DE60219164T2

DE60219164T2 - Polypeptid mit zelltodhemmender wirkung

Info

Publication number: DE60219164T2
Application number: DE60219164T
Authority: DE
Inventors: Tsukasa Tsukuba-shi SUGO; Masaaki Tsukuba-shi MORI
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-06-15
Filing date: 2002-06-14
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2022-06-15
Also published as: CA2450678A1; EP1403371A4; ATE358179T1; EP1403371A1; DE60219164D1; US20040152101A1; US7053053B2; WO2002103018A1; EP1403371B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polypeptid, das biologische Funktionen reguliert, eine für das Polypeptid codierende DNA usw. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung prophylaktische und/oder therapeutische oder diagnostische Mittel gegen neurodegenerative Krankheiten, Hirnfehlfunktionen usw.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Alzheimer-Krankheit ist eine typische neurodegenerative Krankheit, die von fortschreitender Demenz und Verlust an Gedächtnisfähigkeit begleitet ist, jedoch wurde kein wirksames Behandlungsverfahren für diese Krankheit gefunden. Alzheimer-Krankheit ist gegenwärtig sicher eine der gravierendsten Krankheiten der alternden Gesellschaft und somit ist die Entwicklung von Therapeutika für diese Krankheit vom Standpunkt der medizinischen Ökonomie äußerst wichtig.
Vor kurzem zollten Hashimoto et al. der Tatsache Aufmerksamkeit, dass es weniger Läsionen in dem Occipitallappen von Alzheimer-Krankheitspatienten gibt, und sie haben ein Gen, das den Tod von Nervenzellen, in die das für familiäre Alzheimer-Krankheit ursächliche Gen eingeführt wird (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6336-6341, 2001), hemmt, aus dem Occipitallappen durch Anwendung des „Death-Trap"-Verfahrens (L. D'Adamio et al., Semin. Immunol., 9: 17-23, 1997) geklont. Dieses Gen codiert ein Peptid, das "Humanin" (WO 01/21787) bezeichnet wird, welches aus 24 Resten besteht. Ein synthetisches Humaninpeptid hemmt nicht nur den Tod von Nervenzellen, in die das ursächliche Gen von familiärer Alzheimer-Krankheit eingeführt worden ist, sondern auch den Tod der Nervenzellen, der durch den Zusatz von β-Amyloid induziert wird, was als eine potenzielle Ursache für Alzheimer-Krankheit festgestellt wurde. Dieses Auffinden lässt vermuten, dass Humanin oder Derivate davon als therapeutische Mittel für Alzheimer-Krankheit verwendbar sein können.
Obwohl Alzheimer-Krankheit eine typische neurodegenerative Krankheit ist, die von fortschreitender Demenz und Verlust an Gedächtnisfähigkeit begleitet ist, wurde ein wirksames Behandlungsverfahren bis jetzt noch nicht gefunden.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfinder haben intensive und ausgedehnte Untersuchung, die deren Aufmerksamkeit auf diese Tatsachen richteten, ausgeführt. Im Ergebnis haben diese Erfinder das Vorliegen von einem humaninartigen Gen in menschlichem Genom erwartet und eine humaninartige Sequenz mittels Suchen durch eine Humangenomdatenbank (GEMBLE) unter Anwendung der Humaningensequenz gefunden. Weiterhin waren die Erfinder basierend auf dieser Sequenzinformation erfolgreich beim Klonieren eines Gens, das ein humaninartiges Peptid aus einer Humanhirn-cDNA-Library codiert. Wie Humanin bestand dieses neu gefundene Peptid aus 24 Resten, wovon 6 Reste von jenen von Humanin verschieden waren. Diese Erfinder haben auch gefunden, dass dieses Peptid eine Inhibitorwirkung auf den Tod von Nervenzellen aufweist. Im Ergebnis von weiteren auf diesen Auffindungen basierenden Forschungen wurde die vorliegende Erfindung erzielt.
WO-A1-012787 beschreibt einen Bereich von Peptiden mit gewisser (bis zu etwa 80 % Identität) Ähnlichkeit zu den erfindungsgemäßen Peptiden zusammen mit den Antikörpern für diese Materialien.
Gemäß der Erfindung wird bereitgestellt:

1. Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 4 gezeigt, oder einem Amid, Ester oder Salz davon.
2. Polynukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz, die für das Polypeptid nach Absatz 1 codiert.
3. Polynukleotid nach Absatz 2, worin das Polynukleotid DNA ist.
4. Polynukleotid nach Absatz 2, bestehend aus der Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr. 3 gezeigt.
5. Rekombinanter Vektor, umfassend das Polynukleotid nach Absatz 2.
6. Transformante, transformiert mit dem rekombinanten Vektor nach Absatz 5, jedoch ausschließlich eines Menschen, menschlicher Keimbahnzellen oder menschlicher Embryos.
7. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach Absatz 1 oder eines Amids, Esters oder Salzes davon, umfassend Züchten der Transformanten nach Absatz 6 und Erlauben, das Polypeptid nach Absatz 1 herzustellen und zu akkumulieren.
8. Antikörper, der spezifisch das Polypeptid nach Absatz 1 als ein Antigen erkennt.
9. Polynukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz, die zu dem Polynukleotid nach Anspruch 2 komplementär ist.
10. Verfahren zum Absuchen nach Verbindungen oder Salzen davon, die die Inhibitorwirkung gegen Glutaminsäureinduzierten Zelltod des Polypeptids nach Absatz 1 oder eines Amids, Esters oder Salzes davon fördern oder hemmen, wobei das Verfahren durch das Anwenden des Polypeptids nach Absatz 1 oder eines Amids, Esters oder Salzes davon gekennzeichnet ist.
11. Kit zum Absuchen nach Verbindungen oder Salzen davon, die die Inhibitorwirkung gegen Glutaminsäure-induzierten Zelltod des Polypeptids nach Absatz 1 oder eines Amids, Esters oder Salzes davon fördern oder hemmen, das das Polypeptid nach Absatz 1 oder ein Amid, Ester oder Salz davon umfasst.
12. Prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen neurodegenerative Störungen oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom, umfassend das Polypeptid nach Absatz 1 oder ein Amid, Ester oder Salz davon.
13. Prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen neurodegenerative Störungen oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom, umfassend das Polynukleotid nach Absatz 2.
14. Diagnostisches Mittel gegen neurodegenerative Störungen oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom, umfassend das Polynukleotid nach Absatz 2.
15. Diagnostisches Mittel gegen neurodegenerative Störungen oder Hirnfehlfunktion, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom, umfassend den Antikörper nach Absatz 8.
16. Prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen neurodegenerative Störungen oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom, umfassend das Polynukleotid nach Absatz 9.
17. Diagnostisches Mittel gegen neurodegenerative Störungen oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom, umfassend das Polynukleotid nach Absatz 9.
18. Mittel nach Absatz 12, das ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntington Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose, Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheiten, epidurales Hämatom oder subdurales Hämatom ist.
19. Mittel nach Absatz 18, das ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen Alzheimer-Krankheit ist.
20. Mittel nach Absatz 12 oder Absatz 13 oder das ein Zelltodinhibitor ist.
21. Diagnostisches Mittel nach einem der Absätze 14, 16 oder 17, das ein diagnostisches Mittel gegen Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntington Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose, Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheiten, epidurales Hämatom oder subdurales Hämatom ist.
22. Verwendung des Polypeptids nach Absatz 1 oder eines Amids, Esters oder Salzes davon zum Herstellen eines prophylaktischen und/oder therapeutischen Mittels gegen neurodegenerative Krankheiten oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom.
23. Verwendung des Polynukleotids nach Absatz 2 zum Herstellen eines prophylaktischen und/oder therapeutischen Mittels gegen neurodegenerative Krankheiten oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom.
24. Polypeptid mit einer hemmenden Wirkung gegen Glutaminsäure-induzierten Zelltod und bestehend aus der wie in SEQ ID Nr. 4 gezeigten Aminosäuresequenz oder einem Amid, Ester oder Salz davon. Weiterhin können das Polypeptid, das Nukleotid (z.B. DNA) usw. der Erfindung auf Molekülmarker, Gewebsmarker, Chromosomenmapping, Identifizierung von genetischen Krankheiten, Diagnose von Krankheitszuständen oder Grundlagenforschungen, wie Entwicklung von Primern und Sonden, anwendbar sein.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Inhibitorwirkung von verschiedenen Konzentrationen des Humanin-artigen Peptids bei Glutaminsäure-induziertem Zelltod von Rattenadrenalmedulla-abgeleiteter Pheochromocytomzelle PC12h. Die Zellüberlebensverhältnisse werden gezeigt, indem man das Überleben von nicht zugesetzter Glutaminsäure als 100 % nimmt. Die Markierung * gibt einen signifikanten Unterschied (p < 0,05) verglichen mit der Kurve von nicht zugesetztem humaninartigem Peptid wieder.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Das erfindungsgemäße Polypeptid besteht aus der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 4 gezeigt wird (hierin nachstehend als das „erfindungsgemäße Polypeptid" bezeichnet; manchmal kann ein Amid, Ester oder Salz davon auch insgesamt als das „erfindungsgemäße Polypeptid" bezeichnet werden), kann ein Polypeptid sein, das von Zellen jeder Art (z.B. Hepatozyten, Splenozyten, Nervenzellen, Ganglienzellen, pankreatische β-Zellen, Knochenmarkzellen, Mesangialzellen, Langerhans-Zellen, Epidermazellen, Epithelialzellen, Endothelialzellen, Fibroplasten, fibröse Zellen, Muskelzellen, Fettzellen, Immunzellen (z.B. Macrophagen, T-Zellen, B-Zellen, natürliche Killerzellen, Mastzellen, Neutrophile, Basophile, Eosinophile, Monozyten), Megakaryozyten, Synovialzellen, Chondrozyten, Osteozyten, Osteoblasten, Osteoclasten, Säugerzellen oder Intestinalzellen oder Progenitorzellen von diesen Zellen, Stammzellen oder Krebszellen usw.) vom Menschen oder anderem Warmblüter (z.B. Meerschweinchen, Ratte, Maus, Huhn, Kaninchen, Schwein, Schaf, Rind, Affe usw.) oder jedes Gewebe, worin solche Zellen vorliegen, wie Hirn, verschiedene Teile des Hirns (z.B. Geruchskolben, amygdaloider Kern, Cerebralbasalkern, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Cerebralcortex, Medulla oblongata, Cerebellum), Wirbelsäule, Schleimdrüse, Magen, Pankreas, Niere, Leber, Keimdrüse, Schilddrüse, Gallenblase, Knochenmark, Adrenaldrüse, Haut, Muskel, Lunge, Gastrointestinaltrakte (z.B. Dickdarm, Dünndarm), Blutgefäße, Herz, Thymus, Milz, Speicheldrüse, peripheres Blut, Prostata, Hoden, Eierstock, Plazenta, Uterus, Knochen, Knorpel, Gelenk, Skelettmuskel usw., abgeleitet sein. Es kann auch ein rekombinantes Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid sein.
Das erfindungsgemäße Polypeptid wird gemäß den Übereinkünften für die Beschreibung von Peptiden definiert, d.h., der N-Terminus (Aminoterminus) an dem linken Ende und der C-Terminus (Carboxylterminus) an dem rechten Ende. Der C-Terminus des erfindungsgemäßen Polypeptids (wie ein Polypep tid, umfassend die wie in SEQ ID Nr. 4 gezeigte Aminosäuresequenz) kann eine Carboxylgruppe (-COOH), ein Carboxylat (-COO), ein Amid (-CONH₂) oder ein Ester (-COOR) sein.
Beispiele für R von der vorstehenden Estergruppe schließen C_1-6-Alkylgruppen (z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl oder n-Butyl), C_3-8-Cycloalkylgruppen (z.B. Cyclopentyl oder Cyclohexyl), C_6-12-Arylgruppen (z.B. Phenyl oder α-Naphthyl), C_7-14-Aralkylgruppen, wie Phenyl-C_1-2-alkylgruppen (z.B. Benzyl oder Phenethyl) und α-Naphthyl-C_1-2-alkylgruppen (z.B. α-Naphthylmethyl) ein. Zusätzlich schließt die Estergruppe auch Pivaloyloxymethylester ein, die universell als Oralester verwendet werden.
Wenn das erfindungsgemäße Polypeptid eine Carboxylgruppe (oder Carboxylat) in jeder Position, die von ihrem C-Ende verschieden ist, aufweist, kann die Carboxylgruppe amidiert oder verestert sein, wie ein Polypeptid auch in das erfindungsgemäße Polypeptid eingeschlossen sein kann. Der Ester kann in diesem Fall z.B. jeder der vorstehend für den C-terminalen Ester vorgeschlagenen Ester sein.
Weiterhin schließt das erfindungsgemäße Polypeptid jene Polypeptide ein, worin der N-terminale Aminosäurerest (z.B. Met) durch eine Schutzgruppe (z.B. C_1-6-Acylgruppe, wie C_1-6-Alkanoylgruppe (z.B. Formylgruppe oder Acetylgruppe)) geschützt ist; jene Polypeptide, worin der N-Terminus Glu, durch In-vivo-Spaltung erzeugt, pyroglutaminiert ist; jene Polypeptide, worin ein Substituent an einer Seite einer Aminosäure (z.B. -OH, -SH, Aminogruppe, Imidazolgruppe, Indolgruppe oder Guanidinogruppe) durch eine geeignete Schutzgruppe (z.B. C_1-6-Acylgruppe, wie C_1-6-Alkanoylgruppe (z.B. Formylgruppe oder Acetylgruppe)) und konjugierte Peptide, wie die so genannten Glycopolypetide, die an Zuckerketten gebunden sind, geschützt ist.
Als das Salz des erfindungsgemäßen Polypeptids werden Salze, die mit physiologisch verträglichen Säuren (z.B. organischen oder anorganischen Säuren) oder Basen (z.B. Alkalimetallen) gebildet werden, verwendet. Besonders bevorzugt sind physiologisch verträgliche Säureadditionssalze. Beispiele für solche Salze schließen Salze ein, die mit anorganischen Säuren (z.B. Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure oder Schwefelsäure) gebildet werden, und Salze, die mit organischen Säuren (z.B. Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure, Oxalsäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure oder Benzolsulfonsäure) gebildet werden.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann aus den vorstehend erwähnten Zellen oder Geweben von Human- oder anderem Warmblüter durch bekannte Reinigungsverfahren für Polypeptide (Proteine) hergestellt werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Polypeptid oder das Teilpeptid durch Züchten einer Transformanten, umfassend das erfindungsgemäße Polynukleotid (DNA usw.), das später beschrieben wird, unter Codieren des erfindungsgemäßen Polypeptids hergestellt werden. Es kann auch gemäß den Verfahren der Peptidsynthese, die später beschrieben werden, hergestellt werden.
Wenn das erfindungsgemäße Polypeptid aus Geweben oder Zellen von menschlichen oder nicht menschlichen Säugern hergestellt wird, wird das relevante Gewebe oder Zelle homogenisiert und dann wird das erfindungsgemäße Polypeptid mit Säuren usw. extrahiert. Das Polypeptid kann gereinigt und aus dem erhaltenen Extrakt durch eine Kombination von Chromatographie, wie Umkehrphasenchromatographie, Ionenaustauschchromatographie usw., isoliert und gereinigt werden.
Für die Synthese des erfindungsgemäßen Polypeptids oder eines Salzes oder Amids davon kann jedes von den üblichen Harzen, die für die Polypeptid(protein)synthese verfügbar sind, verwendet werden. Beispiele für solche Harze schließen Chlormethylharz, Hydroxymethylharz, Benzhydrylaminharz, Aminomethylharz, 4-Benzyloxybenzylalkoholharz, 4-Methylbenzhydrylaminharz, PAM-Harz, 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethylharz, Polyacrylamidharz, 4-(2',4'-Dimethoxyphenylhydroxymethyl)phenoxyharz und 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminoethyl)phenoxyharz ein. Unter Verwendung eines Harzes werden Aminosäuren, geschützt an ihren α-Gruppen und funktionellen Nebenkettengruppen, an das Harz gemäß der Aminosäuresequenz des Polypeptids von Interesse durch übliche Kondensationsverfahren kondensiert. An der Endstufe der Reaktion werden alle Schutzgruppen gleichzeitig mit der Spaltung des Polypeptids von dem Harz entfernt. Dann wird in einer stark verdünnten Lösung intramolekulare Disulfidbindungsbildungsreaktion ausgeführt, um das Polypeptid von Interesse oder Amid davon zu erhalten.
Bezüglich der Kondensation der vorstehend beschriebenen geschützten Aminosäuren können verschiedene Aktivatoren für die Polypeptidsynthese nützlich sein, wobei unter allen Carbodiimidreagenzien besonders bevorzugt sind. Carbodiimidreagenzien schließen DCC, N,N'-Diisopropylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminoprolyl)carbodiimid ein. Zur Aktivierung durch diese Reagenzien können geschützte Aminosäuren direkt zu dem Harz mit einem Racemierungsinhibitor zusätzlich, wie HOBt oder HOOBt, versetzt werden oder geschützte Aminosäuren können an das Harz addiert werden, nachdem die geschützten Aminosäuren als ein entsprechendes Aminosäureanhydrid oder HOBt-Ester oder HOOBt-Ester aktiviert wurden.
Das für die vorstehend erwähnte Aktivierung von geschützten Aminosäuren oder der Kondensation davon verwendete Lösungsmittel mit einem Harz kann geeigneterweise aus jenen Lösungsmitteln ausgewählt werden, die für Polypeptid(protein)kondensationsreaktionen als verwendbar bekannt sind. Verwendbare Lösungsmittel schließen Säureamide (z.B. N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid oder N-Methylpyrrolidon), halogenierte Kohlenwasserstoffe (z.B. Methylenchlorid oder Chloroform), Alkohole (z.B. Trifluorethanol), Sulfoxide (z.B. Dimethylsulfoxid), Ether (z.B. Pyridin, Dioxan, Tetrahydrofuran), Nitrile (z.B. Acetonitril oder Propionitril), Ester (z.B. Essigsäuremethylester oder Essigsäureethylester) und geeignete Gemische von diesen Lösungsmitteln ein. Die Reaktionstemperatur kann geeigneterweise aus dem als verwendbar für Polypeptid(protein)bindungsbildungsreaktionen bekannten Be reich ausgewählt werden; gewöhnlich wird die Temperatur aus dem Bereich von etwa –20°C bis etwa 50°C ausgewählt. Das aktivierte Aminosäurederivat wird gewöhnlich in 1,5- bis 4-fachem Überschuss verwendet. Wenn die Kondensation im Ergebnis des Testens unter Anwendung der Ninhydrin-Reaktion als unzureichend gefunden wird, kann ausreichende Kondensation durch Wiederholungsreaktionen ohne Entfernen von Schutzgruppen erreicht werden. Wenn auch durch Wiederholen von Reaktionen keine ausreichende Kondensation erreicht werden kann, können nicht umgesetzte Aminosäuren mit Acetanhydrid oder Acetylimidazol acetyliert werden, sodass sie anschließende Reaktionen nicht beeinflussen.
Schutzgruppen für die Aminogruppe von Rohmaterialien schließen Z, Boc, t-Pentyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Formyl, 2-Nitrophenylsulfenyl, Diphenylphosphinothioyl und Fmoc ein.
Die Carboxylgruppe kann geschützt werden, z.B. in Form eines Alkylesters (z.B. geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkylester, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, t-Butyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl, 2-Adamantyl usw.); Aralkylester (z.B. Benzyl, 4-Nitrobenzyl, 4-Methoxybenzyl, 4-Chlorbenzyl, Benzhydryl usw.), Phenacylester, Benzyloxycarbonylhydrazid, t-Butoxycarbonylhydrazid oder Tritylhydrazid.
Die Hydroxylgruppe von Serin kann z.B. durch Veresterung oder Veretherung geschützt sein. Beispiele für geeignete Gruppen für diese Veresterung schließen Nieder(C_1-6)alkanoylgruppen, wie Acetyl-, Aroylgruppen, wie Benzoyl, und von Kohlensäure abgeleitete Gruppen, wie Benzyloxycarbonyl und Ethyloxycarbonyl, ein. Beispiele für Gruppen, die zur Veretherung geeignet sind, schließen Benzyl, Tetrahydropyranyl und t-Butyl ein.
Schutzgruppen für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyrosin schließen Bzl, Cl₂-Bzl, 2-Nitrobenzyl, BrZ und t-Butyl ein.
Schutzgruppen für den Imidazolring von Histidin schließen Tos, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl, DNP, Benzyloxymethyl, Burn, Boc, Trt und Fmoc ein.
Aktivierte Carboxylgruppen von Rohmaterialien schließen die entsprechenden Säureanhydride, Azide und aktive Ester (Ester von Alkoholen, wie Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanomethylalkohol, p-Nitrophenol, HONB, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid und HOBt) ein. Beispiele für Rohmaterialien mit aktivierten Aminogruppen schließen die entsprechenden Phosphorsäureamide ein.
Verfahren zum Entfernen (Eliminieren) von Schutzgruppen schließen z.B. katalytische Reduktion in einem Wasserstoffstrom in Gegenwart eines Katalysators, wie Pd-Ruß oder Pd-Kohlenstoff, Säurebehandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, Methansulfsonäure, Trifluormethansulfonsäure, Trifluoressigsäure oder Gemische davon, Behandlung mit einer Base, wie Diisopropylethylamin, Triethylamin, Piperidin, Piperazin oder dergleichen, und Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak ein. Die Eliminierungsreaktion durch die vorstehend erwähnte Säurebehandlung wird im Allgemeinen bei Temperaturen von etwa –20°C bis etwa 40°C durchgeführt. Bei der Säurebehandlung ist es wirksam, einen Kationenfänger, wie Anisol, Phenol, Thioanisol, m-Cresol, p-Cresol, Dimethylsulfid, 1,4-Butandithiol oder 1,2-Ethandithiol, zuzusetzen. Die als die Schutzgruppe für den Imidazolring von Histidin verwendete 2,4-Dinitrophenylgruppe wird durch Thiophenolbehandlung entfernt. Die als die Schutzgruppe für den Indolring von Tryptophan verwendete Formylgruppe kann durch die vorstehend erwähnte Schutzgruppenentfernung durch die Säurebehandlung in Gegenwart von 1,2-Ethanthiol, 1,4-Butandithiol oder dergleichen oder durch Alkalibehandlung unter Verwendung von verdünntem Natriumhydroxid, verdünntem Ammoniak oder dergleichen entfernt werden.
Der Schutz von funktionellen Gruppen, welche nicht an der Reaktion teilnehmen sollten, und Schutzgruppen dafür, die Entfernung von diesen Schutzgruppen und die Aktivierung von in die Reaktion einbezogenen funktionellen Gruppen kann geeigneterweise aus Gruppen oder Verfahren ausgewählt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Ein alternatives Verfahren zum Gewinnen von Amiden für das Polypeptid der Erfindung umfasst z.B. Schützen der α-Carboxylgruppe von der C-terminalen Aminosäure durch Amidierung, Verlängern der Peptid(polypeptid)kette auf eine gewünschte Länge an der Seite der Aminogruppe, Herstellen eines Polypeptids, dessen N-terminale Aminogruppe selektiv geschützt ist, Herstellen eines Polypeptids dessen C-terminale Carboxylgruppe selektiv geschützt ist, und Kondensieren dieser zwei Polypeptide in einem Lösungsmittelgemisch wie vorstehend beschrieben. Einzelheiten von dieser Kondensationsreaktion sind die gleichen wie vorstehend beschrieben. Nach Reinigung des so erhaltenen geschützten Polypeptids durch Kondensation werden alle Schutzgruppen durch das vorstehend beschriebene Verfahren entfernt, wodurch das eine rohe Polypeptid von Interesse bereitgestellt wird. Dieses rohe Polypeptid wird durch verschiedene bekannte Reinigungstechniken gereinigt und lyophilisiert, um das gewünschte Polypeptid oder Teilpeptid in einer Amidform bereitzustellen.
Das Verfahren zum Gewinnen von Estern des erfindungsgemäßen Polypeptids, ist z.B. Kondensieren der α-Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure mit einem gewünschten Alkohol, um den entsprechenden Aminosäureester herzustellen, und Unterziehen dieses Esters den gleichen wie bei der Herstellung von Amiden beschriebenen Verfahren, um dabei das gewünschte Polypeptid in einer Esterform bereitzustellen.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann durch bekannte Verfahren zur Peptidsynthese hergestellt werden. Das Verfahren zur Peptidsynthese kann Festphasensynthese oder Flüssigphasensynthese sein. Kurz gefasst, kann ein Peptid von Interesse durch Kondensieren eines Teilpeptids oder Aminosäuren, die das Teilpeptid der Erfindung mit dem restlichen Teil davon ausmachen können, und, wenn das Produkt Schutzgruppen aufweist, unter Entfernen der Schutzgruppen hergestellt wer den. Beispiele für Kondensationsverfahren und Verfahren zur Entfernung von Schutzgruppen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, schließen jene, die in den nachstehenden Literaturstellen (i) bis (v) beschrieben werden, ein.

(i) M. Bodanszky & M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York, 1966
(ii) Schroeder & Luebke, The Peptide, Academic Press, New York, 1965
(iii) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Maruzen, 1975
(iv) Haruaki Yajima und Shumpei Sakakibara, Biochemical Experiment Series 1, Polypeptide Chemistry IV, 205, 1977, und
(v) Haruaki Yajima (Hrsg.), Development of Drugs (Continued), Band 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten

Nach der Reaktion kann das erfindungsgemäße Polypeptid durch eine Kombination von üblichen Reinigungstechniken, wie Lösungsmittelextraktion, Destillation, Säulenchromatographie, Flüssigchromatographie und Umkristallisation, isoliert und gereinigt werden. Wenn das so erhaltene Polypeptid ein freies Polypeptid ist, kann es zu einem geeigneten Salz durch bekannte Verfahren oder darauf basierende Verfahren umgewandelt werden. Im Gegensatz dazu kann es, wenn das Polypeptid in einer Salzform erhalten wird, zu einem freien Polypeptid oder weiteren Salz durch bekannte Verfahren oder darauf basierende Verfahren umgewandelt werden.
Das das erfindungsgemäße Polypeptid kodierende Polynukleotid (hierin anschließend wird solches Polynukleotid manchmal als das „erfindungsgemäße Polynukleotid" insgesamt bezeichnet) kann jedes Polynukleotid sein, solange es eine Nukleotidsequenz umfasst, die das vorstehend beschriebene Polypeptid oder Teilpeptid der Erfindung (DNA oder RNA, vorzugsweise DNA) codiert. Das Polynukleotid ist eine DNA oder RNA (wie mRNA), die das erfindungsgemäße Rezeptorprotein codiert, und kann doppelsträngig oder einsträngig sein. Wenn das Polynukleotid doppelsträngig ist, kann es eine doppel strängige DNA, eine doppelsträngige RNA oder ein DNA: RNA-Hybrid sein. Wenn das Polynukleotid einsträngig ist, kann es ein Sense-Strang (d.h. codierender Strang) oder ein Antisense-Strang (d.h. nicht codierender Strang) sein.
Die erfindungsgemäße, das Polypeptid codierende DNA kann genomische DNA, cDNA, abgeleitet von den vorstehend erwähnten Zellen oder Geweben, oder synthetische DNA sein. Für Library-Aufbau verwendete Vektoren können beliebige Vektoren, wie Bacteriophage, Plasmid, Cosmid, Phagemid usw., sein. Alternativ können insgesamt RNA- oder mRNA-Fraktion aus den vorstehend erwähnten Zellen oder Geweben hergestellt werden, gefolgt von direkter Verstärkung bzw. -Amplifikation durch Reverstranskriptase-Polymerasekettenreaktion (nachstehend als „RT-PCR" abgekürzt).
Bezüglich der das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden DNA kann die DNA jede DNA sein, solange sie ein Polypeptid mit einer Aktivität (Beschaffenheit) von im Wesentlichen der gleichen Qualität wie jener des erfindungsgemäßen Polypeptids aufweist [z.B. Zelltodinhibitoreffekt (Inhibitoreffekt auf Zelltod verbunden mit Krankheiten), Zellüberlebenshalteeffekt, prophylaktische und/oder therapeutische Aktivität (Effekt) auf neurodegenerative Krankheiten, Krebs, immunologische Krankheiten, Infektionen, Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheiten] und noch ein Polypeptid mit einer Beschaffenheit von im Wesentlichen der gleichen Qualität wie jene, die das erfindungsgemäße Polypeptid codiert. Spezielle Beispiele für das Polynukleotid, das das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, schließen ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt, DNA, umfassend eine DNA mit einer wie in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Nukleotidsequenz.
DNA, die wie in SEQ ID Nr. 3 gezeigte Nukleotidsequenz unter sehr strengen Bedingungen hybridisieren können, können auch als die DNA aufgezählt werden, die das erfindungsgemäße Polypeptid codiert. Zum Beispiel können DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz mit etwa 80 % oder mehr, vor zugsweise etwa 85 o oder mehr, noch bevorzugter etwa 90 % oder mehr Homologie zu der wie in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Nukleotidsequenz verwendet werden.
Die Hybridisierung kann gemäß bekannten Verfahren oder darauf basierenden Verfahren, z.B. jenen beschrieben in „Molecular Cloning", 2. Ausgabe (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989), beschriebenen Verfahren ausgeführt werden. Wenn kommerzielle Libraries verwendet werden, kann Hybridisierung gemäß den Verfahren, beschrieben in den beigefügten Anweisungen, ausgeführt werden; bevorzugter wird Hybridisierung unter sehr strengen Bedingungen ausgeführt.
„Sehr strenge Bedingungen" beziehen sich z.B. auf Bedingungen, wo die Natriumkonzentration etwa 19 bis 40 mM, vorzugsweise etwa 19 bis 20 mM, ist und die Temperatur etwa 50-70°C, vorzugsweise etwa 60 bis 65°C, ist.
Als eine DNA, die ein Polypeptid mit einer Aminosäure wie in SEQ ID Nr. 4 gezeigten Aminosäuersequenz codiert, kann eine DNA mit einer wie z.B. in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Nukleotidsequenz verwendet werden.
Das Klonierungsverfahren einer DNA, die die volle Länge des erfindungsgemäßen Polypeptids codiert, kann entweder durch PCR-Verstärkung bzw. -Amplifikation von genomischer DNA oder cDNA unter Anwendung synthetischer DNA-Primer, jeweils mit einer Teilnukleotidsequenz von dem erfindungsgemäßen Polypeptid, oder durch ein Verfahren, worin ein DNA-Fragment ausgewählt ist durch Hybridisierung von DNA, die in einen geeigneten Vektor (d.h. Library) inseriert wurde, zu einer DNA-Sonde, markiert mit einem Radioisotop oder Enzym, wobei die DNA-Sonde ein DNA-Fragment oder eine synthetische DNA, die einen Teil oder vollständige Länge des erfindungsgemäßen Polypeptids codiert, erfolgen. Die Hybridisierung kann z.B. gemäß dem Verfahren, beschrieben in „Molecular Cloning", 2. Ausgabe (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989), ausgeführt werden. Wenn kommerzielle Libraries verwendet werden, kann die Hybridisierung gemäß den beigefügten Anweisungen ausgeführt werden.
Substitution der Nukleotidsequenz von einer DNA kann durch bekannte Verfahren, wie ODA-LA PCR, das Spaltduplexverfahren, das Kunkel-Verfahren und dergleichen, unter Verwendung von PCR, bekannten Kits, wie MutanTM-Super Express Km (Takara), Mutan^TM-K (Takara) usw., ausgeführt werden.
Die für das erfindungsgemäße geklonte Polypeptid codierende DNA kann wie sie ist oder nach Verdau mit Restriktionsenzymen oder Zusatz von Linkern in Abhängigkeit von den Zwecken verwendet werden. Die DNA kann ATG bei ihrem 5'-Ende als ein Translationsstartcodon und TAA, TGA oder TAG an seinem 3'-Ende als ein Translationsterminationscodon aufweisen. Die Translationsstart- und -terminationscodone können auch durch Anwendung geeigneter synthetischer DNA-Adapter addiert werden.
Expressionsvektoren für das erfindungsgemäße Polypeptid können z.B. hergestellt werden durch (a) Schneiden des gewünschten DNA-Fragments aus einer für das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden DNA und (b) Ligieren des DNA-Fragments an einen geeigneten Expressionsvektor stromabwärts von dessen Promotor.
Beispiele für in der Erfindung verwendbare Vektoren schließen Plasmide, abgeleitet von Escherichia coli (z.B. pBR322, pBR325, pUC12 und pUC13); Plasmide, abgeleitet von Bacillus subtilis (z.B. pUB10, pTP5 und pC194); Plasmide, abgeleitet von Hefe (z.B. pSH119 und pSH115); Bacteriophagen, wie λ-Phage; Tierviren, wie Retrovirus, Vaccinia-Virus, Baculovirus, und andere Vektoren, wie pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo usw., ein.
Ein beliebiger Promotor kann in der Erfindung verwendet werden, solange er für den Wirt geeignet ist, der zum Exprimieren eines Gens von Interesse verwendet wird. Wenn der Wirt eine tierische Zelle ist, schließen Beispiele für in der Erfindung verwendbare Promotoren SRα-Promotor, SV40-Promotor, LTR-Promotor, CMV-Promotor, HSV-TK-Promotor und β-Actin-Promotor ein.
Unter diesen Promotoren wird vorzugsweise ein CMV (Cytomegalovirus)-Promotor, SRα-Promotor und dergleichen verwendet. Wenn der Wirt ein Escherichia-Bakterium ist, wird vorzugsweise ein trp-Promotor, lac-Promotor, recA-Promotor, λP_L-Promotor, lpp-Promotor, T7-Promotor oder dergleichen verwendet. Wenn der Wirt ein Bazillusbakterium ist, wird vorzugsweise ein SPO1-Promotor, SPO2-Promotor, penP-Promotor oder dergleichen verwendet. Wenn der Wirt eine Hefe ist, wird vorzugsweise ein PHO5-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor, ADH-Promotor oder dergleichen verwendet. Wenn der Wirt eine Insektenzelle ist, wird vorzugsweise ein Polyhedrinpromotor, P10-Promotor oder dergleichen verwendet.
Die Expressionsvektoren können, falls erwünscht, weiterhin Verstärker, Spleißsignale, Polyadenylierungssignale, Selektivmarker, SV40-Replikationsursprung (hierin nachstehend manchmal als „SV40 ori" abgekürzt) und dergleichen umfassen. Beispiele für in der Erfindung verwendbare Selektivmarker schließen Dihydrofolatreduktase (nachstehend manchmal als „dhfr" abgekürzt)-Gen [Methotorexat(MTX)-Resistenz], Ampicillin-Resistenzgen (hierin nachstehend manchmal als „Amp^r" abgekürt), Neomycin-Resistenzgen [hierin nachstehend manchmal als „Neo^r" abgekürzt: Geneticin-Resistenz] und dergleichen ein. Wenn dhfr-Gen-Mangel-Chinesische Hamsterzellen in Kombination mit dhfr-Gen als einem selektiven Marker verwendet werden, können rekombinante Zellen auch in einem Thymidinfreien Medium ausgewählt werden.
Weiterhin kann eine Signalsequenz, die für den Wirt geeignet ist, falls erforderlich, zu dem N-Terminus von dem erfindungsgemäßem Polypeptid gegeben werden. Wenn der Wirt ein Escherichia-Bakterium ist, können als die verwendbaren Signalsequenzen PhoA-Signalsequenz, OmpA-Signalsequenz oder dergleichen zugesetzt werden. Wenn der Wirt ein Bazillus-Bakterium ist, kann α-Amylasesignalsequenz, Subtilisin-Signalsequenz oder dergleichen zugesetzt werden. Wenn der Wirt Hefe ist, kann MFα-Signalsequenz, SUC2-Signalsequenz oder dergleichen zugegeben werden. Wenn der Wirt eine tierische Zelle ist, kann Insulinsignalsequenz, α-Interferonsignalsequenz, Antikörpermolekülsignalsequenz oder dergleichen verwendet werden.
Unter Verwendung des so aufgebauten Vektors, umfassend eine das erfindungsgemäße Polypeptid oder das Teilpeptid codierende DNA, können Transformanten hergestellt werden.
Beispiele von für diesen Zweck verwendbaren Wirten schließen Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, Bakterien, die zu der Gattung Bazillus gehören, Hefen, Insektenzellen, Insekten und tierische Zellen ein.
Spezielle Beispiele für Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, die in der Erfindung verwendbar sind, schließen E. coli K12 DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, Band 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, Band 120, 517 (1978)]), HB101 [Journal of Molecular Biology, Band 41, 459 (1969)] und C600 [Genetics, Band 39, 440 (1954)] ein.
Spezielle Beispiele von Bakterien, die zu der Gattung Bazillus gehören, welche in der Erfindung verwendbar sind, schließen B. subtilis MI114 [Gene, Band 24, 255 (1983)] und 207-21 [Journal of Biochemistry, Band 95, 87 (1984)] ein.
Spezielle Beispiele von in der Erfindung verwendbaren Hefen schließen Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R , NA87-11A, DKD-5D und 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913 und NCYC2036 und Pichia pastoris KM71 ein.
Spezielle Beispiele für in der Erfindung verwendbare Insektenzellen schließen ein, wenn der verwendete Virus AcNPV ist, eine Zelllinie, abgeleitet von Larven von Spodoptera frugiperda (Sf-Zellen), MG1-Zellen, abgeleitet von dem Mitteldarm von Trichoplusia ni, High Five^TM-Zellen abgeleitet von Eiern von Trichoplusia ni, von Mamestra brassicaeabgeleitete Zellen und Estigmena acrea-abgeleitete Zellen. Wenn der verwendete Virus BmNPV ist, können Insektenzellen, wie von Seidenwurm abgeleitete Zelllinie (Bombyx-mori-N-Zellen; BmN-Zellen), verwendet werden. Spezielle Beispiele für Sf-Zellen, die in der Erfindung verwendbar sind, schließen Sf9-Zellen (ATCC CRL 1711) und Sf21-Zellen [beide offenbart in Vaughn J. L. et al., In Vivo, 13, 213-217 (1977)] ein.
Spezielle Beispiele für in der Erfindung verwendbare Insekten schließen Larven von Seidenwurm (Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)) ein.
Spezielle Beispiele von in der Erfindung verwendbaren tierischen Zellen schließen affenartige Zellen COS-7, Vero-Zellen, Chinesische-Hamster-Zelle CHO (hierin nachstehend als „CHO-Zellen" abgekürzt), sdhfr-Genmangel-Chinesische-Hamster-Zelle CHO (hierin nachstehend als „CHO(dh)-Zellen" abgekürzt), Maus-L-Zellen, Maus-AtT-20-Zellen, Maus-Myeloma-Zellen, Ratten-GH3-Zellen und Human-FL-Zellen ein.
Die Transformation von Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, kann gemäß Verfahren, offenbart z.B. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 69, 2110 (1972) und Gene, Band 17, 107 (1982), ausgeführt werden.
Die Transformation von Bakterien, die zu der Gattung Bazillus gehören, kann gemäß Verfahren, offenbart z.B. in Molecular & General Genetics, Band 168, 111 (1979), ausgeführt werden.
Die Transformation von Hefen kann gemäß Verfahren, offenbart z.B. in Methods in Enzymology, 194, 182-187(1991) und Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 75, 1929 (1978), ausgeführt werden.
Die Transformation von Insektenzellen oder Insekten kann gemäß Verfahren, offenbart z.B. in Bio/Technology, 6, 47-55 (1988), ausgeführt werden.
Die Transformation von tierischen Zellen kann durch Verfahren, offenbart z.B. in Cell Engineering, separater Band 8, New Cell Engineering Experiment Protocol, 263-267 (1995) (Shujunsha Co.) und Virology, Band 52, 456 (1973), ausgeführt werden.
Somit können mit dem Expressionsvektor, umfassend eine DNA, die das Polypeptid codiert, transformierte Transformanten erhalten werden.
Als ein Medium zum Züchten von aus Escherichia- oder Bazillusbakterien als Wirten erhaltenen Kulturtransformanten ist ein flüssiges Medium geeignet. Das Medium kann Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Mineralien usw. enthalten, die für das Wachstum der Transformanten notwendig sind. Als Kohlenstoffquellen können Glukose, Dextrin, lösliche Stärke, Saccharose oder dergleichen aufgezählt werden. Als Stickstoffquellen können organische oder anorganische Substanzen, wie Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Bohnenkuchen, Kartoffelextrakt oder dergleichen aufgezählt werden. Als Mineralien können Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat, Magnesiumchlorid oder dergleichen aufgezählt werden. Weiterhin können Hefe, Vitamine, wachstumsfördernde Faktoren usw. zu dem Medium ebenfalls gegeben werden. Vorzugsweise ist der pH-Wert des Mediums etwa 5 bis 8.
Als ein Medium zum Züchten von Escherichia-Bakterien ist M9-Medium, enthaltend Glukose und Casaminosäre [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1972)] z.B. bevorzugt.
Falls erforderlich, können Arzneimittel, wie 3β-Indolylacrylsäure zu dem Medium gegeben werden, um die Wirksamkeit des Promotors zu verbessern.
Wenn der Wirt ein Escherichia-Bakterium ist, wird die Transformante gewöhnlich bei etwa 15 bis 43°C für etwa 3 bis 24 Stunden gezüchtet. Falls erforderlich, kann Belüftung und Rühren angewendet werden.
Wenn der Wirt ein Bazillusbakterium ist, wird die Transformante gewöhnlich bei etwa 30 bis 40°C für etwa 6 bis 24 Stunden gezüchtet. Falls erforderlich, kann auch Belüftung und Rühren angewendet werden.
Als ein Medium zum Züchten von Transformanten, die aus Hefen als Wirt erhalten wurden, kann ein Medium, wie Burkholder-Minimum-Medium [Bostian, K. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Band 77, 4505 (1980)] oder SD-Medium, enthaltend 0,5 % Casaminosäure [Bitter, G.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 81, 5330 (1984)], z.B. verwendet werden. Es ist bevorzugt, dass der pH-Wert des Mediums auf etwa 5 bis 8 eingestellt wird. Die Transformante wird gewöhnlich bei etwa 20 bis 35°C für etwa 24 bis 72 Stunden gezüchtet. Falls erforderlich, kann Belüftung und Rühren angewendet werden.
Als ein Medium zum Züchten von Transformanten, die aus Insektenzellen oder Insekten als Wirten erhalten werden, kann z.B. Graces Insektenmedium [Grace, T.C.C., Nature, 195, 788 (1962)], ergänzt mit Zusätzen, wie aktiviertem 10 %igem Rinderserum, verwendet werden. Es ist bevorzugt, dass der pH-Wert des Mediums auf etwa 6,2 bis 6,4 eingestellt wird. Die Transformante wird gewöhnlich bei etwa 27°C für etwa 3 bis 5 Tage gezüchtet. Falls erforderlich, können Belüftung und Rühren angewendet werden.
Als ein Medium zum Züchten der aus tierischen Zellen als Wirten erhaltenen Transformanten schließen Beispiele für verwendbare Medien MEM-Medium [Science, Band 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, Band 8, 396 (1959)], RPMI-1640-Medium [Journal of the American Medical Association, Band 199, 519 (1967)] und 199-Medium [Proceedings of the Society of the Biological Medicine, Band 73, 1 (1950)], jeweils enthaltend etwa 5 bis 20 % fötales Kalbserum, ein. Vorzugsweise ist der pH-Wert des Mediums etwa 6 bis etwa 8. Die Transformante wird gewöhnlich bei etwa 30 bis 40°C für etwa 15 bis 60 Stunden gezüchtet. Falls erforderlich, kann Belüftung und Rühren angewendet werden.
Somit ist es möglich, der Transformanten zu erlauben, das erfindungsgemäße Polypeptid in Zellen oder Zellmembranen oder vorzugsweise außerhalb von Zellen herzustellen.
Die Abtrennung und Reinigung des erfindungsgemäßen Polypeptids aus der erhaltenen Kultur kann z.B. gemäß den nachstehend beschriebenen Verfahren ausgeführt werden.
Zur Extraktion des erfindungsgemäßen Polypeptids aus gezüchteten Mikroorganismen oder Zellen werden die Mikroorganismuszellen durch bekannte Verfahren nach der Züchtung geerntet, in einem geeigneten Puffer suspendiert und durch Beschallung oder durch Lysozym und Gefrieren und Auftauen usw. aufgebrochen. Dann wird ein roher Extrakt aus dem Polypeptid durch Zentrifugierung oder Filtration erhalten. Der Puffer kann ein Protein denaturierendes Mittel, wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, oder ein Tensid, wie Triton X-100^TM, enthalten. Wenn das Polypeptid in die Kulturbrühe ausgeschieden ist, wird der Überstand von dem Mikroorganismus oder Zellen nach Beendigung der Züchtung abgetrennt und durch bekannte Verfahren gesammelt.
Die Reinigung des erfindungsgemäßen Polypeptids, das in dem erhaltenen Kulturüberstand oder Extrakt enthalten ist, kann durch eine geeignete Kombination von bekannten Verfahren zur Abtrennung und Reinigung ausgeführt werden. Diese bekannten Verfahren schließen Verfahren unter Verwendung von Löslichkeit (wie Aussalzen oder Sedimentation mit Lösungsmitteln), Verfahren hauptsächlich unter Anwendung des Unterschiedes im Molekulargewicht (wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese), Verfahren unter Verwendung des Unterschiedes in der elektrischen Ladung (wie Ionenaustauschchromatographie), Verfahren unter Anwendung von spezifischer Affinität (wie Affinitätschromatographie), Verfahren unter Anwendung des Unterschiedes in der Hydrophobizität (wie Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie), Verfahren unter Verwendung des Unterschieds im isoelektrischen Punkt (wie isoelektrische Elektrophorese) ein.
Wenn das so erhaltene erfindungsgemäße Polypeptid eine freie Form ist, kann es in das vorstehend beschriebene Salz durch bekannte Verfahren oder darauf basierende Verfahren umgewandelt werden. Wenn im Gegensatz dazu das Protein von Interesse in einer Salzform erhalten wird, kann das Sal_z in die freie Form oder gemäß bekannten Verfahren oder darauf basierenden Verfahren in ein anderes Salz umgewandelt werden.
Das durch die Transformante hergestellte Polypeptid kann willkürlich modifiziert sein oder ein Teil davon kann daraus unter Anwendung eines geeigneten Proteinmodifizierungsenzyms vor oder nach der Reinigung daraus entfernt werden. Beispiele für solche Enzyme schließen Trypsin, Chymotrypsin, Arginylendopeptidase, Proteinkinase und Glycosidase ein.
Das Vorliegen des so hergestellten erfindungsgemäßen Polypeptids kann durch Enzymimmunoassays, Western-Blot-Analyse usw. unter Verwendung spezifischer Antikörper gemessen werden.
Alternativ kann das Vorliegen des erfindungsgemäßen Polypeptids durch Kondensieren beliebiger Fremdpeptidsequenz (z.B. FLAG, HIS-Tag, myc-Tag, HA-Tag oder HSV-Tag), die ein Epitop (Antikörpererkennungsstelle) für den N-Terminus, C-Terminus oder eine andere Stelle des Polypeptids sein können, wie früher beschrieben, und dann Nachweisen von Chemolumineszenz oder dergleichen unter Anwendung eines Antikörpers, der die vorstehende Peptidsequenz erkennt, gemessen werden.
Antikörper für das erfindungsgemäße Polypeptid (hierin nachstehend manchmal als der „erfindungsgemäße Antikörper" bezeichnet) können entweder polyklonale Antikörper (hierin nachstehend manchmal als der „erfindungsgemäße polyklonale Antikörper" bezeichnet) oder monoklonale Antikörper (hierin nachstehend manchmal als der „erfindungsgemäße monoklonale Antikörper" bezeichnet) sein, solange sie das erfindungsgemäße Polypeptid erkennen können.
Der Antikörper des erfindungsgemäßen Polypeptids kann unter Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids als Antigen und gemäß bekannten Verfahren für die Antikörper- oder Antiserumherstellung hergestellt werden.
[Herstellung von monoklonalen Antikörpern]
(a) Herstellung von monoklonalen Antikörper erzeugenden Zellen
Das erfindungsgemäße Polypeptid wird an Warmblüter entweder einzeln oder zusammen mit einem Träger oder Verdünnungsmittel an eine zur Herstellung von Antikörpern nach Verabreichung fähigen Stelle verabreicht. Um die Fähigkeit zur Herstellung von Antikörpern zu verstärken, kann vollständiges Freund'sches Adjuvans oder ebenfalls unvollständiges Freund'sches Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung wird gewöhnlich einmal alle zwei bis sechs Wochen und zwei- bis zehnmal insgesamt ausgeführt. Beispiele für in der Erfindung verwendbare Warmblüter schließen Affe, Kaninchen, Hund, Meerschweinchen, Maus, Ratte, Schaf, Ziege und Huhn ein. Unter ihnen wird Maus oder Ratte vorzugsweise verwendet.
Bei der Herstellung von monoklonalen Antikörper erzeugenden Zellen sind Individuen mit nachweisbaren Antikörpertitern aus Warmblütern (z.B. Mäuse), immunisiert mit Antigen ausgewählt. Dann werden die Milz- oder Lymphknoten aus ihnen zwei bis fünf Tage nach Endimmunisierung gesammelt und Antikörper erzeugende Zellen, die darin enthalten sind, werden mit Myelomazellen von einem homologen oder heterologen Lebewesen verbunden zur Gewinnung von monoklonalen Antikörper erzeugenden Hybridoma. Die Messung von Antikörpertitern in Antiseren kann z.B. durch Umsetzen eines markierten Polypeptids (das später beschrieben wird) mit dem Antiserum, gefolgt von Messen der Aktivität des Markierungsmittels, das an den Antikörper gebunden ist, ausgeführt werden. Die Zellfusion kann durch ein bekanntes Verfahren, z.B. das Verfahren von Koehler und Milstein (Nature, 256, 495, (1975)) ausgeführt werden. Beispiele für verwendbare Fusionspromotoren schließen Polyethylenglykol (PEG), Sendai-Virus usw. ein. Vorzugsweise wird PEG verwendet.
Beispiele für in der Erfindung verwendbare Myelomazellen schließen Myelomazellen von Warmblütern, wie NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 usw., ein. Vorzugsweise wird P3U1 verwen det. Ein bevorzugtes Verhältnis der Anzahl von verwendeten Antikörper erzeugenden Zellen (Milzzellen) zu der Anzahl an Myelomazellen ist etwa 1 : 1 bis etwa 20 : 1. Wenn PEG (vorzugsweise PEG 1000 bis PEG 6000) bei einer Konzentration von etwa 10 bis 80 % zugegeben wird, wird das erhaltene Zellgemisch bei 20 bis 40°C (vorzugsweise bei 30 bis 37°C) für etwa 1 bis 10 Minuten inkubiert, wobei effiziente Zellfusion erreicht werden kann.
Verschiedene Verfahren können zum Absuchen von monoklonalen Antikörper erzeugenden Hybridoma verwendet werden. Zum Beispiel wird ein Hybridom-Kulturüberstand zu einer festen Phase (z.B. Mikroplatte) gegeben, auf die das Polypeptidantigen entweder direkt oder mit einem Träger absorbiert wurde. Dann wird ein radioaktiv oder enzymatisch markierter Antiimmunoglobulinantikörper (Antimausimmunoglobulinantikörper wird verwendet, wenn Mauszellen bei der Zellfusion verwendet werden) und Protein A dazugegeben, um die monoklonalen Antikörper, die an die feste Phase gebunden sind, nachzuweisen. Alternativ kann ein Verfahren verwendet werden, worin Hybridom-Kulturüberstand zu einer festen Phase gegeben wird, auf der ein Antiimmunoglobulinantikörper oder Protein A adsorbiert wurde; dann wird ein radioaktiv oder enzymatisch markiertes Polypeptid dazugegeben, um dadurch monoklonale Antikörper, die an die feste Phase gebunden sind, nachzuweisen.
Die Selektion von monoklonalen Antikörpern kann durch bekannte Verfahren oder auf ihnen basierenden Verfahren ausgeführt werden. Gewöhnlich kann die Selektion in einem Medium zum Züchten von Tierzellen, ergänzt mit HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin), ausgeführt werden. Als ein Medium zur Selektion und Züchtung kann jedes Medium verwendet werden, solange Hybridoma darin wachsen können. Beispiele für verwendbare Medien schließen RPMI-1640-Medium, enthaltend 1 bis 20 % (vorzugsweise etwa 10 bis 20 %) fötales Kalbserum, GIT-Medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), enthaltend etwa 1 bis 20 % fötales Kalbserum, und ein serumfreies Medium für Hybridomzüchtung (SFM-101; Nissui Pharmaceutical Co.) ein. Die Züchtungstemperatur ist gewöhnlich etwa 20 bis 40°C, vorzugsweise etwa 37°C. Der Züchtungszeitraum ist gewöhnlich 5 Tage bis 3 Wochen, vorzugsweise 1 bis 2 Wochen. Die Züchtung kann gewöhnlich unter 5 % Kohlendioxid ausgeführt werden. Der Antikörpertiter von Hybridom-Kulturüberstand kann in der gleichen Weise wie die vorstehend erwähnte Messung der Antikörpertiter in Antiseren gemessen werden.
(b) Reinigung der monoklonalen Antikörper
Die Abtrennung und Reinigung der monoklonalen Antikörper kann durch übliche Verfahren, wie Verfahren zum Abtrennen/Reinigen von Immunoglobulin [z.B. Aussalzen, Alkoholausfällung, isoelektrische Ausfällung, Elektrophorese, Adsorption/Desorption unter Verwendung von Ionenaustauschern (z.B. DEAE), Ultrazentrifugation, Gelfiltration, spezifische Reinigungsverfahren, worin nur ein Antikörper mithilfe von einer Antigen bindenden festen Phase oder aktivem Adsorptionsmittel, wie Protein A oder Protein G, gesammelt wird, gefolgt von Auftrennung der Bindung], ausgeführt werden.
[Herstellung von polyklonalen Antikörpern]
Die erfindungsgemäßen polyklonalen Antikörper können durch bekannte Verfahren oder auf ihnen basierende Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel wird ein Immunogen (Antigenpolypeptid) an sich oder ein Komplex von Immunogen und einem Trägerprotein hergestellt. Dann werden unter Verwendung des Immunogens oder des Komplexes Warmblüter in der gleichen Weise, wie zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern beschrieben, immunisiert. Die den Antikörper gegen das erfindungsgemäße Polypeptid enthaltende Fraktionen werden von den immunisierten Lebewesen geerntet, gefolgt von Abtrennung und Reinigung des Antikörpers.
Bezüglich des Immunogenträgerproteinkonjugats zur Verwendung bei der Immunosierung von Warmblütern sind die Art des Trägerproteins und das Mischverhältnis von dem Träger und dem Hapten nicht besonders begrenzt, solange wie Antikörper effizient gegen das Hapten, vernetzt an den Träger, hergestellt werden. Zum Beispiel wird Rinderserumalbumin, Rinderthyroglobulin, Hämocyanin oder dergleichen an das Hapten bei einem Gewichtsverhältnis von etwa 0,1 bis 20 : 1, vorzugsweise etwa 1 bis 5 : 1, gekuppelt.
Eine Vielzahl von Kondensationsmitteln kann für das Kuppeln zwischen dem Hapten und dem Träger verwendet werden. Zum Beispiel können Glutaraldehyd, Carbodiimid, Maleimid oder aktive Esterreagenzien, die eine Thiol- oder Dithiopyridylgruppe enthalten, verwendet werden.
Das Kondensationsprodukt wird an einen Warmblüter entweder einzeln oder zusammen mit einem Träger- oder Verdünnungsmittel an einer zur Herstellung von Antikörpern nach der Verabreichung geeigneten Stelle verabreicht. Um die Antikörperherstellungsfähigkeit zu verstärken, kann vollständiges Freund'sches Adjuvans oder unvollständiges Freund'sches Adjuvans ebenfalls zugesetzt werden. Die Verabreichung wird im Allgemeinen einmal etwa alle 2 bis 6 Wochen und etwa 3- bis 10-fach insgesamt ausgeführt.
Polyklonale Antikörper können aus dem Blut, abdominalem Ödem oder anderer Körperflüssigkeit, vorzugsweise dem Blut, von dem wie vorstehend beschrieben immobilisierten Warmblüter gewonnen werden.
Polyklonale Antikörpertiter in Antiseren können in der gleichen Weise wie vorstehend für die Bestimmung von monoklonalen Antikörpertitern in Antiseren bestimmt werden. Die Abtrennung und Reinigung von polyklonalen Antikörpern kann durch die gleichen Verfahren zur Abtrennung und Reinigung bei Immunoglobulin wie jene, beschrieben für die Abtrennung und Reinigung von monoklonalen Antikörpern, ausgeführt werden.
Bezüglich des Antisensepolynukleotids mit einer Nukleotidsequenz komplementär zu oder im Wesentlichen komplementär zu dem Polynukleotid der Erfindung kann jedes Antisensepolynukleotid verwendet werden, solange es eine Nukleotidsequenz komplementär zu oder im Wesentlichen komplementär zu dem erfindungsgemäßen Polynukleotid ist und eine Wirkung auf weist, die die Expression des Polynukleotids (DNA) hemmen kann.
Eine Nukleotidsequenz, die im Wesentlichen komplementär zu dem erfindungsgemäßen Polynukleotid ist, bezieht sich auf z.B. eine Nukleotidsequenz mit etwa 70 % oder mehr, vorzugsweise etwa 80 % oder mehr, bevorzugter etwa 90 % oder mehr, besonders bevorzugt etwa 95 % oder mehr Homologie zu der Volllängen- oder Teilnukleotidsequenz der komplementären Nukleotidsequenz zu dem erfindungsgemäßen Polynukleotid (d.h. der komplementäre Strang zu der erfindungsgemäßen DNA). Besonders bevorzugt ist ein Antisensepolynukleotid mit etwa 70 % oder mehr, vorzugsweise etwa 80 % oder mehr, bevorzugter etwa 90 % oder mehr, besonders bevorzugt etwa 95 % oder mehr Homologie zu einem Teil des komplementären Strangs des erfindungsgemäßen Polynukleotids, das den N-terminalen Teil des erfindungsgemäßen Polypeptids codiert (z.B. Nukleotidsequenz, die einen Bereich benachbart zu dem Startcodon codiert). Diese Antisensepolynukleotide können mit bekannten DNA-Synthezisern synthetisiert werden.
Wenn das erfindungsgemäße Polypeptid ein Signalpeptid aufweist, wird das Peptid wirksamerweise aus Zellen sekretiert und als ein humoraler Faktor für wichtige biologische Aktivitäten für Signalleitung, Eigenwehr usw. eingesetzt.
Hierin nachstehend werden die Verwendungen des erfindungsgemäßen Polypeptids (manchmal wird dies und Salze davon kollektiv als das „erfindungsgemäße Polypeptid" bezeichnet), das für das erfindungsgemäße Polypeptid codierte Polynukleotid (das erfindungsgemäße Polynukleotid), der Antikörper für das erfindungsgemäße Polypeptid (der erfindungsgemäße Antikörper) und das erfindungsgemäße Antisensepolynukleotid beschrieben.
(1) Therapeutische und/oder prophylaktische Mittel für verschiedene Krankheiten, worin das erfindungsgemäße Polypeptid einbezogen ist
Das erfindungsgemäße Polypeptid liegt in vivo vor und hat eine zelltodhemmende Wirkung, zellüberlebensbehaltende Wirkung usw. Wenn das erfindungsgemäße Polypeptid oder das Polynukleotid (z.B. DNA) mutativ, mangelhaft oder bei einem mutativ gesenkten oder verstärkten Niveau exprimiert wird, sind verschiedene Krankheiten eingeschlossen, Krankheiten begleitet von Neurodegeneration, wie neurodegenerative Krankheiten [z.B. Alzheimer-Krankheit (familiäre Alzheimer-Krankheit, juvenile Alzheimer-Krankheit, sporadische Alzheimer-Krankheit usw.), Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntingon Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose usw.], Hirnfehlfunktionen (z.B. Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheit, epidurales Hämatom, subdurales Hämatom usw.), Krebsformen (z.B. Astrocytoma, Oligodendroglioma usw.), immunologische Krankheiten, Infektionen (z.B. Meningitis, Protozoiasis, Rickettsien-Infektionen, Metazoen-Infektionen, bakterielle oder virale Meningitis, wie Borna-Krankheit, postvaccinale Enzephalitis, AIDS-Enzephalopathie usw.), Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheitsentwicklung.
Deshalb kann das erfindungsgemäße Polypeptid oder das Polynukleotid als ein Arzneistoff von niedriger Toxizität und hoher Sicherheit, z.B. als ein Zelltodinhibitor und als ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen verschiedene Krankheiten verwendet werden, einschließlich Krankheiten begleitet von Neurodegeneration, wie neurodegenerative Krankheiten [z.B. Alzheimer-Krankheit (familiäre Alzheimer-Krankheit, juvenile Alzheimer-Krankheit, sporadische Alzheimer-Krankheit usw.), Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntingon Chorea, diabetische Neuropathie, multip le Sklerose usw.], Hirnfehlfunktionen (z.B. Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheit, epidurales Hämatom, subdurales Hämatom usw.), Krebsformen (z.B. Astrocytoma, Oligodendroglioma usw.), immunologische Krankheiten, Infektionen (z.B. Meningitis, Protozoiasis, Rickettsien-Infektionen, Metazoen-Infektionen, bakterielle oder virale Meningitis, wie Borna-Krankheit, postvaccinale Enzephalitis, AIDS-Enzephalopathie usw.), Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheitsentwicklung. Insbesondere kann das erfindungsgemäße Polypeptid oder Polynukleotid als ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel für Alzheimer-Krankheit verwendet werden.
Wenn z.B. ein Patient unter unzureichender oder mutativer Signalleitung, die sich aus Krankheit oder Mangel des erfindungsgemäßen Polypeptids in seinem/ihrem Körper ergibt, leidet, ist es möglich, ausreichend oder normale Funktion des erfindungsgemäßen Polypeptids wieder aufzubauen durch (1) Verabreichen des erfindungsgemäßen Polynukleotids an den Patienten und dadurch das erfindungsgemäße Polypeptid in dem Körper exprimieren lassen, (2) Einführen des erfindungsgemäßen Polynukleotids in Zellen, wodurch das erfindungsgemäße Polypeptid exprimieren kann und dann Transplantieren der Zellen in den Patienten oder (3) Verabreichen des erfindungsgemäßen Polypeptids an den Patienten.
Wenn das erfindungsgemäße Polynukleotid als das vorstehend erwähnte Arzneimittel verwendet wird, kann das Polynukleotid (z.B. DNA) an sich oder das in einen geeigneten Vektor, wie in Retrovirusvektor, Adenovirusvektor, Adenoverbundener Virusvektor usw. inserierte Polynukleotid an Menschen oder andere Warmblüter unter Verwendung üblicher Mittel verabreicht werden. Das erfindungsgemäße Polynukleotid kann, wie es ist, oder nach Formulierung mit physiologisch verträglichen Trägern, wie Hilfsmitteln, um ihre Aufnahme zu fördern, mithilfe von einer Genpistole oder einem Katheter, wie Hydrogelkatheter, verabreicht werden.
Wenn das erfindungsgemäße Polypeptid als das vorstehend beschriebene prophylaktische und/oder therapeutische Mittel verwendet wird, werden mindestens 90 %, vorzugsweise 95 % oder mehr, bevorzugter 98 % oder mehr, noch bevorzugter 99 % oder mehr, gereinigtes erfindungsgemäßes Polypeptid verwendet.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann z.B. oral in Form von Tabletten (zuckerbeschichtet, falls erforderlich), Kapseln, Elixieren, Mikrokapseln oder dergleichen, oder parenteral in Form von Injektionen, wie aseptische Lösungen oder Suspensionen in Wasser oder anderen pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeiten, verwendet werden. Diese Zubereitungen können z.B. durch Vermischen des erfindungsgemäßen Polypeptids mit physiologisch verträglichen Trägern, Geschmacksmitteln, Exzipienten, Trägern (Vehikeln), antiseptischen Stoffen, Stabilisatoren, Bindemitteln usw. in Einheitsdosierungsformen, die zum Herstellen von allgemein zugelassenen pharmazeutischen Zubereitungen erforderlich sind, hergestellt werden. Die Mengen an Wirkbestandteilen in diesen Formulierungen werden derart entschieden, dass eine geeignete Dosis innerhalb des ausgewiesenen Bereichs erhalten werden kann.
Beispiele für Additive, die in Tabletten, Kapseln usw. vermischt werden können, schließen Bindemittel, wie Gelatine, Maisstärke, Tragacanth und Gummi arabicum, Exzipienten, wie kristalline Zellulose, Quellmittel, wie Maisstärke, Gelatine und Alginsäure, Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Süßungsmittel, wie Saccharose, Laktose und Saccharin, Geschmacksmittel, wie Pfefferminz, Akamonoöl und Kirsche, ein. Wenn die Einheitsdosierungsform mit Kapsel ist, kann flüssiger Träger, wie Öle und Fette, zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Materialien eingeschlossen sein. Sterile Zusammensetzungen zur Injektion können gemäß der üblichen Praxis bei dem Herstellen von Pharmazeutika, beispielsweise durch Auflösen oder Suspendieren von Wirkbestandteilen, natürlich vorkommenden pflanzlichen Ölen, wie Sesamöl, Kokosnussöl usw., in Trägern, wie Wasser zur Injektion, formuliert werden.
Beispiele für wässrige Flüssigkeiten zur Injektion schließen physiologische Salzlösung und isotonische Lösungen, die Glukose und andere Hilfsmittel (z.B. D-Sorbit, D-Mannit, Natriumchlorid usw.) enthalten, ein. Sie können in Kombination mit einem geeigneten Hilfssolubilisator, wie Alkohol (z.B. Ethanol usw.), Polyalkohol (z.B. Propylenglykol, Polyethylenglykol usw.), nichtionisches Tensid (z.B. Polysorbat 80^TM, HCO-50 usw.), verwendet werden. Beispiele für ölige Flüssigkeiten zur Injektion schließen Sesamöl, Sojaöl usw. ein. Sie können in Kombination mit einem Hilfssolubilisator, wie Benzoesäurebenzylester, Benzylalkohol usw., verwendet werden. Zusätzlich können Puffer (z.B. Phosphatpuffer, Natriumacetatpuffer usw.), analgetische Mittel (z.B. Benzalkoniumchlorid, Procainhydrochlorid usw.), Stabilisatoren (z.B. Humanserumalbumin, Polyethylenglykol usw.), Konservierungsmittel (z.B. Benzylalkohol, Phenol usw.), Antioxidantien usw. auch damit angemischt werden. Gewöhnlich werden die hergestellten Injektionen in geeignete Ampullen gefüllt.
Vektoren, in die das erfindungsgemäße Polynukleotid eingeführt wurde, können auch, wie vorstehend beschrieben, formuliert und gewöhnlich parenteral verwendet werden.
Die erhaltenen Zubereitungen sind sicher und von niedriger Toxizität und sie können an Säuger (z.B. Mensch, Ratte, Maus, Meerschwein, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Katze, Hund, Affe usw.) verabreicht werden.
Die Dosisspiegel des erfindungsgemäßen Polypeptids können in Abhängigkeit von der Zielkrankheit, dem zu behandelnden Patienten, Verabreichungsweg usw. variieren. Wenn das erfindungsgemäße Polypeptid oral zum Behandeln von Alzheimer-Krankheit verabreicht wird, wird im Allgemeinen das erfindungsgemäße Polypeptid an erwachsene Patienten (60 kg Körpergewicht) bei einer Dosis von etwa 1 bis 1000 mg/Tag, vorzugsweise etwa 10 bis 500 mg/Tag, bevorzugter etwa 10 bis 200 mg/Tag, verabreicht. Bezüglich der parenteralen Verabreichung, z.B. wenn das erfindungsgemäße Polypeptid an erwachsene Patienten (60 kg Körpergewicht) in Form einer Injektion zum Behandeln einer neurodegenerativen Krankheit, wie Alzheimer-Krankheit, verabreicht wird, ist es üblich, das erfindungsgemäße Polypeptid in den befallenen Teil des Körpers bei einer Dosis von etwa 1 bis 1000 mg/Tag, vorzugsweise etwa 1 bis 200 mg/Tag und bevorzugter etwa 10 bis 100 mg/Tag einzuspritzen, obwohl die Dosis pro Verabreichung in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Patienten, der Zielkrankheit usw. variieren kann. Für andere Lebewesen können entsprechende Dosen nach Umwandlung der vorstehend erwähnten Werte pro 60 kg, basierend auf den tatsächlichen Körpergewichten, verabreicht werden.
(2) Absuchen nach infrage kommenden Verbindungen für ein Arzneimittel zum Behandeln von Krankheiten
Da das erfindungsgemäße Polypeptid in vivo vorliegt, kann eine Verbindung oder ein Salz davon, das die Funktion des erfindungsgemäßen Polypeptids fördert, als ein Arzneimittel von niedriger Toxizität und hoher Sicherheit, z.B. als ein Zelltodinhibitor und als ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel, für verschiedene Krankheiten, einschließlich Krankheiten, begleitet von Neurodegeneration, wie neurodegenerative Krankheiten [z.B. Alzheimer-Krankheit (familiäre Alzheimer-Krankheit, juvenile Alzheimer-Krankheit, sporadische Alzheimer-Krankheit usw.), Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntingon Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose usw.], Hirnfehlfunktionen (z.B. Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheit, epidurales Hämatom, subdurales Hämatom usw.), Krebsformen (z.B. Astrocytoma, Oligodendroglioma usw.), immunologische Krankheiten, Infektionen (z.B. Meningitis, Protozoiasis, Rickettsien-Infektionen, Metazoen-Infektionen, bakterielle oder virale Meningitis, wie Borna-Krankheit, postvaccinale Enzephalitis, AIDS-Enzephalopathie usw.), Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheitsentwicklung, verwendet werden. Insbesondere kann die Verbindung oder ein Salz davon als ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel für Alzheimer-Krankheit verwendet werden.
Andererseits kann eine Verbindung oder ein Salz davon, die die Wirkung des erfindungsgemäßen Polypeptids hemmen, als Arzneimittel für ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel für Krankheiten, die sich aus zu hoher Erzeugung des erfindungsgemäßen Polypeptids ergeben (z.B. Krebsarten), verwendet werden.
Somit ist das erfindungsgemäße Polypeptid als ein Mittel zum Absuchen nach Verbindungen oder Salzen davon, die die Wirkung des erfindungsgemäßen Polypeptids fördern oder hemmen, verwendbar.
Die vorliegende Erfindung stellt (1) ein Verfahren zum Absuchen von Verbindungen oder Salzen davon bereit, die die Aktivität (Funktion) des erfindungsgemäßen Polypeptids (hierin nachstehend manchmal eben als der/die „Promotor(en)" oder „Inhibitor(en)" bezeichnet) fördern oder hemmen, wobei das Verfahren durch das Anwenden des erfindungsgemäßen Polypeptids gekennzeichnet ist.
Insbesondere z.B.: (2) Ein Verfahren zum Absuchen der erfindungsgemäßen Promotoren oder Inhibitoren wird bereitgestellt, worin Zelltodinhibitoraktivitäten verglichen werden zwischen (i) wenn Zellen mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid in Kontakt kommen und (ii) wenn Zellen mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einer Testverbindung in Kontakt kommen.
Insbesondere werden in dem vorstehend beschriebenen Absuchverfahren Zellen unter Bedingungen von (i) und (ii) gezüchtet und dann die Überlebensverhältnisse gemessen.
Als die Zellen werden vorzugsweise jene Zellen, worin der Zelltod induziert werden kann, verwendet. Spezielle Beispiele für in der Erfindung verwendbare Zellen schließen ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt, rattenadrenale Medullaabgeleitete Pheochromocytoma-Zellen (z.B. PC12h-Zellen in später beschriebenen Beispielen), Ratten- oder Mausnervenabgeleitete Zelllinien, transformiert mit einem Vektor, um fassend eine DNA, die das ursächliche Gen für die familiäre Alzheimer-Krankheit codiert, und primäre Kultur von Mauscerebralen Kortexzellen. Der Tod von diesen Zellen wird durch Zusatz von Glutaminsäure, Entfernung von Serum, Zusatz von β-Amyloidprotein oder Expression von der integrierten DNA, die das ursächliche Gen der bekannten Alzheimer-Krankheit codiert, induziert.
Das Medium kann ein beliebiges Medium sein, solange es nicht die Zelltodinhibitorwirkung des erfindungsgemäßen Polypeptids hemmt. Zum Beispiel kann Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) verwendet werden.
Die Überlebensverhältnisse können durch bekannte Verfahren, z.B. ein Verfahren, worin die Lactatdehydrogenase (LDH)-Aktivität in Zellextrakt gemessen wird, MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid)-Assay; MTS (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)-Assay; Trypan-Blau-Anfärben oder Calcein-Anfärben (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6336-6341, 2001; NeuroReport 13: 903-907,2002; WO 01/21787), gemessen werden.
Die Testverbindung kann z.B. ein Peptid, Protein, nicht peptidische Verbindung, synthetische Verbindung, Fermentationsprodukt, Zellextrakt, Pflanzenextrakt oder tierischer Gewebsextrakt sein. Diese Verbindungen können entweder neue Verbindungen oder bekannte Verbindungen sein.
Zum Beispiel kann eine Testverbindung, die die Zelltodinhibitoraktivität (z.B. Überlebensverhältnis) in (ii) vorstehend um etwa 20 % oder mehr, vorzugsweise um etwa 30 % oder mehr, bevorzugter um etwa 50 % oder mehr, verglichen mit der vorstehenden Aktivität in (i), fördert, als eine Verbindung oder ein Salz davon ausgewählt werden, die die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids fördert.
Zum Beispiel kann eine Testverbindung, die die Zelltodinhibitoraktivität (z.B. Überlebensverhältnis) in vorstehend (ii) um etwa 20 % oder mehr, vorzugsweise etwa 30 % oder mehr, bevorzugter etwa 50 % oder mehr, verglichen mit der Ak tivität in vorstehend (i), hemmt, als eine Verbindung oder ein Salz davon, das die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids hemmt, ausgewählt werden.
Das erfindungsgemäße Polynukleotid ist als ein Reagenz zum Absuchen nach Verbindungen oder Salzen davon, die die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptidgens fördern oder hemmen, nützlich.
Die vorliegende Erfindung stellt (3) ein Verfahren zum Absuchen nach Verbindungen oder Salzen davon bereit, die die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptidgens (hierin nachstehend manchmal eben als der/die "Promotor(en)" oder "Inhibitor(en)" bezeichnet) fördern oder inhibieren, wobei das Verfahren durch Anwenden des erfindungsgemäßen Polypeptids gekennzeichnet ist. Insbesondere zum Beispiel:
(4) Ein Verfahren zum Absuchen nach Promotoren oder Inhibitoren wird bereitgestellt, wobei die zwei Fälle (iii) eine das erfindungsgemäße Polypeptid herzustellen fähigen Zelle wird gezüchtet, und (iv) ein Gemisch der das erfindungsgemäße Polypeptid herzustellenden fähigen Zelle und einer Testverbindung wird gezüchtet, verglichen werden.
In dem vorstehend beschriebenen Absuchverfahren werden z.B. der Expressionsgrad des erfindungsgemäßen Polypeptidgens (z.B. Enzymaktivitäten von Alkaliphosphatase, Luciferase usw., die stromabwärts des Promotors für das erfindungsgemäße Polypeptidgen inseriert werden, oder mRNA-Spiegel, die das erfindungsgemäße Polypeptid codieren) gemessen und verglichen.
Spezielle Beispiele für zum Herstellen des erfindungsgemäßen Polypeptids fähigen Zellen schließen ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt, Wirte (Transformanten) transformiert mit einem Vektor, umfassend eine DNA, die das erfindungsgemäße Polypeptid codiert. Als der Wirt können vorzugsweise Tierzellen, wie CHO-Zellen, verwendet werden. Zum Absuchen werden vorzugsweise jene Transformanten verwendet, die das erfindungsgemäße Polypeptid innerhalb Zellen oder des Kulturüberstands, wenn wie vorstehend beschrieben gezüchtet, erzeugen. Bevorzugter werden diese Transformanten verwendet, worin ein Gen, das sekretorische Alkaliphosphatase, Luciferase oder dergleichen codiert, stromabwärts von dem Promotor für das erfindungsgemäße Polypeptidgen inseriert wird.
Die Testverbindung kann z.B. ein Peptid, Protein, eine nicht peptidische Verbindung, synthetische Verbindung, Fermentationsprodukt, Zellextrakt, Pflanzenextrakt oder Lebewesengewebsextrakt sein. Diese Verbindungen können entweder neue Verbindungen oder bekannte Verbindungen sein.
Um das vorstehend beschriebene Absuchverfahren auszuführen, werden Zellen, die das erfindungsgemäße Polypeptid herstellen können, durch Züchten in einem zum Absuchen geeigneten Medium hergestellt.
Das Medium kann ein beliebiges Medium sein, solange es die Zelltodinhibitorwirkung des erfindungsgemäßen Polypeptids nicht hemmt. Zum Beispiel kann DMEM verwendet werden.
Der Expressionsgrad des erfindungsgemäßen Polypeptids kann durch Messen der Enzymaktivität von Alkaliphosphatase, Luciferase oder dergleichen stromabwärts des Promotors für das erfindungsgemäße Polypeptidgen durch übliche Verfahren bestimmt werden.
Alternativ kann der Expressionsgrad des erfindungsgemäßen Polypeptidgens auch durch bekannte Verfahren, wie Northern Blotting, Reverstranskriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), Echtzeit-PCR-Analysesystem (ABI; TagMan-Polymerasekettenreaktion), oder darauf basierende Verfahren gemessen werden.
Zum Beispiel kann eine Testverbindung, die die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptidgens in (iv) vorstehend um etwa 20 % oder mehr, vorzugsweise um etwa 30 % oder mehr, bevorzugter um etwa 50 % oder mehr, verglichen mit der Expression in (iii), fördert, als eine Verbindung oder ein Salz davon ausgewählt werden, das/die die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptidgens fördert.
Zum Beispiel kann eine Testverbindung, die die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptidgens in vorstehendem (iv) um etwa 20 % oder mehr, vorzugsweise um etwa 30 % oder mehr, bevorzugter um etwa 50 % oder mehr, verglichen mit der Expression in vorstehend (iii), hemmt, als eine Verbindung oder ein Salz davon, das/die die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptidgens hemmt, ausgewählt werden.
Das erfindungsgemäße Polynukleotid ist auch als ein Reagenz zum Absuchen von Verbindungen oder Salzen davon verwendbar, die die Wirkung des erfindungsgemäßen Polypeptidgens fördern oder hemmen.
Die vorliegende Erfindung stellt (5) ein Verfahren zum Absuchen von Verbindungen oder Salzen davon bereit, das die Wirkung des erfindungsgemäßen Polypeptids (hierin nachstehend manchmal eben als das/die „Promotor(en)" oder „Inhibitor(en)" bezeichnet) fördert oder hemmt, wobei das Verfahren durch Anwenden des erfindungsgemäßen Polynukleotids gekennzeichnet ist.
Insbesondere zum Beispiel: (6) Ein Verfahren zum Absuchen von Promotoren oder Inhibitoren der Zelltodinhibitorwirkung von dem erfindungsgemäßen Polypeptid wird bereitgestellt, worin die zwei Fälle von (v) einer Zelle, die das erfindungsgemäße Polypeptid herstellen kann, in Kontakt mit einer weiteren Zelle gezüchtet wird, und (vi) ein Gemisch der Zelle, die das erfindungsgemäße Polypeptid herstellen kann, und einer Testverbindung in Kontakt mit einer weiteren Zelle gezüchtet wird, verglichen werden, um dadurch die Wirkung des Polypeptids zum Hemmen des Todes einer weiteren Zelle zu vergleichen.
In den vorstehenden Absuchverfahren werden die Zellen unter Bedingungen von vorstehend (v) und (vi) gezüchtet und dann werden deren Überlebensverhältnisse gemessen.
Als die Zelle, die das erfindungsgemäße Polypeptid herstellen kann, können die in vorstehend (4) erwähnten Zellen verwendet werden. Als eine weitere Zelle können die vorstehend in (2) erwähnten Zellen verwendet werden. Die Testverbindung, das Züchtungsverfahren, Verfahren zum Messen der Zelltodinhibitorwirkungen sind wie vorstehend in (2) beschrieben.
Zum Beispiel kann eine Testverbindung, die die Zelltodinhibitorwirkung (z.B. Überlebensverhältnis) in vorstehend (vi) um etwa 20 % oder mehr, vorzugsweise um etwa 30 % oder mehr, bevorzugter um etwa 50 % oder mehr, verglichen mit der Wirkung in vorstehend (v), fördert, ausgewählt werden als eine Verbindung oder ein Salz davon, das die Wirkung des erfindungsgemäßen Polypeptids fördert.
Zum Beispiel kann eine Testverbindung, die die Zelltodinhibitorwirkung (z.B. Überlebensverhältnis) in vorstehendem Punkt (vi) um etwa 20 % oder mehr, vorzugsweise um etwa 30 % oder mehr, bevorzugter um etwa 50 % oder mehr, verglichen mit der Wirkung in vorstehend (v), hemmt, auch als eine Verbindung oder ein Salz davon ausgewählt werden, das die Wirkung des erfindungsgemäßen Polypeptids hemmt.
Die vorliegende Erfindung stellt (7) ein Verfahren zum Absuchen von Verbindungen oder Salzen davon bereit, die die Expression (Herstellung) des erfindungsgemäßen Polypeptids (hierin nachstehend manchmal eben als der/die „Promotor(en)" oder „Inhibitor(en)" bezeichnet) fördern oder hemmen, wobei das Verfahren durch Anwenden des erfindungsgemäßen Antikörpers gekennzeichnet ist.
Insbesondere zum Beispiel: (8) Ein Verfahren zum Absuchen von Promotoren oder Inhibitoren wird bereitgestellt, worin die zwei Fälle (vii) eine Zelle, die das erfindungsgemäße Polypeptid herstellen kann, wird gezüchtet, und (viii) ein Gemisch von der Zelle, die das erfindungsgemäße Polypeptid herstellen kann, und einer Testverbindung wird gezüchtet, unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers verglichen werden.
In dem vorstehend beschriebenen Absuchverfahren werden z.B. die Ausbeuten des erfindungsgemäßen Polypeptids in (vii) und (viii) gemessen und unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers verglichen.
Die Testverbindung kann z.B. ein Peptid, Protein, nicht peptidische Verbindung, synthetische Verbindung, Fermentationsprodukt, Zellextrakt, Pflanzenextrakt oder Lebewesengewebsextrakt sein. Diese Verbindungen können entweder neue Verbindungen oder bekannte Verbindungen sein.
Um das vorstehend beschriebene Absuchverfahren auszuführen, werden Zellen, die das erfindungsgemäße Polypeptid herstellen können, in einem zum Absuchen geeigneten Medium gezüchtet. Jedes Medium kann verwendet werden, solange es nicht die Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids hemmt. Zum Beispiel kann DMEM verwendet werden.
Spezielle Beispiele für Zellen, die das erfindungsgemäße Polypeptid herstellen können, schließen ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt, Wirte (Transformanten) transformiert mit dem eine DNA, die das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, umfassenden Vektor. Als der Wirt können Tierzellen, wie CHO-Zellen, vorzugsweise verwendet werden. Zum Absuchen werden vorzugsweise jene Transformanten verwendet, die das erfindungsgemäße Polypeptid innerhalb von Zellen oder in dem Kulturüberstand herstellen, wenn wie vorstehend beschrieben gezüchtet wurde.
Die Ausbeuten des erfindungsgemäßen Polypeptids können durch übliche Verfahren, z.B. Western-Analyse des Polypeptids, das in dem Zellextrakt enthalten ist, unter Verwendung eines Antikörpers, der das Polypeptid erkennt, ELISA oder darauf basierenden Verfahren, gemessen werden.
Zum Beispiel kann eine Testverbindung, die die Ausbeute des erfindungsgemäßen Polypeptids (Expressionsgrad) von vorstehendem Punkt (viii) um etwa 20 % oder mehr, vorzugsweise um etwa 30 % oder mehr, bevorzugter um etwa 50 % oder mehr erhöht, verglichen mit der Ausbeute in vorstehendem Punkt (viii), als eine Verbindung oder ein Salz davon ausgewählt sein, das die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids fördert.
Zum Beispiel kann eine Testverbindung, die die Ausbeute des erfindungsgemäßen Polypeptids (Expressionsgrad) von vorstehendem Punkt (viii) um etwa 20 % oder mehr, vorzugsweise um etwa 30 % oder mehr, bevorzugter um etwa 50 % oder mehr, verglichen mit der Ausbeute von vorstehendem Punkt (viii), senkt, als eine Verbindung oder ein Salz davon ausgewählt werden, das die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids hemmt.
Der erfindungsgemäße Absuchkit enthält das erfindungsgemäße Polypeptid oder ein Salz davon.
Verbindungen oder Salze davon, die unter Anwendung des Absuchverfahrens oder Absuchkits der Erfindung erhältlich sind, sind Verbindungen, die aus Peptiden, Proteinen, nicht peptidischen Verbindungen, synthetischen Verbindungen, Fermentationsprodukten, Zellextrakten, Pflanzenextrakten, Tiergewebsextrakten, Plasma usw. ausgewählt sind. Sie fördern oder hemmen die Funktion des erfindungsgemäßen Polypeptids, die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptidgens oder die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids.
Als Salze von solchen Verbindungen können die gleichen Salze wie für die Salze des erfindungsgemäßen Polypeptids beschrieben verwendet werden.
Die Verbindung oder Salz davon, das die Funktion des erfindungsgemäßen Polypeptids fördert, die Verbindung oder Salz davon, das die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids fördert, oder die Verbindung oder Salz davon, das die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids fördert, jeweils erhältlich durch das Absuchverfahren oder mit dem erfindungsgemäßen Absuchkit, können als ein Arzneimittel mit niedriger Toxizität und hoher Sicherheit, z.B. als ein Zelltodinhibitor oder als ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel für verschiedene Krankheiten, einschließlich Krankheiten begleitet von Neurodegeneration, wie neurodegenerative Krankheiten [z.B. Alzheimer-Krankheit (familiäre Alzheimer-Krankheit, juvenile Alzheimer-Krankheit, sporadische Alzheimer-Krankheit usw.), Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntingon Chorea, diabetische Neuropathie, multip le Sklerose usw.], Hirnfehlfunktionen (z.B. Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheit, epidurales Hämatom, subdurales Hämatom usw.), Krebsformen (z.B. Astrocytoma, Oligodendroglioma usw.), immunologische Krankheiten, Infektionen (z.B. Meningitis, Protozoiasis, Rickettsien-Infektionen, Metazoen-Infektionen, bakterielle oder virale Meningitis, wie Borna-Krankheit, postvaccinale Enzephalitis, AIDS-Enzephalopathie usw.), Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheitsentwicklung, verwendet werden. Vorzugsweise kann die Verbindung oder ein Salz davon als ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel für neurodegenerative Krankheiten und Hirnfehlfunktionen verwendet werden. Bevorzugter kann die Verbindung oder ein Salz davon als ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel für Alzheimer-Krankheit verwendet werden.
Andererseits kann die Verbindung oder ein Salz davon, das die Funktion des erfindungsgemäßen Polypeptids hemmt, die Verbindung oder Salze davon, das die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids hemmt, oder die Verbindung oder Salz davon, das die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids hemmt, als ein Arzneimittel verwendet werden, z.B. als ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel für Krankheiten, die sich aus zu hoher Erzeugung des erfindungsgemäßen Polypeptids ergeben (z.B. Krebsformen), verwendet werden.
Wenn eine unter Verwendung des erfindungsgemäßen Absuchverfahrens oder Absuchkits erhältliche Verbindung als das vorstehend beschriebene therapeutische und/oder prophylaktische Mittel verwendet wird, kann die Verbindung durch übliche Mittel verwendet werden. Zum Beispiel kann die Verbindung zu Tabletten, Kapseln, Elixieren, Mikrokapseln, aseptischen Lösungen, Suspensionen usw. in der gleichen Weise, wie für das Arzneimittel, umfassend das erfindungsgemäße Polypeptid, beschrieben, formuliert werden.
Die so erhaltenen Zubereitungen sind sicher und von niedriger Toxizität, so können sie an Säuger (z.B. Mensch, Ratte, Maus, Meerschweinchen, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Katze, Hund, Affe usw.) verabreicht werden.
Die Dosisspiegel dieser Verbindungen oder Salze davon können in Abhängigkeit von deren Wirkung, der Zielkrankheit, dem zu behandelnden Patienten, Verabreichungsweg usw. variieren. Zum Beispiel, wenn eine Verbindung, die die Wirkung oder Funktion des erfindungsgemäßen Polypeptids fördert, oral zum Behandeln von Alzheimer-Krankheit verabreicht wird, wird die Verbindung im Allgemeinen an erwachsene Patienten (60 kg Körpergewicht) bei einer Dosis von etwa 0,1 bis 100 mg/Tag, vorzugsweise 1,0 bis 50 mg/Tag, bevorzugter etwa 1,0 bis 20 mg/Tag, verabreicht. Bezüglich der parenteralen Verabreichung, wenn eine Verbindung, die die Wirkung oder Funktion des erfindungsgemäßen Polypeptids fördert, an erwachsene Patienten (60 kg Körpergewicht) in Form einer Injektion zum Behandeln von Alzheimer-Krankheit verabreicht wird, ist es zweckmäßig, die Verbindung bei einer Dosis von etwa 0,01 bis 30 mg/Tag, vorzugsweise etwa 0,1 bis 20 mg/Tag und bevorzugter etwa 0,1 bis 10 mg/Tag, intravenös zu injizieren, obwohl die Dosis zur Verabreichung in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Patienten, der Zielkrankheit usw. variieren kann. Für andere Lebewesen können die entsprechenden Dosen nach Umwandlung der vorstehend erwähnten Werte pro 60 kg, bezogen auf tatsächliche Körpergewichte, verabreicht werden.
Wenn andererseits eine Verbindung, die die Wirkung oder Funktion des erfindungsgemäßen Polypeptids hemmt, oral verabreicht wird, wird die Verbindung im Allgemeinen an erwachsene Patienten (60 kg Körpergewicht) bei einer Dosis von etwa 0,1 bis 100 mg/Tag, vorzugsweise etwa 1,0 bis 50 mg/Tag, bevorzugter etwa 1,0 bis 20 mg/Tag, verabreicht. Bezüglich parenteraler Verabreichung wird die Verbindung, die die Funktion des erfindungsgemäßen Polypeptids hemmt, an erwachsene Patienten (60 kg Körpergewicht) in Form einer Injektion verabreicht, wobei es zweckmäßig ist, die Verbindung mit einer Dosis von etwa 0,01 bis 30 mg/Tag, vorzugsweise etwa 0,1 bis 20 mg/Tag und bevorzugter etwa 0,1 bis 10 mg/Tag, intravenös zu injizieren, obwohl die Dosis zur Verabreichung in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Patienten, der Zielkrankheit usw. variieren kann. Für andere Lebewesen können entsprechende Dosen nach Umwandlung der vorstehend erwähnten Werte pro 60 kg, bezogen auf tatsächliche Körpergewichte, verabreicht werden.
(3) Quantitative Bestimmung des Polypeptids unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers
Da der erfindungsgemäße Antikörper das erfindungsgemäße Polypeptid spezifisch erkennen kann, kann der Antikörper zur quantitativen Bestimmung des erfindungsgemäßen Polypeptids, das in den Probenlösungen enthalten ist, insbesondere bei der quantitativen Bestimmung, durch Sandwich-Immunoassay erkannt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt bereit:

(i) ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung des erfindungsgemäßen Polypeptids in einer Probenlösung, umfassend vollständiges Umsetzen des erfindungsgemäßen Antikörpers mit der Probenlösung und dem markierten erfindungsgemäßen Polypeptid und Bestimmen des Verhältnisses des markierten Polypeptids der Erfindung, gebunden an den Antikörper, und (ii) ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung des erfindungsgemäßen Polypeptids in einer Probenlösung, umfassend Umsetzen der Probenlösung mit dem erfindungsgemäßen Antikörper, der insolubilisiert ist auf einem Träger und einem anderen markierten erfindungsgemäßen Antikörper, gleichzeitig oder in Folge, und Bestimmen der Wirkung des Markierungsmittels auf dem nicht solubilisierten Träger.

Weiterhin kann der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper zum quantitativen Bestimmen des erfindungsgemäßen Polypeptids verwendet werden oder kann zum Nachweis des Polypeptids durch Gewebeanfärben verwendet werden. Für diese Zwecke können entweder Antikörpermoleküle an sich oder das F(ab')₂-, Fab'- oder Fab-Fragment davon verwendet werden.
Verfahren zur quantitativen Bestimmung des erfindungsgemäßen Polypeptids unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers sind nicht besonders begrenzt. Jedes Messverfahren kann verwendet werden, worin die Menge des Antikörpers, Antigens oder Antikörper-Antigen-Komplexes entsprechend der Menge des Antigens in einer einfachen Lösung (z.B. der Menge des Peptids der Erfindung) durch chemische oder physikalische Mittel bestimmt wird und dann aus einer Standardkurve, hergestellt mit einer Standardlösung, die eine bekannte Menge des Antigens enthält, berechnet wird. Zum Beispiel können Nephrometrie, kompetitive Verfahren, immunometrische Verfahren und Sandwichassay zweckmäßigerweise verwendet werden und bezüglich von Sicherheit und Spezifität ist das Sandwichassay, das später beschrieben wird, besonders bevorzugt.
Beispiele für in den Messverfahren unter Anwendung von Markiersubstanzen verwendbare Markierungsmittel schließen reine Radioisotope, Enzyme, Fluoreszenzsubstanzen und Lumineszenzsubstanzen ein. Beispiele für Radioisotope schließen [¹²⁵I, [¹³¹I], [³H] und [¹⁴C] ein. Bevorzugte Beispiele für Enzyme sind jene, die stabil sind und mit hoher spezifischer Aktivität, z.B. β-Galactosidase, β-Glucosidase, Alkaliphosphatase, Peroxidase und Malatdehydrogenase. Beispiele für Fluoreszenzsubstanzen schließen Fluorescamin und Fluoresceinisothiocyanat ein. Beispiele für Lumineszenzsubstanzen schließen Luminol, Luminolderivate, Luciferin und Lucigenin ein. Weiterhin kann ein Biotin-Avidin-System zum Binden eines Antikörpers oder Antigens mit einem Markierungsmittel verwendet werden.
Die Insolubilisierung von Antigenen oder Antikörpern kann durch physikalische Adsorption oder durch chemisches Binden, das gewöhnlich zum Insolubilisieren oder für Immunobilisierungspolypeptide oder Enzyme verwendet wird, ausgeführt werden. Beispiele von für diesen Zweck verwendbaren Trägern schließen Polysaccharide, wie Agarose, Dextran und Zellulose; synthetische Harze, wie Polystyrol, Polyacrylamid und Silikon, und Glas ein.
In dem Sandwichassay wird eine Probenlösung mit einem insolubilisierten monoklonalen Antikörper der Erfindung umgesetzt (Primärreaktion); dann wird ein weiterer monoklonaler Antikörper der Erfindung, der markiert ist, damit umgesetzt (Sekundärreaktion), und die Aktivität des Markierungsmittels auf dem insolubilisierten Träger wird gemessen, um dadurch quantitativ die Menge des erfindungsgemäßen Polypeptids in der Probenlösung zu bestimmen. Die Primärreaktion und die Sekundärreaktion können in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden oder sie können gleichzeitig oder mit einem Intervall durchgeführt werden. Die Art des Markierungsmittels und das Insolubilisierungsverfahren können die gleichen wie jene, die hierin vorstehend beschrieben wurden, sein. In Immunoassays unter Verwendung der Sandwichtechnik ist der an einer festen Phase insolubilisierte Antikörper oder der markierte Antikörper nicht notwendigerweise ein einzelner Antikörper; ein Gemisch von zwei oder mehreren Antikörpern kann für die Zwecke zum Verstärken der Messempfindlichkeit usw. verwendet werden.
In dem Verfahren zur Messung des erfindungsgemäßen Polypeptids durch das erfindungsgemäße Sandwichassay sind die in den Primär- und den Sekundärreaktionen verwendeten erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper vorzugsweise jene Antikörper, deren Bindungsstellen an das erfindungsgemäße Polypeptid voneinander verschieden sind. Zum Beispiel wenn der in der Sekundärreaktion verwendete Antikörper den C-terminalen Bereich des erfindungsgemäßen Polypeptids erkennt, wird vorzugsweise ein Antikörper, der eine Stelle, die von dem C-terminalen Bereich verschieden ist, erkennt, z.B. ein N-terminaler Bereich, in der Primärreaktion verwendet.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann in einem Messsystem, das von dem Sandwichassay verschieden ist, kompetitiven Verfahren, immunometrische Verfahren und Nephrometrie verwendet werden.
In kompetitiven Verfahren werden ein Antigen in einer Probenlösung und ein markiertes Antigen kompetitiv mit einem Antikörper umgesetzt; dann werden nicht umgesetztes markier tes Antigen (F) und markiertes Antigen, das an den Antikörper gebunden ist (B), getrennt (d.h. B/F-Trennung) und die Menge der Markierung von B oder F wird gemessen, um dadurch quantitativ die Menge des Antigens in der Probenlösung zu bestimmen. Mit Bezug auf dieses Reaktionsverfahren gibt es ein Flüssigphasenverfahren, worin ein löslicher Antikörper verwendet wird und die B/F-Trennung mit Polyethylenglykol durchgeführt wird und ein zweiter Antikörper zu dem vorstehend erwähnten Antikörper verwendet wird, und ein Festphasenverfahren, in dem ein verfestigter Antikörper als der erste Antikörper verwendet wird und ein löslicher Antikörper als der erste Antikörper verwendet wird, während ein verfestigter Antikörper als der zweite Antikörper verwendet wird.
In immunometrischen Verfahren werden ein Antigen in einer Probenlösung und ein verfestigtes Antigen kompetitiv mit einer ausgewiesenen Menge des markierten Antikörpers umgesetzt, gefolgt von Trennung der festen Phase von der flüssigen Phase, oder ein Antigen in einer Probenlösung wird mit einer zu hohen Menge eines markierten Antikörpers umgesetzt, und dann wird ein verfestigtes Antigen zugegeben, um nicht umgesetzten markierten Antikörper an die feste Phase zu binden, gefolgt von Trennung der festen Phase von der flüssigen Phase. Anschließend wird die Menge der Markierung in einer der Phasen gemessen, um die Antigenmenge in der Probenlösung zu bestimmen.
Bei der Nephrometrie wird die Menge an unlöslichem Niederschlag, der im Ergebnis der Genantikörperreaktion in einem Gel oder Lösung erzeugt wird, gemessen. Auch wenn die Menge des Antigens in der Probenlösung klein ist und somit nur eine kleine Menge von solchem Niederschlag erhalten wird, kann Lasernephrometrie unter Anwenden der Streuung des Lasers zweckmäßigerweise verwendet werden.
Beim Anwenden von jedem von jenen immunologischen Messverfahren zum Messen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind keine speziellen Bedingungen oder Vorgänge erforderlich. Ein Messsystem für das erfindungsgemäße Polypeptid kann auf gebaut werden unter Verwendung der üblichen Bedingungen und Arbeitsverfahren in dem relevanten Messverfahren unter Berücksichtigung gewöhnlicher technischer Betrachtung des Fachmanns. Für Einzelheiten von diesen üblicherweise verwendeten technischen Mitteln kann eine Vielzahl von Literaturstellen, Lehrbüchern usw. angeführt werden.
Zum Beispiel Hiroshi Irie (Hrsg.): „Radioimmunoassay" (Kodansha, 1974); Hiroshi Irie (Hrsg.): „Radioimmunoassay; Second Series" (Kodansha, 1979); Eiji Ishikawa et al. (Hrsg.): „Enzyme Immunoassay" (Igaku Shoin, Japan, 1978); Eiji Ishikawa et al. (Hrsg.): „Enzyme Immunoassay" (2. Ausgabe) (Igaku Shoin, 1982); Eiji Ishikawa et al. (Hrsg.): "Enzyme Immnunoassay" (3. Ausgabe) (Igaku Shoin, 1987); "Methods in Enzymology", Band 70 (Immunochemical Techniques (Teil A)); ebd., Band 73 (Immunochemical Techniques (Teil B)); ebd., Band 74 (Immunochemical Techniques (Teil C)); ebd., Band 84 (immunochemical Techniques (Teil D: Selected Immunoassays)); ebd., Band 92 (Immunochemical Techniques (Teil E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)); ebd., Band 121 (Immunochemical Techniques (Teil 1: Hybridom Technology and Monoclonal Antibodies)) (Academic Press) und dergleichen können angeführt werden.
Unter Verwendung des wie vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Antikörpers kann das erfindungsgemäße Polypeptid quantitativ mit hoher Empfindlichkeit bestimmt werden.
Wenn weiterhin eine Erhöhung oder Senkung in der Konzentration des erfindungsgemäßen Polypeptids bei einer Person durch quantitatives Bestimmen der Konzentration des erfindungsgemäßen Polypeptids unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers nachgewiesen wird, ist es möglich, zu diagnostizieren, dass die Person eine der nachstehenden Krankheiten hat: z.B. Krankheiten begleitet von Neurodegeneration, wie neurodegenerative Krankheiten [z.B. Alzheimer-Krankheit (familiäre Alzheimer-Krankheit, juvenile Alzheimer-Krankheit, sporadische Alzheimer-Krankheit usw.), Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntingon Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose usw.], Hirnfehlfunktionen (z.B. Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheit, epidurales Hämatom, subdurales Hämatom usw.), Krebsformen (z.B. Astrocytoma, Oligodendroglioma usw.), immunologische Krankheiten, Infektionen (z.B. Meningitis, Protozoiasis, Rickettsien-Infektionen, Metazoen-Infektionen, bakterielle oder virale Meningitis, wie Borna-Krankheit, postvaccinale Enzephalitis, AIDS-Enzephalopathie usw.), Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheitsentwicklung; oder dass die Person wahrscheinlich eine solche Krankheit in der Zukunft entwickeln wird.
Weiterhin kann der erfindungsgemäße Antikörper zum Nachweisen des in Körperflüssigkeiten, Geweben oder anderen Proben vorliegenden erfindungsgemäßen Polypeptids verwendet werden. Der erfindungsgemäße Antikörper kann bei der Herstellung von Antikörpersäulen zur Verwendung bei der Reinigung des erfindungsgemäßen Polypeptids verwendet werden; beim Nachweis des erfindungsgemäßen Polypeptids in einzelnen Fraktionen, die im Verlauf der Reinigung erzeugt werden, und bei der Analyse des Verhaltens des erfindungsgemäßen Polypeptids in Testzellen.
(4) Diagnostische Mittel, die das erfindungsgemäße Polynukleotid umfassen
Das erfindungsgemäße Polynukleotid kann, falls als eine Sonde z.B. verwendet, Mutativitäten in DNA oder mRNA beim Codieren des erfindungsgemäßen Polypetids (Genmutativitäten) bei Säugern (z.B. Mensch, Ratte, Maus, Meerschwein, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Katze, Hund, Affe usw.) nachweisen. Somit ist das erfindungsgemäße Polynukleotid als ein gendiagnostisches Mittel zum Diagnostizieren, z.B. von Schädigung, Mutationen oder verminderter Expression der vorstehenden DNA oder mRNA oder erhöhte oder zu hohe Expression der vorstehenden DNA oder mRNA verwendbar.
Die Gendiagnose unter Anwendung des erfindungsgemäßen Polynukleotids kann durch bekannte Verfahren, wie Northern Hybridisierung oder PCR-SSCP-Verfahren (Genomics, Band 5, 874-879 (1989); Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 86: 2766-2770 (1989)) ausgeführt werden.
Wenn eine Senkung in der Expression durch Northern-Hybridisierung nachgewiesen wird oder wenn eine Mutation(en) in der DNA durch das PCR-SSCR-Verfahren z.B. nachgewiesen wird/werden, ist es möglich, zu diagnostizieren, dass die relevante Person sehr wahrscheinlich eine der nachstehenden Krankheiten hat: z.B. Krankheiten, begleitet von Neurodegeneration, wie neurodegenerative Krankheiten [z.B. Alzheimer-Krankheit (familiäre Alzheimer-Krankheit, juvenile Alzheimer-Krankheit, sporadische Alzheimer-Krankheit usw.), Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntingon Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose usw.], Hirnfehlfunktionen (z.B. Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheit, epidurales Hämatom, subdurales Hämatom usw.), Krebsformen (z.B. Astrocytoma, Oligodendroglioma usw.), immunologische Krankheiten, Infektionen (z.B. Meningitis, Protozoiasis, Rickettsien-Infektionen, Metazoen-Infektionen, bakterielle oder virale Meningitis, wie Borna-Krankheit, postvaccinale Enzephalitis, AIDS-Enzephalopathie usw.), Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheitsentwicklung.
(5) Arzneimittel und diagnostische Mittel, die Antisensepolynukleotid enthalten
Das Antisensepolynukleotid, das komplementär das erfindungsgemäße Polynukleotid bindet und somit die Expression von dem Polynukleotid hemmt, kann die Funktion des erfindungsgemäßen Polypeptids oder des Polynukleotids in vivo hemmen. Deshalb kann das Antisensepolynukleotid als prophylaktische und/oder therapeutische Mittel für Krankheiten, die sich aus zu hoher Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids ergeben (z.B. Krebsarten), verwendet werden.
Das vorstehend erwähnte Antisensepolynukleotid kann als die vorstehend erwähnten prophylaktischen und/oder therapeutischen Mittel in der gleichen Weise wie die verschiedenen prophylaktischen und/oder therapeutischen Mittel, die das erfindungsgemäße früher beschriebene Polynukleotid enthalten, verwendet werden.
Zum Beispiel kann das Antisensepolynukleotid an sich oder das Antisensepolynukleotid, das in einen geeigneten Vektor, wie einen Retrovirusvektor, Adenovirusvektor, Adenoverbundenen Virusvektor usw. inseriert wird, unter Verwendung üblicher Mittel verabreicht werden. Das Antisensepolynukleotid kann, wie es ist, oder nach Formulierung mit physiologisch verträglichen Trägern, wie Adjuvantien, verabreicht werden, um die Aufnahme mithilfe einer Genpistole oder eines Katheters, wie Hydrogelkatheter, zu fördern.
Weiterhin kann das Antisensepolynukleotid als eine Oligonukleotidsonde für diagnostische Zwecke verwendet werden, um das Vorliegen oder den Expressionszustand des erfindungsgemäßen Polynukleotids in Geweben oder Zellen zu prüfen. Das Antisensepolynukleotid kann zur Diagnose von z.B. Krankheiten verwendet werden, die verbunden sind mit Neurodegeneration, wie neurodegenerative Krankheiten [z.B. Alzheimer-Krankheit (familiäre Alzheimer-Krankheit, juvenile Alzheimer-Krankheit, sporadische Alzheimer-Krankheit usw.), Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntingon Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose usw.], Hirnfehlfunktionen (z.B. Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheit, epidurales Hämatom, subdurales Hämatom usw.), Krebsformen (z.B. Astrocytoma, Oligodendroglioma usw.), immunologische Krankheiten, Infektionen (z.B. Meningitis, Protozoiasis, Rickettsien-Infektionen, Metazoen-Infektionen, bakterielle oder virale Meningitis, wie Borna-Krankheit, postvaccinale Enzephalitis, AIDS-Enzephalo pathie usw.), Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheitsentwicklung.
(6) Arzneimittel, die den erfindungsgemäßen Antikörper enthalten
Der erfindungsgemäße Antikörper, der eine Wirkung zum Neutralisieren der Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids aufweist, kann als prophylaktische und/oder therapeutische Mittel für Krankheiten, die sich aus zu hoher Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids (z.B. Krebsformen) ergeben, verwendet werden.
Die vorstehend erwähnten prophylaktischen und/oder therapeutischen Mittel, die den erfindungsgemäßen Antikörper umfassen, können oral oder parenteral an Säuger (z.B. Mensch, Ratte, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Katze, Hund, Affe usw.) in Formen von flüssigen Zubereitungen ohne jegliches Verarbeiten oder in geeigneten Formen von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden. Die Dosisspiegel können in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Patienten, der Zielkrankheit, Symptomen, Verabreichungsweg usw. variieren. Jedoch ist es zweckmäßig, den erfindungsgemäßen Antikörper intravenös bei einer Dosis von etwa 0,01 bis 20 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise etwa 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht, bevorzugter etwa 0,1 bis 5 mg/kg Körpergewicht pro Verabreichung, etwa ein- bis fünfmal am Tag, vorzugsweise etwa ein- bis dreimal am Tag, zu injizieren. In einer anderen parenteralen Verabreichung und oralen Verabreichung können ähnliche Dosisspiegel verwendet werden. Wenn Symptome besonders schwer sind, kann die Dosis folglich erhöht sein.
Der erfindungsgemäße Antikörper kann an sich oder in Formen von geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen für die vorstehende Verabreichung umfassen den Antikörper oder Salz davon, pharmazeutisch verträgliche Träger und Verdünnungsmittel oder Exzipienten. Solche Zusammensetzungen können in Formen bereitgestellt werden, die zur oralen oder parenteralen Verabreichung geeignet sind.
Zum Beispiel schließen Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung feste oder flüssige Zubereitungen, wie Tabletten (einschließlich mit Zucker beschichteter Tabletten und filmbeschichteter Tabletten), Pillen, Granulate, Dispersantien, Kapseln (einschließlich weiche Kapseln), Sirupe, Emulsionen und Suspensionen, ein. Diese Zusammensetzungen werden gemäß üblichen Verfahren zubereitet und enthalten Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipienten, die üblicherweise auf dem Gebiet der Medizinherstellung verwendet werden. Zum Beispiel werden Laktose, Stärke, Saccharose, Magnesiumstearat und dergleichen als Träger oder Exzipienten für Tabletten verwendet.
Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung schließen z.B. Injektionen und Suppositorien ein. Injektionen schließen intravenöse Injektionen, subkutane Injektionen, intradermale Injektionen, Muskelinjektionen, Tropfinjektionen usw. ein. Solche Injektionen können durch Auflösen, Suspendieren oder Emulgieren des vorstehenden Antikörpers oder Salzes davon in einer aseptischen wässrigen oder öligen Flüssigkeit hergestellt werden. Beispiele für wässrige Flüssigkeiten zur Injektion schließen physiologische Salzlösung und isotonische Lösungen, die Glukose und andere Hilfsmittel enthalten, ein. Sie können in Kombination mit einem geeigneten Hilfssolubilisator, wie Alkohol (z.B. Ethanol), Polyalkohol (z.B. Propylenglykol, Polyethylenglykol), nichtionisches Tensid [z.B. Polysorbat 80^TM, HCO-50 (Polyoxyethylen (50 Mol, Addukt von hydriertem Rizinusöl)] usw.) verwendet werden. Beispiele für ölige Flüssigkeiten zur Injektion schließen Sesamöl und Sojaöl ein. Sie können in Kombination mit einem Hilfssolubilisator, wie Benzoesäurebenzylester, Benzylalkohol usw., verwendet werden. Gewöhnlich werden die hergestellten Injektionen in geeignete Ampullen gefüllt. Suppositorien zur Verabreichung im Rektum können durch Vermischen des Antikörpers oder eines Salzes davon mit einer üblichen Suppositoriengrundlage hergestellt werden.
Es ist üblich, die vorstehend beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen zur oralen oder parenteralen Verabreichung in Einheitsdosierungsformen, die eine geeignete Dosis des Wirkbestandteils ergeben würden, zu formulieren. Beispiele für solche Einheitsdosierungsformen schließen Tabletten, Pillen, Kapseln, Injektionen (Ampullen) und Suppositorien ein. Gewöhnlich enthält jede Einheit von diesen Dosierungsformen vorzugsweise etwa 5 bis 500 mg des vorstehend beschriebenen Antikörpers. Insbesondere enthält jede Einheit vorzugsweise etwa 5 bis 100 mg in Injektionen und jede Einheit in anderen Dosierungsformen enthält vorzugsweise etwa 10 bis 250 mg.
Die vorstehend beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen können andere Wirkbestandteile enthalten, solange sie keine unerwünschte Wechselwirkung mit dem vorstehend beschriebenen Antikörper erzeugen.
(7) DNA-transferierte Lebewesen
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Nichthumansäuger, die eine Fremd-DNA beherbergen, welche für das erfindungsgemäße Polypeptid codiert (nachstehend kurz als die "erfindungsgemäße Fremd-DNA" bezeichnet) bereit.
Somit stellt die vorliegende Erfindung bereit:

(1) Einen Nichthumansäuger, der die erfindungsgemäße Fremd-DNA oder eine mutante DNA davon beherbergt;
(2) den Nichthumansäuger nach (1), der ein Nager ist;
(3) den Nichthumansäuger nach (2), worin der Säuger Maus oder Ratte ist; und
(4) einen rekombinanten Vektor, der die erfindungsgemäße Fremd-DNA oder eine mutante DNA davon enthält und die DNA in einen Säuger exprimieren kann.

Der Nichthumansäuger, der die erfindungsgemäße Fremd-DNA beherbergt (hierin nachstehend kurz als das „erfindungsgemäße DNA-transferierte Lebewesen" bezeichnet), kann durch Transferieren der DNA von Interesse in eine Keimzelle, wie unbefruchtete Eizellen, unbefruchtete Eizellen oder Spermium zellen oder primordiale Zellen davon, vorzugsweise während des Zeitraums der Embryogenese bei der Ontogenese von dem Nichthumansäuger (bevorzugter im Stadium einer Einzelzelle oder einer unbefruchteten Eizelle und im Allgemeinen bei dem 8-Zellen-Stadium oder früher) durch das Calciumphosphatverfahren, elektrische Impulsverfahren, Lipofektionsverfahren, Agglutinierungsverfahren, Mikroinjektionsverfahren, Teilchenpistolenverfahren oder DEAE-Dextran-Verfahren erzeugt werden. Es ist möglich, die erfindungsgemäße Fremd-DNA von Interesse in somatische Zellen, Organe im lebenden Körper, Gewebszellen oder dergleichen durch solche DNA-Transferverfahren zur Anwendung der sich ergebenden Zellen oder Gewebe in der Zellkultur oder Gewebskultur zu transferieren. Weiterhin ist es ebenfalls möglich, durch Fusion der erhaltenen Zellen mit der vorstehend erwähnten germinalen Zelle durch bekannte Zellfusionsverfahren das erfindungsgemäße DNA-transferierte Lebewesen zu erzeugen.
Der in der Erfindung verwendbare Nichthumansäuger schließt Rind, Schwein, Schaf, Ziege, Kaninchen, Hund, Katze, Meerschweinchen, Hamster, Maus, Ratte usw. ein. Vom Standpunkt des Aufbaus von erkrankten Lebewesenmodellen sind Nager, die vergleichsweise kurze Ontogenese und Lebenszyklen aufweisen und leicht gezüchtet werden können, insbesondere Maus (z.B. reine Stämme, wie C57BL/6, DBA2 usw., und Hybridstämme, wie B6C3F₁, BDF₁, B6D2F₁, BALB/c, ICR usw.) oder Ratte (z.B. Wistar, SD usw.) bevorzugt.
Als der "Säuger" bei der Expression "ein rekombinanter Vektor ... der die DNA in einen Säuger exprimieren kann" kann der Mensch ebenfalls zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Nichthumansäugern gezählt werden.
Die erfindungsgemäße Fremd-DNA ist keine erfindungsgemäße DNA, die inhärent von dem Nichthumansäuger besessen wird, sondern eine erfindungsgemäße DNA, die einmal isoliert und aus einem Säuger extrahiert wurde.
Die erfindungsgemäße Fremd-DNA kann von einem Säuger abgeleitet sein, der von der gleichen Spezies ist wie jener des Wirtslebewesens oder von einer anderen Spezies. Zum Transferieren der erfindungsgemäßen DNA zu dem Wirtslebewesen ist es im Allgemeinen vorteilhaft, ein DNA-Konstrukt anzuwenden, in dem die DNA stromabwärts von dem Promotor, der die DNA in Lebewesenzellen exprimieren kann, ligiert. Zum Beispiel kann beim Transferieren der erfindungsgemäßen Human-DNA diese erfindungsgemäße Human-DNA stromabwärts von einem Promotor, der Expression von DNAs, die von verschiedenen Lebewesen abgeleitet sind (z.B. Kaninchen, Hund, Katze, Meerschweinchen, Hamster, Ratte, Maus usw.), die die erfindungsgemäße DNA mit hoher Homologie zu der menschlichen DNA beherbergen, ligieren, wodurch ein DNA-Konstrukt erzeugt wird (z.B. Vektor), welcher dann in unbefruchtete Eizellen eines Wirtssäugers, wie unbefruchtete Mauseizellen, mikroinjiziert werden kann. Somit kann ein DNA-transferierter Säuger, der hohe Expression der erfindungsgemäßen DNA zeigt, erzeugt werden.
Beispiele für den Expressionsvektor des erfindungsgemäßen Polypeptids schließen Plasmide, abgeleitet von E. coli, Plasmide, abgeleitet von B. subtilis, Plasmide abgeleitet von Hefe, λ-Phagen und anderen Bacteriophagen, Retroviren von Molony-Leukämievirus und Tierviren, wie Pockenvirus und Vaculovirus, ein. Bevorzugte Beispiele sind E.-coli-abgeleitete Plasmide, B.-subtilis-abgeleitete Plasmide und Hefeabgeleitete Plasmide.
Beispiele für Promotoren, die die Expression der DNA regulieren, schließen ein (1) Promotoren für DNAs, abgeleitet von Viren (z.B. affenartiger Virus, Cytomegalovirus, Molony-Leukämievirus, JC-Virus, Papillomavirus, Poliovirus usw.), (2) Promotoren, abgeleitet von Säugern (z.B. Mensch, Kaninchen, Hund, Katze, Meerschweinchen, Hamster, Ratte, Maus usw.), z.B. Promotoren von Albumin, Insulin II, Uroprakin II, Elastase, Erythropoietin, Endothelin, Muskelcreatinkinase, Glial-fibrilläres saures Protein, Glutathion-S-Transferase, Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor β, Keratin K1, K10 und K14, Collagen Typ I und Typ II, cyclische AMP-abhängige Polypeptidkinase β1-Untereinheit, Dystrophin, Weinsäure-resistente alkalische Phosphatase, atrialer natriuretischer Faktor, endotheliale Rezeptortyrosinkinase (im Allgemeinen als Tie2 abgekürzt), Natrium/Kalium-abhängige Adenosintriphosphatase (Na, K-ATPase), Neurofilament-leichte Kette, Metallothionein I und IIA, Metalloproteinase-I-Gewebsinhibitor, MHC-Klasse-I-Antigen (H-2L), H-ras, Renin, Dopamin-β-hydroxylase, Thyroidperoxidase (TPO), Polypeptidkettenverlängerungsfaktor-1α (EF-1α), β-Actin, α- und β-Myosin-schwere Kette, Myosin-leichte Ketten 1 und 2, Myelin-basisches Protein, Thyroglobulin, Thy-1, Immunoglobulin-H-Ketten-variable Region (VNP), Serumamyloid-P-Komponente, Myoglobin, Troponin C, Glattmuskel-α-actin, Preproenkephalin A, Vasopressin usw. Bevorzugt sind jene Promotoren, die hohe Expression der DNA in dem gesamten Körper ausrichten können, z.B. Cytomegaloviruspromotor, Humanpolypeptidkettenverlängerungsfaktor-1α-(EF-1α)-Promotor und Human- und Huhn-β-actin-Promotoren.
Es ist bevorzugt, dass der Vektor eine Sequenz zum Beenden der Transkription der mRNA von Interesse (im Allgemeinen Terminator genannt) in dem DNA-transferierten Säuger aufweist. Zum Beispiel können Sequenzen, die von Viren oder verschiedenen Säugern abgeleitet sind, verwendet werden. Vorzugsweise wird der SV40-Terminator von affenartigem Virus oder dergleichen abgeleitet verwendet.
Zusätzlich zum Verstärken der Expression der DNA von Interesse ist es weiterhin möglich, in Abhängigkeit von dem speziellen Zweck ein Spleißsignal, eine Verstärkerdomäne, einen Teil von einem eucaryotischen DNA-Intron usw. stromaufwärts von dem 5'-Ende des Promotorbereichs, zwischen dem Promotorbereich und dem translatierten Bereich oder stromabwärts von dem 3'-Ende des translatierten Bereichs zu ligieren.
Der translatierte Bereich kann als ein DNA-Konstrukt hergestellt werden, das in einem DNA-transferierten Lebewesen durch übliche rekombinante DNA-Techniken, d.h. durch Ligieren derselben stromabwärts von dem Promotor und, falls erwünscht, stromaufwärts von der Transkriptionsterminationsstelle, exprimiert wird.
Die Übertragung der erfindungsgemäßen Fremd-DNA an der unbefruchteten Eizellenstufe sichert, dass die DNA in den Keimzellen und somatischen Zellen des Wirtssäugers allgegenwärtig ist. Das Vorliegen der erfindungsgemäßen DNA in den Keimzellen des DNA-transferierten Lebewesens nach DNA-Transfer bedeutet, dass die gesamten Keimzellen und somatischen Zellen von allen anschließenden Generationen von dem DNAtransferierten Lebewesen die erfindungsgemäße DNA beherbergen. Somit hat die Nachkommenschaft von solchem DNA-transferierten Lebewesen, das die erfindungsgemäße Fremd-DNA vererbt hat, die DNA in allen ihren Keimzellen und somatischen Zellen.
Der Nichthumansäuger, der die erfindungsgemäße Fremd-DNA beherbergt, kann durch Paarung verifiziert werden, um die Fremd-DNA-Stabilität beizubehalten, und dann als eine Linie gezüchtet werden, die die DNA von Generation zu Generation unter gewöhnlichen Zuchtbedingungen beherbergt.
Der Transfer der erfindungsgemäßen Fremd-DNA an der unbefruchteten Eizellenstufe sichert, dass die DNA im Überschuss in allen Keimzellen und somatischen Zellen des Wirtssäugers vorliegen wird. Das Vorliegen der erfindungsgemäßen Fremd-DNA in den Keimzellen des DNA-transferierten Lebewesens nach DNA-Transfer bedeutet, dass alle Keimzellen und somatischen Zellen von der gesamten Nachkommenschaft des DNAtransferierten Lebewesens die erfindungsgemäße Fremd-DNA im Überschuss beherbergt. Somit hat die Nachkommenschaft von solchem DNA-transferiertem Lebewesen, das die erfindungsgemäße Fremd-DNA aufgenommen hat, die DNA im Überschuss in seinen Keimzellen und somatischen Zellen.
Durch Herstellen von homocygoten Lebewesen mit der transferierten DNA in sowohl homologen Chromosomen als auch gepaarten männlichen Lebewesen mit weiblichen Lebewesen ist es möglich, solche Generationen zu züchten, sodass jede Nachkommenschaft die DNA im Überschuss beherbergt.
Der Nichthumansäuger, der die erfindungsgemäße normale DNA beherbergt, ist gekennzeichnet durch eine hohe Expression der normalen DNA und kann schließlich eine Hyperegasie von dem erfindungsgemäßen Polypeptid durch Aktivierung der Funktion der endogenen Normal-DNA entwickeln. Somit kann das Lebewesen als ein künstliches Modell der Krankheit verwendet werden. Zum Beispiel durch Anwenden des DNA-transferierten Lebewesens, das die erfindungsgemäße normale DNA beherbergt, ist es möglich, die Hyperegasie des erfindungsgemäßen Polypeptids zu studieren, die Krankheitsmechanismen, mit denen das erfindungsgemäße Polypeptid verbunden ist, zu klären und therapeutische Modalitäten für die Krankheiten auszuforschen.
Weiterhin gibt der Säuger, auf den die normale erfindungsgemäße Fremd-DNA transferiert wurde, Symptome aufgrund einer Erhöhung des erfindungsgemäßen freien Polypeptids wieder und kann deshalb auch beim Absuchen von therapeutischen Arzneimitteln auf Krankheiten, mit denen das erfindungsgemäße Polypeptid verbunden ist, verwendet werden.
Andererseits kann der Nichthumansäuger, der die erfindungsgemäße mutative Fremd-DNA beherbergt, durch Paaren verifiziert werden, um die DNA stabil zu halten, und dann als eine Linie gezüchtet werden, die die DNA von Generation zu Generation unter gewöhnlichen Zuchtbedingungen beherbergt. Darüber hinaus ist es möglich, die Fremd-DNA von Interesse in dem vorstehend erwähnten Plasmid einzubauen und dasselbe als ein Ausgangsmaterial zu verwenden. Das DNA-Konstrukt mit dem Promotor kann durch übliche rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden. Der Transfer von der erfindungsgemäßen mutativen DNA zu der unbefruchteten Eizellenstufe sichert, dass die transferierte DNA in allen Keimzellen und somatischen Zellen des Wirtssäugers im Überschuss vorhanden sein wird. Das Vorliegen der erfindungsgemäßen mutativen DNA in Keimzellen des DNA-transferierten Lebewesens bedeutet, dass die gesamte Nachkommenschaft von diesem DNA-transferierten Lebewesen die erfindungsgemäße mutative DNA in allen ihren Keimzellen und somatischen Zellen beherbergt. Die Nachkommenschaft von die sem Lebewesen beherbergt die erfindungsgemäße mutative DNA in allen ihren Keimzellen und somatischen Zellen. Durch Herstellen von homocygoten männlichen und weiblichen Lebewesen mit der eingeführten DNA in sowohl homologen Chromosomen als auch gepaarten von ihnen kann es gesichert werden, dass alle Nachkommenschaft die DNA von Generation zu Generation beherbergt.
Den Nichthumansäuger, der die erfindungsgemäße mutative DNA beherbergt, kennzeichnet eine hohe Expression der mutativen DNA und kann deshalb schließlich Adiaphorie, verbunden mit funktioneller Inaktivierung des erfindungsgemäßen Polypeptids durch Inhibierung der Funktion der endogenen Normal-DNA, entwickeln. Somit kann das Lebewesen als ein Lebewesenmodell der Krankheit genutzt werden. Zum Beispiel durch Anwenden des DNA-transferierten Lebewesens, das die erfindungsgemäße mutative DNA beherbergt, können Analyse des Mechanismus von dieser funktionellen Inaktivierung von Adiaphorie, was dem erfindungsgemäßen Polypeptid zuzuschreiben ist, und therapeutische Modalitäten für die Krankheit erforscht werden.
Als eine spezielle potenzielle Verwendung kann das DNA-transferierte Lebewesen mit einer hohen Expression der erfindungsgemäßen mutativen DNA als ein Modell zum Erläutern der funktionellen Inhibierung des Polypeptids durch das erfindungsgemäße mutative Polypeptid (dominanter negativer Effekt) bei Adiaphorie von funktioneller Inaktivierung verwendet werden.
Darüber hinaus entwickelt der DNA-transferierte Säuger, der die erfindungsgemäße Fremd-DNA beherbergt, Symptome aufgrund einer Erhöhung des erfindungsgemäßen freien Polypeptids und kann deshalb beim Absuchen von therapeutischen Arzneimitteln auf Adiaphorie, die als eine funktionelle Inaktivierung des erfindungsgemäßen Polypeptids bewertbar ist, verwendet werden.
Als weitere potenzielle Verwendungen der zwei Arten von DNA-transferierten Lebewesen, die die zwei Arten erfin dungsgemäßer DNA beherbergen, können die Nachstehenden festgestellt werden:

(1) Verwendung einer Zellquelle für Gewebskultur;
(2) Analyse von jenen Genen oder Polypeptiden, die speziell durch das erfindungsgemäße Polypeptid exprimiert oder aktiviert oder desaktiviert werden durch Vergleichen und Analysieren der DNA oder RNA in Geweben von DNA-transferiertem erfindungsgemäßem Lebewesen mit der DNA oder RNA von nicht DNA-transferiertem Lebewesen (Kontrolllebewesen) oder durch Vergleichen und Analysieren der Zusammensetzungen der exprimierten Polypeptide;
(3) Studie der Funktionen von Zellen von jenen Geweben, die im Allgemeinen schwierig zu züchten sind, durch Anwendung der Zellen aus den Geweben, die DNA enthalten, wie durch die Standardgewebskulturtechnik gezüchtet;
(4) Absuchen auf Arzneimittel, die die Zellfunktionen durch Anwenden der in (3) beschriebenen Zellen verstärken können, und
(5) Isolierung und Reinigung des erfindungsgemäßen mutanten Polypeptids und Konstruktion von Antikörpern dazu.

Weiterhin können durch Anwenden des erfindungsgemäßen DNA-transferierten Lebewesens klinische Symptome von Krankheiten, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid verbunden sind, inklusive die vorstehend beschriebene Adiaphorie, verbunden mit funktioneller Inaktivierung des erfindungsgemäßen Polypeptids, untersucht werden. Zusätzlich können genauere pathologische Auffindungen erhalten werden in verschiedenen Organen dieses Modells von Krankheiten, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid verbunden sind, was somit zu der Entwicklung von neuen Therapien beiträgt sowie der Studie und Behandlung von Sekundärkrankheiten, die aus solchen Krankheiten erwachsen.
Darüber hinaus kann durch Entfernen verschiedener Organe aus dem DNA-transferierten Lebewesen der Erfindung, Zerstückeln derselben und Verdau derselben mit einem proteolytischen Enzym, wie Trypsin-freien Einzelzellen, die die trans ferierte DNA beherbergen, gewonnen werden. Diese Zellen können zur Herstellung einer Zelllinie gezüchtet werden. Weiterhin kann Charakterisierung der Zellen, die das erfindungsgemäße Polypeptid erzeugen, ausgeführt werden, und deren Beziehung mit Apoptosis, Differenzierung oder Proliferation, dem Mechanismus von Signalweiterleitung und einbezogene Mutativitäten können erläutert werden, um dabei Information zu erzeugen, die für die weitere Erforschung des erfindungsgemäßen Polypeptids und seiner Wirkungen verwendbar sind.
Darüber hinaus kann für die Entwicklung der therapeutischen Arzneimittel für Krankheiten, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid verbunden sind, wie Adiaphorie, die sich aus der funktionellen Inaktivierung des erfindungsgemäßen Polypeptids ergibt, durch Anwendung des erfindungsgemäßen DNAtransferierten Lebewesens eine wirksame und schnelle Absuchtechnologie für solche therapeutischen Arzneimittel durch Anwendung der hierin vorstehend beschriebenen Test- und Assayverfahren hergestellt werden. Zusätzlich können durch Anwenden des vorstehenden DNA-transferierten Lebewesens oder des erfindungsgemäßen Fremd-DNA-Expressionsvektors Gentherapien für Krankheiten, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid verbunden sind, erläutert und entwickelt werden.
(8) Knock-Out-Lebewesen
Die Erfindung stellt weiterhin Nichthumansäugerembryostammzellen bereit, worin die erfindungsgemäße DNA inaktiviert ist und Nichthumansäuger, in denen es an Expression der erfindungsgemäßen DNA mangelt, worin die erfindungsgemäße DNA des-aktiviert ist.
Die Erfindung erlaubt deshalb:

(1) Eine nicht humane Säugerembryonenstammzelle, worin die erfindungsgemäße DNA inaktiviert ist;
(2) die embryonische Stammzelle nach (1), worin die DNA durch Einführung eines Reportergens (z.B. E. coli-abgeleitetes β-Galactosidasegen) inaktiviert ist;
(3) die Embryonenstammzelle nach (1), die Neomycinresistent ist;
(4) die Embryonenstammzelle nach (1), worin der Nichthumansäuger ein Nager ist;
(5) die Embryonenstammzelle nach (4), worin der Nager eine Maus ist;
(6) einen Nichthumansäuger, der bei der Expression von erfindungsgemäßer DNA unzureichend ist, worin die DNA inaktiviert ist;
(7) den Nichthumansäuger nach (6), worin die DNA durch Einführung eines Reportergens (z.B. E. coli-abgeleitetes β-Galactosidasegen) inaktiviert ist und das Reportergen unter der Steuerung des Promotors für die erfindungsgemäße DNA exprimiert werden kann;
(8) den Nichthumansäuger nach (6), worin der Nichthumansäuger ein Nager ist;
(9) den Nichthumansäuger nach (8), worin der Säuger eine Maus ist, und
(10) ein Verfahren zum Absuchen nach Verbindungen oder Salzen davon, die die Promotoraktivität der erfindungsgemäßen DNA verstärken oder hemmen, das Verabreichen einer Testverbindung an den Nichthumansäuger nach (7) und Nachweisen der Expression des Reportergens umfasst.

Der Ausdruck „Nichthumansäugerembryonenstammzelle, worin die erfindungsgemäße DNA nicht aktiviert ist" bedeutet die Embryonenstammzelle (hierin nachstehend kurz als ES-Zelle bezeichnet) von einem Nichthumansäuger, worin die DNA von der Kapazität ausgeschlossen ist, um das erfindungsgemäße Polypeptid zu exprimieren (hierin nachstehend manchmal als die „erfindungsgemäße Knock-Out-DNA" bezeichnet) durch Einführung einer künstlichen Mutation der erfindungsgemäßen DNA, die der Nichthumansäuger dann enthält, um dadurch die Expression der erfindungsgemäßen DNA zu hemmen, oder durch wesentliche Verarmung an Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids, das durch die DNA codiert wird.
Als die Nichthumansäuger können die gleichen Lebewesen wie hierin vorstehend erwähnt angewendet werden.
Beispiele für das Verfahren zum Einführen einer künstlichen Mutation für die erfindungsgemäße DNA sind eine Deletion von etwas oder der gesamten DNA-Sequenz oder eine Insertion einer anderen DNA oder Substitution mit einer verschiedenen DNA durch die Gentechnik. Die erfindungsgemäße Knock-Out-DNA kann durch eine solche Mutation erzeugt werden, die das Leseraster verschieben oder die Funktion des Promotors oder Exons zerstören würde.
Die Nichthumansäugerembryonenstammzelle, worin die erfindungsgemäße DNA inaktiviert ist (hierin nachstehend als die „DNA-inaktivierte ES-Zelle der Erfindung" oder die „Knock-Out-ES-Zelle der Erfindung" bezeichnet), kann z.B. durch Verfahren hergestellt werden, die Isolieren der erfindungsgemäßen DNA aus dem gewünschten Nichthumansäuger, Inserieren eines arzneistoffresistenten Gens, typischerweise Neomyzin-Resistenzgens oder Hygromycin-Resistenzgens oder eines Reportergens, wie lacZ (β-Galactosidasegen) oder cat (Chloramphenicolacetyltransferasegen), in ihren Exon-Bereich, um die Funktion des Exons zu zerstören oder Inserieren einer DNA-Sequenz zum Beendigen der Gentranskription (beispielsweise Poly-A-Additionssignal) in einen Intronbereich zwischen Exons, um dadurch die Synthese einer vollständigen mRNA zu hemmen, Einführen des so konstruierten DNA-Strangs mit einer DNA-Sequenz aufgebaut, um schließlich das Gen zu zerstören (hierin nachstehend kurz als der „Zielvektor" bezeichnet), in die Chromosomen des Wirtslebewesens durch homologe Rekombination, Unterziehen der erhaltenen ES-Zelle Southern-Hybridisierungsanalyse unter Anwendung einer DNA-Sequenz, die an der erfindungsgemäßen DNA oder in ihrer Nachbarschaft lokalisiert ist, als eine Sonde oder ein PCR-Verfahren unter Anwendung einer DNA-Sequenz, die an dem Zielvektor oder einer DNA-Sequenz in der Nachbarschaft lokalisiert ist, jedoch nicht die bei der Konstruktion des Zielvektors als Primer verwende te erfindungsgemäße DNA einschließend und Auswählen der Knock-Out-ES-Zelle der Erfindung.
Die ursprüngliche nicht humane ES-Zelle, die zur Inaktivierung der erfindungsgemäßen DNA durch die homologe Rekombinationstechnik oder dergleichen verwendet werden soll, kann eine bereits etablierte Zelllinie wie jene hierin vorstehend erwähnt oder eine neue Zelllinie, die de novo durch das bekannte Verfahren von Evans und Kaufman hergestellt wurde, sein. Nimmt man zum Beispiel Maus-ES-Zellen, werden im Allgemeinen ES-Zellen der Linie 129 verwendet, jedoch ist der immunologische Hintergrund dieser Linie nicht klar. Deshalb kann vorteilhafterweise die alternative Zelllinie zum Herstellen von reinen Linien-ES-Zellen mit einem immunologisch definierten genetischen Hintergrund verwendet werden, z.B. BDF₁-Mäuse, erzeugt durch Hybridisierung von C57BL/6-Mäusen und C57BL/6-Mäusen, wobei beide einige Eier erzeugen, mit DBA/2-Mäusen (BDF₁ = F₁ von C57BL/6 und DBA/2). Zusätzlich zu dem Vorteil von hohem Eiausstoß und der Robustheit des Eis haben BDF₁-Mäuse den Hintergrund von C57BL/6-Mäusen, und dergestalt, dass im erhaltenen Aufbau eines Krankheitsmodells mit ES-Zellen der genetische Hintergrund der Modellmäuse zu jenem von C57BL/6-Mäusen durch Zurückkreuzen mit C57BL/6-Maus umgewandelt werden kann.
Darüber hinaus werden beim Herstellen einer ES-Zelllinie im Allgemeinen Blasocyten 3,5 Tage nach Fertilisierung angewendet, jedoch kann daneben eine Vielzahl von frühen Embryos mit hoher Wirksamkeit durch Ernten der Embryos an dem 8-Zellen-Stadium und Züchten derselben in Blastozyten hergestellt werden.
Obwohl ES-Zellen von sowohl männlichen als auch weiblichen Lebewesen verwendet werden können, sind im Allgemeinen ES-Zellen von männlichen Lebewesen für den Aufbau von Reproduktionslinienchimären geeigneter. Darüber hinaus ist es für den Zweck des Verminderns der Last des komplizierten Kulturverfahrens bevorzugt, Sexing so früh wie möglich auszuführen.
Als ein typisches Verfahren zum Sexing von ES-Zellen kann das Verfahren erwähnt werden, in dem das Gen in dem Geschlechtsbestimmungsbereich von dem Y-Chromosom verstärkt wird und durch PCR nachgewiesen wird. Während die übliche Karyotyp-Analyse etwa 10⁶-Zellen erfordert, erfordert das vorstehende Verfahren nur etwa ein Kolonieäquivalent ES-Zellen (etwa 50 Zellen). Deshalb kann die primäre Auswahl an ES-Zellen durch dieses Sexing-Verfahren in einer frühen Stufe erfolgen. Da männliche Zellen somit in der frühen Stufe ausgewählt werden können, können die Schwierigkeiten in der Anfangsstufe der Kultur drastisch vermindert werden.
Darüber hinaus kann die Sekundärauswahl durch G-Banding hinsichtlich der Anzahl der Chromosomen ausgeführt werden. Die Anzahl der Chromosomen in der sich ergebenden ES-Zelle ist vorzugsweise 100 % von der normalen Anzahl, jedoch kann dieses Ziel aufgrund der physikalischen und anderen Faktoren, die in die Herstellung der Linie einbezogen sind, nicht erreicht werden. In solchen Fällen ist es bevorzugt, das Gen aus der ES-Zelle auszuschließen und dieselbe in die normale Zelle erneut zu klonen (Nimmt man beispielsweise eine Maus, die Zelle, in der die Anzahl an Chromosomen 2n = 40).
Die so hergestellte embryonische Stammzelllinie ist im Allgemeinen, in der Proliferationseigenschaft sehr befriedigend, da sie jedoch für den Verlust ihrer ontogenen Fähigkeit anfällig ist, muss sie mit ausreichend Vorsicht subgezüchtet werden. Zum Beispiel sollte diese Zelllinie auf geeigneten Feeder-Zellen, wie STO-Fibroplasten, in Gegenwart von LIF (1-10000 U/ml) in einem Kohlendioxidinkubator (vorzugsweise 5 % CO₂, 95 % Luft oder 5 % Sauerstoff, 5 % CO₂, 90 % Luft) bei etwa 37°C gezüchtet werden. Und in der Subkultur sollte sie mit Trypsin/EDTA-Lösung (im Allgemeinen 0,001-0,5 % Trypsin/0,1-5 mM EDTA, vorzugsweise etwa 0,1 % Trypsin/1 mM EDTA) behandelt werden, um einzelne Zellen bereitzustellen und dieselben auf frisch hergestellten Feeder-Zellen zu beimpfen. Obwohl solche Subkultur im Allgemeinen alle 1 bis 3 Tage vorgebildet wird, ist es gute Praxis, die Zellen bei je der Gelegenheit zu beobachten und, wann immer morphologisch mutative Zellen entdeckt werden, die Kultur zu verwerfen.
Nicht humanen ES-Zellen kann erlaubt werden, zu verschiedenen Typen von Zellen, wie Head-long-Muskelzellen, viszerale Muskelzellen, Herzmuskelzellen usw., durch Ausführen von Einschichtkultur zu einer höheren Dichte unter geeigneten Bedingungen oder Suspensionskultur, bis sich eine Zellmasse gebildet hat, zu differenzieren (M. J. Evans & M. H. Kaufman, Nature, 292, 154, 1981; G. R. Martin, Proceedings of National Academy of Science USA, 78, 7634, 1981; T. C. Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985), und der Zellmangel bei Expression der erfindungsgemäßen DNA, wie durch Verursachen der ES-Zelle der Erfindung zu differenzieren, ist für die cytobiologische In-vitro-Studie von dem erfindungsgemäßen Polypeptid nützlich.
Der Nichthumansäugermangel bei der Expression der erfindungsgemäßen DNA kann aus normalen Lebewesen durch Assayausführung der mRNA in den Lebewesen durch das bekannte Verfahren und indirektes Vergleichen der Expressionsmengen differenziert werden.
Als den für diesen Zweck verwendeten Nichthumansäuger können die gleichen Lebewesen wie hierin vorstehend erwähnt verwendet werden.
Bezüglich des Nichthumansäugermangels bei der Expression der erfindungsgemäßen DNA kann die erfindungsgemäße DNA durch Einführen des Zielvektors, der wie vorstehend beschrieben aufgebaut ist, in z.B. mausembryonische Stammzellen oder Mauselzellen, Knock-out unterzogen werden und dadurch der DNA-Sequenz des Zielvektors erlaubt wird, die erfindungsgemäße inaktivierte DNA zu beherbergen, um homologe Rekombination mit und folglich Ersetzen der erfindungsgemäßen DNA an den embryonischen Mausstammzellen- oder Eizellenchromosomen einzugehen.
Die Zelle mit der erfindungsgemäßen DNA, die somit Knock-out unterzogen wurde, kann durch Southern-Hybridisierungsanalyse unter Verwendung einer DNA-Sequenz der erfin dungsgemäßen DNA oder in ihrer Nachbarschaft als eine Sonde oder durch PCR unter Verwendung einer DNA-Sequenz auf den Zielvektor oder einer mausabgeleiteten DNA-Sequenz in einem Bereich benachbart zu, jedoch die erfindungsgemäße DNA, die in dem Zielvektor als Primer verwendet wird, nicht einschließend eingeschätzt werden. Wenn eine embryonische Stammzelle vom Nichthumansäuger verwendet wird, wird die Zelllinie mit der erfindungsgemäßen DNA durch die homologe Rekombinationstechnik Knock-out unterzogen, geklont und in den Nichthumansäugerembryo oder Blastozyten bei einer geeigneten Stufe der Embryogenese, z.B. bei der 8-Zellen-Stufe, injiziert und der erhaltene Chimärenembryo wird in den pseudoschwangeren Uterus von dem Nichthumansäuger transplantiert. Das so erhaltene Lebewesen ist ein Chimärenlebewesen, das durch sowohl die Zellen, die den erfindungsgemäßen normalen DNA-Ort beherbergen, als auch die Zellen, die den künstlich mutierten erfindungsgemäßen DNA-Ort beherbergen, aufgebaut ist.
Wenn einige von den Nichthumangameten von diesen Chimärenlebewesen den erfindungsgemäß mutierten DNA-Ort beherbergen, kann ein Individuum, dessen gesamtes Gewebe aus Zellen, die den erfindungsgemäß mutierten DNA-Ort beherbergen, besteht, aus der Kolonie der durch Kreuzen solch eines Chimärenlebewesens mit einem normalen Lebewesen erhaltenen Lebewesen abgesucht werden, z.B. durch Farbschichtunterscheidung. Die so selektierten Individuen sind gewöhnlich Lebewesen mit Heteromangeln an Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids, und durch Paaren solcher Individuen mit Heteromangeln an Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids miteinander können Lebewesen mit Homomangel in der Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids erlangt werden.
Wenn Nichthumanzelleneizellen verwendet werden, kann ein transgener Nichthumansäuger mit dem Zielvektor in seinen Chromosomen, eingeführt durch Injizieren der DNA-Lösung in den Eizellenkern durch Mikroinjektionstechnik und Auswählen von Lebewesen, die eine Mutation der erfindungsgemäßen DNA durch homologe Rekombination exprimieren, hergestellt werden.
Die Nichthumanindividuen mit der erfindungsgemäßen DNA, die somit Knock-out sind, werden zum Verifizieren, dass die durch Paaren erhaltenen Lebewesen auch Knock-out-DNA aufweisen, gepaart und sie können unter den gewöhnlichen Zuchtbedingungen unterzüchtet sein.
Die Herstellung und das Halten der Nichthumankeimlinie kann auch gemäß üblichen Verfahren ausgeführt werden. Somit können durch Paaren von männlichen und weiblichen Nichthumanlebewesen, die die inaktivierte DNA beherbergen, Homocygoten mit der inaktivierten DNA in beiden homologen Chromosomen erhalten werden. Die so erhaltenen Homocygoten werden unter solchen Bedingungen gezüchtet, dass bezüglich der Mutter die Anzahl an Homocygoten pro normales Individuum groß ist. Durch Paaren von männlichen und weiblichen Heterocygoten, können Homocygoten und Heterocygoten, die beide die inaktivierte DNA beherbergen, unterzüchtet werden.
Die nichthumansäugerembryonische Stammzelle, die die erfindungsgemäße inaktivierte DNA beherbergt, ist für den Aufbau von Nichthumansäugern, denen es an Expression der erfindungsgemäßen DNA mangelt, sehr nützlich.
Darüber hinaus fehlt es dem Säuger mit Mangel bei der Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids an den verschiedenen biologischen Aktivitäten, die durch das erfindungsgemäße Polypeptid induzierbar sind, und kann deshalb als Nichthumanlebewesenmodell von Krankheiten, die aus der Inaktivierung der biologischen Aktivitäten des erfindungsgemäßen Polypeptids erwachsen, verwendbar sein, wodurch er somit bei den ätiologischen Studien solcher Krankheiten und der Entwicklung von therapeutischen Verfahren verwendbar ist.
(8a) Verfahren zum Absuchen von Verbindungen mit therapeutischem/prophylaktischem Effekt auf Krankheiten, die sich aus dem Mangel von oder Schädigung der erfindungsgemäßen DNA ergeben
Nichthumansäuger mit Mangel bei der Expression der erfindungsgemäßen DNA können zum Absuchen von Verbindungen mit einem therapeutischen und/oder prophylaktischen Effekt bei Krankheiten verwendet werden, die sich aus dem Mangel von oder Schädigung der erfindungsgemäßen DNA ergeben, z.B. Krankheiten, begleitet von Neurodegeneration, wie neurodegenerative Krankheiten [z.B. Alzheimer-Krankheit (familiäre Alzheimer-Krankheit, juvenile Alzheimer-Krankheit, sporadische Alzheimer-Krankheit usw.), Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntingon Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose usw.], Hirnfehlfunktionen (z.B. Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheit, epidurales Hämatom, subdurales Hämatom usw.), Krebsformen (z.B. Astrocytoma, Oligodendroglioma usw.), immunologische Krankheiten, Infektionen (z.B. Meningitis, Protozoiasis, Rickettsien-Infektionen, Metazoen-Infektionen, bakterielle oder virale Meningitis, wie Borna-Krankheit, postvaccinale Enzephalitis, AIDS-Enzephalopathie usw.), Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheitsentwicklung.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Absuchen nach Verbindungen oder Salzen davon mit einem therapeutischen und/oder prophylaktischen Effekt auf Krankheiten, die sich aus dem Mangel von oder Schädigung der erfindungsgemäßen DNA ergeben, bereit, welches durch Verabreichen einer Testverbindung an einen Nichthumansäuger, der Mangel bei Expression der erfindungsgemäßen DNA aufweist, und Beobachten und Messen bei den Veränderungen in dem Säuger gekennzeichnet ist.
Als der Nichthumansäuger mit Mangel bei der Expression der erfindungsgemäßen DNA können die gleichen wie vorstehend beschriebenen Lebewesen verwendet werden.
Die Testverbindung kann z.B. ein Peptid, Protein, nicht peptidische Verbindung, synthetische Verbindung, Fermentationsprodukt, Zellextrakt, Pflanzenextrakt, Lebewesengewebeextrakt oder Plasma sein. Diese Verbindungen können entweder neue Verbindungen oder bekannte Verbindungen sein.
Insbesondere wird ein Nichthumansäugermangel bei der Expression der erfindungsgemäßen DNA mit einer Testverbindung behandelt und dann mit einem Kontrolllebewesen, das nicht mit der Verbindung behandelt wurde, verglichen. Anschließend kann der therapeutische und/oder prophylaktische Effekt der Testverbindung unter Verwendung der Veränderungen in einzelnen Organen, Geweben oder Krankheitssymptomen in dem Säuger als Indikatoren geprüft werden.
Als ein Verfahren zum Behandeln des Testlebewesens mit einer Testverbindung kann orale Verabreichung, intravenöse Injektion oder dergleichen verwendet werden. Das Verfahren kann geeigneterweise in Abhängigkeit von den Symptomen des Testlebewesens, der Beschaffenheit der Testverbindung usw. ausgewählt sein. Dosisspiegel der Testverbindung können geeigneterweise unter Berücksichtigung des Verabreichungsverfahrens, der Beschaffenheit der Testverbindung usw. ausgewählt sein.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Absuchverfahrens erhältliche Verbindungen sind Verbindungen ausgewählt aus den vorstehend erwähnten Testverbindungen und haben einen therapeutischen und/oder prophylaktischen Effekt auf Krankheiten, die sich aus dem Mangel von oder Schädigung der erfindungsgemäßen DNA ergeben, z.B. Krankheiten, begleitet von Neurodegeneration, wie neurodegenerative Krankheiten [z.B. Alzheimer-Krankheit (familiäre Alzheimer-Krankheit, juvenile Alzheimer-Krankheit, sporadische Alzheimer-Krankheit usw.), Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntingon Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose usw.], Hirnfehlfunktionen (z.B. Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheit, epidurales Hämatom, subdurales Hämatom usw.), Krebsformen (z.B. Astrocytoma, Oligodendroglioma usw.), immunologische Krankheiten, Infektionen (z.B. Meningitis, Protozoiasis, Rickettsien-Infektionen, Metazoen-Infektionen, bakterielle oder virale Meningitis, wie Borna-Krankheit, postvaccinale Enzephalitis, AIDS-Enzephalo pathie usw.), Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheitsentwicklung. Deshalb können sie als Arzneimittel verwendet werden, die sicher sind und von niedriger Toxizität, z.B. als prophylaktische und/oder therapeutische Mittel für jene Krankheiten, die sicher und von niedriger Toxizität sind. Weiterhin können Verbindungen, die aus jenen Verbindungen, die durch das vorstehende Absuchen erhalten werden, induzierbar sind, ebenfalls in der gleichen Weise verwendet werden.
Die durch das vorstehende Absuchen erhaltene Verbindung kann in einer Salzform vorliegen. Als Salze für Verbindungen können Salze, gebildet mit physiologisch verträglichen Säuren (z.B. organische oder anorganische Säuren) oder Basen (z.B. Alkalimetalle), verwendet werden. Besonders bevorzugt sind physiologisch verträgliche Säureadditionssalze. Beispiele für solche Salze schließen Salze, gebildet mit anorganischen Säuren (z.B. Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure oder Schwefelsäure), und Salze, gebildet mit organischen Säuren (z.B. Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure, Oxalsäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure oder Benzolsulfonsäure), ein.
Arzneimittel, die die Verbindung oder ein Salz davon, erhalten durch Absuchen, umfassen, können in der gleichen Weise wie für Arzneimittel, die das erfindungsgemäße Polypeptid umfassen, beschrieben, hergestellt werden.
Da die so erhaltenen Zubereitungen sicher und von niederer Toxizität sind, können sie an z.B. Säuger (wie Mensch, Ratte, Maus, Meerschweinchen, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Katze, Hund, Affe usw.) verabreicht werden.
Die Dosierungsspiegel der vorstehend genannten Verbindung oder ein Salz davon können in Abhängigkeit von der Zielkrankheit, dem zu behandelnden Patienten, Verabreichungsweg usw. variieren. Wenn die Verbindung zum Behandeln von Alzheimer-Krankheit oral verabreicht wird, wird die Verbin dung im Allgemeinen an erwachsene Patienten (60 kg im Körpergewicht) bei einer Dosis von etwa 0,1 bis 100 mg/Tag, vorzugsweise etwa 1,0 bis 50 mg/Tag, bevorzugter etwa 1,0 bis 20 mg/Tag, verabreicht.
Bezüglich der parenteralen Verabreichung, wenn die Verbindung an erwachsene Patienten (60 kg im Körpergewicht) in Form einer Injektion zum Behandeln von Alzheimer-Krankheit verabreicht wird, ist es üblich, die Verbindung mit einer Dosis von etwa 0,01 bis 30 mg/Tag, vorzugsweise etwa 0,1 bis 20 mg/Tag und bevorzugter etwa 0,1 bis 10 mg/Tag, intravenös zu injizieren, obwohl die Dosis pro Verabreichung in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Patienten, der Zielkrankheit usw. variieren kann. Für Lebewesen können entsprechende Dosen nach Umwandlung der vorstehend erwähnten Werte pro 60 kg bezogen auf tatsächliche Körpergewichte verabreicht werden.
(8b) Verfahren zum Absuchen von Verbindungen, die die Promotoraktivität für die erfindungsgemäße DNA fördern oder hemmen
Die vorliegende Erfindung erlaubt ein Verfahren zum Absuchen nach Verbindungen oder Salzen davon, die die Promotoraktivität der erfindungsgemäßen DNA fördern oder hemmen, die gekennzeichnet ist durch Verabreichen einer Testverbindung an einen nicht menschlichen Säuger, der Mangel an der Expression der erfindungsgemäßen DNA aufweist, und Nachweisen der Expression von einem Reportergen.
In dem vorstehenden Absuchverfahren wird ein nicht menschlicher Säuger, der Mangel an Expression der erfindungsgemäßen DNA aufweist, verwendet, worin die erfindungsgemäße DNA im Ergebnis der Einführung von einem Reportergen inaktiviert wird, und dieses Reportergen kann unter der Kontrolle des Promotors der erfindungsgemäßen DNA exprimiert werden.
Als die Testverbindung können die wie vorstehend aufgezählten Verbindungen verwendet werden.
Als das Reportergen können wie vorstehend aufgezählte Gene verwendet werden. Unter allen kann β-Galactosidasegen (lacZ), lösliches Alkaliphosphatasegen oder Luciferasegen vorzugsweise verwendet werden.
Bei dem Nichthumansäuger mit Mangel bei der Expression von erfindungsgemäßer DNA, worin die erfindungsgemäße DNA gegen ein Reportergen ersetzt ist, kann, da das Reportergen unter der Steuerung des Promotors für die erfindungsgemäße DNA vorliegt, die Promotoraktivität durch Verfolgen der Expression der durch das Reportergen codierten Substanz nachgewiesen werden.
Wenn zum Beispiel ein Teil des DNA-Bereichs, der das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, mit E. coli-abgeleitetem β-Galactosidasegen (lacZ) ersetzt ist, wird β-Galactosidase exprimiert anstelle des erfindungsgemäßen Polypeptids in jenen Geweben, wo ursprünglich das erfindungsgemäße Polypeptid exprimiert wurde. Somit ist es durch Anfärben mit einem Substrat für β-Galactosidase, wie 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galactopyrasosidas (X-gal) möglich, den Zustand der In-vivo-Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids bei dem Säuger einfach zu beobachten. Insbesondere können Mäuse mit Mangel in dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder Gewebeabschnitten davon in Glutaraldehyd oder dergleichen fixiert werden, mit Phosphat-gepufferter physiologischer Salzlösung (PBS) gewaschen und mit einer Färbelösung, enthaltend X-gal, bei Raumtemperatur oder rund 37°C für etwa 30 min bis 1 h behandelt werden. Anschließend werden die Gewebeproben mit 1 mM ED-TA/PBS-Lösung gewaschen, um die β-Galactosidasereaktion zu beenden, gefolgt von Beobachtung der erhaltenen Farbentwicklung.
Alternativ kann mRNA-codierendes lacZ gemäß den üblichen Verfahren nachgewiesen werden.
Die Verbindungen oder Salze davon, die durch das vorstehend beschriebene Absuchen erhältlich sind, sind Verbindungen, die ausgewählt sind aus den vorstehend erwähnten Testverbindungen und die weder die Promotorwirkung der erfindungsgemäßen DNA fördern noch hemmen.
Die durch das vorstehende Absuchen erhaltene Verbindung kann in einer Salzform vorliegen. Als Salze für die Verbindung können Salze, gebildet mit physiologisch verträglichen Säuren (z.B. organische oder anorganische Säuren), oder Basen (z.B. Alkalimetalle) verwendet werden. Besonders bevorzugt sind physiologisch verträgliche Säureadditionssalze. Beispiele für solche Salze schließen Salze, gebildet mit anorganischen Säuren (z.B. Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure oder Schwefelsäure), und Salze, gebildet mit organischen Säuren (z.B. Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure, Oxalsäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure oder Benzolsulfonsäure), ein.
Da Verbindungen oder Salze davon, die die Promotoraktivität der erfindungsgemäßen DNA fördern, die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids fördern und dabei die Funktion davon fördern, sind sie als Arzneimittel verwendbar, z.B. als prophylaktische und/oder therapeutische Mittel, für Krankheiten, begleitet von Neurodegeneration, wie neurodegenerative Krankheiten [z.B. Alzheimer-Krankheit (familiäre Alzheimer-Krankheit, juvenile Alzheimer-Krankheit, sporadische Alzheimer-Krankheit usw.), Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntingon Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose usw.], Hirnfehlfunktionen (z.B. Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheit, epidurales Hämatom, subdurales Hämatom usw.), Krebsformen (z.B. Astrocytoma, Oligodendroglioma usw.), immunologische Krankheiten, Infektionen (z.B. Meningitis, Protozoiasis, Rickettsien-Infektionen, Metazoen-Infektionen, bakterielle oder virale Meningitis, wie Borna-Krankheit, postvaccinale Enzephalitis, AIDS-Enzephalopathie usw.), Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheitsentwicklung. Bevorzugter sind sie als prophylaktische und/oder therapeutische Mittel für Alzheimer-Krankheit verwendbar.
Weiterhin können jene Verbindungen, die aus von dem vorstehenden Absuchen erhaltenen Verbindungen induzierbar sind, auch in der gleichen Weise verwendet werden.
Arzneimittel, die die Verbindung oder ein Salz davon, erhalten durch Absuchen, umfassen, können in der gleichen Weise wie für Arzneimittel, umfassend das erfindungsgemäße Polypeptid oder ein Salz davon, hergestellt werden.
Da die so erhaltenen Zubereitungen sicher und von niederer Toxizität sind, können sie z.B. an Säuger (wie Ratte, Mensch, Maus, Meerschwein, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Katze, Hund, Affe usw.) verabreicht werden.
Die Dosisspiegel der vorstehend genannten Verbindung oder ein Salz davon können in Abhängigkeit von der Zielkrankheit, dem zu behandelnden Patienten, Verabreichungsweg usw. variieren. Wenn eine Verbindung, die die Promotoraktivität der erfindungsgemäßen DNA fördert, oral zum Behandeln von Alzheimer-Krankheit verabreicht wird, wird die Verbindung im Allgemeinen an erwachsene Patienten (60 kg im Körpergewicht) bei einer Dosis von etwa 0,1 bis 100 mg/Tag, vorzugsweise etwa 1,0 bis 50 mg/Tag, bevorzugter etwa 1,0 bis 20 mg/Tag, verabreicht. Bezüglich der parenteralen Verabreichung, ist es, wenn eine Verbindung, die die Promotoraktivität der erfindungsgemäßen DNA fördert, an erwachsene Patienten (60 kg im Körpergewicht) in Form einer Injektion zum Behandeln von Alzheimer-Krankheit verabreicht wird, üblich, die Verbindung bei einer Dosis von etwa 0,01 bis 30 mg/Tag, vorzugsweise etwa 0,1 bis 20 mg/Tag und bevorzugter etwa 0,1 bis 10 mg/Tag, intravenös zu injizieren, obwohl die Dosis pro Verabreichung in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Patienten, der Zielkrankheit usw. variieren kann. Für andere Lebewesen können entsprechende Dosen nach Umwandlung der vorstehend erwähnten Werte pro 60 kg, bezogen auf tatsächliche Körpergewichte, verabreicht werden.
Wenn andererseits eine Verbindung, die die Promotoraktivität der erfindungsgemäßen DNA hemmt, oral verabreicht wird, wird die Verbindung im Allgemeinen an erwachsene Pati enten mit Alzheimer-Krankheit (60 kg im Körpergewicht) bei einer Dosis von etwa 0,1 bis 100 mg/Tag, vorzugsweise etwa 1,0 bis 50 mg/Tag, bevorzugter etwa 1,0 bis 20 mg/Tag, verabreicht. Bezüglich der parenteralen Verabreichung, ist es, wenn eine Verbindung, die die Promotoraktivität der erfindungsgemäßen DNA hemmt, an erwachsene Patienten mit Alzheimer-Krankheit (60 kg im Körpergewicht) in Form einer Injektion verabreicht wird, üblich, die Verbindung bei einer Dosis von etwa 0,01 bis 30 mg/Tag, vorzugsweise etwa 0,1 bis 20 mg/Tag und bevorzugter etwa 0,1 bis 10 mg/Tag, intravenös zu injizieren, obwohl die Dosis pro Verabreichung in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Patienten, der Zielkrankheit usw. variieren kann. Für andere Lebewesen können entsprechende Dosen nach Umwandlung der vorstehend erwähnten Werte pro 60 kg, basierend auf den tatsächlichen Körpergewichten, verabreicht werden.
Somit ist der Nichthumansäugermangel bei der Expression der erfindungsgemäßen DNA äußerst verwendbar beim Absuchen von Verbindungen oder Salzen davon, die die Promotoraktivität der erfindungsgemäßen DNA fördern oder hemmen, und kann stark zu der Aufklärung der Ursachen von verschiedenen Krankheiten, die sich aus dem Mangel an der Expression der erfindungsgemäßen DNA ergeben, beitragen, z.B. Krankheiten begleitet von Neurodegeneration, wie neurodegenerative Krankheiten [z.B. Alzheimer-Krankheit (familiäre Alzheimer-Krankheit, juvenile Alzheimer-Krankheit, sporadische Alzheimer-Krankheit usw.), Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntingon Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose usw.], Hirnfehlfunktionen (z.B. Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheit, epidurales Hämatom, subdurales Hämatom usw.), Krebsformen (z.B. Astrocytoma, Oligodendroglioma usw.), immunologische Krankheiten, Infektionen (z.B. Meningitis, Protozoiasis, Rickettsien-Infektionen, Metazoen-Infektionen, bakterielle oder virale Meningitis, wie Borna-Krankheit, postvaccinale Enzephalitis, AIDS-Enzephalopathie usw.), Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheitsentwicklung oder für die Entwicklung von prophylaktischen und/oder therapeutischen Mitteln für solche Krankheiten.
In der Beschreibung und den Zeichnungen der vorliegenden Erfindung sind die für Basen (Nukleotide), Aminosäuren usw. verwendeten Abkürzungen jene, die durch die IUPAC-IUB-Commission on Biochemical Nomenclature gefördert werden, oder jene, die üblicherweise auf dem Fachgebiet verwendet werden. Beispiele für solche Abkürzungen werden nachstehend angegeben. Aminosäuren, die optische Isomere aufweisen können, sind vorgesehen, deren L-Isomer wiederzugeben, sofern nicht anders ausgewiesen.

DNA:: Desoxyribonucleinsäure
cDNA:: Komplementäre Desoxyribonucleinsäure
A:: Adenin
T:: Thymin
G:: Guanin
C:: Cytosin
RNA:: Ribonucleinsäure
mRNA:: Botenribonucleinsäure
dATP:: Desoxyadenosintriphosphat
dTFP:: Desoxythymidintriphosphat
dGTP:: Desoxyguanosintriphosphat
dCTP:: Desoxycytidintriphosphat
ATP:: Adenosintriphosphat
EDTA:: Ethylendiamintetraessigsäure
SDS:: Natriumdodecylsulfat
Gly:: Glycin
Ala:: Alanin
Val:: Valin
Leu:: Leucin
Ile:: Isoleucin
Ser:: Serin
Thr:: Threonin
Cys:: Cystein
Met:: Methionin
Glu:: Glutaminsäure
Asp:: Asparaginsäure
Lys:: Lysin
Arg:: Arginin
His:: Histidin
Phe:: Phenylalanin
Tyr:: Tyrosin
Trp:: Tryptophan
Pro:: Prolin
Asn:: Asparagin
Gln:: Glutamin
pGlu:: Pyroglutaminsäure

Die Substituenten, Schutzgruppen und Reagenzien, die häufig in der Beschreibung verwendet werden, werden durch die nachstehenden Abkürzungen wiedergegeben.

Me:: Methyl
Et:: Ethyl
Bu:: Butyl
Ph:: Phenyl
TC:: Thiazolidin-4(R)-carboxamid
Tos:: p-Toluolsulfonyl
CH: O: Formyl
Bzl:: Benzyl
Cl2-Bzl:: 2,6-Dichlorbenzyl
Bom:: Benzyloxymethyl
Z:: Benzyloxycarbonyl
Cl-Z:: 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
Br-Z:: 2-Brombenzyloxycarbonyl
Boc:: t-Butoxycarbonyl
DNP:: Dinitrophenol
Trt:: Trityl
Bum:: t-Butoxymethyl
Fmoc:: N-9-Fluorenylmethyloxycarbonyl
HOBt:: 1-Hydroxybenzotriazol
HOOBt:: 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin
HONB:: 1-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid
DCC:: N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
Pbf:: 2,2,4,6,7-Pentanthyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
tBu:: tertiär-Butyl
TFA:: Trifluoracetat
OHAt:: 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol
PyAop:: 7-Azabenzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)-phosphoniumhexafluorophosphat
DIPCDI:: 1,3-Diisopropylcarbodiimid
Fmoc-Leu-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OH:: (4S)-3-(Fmoc-Leu)-2,2,-Dimethyloxazolidin-4-carbonsäure)]

Die SEQ-ID-Nummern des SEQUENCE LISTING der vorliegenden Beschreibung geben wie nachstehend angezeigt die Sequenzen wieder.
[SEQ ID Nr. 1]
Diese zeigt die Nucleotidsequenz eines in Beispiel 1 verwendeten Primers.
[SEQ ID Nr. 2]
Diese zeigt die Nucleotidsequenz eines in Beispiel 1 verwendeten Primers.
[SEQ ID Nr. 3]
Diese zeigt die Nucleotidsequenz eines gemäß Beispiel 1 erhaltenen erfindungsgemäßen Polypeptids, das für eine DNA codiert.
[SEQ ID Nr. 4]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz von dem in Beispiel 1 erhaltenen erfindungsgemäßen Polypeptid.
[SEQ ID Nr. 5]
Diese zeigt die Nucleotidsequenz einer in Beispiel 1 verwendeten Query.
[SEQ ID Nr. 6]
Diese zeigt die Nucleotidsequenz der in Beispiel 1 erhaltenen DNA, umfassend SEQ ID Nr. 3.
[SEQ ID Nr. 7]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines Teilpeptids des erfindungsgemäßen Polypeptids (SEQ ID Nr. 4), erhalten in Beispiel 1.
[SEQ ID Nr. 8]
Diese zeigt die Nucleotidsequenz einer SEQ ID Nr. 7 codierenden DNA.
Die später beschriebene, in Beispiel 1 erhaltene Transformante Escherichia coli TOP10/pcDNA-hn3 wurde bei der International Patent Organism Depository, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology mit Sitz in Central 6, 1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Pref. (Zipcode-Nr.: 305-8566) seit 19. Juli 2001 unter der Zugangs-Nr. FERM BP-7674 und bei dem Institute for Fermentation, Osaka (IFO) mit Sitz in 17-85, jusanbonncho 2-chome, Yodogawaku, Osaka City, Osaka Pref. (Zipcode-Nr.: 532-8686) seit 3. Juli 2001 unter der Zugangs-Nr. IFO 16673 hinterlegt.
BEISPIELE
Hierin nachstehend wird die vorliegende Erfindung genauer mit Bezug auf die nachstehenden Beispiele beschrieben. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele begrenzt. Genetische Manipulationen unter Verwendung von E. coli wurden gemäß den in dem Buch „Molecular Cloning" beschriebenen Verfahren ausgeführt.
BEISPIEL 1
Datenbank GEMBLE wurde unter Verwendung des Human-Humanin-Gen-codierenden Bereichs als eine Query durchsucht. Im Ergebnis wurde gefunden, dass ein humaninartiger Genbereich, umfassend ein Startcodon und ein Beendigungscodon, beide im Genbereich des Humaningens, in der Sequenz der Zugangs-Nr. AL356135 vorliegt. Um zu bestätigen, dass dieses Gen tatsächlich vorliegt und dass dieses Gen transkribiert ist und funktioniert, haben die Erfinder eine cDNA durch Re verstranskription unter Verwendung von 1,0 μg menschlichem Ganzhirnpoly-A⁺-RNA (Clontech) als ein Templat, SuperScript-Reverstranskriptase (Gibco BRL) und gemäß den Vorschriften, die der Transkriptase beigefügt sind, Oligo(dT)primers, hergestellt. Dann wurden zwei Primer TACCCTAACCGTGCAAAGGTAGCATG (SEQ ID Nr. 1) und GTGGGCTTATTGGGTGTTGTTTGCATTGG (SEQ ID Nr. 2) stromaufwärts vom 5'-Ende bzw. stromabwärts vom 3'-Ende von der Humanin-artigen Sequenz in der Zugangs-Nr. AL356135 angeordnet aufgebaut, gefolgt von einem PCR in 20 μl von einer Reaktionslösung. Diese Reaktionslösung war aus der cDNA-Lösung als einem Templat in einer Menge, äquivalent 10 ng mRNA, 0,5 μM jeweils von den Primern, 2,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTP, 1/100-Volumen AmpliTaq Gold (Perkin Elmer) und 1/10-Volumen von zehnfachem AmpliTaq-Gold-Puffer, zusammengesetzt. Nach der ersten Denaturierung bei 95°C für 10 Minuten wurden 40 Zyklen bei 95°C für 15 s, bei 67°C für 15 s und bei 72°C für 15 s ausgeführt, gefolgt von einer letzten Verlängerung bei 72°C für 5 min. Die vergrößerte DNA in der erhaltenen Lösung wurde in Plasmidvektor pcDNA3,1/V5/His-TOPO unter Verwendung von eukaryotischem TOPO-TA-Klonierungskit (Invitrogen) subgeklont und dann in E. coli TOP10 eingeführt. Aus der erhaltenen Transformante wurde Plasmid-DNA unter Verwendung von QIA prep8 Mini Prep (Qiagen) gereinigt. Die Reaktionen zum Bestimmen der Nucleotidsequenz wurden unter Verwendung von BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (Perkin Elmer) ausgeführt und mit einem automatisierten Fluoreszenzsequenzer analysiert. Im Ergebnis wurde eine wie in SEQ ID Nr. 6 gezeigte Nukleotidsequenz erhalten, die den Codierungsbereich von der humaninartigen Sequenz (SEQ ID Nr. 3) umfasst, die bei der vorstehend beschriebenen Suche gefunden wurde. Somit wurde es bestätigt, dass dieses Gen in dem Humangesamthirn exprimiert ist.
Da diese Sequenz (SEQ ID Nr. 6) die volle Länge des Codierungsbereichs der humaninartigen Sequenz umfasst, wurde E. coli TOP10 mit dem vorstehend beschriebenen Plasmid trans formiert, um dabei Escherichia coli TOP 10/pcDNA-hn3 zu erhalten.
BEISPIEL 2
Ein Polypeptid, das die wie in SEQ ID Nr. 4 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, wird manchmal als ein „humaninartiges Peptid" bezeichnet.
Ein humaninartiges Peptid wurde wie nachstehend beschrieben hergestellt.
Es werden 0,25 mMol Fmoc-Thr(tBu)-O-Clt-Harz (0,527 mMol/g) [worin Fmoc-Thr(tBu)-OH in ein kommerzielles 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mMol/g) eingeführt wurde] in den Reaktor von einem Peptidsynthesizer ABI 433A gegeben und Festphasenpeptidsynthese wurde durch das Fmoc/DCC/HOBt-Verfahren ausgeführt. Als die Nebenkettenschutzgruppen für Fmoc-Aminosäuren wurde Pbf-Gruppe für Arg verwendet; Boc-Gruppe wurde für Lys verwendet; tBu-Gruppe wurde für Asp, Thr und Ser verwendet und Tr-Gruppe wurde für Cys verwendet. Andere Aminosäuren wurden ohne Seitenkettenschutzgruppen verwendet. Die Peptidkette wurde auf Position 13 der vorstehend erwähnten Sequenz (Thr) verlängert. Zu dem erhaltenen Fmochumaninartigen Peptid (13-24)-0-Clt-Harz wurde Fmoc-Leu-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OH (NOVA; Produkt-Nr. 05-20-1004) mit DIPCDI/HOAt eingeführt. Dann wurden Aminosäuren in der Reihenfolge von Leu bei Position 10 gegen das N-Terminale mit DCC/HOBt eingeführt, um dabei ein geschütztes Peptidharz von Interesse zu erhalten.
Dieses Harz (100 mg) wurde in einer gemischten Lösung (gesamt 1,5 ml) TFA, Thioanisol, m-Cresol, Wasser, Triisopropylsilan und Ethandithiol (80 : 5 : 5 : 5 : 2,5 : 2,5) bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden bewegt. Dann wurde Ether zu der Reaktionslösung gegeben, um weißes Pulver abzuscheiden. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert, gefolgt von Entfernung des Überstands. Diese Vorgänge wurden dreimal wiederholt. Der erhaltene Rückstand wurde mit Wasser extrahiert und dann lyophilisiert, um weißes Pulver zu erhalten. Das so er haltene rohe Peptid wurde präparativer HPLC unter Verwendung von YMC Pack R&D-ODS-5-B S-5, 120A-Säule (30 × 250 nm) unterzogen. Eine Konzentrationsgradientenelution vom linearen Typ (60 min) wurde unter Verwendung von mobiler Phase A (0,1 % TFA in Wasser) und mobiler Phase B (0,1 % TFA in Acetonitril) bei A/B-Verhältnissen von 78/22 bis 68/32 ausgeführt. Die das Peptid von Interesse enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, um 21,8 mg weißes Pulver zu erhalten.

ESI-MS: M⁺ 2692,8 (theoretischer Wert: 2692,5)
HPLC-Elutionszeit: 10,5 min
Elutionsbedingungen:
Säule YMC AM 301 (4,6 × 100 mm)
Mobile Phase A: 0,1 % TFA in Wasser; B: 0,1 % TFA in Acetonitril
A/B: 80/20 bis 30/70, Konzentrationsgradientenelution vom linearen Typ (25 min)
Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min

BEISPIEL 3
Inhibitoraktivität des humaninartigen Peptids gegen Glutaminsäure-induzierten Zelltod von rattenadrenaler Medul-1a-abgeleiteter Pheochromocytoma-Zelle PC12h PC12h-Zellen (bezogen von Prof. Hiroshi Hatanaka, Institute for Protein Research, Osaka University; Hatanaka, H., Brain Research 222: 225-233, 1981) wurden bei einer Dichte von 2 × 10⁴-Zellen/cm² in collagenbeschichteten 96-Vertiefungs-Platten (Iwaki), enthaltend Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (nachstehend als „DMEM"), enthaltend 10 % fötales Rinderserum und 5 % Pferdeserum, plattiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium gegen 100 μl DMEM, enthaltend 20 nM HE-PES (pH 7,5), ausgetauscht. Gleichzeitig wurden verschiedene Konzentrationen an dem humaninartigen Peptid, hergestellt in Beispiel 2 (SEQ ID Nr. 4) und Glutaminsäure, um eine Konzentration von 1 mM zu ergeben, hergestellt, die zu dem Medium gegeben wurden. Nach 72 h wurden die Zellen mit 100 μl phosphatgepufferter Salzlösung, enthaltend 0,2 % Tween 20, ly siert. Dann wurde die Lactatdehydrogenase(LDH)aktivität des Zellextrakts mit LDH-cytotoxischem Test WAKO (Wako Purechemical Industries) bestimmt.
Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt.
72 Stunden nach der Glutaminsäurebehandlung, während Zellüberlebensverhältnis 34,0 % in der Kurve mit nicht zugegebem humaninartigem Peptid war, wurden die Überlebensverhältnisse auf 59,3 % bzw. 74,6 % durch die Zugabe von dem humanartigen Peptid bei 1 μM und 10 μM verbessert. Hier sind Zellüberlebensverhältnisse definiert, indem man das Überleben in der mit nicht zugegebener Glutaminsäure-Kurve als 100 % ausgedrückt.
Aus diesen Ergebnissen wird klar, dass Glutaminsäure-induzierter Zelltod von rattenadrenaler Medulla-abgeleiteter Pheochromocytoma-Zelle PC12h durch das humaninartige Peptid gehemmt wird.
BEISPIEL 4
Herstellung von einem weiteren humaninartigen Peptid (19-24) (SEQ ID Nr. 7): Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Tlr Ein geschütztes Peptidharz mit der Sequenz von Interesse wurde unter Verwendung von Harz Fmoc-Thr(tBu)-O-Clt hergestellt und in der gleichen Weise wie vorstehend für das in Beispiel 3 hergestellte humaninartige Peptid gereinigt. Im Ergebnis wurden 29 mg weißes Pulver erhalten.

ESI-MS: M⁺ 756,5 (theoretischer Wert: 756,5)
HPLC-Elutionszeit: 10,2 min
Elutionsbedingungen:
Säule YMC AM 301 (4,6 × 100 mm)
Mobile Phase A: 0,1 % TFA in Wasser; B: 0,1 % TFA in Acetonitril
A/B: 80/20 bis 30/70, Konzentrationsgradientenelution vom linearen Typ (25 min)
Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Das erfindungsgemäße Polypeptid und das Polynukleotid können als ein diagnostisches, therapeutisches und/oder prophylaktisches Mittel für verschiedene Krankheiten verwendet werden, einschließlich Krankheiten begleitet von Neurodegeneration, wie neurodegenerative Krankheiten [z.B. Alzheimer-Krankheit (familiäre Alzheimer-Krankheit, juvenile Alzheimer-Krankheit, sporadische Alzheimer-Krankheit usw.), Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntingon Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose usw.], Hirnfehlfunktionen (z.B. Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheit, epidurales Hämatom, subdurales Hämatom usw.), Krebsformen (z.B. Astrocytoma, Oligodendroglioma usw.), immunologische Krankheiten, Infektionen (z.B. Meningitis, Protozoiasis, Rickettsien-Infektionen, Metazoen-Infektionen, bakterielle oder virale Meningitis, wie Borna-Krankheit, postvaccinale Enzephalitis, AIDS-Enzephalopathie usw.), Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheitsentwicklung oder als ein Zelltodinhibitor. Das erfindungsgemäße Polypeptid ist auch als ein Mittel zum Absuchen für jene Verbindungen oder Salze davon verwendbar, die die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids fördern oder hemmen. Da weiterhin Antikörper des erfindungsgemäßen Polypeptids das erfindungsgemäße Polypeptid spezifisch erkennen können, können sie beim Nachweis, quantitativer Bestimmung oder Neutralisation des erfindungsgemäßen Polypeptids in Probenlösungen verwendet werden und sind bei der Diagnose von verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krankheiten, begleitet von Neurodegeneration, wie neurodegenerative Krankheiten [z.B. Alzheimer-Krankheit (familiäre Alzheimer-Krankheit, juvenile Alzheimer-Krankheit, sporadische Alzheimer-Krankheit usw.), Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntingon Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose usw.], Hirnfehlfunktionen (z.B. Hirn infarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheit, epidurales Hämatom, subdurales Hämatom usw.), Krebsformen (z.B. Astrocytoma, Oligodendroglioma usw.), immunologische Krankheiten, Infektionen (z.B. Meningitis, Protozoiasis, Rickettsien-Infektionen, Metazoen-Infektionen, bakterielle oder virale Meningitis, wie Borna-Krankheit, postvaccinale Enzephalitis, AIDS-Enzephalopathie usw.), Gastrointestinalkrankheiten, Kreislaufkrankheiten und endokrine Krankheitsentwicklung verwendbar.
[Sequenz Listing]

Claims

Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 4 gezeigt, oder ein Amid, Ester oder Salz davon.
Polynukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz, die für das Polypeptid nach Anspruch 1 codiert.
Polynukleotid nach Anspruch 2, worin das Polynukleotid DNA ist.
Polynukleotid nach Anspruch 2, bestehend aus der Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr. 3 gezeigt.
Rekombinanter Vektor, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 2.
Transformante, transformiert mit dem rekombinanten Vektor nach Anspruch 5, jedoch ausschließlich eines Menschen, menschlicher Keimbahnzellen oder menschlicher Embryos.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach Anspruch 1 oder eines Amids, Esters oder Salzes davon, umfassend Züchten der Transformanten nach Anspruch 6 und Erlauben, dass das Polypeptid nach Anspruch 1 hergestellt und akkumuliert wird.
Antikörper, der spezifisch das Polypeptid nach Anspruch 1 als ein Antigen erkennt.
Polynukleotid, bestehend aus einer Nukleotidsequenz, die zu dem Polynukleotid nach Anspruch 2 komplementär ist.
Verfahren zum Absuchen nach Verbindungen oder Salzen davon, die die Inhibitorwirkung gegen Glutaminsäureinduzierten Zelltod des Polypeptids nach Anspruch 1 oder eines Amids, Esters oder Salzes davon fördern oder hemmen, wobei das Verfahren durch das Anwenden des Polypeptids nach Anspruch 1 oder eines Amids, Esters oder Salzes davon gekennzeichnet ist.
Kit zum Absuchen nach Verbindungen oder Salzen davon, die die Inhibitorwirkung gegen Glutaminsäure-induzierten Zelltod des Polypeptids nach Anspruch 1 oder eines Amids, Esters oder Salzes davon fördern oder hemmen, das das Polypeptid nach Anspruch 1 oder ein Amid, Ester oder Salz davon umfasst.
Prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen neurodegenerative Störungen oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom, umfassend das Polypeptid nach Anspruch 1 oder ein Amid, Ester oder Salz davon.
Prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen neurodegenerative Störungen oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 2.
Diagnostisches Mittel gegen neurodegenerative Störungen oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 2.
Diagnostisches Mittel gegen neurodegenerative Störungen oder Hirnfehlfunktion, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom, umfassend den Antikörper nach Anspruch 8.
Prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen neurodegenerative Störungen oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 9.
Diagnostisches Mittel gegen neurodegenerative Störungen oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralemn Hämatom, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 9.
Mittel nach Anspruch 12, das ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntington Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose, Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheiten, epidurales Hämatom oder subdurales Hämatom ist.
Mittel nach Anspruch 18, das ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen Alzheimer-Krankheit ist.
Mittel nach Anspruch 12 oder Anspruch 13 oder das ein Zelltodinhibitor ist.
Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 14, 16 oder 17, das ein diagnostisches Mittel gegen Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Down-Syndrom, amyotrophe Lateralsklerose, Prion-Krankheit, Creutzfeld-Jacob-Krankheit, Huntington Chorea, diabetische Neuropathie, multiple Sklerose, Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidale Blutung, ischämische Hirnkrankheiten, epidurales Hämatom oder subdurales Hämatom ist.
Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 1 oder eines Amids, Esters oder Salzes davon zum Herstellen eines prophylaktischen und/oder therapeutischen Mittels gegen neurodegenerative Krankheiten oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom.
Verwendung des Polynukleotids nach Anspruch 2 zum Herstellen eines prophylaktischen und/oder therapeutischen Mittels gegen neurodegenerative Krankheiten oder Hirnfehlfunktionen, ausgewählt aus Hirninfarkt, Hirnblutung, subarachnoidaler Blutung, ischämischer Hirnkrankheit, epiduralem Hämatom oder subduralem Hämatom.
Polypeptid mit einer hemmenden Wirkung gegen Glutaminsäure-induzierten Zelltod und bestehend aus der wie in SEQ ID Nr. 4 gezeigten Aminosäuresequenz, oder ein Amid, Ester oder Salz davon.