DE10294485T5

DE10294485T5 - Mit Mnk-Kinase homologe Proteine, die in die Regulation der Energiehomöostase und den Organellenmetabolismus involviert sind

Info

Publication number: DE10294485T5
Application number: DE10294485T
Authority: DE
Inventors: Arnd Dr. Steuernagel; Karsten Dr. Eulenberg; Günter Dr. Brönner; Thomas Dr. Ciossek; Bettina Dr. Rudolph; Dorothea Dr. Rudolph; Funmi Dr. Belgore; Stefan Dr. Jäkel; Christoph Dr. Meyer
Original assignee: Develogen AG
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2001-10-29
Filing date: 2002-10-29
Publication date: 2004-04-29
Also published as: DE60238929D1; US20050080026A1; US8957020B2; ATE494912T1; WO2003037362A2; WO2003037362A3; US8076098B2; JP4518378B2; DK1439863T3; JP5185962B2; AU2002363175A1; EP2277552A1; US8828934B2; JP2010119398A; US20120045451A1; EP1439863A2; JP2005508170A; US20120045452A1; US20090170095A1; EP1439863B1

Abstract

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Nucleinsäure-Molekül der MAP-Kinase-interagierenden Kinase- (Mnk) Genfamilie oder ein davon codiertes Polypeptid oder ein Fragment oder eine Variante des Nucleinsäure-Moleküls oder des Polypeptids, oder einen Antikörper, ein Aptamer oder einen anderen Rezeptor, der ein Nucleinsäure-Molekül der Mnk-Genfamilie oder ein darauf codiertes Polypeptid erkennt, zusammen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsmitteln.

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Nucleinsäure-Sequenzen der MAP-Kinase-linteragierenden Kinase (Mnk)-Genfamilie und Aminosäure-Sequenzen, die davon codiert sind, und die Verwendung dieser Sequenzen oder Effektoren von Mnk-Nucleinsäuren oder Polypeptiden, insbesondere Mnk-Kinaseinhibitoren und Aktivatoren, bei der Diagnose, Untersuchung, Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten und Erkrankungen, die mit der Regulation des Körpergewichts und der Thermogenese verbunden sind, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, metabolische Erkrankungen wie etwa Fettleibigkeit, ebenso wie verwandte Erkrankungen wie etwa Essstörungen, Kachexie, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzerkrankung, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis, Gallensteine und Schlafapnoe und Erkrankungen, die mit der ROS-Abwehr verbunden sind, wie etwa Diabetes mellitus, neurodegenerative Erkrankungen und Krebs, zum Beispiel Krebs der Geschlechtsorgane.
Es gibt mehrere metabolische Erkrankungen des humanen und tierischen Metabolismus, zum Beispiel Fettleibigkeit und schwerer Gewichtsverlust, die mit einem Energieungleichgewicht verbunden sind, wobei die Kalorienaufnahme gegenüber dem Energieverbrauch im Ungleichgewicht ist. Fettleibigkeit ist eine der häufigsten metabolischen Erkrankungen weltweit. Es handelt sich um eine noch immer kaum verstandene humane Erkrankung, die für die westliche Welt mehr und mehr an Relevanz gewinnt. Fettleibigkeit wird definiert durch ein Körpergewicht, das das ideale Körpergewicht um mehr als 20% übersteigt, häufig resultierend in einer beachtlichen Gesundheitsbeeinträchtigung. Sie ist verbunden mit einem erhöhten Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Bluthochdruck, Diabetes, Hyperlipidämie und einer erhöhten Sterblichkeitsrate. Neben schwerwiegenden Krankheitsrisiken sind Individuen, die an Fettleibigkeit leiden, oft sozial isoliert.
Fettleibigkeit ist durch genetische, metabolische, biochemische, psychologische und Verhaltensfaktoren beeinflusst. Aus diesem Grund ist es eine komplizierte Erkrankung, der an mehreren Fronten begegnet werden muss, um anhaltende positive klinische Ergebnisse zu erzielen. Da Fettleibigkeit nicht als eine einzelne Erkrankung betrachtet werden kann, sondern als eine heterogene Gruppe von Bedingungen mit (potenziellen) multiplen Ursachen, ist sie auch gekennzeichnet durch erhöhtes Fastenplasmainsulin und eine verstärkte Insulinantwort auf eine orale Glucoseaufnahme (Koltermann, J. Clin. Invest. 65, 1980, 1272–1284). Es kann eine klare Beteiligung der Fettleibigkeit an Diabetes mellitus Typ 2 bestätigt werden (Kopelman, Nature 404, 2000, 635–643).
Die molekularen Faktoren, welche die Nahrungsaufnahme und die Körpergewichtsbalance regulieren, sind nicht vollständig verstanden. Auch wenn mehrere potenzielle Gene beschrieben worden sind, welche vermutlich das homöostatische System/homöostatische Systeme beeinflussen, welches Körpermasse/Gewicht reguliert, wie Leptin, VCPI, VCPL oder der Peroxisomproliferator-aktivierte Rezeptor-Gamma-Coaktivator, sind die verschiedenen molekularen Mechanismen und/oder Moleküle, die Fettleibigkeit oder Körpergewicht/Körpermasseregulationen beeinflussen, nicht bekannt. Außerdem wurden mehrere Einzelgenmutationen in Mäusen beschrieben, die in Fettleibigkeit resultieren, was genetische Faktoren mit der Äthiologie der Fettleibigkeit in Verbindung bringt (Friedman und Leibel, 1990, Cell 69: 217–220). In diesen adipösen Mäusen ergibt eine Einzelgenmutation (adipös) eine nachhaltige Fettleibigkeit, welche von Diabetes begleitet wird (Friedman et al., 1991, Genomics 11: 1054–1062).
Deshalb war das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem, Mittel und Verfahren bereitzustellen zur Modulation von (pathologischen) metabolischen Bedingungen, welche die Thermogenese, Körpergewichtsregulation und/oder energiehomöostatische Kreisläufe beeinflussen. Die Lösung des technischen Problems wird durch Bereitstellen der Ausführungsformen, die in den Ansprüchen charakterisiert sind, erreicht.
Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Gene mit neuen Funktionen in der Körpergewichtsregulation, Energiehomöostase, Metabolismus und Fettleibigkeit. Die vorliegende Erfindung stellt ein spezifisches Gen bereit, das in die Regulation von Krankheiten und Erkrankungen involviert ist, die mit der Körpergewichtsregulation und Thermogenese verbunden sind, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf metabolische Erkrankungen, wie etwa Fettleibigkeit, ebenso wie verwandte Erkrankungen, wie etwa Essstörungen, Kachexie, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzerkrankung, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis, Gallensteine, Krebs der Geschlechtsorgane und Schlafapnoe, und Erkrankungen, die mit der ROS-Abwehr verbunden sind, wie etwa Diabetes mellitus, neurodegenerative Erkrankungen und Krebs. Die vorliegende Erfindung beschreibt, dass die humanen Mnk-Gene in diese oben beschriebenen Bedingungen involviert sind, insbesondere die humanen Mnk2-Genvarianten.
Der Begriff "GenBank-Signatur" bezieht sich auf Einträge in der GenBank-Datenbank "National Center for Biotechnology Information" (NCBI) (Benson et al., Nucleic Acids Res. 28, 2000, 15–18).
Proteinkinasen sind wichtige Moleküle, die in die Regulation von vielen Zellfunktionen involviert sind. Das LK6-Serin/Threoninkinasegen von Drosophila melanogaster wurde als eine kurzlebige Kinase beschrieben, die mit Mikrotubuli assoziieren kann (J. Cell Sci. 1997 110(2): 209–219). Eine genetische Analyse in der Entwicklung im zusammengesetzten Auge von Drosophila weist auf eine Rolle in der Modulation des RAS-Signalwegs hin (Genetics 2000 156(3): 1219–1230). Wie in dieser Erfindung beschrieben, sind die engsten humanen Homologen der Drosophila LK6-Kinase die MAP-Kinase-interagierende Kinase 2 (Mnk2, zum Beispiel die Varianten Mnk2a und Mnk2b) und MAP-Kinase-interagierende Kinase 1 (Mnk1). Alle drei Proteine sind überwiegend im Zytoplasma lokalisiert. Mnks sind durch die pk42 MAP-Kinasen Erk1 und Erk2 und die p38 MAP-Kinasen phosphoryliert. Diese Phosphorylierung wird als Reaktion auf Wachstumsfaktoren, Phorbolester und Onkogene, wie etwa Ras und Mos, ebenso wie durch Stresssignalmoleküle und Zytokine ausgelöst. Die Phosphorylierung von Mnk-Proteinen stimuliert deren Kinaseaktivität gegenüber dem eukaryontischen Initiationsfaktor 4E (EMBO J. 16: 1909-1920 (1997), Mol Cell Biol 19: 1871–1880 (1999), Mol Cell Biol 21: 743-754 (2001)).
Die Phosphorylierung des eukaryontischen Initiationsfaktors 4E (elF4E) resultiert in einer Regulation der Proteintranslation (Mol Cell Biol 22: 5500-5511 (2001)).
Es gibt verschiedene Hypothesen, die die Art und Weise der Stimulation der Proteintranslation durch Mnk-Proteine beschreiben. Die meisten Veröffentlichungen beschrieben eine positive stimulierende Wirkung auf die cap-abhängige Proteintranslation bei Aktivierung der MAP-Kinase-interagierenden Kinasen. Somit kann eine Aktivierung von Mnk-Proteinen zu einer indirekten Stimulierung oder Regulation der Proteintranslation führen, zum Beispiel durch die Wirkung auf die zytosolische Phospholipase 2 Alpha (BBA 1488: 124–138, 2000).
Im Stand der Technik wurden Inhibitoren von Mnk (bezeichnet als CGP57380 und CGP052088) beschrieben (siehe Knauf et al., 2001, Mol. Cell. Biol. 21: 5500, Tschopp et al., 2000, Mol Cell Biol Res Comm 3: 205 und Slentz-Kesler et al., 2000, Genomics 69: 63). CGP052088 ist ein Staurosporin-Derivat mit einem IC50 von 70 nM für die Hemmung der in vitro-Kinaseaktivität von Mnk1. CPG57380 ist ein selektiver nicht zytotoxischer Inhibitor von Mnk2 (Mnk2a oder Mnk2b) oder Mnk1 mit geringem Molekulargewicht. Die Zugabe von CGP57380 zu Zellkulturzellen, die mit Mnk2 (Mnk2a oder Mnk2b) oder Mnk1 transfiziert sind, ergab eine starke Reduktion des phosphorylierten elF4E.
Bislang ist nicht beschrieben worden, dass Mnk-Kinasen in die Regulation des Körpergewichts und der Thermogenes involviert sind, und somit mit metabolischen Erkrankungen, wie etwa Fettleibigkeit, ebenso wie mit verwandten Erkrankungen, wie etwa Essstörungen, Kachexie, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, koronarer Herzerkrankung, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis, Gallensteinen und Schlafapnoe, und Erkrankungen, die mit der ROS-Abwehr verbunden sind, wie etwa Diabetes mellitus, neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs, zum Beispiel Krebs der Geschlechtsorgane, verbunden sein können. In dieser Anmeldung zeigen wir, dass die richtigen Gendosen der Mnk-Kinasen für eine Erhaltung der Energiehomöostase essentiell sind. Es wurde ein genetisches Screening verwendet, um zu identifizieren, dass Mutationen von mit Mnk-Kinase homologen Genen Fettleibigkeit verursachen, was durch einen wesentlich erhöhten Triglyceridgehalt gezeigt wird, der Hauptenergiespeichersubstanz. In dieser Erfindung beziehen wir uns weiterhin auf Mutationen von Mnk-Kinasen, die die Aktivität von Entkopplungsproteinen (UCPs, "Uncoupling Proteins") betreffen, wobei sie zu einer veränderten Mitochondrienaktivität führen. Wir beziehen uns auch auf die Behandlung von metabolischen Erkrankungen mit dem Mnk-spezifischen Inhibitor CGP57380 und Derivaten davon.
In dieser Erfindung zeigen wir, dass die richtige Gendosis des Drosophila melanogaster-Homologen von Mnk für die Erhaltung der Energiehomöostase in adulten Fliegen und für die Aktivität des mitochondrialen Entkopplungsproteins essentiell ist. Es wurde ein genetisches Screening verwendet, um zu identifizieren, dass eine Mutation eines Mnk-homologen Gens Fettleibigkeit in Drosophila melanogaster verursacht, was durch einen wesentlich erhöhten Triglyceridgehalt gespiegelt wird, der Hauptenergiespeichersubstanz. In einer zweiten Untersuchung, die entworfen wurde, um Faktoren zu identifizieren, die die Aktivität des Entkopplungsproteins modulieren, fanden wir, dass eine Mutation dieses Mnk-homologen Gens eine Verringerung der Aktivität des Entkopplungsproteins verursachte. Somit basiert diese Erfindung auch auf der Feststellung, dass das Drosophila-Homologe von Mnk zur Membranstabilität und/oder Funktion von Organellen, insbesondere Mitochondrien, beiträgt. Es wurde gefunden, dass Mutationen in LK6-Kinasen die Aktivität von Entkopplungsproteinen (UCPs) beeinflussen, wobei sie zu einer veränderten Mitochondrienaktivität führen.
Weiterhin zeigen wir, dass das Maus-Homologe des Mnk2-Gens durch Fasten und durch genetisch induzierte Fettleibigkeit reguliert wird. Weiterhin ist die mRNA von Mnk2 während der Adipozytendifferenzierung in vitro (siehe Beispiele) stark hochreguliert. Diese Erfindung zeigt, dass Mnk2-Transkripte in den meisten Mausgeweben exprimiert werden, allerdings mit den höchsten Expressionsniveaus in weißem (WAT, „white adipose tissue") und braunem Fettgewebe (BAT, „brown adipose tissue"). Die Expression in weißem Fettgewebe ist in hungernden Mäusen und in ob/ob-Mäusen um annähernd 60% verringert.
Die Analyse von Aktin-mMnk2DN-transgenen Mäusen zeigte, dass die ektopische Expression des mMnk2DN-Transgens (siehe Beispiele) zu einem deutlichen Anstieg des Körpergewichts führt. Dieser Effekt scheint nahrungsunabhängig zu sein, wie an der Kontrollnahrung ebenso wie an einer Nahrung mit hohem Fettgehalt gesehen werden kann. Somit folgern wir, dass Mnk2 eine wichtige Rolle in der Regulation des Körpergewichts spielt.
Außerdem fanden wir, dass die relativen Expressionsniveaus von beiden humanen Mnk2-Splicingvarianten für alle untersuchten Gewebe gleich sind. Beide Mnk2-Varianten zeigen die höchsten Expressionsniveaus in humanen Geweben, die für metabolische Erkrankungen relevant sind, nämlich Fettgewebe und Muskelgewebe. Weiterhin sind beide Mnk2-Varianten während der humanen Adipozytendifferenzierung hochreguliert. Somit schlussfolgern wir, dass Mnk2 (oder Varianten davon) eine Funktion im Metabolismus von reifen humanen Adipozyten besitzt.
Wir fanden auch, dass zelluläre Triglyceridspiegel in Mnk2 überexprimierenden Zellen von Tag 4 bis Tag 12 der Adipogenese wesentlich geringer waren, im Vergleich mit denen in den Kontrollzellen. Weiterhin waren Mnk2 überexprimierende Zellen weniger effektiv im Synthetisieren von Lipiden aus exogener Glukose. Folglich sind die Spiegel der Insulin-stimulierten Lipidsynthese am Tag 12 der Adipogenese wesentlich geringer, verglichen mit Kontrollzellen. Wir fanden auch, dass der Transport von exogenen Fettsäuren durch die Plasmamembran von Mnk2 überexprimierenden Zellen und folglich eine Veresterung dieser Metaboliten am Tag 12 der Adipogenese beträchtlich geringer war, verglichen mit Kontrollzellen.
Polynucleotide, die für ein Protein mit Homologien zu Proteinen der Mnk-Kinasefamilie codieren, sind geeignet, um Krankheiten und Erkrankungen wie oben beschrieben zu untersuchen. Das Auffinden von Molekülen, die mit Mnk-Kinasen verwandt sind, befriedigt eine Nachfrage im Stand der Technik durch Bereitstellen neuer Zusammensetzungen, die in der Diagnose, Behandlung und Prognose von Krankheiten und Erkrankungen, wie oben beschrieben, nützlich sind.
Ehe die vorliegenden Proteine, Nucleotid-Sequenzen und Verfahren beschrieben werden, wird verständlich gemacht, dass diese Erfindung nicht auf die besonderen beschriebenen Methodiken, Protokolle, Zelllinien, Vektoren und Reagenzien beschränkt ist, da diese variieren können. Es wird auch verständlich gemacht, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich zum Zweck der Beschreibung besonderer Ausführungsformen dient, und nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung limitieren soll, welcher nur durch die angefügten Ansprüche beschränkt ist. Solange nicht anders definiert ist, besitzen alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselben Bedeutungen wie gewöhnlich von einem Durchschnittsfachmann, den diese Erfindung betrifft, verstanden. Obwohl alle Verfahren und Materialien, die gleich oder äquivalent mit den hierin beschriebenen sind, in der Praxis oder Erprobung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden nun die bevorzugten Verfahren, Vorrichtungen und Materialien beschrieben. Alle hierin beschriebenen Publikationen sind hierin als Referenz eingeschlossen zum Zweck der Beschreibung und Offenbarung der Zelllinien, Vektoren und Methodiken, über welche in den Publikationen berichtet wird, die in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden können. Nichts hierin soll als ein Eingeständnis gedeutet werden, dass die Erfindung unberechtigt einer solchen Offenbarung vorangeht.
Die vorliegende Erfindung offenbart, dass Mnk-homologe Proteine die Energiehomöostase und den Fettmetabolismus regulieren, insbesondere den Metabolismus und die Speicherung von Triglyceriden, und Polynucleotide, welche die in dieser Erfindung offenbarten Proteine identifizieren und codieren. Die vorliegende Erfindung offenbart auch, dass Mnk-homologe Proteine direkt oder indirekt in die Membranstabilität und/oder Funktion von Organellen, insbesondere Mitochondrien, involviert ist, und Polynucleotide, welche die in dieser Erfindung offenbarten Proteine identifizieren und codieren. Die Erfindung betrifft auch Vektoren, Wirtszellen, Antikörper und rekombinante Verfahren zur Herstellung der Polypeptide und Polynucleotide der Erfindung. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser Sequenzen in der Diagnose, Untersuchung, Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten und Erkrankungen, die mit der Regulation des Körpergewichts und der Thermogenese verbunden sind, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, metabolische Erkrankungen wie etwa Fettleibigkeit, ebenso wie verwandte Erkrankungen wie etwa Essstörungen, Kachexie, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzerkrankungen, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis, Gallensteine und Schlafapnoe, und Erkrankungen, die mit der ROS-Abwehr verbunden sind, wie etwa Diabetes mellitus, neurodegenerative Erkrankungen und Krebs, zum Beispiel Krebs der Geschlechtsorgane.
Mnk-homologe Proteine und Nucleinsäure-Moleküle, die dafür codieren, sind aus Insekten- oder Vertebratenarten erhältlich, zum Beispiel Säugetieren oder Vögeln. Besonders bevorzugt sind humane Mnk-homologe Polypeptide und Nucleinsäuren, die für solche Polypeptie codieren, insbesondere Polypeptide und Nucleinsäuren, die für ein humanes Mnk2-Protein codieren (Splicingvariante Mnk2a, GenBank-Signatur Nr. AF237775, wie in 3D und 3E gezeigt, oder Splicingvariante Mnk2b, GenBank-Signatur AF237776 oder Nr. NM_017572.1, wie in 3F und 3G gezeigt, GenBank-Signatur Nr. AF237775, identisch mit der früheren GenBank-Signatur Nr. XM_030637, welche auf Antrag des Einreichens entfernt wurde; siehe eine Clustal W multiple Sequenzanordnung in 3B, siehe auch die Sequenzen in den 3D-G) oder ein humanes Mnk1-Protein (GenBank-Signatur Nr. AB000409.1 und NM_003684.2, wie in 3H und 31 gezeigt); die GenBank-Signatur Nr. AB000409 ist identisch mit der früheren GenBank-Signatur Nr. XM_001600, welche auf Antrag des Einreichens entfernt wurde; siehe eine Clustal W multiple Sequenzanordnung in 3C).
Die Erfindung bertrifft insbesondere ein Nucleinsäure-Molekül, das für ein Polypeptid codiert, welches zur Regulation der Energiehomöostase und dem Triglyceridmetabolismus beiträgt und/oder zur Membranstabilität und/oder Funktion von Organellen beiträgt, worin das Nucleinsäure-Molekül umfasst:

(a) die Nucleinsäure-Sequenzen der GenBank-Signaturen Nr. AF237775, NM_017572.1, B000409.1 oder NM_003684.2 und/oder eine komplementäre Sequenz davon,
(b) eine Nucleotid-Sequenz, die bei 50°C in einer Lösung, enthaltend 1 × SSC und 0,1% SDS an das Nucleinsäure-Molekül von (a) hybridisiert, insbesondere eine Nucleinsäure, die für Aminosäure-Sequenzen codiert, wie in 3 gezeigt,
(c) eine Sequenz, die den Sequenzen (a) oder (b) innerhalb der Degeneration des genetischen Codes entspricht,
(d) eine Sequenz, die für ein Polypeptid codiert, welches zu mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, mehr bevorzugt mindestens 95%, mehr bevorzugt mindestens 98% und bis zu 99,6% mit den in 3 gezeigten Aminosäure-Sequenzen identisch ist,
(e) eine Sequenz, die sich von dem Nucleinsäure-Molekül von (a) bis (d) durch Mutation unterscheidet, und worin diese Mutation eine Änderung, Deletion, Duplikation oder einen vorzeitigen Stopp im codierten Polypeptid verursacht, oder
(f) eine Teilsequenz von einer der Nucleotid-Sequenzen (a) bis (e) mit einer Länge von mindestens 15 Basen, bevorzugt mindestens 20 Basen, mehr bevorzugt mindestens 25 Basen und am meisten bevorzugt mindestens 50 Basen.

Die Erfindung basiert auf der Feststellung, dass Mnk-homologe Proteine (hierin als Mnk bezeichnet), insbesondere Mnk2 (Mnk2a oder Mnk2b) oder Mnk1 und die Polynucleotide, die für diese codieren, in die Regulation der Triglyceridspeicherung und deshalb der Energiehomöostase involviert sind. Die vorliegende Erfindung offenbart auch, dass Mnk-homologe Proteine direkt oder indirekt in Membranstabilität und/oder Funktion von Organellen, insbesondere Mitochondrien, involviert sind, und Polynucleotide, welche die in dieser Erfindung offenbarten Proteine identifizieren und codieren. Die Erfindung beschreibt die Verwendung von Zusammensetzungen umfassend die Nucleotide, Proteine oder Effektoren davon, zum Beispiel Antikörper, Aptamere, Antisense-Moleküle, Ribozyme, RNAi-Moleküle, Peptide, niedermolekulare organische Moleküle und andere Rezeptoren, die die Nucleinsäure-Moleküle oder die Polypeptide erkennen, für die Diagnose, Untersuchung, Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten und Erkrankungen, die mit der Regulation des Körpergewichts und der Thermogenese verbunden sind, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, metabolische Erkrankungen, wie etwa etwa Fettleibigkeit, ebenso wie verwandte Erkrankungen wie etwa Essstörungen, Kachexie, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzerkrankung, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis, Gallensteine und Schlafapnoe, und Erkrankungen, die mit der ROS-Abwehr verbunden sind, wie etwa Diabetes mellitus, neurodegenerative Erkrankungen und Krebs, zum Beispiel Krebs der Geschlechtsorgane.
Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Gene mit neuen Funktionen bei der Regulation des Körpergewichts, der Energiehomöostase, dem Metabolismus und bei Fettleibigkeit. Um Gene mit neuen Funktionen bei der Energiehomöostase, dem Metabolismus und bei Fettleibigkeit zu finden, wurde ein funktionelles genetisches Screening mit dem Modellorganismus Drosophila melanogaster (Meigen) durchgeführt. Drosophila melanogaster ist einer der am intensivsten untersuchten Organismen in der Biologie und dient als ein Modellsystem für die Untersuchung von vielen Entwicklungs- und zellulären Prozessen, die für höhere Eukaryonten, einschließlich Menschen, üblich sind (siehe beispielsweise Adams et al., Science 287: 2185–2195 (2000)). Der Erfolg von Drosophila melanogaster als ein Modellorganismus kommt weitgehend von dem Einfluss von vorwärtsgerichteten genetischen Screenings, um die Gene, die in einen biologischen Prozess involviert sind, zu identifizieren (siehe Johnston Nat Rev Genet 3: 176–188 (2002); Rorth, Proc Natl Acad Sci USA 93: 12418-12422 (1996)). Eine Quelle für das Screening war eine gesetzlich geschützte Stammsammlung von EP-Linien von Drosophila melanogaster.
Der P-Vektor dieser Sammlung besitzt Gal4-UAS-Bindestellen, die mit einem basalen Promotor verbunden sind, der bei Bindung der Gal4 an UAS-Stellen benachbarte genomische Drosophila-Sequenzen transkribieren kann. Dies ermöglicht die Sammlung der EP-Linie zur Überexpression von endogenen flankierenden Gensequenzen. Außerdem verursacht eine Integration des EP-Elements in das Gen ohne Aktivierung der UAS-Stellen wahrscheinlich eine Reduktion der Genaktivität und erlaubt die Bestimmung seiner Funktion durch Bewertung der verlorenen Funktion des Phänotyps.
Triglyceride stellen die effiezienteste Speicherung für Energie in Zellen dar, und sind in adipösen Patienten wesentlich erhöht. In dieser Erfindung haben wir ein genetisches Screening verwendet, um zu identifizieren, dass Mutationen von Lk6-homologen Genen Veränderungen im Körpergewicht verursachen, welches durch eine signifikanten Veränderung in den Triglyceridspiegeln gezeigt wird. Um Gene mit einer Funktion in der Energiehomöostase zu isolieren, wurden mehrere tausend EP-Linien auf deren Triglyceridgehalt nach einer verlängerten Fütterungsperiode untersucht. Linien mit einem signifikant veränderten Triglyceridgehalt wurden als positive Kandidaten für eine weitere Untersuchung ausgewählt. In dieser Erfindung wurde der Gehalt an Triglyceriden eines Pools von Fliegen mit dem gleichen Genotyp nach einer Fütterung für 6 Tage untersucht, unter Verwendung eines Triglyceridassays, wie es beispielsweise, allerdings nicht zur Beschränkung des Umfangs der Erfindung, unten im Beispielteil beschrieben ist. Die Veränderung des Triglyceridgehalts aufgrund des Verlusts einer Genfunktion deutet auf Genaktivitäten in der Energiehomöostase in einer dosisabhängigen Weise hin, welche die Menge der als Triglyceride gespeicherten Energie kontrolliert.
Das Ergebnis der Untersuchung des Triglyceridgehalts ist in 1 gezeigt. Es wurden im Triglyceridassay Fliegen untersucht, die hinsichtlich EP(3)3333-und EP(3)3576-Integrationen homozygot waren. Der durchschnittliche Anstieg des Triglyceridgehalts der homozygoten lebensfähigen Linien EP(3)3333 und EP(3)3576 beträgt annähernd 140% (1). Deshalb ist der sehr wahrscheinliche Verlust einer Genaktivität im Genlocus 86F7 (geschätzt, Chromosomenlokalisierung, wo der EP-Vektor von EP(3)3333-und EP(3)3576-Fliegen integriert ist) für Veränderungen im Metabolismus der Energiespeichertriglyceride verantwortlich, und repräsentiert deshalb in beiden Fällen ein adipöses Fliegenmodell. Der Anstieg des Triglyceridgehalts aufgrund des Verlusts einer Genfunktion deutet auf Genaktivitäten in der Energiehomöostase in einer dosisabhängigen Weise hin, welche die Menge an als Triglyceride gespeicherter Energie kontrolliert.
Nucleinsäuren, die für das Mnk-Protein der vorliegenden Erfindung codieren, wurden unter Verwendung eines Plasmid-Rescue-Verfahrens identifiziert. Es wurden genomische DNA-Sequenzen isoliert, die direkt 3' zu den EP(3)3333- und EP(3)3576-Integrationen lokalisiert waren. Unter Verwendung dieser isolierten genomischen Sequenzen wurden öffentliche Datenbanken wie das "Berkeley Drosophila Genome Project" (GadFly; siehe auch FIyBase (1999) Nucleic Acids Research 27: 85–88) durchsucht, wobei die Integrationsstelle von EP(3)3333 in der 5'-Region eines 5'-Exons des Mnk-homologen Gens und von EP(3)3576 in der 5'-Region eines alternativen 5'-Exons (2) bestätigt wurde. 2 zeigt die molekulare Organisation dieses Locus. Die genomische DNA-Sequenz ist durch die Zusammenstellung als schwarze gepunktete Linie in der Mitte dargestellt, welche die Integrationsstelle von EP(3)3333 und EP(3)3576 einschließt. Die Zahlen stellen die Koordinaten der genomischen DNA dar (Beginn mit Position 7544500 auf Chromosom 3R). Graue Balken an den zwei "cDNA"-Linien stellen die vorhergesagten Gene (GadFly & Magpie) dar, und graue Symbole an der Linie "P-Elemente" stellen die EP-Vektorintegrationsstellen dar. Die vorhergesagten Exons des Gens CG17342 sind als dunkelgraue Balken dargestellt und die vorhergesagten Introns als hellgraue Balken.
Lk6 (das Mnk-homologe Gen in Drosophila) codiert für ein Gen, das durch GadFly-Sequenzuntersuchungsprogramme vorhergesagt ist (GadFly-Signatur Nummer CG17342). Es sind keine funktionellen Daten, die die Regulation von Fettleibigkeit und metabolischen Erkrankungen beschreiben, im Stand der Technik für die in 3 gezeigten Gene erhältlich, die in der vorliegenden Erfindung als Mnk bezeichnet werden.
Es ist auch bevorzugt, dass das Nucleinsäure-Molekül für ein Polypeptid codiert, das zur Membranstabilität und/oder Funktion von Organellen beiträgt, und ein Protein von Drosophila dargestellt, welches UCPs modifizieren kann, siehe auch die angefügten Beispiele. Wie in den angefügten Beispielen gezeigt, war das hier beschriebene Polypeptid (und das codierende Nucleinsäure-Molekül) in der Lage, einen speziellen Augenphänotyp in Drosophila zu modifizieren, zum Beispiel zu verstärken, aufgrund der Überexpression des Drosophila melanogaster-Gens dUCPy. Die Überexpression von dUCPy (mit einer Homologie mit humanen UCPs) im zusammengesetzten Auge von Drosophila führte zu einem deutlich sichtbaren Augendefekt, der für eine "Auslese" für ein genetisches "Modifier-Screening" verwendet werden kann.
In dem "Modifier-Screening" werden tausende von verschiedenen Genen mutagenisiert, um deren Expression im Auge zu modifizieren. Sollte eines der mutagenisierten Gene mit dUCPy wechselwirken und dessen Aktivität modifizieren, wird eine Verstärkung oder Unterdrückung des Augendefekts auftreten. Da solche Fliegen leicht zu erkennen sind, können sie ausgewählt werden, um das wechselwirkende Gen zu isolieren. Wie in den angefügten Beispielen gezeigt wird, wurde ein Gen abgeleitet, das den Augendefekt, der durch die Aktivität von dUCPy induziert wird, verstärken kann. Dieses Gen wird als LK6-Gen von Drosophila bezeichnet, mit hohen Homologien zu humanen Mnk-Proteinen, wie oben beschrieben. Man stellt sich vor, dass Mutationen in den hierin beschriebenen Mnk-Polypeptiden (und Genen) zu phänotypischen und/oder physiologischen Veränderungen führen, welche eine modifizierte oder veränderte Mitochondrienaktivität umfassen können. Dieses kann wiederum u.a. zu einem veränderten Energiemetabolismus, einer veränderten Thermogenese und/oder einer veränderten Energiehomöostase führen. Wie in den angefügten Beispielen gezeigt, wurde ein Gen abgeleitet, das den Augendefekt, der durch die Aktivität von dUCPy induziert wird, verstärken kann.
Mnk-homologe Proteine und dafür codierende Nucleinsäure-Moleküle sind von Insekten- oder Vertebratenarten, zum Beispiel Säugetieren oder Vögeln, erhältlich. Besonders bevorzugt sind Nucleinsäuren, die für die humanen Lk6/Mnk-Homologen codieren, insbesondere Mnk2-Varianten (Mnk2a oder Mnk2b) oder Mnk1. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Polypeptid, umfassend die Aminosäure-Sequenz von Mnk, insbesondere Mnk2-Varianten (Mnk2a oder Mnk2b) oder Mnk1. Ein Vergleich (Clustal X 1.8) zwischen den Mnk-Proteinen von verschiedenen Arten (Mensch und Drosophila) wurde durchgeführt und ist in 3A gezeigt. Basierend auf der Homologie können das Mnk-Protein der Erfindung und jedes homologe Protein oder Peptid zumindest einige Aktivität teilen.
In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Erfindung das Polynucleotid, umfassend die Nucleinsäuresequenz der GenBank-Signatur Nr. AF237775, NM_017572.1, AB000409.1 oder NM_003684.2. Es wird von Fachleuten geschätzt werden, dass als ein Ergebnis der Degeneration des genetischen Codes eine Vielzahl von Nucleotid-Sequenzen, die für Mnk codieren, hergestellt werden können, einige tragen eine minimale Homologie zu den Nucleotid-Sequenzen von jeglichem bekannten und natürlich vorkommenden Gen. Somit betrachtet die Erfindung alle und jegliche mögliche Variation einer Nucleotid-Sequenz, die durch Selektion von Kombinationen basierend auf möglichen Codonauswahlen hergestellt werden kann.
Diese Kombinationen werden in Übereinstimmung mit dem genetischen Standard-Triplet-Code gemacht, wie er auf Nucleotid-Sequenzen von natürlich vorkommendem Mnk angewendet wird, und alle solche Variationen sollen als speziell offenbart betrachtet werden. Obwohl Nucleotid-Sequenzen, die für Mnk und dessen Varianten codieren, unter geeignet ausgewählten Bedingungen der Stringenz besonders gut an Nucleotid-Sequenzen des natürlich vorkommenden Mnk hybridisieren können, kann es vorteilhaft sein, Nucleotid-Sequenzen herzustellen, die für Mnk oder dessen Derivate codieren, die einen erheblich unterschiedlichen Codongebrauch besitzen. Codons können ausgewählt werden, um die Rate zu erhöhen, mit der eine Expression der Peptide in einem speziellen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt auftritt, in Übereinstimmung mit der Häufigkeit, mit der bestimmte Codons von einem Wirt benutzt werden. Andere Gründe für eine erhebliche Änderung der Nucleotid-Sequenz, die für Mnk oder dessen Derivate codiert, ohne die codierten Aminosäure-Sequenzen zu verändern, schließen die Herstellung von RNA-Transkripten mit wünschenswerteren Eigenschaften ein, wie etwa einer größeren Halbwertszeit als Transkripte, die von den natürlich vorkommenden Sequenzen hergestellt werden. Die Erfindung umfasst auch die Herstellung von DNA-Sequenzen, oder Teilen davon, welche für Mnk und dessen Derivate codieren, vollständig durch präparative Chemie. Nach der Herstellung kann die synthetische Sequenz in jeden der vielen erhältlichen Expressionsvektoren und Zellsysteme eingefügt werden, unter Verwendung von Reagenzien, die im Fachgebiet zum Zeitpunkt der Einreichung dieser Anmeldung gut bekannt sind. Außerdem kann eine präparative Chemie verwendet werden, um Mutationen in eine Sequenz einzufügen, die für Mnk oder jeglichen Teil davon codiert.
Von der Erfindung sind auch Polynucleotid-Sequenzen umfasst, die an die beanspruchten Nucleotid-Sequenzen, und insbesondere an diese, die in den GenBank-Signaturen Nr. AF237775, NM_017572.1, AB000409.1 oder NM_003684.2 gezeigt sind, unter verschiedenen Bedingungen der Stringenz hybridisieren können. Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nucleinsäure-Bindekomplexes oder der Sonde, wie in Wahl, G.M. und S.L. Berger (1987: Methods Enzymol. 152: 399–407) und Kimmel, A.R. (1987; Methods Enzymol. 152: 507–511) gelehrt wird, und können bei einer definierten Stringenz verwendet werden. Bevorzugt bedeutet eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, dass nach dem Waschen für 1 h mit 1 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C, bevorzugt bei 55°C, mehr bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1 h bei 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C, bevorzugt bei 55°C, mehr bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Veränderte Nucleinsäure-Sequenzen, die für Mnk codieren, welche von dieser Erfindung umfasst sind, schließen Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von verschiedenen Nucleotiden ein, was ein Polynucleotid ergibt, das für das gleiche oder ein funktionell äquivalentes Mnk codiert.
Die codierten Proteine können auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten enthalten, welche einen stillen Austausch erzeugen und ein funktionell äquivalentes Mnk ergeben. Absichtliche Aminosäuresubstitutionen können durchgeführt werden auf Basis der Ähnlichkeit hinsichtlich der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder der amphipathischen Natur der Reste, solange die biologische Aktivität von Mnk erhalten bleibt. Zum Beispiel können negativ geladene Aminosäuren Asparginsäure und Glutaminsäure einschließen; positiv geladene Aminosäuren können Lysin und Arginin einschließen; und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen, die ähnliche Werte der Hydrophilizität besitzen, können Leucin, Isoleucin und Valin einschließen; Glycin und Alanin; Asparagin und Glutamin; Serin und Threonin; Phenylalanin und Thyrosin.
Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind auch alle Allele der Gene, die für Mnk codieren, eingeschlossen. Wie hierin verwendet, ist ein "Allel" oder eine "allelische Sequenz" eine alternative Form des Gens, welche aus zumindest einer Mutation in der Nucleinsäuresequenz resultieren kann. Allele können veränderte mRNA oder Polypeptide ergeben, deren Strukturen oder Funktion verändert sein kann oder nicht verändert sein kann. Jedes gegebene Gen kann keine, eine oder viele allelische Formen besitzen. Gewöhnliche Mutationsveränderungen, welche Allele ergeben, werden im Allgemeinen natürlichen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Nucleotiden zugeschrieben. Jede dieser Art von Veränderung kann alleine auftreten, oder in Kombination mit den anderen, einmal oder mehrmals in einer gegebenen Sequenz. Verfahren zur DNA-Sequenzierung, welche im Fachgebiet gut bekannt und im Allgemeinen zugänglich sind, können verwendet werden, um alle Ausführungsformen der Erfindung zu praktizieren. Diese Verfahren können solche Enzyme wie das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, SEQUENASE DNA-Polymerase (US Biochemical Corp., Cleveland, Ohio), Taq-Polymerase (Perkin Elmer), thermostabile T7-Polymerase (Amersham, Chicago, III.), oder Kombinationen von rekombinanten Polymerasen und Proof-Reading-Exonucleasen, wie etwa das ELONGASE-Amplifikationssystem (Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.) verwenden. Bevorzugt ist das Verfahren automatisiert mit Maschinen wie etwa dem Hamilton MICROLAB 2200 (Hamilton, Reno, Nev.), dem Pettier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown, Mass.) und den ABI 377 DNA-Sequenzierern (Perkin Elmer). Die Nucleinsäure-Sequenzen, die für Mnk codieren, können erweitert werden unter Verwendung einer partiellen Nucleotidsequenz und durch Anwendung verschiedener Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, um stromaufwärts liegende Sequenzen, wie etwa Promotoren und regulatorische Elemente, nachzuweisen. Ein Verfahren, welches beispielsweise angewendet werden kann, eine "Restriktionsstellen"-PCR, verwendet Universalprimer, um eine unbekannte Sequenz, benachbart einem bekannten Locus, herauszufinden (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2: 318–322). Es kann auch eine inverse PCR verwendet werden, um Sequenzen zu amplifizieren oder zu erweitern, unter Verwendung divergierender Primer, basierend auf einer bekannten Region (Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 8186). Ein anderes Verfahren, welches verwendet werden kann, ist eine Capture-PCR, welche eine PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten einbezieht, die benachbart sind zu einer bekannten Sequenz in humaner DNA und DNA von artifiziellen Hefechromosomen (Lagerstrom, M. et al. (PCR Methods Applic. 1: 111–119). Ein anderes Verfahren, welches verwendet werden kann, um unbekannte Sequenzen herauszufinden, ist das von Parker, J.D. et al. (1991; Nucleic Acids Res. 19: 3055–3060). Außerdem kann man PCR, Nested Primer und PROMOTERFINDER-Bibliotheken verwenden, um in genomischer DNA voranzugehen (Clontech, Palo Alto, Calif.). Dieses Verfahren vermeidet den Bedarf, Bibliotheken zu durchmustern, und ist zur Auffindung von Intron/Exon-Verbindungen nützlich.
Wenn nach Volllängen-cDNAs durchmustert wird, ist es bevorzugt, Bibliotheken zu verwenden, die nach Größe selektiert wurden, um größere cDNAs einzuschließen. Es sind auch Random-Primer-Bibliotheken bevorzugt, da sie mehr Sequenzen enthalten werden, die die 5'-Region von Genen enthalten. Die Verwendung einer Random-Primer-Bibliothek kann insbesondere in Situationen bevorzugt sein, worin eine Oligo-d(T)-Bibliothek keine Volllängen-cDNA ergibt. Genomische Bibliotheken können zur Erweiterung einer Sequenz in die nicht transkribierten 5'- und 3'-regulatorischen Regionen nützlich sein. Kapillaren-Elektrophoresesyteme, welche kommerziell erhältlich sind, können verwendet werden, um die Größe zu untersuchen oder die Nucleotid-Sequenz von Sequenzierungs- oder PCR-Produkten zu bestätigen. Insbesondere eine Kapillarsequenzierung kann fließfähige Polymere zur elektrophoretischen Auftrennung, vier verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe (eines für jedes Nucleotid), die laseraktiviert sind, und eine Detektion der emittierten Wellenlängen durch eine ladungsgekoppelte Kameravorrichtung anwenden. Die Output/Lichtintensität kann unter Verwendung einer geeigneten Software (zum Beispiel GENOTYPER and SEQUENCE NAVIGATOR, Perkin Elmer) in ein elektrisches Signal umgewandelt werden, und das gesamte Verfahren vom Laden der Proben bis zur Computeranalyse und dem elektronischen Datendisplay kann computergesteuert sein. Eine Kapillarelektrophorese ist insbesondere zur Sequenzierung von kleinen Stücken von DNA bevorzugt, welche in geringen Mengen in einer besonderen Probe vorhanden sein können.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können Polynucleotid-Sequenzen oder Fragmente davon, welche für Mnk codieren, oder Fusionsproteine oder funktionelle Äquivalente davon, in rekombinanten DNA-Molekülen verwendet werden, um eine Expression von Mnk in geeigneten Wirtszellen zu regeln. Aufgrund der inhärenten Degeneration des genetischen Codes können andere DNA-Sequenzen, welche im Wesentlichen für das Gleiche codieren, oder eine funktionell äquivalente Aminosäure-Sequenz hergestellt werden, und diese Sequenzen können verwendet werden, um Mnk zu klonieren und zu exprimieren. Wie von einem Fachmann verstanden werden wird, kann es vorteilhaft sein, für Mnk codierende Nucleotid-Sequenzen herzustellen, die nicht natürlich vorkommende Codons besitzen. Zum Beispiel können Codons ausgewählt werden, die von einem besonderen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt bevorzugt werden, um die Rate der Proteinexpression zu erhöhen, oder um ein rekombinantes RNA-Transkript herzustellen, welches wünschenswerte Eigenschaften besitzt, wie etwa eine Halbwertszeit, die länger ist als die eines Transkripts, das von der natürlich vorkommenden Sequenz hergestellt wurde. Die Nucleotid-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von Verfahren, die im Allgemeinen im Fachgebiet bekannt sind, entworfen werden, um für Mnk codierende Sequenzen wegen einer Vielzahl von Gründen zu verändern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Veränderungen, welche die Klonierung, das Processing und/oder die Expression des Genprodukts modifizieren. DNA-Verschiebung durch zufällige Fragmentierung und PCR-Wiederzusammenbau von Genfragmenten und synthetischen Oligonucleotiden kann verwendet werden, um die Nucleotid-Sequenzen zu entwickeln. Zum Beispiel kann eine ortsgerichtete Mutagenese verwendet werden, um neue Restriktionsstellen einzufügen, die Glykosilierungsmuster zu verändern, die Codonpräferenz zu verändern, Splicing-Varianten herzustellen oder Mutationen einzufügen, usw.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können natürliche, modifizierte oder rekombinante Nucleinsäure-Sequenzen, die für Mnk codieren, mit einer heterologen Sequenz ligiert werden, um für ein Fusionsprotein zu codieren. Um Peptidbibliotheken nach Inhibitoren von Mnk-Aktivitäten zu durchmustern, kann es beispielsweise nützlich sein, chimäre Mnk-Proteine zu konstruieren, die von kommerziell erhältlichen Antikörpern erkannt werden können. Ein Fusionsprotein kann auch entwickelt werden, um eine Schnittstelle zu enthalten, lokalisiert zwischen der Mnk-codierenden Sequenz und den heterologen Proteinsequenzen, so dass Mnk ausgeschnitten und vom heterologen Anteil weggereinigt werden kann. In einer anderen Ausführungsform können Sequenzen, die für Mnk codieren, synthetisiert werden, gesamt oder teilweise, unter Verwendung von chemischen Verfahren, die im Fachgebiet gut bekannt sind (siehe Caruthers et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7: 215–223, Horn et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7: 225–232). Alternativ können die Proteine selber hergestellt werden unter Verwendung chemischer Verfahren, um die Aminosäure-Sequenz von Mnk oder eines Teils davon zu synthetisieren. Die Peptidsynthese kann zum Beispiel unter Verwendung verschiedener Festphasenverfahren durchgeführt werden (Roberge et al. (1995) Science 269: 202–204), und eine automatisierte Synthese kann zum Beispiel unter Verwendung des ABI 431A-Peptidsynthesizers (Perkin Elmer) erreicht werden. Die neu synthetisierten Peptide können durch eine präparative Hochleistungsflüssigchromatographie wesentlich gereinigt werden (zum Beispiel Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.). Die Zusammensetzung der snythetischen Peptide kann durch eine Aminosäure analyse oder Sequenzierung (zum Beispiel das Edman-Degenerationsverfahren; Creighton, siehe oben) bestätigt werden. Außerdem können die Aminosäure-Sequenzen von Mnk oder von jedem Teil davon, während der direkten Synthese verändert werden und/oder unter Verwendung chemischer Verfahren mit Sequenzen von anderen Proteinen oder jeglichem Teil davon kombiniert werden, um eine Polypeptidvariante herzustellen.
Um ein biologisch aktives Mnk zu exprimieren, können die Nucleotid-Sequenzen, die für funktionelle Mnk-Äquivalente codieren, in geeignete Expressionsvektoren insertiert werden, d.h. in einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der insertierten codierenden Sequenz enthält. Verfahren, welche Fachleuten gut bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionvektoren zu konstruieren, die für Mnk codierende Sequenzen und geeignete Transkriptions- und Translationskontrollelemente enthalten. Diese Verfahren schließen rekombinante in vitro-DNA-Verfahren, synthetische Verfahren und eine genetische Rekombination in vivo ein. Solche Verfahren werden in Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., und Ausubel, F.M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. beschrieben.
Regulatorische Elemente schließen beispielsweise einen Promotor, ein Startcodon, ein Stoppcodon, ein die mRNA stabilisierendes regulatorisches Element und ein Polyadenylierungssignal ein. Die Expression eines Polynucleotids kann gesichert werden durch (i) konstitutive Promotoren, wie etwa die Promotor/Enhancer-Region des Cytomegalovirus (CMV), (ii) gewebespezifische Promotoren, wie etwa den Insulinpromotor (siehe Soria et al., 2000, Diabetes 49: 157), den SOX2-Genpromotor (siehe Li et al., 1998, Curr. Biol. 8: 971–4), den Msi-1-Promotor (siehe Sakakibara et al., 1997, J. Neuroscience 17: 8300–8312), den Promotor der schweren Kette von Alpha-Cardiamyosin oder den Promotor des humanen aurikulären natriuretischen Faktors (Klug et al., J. Clin. Invest. 98: 216–24; Wu et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 6472–79) oder (iii) induzierbare Promotoren wie etwa das induzierbare Tetracyclinsystem. Expressionsvektoren können auch ein Selektionsmittel oder ein Markergen enthalten, welches eine Antibiotikaresistenz verleiht, wie etwa die Neomycin-, Hygromycin- oder Puromycinresistenzgene. Diese Verfahren schließen rekombinante DNA-Verfahren in vitro, syntethische Verfahren und eine genetische Rekombination in vivo ein. Solche Verfahren werden in Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. und Ausubel, F.M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können natürliche, modifizierte oder rekombinante Nucleinsäure-Sequenzen, die für die Proteine der Erfindung und für homologe Proteine codieren, an eine heterologe Sequenz ligiert werden, um für ein Fusionsprotein zu codieren.
Es kann eine Vielzahl von Expressionsvektoren/Wirtssystemen verwendet werden, um Sequenzen, die für die Proteine oder für Fusionsproteine codieren, zu enthalten und zu exprimieren. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Mikroorganismen, wie etwa Bakterien, transformiert mit rekombinanten Bakteriophagen, Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren; Hefe, transformiert mit Hefeexpressionsvektoren; Insektenzellsysteme, infiziert mit Virusexpressionsvektoren (zum Beispiel Baculovirus, Adenovirus, Adeno-assoziierter Virus, Lentivirus, Retrovirus); Pflanzenzellsysteme, transformiert mit Virusexpressionsvektoren (zum Beispiel Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder mit bakteriellen Expressionvektoren (zum Beispiel Ti oder PBR322-Plasmide); oder tierische Zellsysteme.
Die "Kontrollelemente" oder "regulatorischen Sequenzen" sind diejenigen nicht translatierten Regionen der Vektoren, zum Beispiel Enhancer, Promotoren, nicht translatierte 5'- und 3'-Regionen, welche mit den zellulären Wirtsproteinen wechselwirken, um die Transkription und Translation zu realisieren. Solche Elemente können hinsichtlich deren Stärke und Spezifität variieren. Abhängig vom Vektorsystem und vom verwendeten Wirt kann jede Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren. Wenn beispielsweise in bakteriellen Systemen kloniert wird, können induzierbare Promotoren, wie etwa der Hybrid-IacZ-Promotor des BLUESCRIPT-Phagemids (Stratagene, LaJolla, Calif.) oder das PSPORT1-Plasmid (Gibco BRL) und dergleichen verwendet werden. Der Baculovirus-Polyhedrin-Promotor kann in Insektenzellen verwendet werden. Promotoren und Enhancer, die von den Genomen von Pflanzenzellen abgeleitet sind (zum Beispiel Hitzeschock, RUBISCO; und Speicherproteingene) oder von Pflanzenviren abgeleitet sind (zum Beispiel virale Promotoren und Leadersequenzen) können in den Vektor kloniert werden. In Säugetierzellsystemen sind Promotoren von Säugetiergenen oder von Säugetierviren bevorzugt. Falls es nötig ist, eine Zelllinie herzustellen, die mehrfache Kopien der für Mnk codierenden Sequenzen enthält, können Vektoren, basierend auf SV40 oder EBV mit einem geeigneten Selektionsmarker verwendet werden.
In bakteriellen Systemen kann eine Anzahl von Expressionsvektoren ausgewählt werden, abhängig von der beabsichtigten Verwendung von Mnk. Wenn zum Beispiel große Mengen an Mnk für die Induktion von Antikörpern benötigt werden, können Vektoren verwendet werden, welche eine hohe Expression der Fusionsproteine lenken, welche leicht gereinigt werden können. Solche Vektoren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die multifunktionellen Klonierungs- und Expressionvektoren von E.coli, wie etwa das BLUESCRIPT-Phagemid (Stratagene), worin die für Mnk codierende Sequenz in den Vektor ligiert werden kann, im Leseraster mit Sequenzen für das aminoterminale Met und die nachfolgenden 7 Reste der -Galactosidase, so dass ein Hybridprotein produziert wird; pIN-Vektoren (Van Heeke, G. und S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503–5509); und dergleichen. Es können auch Vektoren der pGEX-Serie (Amersham Biosciencies, Uppsala, Schweden) verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können leicht von den lysierten Zellen durch Adsorption and Glutathion-Agarose-Beads gereinigt werden, gefolgt von einer Elution in Gegenwart von freiem Glutathion. Proteine, die in solchen Systemen hergestellt werden, können so entworfen werden, dass sie Schnittstellen für Heparin, Thrombin oder Faktor-XA-Protease enthalten, so dass das interessierende klonierte Polypeptid nach Belieben von dem GST-Anteil entfernt werden kann. In der Hefe, Saccharomyces cerevisiae, kann eine Anzahl von Vektoren verwendet werden, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, wie etwa den Alpha-Faktor, Alkoholoxidase und PGH. Für Überblicke, siehe Ausubel et al. (siehe oben) und Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516–544.
In Fällen, bei denen Pflanzenexpressionvektoren verwendet werden, kann die Expression von Sequenzen, die für Mnk codieren, durch eine Vielzahl von Promotoren gesteuert werden. Es können zum Beispiel virale Promotoren wie etwa die 35S- und 19S-Promotoren von CaMV alleine oder in Kombination mit der Omega-Leadersequenz von TMV verwendet werden (Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6: 307–311). Alternativ können Pflanzenpromotoren, wie etwa die kleine Untereinheit von RUBISCO oder Hitzeschockpromotoren verwendet werden (Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671–1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224: 838–843; und Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85–105). Diese Konstrukte können mittels direkter DNA-Transformation oder Pathogenvermittelter Transfektion in Pflanzenzellen eingebracht werden. Solche Verfahren sind in einer Vielzahl von allgemein erhältlichen Reviews beschrieben (siehe beispielsweise Hobbs, S. oder Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; S. 191–196).
Es kann auch ein Insektensystem verwendet werden, um Mnk zu exprimieren. In einem solchen System wird zum Beispiel das Autographa californica-Nuklearpolyhedrosisvirus (AcNPV) als ein Vektor verwendet, um fremde Gene in Spodoptera frugiperda-Zellen oder in Trichoplusialarven zu exprimieren. Die für Mnk codierenden Sequenzen können in eine nicht essentielle Region des Virus kloniert werden, wie etwa das Polyhedringen, und unter die Kontrolle des Polyhedrinpromotors platziert werden. Erfolgreiche Insertionen von Mnk lassen das Polyhedringen inaktiv werden und produzieren rekombinantes Virus, dem das Hüllprotein fehlt. Die rekombinanten Viren können dann verwendet werden, um beispielsweise S. frugiperda-Zellen von Trichoplusialarven zu infizieren, in welchen Mnk exprimiert werden kann (Engelhard, E.K. et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 3224–3227).
In Säugetier-Wirtszellen können eine Vielzahl von auf Viren basierenden Expressionssystemen verwendet werden. In Fällen, in denen Adenovirus als ein Expressionsvektor verwendet wird, können die für Mnk codierenden Sequenzen in einen Adenovirus-Transkriptions/Translationskomplex ligiert werden, der aus dem späten Promotor und der Tripartite-Leadersequenz besteht. Die Insertion in eine nicht essentielle E1- oder E3-Region des viralen Genoms kann verwendet werden, um lebensfähige Viren zu erhalten, welche Mnk in infizierten Wirtszellen exprimieren können (Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655–3659). Außerdem können Transkriptionsenhancer, wie etwa der Encancer des Rous-Sarkomvirus (RSV) verwendet werden, um eine Expression in Säugetier-Wirtszellen zu verstärken.
Es können auch spezielle Startsignale verwendet werden, um eine effizientere Translation der für Mnk codierenden Sequenzen zu erreichen.
Solche Signale schließen das ATG-Startcodon und benachbarte Sequenzen ein. In Fällen, in denen für Mnk codierende Sequenzen, deren Startcodons und stromaufwärts liegende Sequenzen in den geeigneten Expressionsvektor insertiert werden, sind zusätzliche Transkriptions- oder Translationskontrollsignale nicht unbedingt erforderlich. Aber in Fällen, in denen nur eine codierende Sequenz oder ein Teil davon insertiert wird, sollten exogene Translationskontrollsignale, einschließlich des ATG-Startcodons, bereitgestellt werden. Weiterhin sollte das Startcodon im richtigen Leserahmen vorliegen, um die Translation des kompletten Inserts sicherzustellen. Exogene Translationselemente und Initiationscodons können verschiedenen Ursprungs sein, sowohl natürlich als auch synthetisch. Die Effizienz der Expression kann durch den Einschluss von Enhancern verstärkt werden, die für das besondere Zellsystem, welches verwendet wird, geeignet sind, wie etwa die in der Literatur beschriebenen (Scharf, D. et al. (1994) Results Probt. Cell Differ. 20: 125–162).
Außerdem kann ein Wirtszellstamm gewählt werden aufgrund seiner Fähigkeit, die Expression der insertierten Sequenzen zu modulieren oder das exprimierte Protein in der erwünschten Art und Weise zu prozessieren. Solche Modifikationen des Polypeptids schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf eine Acetylierung, Carboxylierung, Glykosilierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung. Posttranslationales Processing, welches eine "Präpro"-Form des Proteins spaltet, kann auch verwendet werden, um eine richtige Insertion, Faltung und/oder Funktion zu erleichtern. Verschiedene Wirtszellen, wie etwa CHO, HeLa, MDCK, HEK293 und WI38, welche eine spezielle zelluläre Maschinerie und charakteristische Mechanismen für solche posttranslationalen Aktivitäten besitzen, können gewählt werden, um die korrekte Modifizierung und das korrekte Processing des Fremdproteins sicherzustellen.
Für eine langanhaltende Produktion von rekombinanten Proteinen in hoher Ausbeute ist eine stabile Expression bevorzugt. Es können beispielweise Zelllinien, welche Mnk stabil exprimieren, unter Verwendung von Expressionsvektoren transformiert werden, welche virale Replikationsursprünge und/oder endogene Expressionselemente und ein selektierbares Markergen auf demselben oder auf einem separaten Vektor enthalten. Gefolgt von der Einführung des Vektors können Zellen für 1–2 Tage in angereicherten Medium angezogen werden, bevor sie in ein Selektionsmedium gewechselt werden. Der Zweck des Selektionsmarkers ist es, Resistenz gegenüber einer Selektion zu verleihen, und dessen Anwesenheit erlaubt Wachstum und Gewinnung von Zellen, welche die eingefügten Sequenzen erfolgreich exprimieren. Resistene Klone von stabil transformierten Zellen können unter Verwendung von Gewebekulturverfahren proliferiert werden, die für den Zelltyp geeignet sind. Es kann jede Anzahl von Selektionssystemen verwendet werden, um transformierte Zelllinien zu gewinnen. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die Herpes simplex Virus-Thymidinkinase- (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223–32) und Adeninphosphoribosyl-Transferasegene (Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817–23), welche in tk^–- bzw. aprt^–-Zellen verwendet werden können. Es kann auch eine Antimetabolit-, Antibiotika- oder Herbizidresistenz verwendet werden als Basis für die Selektion; beispielsweise dhfr, welches eine Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht (Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567–-70); npt, welches eine Resistenz gegenüber den Aminoglycosiden Neomycin und G-418 verleiht (Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1–14) und als oder pat, welche eine Resistenz gegenüber Chlorsulfuron bzw. gegenüber der Phosphinotricin-Acetyltransferase verleihen (Murry, siehe oben). Zusätzliche Selektionsgene wurden beschrieben, beispielsweise trpB, welches es Zellen ermöglicht, Indol anstelle von Tryptophan zu verwerten, oder hisD, welches es Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin zu verwerten (Hartman, S. C. und R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8047–51). In letzter Zeit gewann die Verwendung von sichtbaren Markern an Popularität, wobei solche Marker wie Anthocyanine, -Glucuronidase und deren Substrat GUS, und Luziferase und deren Substrat Luziferin eine breite Verwendung nicht nur zur Identifizierung von Transformanten, sondern auch zur Quantifizierung der Menge der transienten oder stabilen Proteinexpression, die einem spezifischen Vektorsystem zugeschrieben wird (Rhodes, C.A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55: 121–131).
In vivo kann die enzymatische Kinaseaktivität des unmodifizierten Polypeptids von Mnk gegenüber einem Substrat durch geeignete Stimuli verstärkt werden, welche die Phosphorylierung von Mnk auslösen. Dies kann im natürlichen Zusammenhang durch extrazelluläre oder intrazelluläre Stimuli induziert werden, wie etwa Signalmoleküle oder Umwelteinflüsse. Man kann ein System erzeugen, enthaltend aktiviertes Mnk, es kann ein Organismus, ein Gewebe, eine Kultur von Zellen oder eine zellfreie Umgebung sein, durch exogenes Anwenden dieses Stimulus oder durch Nachahmen dieses Stimulus mittels einer Vielzahl von Verfahren, einige von diesen sind unten näher beschrieben. Ein System, enthaltend aktiviertes Mnk , kann erzeugt werden (i) zum Zweck der Diagnose, Untersuchung, Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten und Erkrankungen, die mit der Regulation des Körpergewichts und der Thermogenese verbunden sind, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf metabolische Erkrankungen, wie etwa Fettleibigkeit, ebenso wie verwandte Erkrankungen, wie etwa Essstörungen, Kachexie, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzerkrankung, Hypercholesterinämie, Dislipidämie, Osteoarthritis, Gallensteine und Schlafapnoe, und Erkrankungen, die mit der ROS-Abwehr verbunden sind, wie etwa Diabetes mellitus, neurodegenerative Erkrankungen und Krebs, zum Beispiel Krebs der Geschlechtsorgane, (ii) zum Zweck der Identifizierung oder Validierung von potenziell therapeutischen Mitteln, Pharmazeutika oder Arzneimitteln, welche die Gene der Erfindung oder die durch sie codierten Polypeptide beeinflussen, (iii) zum Zweck der Herstellung von Zelllysaten, enthaltend aktivierte Polypeptide, codiert durch die Gene der Erfindung, (iv) zum Zweck der Isolierung aktivierter Polypeptide, codiert durch die Gene der Erfindung, aus dieser Quelle.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann man unabhängig von den natürlichen Stimuli zu den obengenannten Zwecken aktiviertes Mnk erzeugen, durch beispielsweise, aber nicht beschränkt auf (i) ein Mittel, das den natürlichen Stimulus nachahmt; (ii) ein Mittel, das stromabwärts des natürlichen Stimulus wirkt, wie etwa Aktivatoren des MAP-Kinasewegs, Phorbolester, Anisomycin, konstitutive aktive Allele der MAP-Kinase-Kinase-Kinasen, der MAP-Kinase-Kinasen, der MAP-Kinase oder von Mnk selbst, wie sie beschrieben sind oder entwickelt werden können; (iii) durch Einbringen von einzelnen oder mehrfachen Aminosäuresubstitutionen, Deletionen oder Insertionen innerhalb der Sequenz von Mnk, um konstitutiv aktive Formen zu erhalten; (iv) durch die Verwendung von isolierten Fragmenten von Mnk. Außerdem kann man enzymatisch aktives Mnk in einem ektopischen System, prokaryontisch oder eukaryontisch, in vivo oder in vitro herstellen, durch Cotransfer der aktivierenden Komponenten in dieses System. Zum Beispiel können diese sein, sind aber nicht beschränkt auf Bestandteile des MAP-Kinasewegs, wie etwa konstitutiv aktive Allele der MAP-Kinase-Kinasen Mek1 oder Mkk6, zusammen mit den MAP-Kinasen ERK1 oder ERK2 oder den p38-MAPK-Isoformen. Man kann zum Beispiel isoliertes Mnk-Protein aktivieren, in Lösung mit einem mutierten Polypeptid von Mek1, enthaltend die Aminosäuresubstitutionen S218D und S222E, zusammen mit isolierter ERK2-Kinase, in Gegenwart von 1,0 mM Adenosintriphosphat und geeigneten Pufferbedingungen, wie etwa 50 mM N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)/Kaliumhydroxid pH 7,4, 5 mM Magnesiumchlorid, 0,5 mM Dithiothreitol (siehe 14).
Obwohl die Gegenwart/Abwesenheit der Markergenexpression darauf hindeutet, dass das interessierende Gen ebenfalls anwesend ist, kann eine Bestätigung dessen Anwesenheit und Expression erforderlich sein. Wenn die für Mnk codierenden Sequenzen innerhalb einer Markergensequenz insertiert werden, können beispielsweise rekombinante Zellen, die Mnk-codierende Sequenzen enthalten, durch die Abwesenheit der Markergenfunktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen in einer Reihe mit Sequenzen, die für Mnk codieren, unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors platziert werden. Normalerweise zeigt die Expression des Markergens als Antwort auf eine Induktion oder Selektion ebenfalls eine Expression des in Reihe angeordneten Gens an. Alternativ können Wirtszellen, die die Nucleinsäure-Sequenzen, die für Mnk codieren, enthalten und Mnk exprimieren, durch eine Vielzahl von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, identifiziert werden. Diese Verfahren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung und des Proteinbioassay- oder Immunassay-Verfahren, welche auf Membran, Lösung oder Chip basierende Technologien zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung einer Nucleinsäure oder eines Proteins einschließen.
Die Anwesenheit von Polynucleotid-Sequenzen, die für Mnk codieren, kann durch eine DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder durch eine Amplifikation unter Verwendung von Sonden oder Anteilen oder Fragmenten von Mnk-codierenden Polynucleotiden nachgewiesen werden. Assays basierend auf einer Nucleinsäure-Amplifikation schließen die Verwendung von Oligonucleotiden oder Oligomeren, basierend auf die Mnk-codierenden Sequenzen ein, um Transformanten zu entdecken, die für Mnk codierende DNA oder RNA enthalten. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Oligonucleotide" oder "Oligomere" auf eine Nucleinsäure-Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden und bis etwa 60 Nucleotide, bevorzugt etwa 15 bis 30 Nucleotide und mehr bevorzugt etwa 20 bis 25 Nucleotide, welche als eine Sonde oder als Amplimer verwendet werden können.
Im Fachgebiet sind eine Vielzahl von Verfahren zum Nachweis oder zur Messung der Expression von Mnk bekannt, entweder unter Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die für das Protein spezifisch sind. Beispiele schließen einen Enzym-linked Immunosorbentassay (ELISA), Radioimmunassay (RIA) und Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ein. Ein zweifacher, monoklonal basierender Immunassay unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die gegenüber den zwei nicht interferierenden Epitopen von Mnk reaktiv sind, ist bevorzugt, aber es kann auch ein kompetitiver Bindungsassay verwendet werden. Diese und andere Assays werden u.a. beschrieben in Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St.Paul, Minn.) und Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158: 1211–1216).
Eine breite Vielzahl von Markierungen und Konjugationsverfahren sind Fachleuten bekannt und können in verschiedenen Nucleinsäure- und Aminosäureassays verwendet werden. Mittel zur Herstellung von markierten Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zum Nachweis von Sequenzen, die mit Mnk-codierenden Polynucleotiden verwandt sind, schließen Oligomarkierung, Nick-Translation, Endmarkierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids ein.
Alternativ können die für Mnk codierenden Sequenzen, oder jegliche Teile davon, in einen Vektor kloniert werden zur Herstellung einer mRNA-Sonde. Solche Vektoren sind im Fachgebiet bekannt, sind kommerziell erhältlich und können verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro durch Zugabe einer geeigneten RNA-Polymerase, wie etwa T7, T3 oder SP6, und markierter Nucleotide zu synthetisieren. Diese Verfahren können unter Verwendung einer Vielzahl von kommerziell erhältlichen Kits durchgeführt werden (Pharmacia & Upjohn, (Kalamazoo, Mich.); Promega (Madison, Wis.); und U.S. Biochemical Corp. (Cleveland, Ohio)).
Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen, welche verwendet werden können, schließen Radionuclide, Enzyme, fluoreszierende, chemilumineszente oder chromogene Mittel ebenso ein wie Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Partikel und dergleichen.
Wirtszellen, die mit für Mnk codierenden Nucleotid-Sequenzen transformiert sind, können unter Bedingungen kultiviert werden, die für die Expression und Gewinnung des Proteins aus einer Zellkultur geeignet sind. Das von einer rekombinanten Zeile erzeugte Protein kann sekretiert werden oder intrazellulär enthalten sein, in Abhängigkeit von der Sequenz und/oder dem verwendeten Vektor. Wie von Fachleuten verstanden werden wird, können Expressionsvektoren, enthaltend für Mnk codierende Polynucleotide, konstruiert werden und Signalsequenzen enthalten, welche eine Sekretion von Mnk durch ein prokaryontische oder eukaryontische Zellmembran leiten. Andere rekombinante Konstruktionen können verwendet werden, um Mnk-codierende Sequenzen zu Nucleotid-Sequenzen, die für eine Polypeptiddomäne codieren, auszuwählen, was die Aufreinigung von löslichen Proteinen vereinfacht. Solche die Reinigung erleichternden Domänen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Metallchelat bildende Peptide, wie etwa Histidin-Tryptophanmodule, welche eine Aufreinigung an immobilisiertem Metall erlauben, Protein A-Domänen, welche eine Aufreinigung an immobilisiertem Immunglobulin erlauben, und die Domäne, die im FLAG-Extensions/Affinitätsreinigungssystem verwendet wird (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Der Einschluss von spaltbaren Linkersequenzen, wie etwa diejenigen für Faktor XA oder Enterokinase spezifischen (Invitrogen, San Diego, Calif.) zwischen der Reinigungsdomäne und Mnk können verwendet werden, um die Reinigung zu erleichtern. Ein solcher Vektor ermöglicht eine Expression eines Fusionsproteins, enthaltend Mnk und eine Nucleinsäure, die für 6 Histidinreste codiert, welche vor einer Thioredoxin- oder eine Enterokinase-Schnittstelle liegen. Die Histidinreste erleichtern eine Aufreinigung an IMIAC (immobilisierte Metallionenaffinitäts-Chromatographie, wie in Porath, J. et al. (1992, Prot. Exp. Purif. 3: 263–281 beschrieben)), während die Enterokinase-Schnittstelle ein Mittel zur Reinigung des Mnk aus dem Fusionsprotein bereitstellt. Eine Erörterung über Vektoren, welche Fusionsproteine enthalten, wird in Kroll, D.J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12: 441–453) bereitgestellt. Zusätzlich zur rekombinanten Produktion können Fragmente von Mnk durch eine direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt werden (Merrifield, J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2154). Eine Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller Verfahren oder durch Automatisierung durchgeführt werden. Eine automatisierte Synthese kann beispielsweise erreicht werden unter Verwendung einer Applied Biosystems 431A-Peptidsynthetisiermaschine (Perkin Elmer). Verschiedene Fragmente von Mnk können chemisch separat synthetisiert werden und unter Verwendung chemischer Verfahren kombiniert werden, um das Molekül mit voller Länge herzustellen.
Diagnose und Therapie
Die in dieser Erfindung offenbarten Daten zeigen, dass die Nucleinsäuren und Proteine der Erfindung und Effektormoleküle davon in angezeigten diagnostischen und therapeutischen Applikationen verwendbar sind, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf metabolische Erkrankungen wie Fettleibigkeit, Diabetes, Essstörungen, Auszehrungssyndrome (Kachexie), pankreatische Funktionsstörungen, Arteriosklerose, koronare Herzerkrankung (CAD) und andere Krankheiten und Erkrankungen, wie oben beschrieben. Folglich sind diagnostische und therapeutische Verwendungen der Mnk-Proteine der Erfindung beispielsweise, aber nicht beschränkt auf die folgenden: (i) Proteintherapie, (ii) das Target kleiner Arzneimittelmoleküle, (iii) das Target von Antikörpern (therapeutisch, diagnostisch, Arzneimitteltargeting/zytotoxische Antikörper), (iv) diagnostische und/oder prognostische Marker, (v) Gentherapie (Genlieferung/Genentfernung), (vi) Forschungswerkzeuge und (vii) Geweberegeneration in vitro und in vivo (Regeneration von allen Geweben und Zelltypen, die diese Gewebe umfassen und von Zelltypen, die von diesen Geweben abstammen).
Die Nucleinsäuren und Proteine der Erfindung sind in angezeigten diagnostischen und therapeutischen Applikationen bei verschiedenen Krankheiten und Erkrankungen, die oben beschrieben sind, und/oder anderen pathologischen Befunden und Erkrankungen nützlich. Beispielsweise, aber nicht beschränkt darauf können cDNAs, die für die Mnk-Proteine der Erfindung und insbesondere deren humane Homologe codieren, in der Gentherapie nützlich sein, und die Mnk-Proteine der Erfindung und insbesondere deren humane Homologe können nützlich sein, wenn sie einem Subjekt, das dieser bedarf, verabreicht werden. Anhand eines nicht beschränkenden Beispiels werden die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eine Wirksamkeit aufweisen für die Behandlung von Patienten, die beispielsweise, aber nicht beschränkt auf metabolische Erkrankungen wie Fettleibigkeit, Diabetes, Essstörungen, Auszehrungssyndrome (Kachexie), pankreatische Funktionsstörungen, Arteriosklerose, koronare Herzerkrankung (CAD) und an anderen Krankheiten und Erkrankungen leiden, insbesondere an den oben beschriebenen.
Die Nucleinsäure(n), die für das/die Mnk-Proteine) der Erfindung codieren, oder Fragmente davon, können weiterhin in diagnostischen Anwendungen nützlich sein, worin die Anwesenheit oder Menge der Nucleinsäuren oder der Proteine zu bewerten sind. Diese Materialien sind weiter bei der Erzeugung- von Antikörpern nützlich, welche immunspezifisch and die neuen Substanzen der Erfindung binden, für eine Verwendung in therapeutischen oder diagnostischen Verfahren.
Zum Beispiel können in einem Aspekt Antikörper, welche für Mnk spezifisch sind, direkt als ein Antagonist verwendet werden, oder indirekt als ein Ziel oder Lieferungsmechanismus, um ein pharmazeutisches Mittel zu Zellen oder Gewebe zu bringen, welches Mnk exprimiert. Die Antikörper können unter Verwendung von im Fachgebiet gut bekannten Verfahren erzeugt werden. Solche Antikörper können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf polyklonale, monoklonale, chimäre, Einzelketten, Fab-Fragmente und Fragmente, die durch eine Fab-Expressionsbibliothek erzeugt wurden. Neutralisierende Antikörper (d.h. solche, welche eine Dimerbildung hemmen) sind für eine therapeutische Verwendung besonders bevorzugt.
Für die Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirte, einschließlich Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mäuse, Menschen und andere durch Injektion mit Mnk, jeglichem Fragment oder Oligopeptid davon, welches immunogene Eigenschaften besitzt, immunisiert werden. In Abhängigkeit von der Wirtsspezies können verschiedene Zusätze verwendet werden, um eine Immunantwort zu steigern. Solche Zusätze schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Freund's Mineralgele, wie etwa Aluminiumhydroxid, und oberflächenaktive Substanzen, wie etwa Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Napfschneckenhämocyanin und Dinitrophenol. Unter den im Menschen verwendeten Zusätzen sind BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum besonders bevorzugt. Es ist bevorzugt, dass die zur Induktion von Antikörpern gegen Mnk verwendeten Peptide, Fragmente oder Oligopeptide eine Aminosäure-Sequenz besitzen, die aus mindestens 5 Aminosäuren, und mehr bevorzugt aus mindestens 10 Aminosäuren besteht. Es ist bevorzugt, dass sie identisch sind mit einem Anteil der Aminosäure-Sequenz des natürlichen Proteins und sie können die gesamte Aminosäure-Sequenz eines kleinen, natürlich vorkommenden Moleküls enthalten. Kleine Abschnitte von Mnk-Aminosäuren können mit denjenigen von einem anderen Protein, wie etwa Napfschneckenhämocyanin fusioniert werden, und es können Antikörper gegen das chimäre Molekül erzeugt werden.
Monoklonale Antikörper gegen Mnk können unter Verwendung jeglicher Technik hergestellt werden, welche eine Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur ermöglicht. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf das Hybridomverfahren, das humane B-Zellhybridomverfahren und das EBV-Hybridomverfahren (Köhler, G. et al. (1975) Nature 256: 495–497; Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81: 31–42; Cote, R.J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026–2030; Cole, S. P. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62: 109–120).
Außerdern können für die Herstellung von "chimären Antikörpern" entwickelte Verfahren verwendet werden, das Splicing von Maus-Antikörpergenen in humane Antikörpergene, um ein Molekül mit einer geeigneten Antigenspezifität und biologischen Aktivität zu erhalten (Morrison, S. L. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851–6855; Neuberger, M. S. et al. (1984) Nature 312: 604–608; Takeda, S. et al. (1985) Nature 314: 452–454). Alternativ können für die Herstellung von Einzelketten-Antikörpern beschriebene Verfahren angepasst werden, unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren, um Mnk-spezifische Einzelketten-Antikörper herzustellen. Antikörper mit einer verwandten Spezifität, aber von einer unterschiedlichen idiotypischen Zusammensetzung können erzeugt werden durch das Mischen von Ketten aus zufälligen kombinatorischen Immunglobulin-Bibliotheken (Burton, D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 11120–3). Antikörper können auch erzeugt werden durch Induzieren einer in vivo-Produktion in der Lymphozytenpopulation oder durch Screening von rekombinanten Immunglobulinbibliotheken oder Gruppen von hochspezifischen Bindereagenzien, wie in der Literatur offenbart (Orlandi, R, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833–3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293–299).
Es können auch Antikörperfragmente, welche spezifische Bindestellen für Mnk enthalten, erzeugt werden. Solche Fragmente schließen beispielsweise ein, sind aber nicht beschränkt auf proteolytische Fragmente, zum Beispiel die F(ab')₂- Fragmente, welche durch einen Pepsinverdau des Antikörpermoleküls und der Fab-Fragmente hergestellt werden können, welche durch Reduktion der Disulfidbrücken von F(ab')₂- Fragmenten hergestellt werden können. Alternativ können rekombinante Fragmente hergestellt werden. Es können zum Beispiel Fab-Expressionsbibliotheken entwickelt werden, um eine schnelle und leichte Identifizierung von monoklonalen Fab-Fragmenten mit der erwünschten Spezifität zu ermöglichen (Huse, W.D. et al. (1989) Science 254: 1275–1281).
Es können verschiedene Immunassays zum Screenen verwendet werden, um Antikörper mit der gewünschten Spezifität zu identifizieren. Im Fachgebiet sind zahlreiche Protokolle für kompetitive Bindungs- und immunradiometrische Assays bekannt, entweder unter Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern mit etablierten Spezifitäten, Solche Immunassays beinhalten typischerweise die Messung der Komplexbildung zwischen Mnk und seinem spezifischen Antikörper. Ein zweifacher monoklonal basierender Immunassay unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die gegenüber zwei nicht interferierenden Mnk-Epitopen reaktiv sind, ist bevorzugt, es kann aber auch ein kompetitiver Bindungsassay verwendet werden (Maddox, siehe oben).
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die Mnk-Polynucleotide oder jegliches Fragment davon, oder Nucleinsäureeffektormoleküle, Aptamere, Antisense-Moleküle, Ribozyme oder RNAi-Moleküle für therapeutische Zwecke verwendet werden. In einem Aspekt können Aptamere, d.h. Nucleinsäure-Moleküle, die an ein Mnk-Protein binden können und dessen Aktivität modulieren können, durch ein Screening und ein Selektionsverfahren erzeugt werden, das die Verwendung von kombinatorischen Nucleinsäure-Bibliotheken einschliesst.
In einem weiteren Aspekt können Antisense-Moleküle zu dem für Mnk codierenden Polynucleotid in Situationen verwendet werden, worin es wünschenswert wäre, die Transkription der mRNA zu blockieren. Insbesondere können Zellen mit Sequenzen transformiert werden, die komplementär sind zu Mnk-codierenden Polynucleotiden. Somit können Antisense-Moleküle verwendet werden, um die Mnk-Aktivität zu modulieren oder eine Regulation der Genfunktion zu errreichen. Eine solche Technologie ist im Fachgebiet gut bekannt, und Sense- oder Antisense-Oligomere oder größere Fragmente können von verschiedenen Orten entlang der codierenden oder Kontrollregionen von Sequenzen, die für Mnk codieren, entworfen werden. Für die, Lieferung von Nucleotid-Sequenzen zum Zielorgan, Gewebe oder Zellpopulation können Expressionsvektoren verwendet werden, die von Retroviren, Adenovirus, Herpes oder Vaccinia-Viren, oder von verschiedenen bakteriellen Plasmiden abgeleitet sind. Es können Verfahren, welche Fachleuten gut bekannt sind, verwendet werden, um rekombinante Vektoren zu konstruieren, welche Antisense-Moleküle exprimieren werden, die zu den Polynucleotiden der Gene komplementär sind, die für Mnk codieren. Diese Techniken sind sowohl in Sambrook et al. (siehe oben) als auch in Ausubel et al. (siehe oben) beschrieben. Für Mnk codierende Gene können abgeschaltet werden durch Transformieren einer Zelle oder eines Gewebes mit Expressionsvektoren, welche hohe Spiegel des Polynucleotids oder Fragments davon, welches für Mnk codiert, exprimieren. Solche Konstrukte können verwendet werden, um nicht translatierbare Sense- oder Antisense-Sequenzen in eine Zelle einzubringen. Sogar in Abwesenheit der Integration in die DNA können solche Vektoren weiterhin RNA-Moleküle transkribieren, ehe sie von endogenen Nucleasen funktionsunfähig gemacht werden. Die transiente Expression kann mit einem nicht replizierenden Vektor für einen Monat oder mehr andauern, und sogar länger, wenn geeignete Replikationselemente ein Teil des Vektorsystems sind.
Wie oben beschrieben, können Modifikationen der Genexpression erhalten werden durch Entwerfen von Antisense-Molekülen, zum Beispiel DNA, RNA oder Nucleinsäureanaloga, wie etwa PNA, zu den Kontrollregionen der für Mnk codierenden Gene, d.h. zu den Promotoren, Enhancern und Introns. Oligonucleotide, die von der Stelle der Transkriptionsinitiation abgeleitet sind, zum Beispiel zwischen den Positionen –10 und +10 von der Startseite, sind bevorzugt. Ähnlich kann eine Inhibition erreicht werden unter Verwendung der "Triple-Helix"-Basenpaarungsmethodik. Triple-Helix-Paarung ist nützlich, da es eine Inhibition der Fähigkeit der Doppelhelix verursacht, sich ausreichend für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen Molekülen zu öffnen. Neuere therapeutische Fortschritte unter Verwendung von Triplex-DNA sind in der Literatur beschrieben worden (Gee, J. E. et al. (1994) In; Huber, B. E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologie Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.). Die Antisense-Moleküle können auch entworfen werden, um eine Translation der mRNA zu blockieren, durch Verhindern, dass das Transkript an Ribosomen bindet.
Ribozyme, enzymatische RNA-Moleküle, können auch verwendet werden, um die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Der Mechanismus der Ribozymwirkung schließt eine sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an komplementäre Target-RNA ein, gefolgt von einer endonukleolytischen Spaltung. Beispiele, welche verwendet werden können, schließen entwickelte Hammerkopfmotiv-Ribozymmoleküle ein, die spezifisch und effizient eine endonukleolytische Spaltung von Sequenzen, die für Mnk codieren, katalysieren können. Spezifische Ribozymspaltungsstellen in jeglichem potenziellen RNA-Target werden anfänglich identifiziert durch Absuchen des Targetmoleküls auf Ribozymspaltungsstellen, welche die folgenden Sequenzen einschließen: GUA, GUU und GUC. Wenn sie einmal identifiziert sind, können kurze RNA-Sequenzen von zwischen 15 und 20 Ribonucleotiden, entsprechend der Region des Targetgens, enthaltend die Spaltungsstelle, auf sekundäre Strukturmerkmale hin bewertet werden, welche das Oligonucleotid funktionsunfähig machen. Die Eignung von potenziellen Targets kann auch bewertet werden durch Austesten der Zugänglichkeit gegenüber einer Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden unter Verwendung von Ribonuclease-Protection-Assays.
Effektormoleküle, zum Beispiel Antisense-Moleküle und Ribozyme der Erfindung, können durch jedes im Fachgebiet bekannte Verfahren zur Synthese von Nucleinsäure-Molekülen hergestellt werden. Diese schließen Verfahren zur chemischen Synthese von Oligonucleotiden, wie etwa eine chemische Festphasen-Phosphoramidit-Synthese ein. Alternativ können RNA-Moleküle durch eine in vitro- und in vivo-Transkription von DNA-Sequenzen erzeugt werden, codierend für Mnk. Solche DNA-Sequenzen können in eine Vielzahl von Vektoren mit geeigneten RNA-Polymerasepromotoren, wie etwa T7 oder SP6 eingebaut werden. Alternativ können diese cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, in Zelllinien, Zellen oder Gewebe eingebracht werden. RNA-Moleküle können modifiziert werden, um die intrazelluläre Stabilität und Halbwertszeit zu erhöhen. Geeignete Modifikationen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf das Anheften von flankierenden Sequenzen an die 5'- und/oder 3'-Enden des Moleküls oder die Verwendung von Phosphorothioat oder 2'-O-Methyl, eher als Phosphodiesterbindungen innerhalb des Grundgerüsts des Moleküls. Dieses Konzept ist inhärent für die Herstellung von PNAs und kann in allen diesen Molekülen durch den Einschluss von nicht traditionellen Basen, wie etwa Inosin, Queosin und Wybutosin, ebenso wie Acetyl-, Methyl-, Thio- und ähnlich modifizierte Formen von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin, welche nicht so leicht von endogenen Endonucleasen erkannt werden können, ausgeweitet werden.
Die Aktivität von Mnk-Proteinen kann zum Beispiel durch in vitro-Kinaseassays untersucht werden, wie von Tschopp et al., 2000, siehe oben, beschrieben, oder durch jedes andere geeignete Assayprinzip, wie unten beschrieben. Als Inhibitor von Mnk kann in diesem Assay ein Staurosporin-Derivat, wie etwa CGP57380 oder CGP052088 verwendet werden, wie von Tschopp et al., 2000, siehe oben, oder Knauf et al., 2001, siehe oben, beschrieben wird. Als negative Kontrolle kann die Verbindung CGP52428 verwendet werden, welche gegenüber Mnk inaktiv ist, aber eine ähnliche Zytotoxizität wie CGP052088 zeigt, oder alle anderen chemischen Einheiten mit einer Kinase-inhibitorischen Aktivität, mit Ausnahme der Aktivität gegenüber Mnk. Außerdem können Derivate von CGP57380 auf eine Aktivität gegenüber Mnk untersucht werden, und sind Substanzen für die Behandlung, Prophylaxe und Diagnose von metabolischen Erkrankungen, wie oben erwähnt. Derivate von CGP57380 können beispielsweise mittels Modifikation durch herkömmliche chemische, physikalische und biochemische Mittel erzeugt werden, und können verwendet werden, um kombinatorische Bibliotheken herzustellen. Sie können direkten oder zufälligen chemischen Modifikationen unterzogen werden, wie etwa einer Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidifizierung, usw., um Strukturanaloga herzustellen.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von Mnk-Kinaseinhibitoren oder Aktivatoren für die Behandlung, Prophylaxe oder Diagnose von metabolischen Erkrankungen, wie oben erwähnt. Bevorzugt, aber nicht ausschließlich sind die Mnk-Kinaseinhibitoren Staurosporin- oder Pyrazol-Derivate. Beispiele für Pyrazol-Derivate sind in EP-A-0 819 129 beschrieben, welche hierin als Referenz eingeschlossen ist. Da CGP57380 bis zu 30 μM nicht zytotoxisch ist, kann diese Substanz bevorzugt verwendet werden, um die Kinaseaktivität zu hemmen, bevorzugt Mnk2, und als Substanz für die Behandlung, Prophylaxe und Diagnose von metabolischen Erkrankungen, wie oben erwähnt, verwendet werden.
Es sind viele Verfahren zum Einbringen von Vektoren in Zellen oder Gewebe erhältlich und gleich geeignet zur Verwendung in vivo, in vitro und ex vivo. Für eine ex vivo-Therapie können Vektoren in Stammzellen, die dem Patienten entnommen wurden, eingebracht werden, und klonal vermehrt werden für eine autologe Transplantation zurück in denselben Patienten. Eine Lieferung durch Transfektion und durch Liposomeninjektionen kann unter Verwendung von Verfahren erreicht werden, welche im Fachgebiet gut bekannt sind. Alle der oben beschriebenen therapeutischen Verfahren können bei jedem geeigneten Subjekt angewendet werden, einschließlich beispielsweise Säugetiere, wie etwa Hunde, Katzen, Kühe, Pferde, Kaninchen, Affen, und am meisten bevorzugt Menschen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger für jeden der oben beschriebenen therapeutischen Effekte. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können aus Mnk, Antikörper gege Mnk, Mimetika, Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren von Mnk bestehen. Die Zusammensetzungen können alleine oder in Kombination mit zumindest einem anderen Mittel verabreicht werden, wie etwa einer stabilisierenden Verbindung, welche in jedem sterilen biokompatiblen pharmazeutischen Träger verabreicht werden kann, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose und Wasser. Die Zusammensetzungen können einem Patienten alleine verabreicht werden, oder in Kombination mit anderen Mitteln, Arzneimitteln oder Hormonen. Die in dieser Erfindung verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen können durch eine Anzahl von Wegen verabreicht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf orale, intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrameduläre, intratekale, intraventrikuläre, transdermale, subkutane, intraperitoneale, intranasale, enterale, topikale, sublinguale oder rektale Mittel.
Außer den Wirkstoffen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger enthalten, umfassend Trägersubstanzen und Hilfsstoffe, welche die Verarbeitung der Wirkstoffe in Präparationen, welche pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Weitere Details von Verfahren für die Formulierung und Verabreichung können in der neuesten Ausgabe von „Remington's Pharmaceutical Sciences" gefunden werden (Maack Publishing Co., Easton, Pa.). Pharmazeutische Zusammensetzungen für eine orale Verabreichung können unter Verwendung von pharmazeutisch akzeptablen Trägern formuliert werden, die im Fachgebiet gut bekannt sind, in Dosierungen, die für eine orale Verabreichung geeignet sind. Solche Träger ermöglichen es, die pharmazeutischen Zusammensetzungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirup, Breie, Suspensionen und dergleichen zu formulieren, zur Ingestion durch den Patienten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer Art und Weise hergestellt werden, die im Fachgebiet bekannt ist, zum Beispiel mittels konventioneller Mischungs-, Lösungs-, Granulations-, Drageeherstellungs-, Pulverisierungs-, Emulgierungs-, Einkapselungs-, Einschluss- oder Lyophilisierungsverfahren. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können als ein Salz bereitgestellt werden, und können mit vielen Säuren gebildet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure usw. Nachdem die pharmazeutischen Zusammensetzungen hergestellt worden sind, können sie in einem geeigneten Behälter platziert werden und für die Behandlung einer angegebenen Bedingung markiert werden. Für eine Administration von Mnk würde solch eine Markierung die Menge, Häufigkeit und das Verfahren der Verabreichung einschließen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für eine Verwendung in der Erfindung geeignet sind, schließen Zusammensetzungen ein, worin die Wirkstoffe in einer effektiven Menge enthalten sind, um den beabsichtigten Zweck zu erreichen. Die Bestimmung einer effektiven Dosis liegt im Bereich der Fähigkeit von Fachleuten. Für alle Verbindungen können die therapeutisch effektiven Dosierungen zuerst entweder in Zellulturassays, zum Beispiel in Präadipozyten-Zelllinien, oder in Tiermodellen, normalerweise Mäuse, Kaninchen, Hunde oder Schweine beurteilt werden. Das Tiermodell kann auch verwendet werden, um den geeigneten Konzentrationsbereich und den Weg der Verabreichung zu bestimmen. Solche Informationen können dann verwendet werden, um nützliche Dosierungen und Wege der Verabreichung im Menschen zu bestimmen. Eine therapeutisch effektive Dosis bezeichnet eine Menge an Wirkstoff, zum Beispiel Mnk-Fragmente davon, Antikörper gegen Mnk, um eine spezielle Bedingung zu behandeln. Die therapeutische Wirksamkeit und Toxizität können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder in Versuchstieren bestimmt werden, zum Beispiel ED50 (die Dosierung, die in 50% der Population therapeutisch wirksam ist) und LD50 (die Dosierung, die für 50% der Population lethal ist). Das Dosisverhältnis zwischen therapeutischen und toxischen Effekten ist der therapeutische Index, und er kann als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche große therapeutische Indices zeigen, sind bevorzugt. Die aus Zellkulturassays und Tierversuchen erhaltenen Daten werden bei der Formulierung eines Dosisbereichs für die humane Verwendung verwendet. Die Dosierung, die in solchen Zusammensetzungen enthalten ist, liegt bevorzugt innerhalb eines Bereichs von zirkulierenden Konzentrationen, welche die ED50 mit einer geringen oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosierung variiert innerhalb dieses Bereichs, in Abhängigkeit von der verwendeten Dosierungsform, der Empfindlichkeit des Patienten und der Art der Verabreichung. Die exakte Dosierung wird vom Praktiker bestimmt werden, anhand von Faktoren, die mit dem Subjekt, welches einer Behandlung bedarf, verbunden sind. Die Dosierung und Verabreichung werden angepasst, um ausreichende Spiegel des aktiven Anteils bereitzustellen oder den erwünschten Effekt zu erhalten. Faktoren, die in Betracht gezogen werden können, schließen die Heftigkeit des Krankheitszustandes, die allgemeine Gesundheit des Subjekts, Alter, Gewicht und Geschlecht des Subjekts, Nahrung, Zeit und Häufigkeit der Administration, die Mittel-Kombination(en), Reaktionsempfindlichkeiten und die Toleranz/Antwort auf die Therapie ein. Langwirkende pharmazeutische Zusammensetzungen können alle drei bis vier Tage, jede Woche oder einmal in zwei Wochen verabreicht werden, in Abhängigkeit von der Halbwertszeit und Beseitigungsrate der speziellen Formulierung. Normale Dosismengen können von 0,1 bis 100 000 Mikrogramm variieren, bis zu einer Gesamtdosis von etwa 1 g, in Abhängigkeit von der Art der Applikation. Ein Leitfaden für allgemeine Dosierungen und Lieferungsverfahren wird in der Literatur bereitgestellt und ist den Praktikern des Fachgebiets allgemein zugänglich. Fachleute verwenden verschiedene Formulierungen für Nucleotide und für Proteine oder deren Inhibitoren. Ähnlich wird die Lieferung von Polynucleotiden oder Polypeptiden spezifisch sein für bestimmte Zellen, Bedingungen, Orte, usw.
In einer anderen Ausführungsform können Antikörper, welche spezifisch an Mnk binden, für die Diagnose von Bedingungen oder Erkrankungen verwendet werden, die charakterisiert sind durch oder verbunden sind mit einer Über- oder Unterexpression von Mnk, oder in Assays, um Patienten zu überwachen, die mit Mnk, Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren behandelt werden. Die für diagnostische Zwecke nützlichen Antikörper können in der gleichen Art und Weise hergestellt werden wie diejenigen, die oben für die Therapie beschrieben sind. Diagnostische Assays für Mnk schließen Verfahren ein, welche den Antikörper verwenden, und eine Markierung, um Mnk in humanen Körperflüssigkeiten oder Extrakten von Zellen oder Geweben nachzuweisen. Die Antikörper können mit oder ohne Modifikation verwendet werden, und können entweder durch kovalentes oder nicht kovalentes Verknüpfen mit einem Reportermolekül markiert werden. Es kann eine breite Vielfalt von Reportermolekülen verwendet werden, welche im Fachgebiet bekannt sind, einige von ihnen sind oben beschrieben.
Zur Messung von Mnk ist eine Vielzahl von Protokollen im Stand der Technik bekannt, einschließlich ELISA, RIA und FACS, und stellt eine Basis zur Diagnose veränderter oder anormaler der Mnk-Expressionsniveaus dar. Normale oder Standardwerte der Mnk-Expression werden etabliert durch Kombination von Körperflüssigkeiten oder Zellextrakten, die von normalen Säugetiersubjekten, bevorzugt Menschen, entnommen sind, mit einem Antikörper gegen Mnk unter Bedingungen, die für eine Komplexbildung geeignet sind. Die Menge der Standardkomplexbildung kann durch verschiedene Verfahren quantifiziert werden, bevorzugt aber durch photometrische Mittel. Die Mengen von exprimierten Mnk in der Kontrolle und Krankheitsproben, zum Beispiel von biopsinierten Geweben, werden mit den Standardwerten verglichen. Eine Abweichung zwischen den Standardwerten und den Werten des Subjekts begründet die Parameter zur Diagnose einer Erkrankung. Eine Analyse der Mnk-Expression kann auch durch Bestimmung der Mnk-Aktivität in Assayformaten bestimmt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind und unten ausführlicher beschrieben sind.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die Polynucleotide, die für Mnk spezifisch sind, für diagnostische Zwecke verwendet werden. Die Polynucleotide, die verwendet werden können, schließen Oligonucleotid-Sequenzen, Antisense-RNA und DNA-Moleküle und PNAs ein. Die Polynucleotide können verwendet werden, um eine Genexpression in biopsinierten Geweben nachzuweisen und zu quantifizieren, in denen die Expression von Mnk mit einer Erkrankung in Verbindung gebracht werden kann. Der diagnostische Assay kann verwendet werden, um zwischen nicht vorhandener, vorhandener und überschüssiger Expression von Mnk zu unterscheiden, und um die Regulation von Mnk-Spiegeln während einer therapeutischen Behandlung zu überwachen.
In einem Aspekt kann eine Hybridisierung mit PCR-Sonden, welche Polynucieotid-Sequenzen einschließlich genomischer Seguenzen detektieren können, die für Mnk und/oder eng verwandte Moleküle codieren, verwendet werden, um Nucleinsäure-Sequenzen, die für Mnk codieren, zu identifizieren. Die Spezifität der Sonde, ob sie aus einer hochspezifischen Region hergestellt ist, zum Beispiel einzigartigen Nucleotiden in der 5'regulatorischen Region, oder einer weniger spezifischen Region, zum Beispiel insbesondere in der 3'-codierenden Region, und die Stringenz der Hybridisierung oder Amplifikation (maximal, hoch, mäßig oder gering) werden festlegen, ob die Sonde nur natürlich vorkommende für Mnk codierende Sequenzen, Allele oder verwandte Sequenzen identifiziert. Sonden können auch verwendet werden zum Nachweis von verwandten Sequenzen, und sollten bevorzugt mindestens 50% der Nucleotide aus einer der für Mnk codierenden Sequenzen enthalten. Die Hybridisierungssonden der Erfindung können DNA oder RNA sein und abgeleitet sein von der Nucleotid-Sequenz von AF237775, NM_017572.1, NM_003684.2 oder AB000409.1, oder von einer genomischen Sequenz einschließlich Promotor, Enhancerelementen und Introns des natürlich vorkommenden Mnk. Mittel zur Herstellung spezifischer Hybridisierungssonden für DNAs, die für Mnk codieren, schließen die Klonierung von Nucleinsäure-Sequenzen, die für Mnk-Derivate codieren, in Vektoren zur Herstellung von mRNA-Sonden ein. Solche Vektoren sind im Fachgebiet bekannt, kommerziell erhältlich und können verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro zu synthetisieren, mittels Zugabe der geeigneten RNA-Polymerasen und der geeigneten markierten Nucleotide. Hybridisierungssonden können durch eine Vielzahl von Reportergruppen markiert werden, zum Beispiel Radionuclide, wie etwa ³²P oder ³⁵S, oder enzymatische Markierungen, wie etwa alkalische Posphatase, gekoppelt an die Sonde via Avidin/Biotin-Kopplungssysteme und dergleichen.
Polynucleotid-Seguenzen, die für Mnk codieren, können für die Diagnose von Bedingungen oder Erkrankungen verwendet werden, welche mit der Expression von Mnk assoziiert sind. Beispiele solcher Bedingungen oder Erkrankungen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf pankreatische Krankheiten und Erkrankungen, einschließlich Diabetes. Polynucleotid-Sequenzen, die für Mnk codieren, können auch verwendet werden, um den Fortschritt von Patienten zu überwachen, welche eine Behandlung gegen pankreatische Krankheiten und Erkrankungen, einschließlich Diabetes erhalten. Die Polynucleotid-Sequenzen, die für Mnk codieren, können in Southern- oder Northern-Analysen, Dot-Blot oder anderen Membran-basierenden Technologien verwendet werden; in PCR-Technologien oder in Dip-Stick, Pin, ELISA- oder Chip-Assays unter Verwendung von Flüssigkeiten oder Geweben von Patientenbiopsien, um eine veränderte Mnk-Expression nachzuweisen. Solche qualitativen oder quantitativen Verfahren sind im Fachgebiet gut bekannt.
In einem besonderen Aspekt können die für Mnk codierenden Nucleotid-Sequenzen in Assays nützlich sein, welche eine Aktivierung oder Induktion verschiedener metabolischer Krankheiten und Erkrankungen nachweisen, einschließlich Fettleibigkeit, Diabetes, Essstörungen, Auszehrungssyndrome (Kachexie), pankreatische Funktionsstörungen, Arteriosklerose, koronare Herzerkrankung (CAD), Erkrankungen, die mit der ROS-Produktion verbunden sind und neurogenerative Erkrankungen. Die für Mnk codierenden Nucleotid-Sequenzen können durch Standardverfahren markiert sein und zu einer Flüssigkeit oder einer Gewebeprobe von einem Patienten zugegeben werden, unter Bedingungen, die für eine Bildung von Hybridisierungskomplexen geeignet sind. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird die Probe gewaschen und das Signal wird quantifiziert und mit einem Standardwert verglichen. Die Gegenwart von veränderten Niveaus von Nukleotidsequenzen, die für Mnk codieren, in der Probe, verglichen mit einer Kontrollprobe, zeigt die Gegenwart der damit verbundenen Erkrankung an. Solche Assays können auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von besonderen therapeutischen Behandlungsverordnungen in Tierstudien, in klinischen Studien oder in der Überwachung der Behandlung eines einzelnen Patienten zu bewerten.
Um eine Basis für die Diagnose von Erkrankungen bereitzustellen, die mit der Expression von Mnk assoziiert sind, wird ein normales oder Standardprofil der Expression etabliert. Dies kann erreicht werden durch Kombination von Körperflüssigkeiten oder Zellextrakten, die normalen Subjekten, entweder Tieren oder Menschen, entnommen sind, mit einer Sequenz oder einem Fragment davon, welches für Mnk codiert, unter Bedingungen, die für eine Hybridisierung oder Amplifikation geeignet sind. Eine Standardhybridisierung kann durch Vergleichen der Werte quantifiziert werden, die von normalen Subjekten erhalten wurden, mit denen aus einem Experiment, worin eine bekannte Menge eines im Wesentlichen gereinigten Polynucleotids verwendet wird. Die Standardwerte, die von normalen Proben erhalten werden, können mit Werten verglichen werden, die von Proben von Patienten erhalten werden, welche Symptome für eine Erkrankung aufweisen. Die Abweichung zwischen den Werten des Standards und des Subjekts wird verwendet, um die Gegenwart einer Erkrankung zu begründen. Wenn ein Krankheit nachgewiesen ist und ein Behandlungsprotokoll begonnen wird, können Hybridisierungsassays auf einer regelmäßigen Basis wiederholt werden, um zu bewerten, ob sich das Expressionsniveau in dem Patienten dem anzunähern beginnt, dasin einem normalen Patienten beobachtet wird. Die von aufeinanderfolgenden Assays erhaltenen Ergebnisse können verwendet werden, um die Wirksamkeit einer Behandlung über eine Zeitperiode im Bereich von mehreren Tagen oder Monaten zu zeigen.
Im Hinblick auf metabolische Krankheiten und Erkrankungen, einschließlich Fettleibigkeit, Diabetes, Essstörungen, Auszehrungssyndrome (Kachexie), pankreatische Funktionsstörungen, Arteriosklerose, koronare Herzerkrankung (CAD), Erkrankungen, die mit der ROS-Produktion verbunden sind und neurodegenerative Erkrankungen, zeigt die Gegenwart einer relativ hohen Menge des Transkripts in biopsiertem Gewebe eines Individuums eine Prädisposition für die Entwicklung der Erkrankung an, oder kann Mittel bereitstellen zum Nachweis der Erkrankung vor dem Auftreten von tatsächlichen klinischen Symptomen. Eine eindeutigere Diagnose dieser Art kann es Personen des Gesundheitswesens erlauben, vorbeugende Maßnahmen oder eine frühere energische Behandlung anzuwenden, wobei die Entwicklung oder ein weiteres Fortschreiten der pankreatischen Krankheiten oder Erkrankungen verhindert wird. Weitere diagnostische Verwendungen für Oligonucleotide, die von den für Mnk codierenden Sequenzen entworfen wurden, können die Verwendung von PCR einschließen. Solche Oligomere können chemisch synthetisiert, enzymatisch hergestellt oder von einer rekombinanten Quelle erzeugt werden. Oligomere werden bevorzugt aus zwei Nucleotid-Sequenzen bestehen, eine mit einer Sense-Orientierung (5'.fwdarw.3') und eine andere mit Antisense (3'.rarw.5'), verwendet unter optimierten Bedingungen zur Identifizierung eines speziellen Gens oder einer Bedingung. Die gleichen zwei Oligomere, nested Sets von Oligomeren oder sogar ein degenerierter Pool von Oligomeren, kann unter weniger stringenten Bedingungen zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von eng verwandten DNA- oder RNA-Sequenzen verwendet werden.
Verfahren, welche auch verwendet werden können, um die Mnk-Expression zu quantifizieren, schließen radiomarkierte oder biotinylierte Nucleotide, Coamplifikation einer Kontrollnucleinsäure und Standardkurven ein, auf denen die experimentellen Ergebnisse interpoliert sind (Melby, P.C. et al. (1993) J. Immunol. Methods, 159: 235–244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 212: 229–236). Die Geschwindigkeit der Quantifizierung von multiplen Proben kann beschleunigt werden durch Ausführen des Assays in einem ELISA-Format, worin das interessierende Oligomer in verschiedenen Verdünnungen präsentiert wird und eine spektrophotometrische oder kolorimetrische Antwort eine schnelle Quantifizierung ergibt.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die Mnk-Nucleinsäure-Sequenzen auch verwendet werden, um Hybridisierungssonden herzustellen, welche für ein Mapping der natürlich vorkommenden genomischen Sequenz nützlich sind. Die Sequenzen können unter Verwendung gut bekannter Verfahren zu einem besonderen Chromosom oder zu einer speziellen Region des Chromosoms kartographiert werden. Solche Verfahren schließen FISH, FACS oder artifizielle Chromosomenkonstruktionen ein, wie etwa artifizielle Hefechromosomen, artifizielle Bakterienchromosomen, bakterielle P1-Konstrukte oder Einzelchromosomen-cDNA-Bibliotheken, wie in Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7: 127–134, und Trask, B. J. (1991) Trends Genet. 7: 149–154 angeführt. FISH (wie in Verma et al. (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y.) beschrieben, kann mit anderen physikalischen Verfahren des Chromosomen-Mapping und genetischen Map-Daten in Beziehung gesetzt werden. Beispiele für genetische Map-Daten können in der Genome-Ausgabe von Science (265: 1981f) von 1994 gefunden werden. Eine Korrelation zwischen der Lage des Mnk-codierenden Gens auf einer physischen Chromosomen-Karte und einer speziellen Erkrankung oder Prädisposition für eine spezielle Erkrankung, können helfen, die DNA-Region, die mit dieser genetischen Erkrankung assoziiert ist, einzuschränken.
Die Nucleotid-Sequenzen der gegenwärtigen Erfindung können verwendet werden, um Unterschiede in Gensequenzen zwischen normalen, Träger- oder betroffenen Individuen nachzuweisen. Es kann eine in situ-Hybridisierung von Chromosomenpräparationen und physikalische Mapping-Verfahren zur Ausdehnung genetischer Karten verwendet werden, wie etwa eine Bindungsanalyse unter Verwendung etablierter Chromosomenmarker. Die Positionierung eines Gens auf dem Chromosom einer anderen Säugetierart, wie etwa Maus, kann oft assoziierte Macker enthüllen, sogar, wenn die Nummer oder der Arm eines speziellen humanen Chromosoms nicht bekannt ist. Neue Sequenzen können durch physikalisches Mapping Chromosomenarmen oder Teilen davon zugeordnet werden. Dies stellt eine verlässliche Information für die Untersuchenden bereit, die nach Erkrankungsgenen suchen, unter Verwendung von positioneller Klonierung oder anderen Verfahren zur Auffindung von Genen. Wenn eine Erkrankung oder ein Syndrom durch genetische Bindung an eine bestimmte Genomenregion grob lokalisiert worden ist, zum Beispiel AT an 11q22–23 (Gatti, R.A. et al. (1988) Nature 336: 577–580), können alle Sequenzen, die diesem Bereich zugeordnet sind, assoziierte oder regulatorische Gene für eine weitere Untersuchung darstellen. Die Nucleotid-Sequenzen der gegenwärtigen Erfindung können auch verwendet werden, um unter normalen, Träger- oder betroffenen Individuen Unterschiede in der Chromosomenlokation aufgrund von Translokation, Inversion usw. nachzuweisen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die Proteine der Erfindung, deren katalytische oder immunogene Fragmente oder Oligopeptide davon, ein in vitro-Modell, eine genetisch veränderte Zelle oder ein Tier, für Screening-Bibliotheken für Verbindungen verwendet werden, in jeder der vielzähligen Wirkstoff-Screening-Verfahren. Man kann Effektoren, zum Beispiel Rezeptoren, Enzyme, Proteine, Peptide, Liganden oder Substrate, welche an ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Proteine binden, sie modulieren oder deren Wirkung nachahmen, identifizieren. Das Protein oder Fragment davon, das in einem solchen Screening verwendet wird, kann frei in Lösung vorliegen, an einem festen Träger befestigt sein, von einer Zelloberfläche getragen werden oder intrazellulär lokalisiert sein. Die Bildung von Bindungskomplexen zwischen den erfindungsgemäßen Proteinen und dem getesteten Mittel kann gemessen werden. Die Mittel können auch, entweder direkt oder indirekt, die Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine beeinflussen. Targetmechanismen können beispielsweise eine Kinaseaktivität, insbesondere die Phosphorylierung von Proteinen oder Peptiden, am meisten bevorzugt, aber nicht beschränkt auf Serin und Threoninreste, einschließen. Ein anderer Targetmechanismus könnte die Regulation der Mnk-Funktion durch posttranslationale Modifikationen einschließen, wie etwa Phosphorylierung, Dephosphorylierung, Acetylierung, Alkylierung, Ubiquitinierung, proteolytisches Prozessieren, subzelluläre Lokalisation oder Degradation. Noch ein anderer Targetmechanismus könnte die Wechselwirkung von Mnk mit Proteinbindungspartnern einschließen, wie etwa, aber nicht beschränkt auf Phospholipase A, Östrogenrezeptoren, Kinasen oder Translationsfaktoren. Von besonderem Interesse sind Screening-Assays für Mittel, welche eine geringe Toxizität gegenüber Säugetierzellen besitzen. Der Begriff "Mittel", wie hierin verwendet, beschreibt jedes Molekül, zum Beispiel ein Protein oder Arzneimittel, mit der Fähigkeit, die physiologische Funktion von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Proteinen zu verändern oder nachzuahmen. Potenzielle Mittel umfassen zahlreiche chemische Klassen, obwohl sie typischerweise organische Moleküle sind, bevorzugt kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 50 und weniger als etwa 2500 Dalton. Potenzielle Mittel umfassen funktionelle Gruppen, die für eine strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen notwendig sind, insbesondere eine Wasserstoffbindung und typischerweise schließen sie mindestens eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe ein, bevorzugt mindestens zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Die potenziellen Mittel umfassen oft carbozyklische oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einem oder mehreren der obigen funktionellen Gruppen substituiert sind.
Potenzielle Mittel werden auch unter Biomolekülen gefunden, einschließlich Peptiden, Sacchariden, Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Nucleinsäuren und Derivaten, Strukturanaloga oder Kombinationen davon. Potenzielle Mittel werden von einer großen Vielfalt von Quellen erhalten, einschließlich Bibliotheken von synthetischen oder natürlichen Verbindungen. Zum Beispiel sind zahlreiche Mittel zur zufälligen und direkten Synthese einer großen Vielfalt von organischen Verbindungen und Biomolekülen erhältlich, einschließlich die Expression von randomisierten Oligonucleotiden und Oligopeptiden. Alternativ sind Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in Form von bakteriellen, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten erhältlich oder leicht herzustellen. Außerdem sind natürliche oder synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen durch konventionelle chemische, physikalische und biochemische Mittel leicht modifizierbar, und können verwendet werden, um kombinatorische Bibliotheken herzustellen. Bekannte pharmakologische Mittel können gerichteten oder zufälligen chemischen Modifikationen unterzogen werden, wie etwa einer Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidifizierung usw., um Strukturanaloga herzustellen. Wenn der Screening-Assay ein Bindungsassay ist, kann eines oder mehrere der Moleküle mit einer Markierung verbunden werden, wobei die Markierung direkt oder indirekt ein detektierbares Signal bereitstellen kann.
Ein anderes Verfahren zum Arzneimittel-Screening, welches verwendet werden kann, stellt ein Hochdurchsatz-Screening von Verbindungen bereit, welche eine geeignete Bindungsaffinität zu dem interessierenden Protein besitzen, wie in der publizierten PCT-Anmeldung WO 84/03564 beschrieben ist. In diesem Verfahren, wenn es auf die erfindungsgemäßen Proteine angewendet wird, werden große Anzahlen von verschiedenen kleinen Testverbindungen, zum Beispiel Aptamere, Peptide, niedermolekulare Verbindungen usw., bereitgestellt oder an einem festen Substrat, wie etwa Kunststoffstifte oder einige andere Oberflächen, synthetisiert. Die Testverbindungen werden mit den Proteinen oder Fragmenten davon zur Reaktion gebracht und gewaschen. Gebundene Proteine werden dann durch im Fachgebiet gut bekannte Verfahren nachgewiesen. Gereinigte Proteine können auch direkt auf Platten geschichtet werden, zur Verwendung in den zuvor genannten Arzneimittel-Screeningverfahren. Alternativ können nicht neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und es auf einem festen Träger zu immobilisieren. In einer anderen Ausführungsform kann man kompetitive Arzneimittel-Screeningassays verwenden, worin neutralisierende Antikörper, die an das Protein spezifisch binden können, mit einer Testverbindung um die Bindung des Proteins konkurrieren. Auf diese Art und Weise können die Antikörper verwendet werden, um die Anwesenheit jedes Peptids nachzuweisen, welches eine oder mehrere antigene Determinanten mit dem Protein teilt.
Potenzielle Mittel können auch in Kinaseassays gefunden werden, worin ein Kinasesubstrat, wie etwa ein Protein oder ein Peptid, welches Modifikationen, die weiterhin unten beschrieben sind, einschließen kann oder nicht, oder andere durch die Proteine oder Proteinfragmente der Erfindung phosphoryliert werden. Ein potenzielles therapeutisches Mittel kann durch seine Fähigkeit identifiziert werden, die enzymatische Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine zu steigern oder zu verringern. Die Kinaseaktivität kann durch einen Wechsel der chemischen, physikalischen oder immunologischen Eigenschaften des Substrats aufgrund einer Phosphorylierung nachgewiesen werden. Ein Beispiel könnte der Transfer von mit Radioisotopen markierten Phosphat-gruppen von einem geeigneten Donor-Molekül zu dem Kinasesubstrat sein, katalysiert durch die Polypeptide der Erfindung. Die Phosphorylierung des Substrats kann gefolgt werden von einem Nachweis der Autoradiographie des Substrats mit Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind. In noch einem anderen Beispiel kann der Wechsel der Substratmasse aufgrund seiner Phosphorylierung mittels Verfahren der Massenspektrometrie nachgewiesen werden. Man kann auch den Phosphorylierungsstatus eines Substrats mit einem Reagenz nachweisen, das zwischen dem phosphorylierten und nicht phosphorylierten Status des Substrats unterscheidet. Solch ein Reagenz kann dadurch wirken, dass es verschiedene Affinitäten für die phosphorylierten und nicht phosphorylierten Formen des Substrats besitzt oder dadurch, dass es spezielle Affinitäten für Phosphatgruppen besitzt. Solch ein Reagenz kann sein, ist aber nicht beschränkt auf einen Antikörper oder ein Antikörperderivat, eine rekombinante Antikörper-ähnliche Struktur, ein Protein, ein Nucleinsäure, ein Molekül enthaltend ein komplexiertes Metallion, eine Anionenaustauschchromatographiematrix, eine Affinitätschromatographiematrix oder jedes andere Molekül mit einer Phosphorylierungs-abhängigen Selektivität gegenüber dem Substrat. Solch ein Reagenz könnte verwendet werden, um das Kinasesubstrat nachzuweisen, welches während oder nach einer enzymatischen Reaktion an einen festen Träger immobilisiert ist. Wenn das Reagenz ein Antikörper ist, könnte seine Bindung an das Substrat mittels einer Vielzahl von Verfahren nachgewiesen werden, wie sie in Harlow und Lane, 1998, Antibodies, CSH Lab Press, N.Y. beschrieben sind. Wenn das Reagenzmolekül kein Antikörper ist, kann es mittels seiner chemischen, physikalischen oder immunologischen Eigenschaften nachgewiesen werden, die endogen mit ihm assoziiert sind oder konstruiert wurden.
In noch einem anderen Beispiel kann das Kinasesubstrat Merkmale besitzen, entworfen oder endogen, um seine Bindung oder seinen Nachweis zu erleichtern, um ein Signal zu erzeugen, welches für die Analyse des Phosphorylierungsstatus des Substrats geeignet ist. Diese Merkmale können sein, sind aber nicht beschränkt auf ein Biotinmolekül oder Derivat davon, ein Glutathion-S-Transferaseanteil, ein Anteil von 6 oder mehr aufeinanderfolgenden Histidinresten, eine Aminosäure-Sequenz oder ein Hapten mit der Funktion eines Epitoptags, ein Fluorochrom, ein Enzym oder Enzymfragment. Das Kinasesubstrat kann an diese oder andere Merkmale mit einem molekularen Spacerarm verbunden sein, um eine sterische Behinderung zu vermeiden.
In einem Beispiel kann das Kinasesubstrat mit einem Fluorophor markiert sein. Die Bindung des Reagenz an das markierte Substrat in Lösung kann gefolgt werden von dem Verfahren der Fluoreszenzpolarisierung, wie es in der Literatur beschrieben ist (siehe zum Beispiel Deshpande, S. et al. (1999) Prog. Biomed. Optics (SPIE) 3603: 261; Parker, G.J. et al. (2000) J. Biomol. Screen. 5: 77–88; Wu, P. et al. (1997) Anal. Biochem. (249: 29–36). In einer Variation dieses Beispiels kann ein fluoreszentes Tracermolekül mit dem Substrat um den Analyten konkurrieren, um eine Kinaseaktivität durch ein Verfahren nachzuweisen, welches Fachleuten als indirekte Fluoreszenzpolarisierung bekannt ist.
Die Nucleinsäuren, die für die erfindungsgemäßen Proteine codieren, können verwendet werden, um transgene Zelllinien und Tiere herzustellen. Diese transgenen Tiere sind für die Untersuchung der Funktion und der Regulation der erfindungsgemäßen Proteine in vivo nützlich. Transgene Tiere, insbesondere transgene Säugetiere, können als ein Modellsystem für die Untersuchung von vielen Entwicklungs- und zellulären Prozessen dienen, die beim Menschen normal sind. Transgene Tiere können durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen hergestellt werden, wobei der normale Locus des Gens, das für das erfindungsgemäße Protein codiert, mutiert ist. Alternativ kann ein Nucleinsäure-Konstrukt, codierend für das Protein, in Oozyten injiziert werden und wird in das Genom zufällig integriert. Man kann die erfindungsgemäße Gene oder Varianten davon auch in Geweben exprimieren, wo sie normalerweise nicht exprimiert werden, oder zu anormalen Zeiten der Entwicklung. Weiterhin können Varianten der erfindungsgemäßen Gene, wie etwa spezielle Konstrukte, die Antisense-Moleküle exprimieren, oder Expression von dominant negativen Mutationen, welche die Expression der erfindungsgemäßen Proteine blockieren oder verändern, zufällig in das Genom integriert werden. Ein detektierbarer Macker, wie etwa IacZ oder Luciferase, kann in den Locus der erfindungsgemäßen Gene eingebracht werden, wobei eine Hochregulierung der Expression der erfindungsgemäßen Gene in einem leicht nachweisbaren Wechsel im Phänotyp resultieren. Vektoren für eine stabile Integration schließen Plasmide, Retroviren und andere Tierviren, artifizielle Hefechromosomen (YACs) und dergleichen ein. DNA-Konstrukte für eine homologe Rekombination werden zumindest Anteile der erfindungsgemäßen Gene mit der gewünschten genetischen Modifikation enthalten, und werden Regionen der Homologie mit dem Ziellocus einschließen. Günstigerweise sind Marker für eine positive und negative Selektion eingeschlossen. DNA-Konstrukte für eine zufällige Integration brauchen keine Regionen der Homologie zu enthalten, um eine Rekombination zu vermitteln. DNA-Konstrukte für eine zufällige Integration werden aus den Nucleinsäuren, die für die erfindungsgemäßen Proteine codieren, einem regulatorischen Element (Promotor), einem Intron und einem Polyadenylierungssignal bestehen. Verfahren zur Herstellung von Zellen mit gezielten Genmodifikationen durch homologe Rekombination sind im Fachgebiet bekannt. Für embryonale Stammzellen (ES) kann eine ES-Zelllinie verwendet werden, oder es können embryonale Zellen frisch aus einem Wirt, zum Beispiel Maus, Ratte, Meerschweinchen usw. erhalten werden. Solche Zellen werden auf einer geeigneten Fibroblasten-Nährschicht angezogen und wachsen in Gegenwart des Leukämieinhibitorischen Faktors (LIF). ES oder embryogene Zellen können transfiziert werden und können dann verwendet werden, um transgene Tiere zu erzeugen. Nach der Transfektion werden die ES-Zellen auf einer Nährschicht in einem geeigneten Medium ausplattiert. Zellen, die das Konstrukt enthalten, können durch Verwenden eines Selektionsmediums selektiert werden. Nach einer für ein Kolonienwachstum ausreichenden Zeit werden sie gepickt und auf das Auftreten einer homologen Rekombination untersucht. Positive Kolonien können dann für eine Embryomanipulation und eine Morulaaggregation verwendet werden. Kurz gesagt, Morulae werden von 4 bis 6 Wochen alten superovulierten Weibchen erhalten, die Zona Pellucida wird entfernt und die Morulae werden in kleine Vertiefungen einer Gewebekulturschale gelegt. Die ES-Zellen werden trypsiniert und die modifizierten Zellen werden in die Vertiefung nahe zu den Morulae platziert. Am folgenden Tag werden die Aggregate in die Gebärmutterzipfel von scheinschwangeren Weibchen transferiert. Den Weibchen wird es dann ermöglicht, auszutragen. Chimäre Nachkommen können leicht durch einen Wechsel in der Fellfarbe nachgewiesen werden, und werden nachfolgend auf eine Übertragung der Mutation in die nächste Generation (F1-Generation) untersucht. Die Nachkommen der F1-Generation werden auf das Vorhandensein des modifizierten Gens durchmustert und Männchen und Weibchen mit der Modifikation werden gepaart, um homozygote Nachkommen zu erzeugen. Wenn die Genveränderungen an manchen Stellen in der Entwicklung eine Letalität verursachen, können Gewebe oder Organe als allogene oder kongene transplantierte Gewebe oder Transplantate oder in vitro-Kultur erhalten werden. Die transgenen Tiere können jegliches nicht humane Säugetier sein, wie etwa Labortiere, Haustiere usw., zum Beispiel Maus, Ratte, Meerschweinchen, Schaf, Kuh, Schwein und andere. Die transgenen Tiere können in funktionellen Studien, im Arzneimittel-Screening und anderen Anwendungen verwendet werden, und sind in der Untersuchung der Funktion und Regulation der erfindungsgemäßen Proteine in vivo nützlich.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Kit, umfassend zumindest eines von

(a) einem Mnk2 (Mnk2a oder Mnk2b)- oder Mnk1-Nucleinsäure-Molekül oder einem Fragment davon;
(b) einem Vektor, umfassend die Nucleinsäure aus (a);
(c) einer Wirtszelle, umfassend die Nucleinsäure aus (a) oder den Vektor aus (b);
(d) einem Polypeptid, codiert von der Nucleinsäure aus (a);
(e) einem Fusionspolypeptid, codiert von der Nucleinsäure aus (a);
(f) einem Antikörper, einem Aptamer oder einem anderen Rezeptor gegen die Nucleinsäure aus (a) oder das Polypeptid aus (d) oder (e), und
(g) einem Antisense-Oligonucleotid der Nucleinsäure aus (a).

Das Kit kann für diagnostische oder therapeutische Zwecke oder für Screening-Anwendungen, wie oben beschrieben, verwendet werden. Das Kit kann weiterhin Gebrauchsanweisungen enthalten.
Die Figuren zeigen:
1 zeigt den Anstieg des Triglyceridgehalts von EP(3)3333 und EP(3)3576 männlichen Fliegen, verursacht durch eine homozygote lebensfähige Integration des P-Vektors (im Vergleich mit EP-Kontrollmännchen). Gezeigt ist das Verhältnis von Triglycerid zu Proteingehalt in the Mutanten in Prozent (%).
2 zeigt die molekulare Organisation des mutierten LK6-Genlocus. Die gepunktete schwarze Linie stellt die Position der cDNA dar (von Position 7544500 bis 7559500 auf Chromoson 3R), welche die Integrationsstellen von EP(3)3333 und EP(3)3576 einschließt. Transkribierte DNA-Sequenzen (ESTs) und vorhergesagte Exons werden als Balken in den unteren zwei Linien gezeigt. Vorhergesagte Exons des Gens CG17342 (GadFly, Lk6) were als dunkelgraue Balken gezeigt und Introns als hellgraue Balken. Lk6 codiert für ein Gen, welches vom GadFly-Sequenzanalyseprogramm als GadFly-Signatur CG17342 vorhergesagt wird.
3 zeigt den Vergleich von Mnk-Proteinen.
3A zeigt den Vergleich (CLUSTAL X 1.8) von Mnk-Proteinen aus verschiedenen Arten, hXP_030637 bezieht sich auf das humane Mnk2 (identisch mit der GenBank-Signatur Nr. AF237775), hXP_001600 bezieht sich auf das humane Mnk1 (identisch mit GenBank-Signatur Nr. AB000409.1) und AAB18789 bezieht sich auf das Protein, codiert vom Drosophila Lk6-Gen mit der GadFly-Signatur Nr. CG17342.
Lücken in der Anordnung werden als – dargestellt.
3B zeigt den Vergleich (CLUSTAL W 1.82) von humanen Mnk2-Proteinen. Die GenBank-Signatur Nr. XM_030637.3 ist identisch mit der GenBank-Signatur Nr. AF237775, und die GenBank-Signatur Nr. NM_017572.1 zeigt eine unterschiedliche Variante des humanen Mnk2-Proteins.
3C zeigt den Vergleich (CLUSTAL W 1.82) von humanen Mnk1-Proteinen. Die GenBank-Signatur Nr. XM_001600.2 ist identisch mit der GenBank-Signatur Nr. AB000409.1, und die GenBank-Signatur Nr. NM_003684.2 zeigt eine unterschiedliche Variante des Mnk1-Proteins.
3D. Nucleinsäure-Sequenz der humanen MAP-Kinase-interagierenden Kinase (Mnk)2a (SEQ ID NO:1; GenBank-Signatur Nr. AF237775, identisch mit der GenBank-Signatur Nr. XM_030637)
3E. Aminosäure-Sequenz der humanen MAP-Kinase-interagierenden Kinase (Mnk)2a (SEQ ID NO:2; GenBank-Signatur Nr. AF237775, identisch mit der GenBank-Signatur Nr. XM_030637)
3F. Nucleinsäure-Sequenz der humanen MAP-Kinase-interagierenden Kinase (Mnk)2b (SEQ ID NO:3; GenBank-Signatur Nr. AF237776 oder NM_017572)
3G. Aminosäure-Sequenz der humanen MAP-Kinase-interagierenden Kinase (Mnk)2b (SEQ ID NO:4; GenBank-Signatur Nr. AF237776 oder NM_017572)
3N. Nucleinsäuresequenz der humanen MAP-Kinase-interagierenden Kinase (Mnk)1 (SEQ ID NO:5; GenBank-Signatur Nr. AB000409 oder NM_003684 oder XM_001600)
3I. Aminosäure-Sequenz der humanen MAP-Kinase-interagierenden Kinase (Mnk)1 (SEQ ID NO:6; GenBank-Signatur Nr. AB000409 oder NM_003684 oder XM_001600)
4 zeigt den Augenphänotyp, der durch eine Überexpression eines Entkopplungsproteins (dUCPy) induziert wird, welches verwendet wurde, um Faktoren zu finden, welche die Aktivität des Entkopplungsproteins modulieren. In der im linken Teil des Bildes gezeigten Fliege wird dUCPy auf normalem Niveau exprimiert. In der in der rechten Seite der Fotografie gezeigten Fliege wird dUCPy überexprimiert, und das Auge ist reduziert.
5 zeigt die Expression des Mnk2-Gens.
5A zeigt die Real-Time-PCR-Analyse von Mnk2 in Wildtyp-Mausgeweben.
5B zeigt die Expression des Maus-Mnk2-Gens in hungernden und adipösen (ob/ob) Mäusen.
5C zeigt die Expression des Maus-Mnk2-Gens in hungernden und adipösen Mäusen.
5D zeigt den durch Real-Time-PCR vermittelten Vergleich der Mnk2-Expression während der Differenzierung von Säugetier-Fibroblasten (3T3-L1)-Zellen von Präadipozyten in reife Adipozyten.
5E zeigt einen durch Real-Time-PCR vermittelten Vergleich der Mnk2-Expression während der Differenzierung von Säugetier-Fibroblasten-3T3-F442A-Zellen von Präadipozyten in reife Adipozyten.
5F zeigt einen durch Real-Time-PCR vermittelten Vergleich der Mnk2-Expression während der Differenzierung von Säugetierfibroblasten-TA1-Zellen von Präadipozyten in reife Adipozyten.
6 zeigt die Expression des Maus-Mnk1-Gens.
6A zeigt die Real-Time-PCR-Analyse von Mnk1 in Wildtyp-Mausgeweben.
6B zeigt einen durch Real-Time-PCR vermittelten Vergleich der Mnk1-Expression in verschiedenen Mäusemodellen.
6C zeigt einen durch Real-Time-PCR vermittelten Vergleich der Mnk1-Expression während der Differenzierung von Säugetierfibroblasten-3T3-L1-Zellen von Präadipozyten zu reifen Adipozyten.
6D zeigt einen durch Real-Time-PCR vermittelten Vergleich der Mnk1-Expression während der Differenzierung von Säugetierfibroblasten-3T3-F442A-Zellen aus Präadipozyten in reife Adipozyten.
6E zeigt einen durch Real-Time-PCR vermittelten Vergleich der Mnk1-Expression während der Differenzierung von Säugetierfibroblasten-TA1-Zellen von Präadipozyten in reife Adipozyten.
7 zeigt die UCPy-Sequenzen.
7A zeigt die Nucleinsäure-Sequenz, die für das Drosophila-UCPy-Protein (SEQ ID NO:7) codiert. Der offene Leserahmen ist unterstrichen.
7B zeigt die Aminosäure-Sequenz, die für das Drosophila-UCPy-Protein (SEQ ID NO:8) codiert.
B. In vitro-Assays zur Bestimmung der Triglyceridspeicherung, Synthese und Transport.
8A zeigt die Verringerung der zellulären Triglyceridspiegel (μg/mg Protein) in Zellen, die Mnk2 überexprimieren, im Vergleich zu Kontrollzellen. Alle Proben wurden in Duplikaten untersucht (s1; Probe 1, s2; Probe 2). Die Y-Achse zeigt die zellulären Triglyceridspiegel (μg/mg Protein) und die X-Achse zeigt die Tage der Zelldifferenzierung.
8B zeigt die Verringerung der Insulin-stimulierten Lipidsynthese (dpm/mg Protein) in Zellen, die Mnk2 überexprimieren, im Vergleich mit Kontrollzellen. Alle Proben wurden in Duplikaten untersucht (s1; Probe 1, s2; Probe 2). CB; Cytochalasin B, veranschaulicht die Hintergrundsynthese in 3T3L1, O; stellt das Basisniveau oder nicht stimulierten Glucosetransport dar und somit die Grundlipidsynthese in den Zellen, während Ins; Insulin den stimulierten Glucosetransport und die daraus folgende Synthese von Glucose zu Fett in 3T3L1-Zellen zeigt. Die Y-Achse zeigt Auflösungen pro min/mg Protein (dpm/mg Protein) und die X-Achse bedeutet die zuvor genannten Proteine.
8C zeigt die Verringerung im aktiven Transport (AT) von freien Fettsäuren durch die Plasmamembran von Zellen, die Mnk2 überexprimieren, im Vergleich zu Kontrollzellen. Alle Proben wurden in Duplikaten untersucht (wie durch die Zwillingsbalken mit identischer Schattierung veranschaulicht). PD; passive Diffusion stellt die Grundlinie oder den nicht energieabhängigen Transport von exogenen Fettsäuren durch die Membran dar. AT; aktiver Transport stellt den energieabhängigen Transport von Fettsäuren durch die Membran dar. Die Y-Achse zeigt die Auflösungen pro min/mg Protein (dpm/mg Protein) und die X-Achse zeigt die zuvor genannten Proteine.
9 zeigt die Expression von humanem Mnk2 in verschiedenen humanen Geweben.
9A zeigt die Expression von humanem Mnk2a und Mnk2b in verschiedenen humanen Geweben.
9B zeigt die Expression von humanem Mnk2a und humanem Mnk2b während der Adipozytendifferenzierung.
10 zeigt die Expression des ektopischen Maus-Mnk2 (mMnk2DN)-Transgens in transgenen Aktin-mMnk2DN Mäusen. Gezeigt ist eine Tagman-Analyse von verschiedenen Geweben, isoliert aus männlichen Aktin-nMnk2DN-transgenen Mäusen und männlichen Wildtyp-Wurfgefährten. Die Daten werden ausgedrückt als mehrfache RNA- Induktion, bezogen auf das entsprechende Wildtyp(wt)-Gewebe. Die Anzahl an der Spitze jedes Balkens zeigt den Wert der mehrfachen Induktion, bezogen auf das entsprechende wt-Gewebe an. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment.
11 zeigt, dass die ektopische Maus-Mnk2 (nMnk2DN)-Expression in transgenen Aktin-mMnk2DN-Mäusen zu einem erhöhten Körpergewicht führt. Gezeigt sind Wachstumskurven von männlichen transgenen BactinmMnk2DN-Mäusen (dunkelgraue Kurve) und männlichen wt-Wurfgefährten (hellgraue Kurve) bei einer Nahrung mit hohem Fettgehalt über einen Zeitraum von 10 Wochen. Die Daten werden ausgedrückt als mittleres Körpergewicht über die Zeit +/- SE. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment mit N = 8 bzw. N = 10 Mäusen pro Gruppe.
12 zeigt die Exon/Introngrenzen des Maus-Mnk2-Gens. Die Exon/Introngrenzen des Maus-Mnk2-Gens werden in dieser Figur veranschaulicht. Die Exonzahlen, die Position der Exons auf der cDNA (GenBank-Signatur Nr. BC010256) und die Intronlängen werden angezeigt. Die Intronsequenzen sind in Kleinbuchstaben, die Exonsequenzen in großen fetten Buchstaben gezeigt.
13 veranschaulicht die gezielte Deletion des Maus-Mnk2-Gens durch homologe Rekombination. Die obere Linie zeigt den Wildtyplocus von Maus-Mnk2, die graphische Darstellung in der Mitte zeigt den Zielvektor und die graphische Darstellung im unteren Teil der Figur veranschaulicht den angesteuerten Locus. Die Exons werden als schwarze Boxen gezeigt. Restriktionsstellen, Translationsstartstelle und Stopcodon sind gezeigt. Die PGK-NEO-Kassette und die TK-Kassette werden als graue Boxen gezeigt. 4,4 kb der genomischen Region des Maus-Mnk2-Gens wird durch eine PGK-NEO-Kassette ersetzt. Die deletierte Region ist angezeigt. Die für Southern Blot-Analyse verwendete äußere flankierende Sonde ist durch einen schwarzen Balken gezeigt. Die genomischen Fragmente, die mit dieser Sonde auf mit EcoR1 verdauter DNA nachgewiesen werden, sind als Pfeile gezeigt. Für mehr Details, siehe Beispiele.
14 zeigt, dass gereinigtes Mnk2A in vitro aktiviert werden kann mit einer Präparation der Kinasen Erk2 und der zweifachen Punktmutante Mek1 S218D S222E.
Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung
Beispiel 1: Messung des Triglyceridgehalts von homozygoten Fliegen (1).
Es wurde die Veränderung des Triglyceridgehalts von Drosophila melanogaster, enthaltend ein spezielles Expressionssystem (EP-Element, Rorth P, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93(22): 12418–22) gemessen. Fliegenmutanten werden von einer Fliegenmutations-Stammsammlung erhalten. Diese Fliegen werden unter Standardbedingungen aufgezogen, die Fachleuten bekannt sind, und im Verlauf des Experiments werden zusätzliche Fütterungen mit Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) bereitgestellt. Es wurden besonders homozygote männliche EP(3)3333-und EP(3)3576-Fliegen untersucht, im Vergleich mit Kontrollfliegen (1). Zur Bestimmung des Triglyceridgehalts wurden die Fliegen für 5 min bei 90°C in einem wäßrigen Puffer unter Verwendung eines Wasserbads inkubiert, gefolgt von einer Heißextraktion. Nach weiteren 5 min Inkubation bei 90°C und einer sanften Zentrifugation wurde der Triglyceridgehalt des Extrakts der Fliegen unter Verwendung eines Sigma-Triglyceridassays (INT 336-10 oder –20) durch Messung der Veränderungen in der optischen Dichte gemäß den Vorschriften des Herstellers gemessen. Als eine Referenz wurde der Proteingehalt desselben Extrakts unter Verwendung eines BIO-RAD DC-Proteinassays gemäß den Vorschriften des Herstellers gemessen. Der Assay wurde mehrere Male wiederholt. Der durchschnittliche Triglyceridspiegel der EP-Sammlung wird in 1 als 100% gezeigt. EP(3)3333 und EP(3)3576 homozygote Fliegen zeigen konstant einen höheren Triglyeridgehalt als die Kontrollen (annähernd 140%). Aus diesem Grund ist die Veränderung der Genaktivität im Locus 86F7 (geschätzt), worin der EP-Vektor von EP(3)3333- und EP(3)3576-Fliegen homozygot lebensfähig in den Lk6-Genlocus integriert ist, für die Veränderungen im Metabolismus der Energiespeicher-Triglyeride verantwortlich, deshalb ist in beiden Fällen ein adipöses Fliegenmodell dargestellt.
Beispiel 2: Identifizierung des Drosophila-Gens, das für die Veränderung im Metabolismus der Energiespeicher-Triglyceride verantwortlich ist (2)
Es wurden genomische DNA-Sequenzen isoliert, welche direkt angrenzend an die Integration der EP-Vektoren (hierin EP(3)3333 und EP(3)3576) lokalisiert sind. Unter Verwendung dieser isolierten genomischen Sequenzen wurden öffentliche Datenbanken, wie das „Berkeley Drosophila Genome Project" (GadFly) durchmustert, wobei die homozygot lebensfähige Integrationsstelle der EP(3)3333- und EP(3)3576-Vektoren bestätigt würde. 2 zeigt die molekulare Organisation dieses Genlocus. In 2 ist die genomische DNA-Sequenz in der Zusammenstellung als eine gepunktete schwarze Linie (von Position 7544500 bis 7559500 auf Chromosom 3R) dargestellt, welche die Integrationsstellen von EP(3)3333 und EP(3)3576 einschließt. Transkribierte DNA-Sequenzen (exprimierte Sequenztags, ESTs) und vorhergesagte Exons werden als Balken in den unteren zwei Linien gezeigt. Vorhergesagte Exons des Gens CG17342 (GadFly, Lk6, homolog mit Mnk) werden als dunkelgraue Balken gezeigt, und Introns werden als schmale graue Linien in der Mitte der Figur gezeigt. Unter Verwendung eines Plasmid-Rescueverfahrens wurden genomische DNA-Sequenzen, welche direkt 3' der Integrationsstelle von EP(3)3333 und EP(3)3576 lokalisiert sind, isoliert. Unter Verwendung der Plasmid-Rescue-DNA wurden öffentliche DNA-Sequenzdatenbanken durchmustert, wobei die Integrationsstelle von EP(3)3333 und EP(3)3576 identifiziert wurde, die einen Anstieg des Triglyceridgehalts verursacht. EP(3)3333 ist in die 5'-Region eines 5-Prime-Exon des Gens CG17342 und EP(3)3576 ist in die 5'-Region eines alternativen 5'-Exons integriert. Mnk codiert für ein Gen, welches von GadFly-Sequenzanalyseprogrammen als CG17342 vorhergesagt wird. Deswegen kann die Expression von CG17342 durch eine homozygote lebensfähige Integration von EP(3)3333 und EP(3)3576 beeinflusst werden, was zu einem Anstieg der Energiespeicher-Triglyceride und zu einer Veränderung der Aktivität des Entkopplungsproteins führt.
Beispiel 3: Klonierung eines Drosophila melanogaster-Gens mit Homologie zu humanen Entkopplungsproteinen (UCPs) (7)
Unter Verwendung des öffentlich erhältlichen Programms BLAST der Datenbank des "National Center for Biotechnology Information" (NCBI) (siehe Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) wurden Sequenzen identifiziert, die zu humanen UCP2- und UCP3-Genen homolog sind,. Die Homologiesuche ergab Sequenzfragmente einer Familie von Drosophilagenen mit einer UCP-Homologie. Sie unterscheiden sich deutlich von den nächstverwandten Mitochondrienproteinen (Oxoglutarat-Carrier).
Unter Verwendung des Sequenzfragments eines dieser Gene (hierin als dUCPy') bezeichnet wurde ein PCR-Primerpaar erzeugt (oberer 5'-CTAAACAAACAATTCCAAACATAG (SEQ ID NO:9), unterer 5-Prime-AAAAGACATAGAAAATACGATAGT (SEQ ID NO:10)) und es wurde eine PCR-Reaktion mit Drosophila-cDNA durchgeführt unter Verwendung von Standard-PCR-Bedingungen. Das Amplifikationsprodukt wurde radioaktiv markiert und verwendet, um eine cDNA-Bibliothek, die aus adulten Drosophila-Fliegen hergestellt wurde (Stratagene), zu screenen. Es wurde ein Volllängen-cDNA-Klon isoliert, sequenziert (7) und für weitere Experimente verwendet. Die Nucleotid-Sequenz von dUCPy ist in 7A (SEQ ID NO:7) gezeigt, der abgeleitete offene Leserahmen ist in 7B (SEQ ID NO:8) gezeigt.
Beispiel 4: Klonierung der dUCPy-cDNA in einen Drosophila-Expressionsvektor
Um die Effekte einer dUCPy-Expression in Drosophila-Zellen zu testen, wurde die dUCPy-cDNA in den Expressionsvektor pUAST (Brand A. und Perrimon N., Development 1993, 118: 401–415) unter Verwendung der Restriktionsschnittstellen NotI und KpnI kloniert. Das resultierende Expressionskonstrukt wurde in die Keimbahn von Drosophila-Embryonen injiziert und es wurden Drosophila-Stämme mit einer stabilen Integration des Konstrukts erzeugt. Da der Expressionsvektor pUAST durch den Hefetranskriptionsfaktor Gal4 aktiviert wird, welcher normalerweise nicht in Drosophila-Zellen vorkommt, wird dUCPy in diesen transgenen Tieren noch nicht exprimiert. Wenn pUAST-dUCPy-Fliegen mit einem zweiten Drosophila-Stamm, der Gal4 in einer gewebespezifischen Art und Weise exprimiert, gekreuzt wird, werden die Nachkommenfliegen dieser Paarung dUCPy in dem Gal4 exprimierenden Gewebe exprimieren.
Die Kreuzung von pUAST-dUCPy-Fliegen mit einem Stamm, der Gal4 in allen Körperzellen (unter Kontrolle des Aktinpromotors) exprimiert, zeigte keine lebensfähige Nachkommenschaft. Dies bedeutet, dass eine dUCPy-Überexpression in allen Körperzellen letal ist. Dieser Befund stimmt mit der Annahme überein, dass eine dUCPy-Überexpression zu einem Zusammenbruch der zellulären Energieproduktion führen kann.
Die Expression von dUCPy in einem nicht lebenswichtigen Orgen wie dem Auge (Gal4 unter der Kontrolle des augenspezifischen Promotors des "Eyeless"-Gens) ergibt Fliegen mit sichtbar geschädigten Augen. Dieser leicht sichtbare Augenphänotyp ist die Basis eines genetischen Screenings für Genprodukte, die die UCP-Aktivität modifizieren können.
Beispiel 5: dUCPy-Modifizierungs-Screening (4)
Teile der Genome des Stamms mit der Gal4-Expression im Auge und des Stamms, der das pUAST-dUCPy-Konstrukt trägt, wurden unter Verwendung genomischer Rekombination auf einem Chromosom kombiniert. Der resultierende Fliegenstamm besitzt Augen, die durch die dUCPy-Expression ständig geschädigt sind. Fliegen dieses Stamms wurden mit Fliegen einer großen Sammlung mutagenisierten Fliegenstämmen gekreuzt. In dieser Mutantensammlung ist ein spezielles Expressionssystem (EP-Element, siehe Rorth, 1996, siehe oben) zufällig in verschiedene genomische Loci integriert. Der Hefetranskriptionsfaktor Gal4 kann an das EP-Element binden und die Transkription von endogenen Genen nahe der Integrationsstelle des EP-Elements aktivieren. Die Aktivierung der Gene tritt deswegen in den gleichen Zellen (Auge) auf, die dUCPy überexprimieren. Da die Mutantensammlung mehrere tausend Stämme mit verschiedenen Integrationsstellen des EP-Elements enthält, ist es möglich, eine große Anzahl von Genen daraufhin zu testen, ob deren Expression mit der dUCPy-Aktivität wechselwirkt. Im Fall, dass ein Gen als ein Enhancer der UCP-Aktivität wirkt, wird der Augendefekt verschlimmert werden; ein Suppressor wird den Defekt lindern (siehe 4).
Unter Verwendung dieses Screenings wurde ein Gen mit einer verstärkenden Aktivität entdeckt, wobei gefunden wurde, dass dies die Lk6-Kinase in Drosophila ist.
Beispiel 6: Klonierung von Lk6 aus Drosophila (3A)
Genomische DNA, die dem Augendefekt rettenden EP-Element benachbart war, wurde durch inverse PCR kloniert und sequenziert. Diese Sequenz wurde für eine BLAST-Suche in einer öffentlichen Drosophila-Gendatenbank verwendet. Die Aminosäure-Sequenz des Drosophilaproteins ist in 3A gezeigt (bezeichnet als dmAAB18789).
Beispiel 7: Identifizierung eines Lk6-homologen Säugetierproteins (3)
Es wurden Sequenzen, die zum Drosophila-Lk6 homolog waren, unter Verwendung des öffentlich erhältlichen Programms BLASTP 2.2.3 der nicht redundanten Proteindatenbank des "National Center for Biotechnology Information (NCBI) (siehe Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) identifiziert.
Mnk-homologe Proteine und Nukleinsäuremoleküle, die dafür codieren, sind von Insekten- oder Vertebratenarten, zum Beispiel Säugetieren oder Vögeln, erhältlich. Besonders bevorzugt sind humane Mnk-homologe Polypeptide und Nucleinsäuren, insbesondere Polypeptide und Nukleinsäuren, die für ein humanes Mnk2-Protein codieren (GenBank-Signatur Nr. AF237775 und NM_017572.1; GenBank-Signatur Nr. AF237775 ist identisch mit der früheren GenBank-Signatur Nr. XM_030637, welche auf Antrag des Einreichers entfernt wurde; siehe eine Clustal W multiple Sequenzanordnung in 3B) oder Nucleinsäuren, die für ein humanes Mnk1-Protein codieren (GenBank-Signatur Nr. AB000409.1 und NM_003684.2; GenBank-Signatur Nr. AB000409.1 ist identisch mit der früheren GenBank-Signatur Nr. XM_001600, welche auf Antrag des Einreichers entfernt wurde; siehe eine Clustal W multiple Sequenzanordnung in 3C).
3A zeigt die Anordnung der Mnk-Proteine von verschiedenen Arten, hXP_030637 bezieht sich auf das humane Mnk2 (identisch mit der GenBank-Signatur Nr. AF237775), hXP_001600 bezieht sich auf humane Mnk1 (identisch mit der GenBank-Signatur Nr. AB000409.1), und dmAB18789 bezieht sich auf das Protein, das vom Drosophila-Gen mit der GadFly-Signatur Nr. CG17342 codiert wird. Die homologen Maus-Polypeptide der Erfindung wurden identifiziert als GenBank-Signaturen Nr. NP_067437.1 (für die Maus-homologe MAP-Kinase-interagierende Serin/Threoninkinase 2; Mnk2; für die cDNA-GenBank-Signatur Nr. BC010256) und die GenBank-Signatur Nr. NP_067436.1 (für die Maushomologe MAP-Kinase-interagierende Serin/Threoninkinase 1; Mnk1).
Beispiel 8: Expression der Polypeptide in Säugetier(Maus)-Geweben (5 und 6)
Zur Analyse der Expression der in dieser Erfindung offenbarten Polypeptide in Säugetiergeweben wurden mehrere Mausstämme (bevorzugt die Mausstämme C57BI/6J, C57BI/6 ob/ob und C57BI/KS db/db, welche Standardmodellsysteme in der Fettleibigkeit und Diabetesforschung sind) von Harlan Winkelmann (33178 Borchen, Deutschland) bezogen und unter konstanter Temperatur (bevorzugt 22°C), 40% Luftfeuchtigkeit und einem Licht/Dunkelrhythmus von bevorzugt 14/10 h gehalten. Den Mäusen wurde ein Standardfutter gefüttert (zum Beispiel von ssniff Spezialitäten GmbH, Bestellnummer ssniff M-Z V1126-000). Für das Fastenexperiment ("ausgehungerte Wildtyp-Mäuse") wurden Wildtyp-Mäuse für 48 h ausgehungert ohne Futter, sondern nur mit Wasser nach Bedarf (siehe zum Beispiel Schnetzler et al., J. Clin. Invest. 1993 Jul; 92(1): 272–80, Mizuno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 Apr 16; 93(8): 3434–8). Die Tiere wurden mit einem Alter von 6–8 Wochen getötet. Die tierischen Gewebe wurden gemäß Standardverfahren, die Fachleuten bekannt sind, isoliert, in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren und bei –80°C bis zum Gebrauch gelagert.
Um die Rolle der in dieser Erfindung offenbarten Proteine bei der in vitro-Differenzierung von verschiedenen Säugetierzellkulturzellen im Hinblick auf die Umwandlung von Präadipozyten zu Adipozyten zu analysieren, wurden Säugetierfibroblasten (3T3-L1)-Zellen (zum Beispiel Green & Kehinde, Cell 1: 113–116, 1974) von der American Tissue Culture Collection (ATCC, Hanassas, VA, USA; ATCC-CL 173) erhalten. 3T3-L1-Zellen wurden als Fibroblasten erhalten und wie im Stand der Technik beschrieben, in Adipozyten differenziert (zum Beispiel Qiu et al., J. Biol. Chem. 276: 11988–95, 2001; Slieker et al., BBRC 251: 225–9, 1998). Kurz, es wurden Zellen in DMEM/10% FCS (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) ausplattiert mit 50,000 Zellen/Well in Duplikaten in 6-Well-Plastikschalen und in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ bei 37°C kultiviert. Bei Konfluenz (definiert als Tag 0: d0) wurden die Zellen in serumfreies (SF) Medium, enthaltend DMEM/HamF12 (3:1; Invitrogen), Fetuin (300 μg/ml; Sigma, München, Deutschland), Transferyin (2 μg/ml; Sigma), Pantothenat (17 μM; Sigma), Biotin (1 μM; Sigma) und EGF (0,8 nM; Hoffmann-La Roche, Basel, Schweiz) transferiert. Die Differenzierung wurde durch Zugabe von Dexamethason (DEX; 1 μM; Sigma), 3-Methyl-isobutyl-1-methylxanthin (MIX; 0,5 mM; Sigma) und Rinderinsulin (5 μg/ml; Invitrogen) induziert. 4 Tage nach Konfluenz (d4) wurden die Zellen in SF-Medium, enthaltend Rinderinsulin (5 μg/ml), gehalten, bis die Differenzierung abgeschlossen war. Zu verschiedenen Zeitpunkten des Differenzierungsverfahrens, beginnend mit Tag 0 (Tag der Konfluenz) und Tag 2 (Hormonzugabe; zum Beispiel Dexamethason und 3-Isobutyl-1-methylxanthin) bis zu Tag 10 der Differenzierung wurden alle zwei geeignete Aliquots von Zellen Tage entnommen.
Alternativ wurden Säugetierfibroblasten-3T3-F4442A-Zellen (zum Beispiel Green & Kehinde, Cell 7: 105–113, 1976) von der Harvard Medical School, Department of Cell Biology (Boston, MA, USA) erhalten. 3T3-F442A-Zellen wurden als Fibroblasten erhalten und wie zuvor beschrieben in Adipozyten differenziert (Djian, P. et al., J. Cell. Physiol. 124: 554–556, 1985). Zu verschiedenen Zeitpunkten des Differenzierungsverfahrens, beginnend mit Tag 0 (Tag der Konfluenz und Hormonzugabe, zum Beispiel Insulin) bis zu Tag 10 der Differenzierung wurden alle 2 Tage geeignete Aliquots von Zellen entnommen. 3T3-F442A-Zellen differenzieren in vitro bereits im konfluenten Stadium nach Hormon(Insulin)-Zugabe.
Es wurde eine Tagman-Analyse der erfindungsgemäßen Proteine durchgeführt (5 und 6). RNA wurde von Mausgeweben oder Zellkulturzellen unter Verwendung des Trizolreagenzes (zum Beispiel von Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) isoliert und weiter aufgereinigt mit dem RNeasy-Kit (zum Beispiel von Qiagen, Deutschland) in Kombination mit einer DNase-Behandlung gemäß den Anleitungen des Herstellers, und wie es Fachleuten bekannt ist. Die Gesamt-RNA wurde revers transkribiert (bevorzugt unter Verwendung der Superscript II-RNaseH-Reverse-Transcriptase von Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) und einer Taqman-Analyse unterzogen, bevorzugt unter Verwendung des Taqman 2 × PCR Master Mix (von Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland; der Mix enthält gemäß dem Hersteller zum Beispiel AmpIiTaq-Gold-DNA-Polymerase, AmpErase-UNG, dNTPs mit dUTP, passives Referenz-Rox und optimierte Pufferbestandteile) in einem GeneAmp 5700 Sequence Detection System (von Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland).
Für die Analyse der Expression von Mnk2 oder Mnk1 wurde eine Taqman-Analyse unter Verwendung der folgenden Primer/Sondenpaare durchgeführt:
Maus-Mnk1-Vorwärtsprimer (SEQ ID NO:11) 5'-GCT GAG GGC CTC TGC TCC-3';
Maus-Mnk1 reverser Primer (SEQ ID NO:12) 5'-TCG CCT TCG AGC CAG G-3';
Maus-Mnk1-Taqman-Sonde (SEQ ID NO:13) (5/6-FAM) TGA AGC TGT CCC CTC CAT CCA AAT CTC (5/6-TAMRA)
Taqman-1856F-Mnk2-Vorwärtsprimer (SEQ ID NO:14): 5'-TGCACTTGATTGACCCCGA-3'
Taqman-1923R-Mnk2-Vorwärtsprimer (SEQ ID NO:15): 5'-TTTCTGATTGTCAACCCTCCAA-3'
Taqman-1877T-Mnk2-Taqman-Sonde (SEQ ID NO:16): (5/6-FAM)-CCCCATCATCCACCTGCAGTGTCC-(5/6-TAMRA)
Die Taqman-Analyse ergab, dass Mnk2 das interessante Homologe des Fliegen-Lk6-Gens ist. Die Ergebnisse sind in 5 und 6 gezeigt. Im Vergleich zu Mnk1, welches eher ubiquitär exprimiert ist, zeigt Mnk2 die höchsten Expressionsspiegel in braunen und weißen Fettgeweben (5A bzw. 6A). Die Expression von Mnk2 in weißem Fettgewebe ist unter einer metabolischen Kontrolle: In ausgehungerten, ebenso wie in adipösen (ob/ob) Mäusen ist die Expression auf etwa 40% des Wildtyp-Niveaus verringert (5C, siehe auch 5B). Ausserdem ist die Expression von Mnk2 während der in vitro-Differenzierung von 3T3-L1 stark induziert (5D), ebenso wie von zwei zusätzlichen Modellsystemen für die in vitro-Differenzierung von Präadipozyten in Adipozyten, die 3T3-F442A- und die TA1-Zelllinien (5E bzw. 5F). Im Gegensatz dazu bleiben die realtiven Expressionsspiegel von Mnk1 während der Differenzierung dieser Zelllinien unverändert (6D bzw. 6E).
Beispiel 9: Expression der Polypeptide in Säugetier(menschlichen)-Geweben (9)
Humane primäre Adipozyten wurden in reife Adipozyten differenziert, wie von Hauner et al., 1989 (J. Clin. Invest. 84(5): 1663–70) beschrieben. Kurz, Zellen wurden differenziert in DMEM/Nährstoffmix F12, 1% Pen/Strep, 17 μM Biotin, 33 μM Pantothenat, 10% nicht hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum. An Tag 0 der Differenzierung wurde das Medium gegen DMEM/Nährstoffmix F12, 1% Pen/Strep, 17 μM Biotin, 33 μM Pantothenat, 0,01 mg/ml Transferrin, Hydrocortison, 20 nM humanes Insulin, 0,2 nM T3, 25 nM Dexamethason, 250 μM IBMX, 3 μM Rosiglitazon gewechselt. An Tag 4 der Differenzierung wurde das Medium gegen DMEM/Nährstoffmix F12, 1% Pen/Strep, 17 μM Biotin, 33 μM Panothenat, 0,01 mg/ml Transferrin, 100 nM Hydrocortison, 20 nM humanes Insulin, 0,2 nM T3 gewechselt. Zu verschiedenen Zeitpunkten des Differenzierungsprozesses, beginnend mit Tag 0 (Tag der Konfluenz) und Tag 4 (Hormonzugabe) bis zu Tag 14 der Differenzierung wurden alle 2 Tage geeignete Aliquots von Zellen entnommen. RNA wurde von humanen Zellkulturzellen unter Verwendung von Trizolreagenz (zum Beispiel von Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) isoliert und weiter gereinigt mit dem RNeasy-Kit (zum Beispiel von Qiagen, Deutschland) in Kombination mit einer DNase-Behandlung gemäß der Anweisungen des Herstellers, und wie es Fachleuten bekannt ist.
Zusätzlich zu der von humanen Adipozyten in verschiedenen Differenzierungsstadien isolierten RNA wurden RNAs, die von verschiedenen humanen Geweben isoliert, erhalten von Invitrogen Corp., Karlsruhe, Deutschland; (i) Gesamt-RNA von humanem aldutem Skelettmuskel (Invitrogen Corp., Bestellnr.735030); (ii) Gesamt-RNA von humaner adulter Lunge (Invitrogen Corp., Bestellnr. 735020); (iii) Gesamt-RNA von humaner adulter Leber (Invitrogen Corp., Bestellnr. 735018); (iv) Gesamt-RNA von humaner adulter Plazenta (Invitrogen Corp., Bestellnr. 735026); (v) Gesamt-RNA von humanen adelten Hoden (Invitrogen Corp., Bestellnr. 64101-1 ); (vi) Gesamt-RNA von humanem normalem Fettgewebe (Invitrogen Corp., Bestellnr. D6005-01); (vii) Gesamt-RNA von humanem normalem Pankreas (Invitrogen Corp., Bestellnr. DG6101); (viii) Gesamt-RNA von humanem normalem Gehirn (Invitrogen Corp., Bestellnr. D6030-01). Die RNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (zum Beispiel von Qiagen, Deutschland), und wie es Fachleuten bekannt ist, mit DNase behandelt.
Die Gesamt-RNA wurde revers transkribiert (bevorzugt unter Verwendung von Superscript II-RNaseH reverser Transcriptase von Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) und einer Tagman-Analyse unterzogen, bevorzugt unter Verwendung des Tagman 2 × PCR Master Mix' (Seite 66, Zeile 31: Weiterstadt, Deutschland; siehe Beispiel 8).
Die Tagman-Analyse wurde bevorzugt unter Verwendung der folgenden Primer/Sondenpaare durchgeführt:
Für die Amplifikation von humanem Mnk2a:
humaner Mnk2a-Vorwärtsprimer (SEQ ID NO:17): 5'-cca tct ccc cct ctg tac ata gg-3';
humaner Mnk2a reverser Primer (SEQ ID NO:18): 5'-ccg gct ggc gat agc tta a-3';
Tagman-Sonde (SEQ ID NO:19): (5/6-FAM) cac ccg tcc ccc aat caa atc taa agg (5/6-TAMRA)
Für die Amplifikation von humanem Mnk2b:
humaner Mnk2b-Vorwärtsprimer (SEQ ID NO:20): 5'-TTA CTG TGA ATG AGT GAA GAT CCT GG-3';
humaner Mnk2b reverser Primer (SEQ ID NO:21): 5'-ATG GCC GTT CAC CGT CC-3';
Tagman-Sonde (SEQ ID NO:22): (5/6-FAM) CCA GGC CAG CTC CCA TCG CTG (5/6-TAMRA)
Wie in 9A gezeigt ist, ergab die Real-Time-PCR (Taqman)-Analyse der Expression des Mnk2a- und Mnk2b-Proteins in humanen Geweben, dass beide Proteine in allen untersuchten Geweben exprimiert werden, mit einer hohen Expressionsstärke in Fettgewebe, Muskel, Lunge, Hoden und Plazenta.
Die relativen Expressionsstärken von beiden humanen Mnk2-Splicing-Varianten ist für alle untersuchten Gewebe gleich. Beide zeigen höchste Expressionsstärken in Geweben, die für metabolische Erkrankungen relevant sind, nämlich Fett- und Muskelgewebe.
Wie in 9B gezeigt ist, sind sowohl Mnk2a wie auch Mnk2b während der humanen Adipozytendifferenzierung hochreguliert. Dies deutet auf eine Funktion beider Proteine im Metabolismus von reifen Adipozyten hin.
Beispiel 10: Assays für die Bestimmung von Triglyceridspeicherung, Synthese und Transport (8)
Retrovirale Infektion von Präadipozyten
Verpackungszellen wurden mit retroviralen Plasmiden pLPCX transfiziert, die das Maus-Mnk2-Transgen und einen Selektionsmarker tragen, unter Verwendung des Calciumphosphatverfahrens. Kontrollzellen wurden mit pLPCX infiziert, welches kein Transgen trägt. Kurz gesagt, exponentiell wachsende Verpackungszellen wurden mit einer Dichte von 350000 Zellen pro 6 Well in 2 ml DMEM + 10% FCS einen Tag vor der Transfektion ausgesät. 10 min vor der Transfektion wurde Chloroquin direkt in den Mediumüberstand zugegeben (25 μM Endkonzentration). 250 μl eines Transfektionsmixes bestehend aus 5 μg Plasmid-DNA (Kandidat: Helfervirus in einem 1:1-Verhältnis) und 250 mM CaCl₂ wurden in einem 15 ml Plastikröhrchen hergestellt. Dasselbe Volumen von 2 × HBS (280 μM NaCl, 50 μM HEPES; 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,06) wurde zugegeben, und Luftblasen wurden für 15 sek in das Gemisch injiziert. Der Transfektionsmix wurde tropfenweise zu den Verpackungszellen zugegeben, verteilt, und die Zellen wurden bei 37°C, 5% CO₂ für 6 h inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und das Medium wurde ausgewechselt gegen 2 ml DMEM + 10% FCS pro 6 Well. Einen Tag nach Transfektion wurden die Zellen erneut gewaschen und für 2 Tage zur Virussammlung in 1 ml DMEM + 10% FCS pro 6 Well bei 32°C, 5% CO₂ inkubiert. Der Überstand wurde dann durch einen 0,45 μm-Zelluloseacetatfilter filtriert, und es wurde Polybren (Endkonzentration 8 μg/ml) zugegeben. Säugetierfibroblasten (3T3-L1)-Zellen in einem subkonfluenten Zustand wurden mit dem vorbereiteten virushaltigen Medium überschichtet. Die infizierten Zellen wurden für 1 Woche mit 2 μg/ml Puromycin selektiert. Nach der Selektion wurden die Zellen durch Western Blot und Immunfluoreszenz auf Transgen-Expression überprüft. Überexprimierende Zellen wurden zur Differenzierung ausgesät.
3T3-L1-Zellen wurden als Fibroblasten erhalten und wie im Stand der Technik und in Beispiel 8 beschrieben in Adipozyten differenziert. Zur Analyse der Rolle der in dieser Erfindung offenbarten Proteine wurden zur Bestimmung der Triglyceridspeichung, Synthese und Transport in vitro-Assays durchgeführt.
Herstellung von Zelllysaten zur Analyse von Metaboliten
Beginnend bei Konfluenz (D0), wurde das Zellmedium alle 48 h gewechselt. Zellen und Medium wurden 8 h vor einem Mediumwechsel wie folgt geerntet. Das Medium wurde gesammelt, und die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen, ehe sie in 600 μl HB-Puffer (0,5% Polyoxyethylen 10 Tridecylethan, 1 mM EDTA, 0,01 M NaH₂PO₄, pH 7,4) lysiert wurden. Nach einer Inaktivierung bei 70°C für 5 min wurden die Zelllysate auf einer Bio 101-Systems-Lysematrix B (0,1 mm Silikabeads; Q-Biogene, Carlsbad, USA) durch Bewegung für 2 × 45 sek bei einer Geschwindigkeit von 4,5 (Fastprep FP120, Bio 101 Thermosavant, Holbrock, USA) hergestellt. Überstände von lysierten Zellen wurden gesammelt nach einer Zentrifugation bei 3000 rpm für 2 min und in Aliquots für eine spätere Analyse bei –80°C gelagert.
Veränderungen in zellulären Triglyceridspiegeln während der Adipogenese (8A)
Zelllysate und Medium wurden in 96-Well-Platten gleichzeitig im Hinblick auf Gesamtprotein und Triglyceridgehalt unter Verwendung des Bio-Rad-DC-Protein-Assayreagenzes (Bio-Rad, München, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert, und eines modifizierten enzymatischen Triglycerid-Kits (GPO-Trinder; Sigma) kurz, Endvolumen von Reagenzien wurden dem 96-Well-Fomat wie folgt angepasst: 10 μl Probe wurde mit 200 μl Reagenz A für 5 min bei 37°C inkubiert. Nach der Glycerolbestimmung (anfängliche Extinktion bei 540 nm) wurden 50 μl Reagenz B zugegeben, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 5 min bei 37°C (Endextinktion bei 540 nm). Glycerol- und Triglyceridkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Glycerolstandardsets (Sigma) für die Standardkurve, die in jedem Assay eingeschlossen ist, berechnet.
Wie in 8A gezeigt ist, fanden wir, dass in Mnk2 überexprimierenden Zellen zelluläre Triglyceridspiegel von Tag 4 bis Tag 12 der Adipogenese wesentlich geringer waren, im Vergleich mit denen in den Kontrollzellen (8A). Diese Resultate weisen darauf hin, dass Mnk2 regulatorische Wege oder Enzyme, die in den Lipidmetabolismus involviert sind, anvisiert, was wir ausführlicher in der Lipidsynthese und FFA-Transportassays, die unten beschrieben sind, untersuchten.
Synthese von Lipiden während der Adipogenese (8B)
Während des Endstadiums der Adipogenese (Tag 12) wurden Zellen auf deren Fähigkeit, Lipide zu metabolisieren, untersucht. Ein modifiziertes Protokoll zu dem Verfahren von Jensen et al. (2000), JBC 275, 40148, zur Lipidsynthese wurde etabliert. Die Zellen wurden vor einer Serumaushungerung in Krebs-Ringer-Biocarbonat-Hepespuffer (KRBH; 134 nM NaCl, 3,5 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 0,5 mM MgSO₄, 1,5 mM CaCl₂, 5 mM NaHCO₃, 10 mM Hepes, pH 7,4), supplementiert mit 0,1% FCS bei 37°C für 2,5 h dreimal mit PBS gewaschen. Für eine Insulin-stimulierte Lipidsynthese wurden die Zellen mit 1 μM Rinderinsulin (Sigma; Träger: 0,005 N HCl) für 45 min bei 37°C inkubiert. Die basale Lipidsynthese wurde nur mit Träger bestimmt. Es wurde ¹⁴C(U)-D-Glucose (NEN Life Sciences) in einer Endaktivität von 1 μCi/Well/ml in Gegenwart von 5 mM Glucose für 30 min bei 37°C zugegeben. Für die Berechnung der Hintergrundradioaktivität wurde 25 μM Cytochalasin B (Sigma) verwendet. Alle Assays wurden in zweifachen Wells durchgeführt. Um die Reaktion zu beenden, wurden die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen und in 1 ml 0,1 N NaOH lysiert. Die Proteinkonzentration jedes Wells wurde unter Verwendung des Standard-Biuret-Verfahrens (Proteinassayreagenz; Bio-Rad) beurteilt. Gesamtlipide wurden von der wäßrigen Phase nach einer Extraktion über Nacht in einem Insta-Fluor-Szintillationscocktail (Packard Bioscience) abgetrennt, gefolgt von einer Szintillations-Zählung.
Unsere Ergebnisse zeigen deutlich, dass Mnk2 überexprimierende Zellen weniger effektiv sind im Synthetisieren von Lipiden aus exogener Glucose. Entsprechend sind die Spiegel der Insulin-stimulierten Lipidsynthese an Tag 12 der Adipogenese wesentlich geringer, im Vergleich zu Kontrollzellen (8B). Die niedrigeren Lipidspiegel, die in den obigen Experimenten beobachtet wurden, resultieren deshalb am wahrscheinlichsten von einer geringeren Lipidsyntheserate und sind nicht ein Ergebnis von einer erhöhten Umwandlung von Lipidspeichern.
Transport und Metabolismus von freien Fettsäuren durch die Plasmamembran während der Adipogenese (8C)
Während des Endstadiums der Adipogenese (D12) wurden Zellen auf deren Fähigkeit untersucht, langkettige Fettsäuren durch die Plasmamembran zu transportieren. Es wurde ein modifiziertes Protokoll zum Verfahren von Abumrad et al. (1991) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991:88; 6008–12) für einen zellulären Transport von Fettsäuren etabliert. Zusammenfassend wurden Zellen vor einer Serumaushungerung dreimal mit PBS gewaschen. Dies wurde gefolgt von einer Inkubation in KRBH-Puffer, supplementiert mit 0,1% FCS für 2,5 h bei 37°C. Die Aufnahme von exogenen freien Fettsäuren wurde durch die Zugabe eines isotopischen Mediums initiiert, das nicht radioaktives Oleat und (³H)oleat (NEN Life Sciences) enthielt, komplexiert mit Serumalbumin, in einer Endaktivität von 1 μCi/Well/ml in Gegenwart von 5 mM Glucose für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Zur Berechnung der passiven Diffusion (PD) in Abwesenheit eines aktiven Transports (AT) durch die Plasmamembran wurden 20 mM Phloretin in glucosefreiem Medium (Sigma) für 30 min bei Raumtemperatur (RT) zugegeben. Alle Assays wurden in zweifachen Wells durchgeführt. Um den aktiven Transport zu beenden, wurden 20 mM Phloretin in glucosefreiem Medium zu den Zellen zugegeben. Die Zellen wurden in 1 ml 0,1 N NaOH lysiert und die Proteinkonzentration von jedem Well wurde unter Verwendung des Standard-Biuret-Verfahrens (Proteinassayreagenz; Bio-Rad) beurteilt. Veresterte Fettsäuren wurden von freien Fettsäuren getrennt unter Verwendung einer Extraktion in einem Insta-Ffuor-Szintillationscocktail (Packard Bioscience) über Nacht, gefolgt von einer Szintillations-Zählung.
Wir fanden, dass der Transport von exogenen Fettsäuren durch die Plasmamembran von Mnk2 überexprimierenden Zellen und folglich die Veresterung dieser Metaboliten an Tag 12 der Adipogenese im Vergleich zu Kontrollzellen (8C) beträchtlich geringer waren. Zusammengenommen zeigte die Überexpression von Mnk2 einen Effekt auf den Triglyceridmetabolismus, in allen drei Assays, die wir in 3T3-L1-Zellen durchführten, was es zu einem potenziell interessanten Arzneimitteltarget zur Behandlung von metabolischen Erkrankungen macht.
Beispiel 11: Erzeugung und Analyse von transgenen Mnk2-Tieren (-ActinmMnk2DN)
Erzeugung der transgenen Tiere
Maus-Mnk2-cDNA wurde von braunem Fettgewebe (BAT) von Mäusen unter Verwendung von Standardverfahren, wie Fachleuten bekannt ist, isoliert. Die cDNA wurde durch RT-PCR unter Verwendung des folgenden Primerpaars amplifiziert:
Mnk2-Vorwärtsprimer (SEQ ID NO:23): 5' AAG TTG GCC TTC GCG TTA GAC 3'
Mnk2 reverser Primer (SEQ ID NO:24): 5' CGA TAT GTA CAA GGA GCT AG 3'.
Die resultierende Mnk2-cDNA wurde in pBluescript KS + (Stratagene) gemäß Standardverfahren kloniert, was ein Plasmid ergab, das als pKS + -mMnk2' bezeichnet wird. Die cDNA von pKS + -mMnk2 c wurde unter Verwendung einer ortsgerichteten Mutagenese (Stratagene) gemäß den Anleitungen des Herstellers mutiert. Unter Verwendung des Mnk2-Top-Oligos (SEQ ID NO:25): 5' CTC CCC CAT CTC CGC ACC AGA GCT GCT CGC CCC GTG TGG GTC AG 3' und des Mnk2-Bottom-Oligos (SEQ ID NO:26) 5' CTG ACC CAC ACG GGG CGA GCT CTG GTG CGG AGA TGG GGG AG 3' wurden zwei Punktmutationen in die cDNA eingebracht, was in Aminosäureaustauschen an Position T197 und T202 zu A197 und A202 der Mnk2-cDNA resultiert.
Die resultierende mutierte cDNA (bezeichnet als mMnk2DN) wurde in die EcoRV-Klonierungsstelle des transgenen Expressionsvektors pTG-Aktin-Xhgh-bgh-polyA kloniert. Das -Actin-Mnk2DN-Transgen wurde in den männlichen Pronucleus von befruchteten Mäuseembryonen (bevorzugt Stamm C57/BL6/CBA F1 (Harlan Winkelmann)) mikroinjiziert. Injizierte Embryonen wurden in scheinträchtige Fostermäuse transferiert. Transgene Gründer wurden durch eine PCR-Analyse unter Verwendung des Forwardprimers (SEQ ID NO:27): 5' GCT GCT GGT CCG AGA TGC C 3' und des reversen Primers (SEQ ID NO:28): 5' GGG TCA TGC GCG ATC CCC 3' nachgewiesen. Es wurden zwei unabhängige transgene Mäuselinien etabliert, die das -Actin-Mnk2DN-Konstrukt enthalten, und auf einem C57/BL6-Hintergrund gehalten. Kurz gesagt, die Gründertiere wurden mit C57/BL6-Mäusen zurückgekreuzt, um F1-Mäuse für eine Analyse zu erzeugen. Transgene Mäuse wurden kontinuierlich auf dem C57/BL6-Hintergrund gezüchtet.
Expression des Konstrukts in verschiedenen Mausgeweben (10)
Unter Verwendung von Standardverfahren wurde die -Actin-Mnk2DN-Transgenexpression durch eine Tagman-Analyse verifiziert, unter Verwendung des Forwardprimers (SEQ ID NO:29): 5' CAG CGT GGT AGT ACA GGA CGT G 3' , des reversen Primers (SEQ ID NO:30): 5' TCC CTG TGG GCG ATG C 3' und des Primers (SEQ ID NO:31): 5' CAG TGC CCT GGA CTT CCT GCA TAA CAA 3'. Die Tagman-Analyse wurde unter Verwendung eines repräsentativen Querschnitts von Mausgeweben durchgeführt.
Die Expression des Bactin-Mnk2DN-Transgens wurde in den folgenden Geweben beobachtet: WAT, Muskel, Leber, Niere, Thymus, Herz, Lunge und Milz. Die Expressionsniveaus des Transgens waren 2,8- bis 16,9-fach erhöht, bezogen auf die Mnk2-Expression in Wildtyp-Mäusen, in Abhängigkeit von dem untersuchten Gewebe. In BAT-Gewebe wurde keine Mnk2-Transgenexpression nachgewiesen (siehe 10).
Analyse des Körpergewichts der transgenen Mäuse (11)
Nach der Entwöhnung wurden männliche transgene -Actin-mMnk2DN-Mäuse und deren Wildtyp (wt)-Wurfgefährten-Kontrollen in Gruppen von 4-5 Tieren (N = 4 bis N = 5) auf eine Kontrolldiät gesetzt (bevorzugt Altromin C1057 Mod-Kontrolle, 4,5% Rohfett) oder eine Hochfettdiät (bevorzugt Altromin C1057 mod. hochfett, 23,5% Rohfett). Das Gesamtkörperfett der Tiere wurde wöchentlich über eine Periode von 12–16 Wochen gemessen. Bei jeder Diät war das mittlere Körpergewicht von transgenen -ActinmMnk2DN-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Wurfgefährten mit der entsprechenden Diät klar erhöht. Signifikante Unterschiede im mittleren Körpergewicht wurden erstmals etwa am Ende der postnatalen Woche 4 bei beiden Diäten beobachtet. Nach 10 Wochen der Hochfettdiät war das mittlere Körpergewicht von transgenen -Actin-mMnk2DN-Mäusen im Vergleich zu wt-Wurfgefährten um 8,8 g (= 23% Anstieg im mittleren Körpergewicht bezogen auf wt-Wurfgefährten) erhöht (1 1). Ähnliche Unterschiede im mittleren Körpergewicht wurden in wt- und transgenen -Actin-mMnk2DN-Mäusen mit Kontrolldiät beobachtet (Daten nicht gezeigt). Somit zeigen unsere Ergebnisse klar, dass die ektopische Expression des mMnk2DN-Transgens zu einem Anstieg im Körpergewicht führt. Der Effekt tritt unabhängig von der gegebenen Nahrung auf, wie es anhand der Kontrollnahrung ebenso wie der Hochfettdiät gesehen werden kann.
Beispiel 12: Erzeugung und Analyse von mMnk2-/-Mäusen (12 und 13)
Eine 605-Basenpaarsonde der mMnk2-cDNA (GenBank-Signatur Nr. BC010256; Position 61–665) wurde von cDNA aus weißem Fettgewebe (WAT) von Mäusen durch PCR amplifiziert, unter Verwendung des Forwardprimers (SEQ ID NO:32): 5' ACA TCA GCC CAC AGT GTG A 3' und des reversen Primers (SEQ ID NO:33): 5' TCT CCA TTG AGT TTG ATA CCA 3'. Diese Sonde wurde verwendet, um eine genomische 129SVJ-Phagenbibliothek (erhalten von Stratagene) durchzumustern. Drei unabhängige Klone wurden isoliert und in die NotI-Klonierungsstelle von pBluescript KS + (Stratagene) subkloniert. Diese genomischen Klone wurden für eine Restriktions-Kartierung und Sequenzierung verwendet, um den genomischen Locus von Maus-Mnk2 zu charakterisieren (12). Eine PGK-Neomycinkassette wurde in den Locus von Maus-Mnk2 insertiert, was 4,4 kb genomische DNA ersetzt, wobei die komplette codierende Region von mMnk2 deletiert wurde. Kurz gesagt, es wurde ein 8 kb Spel-NotI-Fragment in die Xbal-Stelle von pBluescript KS + kloniert, stromaufwärts der PGK-Neomycinkassette, welche in die Smal-Stelle von pBluescript insertiert wurde. Ein genomisches1 kb-Fragment wurde durch PCR amplifiziert, unter Verwendung des folgenden Primerpaars (nicht primende Nucleotide/angeheftete Restriktionsschnittstellen sind Kleinbuchstaben): Mnk2-SA-Vorwärtsprimer (SEQ ID NO:34): EcoRI 5' cgg aat CCA CTA GCT CCT TGT ACA TAT 3'; Mnk2-SA reverser Primer (SEQ ID NO:35): ClaI 5' cca tcg atG GAA CTC GTA TTG CAT AGT AG 3'. Das resultierende Fragment wurde in die EcoRI/ClaI-Stelle von pBluescript KS + insertiert. Als ein negativer Selektionsmarker wurde eine Thymidinkinasekassette in die ClaI/XhoI-Stelle des Targetingkonstrukts kloniert (13). Das Konstrukt wurde durch einen NotI-Verdau linearisiert und in embryonale Stammzellen (ES) der Maus elektroporiert. ES-Zellklone wurden durch G418 und Gancyclovir-Behandlung (bevorzugt 350 μg G418/ml und 2 μm Gancyclovir) selektiert. Von 600 Neomycin-resistenten Kolonien wurden zwei unabhängige homolog rekombinierte ES-Zellklone durch PCR identifiziert. Die Ergebnisse wurden durch Southern Blot-Analyse mit EcoRIverdauter genomischer DNA unter Verwendung einer 3'-flankierenden Sonde (Position 2495–3065 mMnk2-cDNA) bestätigt. Ein einzelnes Integrationsereignis wurde durch Southern Blot-Analyse von BamHIverdauter DNA mit einer Neomycinsonde bestätigt. ES-Zellklone wurden mit 8-Zellstadium-Embryonen von NMRI-Mäusen aggregiert und die entwickelnden Blastocysten wurden in scheinträchtige Mäuse transferiert, um Chimären zu erzeugen. Chimären wurden mit C57/BL6-Mäusen gezüchtet und Nachkommen wurden mittels PCR genotypisiert, unter Verwendung der folgenden Primer: Mnk2-ES-Primer (SEQ ID NO:36): 5' AGA CTA GGG AGG AGG GTG GAG GA 3'; Mnk2-KO-Primer (SEQ ID NO:37): 5' GGT GGA TGT GGA ATG TGT GCG A 3'; Mnk2-WT 5'-GGG GTG TAG GGG TCT GTT AGG 3'. Heterozygote Mäuse wurden für weitere Kreuzungen verwendet und untersucht.
Beispiel 13: Screening kleiner Moleküle
Verbindungen, welche für die Prophylaxe, Behandlung oder Diagnose von Mnk-verbundenen metabolischen Erkrankungen geeignet sind, können mittels eines Kinaseassays, eines Bindungsassays oder mit jedem anderen geeigneten Assay zur Messung einer Funktion, die mit dem Mnk-Polypeptid, einem Mnk-Polypeptidfragment oder Derivat davon assoziiert ist, identifiziert werden. Dieser Kinaseassay kann basieren auf rekombinantem humanem Mnk2- (Mnk2a oder Mnk2b) oder Mnk1-Protein und einem markierten Peptid, umfassend die elF4E-Targetsequenz, eine markierte rekombinante elF4E-Targetsequenz oder ein markiertes rekombinantes elF4E-Protein als ein Substrat. Der Assay kann ein radioaktiver Kinaseassay sein, oder ein Assay, der auf der Verwendung eines Anti-Phosphoserin-Antikörpers basiert, welcher fähig ist, eine elF4E-Phosphorylierung an Ser209 zu erkennen.
Zum Beispiel wurden die Kinasen Mnk2a (GenBank-Signatur Nr. AF237775; siehe auch 3D und 3E), Erk2 (GenBank-Signatur Nr. M84489) und eine doppelte Punktmutante von Mek1 (GenBank-Signatur Nr. Q02750), enthaltend die Aminosäuresubstitutionen Ser218Asp und Ser222Glu (S218D S222E) in E.coli exprimiert und nachfolgend unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gereinigt. Bevorzugt wurden in einer 50 μl Kinasereaktion 2,0 μM Mnk2a mit 200 nM Erk2 plus 20 nM Mek1 S218D S222E (markierte Spuren 1 bis 4 in 14) oder mit 50 nM Erk2 plus 2,5 nM Mek1 S218D S222E (markierte Spuren 5 bis 8 in 14) inkubiert, in Gegenwart von 1,0 mM ATP, 50 mM Hepes/KOH, 5 mM Magnesiumchlorid und 0,5 mM DTT bei 30°C. Bei den angegebenen Zeitpunkten (0, 10, 20 und 40 min, siehe 14) wurden Proben aus der Reaktion entnommen, in SDS-Probenpuffer, enthaltend 50 mM EDTA verdünnt, und durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt. Die durch SDS-PAGE getrennten Reaktionsproben wurden auf Nitrozellulose geblottet und mit einem Antikörper gegen ein Phospho-Eptop, erforderlich für die Aktivierung von Mnk (Anti-Phospho-Mnk Thr197/202; Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA) sondiert. Der Anti-Phospho-Mnk-Antikörper wurde mit einem Peroxidase-gekoppelten Anti-Kaninchen-Antikörper (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) wie anderweitig beschrieben, nachgewiesen (Harlow und Lane, 1998, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).
Wenn die Reaktion voranschreitet, kann die Aktivierung von Mnk2a sichtbar gemacht werden durch die Immunreaktivität von Mnks mit dem Anti-Phospho-Mnk-Antikörper (siehe obere Tafel in 14).
Die Erzeugung des Phospho-Epitops, erforderlich für die Aktivierung von Mnk2a, und der hohe Wirkungsgrad dieses Verfahrens (wie durch die nahezu vollständige elektrophoretische Mobilitätsverschiebung gezeigt) zeigen die Eignung dieses Ansatzes, um enzymatisch aktives Mnk2a zu erzeugen.
Zur Bestätigung des Assays können bekannte Mnk-Inhibitoren, wie etwa CGP57380 oder CGP025088 verwendet werden (siehe Knauf et al., 2001, Mol. Cell. Biol. 21: 5500, Tschopp et al., 2000, Mol. Cell. Biol. Res. Comm. 3: 205 und Slentz-Kesler et al., 2000, Genomics 69: 63). Als eine Negativkontrolle kann CGP052088 verwendet werden.
Alternativ kann das Screening die Verwendung von auf Zellen basierenden Screeningsystemen umfassen, zum Beispiel prokaryontische oder eukaryontische Zellen, welche Mnk-Proteine überexprimieren. Weiterhin können transgene Tiere verwendet werden, die Mnk2 und/oder Mnk1 überexprimieren oder unterexprimieren können.
Alle in der obigen Beschreibung erwähnten Publikationen und Patente sind hierin durch Bezugnahme eingeschlossen.
Zahlreiche Modifikationen und Variationen des beschriebenen Verfahrens und Systems der Erfindung werden Fachleuten offensichtlich sein, ohne vom Umfang und Geist der Erfindung abzuweichen. Obwohl die Erfindung in Zusammenhang mit speziellen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, sollte verstanden werden, dass die Erfindung wie beansprucht nicht in unangemessener Weise auf solche speziellen Ausführungsformen beschränkt werden sollte. Tatsächlich sollen verschiedene Modifikationen der beschriebenen Verfahren zur Ausführung der Erfindung, welche für Fachleute der Molekularbiologie oder verwandten Gebieten offensichtlich sind, innerhalb des Umfangs der folgenden Ansprüche liegen. SEQUENZPROTOKOLL
Zusammenfassung
Diese Erfindung offenbart Mnk-homologe Proteine, welche die Energie-Homöostase, den Triglycerid-Metabolismus regulieren und/oder zur Membranstabilität und/oder Funktion von Organellen beitragen, und Polynukleotide, welche die in dieser Erfindung offenbarten Proteine identifizieren und dafür codieren. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser Sequenzen bei der Diagnose, Untersuchung, Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten und Erkrankungen, die mit der Regulation des Körpergewichts und der Thermogenese verbunden sind, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, metabolische Erkrankungen wie etwa Essstörungen, Kachexie, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzerkrankung, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis, Gallensteine und Schlafapnoe und Erkrankungen, die mit der ROS-Abwehr verbunden sind, wie etwa Diabetes mellitus, neurodegenerative Erkrankungen und Krebs, zum Beispiel Krebs der Geschlechtsorgane, und andere.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Nucleinsäure-Molekül der MAP-Kinase-interagierenden Kinase- (Mnk) Genfamilie oder ein davon codiertes Polypeptid oder ein Fragment oder eine Variante des Nucleinsäure-Moleküls oder des Polypeptids, oder einen Antikörper, ein Aptamer oder einen anderen Rezeptor, der ein Nucleinsäure-Molekül der Mnk-Genfamilie oder ein darauf codiertes Polypeptid erkennt, zusammen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsmitteln.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Nucleinsäure-Molekül eine Vertebraten- oder Insekten-Mnk-Nucleinsäure ist, insbesondere eine humane Mnk-homologe Nucleinsäure, insbesondere eine Nucleinsäure, die für ein Mnk-homologes Gen auf dem humanen Chromosom 19 (Mnk2) (Genbank-Signatur Nr. XM_030637, identisch mit der Genbank-Signatur Nr. AF237775.1, und/oder der Genbank-Signatur Nummer NM_017572.1) codiert, oder für ein humanes Mnk-Protein auf dem Chromosom 1 (Mnk1) (Genbank-Signatur Nr. XM_001600, identisch mit der Genbank-Signatur Nr. AB00409.1, und/oder der Genbank-Signatur Nummer NM_003684.2) oder ein Fragment davon oder eine Variante davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Nucleinsäure-Molekül (a) bei 50°C in einer Lösung, enthaltend 1 × SSC und 0,1 % SDS an eine Mnk-Nucleinsäure oder den komplementären Strang davon hybridisiert, insbesondere ein Nucleinsäure-Molekül, das für die in 3 abgebildeten Aminosäure-Sequenzen codiert; (b) degeneriert ist im Bezug auf das Nucleinsäure-Molekül aus (a) (c) für ein Polypeptid codiert, welches zu mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, mehr bevorzugt mindestens 95%, mehr bevorzugt mindestens 98%, und bis zu 99,6% identisch ist mit den in 3 abgebildeten Polypeptiden; (d) sich von dem Nucleinsäure-Molekül von (a) bis (c) durch eine Mutation unterscheidet, und worin die Mutation eine Änderung, Deletion, Duplikation oder einen vorzeitigen Stop im codierten Polypeptid verursacht.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–3, worin das Nucleinsäure-Molekül ein DNA-Molekül ist, insbesondere eine cDNA oder eine genomische DNA.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–4, worin die Nucleinsäure für ein Polypeptid codiert, das dazu beiträgt, die Energie-Homöostase und/oder den Triglycerid-Metabolismus und/oder die Membran-Stabilität und/oder die Funktion in Organellen, wie etwa Mitochondrien, zu regulieren.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–5, worin das Nucleinsäure-Molekül ein rekombinantes Nucleinsäure-Molekül ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–6, worin das Nucleinsäure-Molekül ein Vektor ist, insbesondere ein Expressions-Vektor.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–5, worin das Polypeptid ein rekombinantes Polypeptid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, worin das rekambinante Polypeptid ein Fusions-Polypeptid ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–7, worin das Nucleinsäure-Molekül ausgewählt ist aus Hybridisierungs-Sonden, Primern und Antisense-Oligonukleotiden.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–10, welche eine diagnostische Zusammensetzung ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–10, welche eine pharmazeutische Zusammensetzung ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–12 zur Herstellung eines Mittels zum Nachweis und/oder zur Bestätigung, zur Behandlung, Linderung und/oder Vorbeugung von Krankheiten und Erkrankungen, die mit der Regulation des Körpergewichts und der Thermogenese verbunden sind, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf metabolische Erkrankungen, wie etwa Fettleibigkeit, ebenso wie verwandte Erkrankungen, wie etwa Essstörungen, Kachexie, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzerkrankung, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis, Gallensteine und Schlafapnoe, und Erkrankungen, die mit der ROS-Abwehr verbunden sind, wie etwa Diabetes mellitus, neurodegenerative Erkrankungen und Krebs, z.B. Krebs der Geschlechtsorgane, und andere, in Zellen, Zellmassen, Organen und/oder Subjekten.
Verwendung eines Nucleinsäure-Moleküls der Mnk-Genfamilie oder eines davon codierten Polynukleotids, oder eines Fragments oder einer Variante des Nucleinsäure-Moleküls oder des Polypeptids, oder eines Antikörpers, eines Aptamers oder eines anderen Rezeptors, der ein Nucleinsäure-Molekül der Mnk-Genfamilie oder ein davon codiertes Polypeptid erkennt, zur Kontrolle der Funktion eines Gens und/oder eines Genprodukts, welches von einem Mnkhomologen Polypeptid beeinflusst und/oder modifiziert wird.
Verwendung des Nucleinsäure-Moleküls der Mnk-Genfamilie oder eines darauf codierten Polynukleotids oder eines Fragments oder einer Variante des Nucleinsäure-Moleküls oder des Polypeptids, oder eines Antikörpers, eines Aptamers oder eines anderen Rezeptors, der das Nucleinsäure-Molekül der Mnk-Genfamilie oder ein davon codiertes Polypeptid erkennt, zur Identifizierung von Substanzen, die mit einem Mnk-homologen Polypeptid Wechselwirken können.
Nicht humanes, transgenes Tier, das eine modifizierte Expression eines Mnk-homologen Polypeptids aufweist.
Tier nach Anspruch 16, worin die Expression des Mnk-homologen Polypeptids erhöht und/oder verringert ist.
Rekombinante Wirtszelle, die eine modifizierte Expression eines Mnk-homologen Polypeptids aufweist.
Zelle nach Anspruch 18, welche eine humane Zelle ist.
Verfahren zur Identifizierung eines (Poly)peptids, das an der Regulierung der Energie-Homöostase und/oder dem Metabolismus von Triglyceriden in einem Säugetier beteiligt ist, umfassend die Schritte (a) Kontaktieren einer Auswahl von (Poly)peptiden mit einem Mnk-homologen Polypeptid oder einem Fragment davon, unter Bedingungen, die eine Bindung des (Poly)peptids erlauben; (b) Entfernen von (Poly)peptiden, die nicht binden, und (c) Identifizieren von (Poly)peptiden, die an das Mnkhomologe Polypeptid binden.
Screening-Verfahren für ein Mittel, welches die Wechselwirkung eines Mnk-homologen Polypeptids mit einem Binde-Target/Mittel moduliert, umfassend die Schritte (a) Inkubieren eines Gemisch, umfassend (aa) ein Mnk-homologes Polypeptid oder ein Fragment davon; (ab) ein Binde-Target/Mittel des Mnk-homologen Polypeptids oder eines Fragments davon, und (ac) einen potentiellen Mittel, unter Bedingungen, wobei das Mnk-Polypeptid oder Fragment davon mit einer Referenz-Affinität spezifisch an das Binde-Target/Mittel bindet; (b) Nachweisen der Bindungsaffinität des Mnk-Polypeptids oder Fragments davon an das Binde-Target, um eine (potentielle) Wirkstoff-bedingte Affinität zu bestimmen; und (c) Bestimmen einer Differenz zwischen der (potentiellen) Wirkstoff-bedingte Affinität und der Referenz-Affinität.
Screening-Verfahren für ein Mittel, welches die Aktivität eines Mnkhomologen Polypeptids moduliert, umfassend die Schritte (a) Inkubieren eines Gemisch, umfassend (aa) ein Mnk-homologes Polypeptid oder ein Fragment davon; (ab) ein potentielles Mittel unter Bedingungen, wobei das Mnk-Polypeptid oder Fragment davon eine Referenz-Aktivität aufweist; (b) Nachweisen der Aktivität des Mnk-Polypetids oder Fragments davon, um eine durch das (potentielle) Mittel bedingte Aktivität zu bestimmen; und (c) Bestimmen eines Unterschieds zwischen einer durch das (potentielle) Mittel bedingten Aktivität und der Referenz-Aktivität.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, worin das potentielle Mittel ausgewählt ist aus Peptiden und niedermolekularen organischen Verbindungen.
Verfahren noch einem der Ansprüche 20–23, worin ein bekannter Mnk-Effektor als Positivkontrolle für die Assay-Entwicklung und/oder Validierung von potentiellen Mitteln verwendet wird,
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, umfassend das durch das Verfahren noch Anspruch 20 identifizierte (Poly)peptid oder das durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 21–24 identifizierte Mittel, mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsmittel.
Verfahren nach Anspruch 25, worin die Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung ist, zur Vorbeugung, Linderung oder Behandlung von Krankheiten und Erkrankungen, die mit der Regulation des Körpergewichts und der Thermogenese verbunden sind; zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf metabolische Erkrankungen, wie etwa Fettleibigkeit, ebenso wie verwandte Erkrankungen, wie etwa Essstörungen, Kachexie, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzerkrankungen, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis, Gallensteine und Schlafapnoe, und Erkrankungen, die mit der ROS-Abwehr verbunden sind, wie etwa Diabetes mellitus, neurodegenerative Erkrankungen und Krebs, z.B. Krebs der Geschlechtsorgane, und andere, in Zellen, Zellmassen, Organen und/oder Subjekten.
Verwendung eines durch das Verfahren noch Anspruch 20 identifizierte Polypeptids oder eines durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 21–24 identifizierten Mittels zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung, Linderung und/oder Vorbeugung von Krankheiten und Erkrankungen, die mit der Regulation des Körpergewichts und der Thermogenese verbunden sind, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf metabolische Erkrankungen, wie etwa Fettleibigkeit, ebenso wie verwandte Erkrankungen, wie etwa Essstörungen, Kachexie, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzerkrankungen, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthriris, Gallensteine und Schlafapnoe, und Erkrankungen, die mit der ROS-Abwehr verbunden sind, wie etwa Diabetes mellitus, neurodegenerative Erkrankungen und Krebs, z.B. Krebs der Geschlechtsorgane, und andere, in Zellen, Zellmassen, Organen und/oder Subjekten.
Verwendung eines Nucleinsäure-Moleküls der Mnk-Familie oder eines Fragments davon zur Herstellung eines nicht humanen Tieres, welches das Mnk-Genprodukt über- oder unterexprimiert.
Kit, umfassend zumindest eines von: (a) einem Mnk-Nucleinsäure-Molekül oder einem Fragment davon; (b) einem Vektor, umfassend die Nucleinsäure aus (a); (c) einer Wirtszelle, umfassend die Nucleinsäure aus (a) oder den Vektor aus (b); (d) einem Polypeptid, codiert von der Nucleinsäure aus (a); (e) einem Fusions-Polypeptid, codiert von der Nucleinsäure aus (a); (f) einem Antikörper, einem Aptamer oder einem anderen Rezeptor gegen die Nucleinsäure aus (a) oder das Polypeptid aus (d) oder (e), und (g) einem Antisense-Oligonukleotid der Nucleinsäure aus (a).
Verwendung eines Effektors eines Mnk-Polypetids zur Herstellung eines Mittels zur Prophylaxe, zur Behandlung oder zur Diagnose von Krankheiten und Erkrankungen, die mit der Regulation des Körpergewichts und der Thermogenese verbunden sind, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf metabolische Erkrankungen, wie etwa Fettleibigkeit, ebenso wie verwandte Erkrankungen, wie etwa Essstörungen, Kachexie, Diabetes mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzerkrankungen, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthriris, Gallensteine und Schlafapnoe, und Erkrankungen, die mit der ROS-Abwehr verbunden sind, wie etwa Diabetes mellitus, neurodegenerative Erkrankungen und Krebs, z.B. Krebs der Geschlechtsorgane.
Verwendung nach Anspruch 30, worin der Effektor ein Mnk2- oder Mnk1-Polypeptid ist.
Verwendung nach Anspruch 30 oder 31, worin der Effektor ausgewählt ist aus Staurosporin- oder Pyrazol-Derivaten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 30–32, worin der Effektor CGP57380 oder ein Derivat davon ist.