DE10106835A1 - Signaltransduktionsproteine 15B3, 15B3-1 und 15B3-2 und zugrundeliegende DNA-Sequenzen - Google Patents
Signaltransduktionsproteine 15B3, 15B3-1 und 15B3-2 und zugrundeliegende DNA-SequenzenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, Expressionsvektoren, die erfindungsgemäße DNA-Sequenzen enthalten, Wirtszellen, Genprodukte der vorgenannten DNA-Sequenzen, die für Signaltransduktionsproteine codieren, sowie weitere Derivate der vorgenannten Erfindungsgegenstände. Weiterhin offenbart die vorliegende Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. den von diesen DNA-Sequenzen exprimierten Signaltransduktionsprotein als Arzneimittel und nicht therapeutische Verwendungen erfindungsgemäßer DNA-Sequenzen bzw. Genprodukte.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft (i) DNA-Sequenzen, (ii)
Expressionsvektoren, die erfindungsgemäße DNA-Sequenzen ent
halten, (iv) Wirtszellen, die erfindungsgemäße Expressions
vektoren aufweisen, (v) Genprodukte, die durch erfindungsge
mäße Sequenzen codiert werden, (vi) hinsichtlich erfindungs
gemäßer Sequenzen veränderte transgene Tiere, (vii) gegen er
findungsgemäße Genprodukte gerichtete Antikörper, (viii) Ver
fahren zur Expression bzw. Isolierung von erfindungsgemäßen
Genprodukten, (ix) die Verwendung von erfindungsgemäßen DNA-
Sequenzen bzw. Genprodukten als Arzneimittel, (x) pharmazeu
tisch wirksame Verbindungen und Verfahren zu deren Herstel
lung sowie Verwendungen derartiger erfindungsgemäßer Verbin
dungen und (xi) nicht-therapeutische Verwendungen erfindungs
gemäßer DNA-Sequenzen bzw. Genprodukte.
Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, daß die Pathophysi
ologie des Schlaganfalls, daß der Ras/Erk Signaltransdukti
onsweg einen großen Einfluß auf NMDA Rezeptor/NOS Aktivierung
und die neuronale ischämische Prekonditionierung hat. Die
Proteine der Ras/Erk-Kaskade stellen pharmakologische targets
dar, da aufgrund definierter biochemischer Funktionen spezi
fische Inhibitoren gefunden werden können.
Der Schlaganfall stellt die dritthäufigste Todesursache und
die Hauptursache für Behinderungen in den westlichen Indust
rienationen dar. Jedes Jahr erleiden in Deutschland un
gefähr 250 000 Menschen einen Schlaganfall, ein Drittel
stirbt innerhalb des ersten Monats daran, 60% behalten Be
hinderungen zurück. Bislang gibt es keine wirksame Therapie
für die Mehrzahl dieser Patienten. Die Mehrzahl aller
Schlaganfälle in den westlichen Ländern beruht auf Störun
gen des cerebralen Blutflusses durch Thrombosen oder Embo
lien. Aus diesem Grund beruhen viele der bisherigen
Therapiekonzepte auf der Thrombolyse (bspw. mittels Strep
tokinase, rtPA, Ancrod). Aus dem Stand der Technik ist al
lerdings nunmehr auch bekannt, daß bei der Mehrzahl der
Schlaganfälle eine spontane Reperfusion auftritt. Neuere Ar
beiten bei Nagetieren lassen auch vermuten, dass der Schaden
durch die Reperfusion in einem gewissen Zeitfenster eher grö
ßer wird.
Die klinische Wirksamkeit ist für die Thrombolyse teilweise
erbracht, hat jedoch nicht zu einer Therapie geführt,
die bei der Mehrzahl der Schlaganfälle eingesetzt werden
kann. Neuere Forschungsentwicklungen stellen daher auf die
Entwicklung neuer Medikamente ab, die direkt das Zelltodpro
gramm in Neuronen beeinflussen.
Um neuartige Konzepte für die Behandlung der cerebralen
Ischämie, deren ausgeprägteste Form der Schlaganfall dar
stellt, zu entwickeln, werden in neueren Modellsystemen
der cerebralen Ischämie Veränderungen der Genexpressi
on registriert, die in funktionellem Zusammenhang mit dem
Ausmaß der Hirnschädigung stehen. Das beste verfügbare
Tiermodell ist das sog. Fadenmodell in Nagetieren ("fila
ment model"), bei dem ein beschichteter Nylonfaden die Ab
zweigung der A. cerebri media verschließt. Durch Zurückzie
hen des Fadens wird eine Wiederdurchblutung des Infarktge
bietes möglich. Aus der Analyse des Transkriptoms zu unter
schiedlichen postischämischen Zeitpunkten können neue the
rapeutische Targets identifiziert werden, die neue Behand
lungswege für die Akuttherapie erschliessen. Einzelne Genpro
dukte, die einer Regulation während des Präkonditionierens
unterliegen, konnten bereits identifiziert werden (z. B. IL-
1ra, TIMP-1, hsp-72). Bislang ist jedoch eine protektive Wir
kung der identifizierten Proteine nicht eindeutig nachgewie
sen worden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere Prote
ine und deren zugrundeliegenden Nukleotidsequenzen zu identi
fizieren, die protektive Wirkung haben, insbesondere eine
gewisse Resistenz gegenüber dem Schlaganfall vermitteln,
wie auch solche, die eine Ausweitung des ischämischen
Schadens bedingen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Er
findung ist es, auf der Basis identifizierter Proteine Ver
fahren zur Verfügung zu stellen, die es erlauben, Pharmaka zu
entwickeln, die in die entsprechende Pathophysiologie thera
peutisch eingreifen können. Damit ist auch das Bereitstellen
von entsprechenden Pharmaka eine Aufgabe der vorliegenden Er
findung.
Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe durch die Ge
genstände der Ansprüche 1, 5, 6, 8, 11, 12, 15, 16, 17, 20,
23, 26 und 27. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den je
weiligen Unteransprüchen beschrieben.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Nuklein
säure-Sequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die einen Se
quenzbereich enthalten, der für ein Polypeptid mit einer Ami
nosäuresequenz von AS 312 bis AS 711 (15B3), AS 180 bis AS 579
(15B3-1) oder AS 306 bis AS 705 (15B3-2) (Numerierung ge
mäß Fig. 4) codiert, einschließlich aller funktionshomologen
Derivate, Fragmente oder Allele. Insbesondere sind alle Nuk
leinsäure-Sequenzen mitumfaßt, die mit den erfindungsgemäßen
Sequenzen hybridisieren, einschließlich der jeweils im Dop
pelstrang komplementären Sequenzen (Anspruch 1).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden DNA-
Sequenzen offenbart, deren Genprodukt für ein Polypeptid co
diert, wie in einer der Fig. 9, 11 oder 13 für die Sequen
zen 15B3, 15B3-1 bzw. 15B3-2 wiedergegeben, einschließlich
aller funktionshomologen Derivate, Allele oder Fragmente ei
ner solchen DNA-Sequenz und auch infunktioneller Derivate,
Allele, Analoga oder Fragmente (bspw. DN-Varianten), die die
physiologische Funktion, bspw. apoptotische Signalkaskade,
inhibieren können (Anspruch 2). Auch mit diesen erfindungsge
mäßen DNA-Sequenzen hybridisierende DNA-Sequenzen (ein
schließlich der Sequenzen des komplementären DNA-Stranges)
sind mitoffenbart. Die Herstellung derartiger Derivate, Ana
loga, Fragmente oder Allele geschieht durch Standardverfahren
(Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al, Cold Spring Harbor, NY). Hierbei werden bei den DNA-
Sequenzen gemäß Fig. 8, 10 oder 12 ein oder mehrere Co
don(s) insertiert, deletiert oder substituiert, um nach
Transkription und Translation ein Polypeptid zu erhalten, das
einen Unterschied in bezug auf mindestens eine Aminosäure ge
genüber den nativen in den Fig. 9, 11 oder 13 dargestell
ten Sequenzen aufweist.
Zum Erfindungsgegenstand der vorliegenden Anmeldung gehören
auch DNA-Teilsequenzen der in den Fig. 8, 10 oder 12 dar
gestellten Sequenzen. Diese Teilsequenzen enthalten typi
scherweise mindestens 60, stärker bevorzugt mindestens 150
und noch stärker bevorzugt mindestens 250 Nukleotide umfas
sende Fragmente der in den Fig. 8, 10 oder 12 dargestell
ten Nukleotidsequenzen. Insbesondere codieren bevorzugte
Teilsequenzen für Polypeptide, die von AS 312 (15B3), 180
(15B3-1) bzw. 306 (15B3-2) mindestens 20 AS in Richtung N-
Terminus verlaufen und ggf. sich bis zum N-Terminus erstre
cken können (Numerierung gemäß Fig. 4). Weiterhin kann die
für mindestens 20 AS codierende Teilsequenz aber auch an ei
nem von den vorgenannten Punkten weiter proximal oder distal
liegenden Codons beginnen. Ganz besonders bevorzugt sind
Teilsequenzen, die für mindestens eine LRR codieren, vorzugs
weise mindestens 2 und stärker bevorzugt mindestens 5 (LRRs
sind in Fig. 4 durch unterlegte Pfeile gekennzeichnet). Ins
besondere bevorzugt sind solche Nukleotidteilsequenzen, die
für mindestens eine der in Fig. 4 markierten LRRs codieren
bzw. Nukleotidsequenzen, die mindestens eine der in Fig. 4
indizierten LRRs enthalten. Mitoffenbart sind alle Derivate,
Analoga oder Allele der vorgenannten offenbarten Teilsequen
zen. Auch die sich aus diesen erfindungsgemäßen DNA-
Teilsequenzen ergebenden AS-Sequenzen sind als solche oder
als Bestandteil in größeren rekombinanten Proteinen mitoffen
bart. Zum Rahmen der vorliegenden Erfindung gehören auch alle
nativen Spleißvarianten der erfindungsgemäßen Sequenzen.
Weiterhin bevorzugt sind Nukleinsäure-Sequenzen, insbesondere
DNA-Sequenzen, die für ein Protein codieren, das mindestens
60% Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens 80% und noch
stärker bevorzugt mindestens 95%, mit den in den Fig. 9,
11 oder 13 dargestellten Sequenzen hat. Nach Isolierung und
Sequenzierung sind die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen
gemäß Fig. 8, 10 oder 12 oder deren funktionelle oder in
funktionelle Äquivalente, wie z. B. Allelvariantenn oder Iso
formen, erhältlich. Unter Allelvarianten werden im Sinne der
vorliegenden Erfindung Varianten verstanden, die 60 bis 100%
Homologie auf Aminosäureebene, bevorzugt 70 bis 100%, ganz
besonders bevorzugt 90 bis 100% aufweisen. Allelvarianten
umfassen insbesondere solche funktionellen oder infunktionel
len Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substituti
on von Nukleotiden aus der in den Fig. 8, 10 oder 12 dar
gestellten Sequenzen erhältlich sind, wobei wenigstens noch
eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften erhalten
bleibt.
Homologe oder sequenzverwandte DNA-Sequenzen können aus allen
Säugerspezies, einschließlich Mensch, nach gängigen Verfahren
durch Homologie-Screening durch Hybridisierung mit einer Pro
be der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Teilen
davon isoliert werden. Unter funktionellen Äquivalenten sind
auch Homologe der in den Fig. 8, 10 oder 12 dargestellten
Sequenzen, beispielsweise ihre Homologen aus anderen Mamma
lia, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der co
dierenden und nicht-codierenden DNA-Sequenz zu verstehen.
Solche funktionellen Äquivalente lassen sich ausgehend von
den in den Fig. 8, 10 oder 12 dargestellten DNA-Sequenzen
oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen
Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen
Vertebraten wie Mammalia, isolieren. Damit sind erfindungsge
mäß alle mit den Sequenzen gemäß Fig. 8, 10 oder 12 hybri
disierenden Sequenzen mitumfaßt. Diese DNA-Sequenzen hybridi
sieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen
Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligo
nukleotide der konservierten Bereiche, die auf dem Fachmann
bekannte Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können
aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäu
ren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung
verwendet werden.
Je nach der verwendeten Nukleinsäure-Sequenz (Oligonukleotid,
längeres Fragment oder vollständige Sequenz) bzw. je nachdem,
welche Nukleinsäureart (DNA oder RNA) für die Hybridisierung
verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So
liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA: DNA-
Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA: RNA-Hybriden
gleicher Länge. Unter Standardbedingungen sind beispielswei
se, je nach Nukleinsäure, Temperaturen zwischen 42 und 58°C
in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwi
schen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natrium
citrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Forma
mid, wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid, zu
verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbe
dingungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen
zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C
bis 45°C. Für DNA: RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbe
dingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen
etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C.
Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung
sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine
Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und ei
nem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die
experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind
in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise
bei Sambrook et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989), beschrieben und lassen sich nach dem Fach
mann bekannten Formeln, beispielsweise abhängig von der Länge
der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt
berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der
Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausübel et al.
(eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nu
cleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at
Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential
Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford
University Press, Oxford.
Zu Äquivalenten von erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen
gehören auch Derivate der in den Fig. 8, 10 oder 12 darge
stellten Sequenzen, wie beispielsweise Promotorvarianten. Die
Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen gemeinsam
oder einzeln vorgeschaltet sind, können durch ein oder mehre
re Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deleti
on(en) verändert sein, wobei Funktionalität bzw. Wirksamkeit
der Promotoren erhalten bleiben kann oder, je nach Bedarf,
verändert werden kann. So können die Promotoren durch Verän
derung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder kom
plett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen
ausgetauscht werden. Unter Derivaten sind erfindungsgemäß
auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Be
reich -1 bis -1000 vor dem Startkodon so verändert wurden,
daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verän
dert, bevorzugt erhöht, wird.
Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen,
die vorzugsweise am 3'-Ende verändert wurden. Als solche
"Tags" sind in der Literatur z. B. Hexa-Histidin-Anker be
kannt oder Epitope, die als Antigene verschiedener Antikörper
erkannt werden können (Studier et al., Meth. Enzymol., 185,
1990: 60-89 und Ausubel et al. (eds.) 1998, Current Proto
cols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).
und/oder mindestens eine Signalsequenz zum Transport des
translatierten Proteins, bspw. in eine bestimmte Zellorganel
le oder in den extrazellulären Raum.
Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekon
strukt oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, bspw. gemäß
Fig. 8, 10 oder 12 bzw. deren Derivate, Varianten, Homolo
ge oder insbesondere Fragmente auch in therapeutisch oder
diagnostisch geeigneter Form exprimiert werden. Zur Generie
rung des rekombinanten Proteins können Vektorsysteme oder O
ligonukleotide verwendet werden, die die Nukleinsäuren oder
das Nukleinsäurekonstrukt um bestimmte Nukleotidsequenzen
verlängern und damit für veränderte Polypeptide kodieren, die
bspw. einer einfacheren Reinigung dienen.
Bevorzugt sind weiterhin DNA-Sequenzen, die eine der in Fig.
8, 10 oder 12 angegebenen (c)DNA-Sequenzen enthalten (An
spruch 4).
Weiterhin werden erfindungsgemäß vorzugsweise alle DNA-
Sequenzen mitoffenbart, die für ein Protein codieren, das im
wesentlichen der Aminosäuresequenz der Proteine 15B3, 15B3-1
oder 15B3-2 gemäß Fig. 9, 11 oder 13 entspricht. Diese
DNA-Sequenzen erhalten nur eine geringe Zahl an Veränderungen
gegenüber der in den vorgenannten Figuren angegebenen Sequen
zen, bspw. kann es sich um Isoformen handeln. Die Zahl der
Sequenzveränderungen wird typischerweise nicht größer als 10
sein. Derartige im wesentlichen mit den für die Proteine
15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 codierenden DNA-Sequenzen entspre
chenden DNA-Sequenzen, die gleichfalls für ein biologisch ak
tives Protein codieren, können durch allgemein bekannte Muta
genese-Verfahren erhalten und die biologische Aktivität der
durch die Mutanten codierten Proteine durch Screening-
Verfahren, bspw. Bindungsstudien oder die Fähigkeit zur Aus
prägung der biologischen Funktion, bspw. im Zusammenhang mit
der Apoptose, identifiziert werden. Zu den entsprechenden Mu
tagenese-Verfahren gehören die "site-directed"-Mutagenese,
die die automatisch durchgeführte Synthese eines Primers mit
mindestens einer Basenveränderung vorsieht. Nach der Polymer
sierungsreaktion wird der Heteroduplex-Vektor in einen geeig
netes Zellsystem transferiert (z. B. E.coli) und entsprechend
transformierte Klone isoliert.
Darüber hinaus kommen alle dem Fachmann geläufigen Methoden
für die Herstellung, Modifikation und/oder Detektion von er
findungsgemäßen DNA-Sequenzen, die in vivo, in situ oder in
vitro ausgeführt werden können in Betracht (PCR (Innis et al.
PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications) oder
chemische Synthese). Durch entsprechende PCR-Primer können
bspw. neue Funktionen in eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz
eingeführt werden, wie z. B. Restriktionsschnittstellen, Ter
minationscodons. Hierdurch können erfindungsgemäße Sequenzen
für den Transfer in Klonierungsvektoren entsprechend entwor
fen werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft
Expressionsvektoren oder ein rekombinantes Nukleinsäurekon
strukt, das eine, wie oben beschrieben, erfindungsgemäße Nuk
leinsäuresequenz, typischerweise eine DNA-Sequenz enthält
(Anspruch 5). Vorteilhafterweise werden hierbei die erfin
dungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit mindestens einem gene
tischen Regulationselement, wie bspw. Transkriptions- und
Translationssignalen, funktionell verknüpft. Diese Verknüp
fung kann je nach gewünschter Anwendung zu einer nativen Ex
pressionsrate oder auch zu einer Erhöhung bzw. Erniedrigung
der nativen Genexpression führen. Mit den solchermaßen herge
stellten Expressionsvektoren können anschließend Wirtsorganismen
bzw. Wirtszellen transformiert werden, z. B. Zellkultu
ren aus Säugetierzellen.
Bei dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor wird (werden) ty
pischerweise das (die) native(n) Regulationselement(e) einge
setzt werden, d. h. die bspw. Promotor und/oder Enhancer-
Region des Gens für das Protein 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2,
bspw. aus Säugetieren, insbesondere entsprechende humane Re
gulationssequenzen. Ggf. können diese nativen 15B3-, 15B3-1
oder 15B3-2-Regulationssequenzen auch genetisch verändert
sein, um eine veränderte Expressionsintensität hervorzurufen.
Zusätzlich zu diesen nativen 15B3-, 15B3-1- oder 15B3-2-
Regulationssequenzen oder anstelle dieser nativen 15B3-,
15B3-1- oder 15B3-2-Regulationssequenzen können für andere Ge
ne native Regulationselemente erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
vor- und/oder nachgeschaltet (5'- oder 3'-
Regulationssequenzen) sein und gegebenenfalls auch genetisch
verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation unter
der Kontrolle der 15B3-, 15B3-1- oder 15B3-2-
Regulationssequenzen ausgeschaltet ist und die Expression der
Gene - je nach Wunsch - hierdurch erhöht oder erniedrigt wer
den kann.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße
Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-,
trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-,
T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, l-PR- oder im l-PL-Promotor
enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien
Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen
sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren wie amy
und SPO2, in den Hefepromotoren wie ADC1, MFa, AC, P-60,
CYC1, GAPDH oder in Mammaliapromotoren wie CaM-KinaseII, CMV,
Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, beta-Globin, GFAP, GAP43, Tyrosin
Hydroxylase, Kainat-Rezeptor-Untereinheit 1, Glutamat-
Rezeptor-Untereinheit B enthalten. Prinzipiell können alle
natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die
bspw. oben genannten für einen erfindungsgemäße Expressions
vektor verwendet werden.
Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteil
haft verwendet werden. Diese regulatorischen Sequenzen sollen
die gezielte Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäurese
quenzen ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirts
organismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion expri
miert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert
und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen
bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression posi
tiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstär
kung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der
Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptions
signale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden.
Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation mög
lich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert
wird.
Als Regulationssequenzen werden alle dem Fachmann geläufigen
Elemente bezeichnet, die auf der Transkriptions- und/oder
Translationsebene die Expression der erfindungsgemäßen Se
quenzen beeinflussen können. Insbesondere sind dabei neben
Promotorsequenzen sog. "Enhancer"-Sequenzen hervorzuheben,
die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-
Polymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken können.
Als weitere Regulationssequenzen seien beispielhaft die sog.
"Locus Control Regions", "Silencer" oder jeweilige Teilse
quenzen davon genannt. Diese Sequenzen können vorteilhaft für
eine gewebespezifische Expression verwendet werden. Auch sog.
Terminatorsequenzen werden vorteilhafterweise in einem erfin
dungsgemäßen Expressionsvektor vorhanden sein und erfindungs
gemäß unter den Terminus "Regulationssequenz" subsumiert.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
ist die Verknüpfung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
mit einem Promotor, wobei der Promotor typisch 5' "upstream"
von einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz zu liegen kommt. Wei
tere Regulationssignale, wie bspw. 3'-gelegene Terminatoren,
Polyadenylierungssignale oder Enhancer, können funktionell in
dem Expressionsvektor enthalten sein. Darüber hinaus können
erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen, insbesondere für die
Sequenzen gemäß Fig. 8, 10 oder 12 bzw. für die entspre
chenden Proteine, in einer oder mehreren Kopien in einem Gen
konstrukt nach dieser Erfindung enthalten sein, oder ggf.
auch auf getrennten Genkonstrukten lokalisiert sein.
Unter den Begriff "Expressionsvektor" fallen sowohl rekombi
nante Nukleinsäurekonstrukte bzw. Genkonstrukte, wie zuvor
beschrieben, als auch komplette Vektorkonstrukte, die neben
erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und etwaigen Regulationsse
quenzen typischerweise auch weitere Elemente enthalten. Diese
Vektorkonstrukte oder Vektoren werden zur Expression in einem
geeigneten Wirtsorganismus verwendet. Vorteilhafterweise wird
mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, bspw. das 15B3-
Gen oder eine Teilsequenz des 15B3-Gens, in einen wirtsspezi
fischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der
Gene im ausgesuchten Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fach
mann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vec
tors" (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New Y
ork-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Unter
Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann
bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40,
CMV, Baculovirus, Adenovirus, Sindbisvirus, Transposons, IS-
Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkulä
re DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirts
organismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Für
die Integration in Mammalia wird typischerweise lineare DNA
verwendet.
Die Expression erfindungsgemäßer Nukleinsäuresequenzen kann
vorteilhaft durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch
Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die Genexpression
positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung
regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkription
sebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale, wie
Promotoren und Enhancer, verwendet werden. Daneben ist aber
auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem bei
spielsweise die Stabilität der mRNA verbessert oder die Able
seeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird. Zur Er
höhung der Genkopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen o
der homologe Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment
bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die
den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen
oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere
werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Ge
nexpression verstärken.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen können zusammen mit
den für interagierende oder für potentiell interagierende
Proteine kodierenden Sequenzen in einen einzelnen Vektor klo
niert werden und anschließend in vitro in einer Wirtszelle
oder in vivo in einem Wirtsorganismus exprimiert werden. Al
ternativ kann auch jede der potentiell interagierenden Nuk
leinsäuresequenzen und die für 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 ko
dierenden Sequenzen in je einen einzelnen Vektor gebracht und
diese getrennt in den jeweiligen Organismus über übliche Me
thoden, wie bspw. Transformation, Transfektion, Transduktion,
Elektroporation oder Partikel-Gun verbracht werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann mindes
tens ein Marker-Gen (bspw. Antibiotika-Resistenz-Gene
und/oder Gene, die für ein fluoreszierendes Protein kodieren,
insbesondere GFP) in einem erfindungsgemäßen Expressionsvek
tor, insbesondere einem kompletten Vektorkonstrukt, enthalten
sein.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft
Wirtszellen, die mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz
und/oder einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor, insbeson
dere einem Vektorkonstrukt transformiert sind (Anspruch 6).
Als Wirtszellen sind prinzipiell alle Zellen geeignet, die
eine Expression erfindungsgemäßer DNA-Sequenzen allein oder
im Verbund mit weiteren Sequenzen, insbesondere Regulations
sequenzen, gestatten. Als Wirtszellen kommen alle Zellen pro-
oder eukaryontischer Natur in Betracht, beispielsweise Bakte
rien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen. Bevor
zugte Wirtszellen sind Bakterien, wie Escherichia coli,
Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikro
organismen, wie Aspergillus oder Saccharomyces cerevisiae o
der die gewöhnliche Bäckerhefe (Stinchcomb et al., Nature,
282: 39, (1997)).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch zur Expres
sion von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen Zellen aus multizel
lulären Organismen gewählt. Dies geschieht auch vor dem Hin
tergrund einer möglicherweise erforderlichen Glykosylierung
(N- und/oder O-gekoppelt) der codierten Proteine. Diese Funk
tion kann in höheren Eukaryotenzellen - im Vergleich zu Prokaryotenzellen
- in geeigneter Weise ausgeführt werden. Im Prin
zip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur als Wirtszelle
verfügbar, wenn auch Zellen von Säugern, beispielsweise Affen,
Ratten, Hamstern oder Menschen, ganz besonders bevorzugt sind.
Dem Fachmann ist eine Vielzahl von etablierten Zellinien be
kannt. In einer keineswegs abschließenden Aufzählung werden
die folgenden Zellinien genannt: 293T (Embryonennierenzelli
nie), (Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1997)), BHK (Ba
byhamsternierenzellen), CHO (Zellen aus den Hamsterovarien),
(Urlaub und Chasin, P. N. A. S. (USA) 77: 4216, (1980)), HeLa
(humane Cervixkarzinomzellen) und weitere - insbesondere für
den Laboreinsatz etablierte - Zellinien, wie bspw. HEK293-,
Sf9- oder COS-Zellen. Ganz besonders bevorzugt sind humane
Zellen, insbesondere Zellen des Immunsystems oder adulte
Stammzellen, bspw. Stammzellen des Blut bildenden Systems (aus
dem Knochenmark) (Anspruch 7). Humane erfindungsgemäße trans
formierte Zellen, insbesondere autologe Zellen des Patienten,
eignen sich nach (vor allem ex vivo) Transformation mit er
findungsgemäßen DNA-Sequenzen oder erfindungsgemäßen Expres
sionsvektoren, ganz besonders als Arzneimittel für bspw.
gentherapeutische Zwecke, also nach Durchführung einer Zell
entnahme, ggf. ex vivo Expansion, Transformation, Selektion
und abschließender Retransplantation.
Die Kombination aus einer Wirtszelle und einem zu den Wirts
zellen passenden erfindungsgemäßen Expressionsvektor, wie
Plasmide, Viren oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit
dem RNA-Polymerase/Promoter System, die Phagen l, Mu oder an
dere temperänte Phagen oder Transposons, und/oder weiteren
vorteilhaften regulatorischen Sequenzen, bilden eine erfin
dungsgemäße Wirtszelle, die als Expressionssystem dienen
kann. Bevorzugte erfindungsgemäße Expressionssysteme auf der
Basis erfindungsgemäßer Wirtszellen sind beispielsweise die
Kombination aus Säugetierzellen, wie bspw. CHO-Zellen, und
Vektoren, wie bspw. pcDNA3neo-Vektor, oder bspw. HEK293-
Zellen und CMV-Vektor, die für Säugetierzellen besonders ge
eignet sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die Gen
produkte der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (Anspruch 8). Un
ter Genprodukten versteht man im Sinne dieser Erfindung sowohl
Primärtranskripte, also RNA, vorzugsweise mRNA, als auch Pro
teine bzw. Polypeptide, insbesondere in aufgereinigter Form
(Anspruch 9). Diese Proteine weisen erfindungsgemäß mindestens
eine LRR-Sequenz, vorzugsweise mindestens 5, stärker bevorzugt
mindestens 8 und am stärksten bevorzugt 10 oder sogar mehr als
10 LRR-Sequenzen auf und regulieren oder transportieren insbe
sondere apoptotische oder nekrotische, ggf. auch inflammatori
sche Signale oder Signale, die das Zellwachstum oder die Zell
plastizität betreffen. Typischerweise sind sie an der
Signaltransduktion über die Ras-Kaskade unmittelbar oder mit
telbar beteiligt. Bevorzugt ist ein aufgereinigtes Genprodukt
dann, wenn es mindestens eine der in Fig. 4 angegebenen (und
auch in den Fig. 9, 11 und 13 enthaltenen Aminosäurese
quenzen (für eine LRR-Domäne), oder ein funktionshomologes
oder die Funktion inhibierendes (infunktionelles) Allel,
Fragment, Analoges oder Derivat dieser Sequenz enthält (An
spruch 10) oder typischerweise aus einer solchen Aminosäure
sequenz besteht. Funktionshomologie wird im Sinne der vorlie
genden Erfindung so definiert, daß mindestens noch eine der
wesentlichen funktionellen Eigenschaften der gemäß Fig. 9,
11 oder 13 dargestellten Proteine 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2
erhalten bleibt. Typischerweise werden funktionshomologe er
findungsgemäße Proteine insbesondere eine charakteristische,
bspw. mindestens 60%ige, vorzugsweise mindestens 80%ige Se
quenzidentität in den als Leucin reichen Regionen (LRRs) be
zeichneten Sequenzabschnitten, die Protein-
Interaktionsdomänen darstellen und typischerweise 20-28 Ami
nosäuren mit einer spezifischen Kernkonsensus-Sequenz von
Leucinen und Asparaginen (LXXLXLXXN) aufweisen. Typischerwei
se wird ein erfindungsgemäßes funktionshomologes Allel, Deri
vat oder Analogon der in den Fig. 9, 11 oder 13 offenbar
ten Aminosäure-Sequenzen mindestens vier, vorzugsweise min
destens 6 und noch stärker bevorzugt mindestens 8 LRRs mit
den vorgenannten Konsensus-Sequenzen aufweisen.
Unter einem Derivat werden dabei insbesondere solche AS-
Sequenzen verstanden, die durch Modifikationen ihrer Seiten
ketten verändert sind. Bspw. durch Konjugation eines Antikör
pers, Enzyms oder Rezeptors an eine erfindungsgemäße AS-
Sequenz. Derivate können aber auch die Kopplung eines Zuckers
oder Fett(säure)-restes oder einer Phosphatgruppe oder jeder
beliebigen Modifikation einer Seitenkette, insbesondere einer
freien OH-Gruppe oder NH2-Gruppe oder am N- oder C-Terminus.
Darüber hinaus schließt der Begriff "Derivat" auch Fusions
proteine ein, bei denen also eine erfindungsgemäße Aminosäu
resequenz an beliebige Oligo- oder Polypeptide gekoppelt ist.
Als "Analoge" werden Sequenzen bezeichnet, die sich durch
mindestens eine AS-Veränderung gegenüber der nativen Sequenz
auszeichnen (Insertion, Substitution). Im Rahmen der vorlie
genden Erfindung sind solche konservativen Substitutionen be
vorzugt, bei denen der physikochemische Charakter (Raumerfül
lung, Basizität, Hydrophobizität etc.) der ausgetauschten AS
erhalten bleibt (polare AS, lange aliphatische Kette, kurze
aliphatische Kette, negativ oder positiv geladene AS, AS mit
aromatischer Gruppe). Die Substitutionen können biologisch
funktionelle, tw. Funktionelle oder biologisch infunktionelle
Sequenzen ergeben. Beispielsweise können Argininreste gegen
Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste
gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht werden. Es
können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Rei
henfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder
es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert
werden. Die solchermaßen gegenüber den in Fig. 9, 11 oder 13
veränderten Proteine besitzen typischerweise wenigstens 60%,
bevorzugt wenigstens 70% und besonders bevorzugt wenigstens
90% Sequenzidentität zu den Sequenzen in den vorgenannten
Figuren, berechnet nach dem Algorithmus von Altschul et al.
(J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990. Das isolierte Protein
und seine funktionellen Varianten lassen sich vorteilhafter
weise aus dem Gehirn von Mammalia wie Homo sapiens, Rattus
norvegicus oder Mus musculus isolieren. Auch Homologe aus an
deren Mammalia sind unter funktionellen Varianten zu verste
hen.
Bevorzugt sind erfindungsgemäß Analoge dann, wenn die Sekun
därstruktur, wie sie in der nativen Sequenz auftritt, auch
bei ihnen erhalten bleibt. Neben konservative Substitutionen
können auch weniger konservative AS-Variationen erfindungsge
mäß in die native Sequenz eingeführt werden. Dabei behalten
sie typischerweise ihre biologische Funktion, insbesondere
als Transduktor eines apoptotischen oder nekrotischen,
zellproliferativen, wachstumsindizierenden oder regenerativen
Signals, bei. Der Effekt einer Substitution oder Deletion
kann ohne weiteres durch entsprechende Untersuchungen, bspw.
Bindungsassays oder zytotoxische Tests, überprüft werden.
Gleichwohl werden erfindungsgemäß aber auch Sequenzen einbe
zogen, die einen sogenannten dominant-negativen Effekt her
vorrufen, d. h. auf Grund ihre veränderten Primärsequenz zwar
noch Bindungsaktivität an eine in der Kaskade stromaufwärts
gelegene Sequenz aufweisen, das Signal aber nicht stromabwärts
weitergeben können. Derartige Analoge fungieren daher
als Inhibitoren der biologischen Funktion, insbesondere als
Inhibitoren der Apoptose, des Zellwachstums, der Zellprolife
ration, der Zellplastizität oder der Zellregeneration. Derar
tige Analoge werden durch gentechnische Maßnahmen herge
stellt, und zwar typischerweise durch die sog. "site-
directed"-Mutagenese einer DNA-Sequenz, die für ein erfin
dunsgemäßes Protein (typischerweise 15B3, 15B3-1 oder 15B3-
2), codiert. Hierdurch wird die dem Analogen zugrundliegende
DNA-Sequenz hergestellt, die schließlich das Protein in einer
rekombinanten Zellkultur exprimieren kann (Sambrook et al.,
1989, s. o.). Auch alle Derivate der vorbeschriebenen Analoge
werden mitoffenbart, genauso wie die den vorbeschriebenen AS-
Sequenzen zugrundeliegenden DNA-Sequenzen.
Weiterhin gehören auch Fragmente einer nativen erfindungsge
mäßen AS-Sequenz zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Fragmente zeichnen sich durch Deletionen aus (N- oder C-
terminal oder auch intrasequentiell). Sie können einen domi
nant-negativen oder dominant-positiven Effekt haben.
Zu den erfindungsgemäßen Genprodukten (Proteinen) gehören aber
auch all jene Genprodukte (Proteine), die sich erfindungsgemäß
von DNA-Derivaten, DNA-Fragmenten oder DNA-Allelen der in den
Fig. 8, 10 oder 12 angegebenen DNA-Sequenzen nach
Transkription und Translation ableiten.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Proteine chemisch
modifiziert sein. So etwa kann eine Schutzgruppe am N-Terminus
vorliegen. Es können Glykosylgruppen an Hydroxyl- oder Ami
nogruppen angefügt sein, Lipide können kovalent mit dem erfin
dungsgemäßen Protein verbunden sein, ebenso Phosphate oder A
cetylgruppen und ähnliches. Auch beliebige chemische Substanzen,
Verbindungen oder Gruppen können auf einem beliebigen
Syntheseweg an das erfindungsgemäße Protein gebunden sein.
Auch zusätzliche Aminosäuren, z. B. in Form einzelner Aminosäu
ren oder in Form von Peptiden oder in Form von Proteindomänen
und ähnliches, können mit dem N- und/oder C-Terminus eines er
findungsgemäßen Proteins, insbesondere aber auch an den N- o
der C-Terminus einer Leucin reichen Domäne, fusioniert sein,
ggf. aber auch in die Sequenz der erfindungsgemäßen Leucin
reichen Domäne integriert sein.
Insbesondere sind hier sogenannte Signal- oder "Leader"-
Sequenzen am N-Terminus der Aminosäuresequenz eines erfin
dungsgemäßen Proteins bevorzugt, die das Peptid cotranslatio
nal oder posttranslational in eine bestimmte Zellorganelle o
der in den extrazellulären Raum (bzw. das Kulturmedium) füh
ren. Am N- oder am C-Terminus können auch Aminosäuresequenzen
vorliegen, die als Antigen die Bindung der erfindungsgemäßen
Aminosäuresequenz an Antikörper erlauben. Zu nennen ist hier
insbesondere das Flag-Peptid, dessen Sequenz im Einbuchstaben
code der Aminosäuren lautet: DYKDDDDK. Oder auch ein His-Tag
mit mindestens 3, vorzugsweise mindestens 6 Histidin-Resten.
Diese Sequenzen haben stark antigene Eigenschaften und erlaubt
somit eine schnelle Überprüfung und leichte Reinigung des re
kombinanten Proteins. Monoklonale Antikörper, die das Flag-
Peptid binden, sind von der Firma Eastman Kodak Co., Scienti
fic Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut erhält
lich.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner mindestens
20, stärker bevorzugt mindestens 30 und noch stärker bevor
zugt mindestens 50 Aminosäuren umfassende Teilabschnitte der
in den Fig. 9, 11 oder 13 offenbarten Sequenzen. Derartige
Teilsequenzen können nach dem Fachmann geläufigen Verfahren
bspw. chemisch synthetisiert werden und können vorzugsweise
als Antigene für die Produktion von Antikörpern eingesetzt
werden. Vorzugsweise wird es sich bei diesen Teilabschnitten
um solche Regionen der in den Fig. 9, 11 oder 13 offenbar
ten Sequenzen handeln, die im räumlichen Modell der Proteine
zumindest teilweise die Proteinoberfläche ausmachen.
Transgene Tiere stellen einen weiteren Gegenstand der vorlie
genden Erfindung dar (Anspruch 11). Bei erfindungsgemäßen
transgenen Tieren handelt es sich um Tiere, die genetisch da
hingehend verändert sind, daß sie eine im Vergleich zum Nor
maltier veränderte Menge eines erfindungsgemäßen Genprodukts
in mindestens einem Gewebe exprimieren bzw. enthalten. Hier
bei sind erfindungsgemäß auch solche Tiere eingeschlossen,
die die nativ vorhandene erfindungsgemäße DNA-Sequenz (a) auf
der genetischen Ebene entweder tw. oder vollständig nicht
mehr aufweisen oder (b) zwar auf der genetischen Ebene erfin
dungsgemäße Sequenzen aufweisen, diese jedoch nicht transkri
bieren und/oder translatieren können und daher das Genprodukt
nicht mehr enthalten. Darüber hinaus kann (können) bei einem
transgenen Tier die native 15B3-Sequenz(en), 15B3-1- oder
15B3-2-Sequenzen) (ob vorhanden oder nicht vorhanden) um
mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz ergänzt bzw.
durch mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz substitu
iert sein. Insbesondere kann es sich bei der (den) substitu
ierten und/oder ergänzten Sequenz(en) um erfindungsgemäße Se
quenzen handeln, die nicht nativer Natur sind.
Die Herstellung von in bezug auf erfindungsgemäße Sequenzen
transgenen und "knock-out" Tieren, insbesondere Mäusen, Rat
ten Schweinen, Fruchtfliegen oder Zebrafischen, erfolgt auf
dem Fachmann geläufige Weise. Hierzu wird z. B. eine 15B3,
15B3-1 oder 15B3-2 cDNA Sequenz oder native oder nicht-native
Variante in transgenen Mäusen exprimiert, z. B. unter einem
NSE-Promotor in Neuronen, unter einem MBP-Promotor in Oligo
dendrozyten etc. Die genetisch veränderten Tiere können da
nach in unterschiedlichen Krankheitsmodellen untersucht wer
den (z. B. experimentell herbeigeführtem Schlaganfall, MCAO).
Die Herstellung von "knock-out" Tieren kann zudem Hinweise
auf die Auswirkungen von Inhibitoren auf den Gesamtorganismen
liefern, da ein "knock out Modell" insoweit der Inhibition
erfindungsgemäßer nativer Sequenzen entspricht.
Sämtliche multizellulären Organismen können erfindungsgemäß
transgen ausgestaltet sein, insbesondere Säugetiere, bspw.
Mäuse, Ratten, Schafe, Rinder oder Schweine. Auch transgene
Pflanzen sind im Prinzip denkbar. Bei den transgenen Organis
men kann es sich auch um sogenannte "Knock-Out"-Tiere han
deln. Dabei können die transgenen Tiere eine funktionelle o
der nicht funktionelle erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäure
konstrukt allein oder in Kombination mit einer funktionellen
oder nicht funktionellen Sequenz, die für 15B3 Proteine ko
diert, enthalten.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung der oben be
schriebenen transgenen Tiere sind transgene Tiere, in deren
Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somati
schen Zellen oder in deren Keimzellen oder der Gesamtheit o
der einem Teil der somatischen Zellen die native(n) 15B3-
Nukleotidsequenz(en) durch gentechnische Verfahren verändert
oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbrochen wurden.
Eine weitere Möglichkeit des Einsatzes einer erfindungsgemä
ßen Nukleotidsequenz oder Teilen davon ist die Erzeugung
transgener oder knock-out- oder konditioneller oder regionenspezifischer
knock-out Tiere oder spezifischer Mutationen
bei gentechnisch veränderten Tieren (Ausubel et al. (eds.)
1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons, New York und Torres et al., (eds.) 1997, Laboratory
protocols for conditional gene targeting, Oxford University
Press, Oxford).
Über transgene Überexpression oder genetische Mutation (Null
mutation oder spezifische Deletionen, Insertionen oder Verän
derungen) durch homologe Rekombination in embryonalen Stamm
zellen kann man Tiermodelle erzeugen, die wertvolle weitere
Informationen über die (Patho-)Physiologie der erfindungsge
mäßen Sequenzen liefern. Solchermaßen hergestellte Tiermodel
le können essentielle Testsysteme zur Evaluierung neuartiger
Therapeutika darstellen, die die biologische Funktion von
Proteinen gemäß Fig. 9, 11 oder 13 für neurale, vaskuläre
oder andere Prozesse beeinflussen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein
Antikörper, der ein Epitop auf einem erfindungsgemäßen Gen
produkt, insbesondere einem erfindungsgemäßen Protein gemäß
Fig. 9, 11 oder 13 oder Derivaten, Fragmenten oder Isofor
men oder Allelen, erkennt (Anspruch 12), aber auch gegen z. B.
erfindungsgemäße mRNA gerichtet sein kann. Der Begriff "Anti
körper" umfaßt i. S. der vorliegenden Erfindung sowohl po
lyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper (An
spruch 13), chimärische Antikörper, anti-idiotypische Anti
körper (gerichtet gegen erfindungsgemäße Antikörper), die al
le in gebundener oder löslicher Form vorliegen und ggf. durch
"Label" markiert sein können, sowie auch Fragmente der vorge
nannten Antikörper. Neben den Fragmenten von erfindungsgemä
ßen Antikörpern in Alleinstellung können erfindungsgemäße An
tikörper auch in rekombinanter Form als Fusionsproteine mit
anderen (Protein)-Bestandteilen auftreten. Fragmente als sol
che oder Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern als Be
standteile von Fusionsproteinen werden typischerweise durch
die Methoden enzymatischer Spaltung, der Protein-Synthese o
der die dem Fachmann geläufigen Rekombinationsmethoden herge
stellt. Als Antikörper werden nach der vorliegenden Erfindung
also sowohl polyklonale, monoklonale, humane oder humanisier
te oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, single
chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper bezeich
net.
Bei den polyklonalen Antikörpern handelt es sich um heteroge
ne Mischungen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tie
ren hergestellt werden, die mit einem Antigen immunisiert
worden sind. Zum Gegenstand der Erfindung gehören aber auch
polyklonale monospezifische Antikörper, die nach Aufreinigung
der Antikörper (bspw. über eine Säule, die mit Peptiden eines
spezifischen Epitops beladen sind) erhalten werden. Ein mo
noklonaler Antikörper enthält eine im wesentlichen homogene
Population von Antikörpern, die spezifisch gegen Antigene ge
richtet sind, wobei die Antikörper im wesentlichen gleiche
Epitop-Bindungsstellen aufweisen. Monoklonale Antikörper kön
nen durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren erhal
ten werden (z. B. Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-397,
(1975); US-Patent 4,376,110; Ausubel et al., Harlow und Lane
"Antikörper": Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Labora
tory (1988); Ausubel et al., (eds), 1998, Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Die in
den vorgenannten Literaturstellen enthaltene Beschreibung
wird als Bestandteil der vorliegenden Erfindung in die Offen
barung der vorliegenden Erfindung einbezogen.
Auch lassen sich gentechnisch manipulierte erfindungsgemäße
Antikörper nach Verfahren, wie in den vorgenannten Druck
schriften beschrieben herstellen. Kurz gesagt, werden dazu
Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei
ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse mit
Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion
mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopro
panol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter
Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen
Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die syntheti
sierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation
beispielsweise durch "site directed mutagenesis", Einführung
von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche
in geeignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale
Vektoren inseriert und in den entsprechenden Wirtsorganismen
exprimiert werden. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe
Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-
Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakte
rien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisi
ae. Spezifische Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Prote
ine können sich sowohl als diagnostische Reagenzien als auch
als Therapeutika bei Erkrankungen eignen, bei denen 15B3 von
pathophysiologischer Bedeutung ist.
Erfindungsgemäße Antikörper können einer der folgenden Im
munglobulinklassen angehören: IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und
ggf. einer Unterklasse der vorgenannten Klassen, wie die Sub
klassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt
sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG1, IgG2,
IgG2a, IgG2b, IgG3 oder IgGM. Besonders bevorzugt sind die
IgG Subtypen IgG1/k oder IgG2b/k. Ein Hybridom-Zellklon, der
erfindungsgemäße monoklonale Antikörper produziert, kann in
vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung
von großen Titern an monoklonalen Antikörpern erfolgt
vorzugsweise in vivo oder in situ.
Bei den erfindungsgemäßen chimärischen Antikörpern handelt es
sich um Moleküle, die verschiedene Bestandteile enthalten,
wobei diese sich aus verschiedenen Tierarten ableiten (z. B.
Antikörper, die eine variable Region, die aus einem Mäuse
monoklonalen Antikörper abgeleitet ist, und eine konstante
Region eines humanen Immunglobulins aufweisen). Chimärische
Antikörper werden vorzugsweise eingesetzt, um einerseits die
Immunogenizität bei der Anwendung zu reduzieren und anderer
seits die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, z. B. erge
ben murine monoklonale Antikörper höhere Ausbeuten aus Hybri
dom-Zellinien, führen aber auch zu einer höheren Immunogeni
zität beim Menschen, so daß human/murine chimärische Antikör
per vorzugsweise eingesetzt werden. Chimärische Antikörper
und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus dem Stand der
Technik bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Sci. USA 81:
3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA
81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312, 643-646
(1984); Cabilly et al., EP-A-125023; Neuberger et al., Nature
314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., EP-A-171496; Morrion
et al., EP-A-173494; Neuberger et al., WO 86/01533; Kudo et
al., EP-A-184187; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074
(1986); Robinson et al., WO 87/02671; Liu et al., Proc. Natl.
Acad. Sci USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl.
Acad. Sci USA 84: 214-218 (1987); Better et al., Science 240:
1041-1043 (1988) und Harlow und Lane, Antikörper: A Laborato
ry Manual, wie oben zitiert. Diese Zitatstellen werden als
zur Offenbarung gehörig in die vorliegende Erfindung einbezo
gen.
Ganz besonders bevorzugt wird ein solcher erfindungsgemäßer
Antikörper gegen einen Leucin reichen Sequenzabschnitt auf
einem Protein gemäß Fig. 9, 11 oder 13 als Epitop gerich
tet sein (Anspruch 14).
Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper ist ein
Antikörper, der eine Determinante, die im allgemeinen mit der
Antigenbindungsstelle eines erfindungsgemäßen Antikörpers as
soziiert ist, erkennt. Ein anti-idiotypischer Antikörper kann
durch die Immunisierung eines Tieres der gleichen Art und des
gleichen genetischen Typs (z. B. eines Mäusestamms) als Aus
gangspunkt für einen monoklonalen Antikörper, gegen welchen
ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper gerichtet
ist, hergestellt werden. Das immunisierte Tier wird die idio
typischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers durch
die Produktion eines Antikörpers, der gegen die idiotypischen
Determinanten gerichtet ist (nämlich ein erfindungsgemäßer
anti-idiotypischer Antikörper), erkennen (U. S. 4,699,880).
Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper kann auch
als Immunogen eingesetzt werden, um eine Immunantwort in ei
nem weiteren Tier hervorzurufen und um dort zur Produktion
eines sog. anti-anti-idiotypischen Antikörpers zu führen. Der
anti-anti-idiotypische Antikörper kann, muß aber nicht, be
züglich seiner Epitop-Konstruktion identisch mit dem originä
ren monoklonalen Antikörper sein, der die anti-idiotypische
Reaktion hervorgerufen hat. Auf diese Weise können durch die
Verwendung von gegen idiotypische Determinanten eines mo
noklonalen Antikörpers gerichtete Antikörper andere Klone,
die Antikörper von identischer Spezifität exprimieren, iden
tifiziert werden.
Monoklonale Antikörper, die gegen erfindungsgemäße Proteine,
Analoge, Fragmente oder Derivate dieser erfindungsgemäßen
Proteine gerichtet sind, können eingesetzt werden, um die
Bindung von anti-idiotypischen Antikörpern in entsprechenden
Tieren, wie z. B. der BALB/c Maus, zu induzieren. Zellen aus
der Milz einer solchen immunisierten Maus können verwendet
werden, um anti-idiotypische Hybridom-Zellinien, die anti-
idiotypische monoklonale Antikörper sekretieren, zu produzie
ren. Weiterhin können anti-idiotypische monoklonale Antikör
per auch an einen Träger gekoppelt werden (KLH, "keyhole lim
pet hemocyanin") und dann verwendet werden, um weitere
BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Die Sera dieser Mäuse enthalten
dann anti-anti-idiotypische Antikörper, die die Bindungsei
genschaften der originären monoklonalen Antikörper haben und
spezifisch für ein Epitop des erfindungsgemäßen Proteins oder
eines Fragments oder Derivats von demselben sind. Die anti-
idiotypischen monoklonalen Antikörper haben auf diese Weise
ihre eigenen idiotypischen Epitope oder "Idiotope", die
strukturell mit dem zu untersuchenden Epitop ähnlich sind.
Die Bezeichnung "Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als
auch Fragmente derselben einschließen. Als Fragmente seien
alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit ei
ner oder zwei dem Antigen-komplementären Bindungsstellen, wie
Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von
leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-,
Fab- oder F(ab')2-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, ge
nannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-,
Fab- oder F(ab')2. Fab- und F(ab')2-Fragmente entbehren ei
nes Fc-Fragments, wie etwa in einem intakten Antikörper
vorhanden, so daß sie im Blutkreislauf schneller
transportiert werden können und vergleichsweise weniger
nicht-spezifische Gewebsbindung als intakte Antikörper
aufweisen. Hierbei wird hervorgehoben, daß Fab- und F(ab')2-
Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern bei der Detektion
und Quantifizierung von erfindungsgemäßen Proteinen
erfindungsgemäßen Proteinen eingesetzt werden können. Solche
Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung
hergestellt, indem Enzyme, wie z. B. Papain (zur Herstellung
von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab')2-
Fragmenten) verwendet werden, oder durch chemische Oxidation
oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene er
halten werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Mischungen
von Antikörpern im Sinne der vorliegenden Erfindung. Neben
den Antikörpern können auch Mischungen von Antikörpern für
alle gemäß der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren
oder Verwendungen eingesetzt werden. Sowohl gereinigte Frak
tionen monoklonaler Antikörper, polyklonale Antikörper oder
Mischungen monoklonaler Antikörper kommen als Arzneimittel
zum Einsatz und finden Verwendung bei der Herstellung von
Arzneimitteln zur Behandlung von cerebralen Ischämien (z. B.
Schlaganfall), degenerativen Erkrankungen, insbesondere neu
rodegenerativen Erkrankungen, und neurologischen Erkrankun
gen, wie z. B. Epilepsie, wie auch Tumorerkrankungen.
Erfindungsgemäße Antikörper, einschließlich der Fragmente von
diesen Antikörpern, bzw. deren Mischungen können zur quanti
tativen oder qualitativen Detektion von erfindungsgemäßem
Genprodukt, insbesondere Proteinen gemäß Fig. 9, 11 oder
13 oder deren Fragmente oder Derivate, in einer Probe einge
setzt werden oder auch zur Detektion von Zellen, die erfin
dungsgemäße Proteine exprimieren und ggf. sekretieren. Inso
weit wird die Verwendung erfindungsgemäßer Antikörper als Di
agnostika offenbart. So kann etwa über erfindungsgemäße Anti
körper die Menge an erfindungsgemäßem Genprodukt und u. U. de
ren Aktivität (z. B. spezifische Phosphorylierungen) der Pro
teine gemäß Fig. 9, 11 oder 13 bestimmt werden. Die Detektion
kann mit Hilfe von Immunofluoreszenz-Verfahren erreicht
werden, die Fluoreszenz-markierte Antikörper in Kombination
mit Lichtmikroskopie, Flußzytometrie oder fluorometrischer
Detektion durchgeführt werden.
Erfindungsgemäße Antikörper im Sinne der Erfindung (dies
schließt Fragmente dieser Antikörper ein oder auch Mischungen
von Antikörpern) eignen sich für histologische Untersuchun
gen, wie z. B. im Rahmen der Immunofluoreszenz oder Immunoe
lektromikroskopie, für die in situ Detektion eines erfin
dungsgemäßen Proteins. Die in situ Detektion kann dadurch er
folgen, daß eine histologische Probe von einem Patienten ge
nommen wird und markierte erfindungsgemäße Antikörper zu ei
ner solchen Probe hinzugegeben werden. Der Antikörper (oder
ein Fragment dieses Antikörpers) wird in markierter Form auf
die biologische Probe aufgetragen. Auf diese Weise ist es
nicht nur möglich, die Anwesenheit von erfindungsgemäßem Pro
tein in der Probe zu bestimmen, sondern auch die Verteilung
des erfindungsgemäßen Proteins in dem untersuchten Gewebe.
Bei der biologischen Probe kann es sich um eine biologische
Flüssigkeit, ein Gewebeextrakt, geerntete Zellen, wie z. B.
Immunzellen oder Herzmuskel- oder Leberzellen, oder allgemein
um Zellen, die in einer Gewebekultur inkubiert worden sind,
handeln. Die Detektion des markierten Antikörpers kann je
nach Art der Markierung durch im Stand der Technik bekannte
Verfahren (z. B. durch Fluoreszenzverfahren) erfolgen. Die
biologische Probe kann aber auch auf einem Festphasenträger,
wie z. B. Nitrocellulose oder ein anderes Trägermaterial,
aufgetragen werden, so daß die Zellen, Zellteile oder lösli
chen Proteine immobilisiert werden. Der Träger kann dann mit
einem geeigneten Puffer ein- oder mehrfach gewaschen werden,
wobei nachfolgend mit einem detektierbar markierten Antikör
per nach der vorliegenden Erfindung behandelt wird. Der Festphasenträger
kann dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewa
schen werden, um nicht gebundenen Antikörper zu beseitigen.
Die Menge an gebundener Markierung auf dem Festphasenträger
kann dann mit einem herkömmlichen Verfahren bestimmt werden.
Als Träger eignen sich insbesondere Glas, Polystyrol, Po
lypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon-Amylasen, natürliche
oder modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide und Magnetit.
Der Träger kann entweder bedingt löslichen oder unlöslichen
Charakters sein, um die Bedingungen nach Maßgabe der vorlie
genden Erfindung zu erfüllen. Das Trägermaterial kann belie
bige Formen einnehmen, z. B. in Form von Kügelchen ("beads"),
oder zylindrisch oder sphärisch sein, wobei Polystyrol-
Kügelchen als Träger bevorzugt sind.
Eine detektierbare Antikörpermarkierung kann auf verschiedene
Weise erfolgen. Beispielsweise kann der Antikörper an ein En
zym gebunden werden, wobei das Enzym schließlich in einem Im
munoassay (EIA) eingesetzt werden kann. Das Enzym kann dann
später mit einem entsprechenden Substrat reagieren, so daß
eine chemische Verbindung entsteht, die auf eine dem Fachmann
geläufige Art und Weise detektiert und ggf. quantifiziert
werden kann, z. B. durch Spektrophotometrie, Fluorometrie o
der andere optische Verfahren. Bei dem Enzym kann es sich um
Malat-Dehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, delta-5-Steroid
Isomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, alpha-Glycerophosphat
dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettich-
Peroxidase, alkalische Phosphatase, Aspariginase, Glucoseoxi
dase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase,
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase oder Acetyl
cholinesterase handeln. Die Detektion wird dann über ein
chromogenes Substrat, das spezifisch für das für die Markie
rung eingesetzte Enzym ist, ermöglicht und kann schließlich
z. B. über Sichtvergleich des durch die Enzymreaktion umge
setzten Substrats im Vergleich zu Kontrollstandards erfolgen.
Weiterhin kann die Detektion durch andere Immunoassays si
chergestellt werden, z. B. durch radioaktive Markierung der
Antikörper oder Antikörperfragmente (also durch einen Radi
oimmunoassay (RIA; Laboratory Techniques and Biochemistry in
Molecular Biology, Work, T. et al. North Holland Publishing
Company, New York (1978). Das radioaktive Isotop kann dabei
durch die Verwendung von Szintillationszählern oder durch Au
toradigraphie detektiert und quantifiziert werden.
Fluoreszierende Verbindungen können gleichfalls zur Markie
rung eingesetzt werden, beispielsweise Verbindungen wie Fluo
rescinisothiocyanat, Rhodamin, Phyoerythrin, Phycocyanin, Al
lophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin. Auch fluores
zensemittierende Metalle, wie z. B. 152E oder andere Metalle
aus der Lanthanid-Gruppe, können eingesetzt werden. Diese Me
talle werden an den Antikörper über Chelatgruppen, wie z. B.
Diethylentriaminpentaessigsäure (ETPA) oder EDTA angekoppelt.
Weiterhin kann der erfindungsgemäße Antikörper über eine mit
Hilfe von Chemilumineszenz wirkende Verbindung angekoppelt
werden. Die Gegenwart des Chemilumineszenz-markierten Anti
körpers wird dann über die Lumineszenz, die im Verlauf einer
chemischen Reaktion entsteht, detektiert. Beispiele für der
artige Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, Acridiniu
mester, Imidazol, Acridiniumsalz oder Oxalatester. Gleicher
maßen können auch biolumineszente Verbindungen zum Einsatz
kommen. Biolumineszenz ist eine Unterart der Chemilumines
zenz, die bei biologischen Systemen vorgefunden wird, wobei
ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszen
ten Reaktion verstärkt. Die Detektion des biolumineszenten
Proteins erfolgt wiederum über die Lumineszenz, wobei als biolumineszente
Verbindung beispielsweise Luciferin, Luciferase
oder Aequorin in Betracht kommen.
Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann für die Verwendung in
einem immunometrischen Assay, auch bekannt als "two-site" o
der "sandwich" Assay, zur Anwendung gelangen. Typische immu
nometrische Assay-Systeme schließen sog. "Vorwärts"-Assays
ein, die sich dadurch auszeichnen, daß erfindungsgemäße Anti
körper an ein Festphasensystem gebunden sind und daß der An
tikörper mit der Probe, die untersucht wird, auf diese Weise
in Kontakt gebracht wird. Derart wird das Antigen aus der
Probe durch die Bildung eines binären Festphasen-Antikörper-
Antigen-Komplexes aus der Probe isoliert. Nach einer geeigne
ten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, um den
verbleibenden Rest der flüssigen Probe zu beseitigen, ein
schließlich des ggf. nicht gebundenen Antigens, und daraufhin
mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die eine unbekannte
Menge an markiertem Detektionsantikörper enthält. Der mar
kierte Antikörper dient hierbei als sog. Reporter-Molekül.
Nach einer zweiten Inkubationszeit, die es den markierten An
tikörper erlaubt, mit dem an die Festphase gebundenen Antigen
zu assoziieren, wird der Festphasenträger erneut gewaschen,
um markierte Antikörper, die nicht reagiert haben, zu besei
tigen.
In einer alternativen Assay-Form kann auch ein sog. "sand
wich"-Assay zum Einsatz kommen. Hierbei kann ein einziger In
kubationsschritt ausreichen, wenn der an die Festphase gebun
dene Antikörper und der markierte Antikörper beide gleichzei
tig auf die zu testende Probe aufgebracht werden. Nach
Abschluß der Inkubation wird der Festphasenträger gewaschen,
um Rückstände der flüssigen Probe und der nicht-assoziierten
markierten Antikörper zu beseitigen. Die Anwesenheit von markiertem
Antikörper auf dem Festphasenträger wird genau so be
stimmt, wie bei den konventionellen "Vorwärts"-Sandwich-
Assay. Bei dem sog. reversen Assay wird schrittweise zunächst
eine Lösung des markierten Antikörpers zur Flüssigprobe hin
zugefügt, gefolgt von der Beimischung von nicht-markiertem
Antikörper, gebunden an einen Festphasenträger, nach Ablauf
einer geeigneten Inkubationszeit. Nach einem zweiten Inkuba
tionsschritt wird der Festphasenträger in herkömmlicher Weise
gewaschen, um ihn von Probenüberresten und von markiertem An
tikörper, der nicht reagiert hat, zu befreien. Die Bestimmung
des markierten Antikörpers, der mit dem Festphasenträger rea
giert hat, wird dann, so wie oben beschrieben, durchgeführt.
Nach der vorliegenden Erfindung werden weiterhin Verfahren zur
Expression von erfindungsgemäßen Genprodukten, insbesondere
also von Polypeptiden gemäß Fig. 9, 11 oder 13, einschließ
lich aller Derivate, Analoge und Fragmente, offenbart, wobei
hierfür Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Expressions
vektor transformiert werden (Anspruch 15). Dieses Verfahren
zur Expression von Genprodukten, die auf einer erfindungsgemä
ßen DNA-Sequenz beruhen, dient nicht dazu, das entsprechende
Genprodukt zu konzentrieren und aufzureinigen, sondern viel
mehr dazu, den Zellstoffwechsel durch das Einführen der erfin
dungsgemäßen DNA-Sequenzen über die Expression des dazugehöri
gen Genprodukts zu beeinflussen. Hier ist insbesondere an die
Verwendung der mit Hilfe von Expressionsvektoren transformier
ten Wirtszellen als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines
Arzneimittels, insbesondere zum Zwecke der Behandlung von Er
krankungen, bspw. von Tumorerkrankungen, neurologischen Er
krankungen, neurodegenerativen Erkrankungen (bspw. Multipler
Sklerose, Morbus Parkinson), cerebralen Ischämien (z. B.
Schlaganfall). Allgemein werden erfindungsgemäße Wirtszellen
bei Erkrankungen zur Verfügung gestellt, denen eine Fehlregulation
der Apoptose, der Nekrose, der Zellproliferation, des
Zellwachstums oder der Zellplastizität zugrunde liegt. Die
derart erfindungsgemäß ex vivo transformierten autologen oder
allogenen Wirtszellen können dann Patienten transplantiert
werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird
ein Verfahren zur Isolierung von Genprodukten mit mindestens
einer mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz von 15B3,
15B3-1 oder 15B3-2 zumindest über eine Teilsequenz von mindes
tens 20, vorzugsweise mindestens 30 AS homologen Teilsequenz,
wobei die Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Expressions
vektor transformiert und dann unter geeigneten, die Expression
fördernden Bedingungen kultiviert werden, so daß das Genpro
dukt schließlich aus der Kultur aufgereinigt werden kann (An
spruch 16). Das erfindungsgemäße Genprodukt der erfindungsge
mäßen DNA-Sequenz kann dabei, abhängig von dem Expressionssys
tem, aus einem Kulturmedium oder aus Zellextrakten isoliert
werden. Der Fachmann kann ohne weiteres erkennen, daß die je
weiligen Isolierungsmethoden und das Verfahren bei der Aufrei
nigung des von einer erfindungsgemäßen DNA kodierten, rekombi
nanten Proteins stark vom Typ der Wirtszelle oder auch von dem
Umstand, ob das Protein in das Medium sekretiert wird, ab
hängt. Zum Beispiel können Expressionssysteme eingesetzt wer
den, die zur Sekretion des rekombinanten Proteins aus der
Wirtszelle führen. Das Kulturmedium muß in diesem Fall durch
kommerziell erhältliche Proteinkonzentrationsfilter, z. B. Ami
con oder Millipore Pelicon, aufkonzentriert werden. Nach dem
Konzentrationsschritt kann ein Reinigungsschritt erfolgen,
z. B. ein Gelfiltrationsschritt oder eine Reinigung mit Hilfe
von säulenchromatographische Methoden. Alternativ kann aber
auch ein Anionenaustauscher eingesetzt werden, der eine Matrix
mit DEAE aufweist.
Als Matrix dienen dabei alle aus der Proteinreinigung
bekannten Materialien, z. B. Acrylamid oder Agarose oder
Dextran oder ähnliches. Es kann aber auch ein
Kationenaustauscher eingesetzt werden, der dann typischerweise
Carboxymethyl-Gruppen enthält. Zur weiteren Reinigung eines
durch eine erfindungsgemäße DNA codierten Polypeptids können
dann HPLC-Schritte dienen. Es kann sich um einen oder mehrere
Schritte handeln. Insbesondere wird die "Reversed-Phase"-
Methode eingesetzt. Diese Schritte dienen zum Erhalt eines im
wesentlichen homogenen rekombinanten Proteins einer
erfindungsgemäßen DNA-Sequenz.
Neben bakteriellen Zellkulturen zur Isolierung des Genprodukts
können auch transformierte Hefezellen eingesetzt werden. In
diesem Fall kann das translatiette Protein sekretiert werden,
so daß die Proteinreinigung vereinfacht wird. Sekretiertes re
kombinantes Protein aus einer Hefewirtszelle kann durch Metho
den erhalten werden, wie sie bei Urdal et al. (J. Chromato.
296: 171 (1994)) offenbart sind und Bestandteil der Offenbarung
der vorliegenden erfindung sind.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen, insbesondere erfin
dungsgemäße DNA-Sequenzen, und/oder erfindungsgemäße Genpro
dukte können als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arz
neimittels Verwendung finden (Anspruch 17). Diese können als
solche verabreicht werden (bspw. bukkal, intravenös, oral,
parenteral, nasal, subkutan) oder in Kombination mit weiteren
Wirk-, Hilfs- oder arzneimitteltypischen Zusatzstoffen. Er
findungsgemäße Nukleinsäure kann als nackte Nukleinsäure,
insbesondere intravenös, injiziert werden oder aber mit Hilfe
von Vektoren dem Patienten verabreicht werden. Bei diesen
Vektoren kann es sich um Plasmide als solche handeln, aber
auch um virale Vektoren, insbesondere retrovirale oder adeno
virale Vektoren, oder auch um Liposomen, die nackte erfin
dungsgemäße DNA oder ein Plasmid, das erfindungsgemäße DNA
enthält, aufweisen können.
Die Verwendung von erfindungsgemäßen Sequenzen, insbesondere
der Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen von 15B3, 15B3-1 oder
15B3-2 bzw. deren Varianten, sowie erfindungsgemäßer Protein
heteromere sowie davon abgeleiteter erfindungsgemäßer Reagen
zien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) kommt somit für
die Herstellung eines Arzneimittels zu therapeutischen Zwe
cken, d. h. zur Behandlung von Erkrankungen, in Betracht. Ganz
besonders bevorzugt ist dabei der therapeutische Einsatz zur
Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Be
handlung von Erkrankungen oder pathophysiologischen Zustän
den, die bspw. auf fehlgesteuerter Regulation der Homöostase
von Zelltod- und Proliferationsereignissen beruhen (Anspruch
18). Durch die erfindungsgemäße Verwendung können Zelltodpro
zesse, z. B. Kaskaden, die zur Apoptose führen, oder Prozesse,
die zur Nekrose führen, in allen Zelltypen, die 158B3, 15B3-1
und/oder 15B3-2 und oder eine native Variante hiervon expri
mieren, insbesondere in neuralen Zellen, beeinflusst werden,
bspw. durch Modulation von Zell-Zell-Interaktionen.
Die nativen erfindungsgemäßen Proteine 15B3, 15B3-1 und 15B3-
2 sind erfindungsgemäß unter anderem Bestandteil des ras-
MAPK-Signaltransduktionswegs, typischerweise als Modulator
desselben, dessen Fehlsteuerung für eine Vielzahl von Erkran
kungen ursächlich ist. Insofern finden sich die vorgenannten
erfindungsgemäßen Proteine insbesondere als Komponenten bei
den folgenden zellulären Prozessen wieder und hat zelluläre
Funktionen bei: Signaltransduktion, Zelldifferenzierung,
Wachstum, Plastizität, Regeneration. Entsprechend kann durch
Infunktionalität eines erfindungsgemäßen Proteins, bspw.
15B3, oder durch infunktionelle Expression oder durch Überex
pression desselben ein pathophysiologischer Zustand ausgelöst
werden, der mit einer Fehlsteuerung bspw. der Zeildifferen
zierung, des Zellwachstums, der Zellplastizität oder der
Zellregeneration einhergeht. Je nach molekularem Mechanismus
der pathophysiologischen Störung kann zu therapeutischen Zwe
cken die Gabe funktionellen erfindungsgemäßen Proteins oder
zumindest eine höhere Expression desselben oder aber eine In
hibition des zellulär überexprimierten oder des exprimierten
infunktionellen Proteins erwünscht sein. Ganz besonders be
vorzugt ist die Verwendung von 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2
im Zusammenhang mit deren Funktion beim neuronalen Zelltod,
Excitation und Neurogenese. Insbesondere geht die Pathophysi
ologie der cerebralen Ischämie mit einer erhöhten Transkrip
tion von erfindungsgemäßem 15B3 einher, weswegen dessen
Verwendung zur Behandlung dieser Pathophysiologie ganz
besonders bevorzugt ist. Aus diesen erfindungsgemäßen
Erkenntnissen ergibt sich die Verwendung erfindungsgemäßer
Sequenzen (Nukleotid- und Aminosäuresequenzen) sowie
entsprechender Derivate (bspw. Peptide, Oligos oder
Antikörper) zur Herstellung eines Arzneimittels zur
Behandlung von Tumorerkrankungen und neurologischen
Erkrankungen, insbesondere ischämische Zustände
(Schlaganfall), multipler Sklerose, neurodegenerative Erkran
kungen, wie bspw. Morbus Parkinson, Amyotrophe Lateralsklero
se, heredodegenerative Ataxien, Neuropathien, Morbus Hunting
ton, Epilepsien und Morbus Alzheimer, viralen Infektionser
krankungen, bspw. Hepatitis-Infektionen (Anspruch 19).
Im Zusammenhang mit der therapeutischen Anwendung erfindungs
gemäßer Sequenzen steht ein weiterer Gegenstand der vorlie
genden Erfindung, nämlich die Verwendung einer erfindungsge
mäßen Nukleinsäuresequenz oder Proteinsequenz, insbesondere
der Nukleotidsequenz oder Aminosäuresequenz von Protein 15B3,
15B3-1 oder 15B3-2 oder einer Variante - wie oben definiert -
hiervon, insbesondere eines Fragments, zur Gentherapie bei
Säugetieren, z. B. beim Menschen bzw. auch derartige genthera
peutische Verfahren. Gentherapie umfaßt dabei alle Therapie
formen, die entweder erfindungsgemäße Sequenzen nach einem
der Ansprüche 1 bis 4 in den Körper oder Teile davon, bspw.
einzelne Gewebe, einbringen, oder die Expression von erfin
dungsgemäßer Sequenzen beeinflussen. Dazu können alle dem
Fachmann geläufigen Modifikationen im Rahmen der Gentherapie
verwendet werden, bspw. Oligonukleotide, z. B. antisense- oder
Hybrid-RNA-DNA Oligonukleotide, mit beliebigen Modifikatio
nen, die erfindungsgemäße Sequenzen enthalten, benutzt wer
den. Ebenfalls können virale Konstrukte, enthaltend eine er
findungsgemäße Sequenzen (dies schließt alle Varianten, wie
Fragmente, Isoformen, Allele, Derivate ein) benutzt werden.
Auch entsprechende erfindungsgemäße nackte DNA-Sequenzen,
kommen im Rahmen der Gentherapie in betracht. Ebenso können
Nukleinsäurestücke mit enzymatischer Aktivität (z. B. Ribozy
me) für gentherapeutische Zwecke benutzt werden.
Neben den therapeutischen Anwendungen kommen auch diagnosti
sche Verwendungen erfindungsgemäßer Nukleinsäuren oder Poly
peptide, erfindungsgemäßer Proteinheteromere sowie davon ab
geleiteter erfindungsgemäßer Reagenzien (Oligonukleotide, An
tikörper, Peptide) in Betracht, bspw. zur Diagnose von
menschlichen Erkrankungen oder von genetischen Prädispositio
nen, bspw. auch im Rahmen von Schwangerschaftsuntersuchungen.
Bei diesen Erkrankungen oder Prädispositionen handelt es sich
insbesondere um die oben im Zusammenhang mit therapeutischen
Anwendungen genannten. Diese diagnostischen Verfahren können
als in vivo, typischerweise jedoch ex vivo Verfahren ausges
taltet sein. Ex vivo wir eine typische Anwendung eines diagnostischen
erfindungsgemäßen Verfahrens zum qualitativen
und/oder quantitativen Nachweis einer erfindungsgemäßen Nuk
leinsäure in einer biologischen Probe dienen. Ein solches
Verfahren umfasst vorzugsweise die folgenden Schritte: (a)
Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge
an erfindungsgemäßer Nukleinsäure oder einer bekannten Menge
an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation
der erfindungsgemäßen Nukleinsäure geeignet sind, (b) Nach
weis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durch spezifische
Hybridisierung oder PCR-Amplifikation, (c) Vergleich der Men
ge an hybridisierender Nukleinsäure oder an durch PCR Ampli
fikation gewonnener Nukleinsäure mit einem Mengenstandard.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum qualitati
ven und/oder quantitativen Nachweis eines erfindungsgemäßen
Proteinheteromers oder eines erfindungsgemäßen Proteins in
einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfaßt: (a)
Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der
spezifisch gegen das Proteinheteromer oder gegen das erfin
dungsgemäße Protein/Polypeptid gerichtet ist, (b) Nachweis
des Antikörper/Antigenkomplexes, (c) Vergleich der Mengen
des Antikörper/Antigenkomplexes mit einem Mengenstandard. Als
Standard wird üblicherweise eine biologische Probe aus einem
gesunden Organismus entnommen. Insbesondere zu diagnostischen
Zwecken kann hierbei die Eigenschaft des 15B3-, 15B3-1-
und/oder 15B3-2-Gens benutzt werden, daß nach charakteristi
schen pathophysiologischen Stimuli, wie z. B. cerebralen I
schämien, die mRNA-Menge von 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2 in
Zellen sich verändert, z. B. sich erhöht. Auf diese Art kann
erfindungsgemäß z. B. eine Verlaufsbeurteilung (Prognose) von
mit Veränderungen von Expressionsraten erfindungsgemäßer
Proteine einhergehender Krankheiten (wie z. B. des Schlagan
falls), die Beurteilung von Therapieerfolgen, die Graduierung
einer Krankheit vorgenommen werden. Schließlich kann mit er
findungsgemäßen Verfahren ein Monitoring der Behandlung oben
angegebener Erkrankungen durchgeführt werden.
Erfindungsgemäße Sequenzen können in Verfahren zur Bestimmung
von Polymorphismen derselben z. B. bei Menschen verwendet wer
den. Auf diese ermittelte Polymorphismen erfindungsgemäßer
Sequenzen unterfallen nicht nur der Offenbarung der vorlie
genden Erfindung, sondern können auch prognostische Marker
für die Diagnose bzw. für die Diagnose einer Prädisposition
von Erkrankungen, die im Zusammenhang mit einer durch infunk
tionale Expression erfindungsgemäßer Sequenzen, durch Expres
sion infunktionaler erfindungsgemäßer Sequenzen und/oder oder
deren Überexpression dienen. Darüber hinaus ist erlauben er
findunsgemäße Sequenzen die Erforschung humaner Erbkrankhei
ten, und zwar sowohl monogener als auch polygener Erkrankun
gen.
Neben therapeutischen und/oder diagnostischen Verwendungszwe
cken im Bereich der Human- und/oder Tiermedizin kommt auch
die Verwendung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren oder Polypep
tide zum wissenschaftlichen Einsatz in Betracht. Insbesondere
erlauben die erfindungsgemäßen Sequenzen auf dem Fachmann be
kannte Weise, bspw. über cDNA-Bibliotheken verwandte Sequen
zen bei ein- oder mehrzelligen Organismen zu identifizieren
oder aber im humanen Genom verwandte Sequenzen zu lokalisie
ren. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, insbesondere
die Sequenzen von 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2, können also
dazu verwendet werden, Gene für mRNAs, die für diese Nuklein
säuren oder deren funktionellen Äquivalente, Homologe oder
Derivate kodieren, im bspw. murinen und im menschlichen Genom
mit gängigen Methoden durch Homologiescreening zu isolieren,
zu kartieren und mit Markern für humane Erbkrankheiten zu
korrelieren. Dies ermöglicht die Identifizierung des Gens als
Ursache für bestimmte Erbkrankheiten, was ihre Diagnose er
heblich vereinfacht und neue Therapieansätze ermöglicht.
Mit Hilfe erfindungsgemäßer Nukleinsäuren lassen sich damit
Erbkrankheiten diagnostizieren, weswegen sie als Marker Ver
wendung finden. Bspw. wird sich eine Korrelation des chromo
somalen Locus des Protein 15B3 beim Menschen (Chromosom 9) zu
bestimmten erblichen Erkrankungen ergeben, wobei hieraus ein
erfindungsgemäßes Diagnoseverfahren für erbliche Erkrankungen
erwachsen wird. Gleiches gilt für die erfindungsgemäßen Pro
teine.
Insbesondere wird erfindungsgemäß für die wissenschaftliche
Anwendung ein Testsystem offenbart, das auf erfindungsgemäßen
Aminosäure- und/oder Nukleotid-Sequenzen beruht. In diesem
Zusammenhang können die cDNA, die genomische DNA, die regula
torischen Elemente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequen
zen, als auch das Polypeptid, sowie Teilfragmente davon in
rekombinanter oder nicht-rekombinanter Form zur Ausarbeitung
eines Testsystems verwendet werden. Ein solches erfindungsge
mäßes Testsystem ist insbesondere geeignet, die Aktivität des
Promotors oder des Proteins in Anwesenheit der Testsubstanz
zu messen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einfache Meß
methoden (kolorimetrische, luminometrische, auf Fluoreszenz
beruhende oder radioaktive), die die schnelle Messung einer
Vielzahl von Testsubstanzen erlauben (Böhm, Klebe, Kubinyi,
1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg). Die be
schriebenen Testsysteme erlauben das Durchsuchen von chemi
schen Bibliotheken nach Substanzen, die hemmende oder akti
vierende Wirkungen auf erfindungsgemäße Proteine haben. Die
Identifizierung solcher Substanzen stellt den ersten Schritt
auf dem Weg zur Identifizierung neuartiger Medikamente dar,
die spezifisch auf die 15B3-, 15B3-1- oder 15B3-2-assoziierte
Signaltransduktion wirken. Insbesondere sind einfache Test
systeme denkbar, die die Aktivität der LLR-domäne vom 15B3,
15B3-1 oder 15B3-2 benutzen.
Eine Inhibition der biologischen Aktivität von erfindungsge
mäßem Protein, insbesondere von Proteinen gemäß Fig. 9, 11
oder 13, typischerweise der biologischen Aktivität im Zusam
menhang mit der Apoptose, wie sie bspw. beim Schlaganfall,
dem septischen Schock, GvHD, degenerativen Erkrankungen, ins
besondere neurodegenerativen Erkrankungen, akuter Hepatitis
oder anderen vorliegend offenbarten Indikationen erwünscht
ist, kann auch dadurch erreicht werden, daß durch dem Fach
mann geläufige Verfahren Oligonukleotide, die für einen Anti
sense-Strang der nativen Sequenzen der Proteine 15B3, 15B3-1
oder 15B3-2 oder eines anderen nativen Proteins mit einer
Leucin reichen Domäne codieren, in die betroffenen Zellen
einzuschleusen. Hierdurch wird die in den entsprechend trans
formierten Zellen die Translation der nativen mRNA von bspw.
15B3 oder 15B3-1 bzw. 15B3-2 blockiert, was im Ergebnis vor
zugsweise die Überlebensfähigkeit der transfizierten Zelle
steigert oder modulierend auf Zellwachstum, Zellplastizität,
Zellproliferation wirkt. Auch in diesem Fall kann das oben
beschriebene Verfahren mit Hilfe rekombinanter Viren einge
setzt werden.
Die ggf. pathologisch gesteigerte Zellapoptose oder Zellpro
liferation bei Erkrankungen, die auf einer entsprechenden
Fehlsteuerung erfindungsgemäßer Sequenzen beruhen (bspw. bei
den vorgenannten Indikationen), kann auch durch Ribozym-
Methoden therapiert werden. Hierzu werden Ribozyme verwendet,
die eine Ziel-mRNA schneiden können. Im vorliegenden Fall
werden daher Ribozyme offenbart und stellen einen Gegenstand
der vorliegenden Erfindung dar, die native 15B3- (oder 15B3-1-
oder 15B3-2)-mRNA oder die mRNA anderer Leucin reiche Domänen
enthaltender Proteine spalten können. Erfindungsgemäße Ribo
zyme müssen dabei mit der erfindungsgemäßen Ziel-mRNA inter
agieren können, bspw. über Basenpaarung, und anschließend die
mRNA spalten, um die Translation von bspw. 15B3 zu blockie
ren. Die erfindungsgemäßen Ribozyme werden über geeignete
Vektoren in die Zielzellen geschleust (insbesondere Plasmide,
modifizierte Tierviren, insbesondere Retroviren), wobei die
Vektoren neben ggf. anderen Sequenzen eine cDNA-Sequenz für
ein erfindungsgemäßes Ribozym aufweist).
Neben den vorgenannten Möglichkeiten zur Modulation der bio
logischen Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte, insbesonde
re der Genprodukte gemäß Fig. 9, 11 oder 13, typischerwei
se der Modulation der Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte
bei der apoptotischen oder nekrotischen oder proliferativen
Signaltransduktion ist dies auch mit Hilfe eines weiteren Ge
genstands der vorliegenden Erfindung möglich. Eine erfin
dungsgemäße chemische Verbindung wird insbesondere die intra
zelluläre Funktion der Proteine 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2
modulieren, typischerweise inhibieren (Anspruch 20) oder auf
der Ebene der zugrundeliegenden erfindungsgemäßen DNA-
Sequenzen die biologische Funktion beeinflussen. Erfindungs
gemäße Verbindungen werden typischerweise spezifisch an ein
Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 9, 11 oder
13 bzw. an eine Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 8, 10 oder
12 binden und dadurch eine pharmakologische, insbesondere
neuroprotektive oder immunmodulierende, anti-apoptotische o
der anti-proliferative Wirkung, hervorrufen.
Daher werden erfindungsgemäß chemische Verbindungen offen
bart, vorzugsweise eine organisch-chemische Verbindung, mit
einem Molekulargewicht von < 5000, insbesondere < 3000, vor al
lem < 1500, die typischerweise physiologisch gut verträglich
ist und vorzugsweise die Blut-Hirn-Schranke passieren kann
(Anspruch 21). Ggf. wird sie Bestandteil einer Zusammenset
zung mit mindestens einem weiteren Wirkstoff sowie vorzugs
weise Hilfs- und/oder Zusatzstoffen sein und als Arzneimittel
eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt wird das orga
nische Molekül dann sein, wenn die Bindungskonstante für die
Bindung an ein erfindungsgemäßes Protein, insbesondere an die
Leucin reiche Domäne eines erfindungsgemäßen Proteins, min
destens 107 mol-1 beträgt. Die erfindungsgemäße Verbindung
wird vorzugsweise so beschaffen sein, daß sie die Zellmembran
passieren kann, sei es durch Diffusion oder über
(intra)membranöse Transportproteine (Anspruch 22), ggf. nach
entsprechender Modifikation, bspw. mit einer angekoppelten
AS-Sequenz. Weiterhin bevorzugt sind jene Verbindungen, die
die Interaktion von 15B3 oder 15B3-1 oder 15B3-2 mit Bin
dungspartnern, insbesondere für die Transduktion eines apop
totischen oder nekrotischen Signals, inhibiert oder ver
stärkt. Insbesondere besetzen derartige Verbindungen Positio
nen auf der Oberfläche erfindungsgemäßer Proteine oder rufen
bei den erfindungsgemäßen Proteinen einen lokalen Konformati
onswechsel hervor, so daß die Bindung eines nativen Bindungs
partners an ein erfindungsgemäßes Protein verhindert wird.
Über Strukturanalysen des erfindungsgemäßen Proteins lassen
sich gezielt erfindungsgemäße Verbindungen finden, die eine
spezifische Bindungsaffinität aufweisen (Rationales Drug De
sign (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-
Verlag, Heidelberg)). Hier wird die Struktur oder eine Teil
struktur, Derivat, Allel, Isoform oder ein Teil einer solchen
von einem der gemäß Fig. 9, 11 oder 13 dargestellten Pro
teinen über NMR- oder Röntgenkristallographie-Verfahren ermittelt
oder, sofern eine solche hochaufgelöste Struktur
nicht vorliegt, mit Hilfe von Strukturvorhersage-Algorithmen
ein Strukturmodell eines erfindungsgemäßen Proteins erstellt,
und diese(s) benutzt, um mit Unterstützung von Molecular Mo
delling Programmen Verbindungen zu identifizieren, für die
sich eine hohe Affinität zum erfindungsgemäßen Protein vor
hersagen läßt. Diese Substanzen werden dann synthetisiert und
in geeigneten Testverfahren auf ihr Bindungsvermögen und ihre
therapeutische Nutzbarkeit getestet.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist die erfindungsgemäße Verbindung ein Antikörper,
vorzugsweise ein gegen ein erfindungsgemäßes Protein, bspw.
15B3, 15B3-1 oder 15B3-2, gerichteter Antikörper oder auch
gegen die zugrundeliegenden mRNA gerichteter Antikörper, der
ex vivo in retransplantierte Wirtszellen oder durch genthera
peutische in vivo Verfahren in Wirtszellen eingeschleust wird
und dort als "intrabody" nicht sekretiert wird, sondern in
trazellulär seine Wirkung entfalten kann. Durch derartige er
findungsgemäße "Intrabodies" können die Zellen vor einer
fehlgeleiteten apoptotischen Reaktion, bspw. durch Überex
pression eines erfindungsgemäßen Proteins, geschützt werden.
Eine derartige Vorgehensweise wird typischerweise für Zellen
jener Gewebe in Betracht kommen, die beim Patienten ein pa
thophysiologisch übersteigertes apoptotisches Verhalten zei
gen, also bspw. bei Zellen der Bauchspeicheldrüse, Keratino
zyten, Bindegewebszellen, Immunzellen, Neuronen oder Muskel
zellen. Neben den Antikörper oder Intrabodies sind auch der
artig mit erfindungsgemäßen "Intrabodies" gentherapeutisch
modifizierte Zellen Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
Eine erfindungsgemäße Verbindung mit der Funktion der Blocka
de der biologischen Funktion von nativem 15B3, 15B3-1 oder
15B3-2 gemäß Fig. 9, 11 oder 13 oder entsprechender nati
ver Allele oder nativer Spleißvarianten, bspw. der apoptoti
schen Funktion, kann als Arzneimittel Verwendung finden.
Hierbei sind als Verbindungen alle vorgenannten Varianten
eingeschlossen, also bspw. organisch-chemische Verbindungen,
Antikörper, anti-sense Oligonukleotide, Ribozyme. Insbesonde
re ist eine erfindungsgemäße Verbindung (zur Herstellung ei
nes Arzneimittels) zur Behandlung von Erkrankungen, für die
zumindest tw. eine pathologische hyperapoptotische oder hy
pernekrotische oder inflammatorische Reaktion kausal oder
symptomatisch ist, geeignet. Damit kann ein erfindungsgemäßer
Inhibitor (bspw. ein inhibitorisch wirkender Antikörper (ins
besondere ein Intrabody), ein Ribozym, anti-sense RNA, domi
nant-negative Mutanten oder eine der vorgenannten inhibitori
schen organisch-chemischen Verbindungen) der zellulären Funk
tion eines erfindungsgemäßen nativen Proteins 15B3, 15B3-1
oder 15B3-2 oder seiner nativen Varianten, also bspw. der a
poptotischen, nekrotischen oder proliferativen Reaktion, als
Arzneimittel und ganz besonders bei der Behandlung der fol
genden Erkrankungen bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels
zur Behandlung der folgenden Erkrankungen eingesetzt werden:
Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen, insbesondere Diabe
tes, Psoriasis, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis oder
Asthma, virale Infektionserkrankungen (bspw. HIV), degenera
tiven Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkran
kungen, bspw. Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson, Epilep
sie oder Muskeldystrophien, GvHD (bspw. Leber, Niere oder
Herz), ischämischer Infarkt oder akuter Hepatitis. Die vorge
nannten bspw. apoptoseinhibitorischen erfindungsgemäßen Sub
stanzen können auch Bestandteil einer pharmazeutischen Zusam
mensetzung sein, die weitere pharmazeutische Träger- Hilfs-
und/oder Zusatzstoffe enthalten kann, um derartige Zusammen
setzungen für die therapeutische Verabreichung bspw. zu stabilisieren,
die biologische Verfügbarkeit und/oder die Phar
makodynamik zu verbessern.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Ver
fahren ("Screening-Methoden") zur Identifizierung von pharma
zeutisch wirksamen Verbindungen, insbesondere mit inhibitori
schen Eigenschaften in Hinblick auf die Auslösung oder Wei
terleitung von Signalen, die mit durch physiologisch auftre
tende, erfindungsgemäße Sequenzen ausgelöste apoptotischen
Reaktionen, in Zusammenhang stehen (Anspruch 23). Erfindungs
gemäße Verfahren sehen vor, daß (a) Zellen mit einem Expres
sionsvektor nach Anspruch 5, insbesondere einem Expressions
vektor, der für das Polypeptid 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 co
diert, und ggf. mindestens einem Expressionsvektor, der für
mindestens ein Reporter-Gen codiert, transfiziert werden, und
(b) ein zur Beobachtung der 15B3 vermittelten Funktion, bspw.
der Apoptose, geeigneter Parameter, insbesondere die Aktivie
rung der Caspase-3, nach Zugabe einer Testverbindung im Ver
gleich zur Kontrolle ohne Zugabe einer Testverbindung für das
gemäß (a) erhaltene Wirtszellsystem gemessen wird. Hierzu
werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise meh
rere parallele Versuche mit ansteigenden Konzentrationen der
Testsubstanz angesetzt, um im Falle einer pharmazeutischen
Wirksamkeit, bspw. die Apoptose inhibierenden Wirkung, der
Testsubstanz deren ID50-Wert bestimmen zu können.
Insbesondere werden in einer bevorzugten Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung "Hochdurchsatz-Suchverfahren" ("High-
throughput screening assays", HTS) zur Identifikation von In
hibitoren von 15B3 offenbart. Ganz besonders bevorzugt ist
dabei der Einsatz von (allen bekannten) Komponenten des ras-
Signaltransduktionswegs im Rahmen des erfindungsgemäßen Ver
fahrens zur Identifikation von Inhibitoren, insbesondere zur
Identifikation kleiner organischer Verbindungen an. Vorzugs
weise bieten sich Systeme mit dem "Scintillation Proximity
Assay" (SPA) an (Fa. Amersham Life Science, MAP kinase SPA
(s. McDonald et al., 1999, Anal Biochem, 268, 318-29)). Vor
genannte Druckschrift, die einen Assayaufbau für die
Raf/MEK/ERK-Kaskade, die Inhibitoren der ganzen Kaskade iden
tifizieren kann, beschreibt, gehört vollinhaltlich zur Offen
barung der vorliegenden Erfindung. Die MAP-Kaskade wird hier
bei in vitro rekonstituiert, mit den einzelnen Bestandteilen
als GST-Fusionsproteinen (E. coli exprimiert) oder im Falle
von cRAF1 mit dem Baculovirussystem hergestellt (Anspruch
25). Das erste Element der Kaskade (MAP-KKK) muss hierbei
stän 39707 00070 552 001000280000000200012000285913959600040 0002010106835 00004 39588dig gleichmäßig aktiviert sein, um verläßlich Inhibitoren
testen zu können. Typischerweise wird dies wird durch
Coexpression von src im Baculovirussystem erreicht. Dadurch
wird eine ras-analoge Aktivierung von cRafsichergestellt.
Nach Transfektion von 15B3, 15B3-1, 15B3-2 oder anderen er
findungsgemäßen Varianten wird eine Modulierung der Kaskade
hervorgerufen, die herangezogen wird, um in einem HTS durch
Zugabe von zu testenden Substanzen eine Beeinflussung dieser
Modulation messen zu können.
Nach Identifizierung hochaffiner, selektiver Substanzen nach
vorgenanntem erfindungsgemäßen Verfahren werden diese auf ih
re Verwendung als Medikamente gegen Epilepsie, Schlaganfall
und andere neurologische, immunologische oder proliferative
Erkrankungen (Tumorerkrankungen) getestet. Darüber hinaus
können die Bindungsplätze der identifizierten und pharmakolo
gisch wirksamen Substanzen an die erfindungsgemäßen Genpro
dukte, insbesondere 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2, mit Hilfe des
two-hybrid Systems oder anderen Assays ermittelt werden,
d. h., dass die für die Interaktion verantwortlichen Aminosäu
ren eingegrenzt werden (Anspruch 24). Auf diese Weise können
auch Substanzen aufgefunden werden, mit denen die Interaktion
zwischen erfindungsgemäßen Polypeptiden und etwaigen nativen
intrazellulären Interaktionspartnern derselben beeinflusst,
insbesondere inhibiert, werden können. Hierdurch wird erfin
dungsgemäß ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit
spezifischer Bindungsaffinität zum erfindungsgemäßen Protein
offenbart.
Aufgrund der pharmakologischen Bedeutung von 15B3, 15B3-1 und
15B3-2 bzw. deren nativen Varianten für zahlreiche Erkrankun
gen, bspw. in neurodegenerativen oder proliferativen Erkran
kungen, haben gemäß erfindungsgemäßem Verfahren identifizier
te pharmazeutisch wirksame Substanzen ein weites Anwendungs
spektrum. Neben der Inhibierung einer Interaktion mit einem
oder mehreren anderen Molekülen, z. B. im Signaltransduktions
weg downstream befindlichen Proteinkinasen, oder Adaptoren
kann insbesondere auch eine Beeinflussung der Transkription
oder der Transkriptmenge von erfindungsgemäßen Proteinen in
der Zelle Ursache pharmazeutischer Wirksamkeit sein. Bei
spielhaft wäre die Suppression der schnellen Hochregulation
von Transkripten erfindungsgemäßer DNA-Sequenzen nach patho
logischen Prozessen durch erfindungsgemäße Verbindungen zu
nennen, da 15B3, 15B3-1 bzw. 15B3-2 einer sehr raschen Regu
lation durch transkriptionelle Aktivierung unterliegen. Vor
zugsweise ist ein Angriffsziel für eine pharmazeutisch wirk
same Verbindung daher die Regulation der Transkription, bspw.
durch spezifische Bindung der Substanzen an eine Regulatorre
gion (bspw. Promotor- oder Enhancer-Sequenzen) eines erfin
dungsgemäßen Genprodukts, Bindung an einen oder mehrere
Transkriptionsfaktoren eines erfindungsgemäßen Genprodukts
(mit dem Resultat einer Aktivierung oder Inhibierung des
Transkriptionsfaktors) oder eine Regulation der Expression
(Transkription oder Translation) eines solchen Transkripti
onsfaktors selbst.
Neben der transkriptionellen Regulation, d. h. Regulation der
mRNA-Menge eines erfindungsgemäßen Gens in der Zelle, kann
eine erfindungsgemäße pharmazeutisch wirksame Verbindung auch
in andere Kontrollprozesse der Zelle eingreifen, die bspw.
die Expressionsrate eines erfindungsgemäßem Proteins beein
flussen können (z. B. Translation, Spleißvorgänge, native De
rivatisierung von erfindungsgemäßem Genprodukt, bspw.
Phosphorylierungen, oder Regulation der Degradation von er
findungsgemäßem Genprodukt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft
Verfahren zur Identifizierung von zellulären Interaktions
partnern von erfindungsgemäßen Polypeptiden, insbesondere der
Proteine 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 bzw. deren nativ auftreten
den Varianten (Isoformen, Allele, Spleißformen, Fragmente)
(Anspruch 27). Auf diese Weise können als Interaktionspartner
Proteine identifiziert werden, die zum erfindungsgemäßen Pro
tein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen, oder zur I
dentifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren,
die zum erfindungsgemäßen Protein spezifische Bindungsaffini
täten aufweisen. Ein derartiges erfindungsgemäßes Verfahren
bzw. die Verwendung erfindungsgemäßer Polypeptide, erfin
dungsgemäßer Nukleinsäuresequenzen und/oder erfindungsgemäßer
Nukleinsäurekonstrukte zur Durchführung derartiger Verfahren
wird vorzugsweise mit Hilfe einer "Yeast-two-hybrid"-
Durchmusterung (y2h-"Screens") allein oder in Kombination mit
anderen biochemischen Verfahren durchgeführt (Fields and
Song, 1989, Nature, 340, 245-6). Derartige Screens finden
sich auch bei Van Aelst et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
90, 6213-7) und Vojtek et al. (1993, Cell, 74, 205-14) beschrieben.
Typischerweise können anstelle von Hefesystemen
auch Säugetiersysteme zur Durchführung eines erfindungsgemä
ßen Verfahrens verwendet werden, bspw. wie bei Luo et al.
(1997, Biotechniques, 22, 350-2) beschrieben.
Für einen y2h-Screen wird das offene Leseraster von 15B3,
15B3-1, 15B3-2 oder einer nativen Variante bspw. in einen
sog. bait-Vektor "in-frame" mit der GAL4-Bindungsdomäne klo
niert (z. B. pGBT10, Fa. Clontech). Damit kann vorzugsweise
eine sog. "prey-library" in einem Hefestamm nach gängigem
Protokoll auf interagierende Proteine durchsucht werden. Vor
zugsweise werden hierfür Kinase-negative Mutanten eingesetzt,
da diese oft stabiler mit etwaigen Phosphorylierungstargets
interagieren. Serin-/Threoninkinasen in einem Stoffwechselweg
können durch Adaptermoleküle in räumliche Nähe gebracht wer
den, um spezifische Phosphorylierungen besser durchführen zu
können (Chang et al., 1998, Science, 281, 1860-3), (Yasuda
et al., 1999, Mol Cell Biol, 19, 7245-54, (Whitmarsh and Da
vis, 1998, Trends Biochem Sci, 23, 481-5), Whitmarsh et al.,
1998, Science, 281, 1671-4). Es ist deshalb erfindungsgemäß
auch möglich, über zwei Schritte im yeast-two-hybrid System
auf Phosphorylierungstargets zu stoßen, indem zunächst ein
Adapterprotein kloniert wird und mit diesem als "bait" das
spezifische Zielprotein ("target") ermittelt wird. Darüber
hinaus können mit y2h-Systemen auch sog. Mapping-Experimente
durchgeführt werden, um spezifische Interaktionsdomänen zu
identifizieren.
Erfindungsgemäß können Interaktionspartner auch über Co-
Immunpräzipitationen aus mit 15B3-, 15B3-1- oder 15B3-2-(bzw.
deren native Varianten)Expressionsvektoren transfizierten
Zellen zu benutzen, um daran bindende Proteine aufzureinigen,
und über Proteinsequenzierungsmethoden (z. B. MALDI-TOF, ESI-
tandem-MALDI) nachfolgend die dazugehörigen Gene zu identifi
zieren.
Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
die Verwendung des two-hybrid Systems oder anderer biochemi
scher Verfahren zur Identifizierung von Interaktionsdomänen
von 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 bzw. nativ auftretender Varian
ten derselben und die Verwendung dieser Interaktionsdomänen
(Fragmente der nativen Sequenzen) zur pharmakotherapeutischen
Intervention.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, insbesondere nativ auftre
tende Formen oder aber auch nicht-native, artifiziell erzeug
te Varianten, deren biologische Funktion untersucht werden
soll, können erfindungsgemäß in einem Apoptoseassay verwen
det werden bzw. in einem Verfahren zur Untersuchung der Funk
tion und/oder Wirksamkeit erfindungsgemäßer Polypeptide bei
Induktion, Transduktion oder Inhibition von Zelltodsignalen
zum Einsatz kommen. Die Beteiligung von 15B3, 15B3-1, 15B3-2
oder vorgenannten Varianten an apoptotischen Kaskaden kann
untersucht werden, indem Expressionskonstrukte mit 15B3,
15B3-1 oder 15B3-2 oder Varianten in eukaryontische Zellen
transfiziert werden, und danach die Induktion von Apoptose
untersucht werden kann. Dies kann z. B. durch Anfärbung mit
Annexin geschehen (Fa. Roche Diagnostics), durch Antikörper,
die die aktive Form von Caspase-3 erkennen (Fa. New England
Biolabs), oder durch ELISAs, die DNA-Histon-Bruchstücke er
kennen (cell-death elisa, Roche Diagnostics). Diese Induktion
von Apoptose ist ggf zelltyp-spezifisch, weswegen erfindungs
gemäß vorzugsweise mehrere Zelllinien und primäre Zellen un
tersucht werden. Die Induktion von Apoptose kann ggf. auch
Stimulus-spezifisch sein. Daher werden in einem erfindungsgemäßen
Verfahren vorzugsweise mehrere Streß-Situationen zug
rundegelegt, z. B. Hitzeschock, Hypoxiebedingungen, Cytokinbe
handlungen (z. B. Il-1, Il-6, TNF-alpha, H2O2-Behandlung). Als
typische Zelltypen für ein derartiges erfindungsgemäßes Ver
fahren kommen gebräuchliche Zellinien, z. B. Cos-Zellen, HEK-
Zellen, PC12-Zellen, THP-1-Zellen, oder primäre Zellen, wie
z. B. Neurone, Astrozyten, in Betracht, ebenso wie andere im
mortalisierte und primäre Zellinien nach Bedarf.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft
die Verwendung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren, Nukleinsäure
konstrukte oder erfindungsgemäßer Genprodukte zur Durchfüh
rung eines Proliferationsassays. Bspw. kann die Beteiligung
von 15B3, 15B3-1, 15B3-2 sowie nativer oder nicht nativer Va
rianten derselben beim Wachstum von Zellen, beim Durchlauf
des Zellzyklus oder bei tumorigener Transformation untersucht
werden, indem Expressionskonstrukte mit 15B3, 15B3-1 oder
15B3-2 oder entsprechender Varianten in eukaryontische Zellen
transfiziert werden und danach bspw. die Induktion von Tumo
rigenizität untersucht wird, z. B. mit Hilfe eines Soft-Agar-
Tests (Housey, et al., 1988, Adv Exp Med Biol, 234, 127-40).
Als bevorzugte Zelltypen kommen gebräuchliche Linien, z. B.
Cos-Zellen, HEK-Zellen, PC12-Zellen, THP-1-Zellen, und primä
re Zellen, wie z. B. Neurone, Astrozyten, in Betracht, ebenso
wie andere immortalisierte und primäre Zellinien nach Bedarf.
Insbesondere kann mit Hilfe eines solchen erfindungsgemäßen
Verfahrens die Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte am ras-
Signalübertragungsweg und die Wechselwirkung erfindungsgemä
ßer Genprodukte mit anderen Komponenten des ras-
Signalübertragungswegs, insbesondere in Hinblick auf prolife
rative oder apoptotische Prozesse, untersucht werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die
Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4
oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 als
Suizidgen/-protein für die in vivo oder ex vivo Transformati
on von Wirtszellen (Anspruch 29). Insbesondere in Hinblick
auf die biologische Funktion von erfindungsgemäßem Protein
bei der Signaltransduktion von apoptotischen und/oder nekro
tischen Signalen kann auf diese Weise in Wirtszellen der
Zelltod gezielt ausgelöst werden. Vorzugsweise wird hierbei
die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz bzw. eines
erfindungsgemäßen Proteins so ausgestaltet sein, daß das Sui
zidgen operabel mit einem Promotor verbunden ist, wobei die
Transkription reprimiert ist und nur im Bedarfsfall aktiviert
wird (Anspruch 30). Insbesondere kann nach Transplantation
von Patienten-Zellen ex vivo oder in vivo im Rahmen einer
Gentherapie gezielt die transfizierte Zelle ausgeschaltet
werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figu
ren näher erläutert.
Fig. 1 zeigt ein RMDD-Schema (restriction-mediated differen
tial display). Eine Beschreibung ist in Ausführungsbeispiel 1
dargelegt.
In Fig. 2 ist das Ergebnis einer 15B3-LightCycler-
Verifizierung dargestellt. Wie in Ausführungsbeispiel 1 er
läutert, wurde 2 Stunden nach einem experimentellen Schlagan
fall (MCAO, 90 min Okklusion) die Hochregulation von 15B3 ge
messen, und zwar im kontralateralen und im ipsolateralen Bereich.
Die Expression (auf der y-Achse) ist normalisiert ge
gen die Expression des Standardgenprodukts Cyclophilin, also
als relative Expression aufgetragen.
Fig. 3 gibt die 15B3-Gewebeexpression in verschiedenen Gewe
ben der Maus (Herz, Milz, Hirn, Lunge, Leber, Skelettmuskel,
Niere, Hoden) oder nach verschiedenen Phasen der Embryonal
entwicklung der Maus wieder. Das Ergebnis wurde mittels einer
quantitativen PCR mit 15B3-Primern auf ein cDNA-Set der Fa.
Clontech gewonnen, d. h. das vorgestellte Gen, 15B3, wird bei
Mensch und Maus ubiqitär exprimiert. Aufgetragen ist die Ex
pressionsrate gegen die einzelnen Gewebe.
Fig. 4 stellt einen Homologie-Vergleich auf Proteinebene der
Proteine 15B3, 15B3-1 und 15B3-2 mit Hilfe des Programms
Clustal (Megalign, Lasergene, Madison, WI) dar. Dunkel unter
legt sind die jeweils identischen Aminosäuren. Insgesamt
fällt der hohe Grad der Konservierung der Aminosäuren bei den
drei Genprodukten auf. Die ober- oder unterhalb der Sequenz
eingezeichneten Linien stellen jene Bereiche (insgesamt 4,
und zwar ca. zwischen (1) AS 234 und 254, (2) 45 und 63, (3)
24 und 43 und (4) 184 und 203 (Numerierung nach Sequenz von
15B3-2) dar, die als Transmembrandomänen bezeichnet werden.
Linien mit Pfeilen (insgesamt 10) markieren Bereiche, die
Leucin-reiche Bereiche sind ("leucin-rich-repeats" (LRR)).
Derartige LRR-Protein-Interaktionmodule sind in Proteinen mit
diversen Funktionen bekannt. So enthält z. B. der humane und
murine Toll-like Receptor 6 (TLR6) neben den Transmembrando
mänen eine extrazelluläre LRR-Domäne (Takeuchi et al., 1999).
In Fig. 5 ist ein phylogenetischer Stammbaum der Proteine
mit "leucin-rich-repeat"-Domänen dargestellt. Zur Bestimmung
des Stammbaums wurde das Programm Megalign eingesetzt. Die
15B3-Familie stellt dabei eine neue Untergruppe innerhalb der
LRR-Domänen enthaltenden Proteine dar.
In Fig. 6 ist eine Proteinstruktur-Vorhersage für erfin
dungsgemäßes Protein 15B3 mit Hilfe des Programms Protean
(DNAStar, Lasergene, Madison, WI) abgebildet. Deutlich sicht
bar sind die 4 putativen Transmembrandomänen.
Fig. 7: Ras-MAPK-Kaskade. Gezeigt sind putative Interaktio
nen von 15B3 innerhalb des Ras-Signaltransduktionsweges. 15B3
hat hier modulatorische Funktionen.
Fig. 8 stellt die humane 15B3-Nukleinsäuresequenz (SEQ ID 1)
dar.
Fig. 9 stellt die Aminosäuresequenz von humanem 15B3-Protein
dar (SEQ ID 2), und zwar durchlaufend vom N- zum C-Terminus.
Fig. 10 stellt die humane Nukleotidsequenz von humanem 15B3-1
dar (Seq ID 3).
Fig. 11 stellt die Aminosäuresequenz vom humanen Protein 15B3-
1 dar (Seq ID 4), und zwar durchlaufend vom N- zum C-
Terminus.
Fig. 12 stellt die Nukleotidsequenz von Protein 15B3-2 dar
(Seq ID 5).
Fig. 13 stellt die Aminosäuresequenz von Protein 15B3-2 dar
(Seq ID 6), und zwar durchlaufend vom N- zum C-Terminus.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Aus
führungsbeispiele näher erläutert:
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein bislang nicht
in der Vollänge definiertes und entsprechend bislang in sei
ner Funktion nicht charakterisiertes Protein, einschließlich
der zugrundeliegenden DNA-Sequenz, wurde aufgrund einer dif
ferentiellen Regulation im zentralen Nervensystem kloniert.
Die RNA-Produkte des Gens 15B3 wurden nach fokaler cerebraler
Ischämie im Gehirn von Mäusen in der ischämischen Hemisphäre
verstärkt exprimiert, und konnten durch ein differentielles
Klonierungssystem (restriction-mediated differential display,
RMDD) kloniert werden. Zur Herbeiführung von fokalen cerebra
len Ischämien wurde hierbei das Fadenmodell benutzt (middle
cerebral artery occlusion, MCAO), ein valides Modell für die
Schlaganfallerkrankung beim Menschen. Dieses experimentelle
System wurde erfindungsgemäß eingesetzt, um Gene zu identifi
zieren, die neben anderen Funktionen auch von pathophysiolo
gischer Bedeutung für das Ereignisse nach einer cerebralen
Ischämie sind. Im einzelnen wurde wie folgt experimentell
verfahren, und molekulare targets für neue Medikamente bei
neurodegenerativen Erkrankungen darstellen können.
Zum Herbeiführen einer fokalen cerebralen Ischämie in c57/b16
Mäusen wurden 3 Monate alte Mäuse benutzt. Nach Herbeiführen
einer Inhalationsnarkose (70% N20, 30% O2, 0,8-1% Ha
lothan) wurde ein 5-0 Prolenefaden (Fa. Ethicon), der mit
0.1% Poly-L-Lysin beschichtet war, über die A. carotis exter
na in die A. carotis interna bis zum Abgang der A. cerebri
media vorgeschoben. Die richtige Position des Fadens wird
durch einen Abfall des Laser-Doppler-Signals (Fa. Perimed)
auf 10-20% des Ausgangssignals angezeigt. Nach Durchführung
dieser Operation und gegebenenfalls Bestimmung zusätzlicher
physiologischer Parameter (Blutdruck, Puls, Blutgase, Blut
glukose) erwachen die Mäuse aus der Narkose. Nach bestimmten
Okklusionszeiten werden die Mäuse wieder einer Narkose unter
zogen, und der Faden zurückgezogen. Dadurch findet eine Re
perfusion des Gewebes statt. Nach bestimmten Reperfusionszei
ten werden die Mäuse durch Genickbruch getötet, und das Ge
hirn sofort präpariert und auf Trockeneis weggefroren.
Im vorliegenden Fall wurden keine Reperfusionen durchgeführt,
sondern nur eine Okklusion von 90 min bzw. 24 h.
Dazu wurde das mRNA-Präparationskit von der Fa. Invitrogen
(Fasttrack) verwendet. Es wird auf die beschriebene Standard
präparationsmethode verwiesen, die Bestandteil der Offenba
rung der vorliegenden Patentanmeldung ist.
Die Durchführung erfolgte nach den in den Druckschriften EP 0 743 367 A2
und US 5,876,932 beschriebenen Verfahren, wobei
abweichend hiervon 2 µg polyA-RNA für die Erststrangsynthese
eingesetzt wurden. Nach Durchführung von Erststrang-, Zweit
strangsynthese, MboI-Restriktion wurde eine Ligation mit A
daptoren durchgeführt. Zwei aufeinanderfolgende PCR-
Reaktionen mit Subsets von Primerkombinationen schlossen sich
an. Die PCR-Reaktionen wurden danach auf ein denaturierendes
Gel geladen und auf eine Nylonmembran geblottet (Fa. GATC).
Die biotin-markierten Banden wurden mit Hilfe einer gebräuch
lichen Streptavidin-Peroxidase-Reaktion visualisiert. Auf das
Gel wurden jeweils PCR-Proben von der ischämischen und
kontralateralen Hemisphäre zusammen aufgetragen (24 h MCAO
rechts und links und 90 min MCAO rechts und links). Banden
unterschiedlicher Intensität in der rechten oder linken Hemi
sphäre wurden ausgeschnitten, und eine Reamplifikation des
entsprechenden PCR-Produktes durchgeführt. Erhaltene amplifi
zierte Produkte wurden in den TOPO TA Vektor pcDNA 2.1 (Fa.
Invitrogen) kloniert und mit T7 und M13rev-Primern sequen
ziert (ABI 3700 Kapillarelektrophoresesequencer). Erhaltene
Sequenzen werden mit der EMBL-Datenbank verglichen.
Nach Ausführung der vorbeschriebenen Verfahrensschritte wurde
eine Sequenz identifiziert, die nach 90 min auf der ischämi
schen Seite hochreguliert schien. Eine "Lightcycler"-Analyse
bestätigte eine schnelle Regulation nach MCAO (90 min MCAO
und 2 h Reperfusion) (s. auch Fig. 2).
Diese Sequenz wies starke Homologie zu den Genen SUR-8 etc.
auf. Das isolierte 3'-gelegene PCR-Fragment wurde benutzt, um
eine Maushirnbank zu hybridisieren. Dabei fanden sich mehrere
Klone, die Sequenzteile von dieser Sequenz (Seq1) enthielten.
Diese wurden mit ESTs aus der EMBL-Datenbank verglichen, und
die Sequenzen Seq1 assembliert. Eine Maus Probe aus dem 5'-
Bereich wurde benutzt, um eine humane fötale Hirnbank in
lambdaZapII (Stratagene) zu durchsuchen ("screening") Eine
Darstellung der Herstellung der benutzten humanen cDNA-
Bibliothek ist in Fig. 1 dargestellt. Die erhaltenen humanen
Klone wurden sequenziert und mit humanen ESTs aus der EMBL-
Datenbank und der humanen mRNA des KIAA1437-Proteins AB037858
verglichen.
Die Nukleotid- und Proteinsequenzen der 15B3 verwandten Klone
15B3-1 und 15B3-2 erbrachte eine Datenbanksuche der EMBL-,
nrdb- und swissprot-Datenbanken (mit dem Programm BLAST 2,
beschrieben bei Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res, 25,
3389-402). Diese Druckschrift ist vollinhaltlich Bestandteil
der vorliegenden Offenbarung. Mittels EMBL-Datenbank wurden
weitere humane ESTs ermittelt, so dass für 15B3-2 der ORF er
mittelt werden konnte. Diese Sequenzen sind als Sequenzen Seq
ID 5, 6 in den Fig. 10 bis 13 dargestellt.
Mit dem cDNA-Synthese Kit der Fa. Stratagene wurde ausgehend
von 2 µg humaner fötaler Gehirn-mRNA (Fa. Clontech) und von 5 µg
mRNA aus adultem Mausgehirn entsprechende cDNA-
Bibliotheken hergestellt. Dabei wurde im wesentlichen ent
sprechend der Angaben des Herstellers verfahren. Zur Synthese
der Erststrang cDNA wurde nach den Herstellerangaben ein oli
godT-Primer verwendet. Die klonierungs-kompatiblen (Eco-
RI/XhoI) doppel-strängigen cDNA-Fragmente wurden größenselek
tioniert (nach Herstellerangaben/ Fa. Stratagene) und in den
Plasmidvektor pBluescript SKII (Stratagene) ligiert. Die Li
gation wurde durch Elektroporation in E.coli (DH10B, Gibco)
transformiert und auf LB-Ampizillin Agar-Platten amplifi
ziert. Die Plasmid-DNA wurde mittels alkalischer Lyse und Io
nenaustauscher-Chromatographie isoliert (QIAfilter-Kit, Fa.
Qiagen).
Die Komplexität an Einzelklonen betrug für die fötale humane
Gehirn-cDNA-Bank 4 Millionen. Von jeder cDNA-Bank wurden zu
fallsmäßig 24 Einzelklone nach Insertgrößen analysiert, die
eine Größenverteilung von 800 bp bis zu 4,5 kb zeigten, die
durchschnittliche Länge der cDNA-Inserts betrug für die huma
ne Bank ca. 1,2 kb.
Die erhaltene Sequenz von 15B3 wurde dazu benutzt, Aufschlüs
se über die Einordnung des Proteins in deren Funktion als E
lement von Signaltransduktionskaskaden, insbesondere der
ras/MapK- Kaskade, zu gewinnen. Dazu wurde das offene Le
seraster des Gens in einen gängigen Expressionsvektor (z. B.
pCMV-tag, Fa. Stratagene) kloniert. Dieses Konstrukt wurde
mit anderen Konstrukten zusammen in eukaryontische Zellen
transfiziert werden (z. B. mit der Calciumphosphatmethode,
siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,
New York, 1997). Hierbei handelte es sich typischerweise um
Reporterkonstrukte, z. B. ein Luciferase-Gen, unter Kontrolle
eines Minimalpromotors mit mehreren SRE-Elementen, der Bin
dungssequenz für den ELK-Transkriptionsfaktor. Extrakte aus
den Zellen wurden dann einer Messung im Luminometer (z. B. Fa.
Bertold) unterzogen. Eine Erhöhung des Luciferase-Wertes wur
de als Beeinflussung des Signaltransduktionsweges gewertet,
der in der Aktivierung eines bestimmten Transkriptionsfaktors
(ELK) mündet. Kombinationen mit anderen Expressionskonstruk
ten (bspw. für andere Gene, z. B. MAP-Kinasen) konnten Auf
schlüsse über die genaue Position von 15B3 in Signalkaskaden
geben.
Ggf. wurden diese Reporter-Assays auch mit anderen Systemen
durchgeführt, z. B. lacZ oder Chloramphenicol-Transferase
(CAT-Assays), wobei dem Assay das gleiche Prinzip, wie oben
beschrieben, zugrundelag.
Zur Untersuchung der Gewebeexpression von 15B3 wurde eine
quantitative PCR mit Hilfe des LightCyclers (Roche Di
agnostics, Mannheim) durchgeführt. Es wurden cDNA-Proben von
8 murinen Geweben verwendet, die bereits mengenstandardisiert
auf 4 verschiedene housekeeping Gene sind (Fa. Clontech). Als
Kontrolle verwendet wurde Plasmid xx15B3, das ein amplifi
ziertes Fragment der murinen 15B3-cDNA enthielt. Als PCR-
Programm wurde ein Standard-Protokoll (annealling-temp 60°C)
gewählt. Es fand in allen Gewebeproben Amplifikation eines
Produktes mit dem Schmelzpunkt 89°C statt, dieser deckte sich
mit der Kontroll-PCR. Die Amplifikation wird im LightCycler
ab Zyklus 25 sichtbar. Folgende Primer wurden verwendet:
seq_15B3.1 GAGCTGCCAAGAAAGGGGGAGACT (in Exon 2)
seq_15B3.2 CAGAAAACACAAATGGACGGAGAG (in Exon 2)
seq_15B3.1 GAGCTGCCAAGAAAGGGGGAGACT (in Exon 2)
seq_15B3.2 CAGAAAACACAAATGGACGGAGAG (in Exon 2)
Die quantitative Analyse (Fig. 3) zeigt eine relativ ubiqui
täre Gewebeverteilung mit Schwerpunkten in Herz, Lunge, Leber
und Gehirn. 15B3 Expression ist ebenfalls in Testis, Muskel,
Niere und Milz sowie während der Embryonalentwicklung nach
weisbar.
Durch eine Homologiesuche (BLAST) mit der humanen 15B3 Se
quenz konnten humane ESTs (expressed sequence tags) aus dem
3' untranslatierten Bereich des Gens identifiziert werden.
Dabei finden sich Klone aus Aorta, Knochen, Gehirn, CNS, Co
lon, Auge, Geschlechtsorganen, Herz, Niere, Lunge, Lymphsys
tem, Pankreas, Prostata, Magen, Testis, Uterus, Embryo,
Brustgewebe, Muskel, nervous Tumor, Ovar, Uterus, die auf ei
ne breite Gewebeverteilung schließen lassen. Dies deckt sich
mit den erhaltenen quantitativen PCR-Daten.
Für die humane Proteinsequenz ergibt sich ein offenes Le
seraster, das für ein Protein mit 811 Aminosäuren kodiert
(94.2 kD Molekulargewicht; isoelektr. Punkt bei pH 7.9).
Zur Ermittlung von Transmembran-Domänen wurde das Computer
programm Tmpred verwendet Es sagt mit hohen Wahrscheinlich
keiten 4 Transmembran-Domänen für den N-terminus des Proteins
15B3 voraus (s. Fig. 6). Ein "Score" über 500 weist auf die
Signifikanz potentieller Transmembransegmente hin, für das
Protein 15B3 ist der "Score" für alle vier potentiellen Do
mänen sehr hoch (1361, 1965, 757, 2592).
Weiterhin wurde Kyte-Doolittle Hydrophobizitätsplot erstellt.
Das Ergebnis dieser Auftragung indiziert im N-Terminus vier
hydrophobe Bereiche an (Index < -3), die mit der oben angege
benen Sequenz übereinstimmen (AS: 26-45, 124-144, 267-287,
320-341), dies unterstützt die Hypothese, daß es sich hierbei
um Transmembranregionen handelt.
Mit Hilfe des Kyte-Doolittle Hydrophobizitätsplots wurde er
findungsgemäß festgestellt, daß eine hydrophile Region für AS 350-435
vorliegt, während der anschließende C-Terminus einen
grösseren hydrophoben Bereich aufweist. Unter Verwendung des
Programm HMMPFAM wurde weiterhin erfindungsgemäß bestimmt,
daß diese Region (AS 461-803) einen charakteristischen Leu
cin-Rich-Repeats-Bereich (LRR) darstellt.
Desweiteren wurde das Programm PSORTII zur näheren Charakte
risierung der erfindungsgemäßen Sequenz eingesetzt. Derart
wurden in der Proteinsequenz zwei Signalsequenzen identifi
ziert. Die letzten 4 Aminosäuren des 15B3-C-Terminus, DKEQ,
weisen signifikante Ähnlichkeit zu einem "ER Membrane Reten
tion Signal" ähnlichen Motif, KKXX, auf. Eine weitere Sequenz
an Position 695 as des Proteins 15B3 wurde ggf. als peroxiso
males Targeting-Signal (KIEKIPTQL) identifiziert. Die Ergeb
nisse der vorgenannten Experimente erlauben den Schluß, daß
ein erfindungsgemäßes Protein im Endoplasmatischen Retikulum
lokalisiert ist.
Es wurden Sequenzvergleiche der 15B3 Sequenz mit EMBL, nrdb
und swissprot-Datenbanken durchgeführt. Hierbei ergaben sich
Übereinstimmungen mit folgenden humanen Sequenzen:
(i) BAA92675 und (ii) BAA91549.
(i) BAA92675 und (ii) BAA91549.
Der Protein-Sequenzvergleich zwischen dem erfindungsgemäßen
Protein 15B3 und BAA92675 ergab eine 100% Identität auf Pro
teinebene. Die Autoren geben für den Klon BAA92675 an, dass
das Startcodon nicht identifiziert wurde. Durch die Ermitt
lung des offenen Leserahmens der 4,7 kb langen Nukleotidse
quenz von 15B3 konnten wir jedoch feststellen, dass es sich
bei der zweiten AS der annotierten BAA92675-Proteinsequenz
sehr wahrscheinlich um das Startcodon von 15B3 handelt. Es
konnten keine längeren ORF identifiziert werden, die mit dem
translatierten Protein übereinstimmen. Auch konnten keine
weiteren ORFs mit anderem Leseraster aufgezeigt werden. Die
Nukleotidsequenz des Klons BAA92675 zeigt einen Nukleoti
daustausch in Position 274B bp (C statt T) und in Position
3891 bp (A statt G). Die Fehler in der Nukleotidsequenz be
wirken jedoch keinen Aminosäureaustausch auf Proteinebene.
Eine Datenbanksuche (BLAST 2 (Altschul, et al., 1997, Nucleic
Acids Res, 25,3389-402)) der EMBL, nrdb und swissprot-
Datenbanken erbrachte Verwandte dieses Proteins.
Die stärksten Homologien zeigt 15B3 zu zwei annotierten Pro
teinsequenzen:
- - 58.8% Identität auf 670 AS zu BAA9131,
- - 58.8% Identität auf 803 AS zu Q92627.
Konserviert ist hierbei die LRR-Bindungsdomäne im C-Terminus
sowie die vier potentiellen Transmembrandomänen im N-Terminus
(Fig. 4).
Die annotierte Proteinsequenz von 476 AS des Klons Q92627
zeigte keinen vollständigen ORF. Durch Translation der ermit
telten 5'-liegenden genomischen Sequenzen konnte das Startco
don bestimmt sowie der ORF auf 804 AS vervollständigt werden.
Auch in den N-terminalen Sequenzen besteht eine gewisse Ho
mologie zu 15B3. Die Proteinsequenz weist ebenfalls vier po
tentielle konservierte Transmembransegmente, 10 Leucin-
reiche repeats sowie ein "ER Membrane Retention Signal" ähn
lichen Motifs auf.
Die Proteinsequenz des Klon BAA9131 beginnt zwar mit einem
Startcodon, jedoch besteht aufgrund der Sequenzvergleiche zu
15B3 und Q92627 die Annahme, daß der ORF im N-Terminus un
vollständig ist. Die Proteinsequenz zeigt starke Konservie
rung zu den potentiellen Transmembransegmenten (3 und 4,
Fig. 6) und weist ebenfalls 10 Leucin-reiche repeats auf.
Aufgrund der Konservierung auf Proteinebene, besonders inner
halb der potentiellen Transmembrandomänen und der LRR-Domänen
kann davon ausgegangen werden, dass 15B3 mit BAA9131 und
Q92627 einer gemeinsamen Genfamilie angehört und eine neue
Subgruppe definiert (Fig. 5). Aus diesem Grund wurde BAA9131
in 15B3-1 und Q92627 in 15B3-2 umbenannt.
Mit Hilfe einer Datenbanksuche konnten außerdem Sequenzähn
lichkeiten zu Proteinen aus anderen Spezies oder Organismen
wie Mensch, Maus, Ratte, Drosophila melanogaster, C.elegans,
S. cerevisiae, E. coli: nachgewiesen werden:
(1) H. sapiens: PID: g1504042 - similar to yeast adenylate cy clase (69%/148 aa)
(2) M. musculus: PID: g3252981 - Ras-binding protein SUR-8 (35 %/141 aa)
(3) R. norvegicus: PID: g1657758 - densin-180 (30%/112 aa)
(4) D. melanogaster: PIR: S60461 - S60461 gene flightless-I protein - fruit fly (34%/141)
(5) C. elegans: PID: g3168891 - contains similarity to re peated leucine-rich (29%/145 aa)
(6) S. cerevisiae: PID: g1006714 - ORF YJL005w (34%/114 aa)
(7) E. coli: PID: g1788752 - cell division protein involved in FtsZ ring (34%/123 aa).
(1) H. sapiens: PID: g1504042 - similar to yeast adenylate cy clase (69%/148 aa)
(2) M. musculus: PID: g3252981 - Ras-binding protein SUR-8 (35 %/141 aa)
(3) R. norvegicus: PID: g1657758 - densin-180 (30%/112 aa)
(4) D. melanogaster: PIR: S60461 - S60461 gene flightless-I protein - fruit fly (34%/141)
(5) C. elegans: PID: g3168891 - contains similarity to re peated leucine-rich (29%/145 aa)
(6) S. cerevisiae: PID: g1006714 - ORF YJL005w (34%/114 aa)
(7) E. coli: PID: g1788752 - cell division protein involved in FtsZ ring (34%/123 aa).
Weitere Homologien zu bekannten Proteinen des Menschen und der
Maus hat erfindungsgemäßes 15B3 zu Sur-8 (Li W., et al.,
Genes Dev. 2000 Apr 15; 14 (8): 895-900), Soc-2 (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, Vol. 95, pp. 6903-6908, June 1998), Rsu-1 (Tsuda
et al., Genomics. 1993 Nov; 18(2): 461-2), Densin-180 (Apper
son et al., J. Neurosci. 1996, Nov 1, 16(21): 6839-52), Scribble
(Nature 403 (6770): 676-680 (2000) und der Adenylate Cyclase
aus Hefe (X).
Dabei liegen verschiedene Gruppen von homologen Sequenzen
vor, die verschiedene Untergruppen der LLR-Proteine bilden,
wie in Fig. 5 in einem phylogenetischen Baum dargestellt. Die
Proteine Adenylyl Cyclase aus Saccharomyces cerevisiae sowie
Sur-8, egl-15 und Rsu-1 haben eine wichtige Funktion in der
Ras/Erk Signalkaskade. Die in C.elegans identifizierten Soc-
Gene (egl-15, sem-5, soc-1 und soc-2), Suppressoren der Re
zeptor Tyrosin Phophatase clr-1, beeinflussen die FGF-
Signalkaskade. Soc-2, ein Protein mit einer 18 Tandern-LRR-
Domäne, unterdrückt die aktivierte Form des EGL-15 FGF-
Rezeptors (Fibroblast Wachstumstumsfactor). Die FGF-
Signalkaskade soll ebenfalls einen aktivierenden Effekt auf
die Ras-Kaskade bewirken. Die humane Form Shoc-2, ist beim
Menschen auf Chromosom 10q25 lokalisiert, einer Region, die
mit bestimmten Knochen und -Krebserkrankungen assoziiert
wird.
Die anderen Untergruppen der LLR-Proteine sind die LAP-
Proteine, die sowohl eine LLR-Domäne im N-Terminus und als
auch eine PDZ-Domäne im Carboxy-Terminus besitzen. Zu den
LAP-Proteinen gehört das C. elgans Protein Let-413, das Dro
sophila-Protein Scribble, die Vertebraten-Proteine Densin-
180, Erbin und das humane Scribble. Interessanterweise haben
die LAP-Proteine ein gemeinsames Expressionsmuster entlang
der Zellmembran.
Aufgrund der Ergebinsse des hieraus resultierenden phylogene
tischen Baum (Fig. 5) kann angenommen werden, dass 15B3 nicht
zu den bisher bekannten LLR-Subgruppen zugeordnet werden
kann.
Eine auf den erfindungsgemäßen Erkenntnissen beruhende Daten
banksuche mit dem Programm BLAST 2 (Altschul, et al., 1997,
Nucleic Acids Res, 25, 3389-402)) in der EMBL-Datenbank er
brachte zusätzliche humane genomische Sequenzinformation.
Der Klon AL136108, bestehend aus 36 zusammengesetzen contigs,
enthält große Bereiche der 15B3-cDNA. Sequenzvergleiche zwi
schen der genomischen Nucleotidsequenz deuten darauf hin, daß
der humane cDNA Klon mindestens von zwei Exons kodiert wird.
Der 3'-Bereich ist dabei komplett konserviert. 15B3 befindet
sich beim Menschen auf Chromosom 9 (Position: 9q22.32-31.3;
http:/ / www.sanger.ac.uk/cgi-bin/humace/searcher.cgi).
Aufgrund der Konservierung der LLR-Domäne bei 15B3 weist eine
LLR-Domäne auf, wie sie für Proteine, die an einer Interakti
on mit Ras beteiligt sind, typisch ist. So gehört die mit Ras
assoziierende LRR-Domäne von S. Cerevisiae Adenylyl Cyclase
einer kleine Untergruppe an, die einen bestimmten 23-AS Con
sensus-Unit besitzt (PXXaXXLXXLXXLXLNXLXXa, a ist hierbei ei
ne aliphatische, X jede beliebige Aminosäure). Andere Mit
glieder dieser Untergruppe wie z. B. RSU1 und SUR-8 sind zwei
mutmaßliche Gerüstproteine, die einen modulierenden Effekt
auf die Ras-abhängige Signalkaskade haben. Beiden gemeinsam
ist die Bildung eines ternären Komplexes mit Ras und Rafund
der daraus resultierenden Aktivierung der Ras-MAP-Kinase
Signaltransduktion. Aus dem Stand der Technik ist bspw. fer
ner bekannt, daß die Aktivierung von Ras und der Raf/Erk-
Kaskade (Raf, Mek; Erk2) auch eine wesentliche Rolle für die
Sauerstoff-Glucosemangel Toleranz in Neuronen besitzt. Wäh
rend der Sauerstoff-Glucosemangel-Preconditionierung in Neu
ronen wird eine Signalkasade gestartet, die durch die Akti
vierung der NMDA-Rezeptoren mittels Ca2+ Einstrom und Produk
tion von NO ausgelöst wird. NO ist ein Mediator der Ras Akti
vierung mittels NMDA Rezeptor Stimulation. Die ischämische
Toleranz erfolgt durch eine Aktvierung der NMDA-Glutamat Re
zeptoren.
Die erfindungsgemäßen Proteine enthalten im C-terminus eine
Tandern-Leucin-Repeat-reichen Domäne (LRR). Diese LRRs im er
findungemäßen Protein sind Protein-Protein-
Interaktionsdomänen bestehend aus 20-28 Aminosäuren mit einem
Core-Consensus von Leucinen und Asparaginen (LXXLXLXXN). Bei
dem Protein 15B3 besteht diese Domäne typischerweise aus 10
Leucin-Rich Repeats (Fig. 4).
Die experimentellen Daten nach der vorliegenden Erfindung
zeigen, daß die identifizierten Proteine eine entscheidende
Rolle bei der Regulation der fokalen cerebralen Ischämie, ei
nem Schlaganfallmodell, spielen.
Mit den Proteinen 15B3, 15B3-1 bzw. 15B3-2 wurden Zielsequen
zen für Pharmaka ("drug targets") mittels eines Verfahrens
zur Klonierung differentiell regulierter Gene (RMDD) in der
ischämischen Hemisphäre von Mäusen nach fokaler cerebraler
Ischämie identifiziert. Die Regulation der Genexpression
spielt bei der cerebralen Ischämie eine entscheidende Rolle
für den Ablauf und das Ausmaß des Neuronenschadens
(Koistinaho and Hokfelt, 1997, Neuroreport, 8, i-viii;
Schneider et al., 1999, Nat. Med., 5, 554-9). Insbesondere
sog. "immediate early genes" spielen hier eine Rolle (Atkins
et al., 1996, Stroke, 27, 1682-1687), wie z. B. cox-2,
(Nogawa, et al., 1997, J. Neurosci., 17, 2746-2755). Das
Tiermodell der fokalen cerebralen Ischämie stellt dabei ein
valides Modell für den humanen ischämischen Schlaganfall dar.
Um eine fokale cerebrale Ischmämie herbeizuführen, wurde das
sog. Fadenmodell, bei dem ein beschichteter Nylonfaden durch
die A. carotis interna an den Abgang der A. cerebri media
vorgeschoben wird und einen ischämischen Schlaganfall indu
ziert, benutzt (Clark et al., 1997, Neurol. Res., 19, 641-648).
Die 15B3-Expression wurde nach einer fokalen cerebralen I
schämie in drei Zeitverläufen beobachtet: Zum einen in einer
transienten Ischämie nach zwei Reperfusionszeiten (90 min I
schämie, 2 h und 6 h Reperfusion), und zum anderen in einer
permanenten Ischämie von 24 h (Fig. 2). RNA wurde aus den
beiden Hemisphärenhälften von 3-4 Gehirnen ohne Hirnstamm und
Kleinhirn gewonnen (Fasttrack kit, Invitrogen). Mit Hilfe des
LightCycler™ Systems (Roche Diagnostics, Mannheim) wurde eine
quantitative PCR durchgeführt. Der cDNA Gehalt der Proben
wurde auf die Expression von Cyclophilin und S20 normiert
(Schneider, et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92, 4447-51).
Benutzte Primer zur Amplifikation von Cyclophilin waren:
cyc5 ACCCCACCGTGTTCTTCGAC
acyc300 CATTTGCCATGGACAAGATG
und zur Amplifikation von Maus 15B3:
seq_15B3.1 GAGCTGCCAAGAAAGGGGGAGACT (in Exon 2)
seq_15B3.2 CAGAAAACACAAATGGACGGAGAG (in Exon 2).
(Diese Primer amplifizieren ein Amplimer von 501 bp, das am 3'-Ende der Maus-cDNA liegt).
cyc5 ACCCCACCGTGTTCTTCGAC
acyc300 CATTTGCCATGGACAAGATG
und zur Amplifikation von Maus 15B3:
seq_15B3.1 GAGCTGCCAAGAAAGGGGGAGACT (in Exon 2)
seq_15B3.2 CAGAAAACACAAATGGACGGAGAG (in Exon 2).
(Diese Primer amplifizieren ein Amplimer von 501 bp, das am 3'-Ende der Maus-cDNA liegt).
Im Ergebnis zeigt sich eine deutliche Hochregulation um den
Faktor 2-3 von 15B3-RNA auf der ischämischen (linken) Hirn
hälfte 2 h nach dem ischämischen Ereignis (middle cerebral ar
tery occlusion von 90 min und 2 h Reperfusion, also in einem
Modell akuter Neurodegeneration (Fig. 2); die Fehlerbalken
zeigen Standardabweichungen, diese ergeben sich aus Messungen
mit 3-fach seriell verdünnten cDNA-Proben und spiegelt damit
die Reliabilität der Messergebnisse dar). Nach 24 h (in einem
permanenten Modell) hingegen konnte kein Unterschied mehr
festgestellt werden. Erfindungsgemäße Proteine, also bspw.
15B3 nimmt bei intrazellulären Signaltransduktionsprozessen
eine wichtige Funktion ein, weswegen sie auch bei pathologi
schen Prozessen (z. B. dem Schlaganfall) beteiligt sind.
Claims (30)
1. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Se
quenzbereich enthält, der für ein Polypeptid mit einer
Aminosäuresequenz von AS 312 bis AS 711 (15B3), AS 180
bis AS 579 (15B3-1) oder AS 306 bis AS 705 (15B3-2) (Nu
merierung gemäß Fig. 4) codiert, einschließlich aller
funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele, oder
hiermit hybridisierenden DNA-Sequenzen.
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
sie einen Sequenzbereich enthält, der für ein Polypeptid
mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 9, 11 oder 13
codiert, einschließlich aller funktionshomologen Deriva
te, Fragmente oder Allele, oder hiermit hybridisierenden
DNA-Sequenzen.
3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich
net, daß sie für ein Polypeptid gemäß Fig. 9, 11 oder
13 codiert, einschließlich aller funktionshomologen De
rivate, Fragmente oder Allele, oder hiermit hybridisie
renden DNA-Sequenzen.
4. DNA-Sequenz nach einem der vorgenannten Ansprüche, da
durch gekennzeichnet, daß sie die in Fig. 8, 10 oder 12
angegebene (c)DNA-Sequenz enthält.
5. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
6. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem
Expressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert ist.
7. Wirtszelle nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
sie eine Säugetierzelle, insbesondere eine humane Zelle,
ist.
8. Aufgereinigtes Genprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß
es durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis
4 codiert wird.
9. Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 8, dadurch ge
kennzeichnet, daß es ein Polypeptid ist.
10. Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 8 oder 9, da
durch gekennzeichnet, daß es die in Fig. 9, 11 oder 13
angegebene Aminosäuresequenz enthält, einschließlich al
ler funktionshomologen Allele, Fragmente oder Derivate.
11. Transgene Tiere, dadurch gekennzeichnet, daß sie gene
tisch dahingehend verändert, daß sie eine im Vergleich
zum Normaltier (spezifisch) veränderte Menge mindestens
einer Aminosäuresequenz nach Anspruch 9 oder 10 oder ei
ne spezifisch gegenüber einer nativen Sequenz (gemäß
Fig. 9, 11 oder 13) veränderte Aminosäuresequenz gemäß
Anspruch 9 oder 10 enthalten oder daß ihnen mindestens
eine Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 9 oder Teile davon
fehlt oder verändert vorliegt.
12. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Epitop
auf einem Genprodukt nach einem der Ansprüche 8 bis 10
erkennt.
13. Antikörper nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
er monoklonal ist.
14. Antikörper nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch
gekennzeichnet, daß er gegen einen Sequenzabschnitt auf
der cytoplasmatischen Domäne als Epitop gerichtet ist.
15. Verfahren zur Expression von Genprodukten nach einem der
Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Wirts
zellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5
transformiert werden.
16. Verfahren zur Isolierung von Genprodukten nach einem der
Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Wirts
zellen nach Anspruch 6 oder 7 unter geeigneten, die Ex
pression fördernden Bedingungen kultiviert werden und
das Genprodukt anschließend aus der Kultur aufgereinigt
wird.
17. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines
Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 als Arz
neimittel.
18. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1
bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8
bis 10 zur Behandlung (bzw. zur Herstellung eines Arz
neimittels zur Behandlung) von Erkrankungen, die auf
fehlgesteuerter Regulation von Zelltod- und/oder
Zellproliferationsereignissen beruhen.
19. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1
bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8
bis 10 zur Behandlung (bzw. zur Herstellung eines Arz
neimittels zur Behandlung) von Tumorerkrankungen und
neurologischen Erkrankungen, insbesondere Schlaganfall,
Multipler Sklerose, Morbus Parkinson, Amyotrophe Late
ralsklerose, Heredodegenerative Ataxien, Morbus Hunting
ton, Neuropathien und Epilepsien.
20. Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß sie die intra
zelluläre Funktion des Proteins 15B3, 15B3-1 und/oder
15B3-2 moduliert, insbesondere inhibiert.
21. Verbindung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekenn
zeichnet, daß sie eine organisch-chemische Verbindung
mit einem Molekulargewicht von vorzugsweise < 3000 ist.
22. Verbindung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch
gekennzeichnet, daß sie die Zellmembran durch Diffusion
oder über membranöse Transportproteine passiert.
23. Verfahren zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksa
men Verbindungen nach einem der Ansprüche 19 bis 22, da
durch gekennzeichnet, daß
- a) ein geeignetes Wirtszellsystem mit einem Expressions vektor nach Anspruch 5, insbesondere einem Expressi onsvektor, der für das Protein 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 codiert, und ggf. mindestens einem Expressi onsvektor, der für mindestens ein Reporter-Gen co diert, transfiziert wird, und
- b) ein zur Beobachtung der 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2 vermittelten Funktion, insbesondere ein zur Beobach tung der Apoptose, des Zellwachstums, der Zellproli feration und/oder der Zellplastizität geeigneter Pa rameter nach Zugabe einer Testverbindung im Vergleich zur Kontrolle ohne Zugabe einer Testverbindung für das gemäß (a) erhaltene Wirtszellsystem in einem ge eigneten Testsystem gemessen wird.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) der Bindungsplatz der pharmazeutisch wirksamen Verbindung auf einem erfindungsgemäßen Protein durch ein geeignetes biochemisches oder strukturbiologisches Verfahren ermit telt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeich
net, daß ein Parameter gemäß (b) innerhalb eines Assay
aufbaus für die Raf/MEK/ERK-Kaskade gemessen wird.
26. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 19 bis 22 zur
Behandlung von (bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels
zur Behandlung von) neurodegenerativen Erkrankungen,
insbesondere Alzheimer-Demenz und Morbus Parkinson, Mus
keldystrophie, viralen Infektionserkrankungen, Tumorer
krankungen und Autoimmunerkrankungen oder cerebralen I
schämien.
27. Verfahren zur Identifizierung eines zellulären Interak
tionspartner des Proteins 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2
oder eines nativen Allels, Fragments oder Derivats, wo
bei ein sog. "yeast-two-hybrid"-System eingesetzt wird.
28. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1
bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8
bis 10 zur Identifizierung von weiteren an der durch das
Protein 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2 vermittelten
Signaltransduktion beteiligten Proteinen.
29. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1
bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8
bis 10 als Suizidgen/-protein für die in vivo oder ex
vivo Transformation von Wirtszellen.
30. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 29, wobei das
Suizidgen operabel mit einem Promotor verbunden ist, wo
bei die Transkription reprimiert ist und nur im Bedarfs
fall aktiviert wird.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10106835A DE10106835A1 (de) | 2001-02-14 | 2001-02-14 | Signaltransduktionsproteine 15B3, 15B3-1 und 15B3-2 und zugrundeliegende DNA-Sequenzen |
AU2002250943A AU2002250943A1 (en) | 2001-02-14 | 2002-02-14 | Signal transduction proteins 15b3, 15b3-1 and 15b3-2, and related dna sequences |
PCT/EP2002/001562 WO2002064776A2 (de) | 2001-02-14 | 2002-02-14 | Signaltransduktionsproteine 15b3, 15b3-1 und 15b3-2 und zugrundeliegende dna-sequenzen |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10106835A DE10106835A1 (de) | 2001-02-14 | 2001-02-14 | Signaltransduktionsproteine 15B3, 15B3-1 und 15B3-2 und zugrundeliegende DNA-Sequenzen |
Publications (1)
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DE10106835A1 true DE10106835A1 (de) | 2002-09-05 |
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ID=7674010
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE10106835A Ceased DE10106835A1 (de) | 2001-02-14 | 2001-02-14 | Signaltransduktionsproteine 15B3, 15B3-1 und 15B3-2 und zugrundeliegende DNA-Sequenzen |
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