DE10163467A1

DE10163467A1 - Protein 24B2 und zugrundliegende DNA-Sequenz

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Publication number: DE10163467A1
Application number: DE10163467A
Authority: DE
Inventors: Armin Schneider; Brigitta Kammandel; Bettina Klausner; Moritz Rossner; Achim Fischer; Rebecca Widenmeyer; Bernhard Goetz; Gisela Eisenhardt; Stephanie Jomana Naim
Original assignee: Axaron Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2001-12-21
Publication date: 2003-11-27

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen des Proteins 24B2 bzw. Abschnitte dieser DNA-Sequenzen, einschließlich aller funktionshomologen Derivate oder Allele sowie entsprechende, auf diesen erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen beruhende Expressionsvektoren; Wirtszellen, die mit derartigen Expressionsvektoren transfiziert sind; Genprodukte, die durch die erfindungsgemäßen Sequenzen codiert werden; gegen erfindungsgemäße Genprodukte gerichtete Antikörper; Verfahren zur Expression bzw. Isolierung von 24B2 oder Fragmenten von 24B2; die Verwendung von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. Genprodukten als Arzneimittel sowie pharmazeutisch wirksame Verbindungen und Verfahren zu deren Herstellung, die die physiologische Funktion von 24B2 modulieren können.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft (i) DNA-Sequenzen, (ii) Expressionsvektoren, die erfindungsgemäße DNA-Sequenzen enthalten, (iv) Wirtszellen, die erfindungsgemäße Expressionsvektoren aufweisen, (v) Genprodukte, die durch erfindungsgemäße Sequenzen codiert werden, (vi) hinsichtlich erfindungsgemäßer Sequenzen veränderte transgene Tiere, (vii) gegen erfindungsgemäße Genprodukte gerichtete Antikörper, (viii) Verfahren zur Expression bzw. Isolierung von erfindungsgemäßen Genprodukten, (ix) die Verwendung von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. Genprodukten als Arzneimittel, (x) pharmazeutisch wirksame Verbindungen und Verfahren zu deren Herstellung sowie Verwendungen derartiger erfindungsgemäßer Verbindungen und (xi) nicht-therapeutische Verwendungen erfindungsgemäßer DNA-Sequenzen bzw. Genprodukte.

Der Schlaganfall stellt die dritthäufigste Todesursache und die Hauptursache für Behinderungen in den westlichen Industrienationen dar. Jedes Jahr erleiden in Deutschland ungefähr 250.000 Menschen einen Schlaganfall, ein Drittel stirbt innerhalb des ersten Monats daran, 60% behalten Behinderungen zurück. Bislang gibt es keine wirksame Therapie für die Mehrzahl dieser Patienten. Die Mehrzahl aller Schlaganfälle in den westlichen Ländern beruht auf Störungen des cerebralen Blutflusses durch Thrombosen oder Embolien. Aus diesem Grund beruhen viele der bisherigen Therapiekonzepte auf der Thrombolyse (bspw. mittels Streptokinase, rtPA, Ancrod). Aus dem Stand der Technik ist allerdings nunmehr auch bekannt, daß bei der Mehrzahl der Schlaganfälle eine spontane Reperfusion auftritt. Neuere Arbeiten bei Nagetieren lassen auch vermuten, daß der Schaden durch die Reperfusion in einem gewissen Zeitfenster eher größer wird.

Die klinische Wirksamkeit von Substanzen mit thrombolytischen Eigenschaften ist teilweise erbracht, hat jedoch nicht zu einer Therapie geführt, die bei der Mehrzahl der Schlaganfälle eingesetzt werden könnte. Neuere Forschungsentwicklungen stellen daher auf die Entwicklung neuer Medikamente ab, die direkt das Zelltodprogramm in Neuronen beeinflussen können.

Um neuartige Konzepte für die Behandlung der cerebralen Ischämie, deren ausgeprägteste Form der Schlaganfall darstellt, zu entwickeln, werden in neueren Modellsystemen der cerebralen Ischämie Veränderungen der Genexpression registriert, die in funktionellem Zusammenhang mit dem Ausmaß der Hirnschädigung stehen. Das beste verfügbare Tiermodell ist das sog. Fadenmodell in Nagetieren ("filament model"), bei dem ein beschichteter Nylonfaden die Abzweigung der A. cerebri media verschließt. Durch Zurückziehen des Fadens wird eine Wiederdurchblutung des Infarktgebietes möglich. Aus der Analyse des Transkriptoms zu unterschiedlichen postischämischen Zeitpunkten können neue therapeutische Targets identifiziert werden, die neue Behandlungswege für die Akuttherapie erschließen. Einzelne Genprodukte, die einer Regulation während des Präkonditionierens unterliegen, konnten bereits identifiziert werden (z. B. IL-1ra, TIMP-1, hsp-72). Bislang ist jedoch eine protektive Wirkung der identifizierten Proteine nicht eindeutig nachgewiesen worden.

Unter den aus dem Stand der Technik für die Pathophysiologie des Schlaganfalls bekannten Proteinen sind jene zu nennen, die am Ras/Erk Signaltransduktionsweg beteiligt sind. Diese Proteine der Ras/Erk-Kaskade stellen daher pharmakologische Angriffspunkte ("targets") dar. Gleichwohl müssen auch andere Signaltransduktionswege an die Pathophysiologie des Schlaganfalls beteiligt sein, wobei die insoweit involvierten Proteinen ebenfalls pharmakologisch von höchstem Interesse wären. Darüber hinaus ist bekannt, daß die Regulation der Genexpression bei der cerebralen Ischämie eine entscheidende Rolle für den Ablauf und das Ausmaß des Neuronenschadens (Koistinaho and Hokfelt, 1997, Neuroreport, 8, i-viii.; Schneider et al., 1999, Nat. Med., 5, 554-9.). Insbesondere immediate early genes spielen hier eine Rolle (Atkins et al., 1996, Stroke, 27, 1682-1687), wie z. B. cox- 2, (Nogawa et al., 1997, J. Neurosci., 17, 2746-2755).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere Proteine und deren zugrundeliegende Nukleotidsequenzen zu identifizieren, die ihre biologische Wirkung vorzugsweise intrazellulär entfalten. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, auf der Basis identifizierter Proteine Verfahren zur Verfügung zu stellen, die es erlauben, Pharmaka zu entwickeln, die in eine Pathophysiologie, die durch Fehlsteuerung der Expression und/oder Expression infunktioneller Varianten bedingt ist, therapeutisch eingreifen können. Damit ist auch das Bereitstellen von entsprechenden Pharmaka eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe durch die Gegenstände der Ansprüche 1, 5, 6, 8, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 23, 26 und 27. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den jeweiligen Unteransprüchen beschrieben.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft daher Nukleinsäure-Sequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die einen Sequenzbereich enthalten, der für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von AS 10 bis AS 350 (24B2), stärker bevorzugt AS 20 bis 300, AS 30 bis 300, AS 40 bis AS 300, AS 50 bis AS 300, AS 60 bis AS 300, AS 70 bis AS 300, AS 80 bis AS 300, AS 90 bis AS 300, AS 100 bis AS 300, AS 110 bis AS 300, AS 120 bis AS 300, AS 130 bis AS 300, AS 140 bis AS 300, AS 150 bis AS 300 oder AS 150 bis AS 400, AS 150 bis AS 390, AS 150 bis AS 380, AS 150 bis AS 370, AS 150 bis AS 360, AS 150 bis AS 350, AS 150 bis AS 340, AS 150 bis AS 330, AS 150 bis AS 320 oder AS 150 bis AS 310 (Numerierung gemäß Reihenfolge der AS in den Fig. 2 oder 4) codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele. Insbesondere sind alle Nukleinsäure-Sequenzen mitumfaßt, die mit den erfindungsgemäßen Sequenzen hybridisieren, einschließlich der jeweils im Doppelstrang komplementären Sequenzen (Anspruch 1).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden DNA- Sequenzen offenbart, deren Genprodukt für ein Polypeptid codiert oder die einen Sequenzbereich enthält, der für ein Polypeptid codiert, wie in einer der Fig. 2 oder 4 für die murinen oder humanen Sequenzen 24B2 wiedergegeben, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Allele oder Fragmente einer solchen DNA-Sequenz und auch infunktioneller Derivate, Allele, Analoga oder Fragmente (bspw. DN-Varianten), die die physiologische Funktion, insbesondere die Beteilung an Signaltransduktionsprozessen (bspw. im Zusammenhang mit Schlaganfall, bspw. aber auch der apoptotische Signalkaskade) inhibieren können (Anspruch 2, 3). Auch mit diesen erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisierende DNA-Sequenzen (einschließlich der Sequenzen des komplementären DNA-Stranges) sind mitoffenbart. Die Herstellung derartiger Derivate, Analoga, Fragmente oder Allele geschieht durch Standardverfahren (Sambrook et al. 1989/2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). Hierbei werden bei den DNA-Sequenzen gemäß Fig. 1 und 3 dargestellten 24B2- Nukleinsäuresequenzen ein oder mehrere Codon(s) insertiert, deletiert und/oder substituiert, um nach Transkription und Translation ein Polypeptid zu erhalten, das einen Unterschied in bezug auf mindestens eine Aminosäure (substituiert, deletiert und/oder insertiert) gegenüber den entsprechenden nativen, bspw. den in den Fig. 2 oder 4 dargestellten AS-Sequenzen aufweist.

Zum Erfindungsgegenstand der vorliegenden Anmeldung gehören auch DNA-Teilsequenzen der in den Fig. 1 oder 3 dargestellten Sequenzen. Diese Teilsequenzen enthalten typischerweise mindestens 60, stärker bevorzugt mindestens 150 und noch stärker bevorzugt mindestens 250 Nukleotide, am stärksten bevorzugt mindestens 450 Nukleotide umfassende Fragmente der in den Fig. 1 oder 3 dargestellten Nukleotidsequenzen. Insbesondere codieren bevorzugte Teilsequenzen für Polypeptide, die von AS 20 der humanen oder murinen 24B2-AS-Sequenz mindestens 20 AS in Richtung C- Terminus verlaufen und ggf. sich bis zum C-Terminus erstrecken können (Numerierung gemäß Fig. 2 oder 4). Andererseits kann die für mindestens 20 AS codierende Teilsequenz aber auch an einem von den vorgenannten Punkten weiter proximal oder distal liegenden Codons beginnen. Mitoffenbart sind alle Derivate, Analoga oder Allele der vorgenannten offenbarten Teilsequenzen. Auch die sich aus diesen erfindungsgemäßen DNA-Teilsequenzen ergebenden AS- Sequenzen sind als solche oder als Bestandteile von größeren rekombinanten Proteinen (am N-Terminus, am C-Terminus und oder eingebettet in andere Sequenzen) mitoffenbart. Insbesondere sind auch alle denkbaren bzw. nativ auftretenden Spleißvarianten der erfindungsgemäßen Sequenzen Bestandteil der vorliegenden Offenbarung.

Weiterhin bevorzugt sind Nukleinsäure-Sequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die für ein Protein codieren, das mindestens 60% Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens 80% und noch stärker bevorzugt mindestens 95%, mit den in den Fig. 2 oder 4 dargestellten Sequenzen hat und vorzugsweise mit diesen funktionshomolog ist. Nach Isolierung und Sequenzierung sind die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen gemäß Fig. 1 oder 3 oder deren funktionelle oder infunktionelle Äquivalente, wie z. B. Allelvarianten oder Isoformen, erhältlich. Unter Allelvarianten werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Varianten verstanden, die 60 bis 100% Homologie auf Aminosäureebene, bevorzugt 70 bis 100%, ganz besonders bevorzugt 90 bis 100% aufweisen. Allelvarianten umfassen insbesondere solche funktionellen oder infunktionellen Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in den Fig. 1 oder 3 dargestellten Sequenzen erhältlich sind, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften erhalten bleibt. Vorzugsweise sind Allelvarianten funktionshomolog mit den nativen 24B2-Sequenzen.

Homologe oder sequenzverwandte DNA-Sequenzen können aus allen Säugerspezies, einschließlich Mensch, nach gängigen Verfahren durch Homologie-Screening durch Hybridisierung mit einer Probe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon isoliert werden. Unter funktionellen Äquivalenten sind auch Homologe der in den Fig. 1 oder 3 dargestellten Sequenzen, beispielsweise ihre Homologen aus anderen Mammalia, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nicht-codierenden DNA-Sequenz zu verstehen. Solche funktionellen Äquivalente lassen sich ausgehend von den in den Fig. 1 oder 3 dargestellten DNA- Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Vertebraten wie Mammalia, isolieren. Damit sind erfindungsgemäß alle mit den Sequenzen gemäß Fig. 1 oder 3 hybridisierenden Sequenzen mitumfaßt. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche, die auf dem Fachmann bekannte Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden.

Je nach der verwendeten Nukleinsäure-Sequenz (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) bzw. je nachdem, welche Nukleinsäureart (DNA oder RNA) für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA : DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA : RNA-Hybriden gleicher Länge. Unter Standardbedingungen sind beispielsweise, je nach Nukleinsäure, Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid, wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid, zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA : DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA : RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise bei Sambrook et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989/2001), beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln, beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C- Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausübel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Zu Äquivalenten von erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen gehören auch Derivate der in den Fig. 1 oder 3 dargestellten Sequenzen, wie beispielsweise Promotorvarianten. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen gemeinsam oder einzeln vorgeschaltet sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, wobei die die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren erhalten bleiben kann oder, je nach Bedarf, verändert werden kann. So können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden. Unter Derivaten sind erfindungsgemäß auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -1000 vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht, wird.

Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die vorzugsweise am 3'-Ende verändert wurden. Als solche "Tags" sind in der Literatur z. B. Hexa-Histidin-Anker oder der Flag-Tag bekannt oder Epitope, die als Antigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (Studier et al., Meth. Enzymol., 185, 1990: 60-89 und Ausubel et al. (eds.) 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). und/oder mindestens eine Signalsequenz zum Transport des translatierten Proteins, bspw. in eine bestimmte Zellorganelle oder in den extrazellulären Raum.

Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, bspw. gemäß Fig. 1 oder 3 bzw. deren Derivate, Varianten, Homologe oder insbesondere Fragmente auch in therapeutisch oder diagnostisch geeigneter Form exprimiert werden. Zur Generierung des rekombinanten Proteins können Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwendet werden, die die Nukleinsäuren oder das Nukleinsäurekonstrukt um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide kodieren, die bspw. einer einfacheren Reinigung dienen.

Bevorzugt sind weiterhin DNA-Sequenzen, die (c)DNA-Sequenzen erfindungsgemäßer genomischer DNA-Sequenzen enthalten oder diesen entsprechen (Anspruch 4), insbesondere Sequenzen gemäß Fig. 1 oder 3.

Weiterhin werden erfindungsgemäß vorzugsweise alle DNA- Sequenzen mitoffenbart, die für ein Protein codieren, das im wesentlichen der Aminosäuresequenz des humanen oder murinen Proteins 24B2 gemäß Fig. 2 oder 4 entspricht. Diese DNA- Sequenzen erhalten nur eine geringe Zahl an Veränderungen gegenüber der in den vorgenannten Figuren angegebenen Sequenzen, bspw. kann es sich um Isoformen handeln. Die Zahl der Sequenzveränderungen wird typischerweise nicht größer als 10 sein. Derartige im wesentlichen mit den für die Proteine 24B2 verschiedenster Spezies codierenden DNA- Sequenzen entsprechenden DNA-Sequenzen, die gleichfalls für ein biologisch aktives Protein codieren, können durch allgemein bekannte Mutagenese-Verfahren erhalten und die biologische Aktivität der durch die Mutanten codierten Proteine durch Screening-Verfahren, bspw. Bindungsstudien oder die Fähigkeit zur Ausprägung der biologischen Funktion, bspw. im Zusammenhang mit der Signaltransduktion, insbesondere auch mit der Signaltransduktion in neuronalen Zellen, identifiziert werden. Zu den entsprechenden Mutagenese-Verfahren gehören die "site-directed"-Mutagenese, die die automatisch durchgeführte Synthese eines Primers mit mindestens einer Basenveränderung vorsieht. Nach der Polymerisierungsreaktion wird der Heteroduplex-Vektor in einen geeignetes Zellsystem transferiert (z. B. E. coli) und entsprechend transformierte Klone isoliert.

Darüber hinaus kommen alle dem Fachmann geläufigen Methoden für die Herstellung, Modifikation und/oder Detektion von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, die in vivo, in situ oder in vitro ausgeführt werden können in Betracht (PCR (Innis et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications) oder chemische Synthese). Durch entsprechende PCR-Primer können bspw. neue Funktionen in eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz eingeführt werden, wie z. B. Restriktionsschnittstellen, Terminationscodons. Hierdurch können erfindungsgemäße Sequenzen für den Transfer in Klonierungsvektoren entsprechend entworfen werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Expressionsvektoren oder ein rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt, das eine, wie oben beschrieben, erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, typischerweise eine DNA-Sequenz enthält (Anspruch 5). Vorteilhafterweise werden hierbei die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit mindestens einem genetischen Regulationselement, wie bspw. Transkriptions- und Translationssignalen, funktionell verknüpft. Diese Verknüpfung kann je nach gewünschter Anwendung zu einer nativen Expressionsrate oder auch zu einer Erhöhung bzw. Erniedrigung der nativen Genexpression führen. Mit den solchermaßen hergestellten Expressionsvektoren können anschließend Wirtsorganismen bzw. Wirtszellen transformiert werden, z. B. Zellkulturen aus Säugetierzellen.

Bei einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor wird (werden) typischerweise das (die) native(n) Regulationselement(e) eingesetzt werden, d. h. die bspw. Promotor und/oder Enhancer-Region des Gens für das Protein 24B2, bspw. aus Säugetieren, insbesondere entsprechende humane Regulationssequenzen. Ggf. können diese nativen 24B2- Regulationssequenzen auch genetisch verändert sein, um eine veränderte Expressionsintensität hervorzurufen. Zusätzlich zu diesen nativen 24B2-Regulationssequenzen oder anstelle dieser nativen 24B2-Regulationssequenzen können für andere Gene native Regulationselemente erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet (5'- oder 3'- Regulationssequenzen) sein und gegebenenfalls auch genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation unter der Kontrolle der 24B2-Regulationssequenzen ausgeschaltet ist und die Expression der Gene - je nach Wunsch - hierdurch erhöht oder erniedrigt werden kann.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Fromotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, l-PR- oder im l-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram- positiven Promotoren wie amy und SPO2, in den Hefepromotoren wie ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in Mammaliapromotoren wie CaM-KinaseII, CMV, Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, beta-Globin, GFAP, GAP43, Tyrosin Hydroxylase, Kainat-Rezeptor-Untereinheit 1, Glutamat-Rezeptor- Untereinheit B enthalten. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die bspw. oben genannten für einen erfindungsgemäße Expressionsvektor verwendet werden.

Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Als Regulationssequenzen werden alle dem Fachmann geläufigen Elemente bezeichnet, die auf der Transkriptions- und/oder Translationsebene die Expression der erfindungsgemäßen Sequenzen beeinflussen können. Insbesondere sind dabei neben Promotorsequenzen sog. "Enhancer"-Sequenzen hervorzuheben, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA- Polymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken können. Als weitere Regulationssequenzen seien beispielhaft die sog. "Locus Control Regions", "Silencer" oder jeweilige Teilsequenzen davon genannt. Diese Sequenzen können vorteilhaft für eine gewebespezifische Expression verwendet werden. Auch sog. Terminatorsequenzen werden vorteilhafterweise in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor vorhanden sein und erfindungsgemäß unter den Terminus "Regulationssequenz" subsumiert.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verknüpfung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit einem Promotor, wobei der Promotor typisch 5' "upstream" von einer erfindungsgemäßen DNA- Sequenz zu liegen kommt. Weitere Regulationssignale, wie bspw. 3'-gelegene Terminatoren, Polyadenylierungssignale oder Enhancer, können funktionell in dem Expressionsvektor enthalten sein. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen, insbesondere für die Sequenzen gemäß Fig. 1 oder 3 bzw. für die entsprechenden Proteine, in einer oder mehreren Kopien in einem Genkonstrukt nach dieser Erfindung enthalten sein, oder ggf. auch auf getrennten Genkonstrukten lokalisiert sein.

Unter den Begriff "Expressionsvektor" fallen sowohl rekombinante Nukleinsäurekonstrukte bzw. Genkonstrukte, wie zuvor beschrieben, als auch komplette Vektorkonstrukte, die neben erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und etwaigen Regulationssequenzen typischerweise auch weitere Elemente enthalten. Diese Vektorkonstrukte oder Vektoren werden zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus verwendet. Vorteilhafterweise wird mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, bspw. das 24B2-Gen oder eine Teilsequenz des 24B2-Gens, in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im ausgesuchten Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Sindbisvirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Für die Integration in Mammalia wird typischerweise lineare DNA verwendet.

Die Expression erfindungsgemäßer Nukleinsäuresequenzen kann vorteilhaft durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die Genexpression positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale, wie Promotoren und Enhancer, verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird. Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen oder homologe Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen können zusammen mit den für interagierende oder für potentiell interagierende Proteine kodierenden Sequenzen in einen einzelnen Vektor kloniert werden und anschließend in vitro in einer Wirtszelle oder in vivo in einem Wirtsorganismus exprimiert werden. Alternativ kann auch jede der potentiell interagierenden Nukleinsäuresequenzen und die für erfindungsgemäße Polypeptide, bspw. das Protein 24B2, kodierenden Sequenzen in je einen einzelnen Vektor gebracht und diese getrennt in den jeweiligen Organismus über übliche Methoden, wie bspw. Transformation, Transfektion, Transduktion, Elektroporation oder Partikel-Gun verbracht werden.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann mindestens ein Marker-Gen (bspw. Antibiotika-Resistenz-Gene und/oder Gene, die für ein fluoreszierendes Protein kodieren, insbesondere GFP) in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor, insbesondere einem kompletten Vektorkonstrukt, enthalten sein.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Wirtszellen, die mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz und/oder einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor, insbesondere einem Vektorkonstrukt transformiert sind (Anspruch 6). Als Wirtszellen sind prinzipiell alle Zellen geeignet, die eine Expression erfindungsgemäßer DNA- Sequenzen allein oder im Verbund mit weiteren Sequenzen, insbesondere Regulationssequenzen, gestatten. Als Wirtszellen kommen alle Zellen pro- oder eukaryotischer Natur in Betracht, beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen. Bevorzugte Wirtszellen sind Bakterien, wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Aspergillus oder Saccharomyces cerevisiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39, (1997)).

In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch zur Expression von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen Zellen aus multizellulären Organismen gewählt. Dies geschieht auch vor dem Hintergrund einer möglicherweise erforderlichen Glykosylierung (N- und/oder O-gekoppelt) der codierten Proteine. Diese Funktion kann in höheren Eukaryotenzellen - im Vergleich zu Prokaryotenzellen - in geeigneter Weise ausgeführt werden. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur als Wirtszelle verfügbar, wenn auch Zellen von Säugern, beispielsweise Affen, Ratten, Hamstern oder Menschen, ganz besonders bevorzugt sind. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von etablierten Zellinien bekannt. In einer keineswegs abschließenden Aufzählung werden die folgenden Zellinien genannt: 293T (Embryonennierenzellinie), (Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1997)), BHK (Babyhamsternierenzellen), CHO (Zellen aus den Hamsterovarien), (Urlaub und Chasin, P. N. A. S. (USA) 77: 4216, (1980)), HeLa (humane Cervixkarzinomzellen) und weitere - insbesondere für den Laboreinsatz etablierte - Zellinien, wie bspw. HEK293-, Sf9- oder COS-Zellen. Ganz besonders bevorzugt sind humane Zellen, insbesondere Zellen des Immunsystems oder adulte Stammzellen, bspw. Stammzellen des Blut bildenden Systems (aus dem Knochenmark) (Anspruch 7). Humane erfindungsgemäße transformierte Zellen, insbesondere autologe Zellen des Patienten, eignen sich nach (vor allem ex vivo, alternativ aber auch in vivo) Transformation mit erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder erfindungsgemäßen Expressionsvektoren, ganz besonders als Arzneimittel für bspw. gentherapeutische Zwecke, also nach Durchführung einer Zellentnahme, ggf. ex vivo Expansion, Transformation, Selektion und abschließender Retransplantation.

Die Kombination aus einer Wirtszelle und einem zu den Wirtszellen passenden erfindungsgemäßen Expressionsvektor, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter System, die Phagen 1, Mu oder andere temperänte Phagen oder Transposons, und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen, bilden eine erfindungsgemäße Wirtszelle, die als Expressionssystem dienen kann. Bevorzugte erfindungsgemäße Expressionssysteme auf der Basis erfindungsgemäßer Wirtszellen sind beispielsweise die Kombination aus Säugetierzellen, wie bspw. CHO-Zellen, und Vektoren, wie bspw. pcDNA3neo-Vektor, oder bspw. HEK293-Zellen und CMV-Vektor, die für Säugetierzellen besonders geeignet sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die Genprodukte der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (Anspruch 8). Unter Genprodukten versteht man im Sinne dieser Erfindung sowohl Primärtranskripte, also RNA, vorzugsweise mRNA, als auch Proteine bzw. Polypeptide, insbesondere in aufgereinigter Form (Anspruch 9). Bevorzugt sind dabei Geprodukte mit Sequenzen gemäß Fig. 2 oder 4 (Anspruch 10). Diese Proteine regulieren oder transportieren insbesondere extern am die Zelle herangetragene Signale, bspw. auch apoptotische oder nekrotische, ggf. auch inflammatorische Signale oder Signale, die das Zellwachstum oder die Zellplastizität betreffen. Bevorzugt ist ein aufgereinigtes Genprodukt dann, wenn es ein funktionshomologes oder die Funktion inhibierendes (infunktionelles) Allel, Fragment, Analoges oder Derivat dieser Sequenz enthält oder typischerweise aus einer solchen Aminosäuresequenz besteht.

Funktionshomologie wird im Sinne der vorliegenden Erfindung so definiert, daß mindestens noch eine der wesentlichen funktionellen Eigenschaften der gemäß Fig. 2 oder 4 dargestellten murinen oder humanem 24B2-Proteine erhalten bleibt. Typischerweise werden funktionshomologe erfindungsgemäße Proteine insbesondere eine charakteristische, bspw. mindestens 60%ige, vorzugsweise mindestens 80%ige Sequenzidentität mit den biologisch funktionellen Abschnitten der erfindungsgemäßen Proteine, die bspw. Protein-Interaktionsdomänen darstellen, aufweisen.

Unter einem Derivat werden dabei insbesondere solche AS- Sequenzen verstanden, die durch Modifikationen ihrer Seitenketten verändert sind. Bspw. durch Konjugation eines Antikörpers, Enzyms oder Rezeptors an eine erfindungsgemäße AS-Sequenz. Derivate können aber auch die Kopplung eines Zuckers oder Fett(säure)-restes oder einer Phosphatgruppe oder jeder beliebigen Modifikation einer Seitenkette, insbesondere einer freien OH-Gruppe oder NH2-Gruppe oder am N- oder C-Terminus. Darüber hinaus schließt der Begriff "Derivat" auch Fusionsproteine ein, bei denen also eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz an beliebige Oligo- oder Polypeptide gekoppelt ist.

Als "Analoge" werden Sequenzen bezeichnet, die sich durch mindestens eine AS-Veränderung gegenüber der nativen Sequenz auszeichnen (Insertion, Substitution). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind solche konservativen Substitutionen bevorzugt, bei denen der physikochemische Charakter (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) der ausgetauschten AS erhalten bleibt (polare AS, lange aliphatische Kette, kurze aliphatische Kette, negativ oder positiv geladene AS, AS mit aromatischer Gruppe). Die Substitutionen können biologisch funktionelle, tw. funktionelle oder biologisch infunktionelle Sequenzen ergeben. Beispielsweise können Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht werden. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden. Die solchermaßen gegenüber den in Fig. 2 oder 4 veränderten Proteine besitzen typischerweise wenigstens 60%, bevorzugt wenigstens 70% und besonders bevorzugt wenigstens 90% Sequenzidentität zu den Sequenzen in den vorgenannten Figuren, berechnet nach dem Algorithmus von Altschul et al. (J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990). Das isolierte Protein und seine funktionellen Varianten lassen sich vorteilhafterweise aus dem Gehirn von Mammalia wie Homo sapiens, Rattus norvegicus oder Mus musculus isolieren. Auch Homologe aus anderen Mammalia sind unter funktionellen Varianten zu verstehen.

Bevorzugt sind erfindungsgemäß Analoge dann, wenn die Sekundärstruktur, wie sie in der nativen Sequenz auftritt, auch bei ihnen erhalten bleibt, ganz besonders auch deren Tertiärstruktur. Neben konservative Substitutionen können auch weniger konservative AS-Variationen erfindungsgemäß in die native Sequenz eingeführt werden. Dabei behalten sie typischerweise ihre biologische Funktion, insbesondere als Transduktor eines exogenen Signals, bspw. eines apoptotischen oder nekrotischen Signals oder eines Signals für die Zellproliferation, Zellplastizität oder das Zellwachstum, bei. Der Effekt einer Substitution oder Deletion kann ohne weiteres durch entsprechende Untersuchungen, Bindungsassays oder bspw. zytotoxische Tests, überprüft werden.

Gleichwohl werden erfindungsgemäß aber auch Sequenzen einbezogen, die einen sogenannten dominant-negativen Effekt hervorrufen, d. h. auf Grund ihre veränderten Primärsequenz zwar noch Bindungsaktivität an eine in der Kaskade stromaufwärts gelegene Sequenz aufweisen, das Signal aber nicht stromabwärts weitergeben können. Derartige Analoge fungieren daher als Inhibitoren der biologischen Funktion, insbesondere als Inhibitoren der Apoptose. Derartige Analoge werden durch gentechnische Maßnahmen hergestellt, und zwar typischerweise durch die sog. "site-directed"-Mutagenese einer zugrundeliegenden DNA-Sequenz, die für ein erfindungsgemäßes Protein codiert. Hierdurch wird die dem Analogen zugrundliegende DNA-Sequenz hergestellt, die schließlich das Protein in einer rekombinanten Zellkultur exprimieren kann (Sambrook et al., 1989, s. o.). Auch alle Derivate der vorbeschriebenen Analoge werden mitoffenbart, genauso wie die den vorbeschriebenen AS-Sequenzen zugrundeliegenden DNA-Sequenzen.

Weiterhin gehören auch Fragmente einer nativen erfindungsgemäßen AS-Sequenz zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Fragmente zeichnen sich durch Deletionen aus (N- oder C-terminal oder auch intrasequentiell). Sie können einen dominant-negativen oder dominant-positiven Effekt haben.

Zu den erfindungsgemäßen Genprodukten (Proteinen) gehören aber auch all jene Genprodukte (Proteine), die sich erfindungsgemäß von DNA-Derivaten, DNA-Fragmenten oder DNA- Allelen der in den Figuren angegebenen DNA-Sequenzen nach Transkription und Translation ableiten.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Proteine chemisch modifiziert sein. So etwa kann eine Schutzgruppe am N- Terminus vorliegen. Es können Glykosylgruppen an Hydroxyl- oder Aminogruppen angefügt sein, Lipide können kovalent mit dem erfindungsgemäßen Protein verbunden sein, ebenso Phosphate oder Acetylgruppen und ähnliches. Auch beliebige chemische Substanzen, Verbindungen oder Gruppen können auf einem beliebigen Syntheseweg an das erfindungsgemäße Protein gebunden sein. Auch zusätzliche Aminosäuren, z. B. in Form einzelner Aminosäuren oder in Form von Peptiden oder in Form von Proteindomänen und ähnliches, können mit dem N- und/oder C-Terminus eines erfindungsgemäßen Proteins.

Insbesondere sind hier sogenannte Signal- oder "Leader"- Sequenzen am N-Terminus der Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Proteins bevorzugt, die das Peptid cotranslational oder posttranslational in eine bestimmte Zellorganelle oder in den extrazellulären Raum (bzw. das Kulturmedium) führen. Am N- oder am C-Terminus können auch Aminosäuresequenzen vorliegen, die als Antigen die Bindung der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz an Antikörper erlauben. Zu nennen ist hier insbesondere das Flag-Peptid, dessen Sequenz im Einbuchstabencode der Aminosäuren lautet: DYKDDDDK. Oder auch ein His-Tag mit mindestens 3, vorzugsweise mindestens 6 Histidin-Resten. Diese Sequenzen haben stark antigene Eigenschaften und erlaubt somit eine schnelle Überprüfung und leichte Reinigung des rekombinanten Proteins. Monoklonale Antikörper, die das Flag-Peptid binden, sind von der Firma Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut erhältlich.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner mindestens 20, stärker bevorzugt mindestens 30 und noch stärker bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren umfassende Teilabschnitte der in den Fig. 2 oder 4 offenbarten Sequenzen. Derartige Teilsequenzen können nach dem Fachmann geläufigen Verfahren bspw. chemisch synthetisiert werden und können vorzugsweise als Antigene für die Produktion von Antikörpern eingesetzt werden. Vorzugsweise wird es sich bei diesen Teilabschnitten um solche Regionen der in den Fig. 2 oder 4 bzw. deren Derivaten, Allelen oder Fragmenten offenbarten Sequenzen handeln, die im räumlichen Modell der Proteine zumindest teilweise die Proteinoberfläche ausmachen.

Transgene Tiere stellen einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar (Anspruch 11). Bei erfindungsgemäßen transgenen Tieren handelt es sich um Tiere, die genetisch dahingehend verändert sind, daß sie eine im Vergleich zum Normaltier veränderte Menge eines erfindungsgemäßen Genprodukts in mindestens einem Gewebe exprimieren bzw. enthalten. Hierbei sind erfindungsgemäß auch solche Tiere eingeschlossen, die die nativ vorhandene erfindungsgemäße DNA-Sequenz (a) auf der genetischen Ebene entweder tw. oder vollständig nicht mehr aufweisen oder (b) zwar auf der genetischen Ebene erfindungsgemäße Sequenzen aufweisen, diese jedoch nicht transkribieren und/oder translatieren können und daher das Genprodukt nicht mehr enthalten. Darüber hinaus kann (können) bei einem transgenen Tier die native 24B2-Sequenz(en) um mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz ergänzt bzw. durch mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz substituiert sein, insbesondere auch um erfindungsgemäße infunktionelle Varianten, bspw. DN-Mutanten. Insbesondere kann es sich bei der (den) substituierten und/oder ergänzten Sequenz(en) daher um erfindungsgemäße Sequenzen handeln, die nichts nativer Natur sind.

Die Herstellung von in bezug auf erfindungsgemäße Sequenzen transgenen und "knock-out" Tieren, insbesondere Mäusen, Ratten Schweinen, Fruchtfliegen oder Zebrafischen, erfolgt auf dem Fachmann geläufige Weise. Hierzu wird eine erfindungsgemäße cDNA Sequenz oder native oder nicht-native Variante, bspw. auch die native 24B2-cDNA-Sequenz eines Säugers, bspw. in transgenen Mäusen (alternativ: Ratten, Pferden, Schweinen, Hamster oder auch Hefe) exprimiert, z. B. unter einem NSE-Promotor in Neuronen, unter einem MBP- Promotor in Oligodendrozyten etc.. Die genetisch veränderten Tiere können danach in unterschiedlichen Krankheitsmodellen untersucht werden (z. B. experimentell herbeigeführtem Schlaganfall, MCAO). Die Herstellung von "knock-out" Tieren kann zudem Hinweise auf die Auswirkungen von Inhibitoren auf den Gesamtorganismen liefern, da ein "knock out Modell" insoweit der Inhibition erfindungsgemäßer nativer Sequenzen entspricht. Die genetisch veränderten Tiere können danach in unterschiedlichen Krankheitsmodellen untersucht werden (z. B. experimentell herbeigeführtem Schlaganfall, MCAO).

Sämtliche multizellulären Organismen können erfindungsgemäß transgen ausgestaltet sein, insbesondere Säugetiere, bspw. Mäuse, Ratten, Schafe, Rinder oder Schweine. Auch transgene Pflanzen sind im Prinzip denkbar. Bei den transgenen Organismen kann es sich auch um sogenannte "Knock-Out"-Tiere handeln. Dabei können die transgenen Tiere eine funktionelle oder nicht funktionelle erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt allein oder in Kombination mit einer funktionellen oder nicht funktionellen Sequenz, die für 24B2-Proteine kodiert, enthalten.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung der oben beschriebenen transgenen Tiere sind transgene Tiere, in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen oder in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen die native(n) 24B2-Nukleotidsequenz(en), die definitionsgemäß beim Menschen bzw. bei der Maus mindestens 90%ige Sequenzidentität mit den in den Fig. 2 bzw. 4 angegebenen Sequenzen haben, durch gentechnische Verfahren verändert oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbrochen wurden. Eine weitere Möglichkeit des Einsatzes einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz oder Teilen davon ist die Erzeugung transgener oder knock-out- oder konditioneller oder regionenspezifischer knock-out Tiere oder spezifischer Mutationen bei gentechnisch veränderten Tieren (Ausübel et al. (eds.) 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York und Torres et al., (eds.) 1997, Laboratory protocols for conditional gene targeting, Oxford University Press, Oxford).

Über transgene Überexpression oder genetische Mutation (Nullmutation oder spezifische Deletionen, Insertionen oder Veränderungen) durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen kann man Tiermodelle erzeugen, die wertvolle weitere Informationen über die (Patho-)Physiologie der erfindungsgemäßen Sequenzen liefern. Solchermaßen hergestellte Tiermodelle können essentielle Testsysteme zur Evaluierung neuartiger Therapeutika darstellen, die die biologische Funktion von Proteinen gemäß Fig. 2 oder 4 für neurale, vaskuläre oder andere Prozesse beeinflussen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der ein Epitop auf einem erfindungsgemäßen Genprodukt, insbesondere einem erfindungsgemäßen Protein gemäß Fig. 2 oder 4 oder Derivaten, Fragmenten oder Isoformen oder Allelen, erkennt (Anspruch 12), aber auch gegen z. B. erfindungsgemäße mRNA gerichtet sein kann. Der Begriff "Antikörper" umfaßt i. S. der vorliegenden Erfindung sowohl polyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper (Anspruch 13), chimärische Antikörper, anti- idiotypische Antikörper (gerichtet gegen erfindungsgemäße Antikörper), die alle in gebundener oder löslicher Form vorliegen und ggf. durch "Label" markiert sein können, sowie auch Fragmente der vorgenannten Antikörper. Neben den Fragmenten von erfindungsgemäßen Antikörpern in Alleinstellung können erfindungsgemäße Antikörper auch in rekombinanter Form als Fusionsproteine mit anderen (Protein)-Bestandteilen auftreten. Fragmente als solche oder Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern als Bestandteile von Fusionsproteinen werden typischerweise durch die Methoden enzymatischer Spaltung, der Protein-Synthese oder die dem Fachmann geläufigen Rekombinationsmethoden hergestellt. Als Antikörper werden nach der vorliegenden Erfindung also sowohl polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper bezeichnet.

Bei den polyklonalen Antikörpern handelt es sich um heterogene Mischungen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tieren hergestellt werden, die mit einem Antigen immunisiert worden sind. Zum Gegenstand der Erfindung gehören aber auch polyklonale monospezifische Antikörper, die nach Aufreinigung der Antikörper (bspw. über eine Säule, die mit Peptiden eines spezifischen Epitops beladen sind) erhalten werden. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im wesentlichen homogene Population von Antikörpern, die spezifisch gegen Antigene gerichtet sind, wobei die Antikörper im wesentlichen gleiche Epitop-Bindungsstellen aufweisen. Monoklonale Antikörper können durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten werden (z. B. Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-397, (1975); US-Patent 4,376,110; Ausübel et al., Harlow und Lane "Antikörper": Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory (1988); Ausübel et al., (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).). Die in den vorgenannten Literaturstellen enthaltene Beschreibung wird als Bestandteil der vorliegenden Erfindung in die Offenbarung der vorliegenden Erfindung einbezogen.

Auch lassen sich gentechnisch manipulierte erfindungsgemäße Antikörper nach Verfahren, wie in den vorgenannten Druckschriften beschrieben herstellen. Kurz gesagt, werden dazu Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die synthetisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation beispielsweise durch "site directed mutagenesis", Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geeignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren insertiert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae. Spezifische Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Proteine können sich sowohl als diagnostische Reagenzien als auch als Therapeutika bei Erkrankungen eignen, bei denen 24B2 von pathophysiologischer Bedeutung ist, bspw. beim Schlaganfall oder Herzinfarkt.

Erfindungsgemäße Antikörper können einer der folgenden Immunglobulinklassen angehören: IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und ggf. einer Unterklasse der vorgenannten Klassen, wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 oder IgGM. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG1/k oder IgG2b/k. Ein Hybridom-Zellklon, der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung von großen Titern an monoklonalen Antikörpern erfolgt vorzugsweise in vivo oder in situ.

Bei den erfindungsgemäßen chimärische Antikörpern handelt es sich um Moleküle, die verschiedene Bestandteile enthalten, wobei diese sich aus verschiedenen Tierarten ableiten (z. B. Antikörper, die eine variable Region, die aus einem Mäusemonoklonalen Antikörper abgeleitet ist, und eine konstante Region eines humanen Immunglobulins aufweisen). Chimärische Antikörper werden vorzugsweise eingesetzt, um einerseits die Immunogenizität bei der Anwendung zu reduzieren und andererseits die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, z. B. ergeben murine monoklonale Antikörper höhere Ausbeuten aus Hybridom-Zellinien, führen aber auch zu einer höheren Immunogenizität beim Menschen, so daß human/murine chimärische Antikörper vorzugsweise eingesetzt werden. Chimärische Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus dem Stand der Technik bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al. Nature 312 643-646 (1984); Cabilly et al., EP-A-125023; Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., EP-A-171496; Morrion et al., EP-A-173494; Neuberger et al., WO 86/01533; Kudo et al., EP-A-184187; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., WO 87/02671; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) und Harlow und Lane, Antikörper: A Laboratory Manual, wie oben zitiert. Diese Zitatstellen werden als zur Offenbarung gehörig in die vorliegende Erfindung einbezogen.

Ganz besonders bevorzugt wird ein solcher erfindungsgemäßer Antikörper gegen einen Cystein-reichen Sequenzabschnitt auf einem erfindungsgemäßen Protein, bspw. einem Protein gemäß Fig. 2 oder 4, als Epitop gerichtet sein oder auch auf die SH3-Domäne von 24B2 (Anspruch 14).

Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper ist ein Antikörper, der eine Determinante, die im allgemeinen mit der Antigenbindungsstelle eines erfindungsgemäßen Antikörpers assoziiert ist, erkennt. Ein anti-idiotypischer Antikörper kann durch die Immunisierung eines Tieres der gleichen Art und des gleichen genetischen Typs (z. B. eines Mäusestamms) als Ausgangspunkt für einen monoklonalen Antikörper, gegen welchen ein erfindungsgemäßer anti- idiotypischer Antikörper gerichtet ist, hergestellt werden. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers durch die Produktion eines Antikörpers, der gegen die idiotypischen Determinanten gerichtet ist (nämlich ein erfindungsgemäßer anti- idiotypischer Antikörper), erkennen (U.S. 4,699,880). Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper kann auch als Immunogen eingesetzt werden, um eine Immunantwort in einem weiteren Tier hervorzurufen und um dort zur Produktion eines sog. anti-anti-idiotypischen Antikörpers zu führen. Der anti-anti-idiotypische Antikörper kann, muß aber nicht, bezüglich seiner Epitop-Konstruktion identisch mit dem originären monoklonalen Antikörper sein, der die anti- idiotypische Reaktion hervorgerufen hat. Auf diese Weise können durch die Verwendung von gegen idiotypische Determinanten eines monoklonalen Antikörpers gerichtete Antikörper andere Klone, die Antikörper von identischer Spezifität exprimieren, identifiziert werden.

Monoklonale Antikörper, die gegen erfindungsgemäße Proteine, Analoge, Fragmente oder Derivate dieser erfindungsgemäßen Proteine gerichtet sind, können eingesetzt werden, um die Bindung von anti-idiotypischen Antikörpern in entsprechenden Tieren, wie z. B. der BALB/c Maus, zu induzieren. Zellen aus der Milz einer solchen immunisierten Maus können verwendet werden, um anti-idiotypische Hybridom-Zellinien, die anti- idiotypische monoklonale Antikörper sekretieren, zu produzieren. Weiterhin können anti-idiotypische monoklonale Antikörper auch an einen Träger gekoppelt werden (KLH, "keyhole limpet hemocyanin") und dann verwendet werden, um weitere BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Die Sera dieser Mäuse enthalten dann anti-anti-idiotypische Antikörper, die die Bindungseigenschaften der originären monoklonalen Antikörper haben und spezifisch für ein Epitop des erfindungsgemäßen Proteins oder eines Fragments oder Derivats von demselben sind. Die anti-idiotypischen monoklonalen Antikörper haben auf diese Weise ihre eigenen idiotypischen Epitope oder "Idiotope", die strukturell mit dem zu untersuchenden Epitop ähnlich sind.

Die Bezeichnung "Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente derselben einschließen. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei dem Antigen-komplementären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂- Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Fab und F(ab')₂-Fragmente entbehren eines Fc- Fragments, wie etwa in einem intakten Antikörper vorhanden, so daß sie im Blutkreislauf schneller transportiert werden können und vergleichsweise weniger nicht-spezifische Gewebsbindung als intakte Antikörper aufweisen. Hierbei wird hervorgehoben, daß Fab und F(ab')₂ Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern bei der Detektion und Quantifizierung von erfindungsgemäßen Proteinen eingesetzt werden können. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung hergestellt, indem Enzyme, wie z. B. Papain (zur Herstellung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab')₂, Fragmenten) verwendet werden, oder durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Mischungen von Antikörpern im Sinne der vorliegenden Erfindung. Neben den Antikörpern können auch Mischungen von Antikörpern für alle gemäß der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren oder Verwendungen eingesetzt werden. Sowohl gereinigte Fraktionen monoklonaler Antikörper, polyklonale Antikörper oder Mischungen monoklonaler Antikörper kommen als Arzneimittel zum Einsatz und finden Verwendung bei der Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von cerebralen Ischämien (z. B. Schlaganfall), degenerativen Erkrankungen, insbesondere auch neurodegenerativen Erkrankungen, und neurologischen Erkrankungen, wie z. B. Epilepsie.

Erfindungsgemäße Antikörper, einschließlich der Fragmente von diesen Antikörpern, bzw. deren Mischungen können zur quantitativen oder qualitativen Detektion von erfindungsgemäßem Genprodukt, insbesondere Proteinen gemäß Fig. 2 oder 4 oder deren Fragmente oder Derivate, in einer Probe eingesetzt werden oder auch zur Detektion von Zellen, die erfindungsgemäße Proteine exprimieren und ggf. sekretieren. Insoweit wird die Verwendung erfindungsgemäßer Antikörper als Diagnostika offenbart. So kann etwa über erfindungsgemäße Antikörper die Menge an erfindungsgemäßem Genprodukt und u. U. deren Aktivität (z. B. spezifische Phosphorylierungen, Bindungsverhalten) der erfindungsgemäßen Proteine, insbesondere von Proteinen gemäß Fig. 2 oder 4, bestimmt werden. Die Detektion kann mit Hilfe von Immunofluoreszenz-Verfahren erreicht werden, die Fluoreszenz-markierte Antikörper in Kombination mit Lichtmikroskopie, Flußzytometrie oder fluorometrischer Detektion durchgeführt werden.

Erfindungsgemäße Antikörper im Sinne der Erfindung (dies schließt Fragmente dieser Antikörper ein oder auch Mischungen von Antikörpern) eignen sich für histologische Untersuchungen, wie z. B. im Rahmen der Immunofluoreszenz oder Immunoelektromikroskopie, für die in situ Detektion eines erfindungsgemäßen Proteins. Die in situ Detektion kann dadurch erfolgen, daß eine histologische Probe von einem Patienten genommen wird und markierte erfindungsgemäße Antikörper zu einer solchen Probe hinzugegeben werden. Der Antikörper (oder ein Fragment dieses Antikörpers) wird in markierter Form auf die biologische Probe aufgetragen. Auf diese Weise ist es nicht nur möglich, die Anwesenheit von erfindungsgemäßem Protein in der Probe zu bestimmen, sondern auch die Verteilung des erfindungsgemäßen Proteins in dem untersuchten Gewebe. Bei der biologischen Probe kann es sich um eine biologische Flüssigkeit, ein Gewebeextrakt, geerntete Zellen, wie z. B. Immunzellen oder Herzmuskel- oder Leberzellen, oder allgemein um Zellen, die in einer Gewebekultur inkubiert worden sind, handeln. Die Detektion des markierten Antikörpers kann je nach Art der Markierung durch im Stand der Technik bekannte Verfahren (z. B. durch Fluoreszenzverfahren) erfolgen. Die biologische Probe kann aber auch auf einem Festphasenträger, wie z. B. Nitrocellulose oder ein anderes Trägermaterial, aufgetragen werden, so daß die Zellen, Zellteile oder löslichen Proteine immobilisiert werden. Der Träger kann dann mit einem geeigneten Puffer ein- oder mehrfach gewaschen werden, wobei nachfolgend mit einem detektierbar markierten Antikörper nach der vorliegenden Erfindung behandelt wird. Der Festphasenträger kann dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um nicht-gebundenen Antikörper zu beseitigen. Die Menge an gebundener Markierung auf dem Festphasenträger kann dann mit einem herkömmlichen Verfahren bestimmt werden.

Als Träger eignen sich insbesondere Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon-Amylasen, natürliche oder modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide und Magnetit. Der Träger kann entweder bedingt löslichen oder unlöslichen Charakters sein, um die Bedingungen nach Maßgabe der vorliegenden Erfindung zu erfüllen. Das Trägermaterial kann beliebige Formen einnehmen, z. B. in Form von Kügelchen ("beads"), oder zylindrisch oder sphärisch sein, wobei Polystyrol-Kügelchen als Träger bevorzugt sind.

Eine detektierbare Antikörpermarkierung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise kann der Antikörper an ein Enzym gebunden werden, wobei das Enzym schließlich in einem Immunoassay (EIA) eingesetzt werden kann. Das Enzym kann dann später mit einem entsprechenden Substrat reagieren, so daß eine chemische Verbindung entsteht, die auf eine dem Fachmann geläufige Art und Weise detektiert und ggf. quantifiziert werden kann, z. B. durch Spektrophotometrie, Fluorometrie oder andere optische Verfahren. Bei dem Enzym kann es sich um Malat- Dehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, delta-5-Steroid Isomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, alpha- Glycerophosphat-dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Aspariginase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat- Dehydrogenase, Glucoamylase oder Acetylcholinesterase handeln. Die Detektion wird dann über ein chromogenes Substrat, das spezifisch für das für die Markierung eingesetzte Enzym ist, ermöglicht und kann schließlich z. B. über Sichtvergleich des durch die Enzymreaktion umgesetzten Substrats im Vergleich zu Kontrollstandards erfolgen.

Weiterhin kann die Detektion durch andere Immunoassays sichergestellt werden, z. B. durch radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente (also durch einen Radioimmunoassay (RIA; Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T. et al. North Holland Publishing Company, New York (1978). Das radioaktive Isotop kann dabei durch die Verwendung von Szintillationszählern oder durch Autoradigraphie detektiert und quantifiziert werden.

Fluoreszierende Verbindungen können gleichfalls zur Markierung eingesetzt werden, beispielsweise Verbindungen wie Fluorescinisothiocyanat, Rhodamin, Phyoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin. Auch fluoreszensemittierende Metalle, wie z. B. ¹⁵²E oder andere Metalle aus der Lanthanid-Gruppe, können eingesetzt werden. Diese Metalle werden an den Antikörper über Chelatgruppen, wie z. B. Diethylentriaminpentaessigsäure (ETPA) oder EDTA angekoppelt. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Antikörper über eine mit Hilfe von Chemilumineszenz wirkende Verbindung angekoppelt werden. Die Gegenwart des Chemilumineszenz- markierten Antikörpers wird dann über die Lumineszenz, die im Verlauf einer chemischen Reaktion entsteht, detektiert. Beispiele für derartige Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz oder Oxalatester. Gleichermaßen können auch biolumineszente Verbindungen zum Einsatz kommen. Biolumineszenz ist eine Unterart der Chemilumineszenz, die bei biologischen Systemen vorgefunden wird, wobei ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszenten Reaktion verstärkt. Die Detektion des biolumineszenten Proteins erfolgt wiederum über die Lumineszenz, wobei als biolumineszente Verbindung beispielsweise Luciferin, Luciferase oder Aequorin in Betracht kommen.

Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann für die Verwendung in einem immunometrischen Assay, auch bekannt als "two-site" oder "sandwich" Assay, zur Anwendung gelangen. Typische immunometrische Assay-Systeme schließen sog. "Vorwärts"- Assays ein, die sich dadurch auszeichnen, daß erfindungsgemäße Antikörper an ein Festphasensystem gebunden sind und daß der Antikörper mit der Probe, die untersucht wird, auf diese Weise in Kontakt gebracht wird. Derart wird das Antigen aus der Probe durch die Bildung eines binären Festphasen-Antikörper-Antigen-Komplexes aus der Frobe isoliert. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, um den verbleibenden Rest der flüssigen Probe zu beseitigen, einschließlich des ggf. nicht gebundenen Antigens, und daraufhin mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die eine unbekannte Menge an markiertem Detektionsantikörper enthält. Der markierte Antikörper dient hierbei als sog. Reporter-Molekül. Nach einer zweiten Inkubationszeit, die es den markierten Antikörper erlaubt, mit dem an die Festphase gebundenen Antigen zu assoziieren, wird der Festphasenträger erneut gewaschen, um markierte Antikörper, die nicht reagiert haben, zu beseitigen.

In einer alternativen Assay-Form kann auch ein sog. "sandwich"-Assay zum Einsatz kommen. Hierbei kann ein einziger Inkubationsschritt ausreichen, wenn der an die Festphase gebundene Antikörper und der markierte Antikörper beide gleichzeitig auf die zu testende Probe aufgebracht werden. Nach Abschluß der Inkubation wird der Festphasenträger gewaschen, um Rückstände der flüssigen Probe und der nicht-assoziierten markierten Antikörper zu beseitigen. Die Anwesenheit von markiertem Antikörper auf dem Festphasenträger wird genau so bestimmt, wie bei den konventionellen "Vorwärts"-Sandwich-Assay. Bei dem sog. reversen Assay wird schrittweise zunächst eine Lösung des markierten Antikörpers zur Flüssigprobe hinzugefügt, gefolgt von der Beimischung von nicht-markiertem Antikörper, gebunden an einen Festphasenträger, nach Ablauf einer geeigneten Inkubationszeit. Nach einem zweiten Inkubationsschritt wird der Festphasenträger in herkömmlicher Weise gewaschen, um ihn von Probenüberresten und von markiertem Antikörper, der nicht reagiert hat, zu befreien. Die Bestimmung des markierten Antikörpers, der mit dem Festphasenträger reagiert hat, wird dann, so wie oben beschrieben, durchgeführt.

Nach der vorliegenden Erfindung werden weiterhin Verfahren zur Expression von erfindungsgemäßen Genprodukten, insbesondere also von Polypeptiden gemäß Fig. 2 oder 4, einschließlich aller Derivate, Analoge und Fragmente, offenbart, wobei hierfür Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert werden (Anspruch 15). Dieses Verfahren zur Expression von Genprodukten, die auf einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz beruhen, dient nicht dazu, das entsprechende Genprodukt zu konzentrieren und aufzureinigen, sondern vielmehr dazu, den Zellstoffwechsel durch das Einführen der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen über die Expression des dazugehörigen Genprodukts zu beeinflussen. Hier ist insbesondere an die Verwendung der mit Hilfe von Expressionsvektoren transformierten Wirtszellen als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zum Zwecke der Behandlung von Erkrankungen, bspw. von Tumorerkrankungen, neurologischen Erkrankungen, neurodegenerativen Erkrankungen (bspw. Multipler Sklerose, Morbus Parkinson) oder cerebralen Ischämien (z. B. Schlaganfall). Allgemein werden erfindungsgemäße Wirtszellen bei Erkrankungen zur Verfügung gestellt, denen eine Fehlregulation der Signaltransduktion, insbesondere auch der Apoptose, der Nekrose, des Zellwachstums oder der Zellplastizität, zugrunde liegt. Die derart erfindungsgemäß ex vivo transformierten autologen oder allogenen Wirtszellen können dann Patienten transplantiert werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung von Genprodukten mit mindestens einer mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz von einem 24B2-Protein gemäß Fig. 2 oder 4 zumindest über eine Teilsequenz von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30 AS homologen Teilsequenz, wobei die Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert und dann unter geeigneten, die Expression fördernden Bedingungen kultiviert werden, so daß das Genprodukt schließlich aus der Kultur aufgereinigt werden kann (Anspruch 16). Das erfindungsgemäße Genprodukt der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz kann dabei, abhängig von dem Expressionssystem, aus einem Kulturmedium oder aus Zellextrakten isoliert werden. Der Fachmann kann ohne weiteres erkennen, daß die jeweiligen Isolierungsmethoden und das Verfahren bei der Aufreinigung des von einer erfindungsgemäßen DNA kodierten, rekombinanten Proteins stark vom Typ der Wirtszelle oder auch von dem Umstand, ob das Protein in das Medium sekretiert wird, abhängt. Zum Beispiel können Expressionssysteme eingesetzt werden, die zur Sekretion des rekombinanten Proteins aus der Wirtszelle führen. Das Kulturmedium muß in diesem Fall durch kommerziell erhältliche Proteinkonzentrationsfilter, z. B. Amicon oder Millipore Pelicon, aufkonzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann ein Reinigungsschritt erfolgen, z. B. ein Gelfiltrationsschritt oder eine Reinigung mit Hilfe von säulenchromatographische Methoden. Alternativ kann aber auch ein Anionenaustauscher eingesetzt werden, der eine Matrix mit DEAE aufweist. Ggf. können derartige Sequenzen zur Erleichterung der Isolierung mit einem Sekretionssignal ausgestattet sein, um eine Sekretion in den extrazellulären Raum zu ermöglichen.

Als Matrix dienen dabei alle aus der Proteinreinigung bekannten Materialien, z. B. Acrylamid oder Agarose oder Dextran oder ähnliches. Es kann aber auch ein Kationenaustauscher eingesetzt werden, der dann typischerweise Carboxymethyl-Gruppen enthält. Zur weiteren Reinigung eines durch eine erfindungsgemäße DNA codierten Polypeptids können dann HPLC-Schritte dienen. Es kann sich um einen oder mehrere Schritte handeln. Insbesondere wird die "Reversed-Phase"-Methode eingesetzt. Diese Schritte dienen zum Erhalt eines im wesentlichen homogenen rekombinanten Proteins einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz.

Neben bakteriellen Zellkulturen zur Isolierung des Genprodukts können auch transformierte Hefezellen eingesetzt werden. In diesem Fall kann das translatierte Protein sekretiert werden, so daß die Proteinreinigung vereinfacht wird. Sekretiertes rekombinantes Protein aus einer Hefewirtszelle kann durch Methoden erhalten werden, wie sie bei Urdal et al. (J. Chromato. 296: 171 (1994)) offenbart sind und Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung sind.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen, insbesondere erfindungsgemäße DNA-Sequenzen, und/oder erfindungsgemäße Genprodukte können als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels Verwendung finden (Anspruch 17). Diese können als solche verabreicht werden (bspw. bukkal, intravenös, oral, parenteral, nasal, subkutan, intraarteriell) oder in Kombination mit weiteren Wirk-, Hilfs- oder arzneimitteltypischen Zusatzstoffen, typischerweise geeigneten Trägermaterialien. Erfindungsgemäße Nukleinsäure kann als nackte Nukleinsäure, insbesondere intravenös oder intraarteriell, injiziert werden oder aber mit Hilfe von Vektoren dem Patienten verabreicht werden. Bei diesen Vektoren kann es sich um Plasmide als solche handeln, aber auch um virale Vektoren, insbesondere retrovirale oder adenovirale Vektoren, oder auch um Liposomen, die nackte erfindungsgemäße DNA oder ein Plasmid, das erfindungsgemäße DNA enthält, aufweisen können.

Die Verwendung von erfindungsgemäßen Sequenzen, insbesondere der Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen von 24B2 bzw. deren Varianten, sowie erfindungsgemäßer Proteinheteromere sowie davon abgeleiteter erfindungsgemäßer Reagenzien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) kommt somit für die Herstellung eines Arzneimittels zu therapeutischen Zwecken, d. h. zur Behandlung von Erkrankungen, in Betracht. Ganz besonders bevorzugt ist dabei der therapeutische Einsatz zur Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen oder pathophysiologischen Zuständen, die auf fehlgesteuerter Regulation der Signaltransduktion, insbesondere auch einer Fehlsteuerung der Homöostase von Zelltod- und Proliferationsereignissen beruhen, also insbesondere auch von Tumorerkrankungen (solide Tumore oder Tumore des blutbildenden Systems, bspw. Lymphome oder Leukämien, insbesondere auch bei jenen soliden Tumoren, bei denen gemäß Legende zu Fig. 8 eine erhöhte Gewebeexpression zu beobachten ist (Anspruch 18). Durch die erfindungsgemäße Verwendung können Zelltodprozesse, z. B. Kaskaden, die zur Apoptose führen, oder Prozesse, die zur Nekrose führen, in allen Zelltypen, die 24B2 oder eine native Variante hiervon exprimieren, insbesondere in neuralen Zellen, beeinflußt werden, bspw. durch Modulation von Zell-Zell-Interaktionen. Ganz besonders kommen all jene Zellen in Betracht, die nach Maßgabe der vorliegenden Offenbarung eine 24B2-Gewebeexpression zeigen.

Die nativen erfindungsgemäßen 24B2-Proteine sind erfindungsgemäß Bestandteil von intrazellulären Signaltransduktionswegen, typischerweise als Modulator desselben, dessen Fehlsteuerung für eine Vielzahl von Erkrankungen ursächlich ist. Insofern finden sich die vorgenannten erfindungsgemäßen Proteine insbesondere als Komponenten bei den folgenden zellulären Prozessen wieder und hat zelluläre Funktionen bei: Signaltransduktion im allgemeinen, Zelldifferenzierung, Wachstum, Plastizität, Regeneration, Proliferation, Zelltod. Entsprechend kann durch Infunktionalität eines erfindungsgemäßen Proteins, bspw. 24B2, oder durch infunktionelle Expression oder durch Überexpression desselben ein pathophysiologischer Zustand ausgelöst werden, der mit einer Fehlsteuerung bspw. der Zelldifferenzierung, des Zellwachstums, der Zellplastizität oder der Zellregeneration einhergeht. Je nach molekularem Mechanismus der pathophysiologischen Störung kann zu therapeutischen Zwecken die Gabe funktionellen erfindungsgemäßen Proteins oder zumindest eine höhere Expression desselben oder aber eine Inhibition des zellulär überexprimierten oder des exprimierten infunktionellen Proteins erwünscht sein. Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von erfindungsgemäßem Protein im Zusammenhang mit dessen Funktion beim neuronalen Zelltod, Excitation und Neurogenese. Aus diesen erfindungsgemäßen Erkenntnissen ergibt sich die Verwendung erfindungsgemäßer Sequenzen (Nukleotid- und Aminosäuresequenzen) sowie entsprechender Derivate (bspw. Peptide, Oligos oder Antikörper) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorerkrankungen und neurologischen Erkrankungen, insbesondere ischämische Zustände (Schlaganfall), multipler Sklerose, neurodegenerative Erkrankungen, wie bspw. Morbus Parkinson, Amyotrophe Lateralsklerose, heredodegenerative Ataxien, Neuropathien, Morbus Huntington, Epilepsien und Morbus Alzheimer (Anspruch 19).

Im Zusammenhang mit der therapeutischen Anwendung erfindungsgemäßer Sequenzen steht ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, nämlich die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder Proteinsequenz, insbesondere der Nukleotidsequenz oder Aminosäuresequenz von Protein 24B2 oder einer Variante - wie oben definiert - hiervon, insbesondere eines Fragments, zur Gentherapie bei Säugetieren, z. B. beim Menschen bzw. auch derartige gentherapeutische Verfahren. Gentherapie umfaßt dabei alle Therapieformen, die entweder erfindungsgemäße Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in den Körper oder Teile davon, bspw. einzelne Gewebe, einbringen, oder die Expression von erfindungsgemäßer Sequenzen beeinflussen. Dazu können alle dem Fachmann geläufigen Modifikationen im Rahmen der Gentherapie verwendet werden, bspw. Oligonukleotide, z. B. antisense- oder Hybrid-RNA-DNA-Oligonukleotide, mit beliebigen Modifikationen, die erfindungsgemäße Sequenzen enthalten, benutzt werden. Ebenfalls können virale Konstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Sequenzen (dies schließt alle Varianten, wie Fragmente, Isoformen, Allele, Derivate ein) benutzt werden. Auch entsprechende erfindungsgemäße nackte DNA-Sequenzen, kommen im Rahmen der Gentherapie in betracht. Ebenso können Nukleinsäurestücke mit enzymatischer Aktivität (z. B. Ribozyme) für gentherapeutische Zwecke benutzt werden.

Neben den therapeutischen Anwendungen kommen auch diagnostische Verwendungen erfindungsgemäßer Nukleinsäuren oder Polypeptide, erfindungsgemäßer Proteinheteromere sowie davon abgeleiteter erfindungsgemäßer Reagenzien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) in Betracht, bspw. zur Diagnose von menschlichen Erkrankungen oder von genetischen Prädispositionen, bspw. auch im Rahmen von Schwangerschaftsuntersuchungen; insgesamt wird daher die Verwendung der vorgenannten Erfindungsgegenstände als in vitro Probenreagens offenbart. Bei den Bezug genommenen Erkrankungen oder Prädispositionen handelt es sich insbesondere um die oben im Zusammenhang mit therapeutischen Anwendungen genannten. Diese diagnostischen Verfahren können als in vivo, typischerweise jedoch ex vivo Verfahren ausgestaltet sein. Ex vivo wir eine typische Anwendung eines diagnostischen erfindungsgemäßen Verfahrens zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einer biologischen Probe dienen. Ein solches Verfahren umfaßt vorzugsweise die folgenden Schritte: (a) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an erfindungsgemäßer Nukleinsäure oder einer bekannten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure geeignet sind, (b) Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durch spezifische Hybridisierung oder PCR-Amplifikation, (c) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure oder an durch PCR Amplifikation gewonnener Nukleinsäure mit einem Mengenstandard.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis eines erfindungsgemäßen Proteinheteromers oder eines erfindungsgemäßen Proteins in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfaßt: (a) Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der spezifisch gegen das Proteinheteromer oder gegen das erfindungsgemäße Protein/Polypeptid gerichtet ist, (b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes, (c) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit einem Mengenstandard. Als Standard wird üblicherweise eine biologische Probe aus einem gesunden Organismus entnommen. Insbesondere zu diagnostischen Zwecken kann hierbei die Eigenschaft des 24B2-Gens benutzt werden, daß nach charakteristischen pathophysiologischen Stimuli die mRNA-Menge von 24B2 in Zellen sich verändert, z. B. sich erhöht. Auf diese Art kann erfindungsgemäß z. B. eine Verlaufsbeurteilung (Prognose) von mit Veränderungen von Expressionsraten erfindungsgemäßer Proteine einhergehender Krankheiten (wie z. B. des Schlaganfalls), die Beurteilung von Therapieerfolgen, die Graduierung einer Krankheit vorgenommen werden. Schließlich kann mit erfindungsgemäßen Verfahren ein Monitoring der Behandlung oben angegebener Erkrankungen durchgeführt werden.

Erfindungsgemäße Sequenzen können in Verfahren zur Bestimmung von Polymorphismen derselben z. B. bei Menschen verwendet werden. Auf diese ermittelte Polymorphismen erfindungsgemäßer Sequenzen unterfallen nicht nur der Offenbarung der vorliegenden Erfindung, sondern können auch prognostische Marker für die Diagnose bzw. für die Diagnose einer Prädisposition von Erkrankungen, die im Zusammenhang mit einer durch infunktionale Expression erfindungsgemäßer Sequenzen, durch Expression infunktionaler erfindungsgemäßer Sequenzen und/oder oder deren Überexpression dienen. Darüber hinaus ist erlauben erfindungsgemäße Sequenzen die Erforschung humaner Erbkrankheiten, und zwar sowohl monogener als auch polygener Erkrankungen.

Neben therapeutischen und/oder diagnostischen Verwendungszwecken im Bereich der Human- und/oder Tiermedizin kommt auch die Verwendung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren oder Polypeptide zum wissenschaftlichen Einsatz in Betracht. Insbesondere erlauben die erfindungsgemäßen Sequenzen auf dem Fachmann bekannte Weise, bspw. über cDNA-Bibliotheken verwandte Sequenzen bei ein- oder mehrzelligen Organismen zu identifizieren oder aber im humanen Genom verwandte Sequenzen zu lokalisieren. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, insbesondere die Sequenzen von 24B2, können also dazu verwendet werden, Gene für mRNAs, die für diese Nukleinsäuren oder deren funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate kodieren, im bspw. murinen oder anderen Tiergenomen und im menschlichen Genom mit gängigen Methoden durch Homologiescreening zu isolieren, zu kartieren, insbesondere den Chromosomenlocus zu bestimmen, und mit Markern für humane Erbkrankheiten zu korrelieren. Dies ermöglicht die Identifizierung des Gens als Ursache für bestimmte Erbkrankheiten, was ihre Diagnose erheblich vereinfacht und neue Therapieansätze ermöglicht.

Mit Hilfe erfindungsgemäßer Nukleinsäuren lassen sich damit Erbkrankheiten diagnostizieren, weswegen sie als Marker Verwendung finden, wobei hieraus ein erfindungsgemäßes Diagnoseverfahren für erbliche Erkrankungen erwächst.

Insbesondere wird erfindungsgemäß für die wissenschaftliche Anwendung ein Testsystem offenbart, das auf erfindungsgemäßen Aminosäure- und/oder Nukleotid-Sequenzen beruht. In diesem Zusammenhang können die cDNA, die genomische DNA, die regulatorischen Elemente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, als auch das Polypeptid, sowie Teilfragmente davon in rekombinanter oder nicht-rekombinanter Form zur Ausarbeitung eines Testsystems verwendet werden. Ein solches erfindungsgemäßes Testsystem ist insbesondere geeignet, die Aktivität des Promotors oder des Proteins in Anwesenheit der Testsubstanz zu messen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einfache Meßmethoden (kolorimetrische, luminometrische, auf Fluoreszenz beruhende oder radioaktive), die die schnelle Messung einer Vielzahl von Testsubstanzen erlauben (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg). Die beschriebenen Testsysteme erlauben das Durchsuchen von chemischen Bibliotheken nach Substanzen, die hemmende oder aktivierende Wirkungen auf erfindungsgemäße Proteine haben. Die Identifizierung solcher Substanzen stellt den ersten Schritt auf dem Weg zur Identifizierung neuartiger Medikamente dar, die spezifisch auf die bspw. 24B2- assoziierte Signaltransduktion wirken.

Eine Inhibition der biologischen Aktivität von erfindungsgemäßem Protein, insbesondere von Proteinen gemäß Fig. 2 oder 4, typischerweise der biologischen Aktivität im Zusammenhang mit der Apoptose, Proliferation, Regeneration, Zellwachstum, wie sie bspw. beim Schlaganfall, dem septischen Schock, GvHD, degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen oder anderen vorliegend offenbarten Indikationen erwünscht ist, kann auch dadurch erreicht werden, daß durch dem Fachmann geläufige Verfahren Oligonukleotide, die für einen Antisense-Strang der nativen Sequenzen, die für erfindungsgemäße Proteine, die zur Familie der 24B2-Protein gehören, codieren, in die betroffenen Zellen einzuschleusen. Hierdurch wird die in den entsprechend transformierten Zellen die Translation der nativen mRNA von bspw. 24B2 gemäß Fig. 2 blockiert, was im Ergebnis vorzugsweise die Überlebensfähigkeit der transfizierten Zelle steigert oder modulierend auf Zellwachstum, Zellplastizität, Zellproliferation wirkt. Auch in diesem Fall kann das oben beschriebene Verfahren mit Hilfe rekombinater Viren eingesetzt werden.

Die ggf. pathologisch gesteigerte Zellapoptose, Zellproliferation bei Erkrankungen, die auf einer entsprechenden Fehlsteuerung erfindungsgemäßer Sequenzen beruhen (bspw. bei den vorgenannten Indikationen), kann auch durch Ribozym-Methoden therapiert werden. Hierzu werden Ribozyme verwendet, die eine Ziel-mRNA schneiden können. Im vorliegenden Fall werden daher Ribozyme offenbart und stellen einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar, die mRNA nativer erfindungsgemäßer Proteine, bspw. 24B2 gemäß Fig. 2, spalten können. Erfindungsgemäße Ribozyme müssen dabei mit der erfindungsgemäßen Ziel-mRNA interagieren können, bspw. über Basenpaarung, und anschließend die mRNA spalten, um die Translation von bspw. 24B2 zu blockieren. Die erfindungsgemäßen Ribozyme werden über geeignete Vektoren in die Zielzellen geschleust (insbesondere Plasmide, modifizierte Tierviren, insbesondere Retroviren), wobei die Vektoren neben ggf. anderen Sequenzen eine cDNA- Sequenz für ein erfindungsgemäßes Ribozym aufweist).

Neben den vorgenannten Möglichkeiten zur Modulation der biologischen Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte, insbesondere der Genprodukte gemäß Fig. 2 oder 4, typischerweise der Modulation der Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte bei der apoptotischen oder nekrotischen, proliferativen oder wachstumsindizierenden Signaltransduktion ist dies auch mit Hilfe eines weiteren Gegenstands der vorliegenden Erfindung möglich. Eine erfindungsgemäße chemische Verbindung wird insbesondere die intrazelluläre Funktion eines erfindungsgemäßen Proteins modulieren, typischerweise inhibieren (Anspruch 20) oder auf der Ebene der zugrundeliegenden erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen die biologische Funktion beeinflussen. Erfindungsgemäße Verbindungen werden spezifisch an ein erfindungsgemäßes Protein, typischerweise mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 2 oder 4, bzw. an eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, typischerweise gemäß Fig. 1 oder 3, binden und dadurch eine pharmakologische, insbesondere neuroprotektive oder immunmodulierende oder antiapoptotische oder anti-proliferative Wirkung, hervorrufen.

Daher werden erfindungsgemäß chemische Verbindungen offenbart, vorzugsweise eine organisch-chemische Verbindung, mit einem Molekulargewicht von < 5000, insbesondere < 3000, vor allem < 1500, die typischerweise physiologisch gut verträglich ist und vorzugsweise die Blut-Hirn-Schranke passieren kann (Anspruch 21), insbesondere auch Peptide oder Peptidomimetika. Ggf. wird sie Bestandteil einer Zusammensetzung mit mindestens einem weiteren Wirkstoff sowie vorzugsweise Hilfs- und/oder Zusatzstoffen sein und als Arzneimittel eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt wird das organische Molekül dann sein, wenn die Bindungskonstante für die Bindung an ein erfindungsgemäßes Protein, insbesondere an die SH3-Domäne eines erfindungsgemäßen Proteins, mindestens 10⁷ mol^-1 beträgt. Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise so beschaffen sein, daß sie die Zellmembran passieren kann, sei es durch Diffusion oder über (intra)membranöse Transportproteine (Anspruch 22), ggf. nach entsprechender Modifikation, bspw. mit einer angekoppelten AS-Sequenz. Weiterhin bevorzugt sind jene Verbindungen, die die Interaktion von Proteinen der 24B2-Familie mit Bindungspartnern, insbesondere für die Transduktion eines apoptotischen oder nekrotischen, proliferativen oder wachstumsindizierenden oder regenerativen Signals, inhibiert oder verstärkt. Insbesondere besetzen derartige Verbindungen Positionen auf der Oberfläche erfindungsgemäßer Proteine oder rufen bei den erfindungsgemäßen Proteinen einen lokalen Konformationswechsel hervor, so daß die Bindung eines nativen Bindungspartners an ein erfindungsgemäßes Protein verhindert wird.

Über Strukturanalysen des erfindungsgemäßen Proteins lassen sich gezielt erfindungsgemäße Verbindungen finden, die eine spezifische Bindungsaffinität aufweisen (Rationales Drug Design (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg)). Hier wird die Struktur oder eine Teilstruktur, Derivat, Allel, Isoform oder ein Teil einer solchen von einem der gemäß Fig. 2 oder 4 dargestellten Proteinen über NMR- oder Röntgenkristallographie-Verfahren ermittelt oder, sofern eine solche hochaufgelöste Struktur nicht vorliegt, mit Hilfe von Strukturvorhersage-Algorithmen ein Strukturmodell eines erfindungsgemäßen Proteins erstellt, und diese(s) benutzt, um mit Unterstützung von "Molecular Modelling" Programmen Verbindungen zu identifizieren, für die sich eine hohe Affinität zum erfindungsgemäßen Protein vorhersagen läßt. Diese Substanzen werden dann synthetisiert und in geeigneten Testverfahren auf ihr Bindungsvermögen und ihre therapeutische Nutzbarkeit getestet. Als Beispiel werden Verbindungen offenbart, die gezielt die Funktion der SH3- Bindungsdomäne von 24B2 blockieren und daher pharmakologisch wirksam sind, also Interaktionsinhibitoren darstellen. Derartige Verbindungen können Peptidcharakter haben oder Peptidanaloga sein (Nguyen, et al., 1998, Science, 282, 2088-92.). Derartige ggf. Prolin-reiche Inhibitoren können optimale in die spezifische Bindungstasche der SH3-Domäne von erfindungsgemäßen 24B2 modelliert werden und folglich auch spezifisch die Interaktion von 24B2 mit seinem (seinen) Interaktionpartner(n) inhibieren. Eine Ersetzung von Prolinen durch Peptoide (z. B. YEVPPPVXPRRR, wobei das X für ein N-(S)-phenylethyl Glycin steht) kann die Affinität der Inhibitoren erhöhen (Nguyen, et al., 1998, Science, 282, 2088-92.)

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die erfindungsgemäße Verbindung ein Antikörper, vorzugsweise ein gegen ein erfindungsgemäßes Protein, bspw. 24B2 gemäß Fig. 2, gerichteter Antikörper oder auch gegen die zugrundeliegenden mRNA gerichteter Antikörper, der ex vivo in retransplantierte Wirtszellen oder durch gentherapeutische in vivo Verfahren in Wirtszellen eingeschleust wird und dort als "intrabody" nicht sekretiert wird, sondern intrazellulär seine Wirkung entfalten kann. Durch derartige erfindungsgemäße "Intrabodies" können die Zellen vor einer fehlgeleiteten apoptotischen Reaktion, bspw. durch Überexpression eines erfindungsgemäßen Proteins, geschützt werden. Eine derartige Vorgehensweise wird typischerweise für Zellen jener Gewebe in Betracht kommen, die beim Patienten ein pathophysiologisch übersteigertes apoptotisches Verhalten zeigen, also bspw. bei Zellen der Bauchspeicheldrüse, Keratinozyten, Bindegewebszellen, Immunzellen, Neuronen oder Muskelzellen. Neben den Antikörper oder Intrabodies sind auch derartig mit erfindungsgemäßen "Intrabodies" gentherapeutisch modifizierte Zellen Bestandteil der vorliegenden Erfindung.

Eine erfindungsgemäße Verbindung mit der Funktion der Blockade der biologischen Funktion von nativem Protein der 24B2-Familie oder entsprechender nativer Allele oder nativer Spleißvarianten, bspw. der apoptotischen Funktion, kann als Arzneimittel Verwendung finden. Hierbei sind als Verbindungen alle vorgenannten Varianten eingeschlossen, also bspw. organisch-chemische Verbindungen, Antikörper, anti-sense Oligonukleotide, Ribozyme. Insbesondere ist eine erfindungsgemäße Verbindung (zur Herstellung eines Arzneimittels) zur Behandlung von Erkrankungen, für die zumindest tw. eine Fehlregulation der Signaltransduktion, bspw. pathologische hyperapoptotische oder hypernekrotische, hyperproliferative oder inflammatorische Reaktion kausal oder symptomatisch ist, geeignet. Damit kann ein erfindungsgemäßer Inhibitor (bspw. ein inhibitorisch wirkender Antikörper (insbesondere ein Intrabody), ein Ribozym, anti-sense RNA, dominant-negative Mutanten oder eine der vorgenannten inhibitorischen organisch-chemischen Verbindungen) der zellulären Funktion eines erfindungsgemäßen nativen Proteins aus der 24B2-Familie oder seiner nativen Varianten, also bspw. der apoptotischen Reaktion, als Arzneimittel und ganz besonders bei der Behandlung der folgenden Erkrankungen bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der folgenden Erkrankungen eingesetzt werden: Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen, insbesondere Diabetes, Psoriasis, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis oder Asthma, virale Infektionserkrankungen (bspw. HIV), degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen, bspw. Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson, Epilepsie oder Muskeldystrophien, GvHD (bspw. Leber, Niere oder Herz), ischämischer Infarkt oder akuter Hepatitis. Die vorgenannten apoptoseinhibitorischen erfindungsgemäßen Substanzen können auch Bestandteil einer pharmazeutischen Zusammensetzung sein, die weitere pharmazeutische Träger-Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthalten kann, um derartige Zusammensetzungen für die therapeutische Verabreichung bspw. zu stabilisieren, die biologische Verfügbarkeit und/oder die Pharmakodynamik zu verbessern.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren ("Screening-Methoden") zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksamen Verbindungen, insbesondere mit inhibitorischen Eigenschaften in Hinblick auf die Auslösung oder Weiterleitung von Signalen, die mit durch physiologisch auftretende, erfindungsgemäße Sequenzen ausgelöste apoptotischen Reaktionen, in Zusammenhang stehen (Anspruch 23). Erfindungsgemäße Verfahren sehen vor, daß (a) Zellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5, insbesondere einem Expressionsvektor, der für ein Polypeptid 24B2 gemäß Fig. 2 oder 4 codiert, und ggf. mindestens einem Expressionsvektor, der für mindestens ein Reporter-Gen codiert, transfiziert werden, und (b) ein zur Beobachtung der 24B2 vermittelten Funktion, bspw. der Apoptose, geeigneter Parameter, insbesondere die Aktivierung der Caspase-3, nach Zugabe einer Testverbindung im Vergleich zur Kontrolle ohne Zugabe einer Testverbindung für das gemäß (a) erhaltene Wirtszellsystem gemessen wird. Hierzu werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise mehrere parallele Versuche mit ansteigenden Konzentrationen der Testsubstanz angesetzt, um im Falle einer pharmazeutischen Wirksamkeit, bspw. die Apoptose inhibierenden Wirkung, der Testsubstanz deren ID₅₀-Wert bestimmen zu können.

Insbesondere werden in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung "Hochdurchsatz-Suchverfahren" ("High- throughput screening assays", HTS) zur Identifikation von Inhibitoren von erfindungsgemäßem 24B2 offenbart. Ganz besonders bevorzugt ist dabei der Einsatz von (allen bekannten) Komponenten des ras-Signaltransduktionswegs im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifikation von Inhibitoren, insbesondere zur Identifikation kleiner organischer Verbindungen an. Vorzugsweise bieten sich Systeme mit dem "Scintillation Proximity Assay" (SPA) an (Fa. Amersham Life Science, MAP kinase SPA (s. McDonald et al., 1999, Anal Biochem, 268, 318-29)). Vorgenannte Druckschrift, die einen Assayaufbau für die Raf/MEK/ERK- Kaskade, die Inhibitoren der ganzen Kaskade identifizieren kann, beschreibt, gehört vollinhaltlich zur Offenbarung der vorliegenden Erfindung. Die MAP-Kaskade wird hierbei in vitro rekonstituiert, mit den einzelnen Bestandteilen als GST-Fusionsproteinen (E. coli exprimiert) oder im Falle von cRAF1 mit dem Baculovirus-System hergestellt (Anspruch 25).

Das erste Element der Kaskade (MAP-KKK) muß hierbei ständig gleichmäßig aktiviert sein, um verläßlich Inhibitoren testen zu können. Typischerweise wird dies wird durch Coexpression von src im Baculovirus-System erreicht. Dadurch wird eine ras-analoge Aktivierung von cRaf sichergestellt. Durch Transfektion von 24B2 wird eine Modulierung der Kaskade hervorgerufen, die herangezogen wird, um in einem HTS durch Zugabe von zu testenden Substanzen eine Beeinflussung dieser Modulation messen zu können.

Zum Auffinden von Substanzen zur Inhibierung von Interaktionen z. B. der SH3-Domäne in 24B2 bieten sich weitere Verfahren an, z. B. die Benutzung von Fluoreszenzpolarisation. Dabei wird 24B2 mit einem Bindungspartner zusammengegeben, der fluoreszent markiert ist. Die Inhibierung der Interaktion durch niedermolekulare chemische Substanzen kann über Messung der Fluoreszenzpolarisation erfolgen. Dieses System wurde bereits erfolgreich zum Auffinden von Inhibitoren für die Interaktion einer BH3-Domäne und Bcl-Xl verwendet (Degterev, et al., 2001, Nat Cell Biol, 3, 173-82.).

Ein weiteres System, das sich für die Identifizierung von Interaktionsinhibitoren von 24B2 anbietet ist das FRET- System (frequence resonance energy transfer). Dabei wird 24B2 mit GFP (green fluorescent protein) und sein Interaktionspartner mit BFP (blue fluorescent protein) in Fusion exprimiert und aufgereinigt wird. In einem zellfreien System kann dann die Abnahme der Emission von BFP als Indikator für die Gegenwart eines Inhibitors benutzt werden beim Absuchen komplexer chemischer Banken.

Nach Identifizierung hochaffiner, selektiver Substanzen nach vorgenanntem erfindungsgemäßen Verfahren werden diese auf ihre Verwendung als Medikamente gegen Epilepsie, Schlaganfall und andere neurologische, immunologische oder proliferative Erkrankungen (Tumorerkrankungen) getestet. Darüber hinaus können die Bindungsplätze der identifizierten und pharmakologisch wirksamen Substanzen an die erfindungsgemäßen Genprodukte, insbesondere 24B2, mit Hilfe des two-hybrid Systems oder anderen Assays ermittelt werden, d. h., daß die für die Interaktion verantwortlichen Aminosäuren eingegrenzt werden (Anspruch 24). Auf diese Weise können auch Substanzen aufgefunden werden, mit denen die Interaktion zwischen erfindungsgemäßen Polypeptiden und etwaigen nativen intrazellulären Interaktionspartnern derselben beeinflußt, insbesondere inhibiert, werden können. Hierdurch wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität zum erfindungsgemäßen Protein offenbart.

Aufgrund der pharmakologischen Bedeutung von 24B2 bzw. deren nativen Varianten für zahlreiche Erkrankungen, bspw. in neurodegenerativen, proliferativen oder hyperapoptotische Erkrankungen, haben gemäß erfindungsgemäßem Verfahren identifizierte pharmazeutisch wirksame Substanzen ein weites Anwendungsspektrum. Neben der Inhibierung einer Interaktion mit einem oder mehreren anderen Molekülen, z. B. im Signaltransduktionsweg "downstream" befindlichen Proteinkinasen, oder Adaptor-Proteinen kann insbesondere auch eine Beeinflussung der Transkription oder der Transkriptmenge von erfindungsgemäßen Proteinen in der Zelle Ursache pharmazeutischer Wirksamkeit sein. Beispielhaft wäre die Suppression der schnellen Hochregulation von Transkripten erfindungsgemäßer DNA-Sequenzen nach pathologischen Prozessen durch erfindungsgemäße Verbindungen zu nennen, da 24B2 einer sehr raschen Regulation durch transkriptionelle Aktivierung unterliegt.

Vorzugsweise ist ein Angriffsziel für eine pharmazeutisch wirksame Verbindung daher die Regulation der Transkription, bspw. durch spezifische Bindung der Substanzen an eine Regulatorregion (bspw. Promotor- oder Enhancer-Sequenzen) eines erfindungsgemäßen Genprodukts, Bindung an einen oder mehrere Transkriptionsfaktoren eines erfindungsgemäßen Genprodukts (mit dem Resultat einer Aktivierung oder Inhibierung des Transkriptionsfaktors) oder eine Regulation der Expression (Transkription oder Translation) eines solchen Transkriptionsfaktors selbst.

Neben der transkriptionellen Regulation, d. h. Regulation der mRNA-Menge eines erfindungsgemäßen Gens in der Zelle, kann eine erfindungsgemäße pharmazeutisch wirksame Verbindung auch in andere Kontrollprozesse der Zelle eingreifen, die bspw. die Expressionsrate eines erfindungsgemäßem Proteins beeinflussen können (z. B. Translation, Spleißvorgänge, native Derivatisierung von erfindungsgemäßem Genprodukt, bspw. Phosphorylierungen, oder Regulation der Degradation von erfindungsgemäßem Genprodukt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von zellulären Interaktionspartnern von erfindungsgemäßen Polypeptiden, insbesondere des Proteins 24B2 gemäß Fig. 2 oder 4 bzw. deren nativ auftretenden Varianten (Isoformen, Allele, Spleißformen, Fragmente) (Anspruch 27). Auf diese Weise können als Interaktionspartner Proteine identifiziert werden, die zum erfindungsgemäßen Protein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen, oder zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren, die zum erfindungsgemäßen Protein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen. Ein derartiges erfindungsgemäßes Verfahren bzw. die Verwendung erfindungsgemäßer Polypeptide, erfindungsgemäßer Nukleinsäuresequenzen und/oder erfindungsgemäßer Nukleinsäurekonstrukte zur Durchführung derartiger Verfahren wird vorzugsweise mit Hilfe einer "Yeast-two-hybrid"-Durchmusterung (y2h-"Screens") allein oder in Kombination mit anderen biochemischen Verfahren durchgeführt (Fields and Song, 1989, Nature, 340, 245-6). Derartige Screens finden sich auch bei Van Aelst et al. (1993, Proc Natl Acad Sci USA, 90, 6213-7) und Vojtek et al. (1993, Cell, 74, 205-14) beschrieben. Typischerweise können anstelle von Hefesystemen auch Säugetiersysteme zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden, bspw. wie bei Luo et al. (1997, Biotechniques, 22, 350-2) beschrieben.

Für einen y2h-Screen wird das offene Leseraster von einem erfindungsgemäßen Protein aus der 24B2-Familie oder einer nativen Variante bspw. in einen sog. bait-Vektor "in-frame" mit der GAL4-Bindungsdomäne kloniert (z. B. pGBT10, Fa. Clontech). Damit kann vorzugsweise eine sog. "prey-library" in einem Hefestamm nach gängigem Protokoll auf interagierende Proteine durchsucht werden. Vorzugsweise werden hierfür Kinase-negative Mutanten eingesetzt, da diese oft stabiler mit etwaigen Phosphorylierungstargets interagieren. Serin-/Threoninkinasen in einem Stoffwechselweg können durch Adaptermoleküle in räumliche Nähe gebracht werden, um spezifische Phosphorylierungen besser durchführen zu können (Chang et al., 1998, Science, 281, 1860-3), (Yasuda et al., 1999, Mol Cell Biol, 19, 7245-54, (Whitmarsh and Davis, 1998, Trends Biochem Sci, 23, 481-5), Whitmarsh et al., 1998, Science, 281, 1671-4). Es ist deshalb erfindungsgemäß auch möglich, über zwei Schritte im yeast-two-hybrid System auf Phosphorylierungstargets zu stoßen, indem zunächst ein Adapterprotein kloniert wird und mit diesem als "bait" das spezifische Zielprotein ("target") ermittelt wird. Darüber hinaus können mit y2h-Systemen auch sog. Mapping-Experimente durchgeführt werden, um spezifische Interaktionsdomänen zu identifizieren.

Erfindungsgemäß können Interaktionspartner auch über Co- Immunpräzipitationen aus mit 24B2- (bzw. deren native Varianten) Expressionsvektoren transfizierten Zellen zu benutzen, um daran bindende Proteine aufzureinigen, und über Proteinsequenzierungsmethoden (z. B. MALDI-TOF, ESI-tandem- MALDI) nachfolgend die dazugehörigen Gene zu identifizieren.

Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung des two-hybrid Systems oder anderer biochemischer Verfahren zur Identifizierung von Interaktionsdomänen von 24B2 bzw. nativ auftretender Varianten derselben und die Verwendung dieser Interaktionsdomänen (Fragmente der nativen Sequenzen) zur pharmakotherapeutischen Intervention.

Erfindungsgemäße 24B2-Sequenz können darüber hinaus dazu eingesetzt werden, Erkenntnisse über die Einordnung des erfindungsgemäßen Proteins in Signaltransduktionskaskaden, insbesondere der ras/MapK Kaskade zu gewinnen. Dazu wird das offene Leseraster des Gens in einen gängigen Expressionsvektor (z. B. pCMV-tag, Fa. Stratagene) kloniert. Dieses Konstrukt kann mit anderen Konstrukten zusammen in eukaryontische Zellen transfiziert werden (z. B. mit der Calciumphosphatmethode, siehe Ausübel et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York, 1997).

Dies können Reporterkonstrukte sein, z. B. ein Luciferase-Gen unter Kontrolle eines Minimalpromotors mit mehreren SRE- Elementen, der Bindungssequenz für den ELK Transkriptionsfaktor. Extrakte aus den Zellen können dann einer Messung im Luminometer (z. B. Fa. Bertold) unterzogen werden. Eine Erhöhung des Luciferase-Wertes deutet auf eine Beeinflussung des Signaltransduktionsweges hin, der in der Aktivierung eines bestimmten Transkriptionsfaktors (ELK) mündet. Kombinationen mit Expressionskonstrukten für andere Gene (z. B. MAP-Kinasen) können Aufschlüsse über die genaue Position von 24B2 in Signalkaskaden geben. Diese Reporterassays können alternativ auch mit anderen Systemen durchgeführt werden, z. B. lacZ oder Chloramphenicoltransferase (CAT-assays). In derselben Weise können auch vorgefertigte Kits (z. B. Mercury in vivo kinase assay kits, Fa. Clontech) benutzt werden. Dabei wird der Tet-Repressor in Fusion mit der Transaktivatordomäne eines Phosphorylierungstargets (im Falle der ras/mapk Kaskade der Transkriptionsfaktor ELK) exprimiert. Die Aktivierung eines Luciferasekonstruktes unter Kontrolle eines Tet-Repressor- Elements findet nur statt, wenn eine spezifische Phosphorylierung der Transaktivatordomäne durch eine Kinase (ERK 1/2) erfolgt. Auf diese Weise ist die Einordnung von 24B2 in einen zellulären pathway möglich.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide, insbesondere nativ auftretende Formen oder aber auch nicht-native, artifiziell erzeugte Varianten, deren biologische Funktion untersucht werden soll, können erfindungsgemäß in einem Apoptoseassay verwendet werden bzw. in einem Verfahren zur Untersuchung der Funktion und/oder Wirksamkeit erfindungsgemäßer Polypeptide bei Induktion, Transduktion oder Inhibition von Zelltodsignalen zum Einsatz kommen. Die Beteiligung von 24B2 oder vorgenannten Varianten an apoptotischen Kaskaden kann untersucht werden, indem Expressionskonstrukte mit 24B2 oder Varianten in eukaryontische Zellen transfiziert werden, und danach die Induktion von Apoptose untersucht werden kann. Dies kann z. B. durch Anfärbung mit Annexin geschehen (Fa. Roche Diagnostics), durch Antikörper, die die aktive Form von Caspase-3 erkennen (Fa. New England Biolabs), oder durch ELISAs, die DNA-Histon-Bruchstücke erkennen (cell-death elisa, Roche Diagnostics). Diese Induktion von Apoptose ist ggf. zelltyp-spezifisch, weswegen erfindungsgemäß vorzugsweise mehrere Zelllinien und primäre Zellen untersucht werden. Die Induktion von Apoptose kann ggf. auch Stimulus-spezifisch sein. Daher werden in einem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise mehrere Streß- Situationen zugrundegelegt, z. B. Hitzeschock, Hypoxiebedingungen, Cytokinbehandlungen (z. B. Il-1, Il-6, TNF-alpha, H₂O₂-Behandlung). Als typische Zelltypen für ein derartiges erfindungsgemäßes Verfahren kommen gebräuchliche Zellinien, z. B. Cos-Zellen, HEK-Zellen, PC12-Zellen, THP-1- Zellen, oder primäre Zellen, wie z. B. Neurone, Astrozyten, in Betracht, ebenso wie andere immortalisierte und primäre Zellinien nach Bedarf.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder erfindungsgemäßer Genprodukte zur Durchführung eines Proliferationsassays. Bspw. kann die Beteiligung von 24B2 sowie nativer oder nicht nativer Varianten derselben beim Wachstum von Zellen, beim Durchlauf des Zellzyklus oder bei tumorigener Transformation untersucht werden, indem Expressionskonstrukte mit 24B2 oder entsprechender Varianten in eukaryontische Zellen transfiziert werden und danach bspw. die Induktion von Tumorigenizität untersucht wird, z. B. mit Hilfe eines Soft- Agar-Tests (Housey, et al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol., 234, 127-40). Als bevorzugte Zelltypen kommen gebräuchliche Linien, z. B. Cos-Zellen, HEK-Zellen, PC12-Zellen, THP-1- Zellen, und primäre Zellen, wie z. B. Neurone, Astrozyten, in Betracht, ebenso wie andere immortalisierte und primäre Zellinien nach Bedarf. Insbesondere kann mit Hilfe eines solchen erfindungsgemäßen Verfahrens die Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte am ras-Signalübertragungsweg und die Wechselwirkung erfindungsgemäßer Genprodukte mit anderen Komponenten des ras-Signalübertragungswegs, insbesondere in Hinblick auf proliferative Prozesse, untersucht werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10, insbesondere als Suizidgen/-protein, für die in vivo oder ex vivo Transformation von Wirtszellen (Anspruch 29). Insbesondere in Hinblick auf die biologische Funktion von erfindungsgemäßem Protein bei der Signaltransduktion von apoptotischen und/oder nekrotischen Signalen kann auf diese Weise in Wirtszellen der Zelltod gezielt ausgelöst werden. Vorzugsweise wird hierbei die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz bzw. eines erfindungsgemäßen Proteins so ausgestaltet sein, daß die erfindungsgemäße DANN-Sequenz, bspw. als Suizidgen, operabel mit einem Promotor verbunden ist, wobei die Transkription reprimiert ist und nur im Bedarfsfall aktiviert wird (Anspruch 30). Insbesondere kann nach Transplantation von Patienten-Zellen ex vivo oder in vivo im Rahmen einer Gentherapie gezielt die transfizierte Zelle ausgeschaltet werden.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert.

Fig. 1 stellt die humane 24B2-Nukleinsäuresequenz (SEQ ID 1)(cDNA) dar. Der translatierte Bereich ist durch Großbuchstaben hervorgehoben. Das Startcodon und das Stopcodon sind durch Unterstreichung hervorgehoben. Die humane 24B2-Nukleotidsequenz weist eine Länge von 2880 bp auf (Seq ID 1, Fig. 1) auf.

Fig. 2 stellt die Aminosäuresequenz von humanem 24B2-Protein dar (SEQ ID 2), und zwar durchlaufend vom N- zum C-Terminus.

Fig. 3 stellt die murine Nukleotidsequenz von 24B2 dar (Seq ID 3). Der translatierte Bereich ist durch Großbuchstaben hervorgehoben.

Fig. 4 stellt die Aminosäuresequenz vom murinen Protein 24B2 dar (Seq ID 4), und zwar fortlaufend vom N- zum C-Terminus.

Fig. 5 zeigt einen Sequenzvergleich unter Berücksichtigung von Homologien auf Proteinebene zwischen den SH3-Domänen von erfindungsgemäßem Protein 24B2 und dem Stac-Protein Q99469 sowie den Proteinen Q08012, Q06449, Q9urw6, Q25432, 060593 und Q9v7c3 mit Hilfe des Programms Clustal (Megalign, Lasergene, Madison, WI). Dunkel unterlegt sind die identischen Aminosäuren. Insgesamt fällt der hohe Grad der Konservierung auf. Die Pfeilen markieren die SH3-Domäne.

In Fig. 6 ist Sequenzvergleich zwischen dem humanen und dem murinen 24B2 mit Hilfe des Programms Clustal (Megalign, Lasergene, Madison, WI). Dunkel unterlegt sind die Aminosäuren, die sich bei der Maus und der humanen Form unterscheiden. Insgesamt fällt der hohe Grad der Konservierung auf. Die fett markierte Linie kennzeichnet die Phorbolester/Diacylglycerol-Bindungsdomäne. Die Pfeilen markieren die SH3-Domäne von 24B2.

Fig. 7 stellt einen phylogenetischen Baum der humanen und murinen 24B2- und der Stac-Proteine dar. Benutzt wurde das Programm Megalign. Die 24B2-Familie stellt eine neue Untergruppe innerhalb der Stac-Proteine dar - die entsprechende Sequenz-basierte Verwandtschaft ist Fig. 7 zu entnehmen.

Fig. 8 zeigt die Gewebe-Expression von 24B2. Offensichtlich ist die starke Expression in Testis, im Gehirn und im 7 Tage alten Embryo. Die Werte auf der y-Achse sind relative auf den Standard bezogene Werte.

Fig. 9 enthält eine Proteinstrukturvorhersage für das erfindungsgemäße Protein 24B2, die mit Hilfe des Programms Protean (DNAStar, Lasergene, Madison, WI) erstellt wurde. Die Positionen der Aminosäuren von erfindungsgemäßem 24B2 sind in der obersten Leiste festgelegt. In den darunter angeordneten Leisten sind die Sekundärstrukturvorhersagen für a-helikale Bereiche (A, nach den Algorithmen von Garnier-Robson bzw. Chou-Fasman), β-Faltblattbereiche (B, wiederum nach Garnier-Robson bzw. Chou-Fasman), Turn- Bereiche (T, nach obigen Algorithmen) und schließlich Knäuel-Bereiche (C, (coiled) nach Garnier- Robson)eingezeichnet. Hervorzuheben ist die Dominanz der β- Faltblattbereiche (nach Garnier-Robson) und die geringe Ausprägung von a-helikalen Bereichen (vor allem am N- Terminus bis AS 60). Ein coil-Bereich ist insbesondere zwischen AS 220 und 280 zu beobachten. Weiterhin sind in Fig. 9 die amphipathischen Bereiche (a, β nach dem Algorithmus von Eisenberg) das Muster der flexiblen Regionen von 24B2 (nach dem Algorithmus von Karplus-Schulz), die Ausprägung antigenischer Bereiche (nach dem Algorithmus von Jameson-Wolf) und schließlich eine Darstellung (ganz unten) der Wahrscheinlichkeiten für an der Proteinoberfläche gelegene Sequenzbereiche - korrespondierend mit dem Hydrophobizitätsprofil von 24B2.

Fig. 10 zeigt einen Sequenzvergleich zwischen der erfindungsgemäßen murinen 24B2-Sequenz (obere Sequenz), die für ein 408 AS langes Protein kodiert (Seq ID 4) und der humanen, 402 AS langen STAC-Sequenz Q99469 (untere Sequenz). Im Ergebnis besteht eine 47%-Konservierung. Eine besonders hohe Sequenzidentität zeigt das im 5'-Bereich gelegene Diacylglycerol-Phorbolesters-Bindungsmotif (51,1%) und die konservierte SH3-Domäne (76,0%).

Die vorliegende Erfindung wird durch das nachfolgende Ausführungsbeispiel näher erläutert:

Ausführungsbeispiele Ausführungsbeispiel 1 Molekulare Klonierung von 24B2

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein bislang nicht in der Vollänge definiertes und entsprechend bislang in seiner Funktion nicht charakterisiertes Protein, einschließlich der zugrundeliegenden DNA-Sequenz, wurde aufgrund einer differentiellen Regulation im zentralen Nervensystem kloniert. Die RNA-Produkte des Gens 24B2 wurden nach fokaler cerebraler Ischämie im Gehirn von Mäusen in der ischämischen Hemisphäre verstärkt exprimiert, und konnten durch ein differentielles Klonierungssystem (restrictionmediated differential display, RMDD) kloniert werden.

Zur Herbeiführung von fokalen cerebralen Ischämien wurde hierbei das Fadenmodell benutzt (middle cerebral artery occlusion, MCAO), ein valides Modell für die Schlaganfallerkrankung beim Menschen. Dieses experimentelle System wurde erfindungsgemäß eingesetzt, um Gene zu identifizieren, die neben anderen Funktionen auch von pathophysiologischer Bedeutung für die Ereignisse nach einer cerebralen Ischämie sind. Im einzelnen wurde wie folgt experimentell verfahren.

A) Herbeiführen des Fadenmodells in Mäusen

Zum Herbeiführen einer fokalen cerebralen Ischämie in c57/bl6 Mäusen wurden 3 Monate alte Mäuse benutzt. Nach Herbeiführen einer Inhalationsnarkose (70% N20, 30% O2, 0,8-1% Halothan) wurde ein 5-0 Prolenefaden (Fa. Ethicon), der mit 0.1% Poly-L-Lysin beschichtet war, über die A. carotis externa in die A. carotis interna bis zum Abgang der A. cerebri media vorgeschoben (Clark et al. 1997, Neurol. Res., 19, 641). Die richtige Position des Fadens wird durch einen Abfall des Laser- Doppler-Signals (Fa. Perimed) auf 10-20% des Ausgangssignals angezeigt. Nach Durchführung dieser Operation und gegebenenfalls Bestimmung zusätzlicher physiologischer Parameter (Blutdruck, Puls, Blutgase, Blutglukose) erwachen die Mäuse aus der Narkose. Nach bestimmten Okklusionszeiten werden die Mäuse wieder einer Narkose unterzogen, und der Faden zurückgezogen. Dadurch findet eine Reperfusion des Gewebes statt. Nach bestimmten Reperfusionszeiten werden die Mäuse durch Genickbruch getötet, und das Gehirn sofort präpariert und auf Trockeneis gefroren.

Im vorliegenden Fall wurden keine Reperfusionen durchgeführt, sondern nur eine Okklusion von 90 min bzw. 24 h.

B) Präparation von mRNA aus den Hirnen

Dazu wurde das mRNA Präparationskit von der Fa. Invitrogen (Fasttrack) verwendet. Es wird auf die vom Hersteller beschriebene Standardpräparationsmethode verwiesen, die Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Patentanmeldung ist.

C) Durchführung des RMDD Protokolls

Dabei wurde im wesentlichen nach Pat. Nr. EP 0 743 367 A2; US 5,876,932 verfahren, mit der Änderung, daß 2 ug polyA-RNA für die Erststrangsynthese eingesetzt wurden. Nach Durchführung von Erststrangsynthese, Zweitstrangsynthese und Restriktionsverdau wurde eine Adapterligation mit Adaptoren durchgeführt. Nach erfolgter PCR-Amplifikation mit Adapter- und cDNA- Primern wurden die Amplifikationsprodukte auf ein denaturierendes Gel geladen und auf eine Nylonmembran geblottet (Fa. GATC). Die Biotin-markierten Banden wurden mit Hilfe einer gebräuchlichen Streptavidin- Peroxidase-Reaktion (Roche Molecular Biochemicals) visualisiert. Auf das Gel wurden jeweils PCR-Proben von der ischämischen und kontralateralen Hemisphäre zusammen aufgetragen (24 h MCAO rechts und links und 90 min MCAO rechts und links). Banden unterschiedlicher Intensität in der rechten oder linken Hemisphäre werden ausgeschnitten, und eine Reamplifikation des entsprechenden PCR-Produktes durchgeführt. Erhaltene amplifizierte Produkte werden in den TOPO TA Vektor pcDNA 2.1 (Fa. Invitrogen) kloniert und mit T7 und M13rev-Primern sequenziert (ABI 3700 Kapillarelektrophorese-Sequencer). Erhaltene Sequenzen werden mit der EMBL-Datenbank verglichen.

D) Klonierung von 24B2

Die Isolierung muriner und humaner cDNA-Klone für 24B2 wurde unter Verwendung von 24B2-spezifischen Biotin- markierten Oligonukleotiden durchgeführt (modifiziertes Protokoll nach Shepard und Rae (Shepard and Rae, 1997, Nucleic Acids Res, 25, 3183-5). Die folgenden Oligonukleotide urden zur Isolierung der murinen cDNAs verwendet: 1. Screen PCR-Primer

Blockprimer

2. Screen PCR-Primer

Blockprimer

3. Screen PCR-Primer

Blockprimer

Das verwendete Verfahren beruht auf einer Hybridisierung Biotin-markierter 24B2-Oligonukleotide mit 5 µg alkalisch denaturierter Plasmid-DNA. Zusätzlich wurden unmittelbar 5'- und 3'-gelegene 40mer-Oligonukleotide hybridisiert. Dadurch wurden einzelne Plasmidmoleküle spezifisch mit Biotin markiert, die entweder murine oder humane cDNAs enthielten. Die Hybridisierungsbedingungen wurden von Sheperd und Rae übernommen (Shepard and Rae, 1997, Nucleic Acids Res, 25, 3183-5).

Die Anreicherung der Biotin-markierten Plasmidmoleküle wurde mit magnetischen Streptavidin-gekoppelten Beads durchgeführt (entsprechend den Herstellerangaben, Fa. Dynal). Nach mehrfachen Waschschritten wurden die 24B2- angereicherten Plasmide thermisch von den magnetischen Beads gelöst (80°C, 2 min) und in E. coli (DH10B, Gibco) elektrotransformiert. Transformandenkolonien wurden vereinigt, und Plasmid-DNA isoliert (QIAprep Mini Spin- Columns, Qiagen). 24B2-cDNA enthaltende Plasmide wurden wiederholt durch Hybridisierung mit den entsprechenden Oligonukleotiden angereichert. Von jeweils 36 der Bakterien-Kolonien der Zweitrunden-Transformanden wurde Plasmid-DNA isoliert und mit cDNA-Insert-flankierenden Primern (T3 und T7 Primer, pBluescript SK II, Stratagene) sequenziert. Die cDNA Inserts von 24B2 mRNA-Sequenz enthaltenden Plasmiden wurden mit spezifischen Primern vollständig sequenziert.

E) Herstellung der humanen cDNA-Bibliothek

Mit dem cDNA-Synthese Kit der Fa. Stratagene wurde ausgehend von 2 µg humaner fötaler Gehirn-mRNA (Fa. Clontech) und von 5 µg mRNA aus adultem Mausgehirn entsprechende cDNA-Bibliotheken hergestellt. Dabei wurde im wesentlichen entsprechend der Angaben des Herstellers verfahren. Zur Synthese der Erststrang cDNA wurde nach den Herstellerangaben ein oligodT-Primer verwendet. Die klonierungs-kompatiblen (EcoRI/XhoI) doppel-strängigen cDNA Fragmente wurden größenselektioniert (nach Hertsellerangaben/Fa. Stratagene) und in den Plasmidvektor pBluescript SKII (Stratagene) ligiert. Die Ligation wurde durch Elektroporation in E. coli (DH10B, Gibco) transformiert und auf LB-Ampizillin Agar-Platten amplifiziert. Die Plasmid-DNA wurde mittels alkalischer Lyse und Ionenaustauscher-Chromatographie isoliert (QIAfilter- Kit, Fa. Qiagen).

Die Komplexität an Einzelklonen betrug für die fötale humane Gehirn cDNA-Bank 4 Millionen. Von jeder cDNA- Bank wurden zufallsmäßig 24 Einzelklone nach Insertgrößen analysiert, die eine Größenverteilung von 800 bp bis zu 4.5 kB zeigten; die durchschnittliche Länge der cDNA-Inserts betrug für die humane Bank ca. 1,2 kB.

Ausführungsbeispiel 2 Gewebeexpression von 24B2 A) Homologiesuche

Durch eine Homologiesuche (BLAST) mit der erfindungsgemäßen humanen 24B2-Sequenz konnten humane ESTs (expressed sequence tags) aus dem 3' nicht- translatierten Bereich des Gens identifiziert werden. Dabei fanden sich Klone aus dem Auge, Embryo, Lymphatischem Gewebe, Muskel, B-Zellen, Lunge, Leber, Gehirn, Niere, Prostata und Brustgewebe, die auf eine breite Gewebeverteilung schließen lassen. Dies stand in Übereinstimung mit den erhaltenen quantitativen PCR- Daten.

B) Gewebeexpression der humanen mRNA für 24B2

Durch eine Homologiesuche (BLAST) mit der humanen 24B2 Sequenz konnten humane ESTs (expressed sequence tags) aus dem 3' untranslatierten Bereich des Gens identifiziert werden. Aus diesen vorbekannten humanen ESTs für erfindungsgemäßes 24B2 ergab sich erfindungsgemäß eine Expression in folgenden Geweben: Gehirn, Prostata, Auge, Niere, Ovar, Testis, Fettgewebe, Knochenmark. Klone fanden sich auch in Embryos, im Lymphatischen Gewebe, Muskel, B-Zellen, Lunge, Leber und Brustgewebe. Dies deckt sich weitgehend mit den erfindungsgemäß erhaltenen quantitativen PCR-Daten. Auch in einer Anzahl von Tumoren: bspw. Endometriumkarzinom (Adenokarzinom, Uterus), malignes Melanom, mucodermoides Karzinom, Nebennierenrindenkarzinom, epithelioides Karzinom, Lungentumor, CML (Chronisch myeloische Leukämie), Phäochromozytom, Nierentumor (klarzelliges Karzinom) findet sich eine deutliche Gewebeexpression.

Diese funktionale Assoziation zu Tumoren steht in Zusammenhang mit den beiden wichtigen Proteindomänen bei 24B2, SH3 und der DAG-Bindungsdomäne, die beide eine Verknüpfung zu tumorigenen Proliferationsvorgängen haben (z. B. src als wichtiges Protoonkogen, und zur cancerogenen Wirkung von Phorbolestern).

Ausführungsbeispiel 3 24B2-Proteinsequenz A) Proteinsequenz von 24B2 (murin)

Durch Hybridisierung von cDNA-Banken mit 24B2-Sonden konnte nach Sequenzierung der identifizierten cDNA- Klone der gesamte ORF bestimmt werden. Für die murine Proteinsequenz ergab sich erfindungsgemäß ein offenes Leseraster, das für ein Protein mit 408 Aminosäuren kodiert (44,79 kD Molekulargewicht; isoelektrischer Punkt bei pH 7,7) (Seq ID 4, Fig. 4).

Mit Hilfe des Computerprogramms "HMMPFAM pattern search" bzw. der Suche in der Datenbank HMMPFAM lassen sich drei potentielle Motive voraussagen: (1) im N- Terminus befindet sich eine Phorbolester/Diacylglycerol-Bindungsdomäne (ca. AS 111-161) (Score: 30,1; e-value: von 4.3e-05); (2) zwischen AS 196 und 203 ist eine sog. SIR2-Domäne lokalisiert (Score: 3,3; e-value: von 9,6) und (3) im C-Terminus liegt zwischen AS 292 und AS 346 eine SH3- Bindungsdomäne (Score: 70,7; e-value: von 3,1e-17). Auffällig sind insbesondere die außergewöhnlich hohen Werte für die Phorbolester/Diacylglycerol- Bindungsdomäne und die SH3-Bindungsdomäne, die ein Interaktionmodul mit einem oder mehreren anderen, z. B. SH3-Domänen enthaltenden Proteinen darstellen kann.

SH3-Domänen spielen eine wesentliche Rolle bei der biologischen Signalweitergabe. Die Src-Tyrosinkinase selbst, die die SH3 Domänen definiert, hat große Bedeutung für den Schlaganfall. Es wurde jüngst gezeigt, daß Blockierung der Src-Aktivierung einen Schutz vor einem Schlaganfallmodell in Mäusen (MCAO) vermittelt (Paul, et al., 2001, Nat Med, 7, 222-7.). Der Mechanismus hierbei ist hierbei vermutlich eine Verringerung der vaskulären Permeabilität die pathologisch beim Schlaganfall auftritt. Die SH3 Domäne selbst bindet an eine prolinreiche Targetsequenz (in der N-terminalen SH3 Domäne von grb2 VPPPVPPRRR) (Feng et al., 1994, Science, 266, 1241-7.) (Wu et al., 1995, Structure, 3, 215-26.).

Nach der erfindungsgemäßen Erkenntnis enthält 24B2 eine Diacylglycerol(DAG)/Phorbolester-Bindungsdomäne. Diese vermittelt Effekte des "second messengers" Diacylglycerol oder der cancerogenen Gruppe der Phorbolester auf Zellen. Ursprünglich wurde die DAG- Domäne in der Proteinkinase C charakterisiert, die als Hauptrezeptor für das DAG-Signal angesehen wurde. Aus dem Stand der Technik sind jedoch nunmehr zahlreiche weitere Proteine bekannt, die ebenfalls DAG-Domänen enthalten, so z. B. die Serin-Threoninkinase Raf (der Effektor von ras), chimaerin, vav, citronN und citronK, ung-13 (C. elegans).

Da Phorbolester wichtige cancerogene Substanzen sind, wirkt erfindungsgemäßes 24B2 als Rezeptor bei der Weiterkeitung des DAG/Phorbolestersignals mit und spielt insoweit eine wichtige Rolle in der Krebsentstehung oder Propagation, weswegen es sich als medikamentöses target für Krebserkrankungen eignet (Gomez, et al., 1999, Oncol Rep, 6, 1363-70.).

Erfindungsgemäß läßt sich darüber hinaus die subzelluäre Lokalisation von 24B2 unter Anwendung des Programms PSORT II (www.nibb.ac.jp) bestimmen. Im Ergebnis läßt sich eine ungefähr 60 bis 85%ige, insbesondere 70 bis 80%ige Zellokalisation des Proteins im Kern feststellen.

B) Proteinsequenz von 24B2 (human)

Erfindungsgemäß wurden die folgenden Daten für das Protein 24B2 (Fig. 2) in seiner humanen Form erhoben: Es besteht aus 411 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 45 kD und einem isoelektrischen Punkt von pH 7,2. Es besteht eine Sequenzidentität der humanen zur Maussequenz von 93,4% (Fig. 6).

Die Aussagen zur Domänenstruktur unter A) für die murine Sequenz gelten für die humane Sequenz entsprechend.

C) Sequenzvergleiche auf der Basis der erfindungsgemäßen 24B2-Proteine

Durch Vergleich der 24B2-Sequenz mit EMBL, nrdb und swissprot-Datenbanken ergab sich eine hohe Übereinstimmung von 47% auf Aminosäureebene mit den humanen und murinen Sequenzen des Stac-Proteins (Suzuki et al., 1996. Bioschemical and Biophysical Communications 229, 902-909), s. Fig. 10. Eine besonders hohe Sequenzidentität zeigt das im 5'Bereich gelegene Diacylglycerol-Phorbolesters-Bindungsmotif (51,1%) und die konservierte SH3-Domäne (76,0%).

Weitere Homologien zwischen erfindungsgemäßem 24B2- Protein und anderen Proteinen beschränken sich auf die SH3-Domäne. Eine 52%ige Homologie wurde über einen Abschnitt von 48 AS zu dem Drosophila melanogaster Protein DRK (E(SEV) 2B (SH2-SH3 ADAPTER PROTEIN DRK, mit einer einzelnen SH2-Domäne und zwei flankierenden SH3- Domänen, in der Plasmamembran lokalisiert) (Q08012) ermittelt, eine 45%ige Identität über einen Abschnitt von 51 AS zum Protein GRB2 (growth factor receptorbound protein2). Die Funktion des Proteins DRK beruht auf der Signalübertragung der Sevenless Rezeptor- Tyrosinkinase.

Weiterhin wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß eine 32%ige Homologie über einen Abschnitt von 81 AS zu der SH3-Domäne des humanen Gehirn-spezifischen alpha-Fodrin (non-erythroid spectrin) besteht. Fodrin ist in der Lage, sowohl Calmodulin, Synapsin, Actin als auch Calcium zu binden.

Ausführungsbeispiel 4

Genomische Struktur von humanem 24B2

Nach Klonierung von erfindungsgemäßem 24B2 wurde eine Datenbanksuche (BLAST 2 (Altschul, et al., 1997, Nucleic Acids Res, 25, 3389-402.)) in der EMBL-Datenbank durchgeführt, diese erbrachte die folgenden Sequenzinformationen.

Bei einer Homologiesuche in der Esembl-Datenbank ergaben sich folgende vorhergesagte Fragmente des humanen 24B2 Proteins, die durch automatische Generkennung detektiert wurden: 1. Im contig AC004408.00001 Genscan volatile id 196015

Dies ist ein Fragment aus dem carboxyterminalen Bereich des erfindungsgemäßen Proteins. 2. Im contig AC021102.00002 Genscan volatile id 329696

Hierbei handelt es sich um ein Fragment aus dem N-Terminus des erfindungsgemäßen Proteins. 3. Ein zusammengesetztes Peptid aus zwei erkannten Exons

Das Alignment mit dem humanen erfindungsgemäßen 24B2 läßt jedoch erkennen, daß nur die ersten 30 Aminosäuren übereinstimmen, danach erfolgt eine Falschvorhersage des zusammengesetzten Proteins. SEQUENCE LISTING

Claims

1. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Sequenzbereich enthält, der für ein Polypeptid mit einer mindestens 20 AS langen Teilsequenz einer der beiden Aminosäuresequenzen gemäß Fig. 2 und 4 codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele, oder hiermit hybridisierenden DNA-Sequenzen, insbesondere DNA- Sequenzen, die einen Sequenzbereich enthalten, der für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von AS 10 bis AS 350, stärker bevorzugt AS 20 bis 300, AS 30 bis 300, AS 40 bis AS 300, AS 50 bis AS 300, AS 60 bis AS 300, AS 70 bis AS 300, AS 80 bis AS 300, AS 90 bis AS 300, AS 100 bis AS 300, AS 110 bis AS 300, AS 120 bis AS 300, AS 130 bis AS 300, AS 140 bis AS 300, AS 150 bis AS 300 oder AS 150 bis AS 400, AS 150 bis AS 390, AS 150 bis AS 380, AS 150 bis AS 370, AS 150 bis AS 360, AS 150 bis AS 350, AS 150 bis AS 340, AS 150 bis AS 330, AS 150 bis AS 320 oder AS 150 bis AS 310 (Numerierung gemäß Reihenfolge der AS in den Fig. 2 oder 4) codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Sequenzbereich enthält, der für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 2 oder 4 codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele, oder hiermit hybridisierenden DNA-Sequenzen.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Polypeptid gemäß Fig. 2 oder 4 codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele, oder hiermit hybridisierenden DNA-Sequenzen.

4. DNA-Sequenz nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie die in Fig. 1 oder 3 angegebene (c)DNA-Sequenz enthält.

5. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.

6. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert ist.

7. Wirtszelle nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Säugetierzelle, insbesondere eine humane Zelle, ist.

8. Aufgereinigtes Genprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß es durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird.

9. Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polypeptid ist.

10. Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die in Fig. 2 oder 4 angegebene Aminosäuresequenz enthält, einschließlich aller funktionshomologen Allele, Fragmente oder Derivate.

11. Transgene Tiere, dadurch gekennzeichnet, daß sie genetisch dahingehend verändert sind, daß sie eine im Vergleich zum Normaltier (spezifisch) veränderte Menge mindestens einer Aminosäuresequenz nach Anspruch 9 oder 10 oder eine spezifisch gegenüber einer nativen Sequenz (gemäß Fig. 2 oder 4) veränderte Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 9 oder 10 enthalten oder daß ihnen mindestens eine nativ vorhandene Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 9 oder Teile davon fehlt oder verändert vorliegt.

12. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Epitop auf einem Genprodukt nach einem der Ansprüche 8 bis 10 erkennt.

13. Antikörper nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.

14. Antikörper nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen einen Sequenzabschnitt auf der cytoplasmatischen Domäne als Epitop gerichtet ist.

15. Verfahren zur Expression von Genprodukten nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Wirtszellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert werden.

16. Verfahren zur Isolierung von Genprodukten nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Wirtszellen nach Anspruch 6 oder 7 unter geeigneten, die Expression fördernden Bedingungen kultiviert werden und das Genprodukt anschließend aus der Kultur aufgereinigt wird.

17. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein Genprodukt nach einem der Ansprüche 8 bis 10 als Arzneimittel.

18. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Behandlung (bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung) von Erkrankungen, die auf fehlgesteuerter Regulation von Zelltod- und/oder Zellproliferationsereignissen beruhen.

19. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Behandlung (bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung) von Tumorerkrankungen und neurologischen Erkrankungen, insbesondere Schlaganfall, Multipler Sklerose, Morbus Parkinson, Amyotrophe Lateralsklerose, Heredodegenerativen Ataxien, Morbus Huntington, Neuropathien und Epilepsien.

20. Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß sie die intrazelluläre Funktion des Proteins 24B2 moduliert, insbesondere inhibiert.

21. Verbindung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine organisch-chemische Verbindung mit einem Molekulargewicht von vorzugsweise < 3000 oder ein Peptid oder Peptidomimetikum ist.

22. Verbindung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Zellmembran durch Diffusion oder über membranöse Transportproteine passiert.

23. Verfahren zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksamen Verbindungen nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein geeignetes Wirtszellsystem mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5, insbesondere einem Expressionsvektor, der für ein Protein oder einen Abschnitt oder eine Variante eines Proteins gemäß Fig. 2 oder 4 codiert, und ggf. mindestens einem Expressionsvektor, der für mindestens ein Reporter-Gen codiert, transfiziert wird, und

b) ein zur Beobachtung der durch ein Protein oder einen Abschnitt oder eine Variante eines Proteins gemäß Fig. 2 oder 4 vermittelten Funktion, insbesondere ein zur Beobachtung der Apoptose, des Zellwachstums, der Zellproliferation und/oder der Zellplastizität geeigneter Parameter nach Zugabe einer Testverbindung im Vergleich zur Kontrolle ohne Zugabe einer Testverbindung für das gemäß (a) erhaltene Wirtszellsystem in einem geeigneten Testsystem gemessen wird.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß

a) der Bindungsplatz der pharmazeutisch wirksamen Verbindung auf einem erfindungsgemäßen Protein durch ein geeignetes biochemisches oder strukturbiologisches Verfahren ermittelt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß ein Parameter gemäß (b) innerhalb eines Assayaufbaus für die Raf/MEK/ERK-Kaskade gemessen wird.

26. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 19 bis 22 zur Behandlung von (bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von) neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere Alzheimer-Demenz und Morbus Parkinson, Muskeldystrophie, viralen Infektionserkrankungen, Tumorerkrankungen und Autoimmunerkrankungen oder cerebralen Ischämien.

27. Verfahren zur Identifizierung eines zellulären Interaktionspartner des nativen Proteins 24B2 oder eines nativen Homologen, Allels, Fragments oder Derivats, wobei ein sog. "yeast-two-hybrid"-System eingesetzt wird.

28. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Identifizierung von weiteren an der durch das Protein 24B2 vermittelten Signaltransduktion beteiligten Proteinen.

29. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10, insbesondere als Suizidgen/-protein, für die in vivo oder ex vivo Transformation von Wirtszellen.

30. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 29, wobei das die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 operabel mit einem Promotor verbunden ist, wobei vorzugsweise die Transkription reprimiert ist und nur im Bedarfsfall aktiviert wird.