DE69924120T2

DE69924120T2 - Für ataxin-2-bindende proteine kodierende nukleinsäure, damit verwandten produkten und verfahren zur deren anwendung

Info

Publication number: DE69924120T2
Application number: DE69924120T
Authority: DE
Inventors: M. Stefan PULST; Shibata
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Current assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 1998-09-01
Filing date: 1999-09-01
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2019-09-02
Also published as: US20010018198A1; EP1108026B1; US6194171B1; JP2002523094A; WO2000012710A8; US6617430B2; EP1108026A1; WO2000012710A1; DE69924120D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Molekularbiologie und insbesondere Nukleinsäuren und die von diesen kodierten Proteine. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodieren neue Ataxin-2-bindende Proteine. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Nukleinsäuren und Proteine, beispielsweise um bestimmte Erkrankungen zu behandeln.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zahlreiche Erkrankungen, die durch einen abnormalen oder unerwünschten Zelltod oder ein abnormales oder unerwünschtes Zellwachstum gekennzeichnet sind, sind das Ergebnis einer abnormalen Gen-Expression oder Gen-Aktivität. Zelluläre degenerative und hyperproliferative Störungen, wie beispielsweise die Alzheimer-Erkrankung und Krebs sind zwei besondere Beispiele. Obwohl einige Gene identifiziert worden sind, die zu degenerativen und hyperproliferativen Störungen beitragen, werden die Signal-Transduktionswege, welche die Entwicklung solcher Störungen vermitteln, gegenwärtig nicht hinlänglich verstanden.
Die spinocerebellare Ataxie des Typs 2 ist ein Beispiel für eine Gruppe von klinisch ähnlichen, erblichen, degenerativen Störungen mit spätem Beginn, die das Gehirn und das Zentralnervensystem betreffen. Ein einzelnes auf dem Chromosom 12 lokalisiertes Gen SCA2 ist mit der Entwicklung von spinocerebellarer Ataxie des Typs 2 in Verbindung gebracht worden; SCA2 kodiert Ataxin-2, ein Protein von 140 kDa, dessen Funktion bislang unbekannt ist. Klinisch ähnliche neurodegenerative Störungen umfassen beispielsweise die spinocerebellaren Ataxien des Typs 1 und 6, die spinobulbare muskuläre Atrophie, die Huntington-Erkrankung und die Machado-Joseph-Erkrankung (Trottier et al., Nature 378: 403–406 (1995)). Obwohl die Entwicklung dieser ähnlichen Störungen durch verschiedene Gene vermittelt wird, löst eine gemeinsame genetische Veränderung den Beginn der Erkrankungen aus. Im Falle der spinocerebellaren Ataxie des Typs 2 zeigen betroffene Individuen beispielsweise eine Ausdehnung (expansion) des CAG-Trinukleotids im SCA2 sowie eine entsprechende Zunahme der Anzahl von Glutamin-Resten im kodierten Ataxin-2-Protein (Pulst et al., Nat. Genet. 14: 269–276 (1996)). Üblicherweise weisen Betroffene eine Polyglutamin-Sequenz von etwa 35–39 Resten auf, wohingegen normale Individuen über etwa 22 zusammenhängende Glutamin-Reste im Ataxin-2 verfügen. In ähnlicher Weise korreliert die Ausdehnung von CAG-Wiederholungen in Genen, die mit den spinocerebellaren Ataxien des Typs 1 und 6, der spinobulbaren muskulären Atrophie, der Huntington-Erkrankung sowie der Machado-Joseph-Erkrankung in Zusammenhang stehen, mit der Entwicklung dieser Störungen. Aufgrund dieser gemeinsamen genetischen Veränderung werden die Erkrankungen gemeinsam als Glutamin-Wiederholungs-Störungen (glutamine repeat disorders) bezeichnet.
Trotz dieser genetischen Erkenntnisse wird die Funktion der Gene, wie beispielsweise SCA2 im Allgemeinen, sowie die Rolle der Ausdehnung der CAG-Wiederholung und der entsprechenden Ausdehnung der Glutamin-Sequenz bei der Entwicklung von degenerativen Störungen, wie beispielsweise der spinocerebellaren Ataxie des Typs 2 im Besonderen, nicht verstanden. Die Glutamin-Wiederholungs-Sequenz von SCA3 liegt bei normalen Individuen im gleichen Größenbereich wie die der Glutamin-Wiederholungs-Sequenz von SCA2 in Individuen, die von spinocerebellarer Ataxie des Typs 2 betroffen sind. Gleichermaßen sind die molekularen Komponenten, die die zelluläre Degeneration regulieren oder vermitteln, sowie die Mechanismen, durch die diese am Signal-Transduktionsweg teilnehmen, nicht verstanden.
Es besteht somit eine Notwendigkeit, die molekularen Komponenten, die an diesem Signal-Transduktionsweg teilnehmen, wie beispielsweise Proteine, welche in vivo an Ataxin-2 binden, zu identifizieren und zu charakterisieren. Ferner besteht ein Bedürfnis, die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen der jeweiligen Gene und Genprodukte, ihre Aktivitäten und die funktionalen Domänen solcher bindenden Proteine zu identifizieren. Soweit solche Moleküle identifiziert werden, können sie die Basis für die Entwicklung von diagnostischen Protokollen oder klinischen Therapien bilden, die für die Diagnose oder Behandlung von Störungen nützlich sind, welche durch zelluläre Degeneration oder Hyperproliferation gekennzeichnet sind. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis und stellt darüber hinaus weitere Vorteile bereit.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue isolierte Nukleinsäuren bereitgestellt, die für Ataxin-2-bindende Proteine (A2BPs) oder funktionale Fragmente derselben kodieren. Die Erfindung stellt ferner Vektoren bereit, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfassen, sowie rekombinante Zellen, die mit diesen transformiert sind, Antisense-Nukleinsäuren zu diesen sowie damit in Verbindung stehende Zusammensetzungen. Ferner werden Oligonukleotide bereitgestellt, die in der Lage sind, mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zu hybridisieren, wobei solche Oligonukleotide ferner markiert sind. Die vorliegend beschriebenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind als Sonden für die Untersuchung einer Menge von A2BP-mRNA in einer Probe sowie zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die ein A2BP kodieren, nützlich. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind ferner zur Expression in Zellen zum Zwecke der Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten der A2BP-Funktion nützlich.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden ferner neue isolierte Ataxin-2-bindende Proteine (A2BPs) bereitgestellt, die die Fä higkeit haben, Ataxin-2 zu binden, oder die Fähigkeit haben, an ein Nukleinsäuremolekül zu binden. Verfahren zur Expression von A2BP oder funktionalen Fragmenten derselben werden ebenfalls bereitgestellt. Proteine und Fragmente derselben sind nützlich in Bioassays, als therapeutische Zusammensetzungen sowie als Immunogene zur Herstellung von Anti-A2BP-Antikörpern. Ferner werden transgene nicht-humane Säugetiere bereitgestellt, die das erfindungsgemäße A2BP oder Mutanten desselben exprimieren. Transgene nicht-humane Säugetiere, die kein endogenes A2BP exprimieren, werden ebenfalls bereitgestellt.
Antikörper mit spezifischer Reaktivität gegen A2BP werden ebenfalls bereitgestellt. Diese Antikörper sind nützlich zur Detektion von A2BP in einer Probe in diagnostischen Assays oder zur Identifizierung von Genen, die Proteine mit ähnlicher Immunreaktivität gegen A2BP kodieren. Die erfindungsgemäßen Antikörper können ferner verwendet werden, um ein A2BP aus einer biologischen Flüssigkeit, Geweben, Zellen o.ä. zu reinigen.
Verfahren zur Identifizierung von A2BP-bindenden Proteinen werden ebenfalls bereitgestellt. Ein Verfahren umfasst das Inkontaktbringen einer Probe, die ein A2BP-bindendes Protein umfasst, und die Identifizierung des daran bindenden Proteins. Ferner werden Verfahren zur Identifizierung eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt, das an A2BP bindet. Ein Verfahren umfasst das Inkontaktbringen einer Probe, die Nukleinsäuren enthält, und die Identifizierung des daran bindenden Nukleinsäuremoleküls.
Verfahren zum Modulieren der Aktivität eines Proteins oder einer RNA, das/die A2BP bindet, werden ebenfalls bereitgestellt. Ein Verfahren umfasst das Inkontaktbringen eines A2BP-bindenden Proteins oder Nukleinsäuremoleküls mit einem im We sentlichen reinen A2BP oder einem funktionalen Fragment desselben. Ein Verfahren zum Modulieren der Aktivität von Ataxin-2 wird ebenfalls bereitgestellt.
Verfahren zur Behandlung einer degenerativen oder hyperproliferativen Störung werden ebenfalls bereitgestellt. Ein Verfahren der Erfindung verwendet eine Antisense-A2BP-Nukleinsäure in einer Menge, die wirksam ist, um die Expression eines humanen A2BP zu inhibieren. Ein Verfahren verwendet A2BP oder ein funktionales Fragment desselben oder Agonisten oder Antagonisten zu diesen, die an ein Subjekt verabreicht werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Diagramm der Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit und -Identität zwischen einem erfindungsgemäßen A2BP und dem Nematoden-Homolog CE04910.
2 zeigt das Ergebnis der in Beispiel 2 beschriebenen Polyglutamin-Ausdehnungs-Untersuchungen.
3 zeigt eine Kartierung der in Beispiel 2 beschriebenen Ataxin-2-Deletionskonstrukte.
4 zeigt die Ergebnisse des in Beispiel 4 beschriebenen Northern-Blot-Assays.
5 zeigt die Ergebnisse des in Beispiel 5 beschriebenen Co-Immunpräzipitations-Assays.
6 zeigt die Wirkung der Injektion von RNAi des Ataxin-2 auf frühe Embryos von C. elegans (n = 36 Würmer). Die Eier pro Wurm (Ordinate) sind als Funktion der Zeit in Stunden (h) nach Injektion (Abszisse) gezeigt. Eine RNA-Interferenz führt zu einer frühzeitigen embryonischen Letalität.
7 zeigt die Wirkung der Injektion von RNAi des Ataxin-2-bindenden Proteins auf frühe Embryos von C. elegans (n = 40 Würmer). Die Eier pro Wurm (Ordinate) sind als Funktion der Zeit in Stunden (h) nach Injektion (Abszisse) gezeigt. Eine RNA-Interferenz führt zu einer frühzeitigen embryonischen Letalität.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nukleinsäuren bereitgestellt, die neue Ataxin-2-bindende Proteine (A2BPs) aus Säugetieren sowie funktionale Fragmente derselben kodieren. Wie vorliegende verwendet sind erfindungsgemäße A2BPs diejenigen, die die Fähigkeit haben (vorzugsweise in vivo) an mindestens eine Form eines von einem SCA2-Gen kodierten Ataxin-2-Proteins, an Ataxin-2-ähnliche-Proteine oder an ein Nukleinsäuremolekül zu binden. Der Begriff "A2BP" bezeichnet ein im Wesentlichen reines, natives A2BP oder rekombinant hergestellte Proteine, einschließlich natürlich vorkommender allelischer Varianten derselben, wie beispielsweise mRNA, die durch alternatives Spleißen des primären Transkripts erzeugt wurde, Fragmente derselben, welche mindestens eine native biologische Aktivität beibehalten haben, einschließlich einer Fähigkeit, an Ataxin-2 zu binden, einer Fähigkeit, an ein Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise eine RNA, zu binden, oder die Immunogenität aufweisen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die vorliegend angesprochenen A2BPs diejenigen Polypeptide, die spezifisch durch einen Antikörper erkannt werden, welcher ebenfalls spezifisch ein A2BP (vorzugsweise humanes) erkennt, einschließlich einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 aufgeführt ist. Die gemäß der Erfindung iso lierten A2BPs sind frei von zellulären Bestandteilen oder Kontaminationen, die normalerweise mit einer nativen in vivo-Umgebung assoziiert sind.
Ataxin-2 ist mit der Entwicklung von spinocerebellarer Ataxie des Typs 2 assoziiert; eine Mutation von Ataxin-2 durch Ausdehnung einer Polyglutamin-Wiederholungs-Sequenz führt zur Entwicklung eines neurodegenerativen Phänotyps. Aus diesem Grund wird angenommen, dass andere, dem Ataxin-2 ähnliche Glutamin-Wiederholungs-Gene (z.B. das Gen der Machado-Joseph-Erkrankung, das Gen der Huntington-Erkrankung u.ä.) eine Funktion bei dem die Zelldegeneration regulierenden Signal-Transduktionsweg aufweisen. Die Bindung von A2BP mit Ataxin-2 verweist darauf, dass A2BP ein Bestandteil dieses Signal-Transduktionswegs ist und folglich ein Bestandteil der Regulation der Zelldegeneration ist.
Darüber hinaus ist durch Identifikation der erfindungsgemäßen, bindenden Proteine von Ataxin-2 entdeckt worden, dass Ataxin-2 eine Rolle. bei der Gen-Regulation zu haben scheint. Beispielsweise binden die erfindungsgemäßen A2BPs, die SEQ ID NO: 2 umfassen, an RNA, wodurch für die Regulation der Genexpression auf den selektiven Transport von RNA abgestellt wird. Ferner spielt die Bindung von A2BPs an RNA eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Genexpression. A2BP1 beispielsweise ist ein Gen, das sehr früh in der Embryonalentwicklung durch selektiven Transport von spezifischen RNAs agiert, was durch die RNA-bindenden Domänen in A2BP1 (siehe Beispiel 6) vermittelt wird. Dieser neue Prozess ist für die Funktionstüchtigkeit von adulten Nervenzellen und für Prozesse wie Lernen und Gedächtnis von Bedeutung.
Die vorliegend beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können beispielsweise nützlich sein, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen, wenn solche Nukleinsäuren in eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Expressionssystemen eingebracht werden. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Fragmente derselben mit einer detektierbaren Markierung markiert werden und beispielsweise als Hybridisierungs-Sonden für die Untersuchung des Vorhandenseins oder der Menge eines erfindungsgemäßen A2BP-Gens oder einer A2BP-mRNA in einer gegebenen Probe verwendet werden. Die vorliegend beschriebenen Nukleinsäuremoleküle oder Fragmente derselben sind ferner auch als Primer oder Matrizen (templates) in einer PCR-Reaktion zur Amplifikation von Genen nützlich, die die vorliegend beschriebenen erfindungsgemäßen Proteine kodieren.
Der Begriff "Nukleinsäure", der auch als Polynukleotid, Oligonukleotid oder Primer bezeichnet wird, umfasst Ribonukleinsäure (RNA) und Desoxyribonukleinsäure (DNA), die doppelsträngig oder einzelsträngig sein können. RNA kann ungespleißt oder gespleißt sein (d.h. mRNA), tRNA oder rRNA, und die DNA kann komplementäre DNA (cDNA) oder genomische DNA sein, wie beispielsweise eine Nukleinsäure, die ein A2BP-Polypeptid kodiert, oder ein Antisense-Molekül zu dieser.
Die Verwendung der Begriffe "isoliert" oder "gereinigt" als Modifikationsmittel von DNA, RNA, Polypeptiden oder Proteinen bedeutet im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der vorliegenden Ansprüche, dass die so bezeichneten DNA, RNA, Polypeptide oder Proteine in einer solchen Form durch menschliche Einwirkung hergestellt worden sind und folglich von ihrer nativen zellulären in vivo-Umgebung getrennt sind und im Wesentlichen frei von anderen Arten von Nukleinsäure oder Protein vorliegen. Als Folge dieser menschlichen Intervention sind die rekombinanten DNAs, RNAs, Polypeptide oder Proteine der Erfindung auf eine der vorliegend beschriebenen Arten nützlich, während die DNAs, RNAs, Polypeptide oder Proteine in ihrer natürlichen Erscheinungsform dies nicht sind.
Ein Mittel zur Isolierung einer Nukleinsäure, die ein A2BP-Polypeptid kodiert, ist das Durchsuchen (Screening) einer Nukleinsäure-Bibliothek mit einer natürlichen oder einer künstlich erstellten Sonde (z.B. DNA, Antikörper, und Ähnlichem) unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik hinlänglich bekannt sind (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). DNA-Sonden, die von einem A2BP-Gen aus einem Säugetier abgeleitet wurden, sind für diesen Zweck besonders nützlich. DNA- und cDNA-Moleküle, die A2BP-Polypeptide kodieren, können verwendet werden, um komplementäre genomische DNA, cDNA oder RNA aus Säugetieren (z.B. aus Mensch, Affe, Maus, Ratte, Kaninchen, Schwein, Kuh und Ähnlichem) oder aus anderen tierischen Quellen zu erhalten, oder, um verwandte cDNA oder genomische Klone durch Screening von cDNA-Bibliotheken oder genomischen Bibliotheken mittels der im Folgenden näher beschriebenen Verfahren zu isolieren. Beispiele für solche Nukleinsäuren sind RNA, cDNA oder isolierte genomische DNA, die ein A2BP-Polypeptid kodieren. Solche Nukleinsäuren umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Nukleinsäuren, die im Wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz wie die in SEQ ID NO: 1 aufgeführte umfassen.
Wie vorliegend verwendet bezeichnet "Säugetier" eine Vielzahl von Arten, von denen das erfindungsgemäße A2BP abgeleitet ist, z.B. humanes, Ratten-, Maus-, Kaninchen-, Affen-, Pavian-, Rinder-, Schweine-, Schaf-, Hunde-, Katzen-A2BP und Ähnliche. Ein vorliegend bevorzugtes A2BP ist humanes A2BP.
Gemäß einer Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren im Wesentlichen dieselbe Nukleinsäuresequenz wie die in SEQ ID NO: 1 aufgeführte. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfassen die A2BP kodierenden, erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle im Wesentlichen dieselbe Nukleinsäurese quenz, wie die Nukleotide 1987–1979 von SEQ ID NO: 1. Bevorzugte Nukleinsäuremolekül-cDNAs, die die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, umfassen dieselbe Nukleotidsequenz wie die Nukleotide 1987–1979 von SEQ ID NO: 1.
Wie vorliegend verwendet, bedeutet "im Wesentlichen dieselbe" in Bezug auf eine Nukleotidsequenz eine Nukleinsäure mit ausreichender Identität zu dem Referenz-Polynukleotid, sodass es unter moderat stringenten Hybridisierungsbedingungen an das Referenz-Nukleotid binden wird (z.B. Bedingungen, unter denen Polynukleinsäure-Hybride stabil sind). Gemäß einer Ausführungsform kodiert eine DNA-Sequenz mit einer Nukleotidsequenz, die im Wesentlichen der Referenz-Nukleotidsequenz gleicht, im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die in SEQ ID NO: 1 aufgeführte. Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist eine DNA-Sequenz mit im Wesentlichen derselben Nukleotidsequenz wie die Referenz-Nukleotidsequenz mindestens 60% Identität in Bezug auf die Referenz-Nukleotidsequenz auf. DNA mit mindestens 70%, vorzugsweise mit mindestens 90% und darüber hinaus bevorzugt mit mindestens 95% Identität zu der Referenz-Nukleinsäure ist bevorzugt.
Diese Erfindung umfasst darüber hinaus Nukleinsäuren, die von den in SEQ ID NO: 1 aufgeführten Nukleinsäuren abweichen, jedoch denselben Phänotyp aufweisen. Solche Nukleinsäuren unterscheiden sich in Bezug auf ihre Nukleotidsequenz, sind jedoch verwandt und werden von Fachmann als "funktional äquivalente Nukleinsäuren" angesehen. Daher umfasst der Begriff "funktional äquivalent" in Bezug auf Nukleinsäuremoleküle Nukleinsäuren mit leichten oder folgenlosen (non-consequential) Sequenzabweichungen, solange diese im Wesentlichen in derselben Weise funktionieren, um im Wesentlichen dasselbe (dieselben) Proteinprodukt(e) zu bilden wie die vorliegend offenbarten Nukleinsäuren. Beispielsweise kodieren funktional äquivalente Nukleinsäuremoleküle insbesondere Polypeptide, die dieselben sind wie diejenigen, die durch die vorliegend offenbarten Nukleinsäuren kodiert werden, oder Nukleinsäuren, die beispielsweise konservative Aminosäure-Austausche kodieren. Konservative Austausche umfassen beispielsweise den Austausch eines nicht-polaren Restes gegen einen anderen nicht-polaren Rest, oder den Austausch eines geladenen Restes gegen einen geladenen Rest. Funktional äquivalente Nukleinsäuremoleküle umfassen ferner geringfügige Modifikationen, die vom Fachmann als solche angesehen werden, die die Tertiärstruktur des kodierten Proteins im Wesentlichen nicht verändern, wie beispielsweise interne Deletionen oder Trunkierungen, welche beispielsweise geringfügige Deletionen am Carboxy- oder Aminoterminus erzeugen.
Darüber hinaus werden Nukleinsäuren bereitgestellt, die A2BP-Polypeptide kodieren, welche aufgrund der Degeneration des genetischen Codes nicht notwendigerweise an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren hybridisieren. Dennoch sind solche Nukleinsäuren funktionale Äquivalente, da sie im Wesentlichen dasselbe (dieselben) Proteinprodukt(e) erzeugen. Bevorzugte Nukleinsäuren, die die erfindungsgemäßen A2BPs kodieren, bestehen aus Nukleotiden, die im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz kodieren wie in SEQ ID NO: 1 aufgeführte.
Eine beispielhafte Nukleinsäure, die ein erfindungsgemäßes A2BP kodiert, kann somit ausgewählt sein aus:

(a) DNA, welche die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte Aminosäuresequenz kodiert,
(b) DNA, welche mit der DNA von (a) unter moderat stringenten Bedingungen hybridisiert, wobei die DNA biologisch aktives A2BP kodiert, oder
(c) DNA, welche entweder im Hinblick auf das obige (a) oder (b) degeneriert ist, wobei die DNA biologisch aktives A2BP kodiert.

Hybridisierung bezeichnet die Bindung von Nukleinsäuremolekülen, die in Bezug zueinander eine Komplementärität aufweisen, mittels Wasserstoff-Bindungen, die den Bindungen ähnlich sind, welche natürlicherweise in chromosomaler DNA (d.h. Sense:Antisense-Stränge oder Sonde:Ziel-DNA) vorkommen. Das Ausmaß der Stringenz, das angewendet wird, um eine gegebene Nukleinsäuresonde mit Ziel-DNA zu hybridisieren, sodass das Hybrid stabil ist, kann vom Fachmann problemlos bestimmt und (falls gewünscht) verändert werden.
Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "stringente Hybridisierung" Bedingungen, unter denen Polynukleinsäure-Hybride stabil sind. Wie dem Fachmann bekannt ist, spiegelt sich die Stabilität eines Hybrids in der Schmelztemperatur (T_m) von Hybriden wieder, die durch den G:C-Gehalt der Sequenz, die Sequenzlänge und andere im Stand der Technik bekannte physikalische Eigenschaften und Hybridisierungsbedingungen bestimmt wird (Sambrook et al., siehe oben, 1989). Beispielsweise beeinflusst die Menge der vorhandenen Natrium-Ionen die Stabilität eines Hybrids. Üblicherweise wird die Hybridisierung oder der Bindungsschritt unter Bedingungen von geringerer Stringenz durchgeführt, gefolgt von Waschvorgängen von veränderter, jedoch höherer Stringenz. Der Verweis auf das Ausmaß der Hybridisierungs-Stringenz betrifft solche Waschbedingungen.
Der Ausdruck "moderat stringente Hybridisierung" bezieht sich auf Bedingungen, die es Ziel-DNA erlauben, an eine komplementäre Nukleinsäure zu binden, welche etwa 60% Identität, vorzugsweise etwa 75% Identität, stärker bevorzugt etwa 85% Identität zu der Ziel-DNA aufweist; wobei mehr als etwa 90% Identität zur Ziel-DNA besonders bevorzugt sind. Moderat stringente Bedingungen sind vorzugsweise Bedingungen, die beispielsweise einer Hybridisierung in 50% Formamid, 5 × Denhardt-Lösung, 5 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C gefolgt von Waschen in 0,2 × SSPE, 0,2% SDS bei 65°C entsprechen.
Der Ausdruck "Hybridisierung von hoher Stringenz" bezeichnet Bedingungen, die eine Hybridisierung von nur denjenigen Nukleinsäuresequenzen erlauben, die in 0,018 M NaCl bei 65°C stabile Hybride bilden (d.h. wenn ein Hybrid in 0,018 M NaCl bei 65°C nicht stabil ist, wird es unter den vorliegend vorgeschlagenen Bedingungen hoher Stringenz nicht stabil sein). Bedingungen von hoher Stringenz können beispielsweise durch Hybridisierung in 50% Formamid, 5 × Denhardt-Lösung, 5 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C gefolgt von Waschen in 0,1 × SSPE und 0,1% SDS bei 65°C geschaffen werden.
Der Ausdruck "Hybridisierung von geringer Stringenz" bezeichnet Bedingungen, die einer Hybridisierung in 10% Formamid, 5 × Denhardt-Lösung, 6 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C gefolgt von Waschen in 1 × SSPE, 0,2% SDS bei 50°C entsprechen.
Denhardt-Lösung und SSPE sind dem Fachmann hinlänglich bekannt, wie auch andere geeignete Hybridisierungs- und Wasch-Puffer (Sambrook et al., siehe oben, 1989).
Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "degeneriert" Triplet-Codons, die in mindestens einem Nukleotid von einer Referenz-Nukleinsäure abweichen, jedoch dieselbe Aminosäuresequenz wie die Referenz-Nukleinsäure kodieren. Beispielsweise sind Codons, die durch die Triplets "UCU", "UCC", "UCA", und "UCG" in. Bezug zueinander degeneriert, da alle vier Codons dieselbe Aminosäure Serin kodieren. Nukleinsäuren, die in Bezug auf die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren degeneriert sind, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung ausdrücklich vorgeschlagen.
Bevorzugte Nukleinsäuren kodieren ein erfindungsgemäßes Polypeptid (erfindungsgemäße Polypeptide), das (die) unter moderat stringenten, vorzugsweise unter Bedingungen von hoher Stringenz mit im Wesentlichen der gesamten Sequenz oder wesentlichen Teilen (d.h. üblicherweise mindestens 15 Nukleotiden) der in SEQ ID NO: 1 aufgeführten Nukleinsäuresequenz mit den Nukleotiden 987–1979 hybridisiert (hybridisieren).
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können durch eine Vielzahl von im Stand der Technik hinlänglich bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren, wie beispielsweise PCR-Amplifikation unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern. aus verschiedenen Bereichen von SEQ ID NO: 1. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren können synthetisch durch kommerzielle Anbieter hergestellt werden, wobei solche Nukleinsäuren zusätzlich modifiziert oder mit Nukleotid-Analoga substituiert sein können.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können wahlweise markierte A2BP-kodierende cDNAs oder Fragmente derselben als Sonden verwendet werden, um eine Bibliothek (Bibliotheken), wie beispielsweise (eine) cDNA-, genomische, EST-Bibliothek(en), auf zusätzliche Nukleinsäuresequenzen zu untersuchen, die neue Säugetier-A2BPs kodieren. Solche Bibliotheken sind kommerziell verfügbar oder können unter Verwendung von im Stand der Technik hinlänglich bekannten Verfahren konstruiert werden. Das Screening einer Bibliothek mit einer DNA-Sonde wird zunächst unter Bedingungen von geringer Stringenz durchgeführt, die eine Temperatur von weniger als 42°C, eine Formamid-Konzentration von weniger als 50% und eine moderate bis geringe Salzkonzentration umfassen.
Gegenwärtig bevorzugte Screening-Bedingungen bezüglich der Nukleinsäurehybridisierung umfassen eine Temperatur von etwa 37°C, eine Formamid-Konzentration von etwa 20% und eine Salzkonzentration von 5 × Standard Salz-Citrat-Lösung (standard saline citrate, SSC; 20 × SSC enthält 3 M Natriumchlorid, 0,3 M Natrium-Citrat, pH 7,0). Solche Bedingungen erlauben die Identifizierung von Sequenzen mit einem wesentlichen Grad an Ähnlichkeit zu der Sequenz einer DNA-Sonde, wobei keine perfekte Homologie erforderlich ist. Der Begriff "wesentliche Ähnlichkeit" bezeichnet Nukleotidsequenzen, die eine Homologie von mindestens etwa 50% gemeinsam haben. Vorzugsweise werden Hybridisierungsbedingungen ausgewählt werden, die die Identifizierung von Sequenzen mit mindestens etwa 70% Homologie zu der Sonde erlauben, während Sequenzen mit geringerer Homologie zu der Sonde unterschieden werden. Als Ergebnis können Nukleinsäuren erhalten werden, die im Wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz aufweisen wie die in SEQ ID NO: 1 aufgeführte.
Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "Sonde" ein Molekül, wie beispielsweise eine Nukleinsäure (z.B. eine DNA) oder ein Protein (z.B. ein Antikörper), die/das zum Identifizieren, Isolieren oder Quantifizieren eines Gens, eines Genprodukts oder eines Proteins verwendet werden kann. Eine Nukleinsäure-Sonde ist im Allgemeinen beispielsweise eine einzelsträngige DNA oder RNA, oder ein Analog derselben, mit einer Nukleotidsequenz aus mindestens 14, mindestens 20, mindestens 50, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400 oder mindestens 500 zusammenhängenden Basen, die beliebigen in SEQ ID NO: 1 aufgeführten zusammenhängenden Basen entsprechen oder komplementär zu diesen sind. Bevorzugte Bereiche, aus denen eine solche DNA-Sonde konstruiert werden soll, umfassen 5'- oder 3'-kodierende Bereiche von SEQ ID NO: 1. Sofern es erwünscht ist, kann der gesamte kodierende Bereich der cDNA eines erfindungsgemäßen A2BP oder die gesamte der SEQ ID NO: 1 entsprechende Sequenz als Sonde verwendet werden. Die Sonden können wie nachfolgend beschrieben nach im Stand der Technik bekannten Verfahren markiert werden, und sie können in verschiedenen kommerziell verfügbaren diagnostischen Kits wie nachfolgend beschrieben verwendet werden.
Wie vorliegend verwendet bezeichnen die Begriffe "Markierung" und "nachweisendes Mittel" in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen einzelne Atome und Moleküle, die entweder direkt oder indirekt an der Erzeugung eines nachweisbaren Signals beteiligt sind. Jede Markierung oder jedes nachweisende Mittel kann mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sonden, den exprimierten Proteinen, Polypeptidfragmenten oder Antikörper-Molekülen verbunden sein. Diese Atome oder Moleküle können allein oder in Verbindung mit zusätzlichen Reagenzien verwendet werden. Gemäß einer Ausführungsform ist die nachweisende Gruppe ein Enzym, wie beispielsweise Meerrettich-Peroxidase (HRP), Glucose-Oxidase und Ähnliches. Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden radioaktive Elemente, wie beispielsweise ³²P, ³³P, ³⁵S, ¹²⁵I und Ähnliches, als Markierungen verwendet. Zusätzliche Arten von Markierungen sind im Bereich der experimentellen und klinisch-diagnostischen Chemie hinlänglich bekannt.
Die Markierungsmittel können fluoreszente Markierungsmittel sein, die ohne Denaturierung chemisch an Antikörper oder Antigene binden, wobei ein Fluorochrom (Farbstoff) gebildet wird, und sie können nützlich sein, um einen immunfluoreszenten Tracer zu bilden. Die Beschreibung von immunfluoreszenten analytischen Methoden kann in DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", in Antibody As a Tool, Marchalonis et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Ltd., Seiten 189–231 (1982), gefunden werden.
Das Anbinden einer Markierung an ein Substrat, wie Beispielsweise Nukleinsäuren, Antikörper, Polypeptide und Proteine, ist im Stand der Technik hinlänglich bekannt. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßer Antikörper unmittelbar durch Iodierung markiert werden, oder er kann durch metabolischen Einbau von radiomarkierten Aminosäuren markiert werden, die im Kulturme dium bereitgestellt werden (vgl. beispielsweise Galfre et al., Meth. Enzymol. 73: 3–46 (1981)). Herkömmliche Mittel der Protein-Konjugation oder -Kopplung durch aktivierte funktionale Gruppen sind insbesondere verwendbar (vgl. Aurameas et al., Scand. J. Immunol. Vol. 8, Ergänzungsband 7: 7–23 (1978); Rodwell et al., Biotech. 3: 889–894 (1984) und US-Patent Nr. 4,493,795).
Im Einklang mit einer weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden isolierte Säugetier-Ataxin-2-bindende Proteine (A2BPs) und funktionale Fragmente derselben bereitgestellt. Der Begriff "A2BP" betrifft im Wesentlichen reine, native A2BP sowie natürlich vorkommende, allelische Varianten derselben. oder rekombinant produzierte Proteine, wie beispielsweise diejenigen, die durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren hergestellt wurden. A2BP umfasst ferner Fragmente derselben, die mindestens eine native biologische Aktivität beibehalten haben, wie beispielsweise die Fähigkeit, an ein Ataxin-2 zu binden, die Fähigkeit an ein Nukleinsäuremolekül (wie beispielsweise RNA) zu binden, oder die eine Immunogenität aufweisen. Erfindungsgemäße A2BPs umfassen zusätzlich A2BPs und funktionale Fragmente derselben, die in einer größeren Aminosäuresequenz enthalten sind.
Gemäß einer Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen A2BPs durch den Besitz der Fähigkeit charakterisiert, an mindestens eine Form des vom SCA2-Gen kodierten Ataxin-2-Proteins zu binden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die vorliegend bezeichneten A2BPs diejenigen Polypeptide, die spezifisch von einem Antikörper erkannt werden, welcher ebenfalls spezifisch ein A2BP (vorzugsweise humanes) erkennt, einschließlich der in SEQ ID NO: 2 aufgeführten Aminosäuresequenz. Erfindungsgemäß isolierte A2BPs sind frei von zellulären Bestandteilen oder Kontaminationen, die normalerweise mit einer nativen in vivo-Umgebung assoziiert sind.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung binden A2BPs RNA in einer Weise, die die Expression der Proteine, welche von der gebundenen RNA kodiert werden, reguliert. Beispielsweise ist herausgefunden worden, dass sowohl Ataxin-2 von C. elegans als auch A2BP1 von C. elegans essentielle zelluläre Gene in der frühen Entwicklung von C. elegans sind. Da sowohl Ataxin-2 als auch A2BP1 auch in Säugetieren stark konserviert ist, wird erwartet, dass humanes Ataxin-2 und A2BP1 ähnliche biologische Funktionen aufweisen. Die Tatsache, dass beide Gene zu einem frühzeitigen letalen Phänotyp führen, wenn sie zum Ziel von RNA-Interferenz-Untersuchungen gemacht werden, unterstreicht die vorliegend beschriebenen Ergebnisse hinsichtlich der Interaktion von Ataxin-2 und A2BP1. Da beide RNA-bindende Eigenschaften aufweisen, bilden sie essentielle Bestandteile des RNA-Lokalisierungsnetzwerks, das die zelluläre Polarität festlegt. Ataxin-2 und A2BP1 haben gleichermaßen in polarisierten Zellen höherer Differenzierung, wie beispielsweise in Neuronen, eine ähnliche Funktion und werden für die neuronale Plastizität benötigt.
Die erfindungsgemäßen Proteine sind ferner dadurch charakterisiert, dass sie ubiquitär exprimiert werden, einschließlich einer Expression im Säugetier-Gehirn. Spleißvarianten von cDNA-Transkripten, die durch alternatives Spleißen von Primärtranskripten erzeugt worden sind, sowie allelische Varianten, die die A2BP-Familie von Proteinen kodieren, werden ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen.
Gegenwärtig bevorzugte A2BPs der Erfindung umfassen Aminosäuren, die im Wesentlichen dieselbe Sequenz wie die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte Proteinsequenz umfassen, sowie biologisch aktive, modifizierte Formen derselben. Wie oben erörtert wurde, bindet jedes der erfindungsgemäßen A2BP-Proteine an Ataxin-2, an Ataxin-2-ähnliche Proteine oder an Nukleinsäure. Das in SEQ ID NO: 2 aufgeführte A2BP wurde im Rahmen eines Screenings nach bindenden Proteinen unter Verwendung von Ataxin-2 identifiziert; es wird vorgeschlagen, dass diese an dem Signal-Transduktionsweg beteiligt sind, der sich auf das Zellüberleben auswirkt. Darüber hinaus weist das SEQ ID NO: 2 entsprechende, erfindungsgemäße A2BP-Protein stark konservierte RNA-bindende Motive auf, die den Aminosäuresequenzen 119–124 und 156–162 von SEQ ID NO: 2 entsprechen (als RNP-1 bzw. RNP-2 bezeichnet), und es wird demgemäß im Rahmen der Erfindung gleichermaßen, vorgeschlagen, dass diese eine Rolle im Signal-Transduktionsweg spielen, der sich auf das Zellüberleben auswirkt.
Der Fachmann wird erkennen, dass zahlreiche Reste der oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteine gegen andere ausgetauscht werden können (chemisch, sterisch und/oder elektronisch ähnliche Reste), ohne die biologische Aktivität der resultierenden Species wesentlich zu verändern. Darüber hinaus werden größere Polypeptidsequenzen vorgeschlagen, die im Wesentlichen dieselbe Sequenz wie die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte enthalten. (z.B. Spleißvarianten und allelische Polymorphismen). Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz" Aminosäuresequenzen mit mindestens etwa 70% Identität bezüglich der Referenz-Aminosäuresequenz, die vergleichbare funktionale und biologische Aktivitäten beibehalten, welche für das durch die Referenz-Aminosäuresequenz definierte Protein charakteristisch sind. Vorzugsweise werden Proteine mit im Wesentlichen derselben Aminosäuresequenz mindestens etwa 80%, vorzugsweise 90% Aminosäureidentität bezüglich der Referenz-Aminosäuresequenz aufweisen, wobei mehr als etwa 95% Aminosäuresequenz-Identität besonders bevorzugt sind. Es ist jedoch verständlich, dass Polypeptide (oder die zuvor erwähnten Nukleinsäuren), die weniger als das beschriebene Ausmaß an Sequenzidentität aufweisen, und die als Spleißvarianten oder allelische Varianten vorkommen, oder die durch geringfügige Deletionen, durch konservative Aminosäure-Austausche, durch Austausch von degenerierten Codons modifiziert sind, ebenfalls im Bereich der vorliegenden Erfindung liegen.
Der Begriff "biologisch aktiv" oder "funktional", sofern vorliegend als Modifikationsmittel des (der) erfindungsgemäßen A2BP(s) oder eines Polypeptidfragments desselben (derselben) verwendet, bezeichnet ein Polypeptid, das eine oder mehrere dem A2BP ähnliche Eigenschaften aufweist. Biologisch aktives A2BP kann beispielsweise die Fähigkeit aufweisen, vorzugsweise in vivo an mindestens eine Form von Ataxin-2 zu binden, das durch ein SCA2-Gen kodiert wird. Ataxin-2-bindende Aktivität kann beispielsweise unter Verwendung der in Beispiel I, II und III beschriebenen Verfahren untersucht werden. Biologisch aktives A2BP kann ferner die Fähigkeit haben, Nukleinsäure (wie beispielsweise RNA) zu binden, und daher weist ein erfindungsgemäßes Polypeptid eine RNA-bindende Fähigkeit auf. RNA-bindende A2BP-Fragmente umfassen die in SEQ ID NO: 2 aufgeführten Aminosäuresequenzen. Eine Bindung von Nukleinsäure durch erfindungsgemäße A2BPs oder Fragmente derselben kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie beispielsweise elektrophoretische Gel-Shift-Analyse, bestimmt werden. Beispielhafte funktionale Fragmente, die an Nukleinsäure wie beispielsweise RNA binden, umfassen Aminosäuren 119–124 und/oder 156–162 von SEQ ID NO: 2.
Ebenfalls umfasst vom Begriff A2BP sind funktionale Fragmente oder Polypeptid-Analoga derselben. Der Begriff "funktionales Fragment" bezeichnet ein Peptid-Fragment, das ein Teil eines A2BP-Proteins vollständiger Länge ist, vorausgesetzt, dass der Teil wie oben beschrieben biologisch aktiv ist (d.h. eine Eigenschaft des entsprechenden Proteins vollständiger Länge aufweist).
Gemäß einer Ausführungsform weist ein funktionales Fragment eines erfindungsgemäßen A2BP-Proteins, wie beispielsweise ein in SEQ ID NO: 2 enthaltener Bereich, die Fähigkeit auf, Ataxin-2 zu binden, wobei ihm jedoch eine Signal-Transduktions-Funktion fehlt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist ein funktionales Fragment von A2BP die Fähigkeit auf, RNA zu binden, wobei ihm jedoch eine Signal-Transduktions-Funktion fehlt. Solche funktionalen Fragmente, die Ataxin-2 oder RNA binden, jedoch kein Signal (wie beispielsweise ein Zell-Degenerations-Signal oder ein Überlebens-Signal) transduzieren, können beispielsweise als dominant-negativer Inhibitor nützlich sein. Ein solcher Inhibitor kann in vivo die Bindung von nativem (d.h. endogenem) A2BP an Ataxin-2 oder RNA inhibieren und kann in einem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sein. Ein dominant-negativer Inhibitor, der den Signal-Transduktionsweg der Zelldegeneration inhibiert, kann beispielsweise nützlich sein, um Störungen zu behandeln, die durch eine Zelldegeneration charakterisiert sind.
Biologisch aktive A2BP-Polypeptide, wie beispielsweise ein dominant-negatives Fragment, können unter Verwendung hinlänglich bekannter Verfahren identifiziert werden, beispielsweise unter Verwendung. der vorliegend beschriebenen Bindungs-Assays. Solche Verfahren umfassen beispielsweise Hefe- oder Säugetier-2-Hybrid-Assay-Systeme, in vitro-Nukleinsäure-Bindungs-Assays und andere kompetitive Bindungs-Inhibitions-Assay, die im Stand der Technik bekannt sind. Solche 2-Hybrid-Assay-Systeme können insbesondere verwendet werden, um funktionale Fragmente von A2BP zu identifizieren, die die Bindung eines A2BP an ein Ataxin-2 in vivo inhibieren.
Funktionale Fragmente von A2BP können darüber hinaus eine Immun-Antwort auslösen, die nützlich ist, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erhalten, welche spezifisch an ein erfindungsgemäßes A2BP binden. Daher wird eine erfindungsgemä ße Nukleinsäure, die ein A2BP kodiert, ein Polypeptid kodieren, das spezifisch von einem Antikörper erkannt wird, der ebenfalls spezifisch das A2BP-Protein (vorzugsweises humanes) erkennt, einschließlich der in SEQ ID NO: 2 aufgeführten Aminosäure. Solche immunologische Aktivität kann durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren untersucht werden. Beispielsweise kann ein Test-Polypeptid, das von einer A2BP-cDNA kodiert wird, verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, welche anschließend auf ihre Fähigkeit untersucht werden, an ein erfindungsgemäßes A2BP-Protein zu binden, einschließlich an die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte Sequenz. Wenn der Antikörper an das Test-Polypeptid und an das Protein, das die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte Sequenz umfasst, mit im Wesentlichen derselben Affinität bindet, so ist das Polypeptid biologisch aktiv, da es immunogene Aktivität besitzt.
Die Aminosäurelänge von funktionalen Fragmenten oder Polypeptid-Analoga der vorliegenden Erfindung kann von etwa 5 Aminosäuren bis zur Proteinsequenz eines erfindungsgemäßen A2BP vollständiger Länge reichen. In einigen Ausführungsformen umfassen die Aminosäurelängen beispielsweise mindestens etwa 10 Aminosäuren, mindestens etwa 20, mindestens etwa 30, mindestens etwa 40, mindestens etwa 50, mindestens etwa 75, mindestens etwa 100, mindestens etwa 150, mindestens etwa 200, mindestens etwa 250 oder mehr Aminosäuren hinsichtlich ihrer Länge bis zur A2BP-Proteinsequenz vollständiger Länge. Exemplarische funktionale Fragmente, die an eine Nukleinsäure, wie beispielsweise eine RNA, binden, umfassen die Aminosäuren 119–124 und/oder 156–162 von SEQ ID NO: 2.
Die erfindungsgemäßen A2BPs können mittels einer Vielzahl von im Stand der Technik hinlänglich bekannten Verfahren isoliert werden, beispielsweise mittels der vorliegend beschriebenen rekombinanten Expressionssysteme, Präzipitation, Gelfiltrations-, Ionenaustausch-, Reverse-Phase- und Affinitäts- Chromatographie und Ähnliche. Andere hinlänglich bekannte Verfahren werden in Deutscher et al., (Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology Vol. 182, Academic Press (1990)) beschrieben. Alternativ dazu können die isolierten Polypeptide der vorliegenden Erfindung unter Verwendung hinlänglich bekannter Verfahren erhalten werden, beispielsweise durch Expressions-Screening, z.B. unter Verwendung von erfindungsgemäßen Antikörpern.
Ein Beispiel für ein Mittel zur Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids (der erfindungsgemäßen Polypeptide) besteht darin, Nukleinsäuren, die ein A2BP kodieren, in einer geeigneten Wirtszelle, wie beispielsweise in einer bakteriellen Zelle, einer Hefe-Zelle, einer Insektenzelle, einer Amphibien-Zelle (d.h. Oozyte) oder einer Säugetier-Zelle, unter Verwendung im Stand der Technik hinlänglich bekannter Verfahren zu exprimieren, und die exprimierten Polypeptide wiederum unter Verwendung hinlänglich bekannter Verfahren zu gewinnen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können unmittelbar aus Zellen isoliert werden, die mit den Expressionsvektoren transformiert wurden, wie vorliegend im Folgenden beschrieben wird. Das erfindungsgemäße Polypeptid, die funktionalen Fragmente und funktionalen Äquivalente derselben können darüber hinaus durch chemische. Synthese hergestellt werden. Synthetische Polypeptide können beispielsweise unter Verwendung des automatischen Peptid-Synthesegeräts von Applied Biosystems, Inc., Modell 430A oder 431A (Foster City, CA) unter Anwendung der vom Hersteller bereitgestellten Chemie hergestellt werden.
Der Begriff "Polypeptidanalog" umfasst jedes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen dieselbe ist wie eine vorliegend spezifisch gezeigte Sequenz, und in dem ein oder mehrere Reste konservativ gegen einen funktional ähnlichen Rest ausgetauscht worden sind, und welches die Fähigkeit zeigt, ein wie vorliegend beschriebenes A2BP funktional nach zuahmen. Beispiele für konservative Austausche umfassen den Austausch eines nicht-polaren (hydrophoben) Restes, wie beispielsweise Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, gegen einen anderen; den Austausch eines polaren (hydrophilen) Restes gegen einen anderen, wie beispielsweise zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutamin und Asparagin, zwischen Glycin und Serin; den. Austausch eines basischen Restes, wie beispielsweise Lysin, Arginin oder Histidin gegen einen anderen oder den Austausch, eines sauren Restes, wie beispielsweise Asparaginsäure oder Glutaminsäure gegen einen anderen.
Wie vorliegend beschrieben umfasst der Begriff "konservativer Austausch" die Verwendung eines chemisch derivatisierten Restes anstelle eines nicht-derivatisierten Restes, vorausgesetzt, dass ein Polypeptid, das einen solchen Rest enthält, die erforderliche Bindungsaktivität zeigt. Der Begriff "chemisches Derivat" bezeichnet ein Polypeptid mit einem oder mehreren chemisch derivatisierten Resten, die durch eine Reaktion, beispielsweise einer funktionalen Seitenkette, hergestellt worden sind. Solche derivatisierten Moleküle umfassen diejenigen Moleküle, in denen freie Aminogruppen derivatisiert worden. sind, wobei Aminhydrochloride, p-Toluen-Sulfonyl-Gruppen, Carbobenzoxy-Gruppen, t-Butyloxycarbonyl-Gruppen, Chloracetyl-Gruppen oder Formyl-Gruppen gebildet werden. Freie Carboxyl-Gruppen können derivatisiert werden, wobei Salze, Methyl- und Ethyl-Ester oder andere Arten von Estern oder Hydraziden gebildet werden. Freie Hydroxyl-Gruppen können derivatisiert werden, wobei O-Acyl- oder O-Alkyl-Derivate entstehen. Der Imidazol-Stickstoff von Histidin kann derivatisiert werden, wobei N-im-Benzylhistidin entsteht. Ferner sind Peptide als chemische Derivate umfasst, die ein oder mehrere natürlich vorkommende Aminosäurederivate der 20 Standard-Aminosäuren enthalten, wie beispielsweise 4-Hydroxyprolin ausgetauscht gegen Prolin; 5-Hydroxylysin ausgetauscht gegen Lysin; 3- Methylhistidin ausgetauscht gegen Histidin; Homoserin ausgetauscht gegen Serin; und Ornithin ausgetauscht gegen Lysin.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen jedes Polypeptid mit einem oder mehreren deletierten Resten in Bezug auf die Sequenz eines Polypeptids, dessen Sequenz vorliegend gezeigt ist, solange die erforderliche Aktivität beibehalten wird. Gleichermaßen werden Zufügungen an die erfindungsgemäßen Polypeptide vorgeschlagen, solange die erforderliche biologische Aktivität beibehalten wird.
Ein Beispiel für eine Zufügung an ein erfindungsgemäßes Polypeptid ist eine heterologe Domäne. Wie vorliegend verwendet wird der Begriff "heterologe Domäne" breit verwendet und bedeutet eine Einheit, die kovalent mit einem erfindungsgemäßen Protein verknüpft ist und diesem eine bestimmte Funktion vermittelt, wobei eine Chimäre gebildet wird. Wie vorliegend verwendet bedeutet der Begriff "Chimäre" ein erfindungsgemäßes A2BP oder funktionales Fragment desselben, das kovalent mit einem oder mehreren heterologen Domänen verknüpft ist.
Eine heterologe Domäne kann im Wesentlichen jedes kleine Molekül, Makromolekül oder jede mikrogefertigte Vorrichtung (microfabricated device) sein, solange dieses dem erfindungsgemäßen Protein (den erfindungsgemäßen Proteinen) ohne wesentliche Beeinflussung der biologischen Funktion eine bestimmte Funktion vermittelt. Solche heterologen Domänen umfassen beispielsweise diejenigen, die eine Funktion für das gezielte Aufsuchen (targeting) bereitstellen oder die die Aktivität von A2BP verstärken, supprimieren oder modulieren, oder nützlich bei der Aufreinigung oder im Rahmen der vorliegend beschriebenen Bioassays (z.B. beim Hefe-2-Hybrid-Assay-System) sind. Beispielsweise sorgen Liganden von Zelloberflächenproteine, die den Eintritt in die Zelle ermöglichen, für das gezielte Aufsuchen (targeting), wie beispielsweise Antikörper, virale Hüll proteine, Wachstumsfaktoren, Fragmente derselben und Ähnliche. Regulatorische Domänen, wie beispielsweise dereprimierbare Steroidhormon-Bindungsdomänen und Ähnliche, können für das Modulieren der Aktivität der erfindungsgemäßen A2BP-Polypeptide nützlich sein. Eine heterologe Domäne, die eine RNAse ist, kann auf RNA-Moleküle abstellen, die A2BP zum Zwecke des Abbaus binden. Anhänge (tags), wie beispielsweise Biotin, T7, Polyhistidin und Ähnliche können für die Detektion von Proteinen oder Nukleinsäuren nützlich sein, welche die erfindungsgemäßen Polypeptide binden, oder die Reinigung von verbundenen erfindungsgemäßen Proteinen kann für die Reinigung oder für diagnostische Assays nützlich sein. Der Fachmann kann die Art einer heterologen Domäne in Abhängigkeit von der Verwendung und der einzelnen gewünschten Funktion problemlos bestimmen. Die Erfindung stellt somit Chimäre bereit, die A2BP oder funktionale Fragmente desselben sowie eine oder mehrere heterologe Domänen umfassen.
Die vorliegende Erfindung. stellt ferner Zusammensetzungen bereit, die einen akzeptablen Träger und ein beliebiges isoliertes, gereinigtes reifes A2BP-Protein oder funktionale Polypeptid-Fragmente desselben oder Chimäre enthalten, allein oder in Kombination miteinander. Solche Polypeptide oder Proteine können rekombinant erhalten, chemisch synthetisiert oder ausgehend von nativen Quellen gereinigt werden. Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "akzeptabler Träger" jeden gewöhnlichen pharmazeutischen Träger, der für die therapeutische Verabreichung geeignet ist, wie beispielsweise Phosphatgepufferte Salz-Lösung, Wasser und Emulsionen, wie beispielsweise Öl/Wasser- oder Wasser/Öl-Emulsion, sowie verschiedene Arten von Befeuchtungsmitteln. Solche pharmazeutischen Träger umfassen darüber hinaus Träger, die in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schranke zu überqueren.
Die vorliegend beschriebenen A2BP-Zusammensetzungen können beispielsweise bei Verfahren zum Modulieren der Expression oder Aktivität von Ataxin-2-Proteinen nützlich sein oder anderen Proteinen, die am Signal-Transduktionsweg von Glutaminverwandten Erkrankungen beteiligt sind (z.B. Ataxin-1, Huntington, Machado-Joseph und Ähnliche). Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Ausdruck "moduliert die Aktivität" oder grammatikalische Abwandlungen desselben entweder das Inhibieren der Aktivität (wie mit einem Antagonisten) oder die Aktivierung der Aktivität (wie mit einem Agonisten). Die vorliegend vorgeschlagene Ataxin-2-Aktivität beispielsweise umfasst das Inhibieren oder Aktivieren des Signal-Transduktionswegs, der mit der Zellgeneration assoziiert ist. Somit werden gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung Verfahren zum Modulieren der Aktivität eines Proteins bereitgestellt, das A2BP bindet, vorzugsweise Ataxin-2-Protein, die das Inkontaktbringen von Ataxin-2 mit einem im Wesentlichen reinen A2BP oder einem funktionalen Fragment desselben umfassen.
Ferner werden Antisense-Nukleinsäuren bereitgestellt, die eine Sequenz enthalten, welche in der Lage ist, spezifisch eine Nukleinsäure vollständiger Länge oder jeden Teil einer solchen Nukleinsäure zu binden, der ein A2BP-Polypeptid kodiert. Eine solche Antisense-Zusammensetzung kann beispielsweise nützlich sein, um die Translation einer mRNA zu inhibieren, welche ein A2BP kodiert. Eine Antisense-Nukleinsäure kann eine Sequenz aufweisen, die in der Lage ist, spezifisch jeden Teil der Sequenz einer cDNA zu binden, die A2BP-Polypeptide kodiert. Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "bindet spezifisch" eine Nukleinsäuresequenz, die ein Nukleinsäuremolekül erkennt, welches eine Sequenzkomplementarität aufweist, und mit diesem durch Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Basenpaaren doppelt-helikale Segmente ausbildet. Ein Beispiel für eine Antisense-Nukleinsäure ist eine An tisense-Nukleinsäure, die chemische Analoga von Nukleotiden umfasst.
Ferner werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die eine wie oben beschriebene Antisense-Nukleinsäure in einer Menge umfassen, welche ausreicht, um die Expression eines humanen A2BP-Polypeptids zu verringern, sowie einen akzeptablen hydrophoben Träger, der in der Lage ist, eine Zellmembran zu durchqueren, indem er die Zellmembran durchquert und spezifisch an Nukleinsäure bindet, welche ein A2BP-Polypeptid kodiert. Geeignete hydrophobe Träger werden beispielsweise in den US-Patent-Nrn. 5,334,761; 4,889,953; 4,897,355 und Ähnlichen beschrieben. Der akzeptable hydrophobe Träger, der in der Lage ist, die Zellmembran zu durchqueren, kann ferner einen Rezeptor-Bestandteil oder ähnliche Strukturen umfassen, die an Zellen binden, um den Eintritt zu ermöglichen. Beispielsweise kann ein Rezeptor-Bestandteil oder eine ähnliche Struktur in einem Lipid-Vesikel-Träger spezifisch für einen ausgewählten Zell-Typ sein, wodurch eine Antisense-Nukleinsäure gezielt zu dem ausgewählten Zell-Typ gebracht wird. Die Struktur kann Teil eines Proteins sein, von dem bekannt ist, dass es an einen Zell-Typ-spezifischen Rezeptor bindet.
Antisense-Nukleinsäure-Zusammensetzungen können nützlich sein, um die Translation einer mRNA zu inhibieren, welche erfindungsgemäße Polypeptide kodiert. Gleichermaßen können synthetische Oligonukleotide oder andere chemische Antisense-Strukturen so gestaltet werden, dass sie an mRNA binden, welche A2BP-Polypeptide kodiert, und die Translation der mRNA inhibieren. Solche Zusammensetzungen können nützlich sein, um die Expression eines A2BP-assoziierten Gens in einer Gewebeprobe oder in einem Subjekt zu inhibieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Kits zur Detektion von Mutationen, Duplikationen, Deletionen, Umla gerungen und Aneuploidien in A2BP-Genen bereitgestellt, die mindestens eine erfindungsgemäße Sonde oder ein erfindungsgemäßes Antisense-Nukleotid umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die zum Modulieren der Expression von A2BP-Polypeptiden nützlich sind. Beispielsweise können synthetische Antisense-Nukleinsäure-Zusammensetzungen (nachfolgend SANZ) verwendet werden, um die Translation von mRNA zu inhibieren, die erfindungsgemäße Polypeptide kodiert. Synthetische Oligonukleotide oder andere chemische Antisense-Nukleinsäure-Strukturen, die so gestaltet werden, dass sie mRNA erkennen und selektiv an diese binden, werden so konstruiert, dass sie komplementär zu der gesamten Länge oder zu Teilen eines A2BP-kodierenden Strangs sind, einschließlich zu der in SEQ ID NO: 1 aufgeführten Sequenz. Die. SANZ wird so gestaltet, dass sie für die Verabreichung durch Injektion in ein Subjekt im Blut-Strom stabil ist, oder unter Labor-Zellkulturbedingungen stabil ist. Die SANZ wird so gestaltet, dass sie in der Lage ist, die Zellmembran zu durchqueren, um durch physikalische und chemische Eigenschaften der SANZ, welche es ihr ermöglichen, die Zellmembran zu durchqueren, in das Cytoplasma der Zelle einzutreten, beispielsweise durch Gestalten von kleinen, hydrophoben, chemischen Strukturen der SANZ, oder durch spezifische Transportsysteme in der Zelle, welche die SANZ erkennen und in die Zelle transportieren. Darüber hinaus kann die SANZ für das gezielte Aufsuchen (targeting) von bestimmten, ausgewählten Zellpopulationen gestaltet sein, beispielsweise durch Verwendung einer SANZ, die von spezifischen zellulären Aufnahme-Mechanismen innerhalb der ausgewählten Zellpopulation erkannt wird. Beispielsweise kann die SANZ so gestaltet werden, dass sie an einen Rezeptor bindet, der (wie oben besprochen) nur in einem bestimmten Zell-Typ vorgefunden wird. Gemäß einer besonderen Ausführungsform ist die SANZ ein Antisense-Oligonukleotid.
Die SANZ kann ferner so gestaltet sein, dass sie eine Ziel-mRNA-Sequenz, die einer Sequenz entsprechen kann, welche in den in SEQ ID NO: 1 aufgeführten Sequenzen enthalten ist, erkennt und selektiv bindet. Die SANZ ist so gestaltet, dass sie die Ziel-mRNA-Sequenz entweder durch Bindung an diese und Induzieren des Abbaus der RNA, beispielsweise durch RNAse I-Verdau, oder durch Inhibieren des Spleißens von prä-mRNA, oder durch Inhibieren der Translation der Ziel-mRNA durch Interferieren mit der Bindung von Translations-regulierenden Faktoren oder Ribosomen, oder durch Einschluss von anderen chemischen Strukturen, wie beispielsweise von Ribozym-Sequenzen oder von reaktiven chemischen Gruppen, die entweder die Ziel-mRNA abbauen oder chemisch modifizieren, inaktiviert. Es wurde gezeigt, dass SANZ zu solche Eigenschaften in der Lage sind, wenn sie sich gegen mRNA-Ziele richten (vgl. Cohen et al., Trends Pharmacol. Sci. 10: 435–437 (1989) und Weintraub, Sci. American, Januar (1990), Seite 40).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur rekombinanten Herstellung von erfindungsgemäßen A2BPs durch Expression der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen in geeigneten Wirtszellen bereitgestellt. Rekombinante DNA-Expressionssysteme, die geeignet sind, die vorliegend beschriebenen A2BPs herzustellen, sind im Stand der Technik hinlänglich bekannt. Die oben beschriebenen Nukleotidsequenzen können beispielsweise für eine weitere Manipulation, Vermehrung und Protein-Expression in Vektoren eingebracht werden. Wie vorliegend beschrieben bezeichnet der Begriff "Vektor" (oder Plasmid) eigenständige Elemente, die verwendet werden, um heterologe DNA in Zellen für eine Vielzahl von Zwecken einzubringen.
Geeignete Expressionsvektoren sind im Stand der Technik hinlänglich bekannt und umfassen beispielsweise Vektoren, die in der Lage sind, DNA zu exprimieren, welche in funktionsfähiger Weise an eine regulatorische Sequenz, wie beispielsweise eine Promotor-Region, gekoppelt ist, welche in der Lage ist, die Expression einer solchen DNA zu steuern. Somit bezieht sich ein Expressionsvektor auf ein rekombinantes DNA- oder RNA-Konstrukt, wie beispielsweise ein Plasmid, ein Phage, ein rekombinantes Virus oder andere Vektoren die – bei Einbringen in eine geeignete Wirtszelle – zu einer Expression der insertierten DNA führen. Geeignete Expressionsvektoren sind dem Fachmann hinlänglich bekannt und umfassen diejenigen, die sich in hohen oder niedrigen Kopienzahlen in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen replizieren, diejenigen, die episomal verbleiben, sowie diejenigen, die in das Genom der Wirtszelle integrieren können.
Wie vorliegend verwendet bezeichnet eine Promotor-Region ein Segment aus DNA, das die Transkription von DNA kontrolliert, an die es in funktionsfähiger Weise gekoppelt ist. Der Promotor-Bereich umfasst spezifische Sequenzen, die für die RNA-Polymerase-Erkennung, Bindung und Transkription-Initiation ausreichen. Darüber hinaus umfasst der Promotor-Bereich Sequenzen, die die Initiation der Transkription modulieren, wie beispielsweise cis-wirkende Elemente, die auf trans-wirkende Faktoren reagieren können. Promotoren können in Abhängigkeit von der Art der Regulation konstitutiv oder reguliert sein. Solche regulierten Promotoren können induzierbar oder reprimierbar sein, sodass die Expression von DNA verstärkt oder reprimiert werden kann. Beispielhafte Promotoren die im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen werden, umfassen den SV40-Early-Promotor, den Cytomegalie-Virus (CMV)-Promotor, den Steroid-induzierbaren Maus-Mammary-Tumor-Virus (MMTV)-Promotor, den Moloney-Murine-Leukemia-Virus (MMLV)-Promotor, das Tetracyclin-regulierte Expressionssystem und Ähnliche.
Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "in funktionsfähiger Weise gekoppelt" die funktionale Beziehung von DNA mit regulatorischen und Effektor-Nukleotidsequenzen, wie beispielsweise Promotoren, Enhancern, transkriptionalen und translationalen Start- und Stopp-Stellen sowie anderen Signalsequenzen. Die funktionsfähige Kopplung von DNA an ein Promotor bezieht sich beispielsweise auf die physikalische und funktionale Beziehung zwischen der DNA und dem Promotor, sodass die Transkription einer solchen DNA vom Promotor durch eine RNA-Plymerase initiiert wird, die die DNA spezifisch erkennt, an diese bindet und sie transkribiert.
Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "Expression" jede Anzahl von Schritten, die den Vorgang umfasst, durch welchen Polynukleinsäuren in RNA transkribiert und in Peptide, Polypeptide oder Proteine translatiert werden. Wenn die Polynukleinsäure von genomischer DNA abgeleitet ist, kann die Expression das Spleißen von RNA umfassen, sofern eine geeignete eukaryotische Wirtszelle oder ein geeigneter eukaryotischer Organismus ausgewählt wurde. In ähnlicher Weise soll die Expression eine posttranslationale Prozessierung umfassen, wie beispielsweise eine proteolytische Spaltung und Glykosylierung von Polypeptiden.
Transformationsvektoren, die für die Expression und Vermehrung in Prokaryoten geeignet sind, sind im Stand der Technik hinlänglich bekannt und umfassen pBluescript, ZAP-Vektoren des Phagen Lambda (Stratagene, La Jolla, CA) und Ähnliche. Andere geeignete. Vektoren und Promotoren werden detailliert, in US-Patent Nr. 4,798,885 beschrieben.
Vektoren, die zur Transformation von E. coli-Zellen geeignet sind, umfassen die pET-Expressionsvektoren, wie beispielsweise pET11a, der den T7-Promotor, den T7-Terminator, einen induzierbaren E. coli-lac-Operator und ein lac-Repressorgen umfasst, sowie pET12a-c, der den T7-Promotor, den T7-Terminator und ein ompT-Sekretionssignal aus E. coli umfasst (siehe US-Patent Nr. 4,952,496). Andere geeignete Vektoren umfassen beispielsweise pIN-IIIompA2, der einen lpp-Promotor, einen lacUV5-Promotor-Operator, ein ompA-Sekretionssignal und ein lac-Repressorgen umfasst (siehe Duffaud et al., Meth. Enzymol. 153: 492–507 (1987)).
Eukaryotische Transformationsvektoren, einschließlich z.B. das klonierte Genom des Rinder-Papilloma-Virus, die klonierten Genome der murinen Retroviren sowie eukaryotische Kassetten, wie beispielsweise das pSV-2 gpt-System (beschrieben durch Mulligan und Berg, Nature 277: 108–114 (1979)), das Okayama-Berg-Klonierungssystem (Mol. Cell Biol. 2: 161–170 (1982)), und der Expressions-Klonierungsvektor, der von Genetics Institute (US-Patent Nr. 4,912,040) beschrieben wurde, sind verfügbar und gewährleisten zumindest einen gewissen Grad an Expression des betreffenden Proteins in der transformierten eukaryotischen Zelllinie.
Besonders bevorzugte Basis-Vektoren, die regulatorische Elemente umfassen, welche an die erfindungsgemäßen A2BP-kodierenden DNAs für die Transfektion von Säugetierzellen gekoppelt werden können, sind auf dem Zytomegalie-Virus (CMV)-Promotor basierende Vektoren, wie beispielsweise pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA), auf dem MMTV-Promotor basierende Vektoren, wie beispielsweise pMAMNeo (Clontech, Palo Alto, CA) und pMSG (Pharmacia, Piscataway, NJ), und auf dem SV40 Promotor basierende Vektoren, wie beispielsweise pSVβ (Clontech, Palo Alto, CA).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden somit "rekombinante Zellen" bereitgestellt, die die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung umfassen. Verfahren zur Transformation von geeigneten Wirtszellen, vorzugsweise von bakteriellen Zellen und insbesondere von E. coli-Zellen sowie Verfahren, die sich zur Kultivierung der Zellen eignen, welche ein Gen umfassen, das für ein heterologes Protein kodiert, sind im Stand der Technik im Allgemeinen bekannt (siehe beispielsweise Sambrook et al., siehe oben 1989).
Beispielhafte Verfahren der Transformation umfassen z.B. die Transformation unter Verwendung von Plasmiden, viralen oder bakteriellen Phagen-Vektoren, Transfektion, Elektroporation, Lipofektion und Ähnliche. Die heterologe DNA kann wahlweise Sequenzen umfassen, die es ihr erlauben, extrachromosomal (z.B. episomal) zu verbleiben, oder die heterologe DNA kann dazu gebracht werden, in das Genom des Wirts zu integrieren (als ein alternatives Mittel, um das stabile Verbleiben im Wirt zu gewährleisten).
Wirtszellen, die zur Verwendung bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen werden, umfassen diejenigen Organismen, in denen die rekombinante Herstellung von heterologen Proteinen ausgeführt worden ist. Beispiele solcher Wirts-Organismen umfassen Bakterien (z.B. E. coli), Hefe (z.B. S. cerevisiae, C. tropicalis, H. polymorpha und P. pastoris; vgl. beispielsweise US-Patent Nrn. 4,882,279; 4,837,148; 4,929,555 und 4,855,231), Säugetier-Zellen (z.B. HeLa, HEK293, MDCK, BHK, CHO und LtK^–-Zellen), Insekten-Zellen und Ähnliche. Gegenwärtig bevorzugte Wirts-Organismen sind Bakterien. Die am meisten bevorzugten Bakterien sind E. coli.
Gemäß einer Ausführungsform können Nukleinsäuren, die die erfindungsgemäßen A2BPs kodieren, entweder in vivo oder in vitro unter Verwendung geeigneter viraler Vektoren, die im Stand der Technik hinlänglich bekannt sind, in Säugetier-Zellen eingebracht werden. Geeignete retrovirale Vektoren, insbesondere diejenigen, die für die "Gen-Therapie"-Verfahren entworfen wurden, werden beispielsweise in den US-Patent Nrn. 5,624,820; 5,693,508 und 5,674,703 sowie in den WIPO-Veröffentlichungen WO 92/05266 und WO 92/14829 beschrieben, und stellen eine Beschreibung von Verfahren zum effizienten Einbringen von Nukleinsäuren in humane Zellen bereit. Darüber hinaus wird in Fällen, in denen es erwünscht ist, die Expression der erfindungsgemäßen A2BPs in vivo zu begrenzen oder zu reduzieren, die Einbringung eines Antisense-Strangs der erfindungsgemäßen Nukleinsäure vorgeschlagen.
Auf Viren basierende Systeme stellen den Vorteil bereit, dass sie relativ große Mengen heterologer Nukleinsäure in eine Vielzahl von Zellen einbringen können. Darüber hinaus können solche Viren heterologe DNA in Zellen einbringen, die sich nicht teilen. Geeignete virale Vektoren für die Einbringung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, die ein A2BP-Protein kodiert, in. Säugetierzellen (z.B. vaskuläre Gewebe-Segmente) sind im Stand der Technik hinlänglich bekannt. Diese viralen Vektoren umfassen beispielsweise Herpes simplex-Virus-Vektoren (US-Patent Nr. 5,501,979), Vaccinia-Virus-Vektoren (US-Patent Nr. 5,506,138); Zytomegalie-Virus-Vektoren (US-Patent Nr. 5,561,063), modifizierte Moloney-Murine-Leukemia-Virus-Vektoren (US-Patent Nr. 5,693,508), Adenovirus-Vektoren (US-Patent Nrn. 5,700,470 und 5,731,172), Adeno-assoziierte Virus-Vektoren (US-Patent Nr. 5,604,090), konstitutive und regulierbare Retrovirus-Vektoren (US-Patent Nrn. 4,405,712; 4,650,764 bzw. 5,739,018), Papilloma-Virus-Vektoren (US-Patent Nrn. 5,674,703 und 5,719,054). Besonders bevorzugte virale Vektoren sind die Adenovirus-Vektoren und retrovirale Vektoren.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Adenovirus-Transferrin/Polylysin-DNA (TfAdpl-DNA)-Vektor-Komplexe (Wagner et al., PNAS, USA 89: 6099–6103 (1992), Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147–154 (1992) und Gao et al., Hum. Gene Ther. 4: 14–24 (1993)) verwendet, um Säugetier-Zellen mit heterologer A2BP-Nukleinsäure zu transfizieren. Jeder der vor liegend beschriebenen Plasmid-Expressionsvektoren kann in einem TfAdpl-DNA-Komplex verwendet werden.
Wie vorliegend verwendet bezeichnet "retroviraler Vektor" hinlänglich bekannte Gen-Transfer-Plasmide, die eine Expressionskassette aufweisen, welche ein heterologes Gen kodiert, das zwischen zwei retroviralen LTRs lokalisiert ist. Retrovirale Vektoren enthalten üblicherweise geeignete Verpackungs-Signale, die es dem retroviralen Vektor (oder der RNA, die unter Verwendung des retroviralen Vektors als Matrize transkribiert wurde) ermöglichen, in einer geeigneten Verpackungs-Zelllinie. in ein virales Virion verpackt zu werden (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4,650,764).
Geeignete retrovirale Vektoren für die vorliegende Verwendung werden beispielsweise in US-Patent Nr. 5,252,479 und in den WIPO-Veröffentlichungen WO 92/07573, WO 90/06997, WO 89/05345, WO 92/05266 und WO 92/14829 beschrieben, die eine Beschreibung für Verfahren zum effizienten Einbringen von Nukleinsäure in humane Zellen unter Verwendung solcher retroviralen Vektoren bereitstellen. Andere retrovirale Vektoren umfassen beispielsweise die MMTV-Vektoren (US-Patent Nr. 5,646,013) und Vektoren die oben beschrieben sind.
Im Einklang mit einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Anti-A2BP-Antikörper mit spezifischer Reaktivität gegenüber einem A2BP-Polypeptid der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Aktive Fragmente von Antikörper, wie beispielsweise Fab-Fragmente, sind ebenfalls von der Definition "Antikörper" eingeschlossen.
Erfindungsgemäße Antikörper können gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren unter Verwendung erfindungsgemäßer Polypeptide, Proteine oder Teilen derselben als Antigene hergestellt werden. Beispielsweise können polyklonale und monoklo nale Antikörper mittels hinlänglich im Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt werden, wie beispielsweise in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory (1988), beschrieben ist. Erfindungsgemäße Polypeptide können als Immunogene bei der Erzeugung solcher Antikörper verwendet werden. Alternativ können synthetische Peptide als Immunogene verwendet werden. Aminosäuresequenzen können nach im Stand der Technik hinlänglich bekannten Verfahren analysiert werden, um zu bestimmen, ob diese hydrophobe oder hydrophile Domänen des entsprechenden Polypeptids aufweisen. Veränderte Antikörper wie beispielsweise chimäre, humanisierte, CDR-ausgetauschte (CDR grafted) oder bifunktionale Antikörper können ebenfalls nach im Stand der Technik hinlänglich bekannten Verfahren hergestellt werden. Solche Antikörper können darüber hinaus durch Hybridoma, chemische Synthese oder rekombinante Verfahren erzeugt werden, die beispielsweise in Sambrook et al., siehe oben, 1989, und in Harlow und Lane, siehe oben, 1988, beschrieben sind. Sowohl Anti-Peptid-Antikörper als auch Anti-Fusionsprotein-Antikörper können verwendet werden (siehe beispielsweise Bahouth et al., Trends Pharmacol. Sci. 12: 338–343 (1991) und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY (1989)).
Derart hergestellte Antikörper können unter anderem in diagnostischen Verfahren und Systemen verwendet werden, um eine Menge von A2BP nachzuweisen, die in einer Körperprobe eines Säugetiers, vorzugsweise in einer humanen Körperprobe, wie beispielsweise in einem Gewebe (z.B. Gehirn) oder in einer biologischer Flüssigkeit (z.B. cerebrospinaler Flüssigkeit) vorhanden ist. Solche Antikörper können darüber hinaus bei der Immunaffinitäts- oder Affinitäts-Chromatographie-Reinigung von erfindungsgemäßem A2BP verwendet werden. Darüber hinaus werden vorliegend Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines erfindungsgemäßen A2BP-Proteins in einer Probe, wie beispiels weise in einer Zelle oder in einem Kompartiment des Körpers oder in einer biologischen Flüssigkeit, vorgeschlagen. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper, der unter Bedingungen, welche die Bindung des Antikörpers an das A2BP-Polypeptide erlauben, spezifisch an A2BP-Polypeptide bindet, den Nachweis des Vorhandenseins des an das A2BP-Polypeptid gebundenen Antikörpers, und das dadurch erfolgende Nachweisen des Vorhandenseins des erfindungsgemäßen Polypeptids in der Probe. Beim Nachweis solcher Polypeptide können Antikörper für die in vitro-Diagnostik oder für in vivo-bildgebende Verfahren verwendet werden.
Verfahren, die zum in vitro-Nachweis von A2BP-Polypeptiden in einer Probe nützlich sind, umfassen Immunoassays, die einen nachweisbaren Antikörper verwenden. Solche Immunoassays umfassen beispielsweise ELISA, den Pandex-mikrofluorimetrischen Assay, Agglutinations-Assays, Durchflusszytometrie, serumdiagnostische Assays und immunhistochemische Färbungsverfahren, die im Stand der Technik hinlänglich bekannt sind. Ein Antikörper kann auf verschiedene Arten, die im Stand der Technik hinlänglich bekannt sind, zu einem nachweisbaren Antikörper gemacht werden. Beispielsweise kann eine nachweisbare Markierung direkt oder indirekt an den Antikörper gekoppelt werden. Nützliche Markierungen umfassen wie oben beschrieben beispielsweise Radionukleotide, Enzyme, Fluorogene, Chromogene und chemilumineszente Substanzen.
Vorliegend werden erfindungsgemäße Anti-A2BP-Antikörper vorgeschlagen, um die Aktivität eines A2BP-Polypeptids in lebenden Tieren, wie beispielsweise in Menschen, oder in biologischen Geweben oder Flüssigkeiten derselben zu modulieren. Der Begriff "modulieren" bezeichnet die Fähigkeit einer Verbindung, die biologische Aktivität eines erfindungsgemäßen A2BP-Proteins, wie beispielsweise die Ataxin-2-bindende Aktivität oder die RNA-bindende Aktivität eines A2BP, zu verstärken (z.B. über einen Agonisten) oder zu inhibieren (z.B. über einen Antagonisten). Demgemäß werden vorliegend Zusammensetzungen vorgeschlagen, die einen Träger und eine Menge eines Antikörpers mit Spezifität für A2BP-Polypeptide umfassen, welche wirksam ist, um natürlich vorkommende Liganden oder A2BP-bindende Proteine (z.B. Ataxin-2) daran zu hindern, an die erfindungsgemäßen A2BP-Polypeptide zu binden. Beispielsweise kann zu diesem Zweck ein monoklonaler Antikörper nützlich sein, der gegen ein Epitop eines erfindungsgemäßen A2BP-Polypeptids gerichtet ist (einschließlich einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 aufgeführt ist). Solche Anti-A2BP-Antikörper können darüber hinaus nützlich zum Inhibieren oder Verstärken, des Signal-Transduktionswegs sein, der mit der Zelldegeneration assoziiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus transgene nicht-humane Säugetiere bereit, die in der Lage sind, exogene Nukleinsäuren zu exprimieren, welche A2BP-Polypeptide kodieren. Wie vorliegend verwendet bedeutet der Begriff "exogene Nukleinsäure" eine Nukleinsäuresequenz, die in Bezug auf den Wirt nicht nativ ist, oder die in dem Wirt nicht in ihrer nativen Umgebung vorliegt, beispielsweise als Teil eines genetisch erstellten DNA-Konstrukts, das in den Wirt eingebracht worden ist. Zusätzlich zu den natürlich vorkommenden Mengen von A2BP können die erfindungsgemäßen A2BPs überexprimiert werden, wie beispielsweise in transgenen Säugetieren.
Ferner werden nicht-humane, transgene Säugetiere bereitgestellt, in denen natives A2BP unterexprimiert oder überhaupt nicht exprimiert wird (z.B. ein A2BP-Knockout). Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden transgene nicht-humane Säugetiere bereitgestellt, die in der Lage sind, Nukleinsäuren zu exprimieren, die A2BP-Polypeptide kodieren, welche so mutiert sind, dass sie nicht in der Lage sind, native Aktivität zu zeigen, d.h. sie exprimieren kein natives A2BP.
Transgene Säugetiere, in denen ein Genlocus für natives A2BP ausgeschaltet worden ist (knocked out) oder durch ein mutiertes A2BP-Gen ersetzt worden ist, um. die Expression oder die Struktur der exprimierten A2BP-Polypeptide zu verändern, können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren erzeugt werden. Homologe Rekombination ersetzt ein natives (endogenes) Gen gegen ein mutiertes Gen, ein rekombinantes Gen oder ein unverwandtes Gen, wobei ein Tier erzeugt wird, das kein natives (endogenes) Protein exprimieren kann, jedoch beispielsweise ein mutiertes Protein exprimieren kann, was zu einer Expression von veränderten A2BP-Polypeptiden führt. Das Expressionsmuster eines solchen ersetzten Gens kann das des nativen (endogenen) Gens nachahmen, was beispielsweise für die Bestimmung der Auswirkung von A2BP-Mutationen auf verschiedene biologische Funktionen, wie beispielsweise auf Entwicklungswege, nützlich sein kann. Homologe Rekombinationsverfahren sind im Stand der Technik hinlänglich bekannt (siehe beispielsweise US-Patent Nrn. 5,721,367; 5,695,977; 5,650,298 und 5,614,396).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung nicht-humane transgene Säugetiere mit einem Genom bereit, das Antisense-Nukleinsäuren umfasst, die komplementär zu Nukleinsäuren sind, welche für A2BP-Polypeptide kodieren, und so angeordnet sind, dass sie in Antisense-mRNA transkribiert werden, welche komplementär zu mRNA ist, welche für A2BP-Polypeptide kodiert, und welche an die mRNA hybridisiert und dadurch die Translation derselben inhibiert. Die Nukleinsäure kann darüber hinaus einen regulierbaren Promotor oder Gewebespezifische regulatorische Elemente umfassen, sodass die Expression induziert, reprimiert oder auf spezifische Zelltypen beschränkt werden kann. Beispiele für Nukleinsäuren sind DNA oder cDNA, die eine kodierende Sequenz aufweisen, welche im Wesentlichen dieselbe ist wie die kodierende Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist. Ein Beispiel eines nicht-humanen transgenen Säugetiers ist eine transgene Maus. Beispiele für Expressionselemente, die die Gewebespezifität bestimmen, sind der Metallothionein-Promotor und der L7-Promotor. Protokolle zur Herstellung transgener Säugetiere, die Antisense-Nukleinsäuren exprimieren, welche in der Lage sind, die Translation einer Sense-Nukleinsäure zu inhibieren sind im Stand der Technik bekannt (US-Patent Nr. 5,661,016).
Tiermodellsysteme, die die biologischen Aufgaben von A2BP-Polypeptiden aufklären, werden ebenfalls bereitgestellt, und sie werden hergestellt, indem man unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren wie oben beschrieben transgene Tiere erzeugt, beispielsweise solche, in denen die Expression von A2BP-Polypeptiden verändert ist. Methoden für das Einbringen von normalen oder mutierten Versionen von Nukleinsäuren, die ein A2BP-Polypeptid kodieren, umfassen Mikroinjektion, retrovirale Infektion oder andere Mittel, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind, in geeignete befruchtete Embryos, wobei ein transgenes Tier erzeugt wird (vgl. beispielsweise Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1986)).
Im Gegensatz zur homologen Rekombination kann die Mikroinjektion einem Wirts-Genom Gene zufügen, ohne ein natives A2BP-Gen zu entfernen. Somit kann die Mikroinjektion ein transgenes Tier erzeugen, welches in der Lage ist, sowohl endogenes (natives) als auch exogenes A2BP zu exprimieren. Regulierbare Promotoren können an den kodierenden Bereich der Nukleinsäuren gekoppelt. werden, um ein Mittel bereitzustellen, um die Expression des Transgens zu induzieren oder zu reprimieren. Sofern es erwünscht ist, können Gewebe-spezifische regulatorische Elemente an den kodierenden Bereich gekoppelt werden, um eine Gewebe-spezifische Expression des Transgens zu erlauben. Transgene Tiermodellsysteme sind darüber hinaus für das in vivo-Screening von Verbindungen zur Identifikation von spezifischen Liganden, wie beispielsweise Agonisten oder Antagoni sten, welche die Proteinantworten aktivieren oder inhibieren, nützlich.
Zusätzlich zum in vivo-Sreening, können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren (einschließlich Antisense), Oligonukleotide, Vektoren, die dieselben enthalten, transformierte Wirtszellen, Polypeptide und Kombinationen derselben sowie die erfindungsgemäßen Antikörper dazu verwendet werden, Verbindungen in vitro zu untersuchen, um zu bestimmen, ob eine Verbindung als potentieller Agonist oder Antagonist zu den erfindungsgemäßen Polypeptiden fungiert. Diese in vitro-Screening-Assays stellen Informationen über Funktion und Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide bereit, die zur Identifizierung und Gestaltung von Verbindungen führen können, welche in der Lage sind, spezifisch mit einer oder mehreren Arten von Polypeptiden, Peptiden oder Proteinen zu interagieren.
Die funktionalen Eigenschaften der erfindungsgemäßen A2BPs sprechen für eine Rolle von Ataxin-2 und den erfindungsgemäßen A2BPs beim Signal-Transduktionsweg, der die Zelldegeneration beeinflusst. Ataxin-2 und die erfindungsgemäßen A2BPs stellen somit auch Ziele zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen dar, bei denen es erwünscht ist, die Zelldegeneration zu erhöhen oder zu verringern. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen A2BPs sowie Agonisten oder Antagonisten zu diesen verwendet werden, um neurodegenerative Störungen, wie beispielsweise spinocerebellare Ataxie des Typs 2, zu behandeln. Gemäß bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung, wie beispielsweise abnormale oder ungewünschte Zellproliferation, können erfindungsgemäße A2BPs, Agonisten oder Antagonisten zu diesen verwendet werden, um Störungen wie beispielsweise Krebs zu behandeln.
Somit werden gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen be reitgestellt, die an A2BP-Polypeptide binden. Die erfindungsgemäßen Proteine können in einem kompetitiven Bindungsassay verwendet, werden. Ein solcher Assay kann ein schnelles Screening einer großen Anzahl von Verbindungen ermöglichen, um zu bestimmen, welche Verbindungen (wenn überhaupt) in der Lage sind, an A2BPs zu binden. Daran anschließend können detailiertere Assays mit denjenigen Verbindungen durchgeführt werden, von denen man herausgefunden hat, dass sie binden, um ferner zu bestimmen, ob solche Verbindungen als Modulatoren, Agonisten oder Antagonisten der erfindungsgemäßen A2BP-Proteine agieren können. Solche Screening-Assays können verwendet werden, um Verbindungen mit therapeutischem Wert zu identifizieren; beispielsweise können Verbindungen, die an erfindungsgemäße A2BPs binden oder diese modulieren, verwendet werden, um eine Vielzahl von pathologischen Zuständen zu behandeln, die durch erfindungsgemäße A2BPs vermittelt werden. Solche pathologischen Zustände umfassen diejenigen, bei denen Zelldegeneration auftritt, beispielsweise die zuvor beschriebenen degenerativen und hyperproliferativen Störungen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Bioassays zum Identifizieren von Verbindungen bereitgestellt, die die biologische Aktivität des erfindungsgemäßen A2BP-Polypeptide modulieren. Nach diesem Verfahren werden erfindungsgemäße Polypeptide mit einer "Test"-Substanz in Kontakt gebracht, die Aktivität des Polypeptids wird nach dem Inkontaktbringen mit der Testsubstanz überwacht, und diejenigen Substanzen; die eine Auswirkung auf die biologische Aktivität von A2BP haben, werden als Liganden der A2BP-Polypeptide identifiziert. Beispielsweise kann ein Reporter-Gen-Expressions-System, das die Proteinaktivität überwacht, wie beispielsweise ein Hefe- oder Säugetier-2-Hybridsystem, welches spezifische Protein-Protein-Interaktionen nachweist, verwendet werden, um Verbindungen auf Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität zu untersuchen. Wie in den Beispielen I, II und III dargestellt, wurde ein Hefe-2-Hybrid-System verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zwischen Ataxin-2 und A2BP nachzuweisen. Somit können Verbindungen, die solche Protein-Protein-Interaktionen verstärken (Agonisten) oder inhibieren (Antagonisten), beispielsweise zwischen Ataxin-2 und A2BP-Polypeptiden, durch Inkontaktbringen solcher Hefe-Zellen, welche rekombinante Proteine exprimieren, mit einer Test-Verbindung identifiziert werden. Antagonisten werden als solche Verbindungen identifiziert werden, die Protein-Protein-Interaktionen inhibieren, wodurch die Expression des Reporters verringert wird, wohingegen Agonisten als solche Verbindungen identifiziert werden, die Protein-Protein-Interaktionen verstärken, wodurch die Expression des Reporters erhöht wird.
Somit stellt die Erfindung transformierte Wirtszellen bereit, die die erfindungsgemäßen Polypeptide rekombinant exprimieren. Die rekombinanten Wirtszellen können mit einer Test-Verbindung in Kontakt gebracht werden, und die modulierende(n) Wirkung(en) derselben kann (können) anschließend durch Vergleich der A2BP-vermittelten Antwort (z.B. über Reporter-Gen-Expression) in Gegenwart und in Abwesenheit der Testverbindung oder durch Vergleich der Antwort von Testzellen oder Kontroll-Zellen (z.B. Zellen, die keine A2BP-Polypeptide exprimieren) zu der Gegenwart der Verbindung ausgewertet werden.
In ähnlicher Weise kann die Bindung eines A2BP-Polypeptids an Nukleinsäuren unter Verwendung eines Bioassays gemessen werden, der die Bindung von Nukleinsäure (z.B. RNA oder DNA) in vivo und in vitro nachweist. Somit kann ein solcher Assay verwendet werden, um Verbindungen nach Agonisten- und Antagonisten-Aktivität zu untersuchen. Solche Nukleinsäure-Bindungsassays, wie beispielsweise in vitro elektrophoretische Gel-Shift-Assays und Ähnliche, können verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die die Protein-Nukleinsäure-Bindung verstärken oder inhibieren.
Wie vorliegend verwendet bezeichnet eine Verbindung oder ein Signal, die/das die „Aktivität" eines erfindungsgemäßen Polypeptides "moduliert" eine Verbindung oder ein Signal, welche(s) die Aktivität von A2BP-Polypeptiden so moduliert, dass die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids in Gegenwart der Verbindung oder des Signals anders ist als beim Fehlen der Verbindung oder des Signals. Insbesondere umfassen solche Verbindungen oder Signale Agonisten und Antagonisten. Ein Agonist umfasst eine Verbindung oder ein Signal, die/das A2BP aktiviert. Im Gegensatz dazu umfasst ein Antagonist eine Verbindung oder ein Signal, die/das A2BP inhibiert. Die Wirkung von Agonisten und Antagonisten auf A2BP-Polypeptiden kann direkt oder indirekt sein. Beispielsweise kann ein indirekt wirkender Agonist eine intermediäre Substanz aktivieren, wie beispielsweise ein Protein, das wiederum A2BP aktiviert. Direkt wirkende Antagonisten können kompetitiv sein, wobei diese an den oder in der Nähe der spezifischen Stelle für die Agonisten-Bindung wirken, oder sie können nicht-kompetitiv sein, wobei diese mit einer anderen Stelle als der Agonisten-Interaktions-Stelle interagieren. Eine Verbindung kann ein Peptid, ein Peptoid, eine peptidomimetische Substanz, eine Nukleinsäure einschließlich eines Expressionsplasmids oder einer Antisense-Nukleinsäure, ein Protein, wie beispielsweise ein Antikörper, oder ein organisches Molekül sein, wobei ein organisches Molekül jedes kleine (Molekulargewicht geringer als 7500 Da) Koh lenstoff-enthaltendes Molekül ist. Eine Verbindung kann die Aktivität von A2BP entweder durch Inhibieren oder Verstärken der Aktivität von A2BP-Proteinen modulieren, ohne das Ausmaß der A2BP-Expression zu verändern, oder sie kann die A2BP-Aktivität durch Modulieren des Ausmaßes der A2BP-Expression modulieren.
Ein Beispiel für einen solchen Antagonisten ist ein A2BP, das Ataxin-2 bindet, jedoch kein Signal transduziert, welches mit der Zelldegeneration assoziiert ist. In ähnlicher Weise stellt ein RNA-bindendes A2BP, das nicht die Fähigkeit aufweist, ein Signal zu transduzieren, welches mit der Zelldegeneration assoziiert ist, ein Beispiel für einen Antagonisten dar.
Wie vom Fachmann verstanden wird, erfordern Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die A2BP-Aktivität modulieren im Allgemeinen einen Vergleich mit einer Kontrolle. Eine Art von "Kontrolle" ist eine Zelle oder eine Kultur, die im Wesentlichen in derselben Weise behandelt wird, wie die Zelle oder Kultur, die der Testverbindung ausgesetzt wird, mit dem Unterschied, dass die Kontroll-Zelle oder die Kontroll-Kultur nicht der Test-Verbindung ausgesetzt wird. Beispielsweise kann dieselbe Zelle in Verfahren, die elektrophysiologische Methoden mit Spannungsklemmen (voltage clamp electrophysiological procedures) verwenden, in Gegenwart oder in Abwesenheit der Verbindung untersucht werden, einfach durch Wechsel der externen Lösung, in die die Zelle eingetaucht ist. Eine andere Art von Kontroll-Zelle oder Kontroll-Kultur kann eine Zelle oder Kultur sein, die identisch mit den transfizierten Zellen ist, mit der Ausnahme, dass die Kontroll-Zelle oder Kontroll-Kultur keine nativen Proteine exprimiert. Demgemäß wird die Antwort der transfizierten Zelle auf die Test-Verbindung mit der Antwort oder dem Ausbleiben derselben der Kontroll-Zelle oder Kontroll-Kultur auf dieselbe Verbindung unter denselben Reaktionsbedingungen verglichen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Aktivität von A2BP-Polypeptiden durch Inkontaktbringen der Polypeptide mit einer wirksamen Menge mindestens einer Verbindung moduliert werden, die durch die oben beschriebenen Bioassays identifiziert wurde. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Aktivität eines Proteins, das an A2BP bindet, durch Inkontaktbringen eines solchen Proteins mit den vorliegend beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptiden moduliert werden. Die modulierte Proteinaktivität kann verstärkt oder inhibiert werden. Bei einem Protein, das A2BP bindet, wie beispielsweise Ataxin-2, kann ein solches Verfahren nützlich sein, um eine Erkrankung zu behandeln, die mit Ataxin-2 in Verbindung steht. In ähnlicher Weise kann bei einer Nukleinsäure, die A2BP oder funktionale Fragmente desselben bindet, die Aktivität des Nukleinsäuremoleküls moduliert werden, indem die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen angewendet werden.
Ferner werden vorliegend Verfahren zum Modulieren der Genexpression in einer Zelle bereitgestellt. Die erfindungsgemäßen A2BPs binden RNA, wodurch Transport, Translation, Degradation und/oder Spleißveränderung von RNA-Molekülen in einer Zelle reguliert werden. Somit wird vorliegend vorgeschlagen, dass ein Verfahren zur Behandlung einer Zelle mit einer Verbindung, die die A2BP-Aktivität moduliert, dadurch die Genexpression innerhalb dieser Zelle durch Modulieren der Expression von einem oder mehreren RNA-Molekülen, die durch ein erfindungsgemäßes A2BP gebunden sind, moduliert. Beispielsweise kann ein Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes A2BP kodiert, in eine Zelle eingebracht werden, was zu einer erhöhten A2BP-Expression und somit zu einer erhöhten Menge von A2BP-Aktivität innerhalb der Zelle führt. Diese erhöhte Menge von Aktivität wird in einer modulierten RNA-Bindungs-Aktivität resultieren, die in einer modulierten Genexpression innerhalb der Zelle resultieren wird. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist die Aktivität von A2BP, die moduliert wird; die RNA-Transport-Aktivität von A2BP.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Modulieren der Zelldifferenzierung bereitgestellt. Wie vorliegend beschrieben wird vorgeschlagen, dass Ataxin-2 und A2BP essentielle Proteine bei der embryonalen Entwicklung sind und daher eine entscheidende Rolle bei der Zelldifferen zierung spielen. Somit wird eine Verbindung, die die Aktivität von A2BP moduliert, die Zelldifferenzierung modulieren. Eine solche Verbindung kann die Aktivität von A2BP auf eine Vielzahl von Wegen modulieren, einschließlich dem Modulieren der A2BP:Ataxin-2-Assoziation und dem Modulieren der RNA-Bindungsaktivität von A2BP. Es liegt ferner im Bereich dieser Ausführungsform, dass ein Verfahren zum Modulieren der Aktivität von A2BP zum Modulieren der embryonalen Entwicklung nützlich sein kann.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren. zum Modulieren der Funktion eines adulten Neurons bereitgestellt. Ein adultes Neuron, wie vorliegend verwendet, ist jede terminal differenzierte neuronale Zelle. Eine Verbindung, die die A2BP-Aktivität in einem adulten Neuron moduliert, wird beispielsweise die A2BP:Ataxin-2-Assoziation oder die RNA-Bindungsaktivität von A2BP modulieren, was entweder zu einer Modulation der Genexpression oder der Signaltransduktion innerhalb des adulten Neurons führen wird. Gemäß einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung wird die Modulation der A2BP-Aktivität eine modulierende Wirkung auf das neuronale Gedächtnis oder die Langzeitpotenzierung haben. Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff Langzeitpotenzierung die lang andauernde Verstärkung der Antwort einer postsynaptischen Nervenzelle auf Stimulation über die Synapse, die bei einer wiederholten Stimulation auftritt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Verfahren zum Modulieren der Funktion einer Muskelzelle durch Einbringen einer Verbindung. in die Muskelzelle bereitgestellt, die die Aktivität von A2BP moduliert. Es wurde eine starke Expression von Ataxin-2 in den Muskelzellen von Organismen, wie beispielsweise C. elegans beobachtet. Das Modulieren der A2BP-Aktivität wird wiederum die Ataxin-2-Aktivität modulieren. Somit wird eine Verbindung, die gemäß dieser Ausführungsform der Erfin dung verwendet wird, das Modulieren des stark exprimierten Ataxin-2 in einer Muskelzelle beeinflussen, wodurch die Funktion der Muskelzelle moduliert wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Verfahren zur Behandlung von degenerativen oder hyperproliferativen Störungen bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst die Verabreichung von A2BP oder funktionalen Fragmenten desselben an ein Subjekt. Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Behandlung von Störungen bereit, die das Verabreichen von Nukleinsäuren umfassen, die für solche A2BP-Polypeptide kodieren. Ferner werden Verfahren zur Behandlung von Störungen bereitgestellt, einschließlich derjenigen, die das Gehirn betreffen, wie beispielsweise spinocerebellare Ataxie des Typs 2. Verfahren zur Behandlung von hyperproliferativen Störungen wie beispielsweise Krebs werden ebenfalls bereitgestellt.
Degenerative und hyperproliferative Störungen können durch Verabreichen von A2BP oder funktionalen Fragmenten desselben behandelt werden. In Bezug auf degenerative Störungen beispielsweise verwenden diese Verfahren A2BP-Proteine, wobei die Polypeptide die zur Zelldegeneration führende Signaltransduktion inhibieren. Beispielsweise kann ein A2BP-Polypeptid, wie beispielsweise ein dominant-negatives Fragment (dem eine Signal-transduzierende Funktion fehlt), welches an Ataxin-2 bindet, wobei die Interaktion von Ataxin-2 mit nativem (d.h. endogenem) A2BP inhibiert wird, an ein Subjekt verabreicht werden, welches von spinocerebellarer Ataxie des Typs 2 betroffen ist, wodurch die Symptome, welche mit dieser Störung assoziiert sind, gelindert werden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann ein RNA-bindendes dominant-negatives A2BP-Polypepid (dem eine Signal-transduzierende Funktion fehlt) an ein Subjekt verabreicht werden, welches von spinocerebellarer Ataxie des Typs 2 betroffen ist, um die Transduktion des Zell-Degenerations-Signals zu inhibieren, wodurch die assoziierten Symptome gelindert werden. Solche Verfahren, die dominant-negative A2BP-Polypeptide verwenden, können einen Signal-Transduktions-Weg inhibieren, der zu einer Zelldegeneration führt, die mit spinocerebellarer Ataxie des Typs 2 assoziiert ist.
Nukleinsäuren, die solche therapeutischen A2BP-Polypeptide kodieren und funktionale Fragmente derselben können in ähnlicher weise in diese Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise kann die Verabreichung eines eukaryotischen Expressions-Vektors, wie beispielsweise eines retroviralen Vektors, der ein A2BP kodiert, in einen Patienten, der an einer degenerativen Störung leidet, wie beispielsweise an spinocerebellarer Ataxie des Typs 2, die Symptome, welche mit dieser Störung assoziiert sind, lindern. Solche Vektoren, die therapeutisches A2BP exprimieren, können, sofern gewünscht, gezielt zu dem geeigneten Zell-Typ gebracht werden, wobei ein Retrovirus mit natürlichem oder künstlich hergestelltem Zelltropismus verwendet wird. Bevorzugte Vektoren zur Verwendung bei solchen Verfahren sind diejenigen, die in der Lage sind, Zellen zu infizieren, die keine Zellteilung durchlaufen.
Zusätzlich kann ein A2BP oder ein funktionales Fragment, das eine Chimäre umfasst, beispielsweise ein A2BP, welches an einen Zelloberflächenprotein-Liganden gekoppelt ist (z.B. einen Nerven-Wachstumsfaktor-Rezeptor oder einen Ähnlichen), an ein Individium verabreicht werden, um die Symptome, die mit spinocerebellarer Ataxie des Typs 2 assoziiert sind, zu lindern. In ähnlicher Weise kann eine Chimäre, die A2BP gekoppelt an eine RNAse umfasst, an ein Subjekt verabreicht werden, um die Symptome, welche mit spinocerebellarer Ataxie des Typs 2 assoziiert sind, zu lindern. In ähnlicher Weise können ein solches A2BP, funktionale Fragmente und Chimäre desselben, die von Nukleinsäuren kodiert werden, verabreicht werden, um die Symptome, welche mit degenerativen Störungen, einschließlich bei spielsweise spinocerebellarer Ataxie des Typs 2 assoziiert sind, zu lindern.
In ähnlicher Weise können A2BP oder Ataxin-2-Agonisten und Ataxin-2-Antagonisten, die in den oben beschriebenen in vivo- oder in vitro-Assays identifiziert worden sind, sowie Chimären derselben und Nukleinsäuren, die diese kodieren, in einem erfindungsgemäßes Verfahren verwendet werden, um die Symptome, die mit degenerativen Störungen assoziiert sind, zu lindern.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung hyperproliferativer Störungen, wie beispielsweise Krebs bereit. Die Verfahren verwenden A2BP-Polypeptide, wobei solche Polypeptide einen Degenerations-Signal-Transduktions-Weg der Zelle stimulieren können. Somit können unter Verwendung der Verabreichungsarten und Expressionssysteme, (z.B. retrovirale Expressions-Vektoren und Ähnliche) erfindungsgemäße Polypeptide an Subjekte verabreicht werden, die eine abnormale oder unerwünschte zelluläre Proliferation aufweisen, um die Zell-Degeneration zu verstärken, wodurch die Symptome, die mit der Hyperproliferation assoziiert sind, gelindert werden. In ähnlicher Weise können A2BP oder Ataxin-2-Agonisten oder Ataxin-2-Antagonisten, die durch die oben beschriebenen Verfahren identifiziert worden sind, in die Verfahren. eingesetzt werden, um die Zell-Degeneration zu verstärken.
Die oben beschriebenen Verfahren verwenden Verabreichungsarten, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind. Solche Wege umfassen beispielsweise intravenös, intramuskulär, subkutan, intraspinal und intrakraniell. Die gewählten Wege hängen von der zu behandelnden Störung und den verwendeten Zusammensetzungen ab.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Diagnose von Störungen bereitgestellt, die mit A2BP in Verbindung stehen, wobei solche Verfahren umfassen: das Nachweisen einer defekten Sequenz, Mutante von SEQ ID NO: 1, in dem Subjekt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden diagnostische Systeme, vorzugsweise in Form eines Kits bereitgestellt, die mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem geeigneten Verpackungsmaterial umfassen. Die diagnostischen Nukleinsäuren sind von den vorliegend beschriebenden A2BP-kodierenden Nukleinsäuren abgeleitet. Gemäß einer Ausführungsform sind die diagnostischen Nukleinsäuren beispielsweise von SEQ ID NO: 1 abgeleitet. Erfindungsgemäße diagnostische Systeme sind für das Untersuchen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von A2BP-kodierender Nukleinsäure, entweder in genomischer DNA oder in transkribierter Nukleinsäure (wie beispielsweise in mRNA oder cDNA), die A2BP kodieren, nützlich.
Ein geeignetes diagnostisches System umfasst mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, vorzugsweise zwei oder mehr erfindungsgemäße Nukleinsäuren, als separat verpackte(s) chemische(s) Reagenz(ien) in einer Menge, die für mindestens einen Assay ausreicht. Instruktionen zur Verwendung des verpackten Reagenz werden üblicherweise ebenfalls umfasst sein. Der Fachmann kann problemlos die erfindungsgemäßen Nukleinsonden und/oder Primer in eine Kitform einbringen, in Kombination mit für die Ausführung der vorliegend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Puffern oder Lösungen.
Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Ausdruck "Verpackungs-Material" ein oder mehrere physikalische Strukturen, die verwendet werden, um die Inhalte des Kits zu umfassen, wie beispielsweise die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sonden oder Primer und Ähnliches. Das Verpackungsmaterial wird nach hinlänglich bekannten Verfahren hergestellt, vorzugsweise um eine sterile, kontaminationsfreie Umgebung bereitzustellen. Das Verpackungsmaterial weist eine Markierung auf, die darauf verweist, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zum Nachweis einer bestimmten Sequenz verwendet werden kann, die für A2BP kodiert, einschließlich der Nukleinsäuresequenzen, die in SEQ ID NO: 1 aufgeführt sind, oder Mutationen oder Deletionen in diesen, wodurch die Diagnose des Vorliegens oder einer Prädisposition für spinocerebellare Ataxie des Typs 2 diagnostiziert werden kann. Darüber hinaus enthält das Verpackungsmaterial Instruktionen, die darauf verweisen, wie die Materialien in dem Kit verwendet werden, um sowohl eine bestimmte Sequenz nachzuweisen, als auch beispielsweise das Vorliegen von oder eine Prädisposition für spinocerebellare Ataxie des Typs 2 nachzuweisen.
Die vorliegend verwendeten Verpackungsmaterialien, die in Bezug auf die diagnostischen Systeme Verwendung finden, sind diejenigen, die üblicherweise bei diagnostischen Systemen auf Basis von Nukleinsäuren verwendet werden. Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "Verpackung" eine feste Matrix oder ein festes Material, wie beispielsweise Glas, Kunststoff, Papier, Folie und Ähnliches, welches in der Lage ist, eine isolierte Nukleinsäure, ein isoliertes Oligonukleotid oder einen isolierten Primer der vorliegenden Erfindung innerhalb festgelegter Grenzen zu halten. Somit kann eine Verpackung beispielsweise ein Glasgefäß sein, das verwendet wird, um Milligramm-Mengen einer vorgeschlagenen Nukleinsäure, eines Oligonukleotids oder eines Primers zu beinhalten, oder es kann die Vertiefung einer Mikrotiterplatte sein, an die Mikrogramm-Mengen der vorgeschlagenen Nukleinsäure-Sonde in funktionsfähiger Weise befestigt wurden.
"Hinweise zur Verwendung" umfassen üblicherweise einen greifbaren Ausdruck, der die Reagenz-Konzentration oder mindestens einen Verfahrens-Parameter des Assays umfasst, wie beispielsweise die relativen Mengen von Reagenz und Probe, die gemischt werden sollen, die Verweildauer für Reagenz/Proben-Mischungen, Temperatur, Puffer-Bedingungen, und Ähnliches.
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr durch Bezug auf die nachfolgenden, nicht beschränkenden Beispiele genauer erläutert.
Materialien und Methoden
Soweit nicht auf anderes verwiesen wird, wurde die vorliegende Erfindung unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt, wie sie beispielsweise in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); oder Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques 152, S. L. Berger und A. R. Kimmerl, Hrsg., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987), beschrieben sind.
BEISPIEL 1
Identifizierung von cDNA, die Ataxin-2-bindende Proteine kodiert
Ein Plasmid, das für den C-terminalen Bereich des Ataxin-2-Proteins kodiert (Aminosäuren 811–1312; vgl. Pulst et al., 1996, Nature Genetics, 14: 269–276), wurde an die bindende Do mäne des Transkriptionsfaktors GAL4 fusioniert, wobei das Plasmid pSCA2U4L2 gebildet wurde. Eine cDNA-Bibliothek aus humanem, adulten Gehirn wurde in einen GAL4-Aktivierungsdomänen-Fusionsvektor pGAD10 (Clontech, Palo Alto, CA) kloniert und mittels des Hefe-2-Hybrid-Verfahrens (Fields et al., Nature 340: 245–246 (1989)) unter Verwendung des Plasmids pSCA2U4L2 durchsucht: Doppeltransformanten des Hefestamms Y190 wurden auf SC-Medien angezüchtet, denen Leucin, Tryptophan und Histidin fehlten (dropped out), und die 25 mM 3-Amino-1,2,4-Triazol und 2% Glucose enthielten (Poullet and Tamanoi, Meth. in Enzym., 255: 488–497 (1995)). Die β-Galaktosidaseaktivität wurde durch Inkubieren gefriergebrochener Kolonien auf Nitrocellulose in Z-Puffer (60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄, pH 7,0, 0,03 mM β-Mercaptoethanol und 2,5 μM X-gal) bei 37°C für 15 Minuten bis 8 Stunden untersucht.
Insgesamt. 2,2 × 10⁶ Kolonien wurden untersucht, von denen 15 positiv in Bezug auf die β-Galaktosidaseaktivität waren, was durch blaue Kolonien sichtbar war. Die Plasmide wurden gereinigt und mit pSCA2U4L2 co-transformiert, wodurch die Anzahl von Transformanten, die blaue Kolonien produzierten, auf 2 abnahm. Beide selektierten Klone kodierten ein neues Ataxin-2-bindendes-Protein, welches vorliegend als SEQ ID NO: 1 aufgeführt wird.
BEISPIEL 2
Charakterisierung der Bindung von Ataxin-2: Ataxin-2-bindendem Protein
Um zu bestimmen, welche Domänen von Ataxin-2 an das Ataxin-2-bindende Protein binden, wurden Deletionskonstrukte erzeugt, die Amino- und carboxyterminale Deletionen von Ataxin-2 enthielten, und diese wurden unter Verwendung des oben beschrie benen Hefe-2-Hybrid-Verfahrens untersucht. Ataxin-2-Proteine, bei denen die carboxyterminalen Reste deletiert waren, zeigten keine Interaktion mit Ataxin-2-bindendem Protein, wohingegen Ataxin-2-Proteine mit aminoterminalen Deletionen von bis zu 1022 Aminosäuren an das erfindungsgemäße Ataxin-2-bindende Protein banden. Diese Ergebnisse verweisen darauf, dass die für die Bindung des erfindungsgemäßen A2BP an Ataxin-2 notwendigen Bereiche innerhalb der Aminosäurereste 1023–1312 von Ataxin-2 liegen.
Es wurde darüber hinaus herausgefunden, dass die Polyglutamin (polyQ)-Wiederholungssequenz in Ataxin-2 für die A2BP-Bindung nicht essentiell ist. Wie jedoch unter Verwendung eines β-Gal-Filterassays bestimmt wurde, war die Bindungsaffinität von A2BP für die pathogen ausgedehnte Ataxin-2 Form vollständiger Länge, die 40 oder mehr Polyglutamin-Reste umfasste, größer als die für normales Ataxin-2 vollständiger Länge, welches 22 Polyglutamin-Reste umfasste (vgl. 2). Der Unterschied bezüglich der Bindungsaffinitäten von Ataxin-2-bindenden Proteinen für verschiedene CAG-Wiederholungs-Längen (Polyglutamin-Wiederholungen) verweist darauf, dass die pathogen ausgedehnten Polyglutamin-Wiederholungen von 40 und 58 Glutaminen die Bindungsinteraktionen von A2BP für Ataxin-2 relativ zu einer polyQ-Wiederholung von 22 Glutaminen verstärkt.
Der Grad der Interaktion zwischen Ataxin-2-bindendem Protein und Ataxin-2 wurde ferner unter Verwendung eines semiquantitativen ONPG-Flüssig-Assays auf β-Galaktosidase-Aktivität untersucht (Poullet und Tamanoi, siehe oben (1995)). Mehrere Ataxin-2-Deletionskonstrukte wurden hergestellt und als "FL", "HP2.3", "BK3.0", "PK1.9", "UHL2" und "AK1.1" bezeichnet. Die entsprechenden Aminosäurebereiche von Ataxin-2 für diese Konstrukte sind in 3 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die β-Galaktosidase-Aktivitäten für das Ataxin-2-Deletionskonstrukt U4L2, welches die Aminosäuren 811–1312 von Ataxin-2 enthält, höher waren als die für das PK1.9-Deletionskontrukt, welches die Aminosäuren 760–1312 von Ataxin-2 enthält (vgl. Tabelle 1).
Tabelle 1 Quantitative ONPG-Flüssigassay
Unter diesen Deletionskonstrukturen zeigten nur diejenigen eine β-Galaktosidase-Aktivität, die carboxyterminale Domänen von Ataxin-2 exprimierten. Die Konstrukte vollständiger Länge zeigten geringe Mengen an β-Galaktosidase-Aktivität. Dies kann auf die räumlichen Begrenzungen des Gal4-Assay-Systems zurückzuführen sein.
Die Ergebnisse, die die Interaktion von Ataxin-2-bindenden Proteinen. mit Ataxin-2 zeigen, sind konsistent mit der Beobachtung, dass das SCA1-Genprodukt Ataxin-1, welches mit spinocerebellarer Ataxie vom Typ-1 assoziiert ist, mit LANP interagiert, einem Leucin-reichen, sauren nukleärem Protein. LANP und Ataxin-1 sind in Matrix-assoziierten subnukleären Strukturen co-lokalisiert (Matilla et al., Nature 389: 974–978 (1997)). Ähnlich der erhöhten Assoziierung von Ataxin-2-bindendem Protein mit Ataxin-2, das über eine erhöhte Anzahl von Glutamin-Resten verfügt, ist die Assoziierung von LANP mit Ataxin-1 stärker, wenn eine erhöhte Anzahl von Glutamin-Resten vorliegt.
BEISPIEL 3
Immunhistochemischer Färbungs-Assay
Um die Verteilung von Ataxin-2-bindendem Protein in den Zielgeweben zu bestimmen, die am Phänotyp der Ataxie beteiligt sind, wurden Antikörper gegen Ataxin-2-bindendes Protein und Ataxin-2 verwendet, um zu zeigen, dass diese Proteine in den selben Zellen vorlagen und das Ataxin-2-bindende Protein ein Ziel für die Ataxin-2-Bindung in vivo war. Die immunhistochemische Färbung wurde mit 20 μg/ml Kaninchen-Anti-Ataxin-2-bindendes. Protein-Antikörper, 20 μg/ml Präimmun-Serum aus Kaninchen erreicht, welche mit Gewebeschnitten über Nacht bei 4°C inkubiert wurden. Primäre Antikörper wurden unter Verwendung des Vektor-ABC-Elite-Peroxidase-Kits (Vector Labs, Burlingame, CA) detektiert, DAB-verstärkt und mit Diaminobenzidin (DAB; Biomeda) sichtbar gemacht. Die Schnitte wurden unter Verwendung von wässrigem Hämatoxylin (Xymed) gegengefärbt. Absorptionskontrollen wurden unter Verwendung desselben Antikörpers durchgeführt, der mit Peptidantigen bei 100 μM für 3 Stunden, bei Raumtemperatur präabsorbiert war.
Die Expression von Ataxin-2 und Ataxin-2-bindendem Protein war im Cerebellum (eines der Gewebe, die an der spinocerebellaren Ataxie des Typs 2 beteiligt sind) auf bestimmte Zelltypen beschränkt. Beide Proteine wurden in Pukinje-Neuronen und Dentatus-Neuronen (dentate neurons) nachgewiesen, hingegen wurde nur geringfügige Expression in granulären Neuronen (granule neurons) beobachtet. Die Färbung von beiden Proteinen wurde darüber hinaus auch in ausgewählten Neuronen des Hippocampus, des cerebralen Kortex, des Thalamus und des Gehirnstamms beobachtet.
Das Gen des Ataxin-2-bindenden Proteins wird in Purkinje-Neuronen und Dentatus-Neuronen im Überfluss exprimiert, und das Ataxin-2-bindende Protein weist eine deutliche Lokalisierung im Cytoplasma auf. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um zu bestimmen, ob Ataxin-2 in denselben Strukturen lokalisiert ist wie Ataxin-2-bindendes Protein. Benachbarte Bereiche des Cerebellums wurden präpariert und die benachbarten Bereiche wurden mit Antikörpern gegen Ataxin-2-bindendes Protein und Ataxin-2 gefärbt. Es wurde eine klare Co-Lokalisierung von Ataxin-2-bindendem Protein und Ataxin-2 bei punktierten Organellen in den Purkinje-Neuronen und Dentatus-Neuronen beobachtet.
Die Gewebeverteilung von Ataxin-2-bindendem Protein und Ataxin-2 verweist darauf, dass ihre Interaktion nicht nur für spinocerebellare Ataxie des Typs 2 signifikant sein könnte, sondern auch neurodegenerative Störungen erklären kann, die andere Gensequenzen betreffen, welche eine Ausdehnung der Glutamin-Wiederholung durchlaufen. Diese Interaktion könnte auf gemeinsame biologische Wege bei der Gruppe von klinisch ähnlichen, neurodegenerativen Störungen verweisen, einschließlich der spinocerebellaren Ataxie des Typs 1 und 6, der spinobulbaren muskulären Atrophie, der Huntington-Erkrankung und der Machado-Joseph-Erkrankung.
BEISPIEL 4
Northern-Blot-Analyse
Gesamt RNA-Proben wurden mit dem Triazolreagenz (GibcoBRL) aus verschiedenen Bereichen des Maus-Gehirns und des Ratten-Cerebellums extrahiert. Die RNA wurde auf einem 1,2%igen Agarosegel getrennt und auf GeneScreen-Plus-Membranen (Du Pont) unter Verwendung hinlänglich bekannter Verfahren geblottet. Das Fragment von A2BP (1/3 kb) wurde durch BglII-Verdau von pGAD-A2BP gereinigt und wurde mittels T4-Kinase und γ-³²P-ATP markiert. Eine gleiche Menge Gesamt-RNA in jeder Bahn wurde. durch Hybridisierung mit β-Actin als Kontrolle (Clontech) bestätigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass ein 4,4 kb mRNA-Transkripts, welches A2BP kodiert, in folgenden Maus-Gehirn-Geweben vorliegt: Cerebellum (Bahn 1), Kortex (Bahn 2), Gehirnstamm (Bahn 3), Thalamus und Hypothalamus (Bahn 4) und Ratten-Cerebellum (Bahn 9). Eine geringfügig kleinere Bande wurde im Herz beobachtet (Bahn 5), was auf eine potentielle Spleiß-Variante des Nukleinsäure-Transkripts verweist.
BEISPIEL 5
Co-Immunpräzipitations-Assay
Um zu zeigen, das A2BP in menschlichen Zellen an Ataxin-2 bindet, wurden Co-Immunpräzipitations-Assay in HTB10-Zellen durchgeführt.
Kaninchen-Anti-Ataxin-2-Antikörper, die als Anti-SCA2A-Antikörper und Anti-SCA2B-Antikörper bezeichnet wurden, wurden gegen die Peptide erzeugt, welche den Aminosäuren 359–371 bzw. den Aminosäuren 904–921 des humanen Ataxin-2-Proteins entsprachen, wobei die humane Ataxin-2-Proteinsequenz in Pulst et al., 1996, Nature Genetics, 14: 269–276 aufgeführt ist. Darüber hinaus wurden Anti-A2BP-Antikörper, die als 1734-2 bezeichnet wurden, gegen das Peptid erzeugt, welches den Aminosäuren 177–190 des erfindungsgemäßen humanen A2BP entsprach. Die primären Antikörper wurden mit Hilfe des ECL-Western-Blot-Detektionssystems (erhältlich von Amersham) detektiert.
Native HTB10-Zellen wurden nach 48 Stunden Inkubation bei 37°C geerntet und in RIPA-Puffer (50 mM Tris-Cl, 0,1% SDS, 0,5% Desoxycholsäure, 1% Tween 20, 0,05% NaN₂) homogenisiert, der 2 μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Leupeptin, 500 μg/ml Pefabloc SC, 1 μg/ml Pepstatin enthielt. Die Lysate wurden für jeweils 1 Stunde mit Formalin-fixierten Staphylococcus aureus-Zellen (Sigma) und anschließend mit Kaninchen-Serum-Agarose (Sigma) bei Raumtemperatur vorgereinigt. Die vorgereinigten Lysate wurden mit dem Anti-SCA2A-Antikörper oder mit dem Anti-A2BP-Antikörper "1734-2" bei 4°C über Nacht inkubiert. Anschließend wurde Protein A/G-Säule (CytoSignal) zu den Lysaten gegeben und es wurde bei 4°C für 1 Stunde inkubiert, um die Antigen-Antikörper-Komplexe zu erhalten. Die Säule wurde mehrfach mit RIPA-Puffer gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden von Spin-Filter-Säulen (CytoSignal) durch Zentrifugation mit 2 × Probenpuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 4% SDS, 20% Glycerol, 5% β-Mercaptoethanol, 0,0025% Bromphenolblau) erhalten. Die endogene Expression von Ataxin-2 und erfindungsgemäßem A2BP in HTB-Zellen wurde mit dem Anti-SCA2A-Antikörper, dem Anti-SCA2B-Antikörper und dem Anti-A2BP-Antikörper 1734-2 bestätigt.
Wie oben dargestellt, wurden vorgereinigten Lysate der HTB10-Zellen entweder mit dem Anti-SCA2A-Antikörper oder dem Anti-A2BP-Antikörper 1734-2 immunpräzipitiert. Das Präzipitat wurde mittels Western-Blot mit dem Anti-SCA2B-Antikörper analysiert (5). Eine einzelne Bande von 145 kd, die der erwarteten Größe von endogenem Ataxin-2 entsprach, wurde in der Probe detektiert, die mit dem Anti-A2BP-Antikörper 1734-2 sowie auch mit dem Anti-SCA2A-Antikörper präzipitiert wurde (Bahnen B). Es wurden keine Banden in Proben detektiert, die mit Prä-Immunserum präzipitiert wurden (Bahnen PB).
BEISPIEL 6
Ataxin-2, das Genprodukt der autosomal-dominanten spinocerebellaren Ataxie des Typs 2 (SCA2) ist ein Protein mit unbekannter Funktion. Ataxin-2 interagiert mit A2BP1, einem Mitglied einer neuen Familie von RNA-bindenden Proteinen. Da Ataxin-2 wie auch A2BP1 evolutionär konserviert sind, wurden Expressionsmuster und Funktion von korrespondierenden Homologen in C. elegans untersucht. Das humane SCA2-Gen weist gegenüber seinem Homolog in C. elegans (CeAtaxin-2) eine Aminosäure-Identität von 19,3% auf. In ähnlicher Weise ist das Ataxin-2-bindende Protein 1 (A2BP1) zu 29,8% identisch zu dem homologen C. elegans-Protein CeA2BP1. Das Expressionsmuster von Ce-Ataxin-2 wurde unter Verwendung des CeAtaxin-2-Promotors untersucht, der mit einem GFP-Expressionsvektor gekoppelt war. CeAtaxin-2 wurde im umfassenden Maße im adulten Wurm mit starker Expression im Muskel exprimiert.
Um die Funktion von CeAtaxin-2 und CeA2BP1 aufzuklären, wurde eine RNA-Interferenz-Degradation von nativer mRNA durchgeführt. Die interferierende doppelsträngige RNA wurde durch Mikroinjektion oder Einweichen in Würmer des N2-Stamms im Larven-L4-Stadium eingebracht. Die Mikroinjektion wurde als eine 2-Gonadeninjektion durchgeführt. Das Einweichen umfasste das Belassen der Würmer in einer dsRNA-Lösung für 24 Stunden. Im Einklang mit früheren RNAi-Untersuchungen war die Mikroinjektion effektiver als das Einweichen.
Die Ergebnisse sind in den 6 und 7 gezeigt. DsRNA, die das CeAtaxin-2-Gen vollständiger Länge darstellte, führte zu einem frühen letalen Phänotyp bei der Nachkommenschaft von allen 40 mittels Mikroinjektion behandelten Würmern. RNAi für das CeA2BP1 vollständiger Länge zeigte eine ähnliche Unterbrechung bei der Entwicklung. Die Ergebnisse verweisen darauf, dass sowohl CeAtaxin-2 als auch CeA2BP1 essentielle zelluläre Gene bei der frühen Entwicklung von C. elegans sind. Beide sind in Säugetieren in hohem Maße konserviert. Die Tatsache dass beide Gene zu einem frühen letalen Phänotyp führen, wenn man mit RNAi auf sie abstellt, unterstreicht die früheren Erkenntnisse bezüglich der Interaktion von Ataxin-2 und A2BP1. Da beide RNA-bindende Eigenschaften aufweisen, werden beide als essentielle Bestandteile des RNA-Lokalisierungsnetzwerks angesehen, das die zelluläre Polarität herstellt. In ähnlicher Weise wird vorgeschlagen, dass Ataxin-2 und A2BP1 in polarisierten Zellen höherer Differenzierung, wie beispielsweise in Neuronen, eine ähnliche Funktion aufweisen für die neuronale Plastizität entscheidend sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nukleinsäure, die ein funktionales Fragment von Ataxin-2-bindendem Protein (A2BP), welches als SEQ ID NO: 2 angegeben wird, kodiert, wobei das funktionale Fragment Ataxin-2-bindende Aktivität, Nukleinsäuremolekül-bindende Aktivität oder A2BP-Antigen-Aktivität aufweist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das kodierte funktionale Fragment Ataxin-2 bindet.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das kodierte funktionale Fragment ein Nukleinsäuremolekül bindet.
Isolierte Nukleinsäure, welche A2BP kodiert, ausgewählt aus: (a) DNA, welche die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte Aminosäuresequenz kodiert, oder (b) DNA, welche in Hinblick auf (a) degeneriert ist, wobei die DNA biologisch aktives A2BP kodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei die Nukleotidsequenz der Nukleinsäure mindestens 50% Identität mit der als Nukleotide 987–1979 von SEQ ID NO: 1 aufgeführten Nukleotidsequenz aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei die Nukleotidsequenz der Nukleinsäure dieselbe ist wie die Nukleotide 987–1979 von SEQ ID NO: 1.
Nukleinsäure nach den Ansprüchen 4 bis 6, wobei die Nukleinsäure cDNA ist.
Vektor, welcher die Nukleinsäure nach den Ansprüchen 4 bis 7 enthält.
Rekombinante Zellen, die die Nukleinsäure nach den Ansprüchen 4 bis 7 enthalten.
Isoliertes Ataxin-2-bindendes Protein (A2BP), dadurch gekennzeichnet, dass es eine Fähigkeit hat, an Ataxin-2 zu binden, wobei die Aminosäuresequenz des Proteins eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70% Identität mit der als SEQ ID NO: 2 aufgeführten Aminosäuresequenz aufweist.
A2BP nach Anspruch 10, welches ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Fähigkeit aufweist, an ein Nukleinsäuremolekül zu binden.
A2BP nach Anspruch 11, welches die Fähigkeit aufweist, RNA zu binden.
A2BP nach Anspruch 10, welches dieselbe Aminosäuresequenz wie SEQ ID NO: 2 umfasst.
A2BP nach Anspruch 10, wobei das Protein durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, welche eine Nukleotidsequenz mit mindestens 50% Identität mit den Nukleotiden 987–1979 von SEQ ID NO: 1 umfasst.
A2BP nach Anspruch 14, wobei das Protein durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die dieselbe Sequenz wie die Nukleotide 987–1979 von SEQ ID NO: 1 umfasst.
Verfahren zur Expression von A2BP oder eines funktionalen Fragments desselben, wobei das Verfahren das Kultivieren von Zellen nach Anspruch 9 unter Bedingungen, die für eine Expression des A2BP geeignet sind, umfasst.
Isolierter Anti-A2BP-Antikörper mit spezifischer Reaktivität gegenüber einem A2BP nach Anspruch 10.
Antikörper nach Anspruch 17, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 17, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.
Zusammensetzung, welche eine Antisense-Nukleinsäure zu den Nukleotiden 987–1979 von SEQ ID NO: 1 in einer Menge umfasst, welche wirksam ist, um die Expression eines humanen A2BP zu inhibieren, und einen akzeptablen hydrophoben Träger, welcher in der Lage ist, eine Zellmembran zu durchqueren.
Transgenes, nicht-menschliches Säugetier, welches eine exogene Nukleinsäure, welche ein A2BP nach Anspruch 10 kodiert, exprimiert.
Transgenes, nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 21, wobei die das A2BP kodierende Nukleinsäure mutiert worden ist, und wobei das so exprimierte A2BP kein natives A2BP ist.
Transgenes, nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 21, wobei das transgene, nicht-menschliche Säugetier eine Maus ist.
Transgenes, nicht-menschliches Säugetier, das kein A2BP nach Anspruch 10 exprimiert.
Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines humanen A2BP in einer Probe, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer Testprobe mit einem Antikörper nach Anspruch 17, den Nachweis des Vorhandenseins eines Antikörper-A2BP-Komplexes und dementsprechend den Nachweis des Vorhandenseins eines humanen A2BP in der Testprobe umfasst.
Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Nukleinsäuremoleküls, das A2BP bindet, in einer Probe, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer Probe, die Nukleinsäuren enthält, mit einem A2BP nach Anspruch 10, den Nachweis des Vorhandenseins eines A2BP-Nukleinsäuremolekül-Komplexes und dementsprechend den Nachweis des Vorhandenseins des Nukleinsäuremoleküls in der Testprobe umfasst.
Einzelsträngiger DNA-Primer für eine Amplifizierung von A2BP-Nukleinsäure, wobei der Primer die als Nukleotide 987–1979 von SEQ ID NO: 1 aufgeführte Nukleinsäuresequenz umfasst.
Verfahren, das kein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Chirurgie oder Therapie ist, zum Modulieren der Aktivität eines Ataxin-2-Proteins, welches das Inkontaktbringen des Proteins mit einem im wesentlichen reinen A2BP nach Anspruch 10 oder einem Ataxin-2-Protein-bindenden Fragment desselben umfasst.
Verfahren, das kein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Chirurgie oder Therapie ist, zum Modulieren der Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls, das A2BP bindet, welches das Inkontaktbringen des Nukleinsäuremoleküls mit einem im wesentlichen reinen A2BP nach Anspruch 10 oder einem Nukleinsäure-bindenden Fragment desselben umfasst.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Nukleinsäure RNA ist.
Verfahren, das kein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Chirurgie oder Therapie ist, zum Modulieren der Genexpression in einer Zelle, welches das Einbringen einer Verbindung, die die A2BP-Aktivität moduliert, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Verbindung eine Nukleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die A2BP-Aktivität eine RNA-Transport-Aktivität ist.
Verfahren, das kein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Chirurgie oder Therapie ist, zum Modulieren der Zelldifferenzierung, welches das Einbringen einer Verbindung, die die A2BP-Aktivität moduliert, in eine Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Zelldifferenzierung während der Embryonalentwicklung auftritt.
Verfahren, das kein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Chirurgie oder Therapie ist, zum Modulieren der Funktion eines adulten Neurons, welches das Einbringen einer Verbindung, die die A2BP-Aktivität moduliert, in das Neuron umfasst.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei die Verbindung eine Nukleinsäure oder ein Anti-A2BP-Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei die Funktion des adulten Neurons neuronales Gedächtnis oder Langzeitpotenzierung ist.
Verfahren, das kein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Chirurgie oder Therapie ist, zum Modulieren der Funktion einer adulten Muskelzelle, welches das Einbringen einer Verbindung, die die A2BP-Aktivität moduliert, in die Muskelzelle umfasst.
A2BP nach Anspruch 10, wobei die Aminosäuresequenz des Proteins aus SEQ ID NO: 2 besteht.
Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei die Nukleinsäure eine DNA ist, die in. Hinblick auf (a) degeneriert ist, wobei die DNA A2BP, welches eine biologische A2BP-Aktivität aufweist, kodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei das biologisch aktive A2BP Ataxin-2-bindende Aktivität aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei das biologisch aktive A2BP Nukleinsäuremolekül-bindende Aktivität aufweist.
Isolierte Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu den Nukleotiden 987–1979 von SEQ ID NO: 1 komplementär ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 5, wobei die Nukleotidsequenz der Nukleinsäure mindestens 75% Identität mit der als Nukleotide 987–1979 von SEQ ID NO: 1 aufgeführten Nukleotidsequenz aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 5, wobei die Nukleotidsequenz der Nukleinsäure mindestens 85% Identität mit der als Nukleotide 987–1979 von SEQ ID NO: 1 aufgeführten Nukleotidsequenz aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 5, wobei die Nukleotidsequenz der Nukleinsäure mindestens 90% Identität mit der als Nukleotide 987–1979 von SEQ ID NO: 1 aufgeführten Nukleotidsequenz aufweist.
Verfahren nach den Ansprüchen 28 bis 39, wobei das Verfahren in vitro ausgeführt wird.
Verwendung eines transgenen nicht-menschlichen Säugetiers nach. den Ansprüchen 21 bis 24 für das in vivo-Screening von Verbindungen zur Identifizierung von A2BP- oder Ataxin-2-Agonisten oder -Antagonisten.