DE60217711T2 - Ptp10d nukleinsäuren und peptide in der regulation von energie-homeostase - Google Patents

Ptp10d nukleinsäuren und peptide in der regulation von energie-homeostase Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die PTP10D oder homologe Proteine kodieren, und die davon kodierten Polypeptide und deren Verwendung und die Verwendung von Effektoren davon bei der Behandlung von Fettsucht sowie verwandten Erkrankungen wie beispielsweise Essstörungen, Abmagerung, Diabetes mellitus, Hypertonie, koronare Herzerkrankung, Hypercholesterinämie, und Dyslipidämie.
  • Es gibt mehrere Stoffwechselkrankheiten des menschlichen und tierischen Stoffwechsels, z. B. Fettsucht und schwerer Gewichtsverlust, die in Zusammenhang mit einem Energieungleichgewicht stehen, bei dem die Kalorienzufuhr im Ungleichgewicht zum Energieverbrauch steht. Fettsucht ist eine der häufigsten Stoffwechselstörungen weltweit. Es handelt sich dabei um eine noch immer kaum verstandene menschliche Erkrankung, die für die westliche Gesellschaft immer relevanter wird. Fettsucht ist definiert als ein um 20% über dem Idealgewicht liegendes Körpergewicht, was häufig zu einer signifikanten Verschlechterung der Gesundheit führt. Weitere Parameter zur Definition von Fettsucht sind Taillenumfang, Hautfaltendicke und Bioimpedanz (siehe unter anderem Kopelman (1999), supra). Fettsucht geht mit einem erhöhten Risiko für kardiovaskuläre Erkrankung, Hypertonie, Diabetes, Hyperlipidämie und einer erhöhten Sterblichkeitsrate einher. Abgesehen von den hohen Krankheitsrisiken sind die an Fettsucht leidenden Personen häufig sozial isoliert.
  • Fettsucht des Menschen wird stark von umweltbedingten und genetischen Faktoren beeinflusst, wobei der Umwelteinfluss häufig eine Hürde für die Identifizierung (humaner) Gene für Fettsucht ist. Fettsucht wird von genetischen, metabolischen, biochemischen, psychologischen und verhaltensbedingten Faktoren beeinflusst. Es handelt sich dabei um eine an sich komplexe Störung, gegen die an mehreren Fronten angegangen werden muss, um ein dauerhaftes positives klinisches Ergebnis zu erhalten. Fettleibige Per sonen sind anfällig für Krankheiten wie: Diabetes mellitus, Hypertonie, koronare Herzkrankheit, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis, Gallensteine, Karzinome der Fortpflanzungsorgane und Schlafapnoe.
  • Fettsucht gilt nicht als einzelne Störung, sondern als eine heterogene Gruppe von Zuständen mit (potenziellen) mehreren Ursachen. Fettsucht ist außerdem gekennzeichnet von einem erhöhten Nüchternplasmainsulin und einer übertriebenen Insulinantwort auf orale Glukosezufuhr (Koltermann, J. Clin. Invest 65, 1980, 1272-1284), und es kann eine deutliche Beteiligung von Fettsucht an Typ-2-Diabetesmellitus bestätigt werden (Kopelman, Nature 404, 2000, 635-643).
  • Hyperlipidämie und eine Erhöhung der freien Fettsäuren korrelieren eindeutig mit dem „metabolischen Syndrom", das als die Verknüpfung zwischen mehreren Krankheiten, einschließlich Fettsucht und Insulinresistenz, definiert ist. Diese findet häufig bei ein und demselben Patienten statt und ist ein Hauptrisikofaktor für die Entwicklung von Typ-2-Diabetes und kardiovaskuläre Erkrankung. Es wurde vorgeschlagen, dass die Kontrolle des Lipidspiegels und des Glukosespiegels erforderlich ist, um Typ-2-Diabetes, Herzkrankheit und andere Fälle eines metabolischen Syndroms zu behandeln (siehe beispielsweise Santomauro A. T. et al., (1999) Diabetes, 48(9): 1836-1841).
  • Obgleich mehrere Kandidatengene beschrieben worden sind, welche das homöostatische System bzw. die homöostatischen Systeme, die Körpermasse/-gewicht regulieren, beeinflussen sollen, wie beispielsweise Leptin, VCPI, VCPL oder der Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptor-Gamma-Coaktivator, sind die speziellen molekularen Mechanismen und/oder Moleküle, die Fettsucht oder die Regulierung von Körpergewicht/Körpermasse beeinflussen, nicht bekannt.
  • Das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, war daher, Mittel und Verfahren bereitzustellen, um (pathologische) metabolische Zustände zu modulieren, die die Körpergewichtregulierung und/oder ho möostatische Energieschaltkreise beeinflussen. Die Lösung des technischen Problems wird erreicht, indem die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen bereitgestellt werden.
  • Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Gene mit neuartigen Funktionen bei der Körpergewichtregulierung, der Energiehomöostase, des Stoffwechsels und von Fettsucht. Die vorliegende Erfindung beschreibt spezifische Gene, die an der Regulierung von Körpergewicht, Energiehomöostase, Stoffwechsel und Fettsucht beteiligt sind und daher an damit zusammenhängenden Störungen wie dem Essstörungen, Abmagerung, Diabetes mellitus, Hypertonie, koronarer Herzerkrankung, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis, Gallensteinen, Krebs, z. B. Karzinomen der Fortpflanzungsorgane, und Schlafapnoe. Die vorliegende Erfindung beschreibt insbesondere das humane PTP10D-Gen als an den oben erwähnten Zuständen beteiligt.
  • Der Begriff „Polynukleotid, umfassend die Nukleotidsequenz wie gezeigt in GenBank-Zugangsnummer" bezieht sich auf das exprimierbare Gen der Nukleotidsequenzen, die unter der entsprechenden GenBank-Zugangsnummer abgelegt sind. Der Begriff „GenBank-Zugangsnummer" bezieht sich auf NCBI-GenBank-Datenbankeinträge (Bezugsquelle: Benson et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28: 15-18).
  • Kinasen und Phosphatasen regulieren viele verschiedene Abläufe bei der Proliferation, Differenzierung und Signalübertragung von Zellen durch Hinzufügen und Entfernen von Phosphatgruppen an bzw. von Proteinen. Reversible Proteinphosphorylierung ist die Hauptstrategie für die Steuerung von Aktivitäten eukaryontischer Zellen. Schätzungsweise sind mehr als 1000 der 10.000 in einer typischen Säugerzelle aktiven Proteine phosphoryliert. Das energiereiche Phosphat, das die Aktivierung antreibt, wird im Allgemeinen von Adenosintriphosphatmolekülen (ATP) durch Proteinkinasen auf ein bestimmtes Protein übertragen und von diesem Protein durch Proteinphosphatasen entfernt. Die Phosphorylierung erfolgt als Reaktion auf extrazelluläre Signale (Hormone, Neurotransmitter, Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, etc.), Zellzykluskontrollpunkte und umwelt- oder ernährungsbedingte Belastungen und entspricht in etwa dem Einschalten eines molekularen Schalters. wird der Schalter eingeschaltet, aktiviert die jeweilige Proteinkinase ein Stoffwechselenzym, ein regulatorisches Protein, einen Rezeptor, ein Zytoskelettprotein, einen Ionenkanal oder eine Ionenpumpe oder einen Transkriptionsfaktor. Unkontrollierte Signalübertragung wurde bei verschiedenen Krankheitszuständen impliziert, beispielsweise Entzündung, Krebs, Arteriosklerose und Psoriasis.
  • Tyrosinphosphatasen:
  • Proteintyrosinphosphorylierung hat sich als evolutionär konservierter Mechanismus erwiesen, der für die Regulierung zahlreicher zellulärer Ereignisse essenziell ist, einschließlich Zellwachstum, Gewebedifferenzierung und – stoffwechsel (Walton K. M. and Dixon J. E., (1993) Annu Rev Biochem 62: 101-120; Li L. and Dixon J. E., (2000) Semin Immunol. 12 (1): 75-84). Im menschlichen Genom sind mehrere hundert Proteintyrosinphosphatasen (hierin bezeichnet als PTP) kodiert, die in verschiedene Klassen unterteilt sind. Je nach der subzellulären Lokalisierung sind PTPs klassifiziert als rezeptorähnlich oder intrazellulär. Rezeptorähnliche PTPs enthalten eine Transmembrandomäne, eine rezeptorähnliche extrazelluläre Domäne und in der Regel zwei intrazelluläre PTP-Domänen. Nur wenige Rezeptor-PTPs enthalten nur eine intrazelluläre PTP-Domäne (z. B. Drosophila PTP10D und humanes PTPRB). Kennzeichen der extrazellulären Domäne werden verwendet, um Rezeptor-PTPs weiter in fünf verschiedene Arten einzuteilen (Mourey R. J. and Dixon, J. E., (1994) Curr Opin Genet
    Dev 4 (1): 31-39). Drosophila PTP10D enthält beispielsweise eine Reihe extrazellulärer fibronektinähnlicher Wiederholungen und immunglobulinähnliche Wiederholungen und gehört zu Typ-III-Rezeptor-PTPs. Die einzige bekannte Funktion von Drosophila PTP10D ist eine Beteiligung an der Kontrolle der Axonsteuerung während der Embryonalentwicklung (Sun Q. et al., (2000) Development 127: 801-812; Kraut R. et al., (2001) Curr Biol 11: 417-430). Für PTP10D oder sein menschliches Homolog wurde keine Funktion bei der Regulierung des Stoffwechsels berichtet.
  • WO 01/57190 beschreibt die cDNA-Sequenz von PTPRB (SEQ ID 499), einem PTP10D-Protein, seine Funktion als Proteintyrosinphosphatase, sein (rekombinantes) Polypeptid, einen dagegen gerichteten Antikörper, Expressionsvektoren, transgene Tiere und Untersuchungsverfahren.
  • EP-A-1046715 beschreibt die Verwendung von Polynukleotiden (cDNA: SEQ ID 3) oder Polypeptiden (SEQ ID 4) von humanem PTP beta (= PTPRB, einem PTP10D-Protein) für die Diagnose und Hemmung von Tumorwachstum. Erwähnt sind auch Antikörper und Antisense-Moleküle gegen humanes PTP beta. Ein Überwachungsassay mit humanem PTP beta und Tie-2 ist beschrieben, bei dem die Kinaseaktivität von Tie-2 gemessen wird. Humanes PTP-beta und Tie-2 treten miteinander in Wechselwirkung.
  • Bislang wurde nicht beschrieben, dass PTP10D oder die humanen homologen Proteine an der Regulierung von Energiehomöostase und der Regulierung von Körpergewicht und verwandten Störungen beteiligt sind, und daher sind keine Funktionen bei den Stoffwechselkrankheiten und anderen Krankheiten, wie oben aufgeführt, erörtert worden. In dieser Erfindung zeigen wir, dass die korrekte Gendosis von PTP10D für die Aufrechterhaltung der Energiehomöostase essenziell ist. Mittels einer genetischen Untersuchung wurde identifiziert, dass eine Mutation eines zu PTP10D homologen Gens Fettsucht verursacht, was sich an einem signifikanten Anstieg des Triglyzeridgehalts zeigte, dem Hauptenergiespeichersubstanz.
  • Polynukleotide, die Proteine mit Homologien zu PT-P10D kodieren, sind geeignet, um Krankheiten und Störungen, wie oben beschrieben, zu untersuchen. Des Weiteren sind neue Zusammensetzungen bereitgestellt, die für die Dia gnose, Behandlung und Prognose von Krankheiten und Störungen, wie oben beschrieben, geeignet sind.
  • Bevor die vorliegenden Proteine, Nukleotidsequenzen und Verfahren beschrieben werden, versteht sich, dass diese Erfindung nicht auf die jeweils beschriebenen Verfahrensweisen, Protokolle, Zelllinien, Vektoren und Reagenzien beschränkt ist, da diese variieren können. Es versteht sich auch, dass die hierin verwendete Terminologie nur für den Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen bestimmt ist und nicht dafür, den Umfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken, die nur von den beiliegenden Ansprüchen beschränkt wird. Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von einem durchschnittlichen Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, üblicherweise verstanden wird. Es können zwar alle Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent sind wie die hierin beschriebenen, bei der Ausübung oder Testung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, aber es werden nun die bevorzugten Verfahren, Vorrichtungen und Materialien beschrieben. Aller hierin erwähnten Veröffentlichungen sind hierin durch Bezugnahme enthalten, um die Zelllinien, Vektoren und Verfahrensweisen zu beschreiben und zu offenbaren, die in den Veröffentlichungen berichtet sind, welche in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden können. Hierin ist nichts als Zugeständnis zu verstehen, dass die Erfindung nicht berechtigt wäre, solche Beschreibungen vorwegzunehmen.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt, dass PTP10D oder homologe Proteine die Energiehomöostase und den Fettstoffwechsel regulieren, vor allem den Stoffwechsel und die Speicherung von Triglyzeriden, und Polynukleotide, welche die in dieser Erfindung beschriebenen Proteine identifizieren und kodieren. Die Erfindung betrifft ferner Vektoren, Wirtszellen, Antikörper und Rekombinationsverfahren zum Herstellen der Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung dieser Sequenzen bei der Diagnose, Untersuchung, Prävention und Behandlung von Krankheiten und Störungen, beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Stoffwechselkrankheiten wie Fettsucht sowie verwandte Störungen wie das Essstörung, Abmagerung, Diabetes mellitus, Hypertonie, koronare Herzkrankheit, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis, Gallensteine, Krebs, z. B. Karzinome der Fortpflanzungsorgane, und Schlafapnoe.
  • PTP10D oder homologe Proteine und Nukleinsäuremoleküle, die diese kodieren, können aus Insekten- oder Wirbeltierarten erhalten werden, z. B. Säugern oder Vögeln. Besonders bevorzugt sind homologe Nukleinsäuren, insbesondere Nukleinsäuren, die für ein humanes RPTP-beta-Protein oder ein PTP10D-ähnliches Mausprotein kodieren.
  • In dieser Erfindung bezeichnen wir insbesondere die Proteintyrosinphosphatase 10D (bezeichnet als PTP10D) und auf PTP10D-homologe Proteine (beispielsweise Proteintyrosinphosphatase, Rezeptortyp, Beta (PTPRB oder RPTP beta), welche homologe Polypeptide von Drosophila und Säugern, vorzugsweise des Menschen, umfasst, oder Proteine oder Sequenzen, die solche Proteine kodieren, als erfindungsgemäße Proteine. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind: Drosophila PTP10D (Gadfly-Zugangsnummer CG1817), humanes PTPRB (Genbank-Zugangsnummer XM_006789.7 für die cDNA (SEQ ID NO: 3, siehe 8A), Genbank-Zugangsnummer XP_006789.4 für das Protein (SEQ ID NO: 4, siehe 8B) und Rezeptortyp-Proteintyrosinphosphatase der Maus (Genbank-Zugangsnummer AF157628 für die cDNA, Genbank-Zugangsnummer AAF80346 für das Protein).
  • Die Erfindung betrifft insbesondere ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches zur Regulierung der Energiehomöostase und dem Stoffwechsel von Triglyzeriden beiträgt, wobei das Nukleinsäuremolekül Folgendes umfasst:
    • (a) Die Nukleotidsequenz, die ein erfindungsgemäßes Protein kodiert, und/oder eine dazu komplementäre Sequenz,
    • (b) Eine Nukleotidsequenz, die bei 50°C in einer Lösung, die 1 x SSC und 0, 1% SDS enthält, an eine Sequenz von (a) hybridisiert,
    • (c) eine Sequenz, die mit den Sequenzen von (a) oder (b) innerhalb der Degeneration des genetischen Codes korrespondiert,
    • (d) eine Sequenz, die ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens 85%, vorzugsweise zu mindestens 90%, mehr bevorzugt zu mindestens 95%, mehr bevorzugt zu mindestens 98% und bis zu 99,6 zu der Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Proteins identisch ist,
    • (e) eine Sequenz, die sich von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (d) durch Mutation unterscheidet und wobei die Mutation eine Abänderung, Deletion, Verdopplung und/oder einen vorzeitigen Stopp des kodierten Polypeptids verursacht, oder
    • (f) eine partielle Sequenz einer beliebigen der Nukleotidsequenzen von (a) bis (e) mit einer Länge von mindestens 15 Basen, vorzugsweise mindestens 20 Basen, mehr bevorzugt mindestens 25 Basen und am meisten bevorzugt mindestens 50 Basen.
  • Die Erfindung beruht auf dem Befund, dass die Proeine der Erfindung und die Polynukleotide, die sie kodieren, an der Regulierung der Triglyzeridspeicherung und daher der Energiehomöostase beteiligt sind. Die Erfindung beschreibt die Verwendung dieser Proteine und Polynukleotide oder Fragmente davon und deren Effektoren, z. B. Antikörper, Aptamere, Antisense-Moleküle, RNAi-Moleküle, Ribozyme, Peptide oder niedermolekulare organische Verbindungen oder andere Rezeptoren, welche die Polynukleotide oder das Polypeptid erkennen, für die Diagnose, Untersuchung, Prävention oder Behandlung von damit in Zusammenhang stehenden Krankheiten und Störungen, einschließlich Stoffwechselkrankheiten wie beispielsweise Fettsucht sowie verwandte Störungen wie das metabolische Syndrom, Essstörung, Abmagerung, Diabetes mellitus, Hypertonie, koronare Herzkrankheit, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis, Gallensteine, Krebs, z. B. Karzinome der Fortpflanzungsorgane, und Schlafapnoe.
  • Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Gene mit neuartigen Funktionen bei der Körpergewichtsregulierung, Energiehomöostase, Metabolismus und Fettsucht. Um Gene mit neuartigen Funktionen bei Energiehomöostase, Metabolismus und Fettsucht zu finden, wurde eine funktionelle genetische Untersuchung mit dem Modellorganismus Drosophila melanogaster (Meigen) durchgeführt. Drosophila melanogaster ist einer der am intensivsten untersuchten Organismen in der Biologie und dient als Modellsystem für das Studium vieler Entwicklungs- und Zellprozesse, die höheren Eukaryonten gemeinsam sind, einschließlich dem Menschen (siehe beispielsweise Adams et al., (2000) Science 287: 2185-2195). Der Erfolg von Drosophila melanogaster als Modellorganismus begründet sich hauptsächlich durch die Stärke vorwärts gerichteter genetischer Untersuchungen zur Identifizierung der Gene, die an einem biologischen Prozess beteiligt sind (siehe Johnston (2002) Nat Rev Genet 3: 176-188; Rorth, (1996) Proc Natl Acad Sci U S A 93: 12418-12422). Eine Untersuchungsquelle war eine proprietäre Drosophila melanogaster-Stammkollektion von EP-Linien. Der P-Vektor dieser Kollektion hat Gal4-UAS-Bindungsstellen fusioniert mit einem basalen Promotor, der bei Bindung von Gal4 and UAS-Stellen benachbarte genomische Drosophila-Sequenzen transkribieren kann. Dadurch kann die Kollektion von EP-Linien endogene flankierende Gensequenzen überexprimieren. Darüber hinaus bewirkt eine Integration des EP-Elements in das Gen, ohne Aktivierung der UAS-Stellen, wahrscheinlich eine Reduktion der Genaktivität und gestattet die Bestimmung seiner Funktion durch Bestimmung des Phänotyps bei Funktionsverlust („Loss-of-function-Phänotyp").
  • Triglyzeride sind die wirksamsten Energiespeicher in Zellen und sind bei fettleibigen Menschen signifikant vermehrt. In dieser Erfindung haben wir eine genetische Untersuchung angewandt, um Mutationen von Genen zu identifi zieren, die die Proteine der Erfindung kodieren, und homologe Gene, die Veränderungen des Körpergewichtes verursachen, was sich an einer wesentlichen Änderung des Triglyzeridspiegels zeigt. Zur Isolierung von Genen mit einer Funktion bei der Energiehomöostase wurden mehrere Tausend proprietäre und öffentlich verfügbare EP-Linien nach einem längeren Fütterungszeitraum auf ihren Triglyzeridgehalt getestet (siehe Beispiele für ausführlichere Angaben). Linien mit signifikant erhöhtem Triglyzeridgehalt wurden als positive Kandidaten für zukünftige Analysen ausgewählt.
  • In dieser Erfindung wurde der Triglyzeridgehalt eines Pools von Fliegen mit demselben Genotyp sechs Tage lang nach dem Füttern mithilfe eines Triglyzeridassays analysiert, wie beispielsweise unten im Abschnitt mit den Beispielen ausführlicher erläutert ist, den Umfang der Erfindung aber nicht einschränken soll. Die Veränderung des Triglyzeridgehalts aufgrund des Verlustes einer Genfunktion deutet auf Genaktivitäten bei der Energiehomöostase in dosisabhängiger Weise hin, welche die als Triglyzeride gespeicherte Energiemenge kontrollieren.
  • Das Ergebnis der Analyse des Triglyzeridgehalts ist in 5 gezeigt. Wir haben festgestellt, das hemizygote PX7194.1-Fliegen einen höheren Triglyzeridgehalt aufweisen als die Kontrollen (durchschnittlicher Triglyzeridgehalt). Der Verlust der Aktivität eines Gens an den Genloci, an denen sich die EP-Vektoren integriert haben, ist also für Veränderungen des Stoffwechsels der Energiespeichertriglyzeride verantwortlich, was in allen Fällen ein Modell der Fettsucht bei der Fliege darstellte. Der Anstieg des Triglyzeridgehalts infolge des Verlustes einer Genfunktion deutet auf Genaktivitäten bei der Energiehomöostase in dosisabhängiger Weise hin, welche die als Triglyzeride gespeicherte Energiemenge kontrollieren.
  • Nukleinsäuren, welche die Proteine der vorliegenden Erfindung kodieren, wurden mit einer iPCR-Technik identifiziert. Es wurden genomische DNA-Sequenzen isoliert, da direkt 5' zu den EP-Vektoren lokalisiert sind (hier PX7194.1- Integration). Unter Verwendung dieser isolierten genomischen Sequenzen wurden öffentliche Datenbanken wie das Berkeley Drosophila Genome Project (GadFly, siehe auch Fly-Base (1999) Nucleic Acids Research 27: 85-88) durchsucht, wodurch die homozygoten oder hemizygoten lebensfähigen oder heterozygoten Integrationsstellen der Vektoren in die Transkriptionseinheiten der Gene identifiziert wurden. 6 zeigt die molekulare Organisation dieses Genlokus.
  • Die erfindungsgemäßen Proteine, homologen Proteine und Nukleinsäuremoleküle, die diese kodieren, können aus Insekten- oder Wirbeltierarten erhalten werden, z. B. Säugern oder Vögeln. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, welche die humanen Homologe der erfindungsgemäßen Proteine kodieren. Die vorliegende Erfindung beschreibt Polypeptide, welche die Aminosäuresequenzen der erfindungsgemäßen Proteine umfassen. Es wurden Vergleiche (ClustalX 1.8-Analyse oder ClustalW 1.82-Analyse, siehe beispielsweise Thompson J. D. et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22 (22): 4673-4680; Thompson J. D., (1997) Nucleic Acids Res 25 (24): 4876-4882; Higgins, D. G. et al., (1996) Methods Enzymol. 266: 383-402) zwischen den entsprechenden Proteinen der verschiedenen Arten (Mensch und Drosophila) durchgeführt. Ausgehend von der Homologie dürften die Drosophila-Proteine der Erfindung und jedes homologe Protein oder Peptid mindestens gewisse Aktivität teilen. Aus dem Stand der Technik sind für die erfindungsgemäßen Gene keine funktionellen Daten verfügbar, welche die Regulierung der Körpergewichtskontrolle und verwandter Stoffwechselkrankheiten wie Fettsucht und Diabetes beschreiben.
  • Untersuchungen des Expressionsprofils (siehe Beispiele für nähere Einzelheiten) bestätigen die besondere Relevanz des Proteins PTPR als Regulator des Energiestoffwechsels bei Säugern.
  • Die Erfindung umfasst auch Polynukleotide, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren. Entsprechend kann jede Nukleinsäuresequenz, welche die Aminosäuresequenzen eines erfindungsgemäßen Proteins kodiert, verwendet werden, um rekombinante Moleküle zu erzeugen, die ein erfindungsgemäßes Protein exprimieren. In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Erfindung das Polynukleotid, das ein erfindungsgemäßes Protein von Drosophila oder des Menschen kodiert. Von einem Fachmann wird anerkannt, dass als ein Ergebnis der Degeneration des genetischen Codes viele Nukleotidsequenzen hergestellt werden können, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, wobei einige minimale Homologie zu den Nukleotidsequenzen beliebiger bekannter und natürlich vorkommender Gene aufweisen. Die Erfindung zieht darin jede und alle möglichen Varianten von Nukleotidsequenzen in Betracht, die hergestellt werden können, indem Kombinationen ausgehend von der möglichen Codonauswahl ausgewählt werden. Diese Kombinationen werden in Übereinstimmung mit dem genetischen Triplett-Standardcode vorgenommen, angewandt auf die Nukleotidsequenzen natürlich vorkommender erfindungsgemäßer Proteine, und alle solche Varianten sind als spezifisch beschrieben zu betrachten. Obgleich Nukleotidsequenzen, welche die erfindungsgemäßen Proteine und deren Varianten kodieren, vorzugsweise in der Lage sind, an die Nukleotidsequenzen der natürlich vorkommenden erfindungsgemäßen Proteine unter angemessen ausgewählten Stringenzbedingungen zu hybridisieren, kann es von Vorteil sein, Nukleotidsequenzen zu produzieren, welche die erfindungsgemäßen Proteine oder deren Derivate kodieren, die eine wesentlich andere Codonverwendung besitzen. Codons können ausgewählt sein, um die Rate zu erhöhen, bei der die Expression des Peptid in einem bestimmten prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt in Übereinstimmung mit der Häufigkeit, mit der bestimmte Codons von dem Wirt genutzt werden, stattfindet. Andere Gründe dafür, die Nukleotidsequenz, welche ein erfindungsgemäßes Protein oder seine Derivate kodiert, zu verändern, ohne die kodierten Aminosäuresequenzen zu verändern, umfassen die Produktion von RNA-Transkripten mit wünschenswerteren Eigenschaften, beispielsweise eine längere Halbwertszeit als die der aus den natürlich auftretenden Sequenzen produzierten Transkripte.
  • Die Erfindung umfasst auch die Produktion von DNA-Sequenzen oder Anteilen davon, welche die erfindungsgemäßen Protein und ihre Derivate kodieren, vollständig durch Synthesechemie. Nach der Produktion kann die synthetische Sequenz in einen der vielen verfügbaren Expressionsvektoren und Zellsystemen eingefügt werden, wobei Reagenzien zur Anwendung kommen, die aus dem Stand der Technik zum Zeitpunkt der Einreichung dieser Anmeldung gut bekannt sind. Darüber hinaus kann Synthesechemie verwendet werden, um Mutationen in eine Sequenz einzuführen, die ein erfindungsgemäßes Protein oder einen beliebigen Anteil davon kodiert.
  • Die Erfindung umfasst außerdem Polynukleotidsequenzen, die unter verschiedenen Stringenzbedingungen an die beanspruchten Nukleotidsequenzen hybridisieren können, und insbesondere solche Polynukleotide, die ein erfindungsgemäßes Protein kodieren. Hybridisierungsbedingungen beruhen auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäurebindungskomplexes bzw. der Sonde, wie gelehrt von Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987: Methods Enzymol. 152: 399-407) und Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152: 507-511), und können bei einer definierten Stringenz verwendet werden. Eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen bedeutet vorzugsweise, dass nach Waschen für 1 Std. mit 1 x SSC und 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, mehr bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1 Std. in 0,2 x SSC und 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, mehr bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Veränderte Nukleinsäuresequenzen, die die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, die in der Erfindung enthalten sind, umfassen Deletionen, Insertionen oder Substitutionen verschiedener Nukleotide, was zu einem Polynukleotid führt, welches dasselbe oder ein funktionell gleichwertiges erfindungsgemäßes Protein kodiert.
  • Die kodierten Proteine können auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten enthalten, welche eine stumme Veränderung herstellen und zu einem funktionell gleichwertigen erfindungsgemäßen Protein führen. Auf der Basis einer Ähnlichkeit der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Art der Reste können absichtliche Aminosäuresubstitutionen vorgenommen werden, so lange die biologische Aktivität des Proteins erhalten bleibt. Beispielsweise können negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure umfassen, positiv geladene Aminosäuren können Lysin und Arginin umfassen und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophilie-Werten können Leucin, Isoleucin und Valin, Glycin und Alanin, Asparagin und Glutamin, Serin und Threonin, Phenylalanin und Tyrosin umfassen. Darüber hinaus betrifft die Erfindung Peptidfragmente der Proteine oder Derivate davon, wie beispielsweise zyklische Peptide, Retro-Inverso-Peptide oder Peptidmimetika mit einer Länge von mindestens 4, vorzugsweise mindestens 6 und bis zu 50 Aminosäuren.
  • Auch enthalten im Umfang der vorliegenden Erfindung sind Allele der Gene, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren. Wie hierin verwendet handelt es sich bei einem „Allel" oder einer „Allelsequenz" um eine alternative Form des Gens, die aus mindestens einer Mutation der Nukleinsäuresequenz resultieren kann. Allele können zu veränderten mRNAs oder Polypeptiden führen, deren Struktur oder Funktion verändert sein können oder nicht. Jedes bestimmte Gen kann keine, eine oder viele allelische Formen aufweisen. Häufige Mutationsveränderungen, aus denen Allele entstehen, werden im Allgemeinen natürlichen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Nukleotiden zugeschrieben. Jeder dieser Veränderungstypen kann alleine oder in Kombination mit den anderen einmal oder mehrmals in einer bestimmten Sequenz stattfinden.
  • Die Nukleinsäuresequenzen, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, können verlängert werden, indem eine besondere Nukleotidsequenz verwendet wird und verschiedene aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren angewandt werden, um stromaufwärts gelegene (Upstream)-Se quenzen wie beispielsweise Promotoren und regulatorische Elemente festzustellen. Beispielsweise verwendet ein Verfahren, das angewandt werden kann, die „Restriktionsstellen-PCR", universelle Primer, um unbekannte Sequenzen neben einem bekannten Lokus zu erhalten (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2: 318-322). Es kann auch eine inverse PCR verwendet werden, um Sequenzen unter Anwendung divergenter Primer ausgehend von einer bekannten Region zu amplifizieren oder zu verlängern (Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 8186).
  • Ein anderes Verfahren, das verwendet werden kann, ist Capture-PCR, welche die PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten neben einer bekannten Sequenz in humaner DNA und Yeast-Artificial-Chromosome-DNA umfasst (Lagerstrom, M. et al. (PCR Methods Applic. 1: 111-119)). Ein anderes Verfahren, das verwendet werden kann, um unbekannte Sequenzen zu erhalten, ist das von Parker, J. D. et al. (1991; Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060). Darüber hinaus können PCR, Nested-Primer und PROMOTERFINDER-Bibliotheken verwendet werden, um genomische DNA abzuwandern (Clontech, Palo Alto, Kalif., USA). Dieser Prozess vermeidet die Notwendigkeit zur Untersuchung von Bibliotheken und ist nützlich, um Intron/Exon-Kontaktstellen zu finden.
  • Zur Expression biologischer aktiver Proteine können die Nukleotidsequenzen, welche die erfindungsgemäßen Proteine oder funktionelle Äquivalente kodieren, optional in Form von Fusionsproteinen, in geeignete Expressionsvektoren eingefügt werden, d. h. in einen Vektor, der die erforderlichen Elemente für die Transkription und Translation der eingefügten Kodierungssequenz enthält. Es können Verfahren verwendet werden, die einem Fachmann gut bekannt sind, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die Sequenzen enthalten, welche. ein erfindungsgemäßes Protein und geeignete Transkriptions- und Translationskontrollelemente kodieren. Solche Verfahren umfassen DNA-Rekombinationstechniken in vitro, synthetische Techniken und genetische Rekombination in vivo. Solche Techniken sind beschrieben in Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., und Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., USA.
  • Regulatorische Elemente umfassen beispielsweise einen Promotor, ein Initiationscodon, ein Stopp-Codon, ein Element, das die mRNA-Stabilität reguliert und ein Polyadenylierungssignal. Die Expression eines Polynukleotids lässt sich sicherstellen durch (i) konstitutive Promotoren wie beispielsweise die Promotor/Enhancer-Region des Zytomegalievirus (ZMV), (ii) gewebespezifische Promotoren wie dem Insulinpromotor (siehe Soria et al., 2000, Diabetes 49: 157), den SOX2-Genpromotor (siehe Li et al., 1998, Curr. Biol. 8: 971-4), den Msi-1-Promotor (siehe Sakakibara et al., 1997, J. Neuroscience 17: 8300-8312), den Promotor der schweren Kette von Alpha-Kardiomyosin oder den Promotor des humanen atriellen natriuretischen Faktors (Klug et al., 1996, J. Clin. Invest 98: 216-24; Wu et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 6472-79) oder (iii) induzierbare Promotoren wie beispielsweise das Tetrazyklin-induzierbare System. Expressionsvektoren können auch ein Selektionsmittel oder ein Markergen enthalten, welches Antibiotikaresistenz verleiht, beispielsweise die Neomycin-, Hygromycin- oder Puromycinresistenzgene. Solche Verfahren umfassen DNA-Rekombinationstechniken in vitro, synthetische Techniken und genetische Rekombination in vivo. Solche Techniken sind beschrieben in Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., und Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., USA. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können natürliche, modifizierte oder rekombinante Nukleinsäuresequenzen, welche die Proteine der Erfindung und homologe Proteine kodieren, mit einer heterologen Sequenz ligiert werden, um ein Fusionsprotein zu kodieren.
  • Es können verschiedene Expressionsvektor-/Wirtsysteme verwendet werden, um Sequenzen zu enthalten und zu exprimieren, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren. Dazu gehören, aber nicht ausschließlich, Mikroorganismen wie Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen-, Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformiert sind, Hefen, die mit Hefeexpressionsvektoren transformiert sind, Insektenzellsysteme, die mit Virusexpressionsvektoren (z. B. Bakulovirus, Adenovirus, adenoassoziiertes Virus, Lentivirus, Retrovirus) transformiert sind, Pflanzenzellsysteme, die mit Virusexpressionsvektoren (z. B. Blumenkohl-Mosaik-Virus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (z. B. Ti oder PBR322-Plasmiden) transformiert sind, oder tierische Zellsysteme.
  • Das Vorhandensein von Polynukleotidsequenzen, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, lässt sich durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung und/oder Amplifizierung anhand von Sonden oder Anteilen oder Fragmenten von Polynukleotiden feststellen, die ein erfindungsgemäßes Protein kodieren. Assays auf der Basis von Nukleinsäureamplifizierung umfassen die Verwendung von Oligonukleotiden oder Oligomeren auf der Basis der für das erfindungsgemäße Protein spezifischen Sequenzen und Nukleinsäuren, um Transformanden zu erkennen, die DNA oder RNA enthalten, die das erfindungsgemäße Protein kodieren. Wie hierin verwendet, bezieht sich „Oligonukleotide" oder „Oligomere" auf eine Nukleinsäuresequenz von mindestens etwa 10 Nukleotiden und bis zu etwa 60 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 15 bis 30 Nukleotiden und mehr bevorzugt etwa 20-25 Nukleotiden, die als Sonde oder Amplimer verwendet werden kann.
  • Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Protokolle für die Feststellung und Messung der Expression der erfindungsgemäßen Proteine unter Verwendung von für das Protein spezifischen polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern bekannt. Beispiele umfassen ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay), RIA (Radioimmunoassay) und FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting). Ein zweiseitiger Immunassay auf der Basis monoklonaler Antikörper, die gegen zwei nicht wechselwirkende Epitope auf den erfindungsgemäßen Proteinen reaktiv sind, ist bevorzugt, aber es kann auch ein kompetitiver Bindungsassay verwendet werden. Diese und andere Assays sind unter Anderem beschrieben in Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn.) und Maddox, D. E, et al. (1983; J. Exp. Med. 158: 1211-1216).
  • Einem Fachmann ist eine breite Vielzahl von Markern und Konjugationstechniken bekannt, die in verschiedenen Nukleinsäure- und Aminosäureassays verwendet werden können. Mittel zum Herstellen markierter Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zur Erkennung von Sequenzen, die mit Polynukleotiden verwandt sind, welche ein erfindungsgemäßes Protein kodieren, umfassen Oligo-Labeling, Nick-Translation, End-Labeling oder PCR-Amplifizierung mit einem markierten Nukleotid oder enzymatische Synthese. Diese Verfahren können unter Verwendung einer Vielzahl handelsüblicher Kits durchgeführt werden (Pharmacia & Upjohn, (Kalamazoo, Mich.); Promega (Madison Wis.); und U.S. Biochemical Corp., (Cleveland, Ohio, USA).
  • Geeignete Reportermoleküle oder Marker, die verwendet werden können, umfassen Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende, chemilumineszente oder chromogene Stoffe sowie Substrate, Cofaktoren, Hemmstoffe, Magnetteilchen und dergleichen.
  • Wirtszellen, die mit Nukleotidsequenzen transformiert sind, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, können unter Bedingungen kultiviert werden, die für die Expression und Wiedergewinnung des Proteins aus der Zellkultur geeignet sind. Das von einer rekombinanten Zelle hergestellte Protein kann sezerniert werden oder intrazellulär vorliegen, je nach der Sequenz und/oder dem verwendeten Vektor. Wie einem Fachmann bekannt ist, können Expressionsvektoren entwickelt werden, die Polynukleotide enthalten, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren und Signalsequenzen enthalten, welche die Sekretion des Proteins durch eine prokaryontische oder eukaryontische Zellmembran veranlassen. Andere rekombinante Konstruktionen können verwendet werden, um Sequenzen, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, mit einer Nukleotidsequenz zu verbinden, die eine Polypeptiddomäne kodiert, welche die Reinigung löslicher Proteine ermöglicht. Solche Domänen, welche die Reinigung ermöglichen, umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Metallchelat-bildende Peptide wie Histidin-Tryptophan-Module, die eine Reinigung auf immobilisierten Metallen zulassen, Protein-A-Domänen, die eine Reinigung auf immobilisiertem Immunglobulin zulassen, und die im FLAG-Extensions/Affinitätsreinigungssystem (Immunex Corp., Seattle, Wash., USA) verwendete Domäne. Der Einbau spaltbarer Linkersequenzen, wie die, die für Faktor XA oder Enterokinase spezifisch sind (Invitrogen, San Diego, Kalif., USA), zwischen der Reinigungsdomäne und den erfindungsgemäßen Proteinen kann verwendet werden, um die Reinigung zu vereinfachen. Ein solcher Expressionsvektor ermöglicht die Expression eines Fusionsproteins, das die erfindungsgemäßen Proteine und eine Nukleinsäure enthält, welche 6 Histidinreste kodiert, die einer Thioreduxin- oder einer Enterokinasespaltungsstelle vorausgehen. Die Histidinreste ermöglichen Reinigung mittels IMIAC (immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie, wie beschrieben in Porath, J. et al. (1992, Prot. Exp. Purif. 3: 263-281)), während die Enterokinasespaltungsstellen ein Mittel zum Reinigen der erfindungsgemäßen Proteine von dem Fusionsprotein bieten. Eine Erläuterung von Vektoren, die Fusionsproteine enthalten, befindet sich in Kroll, D. J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12: 441-453). Außer durch rekombinante Produktion können Fragmente der erfindungsgemäßen Proteine durch direkte Peptidsynthese unter Anwendung von Festphasentechniken hergestellt werden (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154). Proteinsynthese lässt sich anhand von manuellen Techniken oder durch Automatisierung durchführen. Eine automatisierte Synthese lässt sich beispielsweise durch Verwendung des Applied Biosystems 431A Peptidsynthesegeräts (Perkin Elmer) erreichen.
  • Verschiedene Fragmente der erfindungsgemäßen Proteine können chemisch getrennt synthetisiert und durch chemische Verfahren kombiniert werden, um das Volllängenmolekül zu erhalten.
  • Therapeutika
  • Die in dieser Erfindung beschriebenen Daten zeigen, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und Proteine und deren Effektormoleküle für therapeutische Anwendungen geeignet sind, die bei Stoffwechselstörungen indiziert sind, wie beispielsweise bei Fettsucht sowie bei verwandten Störungen wie beispielsweise dem metabolischen Syndrom, Essstörung, Abmagerung, Diabetes mellitus, Hypertonie, koronarer Herzerkrankung, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie. Therapeutische Anwendungsgebiete für die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und Proteine sind daher beispielsweise, aber nicht ausschließlich: (i) Proteintherapeutika, (ii) Zielantikörper (therapeutische Antikörper, diagnostische Antikörper, Antikörper, die gegen einen Wirkstoff gerichtet sind/zytotoxische Antikörper), (iii) Gentherapie (Genverabreichung/Genablation) und (iv) Geweberegeneration in vitro und in vivo (Regeneration all solcher Gewebe und Zelltypen, aus denen diese Gewebe zusammengesetzt sind, und aus diesen Geweben gewonnener Zelltypen).
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und Proteine sind für therapeutische Anwendungen geeignet, die bei verschiedenen Anwendungsgebieten, wie unten beschrieben, impliziert sind. Beispielsweise können cDNAs, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, und insbesondere ihre humanen Homologe, bei der Gentherapie eingesetzt werden, und die erfindungsgemäßen Proteine und insbesondere ihre humanen Homologe können nützlich sein, wenn sie einem Individuum verabreicht werden, das einen diesbezüglichen Bedarf aufweist. Als nicht einschränkendes Beispiel sind die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von Patienten wirksam, die beispielsweise, jedoch nicht ausschließlich, an Stoffwechselstörungen wie oben beschrieben leiden.
  • In einem Aspekt können beispielsweise Antikörper, die für ein erfindungsgemäßes Protein spezifisch sind, direkt als Antagonist oder indirekt als Targeting- oder Abgabemechanismus verwendet werden, um einen pharmazeutischen Stoff zu Zellen oder Geweben zu bringen, welche das Protein exprimieren. Die Antikörper können unter Anwendung von aus dem Stand der Technik gut bekannten Verfahren erzeugt werden. Solche Antikörper umfassen, jedoch nicht ausschließlich, polyklonale, monoklonale, chimäre, einzelkettige Antikörper, Fab-Fragmente oder Fragmente, die von einer Fab-Expressionsbibliothek produziert werden. Neutralisierende Antikörper (d. h. solche, die die Bildung von Dimeren hemmen) sind für den therapeutischen Gebrauch besonders bevorzugt.
  • Für die Produktion von Antikörpern können verschiedene Wirte, einschließlich Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mäuse, Menschen und Andere durch Injektion mit einem erfindungsgemäßen Protein oder einem beliebigen Fragment oder Oligopeptid davon, das immunogene Eigenschaften hat, immunisiert werden. Je nach Art des Wirts können verschiedene Adjuvanzien verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken. Es ist bevorzugt, dass die zur Induktion von Antikörpern verwendeten Peptide, Fragmente oder Oligopeptide eine Aminosäuresequenz aufweisen, die aus mindestens fünf Aminosäuren und mehr bevorzugt mindestens 10 Aminosäuren besteht.
  • Monoklonale Antikörper gegen ein erfindungsgemäßes Protein können mit jeder Technik erzeugt werden, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur ermöglicht. Dazu gehören, jedoch nicht ausschließlich, die Hybridomatechnik, die humane B-Zell-Hybridoma-Technik und die EBV-Hybridoma-Technik (Köhler, G. et al. (1975) Nature 256: 495-497; Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81: 31-42; Cote, R. J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030; Cole, S. P. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62: 109-120).
  • Darüber hinaus können Techniken, die für die Produktion von „chimären Antikörpern" entwickelt wurden, das Splicing von Mausantikörpergenen zu humanen Antikörpergenen, zum Erhalt eines Moleküls mit geeigneter Antigenspezifität und biologischer Aktivität verwendet werden (Morrison, S. L. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-6855; Neuberger, M. S. et al. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda, S. et al. (1985)• Nature 314: 452-454). Alternativ können unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren Techniken angepasst werden, die für die Produktion einzelkettiger Antikörper beschrieben worden sind, um einzelkettige Antikörper zu produzieren, die für ein erfindungsgemäßes Protein spezifisch sind. Antikörper mit verwandter Spezifität, aber von distinkter idiotypischer Zusammensetzung, können erzeugt werden, indem eine Mischung von Ketten (Chain-Shuffling) aus zufälligen kombinatorischen Immunglobulinbibliotheken durchgeführt wird (Burton, D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 11120-3). Antikörper können auch hergestellt werden, indem in vivo eine Produktion in der Lymphozytenpopulation induziert wird oder indem rekombinante Immunglobulinbibliotheken oder Panels hoch spezifischer Bindungsreagenzien, wie in der Literatur (Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833-3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299) beschrieben, durchsucht werden.
  • Es können auch Antikörperfragmente erzeugt werden, die spezifische Bindungsstellen für ein erfindungsgemäßes Protein enthalten. Beispielsweise umfassen solche Fragmente, jedoch nicht ausschließlich die F(ab')2-Fragmente, die durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls erzeugt werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken von F(ab')2-Fragmenten erzeugt werden können. Alternativ können Fab-Expressionsbibliotheken konstruiert werden, um eine schnelle und einfache Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente mit der gewünschten Spe zifität zu ermöglichen (Huse, W. D. et al. (1989) Science 254: 1275-1281).
  • Es können verschiedene Immunassays für ein Screening verwendet werden, um Antikörper mit der gewünschten Spezifität zu identifizieren. Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Protokolle für kompetitive Bindungsassays und immunradiometrische Assays unter Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern mit festgelegten Spezifitäten bekannt. Solche Immunassays umfassen typischerweise die Messung der Komplexbildung zwischen einem erfindungsgemäßen Protein und seinem spezifischen Antikörper. Ein zweiseitiger Immunassay auf der Basis monoklonaler Antikörper, die gegen zwei nicht wechselwirkende Epitope auf einem erfindungsgemäßen Protein reaktiv sind, ist bevorzugt, aber es kann auch ein kompetitiver Bindungsassay verwendet werden (Maddox, oben).
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die Polynukleotide, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, oder Fragmente davon oder Nukleinsäureeffektormoleküle wie beispielsweise Antisense-Moleküle, Aptamere, RNAi-Moleküle oder Ribozyme für therapeutische Zwecke verwendet werden. In einem Aspekt können Aptamere, d. h. Nukleinsäuremoleküle, die an ein erfindungsgemäßes Protein binden und seine Aktivität modulieren können, mit einem Screening- und Auswahlverfahren erzeugt werden, das die Verwendung kombinatorischer Nukleinsäurebibliotheken umfasst.
  • In einem weiteren Aspekt können in Situationen, in denen es wünschenswert wäre, die Transkription der mRNA zu blockieren, Antisense-Moleküle der ein erfindungsgemäßes Protein kodierenden Polynukleotide verwendet werden. Insbesondere können Zellen mit Sequenzen transformiert werden, die zu Polynukleotiden komplementär sind, welche ein erfindungsgemäßes Protein kodieren. Antisense-Moleküle können daher verwendet werden, um Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine zu modulieren oder eine Regulierung der Genfunktion zu erreichen. Eine solche Technologie ist nun aus dem Stand der Technik gut bekannt, und Sense- oder Antisense-Oligomere oder größere Fragmente können von verschiedenen Stellen entlang den Kodierungs- oder Kontrollregionen von Sequenzen aus, welche die Proteine kodieren, entworfen werden. Für die Abgabe von Nukleotidsequenzen an das Zielorgan, Zielgewebe oder die Zielzellpopulation können Expressionsvektoren, die von Retroviren, Adenoviren, Herpes- oder Vakziniaviren oder von verschiedenen bakteriellen Plasmiden abgeleitet sind, verwendet werden. Zur Konstruktion von rekombinanten Vektoren, die Antisense-Moleküle exprimieren, welche zu den Polynukleotiden des Gens, welches ein erfindungsgemäßes Protein kodiert, komplementär sind, können verfahren verwendet werden, die einem Fachmann gut bekannt sind. Diese Techniken sind sowohl in Sambrook et al. (oben) als auch in Ausubel et al. (oben) beschrieben. Gene, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, können abgeschaltet werden, indem eine Zelle oder ein Gewebe mit Expressionsvektoren transformiert wird, welche hohe Mengen eines Polynukleotids oder eines Fragments davon exprimieren, welche ein erfindungsgemäßes Protein kodieren. Solche Konstrukte können verwendet werden, um nicht translatierbare Sense- oder Antisense-Sequenzen in eine Zelle einzuführen. Selbst ohne Integration in die DNA können solche Vektoren fortfahren, RNA-Moleküle zu transkribieren, bis sie von endogenen Nukleasen deaktiviert werden. Transiente Expression kann bei einem nicht replizierenden Vektor einen Monat oder länger andauern, und noch länger, wenn geeignete Replikationselemente Teil des Vektorsystems sind.
  • Wie oben erwähnt, lassen sich Modifikationen der Genexpression erhalten, indem Antisense-Moleküle, z. B. DNA, RNA oder PNA, zu den Kontrollregionen der Gene, d. h. den Promotoren, Enhancern und Introns, entworfen werden. Oligonukleotide, die von der Transkriptionsinitiationsstelle abgeleitet sind, z. B. zwischen Position –10 und +10 ausgehend von der Startstelle, sind bevorzugt. Entsprechend lässt sich mit „Dreifach-Helix"-Basenpaarungsverfahren eine Hemmung erreichen. Dreifach-Helix-Paarung ist geeignet, da sie die Fähigkeit der Doppelhelix hemmt, sich ausreichend für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen Molekülen zu öffnen. Kürzliche therapeutische Fortschritte unter Verwendung von Triplex-DNA sind in der Literatur beschrieben (Gee, J. E. et al. (1994) in; Huber, B. E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., USA). Die Antisense-Moleküle können auch entworfen werden, um die Translation von mRNA zu blockieren, indem sie verhindern, dass das Transkript an Ribosome bindet.
  • Ribozyme, enzymatische RNA-Moleküle, können ebenfalls verwendet werden, um die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Die Mechanismen der Ribozymwirkung umfassen sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an komplementäre Ziel-RNA, gefolgt von endonukleolytischer Spaltung. Beispiele, die verwendet werden können, umfassen gentechnisch hergestellte Ribozymmoleküle mit Hammerhead-Motiv, welche die endonukleolytische Spaltung von Sequenzen, welche ein erfindungsgemäßes Protein kodieren, spezifisch und effizient katalysieren. Spezifische Ribozymspaltungsstellen in einem beliebigen potenziellen RNA-Zielmolekül werden zunächst identifiziert, indem das Zielmolekül auf Ribozymspaltungsstellen gescannt wird, die folgende Sequenzen umfassen: GUA, GUU und GUC. Nach der Identifizierung können kurze RNA-Sequenzen mit 15 bis 20 Ribonukleotiden, die der Region des Zielgens mit der Spaltungsstelle entsprechen, auf sekundäre Strukturmerkmale untersucht werden, welche das Oligonukleotid inoperabel machen. Die Eignung von Kandidatenzielmolekülen kann auch geprüft werden, indem die Zugänglichkeit für eine Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden unter Verwendung von Ribonukleaseschutzassays getestet wird.
  • Nukleinsäureeffektormoleküle, z. B. Antisense-Moleküle und Ribozyme der Erfindung können mit jedem aus dem Stand der Technik für die Synthese von Nukleinsäuremolekülen bekannten Verfahren hergestellt werden. Dazu gehören Techniken für die chemische Synthese von Oligonukleotiden, wie beispielsweise chemische Festphasen-Phosphoramidit-Synthese. Alternativ können RNA-Moleküle durch In-vitro- und In-vivo-Transkription von DNA-Sequenzen hergestellt werden, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren. Solche DNA-Sequenzen können in verschiedene Vektoren mit geeigneten RNA-Polymerasepromoteren, wie beispielsweise T7 oder SP6, eingebaut werden. Alternativ können diese cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, in Zelllinien oder Gewebe eingeführt werden. RNA-Moleküle können modifiziert werden, um intrazelluläre Stabilität und Halbwertszeit zu erhöhen. Mögliche Modifikationen umfassen, jedoch nicht ausschließlich die Addition flankierender Sequenzen am 5'- und/oder 3'-Ende des Moleküls oder die Verwendung von Phosphorothioat- oder 2'-O-Methyl- anstelle von Phosphodiesterase-Verknüpfungen im Molekülgerüst. Dieses Konzept der Produktion von PNAs eigen und lässt sich bei all diesen Molekülen durch den Einbau nicht klassischer Basen wie beispielsweise Inosin, Queosin und Wybutosin sowie acetyl-, methyl-, thio- und ähnlich modifizierter Formen von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin, die von endogenen Endonukleasen nicht einfach erkannt werden, erweitern.
  • Es sind viele Verfahren zum Einführen von Vektoren in Zellen oder Gewebe verfügbar und gleichermaßen zur Anwendung in vivo, in vitro und ex vivo geeignet. Für eine Therapie ex vivo können Vektoren in Stammzellen eingeführt werden, die dem Patienten entnommen und klonal für eine autologe Transplantation zurück in denselben Patienten propagiert worden sind. Die Verabreichung durch Transfektion und durch Liposomeninjektion kann anhand von Verfahren erreicht werden, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind. Es kann jedes beliebige der oben beschriebenen therapeutischen Verfahren bei jedem beliebigen geeigneten Individuum angewandt werden, einschließlich beispielsweise bei Säugern wie Hunden, Katzen, Kühen, Pferden, Kaninchen, Affen und am meisten bevorzugt beim Menschen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Herstellung eines Medikamentes für die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für einen beliebigen der oben erläuterten therapeutischen Effekte. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können ein erfindungsgemäßes Protein, Antikörper gegen ein erfindungsgemäßes Protein, Mimetika, Agonisten, Antagonisten oder Hemmstoffe eines erfindungsgemäßen Proteins, aufweisen. Die Zusammensetzungen können alleine oder in Kombination mit mindestens einem anderen Mittel, wie beispielsweise einer stabilisierenden Verbindung, verabreicht werden, welche in jedem sterilen, biologisch verträglichen pharmazeutischen Trägerstoff verabreicht werden kann, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose und Wasser. Die Zusammensetzungen können dem Patienten alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln, Wirkstoffen oder Hormonen gegeben werden. Die in dieser Erfindung verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf beliebige Weise verabreicht werden, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, auf oralem, intravenösem, intramuskulärem, intra-arteriellem, intramedullärem, intrathekalem, intraventrikulärem, transdermalem, subkutanem, intraperitonealem, intranasalem, enteralem, topilalem, sublingualem oder rektalem Weg.
  • Außer den aktiven Inhaltsstoffen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch annehmbare Trägerstoffe enthalten, welche Exzipienten und Hilfsstoffe aufweisen, welche die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu Zubereitungen, die pharmazeutisch verwendbar sind, ermöglichen. Darüber hinaus sind Einzelheiten über Techniken zu Formulierungen und Verabreichung in der jüngsten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA, USA) zu finden. Pharmazeutische Zusammensetzungen für die orale Gabe können unter Verwendung von pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffen, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, in für die orale Verabreichung geeigneter Dosis formuliert sein. Solche Trägerstoffe ermöglichen, dass die pharmazeutischen Zusammensetzungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Schlämmen, Suspensionen und dergleichen zur Einnahme seitens des Patienten formuliert werden.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf eine Weise hergestellt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt ist, z. B. durch herkömmliche Misch-, Auflösungs-, Granulations-, Drageeherstellungs-, Verreibungs-, Emulgierungs-, Verkapselungs-, Einschluss- oder Lyophilisierungsprozesse. Nach dem Herstellen pharmazeutischer Zusammensetzungen können sie in einen geeigneten Behälter platziert und für die Behandlung eines indizierten Zustands gekennzeichnet werden. Zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Proteine würde eine solche Kennzeichnung Menge, Häufigkeit und Verabreichungsweg enthalten.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für den erfindungsgemäßen Gebrauch geeignet sind, umfassen Zusammensetzungen, bei denen die aktiven Inhaltsstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um den beabsichtigten Zweck zu erreichen. Die Festlegung einer wirksamen Dosis liegt im Kompetenzbereich eines Fachmanns. Die therapeutisch wirksame Dosis kann für jede Verbindung zunächst entweder in Zellkulturassays, z. B. an Präadipozytenzelllinien, oder in Tiermodellen, in der Regel an Mäusen, Kaninchen, Hunden oder Schweinen, eingeschätzt werden. Das Tiermodell kann auch verwendet werden, um den geeigneten Konzentrationsbereich und den Verabreichungsweg festzulegen. Solche Informationen können dann verwendet werden, um geeignete Dosen und Verabreichungswege für Menschen zu bestimmen. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf die Menge eines aktiven Inhaltsstoffes, beispielsweise einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Proteins oder von Fragmenten davon oder Antikörpern, die zur Behandlung eines bestimmten Zustandes wirksam ist. Therapeutische Wirksamkeit und Toxizität können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren ermittelt werden, z. B. ED50 (die Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist) und LD50 (die Dosis, die für 50% der Population letal ist). Das Dosisverhältnis zwischen therapeutischen und toxischen Wirkungen ist der therapeutische Index, der als Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden kann. Pharmazeutische Zusammensetzungen mit hohen therapeutischen Indizes sind bevorzugt. Die aus den Zellkulturassays und Tierstudien erhaltenen Daten werden zur Formulierung eines Dosisbereichs für den Gebrauch beim Menschen verwendet. Die in solchen Zusammensetzungen enthaltene Dosis liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs zirkulierender Konzentrationen, der den ED50-Wert mit wenig oder keiner Toxizität einschließt. Die Dosierung variiert innerhalb dieses Bereichs je nach der angewandten Dosisform, der Empfindlichkeit des Patienten und der Verabreichungsart. Die exakte Dosis wird vom Praktiker unter Berücksichtigung von Faktoren in Verbindung mit dem Individuum, das eine Behandlung benötigt, festgelegt. Dosis und Verabreichung werden angepasst, um ausreichende Mengen der aktiven Einheit bereitzustellen oder um den gewünschten Effekt aufrechtzuerhalten. Zu berücksichtigende Faktoren umfassen das Krankheitsstadium, die allgemeine Gesundheit des Individuums, Alter, Gewicht und Geschlecht des Individuums, Ernährung, Zeit und Häufigkeit der Verabreichung, Wirkstoffkombination(en), Reaktionsempfindlichkeiten und Verträglichkeit/Ansprechen auf die Therapie.
  • Langwirkende pharmazeutische Zusammensetzungen können je nach Halbwertszeit und Clearancerate der jeweiligen Formulierung alle 3 bis 4 Tage, jede Woche oder einmal alle zwei Wochen verabreicht werden. Normale Dosismengen können, je nach Verabreichungsweg, von 0,1 bis 100.000 Mikrogramm bis zu einer Gesamtdosis von etwa 1 g variieren. Leitlinien in Bezug auf die jeweiligen Dosierungen und Verabreichungsverfahren sind in der Literatur angegeben und einem praktizierenden Fachmann verfügbar. Ein Fachmann verwendet für Nukleotide andere Formulierungen als für Proteine oder deren Hemmstoffe. Entsprechend ist die Verabreichung von Polynukleotiden oder Polypeptiden spezifisch für die jeweiligen Zellen, Bedingungen, Orte, etc.
  • Die Nukleinsäuren, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, können verwendet werden, um transgene Zelllinien und Tiere zu erzeugen. Diese transgenen nicht humanen Tiere sind bei der Untersuchung der Funktion und Regulierung der erfindungsgemäßen Proteine in vivo nützlich. Transgene Tiere, insbesondere transgene Säuger, können als Modellsystem für die Untersuchung vieler entwicklungsbedingter und zellulärer Prozesse, die dem Menschen eigen sind, dienen. Es können viele verschiedene nicht humane Modelle für Stoffwechselstörungen verwendet werden, um Modulatoren des erfindungsgemäßen Proteins zu testen. Fehlexpression (beispielsweise Überexpression oder Mangel an Expression) des erfindungsgemäßen Proteins, besondere Fütterungsbedingungen und/oder Verabreichung biologisch aktiver Verbindungen können Modelle für Stoffwechselstörungen schaffen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung verwenden solche Assays Mausmodelle für Insulinresistenz und/oder Diabetes, wie beispielsweise Mäuse mit Gen-Knockouts im Leptin-Signalweg (beispielsweise ob (Leptin)- oder db (Leptinrezeptor)-Mäuse). Solche Mäuse entwickeln typische Symptome eines Diabetes, weisen eine Lipidansammlung in der Leber auf und häufig erhöhte Plasmalipidspiegel (siehe Bruning et al, 1998, Mol. Cell. 2: 449-569). Anfällige Wildtypmäuse (beispielsweise C57Bl/6) zeigen ähnliche Symptome, wenn sie eine fetthaltige Nahrung erhalten. Außer zur Testung der Expression der erfindungsgemäßen Proteine in solchen Mausstämmen (siehe BEISPIEL 4) können diese Mäuse auch verwendet werden um zu testen, ob die Verabreichung eines Kandidatenmodulators beispielsweise die Lipidansammlung in der Leber, im Plasma oder im Fettgewebe ändert, indem aus dem Stand der Technik bekannte Standardassays verwendet werden, wie beispielsweise FPLC, kolorimetrische Assays, Tests des Blutglukosespiegels, Insulintoleranztests und andere.
  • Transgene Tiere können durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen hergestellt werden, in denen der normale Lokus des Gens, welches das erfindungsgemäße Protein kodiert, mutiert ist. Alternativ wird ein Nukleinsäurekonstrukt, welches das Protein kodiert, in Oozyten injiziert und wird zufällig in das Genom integriert. Man kann die erfindungsgemäßen Gene oder Varianten davon auch in Geweben exprimieren, in denen sie normalerweise nicht exprimiert werden, oder zu anomalen Zeiten während der Entwicklung. Darüber hinaus können Varianten der erfindungsgemäßen Gene, beispielsweise spezifische Konstrukte, die Antisense-Moleküle oder dominant negative Mutationen exprimieren, welche die Expression der erfindungsgemäßen Proteine blockieren oder verändern, zufällig in das Genom integriert werden. Ein feststellbarer Marker, wie beispielsweise Lac Z oder Luziferase, kann in den Lokus der erfindungsgemäßen Gene eingeführt werden, wobei die Hochregulierung der Expression der erfindungsgemäßen Gene zu einer leicht feststellbaren Veränderung des Phänotyps führt. Vektoren für eine stabile Integration umfassen Plasmide, Retroviren und andere Tierviren, YACs (Yeast Artifical Chromosomes) und dergleichen. DNA-Konstrukte für eine homologe Rekombination enthalten mindestens Anteile der erfindungsgemäßen Gene mit der gewünschten genetischen Modifikation und enthalten Regionen der Homologie mit dem Ziellokus. Praktischerweise sind Marker für positive und negative Selektion enthalten. DNA-Konstrukte für eine zufällige Integration brauchen keine Homologieregionen zu enthalten, um eine Rekombination zu vermitteln. DNA-Konstrukte für eine zufällige Integration bestehen aus den Nukleinsäuren, welche die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, einem regulatorischen Element (Promotor), einem Intron und einem Polyadenylierungssignal. Verfahren zum Erzeugen von Zellen mit Modifikationen des Zielgens durch homologe Rekombinati on sind aus dem Stand der Technik bekannt. Für embryonale Stammzellen (ES-Zellen) kann eine ES-Zelllinie verwendet werden, oder es können embryonale Zellen frisch aus einem Wirt, z. B. einer Maus, Ratte, Meerschwein, etc. erhalten werden. Solche Zellen werden auf einer geeigneten Fibroblasten-Feeder-Schicht in Gegenwart von LIF (Leukemia Inhibiting Factor) gezüchtet. ES bzw. embryonale Zellen können transfiziert und anschließend verwendet werden, um transgene Tiere herzustellen. Nach der Transfektion werden die ES-Zellen auf einer Feederschicht in einem geeigneten Medium ausgestrichen. Zellen, die das Konstrukt enthalten, können durch Verwendung eines Selektionsmediums ausgewählt werden. Nachdem die Kolonien ausreichend lange Zeit wachsen konnten, werden sie gepickt und hinsichtlich des Stattgefundenhabens einer homologen Rekombination analysiert. Positive Kolonien können dann zur Manipulierung von Embryonen und Morula-Aggregation verwendet werden. In Kürze werden Morulae aus 4 bis 6 Wochen alten superovulierten weiblichen Tieren entnommen, die Zona pellucida entfernt und die Morulae in kleine Vertiefungen einer Gewebekulturschale gegeben. Die ES-Zellen werden trypsiniert, und die modifizierten Zellen werden in die Vertiefungen dicht neben die Morulae gegeben. Am folgenden Tag werden die Aggregate in das Uterushorn scheinschwangerer Weibchen übertragen. Die Weibchen können anschließend normal austragen. Chimäre Nachkommen können einfach an einer Veränderung der Fellfarbe erkannt werden und werden anschließend hinsichtlich einer Weitergabe der Mutation auf die nächste Generation (F1-Generation) untersucht. Die Nachkommen der F1-Generation werden auf Vorhandensein des modifizierten Gens untersucht, und männliche und weibliche Tiere, welche die Modifikationen aufweisen, werden gekreuzt, um homozygote Nachkommen zu erhalten. Wenn die Genveränderungen an einem bestimmten Punkt während der Entwicklung Letalität verursachen, können Gewebe oder Organe als allogene oder kongene Grafts bzw. Transplantate oder als In-vitro-Kultur behalten werden. Bei den transgenen Tieren kann es sich um beliebige nicht humane Säuger handeln, beispielsweise um ein Labortier, Haustiere, etc., beispielsweise Mäuse, Ratten, Meerschweine, Schafe, Kühe, Schweine und andere. Die transgenen Tiere können bei Funktionsuntersuchungen, Wirkstoffuntersuchungen und anderen Anwendungen verwendet werden und sind bei der Untersuchung der Funktion und Regulation der erfindungsgemäßen Proteine in vivo nützlich.
  • Die Figuren zeigen:
  • 5 zeigt den relativen Triglyceridgehalt (Triglycerid/Gewicht) von Drosophila PTP10B (GadFly-Zugangsnummer CG 1817)-Mutanten. Gezeigt ist die Veränderung der Triglyzeride von PX7194.1-Fliegen infolge einer hemizygoten lebensfähigen Integration des P--Vektors in die beschriebene Transkriptionseinheit (Säule 2) im Vergleich zu Kontrollen mit allen Fliegenlinien der PX-Mutantensammlung („Alle Linien", Säule 1).
  • 6 zeigt die molekulare Organisation des mutierten PT-P10D-Genlokus. In der Karte der Insertionsstelle von P- der Linie PX7194.1 bezieht sich PTP10D auf das die Rezeptorproteintyrosinphosphatase 10D kodierende Gen, bif bezieht sich auf bifokal und Rst (1) JH bezieht sich auf Resistenz gegenüber Juvenilhormon.
  • 7 zeigt die Ergebnisse einer BLASTp-Suche zum Vergleich mit Drosophila PTP10D.
  • 8 zeigt die humanen PTP10D-homologen Sequenzen.
  • 8A zeigt die Nukleinsäuresequenz der humanen Proteintyrosinphosphatase, Rezeptortyp B (PTPRB) (SEQ ID Nr.: 3).
  • 8B zeigt die Aminosäuresequenz (Einbuchstabencode) der humanen Proteintyrosinphosphatase, Rezeptortyp B (PT-PRB) (SEQ ID Nr.: 4).
  • 9 zeigt die Expression des PTPRB-Gens in Säugergeweben.
  • 9A zeigt die Echtzeit-PCR-Analyse der PTPRB-Expression in Wildtyp-Mausgeweben. Die relative RNA-Expression ist auf der Y-Achse gezeigt, die getesteten Gewebe sind auf der X-Achse angegeben. WAT = Weißes Fettgewebe, BAT = Braunes Fettgewebe.
  • 9B zeigt die Echtzeit-PCR-Analyse der PTPRB-Expression in verschiedenen Geweben von Wildtyp-Mäusen (wt-Mäuse), von Mäusen nach Fastenperiode (Mäuse nach Fastenperiode) und von genetisch fettleibigen Mäusen (ob/ob--Mäuse). Die relative RNA-Expression ist auf der Y-Achse gezeigt, die getesteten Gewebe sind auf der X-Achse angegeben. WAT = weißes Fettgewebe, BAT = Braunes Fettgewebe.
  • Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung:
  • Beispiel 1: Messung des Triglyzeridgehalts in Drosophila
  • Es wurde die Veränderung des Triglyzeridgehalts von Drosophila melanogaster gemessen, die ein spezielles Expressionssystem aufweisen (EP-Element; Rorth P., (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93 (221: 12418-12422). Mutante Fliegen stammen aus Fliegenmutations-Stammsammlungen (proprietäre Fliegenmutations-Stammsammlung; P-Insertion-Mutation-Stock-Center, Szeged, Ungarn) erhalten. Die Fliegen können unter einem Fachmann bekannten Standardbedingungen wachsen. Im Verlauf des Experimentes werden zusätzliche Fütterungen mit Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) bereitgestellt. Der durchschnittliche Anstieg des Triglyzeridgehalts von Drosophila, enthaltend den PX7194.1-Vektor in hemizygoter lebensfähiger Integration, wurde im Vergleich zu Kontrollfliegen untersucht (5). Zur Bestimmung von Triglyzeriden wurden die Fliegen unter Verwendung eines Wasserbads 5 Min. bei 90°C in einem wässrigen Puffer inkubiert, gefolgt von Heißextraktion. Nach weiteren 5 Min. Inkubation bei 90°C und schwacher Zentrifugation wurde der Triglyzeridgehalt des Fliegenextraktes mit dem Triglyzeridtest von Sigma (INT 336-10 oder -20) durch Messung von Änderungen der optischen Dichte nach dem Protokoll des Herstellers bestimmt. Als Bezugswert wurde der Proteingehalt desselben Extraktes mit dem DC-Proteinassay von BIO-RAD nach dem Protokoll des Herstellers gemessen, oder es wurde das Gewicht der Fliegen gemessen. Die Assays wurden dreimal wiederholt. Der mittlere Triglyzeridgehalt aller Fliegen der PX-Sammlung (in 5 mit „alle Linien" bezeichnet) ist in 5 als 100% gezeigt.
  • PX7194.1-hemizygote Fliegen zeigen konstant einen höheren Triglyzeridgehalt als die Kontrollen (etwa 60%; Säule 2 in 5). Die Veränderung der Genaktivität am Lokus der Integration von PX7194.1 auf Chromosom X, wo der PX-Vektor von PX7194.1-Fliegen hemizygot lebensfähig integriert ist, ist also für Veränderungen des Stoffwechsels der Energiespeichertriglyzeride verantwortlich.
  • Der Anstieg des Triglyzeridgehalts infolge des möglichen Verlustes einer Genfunktion lässt auf potenzielle Genaktivitäten bei der Energiehomöostase in einer dosisabhängigen Weise schließen, welche die in Form von Triglyzeriden gespeicherte Energiemenge kontrolliert.
  • Beispiel 2: Identifikation von Drosophila-Genen, die für Veränderungen des Triglyzeridspiegels verantwortlich sind
  • Mithilfe des iPCR-Verfahrens wurden genomische DNA-Sequenzen isoliert, die, in 5'-Richtung, direkt neben der Integrationsstelle der EP-Vektoren (hierin PX7194.1) lokalisiert sind. Unter Verwendung dieser isolierten genomischen Sequenzen wurden öffentliche Datenbanken wie das Berkeley Drosophila Genome
    Project (GadFly) durchsucht, wodurch die Integrationsstellen der Vektoren identifiziert wurden. 6 zeigt die molekulare Organisation dieses Genlokus.
  • Die chromosomale Lokalisierungsstelle der Integration des Vektors in Linie PX7194.1 befindet sich auf dem Genlokus X, 10C7- D1. In 6 entsprechen die Zahlen den Koordinaten der genomischen DNA (beginnend an Position 220000 auf Chromosom X, endend an Position 280000 auf Chromosom X). Graue Balken entsprechen vorhergesagten Exons der Gene (wie vorhergesagt vom Berkeley Drosophila Genome Project, GadFly und von Magpie). Die Integrationsstelle des Vektors für Linie PX7194.1 ist an Position 222666 angezeigt. PTP10D kodiert ein Gen, das von Tian, S et al. (1991) (1991) Cell 67: 675 und Yang, X. et al. (1991) Cell 67: 661, identifiziert und kloniert worden ist. Mithilfe der veröffentlichen Sequenzen des PTP10D-kodierenden Gens wurde die Stelle der hemizygoten lebensfähigen Integration des PX7194.1-Vektors bestimmt. Sie befindet sich in einem Intron zwischen dem ersten und dem zweiten Exon des PTP10D-Gens (5' zum Startcodon), wodurch ein Anstieg des Triglyzeridgehalts verursacht wird.
  • Beispiel 3: Identifikation von humanen PTP10D-Homologen
  • Die erfindungsgemäßen Proteine und homologe Proteine und Nukleinsäuren, die diese kodieren, können aus Insekten- oder Wirbeltierarten, z. B. Säugern und Vögeln, erhalten werden. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, welche die Homologe der erfindungsgemäßen Proteine von Drosophila und dem Menschen kodieren. Sequenzhomologien zu erfindungsgemäßen Drosophila-Proteinen wurden mithilfe des öffentlich verfügbaren Programms BLASTP 2.2.3 der Datenbank nicht redundanter Proteine des National Center for Biotechnology Information (NCBI) identifiziert (siehe Altschul et. al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-2402).
  • Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die Drosophila PTP10D (Gadfly-Zugangsnummer CG 1817), humanes PTPRB (Genbank-Zugangsnummer XM 006789.7 für die cDNA (SEQ ID Nr.: 3, siehe 8A), Genbank-Zugangsnummer XP 006789.4 für das Protein (SEQ ID Nr.: 4, siehe 8B) und Mausproteintyrosinphosphatase vom Rezeptortyp (Genbank-Zugangsnummer AF157628 für die cDNA, Genbank-Zugangsnummer AAF80346 für das Protein) kodieren.
  • Beispiel 4: Expression der Polypeptide in Säugergeweben (Maus)
  • Zur Analyse der Expression der in dieser Erfindung beschriebenen Polypeptide in Säugergeweben wurden mehrere Mausstämme (vorzugsweise die Mausstämme C57Bl/6J, C57Bl/6 ob/ob und C57Bl/KS db/db, bei denen es sich um Standardmodellsysteme in der Adipositas- und Diabetesforschung handelt) von Harlan Winkelmann (33178 Borchen, Deutschland) erworben und unter konstanter Temperatur (vorzugsweise 22° C), 40 Prozent Luftfeuchtigkeit und einem Licht/Dunkel-Zyklus von vorzugsweise 14/10-Stunden gehalten. Die Mäuse erhielten ein Standardfutter (beispielsweise von ssniff Spezialitäten GmbH, Bestellnummer ssniff M-Z V1126-000). Für das Nüchtern-Experiment („Mäuse nach Fastenperiode") wurde Wildtypmäusen für 48 Std. das Futter entzogen, und die Tiere erhielten nur Wasser ad libitum (siehe beispielsweise Schnetzler et al. J Clin Invest 1993 Jul; 92(1): 272-80, Mizuno et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996 Apr 16; 93(8): 3434-8). Die Tiere wurden in einem Alter von 6 bis 8 Wochen getötet. Die Gewebe der Tiere wurden nach Standardverfahren, die einem Fachmann bekannt sind, entnommen, in Flüssigstickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei –80°C aufbewahrt.
  • Zur Analyse der Rolle der in dieser Erfindung beschriebenen Proteine bei der In-Vitro-Differenzierung verschiedener Säugerzellkulturzellen zur Verwandlung von Präadipozyten zu Adipozyten wurden Säugerfibroblastenzellen (3T3-L1-Zellen) (z. B. Green & Kehinde, Cell 1: 113-116, 1974) von der American Tissue Culture Collection (ATCC, Hanassas, VA, USA; ATCC-CL 173) erhalten. 3T3-L1-Zellen wurden als Fibroblasten gehalten und differenzierten zu Adipozyten wie im Stand der Technik beschrieben (z. B. Qiu. et al., J. Biol. Chem. 276: 11988-95, 2001; Slieker et al., BBRC 251: 225-9, 1998). In Kürze wurden die Zellen in DMEM/10% FCS (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) mit 50.000 Zellen/Vertiefung in Duplikaten in Kunststoffschalen mit 6 Vertiefungen ausgestrichen und in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO2 bei 37°C kultiviert. Bei Konfluenz (definiert als Tag 0: T0) wurden die Zellen in serumfreies Medium (SF-Medium), enthaltend DMEM/HamF12 (3:1; Invitrogen), Fetuin (300 μg/ml; Sigma, München, Deutschland), Transferrin (2 μg/ml; Sigma), Pantothenat (17 μM; Sigma), Biotin (1 μM; Sigma) and EGF (0,8 nM; Hoffmann-La Roche, Basel, Schweiz), überführt. Die Differenzierung wurde durch Zugabe von Dexamethason (DEX; 1 μM; Sigma), 3-Methylisobutyl-1-me thylxanthin (MIX; 0,5 mM; Sigma) und Rinderinsulin (5 μg/ml; Invitrogen) induziert. Vier Tage nach Erreichen der Konfluenz (T4) wurden die Zellen in SF-Medium, enthaltend Rinderinsulin (5 μg/ml), gehalten, bis die Differenzierung abgeschlossen war. Zu verschiedenen Zeitpunkten des Differenzierungsvorgangs, beginnend an Tag 0 (Tag des Erreichens der Konfluenz) und Tag 2 (Hormonzugabe; beispielsweise Dexamethason and 3-Isobutyl-1-methylxanthin) bis zu Tag 10 der Differenzierung, wurden alle zwei Tage geeignete Teilmengen an Zellen entnommen.
  • Zu verschiedenen Zeitpunkten des Differenzierungsvorgangs, beginnend an Tag 0 (Tag des Erreichens der Konfluenz und Hormonzugabe, beispielsweise Insulin) bis zu Tag 10 der Differenzierung, wurden alle zwei Tage geeignete Teilmengen an Zellen entnommen.
  • Analyse des Expressionsprofils der erfindungsgemäßen Proteine
  • RNA wurde aus Mausgeweben oder Zellkulturzellen mit Trizol Reagens (beispielsweise von Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) isoliert und mit dem RNeasy-Kit (beispielsweise von Qiagen, Deutschland) in Kombination mit einer DNase-Behandlung nach den Anleitungen des Herstellers und wie einem Fachmann bekannt weiter gereinigt. Gesamt-RNA wurde revers transkribiert (vorzugsweise mit der Superscript II RNaseH-Reversen Transkriptase von Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) und einer Taqman-Analyse unterzogen, vorzugsweise unter Verwendung des Taqman 2xPCR Master Mix (von Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland; die Mischung enthält herstellergemäß beispielsweise AmpliTaq Gold DNA-Polymerase, AmpErase UNG, dNTPs mit dUTP, Passivreferenz Rox und optimierte Pufferbestandteile) auf einem GeneAmp 5700 Sequenznachweissystem (von Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland).
  • Zur Analyse der Expression von PTPRB wurde eine Taqman-Analyse unter Verwendung folgender Primer/Sonden-Paare durchgeführt:
    Maus-PTPRB-Vorwärtsprimer (Seq ID Nr.: 10) 5'-GAG AAT ACA TCG CCA CTC AGG G- 3';
    Maus-PTPRB-Rückwärtsprimer (Seq ID Nr.: 11) 5'-CTC CCA CGC CAT CTT CCA- 3';
    Maus-PTPRB-Taqman-Sonde (Seq ID Nr.: 12) (5/6-FAM) CGC TTC CAG GCA CCA AGG ATG ACT T(5/6- TAMRA)
  • Die Untersuchungen des Expressionsprofils bestätigten die besondere Relevanz von PTPRB als Regulator des Energiestoffwechsels bei Säugern. PTPRB wird relativ ubiquitär exprimiert, wobei die Expression in Lungengewebe am höchsten ist (siehe 9a).
  • Des Weiteren zeigen wir, dass das Säugerhomolog des PTPRB-Gens von Drosophila durch Fasten reguliert wird. In dieser Erfindung haben wir Mausmodelle für Insulinresistenz und/oder Diabetes verwendet, beispielsweise Mäuse mit ausgeschalteten Genen im Leptin-Signalweg (beispielsweise ob (Leptin-) oder db (Leptinrezeptor)-Mäuse), um die Expression des erfindungsgemäßen Proteins zu untersuchen. Solche Mäuse entwickeln typische Symptome eines Diabetes, haben Lipidansammlungen in der Leber und häufig erhöhte Plasmalipidspiegel (siehe Bruning et al, 1998, Mol. Cell. 2: 449-569). Wir haben beispielsweise festgestellt, dass die Expression von PTPRB in metabolisch aktivem Gewebe (beispielsweise WAT) von Mäusen nach einer Fastenperiode erheblich herunterreguliert ist (siehe 9B).

Claims (9)

  1. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls des Gens der Proteintyrosinphosphatase PTP10D oder Verwendung eines dadurch kodierten Polypeptids oder Verwendung eines Antikörpers, wobei ein Aptamer das Nukleinsäuremolekül oder das dadurch kodierte Polypeptid erkennt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Linderung und/oder Vorbeugung von Fettsucht und verwandten Störungen ausgewählt aus Fettsucht, Störungen der Körpergewichtsregulierung, Essstörung, Abmagerung, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, koronarer Herzerkrankung, Hypercholesterinämie oder Dyslipidämie, wobei (i) das Nukleinsäuremolekül eine Nukleinsäure ist, die Drosophila PTP10D (GadFly-Zugangsnummer CG1817), Human-PTP10D-homologes Protein (PTPRB, Genbank-Zugangsnummer XM_006789.7 für die cDNA (SEQ ID NR: 3), Genbank-Zugangsnummer XP_006789.4 für das Protein (SEQ ID NR: 4)), und Proteintyrosinphosphatase vom Mäuserezeptor-Typ (Genbank-Zugangsnummer AF157628 für die cDNA, Genbank-Zugangsnummer AAF80346 für das Protein) kodiert, oder (ii) wobei das Nukleinsäuremolekül (a) bei 50°C in einer Lösung, enthaltend 1 x SSC und 0,1% SDS, zu einem wie in (i) definierten Nukleinsäuremolekül oder einem dazu komplementären Nukleinsäuremolekül hybridisiert; (b) in Bezug auf das Nukleinsäuremolekül von (a) degeneriert ist, (c) ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens 85 %, vorzugsweise zu mindestens 90%, stärker bevorzugt zu mindestens 95%, stärker bevorzugt zu mindestens 98% und bis zu 99,6% mit wie in (i) definierten PTP10D-Polypeptiden identisch ist; (d) sich von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) durch eine Mutation unterscheidet, und wobei die Mutation eine Abänderung, Deletion, Verdopplung oder einen vorzeitigen Stopp im kodierten Polypeptid bewirkt.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament ferner pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe umfasst.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Nukleinsäuremolekül ein DNA-Molekül, insbesondere eine cDNA oder eine genomische DNA ist.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid kodiert, das zur Regulierung der Energiehomöostase und/oder des Stoffwechsels von Triglyceriden beiträgt.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das Nukleinsäuremolekül ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül ist.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-5, wobei das Nukleinsäuremolekül ein Vektor, insbesondere ein Expressionsvektor ist.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das Polypeptid ein rekombinantes Polypeptid ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei das rekombinante Polypeptid ein Kondensationspolypeptid ist.
  9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-6, wobei das Nukleinsäuremolekül ausgewählt ist aus Anti-Sense-Oligonukleotiden.
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