somit
werden gemäß eines
weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Identifizierung
von Verbindungen be reitgestellt, die an A2BP-Polypeptide binden.
Die erfindungsgemäßen Proteine
können
in einem kompetitiven Bindungsassay verwendet, werden. Ein solcher
Assay kann ein schnelles Screening einer großen Anzahl von Verbindungen
ermöglichen,
um zu bestimmen, welche Verbindungen (wenn überhaupt) in der Lage sind,
an A2BPs zu binden. Daran anschließend können detailiertere Assays mit
denjenigen Verbindungen durchgeführt
werden, von denen man herausgefunden hat, dass sie binden, um ferner
zu bestimmen, ob solche Verbindungen als Modulatoren, Agonisten
oder Antagonisten der erfindungsgemäßen A2BP-Proteine agieren können. Solche
Screening-Assays können
verwendet werden, um Verbindungen mit therapeutischem Wert zu identifizieren;
beispielsweise können
Verbindungen, die an erfindungsgemäße A2BPs binden oder diese
modulieren, verwendet werden, um eine Vielzahl von pathologischen
Zuständen
zu behandeln, die durch erfindungsgemäße A2BPs vermittelt werden.
Solche pathologischen Zustände
umfassen diejenigen, bei denen Zelldegeneration auftritt, beispielsweise
die zuvor beschriebenen degenerativen und hyperproliferativen Störungen.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung werden Bioassays zum Identifizieren von Verbindungen
bereitgestellt, die die biologische Aktivität des erfindungsgemäßen A2BP-Polypeptide modulieren. Nach
diesem Verfahren werden erfindungsgemäße Polypeptide mit einer "Test"-Substanz in Kontakt
gebracht, die Aktivität
des Polypeptids wird nach dem Inkontaktbringen mit der Testsubstanz überwacht,
und diejenigen Substanzen; die eine Auswirkung auf die biologische
Aktivität
von A2BP haben, werden als Liganden der A2BP-Polypeptide identifiziert.
Beispielsweise kann ein Reporter-Gen-Expressions-System, das die Proteinaktivität überwacht,
wie beispielsweise ein Hefe- oder Säugetier-2-Hybridsystem, welches
spezifische Protein-Protein-Interaktionen nachweist, verwendet werden,
um Verbindungen auf Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität zu untersuchen.
Wie in den Beispielen I, II und III dargestellt, wurde ein Hefe-2-Hybrid-System
verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen
zwischen Ataxin-2 und A2BP nachzuweisen. Somit können Verbindungen, die solche
Protein-Protein-Interaktionen verstärken (Agonisten) oder inhibieren
(Antagonisten), beispielsweise zwischen Ataxin-2 und A2BP-Polypeptiden,
durch Inkontaktbringen solcher Hefe-Zellen, welche rekombinante
Proteine exprimieren, mit einer Test-Verbindung identifiziert werden.
Antagonisten werden als solche Verbindungen identifiziert werden,
die Protein-Protein-Interaktionen inhibieren, wodurch die Expression des
Reporters verringert wird, wohingegen Agonisten als solche Verbindungen
identifiziert werden, die Protein-Protein-Interaktionen verstärken, wodurch
die Expression des Reporters erhöht
wird.
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Somit
stellt die Erfindung transformierte Wirtszellen bereit, die die
erfindungsgemäßen Polypeptide
rekombinant exprimieren. Die rekombinanten Wirtszellen können mit
einer Test-Verbindung in Kontakt gebracht werden, und die modulierende(n)
Wirkung(en) derselben kann (können)
anschließend
durch Vergleich der A2BP-vermittelten Antwort (z.B. über Reporter-Gen-Expression) in Gegenwart
und in Abwesenheit der Testverbindung oder durch Vergleich der Antwort
von Testzellen oder Kontroll-Zellen
(z.B. Zellen, die keine A2BP-Polypeptide exprimieren) zu der Gegenwart
der Verbindung ausgewertet werden.
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In ähnlicher
Weise kann die Bindung eines A2BP-Polypeptids an Nukleinsäuren unter
Verwendung eines Bioassays gemessen werden, der die Bindung von
Nukleinsäure
(z.B. RNA oder DNA) in vivo und in vitro nachweist. Somit kann ein
solcher Assay verwendet werden, um Verbindungen nach Agonisten-
und Antagonisten-Aktivität
zu untersuchen. Solche Nukleinsäure-Bindungsassays,
wie beispielsweise in vitro elektrophoretische Gel-Shift-Assays und Ähnliche,
können
verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die die Protein-Nukleinsäure-Bindung
verstärken
oder inhibieren.
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Wie
vorliegend verwendet bezeichnet eine Verbindung oder ein Signal,
die/das die „Aktivität" eines erfindungsgemäßen Polypeptides "moduliert" eine Verbindung
oder ein Signal, welche(s) die Aktivität von A2BP-Polypeptiden so
moduliert, dass die Aktivität
des erfindungsgemäßen Polypeptids
in Gegenwart der Verbindung oder des Signals anders ist als beim
Fehlen der Verbindung oder des Signals. Insbesondere umfassen solche
Verbindungen oder Signale Agonisten und Antagonisten. Ein Agonist
umfasst eine Verbindung oder ein Signal, die/das A2BP aktiviert.
Im Gegensatz dazu umfasst ein Antagonist eine Verbindung oder ein
Signal, die/das A2BP inhibiert. Die Wirkung von Agonisten und Antagonisten
auf A2BP-Polypeptiden kann direkt oder indirekt sein. Beispielsweise
kann ein indirekt wirkender Agonist eine intermediäre Substanz
aktivieren, wie beispielsweise ein Protein, das wiederum A2BP aktiviert.
Direkt wirkende Antagonisten können
kompetitiv sein, wobei diese an den oder in der Nähe der spezifischen
Stelle für
die Agonisten-Bindung
wirken, oder sie können
nicht-kompetitiv sein, wobei diese mit einer anderen Stelle als
der Agonisten-Interaktions-Stelle
interagieren. Eine Verbindung kann ein Peptid, ein Peptoid, eine
peptidomimetische Substanz, eine Nukleinsäure einschließlich eines
Expressionsplasmids oder einer Antisense-Nukleinsäure, ein Protein, wie beispielsweise ein
Antikörper,
oder ein organisches Molekül
sein, wobei ein organisches Molekül jedes kleine (Molekulargewicht
geringer als 7500 Da) Koh lenstoff-enthaltendes Molekül ist. Eine
Verbindung kann die Aktivität
von A2BP entweder durch Inhibieren oder Verstärken der Aktivität von A2BP-Proteinen
modulieren, ohne das Ausmaß der
A2BP-Expression zu verändern,
oder sie kann die A2BP-Aktivität durch
Modulieren des Ausmaßes
der A2BP-Expression modulieren.
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Ein
Beispiel für
einen solchen Antagonisten ist ein A2BP, das Ataxin-2 bindet, jedoch
kein Signal transduziert, welches mit der Zelldegeneration assoziiert
ist. In ähnlicher
Weise stellt ein RNA-bindendes A2BP, das nicht die Fähigkeit
aufweist, ein Signal zu transduzieren, welches mit der Zelldegeneration
assoziiert ist, ein Beispiel für
einen Antagonisten dar.
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Wie
vom Fachmann verstanden wird, erfordern Verfahren zur Identifizierung
von Verbindungen, die die A2BP-Aktivität modulieren im Allgemeinen
einen Vergleich mit einer Kontrolle. Eine Art von "Kontrolle" ist eine Zelle oder
eine Kultur, die im Wesentlichen in derselben Weise behandelt wird,
wie die Zelle oder Kultur, die der Testverbindung ausgesetzt wird,
mit dem Unterschied, dass die Kontroll-Zelle oder die Kontroll-Kultur nicht
der Test-Verbindung ausgesetzt wird. Beispielsweise kann dieselbe
Zelle in Verfahren, die elektrophysiologische Methoden mit Spannungsklemmen
(voltage clamp electrophysiological procedures) verwenden, in Gegenwart
oder in Abwesenheit der Verbindung untersucht werden, einfach durch
Wechsel der externen Lösung,
in die die Zelle eingetaucht ist. Eine andere Art von Kontroll-Zelle
oder Kontroll-Kultur kann eine Zelle oder Kultur sein, die identisch
mit den transfizierten Zellen ist, mit der Ausnahme, dass die Kontroll-Zelle
oder Kontroll-Kultur keine nativen Proteine exprimiert. Demgemäß wird die
Antwort der transfizierten Zelle auf die Test-Verbindung mit der
Antwort oder dem Ausbleiben derselben der Kontroll-Zelle oder Kontroll-Kultur
auf dieselbe Verbindung unter denselben Reaktionsbedingungen verglichen.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann die Aktivität von A2BP-Polypeptiden durch
Inkontaktbringen der Polypeptide mit einer wirksamen Menge mindestens
einer Verbindung moduliert werden, die durch die oben beschriebenen
Bioassays identifiziert wurde. Gemäß einer weiteren Ausführungsform
kann die Aktivität
eines Proteins, das an A2BP bindet, durch Inkontaktbringen eines
solchen Proteins mit den vorliegend beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptiden moduliert
werden. Die modulierte Proteinaktivität kann verstärkt oder
inhibiert werden. Bei einem Protein, das A2BP bindet, wie beispielsweise Ataxin-2,
kann ein solches Verfahren nützlich
sein, um eine Erkrankung zu behandeln, die mit Ataxin-2 in Verbindung
steht. In ähnlicher
Weise kann bei einer Nukleinsäure,
die A2BP oder funktionale Fragmente desselben bindet, die Aktivität des Nukleinsäuremoleküls moduliert
werden, indem die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
angewendet werden.
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Ferner
werden vorliegend Verfahren zum Modulieren der Genexpression in
einer Zelle bereitgestellt. Die erfindungsgemäßen A2BPs binden RNA, wodurch
Transport, Translation, Degradation und/oder Spleißveränderung
von RNA-Molekülen
in einer Zelle reguliert werden. Somit wird vorliegend vorgeschlagen,
dass ein Verfahren zur Behandlung einer Zelle mit einer Verbindung,
die die A2BP-Aktivität
moduliert, dadurch die Genexpression innerhalb dieser Zelle durch
Modulieren der Expression von einem oder mehreren RNA-Molekülen, die
durch ein erfindungsgemäßes A2BP
gebunden sind, moduliert. Beispielsweise kann ein Expressionsvektor,
der ein erfindungsgemäßes A2BP
kodiert, in eine Zelle eingebracht werden, was zu einer erhöhten A2BP-Expression und somit
zu einer erhöhten
Menge von A2BP-Aktivität innerhalb
der Zelle führt.
Diese erhöhte
Menge von Aktivität
wird in einer modulierten RNA-Bindungs-Aktivität resultieren, die in einer
modulierten Genexpression innerhalb der Zelle resultieren wird.
Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
der Erfindung ist die Aktivität
von A2BP, die moduliert wird; die RNA-Transport-Aktivität von A2BP.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung werden Verfahren zum Modulieren der Zelldifferenzierung
bereitgestellt. Wie vorliegend beschrieben wird vorgeschlagen, dass
Ataxin-2 und A2BP essentielle Proteine bei der embryonalen Entwicklung
sind und daher eine entscheidende Rolle bei der Zelldifferen zierung
spielen. Somit wird eine Verbindung, die die Aktivität von A2BP
moduliert, die Zelldifferenzierung modulieren. Eine solche Verbindung
kann die Aktivität
von A2BP auf eine Vielzahl von Wegen modulieren, einschließlich dem
Modulieren der A2BP:Ataxin-2-Assoziation und dem Modulieren der
RNA-Bindungsaktivität von A2BP.
Es liegt ferner im Bereich dieser Ausführungsform, dass ein Verfahren
zum Modulieren der Aktivität von
A2BP zum Modulieren der embryonalen Entwicklung nützlich sein
kann.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird ein Verfahren. zum Modulieren der Funktion eines
adulten Neurons bereitgestellt. Ein adultes Neuron, wie vorliegend
verwendet, ist jede terminal differenzierte neuronale Zelle. Eine
Verbindung, die die A2BP-Aktivität
in einem adulten Neuron moduliert, wird beispielsweise die A2BP:Ataxin-2-Assoziation
oder die RNA-Bindungsaktivität
von A2BP modulieren, was entweder zu einer Modulation der Genexpression
oder der Signaltransduktion innerhalb des adulten Neurons führen wird.
Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
dieser Erfindung wird die Modulation der A2BP-Aktivität eine modulierende
Wirkung auf das neuronale Gedächtnis
oder die Langzeitpotenzierung haben. Wie vorliegend verwendet bezeichnet
der Begriff Langzeitpotenzierung die lang andauernde Verstärkung der
Antwort einer postsynaptischen Nervenzelle auf Stimulation über die
Synapse, die bei einer wiederholten Stimulation auftritt.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
werden Verfahren zum Modulieren der Funktion einer Muskelzelle durch
Einbringen einer Verbindung. in die Muskelzelle bereitgestellt,
die die Aktivität
von A2BP moduliert. Es wurde eine starke Expression von Ataxin-2
in den Muskelzellen von Organismen, wie beispielsweise C. elegans
beobachtet. Das Modulieren der A2BP-Aktivität wird wiederum die Ataxin-2-Aktivität modulieren. Somit
wird eine Verbindung, die gemäß dieser
Ausführungsform
der Erfin dung verwendet wird, das Modulieren des stark exprimierten
Ataxin-2 in einer Muskelzelle beeinflussen, wodurch die Funktion
der Muskelzelle moduliert wird.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
werden Verfahren zur Behandlung von degenerativen oder hyperproliferativen
Störungen
bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst die Verabreichung von A2BP
oder funktionalen Fragmenten desselben an ein Subjekt. Die Erfindung
stellt ferner Verfahren zur Behandlung von Störungen bereit, die das Verabreichen
von Nukleinsäuren
umfassen, die für
solche A2BP-Polypeptide kodieren. Ferner werden Verfahren zur Behandlung
von Störungen
bereitgestellt, einschließlich
derjenigen, die das Gehirn betreffen, wie beispielsweise spinocerebellare
Ataxie des Typs 2. Verfahren zur Behandlung von hyperproliferativen
Störungen
wie beispielsweise Krebs werden ebenfalls bereitgestellt.
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Degenerative
und hyperproliferative Störungen
können
durch Verabreichen von A2BP oder funktionalen Fragmenten desselben
behandelt werden. In Bezug auf degenerative Störungen beispielsweise verwenden
diese Verfahren A2BP-Proteine, wobei die Polypeptide die zur Zelldegeneration
führende
Signaltransduktion inhibieren. Beispielsweise kann ein A2BP-Polypeptid,
wie beispielsweise ein dominant-negatives Fragment (dem eine Signal-transduzierende
Funktion fehlt), welches an Ataxin-2 bindet, wobei die Interaktion
von Ataxin-2 mit nativem (d.h. endogenem) A2BP inhibiert wird, an
ein Subjekt verabreicht werden, welches von spinocerebellarer Ataxie
des Typs 2 betroffen ist, wodurch die Symptome, welche mit dieser
Störung
assoziiert sind, gelindert werden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform
kann ein RNA-bindendes dominant-negatives A2BP-Polypepid (dem eine
Signal-transduzierende Funktion fehlt) an ein Subjekt verabreicht
werden, welches von spinocerebellarer Ataxie des Typs 2 betroffen
ist, um die Transduktion des Zell-Degenerations-Signals zu inhibieren,
wodurch die assoziierten Symptome gelindert werden. Solche Verfahren,
die dominant-negative A2BP-Polypeptide
verwenden, können
einen Signal-Transduktions-Weg
inhibieren, der zu einer Zelldegeneration führt, die mit spinocerebellarer
Ataxie des Typs 2 assoziiert ist.
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Nukleinsäuren, die
solche therapeutischen A2BP-Polypeptide kodieren und funktionale
Fragmente derselben können
in ähnlicher
weise in diese Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise kann
die Verabreichung eines eukaryotischen Expressions-Vektors, wie beispielsweise
eines retroviralen Vektors, der ein A2BP kodiert, in einen Patienten,
der an einer degenerativen Störung
leidet, wie beispielsweise an spinocerebellarer Ataxie des Typs
2, die Symptome, welche mit dieser Störung assoziiert sind, lindern.
Solche Vektoren, die therapeutisches A2BP exprimieren, können, sofern
gewünscht,
gezielt zu dem geeigneten Zell-Typ gebracht werden, wobei ein Retrovirus
mit natürlichem
oder künstlich
hergestelltem Zelltropismus verwendet wird. Bevorzugte Vektoren
zur Verwendung bei solchen Verfahren sind diejenigen, die in der
Lage sind, Zellen zu infizieren, die keine Zellteilung durchlaufen.
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Zusätzlich kann
ein A2BP oder ein funktionales Fragment, das eine Chimäre umfasst,
beispielsweise ein A2BP, welches an einen Zelloberflächenprotein-Liganden
gekoppelt ist (z.B. einen Nerven-Wachstumsfaktor-Rezeptor oder einen Ähnlichen),
an ein Individium verabreicht werden, um die Symptome, die mit spinocerebellarer
Ataxie des Typs 2 assoziiert sind, zu lindern. In ähnlicher
Weise kann eine Chimäre,
die A2BP gekoppelt an eine RNAse umfasst, an ein Subjekt verabreicht
werden, um die Symptome, welche mit spinocerebellarer Ataxie des
Typs 2 assoziiert sind, zu lindern. In ähnlicher Weise können ein
solches A2BP, funktionale Fragmente und Chimäre desselben, die von Nukleinsäuren kodiert
werden, verabreicht werden, um die Symptome, welche mit degenerativen
Störungen,
einschließlich
bei spielsweise spinocerebellarer Ataxie des Typs 2 assoziiert sind,
zu lindern.
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In ähnlicher
Weise können
A2BP oder Ataxin-2-Agonisten und Ataxin-2-Antagonisten, die in den
oben beschriebenen in vivo- oder
in vitro-Assays identifiziert worden sind, sowie Chimären derselben
und Nukleinsäuren,
die diese kodieren, in einem erfindungsgemäßes Verfahren verwendet werden,
um die Symptome, die mit degenerativen Störungen assoziiert sind, zu
lindern.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung hyperproliferativer
Störungen,
wie beispielsweise Krebs bereit. Die Verfahren verwenden A2BP-Polypeptide, wobei
solche Polypeptide einen Degenerations-Signal-Transduktions-Weg der Zelle stimulieren
können.
Somit können
unter Verwendung der Verabreichungsarten und Expressionssysteme,
(z.B. retrovirale Expressions-Vektoren und Ähnliche) erfindungsgemäße Polypeptide
an Subjekte verabreicht werden, die eine abnormale oder unerwünschte zelluläre Proliferation
aufweisen, um die Zell-Degeneration zu verstärken, wodurch die Symptome, die
mit der Hyperproliferation assoziiert sind, gelindert werden. In ähnlicher
Weise können
A2BP oder Ataxin-2-Agonisten oder Ataxin-2-Antagonisten, die durch
die oben beschriebenen Verfahren identifiziert worden sind, in die
Verfahren. eingesetzt werden, um die Zell-Degeneration zu verstärken.
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Die
oben beschriebenen Verfahren verwenden Verabreichungsarten, die
dem Fachmann hinlänglich bekannt
sind. Solche Wege umfassen beispielsweise intravenös, intramuskulär, subkutan,
intraspinal und intrakraniell. Die gewählten Wege hängen von
der zu behandelnden Störung
und den verwendeten Zusammensetzungen ab.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Diagnose von Störungen bereitgestellt,
die mit A2BP in Verbindung stehen, wobei solche Verfahren umfassen:
das Nachweisen einer defekten Sequenz, Mutante von SEQ ID NO: 1,
in dem Subjekt.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden diagnostische Systeme, vorzugsweise
in Form eines Kits bereitgestellt, die mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem geeigneten
Verpackungsmaterial umfassen. Die diagnostischen Nukleinsäuren sind
von den vorliegend beschriebenden A2BP-kodierenden Nukleinsäuren abgeleitet.
Gemäß einer
Ausführungsform
sind die diagnostischen Nukleinsäuren
beispielsweise von SEQ ID NO: 1 abgeleitet. Erfindungsgemäße diagnostische
Systeme sind für
das Untersuchen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von A2BP-kodierender
Nukleinsäure, entweder
in genomischer DNA oder in transkribierter Nukleinsäure (wie
beispielsweise in mRNA oder cDNA), die A2BP kodieren, nützlich.
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Ein
geeignetes diagnostisches System umfasst mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, vorzugsweise
zwei oder mehr erfindungsgemäße Nukleinsäuren, als
separat verpackte(s) chemische(s) Reagenz(ien) in einer Menge, die
für mindestens
einen Assay ausreicht. Instruktionen zur Verwendung des verpackten
Reagenz werden üblicherweise
ebenfalls umfasst sein. Der Fachmann kann problemlos die erfindungsgemäßen Nukleinsonden
und/oder Primer in eine Kitform einbringen, in Kombination mit für die Ausführung der
vorliegend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Puffern
oder Lösungen.
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Wie
vorliegend verwendet bezeichnet der Ausdruck "Verpackungs-Material" ein oder mehrere physikalische Strukturen,
die verwendet werden, um die Inhalte des Kits zu umfassen, wie beispielsweise
die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sonden
oder Primer und Ähnliches.
Das Verpackungsmaterial wird nach hinlänglich bekannten Verfahren
hergestellt, vorzugsweise um eine sterile, kontaminationsfreie Umgebung
bereitzustellen. Das Verpackungsmaterial weist eine Markierung auf,
die darauf verweist, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zum
Nachweis einer bestimmten Sequenz verwendet werden kann, die für A2BP kodiert, einschließlich der
Nukleinsäuresequenzen,
die in SEQ ID NO: 1 aufgeführt
sind, oder Mutationen oder Deletionen in diesen, wodurch die Diagnose
des Vorliegens oder einer Prädisposition
für spinocerebellare
Ataxie des Typs 2 diagnostiziert werden kann. Darüber hinaus
enthält
das Verpackungsmaterial Instruktionen, die darauf verweisen, wie
die Materialien in dem Kit verwendet werden, um sowohl eine bestimmte
Sequenz nachzuweisen, als auch beispielsweise das Vorliegen von
oder eine Prädisposition
für spinocerebellare
Ataxie des Typs 2 nachzuweisen.
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Die
vorliegend verwendeten Verpackungsmaterialien, die in Bezug auf
die diagnostischen Systeme Verwendung finden, sind diejenigen, die üblicherweise
bei diagnostischen Systemen auf Basis von Nukleinsäuren verwendet
werden. Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "Verpackung" eine feste Matrix oder
ein festes Material, wie beispielsweise Glas, Kunststoff, Papier,
Folie und Ähnliches,
welches in der Lage ist, eine isolierte Nukleinsäure, ein isoliertes Oligonukleotid
oder einen isolierten Primer der vorliegenden Erfindung innerhalb
festgelegter Grenzen zu halten. Somit kann eine Verpackung beispielsweise
ein Glasgefäß sein,
das verwendet wird, um Milligramm-Mengen einer vorgeschlagenen Nukleinsäure, eines
Oligonukleotids oder eines Primers zu beinhalten, oder es kann die
Vertiefung einer Mikrotiterplatte sein, an die Mikrogramm-Mengen der vorgeschlagenen
Nukleinsäure-Sonde
in funktionsfähiger
Weise befestigt wurden.
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"Hinweise zur Verwendung" umfassen üblicherweise
einen greifbaren Ausdruck, der die Reagenz-Konzentration oder mindestens
einen Verfahrens-Parameter des Assays umfasst, wie beispielsweise
die relativen Mengen von Reagenz und Probe, die gemischt werden
sollen, die Verweildauer für
Reagenz/Proben-Mischungen, Temperatur, Puffer-Bedingungen, und Ähnliches.
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Die
vorliegende Erfindung wird nunmehr durch Bezug auf die nachfolgenden,
nicht beschränkenden Beispiele
genauer erläutert.
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Materialien
und Methoden
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Soweit
nicht auf anderes verwiesen wird, wurde die vorliegende Erfindung
unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt, wie sie beispielsweise
in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA
(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(2. Auflage), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York, USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology,
Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); oder Methods
in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques 152, S. L.
Berger und A. R. Kimmerl, Hrsg., Academic Press Inc., San Diego,
USA (1987), beschrieben sind.
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BEISPIEL 1
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Identifizierung von cDNA,
die Ataxin-2-bindende Proteine kodiert
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Ein
Plasmid, das für
den C-terminalen Bereich des Ataxin-2-Proteins kodiert (Aminosäuren 811–1312; vgl.
Pulst et al., 1996, Nature Genetics, 14: 269–276), wurde an die bindende
Do mäne
des Transkriptionsfaktors GAL4 fusioniert, wobei das Plasmid pSCA2U4L2
gebildet wurde. Eine cDNA-Bibliothek aus humanem, adulten Gehirn
wurde in einen GAL4-Aktivierungsdomänen-Fusionsvektor pGAD10 (Clontech, Palo
Alto, CA) kloniert und mittels des Hefe-2-Hybrid-Verfahrens (Fields
et al., Nature 340: 245–246
(1989)) unter Verwendung des Plasmids pSCA2U4L2 durchsucht: Doppeltransformanten
des Hefestamms Y190 wurden auf SC-Medien angezüchtet, denen Leucin, Tryptophan
und Histidin fehlten (dropped out), und die 25 mM 3-Amino-1,2,4-Triazol
und 2% Glucose enthielten (Poullet and Tamanoi, Meth. in Enzym.,
255: 488–497
(1995)). Die β-Galaktosidaseaktivität wurde
durch Inkubieren gefriergebrochener Kolonien auf Nitrocellulose
in Z-Puffer (60 mM Na2HPO4,
40 mM NaH2PO4, 10
mM KCl, 1 mM MgSO4, pH 7,0, 0,03 mM β-Mercaptoethanol
und 2,5 μM X-gal)
bei 37°C
für 15
Minuten bis 8 Stunden untersucht.
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Insgesamt.
2,2 × 106 Kolonien wurden untersucht, von denen 15
positiv in Bezug auf die β-Galaktosidaseaktivität waren,
was durch blaue Kolonien sichtbar war. Die Plasmide wurden gereinigt
und mit pSCA2U4L2 co-transformiert, wodurch die Anzahl von Transformanten,
die blaue Kolonien produzierten, auf 2 abnahm. Beide selektierten
Klone kodierten ein neues Ataxin-2-bindendes-Protein, welches vorliegend
als SEQ ID NO: 1 aufgeführt
wird.
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BEISPIEL 2
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Charakterisierung der
Bindung von Ataxin-2: Ataxin-2-bindendem Protein
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Um
zu bestimmen, welche Domänen
von Ataxin-2 an das Ataxin-2-bindende
Protein binden, wurden Deletionskonstrukte erzeugt, die Amino- und
carboxyterminale Deletionen von Ataxin-2 enthielten, und diese wurden
unter Verwendung des oben beschrie benen Hefe-2-Hybrid-Verfahrens
untersucht. Ataxin-2-Proteine, bei denen die carboxyterminalen Reste
deletiert waren, zeigten keine Interaktion mit Ataxin-2-bindendem
Protein, wohingegen Ataxin-2-Proteine mit aminoterminalen Deletionen
von bis zu 1022 Aminosäuren
an das erfindungsgemäße Ataxin-2-bindende
Protein banden. Diese Ergebnisse verweisen darauf, dass die für die Bindung
des erfindungsgemäßen A2BP
an Ataxin-2 notwendigen Bereiche innerhalb der Aminosäurereste 1023–1312 von
Ataxin-2 liegen.
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Es
wurde darüber
hinaus herausgefunden, dass die Polyglutamin (polyQ)-Wiederholungssequenz
in Ataxin-2 für
die A2BP-Bindung nicht essentiell ist. Wie jedoch unter Verwendung
eines β-Gal-Filterassays bestimmt
wurde, war die Bindungsaffinität
von A2BP für
die pathogen ausgedehnte Ataxin-2 Form vollständiger Länge, die 40 oder mehr Polyglutamin-Reste
umfasste, größer als
die für
normales Ataxin-2 vollständiger
Länge,
welches 22 Polyglutamin-Reste umfasste (vgl. 2). Der
Unterschied bezüglich
der Bindungsaffinitäten von
Ataxin-2-bindenden Proteinen für
verschiedene CAG-Wiederholungs-Längen
(Polyglutamin-Wiederholungen) verweist darauf, dass die pathogen
ausgedehnten Polyglutamin-Wiederholungen von 40 und 58 Glutaminen
die Bindungsinteraktionen von A2BP für Ataxin-2 relativ zu einer
polyQ-Wiederholung von 22 Glutaminen verstärkt.
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Der
Grad der Interaktion zwischen Ataxin-2-bindendem Protein und Ataxin-2
wurde ferner unter Verwendung eines semiquantitativen ONPG-Flüssig-Assays
auf β-Galaktosidase-Aktivität untersucht
(Poullet und Tamanoi, siehe oben (1995)). Mehrere Ataxin-2-Deletionskonstrukte
wurden hergestellt und als "FL", "HP2.3", "BK3.0", "PK1.9", "UHL2" und "AK1.1" bezeichnet. Die
entsprechenden Aminosäurebereiche
von Ataxin-2 für diese
Konstrukte sind in 3 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen,
dass die β-Galaktosidase-Aktivitäten für das Ataxin-2-Deletionskonstrukt
U4L2, welches die Aminosäuren
811–1312
von Ataxin-2 enthält,
höher waren
als die für
das PK1.9-Deletionskontrukt, welches die Aminosäuren 760–1312 von Ataxin-2 enthält (vgl.
Tabelle 1).
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Tabelle
1 Quantitative
ONPG-Flüssigassay
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Unter
diesen Deletionskonstrukturen zeigten nur diejenigen eine β-Galaktosidase-Aktivität, die carboxyterminale
Domänen
von Ataxin-2 exprimierten. Die Konstrukte vollständiger Länge zeigten geringe Mengen an β-Galaktosidase-Aktivität. Dies
kann auf die räumlichen
Begrenzungen des Gal4-Assay-Systems zurückzuführen sein.
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Die
Ergebnisse, die die Interaktion von Ataxin-2-bindenden Proteinen.
mit Ataxin-2 zeigen, sind konsistent mit der Beobachtung, dass das
SCA1-Genprodukt Ataxin-1, welches mit spinocerebellarer Ataxie vom Typ-1
assoziiert ist, mit LANP interagiert, einem Leucin-reichen, sauren
nukleärem
Protein. LANP und Ataxin-1 sind in Matrix-assoziierten subnukleären Strukturen
co-lokalisiert (Matilla et al., Nature 389: 974–978 (1997)). Ähnlich der
erhöhten
Assoziierung von Ataxin-2-bindendem
Protein mit Ataxin-2, das über
eine erhöhte
Anzahl von Glutamin-Resten verfügt,
ist die Assoziierung von LANP mit Ataxin-1 stärker, wenn eine erhöhte Anzahl von
Glutamin-Resten vorliegt.
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BEISPIEL 3
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Immunhistochemischer Färbungs-Assay
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Um
die Verteilung von Ataxin-2-bindendem Protein in den Zielgeweben
zu bestimmen, die am Phänotyp
der Ataxie beteiligt sind, wurden Antikörper gegen Ataxin-2-bindendes
Protein und Ataxin-2 verwendet, um zu zeigen, dass diese Proteine
in den selben Zellen vorlagen und das Ataxin-2-bindende Protein
ein Ziel für die
Ataxin-2-Bindung in vivo war. Die immunhistochemische Färbung wurde
mit 20 μg/ml
Kaninchen-Anti-Ataxin-2-bindendes.
Protein-Antikörper,
20 μg/ml
Präimmun-Serum
aus Kaninchen erreicht, welche mit Gewebeschnitten über Nacht
bei 4°C
inkubiert wurden. Primäre
Antikörper
wurden unter Verwendung des Vektor-ABC-Elite-Peroxidase-Kits (Vector
Labs, Burlingame, CA) detektiert, DAB-verstärkt und mit Diaminobenzidin
(DAB; Biomeda) sichtbar gemacht. Die Schnitte wurden unter Verwendung
von wässrigem
Hämatoxylin (Xymed)
gegengefärbt.
Absorptionskontrollen wurden unter Verwendung desselben Antikörpers durchgeführt, der
mit Peptidantigen bei 100 μM
für 3 Stunden,
bei Raumtemperatur präabsorbiert
war.
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Die
Expression von Ataxin-2 und Ataxin-2-bindendem Protein war im Cerebellum
(eines der Gewebe, die an der spinocerebellaren Ataxie des Typs
2 beteiligt sind) auf bestimmte Zelltypen beschränkt. Beide Proteine wurden
in Pukinje-Neuronen und Dentatus-Neuronen (dentate neurons) nachgewiesen,
hingegen wurde nur geringfügige
Expression in granulären
Neuronen (granule neurons) beobachtet. Die Färbung von beiden Proteinen
wurde darüber
hinaus auch in ausgewählten
Neuronen des Hippocampus, des cerebralen Kortex, des Thalamus und
des Gehirnstamms beobachtet.
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Das
Gen des Ataxin-2-bindenden Proteins wird in Purkinje-Neuronen und
Dentatus-Neuronen im Überfluss
exprimiert, und das Ataxin-2-bindende Protein weist eine deutliche
Lokalisierung im Cytoplasma auf. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um
zu bestimmen, ob Ataxin-2 in denselben Strukturen lokalisiert ist wie
Ataxin-2-bindendes Protein. Benachbarte Bereiche des Cerebellums
wurden präpariert
und die benachbarten Bereiche wurden mit Antikörpern gegen Ataxin-2-bindendes
Protein und Ataxin-2 gefärbt.
Es wurde eine klare Co-Lokalisierung von Ataxin-2-bindendem Protein
und Ataxin-2 bei punktierten Organellen in den Purkinje-Neuronen
und Dentatus-Neuronen beobachtet.
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Die
Gewebeverteilung von Ataxin-2-bindendem Protein und Ataxin-2 verweist
darauf, dass ihre Interaktion nicht nur für spinocerebellare Ataxie des
Typs 2 signifikant sein könnte,
sondern auch neurodegenerative Störungen erklären kann, die andere Gensequenzen
betreffen, welche eine Ausdehnung der Glutamin-Wiederholung durchlaufen.
Diese Interaktion könnte
auf gemeinsame biologische Wege bei der Gruppe von klinisch ähnlichen,
neurodegenerativen Störungen
verweisen, einschließlich
der spinocerebellaren Ataxie des Typs 1 und 6, der spinobulbaren
muskulären
Atrophie, der Huntington-Erkrankung und der Machado-Joseph-Erkrankung.
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BEISPIEL 4
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Northern-Blot-Analyse
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Gesamt
RNA-Proben wurden mit dem Triazolreagenz (GibcoBRL) aus verschiedenen
Bereichen des Maus-Gehirns und des Ratten-Cerebellums extrahiert. Die RNA wurde
auf einem 1,2%igen Agarosegel getrennt und auf GeneScreen-Plus-Membranen
(Du Pont) unter Verwendung hinlänglich
bekannter Verfahren geblottet. Das Fragment von A2BP (1/3 kb) wurde
durch BglII-Verdau von pGAD-A2BP gereinigt und wurde mittels T4-Kinase
und γ-32P-ATP markiert. Eine gleiche Menge Gesamt-RNA
in jeder Bahn wurde. durch Hybridisierung mit β-Actin als Kontrolle (Clontech)
bestätigt.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass ein 4,4 kb mRNA-Transkripts, welches A2BP
kodiert, in folgenden Maus-Gehirn-Geweben vorliegt: Cerebellum (Bahn
1), Kortex (Bahn 2), Gehirnstamm (Bahn 3), Thalamus und Hypothalamus
(Bahn 4) und Ratten-Cerebellum (Bahn 9). Eine geringfügig kleinere
Bande wurde im Herz beobachtet (Bahn 5), was auf eine potentielle
Spleiß-Variante
des Nukleinsäure-Transkripts
verweist.
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BEISPIEL 5
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Co-Immunpräzipitations-Assay
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Um
zu zeigen, das A2BP in menschlichen Zellen an Ataxin-2 bindet, wurden
Co-Immunpräzipitations-Assay
in HTB10-Zellen durchgeführt.
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Kaninchen-Anti-Ataxin-2-Antikörper, die
als Anti-SCA2A-Antikörper
und Anti-SCA2B-Antikörper
bezeichnet wurden, wurden gegen die Peptide erzeugt, welche den
Aminosäuren
359–371
bzw. den Aminosäuren
904–921
des humanen Ataxin-2-Proteins entsprachen, wobei die humane Ataxin-2-Proteinsequenz
in Pulst et al., 1996, Nature Genetics, 14: 269–276 aufgeführt ist. Darüber hinaus
wurden Anti-A2BP-Antikörper, die
als 1734-2 bezeichnet wurden, gegen das Peptid erzeugt, welches
den Aminosäuren
177–190
des erfindungsgemäßen humanen
A2BP entsprach. Die primären
Antikörper
wurden mit Hilfe des ECL-Western-Blot-Detektionssystems (erhältlich von
Amersham) detektiert.
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Native
HTB10-Zellen wurden nach 48 Stunden Inkubation bei 37°C geerntet
und in RIPA-Puffer (50 mM Tris-Cl, 0,1% SDS, 0,5% Desoxycholsäure, 1%
Tween 20, 0,05% NaN2) homogenisiert, der
2 μg/ml
Aprotinin, 1 μg/ml
Leupeptin, 500 μg/ml
Pefabloc SC, 1 μg/ml
Pepstatin enthielt. Die Lysate wurden für jeweils 1 Stunde mit Formalin-fixierten
Staphylococcus aureus-Zellen
(Sigma) und anschließend
mit Kaninchen-Serum-Agarose (Sigma) bei Raumtemperatur vorgereinigt.
Die vorgereinigten Lysate wurden mit dem Anti-SCA2A-Antikörper oder
mit dem Anti-A2BP-Antikörper "1734-2" bei 4°C über Nacht
inkubiert. Anschließend wurde
Protein A/G-Säule
(CytoSignal) zu den Lysaten gegeben und es wurde bei 4°C für 1 Stunde
inkubiert, um die Antigen-Antikörper-Komplexe
zu erhalten. Die Säule
wurde mehrfach mit RIPA-Puffer gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden
von Spin-Filter-Säulen
(CytoSignal) durch Zentrifugation mit 2 × Probenpuffer (62,5 mM Tris,
pH 6,8, 4% SDS, 20% Glycerol, 5% β-Mercaptoethanol,
0,0025% Bromphenolblau) erhalten. Die endogene Expression von Ataxin-2
und erfindungsgemäßem A2BP
in HTB-Zellen wurde mit dem Anti-SCA2A-Antikörper, dem Anti-SCA2B-Antikörper und
dem Anti-A2BP-Antikörper
1734-2 bestätigt.
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Wie
oben dargestellt, wurden vorgereinigten Lysate der HTB10-Zellen entweder mit
dem Anti-SCA2A-Antikörper
oder dem Anti-A2BP-Antikörper 1734-2
immunpräzipitiert.
Das Präzipitat
wurde mittels Western-Blot mit dem Anti-SCA2B-Antikörper analysiert
(5). Eine einzelne Bande von 145 kd, die der erwarteten
Größe von endogenem
Ataxin-2 entsprach, wurde in der Probe detektiert, die mit dem Anti-A2BP-Antikörper 1734-2
sowie auch mit dem Anti-SCA2A-Antikörper präzipitiert wurde (Bahnen B).
Es wurden keine Banden in Proben detektiert, die mit Prä-Immunserum präzipitiert
wurden (Bahnen PB).
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BEISPIEL 6
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Ataxin-2,
das Genprodukt der autosomal-dominanten spinocerebellaren Ataxie
des Typs 2 (SCA2) ist ein Protein mit unbekannter Funktion. Ataxin-2
interagiert mit A2BP1, einem Mitglied einer neuen Familie von RNA-bindenden
Proteinen. Da Ataxin-2 wie auch A2BP1 evolutionär konserviert sind, wurden
Expressionsmuster und Funktion von korrespondierenden Homologen
in C. elegans untersucht. Das humane SCA2-Gen weist gegenüber seinem
Homolog in C. elegans (CeAtaxin-2) eine Aminosäure-Identität von 19,3% auf. In ähnlicher
Weise ist das Ataxin-2-bindende
Protein 1 (A2BP1) zu 29,8% identisch zu dem homologen C. elegans-Protein
CeA2BP1. Das Expressionsmuster von Ce-Ataxin-2 wurde unter Verwendung des
CeAtaxin-2-Promotors untersucht, der mit einem GFP-Expressionsvektor
gekoppelt war. CeAtaxin-2 wurde im umfassenden Maße im adulten
Wurm mit starker Expression im Muskel exprimiert.
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Um
die Funktion von CeAtaxin-2 und CeA2BP1 aufzuklären, wurde eine RNA-Interferenz-Degradation von
nativer mRNA durchgeführt.
Die interferierende doppelsträngige
RNA wurde durch Mikroinjektion oder Einweichen in Würmer des
N2-Stamms im Larven-L4-Stadium eingebracht. Die Mikroinjektion wurde
als eine 2-Gonadeninjektion durchgeführt. Das Einweichen umfasste
das Belassen der Würmer
in einer dsRNA-Lösung
für 24
Stunden. Im Einklang mit früheren
RNAi-Untersuchungen war die Mikroinjektion effektiver als das Einweichen.
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Die
Ergebnisse sind in den 6 und 7 gezeigt.
DsRNA, die das CeAtaxin-2-Gen vollständiger Länge darstellte, führte zu
einem frühen
letalen Phänotyp
bei der Nachkommenschaft von allen 40 mittels Mikroinjektion behandelten
Würmern.
RNAi für
das CeA2BP1 vollständiger
Länge zeigte
eine ähnliche
Unterbrechung bei der Entwicklung. Die Ergebnisse verweisen darauf,
dass sowohl CeAtaxin-2 als auch CeA2BP1 essentielle zelluläre Gene
bei der frühen
Entwicklung von C. elegans sind. Beide sind in Säugetieren in hohem Maße konserviert.
Die Tatsache dass beide Gene zu einem frühen letalen Phänotyp führen, wenn
man mit RNAi auf sie abstellt, unterstreicht die früheren Erkenntnisse
bezüglich
der Interaktion von Ataxin-2 und A2BP1. Da beide RNA-bindende Eigenschaften
aufweisen, werden beide als essentielle Bestandteile des RNA-Lokalisierungsnetzwerks
angesehen, das die zelluläre
Polarität
herstellt. In ähnlicher
Weise wird vorgeschlagen, dass Ataxin-2 und A2BP1 in polarisierten
Zellen höherer
Differenzierung, wie beispielsweise in Neuronen, eine ähnliche
Funktion aufweisen für
die neuronale Plastizität
entscheidend sind.
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