DE69839150T2 - Intrazelluläre glukocortikoid-induzierte leucin-zipper modulatoren von mechanismen des apoptotischen zelltodes - Google Patents

Intrazelluläre glukocortikoid-induzierte leucin-zipper modulatoren von mechanismen des apoptotischen zelltodes Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung liegt im Allgemeinen im Gebiet von Modulatoren apoptotischen Zelltods und Verwendungen davon bei therapeutischen Anwendungen, um Apoptose zu inhibieren oder zu verstärken, wie es in Abhängigkeit von der Krankheit und davon, ob es gewünscht wird, die erkrankten Zellen zu töten oder die erkrankten Zellen vor apoptotischem Zelltod zu retten oder nicht, gewünscht wird. Speziell betrifft die vorliegende Erfindung neue Gene, codierend neue Proteine, die zu der Leucin-Zipper-Familie gehören, welche fähig sind, durch das CD3/TCR-System oder durch das Fas/Fas-L-System vermittelte Apoptose zu inhibieren, und welche außerdem fähig sind, Lymphozytenaktivierung zu stimulieren.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Protein und das Gen, das dafür codiert, genannt GILR, Herstellung und Verwendungen davon sowie beliebige Isoformen, Analoga, Fragmente und Derivate von GILR, ihre Herstellung und Verwendungen.
  • Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
  • Apoptose (programmierter Zelltod) ist ein wichtiger intrazellulärer Prozess, der eine wichtige Rolle bei der normalen Zell- und Gewebeentwicklung sowie bei der Kontrolle von neoplastischem Wachstum spielt (Cohen, 1993; Osborne und Schwartz, 1994; Wyllie et al., 1980; Kerr et al., 1972; Bursch et al., 1992).
  • Eine Anzahl von Stimuli kann programmierten Zelltod entweder induzieren oder inhibieren durch Aktivierung von Molekülen, beteiligt bei der Signalgebung und Durchführung von Apoptose, die auf unterschiedlichen Ebenen, einschließlich der Zellmembran, des Zytoplasmas und des Zellkerns agieren. Unter diesen sind jene intrazellularen Moleküle, einschließlich einiger Transkriptionsfraktoren, zu erwähnen, von denen gezeigt worden ist, dass sie Zellwachstum regulieren. Insbesondere können Leucin-Zipper-Familie-Proteine, wie z. B. MYC, FOS und JUN, Zelltod modulieren (Shi et al., 1992; Smeyne et al., 1993; Goldstone und Lavin, 1994).
  • Apoptose ist auch bei T-Zell-Entwicklung wichtig (Dent et al., 1990; Ju et al., 1995; MacDonald und Lees, 1990). Insbesondere ist negative Selektion bedingt durch Apoptose, aktiviert durch die Antigen (Ag)-Wechselwirkung mit dem T-Zell-Rezeptor (TCR)/CD3-Komplex (Smith et al., 1989). Beteiligung des TCR/CD3-Komplexes, entweder durch APCs, die antigenes Peptid präsentieren, oder durch Anti-CD3-Antikörper, löst eine Reihe an Aktivierungsereignissen aus, wie z. B. die Expression des Fas/Fas-Ligand (Fas/Fas-L)-Systems, das Apoptose in Thymozyten, reifen T-Zellen und T-Zell-Hybridom induzieren kann (Alderson et al., 1995; Dhein et al., 1995; Ju et al., 1995; Jenkinson et al., 1989; Webb et al., 1990; Yang et al., 1995). Beispielsweise führt das Auslösen solcher Aktivierungsereignisse in T-Zell-Hybridomen zu Zellzyklus-Arretierung, gefolgt von Apoptose. Dieser Aktivierungs-induzierte Zelltod (AICD, Kabelitz et al., 1993) erfordert die Wechselwirkung von Fas mit Fas-L (Alderson et al., 1995; Itoh et al., 1991; Yang et al., 1995).
  • Es ist gezeigt worden, dass andere Stimuli, wie z. B. Cytokine und Glucocorticoidhormone (GCH), auch kritische Regulatoren von T-Zell-Entwicklung sind (Migliorati et al., 1993; Nieto et al., 1990; Nieto und Lopez-Rivas, 1989; Cohen und Duke, 1984; Wyllie, 1980). Beispielsweise kann Dexamethason (DEX), ein synthetisches GCH, welches von sich aus Apoptose in T-Zell-Hybridomen und in normalen T-Lymphozyten induziert, AICD, induziert durch Triggern des TCR/CD3-Komplexes (Zacharchuk et al., 1990) inhibieren. Diese Inhibition kann bedingt sein durch Verhindern von Aktivierungs-induzierter Expression von Fas und Fas-L (Yang et al., 1995).
  • Hinsichtlich des oben erwähnten Fas/Fas-L-Systems sollte angemerkt werden, dass Fas auch der FAS-Rezeptor oder FAS-R sowie CD95 genannt worden ist. Der Einfachheit halber wird dieser Rezeptor hierin durchgehend "Fas" genannt werden, und sein Ligand, wie oben angemerkt, wird hierin durchgehend "Fas-L" genannt werden.
  • Fas ist ein Mitglied der TNF/NGF-Superfamilie von Rezeptoren, und es teilt sich mit einer Anzahl von Zelloberflächen-Rezeptoren, einschließlich dem p55-TNF-Rezeptor und dem NGF-Rezeptor Homologie (siehe beispielsweise Boldin et al., 1995a und 1995b). Fas vermittelt Zelltod durch Apoptose (Itoh et al., 1991) und scheint als ein negativer Selektor autoreaktiver T-Zellen zu wirken, d. h., Fas vermittelt während Reifung von T-Zellen den apoptotischen Tod von T-Zellen, die Selbst-Antigene erkennen. Von Mutationen in dem Fas-Gen, wie z. B. den lpr-Mutationen in Mäusen, ist gezeigt worden, dass sie verantwortlich sind für eine Lymphproliferationsstörung in Mäusen, die der humanen Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematosus (SLE; Watanabe-Fukunaga et al., 1992) gleicht. Das Fas-L-Molekül ist offensichtlich ein Zelloberflächen-assoziiertes Molekül, das unter anderen von Killer-T-Zellen (oder cytotoxischen T-Lymphozyten – CTLs) getragen wird, und folglich sind sie, wenn solche CTLs mit Zellen in Kontakt treten, die Fas tragen, in der Lage, apoptotischen Zelltod der Fas-tragenden Zellen zu induzieren. Weiterhin ist ein monoklonaler Antikörper, spezifisch für Fas, hergestellt worden, welcher in der Lage ist, apoptotischen Zelltod in Zellen zu induzieren, die Fas tragen, einschließlich Mauszellen, transformiert mit cDNA, codierend humanes Fas (siehe beispielsweise Itoh et al., 1991).
  • Während manche der cytotoxischen Effekte von Lymphozyten vermittelt werden durch Wechselwirkung von Lymphozyten-produziertem Fas-L mit dem weit vorkommenden Fas, ist auch gefunden worden, dass verschiedene andere normale Zellen neben T-Lymphozyten auf ihrer Oberfläche Fas exprimieren und durch Triggern dieses Rezeptors getötet werden können. Unkontrollierte Induktion solch eines Tötungsprozesses steht im Verdacht, in bestimmten Krankheiten zu Gewebeschädigung beizutragen, beispielsweise der Zerstörung von Leberzellen bei akuter Hepatitis. Dementsprechend kann das Finden von Wegen, die cytotoxische Aktivität von Fas einzuschränken, therapeutisches Potential aufweisen.
  • Umgekehrt können, weil es auch gefunden worden ist, dass gewisse maligne Zellen und HIV-infizierte Zellen Fas auf ihrer Oberfläche tragen, Antikörper gegen Fas oder Fas-L selbst verwendet werden, um in diesen Zellen Fas-vermittelte cytotoxische Effekte auszulösen bzw. zu triggern, und dadurch ein Mittel für das Bekämpfen solcher maligner Zellen oder HIV-infizierter Zellen bereitzustellen (siehe beispielsweise Itoh et al., 1991). Das Finden noch anderer Wege für das Verstärken der cytotoxischen Aktivität von Fas kann deshalb auch therapeutisches Potential aufweisen.
  • Wie oben angemerkt, ist Fas mit einem der TNF-Rezeptoren, nämlich dem p55-TNF-Rezeptor, verwandt. TNF (sowohl TNF-α als auch TNF-β, und, wie durchgehend verwendet, wird sich "TNF" auf beide beziehen) hat viele Effekte auf Zellen (siehe beispielsweise Wallach, D. (1986) in: Interferon 7 (Ion Gresser, Hrsg.), S. 83–122, Academic Press, London; und Beutler und Cerami (1987)).
  • TNF übt seine Effekte durch Binden an seine Rezeptoren, den p55-TNF-Rezeptor und den p75-TNF-Rezeptor, aus. Manche der TNF-induzierten Effekte sind für den Organismus vorteilhaft, wie z. B. Zerstörung von Tumorzellen und von Virus-infizierten Zellen und Vergrößerung antibakterieller Aktivitäten von Granulozyten. Auf diese Weise trägt TNF zu der Verteidigung des Organismus gegen Tumoren und infektiöse Agenzien bei und trägt der Erholung von Verletzung bei.
  • Folglich kann TNF als ein Anti-Tumor- und anti-infektiöses Mittel verwendet werden. Jedoch kann TNF auch schädliche Effekte haben. Beispielsweise kann Überproduktion von TNF eine pathogene Rolle in mehreren Krankheiten haben, einschließlich u. a. septischem Schock (Tracey et al., 1986); übermäßigem Gewichtsverlust (Kachexie); Gewebeschädigung in rheumatischen Krankheiten (Beutler und Cerami, 1987); Gewebeschädigung in Transplantat-Wirt-Reaktionen (Piquet et al., 1987); und Gewebeschädigung bei Entzündung, um nur einige der pathogenen Wirkungen von TNF zu nennen.
  • Die obigen zytoziden bzw. Zell-zerstörenden Effekte von TNF werden in den meisten bisher untersuchten Zellen vorwiegend durch den p55-TNF-Rezeptor vermittelt, wobei diese Aktivität abhängig ist von der Integrität der intrazellulären Domäne dieses Rezeptors (siehe beispielsweise Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993). Zusätzlich dazu zeigen Mutationsstudien an, dass Fas und der p55-TNF-Rezeptor, die verwandt sind, intrazelluläre Signalgebungsprozesse, die letztlich in Zelltod resultieren, über bestimmte Regionen innerhalb ihrer intrazellulären Domänen vermitteln (siehe außerdem beispielsweise Itho und Nagata, 1993). Diese Regionen, die auch als "Todesdomänen" („death domains") bezeichnet werden, und die in diesen beiden Rezeptoren vorhanden sind, weisen Sequenzähnlichkeit auf. Die "Todesdomänen" von Fas und dem p55-TNF-Rezeptor sind zur Selbstassoziierung fähig, welche offensichtlich wichtig ist für das Fördern der Rezeptoraggregation, die notwendig ist für das Initiieren intrazellulärer Signalgebung (siehe beispielsweise Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995a, b), und welche bei hohen Leveln an Rezeptorexpression in dem Triggern Ligandenunabhängiger Signalgebung resultieren kann (Boldin et al., 1995a, b).
  • Jüngere Studien haben angezeigt, dass die cytotoxischen Effekte, vermittelt von Fas und dem p55-TNF-Rezeptor, einen intrazellulären Signalgebungsweg involvieren, welcher eine Anzahl von Protein-Protein-Wechselwirkungen einschließt, die von dem ursprünglichen Liganden-Rezeptor-Binden zu der letztendlichen Aktivierung enzymatischer Effektorfunktionen führen, und welche nicht-enzymatische Protein-Protein-Wechselwirkungen einschließen, welche beteiligt sind an der Initiierung der Signalgebung für Zelltod (siehe außerdem, z. B., Nagata und Golstein, 1995; Vandenabeele et al., 1995; und Boldin et al., 1995a, b). Offensichtlich resultiert das Binden des trimeren Fas-L und TNF an ihre Rezeptoren in der Wechselwirkung der intrazellulären Domänen dieser Rezeptoren, welche vergrößert wird durch eine Neigung der Todesdomänen-Regionen oder Motive zur Selbstassoziation (Boldin et al., 1995a, b), und in induziertem Binden wenigstens zweier anderer cytoplasmatischer Proteine (welche auch aneinander binden können) an die intrazellulären Domänen dieser Rezeptoren, nämlich des Proteins MORT-1 (auch FADD genannt), welches an Fas bindet (siehe Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995), und des Proteins TRADD, welches an den p55-TNF-Rezeptor bindet (siehe Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996). Ein drittes solches intrazelluläres Protein, genannt RIP (siehe Stanger et al., 1995) ist auch identifiziert worden, welches an die intrazellulären Domänen sowohl von Fas, als auch des p55-TNF-Rezeptors bindet. RIP kann auch mit TRADD und MORT-1 Wechselwirken. Folglich erlauben diese drei intrazellulären Proteine einen funktionalen "Crosstalk" zwischen Fas und dem p55-TNF-Rezeptor. Die Wechselwirkungen zwischen diesen Rezeptoren und ihren assoziierten Proteinen (MORT-1, TRADD, RIP) geschieht durch die "Todesdomäne"-Motive, die in jedem dieser Rezeptoren und Proteine vorhanden sind.
  • Folglich scheinen die "Todesdomäne" Motive von dem p55-TNF-Rezeptor und von Fas sowie von ihren drei assoziierten Proteinen MORT-1, RIP und TRADD, die Orte der Protein-Protein-Wechselwirkungen, zu sein. Diese drei Proteine MORT-1, RIP und TRADD stehen mit intrazellulären Domänen von dem p55-TNF-Rezeptor und von Fas durch das Binden ihrer Todesdomänen an jene der Rezeptoren in Wechselwirkung, und für sowohl für RIP als auch TRADD selbstassoziieren ihre Todesdomänen auch, obwohl MORT-1 sich in dieser Hinsicht dadurch unterscheidet, dass seine Todesdomäne nicht selbstassoziiert. Dementsprechend würde es scheinen, dass die Wechselwirkung zwischen den drei Proteinen MORT-1, RIP und TRADD ein wichtiger Teil der Gesamtmodulation der intrazellulären Signalgebung, vermittelt durch diese Proteine, ist. Beeinträchtigung der Wechselwirkung zwischen diesen drei intrazellulären Proteinen wird in der Modulation der Effekte, verursacht durch diese Wechselwirkung, resultieren. Beispielsweise kann Inhibition von TRADD-Binden an MORT-1 die Fas-p55-TNF-Rezeptor-Wechselwirkung modulieren. Ähnlich dazu kann Inhibition von RIP, zusätzlich zu der obigen Inhibition von TRADD-Binden an MORT-1, Fas-p55-TNF-Rezeptor-Wechselwirkung weiter modulieren.
  • Kürzliche Studien haben auch eine Gruppe von cytoplasmatischen Thiolproteasen, welche strukturell verwandt sind mit der Caenorhabditis elegans-Protease CED3 und dem Säuger- Interleukin-1β-Umwandlungsenzym (ICE, "interleukin-1β converting enzyme"), beim Beginn verschiedener physiologischer Zelltod-Prozesse mit einbezogen (von Kumar, 1995, und Henkart, 1996, in Übersichtsartikeln, behandelt). Es gab auch einige Hinweise, dass eine Protease/Proteasen dieser Familie bei der Zell-Cytotoxizität, induziert von Fas und TNF-Rezeptoren, teilnehmen kann können. Es wurde gefunden, dass spezifische Peptid-Inhibitoren der Proteasen und zweier Virus-codierte Proteine, die ihre Funktion blockieren, das Kuhpocken-Protein crmA und das Bakulovirus-p35-Protein, Zellen Schutz gegen diese Zell-Cytotoxizität verleihen (Enari et al., 1995; Los et al., 1995; Tewari et al., 1995; Xue et al., 1995; Beidler et al., 1995). Rasche Spaltung gewisser spezifischer zellulärer Proteine, offenbar vermittelt durch Protease(n) der CED3/ICE-Familie, konnte in Zellen kurz nach Stimulation von Fas oder TNF-Rezeptoren (sowohl dem p55-TNF-Rezeptor als auch dem p75-TNF-Rezeptor) gezeigt werden.
  • Eine solche Protease und verschiedene Isoformen davon (einschließlich inhibitorischer), bezeichnet als MACH, welche ein MORT-1-Bindungsprotein ist, und welche dazu dient, die Aktivität von MORT-1, und folglich von Fas und dem p55-TNF-Rezeptor, zu modulieren, und welche auch unabhängig von MORT-1 wirken kann, ist kürzlich isoliert, kloniert und charakterisiert worden, und außerdem ihre möglichen Verwendungen beschrieben worden, wie im Detail in der internationalen Anmeldung Nr. PCT/US96/10521, und in einer kürzlichen Veröffentlichung (Boldin et al., 1996) im Detail dargelegt ist. Eine weitere solche Protease und verschiedene Isoformen davon (einschließlich inhibitorischer Isoformen), die als Mch4 bezeichnet wird, ist kürzlich auch isoliert und charakterisiert worden (Fernandes-Alnemri et al., 1996; Srinivasula et al., 1996). Dieses Mch4-Protein ist auch ein MORT-1-Bindungsprotein, welches dazu dient, die Aktivität von MORT-1, und folglich wahrscheinlich auch von Fas und dem p55-TNF-Rezeptor, zu modulieren, und welches auch unabhängig von MORT-1 wirken kann.
  • Darüber hinaus ist kürzlich auch gefunden worden, dass neben den oben erwähnten Zellcytotoxizitäts-Aktivitäten und der Modulation davon, vermittelt durch die verschiedenen Rezeptoren und ihre Bindungsproteine, einschließlich Fas, p55-TNF-Rezeptor, MORT-1, TRADD, RIP, MACH und Mch4, eine Anzahl dieser Rezeptoren und ihrer Bindungsproteine auch beteiligt sind an der Modulation der Aktivität des Kerntranskriptionsfaktors NF-κB, welcher ein Hauptvermittler von Zellüberleben oder -lebensfähigkeit ist und verantwortlich ist für die Kontrolle der Expression vieler Immun- und Entzündungsreaktionsgene. Beispielsweise ist gefunden worden, dass TNF-α in der Tat die Aktivierung von NF-κB stimulieren kann, und folglich ist TNF-α fähig, in Zellen zwei Signale zu induzieren, eines, das Zelltod auslöst, und ein weiteres, das Zellen gegen Zelltod-Induktion durch Induzieren von Genexpression via NF-κB schützt (siehe Beg und Baltimore, 1996; Wang et al., 1996; Van Antwerp et al., 1996). Über einen ähnlichen dualen Effekt für Fas ist auch berichtet worden (siehe Referenz zu diesem Effekt, wie dargelegt, in obigem Van Antwerp et al., 1996). Deshalb würde es scheinen, dass eine empfindliche Balance zwischen Zelltod und Zellüberleben bei Stimulation verschiedener Typen von Zellen mit TNF-α und/oder dem Fas-L besteht, wobei das letztendliche Ergebnis der Stimulation davon abhängt, welcher intrazelluläre Weg in einem größeren Ausmaß stimuliert wird, der eine, der zu Zelltod führt (gewöhnlich mittels Apoptose), oder der andere, der zu Zellüberleben mittels Aktivierung von NF-κB führt.
  • Zusätzlich dazu ist kürzlich weiterhin der mögliche Weg aufgeklärt worden, durch welchen Mitglieder der TNF/NGF-Rezeptor-Familie NF-κB aktivieren (siehe Malinin et al., 1997, und die verschiedenen relevanten Referenzen, die darin dargelegt sind). Kurz gesagt ergibt sich, dass einige Mitglieder der TNF/NGF-Rezeptor-Familie fähig sind, NF-κB durch ein allgemeines Adapterprotein, Traft, zu aktivieren. Eine neu aufgedeckte Proteinkinase, genannt NIK (siehe obiges Malinin et al., 1997), ist fähig, an Traf2 zu binden und NF-κB-Aktivität zu stimulieren. Tatsächlich wurde gezeigt (siehe oben genanntes Malinin et al.), dass Expression in Zellen von Kinase-defizienten NIK-Mutanten darin resultiert, dass die Zellen unfähig sind, die Stimulation von NF-κB in einer normalen endogenen Weise aufzuweisen, und außerdem darin resultiert, dass die Zelle eine Blockade bei der Induktion von NF-κB-Aktivität durch TNF, via entweder dem p55-TNF-Rezeptor oder Fas, aufweist, und eine Blockade in NF-κB-Induktion durch TRADD, RIP und MORT-1 (welches Adapterproteine sind, die diese p55-TNF- und/oder Fas-Rezeptoren binden) aufweist. Alle der Rezeptoren p55-TNF- und p75-TNF-Rezeptoren und Fas, und ihre Adapterproteine MORT-1, TRADD und RIP, binden direkt oder indirekt an Traf2, welches durch sein Bindungsvermögen an NIK offensichtlich die Induktion von NF-κB moduliert.
  • Es ist ein lange gefühltes Bedürfnis gewesen, einen Weg für das Modulieren der zellulären Antwort auf Fas-L und auf TNF bereitzustellen. Beispielsweise wäre es in den oben erwähnten pathologischen Situationen, in denen Fas-L oder TNF überexprimiert wird oder auf andere Weise in überschüssigen Mengen vorhanden ist oder in denen Fas oder wenigstens der p55-TNF-Rezeptor überaktiviert oder überexprimiert ist, wünschenswert, die Fas-L- oder TNF-induzierten zytoziden Effekte zu inhibieren, wobei es in anderen Situationen, z. B. in Tumorzellen oder bei Wundheilungsanwendungen, wünschenswert wäre, den TNF-Effekt zu verstärken, oder im Fall von Fas, in Tumorzellen oder HIV-infizierten Zellen, es wünschenswert wäre, den Fas-vermittelten Effekt zu verstärken. Zu diesem Zweck sind eine Anzahl an Vorgehensweisen versucht worden, gerichtet auf die Rezeptoren selbst (um ihre Aktivität oder Menge je nach Fall zu verstärken oder zu inhibieren), oder gerichtet auf die Signalgebungspfade, wie oben erwähnt, in welchen diese Rezeptoren oder ihre assoziierten Proteine eine Rolle spielen (um die Aktivitäten oder Mengen der Rezeptoren oder ihrer assoziierten Proteine je nach Fall zu verstärken oder zu inhibieren).
  • Jedoch ist vordem die Rolle von Glucocorticoidhormonen (GCH) bei der Regulation von Lymphozyten-Apoptose nicht aufgeklärt gewesen, insbesondere die Rolle, die GCH beim Induzieren von Genexpression haben, deren Produkt(e) Apoptose in T-Zellen (und möglicherweise auch anderen Zellen) moduliert/modulieren, wobei diese Modulation mittels direkter oder indirekter Wechselwirkung sein kann mit, oder anderen Mitteln an Modulation von, den Fasvermittelten oder den assoziierten/verwandten p55-TNF-Rezeptor-vermittelten intrazellulären Signalgebungswegen, die zu Zelltod führen (mittels Apoptose, bei welcher verschiedene Proteasen wie oben erwähnt beteiligt sind) oder zu Zellüberleben führen (via Induktion von NF-κB-Aktivierung, wie oben erwähnt).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Rolle von Glucocorticoidhormonen (GCH) bei der Regulation von Lymphozyten-Apoptose aufzuklären, insbesondere, das Gen/die Gene oder das Genprodukt/die Genprodukte, induziert von GCH, aufzuklären, welche Apoptose in T-Zellen oder in anderen Zellen modulieren kann/können. Folglich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Gen/neue Gene bereitzustellen, welches/welche durch GCH induziert ist/werden und dessen Produkt/deren Produkte Apoptose in T-Zellen oder anderen Zellen modulieren kann/können.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Proteine, einschließlich aller Isoformen, Analoga, Fragmente oder Derivate davon, bereitzustellen, welche codiert sind von dem neuen GCH-induzierten Gen/den neuen GCH-induzierten Genen, wobei diese Proteine, Isoformen, Analoga, Fragmente oder Derivate Apoptose in T-Zellen oder in anderen Zellen modulieren können. Diese neuen Proteine, Isoformen, Analoga, Fragmente oder Derivate können Apoptose durch Modulieren der Signalgebungsaktivität von Fas oder dem p55-TNF-Rezeptor intrazellulär auf einem direkten oder indirekten Weg modulieren, oder können Apoptose in einer gänzlich Fas-unabhängigen und/oder p55-TNF-Rezeptor-unabhägigen Weise modulieren durch Modulieren der Aktivität anderer intrazellulärer Mediatoren von Apoptose. Es sollte verstanden werden, dass die Modulation von Apoptose eine Verstarkung/Vergrößerung von apoptotischem Zelltod sein kann oder eine Inhibition von apoptotischem Zelltod sein kann, wobei diese die möglichen Wege der direkten Modulation von Apoptose sind, sei es via Fas- oder p55-TNF-Rezeptor-vermittelter Wege (einschließlich von all den assoziierten Proteinen/Enzymen in diesen Wegen, wie oben angemerkt) oder via anderer Wege, die andere intrazelluläre Mediatoren von Apoptose einbeziehen.
  • Indirekte Modulation von Apoptose soll verstanden werden als, z. B., Induktion durch direkte oder indirekte Wege von Zellüberlebenswegen (d. h., Induktion von NF-κB-Aktivierung oder anderen solchen mit Zellüberleben in Beziehung stehenden Wegen), wobei diese Zellüberlebenswege im Wesentlichen apoptotischen Wegen entgegenwirken.
  • Antagonisten (z. B. Antikörper, Peptide, organische Verbindungen oder sogar manche Isoformen, Analoga, Fragmente oder Derivate) zu den obigen neuen Proteinen, Isoformen, Analoga, Fragmenten oder Derivaten davon, können verwendet werden, um ihre Aktivität in dem intrazellulären Signalgebungsprozess, an welchem sie beteiligt sind, zu inhibieren, und folglich, um Apoptose zu inhibieren, oder umgekehrt, um Apoptose zu verstärken (Zellüberleben zu inhibieren), wie es gewünscht wird und abhängig von der Aktivität des Proteins, der Isoform, der Analoga, des Fragments oder Derivats, die Aktivität wessen/derer durch den Antagonisten inhibiert werden soll. Beispielsweise würde, wenn ein neues Protein, eine neue Isoform, ein neues Analogon, Fragment oder Derivat der Erfindung Apoptose erhöhend ist, solch ein Antagonist dann dazu dienen, diese vergrößernde Rolle zu blockieren und letztendlich Zelltod mittels Apoptose zu blockieren oder zu reduzieren. Ähnlich würde, wenn ein neues Protein, eine neue Isoform, ein neues Analogon, Fragment oder Derivat der Erfindung inhibitorisch für Apoptose ist, solch ein Antagonist dann dazu dienen, diese inhibitorische Aktivität zu blockieren und Letztendlich Apoptose zu verstärken oder zu vergrößern, d. h., in erhöhtem Zelltod resultieren.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, die neuen Proteine, Isoformen, das Analogon, die Fragmente und Derivate davon zu verwenden, um zusätzliche Proteine oder Faktoren zu isolieren oder charakterisieren, welche an GCH-induzierter Modulation von Apoptose beteiligt sein können (d. h., ein GCH-induziertes Produkt/GCH-induzierte Produkte von Genexpression, fähig zum Modulieren von Apoptose in T-Zellen und anderen Zellen), wobei die Modulation wie oben erwähnt sein kann. Beispielsweise können andere Proteine isoliert werden, welche mit den neuen Proteinen der Erfindung Wechselwirken können und ihre Aktivität beeinflussen können, oder es können andere Rezeptoren oder intrazelluläre Mediatoren weiter stromaufwärts oder stromabwärts in dem Signalgebungsprozess/den Signalgebungsprozessen isoliert werden, mit welchen die neuen Proteine der vorliegenden Erfindung Wechselwirken, und in deren Funktion die neuen Proteine der Erfindung folglich auch involviert sind.
  • Weiterhin ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die oben aufgeführten neuen Proteine, Isoformen, Analoga, Fragmente und Derivate als Antigene für die Herstellung polyklonaler und/oder monoklonaler Antikörper gegen diese zu verwenden. Die Antikörper können wiederum verwendet werden beispielsweise für die Reinigung der neuen Proteine aus unterschiedlichen Quellen, wie z. B. Zellextrakten oder transformierten Zelllinien. Diese Antikörper können auch verwendet werden für diagnostische Zwecke, z. B. zum Identifizieren von Störungen, die in Beziehung stehen zu abnormalem Funktionieren zellulärer Effekte, induziert durch GCH und/oder vermittelt durch die Signalgebungsprozesse, in welchen die neuen Proteine der Erfindung eine Rolle spielen, wie z. B. den apoptotischen Wegen, vermittelt durch Fas und/oder den p55-TNF-Rezeptor, oder Zellüberlebenswege, die die Induktion von NF-κB-Aktivierung beinhalten, oder irgendeinen anderen solchen Weg, in welchem ein solches GCH-induziertes Produkt/solche GCH-induzierten Produkte eine Rolle spielt/spielen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die die obigen neuen Proteine, Isoformen, Analoga, Fragmente oder Derivate umfassen, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die die oben erwähnten Antikörper umfassen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind ein neues Gen und ein neues Protein, codiert von diesem Gen, identifiziert und isoliert worden. Das neue Gen ist als GILR (für: Glucocorticoid-induziertes Leucin-Zipper-Familie-zugehöriges Gen; "Glucocorticoid Induced Leucinezipper familiy Related gene") bezeichnet worden, welches ein neues Mitglied der Leucin-Zipper-Familie codiert. Die Bezeichnung GILZ (Glucocorticoid-induziertes Leucin-Zipper-Gen; "Glu cocorticoid Induced Leucine-Zipper gene") kann ebenso als ein Synonym („synonymous") verwendet werden. Das Maus-GILR-Protein ist ein Protein von 137 Aminosäureresten, dadurch gekennzeichnet, dass es vier Leucin-Reste (an Positionen 76, 83, 90 und 97 – siehe 2 und SEQ ID NO: 2), mit Abstand von („spanned by") von 7 Aminosäuren, und einen Asparagin-Rest (an Position 87 – siehe 2 und SEQ ID NO: 2) innerhalb der Leucin-Zipper-Domäne aufweist (siehe 4). Das neue GILR-Gen und das Produkt, das es codiert, das das neue GILR-Protein ist, wurden identifiziert und isoliert, folgend auf Dexamethason (DEX)-Behandlung von Zellen. DEX ist ein gut bekanntes Glucocorticoidhormon, und folglich stellen das GILR-Gen und GILR-Protein ein neues Glucocorticoid-induziertes Gen bzw. Protein dar. Weiterhin scheint es, dass das GILR-Gen in Thymozyten und peripheren T-Zellen induziert wird und man auch findet, dass es in normalen Lymphozyten von dem Thymus, der Milz und den Lymphknoten exprimiert wird. Wenig oder keine Expression des GILR-Gens wurde in anderen nichtlymphoiden Geweben, einschließlich Gehirn, Niere und Leber, detektiert.
  • Unter Verwendung des zuvor klonierten Maus-GILR als eine Sonde, ist das humane Homolog von GILR kloniert und sequenziert worden (siehe 13 und SEQ ID NO: 5), was den hohen Level an Konserviertheit dieser Sequenz demonstriert.
  • Hinsichtlich der biologischen Aktivität des neuen GILR-Proteins zeigen die experimentellen Ergebnisse an, dass dieses Protein wenigstens eine wichtige Aktivität aufweist, die sein Vermögen ist, T-Zellen selektiv vor Apoptose zu schützen. Spezifischer schützt GILR-Expression T-Zellen selektiv vor Apoptose, die durch Behandlung der T-Zellen mit monoklonalem Anti-CD3-Antikörper (mAk), jedoch nicht durch Behandlung mit anderen apoptotischen Stimuli induziert wird. Dieser spezifische anti-apoptotische Effekt korreliert mit der Inhibition von Fas- und Fas-L-Expression.
  • Demgemäß kann GILR-Expression auch dazu dienen, andere intrazelluläre Wege, wie oben erwähnt, in welchen Fas beteiligt ist, wenn auch indirekt, zu modulieren, beispielsweise die apoptotischen Prozesse, die Fas und dem p55-TNF-Rezeptor gemeinsam sind, in welchen ihre assoziierten Proteine und Enzyme (z. B. MORT-1, TRADD, RIP, MACH, Mch4) beteiligt sind, welche letztlich Zelltod durch Apoptose verursachen. GILR kann deshalb durch spezifisches Inhibieren von Fas- und Fas-L-Expression auch Wege inhibieren, in welchen Fas zusammen mit dem p55-TNF-Rezeptor agiert, bedingt durch den "Crosstalk" zwischen diesen Rezeptoren, vermittelt durch die obigen Proteine, welche an beide dieser Rezeptoren binden. Folglich kann, während GILR-Expression dazu dienen kann, Fas- und Fas-L-Expression in einer direkten Weise und zu einem bestimmten Ausmaß zu inhibieren, GILR-Expression auch dazu dienen, die intrazelluläre Signalgebungsaktivität des p55-TNF-Rezeptors zu inhibieren, wenngleich in einer indirekten Weise und möglicherweise in einem geringeren Ausmaß. Zusätzlich dazu ist Fas, wie oben erwähnt auch beteiligt an der Induktion von NF-κB-Aktivierung, und folglich kann GILR-Expression, welche FAS-Expression inhibiert, möglicherweise auch dazu dienen, diese Aktivität von Fas zu reduzieren, wenngleich mit offensichtlich weniger schädlichen Effekten an den Zel len, weil in erster Linie das Blockieren von Fas-vermittelter Apoptose dazu dienen würde, die Zellen in einem größeren Ausmaß vor Zelltod zu bewahren als NF-κB-Aktivierung die Zellen retten würde.
  • Angesichts des oben Erwähnten zeigt sich z. B. auch, dass, wenn es erwünscht ist, Zellen, z. B. Tumorzellen oder HIV-infizierte Zellen, zu töten, es dann wünschenswert wäre, GILR-Expression zu inhibieren, während im Gegensatz dazu, wenn es erwünscht wäre, die Zellen, z. B. Leberzellen in Hepatitis-Patienten, zu schützen, es dann erwünscht wäre, die Expression von GILR zu erhöhen oder seine Aktivität zu vergrößern. Andere Verwendungen von GILR und der Kontrolle seiner Expression werden hierin unten in größerem Detail dargelegt werden.
  • Wie hierin unten im Detail angegeben, war es durch Vergleichen unbehandelter und DEX-behandelter Zellen (z. B. von Maus-Thymozyten, obwohl irgendwelche Säuger-Thymozyten und/oder periphere T-Zellen und/oder andere Lymphozyten, wie z. B. jene, erhalten von Menschen, gleichermaßen verwendet werden können) durch Einsetzen der Subtraktionssondentechnik („Subtraction probe technique") möglich, das neue GILR-Gen der vorliegenden Erfindung zu identifizieren, isolieren und zu klonieren.
  • Das neue GILR-Protein der Erfindung ist angesichts des oben Erwähnten und wie hierin unten dargelegt, ein Modulator von Apoptose in Lymphozyten im Allgemeinen und ist insbesondere offenbar ein Inhibitor von Fas- (und Fas-L-) vermittelter Apoptose, insbesondere in T-Lymphozyten.
  • Sequenzieren des neuen GILR-Gens und -Proteins hat aufgeklärt, dass diese neu sind, wie es auf Vergleichen der GILR-Nucleotid- und Aminosäuresequenzen (siehe 2 und 13) mit bekannten Sequenzen in verschiedenen Datenbanken basiert.
  • Diese Vergleiche deckten eine gewisse Homologie zwischen diesen GILR-Sequenzen und irgendwelchen bekannten Sequenzen auf.
  • Die Proteine, die den höheren Grad an Homologie zeigen, sind hDIP (Vogel et al., 1996) und humanes TSC-22 (Jay et al., 1996)(15). Alle enthalten eine ähnliche Leucin-Zipper-Domäne (4). Beide dieser Proteine sind dürftig als potentielle Transkriptionsfaktoren mit einer weit ausgedehnten Verteilung in unterschiedlichen Geweben charakterisiert worden. In dieser Hinsicht zeigt GILR ein klar unterschiedliches Expressionsprofil und eine klar unterschiedliche Aktivität, wie es in den Beispielen demonstriert werden wird.
  • Zusammenfassend zeigt sich, basierend auf dem oben Erwähnten und indem man auch die biologischen Eigenschaften der Leucin-Zipper-Familie, von welcher GILR ein Mitglied ist, in Betracht zieht, dass im Allgemeinen GILR verwendet werden kann, um Lymphozytenaktivität zu stimulieren und Zellen vor apoptotischem Zelltod zu retten. GILR kann natürlich auch als eine Sonde verwendet werden, um andere Moleküle zu isolieren, welche an GILR binden und welche dazu dienen können, seine Aktivität zu modulieren, oder auf andere Weise an intrazellulären Signalgebungsprozessen beteiligt sein können.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz bereit, codierend ein Glucocorticoid-induziertes Leucin-Zipper-Familie-verwandtes bzw. Leucin-Zipper-Familiezugehöriges Protein (GILR), Isoformen, Fragmente oder Analoga davon, wobei das GILR, die Isoformen, Fragmente oder Analoga davon fähig sind, Apoptose zu inhibieren und Lymphozytenaktivität zu stimulieren.
  • Ausführungsformen der DNA-Sequenz der Erfindung schließen ein:
    • (a) eine cDNA-Sequenz, abgeleitet von der codierenden Region eines nativen GILR-Proteins;
    • (b) DNA-Sequenzen, fähig zur Hybridisierung an eine Sequenz von (a) unter moderat stringenten Bedingungen, und welche ein biologisch aktives GILR-Protein codieren; und
    • (c) DNA-Sequenzen, welche als ein Ergebnis des genetischen Codes gegenüber dem (a) und (b) definierten Sequenzen degeneriert sind und welche in biologisch aktives GILR-Protein codieren.
  • Andere Ausführungsformen der obigen DNA-Sequenzen sind Sequenzen, umfassend wenigstens einen Teil der DNA-Sequenz, dargestellt in SEQ ID NO: 1, und codierend wenigstens ein/eine aktive(s) GILR-Protein, -Isoform, -Analogon oder -Fragment; sowie eine DNA-Sequenz, codierend ein(e) GILR-Protein, -Isoform, -Analogon oder -Fragment, das wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID NO: 2, aufweist.
  • Weitere Ausführungsformen der obigen DNA-Sequenz sind Sequenzen, umfassend wenigstens einen Teil der DNA-Sequenz, dargestellt in SEQ ID NO: 5, und codierend wenigstens ein(e) aktive(s) humane(s) GILR-Protien, -Isoform, -Analogon oder -Fragment; sowie eine DNA-Sequenz, codierend ein(e) humane(s) GILR-Protein, -Isoform, -Analogon oder -Fragment, das wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID NO: 6, aufweist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Vektor bereit, umfassend irgendeine der obigen DNA-Sequenzen.
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung sind fähig, in einer eukaryotischen Wirtszelle exprimiert zu werden oder in einer prokaryotischen Wirtszelle exprimiert zu werden.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung auch transformierte eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, enthaltend irgendwelche der obigen Vektoren, bereit.
  • Durch einen anderen Aspekt der Erfindung ist bereitgestellt ein GILR-Protein, eine Isoform, ein Fragment, funktionale Analoga oder Derivate davon, codiert von irgendeiner der obigen DNA-Sequenzen, wobei das Protein, die Isoform, das Fragment, die Analoga und Derivate davon fähig sind, Apoptose zu inhibieren und Lymphozytenaktivität zu stimulieren.
  • Ausführungsformen der obigen Proteine, etc., der Erfindung beinhalten ein GILR-Protein, eine Isoform, ein Fragment, Analoga und Derivate davon, wobei das Protein, die Isoform, die Analoga, die Fragmente und Derivate wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Herstellen des GILR-Proteins, der Isoform, des Fragments, der Analoga oder der Derivate davon bereit, umfassend Kultivieren der transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, geeignet für die Expression des Proteins, der Analoga oder Derivate, Bewirken posttranslationaler Modifikationen, wie sie notwendig sind, um das Protein, die Fragmente, Analoga oder Derivate zu erhalten, und Isolieren des/der exprimierten Proteins, Fragmente, Analoga oder Derivate.
  • In einem weiteren Aspekt sind außerdem Antikörper oder aktive Fragmente oder Derivate davon bereitgestellt, spezifisch für das GILR-Protein, die Isoform, das Fragment, die Analoga oder Derivate der Erfindung.
  • Die obigen DNA-Sequenzen und GILR-Proteine, etc., die dadurch codiert sind, der Erfindung haben viele mögliche Verwendungen, und demgemäß stellt die vorliegende Erfindung außerdem die folgenden Verfahren bereit. Es muss betont werden, dass man sich vorstellt, dass andere therapeutische Verwendungen von GILR, seinen Isoformen, Analoga, Fragmenten und Derivaten, sowie Antikörper dagegen und weitere Antagonisten von GILR-Aktivität, z. B. Peptide, auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind, wie es (sie) in der detaillierten Beschreibung dargelegt sind oder wie sie sich aus der untenstehenden Offenbarung hierin zeigen. Demgemäß sind die Folgenden nur repräsentativ für die verschiedenen offenbarten Verfahren.
    • (i) Ein Verfahren für die Inhibition von Apoptose in Zellen, vermittelt durch das Fas/Fas-L-System, CD3/TCR-System oder andere intrazelluläre Mediatoren von Apoptose, umfassend Behandeln der Zellen mit einem/einer oder mehreren GILR-Proteinen, -Isoformen, -Analoga, -Fragmenten oder -Derivaten, wobei das Behandeln der Zellen das Einführen des/der ein oder mehreren Proteine, Isoformen, Analoga, Fragmente oder Derivate in einer für dessen/deren intrazelluläre Einführung geeignete Form in die Zellen, oder Einführen einer DNA-Sequenz, codierend die/das ein oder mehrere/n Proteine, Isoformen, Analoga, Fragmente oder Derivate in der Form eines geeigneten Vektors, der die Sequenz trägt, in die Zellen, wobei der Vektor fähig ist, die Insertion der Sequenz in die Zellen in einer Weise zu bewirken, dass die Sequenz in den Zellen exprimiert wird, umfasst.
    • (ii) Ein Verfahren, wie in (i) oben für die Inhibition von Apoptose in Zellen, wobei das Behandeln von Zellen Einführen in die Zellen einer DNA-Sequenz, codierend das/die GILR-Protein, -Isoformen, -Analoga, -Fragmente oder -Derivate in der Form eines geeigneten Vektors, der die Sequenz trägt, umfasst, wobei der Vektor fähig ist, die Insertion der Sequenz in die Zellen in einer Weise zu bewirken, dass die Sequenz in den Zellen exprimiert wird.
    • (iii) Ein Verfahren, wie in (i) oder (ii) oben, wobei das Behandeln der Zellen durch Transfektion der Zellen mit einem rekombinanten Tier-Virus-Vektor ist, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Konstruieren eines rekombinanten Tier-Virus-Vektors, der eine Sequenz trägt, die ein virales Oberflächenprotein (Ligand) codiert, das fähig ist, an einen spezifischen Zelloberflä chen-Rezeptor auf der Oberfläche der zu behandelnden Zellen zu binden, und eine zweite Sequenz trägt, die ein Protein, ausgewählt aus dem/den GILR-Protein, – Isoformen, -Analoga, -Fragmenten und -Derivaten, codiert, das, wenn es in den Zellen exprimiert wird, fähig ist, Apoptose zu inhibieren; und (b) Infizieren der Zellen mit dem Vektor von (a).
    • (iv) Ein Verfahren für das Verstärken von Apoptose in Zellen durch Inhibieren der Aktivität von ("if") GILR-Proteinen in den Zellen, umfassend Behandeln der Zellen mit Antikörpern oder aktiven Fragmenten oder Derivaten davon, wobei das Behandeln durch Anwendung einer geeigneten Zusammensetzung, enthaltend die Antikörper, aktiven Fragmente oder Derivate davon, auf die Zellen ist.
    • (v) Ein Verfahren für das Verstärken von Apoptose in Zellen durch Inhibieren der Aktivität von GILR-Proteinen in den Zellen, umfassend Behandeln der Zellen mit einer Oligonucleotidsequenz, codierend eine Antisense-Sequenz für wenigstens einen Teil der DNA-Sequenz, codierend ein GILR-Protein, wobei die Oligonucleotidsequenz fähig ist, die Expression des GILR-Proteins zu blockieren.
    • (vi) Ein Verfahren, wie in (v) oben, wobei die Oligonucleotidsequenz in die Zellen mittels eines Virus von (iii) oben eingeführt wird, wobei die zweite Sequenz des Virus die Oligonucleotidsequenz codiert.
    • (vii) Ein Verfahren für das Behandeln von Tumorzellen oder HIV-infizierten Zellen oder anderer erkrankter Zellen, um Apoptose in den Zellen durch Inhibieren der Aktivität von GILR-Proteinen in den Zellen zu verstärken, umfassend: (a) Konstruieren eines rekombinanten Tier-Virus-Vektors, der eine Sequenz trägt, die ein virales Oberflächenprotein codiert, das fähig ist, an einen spezifischen Tumorzelloberflächenrezeptor oder Oberflächenrezeptor einer HIV-infizierten Zelle oder Rezeptor, getragen von anderen erkrankten Zellen, zu binden, und eine Sequenz trägt, codierend ein inaktives GILR-Mutantenprotein, wobei das mutierte Protein, wenn exprimiert in der Tumor-, der HIV-infizierten oder anderen erkrankten Zelle, fähig ist, die Aktivität von normalem endogenem GILR zu inhibieren und Apoptose in den Zellen zu verstärken; und (b) Infizieren der Tumorzellen oder HIV-infizierten Zellen oder anderen erkrankten Zellen mit dem Vektor von (a).
    • (viii) Ein Verfahren für das Verstärken von Apoptose in Zellen durch Inhibieren der Aktivität von GILR-Proteinen in den Zellen, umfassend Anwenden der Ribozym-Vorgehensweise, bei welcher ein Vektor, codierend eine Ribozym-Sequenz, fähig zum Wechselwirken mit einer zellulären mRNA-Sequenz, codierend ein GILR-Protein, in einer Form in die Zellen eingeführt wird, die eine Expression der Ribozym-Sequenz in den Zellen erlaubt, und wobei, wenn die Ribozym-Sequenz in den Zellen exprimiert wird, sie mit der zellulären mRNA-Sequenz wechselwirkt und die mRNA-Sequenz spaltet, was in der Inhibition von Expression des GILR-Proteins in den Zellen resultiert.
    • (ix) Ein Verfahren für das Verstärken von Apoptose in Zellen durch Inhibieren der Aktivität von GILR-Proteinen in den Zellen, umfassend Einführen eine Peptids in die Zellen, das fähig ist, das normale endogene GILR in den Zellen zu binden und seine Aktivität zu inhibieren, wodurch Apoptose verstärkt wird.
    • (x) Ein Verfahren für das Isolieren und Identifizieren von Proteinen, welche GILR-ähnliche Proteine sind, die zu der Leucin-Zipper-Familie gehören, oder Proteine sind, die fähig sind, direkt an GILR zu binden, umfassend Anwenden der Hefe-Two-Hybrid-Vorgehensweise, bei welcher eine Sequenz, die das GILR codiert, von einem Hybridvektor getragen wird, und eine Sequenz aus einer cDNA- oder genomische DNA-Bibliothek von dem zweiten Hybridvektor getragen wird, die Vektoren dann verwendet werden, um Hefe-Wirtszellen zu tranformieren, und die positiven transformierten Zellen isoliert werden, gefolgt von Extraktion des zweiten Hybridvektors, um eine Sequenz zu erhalten, die ein Protein codiert, welches an das GILR bindet.
    • (xi) Ein Verfahren, wie in irgendeinem der Obigen, wobei das Protein wenigstens eines/eine der GILR-Isoformen, -Analoga, -Fragmente oder -Derivate davon ist.
  • Durch einen noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung sind verschiedene pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, welche besonders nützlich für das Bewirken wenigstens mancher der obigen erfindungsgemäßen Verfahren ist. Das Folgende ist deshalb nur eine repräsentative Anzahl möglicher pharmazeutischer Zusammensetzungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, andere mögliche Zusammensetzungen/Formulierungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind wie in der folgenden detaillierten Offenbarung dargelegt oder wie sie daraus klar hervorgehen:
    • (a) Eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Inhibition von Apoptose in Zellen oder für die Stimulierung von Lymphozytenaktivierung, umfassend, als aktiven Bestandteil, wenigstens ein GILR-Protein, seine biologisch aktiven Fragmente, Analoga, Derivate oder Gemische davon.
    • (b) Eine pharmazeutische Zusammensetzung für das Inhibieren von Apoptose in Zellen oder für das Stimulieren von Lymphozytenaktivierung, umfassend, als aktiven Bestandteil, einen rekombinanten Tier-Virus-Vektor, codierend ein Protein, fähig zum Binden eines Zelloberflächenrezeptors, und codierend wenigstens ein/eine GILR-Protein, -Isoform, aktive Fragmente oder Analoga.
    • (c) Eine pharmazeutische Zusammensetzung für das Verstärken von Apoptose in Zellen durch Inhibieren von GILR-Aktivität in den Zellen, umfassend, als aktiven Bestandteil, eine Oligonucleotidsequenz, codierend eine Antisense-Sequenz der GILR-Protein-mRNA-Sequenz.
    • (d) Eine pharmazeutische Zusammensetzung für das Verstärken von Apoptose in Zellen durch Inhibieren von GILR-Aktivität in den Zellen, umfassend, als aktiven Bestandteil, ein inaktives mutiertes GILR-Protein oder eine DNA-Sequenz, codierend das inaktive mutierte GILR-Protein, wobei die GILR-Mutante, wenn eingeführt in die oder exprimiert in den Zellen, die Aktivität des normalen endogenen GILR-Proteins inhibiert.
    • (e) Eine pharmazeutische Zusammensetzung für das Verstärken von Apoptose in Zellen durch Inhibieren von GILR-Aktivität in den Zellen, umfassend, als aktiven Bestandteil, ein Peptid, fähig zum Binden an das aktive Zentrum oder die Leucin-Zipper-Domäne von GILR, und dadurch Inhibieren normaler endogener GILR-Aktivität in Zellen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 (A, B) zeigt Reproduktionen von Autoradiogrammen, die die Ergebnisse der Analyse von GILR-Expression in verschiedenen Geweben und die Effekte von Glucocorticoid-Induktion (Dexamethason-DEX)-Induktion von GILR-Expression in verschiedenen Geweben darlegen, wobei 1A die Expression von GILR-mRNA in Mäuseorganen zeigt. Gesamt-RNA wurde extrahiert, auf Agarosegel getrennt und auf einen Nitrocellulosefilter transferiert. Der Filter wurde hybridisiert mit einer nick-Translation-markierten GILR-cDNA-Sonde, gewaschen, autoradiographiert und 8 Tage lang exprimiert. Jede Spur wurde mit 2 μg Gesamt-RNA beladen; und 1B zeigt den Effekt von Dexamethason auf GILR-Induktion. Die Zellen waren entweder unbehandelt (Spuren 1, 3, 5) oder behandelt (Spuren 2, 4, 6) mit 100 nM/1 DEX für 3 h. Gesamt-RNA (25 μg) wurde extrahiert, einer Elektrophorese auf einem Gel unterzogen und auf einen Nitrocellulosefilter transferiert. Der Filter wurde hybridisiert mit markierter GILR-cDNA und 24 Stunden lang exponiert. 1A, Spuren 1 bis 9: Milz, Niere, Knochenmark, Herz, Leber, Gehirn, Lunge, Lymphknoten, Thymus. 1B, Spuren 1 bis 6: Lymphknoten, Lymphknoten + DEX, Thymus, Thymus + DEX, Milz, Milz + DEX.
  • 2 stellt schematisch die Nucleotid- und abgeleitete Polypeptid (Aminosäure)-Sequenz des Maus-GILR-Gens und -Proteins dar.
  • 3 (A, B, C) zeigt Reproduktionen von Autoradiogrammen, die die Ergebnisse der Expression von GILR-cDNA darlegen, wobei: 3A die Expression von GILR-cDNA, insertiert in einem Bluescript-Vektor (Spur 1, Kaninchen-Reticulozytenlysat-Kontrolle; Spur 2, leerer Vektor-Kontrolle; Spur 3, Vektor, der GILR-cDNA (Sinn) trägt), in welchem die exprimierten Transkripte in einem Kaninchen-Reticulozytenlysat in der Gegenwart von [35S]Met translatiert wurden, zeigt; 3B eine Western-Blot zeigt, in welchem polyklonales Kaninchen-Antiserum verwendet wurde für Western-Blot-Analyse von GILR-Fusionsprotein, konstruiert und exprimiert, wie im Detail hierin unterhalb beschrieben (Spur 1, Präimmunserum, Spur 2, Anti-GILR Ak); und 3C die Western-Blot-Analyse von GILR-Protein zeigt, durchgeführt unter Verwendung von Kaninchen-Präimmunserum (Spur 1, unbehandelte Thymozyten; Spur 2, Thymozyten, behandelt mit DEX 100 nM) oder Anti-GILR Ak (Spur 3, unbehandelte Thymozyten; Spur 4, Thymozyten, behandelt mit DEX).
  • 4 ist eine schematische Abbildung des Vergleichs des Leucin-Zipper-Motivs in dem offenen Leserahmen der Maus-GILR-cDNA mit jenen von anderen Mitgliedern der Leucin-Zipper-Familie.
  • 5 (A, B) zeigt Reproduktionen von Autoradiogrammen, die die Ergebnisse der RNase-Protection-Analyse von GILR-mRNA-Expression in transfizierten Klonen darlegen, wobei in 5A in Spuren 1, 2 transfizierte Klone mit leeres pcDNA3-Kontrollen gezeigt ist; in Spuren 3–8 transfizierte Klone mit GILR-cDNA gezeigt ist; in Spur 9 tRNA-Kontrolle gezeigt ist; in Spur 10 unverdaute Sonde-Kontrolle gezeigt ist; und 5B zeigt in Spur 1 unverdaute Sonde-Kontrolle; in Spuren 2–4 transfizierte Klone mit leeres pcDNA3-Kontrollen; in Spuren 5–7 transfizierte Klone mit GILR-cDNA; in Spur 8 tRNA-Kontrolle. 20 μg RNA wurden auf jede Spur geladen. 5C zeigt schematisch das Konstrukt, in welchem das Fragment, das die Antisense-Sonde bei Einzelstrang-spezifischem RNase-Verdau schützen würde.
  • 6 zeigt eine Balkendiagramm-Abbildung der Ergebnisse, die den Schutz von 3DO-transfizierten Klonen vor TCR-induziertem Tod zeigt. 3DO-Zellen wurden durch Elektroporation mit 15 μg linearisiertem pcDNA3 oder 15 μg linearisiertem pcDNA3-Vektor, der die GILR-cDNA exprimiert, transfiziert. Zur Induktion von Apoptose wurden Zellen 20 Stunden lang auf Platten kultiviert, beschichtet mit Anti-CD3 (1 μg/ml). Der Prozentsatz an Zelltod wurde bewertet durch Messung des DNA-Gehalts von isolierten Nuclei, gefärbt mit Propidiumiodid. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.
  • 7(A-D) sind Balkendiagramm-Abbildungen der Ergebnisse der Analyse von Apoptose, induziert durch andere Stimuli an 3DO-transfizierten Klonen, wobei in 7A die Ergebnisse gezeigt sind, erhalten mit entnommenem trophischen Faktor; in 7B die Ergebnisse gezeigt sind, erhalten mit UV-Bestrahlung (100 J/m2); in 7C die Ergebnisse gezeigt sind, erhalten mit DEX (100 mM/l); und in 7D die Ergebnisse gezeigt sind, erhalten mit monoklonalem (mAk) Anti-Fas-Antikörper (5 μg/ml). Alle Gruppen wurden 20 Stunden lang behandelt. Zelltod wurde gemessen, wie oben hinsichtlich 6 angezeigt, und wie hierin unten angegeben.
  • 8 (A, B) sind Balkendiagramm-Abbildungen der Ergebnisse der Fas- und Fas-L-Expression an 3DO-transfizierten Klonen. 3DO-Zellen, transfiziert mit leerem Vektor oder mit GILR-pcDNA3, wurden mit Anti-CD3 mAk (1 μg/ml) 20 h lang getriggert und auf Fas-(8A) und Fas-L (8B)-Expression analysiert.
  • 9 (A, B) zeigt Reproduktionen von Autoradiogrammen, die die Expression von Fas-mRNA in transfizierten Klonen präsentieren, wobei: 9A die Expression von Fas-mRNA in Klonen, transfiziert mit leerem pcDNA3, unbehandelt (Spuren 1, 3, 5, 7, 9), mit leerem pcDNA3, behandelt mit monoklonalem Anti-CD3-Antikörper (1 μg/ml) für 20 Stunden (Spuren 2, 4, 6, 8, 10), mit GILR-cDNA, unbehandelt (Spuren 11, 13, 15, 17, 19), und mit GILR-cDNA, behandelt mit monoklonalem Anti-CD3-Antikörper (1 μg/ml) für 20 Stunden unbehandelt (Spuren 12, 14, 16, 18, 20), zeigt. 9B die RNase-Protection-Analyse von FasL-mRNA-Expression in den transfizierten Klonen zeigt. Fas-L (Spur 1) oder β-Actin (Spur 2) unverdaute Sonde; Klone, transfiziert mit leerem pcDNA3, unbehandelt (Spuren 3, 5, 7, 16, 18) oder behandelt mit monoklonalem Anti-CD3-Antikörper (1 μg/ml) für 20 Stunden (Spuren 4, 6, 8, 17, 19), mit GILR-cDNA und unbehandelt (Spuren 9, 11, 13, 20, 22), und mit GILR-cDNA und dann behandelt mit monoklonalem Anti-CD3-Antikörper (1 μg/ml) für 20 Stunden (Spuren 10, 12, 14, 21, 23); tRNA (Spur 15). 20 μg RNA wurden auf jede Spur geladen. Die Länge des geschützten Antisense-mRNA-Fas-L-Fragments ist 184 Basenpaare.
  • 10 (A, B) zeigt Reproduktionen von Autoradiogrammen, die die Ergebnisse über den Effekt unterschiedlicher Mittel auf die Modulation von GILR-mRNA-Expression darlegen, wobei 10A zeigt, dass Anti-CD3 GILR-Expression herabmoduliert und Anti-CD2 GILR-Expression heraufmoduliert. 3DO-Zellen wurden kultiviert in Platten mit 96 Kavitäten mit Medium alleine, beschichtet mit monoklonalem Anti-CD3-Antikörper (1 μg/ml) und/oder monoklonalem Anti-CD2-Antikörper (1 μg/ml) und/oder monoklonalem Anti-CD2-Antikörper (50 μg/ml). Spur 1 = Kontrolle; Spur 2 = Anti-CD3 + Anti-CD2; Spur 3 = Anti-CD2; Spur 4 ist Anti-CD3. 10B zeigt, dass Cyclosporin Anti-CD3-angetriebene Herabmodulation von GILZ-Expression inhibiert. 3DO-Zellen wurden kultiviert auf Anti-CD3-beschichteten Platten (1 μg/ml) in Gegenwart oder in Abwesenheit von Cyclosporin (1 μg/ml). In sowohl 10A als auch 10B wurde die Expression von GILR evaluiert mittels Northern-Blot. 20 μg RNA wurden auf jede Spur geladen. Spur 1 = Kontrolle; Spur 2 = Anti-CD3; Spur 3 = Cyclosporin; Spur 4 = Anti-CD3 + Cyclosporin.
  • 11 (A, B) zeigt die Ergebnisse über die Induktion von GILR-Expression durch Anti-CD3 mit oder ohne Dexamethason-Behandlung. 11A zeigt eine Western-Blot-Analyse von GILR-Protein in Kernzellextrakten von unbehandelten Thymozyten (Spur 1), Thymozyten, kultiviert auf Platten, beschichtet mit Anti-CD3 (1 μg/ml) für 3 Stunden (Spur 2), Thymozyten, behandelt mit 100 nM Dexamethason für 3 Stunden (Spur 3), und Thymozyten, kultiviert auf Platten, beschichtet mit Anti-CD3 (1 μg/ml) für 3 Stunden, und behandelt, für die gleiche Zeit, mit 100 nM Dexamethason. Die Menge an in jeder Spur geladenem Protein wird verglichen mit einem Signal, erhalten mit einem Antikörper gegen β-Tubulin. 11B zeigt ein Autoradiogramm einer Northern-Blot-Analyse von GILR-mRNA, die unbehandelte Thymozyten (Spur 1), Thymozyten, kultiviert auf Platten, beschichtet mit Anti-CD3 (1 μg/ml) für 3 Stunden (Spur 2), Thymozyten, behandelt mit 100 nM Dexamethason für 3 Stunden (Spur 3), und Thymozyten, kultiviert auf Platten, beschichtet mit Anti-CD3 (1 μg/ml) für 3 Stunden und behandelt, für die gleiche Zeit, mit 100 nM Dexamethason, vergleicht. Der Filter wurde hybridisiert mit markierter GILR-cDNA und zur Autoradiographie 48 Stunden lang exponiert. Die Menge an Gesamt-RNA (25 μg), die in jede Spur geladen wurde, auf dem Gel laufen gelassen wurde und auf den Filter transferiert wurde, wird mit dem Signal, erhalten mit markierter β-Actin-cDNA, verglichen.
  • 12 (A, B) zeigt die Ergebnisse über die Expression und die Lokalisierung von GILR-Protein. 11A ist eine Protein-Immunoblot-Analyse von GILR-Protein. 3DO-Klone wurden transfiziert ("trasfected") mit dem leeren Vektor pcDNA3: Kern- (Spur 1) und cytoplasmatische (Spur 3) Proteinextrakte wurden gereinigt, auf das Gel geladen und auf den Filter transferiert. Der Kernproteinextrakt und cytoplasmatische Proteinextrakt von 3DO-Klonen, transfiziert ("trasfected") mit GILR-cDNA, sind in Spur 2 bzw. Spur 4 gezeigt. 11B ist eine Protein-Immunoblot-Analyse von β-Tubulin-Protein in den gleichen Extrakten.
  • 13 stellt schematisch die Nucleotid- und abgeleitete Polypeptid (Aminosäure)-Sequenzen des humanen GILR-Gens und -Proteins dar.
  • 14 zeigt den Vergleich zwischen Maus-GILR-(GROSSBUCHSTABEN) und humaner GILR-(kleine Buchstaben)cDNA-Sequenz.
  • 15 zeigt die Anordnung der Proteinsequenzen von Maus-GILR (mG), verglichen mit humanem GILR (hG), humanem DIP (hD; Vogel et al., 1996; Zugangsnummer in Swiss-Prot Q99576) und humanem TSC-22 (hT; Jay et al., 1996; Zugangsnummer in Swiss-Prot Q15714). Reste, welche identisch zu Maus-GILR (sind), sind mit (=) markiert, währenddessen die Reste, welche homolog sind, mit (–) markiert sind.
  • Es sollte angemerkt werden, dass alle der obigen Figuren auch beschrieben sind und auf sie auch Bezug genommen wird in dem Beispiel unten hierin.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein neues Mitglied der Leucin-Zipper-Familie, bezeichnet als GILR, isoliert worden. Die cDNA, codierend GILR, ist identifiziert, kloniert und sequenziert worden, und das von dieser cDNA codierte Protein ist exprimiert worden, und seine Aminosäuresequenz ist von der cDNA-Sequenz abgeleitet worden. Das GILR-Gen stellt ein Gen dar, dessen Transkription reguliert wird durch Glucocorticoidhormone (GCH), wie es deutlich gemacht ist durch seine Induktion durch das synthetische GCH Dexamethason (DEX), und stellt ferner solch ein GCH-reguliertes Gen dar, dessen Expression beteiligt ist an der Modulation von T-Lymphozyten-Apoptose.
  • Das GILR-Protein (siehe 2, 4 und 13) weist gute Homologie mit all den anderen Mitgliedern der Leucin-Zipper-Familie auf, insbesondere in der Leucin-Zipper-Domäne, einschließlich wenigstens gewisser Homologien mit dem Protein TSC-22, dessen Funktion noch nicht definiert worden ist, von welchem jedoch auch gezeigt worden ist, dass es von DEX-Behandlung induziert wird (Shibanuma et al., 1992, Jay et al., 1996). Vier Leucin-Reste in GILR, mit Abstand von („spanned by") 7 Aminosäuren (an Positionen 76, 83, 90 und 97) und ein Asparagin-Rest (an Position 87) innerhalb der Leucin-Zipper-Domäne sind mit der kanonischen Leucin-Zipper-Struktur der Familie kompatibel.
  • Jedoch scheint GILR, wie TSC-22, die kanonische basische Domäne nicht zu enthalten, die in den meisten Transkriptionsfaktoren gefunden wird und essentiell für das Binden an DNA ist.
  • Weiterhin haben sowohl TSC-22 als auch GILR, im Gegensatz zu anderen Leucin-Zipper-Molekülen (Goldstone und Lavin, 1994; Hope und Struhl, 1987; Nicholas et al., 1991; Yamamoto et al., 1988) eine relativ kleine Größe (143 bzw. 137 Aminosäuren in der gesamten Länge), was nahe legt, dass diese zwei eine neue Familie niedermolekulargewichtiger Leucin-Zipper-Proteine darstellen können. Das GILR-Protein weist außerdem eine Domäne, erstreckt von Rest 59 bis Rest 138, auf, die identisch zu Protein hDIP (Vogel et al., 1996) ist, dessen Funktion noch nicht definiert worden ist.
  • Die GILR-mRNA ist klar detektierbar, durch Northern-Blotting, in frisch isolierten Thymozyten, frisch isolierter Milz und frisch isolierten Lymphknotenzellen, und mRNA und Proteinexpression wird induziert in lymphoiden Geweben, wie z. B. Thymozyten, Milz und Lymphknoten, durch Behandlung mit DEX (siehe 1). Obwohl diese Ergebnisse nahe legen können, dass dieses Gen hauptsächlich in T-Lymphozyten exprimiert wird, kann die Expression in anderen Geweben (einschließlich jener, in welcher geringe oder keine mRNA-Expression gefunden worden ist: Knochenmark, Herz, Lunge, Leber, Gehirn und Niere) unter einem besonderen Kontext, wie z. B. während inflammatorischer Prozesse und Geweberegeneration oder in der Gegenwart von gewebespezifischen Signalen, nicht ausgeschlossen werden. Das Expressionsmuster von GILR ist jedenfalls besonders, wenn ("is") verglichen mit den ähnlicheren niedermolekulargewichtigen Leucin-Zipper-Proteinen: TSC-22-mRNA wurde unter Verwendung von Northern-Blot ziemlich ubiquitär unter verschiedenen Geweben detektiert, wenn sein Level mit dem von Tubulin in sowohl Mausgeweben (Shibanuma et al., 1992) als auch menschlichen Geweben (Jay et al., 1996) verglichen wurde, die Analyse des hDIP-Genexpressionsmusters durch kombinierte Umkehrtranskriptase-Polymerasekettenreaktion-Hybridisierung zeigte eine signifikante Expression des hDIP-Gens bei einem vergleichbaren Level in jedem der untersuchten Gewebe, umfassend Herz, Lunge, Magen, Blut, Bauchspeicheldrüse und andere (Vogel et al., 1996). Die subzelluläre Lokalisierung ist ebenfalls unterschiedlich zwischen GILR, welches klar nucleär ist (11) und TSC-22, welches nucleär ist (11), und TSC-22, welches nucleär und cytoplasmatisch sein kann (Shibanuma et al., 1992).
  • Die folgend auf Transfektionsexperimente erhaltenen Ergebnisse zeigen an, dass das GILR-Gen fähig ist, T-Zell-Apoptose, induziert durch Behandlung mit Anti-CD3-mAk, zu inhibieren. Im Gegensatz sind die gleichen transfizierten Klone nur zu einem signifikant geringeren Ausmaß gegen den programmierten Zelltod, induziert mit anderen typischen apoptotischen Mitteln, wie z. B. DEX, UV-Bestrahlung, Serumhungern oder Auslösen von Fas durch vernetzten Anti-Fas-mAk, geschützt.
  • Beispielsweise ist zuvor gezeigt worden, dass DEX Apoptose in T-Lymphozyten, einschließlich Thymozyten und T-Zell-Hybridomen, induziert, als auch Zelltod, aktiviert durch Auslösen des CD3/TCR-Komplexes, inhibiert (Cohen und Duke, 1984; Yang et al., 1995). Diese Ergebnisse zeigen an, dass GILR spezifisch dabei ist, T-Zell-Tod, aktiviert durch Auslösen des CD3/TCR-Komplexes, entgegenzuwirken, und zum Teil zu der DEX-induzierten Inhibition von CD3/TCR-aktivierter Apoptose beitragen könnte.
  • Dieser schützende Effekt wirft die Frage über den möglichen Mechanismus/die möglichen Mechanismen von GILR-induzierter Inhibition von Apoptose auf. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen an, dass die Apoptose-Inhibition, assoziiert mit GILR-Überexpression, mit der Inhibition von Fas-Überexpression und Fas-L-Expression, induziert durch Behandlung mit Anti- CD3-mAk (8, 9 und Tabelle II) korreliert. Eine Möglichkeit ist, das GILR mit anderen, derzeit unbekannten Molekülen, welche bei der Aktivierung von Fas- und Fas-L-Genexpression beteiligt sind, wechselwirkt.
  • GILR könnte entweder mit Signal(en), induziert durch TCR/CD3-Triggern in aktivierten Lymphozyten, oder direkt mit Transkriptionsfaktoren, beteiligt an der Regulation von Fas- und Fas-L-Gentranskription, Wechselwirken.
  • Ferner legt die Zunahme an GILR-Expression, folgend auf DEX/T-Zell-Wechselwirkung, nahe, dass dieses Gen beim Regulieren von Lymphozyten-Tod beteiligt sein kann. Tatsächlich ist vorgeschlagen worden, dass GCH bei der Regulation von T-Zell-Selektion beteiligt sein könnte und, zusammen mit anderen Stimuli (wie z. B. Ag/TCR-Wechselwirkung, Cytokinen und co-akzessorischen Molekülen) in dem komplexen Selektionsnetzwerk, beteiligt an der Kontrolle von T-Zell-Überleben, mitwirken könnte (Migliorati et al., 1993; Nieto et al., 1990; Nieto und Lopez-Rivas, 1989; Cohen und Duke, 1984; Wyllie, 1980).
  • Die experimentellen Ergebnisse gemäß der vorliegenden Erfindung beschreiben folglich die Identifikation eines Gens, das für ein neues Molekül, GILR, der Leucin-Zipper-Familie, codiert, welches an der Regulation von Zelltod beteiligt sein kann.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb in einem Aspekt neue GILR-Proteine, welche fähig sind, den intrazellulären Fas-vermittelten Zelltod- oder -Apoptoseweg und möglicherweise auch Zellüberlebenswege, in welchen Fas eine Rolle spielt, wie hierin oben im Detail beschrieben, zu vermitteln oder zu modulieren. Dieses GILR scheint ein Inhibitor von Apoptose, aktiviert durch das Triggern des CD3/TCR-Komplexes zu sein, sowie ein Inhibitor von Fas/Fas-L-Expression zu sein, und als solches kann GILR eine Schlüsselrolle beim Retten von Zellen vor Zelltod spielen.
  • Spezieller ist gemäß der vorliegenden Erfindung ein neues Protein GILR offenbart worden, welches intrazellulär beteiligt ist an beiden Zelltod-Wegen, und auch beteiligt sein kann an intrazellulären Zellüberlebenswegen. Folglich kann Regulation oder Kontrolle der Aktivität von GILR einen oder beide dieser Wege, oder selbst das Binden von TNF- oder Fas-Ligand an ihre Rezeptoren (für TNF insbesondere den p55-R) regulieren, welche dafür bekannt sind, beide Zelltod- und Zellüberlebenswege zu aktivieren, wobei das Ausmaß an Aktivierung von einem Weg im Vergleich zu dem anderen möglicherweise das endgültige Resultat der beispielsweise CD3-TCR-Komplex-, TNF- oder Fas-Ligand-induzierten intrazellulären Ereignisse, d. h., ob die Zelle stirbt oder überlebt, bestimmt. Weil GILR Fas/Fas-L-Expression direkt zu beeinflussen („effect")(d. h. inhibieren) scheint, scheint es direkter in Beziehung zum Schützen von Zellen vor Zelltod zu stehen. Folglich stellt das GILR-Protein der vorliegenden Erfindung einen wichtigen intrazellulären Modulator oder Mediator, insbesondere was Apoptose betrifft, dar.
  • Aufgrund der einzigartigen Fähigkeit von Fas, CD3/TCR und den TNF-Rezeptoren, Zelltod zu verursachen, sowie des Vermögens der TNF-Rezeptoren, verschiedene andere Gewebeschädigenden Aktivitäten auszulösen, kann Aberration von der Funktion dieser Rezeptoren für den Organismus besonders schädlich sein. In der Tat ist gezeigt worden, dass sowohl übermäßiger als auch unzureichende Funktion dieser Rezeptoren zu den pathologischen Manifestationen verschiedener Krankheiten beitragen. Das Identifizieren von Molekülen, die an der Regulation der Expression sowie an der Signalgebungsaktivität dieser Rezeptoren teilnehmen, und das Finden von Wegen, die Funktion dieser Moleküle zu modulieren, stellt einen potentiellen Anhaltspunkt für neue therapeutische Herangehensweisen an diese Krankheiten dar. Angesichts der vermuteten wichtigen Rolle von GILR in Fas- und möglicherweise auch p55-TNF-Rezeptor-Toxizität, bedingt durch den Zusammenhang oder Crosstalk zwischen Fas- und p55-TNF-Rezeptoren, scheint es besonders wichtig, Arzneimittel zu entwerfen, die die cytotoxische Funktion des Fas, CD3/TCR und von anderen zuvor genannten Mediatoren blockieren können, möglicherweise durch Erhöhen von GILR-Expression oder durch das Erhöhen der Mengen von GILR auf andere Weise. Dies würde Verstärkung/Vergrößerung der Rettung von Zellen vor Zelltod in jenen pathologischen Zuständen erlauben, wo Zelltod reduziert werden sollte, z. B. bei Entzündung, verschiedenen Autoimmunerkrankungen und dergleichen, wo erhöhtes Zellüberleben gefragt ist.
  • Im Gegensatz wäre es, wenn es erwünscht ist, Zellen, z. B. Krebszellen, HIV-infizierte Zellen und dergleichen, zu töten, wünschenswert, die cytotoxischen Effekte von Fas, CD3/TCR, p55-TNF-Rezeptor (und ihrer assoziierten Proteine, wie z. B. MORT-1, MACH, Mch4, TRADD) zu verstärken, und dies durch Reduzierung der Expression oder Mengen von GILR.
  • Es muss jedoch betont werden, dass die präsentierten experimentellen Hinweise auf die GILR-Funktion (d. h., Inhibition von T-Zell-Apoptose, spezifisch derjenigen, induziert durch Behandlung mit Anti-CD3-mAk und aktiviert durch das Triggern des CD3/TCR-Komplexes, sowie eine Inhibition von Fas/Fas-L-Expression) GILR klar von den anderen Elementen der gleichen Leucin-Zipper-Familie differenzieren. Wie vor kürzerer Zeit gezeigt, löst die Transfektion eines TSC-22-Expressionsvektors den apoptotischen Zelltod in einer menschlichen Magenkarzinom-Zelllinie aus durch ("though") die Aktivierung von TGF-β-Signalgebungsweg zur Apoptose (Ohta et al., 1997).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die DNA-Sequenz, codierend ein GILR-Protein, und die von den DNA-Sequenzen codierten GILR-Proteine.
  • Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ferner die DNA-Sequenzen, codierend biologisch aktive Isoformen, Analoga, Fragmente und Derivate des GILR-Proteins, und die Isoformen, Analoga, Fragmente und Derivate, die davon codiert werden. Die Herstellung von solchen Analoga, Fragmenten und Derivaten geschieht mittels Standardvorgehensweisen (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989), in welchen in den DNA-Sequenzen, codierend das GILR-Protein, ein oder mehrere Kodonen deletiert, addiert oder substituiert durch ein Anderes sein können, um Analoga zu ergeben, die wenigstens einen Aminosäurerest-Austausch hinsichtlich des nativen Proteins aufweisen.
  • Von den obigen DNA-Sequenzen der Erfindung, welche ein/eine GILR-Protein-Isoform, -Analogon, -Fragment oder -Derivat codieren, sind außerdem eingeschlossen, als eine Ausführungsform der Erfindung, DNA-Sequenzen, fähig zum Hybridisieren mit einer cDNA-Sequenz, abgeleitet von der codierenden Region eines nativen GILR-Proteins, wobei eine solche Hybridisierung unter moderat stringenten Bedingungen durchgeführt wird, und wobei hybridisierbare DNA-Sequenzen ein biologisch aktives GILR-Protein codieren. Diese hybridsierbaren DNA-Sequenzen schließen deshalb DNA-Sequenzen ein, welche eine relativ hohe Homologie mit der nativen GILR-cDNA-Sequenz aufweisen, und als solche GILR-ähnliche Sequenzen darstellen, welche beispielsweise natürlich abgeleitete Sequenzen, codierend die verschiedenen GILR-Isoformen, sein können, oder natürlich vorkommende Sequenzen sein können, codierend Proteine, die zu einer Gruppe von GILR-ähnlichen Sequenzen gehören, die ein Protein codieren, das die Aktivität von GILR aufweist. Ferner können diese Sequenzen z. B. auch nicht natürlich vorkommende, synthetisch produzierte Sequenzen einschließen, die ähnlich zu der nativen GILR-cDNA-Sequenz sind, jedoch eine Anzahl erwünschter Modifikationen einschließen. Solche synthetischen Sequenzen schließen deshalb alle der möglichen Sequenzen, codierend Analoga, Fragmente und Derivate von GILR, von welchen alle die Aktivität von GILR aufweisen, ein.
  • Um die verschiedenen oben genannten, natürlich vorkommenden GILR-ähnlichen Sequenzen zu erhalten, können Standardvorgehensweisen für das Screenen und die Isolierung von natürlich abgeleiteten DNA- oder RNA-Proben aus verschiedenen Geweben unter Verwendung der natürlichen GILR-cDNA oder eines Teils davon als Sonde eingesetzt werden (siehe beispielsweise Standardvorgehensweisen, dargelegt in Sambrook et al., 1989).
  • Gleichermaßen können eine Anzahl von Standardvorgehensweisen verwendet werden, wie sie hierin unten betreffend die Herstellung solcher Analoga, Fragmente und Derivate im Detail beschrieben sind, um die oben erwähnten verschiedenen synthetischen GILR-ähnlichen Sequenzen, codierend Analoga, Fragmente oder Derivate von GILR, herzustellen.
  • Ein Polypeptid oder Protein, "im Wesentlichen entsprechend" einem GILR-Protein, schließt nicht nur ein GILR-Protein, sondern auch Polypeptide oder Proteine, die Analoga von GILR sind, ein. Analoga, die im Wesentlichen einem GILR-Protein entsprechen, sind jene Polypeptide, bei welchen eine oder mehrere Aminosäure(n) der Aminosäuresequenz des GILR-Proteins mit einer anderen Aminosäure ersetzt worden ist, deletiert und/oder insertiert worden ist, vorausgesetzt, dass das resultierende Protein im Wesentlichen die gleiche oder höhere biologische Aktivität wie/als das GILR-Protein, welchem es entspricht, aufweist.
  • Um einem GILR-Protein im Wesentlichen zu entsprechen, sind die Änderungen in der Sequenz von GILR-Proteinen, wie z. B. Isoformen, im Allgemeinen relativ gering. Obwohl die Anzahl der Änderungen mehr als zehn sein kann, gibt es vorzugsweise nicht mehr als zehn Änderungen, stärker bevorzugt nicht mehr als fünf Änderungen, und am stärksten bevorzugt nicht mehr als drei solche Änderungen.
  • Während eine beliebige Technik verwendet werden kann, um potentiell biologisch aktive Proteine zu finden, welche GILR-Proteinen im Wesentlichen entsprechen, ist eine solche Technik die Verwendung konventioneller Mutagenesetechniken an der DNA, codierend das Protein, was in ein paar Modifikationen resultiert. Die Proteine, die von solchen Klnnen exprimiert werden, können dann auf ihre Fähigkeit durchmustert werden, an GILR zu binden und GILR-Aktivität bei Modukation/Vermittlung der oben angegebenen intrazellulären Wege zu modulieren.
  • "Konservative" Änderungen sind jene Änderungen, von welchen man nicht erwarten würde, dass sie die Aktivität des Proteins ändern, und sind gewöhnlich die ersten zu Durchmusternden, weil man von ihnen nicht erwarten würde, dass sie die Größe, Ladung oder Konfiguration des Proteins wesentlich ändern, und man folglich von ihnen nicht erwarten würde, dass sie die biologischen Eigenschaften davon ändern.
  • Konservative Substitutionen von GILR-Proteinen schließen ein Analogon ein, wobei wenigstens ein Aminosäure-Rest in dem Polypeptid durch eine unterschiedliche Aminosäure konservativ ersetzt worden ist. Solche Substitutionen werden vorzugsweise gemäß der folgenden Liste, wie in Tabelle A präsentiert, gemacht, wobei die Substitutionen durch Routineexperimentieren bestimmt werden können, um modifizierte strukturelle und funktionale Eigenschaften eines synthetisierten Polypeptid-Moleküls bereitzustellen, während die biologische Aktivität, charakteristisch für GILR-Protein, beibehalten wird. Tabelle A
    Ursprünglicher Beispielhafte
    Rest Substitution
    Ala Gly; Ser
    Arg Lys
    Asn Gln; His
    Asp Glu
    Cys Ser
    Gin Asn
    Glu Asp
    Gly Ala; Pro
    His Asn; Gln
    Ile Leu; Val
    Leu Ile; Val
    Lys Arg; Gln; Glu
    Met Leu; Tyr; Ile
    Phe Met; Leu; Tyr
    Ser Thr
    Thr Ser
    Trp Tyr
    Tyr Trp; Phe
    Val Ile; Leu
  • Alternativ bilden eine weitere Gruppe von Substitutionen von GILR-Proteinen jene, bei welchen wenigstens ein Aminosäurerest in dem Polypeptid entfernt worden ist und ein unterschiedlicher Rest an dieser Stelle gemäß der folgenden Tabelle B eingeführt worden ist. Die Arten an Substitutionen, welche in dem Polypeptid durchgeführt werden können, können basierend auf der Analyse der Häufigkeiten an Aminosäureaustauschen zwischen einem homologen Protein unterschiedlicher Arten, wie z. B. jene, dargestellt in Tabelle 1–2 von Schulz et al., G. E., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY, 1798, und 3–9 von Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA, 1983. Basierend auf einer solchen Analyse sind alternative konservative Substitutionen hierin definiert als Austausche innerhalb einer der folgenden fünf Gruppen: TABELLE B
    1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder leicht polare Reste: Ala, Ser, Thr (Pro,
    Gly);
    2. Polare, negativ geladene Reste und ihre Amide: Asp, Asn, Glu, Gin;
    3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg, Lys;
    4. Große aliphatische nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val (Cys); und
    5. Große aromatische Reste: Phe, Tyr, Trp.
  • Die drei Aminosäurereste oben in Klammern haben spezielle Rollen bei der Proteinarchitektur. Gly ist der einzige Rest, dem jedwede Seitenkette fehlt, und es steuert folglich Flexibilität zur Kette bei. Dies tendiert jedoch dazu, die Ausbildung einer anderen Sekundärstruktur als a-helikal zu fördern. Pro schränkt die Kette aufgrund seiner ungewöhnlichen Geometrie stark ein und tendiert im Allgemeinen dazu, β-Schleife-ähnliche Strukturen zu fördern, obwohl Cys in manchen Fällen fähig sein kann, an Disulfid-Brückenbildung teilzunehmen, welches wichtig ist bei der Proteinfaltung.
  • Beachten Sie, dass Schulz et al., supra, Gruppen 1 und 2 oben verbinden würden. Beachten Sie auch, dass Tyr aufgrund seines Wasserstoff-Brückenbildungspotentials eine signifikante Verwandschaft mit Ser, und Thr, etc., aufweist.
  • Konservative Aminosäure-Substitutionen gemäß der vorliegenden Erfindung, z. B. wie oben dargelegt, sind im Fachgebiet bekannt, und man würde erwarten, dass sie biologische und strukturelle Eigenschaften des Polypeptids nach Aminosäure-Substitution beibehalten. Die meisten Deletionen und Substitutionen gemäß der vorliegenden Erfindung sind jene, welche keine radikalen Änderungen in den Charakteristika des Protein- oder Polypeptid-Moleküls hervorrufen. "Charakteristika" ist in einer nicht-ausschließlichen Weise definiert, um sowohl Änderungen in der Sekundärstruktur, z. B. a-Helix oder β-Faltblatt, sowie Änderungen in der biologi schen Aktivität, z. B. Inhibition von Apoptose, vermittelt durch CD3/TCR, Fas und andere Mediatoren, mittels GILR, zu definieren.
  • Beispiele der Herstellung von Aminosäure-Substitutionen in Proteinen, welche verwendet werden können, um Analoga von GILR-Proteinen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu erhalten, schließen alle bekannten Verfahrenschritte, wie z. B. präsentiert in US-Patent RE 33,653 , 4,959,314 , 4,588,585 und 4,737,462 an Mark et al., 5,116,943 an Koths et al., 4,965,195 an Namen et al.; 4,879,111 an Chong et al.; und 5,017,691 an Lee et al.; und Lysinsubstituierte Proteine, dargestellt in US-Patent Nr. 4,904,584 (Shaw et al.), ein.
  • Neben konservativen Substitutionen, die oben diskutiert sind, und welche die Aktivität von GILR-Protein nicht wesentlich ändern würden, sind entweder konservative Substitutionen oder weniger konservative und zufälligere Änderungen, welche zu einer Zunahme bei der biologischen Aktivität der Analoga von GILR-Proteinen führen, beabsichtigt, innerhalb des Umfangs der Erfindung zu sein.
  • Wenn der exakte Effekt der Substitution oder Deletion bestätigt werden soll, wird sich ein Fachmann auf dem Gebiet dessen bewusst sein, dass der Effekt der Substitution(en), Delektion(en), etc., durch Routine-Eindungs- und -Zelltod-Assays ausgewertet werden wird. Das Screenen unter Verwendung solch eines Standardtests schließt kein unangemessenes Experimentieren ein.
  • Akzeptable GILR-Analoga sind solche, die wenigstens die Fähigkeit behalten, Apoptose, induziert durch CD3/TCR und/oder Fas zu inhibieren, oder alternativ jene Analoga, welche keine solche inhibitorische Aktivität aufweisen und eher als kompetitive Antagonisten von normalen GILR-Molekülen dienen. Solche Antagonisten sind in Situationen nützlich, wo es erwünscht ist, Apoptose zu verstärken.
  • Auf solch eine Weise können Analoga hergestellt werden, welche einen sogenannten dominant-negativen Effekt aufweisen, nämlich ein Analogon, welches beim Inhibieren von CD3/TCR-induzierter Apoptose oder Fas-Fas-L-Expression fehlerhaft ist. Weiterhin können Analoga reproduziert werden, die einen sogenannten dominant-positiven Effekt aufweisen, und welcher ein größeres Vermögen zum Inhibieren von Apoptose, induziert durch CD3/TCR oder Fas/Fas-L, aufweisen als normales GILR, wobei diese besonders nützlich sind, wenn es erwünscht ist, Zellüberleben unter gewissen Umständen, wie oben angemerkt, zu verstärken.
  • Auf dem genetischen Level werden diese Analoga im Allgemeinen durch ortsgerichtete Mutagenese von Nucleotiden in der DNA, codierend das GILR-Protein, hergestellt, wodurch DNA, codierend das Analogon, produziert wird, und nachfolgendes Synthetisieren der DNA und Exprimieren des Polypeptids in rekombinanter Zellkultur hergestellt wird. Die Analoga weisen typischerweise die gleiche oder erhöhte qualitative biologische Aktivität wie das natürlich vorkommende Protein auf, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987–1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
  • Herstellung eines GILR-Proteins in Übereinstimmung hiermit, oder einer alternativen Nucleotidsequenz, codierend das gleiche Polypeptid, jedoch mit Unterschieden gegenüber der natürlichen Sequenz aufgrund von Änderungen, erlaubt durch die bekannte Degeneriertheit des genetischen Codes, kann erzielt werden durch ortsgerichtete Mutagenese von DNA, die ein früher hergestelltes Analogon oder eine native Version eines GILR-Proteins codiert. Ortsgerichtete Mutagenese erlaubt die Produktion von Analoga durch die Verwendung spezifischer Oligonucleotidsequenzen, die die DNA-Sequenz der erwünschten Mutation codieren, sowie eine ausreichende Anzahl benachbarter Nucleotide, um eine Primersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexizität bereitzustellen, um einen stabilen Duplex auf beiden Seiten der Deletionsverbindung, die überschritten wird, auszubilden. Typischerweise ist ein Primer von 20 bis 25 Nucleotiden Länge bevorzugt, mit etwa 5 bis 10 komplementierende Nucleotide auf jeder Seite der Sequenz, die verändert wird. Im Allgemeinen ist die Technik der ortsgerichteten Mutagenese im Fachgebiet gut bekannt, wie es durch Publikationen, wie z. B. Adelman et al., DNA 2: 183 (1983), exemplifiziert ist, deren Offenbarung hierin durch Referenz inkorporiert ist. Wie verstanden werden wird, setzt die ortsspezifische Mutagenesetechnik typischerweise einen Phagenvektor ein, der sowohl in einer einzelsträngigen als auch doppelsträngigen Form existiert. Typische Vektoren, verwendbar bei seitgerichteter Mutagenese, beinhalten Vektoren, wie z. B. den M13-Phagen, z. B. wie offenbart von Messing et al., Third Cleveland Symposium an Macromolecules and Recombinant DNA, Herausgeber A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), deren Offenbarung hierin durch Referenz inkorporiert ist. Diese Phagen sind leicht kommerziell verfügbar, und ihre Verwendung ist im Allgemeinen dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt. Alternativ können Plasmidvektoren, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsursprung enthalten (Veira et al., Meth. Enzymol. 153: 3, 1987) eingesetzt werden, um einzelsträngige DNA zu erhalten.
  • Im Allgemeinen wird ortsgerichtete Mutagenese in Übereinstimmung hiermit durchgeführt, indem zuerst ein einzelsträngiger Vektor erhalten wird, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz einschließt, die das relevante Polypeptid codiert. Ein Oligonucleotid-Primer, der die erwünschte mutierte Sequenz trägt, wird synthetisch durch automatisierte DNA/Oligonucleotid-Synthese hergestellt. Dieser Primer wird dann an den einzelsträngigen Proteinsequenzenthaltenden Vektor angelagert und einer Behandlung mit DNA-polymerisierenden Enzymen, wie z. B. E. coli-Polymerase I-Klenow-Fragment, unterzogen, um die Synthese des Mutationtragenden Stranges zu vervollständigen. Folglich trägt eine mutierte Sequenz und der zweite Strang die erwünschte Mutation. Dieser Heteroduplexvektor wird dann verwendet, um geeignete Zellen, wie z. B. E. coli-JM101-Zellen, zu tranformieren, und Klone werden ausgewählt, die rekombinante Vektoren beinhalten, die das mutierte Sequenzarrangement tragen.
  • Nachdem solch ein Klon ausgewählt ist, kann die mutierte GILR-Proteinsequenz entfernt und in einem geeigneten Vektor platziert werden, im Allgemeinen einem Transfer- oder Expressionsvektor, der Art, die zur Transfektion eines geeigneten Wirts eingesetzt werden kann.
  • Dementsprechend kann ein Gen oder eine Nucleinsäure, codierend für ein GILR-Protein, auch in vitro, in situ und/oder in vivo durch die Verwendung bekannter DNA- oder RNA-Amplifikationstechniken, wie z. B. von PCR und chemischer Oligonucleotidsynthese, detektiert, erhalten und/oder modifiziert werden. PCR erlaubt die Amplifikation (Erhöhung der Anzahl) spezifischer DNA-Sequenzen, durch wiederholte DNA-Polymerase-Reaktionen. Diese Reaktion kann verwendet werden als ein Ersatz für das Klonieren; alles was erforderlich ist, ist ein Wissen um die Nucleinsäuresequenz.
  • Um PCR auszuführen, werden Primer entworfen, welche komplementär sind zu der interessierenden Sequenz. Die Primer werden dann durch automatisierte DNA-Synthese erzeugt.
  • Weil Primer entworfen werden können, um an jeden Teil des Gens zu hybridisieren, können solche Bedingungen geschaffen werden, dass fehlende Übereinstimmungen („mismatches") bei der Paarung komplementärer Basen toleriert werden können.
  • Amplifikation dieser fehlgepaarten Regionen kann zur Synthese eines Mutagenese-Produkts führen, was in der Erzeugung eines Peptids mit neuen Eigenschaften resultiert (d. h., ortsgerichtete Mutagenese). Siehe außerdem z. B. Ausubel, supra, Kapitel 16. Außerdem kann RNA durch Koppeln von komplementärer DNA(cDNA)-Synthese unter Verwendung von Umkehrtranskriptase mit PCR als das Ausgangsmaterial für die Synthese der extrazellulären Domäne eines Prolaktin-Rezeptors ohne Klonieren verwendet werden.
  • Weiterhin können PCR-Primer entworfen werden, um neue Restriktionsstellen oder andere Eigenschaften, wie z. B. Terminations-Kodonen, an den Enden des zu amplifizierenden Gensegments einzuschließen. Dieses Einbringen von Restriktionsstellen an den 5'- und 3'-Enden der amplifizierten Gensequenz erlaubt, dass Gensegmente, codierend GILR-Protein oder ein Segment davon, für die Ligation anderer Sequenzen und/oder Klonierungsstellen in Vektoren maßgeschneidert entworfen werden.
  • PCR und andere Verfahren zur Amplifikation von RNA und/oder DNA sind im Fachgebiet gut bekannt und können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ohne unzumutbares Experimentieren, basierend auf der hierin präsentierten Lehre und Anleitung, verwendet werden. Bekannte Verfahren zur DNA- oder RNA-Amplifikation schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und verwandte Amplifikationsprozesse (siehe z. B. U. S. Patent Nrn. 4,683,195 , 4,683,202 , 4,800,159 , 4,965,188 an Mullis et al.; 4,795,699 und 4,921,794 an Tabor et al.; 5,142,033 an Innis; 5,122,464 an Wilson et al.; 5,091,310 an Innis; 5,066,584 an Gyllensten et al.; 4,889,818 an Gelfand et al.; 4,994,370 an Silver et al.; 4,766,067 an Biswas; 4,656,134 an Ringold; und Innis et al., Hrsg., PCR Protocols: A Guide to Method and Amplications) und RNA-vermittelte Amplifikation, welche RNA, die zur Zielsequenz antisense ist, als eine Matrize zur doppelsträngigen DNA-Synthese verwendet ( U. S. Patent Nr. 5,130,238 an Malek et al., mit dem Handelsnamen NASBA); und Immuno-PCR, welche die Verwendung von DNA-Amplifikation mit Antikörper-Markieren kombiniert (Ruzicka et al., Science 260: 487 (1993); Sano et al., Science 258: 120 (1992); Sano et al., Biotechniques 9: 1378 (1991).
  • Auf analoge Weise können biologisch aktive Fragmente von GILR-Proteinen (z. B. jene von irgendeinem des GILR oder seiner Isoformen), wie oben hinsichtlich der Analoga von GILR-Proteinen angemerkt, hergestellt werden. Geeignete Fragmente von GILR-Proteinen sind jene, welche die GILR-Aktivität, wie oben angemerkt, beibehalten. Demgemäß können GILR-Proteinfragmente hergestellt werden, welche einen dominant-negativen oder dominant-positiven Effekt, wie oben angemerkt, hinsichtlich der Analoga aufweisen. Es sollte erwähnt werden, dass diese Fragmente eine spezielle Klasse der Analoga der Erfindung darstellen, und zwar sind sie definierte Anteile von GILR-Proteinen, abgeleitet von der vollen GILR-Proteinsequenz (z. B. von der von irgendeinem GILR oder seinen Isoformen), wobei jeder solche Anteil oder jedes solches Fragment beliebige der oben erwähnten erwünschten Aktivitäten aufweist. Solch ein Fragment kann z. B. ein Peptid sein.
  • In ähnlicher Weise können Derivate durch Standardmodifikationen der Seitengruppen eines oder mehrerer Aminosäurereste des GILR-Proteins, seiner Analoga oder Fragmente oder durch Konjugation des GILR-Proteins, seiner Analoga oder Fragmente an ein anderes Molekül, z. B. einen Antikörper, ein Enzym, einen Rezeptor, etc., hergestellt werden, wie sie im Fachgebiet gut bekannt sind. Demgemäß deckt „Derivate", wie hierin verwendet, Derivate ab, welche durch im Fachgebiet bekannte Mittel hergestellt werden können von den funktionalen Gruppen, welche als Seitenketten an den Resten auftreten, oder den N- oder C-terminalen Gruppen, und sie sind in der Erfindung eingeschlossen. Derivate können chemische Gruppierungen, wie z. B. Kohlenhydrat- oder Phosphatreste, aufweisen, vorausgesetzt, solch ein Anteil hat die gleiche oder höhere biologische Aktivität als GILR-Proteine.
  • Beispielsweise können Derivate aliphatische Ester der Carboxylgruppen, Amide der Carboxylgruppen durch Reaktion mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären Aminen, N-Acylderivate oder freie Aminogruppen der Aminosäurereste, gebildet mit Acylgruppierungen (z. B. Alkanoyl- oder carbocyclischen Arylgruppen), oder O-Acylderivate einer freien Hydroxylgruppe (z. B. die von Seryl- oder Threonylresten), gebildet mit Acylgruppierungen, einschließen.
  • Der Ausdruck „Derivate" soll nur jene Derivate einschließen, die nicht eine Aminosäure zu einer anderen der zwanzig gewöhnlich auftretenden natürlichen Aminosäuren ändert.
  • GILR ist ein Protein oder Polypeptid, d. h. eine Sequenz von Aminosäureresten. Ein Polypeptid, das aus einer größeren Sequenz, welche die gesamte Sequenz eines GILR-Proteins gemäß den Definitionen hierin beinhaltet, soll innerhalb des Umfangs eines solchen Polypeptids eingeschlossen sein, solange die Additionen die grundsätzlichen und neuen Charakteristika der Erfindung nicht beeinträchtigen, d. h. wenn sie die biologische Aktivität von GILR-Protein entweder beibehalten oder erhöhen oder gespalten werden können, um ein Protein oder Polypeptid zurückzulassen, das die biologische Aktivität von GILR-Protein aufweist. Folglich ist z. B. beab sichtigt, dass die vorliegende Erfindung Fusionsproteine von GILR-Protein mit anderen Aminosäuren oder Peptiden einschließt.
  • Das neue GILR-Protein, ihre Analoga, Fragmente und Derivate davon haben eine Anzahl möglicher Verwendungen, z. B.:
    • (i) GILR-Protein, seine Isoformen, Analoga, Fragmente und Derivate kann/können verwendet werden, um die Inhibition von Apoptose, vermittelt oder induziert durch CD3/TCR, Fas/Fas-L oder irgendwelcher anderer dazu in Beziehung stehender Apoptose-Mediatoren, zu verstärken/vergrößern. Solche Inhibition von Apoptose ist insbesondere wünschenswert in Fällen wie z. B. Gewebeschaden bei septischem Schock, Transplantat-Wirt-Abstoßung, akuter Hepatitis und verschiedenen Autoimmun- und inflammatorischen Krankheiten, bei welchen es erwünscht ist, apoptotischen Zelltod, vermittelt von Fas/Fas-L, CD3/TCR oder irgendwelchen anderen Vermittlern, zu blockieren. Folglich kann/können im Hinblick auf die biologischen Eigenschaften der Leucin-Zipper-Familie, zu welcher GILR gehört, und des funktionalen Wissens über GILR selbst, GILR, seine Isoformen, Analoga, Fragmente oder Derivate verwendet werden, um Lymphozytenaktivität zu stimulieren und die Rettung von Zellen vor Zelltod durch Apoptose zu verstärken.
  • Dies kann z. B. erreicht werden durch Einführen von GILR oder irgendwelche seiner geeigneten Isoformen, Analoga, Fragmente oder Derivate in Zellen durch Standardvorgehensweisen, die per se bekannt sind. Gleichermaßen ist es möglich, ein geeignetes Fusionsprotein (wobei dies ein solches GILR-Derivat ist) zu konstruieren, das die Leucin-Zipper- und/oder Prolinreiche („praline-rich")-Sequenz von GILR umfasst und dieses Fusionsprotein durch Standardvorgehensweisen in Zellen einzuführen, in welchen das Fusionsprotein seinen Effekt z. B. durch Wechselwirkung mit anderen intrazcellulären Proteinen ausüben wird, was zu erhöhter Inhibition von Apoptose führt.
  • Um das/die GILR-Protein-, -Isoformen, -Analoga, -Fragmente und -Derivate (einschließlich des obigen Fusionsproteins) in Zellen einzuführen, gibt es eine Anzahl möglicher Wege, dies zu tun: beispielsweise ist es bevorzugt, solch ein GILR spezifisch in Zellen, wie z. B. T-Lymphozyten, einzuführen, in welchen das CD3/TCR- und/oder Fas/Fas-L-System exprimiert sind, und beim Induzieren von Apoptose aktiv sind. Ein Weg, dies zu erzielen, ist, ein rekombinantes Tiervirus, z. B. eines, abgeleitet von Vaccinia, herzustellen, wobei in die virale DNA wenigstens die folgenden zwei Gene eingeführt werden: (i) das Gen, codierend einen Liganden, der an Zelloberflächenproteine bindet, die spezifisch von den Zellen exprimiert werden, z. B. diejenigen, die auf der Oberfläche von T-Lymphozyten vorhanden sind, so dass der rekombinante Virusvektor fähig sein wird, solche T-Lymphozyten zu binden; und (ii) das GILR-Gen, codierend das GILR-Protein. Folglich wird Expression des Zelloberflächenbindungsproteins (Ligand) auf der Oberfläche des Virus das Virus spezifisch zu den T-Lymphozyten zielleiten. Worauf folgend die GILR-codierende Sequenz in die Zellen mittels des Virus eingeführt werden wird und, sobald sie co-exprimiert („so-expressed") ist, Apoptose in diesen Zellen inhibieren wird.
  • Auf eine analoge Weise können eingekapselte Plasmide, wie sie im Fachgebiet bekannt sind, auch für das spezifische Zielleiten bzw. Targeting von GILR-codierenden Plasmiden/Vektoren zu den Zellen verwendet werden, bei welchen die Kapseln die Spezifität des Targeting ermöglicht und die Plasmid-DNA die GILR-codierende Sequenz, die in den Zellen zu exprimieren ist, trägt. Konstruktion solcher rekombinanter Tierviren oder eingekapselter Plasmide geschehen durch Standardvorgehensweisen (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989).
  • Eine weitere Möglichkeit, DNA-Sequenzen, die GILR einschließlich seiner Isoformen, Analoga, Fragmente und Derivate (einschließlich der oben genannten Fusionsproteine) codieren, in Zellen einzuführen, ist in der Form von Oligonucleotiden, welche von den Zellen absorbiert werden können und darin exprimiert werden können. Solch ein Verfahren ist vorzuziehen, wenn die zu behandelnden Zellen, z. B. T-Lymphozyten in vitro mit dem Ziel behandelt werden, solche behandelten (geretteten) Zellen wieder zurück in den Patienten einzuführen. Gleichermaßen ist es auch möglich, beispielsweise ein lösliches GILR-Protein herzustellen und dieses in T-Zellen in vitro einzuführen oder die oben genannten viralen Vektoren oder eingekapselten Plasmide, codierend GILR, in T-Zellen in vitro einzuführen, um erhöhte Level von GILR oder GILR-Expression in diesen Zellen zu bewerkstelligen und sie dann in den Patienten wieder einzuführen.
  • Gleichermaßen können z. B. T-Lymphozyten in vitro unter den Umständen mit einem Peptid behandelt werden, das GILR-Aktivität (z. B. Inhibition von Apoptose) imitiert, in denen es erwünscht ist, Apoptose zu inhibieren, z. B. in Entzündungskrankheiten und Autoimmunkrankheiten oder akuter Hepatitis oder dergleichen.
  • Es sollte auch angemerkt werden, dass Proteine der Leucin-Zipper-Familie, zu welchen GILR gehört, auch die Fähigkeit zu haben scheinen, Lymphozytenaktivität zu stimulieren (wobei dies zusätzlich zu der Fähigkeit von GILR, Apoptose von inhibieren, ist). Folglich kann GILR in gewissen Situationen, in denen Aktivierung von Lymphozyten wichtiger ist als die Inhibition von Apoptose, auch verwendet werden, um Lymphozyten zu stimulieren. Beispielsweise ist gefunden worden, dass in gewissen neoplastischen Krankheiten (Krebsarten) und Immundefizienz (einschließlich AIDS)-Krankheiten nicht ansprechende oder auf geringem Level ansprechende T-Lymphozyten in dem Patienten existieren, wie z. B. in verschiedenen Tumor-infiltrierenden T-Lymphozyten. Folglich ist es, während es erwünscht ist, die Tumorzellen oder HIV-infizierten Zellen durch Induzieren erhöhter Apoptose in diesen Zellen zu töten (z. B. durch eigentliches spezifisches Inhibieren von GILR in diesen erkrankten Zellen), jedoch nicht weniger wünschenswert (wenn nicht wünschenswerter) in diesen Patienten die Aktivierung von T-Lymphozyten spezifisch zu stimulieren, wobei diese T-Lymphozyten, wenn aktiviert, beim Bekämpfen der Tumorzellen oder beim Überwinden der Immundefizienz, verursacht durch die HIV-Infektion, effektiver sein können. Folglich wäre es in solchen Situationen wünschenswert, die Mengen an GILR oder GILR-Expression in solchen T-Lymphozyten in vivo oder in vitro zu erhöhen, welches auf einem beliebigen der oben angegebenen Wege erzielt werden kann. In vitro-behandelte T-Zellen werden dann zurück in den Patienten transferiert werden.
  • Dieser Weg, erkrankte Zellen durch Stimulieren von Lymphozyten zu bekämpfen, ist in anderen Systemen verwendet worden, in welchen es entscheidend war, Co-Stimulation von T-Zellen bereitzustellen. Diese Herangehensweise der Verwendung von GILR, seinen Isoformen, Analoga, Fragmenten und Derivaten, Zellen zu behandeln, um T-Zell-Aktivierung zu stimulieren und auch zur gleichen Zeit diesen Zellen zu ermöglichen, Apoptose zu widerstehen (bedingt durch hohe GILR-Level in den behandelten Zellen) ist insbesondere nützlich in z. B. Melanomen, in welchen die Tumorzellen cytotoxische T-Lymphozyten durch die Fas/Fas-L-System-Wechselwirkung töten.
  • Direkte Behandlung von anderen Zellen als T-Lymphozyten mit GILR, seinen Isoformen, Analoga, Fragmenten oder Derivaten durch in vitro-Verfahren auf die verschiedenen möglichen Wege, wie oben angegeben, ist auch in verschiedenen anderen Krankheiten wichtig. Beispielsweise sterben in akuter Hepatitis Leberzellen mittels Apoptose, vermittelt durch Fas/Fas-L-System-Expression, wobei die Fas/Fas-L-System-Expression die Krankheit zu induzieren und aufrechtzuerhalten scheint (siehe Galle et al., 1995). GILR-Spiegel oder GILR-Expression spezifisch in diesen erkrankten Zellen zu erhöhen, sollte einen effektiven Weg für das Behandeln dieser Krankheit bereitstellen.
    • (ii) Im Gegensatz kann es in vielen Fällen wünschenswert sein, Immunzellstimulation zu inhibieren und apoptotischen Zelltod, vermittelt durch Fas/Fas-L, CD3/TCR oder andere Mediatoren, zu erhöhen. Die erkrankten Zellen können beispielsweise in verschiedenen Anti-Tumor-, Anti-HIV-, Anti-Entzündungsanwendungen spezifisch getötet werden durch Erhöhen der Spiegel an induzierter Apoptose, z. B. erhöhte Fas/Fas-L-System-Expression. In solchen Fällen wäre es deshalb wünschenswert GILR-Expression oder -Spiegel in diesen Zellen spezifisch zu inhibieren und auf diese Weise die Inhibition von Fas/Fas-L-System-Expression zu reduzieren, um letztendlich höhere Level an Fas/Fas-L-System-Expression und höhere Level an Zelltod durch Apoptose bereitzustellen.
  • Zum Erzielen von Inhibition von GILR-Expression oder -Aktivität in solchen Zellen existiert eine Anzahl möglicher Wege: es ist möglich, in die Zellen mittels Standardverfahren Oligonucleotide einzuführen, die die Antisense-codierende Sequenz für das GILR-Protein aufweisen, welche Translation von mRNAs, codierend GILR, effektiv blockieren würden, dadurch GILR-Expression blockieren würden und zu erhöhten Leveln an Fas/Fas-L-System-Expression und Apoptose führen würden.
  • Solche Oligonucleotide können in die Zellen unter Verwendung der obigen rekombinantes Virus-Vorgehensweise eingeführt werden, wobei die zweite Sequenz, die von dem Virus getragen wird, die Oligonucleotid-Sequenz ist.
  • Eine weitere Möglichkeit ist, Antikörper, spezifisch für das GILR-Protein, zu verwenden, um seine intrazelluläre Aktivität zu inhibieren.
  • Noch ein weiterer Weg zum Inhibieren der Aktivität von GILR ist (durch) die kürzlich entwickelte Ribozym-Vorgehensweise. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle, die RNAs spezifisch spalten. Ribozyme können konstruiert werden, um Ziel-RNAs nach Wahl zu spalten, z. B. die mRNAs, codierend das GILR-Protein der Erfindung. Solche Ribozyme würden eine Sequenz, spezifisch für die GILR-Protein-mRNA aufweisen und wären fähig, damit wechselzuwirken (komplemtäres Binden), gefolgt von Spaltung der mRNA, was in einer Abnahme (oder vollständigem Verlust) bei der Expression des GILR-Proteins resultiert, wobei der Level an verringerter Expression von dem Level an Ribozym-Expression in der Zielzelle abhängig ist. Um Ribozyme in die Zellen der Wahl einzuführen, kann ein beliebiger geeigneter Vektor verwendet werden, z. B. Plasmid, Tiervirus-(Retrovirus)Vektoren, die gewöhnlich zu diesem Zweck verwendet werden (siehe außerdem (i) oben, wo das Virus als zweite Sequenz eine cDNA, codierend die Ribozymsequenz nach Wahl, aufweist). (Übersichtsartikel, Verfahren etc. betreffend Ribozyme siehe Chen et al., 1992; Zhao und Pick, 1993; Shore et al., 1993; Joseph und Burke, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et al., 1993 und Koizumi et al., 1993).
  • Darüber hinaus ist es, um GILR-Expression zu inhibieren, auch möglich, durch die verschiedenen oben erwähnten Wege ein mutiertes GILR-Protein oder eine DNA-Sequenz, codierend ein mutiertes GILR, in Zellen einzuführen, wobei das mutierte GILR mit normalem GILR in diesen Zellen konkurrieren würde und normale GILR-Aktivität effektiv inhibieren würde.
  • Gleichermaßen ist es auch möglich, GILR-Aktivität in Zellen zu inhibieren, indem man solche Zellen mit einem Peptid behandelt, das die Leucin-Zipper-Domäne von GILR bindet, wodurch die Aktivität von GILR inhibiert wird. Solch ein Peptid kann durch Standardmittel hergestellt werden und mittels Standardvorgehensweisen in die Zellen eingeführt werden.
    • (iii) Das GILR-Protein, seine Analoga, Fragmente oder Derivate können auch verwendet werden, um andere Proteine der gleichen Klasse, d. h. jene, die zu der Leucin-Zipper-Familie gehören oder jene, welche an GILR binden und welche an den intrazellulären Signalgebungsprozessen, z. B. Inhibition von Apoptose, beteiligt sind, zu isolieren, zu identifizieren und zu klonieren. Bei dieser Anwendung kann die oben genannte (und unten in Beispiel 1 im Detail beschriebene) Subtraktionssondentechnik verwendet werden, oder es kann ein kürzlich entwickeltes System verwendet werden, das nicht-stringente Southern-Hybridisierung, gefolgt von PCR-Klonieren einsetzt (Wilks et al., 1989). In der Publikation von Wilks et al. ist die Identifikation und Klonierung von zwei mutmaßlichen Protein-Tyrosinkinasen durch Anwendung nichtstringenter Southern-Hybridisierung, gefolgt von Klonieren durch PCR, basierend auf der bekannten Sequenz des Kinasemotivs, einer mutmaßlichen („conceived") Kinasesequenz, beschrieben. Diese Vorgehensweise kann gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der Sequenz des GILR-Proteins verwendet werden, um jene der verwandten Proteine einschließlich GILR-bindender Proteine zu identifizieren und zu klonieren. Gleichermaßen kann das Hefe two-hybrid-System, das gut bekannt ist und nun Standard ist, eingesetzt werden, um spezifisch jene Proteine zu isolieren und zu klonieren, die fähig sind, spezifisch an GILR zu binden.
    • (iv) Ein noch weiterer Ansatz, das GILR-Protein oder seine Analoga, Fragmente oder Derivate davon der Erfindung einzusetzen, ist, sie in Verfahren der Affinitätschromatographie einzusetzen, um andere Proteine oder Faktoren zu isolieren und zu identifizieren, an welche sie zu binden in der Lage sind, z. B. andere Proteine oder Faktoren, beteiligt an den intrazellulären Signalgebungsprozessen. In dieser Anwendung können das GILR-Protein, seine Analoga, Fragmente oder Derivate davon der vorliegenden Erfindung einzeln an Affinitätschromatographie-Matrizen befestigt werden und dann in Kontakt gebracht werden mit Zellextrakten oder isolierten Proteinen oder Faktoren, von denen man annimmt, dass sie an dem intrazellulären Signalgebungsprozess beteiligt sind. Auf die Affinitätschromatographieprozedur folgend können die anderen Proteine oder Faktoren, welche an das GILR-Protein oder seine Analoga, Fragmente oder Derivate davon der Erfindung binden, eluiert, isoliert und charakterisiert werden.
    • (v) Wie oben angemerkt, können das GILR-Protein oder seine Analoga, Fragmente oder Derivate davon der Erfindung auch als Immunogene (Antigene) verwendet werden, um spezifische Antikörper dagegen zu produzieren. Diese Antikörper können auch verwendet werden für die Zwecke der Reinigung des GILR-Proteins (z. B. von GILR oder irgendeiner seiner Isoformen), entweder aus Zellextrakten oder aus transformierten Zelllinien, die GILR-Protein oder seine Analoga oder Fragmente produzieren. Weiterhin können diese Antikörper für diagnostische Zwecke zum Identifizieren von Störungen verwendet werden, die zu anormalem Funktionieren des GILR-Proteins in Beziehung stehen.
  • Es sollte auch angemerkt werden, dass die Isolation, Identifikation und Charakterisierung des GILR-Proteins der Erfindung unter Verwendung der gut bekannten Standard-Screening-Vorgehensweisen durchgeführt werden kann. Z. B. wurde eine dieser Screening-Vorgehensweisen, die Subtraktionssondentechnik, verwendet, wie es hierin unterhalb dargelegt ist. Das Hefe-Two-hybrid-System kann auch verwendet werden (siehe beispielsweise Boldin et al., 1995a, b und Referenzen darin). Gleichermaßen können, wie oben und unten angemerkt, andere Vorgehensweisen, wie z. B. Affinitätschromatographie, DNA-Hybridisierungs-Prozeduren etc., wie sie im Fachgebiet gut bekannt sind, eingesetzt werden, um das GILR-Protein der Erfindung zu isolieren, zu identifizieren und zu charakterisieren oder zusätzliche Proteine, Faktoren, Rezeptoren etc. zu isolieren, zu identifizieren und zu charakterisieren, welche fähig sind, an die GILR-Proteine der Erfindung zu binden.
  • Wie hierin oben dargelegt, kann das GILR-Protein verwendet werden, um Antikörper, spezifisch für GILR-Proteine, z. B. GILR und seine Isoformen, zu erzeugen. Diese Antikörper oder Fragmente davon können verwendet werden, wie es hierin unterhalb im Detail dargelegt ist, wobei es selbstverständlich ist, dass in diesen Anwendungen die Antikörper oder Fragmente davon jene sind, die spezifisch für GILR-Proteine sind.
  • Basierend auf den Funden gemäß der vorliegenden Erfindung, dass GILR ein Modulator (Inhibitor) von Fas/Fas-L-Expression und dem CD3/TCR-System ist und folglich Zelltod (Apoptose)-Wege vermitteln/modulieren kann, ist es wichtig, Arzneimittel zu entwerfen, welche die GILR-Aktivität, wie erwünscht, verstärken oder inhibieren können. Es gibt viele Krankheiten, in welchen solche Arzneimittel von großer Hilfe sein können. Unter anderem akute Hepatitis, bei welcher der akute Schaden an der Leber Fas/Fas-L-vermittelten Tod von Leberzellen zu reflektieren scheint; Autoimmun-induzierter Zelltod, wie z. B. der Tod der β-Langerhans-Zellen der Bauchspeicheldrüse, der in Diabetes resultiert; der Tod von Zellen bei der Transplantatabstoßung (z. B. Niere, Herz und Leber); der Tod von Oligodendrozyten im Gehirn bei multipler Sklerose; und AIDS-inhibierter T-Zell-Suizid, welcher Proliferation des AIDS-Virus und folglich der AIDS-Krankheit verursacht. In solchen Fällen ist es erwünscht, die GILR-Aktivität, wie oben angemerkt, zu verstärken und auf diese Weise Fas/Fas-L-Aktivität zu blockieren und Zelltod zu reduzieren. Jedoch ist es in anderen Fällen, wie oben angemerkt, wünschenswert, GILR-Aktivität zu blockieren, um letztendlich Zelltod zu erhöhen.
  • Hinsichtlich solcher Inhibitoren ist es möglich, dass eine oder mehrere der möglichen Isoformen von GILR als „natürliche" Inhibitoren von GILR-Aktivität dienen können und diese folglich wie die oben erwähnten spezifischen Inhibitoren von GILR eingesetzt werden können. Ähnlich dazu können mutierte GILR-Proteine und andere Substanzen, wie z. B. Peptide, organische Verbindungen, Antikörper etc., auch durchmustert werden, um spezifische Arzneimittel zu erhalten, welche fähig sind, die Aktivität von GILR zu inhibieren, z. B. Peptide, fähig zum Binden an die Leucin-Zipper-Domäne von GILR.
  • Ein nicht-limitierendes Beispiel davon, wie Peptidinhibitoren von GILR entworfen und durchmustert werden würden, basiert auf vorherigen Studien an Peptidinhibitoren von ICE oder ICE-ähnlichen Proteasen, der Substratspezifität von ICE und Strategien zur Epitopanalyse unter Verwendung von Peptidsynthese. Es wurde gefunden, dass das minimale Erfordernis zur effektiven Spaltung eines Peptids durch ICE vier Aminosäuren zur Linken der Spaltstelle mit einer starken Präferenz für Asparatat in der P1-Position und wobei Ethylamin zur Rechten der P1-Position ausreichend ist, beteiligt (Sleath et al., 1990; Howard et al., 1991; Thornberry et al., 1992). Weiterhin entspricht das fluorogene Substratpeptid (ein Tetrapeptid) Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-a(4-methylcumaryl-7-amid), abgekürzt Ac-DEVD-AMC, einer Sequenz in Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP), von der gefunden wurde, dass sie in Zellen kurz nach Fas-Stimulation sowie anderen apoptotischen („apoptopic") Prozessen (Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994) gespalten wird, und wird durch CPP32 (ein Mitglied der CED3/ICE-Proteasefamilie) und MACH-Proteasen wirksam gespalten.
  • Da Asp in der P1-Position des Substrats wichtig zu sein scheint, können Tetrapeptide, die Asp als den vierten Aminosäurerest aufweisen und verschiedene Kombinationen von Aminosäuren in den Positionen der ersten drei Reste aufweisen, rasch auf das Binden an das aktive Zentrum der Protease unter Verwendung von beispielsweise dem Verfahren, entwickelt durch Gey sen (Geysen, 1985; Geysen et al., 1987), wobei eine große Anzahl von Peptiden auf festen Trägern auf spezifische Wechselwirkungen mit Antikörpern hin durchmustert wurden, durchmustert werden. Das Binden von GILR an spezifische Peptide kann durch eine Vielzahl von gut bekannten Detektionsverfahren innerhalb fachmännischer Tätigkeit auf dem Gebiet, wie z. B. Radiomarkieren des GILR etc., detektiert werden. Von diesem Verfahren von Geysen wurde gezeigt, dass es fähig ist, an jedem Arbeitstag wenigstens 4000 Peptide zu testen.
  • Auf eine ähnliche Weise kann die genaue Bindungsregion oder Homologieregion, welche das aktive Zentrum von GILR bestimmt oder seine Leucin-Zipper-Domäne aufgedeckt werden und dann können Peptide durchmustert werden, welche dazu dienen können, das aktive Zentrum oder die Domäne zu blockieren, z. B. synthetisierte Peptide, die eine Sequenz, ähnlich zu der Region des aktiven Zentrums oder zu der Zipper-Domäne-Region, oder komplementär dazu, aufweisen, welche mit natürlichem GILR konkurrieren können.
  • Nachdem es vorteilhaft sein kann, Peptidinhibitoren zu entwerfen, die selektiv GILR-Wechselwirkungen inhibieren, ohne mit anderen physiologischen Zellprozessen zu interferieren, kann der Pool von Peptiden, die an GILR in einem Assay, wie dem oben beschriebenen, binden, weiterhin als ein fluorogenes Substratpeptid syntethisiert werden, um auf selektives Binden an anderen Proteine zu testen, um nur jene, spezifisch für GILR, auszuwählen. Peptide, von welchen bestimmt wird, dass sie spezifisch für GILR sind, können dann modifiziert werden, um Zellpermeabilität zu verstärken und Apoptose zu verstärken, indem sie GILR entweder reversibel oder irreversibel inhibieren. Thornberry et al. (1994) berichteten, dass ein Tetrapeptid(acyloxy)methylketon Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH2OC(O)-[2,6-(CF3)2]Ph ein wirkungsvoller Inaktivator von ICE war. In ähnlicher Weise berichteten Milligan et al. (1995), dass Tetrapeptidinhibitoren, die eine Chlormethylketon-(irreversibel) oder Aldehyd-(reversibel) Gruppe(n) aufweisen, ICE inhibierten. Zusätzlich dazu wurde gezeigt, dass ein Benzyloxycarboxyl-Asp-CH2OC(O)-2,6-dichlorbenzol (DCB) ICE inhibiert (Mashima et al., 1995). Demgemäß können auf eine analoge Weise Tetrapeptide, die selektiv an GILR binden, mit beispielsweise einer Aldehydgruppe, einem Chlormethylketon, einem (Acyloxy)methylketon oder einer CH2OC(O)-DCB-Gruppe modifiziert werden, um einen Peptidinhibitor von GILR-Aktivität zu erzeugen.
  • Weiterhin können Peptide, um Permeabilität zu verbessern, beispielsweise chemisch modifiziert oder derivatisiert werden, um ihre Permeabilität über die Zellmembran hinweg zu verbessern und den Transport solcher Peptide durch die Membran und in das Cytoplasma zu erleichtern.
  • Muranishi et al. (1991) berichteten über das Derivatisieren von Thyrotropin-Freisetzungshormon mit Laurinsäure, um ein lipophiles Lauroylderivat mit guten Penetrationscharakteristika durch Zellmembranen zu bilden. Zacharia et al. (1991) berichteten außerdem über die Oxidation von Methionin zu Sulfoxid und das Ersetzen der Peptidbindung mit seinem Ketomethylenisoester (COCH2), um den Transport von Peptiden durch die Zellmembran zu er leichtern. Diese sind nur einige der bekannten Modifikationen und Derivate, die sicher innerhalb der Tätigkeit eines Fachmanns auf dem Gebiet liegen.
  • Weiterhin können Arzneimittel oder Peptidinhibitoren, welche fähig sind, die Aktivität von GILR zu inhibieren und Zelltod durch Apoptose zu verstärken, mit Molekülen konjugiert oder komplexiert werden, die Eintritt in die Zelle ermöglichen.
  • U. S. Patent Nr. 5,149,782 offenbart das Konjugieren eines Moleküls, das über die Zellmembran hinweg transportiert werden soll, mit einem Membranmischungsmittel („membrane blending agent"), wie z. B. fusogenen Polypeptiden, Innenkanal-bildenden Polypeptiden, anderen Membranpolypeptiden und langkettigen Fettsäuren, z. B. Myristinsäure, Palmitinsäure. Diese Membranmischungsmittel insertieren die molekularen Konjugate in die Lipiddoppelschicht von Zellmembranen und erleichtern ihren Eintritt in das Cytoplasma.
  • Low et al., U. S. Patent Nr. 5,108,921 , rezensieren verfügbare Verfahren für das Transmembran-Abliefern von Molekülen, wie z. B., jedoch nicht limitiert auf, Proteine und Nucleinsauren, durch den Mechanismus von Rezeptor-vermittelter Endocytose-Aktivität. Diese Rezeptorsysteme beinhalten jene, die Galactose, Mannose, Mannose-6-phosphat, Transferrin, Asialoglycoprotein, Transcobalamin (Vitamin 1312), α-2-Makroglobuline, Insulin und andere Peptidwachstumsfaktoren, wie z. B. epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF), erkennen. (Die Referenz von) Low et al. lehrt, dass Nährstoffrezeptoren, wie z. B. Rezeptoren für Biotin und Folat, aufgrund der Lokalisierung und Vielzahl der Biotin- und Folat-Rezeptoren auf den Membranoberflächen der meisten Zellen und der assoziierten Rezeptor-vermittelten Transmembran-Transport-Prozesse in vorteilhafter Weise verwendet werden können, um Transport über die Zellmembran hinweg zu verstärken. Folglich wird ein Komplex, gebildet zwischen einer in das Cytoplasma abzuliefernden Verbindung und einem Liganen, wie z. B. Biotin oder Folat, mit einer Zellmembran in Kontakt gebracht, die Biotin- oder Folat-Rezeptoren trägt, um den Rezeptor-vermittelten Transmembrantransportmechanismus zu initiieren und dadurch Eintritt der gewünschten Verbindung in die Zelle zu erlauben.
  • Von ICE ist bekannt, dass es die Fähigkeit hat, liberale Substitutionen in der P2-Position zu tolieren, und diese Toleranz gegenüber liberalen Substitutionen wurde ausgenutzt, um eine wirksame und hoch selektive Affinitätsmarkierung zu entwickeln, die einen Biotin-Tag enthält (Thornberry et al., 1994). Konsequenterweise kann die P2-Position sowie möglicherweise der N-Terminus des Tetrapeptidinhibitors modifiziert oder derivatisiert werden, wie z. B. mit der Addition eines Biotinmoleküls, um die Permeabilität dieser Peptidinhibitoren über die Zellmembran hinweg zu verstärken.
  • Zusätzlich dazu ist es im Fachgebiet bekannt, das Fusionieren einer gewünschten Peptidsequenz mit einer Leader-Signalpeptidsequenz, um ein „chimäres Peptid" zu erzeugen, erlauben wird, dass solch ein „chimäres Peptid” über die Zellmembran hinweg in das Cytoplasma transportiert wird.
  • Wie von jenen, die über Können auf dem Fachgebiet von Peptiden verfügen, verstanden werden wird, ist beabsichtigt, dass die Peptidinhibitoren der GILR-Wechselwirkung gemäß der Erfindung peptidomimetische Arzneimittel oder Inhibitoren einschließen, welche auch rasch auf das Binden an GILR durchmustert werden können, um vielleicht stabilere Inhibitoren zu entwerfen.
  • Es wird auch verstanden werden, dass die gleichen Mittel für das Ermöglichen oder Verstärken des Transports von Peptidinhibitoren über Zellmembranen hinweg, wie oben diskutiert, auch anwendbar sind auf das GILR oder seine Isoformen selbst, sowie andere Peptide und Proteine, die davon abgeleitet sind, wie oben angemerkt, welche ihre Effekte intrazellulär ausüben.
  • Was die hierin durch das ganze Dokument hindurch erwähnten Antikörper betrifft, ist beabsichtigt, dass der Ausdruck „Antikörper" polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAk), chimäre Antikörper, anti-idiotype (anti-Id) Antikörper gegen Antikörper, die in löslicher oder gebundener Form markiert werden können, sowie Fragmente davon, bereitgestellt durch irgendeine bekannte Technik, wie z. B., jedoch nicht limitiert auf enzymatische Spaltung, Peptidsynthese oder rekombinante Techniken, einschließt.
  • Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, abgeleitet aus den Seren von Tieren, die mit einem Antigen immunisiert sind. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im Wesentlichen homogene Population von Antikörpern, spezifisch für Antigene, wobei die Population(en) im Wesentlichen ähnliche Epitop-Bindungsstellen enthält. Monoklonale Antikörper (mAK) können erhalten werden durch Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Siehe beispielsweise Kohler und Milstein, Nature, 256: 495–497 (1975); U.S. Patent Nr. 4,376,110 ; Ausubel et al., Hrsg., Harlow und Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); und Colligan et al., Hrsg., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N. Y., (1992-1996), wobei die Inhalte dieser Referenzen in ihrer Gesamtheit hierin mittels Referenz inkorporiert sind. Solche Antikörper können von einer beliebigen Immunoglobulinklasse einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und irgendwelchen Unterklassen davon sein. Ein Hybridom, das einen mAk der vorliegenden Erfindung produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Produktion hoher Titer von mAk in vivo oder in situ macht dies zum gegenwärtig bevorzugten Produktionsverfahren.
  • Chimäre Antikörper sind Moleküle, von welchen unterschiedliche Anteile von unterschiedlichen Tierarten abgeleitet sind, wie z. B. jene, die die variable Region, abgeleitet von einem Maus-mAk, aufweisen und eine konstante Region eines menschlichen Immunoglobulins aufweisen. Chimäre Antikörper werden in erster Linie verwendet, um Immunogenität bei Anwendung zu reduzieren und Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, beispielsweise wo murine mAk höhere Ausbeuten von Hybridomen aufweisen, jedoch höhere Immunogenität in Menschen aufweisen, so dass chimäre Mensch/Maus-mAk verwendet werden. Chimäre Antikörper und Verfahren für ihre Produktion sind im Fachgebiet bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273–3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851–6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643–646 (1984); Cabilly et al., Europäische Patentanmeldunng 125023 (veröffentlicht am 14. November 1984); Neuberger et al., Nature, 314: 268–270 (1985); Taniguchi et al., Europäische Patentanmeldung 171496 (veröffentlicht am 19. Februar 1985); Morrison et al., Europäische Patentanmeldung 173494 (veröffentlicht am 5. März 1986); Neuberger et al., PCT-Anmeldung WO 8601533 (veröffentlicht am 13. März 1986); Kudo et al., Europäische Patentanmeldung 184187 (veröffentlicht am 11. Juni 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066–1074 (1986); Robinson et al., Internationale Patentanmeldung Nr. WO 8702671 (veröffentlicht am 7. Mai 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439–3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218 (1987); Retter et al., Science 240: 1041–1043 (1988); und Harlow und Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra.
  • Ein anti-idiotyper (anti-Id) Antikörper ist ein Antikörper, welcher einzigartige Determinanten, im Allgemeinen assoziiert mit der Antigenbindungsstelle eines Antikörpers, erkennt. Ein Id-Antikörper kann hergestellt werden durch Immunisieren eines Tiers gleicher Art und genetischen Typs (z. B. Mausstamm), wie die Quelle des mAk, gegen welchen ein anti-Id hergestellt wird. Das immunisierte Tier wird die idiotypen Determinanten des immunisierenden Antikörpers erkennen und darauf reagieren durch Produzieren eines Antikörpers gegen diese idiotypen Determinanten (den Anti-Id-Antikörper). Siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 4,699,880 , welches hierin in seiner Gesamtheit mittels Referenz inkorporiert ist.
  • Der Anti-Id-Antikörper kann auch verwendet werden als ein „Immunogen", um eine Immunreaktion in einem noch weiteren Tier zu induzieren, das einen sogenannten Anti-Anti-Id-Antikörper produziert. Der Anti-Anti-Id kann epitopisch identisch zu dem ursprünglichen mAk sein, welcher den Anti-Id induzierte.
  • Folglich ist es durch Verwendung von Antikörpern gegen die idiotypen Determinanten eines mAk möglich, andere Klone zu identifizieren, die Antikörper identischer Spezifität exprimieren.
  • Demgemäß können mAk, erzeugt gegen die GILR-Proteine, Analoga, Fragmente oder Derivate davon der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Anti-Id-Antikörper in geeigneten Tieren, wie z. B. BALB/c-Mäusen, zu induzieren. Milzzellen aus solchen immunisierten Mäusen werden verwendet, um Anti-Id-Hybridome zu produzieren, die Anti-Id-mAk sezernieren. Weiterhin können die Anti-Id-mAk an einen Träger wie z. B. ein „keyhole limpet hemocyanin" (KLH) gekoppelt werden und verwendet werden, um zusätzliche BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Seren aus diesen Mäusen werden Anti-Anti-Id-Antikörper enthalten, die die Bindungseigenschaften des ursprünglichen mAk, spezifisch für ein Epitop des obigen GILR-Proteins oder der Analoga, Fragmente und Derivate davon, aufweisen.
  • Die Anti-Id-mAk haben folglich ihre eigenen idiotypen Epitope oder „Idiotope", die strukturell ähnlich sind zu dem Epitop, das ausgewertet wird, wie z. B. GRB-Protein A.
  • Es ist außerdem beabsichtigt, dass der Ausdruck „Antikörper" sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente davon, wie z. B. Fab und F(ab')2, einschließt, welche fähig sind, Antigen zu binden. Fab- und F(ab')2-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment eines intakten Antikörpers, sie werden rascher aus der Zirkulation entfernt und können weniger nicht-spezifische Gewebebindung als ein intakter Antikörper aufweisen (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316–325 (1983)).
  • Es wird verstanden werden, dass Fab- und F(ab')2- und andere Fragmente der Antikörper, verwendbar in der vorliegenden Erfindung, verwendet werden können für die Detektion und Quantifizierung des GILR-Proteins gemäß den hierin offenbarten Verfahren für intakte Antikörpermoleküle. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung unter Verwendung von Enzymen, wie z. B. von Papain (um Fab-Fragmente zu produzieren) oder Pepsin (um F(ab')2-Fragmente zu produzieren), hergestellt.
  • Von einem Antikörper wird gesagt, dass er „fähig zum Binden" eines Moleküls ist, wenn er fähig ist, spezifisch mit dem Molekül zu reagieren, um dadurch das Molekül an den Antikörper zu binden. Der Ausdruck „Epitop" soll sich auf den Anteil eines Moleküls, das fähig ist, von einem Antikörper gebunden zu werden, beziehen, welches auch von diesem Antikörper erkannt werden kann. Epitope oder „antigene Determinanten" bestehen gewöhnlich aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen, wie z. B. Aminosäuren(-) oder Zuckerseitenketten, und weisen spezifische dreidimensionale Strukturcharakteristika sowie spezifische Ladungscharakteristika auf.
  • Ein „Antigen" ist ein Molekül oder ein Anteil eines Moleküls, fähig, von einem Antikörper gebunden zu werden, welches zusätzlich fähig ist, ein Tier zu induzieren, einen Antikörper zu produzieren, der fähig ist, an ein Epitop dieses Antigens zu binden. Ein Antigen kann ein Epitop oder mehr als ein Epitop aufweisen. Die spezifische Reaktion, auf die oben Bezug genommen wird, soll anzeigen, dass das Antigen auf eine hoch selektive Art und Weise mit seinem entsprechenden Antikörper reagieren wird und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper, welche durch andere Antigene hervorgerufen worden sein können.
  • Die Antikörper, einschließlich der Fragmente von Antikörpern, verwendbar in der vorliegenden Erfindung, können verwendet werden, um das GILR-Protein in einer Probe quantitativ oder qualitativ zu detektieren oder das Vorhandensein von Zellen zu detektieren, welche das GILR-Protein der vorliegenden Erfindung exprimieren. Dies kann erreicht werden durch Immunofluoreszenztechniken, die einen fluoreszent markierten Antikörper (siehe unten) einsetzen, gekoppelt mit lichtmikroskopischer, Durchfluss-cytometrischer oder fluorometrischer Detektion.
  • Die Antikörper (oder Fragmente davon), verwendbar in der vorliegenden Erfindung, können histologisch, wie bei Immunofluoreszenz- oder Immunoelektronenmikroskopie, zur in situ-Detektion des GILR-Proteins der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. In situ-Detektion kann erreicht werden durch Entfernen einer histologischen Probe von einem Patienten, und Anwenden des markierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung auf solch eine Probe. Der Antikörper (oder das Fragment) wird vorzugsweise bereitgestellt durch Anwenden oder durch Über schichten des markierten Antikörpers (oder Fragments) auf/über eine biologische Probe. Durch die Verwendung solch einer Vorgehensweise ist es möglich, nicht nur das Vorhandensein des GILR-Proteins zu bestimmen, sondern außerdem seine Verteilung auf dem untersuchten Gewebe zu bestimmen.
  • Beim Verwenden der vorliegenden Erfindung wird der Durchschnittsfachmann leicht wahrnehmen, dass irgendeines der großen Vielfalt histologischer Verfahren (wie z. B. Färbeverfahren) modifiziert werden kann, um solch eine in situ-Detektion zu erreichen.
  • Solche Assays für das GILR-Protein der vorliegenden Erfindung umfassen typischerweise Inkubieren einer biologischen Probe, wie z. B. einer biologischen Flüssigkeit, eines Gewebeextrakts, frisch geernteter Zellen, wie z. B. Lymphozyten oder Leukozyten, oder von Zellen, welche in Gewebekultur inkubiert worden sind, in Gegenwart eines detektierbaren markierten Antikörpers, fähig zum Identifizieren des GILR-Proteins, und Nachweisen des Antikörpers durch irgendeine einer Anzahl von auf dem Fachgebiet gut bekannter Techniken.
  • Die biologische Probe kann behandelt werden mit einer Festphasenhaltevorrichtung oder einem Festphasenträger, wie z. B. Nitrocellulose, oder einer/einem anderen festen Haltevorrichtung/Träger, welche(r) fähig ist, Zellen, Zellpartikel oder lösliche Proteine zu immobilisieren. Die Haltevorrichtung oder der Träger kann dann mit geeigneten Puffer gewaschen werden, gefolgt von Behandlung mit einem detektierbaren markierten Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, wie oben angemerkt. Die Festphasenhaltevorrichtung oder der Festphasenträger können dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Die Menge an gebundener Markierung auf der festen Haltevorrichtung oder dem festen Träger kann dann durch konventionelle Mittel detektiert werden.
  • Durch „Festphasenhaltevorrichtung", „Festphasenträger", „feste Haltevorrichtung", „fester Träger", „Haltevorrichtung" oder „Träger" ist irgendeine Haltevorrichtung oder irgendein Träger beabsichtigt, fähig zum Binden von Antigen oder Antikörpern. Gut bekannte Haltevorrichtungen oder Träger schließen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Gabbros und Magnetit ein. Die Art des Trägers kann für den Zweck der vorliegenden Erfindung entweder in einem gewissen Ausmaß löslich oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann so gut wie jede mögliche strukturelle Konfiguration aufweisen, solange das gekoppelte Molekül fähig ist, an ein Antigen oder einen Antikörper zu binden. Folglich kann die Haltevorrichtungs- oder Trägerkonfiguration sphärisch, wie bei einem Kügelchen, zylindrisch, wie bei der Innenseitenoberfläche eines Teströhrchens oder der äußeren Oberfläche eines Stabes, sein. Alternativ kann die Oberfläche flach sein, wie z. B. ein Blatt, Teststreifen etc.
  • Bevorzugte Haltevorrichtungen oder Träger schließen Polystyrolkügelchen ein. Der Fachmann auf dem Gebiet wird viele andere geeignete Träger für das Binden von Antikörper oder Antigen kennen oder wird in der Lage sein, das gleiche durch Routineexperimentieren sicherzustellen.
  • Die Bindungsaktivität einer gegebenen Antikörpercharge der Erfindung, wie oben angemerkt, kann durch gut bekannte Verfahren bestimmt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet wird in der Lage sein, funktionsfähige und optimale Assaybedingungen für jede Bestimmung durch Einsetzen von Routineexperimentation zu bestimmen.
  • Andere solche Schritte, wie Waschen, Rühren, Schütteln, Filtrieren und dergleichen, können zu den Assays zugefügt werden, wie es gebräuchig ist oder notwendig ist für die jeweilige Situation.
  • Einer der Wege, auf welche ein Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung detektierbar markiert werden kann, erfolgt durch Verknüpfen desselben mit einem Enzym und verwenden in einem Enzym-Immuno-Assay (EIA). Dieses Enzym wird wiederum, wenn es später einem geeigneten Substrat ausgesetzt ist, mit dem Substrat auf solch eine Weise reagieren, um eine chemische Gruppierung zu produzieren, welche detektiert werden kann beispielsweise durch spektrophotometrische, fluorometrische oder durch visuelle Mittel. Enzyme, welche verwendet werden können, um den Antikörper detektierbar zu markieren, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Malatdehydrogenase, Staphylococcennuclease, delta-5-Steroid-Isomerase, Hefe-Alkoholdehydrogenase, alpha-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase. Die Detektion kann erreicht werden durch kolorimetrische Verfahren, welche ein homogenes Substrat für das Enzym einsetzen. Detektion kann auch erreicht werden durch visuellen Vergleich des Ausmaßes an enzymatischer Reaktion eines Substrats im Vergleich mit in ähnlicher Weise präparierten Standards.
  • Detektion kann unter Verwendung einer Vielzahl anderer Immunoassays erzielt werden.
  • Beispielsweise ist es durch radioaktives Markieren der Antikörper oder Antikörperfragmente möglich, R-PTPase durch die Verwendung eines Radioimmunoassays (RIA) zu detektieren. Eine gute Beschreibung von RIA kann in „Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology", von Work, T. S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978), mit besonderer Bezugnahme auf das Kapitel, überschrieben „An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" von Chard, T., hierin durch Referenz inkorporiert, gefunden werden. Das radioaktive Isotop kann durch solche Mittel wie die Verwendung eines g-Zählers („g counter") oder eines Szintillationszählers oder durch Autoradiographie detektiert werden.
  • Es ist auch möglich, einen Antikörper gemäß der Erfindung mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wenn der Fluoreszenz-markierte Antikörper gegenüber Licht der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt wird, kann seine Gegenwart dann, bedingt durch Fluoreszenz, detektiert werden. Unter den am gewöhnlichsten verwendeten Fluoreszenzmarkierungsverbindungen sind Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Pycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin.
  • Der Antikörper kann auch unter Verwendung von Fluoreszenz-emittierenden Metallen, wie z. B. von 125E, oder anderen der Lanthanidreihe, detektierbar markiert werden. Diese Metalle können unter Verwendung solcher Metall-chelierender Gruppen, wie z. B. von Diethylentriaminpentaessigsäure (ETPA), an dem Antikörper befestigt werden.
  • Der Antikörper kann außerdem dadurch detektierbar markiert werden, indem er an eine chemilumineszente Verbindung gekoppelt wird. Die Gegenwart des Chemilumineszenzmarkierten Antikörpers wird dann durch Detektieren des Vorhandenseins von Lumineszenz bestimmt, die während des Verlaufs einer chemischen Reaktion auftritt. Beispiele besonders nützlicher chemilumineszenter Markierungsverbindungen sind Luminol, Isoluminol, theromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester.
  • Gleichermaßen kann eine biolumineszente Verbindung verwendet werden, um den Antikörper der vorliegenden Erfindung zu markieren. Biolumineszenz ist eine Art von Chemilumineszenz, gefunden in biologischen Systemen, in welchen ein katalytisches Protein die Effizienz der Chemilumineszenzreaktion erhöht. Die Gegenwart eines biolumineszenten Proteins wird bestimmt durch Detektieren der Gegenwart von Lumineszenz. Wichtige Biolumineszenzverbindungen für Zwecke des Markierens sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
  • Ein Antikörpermolekül der vorliegenden Erfindung kann angepasst werden für den Einsatz in einem immunometrischen Assay (auch bekannt als ein „two-site"- oder „Sandwich"-Assay). In einem typischen immunometrischen Assay wird eine Menge an unmarkiertem Antikörper (oder Antikörperfragment) an eine feste Haltevorrichtung oder einen festen Träger gebunden und eine Menge an detektierbar markiertem löslichem Antikörper wird zugegeben, um Detektion und/oder Quantifizierung des ternären Komplexes, gebildet zwischen Festphasen-Antikörper, Antigen und markiertem Antikörper zu erlauben.
  • Typische und bevorzugte immunometrische Assays beinhalten „Vorwärts"-Assays („forward assays"), bei welchen der an die feste Phase gebundene Antikörper zuerst mit der Probe, die getestet wird, in Kontakt gebracht wird, um das Antigen aus der Probe durch Bilden eines binären Festphasenantikörper-Antigen-Komplexes zu extrahieren. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird die feste Haltevorrichtung oder der feste Träger gewaschen, um den Rest der flüssigen Probe, einschließlich von nicht-reagiertem Antigen, sofern vorhanden, zu entfernen und dann in Kontakt gebracht mit der Lösung, enthaltend eine unbekannte Menge an markiertem Antikörper (welche als ein „Reportermolekül" fungiert). Nach einer zweiten Inkubationsperiode, um dem markierten Antikörper zu erlauben, mit dem an die feste Haltevorrichtung oder den festen Träger durch den unmarkierten Antikörper gebundenes Antigen zu komplexieren, wird die feste Haltevorrichtung oder der feste Träger ein zweites Mal gewaschen, um nicht-reagierten markierten Antikörper zu entfernen.
  • In einer anderen Art des „Sandwich"-Assays, welcher mit den Antigenen der vorliegenden Erfindung auch nützlich sein kann, werden die sogenannten „simultanen” und „rückwärtigen" („reverse") Assays verwendet. Ein simultaner Assay beinhaltet einen einzelnen Inkubati onsschritt, weil der an die feste Haltevorrichtung oder den festen Träger gebundene Antikörper und der markierte Antikörper beide zu der Probe, die getestet wird, zur gleichen Zeit zugegeben werden. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, wird die feste Haltevorrichtung oder der feste Träger gewaschen, um den Rest an flüssiger Probe und nicht-komplexiertem markiertem Antikörper zu entfernen. Die Gegenwart von markiertem Antikörper, assoziiert mit der festen Haltevorrichtung oder dem festen Träger, wird dann bestimmt, wie sie in einem konventionellen „Vorwärts"-Sandwichassay bestimmt werden würde.
  • Bei dem „rückwärtigen" Assay wird die schrittweise Zugabe zuerst einer Lösung markierten Antikörpers zu der flüssigen Probe, gefolgt von der Zugabe von nicht-markiertem Antikörper, gebunden an eine feste Haltevorrichtung oder einen festen Träger, nach einer geeigneten Inkubationsperiode, eingesetzt. Nach einer zweiten Inkubation wird die feste Phase auf konventionelle Weise gewaschen, um sie von dem Rest der Probe, die getestet wird, und der Lösung von nicht-reagiertem markiertem Antikörper zu befreien. Die Bestimmung von markiertem Antikörper, assoziiert mit einer festen Haltevorrichtung oder einem festen Träger wird dann wie in den „simultanen" und „Vorwärts"-Assays bestimmt.
  • Die GILR-Proteine der Erfindung können durch irgendeine Standard-rekombinante DNA-Vorgehensweise hergestellt werden (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989 und Ausubel et al., 1987-1995, supra), bei welcher geeignete eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, gut bekannt im Fachgebiet, durch geeignete eukaryotische oder prokaryotische Vektoren, die die Sequenzen enthalten, die für die Proteine codieren, transformiert werden. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch solche Expressionsvektoren und transformierten Wirte zur Herstellung der Proteine der Erfindung. Wie oben erwähnt, schließen diese Proteine auch ihre biologisch aktiven Analoga, Fragmente und Derivate ein und folglich schließen die Vektoren, die sie codieren, auch Vektoren ein, die Analoga oder Fragmente dieser Proteine codieren und die transformierten Wirte schließen auch jene ein, die solche Analoga oder Fragmente produzieren. Die Derivate dieser Proteine, hergestellt durch die transformierten Wirte, sind die Derivate, hergestellt durch Standardmodifikation der Proteine oder ihrer Analoga oder Fragmente.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend rekombinante Tier-Virus-Vektoren, die die GILR-Proteine codieren, wobei der Vektor auch ein Virusoberflächenprotein codiert, das fähig ist, spezifische Zielzell-(z. B. Lymphozyten, Krebszellen etc.)-Oberflächenproteine zu binden, um die Insertion der GILR-Proteinsequenzen in die Zellen zu steuern. Weitere pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung umfassen als den aktiven Bestandteil (a) eine Oligonucleotidsequenz, codierend eine Antisense-Sequenz der GILR-Proteinsequenz, oder (b) Arzneimittel, die die GILR-Aktivität blockieren.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten eine ausreichende Menge des aktiven Bestandteils, um seinen beabsichtigten Zweck zu erzielen. Zusätzlich dazu können die pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger enthalten, die Exzipientien und Hilfsmittel umfassen, die Prozessieren der aktiven Verbindung in Zubereitungen erleichtern, die pharmazeutisch verwendet werden können, und die solche Zubereitungen zur Verabreichung an das Subjekt, das derer bedarf, stabilisieren können, die dem Fachmann auf dem Gebiet auch gut bekannt sind.
  • Die Erfindung wird nun in größerem Detail in dem folgenden nicht-beschränkenden Beispiel und den begleitenden Zeichnungen beschrieben werden. Es sollte angemerkt werden, dass alle der verschiedenen Vorgehensweisen, wenn nicht anders angezeigt, Standard-Vorgehensweisen des Fachgebiets sind oder Vorgehensweisen sind, die allen, die über Können auf dem Fachgebiet verfügen, mittels ihrer Veröffentlichung, wie in weit verfügbaren Veröffentlichungen beschrieben, leicht offensichtlich sind. Gleichermaßen sind all die verschiedenen Reagenzien, Zellen etc. (d. h. „Materialien") allen von Können in dem Fachgebiet leicht verfügbar mittels Erwerben von den verschiedenen Herstellern oder mittels der Standardherstellung davon.
  • Beispiel 1: Identifikation, Isolierung, Klonierung und Charakterisierung des GILR-Gens und des GILR-Proteins
  • I. Materialien und Methoden
  • a) Zellen und Kulturbedingungen:
  • Thymocyten wurden erhalten von 3 bis 5 Wochen alten C3H/HeN-Mäusen, käuflich erworben von Charles River (Mailand, Italien). Die Zellsuspensionen wurden gewaschen, filtriert und auf eine Konzentration von 8 × 106 Zellen/ml in Vollmedium eingestellt. Die Zellen wurden bei 37°C alleine oder mit 100 nM/l DEX (Sigma, St. Louis, Mo.) 3 Stunden lang inkubiert. Eine CD3+-, CD4+-, CD2+- CD44+-Unterlinie, erhalten in unserem Labor, der OVA-spezifischen Maus-Hybridom-T-Zell-Linie (3DO; Ayroldi et al., 1995) aufrechterhalten in Suspension in RPMI-1640-Medium, supplementiert mit 10% FCS und 10 μM HEPES-Puffer, wurde für Transfektionsexperimente verwendet. Zellen wurden bei zuvor etablierten Zeiten bei 200 g 10 min lang zentrifugiert, gewaschen und auf die gewünschten Konzentrationen eingestellt.
  • b) RNA-Präparation:
  • Gesamte cytoplasmatische RNA wurde aus Thymocyten unter Verwendung des Protokolls von Chirgwin (Chirgwin et al., 1979) isoliert. Polyadenylierte RNA wurde erhalten wie früer beschrieben (Maniatis et al., 1989).
  • c) Bibliothek-Konstruktion:
  • Eine gerichtet klonierte cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von polyadenylierter cytoplasmatischer RNA aus Thymozyten, kultiviert für 3 Stunden in Gegenwart von DEX gemäß dem Maniatis-Protokoll (siehe Maniatis et al., 1989), konstruiert. Kurz gesagt wurde eine Erststrang-cDNA erhalten durch eine Umkehrreaktion („reverse reaction") unter Verwendung eines Oligo(dT)-Primers (10 μg) und von 7 μg di-polyadenylierter RNA. Um Synthese aufzuzeichnen, waren 20 μCi [32P] dCTP (3000 Ci/mmol) im Reaktionsgemisch enthalten. Eine Zweitstrang-cDNA wurde gemäß den von Gubler und Hoffman beschriebenen Vorgehensweisen synthetisiert (Gubler und Hoffman, 1983). Die cDNA hatte stumpfe Enden unter Verwendung von T4-Polymerase (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) und wurde dann methy liert mit EcoRI-Methylase (Boehringer Mannheim). EcoRI-Linker wurden an die cDNA mit T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, Beverly, MA) bei 16°C 12 Stunden lang ligiert. Folgend auf die Ligation von Linkern wurde die Reaktion durch Erwärmen auf 68°C und 15-mintitiges Inkubieren bei dieser Temperatur inaktiviert. Die cDNA-Suspension wurde in Ethanol gefällt und auf einer CL4B-Säule (Invitrogen BV, San Diego, CA) gereinigt.
  • Die cDNA wurde in λgt11-Arme unter Verwendung von EcoRI-Adaptoren insertiert, wobei dem Protokoll des Herstellers (Invitrogen) gefolgt wurde. Rekombinante Klone (0,25 × 104 p. f. u./μl) wurden durch Hybridisierung mit der Subtraktionssonde (siehe unten) durchmustert.
  • d) Subtraktionssonden-Vorgehensweise und Bibliotheksdurchmustern
  • Um die subtrahierte Sonde zu konstruieren, wurden eine biotinylierte Kopie des nichtinduzierten Pools von mRNA (10 μg) und 32P-markierte cDNA aus der induzierten RNA (1 μg) in Ethanol co-präzipitiert. Das Präzipitat wurde getrocknet und in 2x-Hybridisierungspuffer gelöst. Die Probe wurde 1 Minute lang bei 100°C erwärmt und dann 24 Stunden lang bei 68°C inkubiert. Um unhybridisierte von hybridisierten Sequenzen zu trennen, wurde die Reaktion 10-bis 15-fach mit Streptavidin-Bindungspuffer verdünnt und mit Streptavidin 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Zwei Phenol-Chloroform-Extraktionen wurden durchgeführt. Nach Präzipitation wurde die markierte cDNA-Sonde in 50 μl sterilem Wasser resuspendiert und direkt als eine Subtraktionssonde zum Screenen der cDNA-Bibliothek verwendet.
  • Nitrocellulosefilter (Amersham Life Science International PLC, Buckinghamshire, England), mit welchen Blotting-Platten erhalten wurden, die 5 × 104 Klone enthielten, wurden in 5 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung, 1% SDS, 100 μg/μl tRNA (Sigma) und 20 mM Natriumpyrophosphat (pH 6,8) bei 42°C 12 Stunden lang hybridisiert und der letzte Waschschritt war in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 30 min.
  • e) Northern Blot-Analyse
  • Angezeigte Mengen (siehe „Kurze Beschreibung der Zeichnungen" oben) gesamter cytoplasmatischer RNA (die von 2 μg–25 μg RNA/Spur auf den Gelen reichten, wie angegeben hinsichtlich der Figuren in „Kurze Beschreibung der Zeichnungen" oberhalb hierin) wurden auf 1,2%igen Agarosegelen getrennt und auf Nitrocellulosefilter (Scheicher und Schuell, Kassel („Dassel"), Deutschland) transferiert. DNA-Sonden wurden unter Verwendung des Nick-Translations-Kit von Boehringer Mannheim und unter Befolgen der Instruktionen des Herstellers 32P-markiert. Die Hybridisierung wurde über Nacht durchgeführt. Filter wurden dreimal in 0,2 × SSC mit 0,5% SDS bei 37°C, gefolgt von zwei Waschschritten bei 65°C, gewaschen.
  • f) Primer Extension-Technik
  • Die Primer Extension wurde gemäß der Vorgehensweise von Maniatis (Maniatis et al., 1989) durchgeführt. Der radiomarkierte DNA-Primer (105 cpm), komplementär zu der Sequenz von dem Nucleotid bei Position 298 zu dem Nucleotid bei Position 327 des GILR-Gens (siehe 2) wurde mit 20 μg mRNA von Dex-behandelten Thymocyten 3 Stunden lang gemischt.
  • g) DNA-Sequenzbestimmung
  • cDNA-Klone wurden unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase (Sequenase-Kit, US Biochemical Corp.) im Zusammenhang mit speziell synthetisierten 20- und 21-mer Oligonucleotidprimern (komplementär zu der cDNA-Sequenz) und Primern, komplementär zu den Plasmid-Klonierungsstelle-Sequenzen, sequenziert. Überlappende Sequenzen wurden für beide Stränge der cDNA erhalten. cDNA-Sequenzen wurden von Klonen, isoliert von dem Durchmustern der cDNA-Bibliothek, erhalten.
  • Die gesamte Sequenzanalyse und Identifikation von Strukturmotiven wurde mit dem PC/Gene Software Programm (Intelligenetics, Inc.) durchgeführt. Die am meisten aktualisierte GenBank und EMBL Nucleinsäure-Datenbanken und die Swiss-Prot-Protein-Datenbank wurden durch das Internet-Netzwerk durch Verwendung des FASIA-Programms von Pearson und Lippman durchsucht.
  • h) In vitro-Translation
  • RNA wurde in vitro unter Verwendung eines Kaninchenretikulocytenlysats (Promega) durch die Vorgehensweise, die von den Instruktionen des Herstellers empfohlen wurde, in Gegenwart von [35S]Methionin (Amersham) translatiert und die Produkte wurden mit 15% SDS-PAGE analysiert. Nach Elektrophorese wurde das Gel fixiert und einer Autoradiographie unterzogen.
  • i) Herstellung von Kaninchen-Anti-Maus-Antiserum und Western Blot-Analyse
  • Ein polyklonales Kaninchenantiserum, das GILR erkennt, wurde mit der „se" eines Fusionsproteins, enthaltend die voll GILR-Aminosäuresequenz, fusioniert an Glutathion S-Transferase (GST; Pharmacia), hergestellt. Das GST-Fusionsprotein wurde in Escherichia coli (E. coli) exprimiert, induziert mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und mit Glutathion(GSH)-Agarosekügelchen, wie zuvor beschrieben (Tan et al., 1994), gereinigt. Diese Präparation wurde verwendet, um New Zealand White-Kaninchen zu immunisieren (1 mg/Kaninchen).
  • Nach 4 Wochen wurde eine Booster-Injektion von 0,2 mg Protein intravenös gegeben und Blut wurde 1 Woche später zur Herstellung von Antiserum gesammelt. Das Antiserum wurde unter Verwendung eines Fusionsproteins, immobilisiert auf Nitrocellulosefilter gemäß dem Maniatis-Protokoll (Maniatis et al., 1989), gereinigt. Das Antiserum wurde zur Western Blot-Analyse von Proteinen, extrahiert aus Thymocyten, behandelt mit oder ohne DEX, wie früher beschrieben (Ayroldi et al., 1997), verwendet. Zum Western Blot wurden Maus-Thymocyten (5 × 106/Probe) durch 30-minütiges Inkubieren auf Eis in 300 μl Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, 0,15 NaCl, 5 mM EDTA, 100 mM PMSF, 2,5 mM Leupeptin, 2,5 mM Aprotinin) lysiert. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 15.000 UpM wurden die Pellets dreimal mit kaltem Lysepuffer gewaschen, 3 Minuten lang gekocht und dann durch Elektrophorese in 10% SDS-PAGE-Gelen, gefolgt von Transfer auf Nitrocellulose (Bioblot-NC, Costar), 5 Stunden lang bei 250 mA bei 4°C in 25 mM Tris/Glycin, pH 8,3, und 20% V/V Methanol analysiert. Nicht-spezifische Bin dungsstellen wurden durch Eintauchen der Membran in 5% Blockingmittel in Tris-gepufferter Salzlösung-Tween (TBS-T, „Tris-buffered saline Tween") 1 Stunde lang bei Raumtemperatur geblockt.
  • Die Membranen wurden mit polyklonalem GILR-Antiserum, 1:10000 verdünnt, 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen mit TBS-T-Puffer wurden die Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit HRP-markierten Schaf-Anti-Kaninchen-Antikörper, 1:5000 verdünnt, (Amersham) behandelt („probed"), dann mit ECL-Western Blotting-Reagenzien (Amersham) inkubiert und Hyperfilm-ECL (Amersham) 15 Sekunden lang ausgesetzt.
  • j) Transfektionen von kultivierten Zellen
  • Die GILR-cDNA-codierende Sequenz (874 bp – siehe 2) wurde in ein pcDNA3-Plasmid (Invitrogen) zur Expression in Säugerzellen kloniert. 3DO-Zellen wurden durch Elektroporation (300 mA, 960 μF) mit 15 μg linearisiertem pcDNA3-Vektor (Kontrollklone) oder 15 μg linearisiertem pcDNA3-Vektor, der die GILR-cDNA exprimiert, transfiziert. 36 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen in Medium kultiviert, das 0,8 mg/gr G418 aktive Form (GIBCO-BRL, Life Technologies, Paisley, Schottland) enthielt, kultiviert und 100 μl der Zellsuspension wurden in Platten mit 96 Kavitäten (4 für jede Transfektion) plattiert. Auf 15–20 Tage folgend wiesen nicht mehr als 15% der Kavitäten lebende wachsende Zellen auf. Diese überlebenden Zellen wurden als Klone erachtet und in einem RNAse-Protection-Assay auf die Expression von exogenem GILR hin analysiert (Vito et al., 1996).
  • k) RNAse-Protection-Analyse (RPA)
  • Die Sonde für RPA wurde durch PCR unter Verwendung des Forward-Primers C CATCTGGGTCCACTCCAGT (lokalisiert auf GILR, 763–782 bp – siehe 2 und SEQ ID NO: 3) und des Rückwärts-Primers AGGACAGTGGGAGTGGCACC (lokalisiert auf pcDNA3 – siehe 5C und SEQ ID NO: 4) konstruiert. Das PCR-Produkt (244 bp) wurde in einen pCRII-Vektor unter Verwendung des TA Cloning-Kit (Invitrogen) kloniert. Das Produkt dieser Klonierung wurde sequenziert, um jedewede Möglichkeit einer Punktmutation auszuschließen. Plasmid-DNA wurde mit Xba I (New England Biolabs) linearisiert und mit T7-RNA-Polymerase (GIBCO-BRL) in Gegenwart von 50 μM [α32P]UTP transkribiert. Auf Gelreinigung folgend wurde die Sonde (2 × 105 cpm) an Gesamt-RNA (20 μg) über Nacht bei 60°C hybridisiert. RNase-Verdau wurde bei 37°C 15 min lang unter Verwendung einer RNase A-(Boehringer Mannheim)(40 μg/ml) und RNase T1-(GIBCO-BRL)(1,5 U/μl)Lösung durchgeführt. Die unverdauten Produkte wurden mit Phenol-Chloroform behandelt, mit Ethanol gefällt und auf ein denaturierendes Polyacrylamid-Sequenziergel geladen. Autoradiographische Exposition wurde 2 Tage lang durchgeführt.
  • l) Antikörper-Quervernetzen und Zellbehandlung
  • Hamster-Anti-Maus-CD3ε (Klon 145-2C11; Pharmingen, San Diego, CA)-mAk bei 1 μg/Kavität (= 1 μg/ml Anti-CD3-Antikörper) wurde erlaubt, an hoch-bindenden Platten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden (Costar, Cambridge, MA) bei 4°C in 100 μl PBS anzuhaften. Nach 20 Stunden wurden Platten, beschichtet mit mAk, gewaschen und transfizierte Klone wurden bei 1 × 105 Zellen/Kavität plattiert und 20 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Ratten-Anti-Maus-IgG-2b-mAk mit passendem Isotyp (Klon R 35–38, Pharmingen) wurden als eine Kontrolle verwendet.
  • Um Fas-vermitteltes Töten zu evaluieren, wurden 3DO-Zellen (1 × 106) bei Raumtemperatur 30 Minuten lang mit 10 μg/ml des Antikörpers gegen Fas (Hamster-Anti-Maus, Klon Jo2; Pharmingen) inkubiert, dann gewaschen und auf Kavitäten plattiert, die beschichtet waren mit einem Antikörper gegen Hamster-Immunoglobulin G (5 μg/Kavität; Pharmingen).
  • In ausgewählten Experimenten wurde ein Anteil von T-Zellen mit Cyclosporin (Calbiochem, San Diego, CA) in Gegenwart oder Abwesenheit von quervernetzten monoklonalen Antikörpern behandelt.
  • m) UV-Bestrahlung, DEX-Behandlung und Hunger
  • In manchen Experimenten wurden Klone, transfiziert mit leerem pcDNA3 oder GILR-cDNA, unterschiedlichen Dosen von UV-Strahlen aus einem UV-Stratalinker (Modell 1800; Stratagene, La Jolla, CA) ausgesetzt.
  • Aliquots von 2 ml transfizierte Klone (1 × 106/ml) wurden mit DEX inkubiert oder Mangelbedingungen (1% FCS) unterworfen. Die Apoptose wurde nach 20 Stunden wie unten beschrieben ausgewertet.
  • n) Durchflusscytometrie-Analyse
  • Eine einzelne Suspension (1 × 106 Zellen/Probe) wurde 30 Minuten lang auf Eis in 50 μl Färbepuffer (PBS plus 5% FCS), enthaltend 10 μg/ml Hamster-Anti-Maus-Fas-mAk, direkt konjugiert an R-Phycoerythrin (PE) oder PE-Hamster-IgG (Isotypenkontrolle) inkubiert.
  • Beide mAk wurden von Pharmingen käuflich erworben. Zellen wurden auch mit polyklonalem Kaninchen-Antikörper, erzeugt gegen ein Peptid, das Aminosäuren 260–279 entspricht, die am Carboxyterminus von menschlichem Fas-L liegen („mapping at")(Santa Cruz, Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) oder mit Isotyp-passendem Antikörper („ab") und mit Anti-Kaninchen-IgG-FITC-Konjugat, F(ab')2-Fragment (Sigma), als einem Reagens der zweiten Stufe, gefärbt.
  • Alle Klone wurden mit Hamster-Anti-Maus-αCD3, direkt konjugiert mit Fluorescein (Pharmingen) gefärbt. Der Mittelwert oder Prozentsatz von Fas- und Fas-L-Histogrammen wurde unter Verwendung von „lysis II research software" (Becton-Dickinson, Moutain View, USA) berechnet.
  • o) Apoptose-Auswertung durch Propidiumiodidlösung
  • Apoptose wurde durch Durchflusscytometrie wie anderswo beschrieben (Nicoletti et al., 1991) gemessen. Nach Kultivieren wurden Zellen zentrifugiert und die Pellets sanft in 1,5 ml hypotoner Propidiumiodidlösung (PI, 50 μg/ml in 0,1% Natriumcitrat plus 0,1% Triton-X-100) resuspendiert. Die Röhrchen wurden über Nacht bei 4°C im Dunkeln gehalten. Die PI- Fluoreszenz einzelner Nuclei wurde durch Durchflusscytometrie unter Verwendung von Standard-FACScan-Ausrüstung (Becton Dickinson) gemessen. Die Nuclei durchwanderten einen 488 nm-Argon-Laser-Lichtstrahl. Ein dichroider 560 nm-Spiegel (DM 570) und ein 600 nm-„band pass filter" (Bandweite 35 nm) wurden verwendet, um die rote Fluoreszenz, bedingt durch PI-DNA-Färbung, zu sammeln. Die Daten wurden auf einer logarithmischen Skala auf einem Hewlett Packard (HP 9000, Modell 310; Palo Alto, CA)-Computer aufgezeichnet. Der Prozentsatz an apoptotischen Zellkernen (sub-diploide DNA-Peak in dem DNA-Fluoreszenz-Histrogramm) wurde mit spezifischer FACScan-Forschungssoftware (Lysis II) berechnet.
  • p) Interleukin-2 (IL-2)-Analyse
  • Überstande von unbehandelten Klonen oder 18 Stunden lang mit Anti-CD3-behandelten Klonen wurden auf ihre Konzentration von IL-2 mittels two site-ELISA unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers JES6-1A12 als Primärreagens und biotinyliertem monoklonalem Antikörper S4B6 als Sekundärreagens getestet. Beide Antikörper wurden von Pharmingen käuflich erworben. Der IL-2-Titer (Mittelwerte +/– Standardabweichung von replizierten Proben) wurde als Picogramm pro Milliliter ausgedrückt, berechnet mittels Referenz zu Standardkurven, konstruiert mit bekannten Mengen von IL-2. Das Sensitivitätslimit war ungefähr 20 pg/ml.
  • q) Kern- und cytoplasmatische Extrakte
  • Kernproteine wurden aus 1 × 107 Zellen extrahiert. Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und gepackte Zellen wurde in 1 ml hyptotonem Puffer (25 mM HEPES, 50 mM KCl, 0,5% NP-40, 0,1 mM Dithiothreitol, 10 μg/ml Leupeptin, 20 μg/ml Aprotinin und 1 mM PMSF-Lösung in Ethanol resuspendiert. Nach 10 Minuten Inkubation auf Eis wurden die Überstände, die cytoplasmatische Proteine enthielten, von den Kernpellets mittels Zentrifugation getrennt. Kempellets wurden dann mit isotonem („ipotonic") Puffer ohne NP-40 gewaschen und in 10 μl Lysepuffer (25 mM HEPES, 2 mM KCl, 0,1 mM Dithiothreitol, 10 μg/ml Leupeptin, 20 μg/ml Aprotinin und 1 mM PMSF) resuspendiert. Nach 15-minütiger Inkubation auf Eis wurden Lysate mit 10 Vol. Verdünnungspuffer (25 mM HEPES, 0,1 mM Dithiothreitol, 10 μg/ml Leupeptin, 20 μg/ml Aprotinin und 1 mM PMSF und 20% Glycerin) verdünnt und in einer vorgekühlten „Mikrofuge" 30 min lang bei 14.000 × g vor dem Laden klar gemacht („cleared").
  • r) Isolierung von humanem GILR
  • Das menschliche Homolog von Maus-GILR wurde aus einer λgt 11 menschlicher Lymphocyt-cDNA-Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA, USA) isoliert. Maus-GILR-cDNA, 32P-markiert, wurde als eine Sonde verwendet. Nitrocellulosefilter (Amersham), erhalten durch Blotten von Platten, enthaltend 5 × 104 Klone, wurden in 5 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung, 1% SDS, 100 μg/μl tRNA (SIGMA) und 20 mM Natriumpyrophosphat (pH 6,8) bei 42°C 12 Stunden lang hybridisiert und der endgültige Waschschritt war in 0,2 × SSC, 0,1 SDS bei 65°C für 30 Minuten. Fünfzig mögliche Kandidaten wurden von Replica-Filtern identifiziert und wie beschrieben weiter durchmustert (D'Adamio et al., 1997). Einige Klone, abgeleitet von dem dritten Screenen, wurden isoliert, mit EcoRI verdaut und die cDNA-Insertionen von etwa 2000 Basenpaaren wurden in pcDNA3 subkloniert. Nach Extraktion und Reinigung mit dem alkalischen Lyseverfahren (Maniatis et al., 1989) wurde Plasmid-DNA von mehreren Klonen unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase in Verbindung mit Sp6- und T7-Primern, komplementär zu den Plasmid-Klonierungsstelle-Sequenzen, und mit speziell synthetisierten Oligonucleotidprimern (20 und 23 Basen lang) sequenziert.
  • Überlappende Sequenzen wurden für beide Stränge der cDNA erhalten.
  • II. ERGEBNISSE
  • a) Isolierung der Maus-GILR-cDNA
  • Um die Rolle von Glucocorticoidhormonen bei der Regulierung von Lymphocyten-Apoptose zu untersuchen, wurde die Isolierung von mRNA, induziert durch 3-ständige Behandlung mit dem synthetischen Glucocorticoidhormon Dexamethason (DEX, 100 nM), in frisch isolierten Thymocyten durchgeführt. Durch Vergleichen der cDNAs von unbehandelten und DEX-behandelten Zellen durch die Subtraktionssondentechnik, wie oben beschrieben, wurden manche überexprimierten mRNAs in den behandelten Zellen identifiziert. Beim Sequenzieren der verschiedenen cDNAs wurde von einem von ihnen (bezeichnet als „GILR", für: Glucocorticoid-induzierte Leucin-Zipper-Familie verwandtes/zugehöriges Gen („Glucocorticoid Induced Leucin-zpper family Related gene")) gezeigt, dass es gewisse Homologie (40% Ähnlichkeit) mit der offenbar nicht in Beziehung stehenden Maus-TSC-22-Sequenz (Shibanuma et al., 1992) und hDIP (Vogel et al., 1996) aufwies, wobei diese Homologie nicht von grundlegender Signifikanz war, weil die GILR-Sequenz wichtigererweise keine Homologie mit anderen Sequenzen zeigte, die in EMBL- und Genbank-Datenbank vorhanden sind.
  • b) GILR-Expression in Geweben: Induktion in T-Lymphocyten
  • Experimente wurden durchgeführt, um GILR-Expression in verschiedenen Geweben zu untersuchen und zu definieren. Die Ergebnisse zeigten an, dass GILR-mRNA mittels Northern Blotting (8 Tage Exposition) in frisch isolierten Thymocyten, Milz(–) und Lymphknotenzellen klar detektierbar war, in Knochenmark, Niere und Lunge leicht detektierbar war und in Leber, Herz und Gehirn nicht detektierbar war, was nahe legt, dass das Gen hauptsächlich in lymphoiden Geweben exprimiert wird (1A).
  • Experimente wurden durchgeführt, um den möglichen Effekt von DEX-Behandlung in lymphoidem Gewebe zu testen. Die Ergebnisse zeigen an, dass GILR-Expression durch Behandlung mit DEX in frischen Thymocyten und Lymphocyten von peripheren Lymphoidgeweben einschließlich Milz und Lymphknoten klar erhöht war (1B). Diese Ergebnisse differenzieren GILR klar von den ähnlicheren Elementen der Leucin-Zipper-Familie hDIP (Vogel et al., 1996) und TSC-22 (Shibanuma et al., 1992), die beide ubiquitär exprimiert werden.
  • c) Das Protein, codiert von GILR, ist ein Protein, das zur Leucin-Zipper-Familie gehört
  • Um eine Volllangen-GILR-cDNA zu isolieren wurde eine Thymus-Lymphocyten-cDNA-Bibliothek unter Verwendung einer isolierten Sonde (1100 bp), erhalten durch die Subtraktionssonden-Prozedur (siehe oben) durchmustert. Mehrere Klone wurden isoliert und 3 von ihnen waren 1972 bp lang und zeigten die gleiche Sequenz. Da Northern Blotting-Analyse (1A) anzeigte, dass GILR-mRNA etwa 1,9 kB lang war, wurde angenommen, dass diese Klone Volllänge-cDNAs darstellen. Dies wurde durch Experimente unter Verwendung der Primer-Extension-Technik (Ergebnisse nicht gezeigt) bestätigt.
  • Nucleotidsequenzieren der oben angegebenen 3 cDNA-Klone, codierend für GILR, zeigten die Anwesenheit eines einzelnen offenen Leserahmens (ORF), der an Nucleotidposition 206 beginnt und sich bis zu einem TAA-Stoppcodon bei Position 617 erstreckt (2).
  • Das mutmaßliche ATG-Startcodon bei Position 206 wird umgeben von einer Sequenz (GAACCATGA) in guter Übereinstimmung mit der Konsensussequenz zur Initiation der Translation in Eukaryoten (Kozak, 1989). Das Stoppcodon ist gefolgt von einer 3'-nichttranslatierten Region von 1355 bp. Ein Polyadenylierungssignal ist 45 bp 5' von dem Poly-A-Schwanz vorhanden.
  • Die GILR-Aminosäure-(„amino acidic")-Sequenz zeigt significante Homologien mit Molekülen, welche zu der Leucin-Zipper-Familie gehören (4 und 15; Shibanuma et al., 1992; Yamamoto et al., 1988; Nicholas et al., 1991; Hope und Struhl, 1987; Lamph et al., 1988). Das Protein, das mutmaßlich von der GILR-mRNA codiert wird, ist ein Leucin-Zipper-Protein von 138 Aminosäureresten (2). Vier Leucinreste sind bei Triplett-Positionen 431–433, 452–454, 473–475 und 494–496 vorhanden, ein Asparagin ist bei Position 464–466 vorhanden, wobei dieses mit einer Leucin-Zipper-Struktur kompatibel ist (unterstrichen in 2) und vermutlich in der Lage ist, Dimere zu bilden.
  • Weiterhin ist eine Region (basische Aminosäuren sind in 2 unterstrichen), die möglicherweise eine DNA-Bindungsdomäne darstellt, am N-terminalen Ende vorhanden, während eine PAR-Region, reich an Prolinresten und sauren Resten, an der C-terminalen Endregion vorhanden ist.
  • Basierend auf diesen Eigenschaften kann GILR als ein Leucin-Zipper-Protein klassifiziert werden. Das vorhersagte Molekulargewicht des mutmaßlichen reifen Proteins, vor weiteren posttranslationalen Modifikationen ist etwa 17.000 Da. Das Molekulargewicht des nativen Proteins ist etwa 17.000 Da (17 kDa), wie durch in vitro-Translationsexperimente der klonierten cDNA (3A) und durch Western-Blot-Analyse-Experimente unter Verwendung eines Kaninchen-Antiserums, hergestellt gegen in vitro-translatiertes GILR-Protein (3C), angezeigt. Das Antiserum wurde verwendet, um ein zelluläres Produkt des GILR in normalen unbehandelten oder DEX-behandelten (6 Stunden Behandlung) Thymocyten zu detektieren. Insbesondere wurde eine Bande von molekularer Masse von ungefähr 17 kDa durch dieses Antiserum in dem Proteinextrakt von DEX-behandelten, jedoch nicht von unbehandelten Thymocyten in einer Western Blot-Analyse (3C) detektiert. 3B zeigt, dass dieses Antiserum das in vitro translatierte Fusionsprotein erkennt. Insbesondere deckt das Antiserum entweder das GST-Fusionsprotein oder das intakte GILR-Protein, erhalten durch Thrombinabbau gemäß dem Pharmacia-Protokoll, auf.
  • Andere Experimente wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob GILR-Protein und mRNA durch Behandlung mit DEX induziert werden könnten und ob dieser Effekt durch Co-Stimulation mit Anti-CD3-mAk moduliert werden könnte (11). Ergebnisse eines repräsentativen Western-Blot-Experiments zeigen, dass GILR-Protein in Thymocyten durch Behandlung mit DEX (Spur 3) oder Anti-CD3 plus DEX (Spur 4) induziert wird, wohingegen GILR-Protein durch Behandlung mit Anti-CD3-mAk alleine (Spur 2) herabmoduliert wird (11A). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn GILR-mRNA-Expression evaluiert wurde. Ein Northern Blot-Experiment zeigte tatsächlich, dass GILR-mRNA durch Behandlung mit Anti-CD3-mAk herabreguliert wird (11B)(Spur 2), sie wird induziert durch Behandlung mit DEX (Spur 3) oder Anti-CD3 plus DEX (Spur 4). Ähnliche Ergebnisse wurden mit Milz- und Lymphknotenzellen erhalten (nicht gezeigt).
  • Um die subzelluläre Lokalisierung von GILR zu definieren, wurden die Level von GILR im Nucleus und im Cytoplasma von Klonen, transfiziert mit dem leeren Vektor oder mit der GILR-cDNA, ausgewertet. 12A zeigt, dass GILR in den Kernproteinen, extrahiert aus einem Klon, transfiziert mit GILR-cDNA, nicht aber in dem Cytoplasma oder in dem Nucleus und Cytoplasma eines Kontrollklons detektierbar ist. Anti-β-Tubulin-Antikörper wurde verwendet, um die mögliche Kernkontamination mit Cytoplasmamaterial zu kontrollieren. Ergebnisse in 12B zeigen an, dass β-Tubulin in dem Cytoplasmaproteinextrakt von der Kontrolle (Spur 3) und von GILR-transfizierten Klonen (Spur 4), nicht jedoch in den Kernextrakten (Spuren 1 und 2) vorhanden ist.
  • d) GILR-Expression in transfizierten T-Zellen verleiht Resistenz gegenüber TCR/CD3-induzierter Apoptose, jedoch nicht gegenüber durch andere Stimuli induziertem Zelltod
  • Mitglieder der Leucin-Zipper-Familie sind bei der Lymphocytenaktivierung beteiligt und sind in der Lage, Apoptose zu induzieren oder zu inhibieren (Smeyne et al., 1993; Goldstone und Lavin, 1994). Um die möglichen Effekte von GILR-Expression auf Apoptose zu testen, wurde eine Hybridom-T-Zell-Linie, 3DO, transfiziert, diese 3DO-Zell-Linie ist, wie andere T-Zellhybridome, bei der Untersuchung von Apoptose, induziert durch Anti-CD3-Antikörper, weit verwendet worden (Ayroldi et al., 1995; Vito et al., 1996). Diese Transfektion wurde mit einem Expressionsvektor durchgeführt, in welchem die GILR-cDNA unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert wird. Es ist zuvor gezeigt worden, dass die Apoptose, induziert durch Anti-CD3-Antikörper in 3DO-Zellen von dem Fas/Fas-L-System abhängig ist (Yang et al., 1995). Als Kontrollen wurde auch der leere Vektor (pcDNA3-Kontrolle) in solchen Transfektionen verwendet. Nach Selektion mit G418 Antibiotikum wurden Zellklone durch RNase-Protection-Analyse auf die GILR-Expression hin durchmustert (5). Für jede Transfektion wurden 9 Klone getestet und für funktionale Charakterisierung verwendet. Zusätzlich dazu wurden 6 normale untransfizierte Klone (nuc/1–6) als weitere Kontrollen getestet.
  • Die Ergebnisse zeigten, dass Zellklone, die GILR überexprimieren (Klone GILR/1–9), alle variabel resistent waren gegenüber Anti-CD3-mλk-induzierter Apoptose (Apoptose zwischen 5% und 10%), mit P < 0,0001, wenn verglichen mit pcDNA3-Kontrollklonen (Klone pcDNA3/1–9, Apoptose zwischen 45% und 60%). Es waren keine signifikanten Unterschiede zwischen pcDNA3-Klonen und normalen untransfizierten Klonen (Klone nuc/1–6, Apoptose zwischen 45 und 60%) detektierbar (6). Um einen möglichen Effekt von GILR-Gen auf TCR/CD3-Membranexpression auszuschließen, welcher selbst für verringerte Sensitivität gegenüber Anti-CD3-induzierter Apoptose sorgen könnte, wurden alle Klone mit Anti-CD3-AntimAk gefärbt und mittels Durchflusscytometrie analysiert.
  • Zwischen transfizierten und nicht-transfizierten Klonen wurden keine Unterschiede der CD3-Expression detektiert (Ergebnisse nicht gezeigt).
  • Es ist gezeigt worden, dass T-Zell-Apoptose durch verschiedene andere Stimuli als das Triggern des PCR-CD3-Komplexes induziert werden können, einschließlich Corticosteroiden, UV-Bestrahlung und Hunger (Zacharchuk et al., 1990; Bansal et al., 1991; Lowe et al., 1993).
  • Experimente wurden durchgeführt, um zu testen, ob GILR-Expression T-Zell-Apoptose, induziert durch andere Stimuli, inhibieren könnte. Ergebnisse, erhalten mit den gleichen Klonen (Ergebnisse mit GILR/1,5,7 und pcDNA3/4,7,8 sind in 7 gezeigt) zeigen an, dass GILR-Überexpression Apoptose, inhibiert durch DEX, verschiedene Dosen von UV-Strahlung, Hungern oder Triggern durch quervernetzten monoklonalen Anti-Fas-Antikörper, nicht entgegenwirkt.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass GILR T-Zell-Apoptose, ausgelöst durch den TCR/CD3-Komplex, jedoch nicht durch andere Stimuli, modulieren kann.
  • Interessanterweise ist der spezifische inhibitorische Effekt von GILR auf den CD3/TCR-abhängigen Apoptose-Signalgebungspfad in besonderer Weise unterschiedlich von dem Effekt, der von TSC-22, dem homologeren Leucin-Zipper-Protein, ausgeübt wird. Wissenschaftliche Literatur zeigt, dass TSC-22 Apoptose in einer humanen Karzinom-Zelllinie induzieren kann (Ohta et al., 1997), sie in einer humanen Speicheldrüsen-Krebszelllinie durch ein Antikrebs-Arzneimittel, Vesarinon, (Kawamata et al., 1998) induziert wird und ihre Herabregulation das Wachstum der Zelllinie deutlich verstärkt (Nakashiro et al., 1998).
  • e) Expression von Fas und Fas-L in GILR-transfizierten T-Zellen
  • Es ist vorgeschlagen worden, dass T-Zell-AICD auch von Fas/Fas-L-Wechselwirkung abhängig ist (Alderson et al., 1995; Dhein et al., 1995; Ju et al., 1995). Insbesondere haben die genannten Erfinder früher gezeigt, dass Anti-CD3-induzierte Apoptose in 3DO-Zellen durch löslichen Anti-Fas-mAk blockiert wird, während ein quervernetzter Anti-Fas-mAk Zelltod direkt induziert (Ayroldi et al., 1997). Experimente wurden durchgeführt, um zu testen, ob Blockieren von Fas (unter Verwendung von löslichem Anti-Fas-mAk, 1 μg/ml) die Anti-CD3- induzierte Apoptose in diesem experimentellen System inhibieren könnte, in dem Klone von 3DO getestet wurden. Die Ergebnisse zeigen an, dass Blockieren von Fas den CD3-induzierten Zelltod signifikant inhibiert (Apoptose, Mittelwert von Ergebnissen, erhalten mit 3 normalen Klonen in einem 20 Stunden-Assay, war: 4 ± 1 in unbehandelten Kontrollen, 63 ± 5 in Anti-CD3-behandelten, 29 ± 6 in mit Anti-CD3 plus löslichen Anti-Fas behandelten Klonen; P < 0,01 beim Vergleich von mit Anti-CD3 behandelten mit mit Anti-CD-plus-Anti-Fa-behandelten).
  • Experimente wurden auch durchgeführt, um zu bewerten, ob die Inhibition von Apoptose in GILR-transfizierten Zellen durch einen Effekt auf Fas/Fas-L-System-Expression vermittelt werden könnte.
  • Ergebnisse zeigen, dass 20 Stunden von Anti-CD3-mAk-Behandlung Fas- und Fas-L-Expression in der 3DO-Zelllinie und in Klonen, transfiziert (mit) der leerer Vektor-Kontrolle (pcDNA3/4,7) induzierte, jedoch Fas- und Fas-L-Expression in Klonen, die GILR überexprimierten (Klone GILR/1,2,3,5,7) nicht vergrößerte (8).
  • Kinetische Experimente zeigen auch an, dass während Fas-L-Expression 3 Stunden nach Anti-CD3-Behandlung nicht ersichtlich ist, wenn es keine detektierbare Apoptose gibt, Induktion von Fas-L-Expression bei 10 Stunden detektiert wird, wenn Apoptose messbar ist. Ergebnisse eines repräsentativen Experiments mit einem leeren Vektor und einem GILR-transfizierten Klon sind in Tabelle I gezeigt. Ähnliche Ergebnisse wurden auch erhalten, wenn Fas-mRNA-Expression durch Northern-Blot und RNase-Protection-Assays bewertet wurden (9).
  • Diese Ergebnisse zeigen an, dass GILR-Expression TCR/CD3-aktivierte Apoptose und Fas/Fas-L-Expression inhibiert.
  • f) GILR in T-Zell-Aktivierung
  • Nachdem gezeigt wurde, dass GILR-Überexpression vor Anti-CD3-induzierter Apoptose durch Verringern von Fas/Fas-L-Expression rettete, wurde die Rolle von GILR dann bei der T-Zell-Aktivierung bewertet. Zu diesem Zweck wurden GILR-transfizierte Klone aktiviert und auf Apoptose und Expression von Aktivierungsmarkern, wie z. B. Interleukin-2-Rezeptor (IL-2R), analysiert. Insbesondere wurden nach Stimulation mit quervernetzten monoklonalen Anti-CD3-Antikörpern (1 μg/ml) GILR-transfizierte und leerer Vektor-Klone (verwendet als Kontrolle) mit monoklonalem Anti-IL-2R-Antikörper (CD25) gefärbt oder zur Propidiumiodidmarkierung zur Apoptoseauswertung behandelt. Die Überstände von Kontrollklonen und Anti-CD3-behandelten Klonen wurden zur IL-2-Detektion in einem ELISA-Assay verwendet.
  • Ergebnisse zeigten, dass mit leerem Vektor transfizierte Klone bei Anti-CD3-Stimulation hohe Level an IL-2R exprimieren und IL-2 produzieren, wie mittels Durchflusscytometrie-Analyse bzw. ELISA-Assay ausgewertet. Im Gegensatz dazu exprimieren GILR-transfizierte Klone niedrige oder nicht detektierbare Level von IL-2 (Tabelle II). Diese Daten zeigen an, dass („tha") Überexpression von GILR Anti-CD3-induzierte Aktivierung inhibiert und legt nahe, dass GILR eine Rolle beim Kontrollieren von T-Zell-Aktivierung spielen kann.
  • Um die Rolle von GILR bei T-Zell-Aktivierung weiter zu untersuchen, untersuchen wir als Nächstes seine Expression bei Anti-CD3- und/oder Anti-CD2-Stimulation und die Effekte von Cyclosporin A.
  • Es ist gezeigt worden, dass CD2-Triggern T-Zellen vor Anti-CD3-induzierter Apoptose durch Herabregulieren des Fas/Fas-L-Systems rettet (Ayroldi et al., 1997).
  • Dieser Effekt wird vermittelt durch die Abnahme von endogener IL-2-Produktion und deshalb von T-Zell-Aktivierung. Die Expression von GILR wurde dann unter Verwendung von Northern Blot in 3DO-Zellen, behandelt mit monoklonalen Anti-CD3- und/oder Anti-CD2-Antikörpern, studiert. 10A zeigt, dass GILR-mRNA durch Anti-CD3-Aktivierung herabreguliert wird, wohingegen es heraufmoduliert wird durch Anti-CD2-Behandlung. Co-Stimulation mit sowohl Anti-CD2- als auch Anti-CD3-Behandlung setzt GILR-mRNA wieder auf den Kontrolllevel zurück.
  • Es wurde zuvor berichtet, dass Cyclosporin die TCR-vermittelte Transkription des IL-2-Gens durch das Blockieren des Calcium-abhängigen Signaltransduktionswegs spezifisch inhibiert (Liu et al., 1993). Wie 10B zeigt, kehrt Cyclosporin A Anti-CD3-induzierte GILR-Herabregulierung um.
  • Diese Ergebnisse legen ferner die Beteiligung von GILR bei der Kontrolle von T-Zell-Aktivierung nahe.
  • g) Isolierung der Mensch-GILR-cDNA
  • Das menschliche Homolog von Maus-GILR wurde bei einem Screenen einer Agt11-Mensch-cDNA-Bibliothek, erzeugt von T-Lymphocyt, PHA-stimuliert, unter Verwendung der zuvor isolierten Maus-GILR-cDNA als eine Sonde, isoliert. Unter den positiven Klonen zeigten vier die gleiche Sequenz, hoch homolog zur Maus-GILR-cDNA-Sequenz, und die gleiche Länge (1946 Basenpaare, 2).
  • Die cDNA-Sequenz des Mensch-GILR (h-GILR) ist in 13 gezeigt. Die cDNA enthält einen einzelnen offenen Basenpaar-Rahmen („single base pair open frame"), der bei der Nucleotidposition 241 beginnt und sich bis zu einem Stoppcodon bei Position 643 erstreckt. Mensch-GILR weist 86% Identität auf DNA-Level (14) und 94% Identität und 97% Ähnlichkeit mit Maus-GILR (15) auf Proteinlevel auf. Mensch-GILR ist ein Leucin-Zipper-Protein, welches hoch homolog ist zu Maus-GILR und Ähnlichkeit zu den zuvor beschriebenen TSC-22- und hDIP-Proteinen, insbesonder am C-Terminus, an dem das Leucin-Zipper-Motiv lokalisiert ist, zeigt. TABELLE I
    Zeitverlauf von Fas/L-Expression, die in Beziehung steht zu Anti-CD3-induzierter Apoptose, bei einem mit leerem Vektor oder GILR transfizierten Klon
    3 Stunden 6 Stunden 10 Stunden
    Fas/L Apoptose Fas/L Apoptose Fas/L Apoptose
    pcDNA3(4) 0,7* 1,3 1,0 2,5 5,7 2,9
    pcDNA4(4) + anti-CD3 1,2 1,7 1,1 3,7 81,1 72,0
    GILR(7) 1,0 0,3 1,7 1,8 0,1 2,8
    GILR(7) + anti-CD3 0,6 0,9 1,2 1,4 1,4 2,7
    = Zahlen stellen den Prozentsatz an Zellen, positiv für Fas/L bei Durchflusscytometrieanalyse, und von Zellen, die gegenüber Propidiumiodid-Analyse apoptotisch waren, dar.
    TABELLE II
    Aktivierungs-Marker in GILR-transfizierten Klonen
    KLONE APOPTOSE (%) IL-2R (%) Il-2 (pg/ml)
    leerer Vektor Kontrolle anti-CD3 Kontrolle anti-CD3 Kontrolle anti-CD3
    PV5 1,7 55,7 3,3 85,2 neg,
    PV6 5,8 62,8 5,8 62,8 1200
    PVT1 5,5 59,3 1,3 87,7 neg.
    601
    neg.
    555
    GILR-Vektor Kontrolle anti-CD3 Kontrolle anti-CD3 Kontrolle anti-CD3
    ST7 6,4 39,3 6,9 32 neg. 448
    SG11 2,4 6,5 13 neg.
    SG5 4,6 7,1 33,6 neg.
    ST5 6,5 41,6 4,4 28,1 neg. 339
    GILR19 2,4 32,8 2,6 neg. 25
    2,6 6,4 neg. 6
    6,4
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  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
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  • Figure 00660001
  • Figure 00670001

Claims (26)

  1. Isolierte DNA-Sequenz, codierend ein Glucocorticoidinduziertes Leucin-Zipper-Familie-verwandtes Protein (GILR), Isoformen, Fragmente oder Analoga davon, wobei das GILR, die Isoformen, Fragmente oder Analoga davon fähig sind, TCR/CD3-und/oder Fas/FasL-induzierte Apoptose zu inhibieren und Lymphozytenaktivität zu stimulieren, und, wenn verglichen mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6, nicht mehr als zehn Aminosäure-Änderungen beinhalten.
  2. Isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer cDNA-Sequenz, abgeleitet von der codierenden Region eines nativen GILR-Proteins; (b) DNA-Sequenzen, fähig zur Hybridisierung an eine Sequenz von (a) unter moderat stringenten Bedingungen; und (c) DNA-Sequenzen, welche als ein Ergebnis des genetischen Codes gegenüber den in (a) und (b) definierten DNA-Sequenzen degeneriert sind.
  3. Isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, umfassend wenigstens einen Teil der DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1.
  4. Isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 3, codierend ein/eine GILR-Protein, -Isoform, -Analogon oder -Fragment, das/die wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 aufweist.
  5. Isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, umfassend wenigstens einen Teil der DNA-Sequenz SEQ ID NO: 5.
  6. Isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 5, codierend ein/eine humane(s) GILR-Protein, -Isoform, -Analogon oder -Fragment, das/die wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 aufweist.
  7. Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1–6.
  8. Vektor nach Anspruch 7, der fähig ist, in einer eukaryotischen Wirtszelle exprimiert zu werden.
  9. Vektor nach Anspruch 7, der fähig ist, in einer prokaryotischen Wirtszelle exprimiert zu werden.
  10. Isolierte transformierte eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 7–9.
  11. Isoliertes GILR-Protein, Isoform, Fragment, Analoga oder Derivate davon, wobei das Protein, die Isoform, das Fragment, die Analoga und die Derivate davon fähig sind, TCR/CD3-und/oder Fas/FasL-induzierte Apoptose zu inhibieren und Lymphozytenaktivität zu stimulieren, und, wenn verglichen mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6, nicht mehr als zehn Aminosäure-Änderungen aufweisen.
  12. Isoliertes GILR-Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6 aufweist.
  13. Verfahren zur Herstellung des GILR-Proteins, der Isoform, des Fragments, der Analoga oder der Derivate davon nach Anspruch 11 oder 12, umfassend Kultivieren der transformierten Wirtszellen nach Anspruch 10 unter Bedingungen, geeignet für die Expression der Proteine, Analoga oder Derivate, Bewirken posttranslationaler Modifikationen, wie sie notwendig sind, um das Protein, die Fragmente, Analoga oder Derivate zu erhalten, und Isolieren des/der exprimierten Proteins, Fragmente, Analoga oder Derivate.
  14. Antikörper oder aktive Fragmente oder Derivate davon, spezifisch für das GILR-Protein, die Isoform, das Fragment, die Analoga oder Derivate nach Anspruch 11 oder 12.
  15. Verfahren für das Verleihen von Resistenz gegenüber TCR/CD3- und/oder Fas/FasL-induzierter Apoptose für T-Zellen in Zellkultur unter Verwendung einer oder mehrerer GILR-Proteine, Isoformen, Fragmente, Analoga oder Derivate nach Anspruch 11 oder 12, umfassend das Einführen der ein oder mehreren Proteine, Isoformen, Analoga, Fragmente oder Derivate in einer für deren intrazelluläre Einführung geeigneten Form in die Zellen, oder Einführen einer DNA-Sequenz, codierend die ein oder mehreren Proteine, Isoformen, Analoga, Fragmente oder Derivate in der Form eines geeigneten Vektors, der die Sequenz trägt, in die Zellen, wobei der Vektor fähig ist, die Insertion der Sequenz in die Zellen in einer Weise zu bewirken, dass die Sequenz in den Zellen exprimiert wird.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Zellen mit einem rekombinanten Tier-Virus-Vektor transfiziert werden, umfassend die Schritte: (a) Konstruieren eines rekombinanten Tier-Virus-Vektors, der eine Sequenz trägt, die ein virales Oberflächenprotein (Ligand) codiert, das fähig ist, an einen spezifischen Zelloberflächenrezeptor auf der Oberfläche der Zellen zu binden, und eine zweite Sequenz trägt, die ein Protein, ausgewählt aus dem/den GILR-Protein, Isoformen, Analoga, Fragmenten und Derivaten nach Anspruch 11 oder 12, codiert, das, wenn in den Zellen exprimiert, fähig ist, CR/CD3- und/oder Fas/FasL-induzierte Apoptose zu inhibieren; und (b) Infizieren der Zellen mit dem Vektor von (a).
  17. Verfahren für das Verstärken von TCR/CD3- und/oder Fas/FasL-induzierter Apoptose in T-Zellen in Zellkultur unter Verwendung der Antikörper oder aktiven Fragmente oder Derivate nach Anspruch 14, umfassend Einführen der Antikörper, aktiven Fragmente oder Derivate in die Zellen in einer für intrazelluläres Einführen geeigneten Form.
  18. Verfahren für das Verstärken von TCR/CD3-induzierter und/oder Fas/FasL-induzierter Apoptose in T-Zellen in Zellkultur unter Verwendung einer Oligonucleotidsequenz, die antisense für wenigstens einen Teil der DNA-Sequenz, codierend ein GILR-Protein, nach einem der Ansprüche 1–6 ist, wobei die Oligonucleotidsequenz fähig ist, die Expression des GILR-Proteins zu blockieren, umfassend Einführen des Oligonucleotids in die Zellen in einer für intrazelluläres Einführen geeigneten Form.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Oligonucleotidsequenz in die Zellen über ein Virus nach Anspruch 16 eingeführt wird, wobei die zweite Sequenz des Virus die Oligonucleotidsequenz codiert.
  20. Verfahren nach Ansprüchen 17–19, wobei die T-Zellen Tumor- oder HIV-infizierte T-Zellen sind.
  21. Verfahren für das Isolieren und Identifizieren von Proteinen nach Anspruch 11 oder 12, welche GILR-ähnliche Proteine sind, die zur Leucin-Zipper-Familie gehören, oder Proteine sind, die fähig sind, direkt an GILR zu binden, umfassend Anwenden der Hefe-Two-Hybrid-Vorgehensweise, bei welcher eine Sequenz, die das GILR codiert, von einem Hybridvektor getra gen wird, und eine Sequenz aus einer cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek von dem zweiten Hybridvektor getragen wird, die Vektoren dann verwendet werden, um Hefe-Wirtszellen zu transformieren, und die positiven transformierten Zellen isoliert werden, gefolgt von Extraktion des zweiten Hybridvektors, um eine Sequenz zu erhalten, die ein Protein codiert, welches an das GILR bindet.
  22. Pharmazeutische Zusammensetzung für die Inhibition von TCR/CD3-induzierter und/oder Fas/FasL-induzierter Apoptose in Zellen oder für das Stimulieren von Lymphozytenaktivierung, umfassend als aktiven Bestandteil wenigstens ein GILR-Protein, eine Isoform, Fragmente, Analoga, Derivate nach Anspruch 11 oder 12 oder Gemische davon.
  23. Pharmazeutische Zusammensetzung für das Inhibieren von TCR/CD3-induzierter und/oder Fas/FasL-induzierter Apoptose in Zellen oder für das Stimulieren von Lymphozytenaktivierung, umfassend als aktiven Bestandteil einen rekombinanten Tier-Virus-Vektor, codierend ein Protein, das fähig ist, einen Zelloberflächenrezeptor zu binden, und codierend wenigstens ein GILR-Protein, eine Isoform, aktive Fragmente oder Analoga nach Anspruch 11 oder 12.
  24. Pharmazeutische Zusammensetzung für das Verstärken von TCR/CD3-induzierter und/oder Fas/FasL-induzierter Apoptose in T-Zellen, umfassend als aktiven Bestandteil einen Antikörper, ein aktives Fragment oder Derivat nach Anspruch 14.
  25. Pharmazeutische Zusammensetzung für das Verstärken von TCR/CD3-induzierter und/oder Fas/FasL-induzierter Apoptose in T-Zellen, umfassend als aktiven Bestandteil eine Oligonucleotidsequenz, die antisense für wenigstens einen Teil der DNA-Sequenz, codierend ein GILR-Protein, nach einem der Ansprüche 1–6 ist.
  26. GILR-Protein nach einem der Ansprüche 11 oder 12 zur Verwendung als Medikament.
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