DE69434738T2

DE69434738T2 - Ein FAS Ligand, ein Fragment davon und kodierende DNA dafür

Info

Publication number: DE69434738T2
Application number: DE69434738T
Authority: DE
Inventors: Shigekazu Suita-shi NAGATA; Takashi Minou-shi Suda; c/o MOCHIDA PHARMACEUTICAL Tomohiro Shinjuku-ku Takahashi; c/o MOCHIDA PHARMACEUTICAL Norio Shinjuku-ku Nakamura
Original assignee: Osaka Bioscience Institute; Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Osaka Bioscience Institute; Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-11-10
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2014-11-11
Also published as: AU8115894A; CA2153507C; US6348334B1; ATE326535T1; WO1995013293A1; EP0675200B1; AU689157B2; EP0675200A1; JPH08127594A; CA2153507A1; KR100384821B1; DE69434738D1; JP3716936B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf einen Fas-Liganden, einen Teil des Fas-Liganden und ein neues DNA-Fragment, das den Fas-Liganden kodiert, welche auf dem Gebiet der Medizin verwendet werden können. Diese Erfindung bezieht sich außerdem auf einen Antikörper, der zur Detektion des Fas-Liganden verwendet werden kann, welcher auf dem Gebiet der diagnostischen Reagenzien verwendet werden kann. Diese Erfindung bezieht sich außerdem auf ein rekombinantes DNA-Molekül, welches das neue DNA-Fragment enthält, einen Transformanten, ein Verfahren zur Reinigung des neuen Proteins und ein Verfahren zur Herstellung des neuen Proteins. Diese Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Antisense-Oligonukleotid und auf ein Verfahren zum Screenen einer Substanz, die mit einem Fas-Liganden oder einem Fas-Antigen in Beziehung steht.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Auf der Grundlage der Morphologie sterbender Zellen wird der Zelltod im Allgemeinen in zwei Kategorien eingeteilt, der Nekrose und der Apoptose. Bei dem nekrotischen Zelltod werden eine Degradation der Zellmembran und die Freisetzung zellulärer Inhalte in die extrazelluläre Matrix beobachtet. Andererseits werden bei dem apoptotischen Zelltod die Fragmentierung chromosomaler DNA und die Konzentration von Nuklei beobachtet, während die Degradation der Zellmembran und die Freisetzung der zellulären Inhalte, wie bei der Nekrose beobachtet, nicht beobachtet werden. Die Apoptose wird als eine Form des programmierten Zelltodes verstanden. Zum Beispiel wird angenommen, dass die Phänomene der Zerstörung unnötiger Zellen und Organe im Lauf der Ontogenese durch die Apoptose von Zellen verursacht wird. Ein weiteres Phänomen, von dem angenommen wird, dass es sich um Apoptose handelt, ist der Zelltod, der auftritt, wenn virusinfizierte Zellen und Tumorzellen von cytotoxischen T-Zellen (CTL), natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), TNF-α, TNF-β und dergleichen attackiert und entfernt werden. Wie oben beschrieben, ist die Apoptose eines der physiologischen Phänomene, die kürzlich besondere Aufmerksamkeit auf sich gezogen haben, und Studien werden von vielen Forschern mit dem Ziel durchgeführt, die Funktion der Apoptose ebenso wie deren physiologische Bedeutung und Beziehung zu Krankheiten aufzuklären.
Der Fas-Antikörper war als Substanz bekannt, die die Apoptose von Zellen induzieren kann. Der Fas-Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper, der durch Immunisieren einer Maus mit humanen Fibroblasten erhalten wird (Yonehara S. et al., J. Exp. Med., Band 169, Seiten 1747–1756, 1989). Da der Fas-Antikörper durch die Immunisierung einer Maus mit Zellen erhalten wurde, wurde die Art der Moleküle, die von dem Fas-Antikörper erkannt werden und der Übertragungsmechanismus des Apoptosesignals auf die Zellen lange Zeit nicht aufgedeckt. Kürzlich jedoch ist es Itoh N. et al. gelungen, das Gen des Moleküls (Fas-Antigen), das spezifisch von dem Fas-Antikörper erkannt wird, zu klonieren (Cell, Band 66, Seiten 233–243, 1991). Es wurde anschließend festgestellt, dass das Fas-Antigen ein Zellmembranprotein ist, das eine Größe von etwa 45 kD aufweist, und die Analyse seiner Aminosäuresequenz hat gezeigt, dass das Fas-Antigen zu der Familie der TNF-Rezeptoren gehört. Zusätzlich wurde ein Maus-Fas-Antigen-Gen kloniert (Watanabe-Fukunaga R. et al., J. Immunol., Band 148, Seiten 1274–1279, 1992), und von der mRNA für das Fas-Antigen wurde bestätigt, dass sie in Thymus, Leber, Lunge, Herz und Ovarien der Maus exprimiert wird.
Nach der Klonierung des Fas-Antigen-Gens wurde eine Reihe von Studien durchgeführt, und es wurde über den Zusammenhang zwischen der durch das Fas-Antigen vermittelten Apoptose und verschiedenen Krankheiten berichtet.
Kobayashi N. et al. haben berichtet, dass die Expression des Fas-Antigens auf der T-Zellmembran bei Infektion mit dem AIDS-Virus induziert wird, was die Möglichkeit nahelegt, dass die Apoptose von T-Zellen, wie sie bei AIDS festgestellt wird, ein Fas-Antigen-vermitteltes Phänomen ist (Nikkei Science, Band 6, Seiten 34–41, 1993).
Ogasawara J. et al. haben beobachtet, dass bei Verabreichung des Fas-Antikörpers an eine Maus ein Phänomen ähnlich der fulminanten Hepatitis auftritt, und sie haben die Möglichkeit des Auftretens einer Fas-Antigen-vermittelten Apoptose in den entzündlichen Läsionen der fulminanten Hepatitis oder dergleichen vorgeschlagen (Nature, Band 364, Seiten 806–809, 1993). Hiramatsu Y. et al. haben berichtet, dass in einem Patien ten, der an chronischer Hepatitis C leidet, Fas-Antigen häufig in den entzündlichen Läsionen der Leber exprimiert wird, wo eine Leukozyteninfiltration beobachtet wird (Hepatology, Band 19, Seiten 1354–1359, 1994).
Darüber hinaus haben Watanabe-Fukunaga R. et al. bestätigt, dass in dem Fas-Antigen-Gen in der Ipr-Maus, die eines der Modelltiere für Autoimmunkrankheiten ist, eine Mutation vorhanden ist und dass die Zellen, die eine solche Mutation in dem Fas-Antigen-Gen exprimieren, keine Apoptose eingehen (Nature, Band 356, Seiten 314–317, 1993). Watanabe-Fukunaga R. et al. haben angenommen, dass die Autoimmunkrankheits-ähnlichen Symptome durch die in dem Körper zurückbleibenden autoreaktiven T-Zellen erzeugt werden, die von dem Körper durch die Apoptose hätten entfernt werden sollen.
Wie oben beschrieben, haben eine Reihe von Studien über den Zusammenhang zwischen dem Fas-Antigen und Krankheiten berichtet. Eine ungelöste Frage ist, ob es ein Molekül (Fas-Liganden) gibt oder nicht, das an das Fas-Antigen auf der Zelloberfläche zur Induktion der Zell-Apoptose bindet, nämlich ein Molekül, das auf ähnliche Weise wie der oben beschriebene Fas-Antikörper wirkt.
Watanabe-Fukunaga R. et al. haben vermutet, dass in einer gld-Maus, die Autoimmunkrankheits-ähnliche Symptome zeigt, eine Anomalie in einem biologischen Molekül vorliegen sollte, das an das Fas-Antigen bindet, wie es der Fall in der Ipr-Maus ist.
Ferner haben Rouvier E. et al. berichtet, dass ein bestimmter Typ T-Zellen eine spezifische cytotoxische Wirkung auf die Zellen zeigt, die Fas-Antigen exprimieren (J. Exp. Med., Band 177, Seiten 195–200, 1993). Veranschaulichender dargestellt, haben sie gezeigt, dass eine Ca²⁺-unabhängige cytotoxische Wirkung von peripheren Blutlymphozyten (PBL) der Maus und von PC60-d10S-Zellen, wobei letztere ein Hybridom aus Maus-CTL und Ratten-T-Lymphomzellen ist, nur bei den Fas-Antigen-exprimierenden Zellen beobachtet wird. Sie haben außerdem die Möglichkeit vorgeschlagen, dass solche Lymphozyten, insbesondere T-Zellen, das Fas-Antigen oder bestimmte Fas-Antigen-verwandte Moleküle erkennen könnten, sowie die Möglichkeit, dass diese Zellen Fas-Liganden exprimieren.
Suda et al. (Cell, Band 75, 1169–1178, 17. Dezember 1993) beziehen sich auf die Isolierung der cDNA eines Fas-Liganden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und anschließende Klonierung. In einer weiteren Publikation (J. Exp. Med., Band 179, März 1994, 873–879) beschreiben Suda et al. die Reinigung und Charakterisierung eines 40 kD Membranglycoproteins, das auf PC60-d10S-Zellen exprimiert wird, von dem festgestellt wurde, dass es ein Fas-Ligand ist.
Takahashi et al. (Cell, Band 76, 969–976, 25. März 1994) beziehen sich auf die Isolierung und Identifizierung eines FasL-Gens aus der Maus, das in der gld-Region des Mauschromosoms 1 lokalisiert ist und eine Punktmutation in dem C-terminalen Bereich des Gens trägt.
WO 95/18819, veröffentlicht am 13. Juli 1995, beansprucht die Prioritätsdaten des 7. Januar 1994 und 1. Februar 1994. WO 95/18819 bezieht sich unter anderem auf die Aminosäure- und Nukleotidsequenzen von sowohl dem humanen Fas-Liganden als auch dem Fas-Liganden der Maus. WO 95/18819 war zum Zeitpunkt der Einreichung der vorliegenden Anmeldung noch nicht veröffentlicht und bildet Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) EPÜ. Itoh N. et al., Cell 66 (1991), 233 bis 243 beziehen sich auf einen anti-Fas-Antikörper. Der anti-Fas-Antikörper ist fähig, Apoptose zu induzieren. Der anti-Fas Antikörper von Itoh, N. et al. wurde aus den Ansprüchen der vorliegenden Erfindung mit Hilfe eines Disclaimers ausgeschlossen.
Obwohl die Möglichkeit des Vorhandenseins eines Fas-Liganden von den oben genannten Forschern vorgeschlagen wurde, ist dessen spezifische Beschaffenheit noch nicht aufgedeckt.
Es ist wichtig, den Fas-Ligand zu isolieren, um den Mechanismus der Fas-Antigen-vermittelten Apoptose aufzuklären und den Zusammenhang zwischen der Fas-Antigen-vermittelten Apoptose und Krankheiten genauer aufzudecken. Als Konsequenz wurde die Bestätigung des Vorhandenseins des Fas-Liganden und die Offenbarung seiner wahren Eigenschaften in verschiedenen Gebieten einschließlich der Medizin gefordert.
Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, auf dem Gebiet der medizinischen Versorgung einen Fas-Liganden und dessen Gen zur Verfügung zu stellen, sowie ein Mittel zur künstlichen Regulierung der Apoptose, die im Körper erzeugt wird.
Wie vorangehend beschrieben, schließen die Krankheiten, von denen angenommen wird, dass sie mit der Fas-Antigen-vermittelten Apoptose zusammenhängen, solche ein, die durch die Fas-Antigen-vermittelte Apoptose verursacht werden sowie solche, die durch das Fehlen der Fas-Antigen-vermittelten Apoptose verursacht werden. Zum Beispiel wird angenommen, dass der Tod von Hepatozyten und die anschließende Verringerung der Leberfunktion im Fall der Hepatitis und die Verringerung der Anzahl von HIV-infizierten T-Zellen und die anschließende Verringerung der immunologischen Funktion im Fall von AIDS durch Inhibierung der Apoptose verbessert würden. Im Fall von bestimmten Autoimmunkrankheiten wird andererseits angenommen, dass die Symptome durch das Ermöglichen des normalen Auftretens der Fas-Antigen-vermittelten Apoptose und durch Verstärkung des Entfernens von Autoantigen-reaktiven T-Zellen verbessert werden. Im Hinblick auf die Behandlung von AIDS in seinen frühen Stadien wäre die Induktion der Apoptose der Zellen, die mit HIV infiziert sind und deren Entfernung aus dem Körper wirksam sein. Morimoto H. et al. haben berichtet, dass die in Krebszellen induzierte Fas-Antigen-vermittelte Apoptose die karzinostatischen Effekte von Adriamycin und Cisplatin synergistisch verstärken könnte (Cancer Res., Band 53, Seiten 2591–2596, 1993). Eine Substanz, die fähig ist, an das Fas-Antigen zu binden, um die Apoptose zu induzieren, sollte bei der Behandlung von Krebs nützlich sein.
Solch eine Behandlung, die auf dem Prinzip der artifiziellen Regulierung der Fas-Antigen-vermittelten Apoptose basiert, kann nur nach der Identifizierung des Fas-Liganden etabliert werden. Mit anderen Worten würde die künstliche Verstärkung der Apoptose im lebenden Körper ermöglicht werden, wenn der Fas-Ligand spezifiziert ist.
Um den Fas-Liganden oder einen Teil des Liganden in der medizinischen Behandlung und der medizinischen Forschung einzusetzen, wäre es notwendig, das Fas-Ligand-Protein in großem Maßstab und mit einer hohen Reinheit herzustellen. Die Klonierung des Gens, das für ein solches Protein kodiert, wird die Herstellung des Proteins mit Hilfe gentechnologischer Methoden ermöglichen, und das so hergestellte Protein kann als Hauptwirkkomponente in therapeutischen Arzneimitteln und bei der Herstellung von An tikörpern verwendet werden. Ferner könnte das Gen selbst in der Gentherapie und bei der Entwicklung von Antisense-Arzneimitteln verwendet werden, ebenso wie zur Herstellung von Modelltieren, wie z.B. transgenen Mäusen, für Apoptose-bedingte Krankheiten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben intensive Studien durchgeführt mit dem Ziel, den Fas-Liganden zu isolieren, wobei sie die zuvor erwähnten PC60-d10S-Zellen berücksichtigt haben. PC60-d10S ist ein Hybridom von Maus-CTL und Ratten-T-Lymphom, das Apoptose nur in Fas-Antigen-exprimierenden Zellen induziert, wenn diese mit PMA (Phorbolmyristatacetat) und Ionomycin stimuliert wurden. Als Ergebnis der intensiven Studien ist es den Erfindern der vorliegenden Erfindung gelungen, eine Zellpopulation, PC60-d10S-2, zu erhalten, die eine höhere Toxizität ohne Stimulierung zeigt und die nützlich für die Klonierung des Fas-Liganden-Gens ist. Anschließend wurde das Fas-Liganden-Gen der Ratte unter Verwendung dieser Zellpopulation kloniert. Außerdem haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung intensive Studien durchgeführt mit dem Ziel, einen humanen Fas-Liganden zu isolieren, der geeignet ist für die Verwendung in pharmazeutischen Arzneimitteln und dergleichen und es ist ihnen gelungen, ein Gen zu erhalten, das den humanen Fas-Liganden kodiert, ebenso wie ein Gen, das den Fas-Liganden aus der Maus kodiert. Es wurde anschließend bestätigt, dass diese Gene ähnliche Sequenzen mit einer gemeinsamen Teilsequenz aufweisen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben außerdem den Teil der Sequenz identifiziert, der notwendig sein sollte, um die Fas-Ligandenfunktion auszuüben. Die vorliegende Erfindung wurde auf Grundlage dieser Bemühungen gemacht.
Gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Polypeptid zur Verfügung gestellt, das ein Fas-Ligand ist.
Gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Fragment des Fas-Ligand-Polypeptids gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt.
Gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein DNA-Fragment zur Verfügung gestellt, das eine Nukleotidsequenz enthält, die für das Polypeptid gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung kodiert.
Gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes DNA-Molekül zur Verfügung gestellt, welches die DNA gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung enthält.
Gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Transformant zur Verfügung gestellt, der mit dem DNA-Fragment gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung transformiert wurde.
Gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Transformant zur Verfügung gestellt, der mit dem DNA-Molekül gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung transformiert wurde.
Gemäß dem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt, wobei der Transformant gemäß dem fünften oder sechsten Aspekt der Erfindung verwendet wird.
Gemäß dem achten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung des Polypeptids gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung zur Verfügung gestellt.
Gemäß dem neunten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper oder Fragment davon, der/das fähig ist, das Polypeptid gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der Erfindung zu erkennen, zur Verfügung gestellt.
Gemäß dem zehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Oligonukleotid oder ein Derivat davon, das eine Nukleotidsequenz enthält, die komplementär zu einem Teil eines Fas-Liganden-Gens oder zu einem Teil der mRNA für den Fas-Liganden ist, zur Verfügung gestellt.
Gemäß dem elften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Screenen einer mit dem Fas-Liganden in Beziehung stehenden Substanz zur Verfügung gestellt, wobei das Polypeptid gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung oder ein Transformant, der fähig ist, das Polypeptid gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung zu exprimieren, verwendet wird.
Weitere Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden im Laufe der Beschreibung ersichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1, a, b und c zeigen die Ergebnisse der Durchflusszytometrie von COS-7-Zellen, die mit d10S, d10S-2 bzw. pTN24-15 transformiert wurden.
2 zeigt die Nukleotidsequenz in Klon pTN24-15 und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
3 zeigt die Nukleotidsequenz in Klon pTN24-15 und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
4 zeigt die Ergebnisse der Northern-Hybridisierung von d10S, d10S-2 und d10S-16.
5 zeigt die Ergebnisse der Northern-Hybridisierung von Splenozyten und Thymozyten der Ratte.
6 zeigt die Ergebnisse der Northern-Hybridisierung von Rattengeweben.
7 zeigt die Ergebnisse der Immunpräzipitation von COS-7-Zellen, die mit d10S-12 oder pTN24-15 transformiert wurden.
8 zeigt die cytotoxische Aktivität von d10S-Zellen, wenn W4 und W19L als Zielzellen verwendet werden.
9 zeigt die cytotoxischen Aktivitäten von COS-7-Zellen, die mit pTN24-15 transformiert wurden und COS-7-Zellen, die mit pCEV4 transformiert wurden, wenn W4 und W19L als Zielzellen verwendet werden.
10 zeigt die cytotoxischen Aktivitäten von COS-7-Zellen, die mit pTN24-15 transformiert wurden und COS-7-Zellen, die mit pCEV4 transformiert wurden, wenn W4 und W19L als Zielzellen verwendet werden.
11 zeigt die Inhibierungswirkung von mFas-Fc auf die cytotoxische Aktivität von COS-7-Zellen, die mit d10S-Zellen oder pTN24-15 transformiert wurden, gegenüber W4-Zellen.
12 zeigt eine Gelelektrophorese, die Veränderungen in der chromosomalen DNA der Zielzellen zeigt, wenn COS-7-Zellen, die mit pTN24-15 transformiert wurden, als Effektorzellen verwendet werden und W4- und W19L-Zellen als Zielzellen verwendet werden.
13 zeigt die Ergebnisse der SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese des gereinigten Fas-Liganden.
14 zeigt die cytotoxische Aktivität des gereinigten Fas-Liganden, wenn W4- und W19L-Zellen als Zielzellen verwendet werden.
15 zeigt die Nukleotidsequenz des Plasmids pBL-hFL4H und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
16 zeigt die Nukleotidsequenz des chromosomalen Gens des humanen Fas-Liganden.
17 zeigt die Nukleotidsequenz des chromosomalen Gens des humanen Fas-Liganden.
18 zeigt die Nukleotidsequenz des chromosomalen Gens des humanen Fas-Liganden.
19 zeigt die Nukleotidsequenz in Klon pBX-hFL1.
20 zeigt die Nukleotidsequenz in Klon pBX-hFL1.
21 zeigt die cytotoxische Aktivität von COS-Zellen, die mit pEX-hFL1 und von COS-Zellen, die mit pEF-MFLW4F transformiert wurden, wenn WR19L und WC8A als Zielzellen verwendet werden.
22 zeigt den Inhibierungseffekt von hFas-Fc und mFas-Fc auf die Cytotoxizität von COS-Zellen, die mit pBL-hFL1 transformiert wurden, gegenüber WC8A-Zellen.
23 zeigt die Nukleotidsequenz in Klon pBL-MFLW4 und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
24 zeigt die Nukleotidsequenz in Klon pBL-MFLW4 und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
25 zeigt die cytotoxische Aktivität von COS-Zellen, die mit pEF-MFLW4F transformiert wurden, wenn WR19L und W4 als Zielzellen verwendet werden.
26 zeigt die cytotoxische Aktivität von COS-Zellen, die mit einem Plasmid transformiert wurden, das die cDNA für den Fas-Liganden enthält, die aus gld-Mäusen isoliert wurde, wenn WR19L und W4 als Zielzellen verwendet werden.
27 ist ein Foto, das die Ergebnisse des Western-Blottings zeigt, in welchem Antiserum 19-3 und den humanen Fas-Liganden-exprimierende Zellen verwendet werden.
28 ist ein Foto, das die Ergebnisse des Western-Blottings zeigt, in dem ein monoklonaler Antikörper F864-5-1 und den humanen Fas-Liganden-exprimierende Zellen verwendet werden.
29 zeigt die Reaktivität des monoklonalen Antikörpers F883-1-1 mit einem Peptid.
30 zeigt die Apoptose-inhibierende Aktivität des monoklonalen Antikörpers F883-1-1.
31 zeigt die Reaktivität des monoklonalen Antikörpers F897-1-2 mit Peptid (3).
32 zeigt die Apoptose-inhibierende Aktivität des monoklonalen Antikörpers F897-1-2.
33 zeigt die cytotoxische Aktivität des Kulturüberstandes des Transformanten COS-1/pM1070, wenn WC8 und W4 als Zielzellen verwendet werden.
34 zeigt die cytotoxische Aktivität eines Kulturüberstandes des Transformanten COS-1/pEX-hFL1, wenn WC8 und W4 als Zielzellen verwendet werden.
35 ist ein Foto, das die Ergebnisse des Western-Blottings eines Kulturüberstandes des Transformanten COS-1/pM1070 zeigt, das unter nicht-reduzierenden Bedingungen durchgeführt wurde.
36 ist ein Foto, das die Ergebnisse des Western-Blottings eines Kulturüberstandes des Transformanten COS-1/pEX-hFL1 zeigt, das unter nicht-reduzierenden Bedingungen durchgeführt wurde.
37 zeigt die Apoptose-inhibierende Aktivität des Antisense-Oligomers A41.
38 zeigt die Apoptose-inhibierende Aktivität der Antisense-Oligonukleotide A69, A184, A355, A505, A733 und A924.
39 zeigt die cytotoxische Aktivität der Polypeptide ND38, ND40, ND41, ND42, ND43 bzw. CD179 in dem Kulturüberstand.
40 ist ein Foto, das die Ergebnisse des Western-Blottings zeigt, in dem der Transformant JE5505 (pM1068) und Kulturüberstand verwendet werden.
41 ist ein Foto, das die Ergebnisse des Western-Blottings zeigt, in dem der Transformant JE5505 (pM1069) und Kulturüberstand verwendet werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend in weiteren Einzelheiten beschrieben.
Zunächst wird das Polypeptid gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben.
In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Polypeptid, enthaltend (oder beinhaltend) die Aminosäuresequenz der Formel X (oder SEQ ID NR. X)" das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz hat, die in Formel X (oder SEQ ID NR. X) definiert ist, wobei ein oder mehrere Aminosäurereste optional an dessen N-Terminus oder C-Terminus oder sowohl an den N-Terminus und C-Terminus angefügt sind.
Der Begriff "Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der Formel X (oder SEQ ID NR. X) hat" bezeichnet das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz hat, die in Formel X (oder SEQ ID NR. X) definiert ist.
Der Begriff "Fas-Ligand" bezeichnet eine Substanz, die eine Aktivität zur Induktion der Apoptose einer Fas-Antigen-exprimierenden Zelle aufweist. Von der Apoptose der Fas- Antigen-exprimierenden Zellen wird angenommen, dass sie durch die Bindung des Fas-Liganden an das Fas-Antigen auf der Zelloberfläche induziert worden ist, was zur Übermittlung des Apoptosesignals an die Zelle über das Fas-Antigen führt.
Das "Fas-Antigen", wie hierin verwendet, kann jedes Fas-Antigen tierischer Herkunft sein, einschließlich dem humanen Fas-Antigen, Fas-Antigen der Ratte und Fas-Antigen der Maus. In diesem Zusammenhang wurde die Aminosäuresequenz für das humane Fas-Antigen von Itoh, N. et al., Cell, Band 66, Seiten 233–243, 1991 bestimmt. Die Aminosäuresequenz für das Fas-Antigen der Maus wurde von Watanabe-Fukunaga, R. et al., J. Immunol., Band 148, Seiten 1274–1279, 1992 bestimmt. Die Aminosäuresequenz für das Fas-Antigen der Ratte wurde von Kimura, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Band 198, Seiten 666–674, 1994 bestimmt.
Die Polypeptide gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung können jede der in den Formeln 1 bis 12 und in SEQ ID NR. 103 definierten Sequenzen enthalten.
Die Aminosäuresequenzen, die in den Formeln 1 bis 4 definiert sind, sind die Aminosäuresequenzen der Fas-Liganden humaner Zellherkunft. Die Aminosäuresequenzen, die in den Formeln 5 bis 8 definiert sind, sind die Aminosäuresequenzen der Fas-Liganden mit Herkunft aus Rattenzellen. Die Aminosäuresequenzen, die in den Formeln 9 bis 12 definiert sind, sind die Aminosäuresequenzen der Fas-Liganden mit Herkunft aus Mauszellen.
Die Aminosäuresequenzen, die in den Formeln 4, 8 und 12 definiert sind, schließen alle die intrazellulären, Transmembran- und extrazellulären Domänen ein, und es wird angenommen, dass solche Polypeptide in Organismen als Zelloberflächen-Polypeptide vorkommen sollten. Daher würde die Herstellung von Polypeptiden mit solchen Aminosäuresequenzen die Reinigung der Polypeptide aus den Zellen oder Geweben, die solche Polypeptide exprimieren, erfordern.
Die extrazelluläre Domäne eines Zelloberflächen-Polypeptids wird häufig von der Zellmembran abgespalten, um in den Überstand der Zellkultur, die solche Polypeptide produziert oder in Körperflüssigkeiten wie z.B. Urin und Blut freigesetzt zu werden. Im Allgemeinen ist die Reinigung eines Polypeptids effizienter und produktiver, wenn das Polypeptid aus einem Überstand oder aus Urin gereinigt wird im Vergleich zu der Reinigung aus Zellen oder einem Gewebe. Die Situation ist die gleiche für den Fas-Liganden, und die Reinigung der extrazellulären Domäne des Fas-Liganden ist produktiver als die Reinigung des gesamten Fas-Liganden.
In der vorliegenden Erfindung werden außerdem Polypeptide zur Verfügung gestellt, die einer solchen extrazellulären Domäne der Fas-Liganden entsprechen. Die Spaltstelle für den Fas-Liganden, an der die extrazelluläre Domäne von der Zellmembran getrennt wird, ist nicht auf eine bestimmte Stelle beschränkt, und die Spaltstelle kann gemäß den Bedingungen der Zellkultur oder der innerhalb oder außerhalb der Zelle vorhandenen Proteasen variieren. Vorzugsweise sind die extrazellulären Domänen der Fas-Liganden Polypeptide, welche die Aminosäuresequenzen, die in den Formeln 3, 7 und 11 definiert sind, haben, welche den extrazellulären Domänen der Fas-Liganden aus Mensch, Ratte bzw. Maus entsprechen. Die Aminosäuresequenz der Formel 3 entspricht der Sequenz von dem 103. Aminosäurest bis zum 281. Aminosäurerest des N-Terminus in der Aminosäuresequenz der Formel 4. Die Aminosäuresequenz der Formel 7 entspricht der Sequenz ab dem 100. Aminosäurerest bis zum 278. Aminosäurerest des N-Terminus in der Aminosäuresequenz der Formel 8. Die Aminosäuresequenz der Formel 11 entspricht der Sequenz vom 101. Aminosäurerest bis zum 279. Aminosäurerest des N-Terminus in der Aminosäuresequenz der Formel 12.
Wie auf dem Gebiet bekannt ist, ist bei der Herstellung von Polypeptiden durch rekombinante DNA-Technologie die Menge des exprimierten Polypeptids und folglich die Produktionseffizienz höher, wenn das hergestellte Polypeptid ein geringeres Molekulargewicht hat. Darüber hinaus hätte ein Polypeptid, das ausschließlich den für seine Wirkung erforderlichen Teil umfasst, eine geringere Antigenizität als Polypeptide, die zusätzliche Sequenzen umfassen. Darüber hinaus wäre es, wenn das Polypeptid von Interesse ein geringes Molekulargewicht hat, möglich, das Polypeptid mit einem weiteren Polypeptid, das eine andere Aktivität hat, zu fusionieren, um dem Polypeptid eine andere Aktivität zu verleihen oder das Polypeptid mit einem Antikörper zu binden, um die Zielzelle zu spezifizieren, auf die das Polypeptid seine Wirkung ausübt. In der vorliegenden Erfindung werden Polypeptide zur Verfügung gestellt, welche die Aminosäuresequenz haben, die in den Formeln 1, 5 und 9 definiert ist, die ein geringeres Molekulargewicht aufweisen, und es wird daher eine höhere Produktivität und geringere Antigenizität erwartet. Außer dem werden in der vorliegenden Erfindung Polypeptide zur Verfügung gestellt, welche die Aminosäuresequenzen, die in den Formeln 2, 6 und 10 definiert sind, haben.
Die Formeln 1, 2, 5, 6, 9 bzw. 10 stellen Teile der Aminosäuresequenzen der extrazellulären Domäne der Fas-Liganden aus Mensch, Ratte und Maus dar.
Veranschaulichender dargestellt repräsentieren die Aminosäuresequenzen der Formeln 1, 5 bzw. 9 die Aminosäuresequenzen der Formeln 3, 7 und 11, in denen 42 Aminosäurereste an ihrem N-Terminus fehlen; und die Aminosäuresequenzen der Formeln 2, 6 bzw. 10 repräsentieren die Aminosäuresequenzen der Formeln 3, 7 und 11, wobei 41 Aminosäurereste an deren N-Terminus fehlen. Wie in den Beispielen dargelegt, weisen die Polypeptide (der Formeln 1 und 2), welche die Aminosäuresequenzen der Formel 3 haben, in der 42 oder 41 Aminosäurereste am N-Terminus fehlen, noch immer die Apoptose-induzierende Aktivität auf. Die Polypeptide, welche die Aminosäuresequenzen der Formel 3 haben, in der 40, 38 oder 34 Aminosäurereste an dem N-Terminus fehlen, weisen ebenfalls die Apoptose-induzierende Aktivität auf.
Es deutete sich dan an, dass die Aminosäuresequenz stromabwärts des 43. Aminosäurerestes entscheidend für die Apoptose-induzierende Aktivität sein sollte, und ein Polypeptid, das diese entscheidende Sequenz wie in den Formeln 1, 5 oder 9 definiert, als einen Teil seiner Sequenz beinhaltet, würde die Apoptose-induzierende Aktivität haben. Entsprechend können die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung durch den Einschluss der Aminosäuresequenz, wie in den Formeln 1, 5 oder 9 definiert, gekennzeichnet sein.
Von den Polypeptiden gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung sind solche Polypeptide, die die Aminosäuresequenz der Formel 3 haben, die der extrazellulären Domäne des Fas-Liganden humanen Ursprungs entspricht, in welcher Aminosäurereste mit einer Anzahl, die aus den Zahlen 1 bis 42 ausgewählt ist, an dem N-Terminus fehlen, im Hinblick auf ihre geringe Antigenizität für den Menschen im Vergleich zu Fas-Liganden tierischer Herkunft und im Hinblick auf ihre höhere Produktivität aufgrund des geringen Molekulargewichts vorteilhaft. Solche Polypeptide können auch aus den Kulturüberständen gewonnen werden, wenn sie mit einem geeigneten Signalpeptid von einem Transformanten exprimiert werden. Insbesondere sind die Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz der Formel 3 haben, in der 40 oder 34 Aminosäurereste am N-Terminus fehlen, in Hinblick auf ihre hohe Aktivität vorteilhaft.
Abhängig von Unterschieden in Arten und Individuen treten gewöhnlich gelegentlich Mutationen der Aminosäuresequenz in einem Protein auf, ohne dessen Grundfunktion zu stören. Der Begriff "Mutation der Aminosäuresequenz", wie hierin verwendet, bezeichnet die Deletion eines oder mehrerer Aminosäurereste von einer Aminosäuresequenz oder deren Substitution durch andere Aminosäurereste und die Insertion oder Addition von einem oder mehreren Aminosäurerest(en) in oder an beliebige Stellen der Aminosäuresequenz. Solch eine Mutation kann künstlich mit Hilfe gentechnologischer Methoden eingeführt werden.
Folglich sind Polypeptide, die eine andere Aminosäuresequenz haben, z.B. solche, die Derivate von einer der vorstehend genannten Aminosäuresequenzen aufweisen, die in den Formeln 1 bis 12 dargestellt sind, in denen eine Mutation der Aminosäuresequenz an einer oder mehreren optionalen Positionen aufgetreten ist, ebenfalls von dem Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, vorausgesetzt, dass diese Polypeptide mit ähnlichen Eigenschaften ausgestattet sind wie das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung.
Im Allgemeinen zeigen DNA-Moleküle, die Polypeptide mit denselben Funktionen kodieren, gegenseitige Homologie und hybridisieren in vielen Fällen miteinander. Unterschiede in den Aminosäuresequenzen treten außerdem in vielen Fällen innerhalb eines solchen Ausmaßes auf, dass die DNA-Moleküle, welche sie kodieren, miteinander hybridisiert werden können. Zum Beispiel können, wie später in den Beispielen beschrieben werden wird, DNA-Fragmente, welche Aminosäuresequenzen der zuvor genannten Formeln 3 und 11 kodieren, mit einem DNA-Fragment hybridisieren, das Aminosäuresequenzen der zuvor genannten Formel 7 kodiert. Darüber hinaus kann der Fas-Ligand, der die Aminosäuresequenz der Formel 3 enthält, nicht nur an humanes Fas-Antigen binden, sondern auch an Maus-Fas-Antigen. Außerdem kann der Fas-Ligand, der die Aminosäuresequenz der Formel 7 enthält, nicht nur an Fas-Antigen der Ratte binden, sondern auch an Fas-Antigen der Maus. Der Fas-Ligand, der die Aminosäuresequenz der Formel 11 enthält, kann nicht nur an Fas-Antigen der Maus binden, sondern auch an humanes Fas-Antigen. Folglich wird in Betracht gezogen, dass Polypeptide, welche die Aminosäuresequenzen haben, die von miteinander hybridisierbaren DNA-Fragmenten kodiert werden, im Wesentlichen die gleiche Funktion haben. Folglich ist das neue Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz enthält, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die mit einer Nukleotidsequenz hybridisiert, welche komplementär zu irgendeiner der Nukleotidsequenzen ist, die für die zuvor erwähnten Aminosäuresequenzen der Formeln 1 bis 12, vorzugsweise der Formeln 1, 5 oder 9 ist.
Zusätzlich zu den oben genannten Eigenschaften ist das neue Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass es an wenigstens eines der Moleküle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den humanen Fas-Antigenen, den Fas-Antigenen der Ratte und den Fas-Antigenen der Maus, bindet und vorzugsweise eine Aktivität zur Induktion der Apoptose in Fas-Antigen-exprimierenden Zellen aufweist.
Als Nächstes wird das Polypeptid gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Das Polypeptid gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ein Fragment eines Fas-Liganden oder ein Fusionsprodukt einer Vielzahl derselben oder verschiedener Fragmente des Fas-Liganden umfassen. Solch ein Polypeptid kann vorzugsweise einen Teil der Aminosäuresequenz, die durch irgendeine der Formeln 4, 8 und 12 definiert ist, aufweisen und solch ein Polypeptid kann in einer beliebigen Reihenfolge fusioniert sein, um Fusions-Polypeptide zu bilden.
Das Polypeptid, das einen Teil der Aminosäuresequenz, die in den Formeln 4, 8 oder 12 definiert ist, aufweist, kann jede gewünschte Länge haben. Das Polypeptid kann jedoch vorzugsweise eine Länge von 5 oder mehr Aminosäureresten und bevorzugter eine Länge von 10 oder mehr Aminosäureresten haben, um die Einbeziehung des kennzeichnenden Teils der Aminosäuresequenz, die durch die Formel 4, 8 oder 12 definiert wird, zu ermöglichen.
Das Polypeptid gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann entweder fähig oder unfähig sein, an das Fas-Antigen zu binden. Von den Polypeptiden gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung können solche, die fähig sind, an das Fas-Antigen zu binden, jedoch unfähig sind, die Apoptose zu induzieren, als Substanz verwendet werden, die in einem Organismus kompetitiv gegen den Fas-Liganden wirkt, und solche Polypeptide können zum Zwecke der künstlichen Inhibierung der Apoptose verabreicht werden. Wie in dem Beispiel beschrieben, können die Polypeptide gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung als Antigen bei der Herstellung eines Antikörpers gegen das Polypeptid gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung verwendet werden, unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit der Bindungsfähigkeit mit dem Fas-Antigen oder der Apoptose-induzierenden Aktivität.
Wie oben beschrieben, kann das Polypeptid gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Fusion von zwei oder mehr Polypeptiden umfassen, die jeweils die Aminosäuresequenz aufweisen, welche ein Teil der Aminosäuresequenz ist, die durch die Formel 4, 8 oder 12 definiert wird, und die in beliebiger Reihenfolge fusioniert wurden. Beispiele solcher Fusions-Polypeptide schließen eine Fusion von zwei Polypeptiden, die jeweils die Aminosäuresequenz aufweisen, die ein Teil der durch Formel 4 definierten Aminosäuresequenz ist, ein; und eine Fusion eines Polypeptids, das die Aminosäuresequenz hat, die ein Teil der Aminosäuresequenz ist, die in Formel 4 definiert wird, mit einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz hat, die ein Teil der Aminosäuresequenz ist, die in der Formel 8 oder 12 definiert ist. Ein bevorzugtes Beispiel ist das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von dem 50. Aminosäurerest bis zum 179. Aminosäurerest des N-Terminus in der Aminosäuresequenz, die in Formel 3 definiert ist, umfasst, fusioniert mit dem C-Terminus des Polypeptids, umfassend die Aminosäuresequenz von dem 1. Aminosäurerest bis zum 49. Aminosäurerest des N-Terminus in der Aminosäuresequenz, die in der Formel 7 oder 11 definiert ist. Solche Fusions-Polypeptide sind chimäre Polypeptide des Fas-Liganden humaner Herkunft mit dem Fas-Liganden mit Herkunft aus der Ratte bzw. der Maus. Von solchen Fusions-Polypeptiden wird erwartet, dass sie eine Apoptose-induzierende Aktivität auf Fas-Antigen-exprimierende Zellen haben.
Das oben beschriebene Fusions-Polypeptid kann mit Hilfe rekombinanter DNA-Technologie durch Ligieren der entsprechenden DNAs, die für die Polypeptidkomponenten kodieren, hergestellt werden, so dass eine DNA hergestellt wird, die für den chimären Fas-Liganden kodiert; durch Einführen der so produzierten DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren; und durch Gewinnung des chimären Fas-Liganden von Interesse aus den transformierten Zellen oder dem Kulturüberstand.
Das neue Polypeptid gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann Zuckerketten aufweisen oder nicht.
Jede der Aminosäuresequenzen, die in den zuvor erwähnten Formeln 4 und 8 dargestellt sind, enthält 4 Stellen, an die Zuckerketten angefügt werden können (N-Glycosylierungsstellen). Das heißt, die Aminosäurereste der Positionen 76 bis 78, 184 bis 186, 250 bis 252 und 260 bis 262 in der Formel 4 und solche der Positionen 116 bis 118, 130 bis 132, 247 bis 249 und 257 bis 259 in der Formel 8 entsprechen den N-Glycosylierungsstellen. Außerdem hat die Aminosäuresequenz der zuvor erwähnten Formel 12 fünf N-Glycosylierungsstellen (Aminosäurereste der Positionen 117 bis 119, 131 bis 133, 182 bis 184, 248 bis 250 und 258 bis 260).
Folglich kann das Anfügen von Zuckerketten an solche Polypeptide auftreten, wenn sie von tierischen Zellen oder mit Hilfe von gentechnologischen Methoden unter Verwendung von eukaryontischen Zellen wie z.B. Zellen der Hefe oder tierischen Zellen als Wirtszellen hergestellt werden. Andererseits weist das neue Polypeptid keine Zuckerkette auf, wenn es mit Hilfe von gentechnologischen Methoden unter Verwendung von prokaryontischen Zellen wie z.B. Escherichia coli als Wirt hergestellt wird.
Unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit zusätzlicher Zuckerketten sind die Polypeptide gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung nützlich und können als das Antigen bei der Herstellung des Antikörpers gemäß dem neunten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet werden, oder beim Screenen von Substanzen, die an solche Polypeptide binden würden.
Das neue Polypeptid gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann durch jedes Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann es chemisch synthetisiert werden unter Verwendung eines Peptid-Synthetisierers (z.B. Peptide Synthesizer 430A, Perkin-Elmer Japan) oder aus Geweben, Zellen oder Körperflüssigkeiten des Menschen oder jedem anderen Organismus gereinigt werden. Beispiele für die Körper flüssigkeiten von Mensch und Tieren schließen Blut, Urin und dergleichen ein. Geeignete Zellen können optional aus solchen ausgewählt werden, die fähig sind, das neue Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung zu produzieren. Zum Beispiel können Zellen, die fähig sind, das neue Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung in großen Mengen zu exprimieren, ausgewählt werden aus Splenozyten, Thymozyten, Lymphozyten und daraus etablierten Zelllinien, über deren Analyse durch Northern-Blotting, Western-Blotting und dergleichen.
Wenn nötig, kann die Herstellung des Polypeptids durch Stimulieren der Zellen mit einem oder mehreren geeigneten Stimulierungsmitteln, ausgewählt aus PMA (Phorbolmyristatacetat), Ionomycin, PHA (Phytohämagglutinin), ConA (Concanavalin A), IL-2 (Interleukin-2) und dergleichen induziert werden. Danach wird das Protein von Interesse aus den Zellen oder einem Kulturüberstand der Zellen gereinigt. Seine Reinigung kann durch eine geeignete Kombination von gewöhnlicherweise verwendeten Polypeptid-Reinigungsschritten wie z.B. Konzentrieren, verschiedenen Arten der Chromatografie, Aussalzung und dergleichen, welche die Affinität des Polypeptids für das Fas-Antigen oder dessen Cytotoxizität auf Fas-Antigen-exprimierende Zellen als ein Marker verwenden, ausgeführt werden. Ein bevorzugtes Beispiel für das Reinigungsverfahren wird im Zusammenhang mit dem achten Aspekt der vorliegenden Erfindung später beschrieben werden.
Bevorzugterweise jedoch wird das neue Polypeptid in Hinblick auf dessen Reinheit mit Hilfe von gentechnologischen Methoden in Form eines rekombinanten Polypeptids hergestellt. Um das neue Polypeptid mit Hilfe gentechnologischer Verfahren zu erhalten, werden geeignete Wirtszellen mit der neuen DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung oder mit rekombinanten DNA-Molekülen gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung, die beide später beschrieben werden, transformiert und der so erhaltene Transformant wird kultiviert, um die Kulturmischung mit dem Transformanten zu erhalten, von der das Polypeptid von Interesse anschließend gereinigt wird. Das neue Polypeptid kann außerdem durch andere gentechnologische Mittel hergestellt werden, welche die neue DNA oder das rekombinante DNA-Molekül durch Anwendung eines zellfreien Syntheseverfahrens verwenden (Sambrook J. et al., Molecular Cloning 2. Ausgabe, 1989).
Ein bevorzugtes Beispiel des Verfahrens zur Herstellung des neuen Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung mit Hilfe gentechnologischer Verfahren wird später im Zusammenhang mit dem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben werden.
Neueste Fortschritte im Bereich der proteintechnologischen Verfahren haben es möglich gemacht, Polypeptide an hochmolekulare Verbindungen wie z.B. Polyethylenglycol, Styrol-Maleinsäure-Copolymer, Dextran, Pyran-Copolymer, Polylysin und dergleichen, ebenso wie an natürliche hochmolekulare Verbindungen wie z.B. Polysaccharide, Polypeptide und dergleichen, physiologisch aktive Substanzen, wie z.B. Hormone und anorganische Verbindungen, wie z.B. Magnetit und dergleichen zu binden (siehe z.B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 84, Seiten 1487–1491, 1981 und Biochemistry, Band 28, Seiten 6619–6624, 1989).
Ein Beispiel für das Bindungsverfahren von Polypeptiden an Polyethylenglycol wird im Folgenden kurz beschrieben. Zunächst wird ein Polypeptid von Interesse in einer Pufferlösung gelöst, die einen basischen pH-Wert innerhalb eines solchen Bereiches aufweist, dass die Aktivität des Polypeptids nicht beeinträchtigt wird. Die so hergestellte Lösung wird mit einem aktivierten Polyethylenglycol, wie z.B. Methoxypolyethylenglycolsuccinimidylsuccinat gemischt, um miteinander bei Raumtemperatur für eine bestimmte Zeit zu reagieren. Anschließend wird eine Fraktion, welche die Aktivität des Polypeptids aufweist, durch Gelfiltration oder ähnliche Mittel gesammelt.
Das neue Polypeptid gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann außerdem auf diese Weise durch eine Kombination der bekannten Verfahren modifiziert werden. Folglich umfasst das neue Polypeptid gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung auch solche, die derartige Modifikationen erhalten haben.
Es ist allgemein bekannt, dass Polypeptide durch kovalente Bindung oder nicht-kovalente Bindung in einem Organismus oder in einem Kulturmedium häufig die Form eines Multimers annehmen. Solch ein Multimer wird durch die Bindung des Polypeptids derselben Art oder verschiedener Arten gebildet. Zum Beispiel war TNF bekannt dafür, ein Trimer zu bilden und von Actibin war bekannt, dass es ein Dimer bildet.
Das Polypeptid gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann entweder in der Form eines Monomers oder eines Multimers vorliegen. Zum Beispiel kann das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung, das die Aminosäuresequenz hat, die durch eine der Formeln 1 bis 12 definiert wird, durch Bindung miteinander die Form eines Trimers einnehmen.
Das Polypeptid gemäß dem ersten und dem zweiten Aspekt der Erfindung kann zur Regulierung der Apoptose, die im lebenden Körper induziert wird, verwendet werden.
Zum Beispiel kann das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung, das typischerweise eine Aminosäuresequenz hat, die durch eine der Formeln 1 bis 12 definiert wird und das fähig ist, an das Fas-Antigen zu binden, um die Apoptose zu induzieren, für die Behandlung eines Krebses verwendet werden, der Resistenzen gegenüber karzinostatischen Mitteln erworben hat. Alternativ kann das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung zur Behandlung eines frühen Stadiums von AIDS durch Induzieren der Apoptose der HIV-infizierten Zellen verwendet werden. Solche Behandlungen sollten neue Behandlungsschemata auf dem Gebiet der Medizin darstellen.
Von den Polypeptiden gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung können solche, die fähig sind, an das Fas-Antigen zu binden, jedoch unfähig sind, die Apoptose zu induzieren, zur Verhinderung der Apoptose von Zellen wie z.B. Hepatozyten verwendet werden, um dadurch einen raschen Verlust der Zahl von Zellen, die Organe bilden, die wichtig für die Patienten sind, wie z.B. die Leber, zu verhindern und folglich eine rasche Dysfunktion solcher Organe, z.B. im Fall der Hepatitis, zu verhindern.
Die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung können als Medikamente, z.B. in Form einer Injektion, einer Tablette, einer Kapsel, eines Suppositoriums, eines Sprays, einer Salbe, eines Kataplasmas oder Augentropfen hergestellt werden, in Übereinstimmung mit jedem beliebigen konventionellen Verfahren, das für die Herstellung Polypeptid-enthaltender Medikamente verwendet wird. Zum Beispiel kann ein Medikament, das das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung als sein wirksamer Bestandteil in Form einer Injektion enthält, durch Füllen einer Ampulle mit einer Lösung des Polypeptids, die unter aseptischen Bedingungen hergestellt wurde und durch Lyophilisieren der Lösung hergestellt werden. Die Injektion kann zusätzlich pharmazeutisch annehmbare Zusatzstoffe wie z.B. einen Stabilisator, enthalten. Die so hergestellte Injektion kann vor der intravenösen oder topischen Verabreichung in destilliertem Wasser zu Injektionszwecken hergestellt werden. Von den Polypeptiden gemäß der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, die am geeignetsten für die Verwendung als Wirkstoff in einem Medikament sind, Polypeptide, die eine geringe Antigenizität für Menschen aufweisen, wie z.B. Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz, die durch eine der Formeln 1 bis 4 definiert wird, oder ein Fragment davon, und insbesondere solche, die in den Formeln 1 und 4 definiert werden, oder ein Fragment davon enthalten.
Das neue Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Festlegen seines Verabreichungsverfahrens und seiner Dosis abhängig von dem Alter und Geschlecht des jeweiligen Patienten und der Art und Ausprägung der jeweiligen Krankheit verwendet werden. Mit anderen Worten kann es in einer Dosis verwendet werden, die wirksam bei der Kontrolle der Apoptose und folglich bei der Verbesserung eines krankhaften Zustandes ist, durch Auswählen eines geeigneten Verabreichungsweges aus der oralen Verabreichung und der parenteralen Verabreichung, wie z.B. der Inhalation, perkutanen Absorption, ophthalmischen Verabreichung, vaginalen Verabreichung, intraartikulären Injektion, rektalen Verabreichung, intravenösen Injektion, topischen Applikation, intramuskulären Injektion, subkutanen Injektion, intraperitonealen Verabreichung und dergleichen.
Außerdem können die Polypeptide gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der Erfindung zur Herstellung eines Antikörpers durch Immunisieren eines Tieres wie z.B. einem Kaninchen mit dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Herstellung des Antikörpers wird in der Beschreibung des neunten Aspekts der vorliegenden Erfindung dargestellt. Der resultierende Antikörper kann zum Färben von Geweben oder Zellen verwendet werden oder für die Herstellung einer Affinitätssäule, die für die Verwendung bei der Reinigung des Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung angepasst wurde.
Als Nächstes wird die DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben.
In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "eine DNA enthaltend (oder umfassend) die Nukleotidsequenz, die durch die Formel Y (oder SEQ ID NR. Y) definiert wird" eine DNA, welche die Nukleotidsequenz hat, die durch Formel Y (oder SEQ ID NR. Y) definiert ist, die optional wenigstens ein Nukleotid angefügt auf einer oder beiden seiner 3' und 5'-Enden aufweist. Das angefügte Nukleotid ist nicht auf einen bestimmten Typ beschränkt, solange eine solche Anfügung des Nukleotids nicht in einer Verschiebung des Leserasters resultiert. Beispiele für angefügte Sequenzen schließen eine Linkersequenz, eine Terminationskodon-Sequenz, eine Nukleotidsequenz, die für ein Signalpeptid oder ein anderes Polypeptid kodiert, eine Sequenz, die bei der Herstellung einer DNA-Sonde zum Zwecke der Erhöhung der Detektionssensitivität angefügt wird, ein. Der Begriff "eine DNA, die die Nukleotidsequenz hat, die durch Formel Y definiert wird (oder SEQ ID NR. Y)" bezeichnet die DNA, die im Wesentlichen durch die Nukleotidsequenz, die durch Formel Y (oder SEQ ID NR. Y) definiert wird, dargestellt wird.
Die neue DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt die gesamte DNA oder einen Teil der DNA, die den Fas-Liganden kodiert, ein.
Die neue DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz enthält, die das neue Polypeptid gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kodiert.
Das heißt, die neue DNA gemäß der vorliegenden Erfindung enthält bevorzugterweise eine Nukleotidsequenz, die wenigstens einen Teil jeder beliebigen der Aminosäuresequenzen der obengenannten Formeln 1 bis 12 (SEQ ID NR. 1 bis 12) kodiert.
Da bekannt ist, dass für jede Aminosäure 1 bis 6 Aminosäure-kodierende DNA-Triplets vorhanden sind, ist die Nukleotidsequenz, welche eine der Aminosäuresequenzen der obengenannten Formeln 1 bis 12 kodiert, nicht auf eine bestimmte Art beschränkt. Folglich sind alle DNA-Fragmente, die irgendeine Art der Sequenz umfassen, von dem neuen DNA-Fragment gemäß der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, vorausgesetzt, dass sie eine Nukleotidsequenz enthalten, die wenigstens einen Teil oder eine der Aminosäuresequenzen der obengenannten Formeln 1 bis 12 kodieren.
Bevorzugter ist das neue DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung ein Fragment, das wenigstens einen Teil einer Nukleotidsequenz enthält, die durch eine der Formeln 13 bis 24 und SEQ ID NR. 104 dargestellt wird (SEQ ID NRN. 13 bis 24 und 104).
Die Nukleotidsequenzen, die durch die Formeln 16, 20 und 24 dargestellt werden, kodieren die Aminosäuresequenzen, die durch die Formeln 4, 8 bzw. 12 dargestellt werden. Die Nukleotidsequenzen, die durch die Formeln 15, 19 und 23 dargestellt werden, kodieren die Aminosäuresequenzen, die durch die Formeln 3, 7 bzw. 11 dargestellt werden, welche die extrazellulären Regionen des humanen Fas-Liganden, des Fas-Liganden der Ratte und der Maus sind, dargestellt durch die Aminosäuresequenzen der Formeln 4, 8 bzw. 12. Die Nukleotidsequenzen, die durch die Formeln 13, 14, 17, 18, 21 und 22 dargestellt werden, kodieren die Aminosäuresequenzen, die durch die Formeln 1, 2, 5, 6, 9 und 10 dargestellt werden, welche kürzere Aminosäuresequenzen sind als die der Polypeptide der extrazellulären Regionen des humanen Fas-Liganden, des Fas-Liganden der Ratte und der Maus.
Das neue DNA-Fragment gemäß der vorliegenden Erfindung kann entweder cDNA oder chromosomale DNA sein, vorausgesetzt, dass es Nukleotidsequenzen enthält, die das neue Polypeptid gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kodieren. Als ein Beispiel für eine solche Art von chromosomaler DNA wird eine Nukleotidsequenz von chromosomaler DNA, die einen Teil der oben erwähnten Nukleotidsequenz der Formel 13 oder 16 enthält, in den 16 bis 18 gezeigt. Es ist jedoch wünschenswert, dass das neue DNA-Fragment gemäß der vorliegenden Erfindung eine cDNA ist, da diese bei der Ausführung gentechnologischer Verfahren leicht handhabbar ist, wie z.B. die Leichtigkeit, sie in einen Vektor einzuführen.
Die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung ist nützlich, um das neue Polypeptid gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung mit Hilfe rekombinanter DNA-Methoden herzustellen. Die DNA der vorliegenden Erfindung kann in den Vektor, der eine geeignete Nukleotidsequenz für die Expression des Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung wie z.B. eine Promotorsequenz enthält, insertiert werden; anschließend kann der so erhaltene Vektor verwendet werden, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren, um das Polypeptid gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung herzustellen. Das Polypeptid kann aus dem Transformanten oder dem Kulturüberstand davon gewonnen werden.
Wie in den Beispielen beschrieben werden wird, kann der Fas-Ligand, nämlich die Polypeptide, die die Aktivität zur Induktion der Apoptose aufweisen, aus dem Kulturüberstand des Transformanten, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde, das die DNA enthält, welche die Sequenz hat, die durch die Formeln 16, 20 und 24 dargestellt wird, erhalten werden.
Die DNAs, welche die Nukleotidsequenzen aufweisen, die durch die Formeln 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23 dargestellt werden, sind nützlich zum Erhalt niedrigmolekularer Fas-Liganden. Die DNAs kodieren die Aminosäuresequenzen, die durch die Formeln 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11 dargestellt werden, welche Aminosäuresequenzen eines Teils oder der ganzen extrazellulären Region des Fas-Liganden sind. Wenn die DNA an die stromabwärts liegende Sequenz einer Nukleotidsequenz gebunden wird, die ein geeignetes Signalpeptid zur Expression durch einen Transformanten kodiert, kann das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung, das von der DNA kodiert wird, aus dem Kulturüberstand des Transformanten erhalten werden.
Wie bereits beschrieben, ist es effektiver, die Polypeptide aus dem Kulturüberstand zu gewinnen, als aus dem Lysat von Zellen. Die DNAs, welche die Nukleotidsequenzen aufweisen, die durch die Formeln 13, 14, 15, 17, 18, 21, 22, 23 dargestellt werden, sind außerdem nützlich, da sie ein geringes Molekulargewicht haben und bei der Ausführung gentechnologischer Verfahren leicht zu handhaben sind.
Wie oben beschrieben, können die Polypeptide, die von verschiedenen Tierspezies oder von verschiedenen Individuen derselben Spezies stammen, verschiedene Aminosäuresequenzen haben und folglich können die DNAs, die solche Polypeptide kodieren, verschiedene Nukleotidsequenzen haben. Trotz dieser Sequenzvariation sind die Nukleotidsequenzen der DNAs, die für Proteine kodieren, die eine identische Funktion aufweisen, im Allgemeinen homolog zueinander, trotz ihrer unterschiedlichen Herkunft. Angesichts dieser Situation sollte eine DNA, die eine Nukleotidsequenz hat, die wenigstens teilweise homolog zu der Nukleotidsequenz ist, die in einer der Formeln 13 bis 24 definiert wird, nämlich eine DNA, die mit wenigstens einem Teil der Nukleotidsequenz hybridisierbar ist, die komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, die in einer der Formeln 13 bis 24 definiert wird, für ein Polypeptid kodieren, das eine identische Funktion mit der Funktion des Polypeptids aufweist, das durch die Nukleotidsequenz kodiert wird, die in einer der Formeln 13 bis 24 definiert wird. Der Begriff "hybridisierbar", wie hierin verwendet, bedeutet, dass die Sequenz hybridisierbar wäre, wenn die Hybridisierung in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren ausgeführt würde (siehe z.B., Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2. Ausgabe, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), unter Verwendung von wenigstens einem Teil der Sequenz, die komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, die in einer der Formeln 13 bis 24 definiert wird, als Probe. In den Beispielen wird die Hybridisierung unter Verwendung eines Teils der Nukleotidsequenz, die komplementär zu der Nukleotidsequenz der Formel 19 ist, als Probe ausgeführt.
Wie oben beschrieben, ist die DNA, die mit der Nukleotidsequenz hybridisierbar ist, die komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, die in einer der Formeln 13 bis 24 definiert wird, von der DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Insbesondere ist eine DNA, die mit der Nukleotidsequenz hybridisierbar ist, die komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, die in einer der Formeln 13, 17 und 21 definiert ist und die den Fas-Liganden kodiert, eine bevorzugte Ausführungsform der DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Die DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ein DNA-Fragment sein, das eine Nukleotidsequenz hat, die ein Teil der Nukleotidsequenz ist, die in einer der SEQ ID NRN. 99 bis 102, 25 und 27 definiert ist. Wie in den Beispielen nachgewiesen, enthalten die Nukleotidsequenzen der SEQ ID NRN. 99 bis 102, 25 und 27 die Nukleotidsequenzen der cDNAs, die aus humanen, Ratten- und Maus-cDNA-Bibliotheken erhalten wurden in dem Bemühen, die DNAs zu finden, welche die Nukleotidsequenzen aufweisen, die für den Fas-Liganden kodieren. Die Nukleotidsequenzen der SEQ ID NRN. 99 bis 102, 25 und 27 enthalten die Nukleotidsequenzen der Formeln 16, 20 bzw. 24 innerhalb ihrer Sequenzen.
Die Nukleotidsequenz, die ein Teil der Nukleotidsequenz ist, die in einer der SEQ ID NRN. 99 bis 102, 25 und 27 definiert ist, kann jeden beliebigen Teil der Nukleotidsequenz umfassen. Solch ein Fragment ist seiner Länge nach nicht beschränkt und kann z.B. einen Teil der Nukleotidsequenz der Formeln 16, 20 oder 24 umfassen oder einen Teil des nicht-kodierenden Bereichs am 5'- oder 3'-Ende der Nukleotidsequenz.
Die oben beschriebene DNA kann zum Nachweis der Klonierung der DNA, die für die Apoptose-induzierenden Polypeptide kodiert oder als Primer in der PCR verwendet werden.
Die oben beschriebene DNA kann außerdem als diagnostischer DNA-Nachweis bei der Detektion oder Quantifizierung der Polypeptide gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung in den Geweben oder Zellen nach Markierung der DNA mit einem Enzym wie z.B. der Meerrettich-Peroxidase (horse radish peroxidase, HRPO), einem Radioisotop, einer fluoreszenten Substanz oder einer chemilumineszenten Substanz verwendet werden.
Die DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist bezüglich ihres Herstellungsprozesses oder ihrer Quelle nicht beschränkt. Mit anderen Worten kann die DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung eine DNA sein, die auf Grundlage einer der Formeln 13 bis 24 (SEQ ID NRN. 13 bis 24) oder SEQ ID NRN. 99 bis 102, 25 und 27 chemisch synthetisiert wurde; oder eine DNA, die aus einer geeigneten DNA-Bibliothek kloniert wurde.
Die chemische Synthese der DNA gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Unterteilen der gewünschten Nukleotidsequenz in Bereiche, die jeweils etwa 20 Nukleotide umfassen, durch Bezugnahme auf eine der Formeln 13 bis 24 und SEQ ID NRN. 99 bis 102, 25 und 27 durchgeführt werden; durch Synthetisieren der Fragmente, die diesen Regionen entsprechen, mit einem chemischen DNA-Synthetisierer (z.B. 394, Perkin-Elmer Japan K.K.); durch Annealen der so synthetisierten Fragmente nach optionaler Phosphorylierung des 5'-Endes der Fragmente; und durch Ligieren der so annealten Fragmente, um die gewünschte DNA herzustellen.
Die Isolierung der neuen DNA gemäß der vorliegenden Erfindung aus einer DNA-Bibliothek kann z.B. durch ein Verfahren ausgeführt werden, in dem eine geeignete genomische DNA-Bibliothek oder cDNA-Bibliothek mit Hilfe einer Hybridisierung oder eines Immunscreenings unter Verwendung eines Antikörpers gescreent wird; dadurch, dass die so gescreenten Klone, die das DNA-Fragment von Interesse haben, kultiviert werden und anschließend das DNA-Fragment unter Verwendung von Restriktionsenzymen und dergleichen ausgeschnitten wird.
Die Hybridisierung kann durch Markieren eines DNA-Fragmentes, das den gesamten Teil oder einen Anteil der Nukleotidsequenz einer der zuvor genannten Formeln 13 bis 24 und SEQ ID NRN. 99 bis 102, 25 und 27 enthält, mit ³²P oder dergleichen ausgeführt werden und durch anschließendes Durchführen des Screenings einer beliebigen cDNA-Bibliothek unter Verwendung des markierten DNA-Fragments als Probe in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren (z.B. siehe Maniatis T. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).
Im Hinblick auf den in dem Immunscreening zu verwendenden Antikörper kann der Antikörper gemäß dem neunten Aspekt der vorliegenden Erfindung, der später beschrieben werden wird, verwendet werden.
Die neue DNA gemäß der vorliegenden Erfindung kann außerdem durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) unter Verwendung einer genomischen DNA-Bibliothek oder einer cDNA-Bibliothek als Template erhalten werden.
Das heißt, die neue DNA gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Herstellen von Sense- und Antisense-Primern auf der Grundlage irgendeiner der Nukleotidsequenzen der zuvor genannten Formeln 13 bis 24 oder SEQ ID NRN. 99 bis 102, 25 und 27 und durch Durchführen der PCR unter Verwendung einer DNA-Bibliothek in Übereinstimmung mit jedem bekannten Verfahren (z.B. siehe Michael A.I. et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990) erhalten werden.
Jede Art von DNA-Bibliothek kann in den oben erwähnten verschiedenen Verfahren verwendet werden, vorausgesetzt, dass es das DNA-Fragment gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, wie z.B. eine kommerziell erhältliche DNA-Bibliothek oder eine cDNA-Bibliothek, die aus geeigneten Zellen hergestellt wurde, welche die DNA enthalten und die geeignet sind, eine cDNA-Bibliothek in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren zu erhalten (vgl. Sambrook J. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989).
Wenn eine DNA-Nukleotidsequenz zur Verfügung gestellt wird, sind eine RNA-Sequenz und die komplementäre DNA- und RNA-Sequenz automatisch festgelegt. Infolgedessen werden eine RNA-Sequenz, welche dem DNA-Fragment gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung entspricht und ein DNA- und RNA-Fragment, das eine Sequenz aufweist, die komplementär zu dem DNA-Fragment gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, ebenfalls durch die Offenbarung der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt.
Die DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann einzelsträngig sein oder eine doppelsträngige oder dreifachsträngige Kette durch die Bindung eines DNA- oder RNA-Fragments bilden.
Die neue DNA kann außerdem mit einem Enzym, wie z.B. der Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase, HRPO), einem radioaktiven Isotop, einem fluoreszenten Material, einem chemilumineszenten Material oder dergleichen markiert sein.
Die neue DNA gemäß der vorliegenden Erfindung kann zur Herstellung des neuen Polypeptids gemäß dem ersten und dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung in großem Maßstab verwendet werden. Ein Beispiel für das Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung, das von der neuen DNA Verwendung macht, wird später im Zusammenhang mit dem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben werden. Die neue DNA kann außerdem zur Untersuchung des Expressionszustandes des neuen Proteins gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung in Geweben, zur Markierung des Fragments mit einem Enzym oder dergleichen, wie oben beschrieben, verwendet werden. Durch Bestätigen der Expressionsmenge des neuen Proteins gemäß dem ersten und dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung in Zellen unter Verwendung der neuen DNA können Zellen und Kulturbedingungen für die Zellen, die für die Verwendung bei der Herstellung des neuen Proteins gemäß dem ersten und dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung geeignet sind, bestimmt werden.
Außerdem kann die neue DNA gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Gentherapie von Krankheiten, in denen der Mechanismus der Apoptose erblich bedingt zerstört ist, wie z.B. bei Autoimmunkrankheiten und dergleichen, durch Einführen des DNA-Fragments in Zellen des lebenden Körpers verwendet werden.
Darüber hinaus ist es außerdem möglich, ein pharmazeutisches Antisense-Mittel auf Grundlage der Nukleotidsequenz, die in der neuen DNA gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten ist, zur Verwendung bei der Regulation der Expression des Fas-Liganden im lebenden Körper zu entwickeln. Das heißt, es ist möglich, die Expression des Fas-Liganden unter Zuhilfenahme eines Oligonukleotids oder eines Derivates davon, das eine Sequenz enthält, die komplementär zu einer der Nukleotidsequenzen der zuvor erwähnten Formeln 13 bis 24 oder SEQ ID NRN. 25, 99 bis 102 und 27 ist, zu regulieren. Verfahren für die Herstellung von pharmazeutischen Antisense-Zusammensetzungen werden später im Zusammenhang mit dem zehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung detailliert beschrieben werden.
Als Nächstes wird ein rekombinantes DNA-Molekül als ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Das rekombinante DNA-Molekül gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes DNA-Molekül, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die zuvor beschriebene neue DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält. Das rekombinante DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung kann jegliche Form wie z.B. eine zirkuläre, lineare oder ähnliche Struktur haben. Außerdem kann das rekombinante DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung für jeden Zweck verwendet werden. Zum Beispiel kann es verwendet werden, wenn das neue Polypeptid gemäß dem ersten und dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung hergestellt wird oder wenn die neue DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung amplifiziert und in einer großen Menge hergestellt wird.
Wenn nötig, kann das rekombinante DNA-Molekül gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung eine weitere Nukleotidsequenz zusätzlich zu der neuen DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthalten. Beispiele für die "weitere Nukleotidsequenz", wie hierin verwendet, schließen eine Enhancer-Nukleotidsequenz, eine Promotor-Nukleotidsequenz, eine Ribosomen-Bindungssequenz, eine Nukleotidsequenz, die zum Zwecke der Erhöhung der Kopienzahlen verwendet wird, eine Nukleo tidsequenz, die ein Signalpeptid kodiert, eine Nukleotidsequenz, die ein anderes Polypeptid kodiert, eine Adenylierungsstelle, eine Splicingsequenz, einen Replikationsursprung und eine Nukleotidsequenz eines Gens, das als Selektionsmarker verwendet werden soll, ein. Die Notwendigkeit dieser Nukleotidsequenzen wird abhängig von der Verwendung des rekombinanten DNA-Moleküls bestimmt. Vorzugsweise jedoch kann das rekombinante DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung wenigstens einen Replikationsursprung und ein Markergen zusätzlich zu der neuen DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthalten. Beispiele für das Markergen schließen das Ampicillin-Resistenzgen, Kanamycin-Resistenzgen, Neomycin-Resistenzgen, Thymidinkinasegen und dergleichen ein.
Ein bevorzugtes Beispiel für das rekombinante DNA-Molekül ist ein Molekül, das E. coli transformieren kann, so dass das neue Protein gemäß dem ersten und dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung in den Wirtszellen exprimiert werden kann. Es wird daher bevorzugt, dass das rekombinante DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung wenigstens einen E. coli-Replikationsursprung, ein Markengen und eine Promotorsequenz, die in E. coli-Zellen funktionieren, zusätzlich zu dem neuen DNA-Fragment gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält. Außerdem kann es vorzugsweise zusätzlich zu diesen Sequenzen eine Sequenz enthalten, die ein Signalpeptid kodiert. Ideale Beispiele für die Promotorsequenz, die in E. coli-Zellen funktioniert, schließen den trp-Promotor und den lac-Promotor ein, und ideale Beispiele für das Signalpeptid, das in E. coli-Zellen funktioniert, schließen das Signalpeptid der alkalischen Phosphatase von E. coli ein.
Ein weiteres bevorzugtes Beispiel für das rekombinante DNA-Molekül ist ein Molekül, das eukaryontische Zelle wie z.B. Hefezellen, Insektenzellen, tierische Zellen und ähnliche transformieren kann, so dass das neue Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung in den Wirtszellen exprimiert werden kann. Es wird daher bevorzugt, dass das rekombinante DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung wenigstens ein Markergen, eine Adenylierungsstelle und eine Promotorsequenz, die in eukaryontischen Zellen funktioniert, zusätzlich zu dem neuen DNA-Fragment gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält. Ideale Beispiele für den Promotor, der in eukaryontischen Zellen funktionieren, schließen den Alkoholoxidase (AOX)-1-Promotor ein, der in Hefe funktioniert, den Polyhedrin-Promotor, der in Insektenzellen funktioniert und den SV40- Promotor, SRα-Promotor und humanen Elongationsfaktor 1α (EF-1α)-Promotor, die in tierischen Zellen funktionieren. Bevorzugter kann das rekombinante DNA-Molekül weiterhin einen E. coli-Replikationsursprung enthalten.
Das rekombinante DNA-Molekül gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann durch Einführen des neuen DNA-Fragmentes gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung in einen beliebigen Vektor erhalten werden. In diesem Schritt kann die neue DNA wie es die Umstände verlangen mit einer optionalen Sequenz in einen Vektor eingeführt werden. Alternativ kann das rekombinante DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung durch Ausführen einer Ligation des neuen DNA-Fragments gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung mit einem DNA-Fragment, das eine beliebige Nukleotidsequenz enthält, erhalten werden. Das Einführen eines DNA-Fragments in einen Vektor kann in Übereinstimmung mit jedem bekannten Verfahren durchgeführt werden (z.B. siehe Sambrook J. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Das heißt, ein DNA-Fragment und ein Vektor werden jeweils mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und die resultierenden Fragmente werden einer Ligation unter Verwendung von DNA-Ligase unterzogen. Der Vektor kann irgendein Plasmidvektor sein, ein Phagenvektor, Virusvektor und dergleichen. Zum Beispiel kann er ausgewählt sein aus pUC118, pBR322, pSV2-dhfr, pBluescript II, PHIL-S1, λZap II, λgt10, pAc700, YRP17, pEF-BOS, pEFN-II und dergleichen.
Als Nächstes wird ein Transformant gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Der Transformant gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass er mit dem neuen DNA-Fragment gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung transformiert ist. Mit anderen Worten ist der Transformanten gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass er durch direktes Einführen des neuen DNA-Fragments gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung in geeignete Zellen oder Mikroorganismen, die als Wirt verwendet werden, transformiert wurde.
Das Einführen des neuen DNA-Fragments gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung in Wirtszellen kann durch jedes der bekannten Verfahren wie z.B. Elektroporation, Protoblasten-Verfahren, Alkalimetall-Verfahren, Calciumphosphat-Präzipitation, DEAE-Dextran-Verfahren, Mikroinjektion und ein Verfahren, in dem Viruspartikel verwendet werden [siehe Jikken Igaku (Experimental Medicine) Anhang, Idenshi Kogaku (Gene engineering) Hand Book, 20. März 1991, Yohdo-sha), durchgeführt werden.
Der Transformant gemäß der vorliegenden Erfindung kann zum Zwecke der Herstellung des neuen DNA-Fragments gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung in großen Mengen verwendet werden. Darüber hinaus produziert der resultierende Transformant das neue Polypeptid gemäß dem ersten und dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung, wenn die neue DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung stromabwärts eines geeigneten Promotors in die Wirtszellen integriert wird. Folglich kann ein solcher Transformant zum Zwecke der Herstellung des neuen Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Als Nächstes wird ein weiterer Transformant gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Der Transformant gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass er durch Einführen des rekombinanten DNA-Moleküls gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung in Zellen oder Mikroorganismen, die als Wirt verwendet werden, transformiert wurde. In diesem Fall ist es notwendig, ein rekombinantes DNA-Molekül auszuwählen, das für den Wirt geeignet ist. Mit anderen Worten sollte das genannte rekombinante DNA-Molekül durch Einführen des neuen DNA-Fragments gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung in einen Vektor, der für den Wirt geeignet ist, erhalten werden. Außerdem sollte das genannte rekombinante DNA-Molekül einen Promotor, eine Nukleotidsequenz, die ein Signalpeptid kodiert, ein Markergen und ähnliches, das für den Wirt geeignet ist, enthalten. Beispiele für bevorzugte Kombinationen von Vektoren und Wirten schließen pUC118 mit E. coli, pEF-BOS mit COS-Zellen oder CHO-Zellen, Yac mit Hefen und AcNPV mit Sf-Zellen ein [siehe Jikken Igaku (Experimental Medicine) Anhang, Idenshi Kogaku (Gene engineering) Hand Book, 20. März 1991, Yohdo-sha).
Ähnlich wie in dem Fall der Herstellung des Transformanten gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das Einführen des rekombinanten DNA-Moleküls gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung in Wirtszellen durch jedes der bekannten Verfahren, wie z.B. Elektroporation, Protoblasten-Verfahren, Alkalimetall-Verfahren, Calciumphosphat-Präzipitation, DEAE-Dextran-Verfahren, Mikroinjektion und ein Verfahren, in dem Viruspartikel verwendet werden [siehe Jikken Igaku (Experimental Medicine) Anhang, Idenshi Kogaku (Gene engineering) Hand Book, 20. März 1991, Yohdo-sha) ausgeführt werden.
Der zu transformierende Wirt kann entweder eine prokaryontische oder eine eukaryontische Zelle sein. Typische Beispiele für prokaryontische Zellen schließen solche von Escherichia coli und Bacillus subtilis ein. Typische Beispiele für eukaryontische Zellen schließen tierische Zellen wie z.B. CHO-Zellen, HeLa-Zellen, COS-Zellen, Namalwa-Zellen und dergleichen ein, Insektenzellen wie z.B. Sf-Zellen und dergleichen und Hefezellen.
Der Transformant gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann durch Transformieren jeder beliebigen Zellart erhalten werden, jedoch vorzugsweise durch Transformieren von E. coli, tierischen Zellen oder Hefe. Als tierische Zellen wird ein dhfr-Deletionsmutant von CHO-Zellen aufgrund seiner Fähigkeit, die Gen-Kopienzahlen zu erhöhen, bevorzugt. Im Hinblick auf Hefezellen wird ein Stamm, der zu dem Genus Pichia gehört, aufgrund der hohen Expressions- und Sekretionsmenge an exogenem Polypeptid bevorzugt.
Der Transformant gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann zum Zwecke des Erhaltens des neuen DNA-Fragments gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung in großen Mengen und der Herstellung des neuen Polypeptids gemäß dem ersten und dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Der genannte Transformanten kann für jeden Zweck verwendet werden, vorzugsweise jedoch für die Herstellung des neuen Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung.
Mit anderen Worten ist ein bevorzugter Transformant gemäß der vorliegenden Erfindung ein Transformant, der das neue Polypeptid gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung produziert.
Bevorzugter ist der Transformant gemäß der vorliegenden Erfindung ein Transformant, welcher das neue Polypeptid in das Kulturmedium sezerniert.
Der Transformant, der fähig ist, das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren und zu sezernieren, kann durch Transformieren von Wirtszellen mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das die neue DNA gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung sowie eine ein Signalpeptid kodierende Sequenz, die an das 5'-Ende dieses DNA-Fragmentes angefügt ist, umfasst, erhalten werden.
Ein bevorzugtes Beispiel für den Transformanten gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein E. coli-Stamm, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, das in einem DNA-Molekül, das fähig ist, als Vektor zu fungieren, wenigstens einen Replikationsursprung, einen Promotor, der in E. coli-Zellen funktioniert, ein Markergen, eine Nukleotidsequenz, die ein Signalpeptid wie z.B. das der alkalischen Phosphatase aus E. coli oder ein ähnliches kodiert sowie das neue DNA-Fragment gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält. Ein weiteres bevorzugtes Beispiel des Transformanten gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Säugerzelllinie, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, das in einem DNA-Molekül, das fähig ist, als Vektor zu fungieren, wenigstens einen Marker, eine Adenylierungsstelle, einen Promotor, der in Säugerzellen funktioniert und das neue DNA-Fragment gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält. Außerdem ist als Transformant gemäß der vorliegenden Erfindung ein Hefestamm bevorzugt, der zu dem Genus Pichia gehört, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, das in einem DNA-Molekül, das fähig ist, als Vektor zu fungieren, wenigstens einen AOX1-Promotor, ein Markergen und das neue DNA-Fragment gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält.
Als Nächstes wird ein Produktionsverfahren als ein siebter Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Das Produktionsverfahren gemäß dem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptids gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass der Transformant gemäß dem fünften oder sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Ein Verfahren zur Herstellung des Transformanten wurde bereits beschrieben.
Gemäß dem Herstellungsverfahren wird der Transformant gemäß dem fünften oder sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung zunächst kultiviert. In diesem Schritt wird die Amplifikation und die Expressionsinduktion des Gens von Interesse ausgeführt, wie es die Umstände verlangen. Als Nächstes wird die resultierende Kulturmischung gewonnen, um das neue Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung durch Durchführen einer Konzentration, Löslichmachen, Dialyse, verschiedener Arten von Chromatografie und dergleichen zu reinigen.
Die zur Verwendung in diesem Herstellungsprozess zu transformierenden Wirte sind nicht besonders beschränkt. Jedoch kann ein bevorzugter Transformant durch Transformieren eines Wirtes, der aus Säugerzellen wie z.B. CHO-Zellen und dergleichen, Hefe und E. coli ausgewählt ist, erhalten werden.
Das Kultivieren des Transformanten kann auf gewöhnliche Weise mit Verweis auf verschiedene veröffentlichte Publikationen und Bücher durchgeführt werden (z.B. "Biseibutsu Jikken-ho" (Microbial Experiments), Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin, 1992). Die Verfahren und die Notwendigkeit zur Amplifikation und Expressionsinduktion des Gens variieren abhängig von der Art des Wirtes und dem zu verwendenden Promotor. Zum Beispiel kann die Induktion mit 3b-Indolacrylsäure durchgeführt werden, wenn der Promotor ein trp-Promotor ist, mit Dexamethason im Falle des MMTV-Promotors oder mit Methanol im Falle des AOX1-Promotors.
Andererseits kann das Gen von Interesse, wenn der Wirt dhfr^–-CHO-Zellen sind und der bei der Transformation zu verwendende Vektor dhfr⁺ enthält, durch Behandeln des Transformanten mit Methotrexat amplifiziert werden.
Beispiele für die Kultivierung und die Expressionsinduktion für den Fall, dass E. coli, CHO-Zellen oder ein Hefestamm, der zu dem Genus Pichia gehört, als Wirt für jeden Transformanten verwendet werden, sind unten gezeigt.
Im Falle eines E. coli-Stammes, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, das einen trp-Promotor enthält, werden die Zellen in L-Nährlösung vorkultiviert, in M9-CA-Medium in 1/50 des Volumens angeimpft und anschließend bei 37°C kultiviert. Wenn der OD₅₅₀-Wert des Mediums mehrere Stunden nach Beginn der Kultivierung 1 bis 4 erreicht (nämlich die logarithmische Wachstumsphase), wird 3b-Indolacrylsäure mit einer Endkonzentration von 10 μg/ml dazugegeben, um die Expressionsinduktion zu bewirken. Durch Weiterführen der Kultivierung für etwa 1 bis 2 Tage wird eine Kulturmischung erhalten, die das Polypeptid von Interesse enthält.
Wenn ein Pichia-Stamm verwendet wird, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, das den AOX1-Promotor enthält, werden die Hefezellen etwa 2 Tage lang in BMGY-Medium vorkultiviert und nachdem das Medium ausgewechselt wurde, wird Methanol zur Bewirkung der Expressionsinduktion dazugegeben. Durch Weiterführen der Kultivierung bei 30°C für etwa 2 Tage wird eine Kulturmischung erhalten, die das Polypeptid von Interesse enthält.
Im Falle eines Transformanten von Säugerzellen wie z.B. CHO-Zellen oder dergleichen, die mit einem Expressionsplasmid transformiert wurden, das einen Elongationsfaktor-Promotor enthält, wird der Transformant in D-MEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium), das 10 % fötales Rinderserum enthält, kultiviert. Die Zellen werden mit einer Dichte von etwa 5 × 10⁴ Zellen/ml inokuliert und bei 37°C in einer Atmosphäre von 5 % CO₂/95 % Luft kultiviert. Wenn die Zellen im Allgemeinen nach 2 bis 3 Tagen der Kultivierung konfluent werden, wird das Medium durch serumfreies DMEM ausgetauscht. Durch Fortführen der Kultivierung für 2 bis 3 Tage wird eine Kulturmischung erhalten, die das Polypeptid von Interesse enthält. Wenn die Produktivität des Polypeptids von Interesse gering ist, ist es möglich, die Produktivität in der zuvor erwähnten Weise durch Verwendung von dhfr^–-CHO-Zellen und durch Amplifizieren des Gens mit Methotrexat zu erhöhen.
Gemäß dem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Kulturmischung" einen Kulturüberstand oder eine Zelle. Das heißt, wenn der Transformant das Polypeptid von Interesse in das extrazelluläre Milieu sezerniert, wird das neue Polypeptid von Interesse gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung aus dem Kulturüberstand gewonnen und gereinigt.
Andererseits werden die Zellen, wenn sich das neue Polypeptid in den Wirtszellen akkumuliert, durch Lysozym-Behandlung, Behandlung mit Tensiden, Einfrieren und wieder Auftauen, Druckbehandlung oder ähnliche Mitteln aufgeschlossen und einer Zentrifugation unterzogen, um die Überstandsflüssigkeit zu gewinnen, aus der unnötige Zelltrümmer und dergleichen durch Filtration oder ähnliche Maßnahmen anschließend entfernt werden, und die Überstandsflüssigkeit wird als Material zur Reinigung des neuen Polypeptids gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet. Wenn der zu verwendende Transformant E. coli ist und sich das produzierte neue Polypeptid in dem periplasmatischen Raum der Zellen ansammelt, kann das Polypeptid von Interesse z.B. mit Verweis auf die Verfahren nach Willsky et al. (J. Bacteriol., Band 127, Seiten 595–609, 1976) gereinigt werden.
Das neue Polypeptid gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann aus der Kulturmischung durch Auswählen der geeigneten Methoden, die gewöhnlich für die Reinigung eines Polypeptids verwendet werden, wie z.B. dem Aussalzen, der Ultrafiltration, isoelektrischen Präzipitation, Gelfiltration, Elektrophorese, Ionenaustauschchromatographie, verschiedenen Arten von Affinitätschromatographie, wie z.B. der hydrophoben Chromatografie, der Antikörper-Chromatografie und ähnlichen, dem Chromatofocusing und der reversen Phase-Chromatografie, ebenso wie durch ein HPLC-System und ähnliches, wie es die Umstände verlangen, gereinigt werden. Diese Reinigungsschritte können in jeder geeigneten Reihenfolge angewendet werden. Ein bevorzugtes Beispiel für das Reinigungsverfahren wird später im Zusammenhang mit dem achten Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben werden.
Gemäß dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann das neue Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung durch den Transformant in Form eines Fusionspolypeptids mit einem anderen Polypeptid hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine hohe Produktivität von einem allgemein verwendeten Verfahren erwartet werden, in dem ein DNA-Fragment, das für ein Polypeptid von Interesse kodiert, mit einer stromabwärts gelegenen Stelle eines anderen DNA-Fragments verbunden ist, das E. coli β-Galaktosidase kodiert und in dem das Polypeptid von Interesse als ein Fusionspolypeptid mit β-Galaktosidase exprimiert wird.
Wenn das neue Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung in Form eines Fusionspolypeptids mit einem anderen Polypeptid exprimiert wird, ist es notwendig, einen zusätzlichen Schritt zwischen bestimmten Schritten des Reinigungsverfahrens einzufügen, um das neue Polypeptid durch Behandeln des Fusionspolypeptids mit einer chemischen Substanz wie z.B. Cyanogenbromid oder ähnlichem oder ein Enzym, wie z.B. einer Protease oder dergleichen, zu behandeln.
Darüber hinaus kann, wenn der zu verwendende Transformant ein E. coli-Stamm ist und das neue Polypeptid in Form von Einschlusskörperchen produziert wird, was ein unlösliches Protein ist, ein geeigneter Schritt des Reinigungsverfahrens von einer Prozedur gefolgt sein, in dem der Einschlusskörper einem Löslichmachen, Denaturieren und Renaturieren unterzogen wird (Thomas E. und Creighton J., Molecular Biology, Band 87, Seiten 563–577, 1974).
Veranschaulichend dargestellt werden die Transformanten zuerst aufgeschlossen und einer Zentrifugation unterzogen, um das resultierende Pellet zu gewinnen. Als Nächstes wird zu dem Pellet ein Solubilisierungspuffer gegeben, der geeignete Mengen an Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, ein oberflächenaktives Mittel, reduziertes Glutathion und oxidiertes Glutathion enthält (z.B. ein Puffer, der 5 M Guanidinhydrochlorid, 0,005 Tween 80, 50 mM tris-Hydrochlorid (pH 8,0), 5 mM EDTA, 2 mM reduziertes Glutathion und 0,02 M oxidiertes Glutathion enthält), gefolgt von der Zugabe von 2-Mercaptoethanol, um eine Denaturierung zu bewirken. Anschließend wird die Renaturierung durch Dialysieren der resultierenden Lösung gegen den obengenannten Solubilisierungspuffer, in dem Guanidinhydrochlorid fehlt, bewirkt. Wenn es als Fusionspolypeptid exprimiert wird, wird der unnötige Polypeptidanteil nach dieser Behandlung unter Verwendung einer chemischen Substanz wie z.B. Cyanogenbromid oder dergleichen, oder ein Enzym, wie z.B. Protease oder dergleichen abgeschnitten und entfernt, und das so freigesetzte neue Polypeptid von Interesse wird anschließend einer geeigneten Chromatografie unterzogen.
Als Nächstes wird ein achter Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Der achte Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung des neuen Polypeptids gemäß dem ersten und dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung aus einer Probe, die das neue Polypeptid gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, dass wenigstens ein Schritt, ausgewählt aus den folgenden Reinigungsschritten, durchgeführt wird:

(1) eine Affinitätschromatographie, die ein Fas-Antigen verwendet, und
(2) eine Affinitätschromatographie, die einen Antikörper verwendet, der das neue Polypeptid gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung erkennt.

Das Reinigungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch jeden einzelnen der obigen Schritte (1) und (2) oder durch beide ausgeführt werden. Alternativ kann es durch eine Kombination von anderen Reinigungsverfahren mit wenigstens einem der obigen Schritte (1) und (2) ausgeführt werden. Vorzugsweise jedoch können einer der obigen Schritte (1) und (2) oder beide Schritte in beliebiger Reihenfolge vor oder nach einem allgemein verwendeten Verfahren zur Reinigung von Proteinen durchgeführt werden.
Zum Beispiel kann das neue Polypeptid gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung durch Anwenden einer Chromatografie, in der ein Lectinadsorbierter Träger verwendet wird, zusätzlich zu einem der obigen Schritte (1) oder (2), mit hoher Reinheit erhalten werden.
Der Begriff "eine Probe, die das neue Polypeptid gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält" bezeichnet jegliche Probe, vorausgesetzt, dass sie das genannte neue Polypeptid enthält. Zum Beispiel kann es sich um einen Kulturüberstand von Zellen handeln, ein Zelllysat oder eine Körperflüssigkeit, wie z.B. Urin, Blut oder ähnliches.
Bei der Ausführung der Affinitätschromatographie gemäß dem obigen Schritt (1) ist es notwendig, das Fas-Antigen an einen geeigneten Träger zu adsorbieren. Das zu verwendende Fas-Antigen kann jeglicher tierischer Herkunft sein, vorausgesetzt, dass es an das Polypeptid von Interesse bindet. Es wird jedoch bevorzugt, humanes Fas-Antigen zu verwenden, wenn das Polypeptid von Interesse, das gereinigt werden soll, wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz der zuvor erwähnten Formeln 1 bis 4 enthält, oder Fas-Antigen der Ratte oder Fas-Antigen der Maus, wenn das Polypeptid von Interesse wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz der zuvor erwähnten Formel 5 bis 8 enthält, oder Fas-Antigen der Maus, wenn das Polypeptid von Interesse wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz der zuvor erwähnten Formeln 9 bis 12 enthält.
Der Träger, an den das Fas-Antigen adsorbiert wird, ist nicht besonders beschränkt. Wenn das Fas-Antigen an einen Träger gebunden wird, wird das Fas-Antigen direkt an den Träger oder über einen Spacer gebunden. Alternativ kann das Fas-Antigen indirekt an den Träger gebunden werden, durch Herstellen des Fas-Antigens als Fusionspolypeptid mit einem anderen Polypeptid und durch Binden eines Teils des Fusionspolypeptids, der einen anderen Teil als die Fas-Antigen-Komponente darstellt, an einen bindbaren Träger. Zum Beispiel kann ein in der genannten Affinitätschromatographie zu verwendender Fas-Antigen-adsorbierter Träger leicht durch Herstellung des Fas-Antigens als ein Fusionspolypeptid mit der konstanten Domäne von Immunoglobulin und durch Adsorbieren des Fusionspolypeptids an einen Protein A-adsorbierten Träger, der in einer Säule gepackt ist, unter Ausnutzung der Eigenschaft von Immunglobulin, an Protein A zu binden, erhalten werden.
Um die Affinitätschromatographie des obigen Schrittes (2) durchzuführen, kann ein neuer Antikörper gemäß dem neunten Aspekt der vorliegenden Erfindung, der später beschrieben werden wird, verwendet werden. Das heißt, der genannte neue Antikörper wird an einen geeigneten Träger, wie z.B. Agarose oder dergleichen, direkt oder über einen Spacer binden gelassen, und der resultierende Träger wird in eine Säule zur Verwendung in der Affinitätschromatographie gefüllt.
In diesem Fall schließen Beispiele des zuvor erwähnten Lectin-adsorbierten Trägers ConA-adsorbierte Träger ein. Da Produkte, in denen ConA an Agaroseträger und der gleichen adsorbiert ist, kommerziell erhältlich sind, kann es praktisch sein, nach beliebiger Auswahl eines dieser Produkte zu verwenden.
Die Affinitätschromatographie der obigen Schritte (1) oder (2) oder die Affinitätschromatographie, in der ein Lectin-adsorbierter Träger verwendet wird, kann durch wahlweises Auswählen einer Elutionslösung aus Lösungen, die bei der Polypeptidreinigung zu verwenden sind und durch Überprüfen der Menge an Polypeptid von Interesse in den eluierten Fraktionen durchgeführt werden. Das Vorhandensein des neuen Polypeptids gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann durch Messen der cytotoxischen Aktivität gegenüber Fas-Antigen-exprimierenden Zellen oder mit Hilfe von EIA unter Verwendung eines Antikörpers, der das neue Polypeptid gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung erkennt, bestätigt werden. Der Antikörper, der das neue Polypeptid gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung erkennt, wird in dem folgenden neunten Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Als Nächstes wird ein neuer Antikörper als ein neunter Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Der neue Antikörper gemäß dem neunten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass er an das neue Polypeptid gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung bindet.
Der neue Antikörper gemäß dem neunten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann entweder ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper sein, vorausgesetzt, dass er an das neue Polypeptid gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung bindet.
Antikörper, nämlich Immunglobuline, haben eine Struktur, die H- und L-Ketten umfasst und werden in 5 Klassen eingeteilt (IgG, IgA, IgM, IgD und IgE), abhängig von ihren physicochemischen und immunologischen Eigenschaften. Von diesen Klassen werden IgG und IgA weiter in Subklassen unterteilt, abhängig von den Arten von H-Ketten. Der neue Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kann zu jeder dieser Klassen und Subklassen gehören. Darüber hinaus wird Immunglobulin in F(ab')₂- und Fc'-Fragmente unterteilt, wenn es mit Pepsin hydrolysiert wird, oder in Fab- und Fc-Fragmente, wenn es mit Papain hydrolysiert wird. Der neue Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kann entweder ein vollständiges Antikörpermolekül sein oder ein Teilfragment davon, vorausgesetzt, dass er/es an das neue Polypeptid gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung bindet. Außerdem kann der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung in Form eines chimären Antikörpers vorliegen.
Der neue Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kann entweder als polyklonaler Antikörper oder als monoklonaler Antikörper mit Verweis auf veröffentlichte Verfahren erhalten werden [siehe z.B., Men-eki Jikken Sosa-ho (Procedures for Immunological Experiments), The Japanese Society for Immunology]. Im Folgenden wird das Verfahren kurz beschrieben.
Um den neuen Antikörper zu erhalten, wird das neue Polypeptid gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung als immunisierendes Antigen in ein Tier geimpft, wenn notwendig mit einem geeigneten Adjuvans, wie z.B. dem Freund's kompletten Adjuvans (FCA) oder dem Freund's unvollständigen Adjuvans (FIA) oder dergleichen, wenn nötig gefolgt von einem Booster in Intervallen von 2 bis 4 Wochen. Nach Abschluss des Boosters wird Blut gewonnen, um ein Antiserum zu erhalten. Das neue Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung, das als das Antigen verwendet werden soll, kann durch jegliches Verfahren erhalten werden, vorausgesetzt, dass es eine solche Reinheit aufweist, dass es für die Herstellung des Antikörpers verwendet werden kann.
Wenn das neue Polypeptid, das als immunisierendes Antigen verwendet wird, von geringem molekularem Gewicht ist, wie z.B. ein Polypeptid, das aus etwa 10 bis 20 Aminosäureresten zusammengesetzt ist, kann ein solches Polypeptid nach seiner Bindung an einen Träger wie z.B. keyhole limpet hemocyanin (KLH) oder ähnliches verwendet werden. Das Tier, das mit dem neuen Polypeptid immunisiert werden soll, ist nicht besonders beschränkt, es kann vorzugsweise jedoch aus Tierarten ausgewählt werden, die fähig sind, den Antikörper von Interesse herzustellen, wie z.B. Ratte, Maus, Kaninchen, Schaf, Pferd, Hausgeflügel, Ziege, Schwein, Rind und dergleichen, die im Allgemeinen bei immunologischen Experimenten verwendet werden.
Der polyklonale Antikörper kann durch Reinigen des so erhaltenen Antiserums durch wahlweise Kombination bekannter Reinigungsverfahren wie z.B. dem Aussalzen, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und dergleichen erhalten werden.
Der monoklonale Antikörper kann auf folgende Weise erhalten werden. Das heißt, Antikörperproduzierende Zellen wie z.B. Splenozyten, Lymphozyten und ähnliche werden aus dem immunisierten Tier gewonnen und mit Myelomzellen oder dergleichen fusioniert, um aus ihnen Hybridomzellen durch ein bekanntes Verfahren herzustellen, in dem Polyethylenglycol, Sendai-Virus, elektrische Pulse und dergleichen verwendet wird. Anschließend wird ein Klon, der fähig ist, einen Antikörper zu produzieren, der an das neue Protein der vorliegenden Erfindung bindet, ausgewählt und kultiviert, und der monoklonale Antikörper von Interesse wird aus dem resultierenden Kulturüberstand gewonnen. Die Reinigung kann durch wahlweise Kombination bekannter Reinigungsverfahren wie z.B. dem Aussalzen, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und dergleichen ausgeführt werden.
Der neue Antikörper kann außerdem mit Hilfe gentechnologischer Verfahren erhalten werden. Das heißt, mRNA wird von Splenozyten oder Lymphozyten eines Tieres isoliert, das mit dem neuen Polypeptid gemäß dem ersten oder dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung immunisiert wurde, oder aus dem Hybridom, das fähig ist, einen monoklonalen Antikörper zu produzieren, der spezifisch für das neue Polypeptid gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, und eine cDNA-Bibliothek wird unter Verwendung der so isolierten mRNA hergestellt. Anschließend wird ein Klon, der fähig ist, einen Antikörper zu produzieren, der mit dem Antigen reagiert, aus der cDNA-Bibliothek ausfindig gemacht und kultiviert, um einen Kulturüberstand zu erhalten, aus dem der Antikörper von Interesse durch Kombination bekannter Reinigungsverfahren gereinigt wird.
Der neue Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Aktivität zur Modifikation der Funktion des Fas-Liganden auf Zellen aufweisen. Unter den Antikörpern, die eine Aktivität zur Modifikation der Funktion des Fas-Liganden auf Zellen haben, ist ein Antikörper am bevorzugtesten, der eine Aktivität zur Inhibierung der Fas-Liganden-induzierten Apoptose hat . Solch ein Antikörper kann die Fas-Liganden-induzierte Apoptose vollständig oder teilweise inhibieren.
Um einen Antikörper zu erhalten, der eine Aktivität zur Inhibition der Fas-Liganden-induzierten Apoptose hat, werden Sera, die während des zuvor erwähnten Herstellungsprozesses für polyklonale oder monoklonale Antikörper erhalten wurden oder Kulturüberstände der zuvor erwähnten Hybridomzellen durch ihre Untersuchung in einem Assay-System wie z.B. einem in-vitro-Assay-System, in dem Fas-Ligand oder Fas-Ligand-exprimierenden Zellen und Fas-Antigen-exprimierende Zellen verwendet werden, gescreent. Anschließend wird der Antikörper von Interesse aus einer Serumprobe oder einem Kulturüberstand, der als Ergebnis des Screenings erhalten wurde, durch Kombination bekannter Reinigungsverfahren gereinigt. Ein bevorzugtes Beispiel für das Screeningverfahren, in dem der Fas-Ligand oder Fas-Ligand-exprimierende Zellen und Fas-Antigen-exprimierende Zellen verwendet werden, wird später im Zusammenhang mit dem elften Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben werden.
Der Antikörper, der fähig ist, die Fas-Ligand-induzierte Apoptose vollständig oder teilweise zu inhibieren, kann bei der Regulation der Apoptose im lebenden Körper verwendet werden. Zum Beispiel kann der genannte Antikörper als pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Krankheiten verwendet werden, in denen die Apoptose von Geweben und Zellen stattfindet, wie z.B. dem Abbau von Gelenkgeweben bei Rheumatismus, Selbstzerstörung von Gewebe beim systemischen Lupus erythematodes (SLE), Diabetes mellitus, Influenza, AIDS, Hepatitis und dergleichen.
Als Nächstes wird ein zehnter Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Der zehnte Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Oligonukleotid oder ein Derivat davon, das eine Nukleotidsequenz enthält, die komplementär zu einem Teil des Gens eines Fas-Liganden oder eines Teils der mRNA für einen Fas-Liganden ist. Das genannte Oligonukleotid oder Derivat davon kann als dessen Nukleotidsequenz entweder nur die genannte komplementäre Nukleotidsequenz oder weitere Basen und Nukleotidsequenzen, wie z.B. eine Ribozymsequenz und dergleichen, zusätzlich zu der komplementären Nukleotidsequenz enthalten.
Der Begriff "Gen eines Fas-Liganden", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Gen, das eine einen Fas-Liganden kodierende DNA enthält, einschließlich nicht nur einer Fas- Liganden-kodierenden Region, sondern auch dessen regulatorischer Region. Die regulatorische Region meint beide der Regionen, die stromaufwärts und stromabwärts der Fas-Liganden-kodierenden Region liegen. Der Begriff "mRNA für den Fas-Liganden" bezeichnet eine mRNA, die eine einen Fas-Liganden kodierende Nukleotidsequenz enthält. Die genannte mRNA schließt ein mRNA-Molekül ein, das nicht nur die Fas-Liganden-kodierende Nukleotidsequenz enthält, sondern auch nicht-kodierende Regionen, die stromaufwärts und stromabwärts der Nukleotidsequenz liegen.
Wie in den 16 bis 18 gezeigt, ist die Fas-Liganden-kodierende chromosomale DNA aus Introns und Exons zusammengesetzt. Wenn ein DNA-Fragment, das Introns und Exons enthält, in mRNA transkribiert wird, werden die Introns und Exons zunächst so transkribiert, dass sie eine prä-mRNA bilden. Anschließend werden die Teile, die den Introns entsprechen, durch Spleißen eliminiert, um eine reife mRNA zu bilden, in der nur die Exons transkribiert sind. Der Begriff "mRNA für den Fas-Liganden", wie hierin verwendet, bezeichnet sowohl die prä-mRNA als auch die reife mRNA.
Der Begriff "ein Teil des Gens eines Fas-Liganden oder ein Teil der mRNA für den Fas-Liganden", wie hierin verwendet, bezeichnet irgendeinen Teil, der in dem Fas-Liganden-Gen oder der mRNA für den Fas-Liganden enthalten ist, unabhängig von deren kodierenden und nicht-kodierenden Bereichen und Intron- und Exon-Stellen.
Gemäß dem zehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der "Fas-Ligand" jeglicher tierischer Herkunft sein, stammt jedoch vorzugsweise aus dem Menschen, der Ratte oder der Maus. Humaner Fas-Ligand wird besonders bevorzugt, wenn dessen Anwendung in diagnostischen Arzneimitteln und pharmazeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen wird.
Eine Nukleotidsequenz in und um den kodierenden Bereich des humanen Fas-Liganden wird in den 16 bis 18 gezeigt. Nukleotidsequenzen, die in reifen mRNAs für den humanen Fas-Liganden, im Fas-Liganden der Ratte und im Fas-Liganden der Maus enthalten sind, werden durch Erstzen von T durch U in der DNA-Sequenz der SEQ ID NRN. 99 bis 102, 25 und 27, welche diese Liganden jeweils kodieren, erhalten.
Der Begriff "komplementäre Nukleotidsequenz", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Nukleotidsequenz, die komplementäre Basenpaare basenspezifisch für die Nukleotidsequenz der DNA oder mRNA ausbildet. Es ist allgemein bekannt, dass die komplementären Basenpaare zwischen C (Cytosin) und G (Guanin), T (Thymin) und A (Adenin) und U (Uracil) und A (Adenin) geformt werden. Folglich wird eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu dem humanen Fas-Liganden-Gen ist und Nukleotidsequenzen, die komplementär zu den reifen mRNAs für den humanen Fas-Liganden, den Fas-Liganden der Ratte und den Fas-Liganden der Maus sind, jeweils durch Ersetzen des A durch T, C durch G, G durch C und T durch C oder A durch U, C durch G, G durch C und T durch A in den in den 16 bis 18 und den SEQ ID NRN. 30, 25 und 27 gezeigten Nukleotidsequenzen erhalten. Eine DNA- und RNA-Sequenz, die komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, die den humanen Fas-Liganden der SEQ ID NR. 30 kodiert, ist in SEQ ID NR. 28 bzw. 29 gezeigt. In diesem Fall schließt die "komplementäre Nukleotidsequenz" nicht nur solche ein, die aus C, G, A, T und U zusammengesetzt sind, sondern auch solche, die Derivate dieser Basen enthalten.
Das Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung schließt jedes Oligonukleotid ein, das aus einer Vielzahl von Nukleotiden zusammengesetzt ist, die jeweils Basen, Phosphorsäure und Zucker enthalten. Typische Beispiele sind DNA und RNA.
Das Oligonukleotidderivat der vorliegenden Erfindung schließt jedes Derivat ein, dessen stereochemische Struktur und Funktion analog zu dem Oligonukleotid sind. Beispiele für solche Derivate schließen ein Derivat ein, das aus der Bindung einer exogenen Substanz an das 3'- oder 5'-Ende des Oligonukleotids resultiert, ein Derivat, das aus der Substitution oder Modifikation von wenigstens einer der Basen, Zuckerreste und Phosphatkomponenten des Oligonukleotids resultiert, ein Derivat, das aus dem Einschluss einer Base, eines Zuckers oder einer Phosphorsäurekomponente, die nicht in der Natur existieren, resultiert und ein Derivat, das ein Rückgrat enthält, das ein anderes als Phosphodiester ist.
Vorzugsweise hat das Oligonukleotid oder Derivat davon gemäß dem zehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einem Teil des Fas-Liganden-Gens oder einem Teil der mRNA für den Fas-Liganden ist und mit diesem Gen und dieser mRNA hybridisiert.
Das Oligonukleotid oder Derivat davon, das mit dem Fas-Liganden-Gen oder der mRNA für den Fas-Liganden hybridisiert, kann als diagnostische Oligonukleotid-Sonde für die Untersuchung des Vorhandenseins und des Expressionszustands des Fas-Liganden-Gens in Geweben und Zellen verwendet werden.
Bevorzugter hybridisiert das Oligonukleotid oder Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung mit dem Fas-Liganden-Gen oder der mRNA für den Fas-Liganden und weist eine Aktivität zur Kontrolle der Expression des Fas-Liganden auf.
Ein Verfahren zur Kontrolle der Expression eines Proteins unter Verwendung eines Oligonukleotids, das eine Nukleotidsequenz enthält, die komplementär zu einer DNA oder mRNA ist, die das Protein kodiert, ist eine Technik, die Antisense-Verfahren genannt wird, die zur Zeit von vielen Forschern untersucht wird. Es wird angenommen, dass ein Oligonukleotid, das eine komplementäre Sequenz aufweist, die Expression eines Proteins durch Ausüben eines Einflusses auf den normalen Fluss des Transfers genetischer Informationen über dessen Bindung an eine DNA oder mRNA, die die genetische Information enthält, ausübt, wobei die Bindung während einem der folgenden Schritte auftritt: bei der (1) Transkription des Gens zur prä-mRNA, (2) der Prozessierung der prä-mRNA in reife mRNA, (3) dem Passieren der reifen mRNA durch die Kernmembran und (4) der Translation in Protein.
Wie vorangehend beschrieben wird angenommen, dass die Ursache des Zelltodes im Falle von AIDS und Hepatitis die Fas-Antigen-vermittelte Apoptose ist. Folglich kann ein Oligonukleotid oder ein Derivat davon, das fähig ist, die Expression des Fas-Liganden zu inhibieren, für die Behandlung von Krankheiten, an denen eine Fas-Liganden-vermittelte Apoptose beteiligt ist, wie z.B. AIDS und Hepatitis, ebenso wie dem Abbau von Gelenkgewebe beim Rheumatismus, der Selbstzerstörung des Gewebes beim systemischen Lupus erythematodes (SLE), Diabetes mellitus, Influenza und dergleichen verwendet werden.
Anderseits kann ein anderes Oligonukleotid oder Derivat davon, das fähig ist, die Expression des Fas-Liganden zu verstärken, für die Entfernung von Zellen, die für den lebenden Körper unnötig sind, verwendet werden, z.B. für die Behandlung von AIDS in einem frühren Stadium der Infektion und zur Inhibierung des anormalen Wachstums der Synovialmembranzellen beim Rheumatismus oder der Vermehrung von Autoantigen-reaktiven T-Zellen in Autoimmunkrankheiten. Folglich sind sowohl Oligonukleotide, welche die Expression des Fas-Liganden inhibieren, als auch Oligonukleotide, welche die Expression des Fas-Liganden verstärken, auf dem Gebiet der medizinischen Versorgung nützlich. Am bevorzugtesten jedoch kann das Oligonukleotid oder ein Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung eine Funktion zur Inhibierung der Expression des Fas-Liganden aufweisen.
Das Oligonukleotid oder Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit irgendeinem Teil des Fas-Liganden-Gens oder der mRNA hybridisieren. Im Allgemeinen wird angenommen, dass eine Hybridisierung leicht erreicht werden kann, wenn sie auf die Schlaufenkomponente von Stamm- und Schlaufen-bildender mRNA (stem loop-forming mRNA) gerichtet ist [Y. Shoji, Rinsho Men-eki (Clinical Immunology), Band 25, Seiten 1200–1206, 1993], nämlich im Falle eines Oligonukleotids oder Derivates davon, das eine Sequenz hat, die komplementär zu der Sequenz dieser Regionen ist.
Außerdem wird von Oligonukleotiden, die an Translations-Initiations-Codon-Bereiche, die ribosomale Bindungsstelle, die Cappingstelle und Splicingstelle binden, d.h. von Oligonukleotiden, die Sequenzen haben, die komplementär zu den Sequenzen dieser Stellen sind, erwartet dass sie eine starke Inhibitionswirkung auf die Expression haben [Gan to Kagaku Ryoho (Cancer und Chemotherapy), Band 20, Nr. 13, Seiten 1899–1907]. Folglich kann von dem Oligonukleotid oder Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung ein höherer Inhibitionseffekt der Expression erwartet werden, wenn es an den Bereich des Translations-Initiations-Codons des Fas-Liganden-Gens oder der mRNA, die Ribosomen-Bindungsstelle, die Capping-Stelle oder Splicingstelle bindet, nämlich dann, wenn es eine Sequenz enthält, die zu jeder dieser Stellen komplementär ist.
Wenn dessen Anwendung in der diagnostischen und pharmazeutischen Verwendung betrachtet wird, kann das Oligonukleotid und Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise die Funktion aufweisen, mit dem Fas-Liganden-Gen oder der mRNA auf spezifische Weise zu hybridisieren.
Im Allgemeinen wird von einer Nukleotidsequenz, die 15 oder mehr Basen enthält, angenommen, dass sie eine Sequenz mit hoher Spezifität ist (K. Yokoyama, Protein, Nucleic acid and Enzyme, Band 38, Seiten 754–765, 1994). Folglich kann von dem genannten Oligonukleotid oder Derivat davon eine spezifische Bindung an das Fas-Liganden-Gen oder die mRNA für den Fas-Liganden erwartet werden, wenn es eine Nukleotidsequenz enthält, die komplementär zu dem Fas-Liganden-Gen oder der mRNA für den Fas-Liganden ist und aus 15 oder mehr Basen zusammengesetzt ist.
Andererseits ist eine zu große Länge nicht geeignet für das Einführen des Oligonukleotids in Zellen. Folglich wird, wenn das Oligonukleotid oder Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung zur Kontrolle der Expression des Fas-Liganden durch dessen Einführen in Zellen verwendet wird, bevorzugt, dass das genannte Oligonukleotid oder Derivat davon eine Sequenz enthält, die komplementär zu dem Fas-Liganden-Gen oder die mRNA für den Fas-Liganden ist und 15 bis 30 Basen, vorzugsweise 15 bis 25 Basen, bevorzugter 18 bis 22 Basen umfasst.
Mit dem Fortschritt bei der Antisense-Methode mit dem Ziel, die Wirkungen der Oligonukleotide als pharmazeutische Herstellungen zu verbessern, wurden verschiedene Oligonukleotidderivate gefunden, wie z.B. solche, die eine verbesserte Affinitäten für DNA oder mRNA von Interesse aufweisen, ebenso wie solche, die eine verbesserte Gewebeselektivität aufweisen, eine verbesserte Zellpermeabilität, Nukleaseresistenz und intrazelluläre Stabilität.
Wie zuvor beschrieben, schließt das "Oligonukleotidderivat" gemäß der vorliegenden Erfindung jegliche Arten von Derivaten ein, einschließlich solcher, die eine Base, einen Zucker, eine Phosphorsäurekomponente und eine Rückgratstruktur enthalten, die nicht in der Natur vorkommen.
Beispiele für allgemein bekannte Derivate schließen solche ein, in denen der gesamte Teil oder ein Anteil der Rückgratstruktur eine Phosphodiesterbindung, Phosphorthioatbindung, Phosphotriesterbindung, Methylphosphonatbindung, Phosphoramidatbindung, Phosphordithioatbindung oder Morpholingruppe aufweist [Y. Shoji, Gan to Kagaku Ryoho (Cancer und Chemotherapy), Band 20, Seiten 1899–1907, 1993]. Außerdem sind Polyamid-Nukleinsäuren (polyamide-nucleic acid, PAN) eingeschlossen (P.E. Nielsen et al., Science, Band 2 54, Seiten 1497–1500, 1991) und bestimmte Derivate, in denen die 2'-Position des Zuckers durch ein anderes Atom oder einen anderen Substituenten (α-Ribose und dergleichen) ersetzt ist (Michael J. Gait, Seiten 290–299; in Antisense Research and Applications, CRC Press Inc, Florida, 1993).
Ebenfalls als Oligonukleotidderivate bekannt sind solche, in denen die Zuckerkomponente durch eine andere Substanz ersetzt ist, bestimmte Basen durch Inosin ersetzt sind (universelle Base genannt wegen deren Fähigkeit, an A, T, C und G zu binden) und Cholesterol, Acridin, Poly-L-lysin, Psoralen, lange Alkylketten und dergleichen an das 5'- oder 3'-Ende oder innerhalb eines Oligonukleotids angefügt sind (Makoto Matsukura, Seiten 506–519, Paul S. Miller et al., Seiten 190–202; in Antisense Research and Applications, CRC Press Inc, Florida, 1993).
Das Oligonukleotidderivat gemäß der vorliegenden Erfindung schließt sämtliche Derivate ein, einschließlich der oben erläuterten Derivate. Jedoch kann das genannte Oligonukleotidderivat vorzugsweise ein Derivat sein, in dem wenigstens eines der Folgenden verbessert ist: seine Nukleaseresistenz, Gewebsselektivität, Zellpermeabilität und Affinität.
In besonders bevorzugter Weise ist das genannte Oligonukleotidderivat ein Derivat, das eine Phosphorthioatbindung als dessen Rückgratstruktur hat.
Im Folgenden wird ein Verfahren zur Herstellung des Oligonukleotids und dessen Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Oligonukleotide und ihre Derivate können durch bekannte Verfahren hergestellt werden (siehe z.B. Antisense Research and Applications, herausg. durch Stanley T. Crooke und Bernald Lebleu, CRC Press Inc, Florida, 1993).
Im Falle einer natürlichen DNA oder RNA kann das Oligonukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung durch chemische Synthetisierer oder durch Durchführen einer PCR unter Verwendung des Fas-Liganden-Gens als Template erhalten werden. Außerdem können bestimmte Oligonukleotidderivate, wie z.B. die des Methylphosphonat-Typs, des Phosphorthioat-Typs und dergleichen unter Zuhilfenahme eines chemischen Syntheti sierers (z.B., Modell 394 Perkin-Elmer Japan) synthetisiert werden. In diesem Fall kann ein Oligonukleotid von Interesse oder dessen Derivat ebenfalls durch Betätigen eines chemischen Synthetisierers in Übereinstimmung mit dem dazugehörigen Handbuch und durch Reinigen des so synthetisierten Produktes mit Hilfe einer HPLC, unterstützt durch eine reverse Chromatografie oder ähnlichem, erhalten werden.
Als Nächstes wird die Verwendung des Oligonukleotids und eines Derivates davon gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Wenn das Oligonukleotid und ein Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung als diagnostische Sonden verwendet werden, werden sie mit einem Radioisotop, einem Enzym, einem fluoreszenten Material, einem lumineszenten Material oder dergleichen in Übereinstimmung mit einem gewöhnlich verwendeten Verfahren markiert. Als Nächstes wird DNA oder mRNA aus den Zellen eines Patienten, der auf Expression des Fas-Liganden untersucht werden soll, präpariert, die so hergestellte DNA oder mRNA als zu testende Probe wird mit der markierten Sonde, die wie oben hergestellt wurde, zur Reaktion gebracht und anschließend wird die Reaktionsmischung gewaschen, um nicht reagierte markierte Sonde zu entfernen. Wenn das Fas-Liganden-Gen oder die RNA in der zu testenden Probe vorhanden ist, bindet das genannte Oligonukleotid oder Derivat davon an das Gen oder die RNA. Das Vorhandensein des so gebundenen Produktes kann durch Verwendung des markierten Enzyms, fluoreszenten Materials, lumineszenten Materials oder Radioisotops als Marker detektiert werden.
Da in den letzten Jahren von einem Zusammenhang zwischen der Expression des Fas-Liganden und Autoimmunkrankheiten und von ähnlichen Informationen berichtet wurde, können diagnostische Sonden, die mit Hilfe des Oligonukleotids gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, zur Diagnose von Autoimmunkrankheiten wie z.B. Rheumatismus, SLE und dergleichen verwendet werden. Darüber hinaus können solche Proben, da von dem Fas-Liganden auch angenommen wird, dass er im Zusammenhang mit der Cytotoxizität steht, die durch T-Zellen zum Zeitpunkt einer Entzündung verursacht wird, auch bei der Diagnose zur Bestimmung des Entzündungsgrades und des therapeutischen Verfahrens verwendet werden.
Wenn das Oligonukleotid und ein Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung zu pharmazeutischen Zwecken verwendet wird, ist es wünschenswert, sie mit einer Reinheit zu verwenden, die zur Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen und in pharmakologisch annehmbaren Verwendungsverfahren geeignet ist.
Das Oligonukleotid oder Derivat davon gemäß dem zehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann durch dessen direktes Auflösen oder Suspendieren in einem geeigneten Lösungsmittel verwendet werden oder durch dessen Einschluss in Liposomen oder dessen Integration in einen geeigneten Vektor. Wenn es die Umstände erfordern, kann das Oligonukleotid oder Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung in geeigneten Dosierungsformen wie z.B. Injektionen, Tabletten, Kapseln, Augentropfen, Cremes, Suppositorien, Sprays, Cataplasmen und dergleichen durch dessen Mischung mit pharmakologisch annehmbaren Zusatzstoffen wie z.B. Lösungsmitteln, Basen, Stabilisierungsmitteln, Antiseptika, Mittel zum Löslichmachen, Füllstoffen, Puffern und dergleichen verwendet werden.
Das Oligonukleotid oder Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Festlegen seines Verabreichungsverfahrens und seiner Dosis, abhängig von dem Alter und Geschlecht eines jeden Patienten und der Art und dem Grad der jeweiligen Krankheit verwendet werden. Mit anderen Worten kann es in einer Dosis verwendet werden, die wirksam bei der Kontrolle der Apoptose und folglich bei der Verbesserung krankhafter Zustände ist, durch Auswahl eines geeigneten Verabreichungsweges, ausgewählt aus der oralen Verabreichung und parenteralen Verabreichung, wie z.B. der Inhalation, perkutanen Absorption, ophthalmischen Verabreichung, vaginalen Verabreichung, intraartikulären Injektion, rektalen Verabreichung, intravenösen Injektion, topischen Anwendung, intramuskulären Injektion, subkutanen Injektion, intraperitonealen Verabreichung und dergleichen.
Zum Schluss wird ein Screeningverfahren als elfter Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Das Screeningverfahren gemäß dem elften Aspekt der vorliegenden Erfindung ist gekennzeichnet durch die Verwendung eines neuen Polypeptids gemäß dem ersten und dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung oder eines Transformanten, der so transformiert wurde, dass er die Polypeptide exprimiert.
Gemäß dem Screeningverfahren gemäß des elften Aspektes der vorliegenden Erfindung können Substanzen, die an den Fas-Liganden oder andere Substanzen, die Einflüsse auf die Expression des Fas-Liganden ausüben, binden, gescreent werden. Alle Substanzen, einschließlich Verbindungen, Peptide, Proteine, Antikörper, Nukleinsäuren und dergleichen sind von den zu screenenden Substanzen eingeschlossen.
Darüber hinaus kann unter Verwendung des Screeningverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung eine Diagnose von mit dem Fas-Liganden in Beziehung stehenden Krankheiten durchgeführt werden.
Zum Beispiel kann das Vorhandensein einer Anomalie bei der Funktion oder der Expression des Fas-Antigens in einem Patienten mit einer Autoimmunkrankheit durch Isolieren von Blutzellen oder Gewebezellen von dem Patienten, der Reaktion der isolierten Zellen mit dem Fas-Liganden oder dem Transformanten, der den Fas-Liganden exprimiert und der anschließenden Beobachtung des in den aus den Patienten isolierten Zellen erzeugten Apoptosegrades diagnostiziert werden. Im Hinblick auf das Ergebnis der Diagnose können Mittel zur Behandlung der Krankheit entsprechend ihrer Ursache ausgewählt werden.
Zusätzlich zu dem Fas-Liganden oder dem Fas-Liganden-exprimierenden Transformanten wird bevorzugt, Fas-Antigen-exprimierende Zellen in dem Screeningverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Durch die Verwendung solch eines Verfahrens können nicht nur Substanzen, die an den Fas-Liganden binden oder die Expression des Fas-Liganden verstärken oder inhibieren, sondern auch andere Substanzen, die einen Einfluss auf die Funktion des Fas-Liganden auf Zellen ausüben, Substanzen, die die Expression des Fas-Liganden verstärken oder inhibieren und ähnliche untersucht werden. Obwohl ein typisches Beispiel für die Funktion des Fas-Liganden auf Zellen die Induktion der Apoptose ist, kann das genannte Sreeningverfahren in geeigneter Weise nicht nur für das Screenen von Substanzen, welche die Apoptose verstärken oder inhibieren, sondern auch für das Screenen anderer Substanzen, welche bestimmte Veränderungen verstärken oder inhibieren, die in Fas-Antigen-exprimierenden Zellen in der Anwesenheit des Fas-Liganden erzeugt werden, verwendet werden.
Das Screeningverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann jegliche Schritte enthalten. Vorzugsweise jedoch enthält das Screeningverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung einen Schritt, der aus den folgenden Schritten (1) bis (3) ausgewählt ist:

(1) (a) ein Mittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Fas-Liganden, einem Fas-Ligand-exprimierenden Transformanten und Kulturüberstand des Transformanten, wird zusammen mit Zellen kultiviert, die Fas-Antigen exprimieren, (b) eine zu testende Substanz oder eine Probe, welche die zu testende Substanz enthält, wird zu dem obigen System (a) dazugegeben, und (c) wenigstens ein Parameter, ausgewählt aus Lebensfähigkeit, morphologischen Veränderungen und biochemischen Veränderungen in den Fas-Antigen-exprimierenden Zellen wird gemessen;
(2) (a) wenigstens eine zu testende Substanz oder eine Probe, welche die zu testende Substanz enthält, wird zusammen mit wenigstens einem Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, Transformanten, welche dieselben exprimieren und Kulturüberständen der Transformanten, inkubiert, (b) Zellen, die Fas-Antigen exprimieren, werden zu dem obigen System (a) gegeben und kultiviert, und (c) wenigstens ein Parameter, ausgewählt aus der Lebensfähigkeit, morphologischen Veränderungen und biochemischen Veränderungen in den Fas-Antigen-exprimierenden Zellen wird gemessen; und
(3) (a) eine zu testende Substanz oder eine Probe, welche die zu testende Substanz enthält, wird zusammen mit Zellen, die Fas-Antigen exprimieren, inkubiert, (b) ein Fas-Ligand, ein Transformant, der den Fas-Liganden exprimiert oder der Kulturüberstand davon wird zu dem obigen System (a) gegeben und kultiviert, und (c) wenigstens ein Parameter, ausgewählt aus Lebensfähigkeit, morphologischen Veränderungen und biochemischen Veränderungen in den Fas-Antigen-exprimierenden Zellen wird gemessen.

Verfahren zur Messung der Lebensfähigkeit, der morphologischen Veränderung oder biochemischen Veränderungen in den Fas-Antigen-exprimierenden Zellen sind nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt, dass sie solche Veränderungen detektieren können. Das Vorhandensein und der Grad der Apoptose in Fas-Antigen-exprimierenden Zellen kann auf Grundlage der Menge an freigesetztem ⁵¹Cr, das zuvor in die Fas-Antigen-exprimierenden Zellen inkorporiert wurde, gemessen werden. Die Anzahl der überlebenden Zellen, nämlich die Anzahl nicht-apoptotischer Zellen unter den Fas-Antigen-exprimierenden Zellen kann durch Färben mit Tryptan-Blau oder durch einen Assay, in dem die Bildung von Formazan als Marker verwendet wird (MTT-Assay, Almarl-Blau-Assay oder dergleichen) bestimmt werden.
Das Screeningverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise durch die Verwendung des Polypeptids gekennzeichnet, das durch eine der Formeln 1 bis 12 dargestellt wird, oder des das Polypeptid exprimierenden Transformanten.
Es wird im Allgemeinen angenommen, dass ein Membranprotein, das auf der Zelloberfläche vorhanden ist, über dessen extrazelluläre Domäne an andere Moleküle bindet. Folglich wäre es in dem Screeningverfahren gemäß dem elften Aspekt der vorliegenden Erfindung zu bevorzugen, die Polypeptide mit der Aminosäuresequenz der Formeln 1 bis 3, 5 bis 7 und 9 bis 11 sowie die Transformanten, die fähig sind, solche Polypeptide zu exprimieren, zu verwenden. Insbesondere werden die Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz der Formeln 1 bis 3 haben und die Transformanten, welche fähig sind, diese zu exprimieren, bevorzugt. Das in dem Screeningverfahren verwendete Polypeptid kann durch das für den siebten Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren hergestellt werden, und der Transformant, der fähig ist, das Polypeptid zu exprimieren, kann durch das für den fünften oder sechsten Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Gemäß dem Screeningverfahren gemäß dem elften Aspekt der vorliegenden Erfindung können Substanzen, die an den Fas-Liganden binden und andere Substanzen, die einen Einfluss auf die Expression des Fas-Liganden ausüben, untersucht werden.
Der Begriff "Substanz", wie hierin verwendet, ist nicht auf irgendwelche bestimmte Substanzen beschränkt und kann eine Verbindung, ein Peptid, ein Protein, einen Antikörper, eine Nukleinsäure oder ähnliches bezeichnen. Das Screening, wie oben beschrieben, kann außerdem bei der Diagnose von Fas-Liganden-assoziierten Krankheiten verwendet werden.
Zum Beispiel kann das Vorhandensein/Fehlen einer Anomalie bei der Funktion des Fas-Antigens eines Patienten, der an einer Autoimmunkrankheit leidet, durch Isolieren von Blutzellen oder Gewebezellen des Patienten und der Reaktion der so isolierten Zellen mit dem Fas-Liganden oder dem Transformanten, der fähig ist, den Fas-Liganden zu exprimieren, zur Beobachtung des Apoptosegrades, der in den von dem Patienten isolierten Zellen induziert wird, diagnostiziert werden. Eine geeignete Behandlung kann anschließend durch Inbetrachtziehen der Resultate einer solchen Diagnose ausgewählt werden.
Jegliche Zellarten können als Fas-Antigen-exprimierende Zellen verwendet werden, wie z.B. Zellen, in denen die Expression des Fas-Antigens durch einen Virus oder ein Arzneimittel induziert wird, wie z.B. im Falle von AIDS-Virus infizierten Zellen oder etablierte Zellen, ein Hybridom oder ein Transformant, der das Fas-Antigen exprimiert. Es wird bevorzugt, humane Fas-Antigen-exprimierende Zellen zu verwenden, insbesondere Zellen eines humanen Fas-Antigen-exprimierenden Transformanten, wie z.B. WC8-Zellen (Itoh N. et al., J. Immunol., Band 151, Seiten 621–627, 1993).
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden zur Verfügung gestellt, um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen. Es versteht sich jedoch, dass die Beispiele nur dem Zwecke der Veranschaulichung dienen und nicht als Definition der Grenzen der vorliegenden Erfindung gedacht sind.
Die in den folgenden Beschreibungen verwendeten Abkürzungen basieren auf den gewöhnlich auf verwandten technischen Gebieten verwendeten Abkürzungen.
Grundlegende Verfahren, die in den folgenden Beispielen beschrieben werden, wurden im Lichte von "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Ausgabe (Sambrook J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), "Introduction of Rekombinante Genes into Cells and Expression of the Genes" (Imamoto F. et al., Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Anhang 28 (14), 1983; auf Japanisch) und "General Cell Technological Techniques" (Okada Y., Experimental Medicine, Anhang 7 (13), 1989; auf Japanisch) ausgeführt.
(Erfinderisches Beispiel 1) Herstellung von chimärem Protein
(1) Herstellung des Expressionsplasmids pFas-FcII
Ein Plasmid, pFas-FcII, wurde zur Verwendung bei der Expression eines chimären Proteins (im Weiteren "mFas-Fc" genannt) aus der extrazellulären Domäne des Fas-Antigens der Maus (mFas) und der Fc-Region des humanen IgG1 (hlgG1) auf folgende Art und Weise hergestellt, um in dem erfinderischen Beispiel 2 verwendet zu werden.
Zunächst wurden Oligonukleotidprimer, die eine Sense-Sequenz in Intron 4 (GATTTTCAACCACTCAGTCG) SEQ ID NR. 32 und eine Antisense-Sequenz in Intron 5 (ATGCGGCCGCTGGATCCTTTGTATGAAATTGAGTAAT) SEQ ID NR. 33 des chromosomalen Fas-Antigen-Gens der Maus enthalten, chemisch synthetisiert. Letzterer Oligonukleotidprimer enthielt eine BamHI-Stelle. Unter Verwendung dieser Oligonukleotidprimer wurde eine PCR durchgeführt, die ein Plasmid, welches das chromosomale Gen des Fas-Antigens der Maus enthält (pMF3ES; annual meeting der Society of Molecular Biology, 1992), als ein Template verwendet, durchgeführt. Als Resultat wurde ein DNA-Fragment mit einer Länge von 383 bp, das flankierende Bereiche am 5'- und 3'-Ende des Exon 5 hat, amplifiziert.
Das so amplifizierte Produkt wurde mit PstI und BamHI verdaut, um ein DNA-Fragment mit 128 bp zu erhalten, welches das 3'-Ende des Exon 5 und einen Teil des Intron 5 enthält. Mit dem so erhaltenen DNA-Fragment wurde eine PstI-BamHI DNA-Fragment-Komponente eines Plasmid pMF1 (Watanabe-Fukunaga R. et al., J. Immunol., Band 148, Seiten 1274–1279, 1992) ersetzt, um ein Plasmid pMFX herzustellen.
Unabhängig davon wurde ein Plasmid pMH4, das ein Exon für die konstante Region der humanen IgG1 schweren Kette enthält (Nishimura Y. et al., Cancer Res., Band 47, Seiten 999–1005, 1987) mit HaeII verdaut, und das resultierende DNA-Fragment von 1,7 kbp Länge wurde in die XbaI-Stelle von pBluescript KS(+) subkloniert.
Dieser wurde mit HincII und ApaI verdaut, um ein DNA-Fragment von 1,4 kbp zu erhalten, das die Exons, kodierend für die Hinge-, CH₂- und CH₃-Domänen enthält. Dieses Fragment wurde in die XbaI-Stelle des zuvor genannten Plasmids pMFX insertiert, um ein Plasmid pFas-Fc herzustellen. Das Plasmid pFas-Fc wurde mit KpnI verdaut, stumpfe Enden wurden hergestellt und anschließend wurde es mit NotI verdaut. Danach wurde das so erhaltene DNA-Fragment von 2,3 kbp in einen Säuger-Expressionsvektor pEF-BOS (Mizushima S. und Nagata S., Nucleic Acids Res., Band 18, Seiten 5332, 1990) ligiert, um das Expressionsplasmid pFas-FcII von Interesse zu erhalten.
(2) Herstellung des Expressionsplasmids phTNFRβ-Fc
Ein Plasmid phTNFRβ-Fc zur Verwendung bei der Expression eines chimären Proteins (im weiteren als "hTNFRβ-Fc" bezeichnet) des TNF-Rezeptors β und der Fc-Region des humanen IgG1 wurde auf folgende Weise konstruiert, um in dem erfinderischen Beispiel 2 verwendet zu werden.
Zunächst wurde ein Plasmid p55TNFr-HG1 (Leostscher H. et al., J. Biol. Chem., Band 266, Seiten 18324–18329, 1991) mit KpnI und HindIII verdaut, um ein DNA-Fragment von 650 bp herzustellen. Das Plasmid p55TNFr-HG1 ist ein Plasmid, das eine cDNA-Sequenz enthält, welche die extrazelluläre Domäne des humanen TNF-Rezeptors (p55) angefügt an eine künstliche Splice-Donor-Sequenz enthält.
Unabhängig davon wurde das Plasmid pFas-FcII mit HincII und HindIII verdaut. Anschließend wurde ein DNA-Fragment von etwa 700 bp, das eine Sequenz enthält, die für die extrazelluläre Domäne des Fas-Antigens der Maus kodiert, mit dem zuvor erwähnten 650 bp KpnI-HindIII-Fragment ersetzt, um das Plasmid phTNFRβ-Fc von Interesse zu erhalten.
(3) Herstellung des Expressionsplasmids pBF-Fc1
Ein Plasmid pBF-Fc1 zur Verwendung bei der Expression eines chimären Proteins (im Folgenden als "hFas-Fc" bezeichnet) der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Antigens und der Fc-Region des humanen IgG1 wurde auf folgende Weise konstruiert, um in dem erfinderischen Beispiel 10 verwendet zu werden.
Zunächst wurde ein Plasmid pBLF58-1, das ein das humane Fas-Antigen-kodierende DNA-Fragment enthält (Itoh N. et al., Cell, Band 66, Seiten 233–243, 1991), mit XhoI und BamHI verdaut, um ein Fragment von 700 bp zu erhalten. Als Nächstes wurde das Plasmid pFas-Fc, das bei der Konstruktion des Expressionsvektors für das chimäre Protein mFas-Fc verwendet wurde, mit XhoI und BamHI verdaut, und das oben erhaltene 700 bp-Fragment wurde in das verdaute Produkt insertiert, um ein Expressionsplasmid pBHF-C1 zu erhalten.
Unabhängig davon wurde ein Fragment, in dem eine Intron-5-Sequenz des chromosomalen Gens des Fas-Antigens der Maus und eine BamHI-Stelle an einer Sequenz angefügt wurde, die für die extrazelluläre Domäne des humanen Fas-Antigens kodiert, durch Ausführen einer PCR unter Verwendung eines Sense-Primers 1 (ATGCCCAAGTGACTGACATCAACT) SEQ ID NR. 34 und eines Antisense-Primers 1 (GCGCGGATCCAGGAAGTGGGAAAGGATTACCTTCCTCTTTGCACTTGGTG) SEQ ID NR. 35 unter Verwendung von pBLF58-1 als Template durchgeführt.
Das so erhaltene PCR-Produkt wurde mit MscI und BamHI verdaut, und das resultierende DNA-Fragment von 360 bp wurde in pBHF-C1 insertiert, der zuvor mit MscI und BamHI verdaut wurde. Als Nächstes wurde das so erhaltene Plasmid mit KpnI verdaut, stumpfe Enden hergestellt und anschließend mit NotI verdaut, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das für die extrazelluläre Domäne des humanen Fas-Antigens und die Fc-Re gion des humanen IgG1 kodiert. Danach wurde das so erhaltene Fragment in pEF-BOS insertiert, der zuvor mit BstXI verdaut, in dem stumpfe Enden hergestellt und der anschließend mit NotI verdaut wurde, wodurch der humane Fas-Fc-Expressionsvektor pBF-Fc1 erhalten wurde.
(4) Herstellung und Reinigung des chimären Proteins
COS-7-Zellen und BTS-1-Zellen (Sedivy J.M., Biol. Technology, Band 6, Seiten 1192–1196, 1993) wurden mit den Plasmiden pFas-FcII bzw. phTNFRβ-Fc transfiziert. Die COS-7-Zellen wurden außerdem mit dem Plasmid pBF-Fc1 transformiert.
Die Transfektion der COS-7-Zellen wurde in Übereinstimmung mit dem von Fukunaga R. et al. (Cell, Band 61, Seiten 341–350, 1990) beschriebenen DEAE-Dextran-Verfahren ausgeführt. Nach Abschluss der Transformation wurden die transformierten COS-7-Zellen 24 Stunden lang in einem Medium, das 10 % FCS (fötales Kälberserum) enthielt, und anschließend 48 Stunden und 72 Stunden lang in einem serumfreien Medium inkubiert. Danach wurden die resultierenden Kulturüberstände gesammelt, zentrifugiert und durch einen 0,45 μm Filter gefiltert, um Zelltrümmer zu entfernen, und anschließend einer Säulenchromatografie unter Verwendung von Protein A-Sepharose 4B (Pharmacia) unterzogen, um die chimären Proteine mFas-Fc, hTNFRβ-Fc bzw. hFas-Fc zu reinigen.
Andererseits wurde mit Hilfe der Elektroporation eine Transfektion von BTS-1-Zellen ausgeführt (Potter H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 81, Seiten 7161–7165, 1984). Das heißt, nach dem Verdau des Plasmids pFas-FcII mit ApaLI und dem Plasmid phTNFRβ-Fc mit SacI wurden 1 × 10⁷ Zellen mit 50 μg eines jeden der resultierenden Plasmid-DNA-Fragmente zusammen mit 5 μg XhoI-verdautem pSTneoB transformiert. Nach 10 Tagen Selektion unter Verwendung von D-MEM, enthaltend 10 % FCS und 300 μg/ml G-418, wurden G-418-resistente Klone isoliert und bei 39,5°C kultiviert.
Um einen Klon zu identifizieren, der das chimäre Protein von Interesse produziert, wurden einige der isolierten Klone bei 33°C drei Tage lang kultiviert, und das in das Medium sezernierte chimäre Protein wurde durch Enzym-gekoppelte Immunabsorptionsbestimmung (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) untersucht. In dem ELISA wurde ein anti-human IgG-Fc-Antikörper (Cappel, 55071) als Empfänger-Antikörper (capture antibody) verwendet, und ein Meerrettich-Peroxidase-markierter anti-human IgG-Fc-Antikörper (Jackson Immunoresearch Lab, 109-035098) wurde als der Nachweis-Antikörper (detection antibody) verwendet.
Jeder der beiden Transformanten, die fähig sind, mFas-Fc bzw. hTNFRβ-Fc mit hoher Effizienz zu produzieren, wurde bei 39,5°C kultiviert und anschließend in einer 15 cm-Platte bis 50 % Konfluenz angeimpft. Nach 1 Woche Kultivierung bei 33°C wurden mFas-Fc bzw. hTNFRβ-Fc aus den resultierenden Kulturüberständen mit Hilfe einer Protein A-Sepharose 4B-Säule(Pharmacia)-Chromatografie gereinigt.
Als das so gereinigte mFas-Fc durch SDS-PAGE analysiert wurde, wurde eine Bande an einer Position beobachtet, die einem Molekulargewicht von 55 kD unter reduzierenden Bedingungen entspricht, und unter nicht-reduzierenden Bedingungen wurde eine Bande bei einer Position beobachtet, die einem Molekulargewicht von 110 kD entspricht. Diese Ergebnisse zeigen, dass das so erhaltene chimäre Protein mFas-Fc als ein Homodimer vorliegt, das über S-S-Bindungen gebildet wird.
(Erfinderisches Beispiel 2) Analyse mit Hilfe von Durchflusszytometrie und Selektion der d10S-2-Zellinie
(1) Biotinylierung und FITC-Markierung des chimären Proteins
Die Biotinylierung von mFas-Fc und hTNFRβ-Fc wurde unter Verwendung von Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamid)hexanoat (NHS-LC-Biotin, Pierce Chemical, 21335) in Übereinstimmung mit den Instruktionen des Herstellers ausgeführt.
Unabhängig davon wurden 1 mg hTNFRβ-Fc und 20 μg Fluoresceinisothiocyanat (FITC) in 1 ml 50 mM Natriumcarbonat-Puffer (pH 9,5) gemischt und miteinander bei Raumtemperatur 4 Stunden lang reagieren gelassen. Anschließend wurde ungebundenes FITC über eine Säulenchromatografie unter Verwendung von Sephadex G-25M entfernt, um FITC-markiertes hTNFRβ-Fc zu erhalten.
(2) Durchflusszytometrie
PC60-d10S-Zellen (im Folgenden als "d10S" bezeichnet; Rouvier E. et al., J. Exp. Med., Band 177, Seiten 195–200, 1993) wurden mit einer Färbelösung (Phosphat-gepufferte Salzlösung, im Folgenden als "PBS" bezeichnet), enthaltend 2 % FCS und 0,02 % NaN₃) gewaschen. Etwa 1 × 10⁶ Zellen wurden in 50 μl der Färbelösung, der 5 μg/ml des Ratte anti-Maus Fcγ-RII-Blocking-Antikörpers (Pharmingen) zugesetzt wurde, suspendiert. Diese Suspension wurde in Vertiefungen einer 96 well-Platte verteilt und 10 Minuten lang auf einem Eisbad inkubiert. Eine 20 μg/ml Lösung des biotinylierten mFas-Fc wurde in 50 μl-Portionen in die Vertiefungen der resultierenden Platte verteilt, und die Inkubation wurde für weitere 30 Minuten auf einem Eisbad fortgesetzt. Nach dem Waschen der Platte mit der Färbelösung wurde Phycoerythrin-markiertes Streptavidin (25-fache Verdünnung, Becton Dickinson) zu jeder der Vertiefung gegeben, der Inhalt in jeder Vertiefung wurde mit der Färbelösung auf 100 μl aufgefüllt und anschließend wurde die Reaktion 30 Minuten lang in einem Eisbad ausgeführt.
Nach dem Waschen der Zellen mit der Färbelösung wurde eine zytometrische Analyse unter Verwendung des FACScan (Becton Dickinson) ausgeführt. Als Ergebnis wurde eine leichte Verschiebung in der Fluoreszenzintensität beobachtet, die bestätigt, dass die genannten Zellen mit dem biotinylierten mFas-Fc gefärbt sind (siehe 1a). Die Kontrolle zeigte sich als offener Bereich, und die Färbung 4 Stunden vor der Behandlung mit PMA und Ionomycin als ein getupfter Bereich, und die Färbung 4 Stunden nach der Behandlung mit PMA und Ionomycin als geschlossener Bereich.
Im Gegensatz dazu wurde keine Färbung beobachtet, als die d10S-Zellen, die auf dieselbe Weise mit dem biotinylierten hTNFRβ-Fc behandelt wurden, mit Hilfe der Durchflusszytometrie analysiert wurden. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass das in dem erfinderischen Beispiel 1 hergestellte mFas-Fc in spezifischer Weise an den Fas-Liganden auf den d10S-Zellen bindet.
(3) Screening des d10S-2-Zellstamms
Insgesamt 1–3 × 10⁷ der d10S-Zellen, die eine hohe Fluoreszenzaktivität in dem obigen Schritt (2) zeigten, wurden mit dem biotinylierten mFas-Fc und dem FITC-markierten hTNFRβ-Fc auf dieselbe Weise wie oben beschrieben zur Reaktion gebracht, mit Phycoerythrin-markiertem Streptoavidin gefärbt und anschließend einer Zellsortierung unter Verwendung des FACScan (Becton Dickinson) unterzogen. Zellen, welche die Phycoerythrin-Fluoreszenz auf hohem Niveau emittierten (mehr als 0,3 bis 0,5 % der Zellen) wurden gesammelt und unter Verwendung von D-MEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium), enthaltend 10 % FCS und 50 nM 2-Mercaptoethanol, kultiviert.
Die so aussortierten Zellen wurden dem oben beschriebenen Sortierungsverfahren wiederholt unterzogen, und die schließlich selektionierte Zellgruppe wurde d10S-2 genannt. Der d10S-2-Zellstamm ist eine Gruppe hochkonzentrierter Zellen, die fähig sind, eine hohe Fas-Liganden-Expressionsmenge sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit stimulierender Agentien zu zeigen (siehe 1b).
(Erfinderisches Beispiel 3) Herstellung der cDNA-Bibliothek
Die in dem erfinderischen Beispiel 2 erhaltenen d10S-2-Zellen wurden in D-MEM, enthaltend 10 % FCS kultiviert, bis die Zelldichte 2 × 10⁵ Zellen/ml erreichte und anschließend mit 20 ng/ml PMA und 1 μg/ml Ionomycin bei 37°C 3 Stunden lang stimuliert. Nach Isolieren der Gesamt-RNA mit Hilfe des Guanidin-Isothiocyanat/Säure-Phenol-Verfahrens (Chomczynski P. und Sacchi N., Anal. Biochem., Band 162, Seiten 156–159, 1987), wurde durch zweifaches Wiederholen einer Oligo(dT)-Cellulose-Säulenchromatografie selektiv Poly (A) RNA isoliert. Unter Verwendung eines Zufalls-Hexamers oder eines Oligo(dT)-Primers wurde in Übereinstimmung mit dem Protokoll von Itoh N. et al. (Cell, Band 66, Seiten 233–243, 1991) doppelsträngige cDNA synthetisiert. Nach Zugabe eines BstXI-Adapters zu der so erhaltenen doppelsträngigen cDNA wurde mit Hilfe einer 1 % Agarose-Gelelektrophorese eine Molekulargewichtsfraktionierung ausgeführt. cDNA-Moleküle mit einer Größe von 1,5 kbp oder mehr wurden gewonnen und mit einem pCEV4-Vektor ligiert (Itoh N. et al., Cell, Band 66, Seiten 233–243, 1991), der zuvor mit BstXI verdaut wurde. Unter Verwendung des Ligationsproduktes wurden E. coli DH10B-Zellen (Gibco BRL) mit Hilfe der Elektroporation (Dower W. et al., Nucleic Acids Res., Band 16, Seiten 6127–6145, 1988) transformiert. Etwa 1,0 × 10⁶ unabhängige Klone, die aus der oligo(dT)-geprimten cDNA-Bibliothek erhalten wurden, wurden mit etwa 1,3 × 10⁶ Klonen, die aus der Zufallshexamer-geprimten cDNA-Bibliothek erhalten wurden, gemischt, um Plasmid-DNA zur Verwendung bei der Transformation von COS-7-Zellen herzustellen.
(Erfinderisches Beispiel 4) Konzentrieren des cDNA-Klons durch Panning
Die Transformation der COS-7-Zellen mit der Plasmid-DNA, die in dem erfinderischen Beispiel 3 erhalten wurde, wurde mit Hilfe der Elektroporation durchgeführt. Das heißt, 5 × 10⁶ COS-7-Zellen wurden mit K-PBS^– (eine Pufferlösung, die 30,8 mM NaCl, 120,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄ und 1,46 mM KH₂PO₄ enthält) gewaschen und in 0,4 ml K-PBS, angereichert mit 5 mM MgCl₂ (K-PBS⁺), suspendiert.
Als Nächstes wurden 40 μg der Plasmid-DNA in 0,4 ml K-PBS⁺ aufgelöst und zu der obigen Zellsuspension gegeben, und die Mischung wurde 10 Minuten lang auf einem Eisbad inkubiert. Die Elektroporation wurde durch Anlegen einer Spannung von 230 V mit einer Kapazität von 960 μF an die Zellen ausgeführt. Nach 10 bis 15 Minuten der Inkubation auf einem Eisbad wurde die Zellsuspension mit 5 ml kaltem, serumfreiem D-MEM verdünnt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Zellen auf zwei Platten geimpft, die einen Durchmesser von 10 cm haben und bei 37°C 60 Stunden lang in D-MEM enthaltend 10 % FCS kultiviert.
In dem obigen Verfahren wurden insgesamt 1,2 × 10⁸ COS-7-Zellen transformiert und in den 10 cm-Platten kultiviert. Eine Menge von 5 ml PBS/EDTA/NaN₃ (PBS, angereichert mit 0,5 mM EDTA und 0,02 % NaN₃) wurde zu jeder der resultierenden Platten gegeben und bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Die so behandelten Zellen wurden von der Platte gelöst und erneut in PBS/EDTA/NaN₃, enthaltend 3 mg/ml BSA und 2,5 μg/ml eines anti-Maus FcγII-Rezeptor-Antikörpers mit einer Zelldichte von 5–7 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert. Nach 10 Minuten Inkubation auf einem Eisbad wurde mFas-Fc mit einer Endkonzentration von 4 μg/ml dazugegeben, und die resultierende Zellsuspension wurde erneut 60 Minuten lang auf einem Eisbad inkubiert. Die so behandelten Zellen wurde mit eiskaltem PBS gewaschen und mit einer Zelldichte von 5–7 × 10⁶ Zellen/ml in PBS, angereichert mit 50 mM HEPES-Puffer (pH 8,3) und 0,2 mM Bis(sulfosuccinimidoyl)suberat (BS³, Pierce Chemical), suspendiert. Nach 30 Minuten Inkubation auf einem Eisbad wurde 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) mit einer Endkonzentration von 50 mM dazugegeben, und die resultierende Zellsuspension wurde 10 Minuten lang auf einem Eisbad inkubiert. Die so behandelten Zellen wurden mit PBS gewaschen und in 30 ml PBS/EDTA/NaN₃, dem 3 mg/ml BSA zugesetzt wurde, suspendiert, und die Suspension wurde durch ein Nylonnetz mit einer Porengröße von 100 μm gefiltert, um aggregiertes Material zu entfernen.
Die Zellsuspension wurde auf 30 Panningplatten (10 cm Durchmesser) verteilt, auf denen zuvor ein anti-human IgG-Fc-Antikörper (Cappel, 55071) immobilisiert wurde. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden nicht-adhärente Zellen durch sanftes Waschen mit PBS entfernt, und die extrachromosomale DNA wurde von den adhärenten Zellen in Übereinstimmung mit dem Protokoll von Itoh N. et al. (Cell, Band 66, Seiten 233–243, 1990) extrahiert. Unter Verwendung der so durch das erste Panning erhaltenen DNA wurde die Transformation von E. coli-Zellen mit Hilfe der Elektroporation ausgeführt, um 4,1 × 10⁶ Kolonien zu erhalten. Unter Verwendung der von diesen Kolonien präparierten Plasmid-DNA wurden 9,6 × 10⁷ COS-7-Zellen (60 Platten) transformiert.
Das zweite Panning wurde durch Verteilen der so transformierten Zellen auf 30 Panningplatten ausgeführt, und Plasmid-DNA wurde von den adhärenten Zellen auf dieselbe Weise wie bei dem ersten Panning hergestellt. Unter Verwendung der so gewonnenen Plasmid-DNA wurde die Transformation von E. coli-Zellen ausgeführt, um 8,0 × 10⁶ Klone zu erhalten. Unter Verwendung der von diesen Kolonien präparierten Plasmid-DNA wurden 4,0 × 10⁷ COS-7-Zellen (10 Platten) transformiert.
Das dritte Panning wurde durch Verteilen der so transformierten Zellen auf 30 Panningplatten ausgeführt. Plasmid-DNA wurde von den adhärenten Zellen auf dieselbe Weise wie bei dem ersten und zweiten Panning präpariert und für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet, um 3,8 × 10⁶ Klone zu erhalten. Unter Verwendung der von diesen Kolonien präparierten Plasmid-DNA wurden 1,0 × 10⁷ COS-7-Zellen (25 Platten) transformiert und auf 10 Panningplatten verteilt, um das vierte Panning durchzuführen.
Nach Fertigstellen des vierten Pannings wurde von den COS-7-Zellen extrachromosomale DNA hergestellt und für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Als die Plasmid-DNA von jedem Zellklon hergestellt und analysiert wurde, enthielten 16 der 48 Klone Plasmid-DNA-Moleküle, die jeweils ein Insert von 1,0 kbp oder mehr aufwiesen.
Jedes dieser Plasmid-DNA-Moleküle wurde in COS-7-Zellen eingeführt, die anschließend einer Färbung mit dem biotinylierten mFas-Fc unterzogen wurden und anschließend der Durchflusszytometrie in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß dem erfinderischen Beispiel 2. Als Ergebnis wurde von 5 Klonen festgestellt, dass sie gefärbt sind. 1c zeigt ein Ergebnis der Durchflusszytometrie der COS-7-Zellen (COS/pTN24-15), die mit einem dieser 5 Klone transfiziert wurden, pTN24-15, der ein Insert von 1,6 kbp enthält. Die mit pTN24-15 transfizierten COS-7-Zellen wurden nicht mit dem biotinylierten hTNFRβ-Fc gefärbt. Außerdem wurden COS-7-Zellen, die mit pCEV4 transfiziert wurden, der kein fremdes Gen aufweist, nicht mit dem biotinylierten mFas-Fc gefärbt.
(Erfinderisches Beispiel 5) Bestimmung und Analyse der DNA-Sequenz
Als die in dem erfinderischen Beispiel 4 erhaltenen 5 Klone durch Restriktionsenzymmapping analysiert wurden, wurde festgestellt, dass sie miteinander überlappend waren. Folglich wurde pTN24-15 als einer dieser 5 Klone weiter im Detail analysiert. Die Bestimmung der DNA-Sequenz wurde unter Verwendung eines DNA-Sequencers (Model 370A, Perkin-Elmer Japan) und eines Taq Dye Deoxy Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer Japan) durchgeführt.
Die Nukleotidsequenz des Klons pTN24-15 und eine von der Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz sind in den 2 und 3 und der SEQ ID NR. 25 gezeigt. Diese cDNA ist aus 1623 Basen zusammengesetzt und enthält einen offenen Leserahmen.
Obwohl die Sequenz "CCA/GCCATGG" (SEQ ID NR. 36), die von Kozak M. (J. Cell Biol., Band 115, Seiten 887–903, 1991) vorgeschlagen wurde, in dieser Sequenz nicht gefunden wurde, wurde angenommen, dass es sich bei dem ATG der Positionen 74 bis 76 um die Translations-Initiationsstelle handelt. Der offene Leserahmen wird mit dem Terminationscodon TAA der Positionen 908 bis 910 beendet. Es wurde außerdem festgestellt, dass diese cDNA 278 Aminosäurereste kodiert. Das von der Aminosäuresequenz abgeleitete Molekulargewicht beträgt 31138, mit einem isoelektrischen Punkt von 9,53.
Von den 278 Aminosäureresten, die durch die cDNA kodiert werden, wurde von einer Sequenz von 77 Aminosäureresten auf der N-terminalen Seite festgestellt, dass sie extrem reich an Prolin ist. Obwohl eine typische Signalsequenz im Bereich der N-terminalen Seite nicht gefunden wurde, bestätigte eine Hydropathieanalyse das Vorhandensein von 22 hydrophoben Aminosäureresten, die an die Prolin-reiche Region grenzen, die eine Funktion als Transmembrananchor zu haben schienen. Aufgrund des Fehlens einer Signalsequenz und des Vorhandenseins einer inneren hydrophoben Domäne wurde gemutmaßt, dass der Fas-Ligand ein Typ-II-Transmembranprotein ist.
Es wurde bestätigt, dass eine als extrazelluläre Domäne angenommene Region in der C-terminalen Seite vorhanden ist, die aus 179 Aminosäureresten zusammengesetzt ist und vier N-Glycosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr) enthält. Diese Glycosylierungsstellen sind in den 2 und 3 als * gezeigt.
Der bei der Herstellung der cDNA-Bibliothek verwendete d10S-2-Zellstamm ist ein Hybridom von Ratten- und Mauszellen. Um die Herkunft der Fas-Liganden-cDNA zu bestimmen, wurden auf Grundlage des nicht-kodierenden Bereichs des 3'-Ende der Fas-Liganden-cDNA Primer entwickelt und synthetisiert, um eine PCR auszuführen, in der Präparationen der chromosomalen DNA, die aus Splenozyten der Ratte und Maus erhalten wurden, als Templates verwendet wurden. Das heißt, in der Sequenz der SEQ ID NR. 25 wurden die Nukleotidpositionen 1006 bis 1025 und 1305 bis 1324 als Sense-Primer 2 und 3 (SEQ ID NRN. 37 und 38) verwendet und die Positionen 1327 bis 1346 und 1543 bis 1562 als Antisense-Primer 2 und 3 (SEQ ID NRN. 39 und 40). Als Ergebnis wurden Banden mit 341 bp und 258 bp Länge nur mit der chromosomalen DNA der Ratte erhalten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die cDNA aus dem Klon pTN24-15 ursprünglich von dem Ratten-Gen in den d10S-2-Hybridomzellen stammt.
In diesem Zusammenhang wurden E. coli-Zellen mit dem zuvor genannten pTN24-15 in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Hanahan D. et al. ("Techniques for Transformation of E. coli", in DNA Cloning, Band 1, herausgegeben von Glover D.M., Seiten 109–136, IRL Press, 1985) transformiert. Ein resultierender Transformant, genannt DH10B(pTN24-15), wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, hinterlegt und wurde mit der Be zeichnung FERM P-13953 versehen, der anschließend am 27. Oktober 1994 als FERM BP-4848 an die Internationale Hinterlegungsstelle transferiert wurde.
(Erfinderisches Beispiel 6) Northern-Hybridisierung
Unter Verwendung eines mRNA-Isolierungskits (Pharmacia) wurde Poly (A) RNA aus d10S, d10S-2, Rattengeweben (Hirn, Lunge, Herz, Leber, Dünndarm, Niere, Ovarien, Hoden, Skelettmuskel) und Ratten-Zellen (Splenozyten und Thymozyten) hergestellt. Die RNA wurde durch Erhitzen bei 65°C für 5 Minuten in 50 % Formamid denaturiert, einer Elektrophorese unter Verwendung von 1,5 % Agarosegel, enthaltend 6,6 % Formaldehyd unterzogen und anschließend auf eine Nitrocellulose- oder Nylon-Membran (Schleicher und Schuell) transferiert.
Als Sonde wurde mit Hilfe von PCR ein doppelsträngiges DNA-Fragment von 925 bp hergestellt, das ein DNA-Fragment der SEQ ID NR. 41, umfassend die Positionen 43 bis 967 des in dem erfinderischen Beispiel 4 erhaltenen pTN24-15, enthält, und unter Verwendung eines Random-Primer-Labelingkits (Boehringer Mannheim) mit ³²P markiert. Ein 1,8 kbp BamHI-Fragment der humanen EF1α-cDNA (Uetsuki T. et al., J. Biol. Chem., Band 264, Seiten 5791–5798, 1989) wurde mit ³²P markiert und als Kontrollsonde verwendet. Die Hybridisierung wurde unter hochstringenten Bedingungen in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Sambrook J. et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) durchgeführt.
4 zeigt die Ergebnisse der Northern-Hybridisierung, in der d10S-, d10S-2- bzw. d10S-16-Zellen mit PMA und Ionomycin stimuliert oder nicht stimuliert wurden. Wie aus 4 ersichtlich wird, zeigte die aus den d10S-Zellen erhaltene Poly (A) RNA eine schwache Hybridisierungsbande von etwa 2,0 kbp. Die Stärke des Signals dieser Bande erhöht sich, wenn die d10S-Zellen mit PMA und Ionomycin stimuliert werden. Die aus den d10S-2 Zellen erhaltene Poly (A) RNA zeigte ein Signal, das etwa 4-mal stärker war als das von den d10S-Zellen, die mit PMA und Ionomycin stimuliert wurden, erhaltene Signal, was zeigt, dass die Expressionsmenge an Fas-Liganden-mRNA in d10S-2-Zellen etwa 4-mal höher ist als in d10S-Zellen.
Im Falle der d10S-16-Zellen, die nach 16 Wiederholungen des Verfahrens gemäß dem erfinderischen Beispiel 2 erhalten wurden, war die Expressionsmenge an mRNA etwa 100-mal höher als im Falle der d10S-Zellen. Da die cytotoxische Aktivität der d10S-16-Zellen 100-mal höher war als die der d10S-Zellen, wurde festgestellt, dass die Zunahme der Expressionsmenge der mRNA für den Fas-Liganden eine positive Korrelation mit der cytotoxischen Aktivität und der Stärke der Färbung durch mFas-Fc aufweist.
5 zeigt die Ergebnisse der Northern-Hybridisierung der Splenozyten und Thymozyten, die aus der Milz und dem Thymus von Ratten hergestellt wurden, wobei die Situation direkt nach ihrer Herstellung (vor der Kultivierung), nach ihrer Kultivierung bei 37°C für 8 Stunden ohne Stimulierungsmittel (unbehandelt) und nach ihrer Kultivierung bei 37°C für 8 Stunden in Anwesenheit des jeweiligen Stimulierungsmittels verglichen wird. In den Splenozyten der Ratte wurde eine schwache Expression der Fas-Liganden-mRNA beobachtet. Wurden die Splenozyten der Ratte 8 Stunden lang mit PMA und Ionomycin oder ConA und IL-2 stimuliert, erhöhte sich die Menge der Fas-Liganden-mRNA merklich. Im Falle der Thymozyten der Ratte konnte eine Expression der Fas-Liganden-mRNA vor ihrer Kultivierung und nach der unbehandelten Kultivierung kaum festgestellt werden. Jedoch erhöhte sich die Expressionsmenge der Fas-Liganden-mRNA auf das gleiche Niveau wie im Falle der Splenozyten, wenn die Ratten-Thymozyten mit PMA und Ionomycin oder ConA und IL-2 stimuliert wurden (5).
Als die Expressionsmenge der Fas-Liganden-mRNA in jedem Gewebe der Ratte untersucht wurde, wurde eine Bande von etwa 2,0 kbp mit einem starken Signal in den Hoden festgestellt (6). Banden mit normalen oder schwachen Signalen wurden in dem Dünndarm, der Niere und Lunge festgestellt, eine Expression der Fas-Liganden-mRNA wurde jedoch nicht in anderen Geweben gefunden.
In diesem Fall waren alle mRNA-Moleküle offensichtlich intakt, da eine Bande von 1,8 kbp in sämtlichen Zellen und Geweben, die mit der humanen EF1α-cDNA-Sonde rehybridisiert wurden, festgestellt wurde (die untere Spalte in den jeweiligen 4, 5 und 6).
(Erfinderisches Beispiel 7) Biochemische Analyse des Fas-Liganden
Der in d10S-12-Zellen exprimierte Fas-Ligand und der in mit pTN24-15 transfizierten COS-7-Zellen exprimierte Fas-Ligand wurden auf ihre biochemischen Eigenschaften hin untersucht.
Die d10S-16-Zellen sind eine Zellpopulation, die nach 12 Wiederholungen des Verfahrens gemäß dem erfinderischen Beispiel 2 erhalten wurden. Zunächst wurde das Zell-oberflächenprotein der d10S-12-Zellen oder der COS-7-Zellen, die mit pTN24-15 transfiziert wurden, mit Hilfe des Verfahrens nach Meier et al. (Anal. Biochem., Band 204, Seiten 220–226, 1992), in dem D-biotinyl-ε-aminocapronsäure N-Hydroxysuccinimidester (Biotin-CNHS-Ester, Boehringer Mannheim) verwendet wird, biotinyliert. In diesem Fall wurden COS-7-Zellen, die mit dem pCEV4-Vektor transfiziert wurden, der kein extrinsisches Gen enthält, als Kontrolle für die COS-7-Zellen, die mit pTN24-15 transfiziert wurden, verwendet. Die Zellen (7,5 × 10⁶) wurden zu 1 ml eines Lysepuffers (1 % NP-40, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM (p-Aminophenyl)methylsulfonylfluoridhydrochlorid (APMSF), 1 μg/ml Pepstatin und 1 mM Leupeptin) gegeben und 30 Minuten lang auf einem Eisbad inkubiert, um die Zelllyse auszuführen.
Nach 15 Minuten Zentrifugation bei 14000 rpm wurde die resultierende Überstandsflüssigkeit mit 10 μg/ml hTNFRβ-Fc 60 Minuten lang auf einem Eisbad inkubiert und anschließend mit 5 % Volumen Protein A-Sepharose 4B 60 Minuten lang bei 4°C. Nach Entfernen der Protein A-Sepharose 4B wurde 10 μg/ml mFas-Fc zu der resultierenden Überstandsflüssigkeit gegeben und 60 Minuten lang auf einem Eisbad inkubiert. Zu der resultierenden Mischung wurde 1 % Volumen Protein A-Sepharose 4B gegeben, gefolgt von einer Über-Nacht-Inkubation bei 4°C. Nach der Zentrifugation wurde das Präzipitat mit dem Lysepuffer gewaschen, in 20 μl Laemmli's Probenpuffer (62,5 mM Tris-HCl-Puffer (pH 6,3), enthaltend 2 % SDS, 10 % Glycerol und 0,002 % Bromphenol Blau), dem 5 % 2-Mercaptoethanol zugesetzt wurde, suspendiert und 2 Minuten lang bei 95°C erhitzt. Anschließend wurde die so hergestellte Probe einer Gradienten-Gel-elektrophorese unter Verwendung eines 10 bis 20 % Gradienten-Polyacrylamidgels, enthaltend 0,1 % SDS, unterzogen, und die Proteinmoleküle wurden auf eine PVDF-Membran transferiert und mit Hilfe eines ECL-Systems (Amersham) nachgewiesen.
Wie in 7 gezeigt, immunpräzipitierte mFas-Fc mit einem Protein, das ein Molekulargewicht von etwa 40000 aufweist und in dem d10S-12-Zelllysat enthalten war und mit einem Protein, das ein Molekulargewicht von etwa 37000 bis 45000 aufweist und in dem Lysat der COS-7-Zellen, die mit pTN24-15 transfiziert waren (COS7/pTN24-15), enthalten war. Produkte einer Immunpräzipitation wurden im Falle der COS-7-Zellen, die mit dem pCEV4-Vektor transfiziert wurden, der kein fremdes Gen enthält (COS7/pCEV4), nicht festgestellt.
Das Molekulargewicht der jeweiligen Proteine, die in den mit pTN24-15 transfizierten COS-7-Zellen und in den d10S-12-Zellen immunpräzipitiert wurden, war größer als das Molekulargewicht, das von der zuvor erwähnten Aminosäuresequenz abgeleitet wurde. Es wurde angenommen, dass der Unterschied in dem Molekulargewicht zwischen diesen beiden Zellpopulationen und der Unterschied zwischen dem Molekulargewicht der immunpräzipitierten Proteine und dem Molekulargewicht, das von der Aminosäuresequenz abgeleitet wurde, auf verschiedene Glycosylierung zurückzuführen ist, die an einigen der vier N-Glycosylierungsstellen aufgetreten ist.
(Erfinderisches Beispiel 8) Messung der Cytotoxizität des Fas-Liganden
Die cytotoxischen Aktivitäten der d10S-Zellen und der mit pTN24-15 transfizierten COS-7-Zellen wurden unter Verwendung von W4-Zellen als Zielzellen gemessen (Ogasawara J., et al., Nature, Band 364, Seiten 806–809, 1993). Die W4-Zellen sind Zellen, welche die Fähigkeit zur Expression des Fas-Antigens der Maus durch Transformation von WR19L-Zellen der Maus, die kaum Fas-Antigen der Maus exprimieren können und sensitiv gegenüber der Cytotoxizität von TNF sind, erworben haben.
Die Untersuchung der cytotoxischen Aktivität wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Rouvier E. et al. (J. Exp. Med., Band 177, Seiten 195–200, 1993) ausgeführt.
Zunächst wurden d10S-Zellen (2,5–5 × 10⁵ Zellen/ml) in 10 % FCS-enthaltendem D-MEM, dem 10 ng/ml PMA (Sigma Chemical) und 500 ng/ml eines Calciumionophors, Ionomycin (Calbiochem), zugesetzt wurde, suspendiert. Nach 3 Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Zellen mit D-MEM gewaschen, um als Effektorzellen verwendet zu werden. Außerdem wurden COS-7-Zellen mit pTN24-15 durch die DEAE-Dextran-Methode transfiziert, um als Effektorzellen verwendet zu werden. Andererseits wurden 1 × 10⁶ WR19L-Zellen oder W4-Zellen in 100 μl RPMI 1640, enthaltend 10 % FCS, suspendiert und bei 37°C 2 Stunden lang zusammen mit 20 μCi [⁵¹Cr] Natriumchromat (Amersham) inkubiert. Die resultierenden Zellen wurden mit der Kulturlösung (RPMI 1640) gewaschen und als Zielzellen verwendet.
1 × 10⁴ ⁵¹Cr-markierte Zielzellen wurden mit den Effektorzellen in verschiedenen Verhältnissen in jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit rundem Boden gemischt. Das Gesamtvolumen der Zellsuspension in jeder Vertiefung wurde auf 200 μl aufgefüllt. Die so hergestellte Platte wurde bei 700 rpm 2 Minuten lang zentrifugiert und anschließend bei 37°C 4 Stunden lang inkubiert. Nach 5 Minuten Zentrifugation bei 1200 rpm wurde eine 100 μl Menge der Überstandsflüssigkeit aus jeder Vertiefung gesammelt und dessen Radioaktivität wurde unter Verwendung eines γ-Zählers gemessen, um den spezifischen Cytolyseanteil zu berechnen.
Die spontane Freisetzung von ⁵¹Cr wurde durch Inkubieren der Zielzellen allein in dem Medium bestimmt und die maximale Freisetzung wurde durch Zufügen von Triton X-100 mit einer Endkonzentration von 0,1 % zu den Zielzellen bestimmt. Der spezifische Cytolyseanteil wurde auf Grundlage der folgenden Formel berechnet.

A: experimentelle Freisetzung von ⁵¹Cr
B: spontane Freisetzung von ⁵¹Cr
C: maximale Freisetzung von ⁵¹Cr.

Wie in 9 gezeigt, haben die COS-7-Zellen, die mit pTN24-15 transfiziert wurden (COS/pTN24-15), W4-Zellen lysiert, eine Lyse der W4-Zellen wurde jedoch nicht mit anderen COS-7-Zellen beobachtet, die mit dem pCEV4-Vektor, der kein fremdes Gen aufweist, transfiziert wurden (COS/pCEV4). Wenn die cytotoxischen Aktivitäten der COS-7-Zellen, die mit pTN24-15 transfiziert wurden (COS/pTN24-15) und die d10S-Zellen durch ihr Verhältnis zu W4-Zellen (Effektorzellen/Zielzellen) verglichen werden, zeigten erstere eine wenigstens 10-mal höhere Aktivität als letztere. Außerdem zeigten sowohl die d10S-Zellen als auch die COS-7-Zellen, die mit pTN24-15 transfiziert wurden (COS/pTN24-15) keine Cytotoxizität gegenüber WR19L-Zellen (8 und 9).
(2) Cytotoxizität durch Zugabe von Kulturüberstand
10 zeigt die untersuchte cytotoxische Aktivität durch Zugabe eines Kulturfiltrats verschiedener Konzentrationen an COS/pTN24-15 (die mit pTN24-15 transfizierten COS-7-Zellen) oder COS/pCEV4 gegenüber den entsprechenden Effektorzellen (W4, WR19L).
Als die cytotoxische Aktivität eines Kulturüberstandes der COS-7-Zellen, die mit pTN24-15 transfiziert wurden (COS/pTN24-15) untersucht wurde, wurde eine signifikante Aktivität auf die W4-Zellen, jedoch nicht auf die WR19L-Zellen beobachtet (10). Dieses Ergebnis zeigt, dass der rekombinante Fas-Ligand von den COS-7-Zellen exprimiert wurde und zu einer löslichen Form gespalten wurde.
(3) Inhibition der cytotoxischen Aktivität durch mFas-Fc und hTNFRβ-Fc.
Darüber hinaus wurde die Cytotoxizität untersucht, wenn mFas-Fc und hTNFRβ-Fc zu dem Assaysystem dazugegeben wurden. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Wie 11 zeigt, wurde die Cytotoxizität der den Fas-Liganden-exprimierenden COS-7-Zellen (COS/pTN24-15) durch 10 μg/ml mFas-Fc inhibiert, jedoch nicht durch die gleiche Menge an hTNFRβ-Fc, ähnlich wie in dem Fall der d10S-Zellen.
(Erfinderisches Beispiel 9) Fragmentierung der chromosomalen DNA
Unter Verwendung einer 24 well-Platte wurden 8 × 10⁴ COS-7-Zellen in jeder Vertiefung mit 10 μg pTN24-15 transfiziert. Nach 72 stündiger Transformation wurden 2 × 10⁵ WR19L-Zellen oder W4-Zellen zu jeder Vertiefung dazugegeben und bei 37°C 1 bis 3 Stunden lang in RPMI 1640, enthaltend 10 % FCS, inkubiert. Nicht-adhärente Zellen, die sich nicht an der Wand der jeweiligen Vertiefung anlagerten, wurden gesammelt, um chromosomale DNA in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Laird P.W. et al. (Nucleic Acids Res., Band 19, Seite 4293, 1991) herzustellen, und die so hergestellte DNA wurde einer Agarosegelelektrophorese in Anwesenheit von 0,5 μg/ml Ethidiumbromid unterzogen.
Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Wie auf der Abbildung offensichtlich ist, ist die chromosomale DNA in den W4-Zellen, die mit COS-7-Zellen, die mit pTN24-15 transfiziert wurden (COS/pTN24-15), cokultiviert wurden, zu Fragmenten in einer Leiterform geworden, was ein wichtiges Merkmal der Apoptose ist.
Die DNA-Leiter wurde nach 1 Stunde Inkubation beobachtet, und die meisten Teile der DNA wurden nach 2 Stunden der Inkubation zu Fragmenten.
Solch eine Fragmentierung der DNA wurde nicht in W4-Zellen beobachtet, die mit COS-7-Zellen cokultiviert wurden, die mit pCEV4 transfiziert wurden, der kein fremdes Gen enthält. Darüber hinaus wurde eine Fragmentierung der DNA nicht in WR19L-Zellen, sondern nur in W4-Zellen festgestellt, die mit transformierten COS-7 Zellen cokultiviert wurden.
(Erfinderisches Beispiel 10) Reinigung des Fas-Liganden durch Affinitätschromatographie
(1) Biotinylierung des Zelloberflächenproteins
Um es in den folgenden Experimenten als Tracer-Protein zu verwenden, wurde eine Biotinylierung des Zelloberflächenproteins in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Meier et al. (Anal. Biochem., Band 204, Seite 220, 1992) ausgeführt. Das heißt, die in dem folgenden Schritt (3) hergestellten d10S-12-Zellen wurden in 10 mM Natriumboratgepufferter physiologischer Salzsäure, enthaltend 50 μg/ml NHS-LC-Biotin, mit einer Zelldichte von 1 × 10⁷ Zellen/ml suspendiert und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. Nach der Zugabe von Ammoniumchlorid mit einer Endkonzentration von 10 mM zur Beendigung der Reaktion, wurden die so behandelten Zellen dreimal mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, enthaltend 150 mM NaCl (pH 8,0, im Folgenden als "TBS" bezeichnet) gewaschen, wodurch die Biotinylierung des Zelloberflächenproteins bewirkt wird.
(2) Herstellung der mFas-Fc-Affinitätssäule
Eine Menge von 4 mg des gereinigten chimären Proteins, mFas-Fc, das in dem erfinderischen Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde in 4 ml PBS (pH 7,4) aufgelöst und mit 2 ml Protein A-Sepharose 4B gemischt, und die Mischung wurde bei 4°C 1 Stunde lang inkubiert, um deren Bindung zu bewirken. Um freie Proteinmoleküle zu entfernen, wurde das Harz dreimal mit TBS gewaschen und einmal mit 200 mM Natriumboratlösung (pH 9,0). Anschließend wurde das so behandelte Harz bei Raumtemperatur 45 Minuten lang in 200 mM Natriumboratlösung (pH 9,0), enthaltend Dimethylpimelimidat (DMP), inkubiert, um die kovalente Bindung des mFas-Fc an das Harz zu bewirken.
(3) Reinigung des Fas-Liganden
Die d10S-Sublinie, d10S-12, die durch 12-malige Wiederholung des Verfahrens gemäß dem erfinderischen Beispiel 2 erhalten wurde, wurde bei 37°C unter Verwendung von 10 Rollflaschen, enthaltend 10 % FCS-enthaltendes D-MEM, dem weiterhin 50 nM 2-Mercaptoethanol und 20 mM HEPES (pH 7,4) zugefügt wurden, kultiviert. Als die Zelldichte 2 × 10⁵ Zellen/ml erreichte, wurden 10 ng/ml PMA und 500 ng/ml Ionomycin dazugegeben und die Kultivierung wurde für weitere 4 Stunden fortgesetzt.
Nach Abschluss der Kultivierung wurde die Zellsuspension einer 20-minütigen Zentrifugation bei 250 × g unterzogen, um das resultierende Pellet zu gewinnen, das anschließend dreimal mit PBS und dann einmal mit TBS gewaschen wurde. Das so gewaschene Pellet wurde bei –80°C zur Verwendung bei der folgenden Herstellung der Membranfraktion gelagert. Ein Teil des Pellets wurde außerdem für die Biotinylierung des Zelloberflächenproteins, die in dem obigen Schritt (1) durchgeführt wurde, verwendet.
Das gefrorene Zellpellet wurde zu 4 Volumen 0,3 M Sucroselösung, enthaltend 1 mM p-Aminophenylmethansulfonylfluoridhydrochlorid (APMSF), 1 μg/ml Pepstatin, 1 μg/ml Leupeptin und 0,02% NaN₃, gegeben und unter Verwendung der Ultra-Turrax T25 (Janke & Kunkel, Staufen) mit Einstellung auf blau 2 Minuten lang auf einem Eisbad homogenisiert.
Die Nuklei und nichthomogenisierten Zellen wurden durch 20 minütige Zentrifugation bei 1000 × g bei 4°C entfernt. Die resultierende Überstandsflüssigkeit wurde anschließend einer 90-minütigen Zentrifugation bei 100000 × g und bei 4°C unterzogen, um eine Membranfraktion zu erhalten. Die so erhaltene Membranfraktion wurde in 40 ml eines Lysepuffers (TBS, enthaltend 1 % NP-40, 1 mM APMSF, 1 μg/ml Pepstatin und 1 μg/ml Leupeptin) aufgelöst und die Lösung wurde über Nacht bei 4°C zum Löslichmachen geschüttelt. Die so gelöste Membranfraktion wurde bei 100000 × g 60 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, und die resultierende Überstandsflüssigkeit wurde bei –80°C gelagert. Die zuvor genannten Zellen, deren Zelloberflächenprotein biotinyliert wurde, wurden ebenfalls auf die gleiche Weise behandelt und bei –80°C gelagert.
Eine Menge von 100 ml der Membranfraktion, die zur Verwendung als Tracer für den Fas-Liganden gelöst wurde, wurde mit 10 ml der gelösten Membranfraktion der biotinylierten Zellen gemischt. Die resultierende Mischung wurde auf eine mFas-Fc-Säule (1,4 ml) gegeben, die zuvor mit TBS, enthaltend 1 % NP-40, äquilibriert wurde.
Die Säule wurde mit 50 ml TBS, enthaltend 1 % NP-40 und mit 50 ml TBS, enthaltend 0,1 % NP-40 gewaschen und anschließend wurde die Elution des Fas-Liganden mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend 1 M NaCl und 0,1 % NP-40, ausgeführt.
Die Eluate wurden in 1 ml-Fraktionen gesammelt, und eine Menge von 10 μl jeder Fraktion wurde einem SDS-PAGE unterzogen und anschließend auf eine PVDF-Membran transferiert. Das biotinylierte Protein wurde gefärbt, indem es mit HRPO-markiertem Streptavidin zur Reaktion gebracht wurde und durch ein ECL-System (Amersham) in Übereinstimmung mit den Instruktionen des Herstellers detektiert wurde.
Die Fraktionen, die den 40 kD biotinylierten Fas-Liganden enthielten, wurden vereinigt und über Nacht bei 4°C zusammen mit 10 μl ConA-Agarosebeads (EY Laboratories) inkubiert. Nach 4-maligem Waschen mit TBS, enthaltend 0,1 % NP-40, wurde der Fas-Ligand mit 200 μl PBS, enthaltend 0,1 % NP-40 und 2 M α-Methylmannosid eluiert, um gereinigten Fas-Liganden zu erhalten.
(4) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Der in dem obigen Schritt (3) erhaltene gereinigte Fas-Ligand wurde einer Elektrophorese unter Verwendung eines 10 % bis 20 % Gradienten-Polyacrylamidgels mit 0,1 % SDS unterzogen, unter Verwendung eines Silber-Färbekits (Wako Pure Chemical Industries) gefärbt und auf eine PVDF-Membran transferiert und anschließend mit Hilfe des zuvor erwähnten ECL-Systems detektiert. Wie in 13 gezeigt, wurde der gereinigte Fas-Ligand als eine einzelne Bande von etwa 40 kD Molekulargewicht sowohl durch die Silberfärbung als auch durch das ECL-System unter nicht-reduzierenden Bedingungen detektiert.
Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. In der Abbildung zeigt die Spur 1 die Resultate der Silberfärbung und die Spur 2 zeigt die Nachweisergebnisse mit Hilfe des ECL-Systems.
(5) Cytotoxische Aktivität
Die cytotoxische Aktivität des gereinigten Fas-Liganden wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß dem erfinderischen Beispiel 8 gemessen. In diesem Fall jedoch wurde der gereinigte Fas-Ligand, der in dem obigen Schritt (3) erhalten wurde, anstelle der d10S-Effektorzellen und der mit pTN24-15 transfizierten COS-Zellen verwendet, und die cytotoxische Aktivität wurde unter Verwendung des spezifischen Cytolyseanteils auf die W4- und WR19L-Zielzellen als Index gemessen. Wie in 14 gezeigt, wurde keine cytotoxische Aktivität gegen WR19L-Zellen, die kein Fas-Antigen exprimieren, jedoch eine konzentrationsabhängige cytotoxische Aktivität gegen die Fas-Antigen-exprimierenden W4-Zellen festgestellt.
(Erfinderisches Beispiel 11) Screening unter Verwendung eines Teils der Fas-Liganden-DNA der Ratte
(1) Screening einer humanen chromosomalen DNA-Bibliothek
Indikatorzellen (E. coli-Stamm VCS257) wurden mit einer humanen (placentalen) chromosomalen DNA-Phagen-Bibliothek (EMBL3 SP6/T7, Clontech) infiziert, mit Weichagar gemischt und auf Agarplatten aufgebracht. Die überschichteten Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert, um die Bildung der Phagenplaques zu bewirken. Nach Abkühlen bei 4°C für etwa 4 Stunden wurden die Phagenpartikel auf Nitrocellulosefilter transferiert.
Unabhängig davon wurde eine PCR unter Verwendung des Plasmids pTN24-15, das in dem erfinderischen Beispiel 4 erhalten wurde, als Template, einer Sequenz (AGAACTCCGTGAGTTCACCA) als Sense-Primer 4 (SEQ ID NR. 42, SEQ ID NR. 43) und einer Sequenz (CAATATTCCTGGCATCCATG) als Antisense-Primer 4 ausgeführt, wodurch die Amplifikation eines cDNA-Fragmentes ausgeführt würde, welches die extrazelluläre Domäne der cDNA des Fas-Liganden der Ratte (Nukleotidpositionen 400 bis 967 der SEQ ID NR. 25) kodiert. Eine Sonde 1 (SEQ ID NR. 44) wurde durch Markieren des amplifizierten Produktes mit ³²P unter Verwendung eines Zufallsprimer-Markierungskits (Boehringer-Mannheim) in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß dem erfinderischen Beispiel 6 hergestellt. Auf dieselbe Weise wurde eine Sequenz des 5'-Endes der SEQ ID NR. 25, nämlich die Nukleotidpositionen 43 bis 233, durch PCR amplifiziert und mit ³²P markiert, um eine Sonde 2 (SEQ ID NR. 45) herzustellen.
Die oben erhaltenen Nitrocellulosefilter und die so hergestellten jeweiligen Proben wurden der Hybridisierung durch geringfügige Änderung des Verfahrens von Shaw et al. (Nucleic Acids Res., Band 11, Seiten 555–573, 1983) unterzogen. Das heißt, die Filter wurden über Nacht bei 65°C in 3 × SSC, enthaltend 0,1 % SDS, gewaschen und anschließend einer 5-stündigen Prähybridisierung bei 42°C in 5 × SSC, enthaltend 50 % Formamid, 5 × Denhardt-Lösung, 0,1 % SDS und 250 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA, unterzogen. Als Nächstes wurde die zuvor erwähnte jeweilige Sonde (1,1 × 10⁶ cpm/ml) zu 5 × SSCP, enthaltend 50 % Formamid, 1 × Denhardt-Lösung, 0,1 % SDS, 100 μg/ml denaturierte Lackssperma-DNA und 10 % (W/V) Dextransulfat, gegeben und die obigen Filter wurden einer 18-stündigen Hybridisierung bei 28°C unterzogen. Die Filter wurden zweimal mit 2 × SSCP, enthaltend 0,1 % SDS, bei Raumtemperatur gewaschen und anschließend dreimal mit 0,3 × SSCP, enthaltend 0,1 SDS, bei 37°C. Als die so behandelten Filter mit Hilfe von Autoradiografie überprüft wurden, wurde eine Mehrzahl positiver Klone detektiert.
(2) Analyse der positiven Klone -- 1
Phagen-DNA-Fragmente wurden von 2 Klonen hergestellt, λhFL4 und λhFL7, ausgewählt aus den positiven Klonen, die durch die Hybridisierung mit der Sonde 1 erhalten wurden, in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren (z.B., siehe Sambrook J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Die Klone λhFL4 bzw. λhFL7 enthielten humane chromosomale DNA-Fragmente von 18 kbp und 17 kbp, und die Ergebnisse ihrer Restriktionsenzymkartierung ergab, dass sie einen gegenseitig überlappenden Bereich aufweisen.
Ein DNA-Fragment (SEQ ID NR. 46), das den Nukleotidpositionen 524 bis 967 der SEQ ID NR. 25 entspricht, wurde von dem in dem erfinderischen Beispiel 4 erhaltenen Plasmid pTN24-15 hergestellt und mit ³²P in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß dem erfinderischen Beispiel 6 markiert, um als Sonde verwendet zu werden. Die Klone λhFL4 und λhFL7 wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und einer Southern-Hybridisierung unter Verwendung der soeben erhaltenen Sonde 3 unterzogen. Als Ergebnis hybridisierte ein 2,8 kbp HindIII-Fragment in den Klonen λhFL4 und λhFL7 mit der Sonde 3.
Von dem Klon λhFL4 wurde DNA hergestellt und mit HindIII verdaut. Das so erhaltene 2,8 kbp-Fragment wurde in einen mit HindIII verdauten pBluescript KS(+) insertiert, und das resultierende Plasmid wurde pBL-hFL4H genannt. Als die DNA-Sequenz des Plasmids pBL-hFL4H unter Verwendung eines DNA-Sequenzierers analyisiert wurde (Modell 370A, Perkin-Elmer Japan), wurde bestätigt, dass dieses Plasmid eine DNA-Sequenz enthält, welche die C-terminalen 130 Aminosäurereste der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden kodiert. Die Ergebnisse sind in 15 und SEQ ID NRN. 26, 103 und 104 gezeigt. In 15 handelt es sich bei dem Bereich bis zu der 12. Position ausgehend von dem 5'-Ende um ein Intron, die Exon-Komponente beginnt ab der 13. Position G und die Sequenz TAA von der 405. bis 407. Position ist ein Terminationscodon.
Diese Nukleotidsequenz wurde mit der Nukleotidsequenz von pTN24-15, die in dem erfinderischen Beispiel 5 analysiert wurde, verglichen und Aminosäurereste und Basen des Fas-Liganden der Ratte, die sich von denen des humanen Fas-Liganden unter schieden, wurden in 15 unterstrichen. Die bestätigte Komponente der Sequenz wies eine starke Homologie mit der Nukleotidsequenz von der 514ten bis 910ten Position der SEQ ID NR. 25 auf; 86,7 % Homologie in der Nukleotidsequenz und 81,5 % Homologie in der Aminosäuresequenz.
Ein Transformant, E. coli DH10B(pBL-hFL4H), der durch Transformieren eines E. coli-Stammes mit dem Plasmid pBL-hFL4H erhalten wurde, wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, hinterlegt und wurde mit der Bezeichnung FERM P-14014 bezeichnet und wurde anschließend an die International Depository Authority am 27. Oktober 1994 als FERM BP-4849 transferiert.
(3) Analyse der positiven Klone -- 2
Phagen-DNA wurde auf die gleiche Weise von einem Klon, λhFL5, der aus den positiven Klonen ausgewählt wurde, die durch Hybridisierung mit der Sonde 2 erhalten wurden, hergestellt. Es wurde bestätigt, dass dieser Klon ein chromosomales DNA-Fragment von 18 kbp enthält. Die DNA wurde von dem Klon λhFLS hergestellt und mit BamHI verdaut. Das so erhaltene Fragment von 4,4 kbp wurde in einen BamHI-verdauten pBluescript KS(+) eingeführt, und das resultierende Plasmid wurde pBL-hFL5B1 genannt. Als die DNA-Sequenz in dem Plasmid pBL-hFL5B1 unter Verwendung eines DNA-Sequenzierers analysiert wurde, wurde bestätigt, dass dieses Plasmid eine DNA-Sequenz enthält, die 130 Aminosäurereste, einschließlich der cytoplasmatischen Domäne des humanen Fas-Liganden, kodiert. Durch Vergleichen der so erhaltenen Nukleotidsequenz mit der Nukleotidsequenz von pTN24-15, wurden der Promotor, die Intron- und Exon-Bereiche bestimmt.
Die Ergebnisse, die in den obigen Schritten (2) und (3) erhalten wurden, sind in den 16 bis 18 gezeigt. In diesen Abbildungen ist ein Teil, der durch ----- gekennzeichnet ist, eine nicht identifizierte Nukleotidsequenz. Das chromosomale Gen für den humanen Fas-Liganden umfasst 4 Exons. Alle Splicingdonor- und Akzeptorstellen wurden der GT---AG-Regel entsprechend bestimmt (Padgett et al., Annu. Rev. Biochem. Band 55, Seiten 1119–1150, 1986). Die weiteren flankierenden Sequenzen sind in guter Überein stimmung mit bevorzugten Nukleotidfrequenzen, die in anderen gesplitteten Genen beobachtet werden.
(Erfinderisches Beispiel 12) Klonierung und Expression der den humanen Fas-Liganden kodierenden cDNA
(1) Klonieren der cDNA des humanen Fas-Liganden durch PCR
Zunächst wurden Lymphozyten, die aus peripherem menschlichem Blut gewonnen wurden, mit einer Zelldichte von 2 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640-Medium (NISSUI PHARMACEUTICAL), enthaltend 10 % FCS, 50 μm β-Mercaptoethanol und 20 ng/ml IL-2, suspendiert und über Nacht bei 37°C kultiviert. Als Nächstes wurde ConA mit einer Endkonzentration von 5 μg/ml dazugegeben, und die Kultivierung wurde für 4 Tage bei 37°C fortgesetzt. Tote Zellen wurden mit Hilfe einer Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von HistoPak 1083 (Sigma Chemical) entfernt, und Poly (A) RNA wurde unter Verwendung eines mRNA-Präparationskits (Pharmacia) hergestellt. Die Synthese einer einzelsträngigen cDNA und die PCR wurden auf die folgende Weise in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Kawasaki E.S. et al. (Amplification of RNA in PCR Protocols, A Guide to Methods and Amplifications, herausgegeben von M.A. Innis et al., Academic Press, San Diego, Seiten 21–27, 1990) ausgeführt.
Zunächst wurden ein Sense-Primer 5 (GCTCTAGACTACAGGACTGAGAAGAAGT) (SEQ ID NR. 47) und ein Antisense-Primer 5 (GCTCTAGAACATTCTCGGTGCCTGTAAC) (SEQ ID NR. 48) hergestellt. Dieser Sense-Primer enthält einen Upstream-Bereich des ATG-Initiationscodons und eine XbaI-Stelle (GCTCTAGA) am 5'-Ende. Andererseits enthält der Antisense-Primer einen Downstream-Bereich des TAA-Terminationscodons und eine XbaI-Stelle (GCTCTAGA) am 5'-Ende.
Zu 1 μg der Poly (A) RNA wurden 50 ng von Zufallshexameren und 200 Units der MMLV RNase H^– reversen Transkriptase (Gibco BRL) gegeben, und eine reverse Transkriptionsreaktion wurde durchgeführt. Eine Menge von 2,0 μl der resultierenden Reaktionslösung wurde mit 100 μl eines PCR-Puffers, enthaltend 100 pmol Sense-Primer und dieselbe Menge Antisense-Primer, 4xdNTP und Taq DNA-Polymerase, verdünnt. Die PCR wurde unter Verwendung eines DNA-Thermal-Cyclers (Perkin-Elmer) mit 20 Reaktionszyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus eine Inkubation bei 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten umfasste.
Das so erhaltene PCR-Produkt wurde mit einem Restriktionsenzym XbaI verdaut und anschließend unter Verwendung eines 1 %igen Agarosegels (Low Gel Temperature, BioRad) isoliert. Ein DNA-Fragment von etwa 970 bp wurde aus dem Gel gewonnen und in die XbaI-Stelle von pBluescript II insertiert, und das resultierende Plasmid wurde pBX-hFL1 genannt. Die DNA-Sequenz in dem Plasmid pBX-hFL1 wurde unter Verwendung eines DNA-Sequenzierers bestimmt. Es wurde bestätigt, dass die Nukleotidsequenz des 970 bp DNA-Fragments, das in diesem Plasmid enthalten war, mit der chromosomalen Gensequenz, die in dem erfinderischen Beispiel 11 erhalten wurde, übereinstimmt. Die Ergebnisse sind in SEQ ID NR. 31 und den 19 und 20 gezeigt. Es wurde festgestellt, dass es, obwohl der humane Fas-Ligand keine Signalsequenz an der N-terminalen Seite aufweist, ähnlich wie in dem Fall des Fas-Liganden der Ratte, ein Typ II-Membranprotein ist, da es 22 hydrophobe Aminosäurereste in einem zentralen Bereich seines Proteinmoleküls enthält. Die cytoplasmatische Domäne umfasst 80 Aminosäurereste, beginnend von Met, und 32 der 80 Reste sind Prolin. Die C-terminale extrazelluläre Domäne umfasst 179 Aminosäurereste und enthält 3 N-Glycosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr).
Ein Transformant, E. coli DH10B(pBX-hFL1), der durch Transformieren eines E. coli-Stamms DH10B mit dem Plasmid pBX-hFL1 in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Hanahan (siehe oben) erhalten wurde, wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt und wurde mit der Bezeichnung FERM P-14225 versehen, und anschließend an die International Depository Authority am 27. Oktober 1994 als FERM BP-4850 transferiert.
(2) Einführen in COS-Zellen
Das 970 bp XbaI DNA-Fragment, das in dem obigen Schritt (1) erhalten wurde, wurde in die XbaI-Stelle eines Expressionsvektors pEF-BOS für tierische Zellen (Mizushima & Nagata, Nucleic Acids Res., Band 18, Seite 5322, 1990) insertiert, und das resultierende Plasmid wurde pEX-hFL1 genannt. Anschließend wurden COS-7-Zellen in D-MEM- Medium, enthaltend 10 % FCS, mit einer Zelldichte von 2 × 10⁶ Zellen pro Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm angeimpft, und 5 μg des Plasmids pEX-hFL1 wurden in die Zellen eingeführt, um einen Transformanten mit dem Namen COS/pEX-hFL1 zu erhalten.
(3) Cytotoxische Aktivität des Transformanten
Die cytotoxische Aktivität der rekombinanten Zellen wurde auf dieselbe Weise gemessen, wie in dem erfinderischen Beispiel 8 beschrieben; unter Verwendung der COS-7-Zellen, die in dem obigen Schritt (2) transformiert wurden, als Effektorzellen und 10⁶ Zellen WR19L- oder WC8A-Zellen als Zielzellen. WC8A ist ein Transformant, der die Fähigkeit zur Expression des humanen Fas-Antigens durch die Transformation von Maus-WR19L-Zellen erworben hat (Itoh N. et al., J. Immunol., Band 151, Seiten 621–627, 1993).
Das heißt, 10⁶ WR19L- oder WC8A- Zellen wurden mit ⁵¹Cr durch Kultivieren der Zellen bei 37°C für 2 Stunden in RPMI 1640-Medium, enthaltend 20 μCi [⁵¹Cr] Natriumchromat (Amersham), markiert.
Die so mit ⁵¹Cr markierten Zellen (1 × 10⁴) wurden mit COS/pEX-hFL1-Zellen in verschiedenen Mischungsverhältnissen gemischt und bei 37°C 4 Stunden lang inkubiert, wobei anschließend die cytotoxische Aktivität unter Verwendung des freigesetzten ⁵¹Cr als Index gemessen wurde. Wie in 21 gezeigt, zeigte COS/pEX-hFL1 eine cytotoxische Aktivität gegenüber den WC8A-Zellen in konzentrationsabhängiger Weise. Er induzierte keine Apoptose gegen WR19L. Darüber hinaus wurde die Cytotoxizität von COS/pEX-hFL1, wie in 22 gezeigt, durch die Zugabe des chimären Proteins, welches die extrazelluläre Domäne des humanen Fas-Antigens enthält (hFas-Fc) oder das chimäre Protein, welches die extrazelluläre Domäne des Fas-Antigens der Maus enthält (mFas-Fc), das in dem erfinderischen Beispiel 1 hergestellt wurde, inhibiert, wurde jedoch nicht durch die Zugabe eines löslichen Typs des humanen TNF-Rezeptors (hTNFRβ-Fc) inhibiert.
Auf der Grundlage der obigen Ergebnisse wurde bestätigt, dass das Protein, das durch die 970 bp cDNA, die in dem obigen Schritt (1) isoliert wurde, kodiert wird, ein Fas-Ligand ist, der die Apoptose durch Binden des Fas-Antigens induziert.
Erfinderisches Beispiel 13) Isolieren des chromosomalen Gens des Fas-Liganden der Maus
Indikator-E. coli-Zellen wurden mit einer chromosomalen DNA-Bibliothek der Maus (Stratagene) infiziert, die durch Einführen von 129/Sv-Maus chromosomaler DNA in den λFIX II-Vektor hergestellt wurde. Die so infizierten Zellen wurden mit Weichagar gemischt und auf Agarplatten gegeben, um 1,3 × 10⁶ Phagenplaques zu erhalten. Nach Abkühlen bei 4°C für etwa 4 Stunden wurden die Phagenpartikel auf Nitrocellulosefilter übertragen.
Unabhängig davon wurde unter Verwendung des Plasmids pTN24-15, das in dem erfinderischen Beispiel 4 erhalten wurde, als Template, einer Sequenz (AGAACTCCGTGAGTTCACCA) als Sense-Primer 4 (SEQ ID NR. 42) und einer Sequenz (CAATATTCCTGGCATCCATG) als Antisense-Primer 4 (SEQ ID NR. 43) eine PCR ausgeführt, wodurch die Amplifikation eines cDNA-Fragments erreicht wurde, das die extrazelluläre Domäne (Nukleotidpositionen 400 bis 967 der SEQ ID NR. 25) kodiert. Eine Sonde 3 wurde durch Markieren des amplifizierten Produktes mit ³²P unter Verwendung eines Randomprimer-Labelingkits (Boehringer-Mannheim) in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß dem erfinderischen Beispiel 6 hergestellt. Auf dieselbe Weise wurde eine am 5'-Ende liegende Sequenz der SEQ ID NR. 25, nämlich die Nukleotidpositionen 43 bis 233, durch PCR amplifiziert und mit ³²P markiert, um eine Sonde 4 herzustellen.
Die im obigen Schritt erhaltene Nitrocellulosefilter und jede der so hergestellten Sonden 3 und 4 wurden der Hybridisierung unterzogen. Die Hybridisierung wurde unter milden Bedingungen ähnlich wie in dem Fall des erfinderischen Beispiels 16 ausgeführt. Das heißt, nach 18 Stunden der Hybridisierung bei 33°C wurden die Filter zweimal mit 2 × SSCP, enthaltend 0,1 % SDS, bei Raumtemperatur gewaschen und anschließend mit 0,3 × SSCP, enthaltend 0,1 % SDS, bei 37°C. Durch Behandeln der so behandelten Filter mit Autoradiografie wurden 2 positive Klone erhalten (λMFL5 und λMFL18). Jeder Plaque der positiven Klone wurde isoliert und in pBluescript IIKS(+) (Stratagene) subkloniert, um eine Restriktionsenzymkarte der insertierten Fragmente chromosomaler DNA der Maus herzustellen und die Nukleotidsequenz unter Verwendung eines DNA-Sequenzierers zu bestimmen.
Die Herstellung der Restriktionsenzymkarte für jeden dieser beiden Klone und die Analyse der Klone durch Southern-Hybridisierung ergab, dass die Klone λMFL5 bzw. λMFL18 die 5'-Bereiche und 3'-Bereiche der chromosomalen DNA des Fas-Liganden aufweisen. Als die Nukleotidsequenzen einschließlich des Promotors und des Bereiches, welcher der cDNA des Fas-Liganden der Ratte entspricht, bestimmt wurden, wies die so bestimmte Nukleotidsequenz darüber hinaus eine starke Homologie zu der cDNA des Fas-Liganden der Ratte auf, was bestätigt, dass die geklonte λDNA das Gen des Fas-Liganden der Maus enthält.
Die Nukleotidsequenz des Promotors, des Exons und der 3'-flankierenden Bereiche des Maus-Fas-Liganden-Gens sind in 23 und 24 gezeigt. Das Gen für den Fas-Liganden der Maus enthält einen offenen Leserahmen von 837 bp, beginnend an dem ATG-Initiationscodon 107 bp stromabwärts von der TATA-Box, der 279 Aminosäurereste kodiert (Molekulargewicht der Aminosäurekomponente 31440). Ähnlich wie im Fall des Fas-Liganden der Ratte weist der Fas-Ligand der Maus keine Signalsequenz in seinem N-terminalen Bereich auf, enthält jedoch 22 hydrophobe Aminosäurereste in dem zentralen Bereich des Proteinmoleküls. Es wurde daher aufgedeckt, dass der Fas-Ligand der Maus ein Typ II-Membranprotein ist. Seine cytoplasmatische Domäne besteht aus 78 Aminosäureresten, von denen 25 Prolinreste sind. Seine C-terminale extrazelluläre Domäne besteht aus 179 Aminosäureresten und enthält 5 N Glycosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr).
Außerdem wurde bestätigt, dass die cDNA des Fas-Liganden der Maus eine starke Homologie zu der cDNA des Fas-Liganden der Ratte aufweist; 90,6 % in der Nukleotidsequenz der kodierenden Region, 91,4 % in der Aminosäuresequenz und 84,5 % in der Nukleotidsequenz des 3' nicht-kodierenden Bereiches.
(Erfinderisches Beispiel 14) Klonierung der den Fas-Liganden der Maus kodierenden cDNA durch PCR und deren Expression
(1) Herstellung des Plasmids pBL-MFLW4
Splenozyten einer Wildtyp (C3H+/+)-Maus wurden mit einer Zelldichte von 2 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640-Medium (NISSUI PHARMACEUTICAL), enthaltend 10 % FCS, 50 μm β-Mercaptoethanol, 1,5 μg/ml ConA und 20 ng/ml IL-2, suspendiert und 2 Tage lang bei 37°C kultiviert. Nach 4-stündiger Behandlung mit 10 ng/ml PMA und 500 ng/ml Ionomycin wurden tote Zellen mit Hilfe einer Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von HistoPak 1083 (Sigma Chemical) entfernt, und Poly (A) RNA wurde unter Verwendung eines mRNA-Präparationskits (Pharmacia) hergestellt. Die Synthese der einzelsträngigen cDNA und die PCR wurden auf die folgende Weise in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Kawasaki E.S. et al. (Amplification of RNA in PCR Protocols, A Guide to Methods and Amplifications, herausgegeben von M.A. Innis et al., Academic Press, San Diego, Seiten 21–27, 1990) durchgeführt.
Zunächst wurden ein Sense-Primer 6 (GCTCTAGAGAGAAGGAAACCCTTTCCTG) (SEQ ID NR. 49) und ein Antisense-Primer 6 (GCTCTAGAATATTCCTGGTGCCCATGAT) (SEQ ID NR. 50) hergestellt. Dieser Sense-Primer enthält einen Upstream-Bereich des ATG-Initiationscodons und eine XbaI-Stelle (GCTCTAGA) an seinem 5'-Ende. Andererseits enthält der Antisense-Primer einen Downstream-Bereich des TAA-Terminationscodons und eine XbaI-Stelle (GCTCTAGA) am 5'-Ende.
Zu 1 μg der Poly (A) RNA wurden 50 ng Zufallshexamere und 200 Units MMLV-Rnase H^– reverse Transkriptase (Gibco BRL) gegeben, und eine reverse Transkriptionsreaktion wurde durchgeführt. Eine Menge von 1,0 μl der resultierenden Reaktionslösung wurde mit 100 μl eines PCR-Puffers, enthaltend 100 pmol des Sense-Primers und dieselbe Menge des Antisense-Primers, 4xdNTP und Taq DNA-Polymerase, verdünnt. Die PCR wurde unter Verwendung eines DNA Thermalcyclers (Perkin-Elmer) durchgeführt. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde mit einem Restriktionsenzym XbaI verdaut und anschließend unter Verwendung eines 1 %igen Agarosegels (Low Gel Temperature, BioRad) isoliert. Ein DNA-Fragment von etwa 940 bp wurde aus dem Gel gewonnen und in die XbaI-Stelle von pBluescript IIKS(+) insertiert, und das resultierende Plasmid wurde pBL-MFLW4 genannt. Die DNA-Sequenz in dem Plasmid pBL-MFLW4 wurde unter Verwendung eines DNA-Sequenzierers bestimmt. Es wurde bestätigt, dass das Plasmid pBL-MFLW4 die Nukleotidsequenz der SEQ ID NR. 31 enthält, und die genannte Nuk leotidsequenz stimmt mit der Sequenz des chromosomalen Gens, das in dem erfinderischen Beispiel 13 erhalten wurde, überein.
Ein Transformant, E. coli DH10B(pBL-MFLW4), der durch Transformieren von E. coli DH10B mit dem Plasmid pBL-MFLW4 in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Hanahan (siehe oben) erhalten wurde, wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, hinterlegt und wurde mit der Bezeichnung FERM P-14226 versehen, und anschließend an die International Depository Authority am 27. Oktober 1994 als FERM BP-4851 transferiert.
(2) Einführen in COS-Zellen
Das in dem obigen Schritt (1) erhaltene 940 bp XbaI-Fragment wurde in die XbaI-Stelle eines Expressionsvektors pEF-BOS für tierische Zellen insertiert (Mizushima & Nagata, 1990), und das resultierende Plasmid wurde pEF-MFLW4 genannt. Anschließend wurden COS-7-Zellen in D-MEM-Medium, enthaltend 10 % FCS, mit einer Inokulumgröße von 2 × 10⁶ Zellen pro Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm angeimpft, und 5 μg des Plasmids pEF-MFLW4 wurden mit Hilfe des DEAE-Dextran-Verfahrens (Fukunaga, 1990) in die Zellen eingeführt.
(3) Cytotoxische Aktivität des Transformanten
Die cytotoxische Aktivität der rekombinanten Zellen wurde auf dieselbe Weise, wie in dem erfinderischen Beispiel 8 beschrieben, unter Verwendung der transformierten COS-Zellen (COS/pEF-MFLW4F), die in dem obigen Schritt (2) erhalten wurden, als Effektorzellen und 10⁶ WR19L- oder W4-Zellen als Zielzellen gemessen. W4 ist ein Transformant, der die Fähigkeit zur Expression des Fas-Antigens der Maus durch die Transformation von WR19L-Zellen der Maus erworben hat. Das heißt, 10⁶ WR19L- oder W4-Zellen wurden mit ⁵¹Cr durch Kultivieren der Zellen bei 37°C für 2 Stunden in RPMI 1640-Medium, enthaltend 20 μCi [⁵¹Cr] Natriumchromat (Amersham), markiert.
Die so ⁵¹Cr-markierten Zellen (1 × 10⁴) wurden mit COS/pEF-MFLW4F-Zellen in verschiedenen Mischungsverhältnissen gemischt und bei 37°C 4 Stunden lang kultiviert, anschließend wurde die cytotoxische Aktivität unter Verwendung des freigesetzten ⁵¹Cr als Index gemessen. Die Ergebnisse sind in 25 gezeigt. Wie in 25 gezeigt, wiesen die COS/pEF-MFLW4F-Zellen eine cytotoxische Aktivität gegen die W4-Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise auf, induzierten jedoch keine Apoptose gegen WR19L-Zellen. Die Ergebnisse sind in 25 gezeigt. Wie in 21 gezeigt, zeigten die COS/pEF-MFLW4F-Zellen außerdem eine cytotoxische Aktivität gegen die WC8A-Zellen in konzentrationsabhängiger Weise. Darüber hinaus wurde die Cytotoxizität der COS/pEF-MFLW4F-Zellen durch die Zugabe von 20 μg/ml des chimären Proteins, das die extrazelluläre Domäne des Fas-Antigens der Maus enthält (mFas-Fc), das in dem erfinderischen Beispiel 1 hergestellt wurde, inhibiert, wurde jedoch nicht durch die Zugabe des löslichen Typs des humanen TNF-Rezeptors (hTNFRβ-Fc) inhibiert.
Auf Grundlage der obigen Ergebnisse wurde bestätigt, dass das Protein, das durch die in dem obigen Schritt (1) istlierte cDNA kodiert wird, ein Fas-Ligand ist, welcher die Apoptose durch Binden des Fas-Antigens induziert.
(Erfinderisches Beispiel 15) Herstellen eines monoklonalen Antikörpers
(1) Synthese des Peptids und Herstellen des immunisierenden Antigens
Vier Peptide wurden auf Grundlage der Aminosäuresequenz, die in dem erfinderischen Beispiel 12 bestimmt wurde, synthetisiert. Peptid (1) (LVMMEGKMMSY) (SEQ ID NR. 51) wurde unter Verwendung eines Fmoc-Verfahren-unterstützten Peptidsynthesekits (Kokusan Kagaku) in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers synthetisiert, durch Deprotektion von dem verwendeten Harz freigesetzt und dann mit Ether behandelt, um 275,7 mg des Rohpeptids zu erhalten. Als Nächstes wurde eine Menge von 10 mg des Rohpeptids in 5 % wässrigem Ammoniak gelöst und einem Entsalzungsschritt unter Verwendung von Sephadex G10 unterzogen.
Die so erhaltene Lösung wurde einer Reinigung unter Verwendung einer reversen Phase-HPLC-Säule (CAPCELLPAK C18, 120 A, 5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Shiseido) unterzogen, und die resultierenden Eluate wurden gefriergetrocknet, um gereinigtes Peptid zu erhalten.
Peptid (2) (KSNSRSMPLEWEDTYGIVLL) (SEQ ID NR. 52), Peptid (3) (SKYPQDLVMMEGKMMS) (SEQ ID NR. 53) und Peptid (4) (LSLVNFEESQTFF) (SEQ ID NR. 54) wurden durch Beauftragen ihrer Synthese beim Fujiya Bioscience Laboratory erhalten.
Die so erhaltenen Peptide wurden auf die folgende Weise mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH: Pierce Chemical) und kationischem BSA (Pierce Chemical) verbunden, um als immunisierende Antigene verwendet zu werden.
KLH und kationisches BSA wurden jeweils in destilliertem Wasser aufgelöst, um eine 10 mg/ml Lösung herzustellen. Jedes der Peptide wurde in destilliertem Wasser oder 5 % wässrigem Ammoniak gelöst, um eine 1 mg/ml Lösung herzustellen. Das KLH wurde mit jedem Peptid in einem Mischungsverhältnis von 1:100 gemischt, und das kationische BSA in einem Verhältnis von 1:10, und die resultierenden Mischungen wurden mit Hilfe von Salzsäure auf pH 5 eingestellt. Als Nächstes wurde ein wasserlösliches Carbodiimid (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid, Dojin Laboratories) zu der Mischung in einer Menge von 1 mg/mg KLH oder kationischem BSA gegeben und bei Raumtemperatur 4 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Hilfe von Sephadex G25 (Pharmacia) gereinigt, und das erste Eluat wurde als Antigen zur Verabreichung verwendet.
(2) Immunisierung und Herstellung des Antiserums
Eine Menge von 100 μg des immunisierenden Antigens, das in dem obigen Schritt (1) hergestellt wurde, wurde mit derselben Menge an Freund's komplettem Adjuvans gemischt und Balb/c- oder ddy-Mäusen intraperitoneal verabreicht (5 bis 6 Wochen alt, weiblich). 1 Woche nach der ersten Verabreichung wurde dieselbe Menge des Antigens mit Freund's inkomplettem Adjuvans gemischt und intraperitoneal verabreicht. Der Booster wurde weitere zwei Male in Ein-Wochen-Intervallen wiederholt. Eine Woche danach wurden 20 μg des immunisierenden Antigens mit physiologischer Salzlösung verdünnt und durch intravenöse Injektion verabreicht. Die Zellfusion wurde 2 Tage nach der letzten Verabreichung ausgeführt. Nach 2-maliger Verabreichung wurde Antiserum durch Entnahme von Blut aus der Augenvene und durch Trennen des Serums erhalten.
(3) Messen der Reaktivität des Antiserums mit Peptid
Eine 2,5 %ige Glutaraldehydlösung wurde in den Vertiefungen einer Aminoplatte (Sumitomo Bakelite) in Mengen von 70 μl verteilt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehengelassen, anschließend wurden die flüssigen Inhalte verworfen. Eine Menge von 50 μl von jeder Peptidlösung wurde mit 0,076 M PBS (pH 6,4) auf 5 μg/ml verdünnt und zu jeder Vertiefung der so behandelten Platte gegeben und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde mit Eiswasser gekühlt und anschließend 5-mal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Anschließend wurde eine 0,2 %ige Gelatinelösung in PBS in die Vertiefungen der resultierenden Platten in 100 μl Mengen verteilt und 30 Minuten lang stehengelassen, um die Blockierung auszuführen.
Als Nächstes wurde jedes Antiserum 500-fach mit PBS verdünnt und in Mengen von 50 μl in den Vertiefungen verteilt. Nach 1-stündiger Reaktion bei 37°C wurde die Platte zweimal mit physiologischer Salzlösung, enthaltend 0,005 % Tween 20 (im Folgenden als "Waschlösung" bezeichnet) gewaschen. Ein Peroxidase-markierter anti-Maus Immunglobulin-Antikörper (DAKO) wurde 2000-fach mit PBS, enthaltend 0,25 % Gelatine, verdünnt und zu den gewaschenen Platten gegeben. Nach 1-stündiger Reaktion bei 37°C wurde die Platte 5-mal mit der Waschlösung gewaschen. Anschließend wurde McIlvaine-Pufferlösung (pH 5,0), enthaltend 3 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,027 % Wasserstoffperoxid, in den Vertiefungen der so behandelten Platte in Mengen von 50 μl verteilt, und die Reaktion wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur ausgeführt.
Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 50 μl 2 N Schwefelsäure zu jeder Vertiefung beendet, und anschließend wurde die Absorption bei 492 nm gemessen. Als Ergebnis zeigten alle getesteten Antisera eine Reaktivität mit dem immunisierenden Peptid.
(4) Herstellung eines monoklonalen Antikörpers
Die in dem obigen Schritt (2) erhaltene immunisierte Maus wurde geopfert, um die Milz herauszunehmen, die anschließend in Scheiben geschnitten, durch ein nicht rostendes Stahlnetz gegeben und anschließend in RPMI 1640-Medium suspendiert wurde, um eine Splenozyten-Suspension zu erhalten. Die so erhaltenen Splenozyten wurden mit Myelomzellen der Maus (P3X63Ag8U1) in einem Mischungsverhältnis von 10 : 1 gemischt, und die Mischung wurde einer 8-minütigen Zentrifugation bei 1400 rpm unterzogen. Zu dem resultierenden Präzipitat wurden schnell 0,5 ml RPMI 1640, enthaltend 42,5 % Polyethylenglycol 1540 und 15 % Dimethylsulfoxid, gegeben. Nach 1 Minute starkem Schütteln wurden 10 ml RPMI 1640 nach und nach zu den Zellen gegeben, und die resultierende Mischung wurde einer 5-minütigen Zentrifugation bei 800 rpm unterzogen.
Das so erhaltene Präzipitat wurde in HAT-Medium (RPMI 1640-Medium, angereichert mit 1 × 10^–4 M Hypoxanthin, 4 × 10^–7 M Aminopterin, 1,6 × 10^–5 M Thymidin und 10 % FCS) mit einer endgültigen Zelldichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert, und die Suspension wurde in Vertiefungen einer 96 well Mikroplatte in 0,2 ml Portionen verteilt. Die Hälfte des Mediums wurde alle 2 bis 3 Tage durch frisches Medium ersetzt, und das Medium wurde anschließend vollständig mit HAT-Medium (RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 1 × 10^–4 M Hypoxanthin, 1,6 × 10^–5 M Thymidin und 10 % FCS) ersetzt.
Als ein Wachstum der Hybridomzellen beobachtet wurde, wurde das Screening mit Hilfe eines ELISA ausgeführt. Das heißt, eine 96 well-Platte, auf der das in dem erfinderischen Beispiel 15 (1) hergestellte Peptid immobilisiert wurde, wurde zweimal mit der zuvor erwähnten Waschlösung gewaschen, und eine Menge von 100 μl eines jeden Kulturüberstandes, der 10-fach mit PBS, enthaltend 0,25 % Gelatine, verdünnt wurde, wurde zu jeder Vertiefung der so gewaschenen Platte gegeben und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Platte 5-mal mit der Waschlösung gewaschen, und 50 μl eines Peroxidase-markierten Kaninchen anti-Maus Igs-Antikörpers (DAKO), der 2000-fach mit PBS, enthaltend 0,25 % Gelatine, verdünnt wurde, wurde als sekundärer Antikörper zu jeder Vertiefung der so gewaschenen Platte gegeben.
Nach 2-stündiger Reaktion bei Raumtemperatur wurde die Platte 5-mal mit der Waschlösung gewaschen und 0,1 M McIlvaine-Pufferlösung (pH 5,0), enthaltend 3 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,027 % Wasserstoffperoxid, wurden in den Vertiefungen der so behandelten Platte in 100 μl Portionen verteilt. Nach 10 minütiger Enzymreaktion bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 μl 2 N Schwefelsäure zu jeder Vertiefung gestoppt, und anschließend wurde die Absorption bei 492 nm gemessen. Hybridome in Vertiefungen, die im ELISA positiv waren, wurden mit RPMI 1640, enthaltend 10 % FCS, in solch einem Verhältnis verdünnt, dass jede Vertiefung der 96 well Mikroplatte 2, 1 oder 0,5 Zellen enthielt.
Thymozyten von Wistar-Ratten wurden in jede Vertiefung der Platte als Feeder-Zellen zur Ausführung der Klonierung inokuliert.
Die Vertiefungen, die jeweils eine einzige Zellkolonie enthielten, wurden durch Beobachtung unter einem Mikroskop ausgewählt, und die Kulturüberstände in den ausgewählten Vertiefungen wurden mit Hilfe des ELISA-Verfahrens gemäß dem obigen Schritt (3) gescreent, um ein Hybridom zu erhalten, das fähig ist, den monoklonalen Antikörper von Interesse zu produzieren.
(5) Bestätigung der Reaktivität mit Hilfe von Western-Blotting
Die Reaktivität des Antiserums, das in dem obigen Schritt (2) erhalten wurde (immunisiert mit dem unter Verwendung des Peptids (2), lot. 19-3 hergestellten Antigen) und der monoklonale Antikörper, der in dem obigen Schritt (4) erhalten wurde (immunisiert mit dem unter Verwendung des Peptids (2) hergestellten Antigen, F864-5-1 ), mit dem humanen Fas-Liganden wurde mit Hilfe von Western-Blotting bestätigt. Als Proben wurden COS-Zellen, die mit einem Vektor transfiziert wurden, der die Sequenz des humanen Fas-Liganden, der in den COS-Zellen gemäß dem erfinderischen Beispiel 12 exprimiert wird oder des Fas-Liganden der Maus, der in dem erfinderischen Beispiel 14 exprimiert wird oder keine Sequenz für einen Fas-Liganden enthielt, verwendet.
Zunächst wurden etwa 1 × 10⁴ der jeweiligen transformierten COS-Zellen mit 9 μl 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,1 % Natriumdeoxycolat, 0,1 % SDS und 0,2 U/ml Aprotinin, gemischt und anschließend mit demselben Volumen an 0,25 M Tris-HCl-Puffer (pH 6,8), enthaltend 2 % SDS, 30 % Glycerol, 10 % 2-Mercaptoethanol und 0,01 % BPB (Bromphenol Blau), gemischt.
Nach 1-stündiger Behandlung bei 37°C wurde eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (4 bis 20 % Gradientengel) ausgeführt, und die Inhalte der Gele wurden anschließend auf eine PVDF-Membran (Millipore Corp.) unter Reaktionsbedingungen von 200 mA für 90 Minuten bei 4°C transferiert. Die resultierende Membran wurde einer 2-stündigen Blocking-Reaktion bei 37°C unter Verwendung von Block Ace (Snow Brand Milk Products) unterzogen.
Als Nächstes wurde die Membran zweimal mit der Waschlösung gewaschen (4 Minuten Rühren bei 37°C) und anschließend 1,5 Stunden bei 37°C mit dem Antiserum 19-3 oder dem Kulturüberstand des Hybridoms F864-5-1, das 500-fach mit Block Ace verdünnt wurde, das 5-fach mit PBS verdünnt wurde, reagieren gelassen. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Membran zweimal mit der Waschlösung gewaschen und anschließend in einer Lösung mit einem Peroxidase-markierten Kaninchen anti-Maus Immunglobulin-Antikörper (Kat. Nr. P260, DAKO), der 1000-fach mit 5-fach verdünntem Block Ace mit PBS verdünnt wurde, inkubiert. Nach 1,5-stündiger Reaktion bei 37°C wurde die Membran 3-mal mit der Waschlösung gewaschen und anschließend zweimal mit destilliertem Wasser. Danach wurde das Wasser auf der Oberfläche der Membran entfernt, um die Farbentwicklung mit TMB-Reagenz (Kat. Nr. TM9125, SCYTK) durchzuführen.
Die Ergebnisse des Western-Blottings unter Verwendung des Antiserums 19-3 und des monoklonalen Antikörpers F864-5-1 sind in den 27 bzw. 28 gezeigt. Wie aus diesen Abbildungen offensichtlich ist, wurde eine Bande beobachtet, die fähig ist, mit dem Extrakt aus den den humanen Fas-Liganden exprimierenden COS-Zellen zu reagieren, während eine solche Bande im Falle des Fas-Liganden der Maus und der Kontrolle nicht beobachtet wurde.
(6) Bestätigung der Reaktivität des monoklonalen Antikörpers mit Peptid (2) durch Blockingreaktion-1
Die Reaktivität des monoklonalen Antikörpers, der in dem obigen Schritt (4) erhalten wurde, (immunisiert mit dem unter Verwendung des Peptids (2) hergestellten Antigen, F883-1-1 ), mit dem immunisierenden Peptid (2) wurde durch eine Blockingreaktion bestätigt.
Eine 2,5 %ige Glutaraldehydlösung wurde in Vertiefungen einer Aminoplatte (Sumitomo Bakelite) in 70 μl Mengen verteilt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, anschließend wurden die flüssigen Inhalte verworfen. Eine Menge von 50 μl einer Lösung des Peptids (2), verdünnt auf 5 μg/ml mit 0,076 M PBS (pH 6,4), wurde zu jeder der Vertiefungen der so behandelten Platte gegeben und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde mit Eiswasser gekühlt und anschließend 5-mal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Anschließend wurde PBS, enthaltend 0,2 % Gelatine und 0,1 M Glycin, in jede Vertiefung der resultierenden Platte in 100 μl-Portionen verteilt und 30 Minuten lang stehengelassen, um das Blocking zu bewirken.
Unabhängig davon wurde jedes der zuvor erwähnten Peptide (2), (3) und (4) mit PBS mit einer Konzentration von 10 μg/ml verdünnt, um als Blocking-Antigenlösung verwendet zu werden. Außerdem wurde eine Lösung, die kein blockierendes Antigen enthält, hergestellt, um als negative Kontrolle verwendet zu werden. Nach Zugabe von 25 μl der jeweiligen Lösungen zu jeder Vertiefung der obigen Platte wurde der Antikörper F883-1-1, der mit 0,2 % Gelatine-enthaltendem PBS auf 0,4 μg/ml verdünnt worden war, in 25 μl-Portionen in die Vertiefungen gegeben. Nach einer 1-stündigen Reaktion bei 37°C wurde die Platte zweimal mit der Waschlösung gewaschen.
Als Nächstes wurde ein Peroxidase-markierter anti-Maus Immunglobulin-Antikörper (DAKO) 2000-fach mit PBS, enthaltend 0,2 % Gelatine, verdünnt und in die Vertiefungen der gewaschenen Platte in 50 μl-Portionen verteilt. Nach 1-stündiger Reaktion bei 37°C wurde die Platte 5-mal mit der Waschlösung gewaschen. Danach wurde McIlvaine-Pufferlösung (pH 5,0), enthaltend 3 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,027 % Wasserstoffperoxid, in die Vertiefungen der so behandelten Platte in 50 μl-Portionen gegeben, und die Reaktion wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl 2 N Schwefelsäure zu jeder Vertiefung gestoppt und anschließend wurde die Absorption bei 492 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in 29 gezeigt.
In 29 wurde die Absorption einer Vertiefung, zu der kein blockierendes Antigen gegeben wurde (negative Kontrolle) als 100 gewertet, und die relative Absorption in jeder der anderen Vertiefungen wurde gezeigt.
Wie aus 29 ersichtlich ist, wurde bestätigt, dass die Reaktivität des F883-1-1-Antikörpers mit dem Antigenpeptid nur inhibiert wird, wenn das Peptid (2) als blockierendes Peptid verwendet wird.
(7) Bestätigung der Reaktivität des monoklonalen Antikörpers mit dem Peptid (3) durch Blockingreaktion-2
Die Reaktivität des IgM-monoklonalen Antikörpers, der in dem obigen Schritt (4) hergestellt wurde (Antikörper F897-1-2, produziert von Hybridom F897-1-2, das aus den Milzzellen der Maus, die mit dem unter Verwendung des Peptids (2) produzierten Antigen immunisiert wurde, sowie den Myelomzellen hergestellt wurde) mit dem immunisierenden Antigenpeptid (3) (Peptid (3)) wurde mit Hilfe einer Blockingreaktion bestätigt.
Zunächst wurde das Peptid (3) mit Peroxidase in Übereinstimmung mit Nakane et al., (Immunofluorescence and Related Staining Techniques, W. Knapp, K. Holubar und G. Wick Hrsg., 1978) wie oben beschrieben, markiert.
6 mg Peroxidase (RZ3.11, Toyobo Co., Ltd.) wurden in 1,5 ml destilliertem Wasser gelöst. Zu der Lösung wurden 0,3 ml 0,1 M Natrium-m-periodat in destilliertem Wasser gegeben, und die Lösung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu der Lösung wurden anschließend 0,3 ml 1,5 % Ethylenglycol in destilliertem Wasser gegeben, und die Lösung wurde 20 Minuten lang stehengelassen. Die resultierende Lösung wurde gegen 0,001 M Acetatpuffer, pH 4,4, bei 4°C über Nacht dialysiert.
Zu 159 μl der resultierenden aktivierten Peroxidaselösung (entsprechend 500 μg Peroxidase) wurden 9 μl 1 M Carbonat-Pufferlösung, pH 9,5, gegeben und anschließend 428 μl der Lösung des Peptids (3), die durch Lösen des Peptids (3) in destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt wurde (wobei die Menge des Peptids (3) der 20-fachen molaren Menge der Peroxidase entspricht), und die Lösung wurde 2 Stunden lang bei 25°C reagieren gelassen. Zu der Lösung wurden 15 μl Natriumborhydridlösung gegeben, die durch Auflösen des Natriumborhydrids in 0,01 M Carbonatpufferlösung, pH 9,5, auf 4 mg/ml hergestellt wurde, und die Lösung wurde 2 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen. Zu der Lösung wurden weiterhin 25 μl 0,2 M Glycin in destilliertem Wasser zugefügt, und die Lösung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Lösung wurde anschließend gegen 0,076 M PBS, pH 6,4 bei 4°C über Nacht dialysiert, und zu der resultierenden Lösung von Peroxidasemarkiertem Peptid (3) wurde eine gleiche Menge an Glycerol gegeben. Die Mischung wurde bei –20°C gelagert.
Als Nächstes wurden 20 μg/ml eines anti-Maus Immunoglobulin-Antikörpers (Z259, DAKO) in 0,076 M PBS auf Vertiefungen einer Immunplatte (Maxi Sorp TM, NUNC) in 50 μl Portionen verteilt, und die Platte wurde bei 45°C 30 Minuten lang inkubiert. Die Platte wurde anschließend mit Eiswasser gekühlt und 5-mal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Auf die Vertiefungen wurde anschließend PBS, enthaltend 0,2 % Gelatine in 100 μl Portionen verteilt, und die Platte wurde für die Blockierung über Nacht bei 4°C gelagert. Nach der Blockierung wurde der 100-fach mit PBS verdünnte ausgesalzene Antikörper (F897-1-2) in 50 μl Mengen verteilt, und die Platte wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde anschließend zweimal mit 0,9 % NaCl-Waschlösung, enthaltend 0,005 % Tween 20 und einmal mit entionisiertem Wasser gewaschen.
In der Zwischenzeit wurde Peptid (3) mit PBS auf eine Konzentration von 3 μg/ml bzw. 10 μg/ml verdünnt, und die resultierenden Lösungen wurden für die Blocking-Antigen-Lösungen verwendet. Eine Lösung, die kein blockierendes Antigen enthält, wurde ebenfalls hergestellt, und die Lösung wurde als negative Kontrolle verwendet. Die so hergestellten Lösungen wurden auf die Vertiefungen der Platte in 25 μl Portionen verteilt und anschließend wurde das Peroxidase-markierte Peptid (3), das 200-fach mit PBS verdünnt wurde, in 25 μl-Mengen verteilt. Die Platte wurde bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert, um die Reaktion zu fördern. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Platte 5-mal mit der Waschlösung und zweimal mit dem entionisierten Wasser gewaschen. Zu den Vertiefungen wurden 50 μl-Mengen des McIlvaine-Puffers, pH 5,0, enthaltend 3 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,027 % Wasserstoffperoxid, gegeben und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 5 Minuten lang durchgeführt. 50 μl-Mengen von 2N Schwefelsäure wurden zu den Vertiefungen zur Beendigung der Reaktion gegeben, und die Absorption bei 492 nm wurde gemessen.
Die Reaktivität in Prozent wurde als relative Absorption einer jeden Vertiefung berechnet, indem die Absorption der Vertiefung, die frei von dem blockierenden Antigen war (die negative Kontrolle) als 100 gesetzt wurde. Die Resultate sind in 31 gezeigt.
Wie in 31 klar gezeigt, wurde bestätigt, dass die Reaktivität des Antikörpers F897-1-2 mit dem Antigenpeptid durch das Peptid (3) inhibiert wird.
(Erfinderisches Beispiel 16) Bewertung der Apoptose-Inhibierungsaktivität – 1
Die Apoptose-Inhibierungsaktivität des Antikörpers F883-1-1, der in dem erfinderischen Beispiel 15 hergestellt wurde, wurde auf die folgende Weise unter Verwendung eines Fas-Liganden-exprimierenden Transformanten und eines Fas-Antigen-exprimierenden Transformanten bestätigt.
Zunächst wurde die Zelllinie FDC-P1, die von einer normalen myeloiden Zelle der Maus abgeleitet ist, mit dem Plasmid pEX-hFL1 (siehe erfinderisches Beispiel 12), das die cDNA enthält, die für den humanen Fas-Liganden kodiert, transformiert. FLh1-Zellen, die einer der resultierenden Klone sind, wurden bei 37°C 4 Tage lang in Gegenwart von 5 % CO₂ in RPMI 1640-Medium (Gibco BRL), das mit 50 U/ml Maus-IL-3 (INTERGEN) und 10 % FCS versetzt war, inkubiert. Nach der Inkubation wurden die FLh1-Zellen in 10 % FCS-enthaltendem RPMI 1640-Medium mit einer Zellkonzentration von 5 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert, und die Zellsuspension wurde in die Vertiefungen einer 96 well Platte mit flachem Boden in 50 μl Portionen verteilt.
In der Zwischenzeit wurde der Antikörper F883-1-1, der in dem erfinderischen Beispiel 15 hergestellt wurde, mit PBS^– auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Die so verdünnten Antikörperlösungen wurden in die oben beschriebenen Vertiefungen in 10 μl-Mengen verteilt, und die Platte wurde 30 Minuten lang in Gegenwart von 5 % CO₂ bei 37°C inkubiert.
Als Nächstes wurden die Transformantenzellen WC8, die fähig sind, humanes Fas-Antigen zu exprimieren (Itoh N. et al., J. Immunol., Band 151, Seiten 621–627, 1993), in 10 % FCS-enthaltendem RPMI 1640-Medium mit einer Zellkonzentration von 6,3 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert, und die Suspension wurde in 40 μl-Portionen in die Vertiefungen gegeben. Nach 16-stündiger Inkubation bei 37°C in Gegenwart von 5 % CO₂ wurden 100 μl Trypan Blau zu jeder Vertiefung gegeben, um die Anzahl der überlebenden Zellen in jeder Vertiefung zu bestimmen.
30 zeigt die Apoptose-Inhibierungsaktivität des Antikörpers F883-1-1, der in dem erfinderischen Beispiel 15 hergestellt wurde. Wie in 30 klar gezeigt ist, wird die Apoptose von WC8-Zellen, die durch FLh1 induziert wird, durch den Antikörper F883-1-1 in dosisabhängiger Weise inhibiert. Es sollte erwähnt werden, dass die Erfinder der vorliegenden Erfindung das Hybridom F883-1-1, das den monoklonalen Antikörper F883-1-1 produziert, bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, am 9. August 1994 hinterlegt haben (Hinterlegungsnummer FERM P-14464), das anschließend an die International Depository Authority am 27. Oktober 1994 als FERM BP-4852 transferiert wurde.
(Erfinderisches Beispiel 17) Beurteilung der Apoptose-Inhibitionsaktivität – 2
Die Apoptose-Inhibitionsaktivität des Antikörpers F897-1-2, der in dem erfinderischen Beispiel 15 hergestellt wurde, wurde wie unten beschrieben in Übereinstimmung mit den Verfahren gemäß den erfinderischen Beispielen 8 und 12 unter Verwendung des Überstandes des Transformanten COS-1/pEX-hFL1, der in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß dem erfinderischen Beispiel 18(3) hergestellt wurde, sowie unter Verwendung der das humane Fas-Antigen-exprimierenden Transformantenzellen WC8 bestätigt.
Zunächst wurden 10⁶ WC8-Zellen in PRMI 1640-Medium, dem 20 μCi [⁵¹Cr]Natriumchromat (NEN) und 10 % hitzeinaktiviertes FCS zugesetzt war, bei 37°C zwei Stunden lang inkubiert, um die Zellen mit ⁵¹Cr zu markieren.
Als Nächstes wurden zu jeder Vertiefung einer 96 well Platte mit U-förmigem Boden (CORNING) 6 μl des Überstandes von COS-1/pEX-hFL1 mit einer Endkonzentration von 3 % gegeben sowie 74 μl 10 % FCS-enthaltendes RPMI 1640-Medium. Zu jeder Vertiefung wurden anschließend 20 μl der Verdünnung des Antikörpers F-897-1-2, der in dem erfinderischen Beispiel 15 hergestellt wurde, die mit 0,1 % BSA-enthaltenden PBS^– auf 300 μg/ml eingestellt wurde, mit einer Endkonzentration von 30 μg/ml gegeben. Die Platte wurde bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Die ⁵¹Cr-markierten WC8-Zellen wurden anschließend mit 1 × 10⁴ Zellen/100 μl/Vertiefung verteilt, und die Platte wurde bei 37°C für weitere 4 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde die cytotoxische Aktivität unter Verwendung der Freisetzung von ⁵¹Cr als Index bewertet.
Die Ergebnisse sind in 32 gezeigt. Wie in 32 klar gezeigt wird, wurde die Apoptose der WC8-Zellen, die durch den in dem Überstand des Transformanten COS-1/pEX-hFL1 vorhandenen Fas-Liganden induziert wurde, durch den Antikörper F897-1-2 in dosisabhängiger Weise inhibiert.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Erfinder der vorliegenden Erfindung das Hybridom F897-1-2, welches den monoklonalen Antikörper F897-1-2 produziert, beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology am 1. September 1994 hinterlegt haben (Hinterlegungsnummer FERM P-14497), das anschließend an die Internationale Hinterlegungsbehörde am 27. Oktober 1994 als FERM BP-4853 transferiert wurde.
(Erfinderisches Beispiel 18) Expression der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden
(1) Herstellung des Plasmids pM1067
Ein Sense-Primer 7 (CACCTGCAGAAGGAGCTGGCAGAA) (SEQ ID NR. 55) und ein Antisense-Primer 7 (AATAAGCTTGGTACCCTATTAGAGCTTATATAA) (SEQ ID NR. 56) wurden in einem chemischen Synthetisierer synthetisiert. Der Sense-Primer enthält die Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz kodiert, die an dem N-Terminus der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden liegt, wovon die Aminosäuresequenz in SEQ ID NR. 3 gezeigt ist, sowie eine PstI-Stelle (CTGCAG). Der Antisense-Primer enthält eine Sequenz, die das Terminationscodon (TAA), eine HindIII-Stelle (AAGCTT) und eine KpnI-Stelle (GGTACC) enthält.
100 μl einer Lösung, die jeweils 100 pmol des Sense-Primers und des Antisense-Primers; 50 ng des Plasmids pBX-hFL1, das in dem erfinderischen Beispiel 12(1) hergestellt wurde; jeweils 20 nmol dATP, dCTP, dGTP und dTTP; und 2,5 Einheiten der Pfu-Polymerase und 10 μl des dazugehörigen Pfu-Puffers (Stratagene) enthält, wurde hergestellt. Eine PCR wurde unter Verwendung des DNA Thermal Cyclers (PCR System 9600, Perkin-Elmer) durch Wiederholen von 30 Zyklen, die jeweils 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minuten umfassten, durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit PstI und HindIII doppelt verdaut, und das DNA-Fragment wurde zwischen die PstI-Stelle und die HindIII-Stelle von pUC118 insertiert. Das resultierende Plasmid wurde Plasmid pM1067 genannt.
(2) Herstellung des Plasmids pM1070
Ein Sense-Primer 8 (TGCGAATTCIACCATGCTGGGCATCTGG) (SEQ ID NR. 57) und Antisense-Primer 8 (AACCTGCAGGTGGAAGAGCTGAGCAACAGACGTAAG) (SEQ ID NR. 58) wurden in einem chemischen Synthetisierer synthetisiert. Der Sense-Primer enthält die Sequenz, die an dem 5'-Terminus einer Sequenz lokalisiert ist, die für das Signalpeptid des humanen Fas-Antigens kodiert; und eine EcoRI-Stelle (GAATTC). Der Antisense-Primer enthält die Sequenz, die am 3'-Terminus einer Sequenz lokalisiert ist, die für das Signalpeptid des humanen Fas-Antigens kodiert; die Nukleotidsequenz, die für den N-Terminus der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden kodiert, und eine PstI-Stelle.
100 μl einer Lösung, die jeweils 100 pmol des Sense-Primers und des Antisense-Primers; 50 ng des Plasmids pBLF58-1, das in dem erfinderischen Beispiel 1(3) verwendet wurde; jeweils 20 nmol dATP, dCTP, dGTP und dTTP; und 2,5 Einheiten der Pfu-Polymerase und 10 μl des dazugehörigen Pfu-Puffers (Stratagene) enthält, wurden hergestellt, und eine PCR wurde unter Wiederholung des Verfahrens des obigen Schrittes (1) durchgeführt.
Das resultierende PCR-Produkt wurde doppelt mit EcoRI und PstI verdaut, und das resultierende DNA-Fragment wurde zwischen die EcoRI-Stelle und die PstI-Stelle des Plasmids pM1067, das in dem obigen Schritt (1) hergestellt wurde, insertiert, um das Plasmid pM 1250 zu erhalten. Das so hergestellte Plasmid wurde doppelt verdaut mit EcoRI und KpnI, und das Produkt des Verdaus wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel ausgesetzt. Ein DNA-Fragment von etwa 600 bp wurde gewonnen, und die DNA mit dem QIAEX TM-Kit von QIAGEN gereinigt. Das so gereinigte DNA-Fragment von etwa 600 bp wurde zwischen die EcoRI-Stelle und die KpnI-Stelle des Plasmids pM1103, das durch Insertieren des DHFR-Gens in das Plasmid pEF-BOS, das in dem erfinderischen Beispiel 14(2) verwendet wurde, hergestellt wurde, insertiert. Das resultierende Plasmid wurde Plasmid pM1070 genannt.
(3) Einführen in COS-Zellen
Das oben in (1) hergestellte Plasmid pM1070 und in dem erfinderischen Beispiel 12(1) hergestellte pEX-hFL1 wurden jeweils in COS-1-Zellen eingeführt, um durch das oben beschriebene Verfahren die Transformanten COS-1/pM1070 und COS-1/pEX-hFL1 herzustellen.
Zu 40 μl einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,4)/ 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (im Folgenden als Tris/EDTA bezeichnet) wurden 8,1 μg pM1070 oder pEX-hFL1 gegeben. Zu den resultierenden Lösungen wurden anschließend 11,3 ml D-MEM (Nissui Pharmaceutical), enthaltend 0,2 mg/ml DEAE-Dextran und 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, gegeben, um DNA-DEAE-Dextran-Mischlösungen herzustellen.
Die resultierenden DNA-DEAE-Dextran-Mischlösungen wurden jeweils tropfenweise zu einer Monolayerkultur von COS-1 Zellen in 150 cm² Roux-Flaschen gegeben, die bis zu einem semikonfluenten Zustand gewachsen waren, und die Kulturen wurden bei 37°C in Gegenwart von 5 % CO₂ inkubiert, um die Transformanten COS-1/pM1070 und COS-1/pEX-hFL1 herzustellen. Nach 4-stündiger Inkubation wurden die DNA-DEAE-Dextran-Mischlösungen entfernt und 10 % FCS enthaltendes D-MEM (IRVINE Scientific K.K.) wurde zu den Flaschen gegeben. Die Inkubation wurde für weitere 48 bis 96 Stunden fortgesetzt, und die Kulturüberstände wurden von den COS-1/pM1070- und COS-1/pEXhFL1-Transformanten zur Verwendung in den Schritten (4) und (5) wie unten beschrieben gesammelt.
(4) Cytotoxische Aktivität des Transformanten
Die cytotoxische Aktivität der Kulturüberstände der Transformanten COS-1/pM1070 und COS-1/pEX-hFL1, die in dem obigen Schritt (3) hergestellt wurden, wurde wie im Fall der erfinderischen Beispiele 8 und 12 durch Verwendung von WC8A-Zellen bzw. W4-Zellen als Zielzellen bestimmt. Die Untersuchung wurde wie unten beschrieben ausgeführt.
10⁶ WC8- oder W4 Zellen wurden in RPM11640-Medium, enthaltend 20 μCi [⁵¹Cr] Natriumchromat (NEN), bei 37°C zwei Stunden lang inkubiert, um die Zellen mit ⁵¹Cr zu markieren.
Die in dem obigen Schritt (3) hergestellten Zellkulturüberstände wurden zu der Reaktionslösung, welche 1 × 10⁴ ⁵¹Cr-markierte Zellen enthielt, mit einer Endkonzentration von 3 % bzw. 10 % gegeben. Die Kulturen wurden bei 37°C 4 Stunden lang inkubiert, und die cytotoxische Aktivität wurde durch Verwendung der Freisetzung von ⁵¹Cr als Index beurteilt.
Die Resultate sind in den 33 und 34 gezeigt. Wie aus den 33 und 34 ersichtlich wird, wiesen die Kulturüberstände von COS-1/pM1070 und COS-1/pEX-hFL1 eine konzentrationsabhängige cytotoxische Aktivität auf WC8A-Zellen bzw. W4-Zellen auf. In den 33 und 34 bezeichnet "Mock" die Kontrolle.
Das Vorhandensein des Fas-Liganden, der die Aktivität zur Bindung an das humane Fas-Antigen aufweist, wodurch Apoptose induziert wird, in diesen Kulturüberständen wurde damit bestätigt.
(5) Western-Blotting unter Verwendung der Kulturüberstände der Transformanten COS-1/pM1070 und COS-1/pEX-hFL1
Ein Kaninchen-Antiserum, das fähig ist, einen Teil der Aminosäuresequenz des humanen Fas-Liganden zu erkennen (PSPPPEKKELRKVAH, SEQ ID NR. 59), wurde in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren hergestellt, und Western-Blotting wurde unter Verwendung des so hergestellten Kaninchen-Antiserums wie unten beschrieben durchgeführt.
10 μl der Kulturüberstände der Transformanten COS-1/pM1070 und COS-1/pEX-hFL1, die in dem obigen Schritt (3) hergestellt wurden, wurden jeweils mit 5 μl destilliertem Wasser gemischt. Zu diesen Mischungen wurden jeweils 5 μl destilliertes Wasser, enthaltend 4 % SDS, 80 % Glycerol und 0,04 % BPB, oder 5 μl destilliertes Wasser, enthaltend 4 % SDS, 80 % Glycerol, 8 % DTT und 0,04 % BPB, gegeben. Die resultierenden Mischungen wurden bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert und anschließend einer SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese auf einem 5 bis 20 % Gradientengel unterzogen. Nach Abschluss der Elektrophorese wurde das Gel bei Raumtemperatur bei 200 mA 60 Minuten lang auf eine PVDF-Membran (Atto K.K.) transferiert, und die Membran wurde durch Magermilchlösung (Snow Brand Milk Products, Co., Ltd.) bei 4°C über Nacht geblockt. Die so geblockte Membran wurde einmal mit PBS gewaschen (durch Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten) und zweimal mit 0,1 % Tween 20/PBS (durch Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten).
Das oben beschriebene Kaninchen-Antiserum wurde 1000-fach mit 0,5 % BSA/0,1 Tween 20/PBS verdünnt, und die Membran wurde mit dem so verdünnten Kaninchen-Antiserum bei 37°C 1 Stunde lang zur Reaktion gebracht. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Membran zweimal mit 0,1 % Tween 20/PBS gewaschen. Die Membran wurde anschließend in eine Lösung aus Peroxidase-markiertem anti-Kaninchen Immunglobulin-Antikörper (Kat. Nr. P448, DAKO), der 1000-fach mit 0,5 % BSA/0,1 % Tween 20/PBS verdünnt wurde, getaucht und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang reagieren gelassen. Die Membran wurde 5-mal mit 0,1 % Tween 20/PBS gewaschen, und das Wasser auf der Oberfläche wurde entfernt. Die Membran wurde anschließend in dem ECL-System (Amersham) ausgewertet.
Im Falle des Überstands von COS-1/pM1070 wurde eine Bande bei etwa 29 kD unter reduzierenden Bedingungen und eine Bande bei etwa 26 kD unter nicht-reduzierenden Bedingungen beobachtet.
Im Fall des Überstandes von COS-1/pEX-hFL1 wurde eine Bande bei etwa 26 kD unter reduzierenden Bedingungen und eine Bande bei etwa 24 kD unter nicht-reduzierenden Bedingungen beobachtet.
Die Resultate des Western-Blottings unter nicht-reduzierenden Bedingungen sind in den 35 und 36 gezeigt.
(Erfinderisches Beispiel 19) Inhibition der Expression des Fas-Liganden durch ein Antisense-Oligonukleotid
(1) Synthese eines Antisense-Oligonukleotids
Ein Phosphorthioat-Sense-Oligonukleotid von 22 Nukleotiden, das die Nukleotidsequenz (TAAAACCGTTTGCTGGGGCTGG) von dem 20. bis 41. Nukleotid der SEQ ID NR. 30 enthält (im Folgenden als Sense-Oligonukleotid S20 bezeichnet) und ein Phosphorthioat-Antisense-Oligonukleotid, das die komplementäre Sequenz (CCAGCCCCAGCAAACGGTTTTA) zu dem Sense-Oligonukleotid S20 aufweist (im Folgenden als Antisense-Oligonukleotid A41 bezeichnet) wurde in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren synthetisiert (SEQ ID NRN. 60 und 61 ). Die resultierenden synthetischen Oligonukleotide wurden jeweils mit einer Konzentration von 1 mM in TE-Puffer gelöst.
(2) Einführen des Antisense-Oligonukleotids in die Zelle
Transformantenzellen FLh1, die den humanen Fas-Liganden exprimieren (siehe erfinderisches Beispiel 16) wurden in RPMI 1640-Medium, enthaltend 10 % hitzeinaktiviertes FCS, suspendiert, und die Zellsuspension wurde in die Vertiefungen einer 96 well-Platte (NUNC) mit 2,0 × 10⁴ Zellen/196 μl/Vertiefung verteilt.
Die 1 mM Lösung des Antisense-Oligonukleotids A41, das in dem obigen Schritt (1) hergestellt wurde, wurde in 4 μl Portionen mit einer Endkonzentration von 20 μM in die Vertiefungen gegeben, und die Platte wurde in Gegenwart von 5 % CO₂ 3 Tage lang inkubiert, um das Oligonukleotid in die Zellen einzuführen.
In die die Zellsuspension enthaltenden Vertiefungen wurden außerdem 4 μl Portionen der 1 mM Lösung des Sense-Oligonukleotids S20, das in dem obigen Schritt (1) hergestellt wurde, bzw. der TE-Puffer gegeben, und die Platte wurde in Gegenwart von 5 CO₂ 3 Tage lang inkubiert. Diese Vertiefungen wurden als Kontrolle verwendet.
(3) Bewertung der cytotoxischen Aktivität
FLh1-Zellen, die 3 Tage lang in dem obigen Schritt (2) inkubiert wurden, wurden als Effektorzellen verwendet, um die cytotoxische Aktivität auf humane Fas-Antigen-exprimierende Transformanten WC8 zu untersuchen.
Die cytotoxische Aktivität wurde, wie unten beschrieben, in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das in den erfinderischen Beispielen 8 und 12 verwendet wurde, bestimmt.
10⁶ WC8-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, enthaltend 20 μCi [⁵¹Cr] Natriumchromat (NEN), bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert, um die WC8-Zellen mit ⁵¹Cr zu markieren. Die oben beschriebenen Effektorzellen wurden mit 1 × 10⁴ ⁵¹Cr-markierten Zellen in einem E/Z-Verhältnis von 3 : 1 gemischt. Die Kultur wurde bei 37°C 5 Stunden lang inkubiert, und die cytotoxische Aktivität wurde durch Verwendung der Freisetzung des ⁵¹Cr als Index bestimmt.
Die Ergebnisse sind in 37 gezeigt. Wie in 37 gezeigt, wiesen die FLh1-Zellen, welche das Antisense-Oligonukleotid A41 in sich trugen, eine Apoptose-Inhibitions-aktivität auf WC8-Zellen auf.
(Erfinderisches Beispiel 20) Inhibition der Expression des Fas-Liganden durch ein Antisense-Oligonukleotid-2
(1) Synthese von Antisense-Oligonukleotiden
Die Phosphorthioat-Sense-Oligonukleotide S50, S163, S338, S484, S714 und S905 und die Phosphorthioat-Antisense-Oligonukleotide A69, A184, A355, A505, A733 und A924 (SEQ ID NRN. 62 bis 72) wurden in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren durch Verweis auf die DNA-Sequenz, die für den humanen Fas-Liganden kodiert (SEQ ID NR. 30), synthetisiert.
Von den so synthetisierten Oligonukleotiden handelt es sich bei dem Sense-Oligonukleotid S50 und dem Antisense-Oligonukleotid A69 um Oligonukleotide von jeweils 20 Nukleotiden, welche die Nukleotidsequenz (ACCAGCTGCCATGCAGCAGC) vom 50. bis 69. Nukleotid in SEQ ID NR. 30 bzw. die komplementäre Sequenz (GCTGCTGCATGGCAGCTGGT) zu dieser Sequenz enthalten.
Das Sense-Oligonukleotid S163 und das Antisense-Oligonukleotid A184 sind Oligonukleotide von jeweils 22 Nukleotiden, die die Nukleotidsequenz (CTGTGCCCAGAAGGCCTGGTCA) von dem 163. bis 184. Nukleotid in SEQ ID NR. 30 bzw. die komplementäre Sequenz (TGACCAGGCCTTCTGGGCACAG) zu dieser Sequenz enthalten.
Das Sense-Oligonukleotid S338 und das Antisense-Oligonukleotid A355 sind Oligonukleotide von jeweils 18 Nukleotiden, die die Nukleotidsequenz (CTTGGTAGGATTGGGCCT) vom 338. bis 355. Nukleotid in SEQ ID NR. 30 bzw. die komplementäre Sequenz (AGGCCCAATCCTACCAAG) zu dieser Sequenz enthalten.
Das Sense-Oligonukleotid S484 und das Antisense-Oligonukleotid A505 sind Oligonukleotide von jeweils 22 Nukleotiden, die die Nukleotidsequenz (AGCTGAGGAAAGTGGCCCATTT) vom 484. bis 505. Nukleotid in SEQ ID NR. 30 bzw. die komplementäre Sequenz (AAATGGGCCACTTTCCTCAGCT) zu dieser Sequenz enthalten.
Das Sense-Oligonukleotid S714 und das Antisense-Oligonukleotid A733 sind Oligonukleotide von jeweils 20 Nukleotiden, die die Nukleotidsequenz (CCCCAGGATCTGGTGATGAT) vom 714. bis 733. Nukleotid in SEQ ID NR. 30 bzw. die komplementäre Sequenz (ATCATCACCAGATCCTGGGG) zu dieser Sequenz enthalten.
Das Sense-Oligonukleotid S905 und das Antisense-Oligonukleotid A924 sind Oligonukleotide von jeweils 20 Nukleotiden, die die Nukleotidsequenz (AGAGAAGCACTTTGGGATTC) vom 905. bis 924. Nukleotid in SEQ ID NR. 30 bzw. die komplementäre Sequenz (GAATCCCAAAGTGCTTCTCT) zu dieser Sequenz enthalten.
Die resultierenden synthetischen Oligonukleotide wurden jeweils in TE-Puffer mit einer Konzentration von 1 mM gelöst.
(2) Einführen der Antisense-Oligonukleotide in die Zellen
Zunächst wurde eine Fibroblasten-ähnliche Zelllinie L929 der Maus mit dem Plasmid pEX-hFL1 transformiert (siehe erfinderisches Beispiel 12(2)), das die cDNA, kodierend für den humanen Fas-Liganden, trägt. LFLh3-Zellen, die einer der resultierenden Klone sind, wurden in D-MEM suspendiert, das mit 10 % FCS versetzt war, und die Suspensi on wurde in die Vertiefungen einer 6 well-Platte (NUNC) mit 3,0 × 10⁵ Zellen/2,0 ml/Vertiefung verteilt. Die Platte wurde bei 37°C über Nacht in Gegenwart von 5 % CO₂ inkubiert. ⁵¹Cr als Index bewertet.
Am nächsten Tag wurden die in dem obigen Schritt (1) synthetisierten Oligonukleotide jeweils in 1000 μl OPTIMEM^TM I (Gibco BRL), dem Lipofectamin (Gibco BRL) zugesetzt war, suspendiert, um Oligonukleotid-Lipofectamin-Mischlösungen herzustellen. Das Medium wurde entfernt und die Mischlösungen wurden jeweils zu den LFLh3-Zellen gegeben, die über Nacht bei 37°C in Gegenwart von 5 % CO₂ inkubiert wurden. Nach der Inkubation bei 37°C für 4 Stunden in Gegenwart von 5 % CO₂ wurden 1000 μl D-MEM, das mit 20 % hitzeinaktiviertem FCS und 1 μM Oligonukleotid versetzt war, zu der Kultur gegeben, und die Kultur wurde für weitere 16 Stunden inkubiert, um die in dem obigen Schritt (1) synthetisierten Oligonukleotide jeweils in die LFLh3-Zellen einzubringen.
(3) Beurteilung der cytotoxischen Aktivität
Die LFLh3-Zellen, in welche die Oligonukleotide jeweils in dem obigen Schritt (2) eingeführt worden waren, wurden gesammelt und 3 Minuten lang mit Trypsinlösung behandelt. Die Zellen wurden anschließend als Effektorzellen zur Beurteilung der cytotoxischen Aktivität verwendet.
Die cytotoxische Aktivität wurde wie unten beschrieben in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das in den erfinderischen Beispielen 8 und 12 verwendet wurde, bewertet.
10⁶ WC8-Zellen wurden in RPM11640-Medium, enthaltend 20 μCi [⁵¹Cr] Natriumchromat (NEN), bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert, um die WC8-Zellen mit dem ⁵¹Cr zu markieren. Die Effektorzellen, wie oben beschrieben, wurden mit 1 × 10⁴ ⁵¹Cr-markierten Zellen in einem E/Z-Verhältnis von 1 : 1 gemischt. Die Kultur wurde bei 37°C 4 Stunden lang inkubiert, und die cytotoxische Aktivität wurde unter Verwendung der Freisetzung von ⁵¹Cr als Index bewertet.
Die LFLh3-Zellen, welche die Antisense-Oligonukleotide A69, A184, A355, A505, A733 oder A924 in sich eingeführt trugen, zeigten eine Apoptose-Inhibitionsaktivität auf die WC8-Zellen. Die Inhibition der spezifischen Cytolyse durch das Antisense-Oligonukleotid wurde mit Hilfe der folgenden Formel berechnet: Inhibition (%) der spezifischen Cytolyse = {1 – (D/E)} × 100

D:: Spezifische Cytolyserate von LFLh3-Zellen, die das Antisense-Oligonukleotid tragen,
E:: Spezifische Cytolyserate von LFLh3-Zellen, die das Sense-Oligonukleotid tragen.

Die Ergebnisse sind in 38 gezeigt.
(Erfinderisches Beispiel 21) Expression von Deletionsmutanten der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden in einem tierischen Zellwirt
Die Polypeptide ND38 (SEQ ID NR. 74), ND40 (SEQ ID NR. 75), ND41 (SEQ ID NR. 76), ND42 (SEQ ID NR. 77), ND43 (SEQ ID NR. 78) und CD179 (SEQ ID NR. 79), die Deletionsmutanten der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden sind, wurden wie unten beschrieben exprimiert. Es sollte erwähnt werden, dass ND38, ND40, ND41, ND42, ND43 Polypeptide sind, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 3 aufweisen, von der 38, 40, 41, 42 bzw. 43 Aminosäuren an dem N-Terminus deletiert sind. Mit anderen Worten sind ND38, ND40, ND41, ND42 bzw. ND43 Polypeptide, welche die Aminosäuresequenzen der Aminosäuren Nrn: 39 bis 179, 41 bis 179, 42 bis 179, 43 bis 179 und 44 bis 179 der SEQ ID NR. 3 haben. CD179 ist ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 3 hat, von der 1 Aminosäure am C-Terminus deletiert ist. Mit anderen Worten ist CD179 ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1 bis 178 der SEQ ID NR. 3 hat.
(1) Herstellung des Plasmids pM1081
Das Plasmid pM1081 ist ein Plasmid, das eine Nukleotidsequenz trägt, die für das Signalpeptid des humanen Fas-Antigens und die extrazelluläre Domäne des humanen Fas-Liganden kodiert, wobei SpeI- und PshAI-Erkennungssequenzen in die Nukleotidsequenz für das Signalpeptid der humanen Fas-Antigens und eine PstI-Erkennungssequenz in die Nukleotidsequenz, die für den humanen Fas-Liganden kodiert, mit Hilfe stil ler Mutationen eingeführt wurden. Das Plasmid pM1081 wurde wie unten beschrieben hergestellt.
Zunächst wurde ein Antisense-Primer 9 (CTTCTGCAGGTGGAAGAGCTGAGCGACACTAGTCAGAACCAGAGG) (SEQ ID NR. 80) synthetisiert. Dieser Antisense-Primer enthält eine Nukleotidsequenz, die für den N-Terminus des humanen Fas-Liganden und den C-Terminus des Signalpeptids des humanen Fassignals kodiert; eine PstI-Stelle (CTGCAG); eine SpeI-Stelle (ACTAGT); und eine PshAI-Stelle (GACTAGTATC).
100 μl einer Lösung, die 100 pmol des resultierenden Antisense-Primers; 100 pmol des Sense-Primers 8 (TGCGAATTCACCATGCTGGGCATCTGG, enthaltend eine EcoRI-Stelle (GAATTC) und eine Sequenz, die für den N-Terminus des Signalpeptids des humanen Fas-Antigens kodiert, enthält), der in dem erfinderischen Beispiel 18(2) verwendet wurde; 50 ng des Plasmids pBLF58-1, das in dem erfinderischen Beispiel 1(3) verwendet wurde; und 2,5 Einheiten der Pfu-DNA-Polymerase und 10 μl des dazugehörigen Pfu-Puffers enthält, wurden hergestellt. Eine PCR wurde durch Wiederholen des Verfahrens gemäß dem erfinderischen Beispiel 18(1) ausgeführt, und das PCR-Produkt wurde mit EcoRI und PstI doppelverdaut, und das Verdauungsprodukt wurde auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Ein DNA-Fragment von etwa 70 bp wurde gewonnen, und die DNA wurde mit dem QIAEX^TM-Kit gereinigt. Das so gereinigte DNA-Fragment von etwa 70 bp wurde zwischen die EcoRI-Stelle und die PstI-Stelle des Plasmids pM1067, das in dem erfinderischen 18(1) hergestellt wurde, insertiert.
Das resultierende Plasmid wurde auf seine Nukleotidsequenz hin untersucht, und es wurde anschließend nachgewiesen, dass 16 Nukleotide zwischen der EcoRI-Stelle und der SpeI-Stelle fehlten. Um die Sequenz zwischen der EcoRI-Stelle und der SpeI-Stelle herzustellen, wurden ein Sense-Oligonukleotid 9 (AATTCACCATGCTGGGCATCTGGACCCTCCTACCTCTGGTTCTGA) SEQ ID NR. 81 und ein Antisense-Oligonukleotid 10 (CTAGTCAGAACCAGAGGTAGGAGGGTCCAGATGCCCAGCATGGTG) SEQ ID NR. 82 synthetisiert, und 20 μl einer TE-Lösung, enthaltend 1 nmol des so synthetisierten Sense-Oligonukleotids und 1 nmol des Antisense-Oligonukleotids wurden hergestellt. Die Lösung wurde 5 Minuten lang auf 95°C erhitzt und allmählich auf 16°C abgekühlt, um die Oligonukleotide zu annealen und dadurch ein doppelsträngiges DNA-Fragment mit der EcoRI-Spaltstelle und der SpeI-Spaltstelle an gegenüberliegenden Enden zu erhalten. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde zwischen die EcoRI-Stelle und die SpeI-Stelle des Plasmids, in dem 16 Nukleotide fehlten, wie oben beschrieben, insertiert, um das Plasmid pM1081 herzustellen.
(2) Herstellen des Plasmids pM1253, das eine Nukleotidsequenz trägt, die für das Polypeptid ND38 kodiert
Zunächst wurde ein Sense-Primer 11 (CTGACTAGTGTCGCTAAGGAGCTGAGGAAA) SEQ ID NR. 83 synthetisiert. Dieser Sense-Primer 11 enthält eine Nukleotidsequenz, die für das Signalpeptid des humanen Fas-Antigens kodiert; eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz von Lysin (39. Aminosäure) bis Lysin (43. Aminosäure) in SEQ ID NR. 3 kodiert; und eine SpeI-Stelle (ACTAGT). Ein Antisense-Primer 11 (TAAGCCGAAAAACGTCTGAG) SEQ ID NR. 84 wurde ebenfalls chemisch auf Grundlage der Nukleotidsequenz in dem stromabwärts gelegenen 3'-Bereich der ApaI-Stelle (GGGCCC) in SEQ ID NR. 15 synthetisiert.
100 μl einer Lösung, die jeweils 100 pmol des resultierenden Sense-Primers und des Antisense-Primers; 50 ng des Plasmids pEX-hFL1, das in dem erfinderischen Beispiel 12(1) hergestellt wurde; und 2,5 Einheiten der Pfu-DNA-Polymerase und 10 μl des dazugehörigen Pfu-Puffers enthält, wurden hergestellt. Eine PCR wurde durch Wiederholen des Verfahrens gemäß dem erfinderischen Beispiel 18(1) durchgeführt, und das PCR-Produkt wurde mit SpeI und ApaI doppelt verdaut, und das Verdauungsprodukt wurde auf einem Agarosegel der Elektrophorese unterzogen. Ein DNA-Fragment von etwa 400 bp wurde gewonnen, und die DNA wurde mit Hilfe des QIAEX^TM-Kits gereinigt. Das so gereinigte DNA-Fragment von etwa 400 bp wurde zwischen die SpeI-Stelle und die ApaI-Stelle des Plasmids pM1081, das in dem obigen Schritt (1) hergestellt wurde, insertiert, um das Plasmid pM1253 herzustellen.
(3) Herstellung des Plasmids pM1254, das eine Nukleotidsequenz trägt, die für das Polypeptid ND40 kodiert
Zunächst wurde ein Sense-Primer 12 (CTGACTAGTGTCGCTCTGAGGAAAGTGGCC) SEQ ID NR. 85 synthetisiert. Dieser Sense-Primer enthält eine Nukleotidsequenz, die für das Signalpeptid des humanen Fas-Antigens kodiert; eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz von Leucin (41. Aminosäure) bis Alanin (45. Aminosäure) in SEQ ID NR. 3 kodiert; und eine SpeI-Stelle (ACTAGT).
Unter Verwendung des so synthetisierten Sense-Primers und des Antisense-Primers 11 wurde eine PCR durchgeführt durch Wiederholen des Verfahrens gemäß dem obigen Schritt (2), und das PCR-Produkt wurde in das Plasmid pM1081 insertiert, um das Plasmid pM1254 herzustellen.
(4) Herstellung des Plasmids pM1255, das eine Nukleotidsequenz trägt, die für das Polypeptid ND41 kodiert
Zunächst wurde ein Sense-Primer 13 (CTGACTAGTGTCGCTAGGAAAGTGGCCCAT) SEQ ID NR. 86 synthetisiert. Dieser Sense-Primer enthält eine Nukleotidsequenz, die für das Signalpeptid des humanen Fas-Antigens kodiert; eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz von Arginin (42. Aminosäure) bis Histidin (46. Aminosäure) der SEQ ID NR. 3 kodiert; und eine SpeI-Stelle (ACTAGT).
Unter Verwendung des so synthetisierten Sense-Primers und des Antisense-Primers 11 wurde eine PCR ausgeführt durch Wiederholen des Verfahrens gemäß dem Schritt (2) oben, und das PCR-Produkt wurde in das Plasmid pM1081 insertiert, um das Plasmid pM1255 herzustellen.
(5) Herstellung des Plasmids pM1256, das eine Nukleotidsequenz trägt, die für das Polypeptid ND42 kodiert
Zunächst wurde ein Sense-Primer 14 (CTGACTAGTGTCGCTAAAGTGGCCCATTTA) SEQ ID NR. 87 synthetisiert. Dieser Sense-Primer enthält eine Nukleotidsequenz, die für das Signalpeptid des humanen Fas-Antigens kodiert; eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz von Lysin (43. Aminosäure) bis Leucin (47. Aminosäure) der SEQ ID NR. 3 kodiert; und eine SpeI-Stelle (ACTAGT).
Unter Verwendung des so synthetisierten Sense-Primers und des Antisense-Primers 11 wurde eine PCR durchgeführt durch Wiederholen des Verfahrens gemäß dem obigen Schritt (2), und das PCR-Produkt wurde in das Plasmid pM1081 insertiert, um das Plasmid pM1256 herzustellen.
(6) Herstellung des Plasmids pM1257, das eine Nukleotidsequenz trägt, die für das Polypeptid ND43 kodiert
Zunächst wurde ein Sense-Primer 15 (CTGACTAGTGTCGCTGTGGCCCATTTAACA) SEQ ID NR. 88 synthetisiert. Dieser Sense-Primer enthält eine Nukleotidsequenz, die für das Signalpeptid des humanen Fas-Antigens kodiert; eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz von Valin (44. Aminosäure) bis Threonin (48. Aminosäure) der SEQ ID NR. 3 kodiert; und eine SpeI-Stelle (ACTAGT).
Unter Verwendung des so synthetisierten Sense-Primers und des Antisense-Primers 11 wurde eine PCR durchgeführt durch Wiederholen des Verfahrens gemäß dem obigen Schritt (2), und das PCR-Produkt wurde in das Plasmid pM1081 insertiert, um das Plasmid pM1257 herzustellen.
(7) Herstellung des Plasmids pM1259, das eine Nukleotidsequenz trägt, die für das Polypeptid CD179 kodiert
Ein Antisense-Primer 16 (CTTGGTACCCTATTACTTATATAAGCC) SEQ ID NR. 89 und ein Sense-Primer 16 (GAGCTACTGCACTACTGGGC) SEQ ID NR. 90 wurden synthetisiert. Der Antisense-Primer enthält eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz von Glycin (175. Aminosäure) bis Lysin (178. Aminosäure) der SEQ ID NR. 3 kodiert; Terminationscodons (TAA, TAG); und eine KpnI-Stelle (GGTACC). Der Sense-Primer ist die Sequenz, die in dem Upstream 5'-Bereich der ApaI-Stelle (GGGCCC) der SEQ ID NR. 15 liegt, welche die DNA-Sequenz der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden ist.
100 μl einer Lösung, die 100 pmol des resultierenden Antisense-Primers und des Sense-Primers; 50 ng des Plasmids pEX-hFL1, das in dem erfinderischen Beispiel 12(1) hergestellt wurde; und 2,5 U der Pfu-DNA-Polymerase und 10 μl des dazugehörigen Pfu-Puffers enthält, wurden hergestellt. Eine PCR wurde durch Wiederholen des Verfahrens gemäß dem erfinderischen Beispiel 18(1) durchgeführt, und das PCR-Produkt wurde doppelt verdaut mit ApaI und KpnI, und das Verdauungsprodukt wurde auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Ein DNA-Fragment von etwa 170 bp wurde gewonnen, und die DNA wurde mit Hilfe des QIAEX^TM-Kits gereinigt. Das so gereinigte DNA-Fragment von etwa 170 bp wurde zwischen die ApaI-Stelle und die KpnI-Stelle des Plasmids pM1250, das in dem erfinderischen Beispiel 18(2) hergestellt wurde, insertiert. Das resultierende Plasmid wurde pM1259 genannt.
(8) Herstellung von pM1083, pM1084, pM1085, pM1086, pM1087 und pM1089 für die Expression in einer Säugerzelle
Die Plasmide pM1253, pM1254, pM1255, pM1256, pM1257 und pM1259, die in den obigen Schritten (2) bis (7) hergestellt wurden, wurden jeweils mit EcoRI und KpnI doppelverdaut, und die Verdauungsprodukte wurden auf einem Agarosegel der Elektrophorese unterzogen. Ein DNA-Fragment von etwa 450 bp wurde in den Fällen von pM1253, pM1254, pM1255, pM1256 und pM1257 gewonnen, und ein DNA-Fragment von etwa 600 bp wurde in dem Fall von pM1259 gewonnen. Die so gewonnenen DNAs wurden mit Hilfe des QIAEX^TM-Kits gereinigt. Die so gereinigten DNA-Fragmente von etwa 450 bp und etwa 600 bp wurden jeweils zwischen die EcoRI-Stelle und die KpnI-Stelle des Plasmids pM1103, das in dem erfinderischen Beispiel 18(2) für die Expression einer tierischen Wirtszelle verwendet wurde, insertiert. Die resultierenden Plasmide wurden als pM1083 (ND38), pM1084 (ND40), pM1085 (ND41), pM1086 (ND42), pM1087 (ND43) bzw. pM1089 (CD179) bezeichnet.
(9) Einführen in COS-Zellen
pM1070, das in dem erfinderischen Beispiel 18(2) hergestellt wurde und pM1083, pM1084, pM1085, pM1086, pM1087 und pM1089, die in dem obigen Schritt (8) hergestellt wurden, wurden jeweils in COS-1-Zellen eingeführt, wie im Falle des erfinderischen Beispiels 18(3), um die Transformanten COS-1/pM1070, COS-1/pM1083, COS-1/pM1084, COS-1/pM1085, COS-1/pM1086, COS-1/pM1087 und COS-1/pM1089 durch das unten beschriebene Verfahren herzustellen.
Zu 2,5 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM EDTA wurden 0,5 μg pM1070, pM1083, pM1084, pM1085, pM1086, pM1087 bzw. pM1089 gegeben. Zu den resultierenden Lösungen wurden 0,7 ml D-MEM (Nissui Pharmaceutical), enthaltend 0,2 mg/ml DEAE-Dextran und 50 mM Tris-HCl, pH 8, gegeben, um DNA-DEAE-Dextran-Mischlösungen herzustellen. Die resultierenden DNA-DEAE-Dextran-Mischlösungen wurden jeweils tropfenweise auf eine Monolayerkultur von COS-1 Zellen in einer 6 well-Platte (9,4 cm²/Vertiefung, NUNC), die bis zur semi-konfluenten Phase gewachsen waren, gegeben, und die Platte wurde bei 37°C in Gegenwart von 5 % CO₂ inkubiert, um die Transformanten COS-1/pM1070, COS-1/pM1083, COS-1/pM1084, COS-1/pM1085, COS-1/pM1086, COS-1/pM1087 und COS-1/pM1089 herzustellen. Nach 4 stündiger Inkubation wurden die DNA-DEAE-Dextran-Mischungslösungen jeweils entfernt, und D-MEM, enthaltend 10 % FCS (Urban Scientific) wurde zu den Vertiefungen gegeben. Die Inkubation wurde für weitere 96 Stunden fortgesetzt, und die Kulturüberstände wurden jeweils von den Transformanten COS-1/pM1070, COS-1/pM1083, COS-1/pM1084, COS-1/pM1085, COS-1/pM1086, COS-1/pM1087 und COS-1/pM1089 gesammelt. Die so gewonnenen Kulturüberstände wurden für die folgende Evaluierung ihrer cytotoxischen Aktivität verwendet.
(10) Cytotoxische Aktivität der Kulturüberstände der Transformanten
Die cytotoxische Aktivität der Kulturüberstände der transformierten COS Zellen, die in dem obigen Schritt (9) hergestellt wurden, wurde wie in dem Fall der erfinderischen Beispiele 8 und 12 unter Verwendung von WC8-Zellen als Zielzellen untersucht. Die Bewertung wurde wie unten beschrieben durchgeführt.
10⁶ WC8-Zellen wurden in RPM11640-Medium, enthaltend 20 μCi [⁵¹Cr] Natriumchromat (NEN), bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert, um die WC8-Zellen mit dem ⁵¹Cr zu markieren.
Die in dem obigen Schritt (9) hergestellten Zellkulturüberstände wurden jeweils zu der Reaktionslösung, die 1 × 10⁴ ⁵¹Cr-markierte Zellen mit einer Endkonzentration von 1 %, 3 %, 10 % bzw. 30 % enthielt, gegeben. Die Kulturen wurden bei 37°C für 4 Stunden inkubiert, und die cytotoxische Aktivität wurde durch Verwendung der Freisetzung an ⁵¹Cr als Index bewertet.
Die Resultate sind in 39 gezeigt. Wie in 39 erkennbar ist, zeigten die Kulturüberstände von COS-1/pM1083, COS-1/pM1084, COS-1/pM1085 und COS-1/pM1086 eine konzentrationsabhängige cytotoxische Aktivität auf WC8-Zellen, wie in dem Fall von COS-1/pM1070. Es wurde anschließend angenommen, dass die Deletionsmutanten des humanen Fas-Liganden, die in solchen Kulturüberständen vorhanden sind, eine Aktivität zur Bindung an das humane Fas-Antigen haben sollten, um die Apoptose zu induzieren. Andererseits zeigten die Kulturüberstände von COS-1/pM1087 und COS-1/pM1089 eine cytotoxische Aktivität auf WC8-Zellen, die signifikant geringer als die des Überstands von COS-1/pM1070 war, und es wurde dann angenommen, dass die Deletionsmutanten des humanen Fas-Liganden, die in diesen Kulturüberständen vorhanden waren, eine leichte oder keine Apoptose-induzierende Aktivität haben sollten.
Es wird angenommen, dass eine solche Inaktivierung durch die Deletion von einer oder mehr Aminosäuren am N- oder C-Terminus des Fas-Liganden verursacht wurde, die zu einer Veränderung der sterischen Konformation des Fas-Liganden führt. Es wurde dann angenommen, dass, wenn eine Aminosäuresequenz, die fähig ist, die ursprüngliche Konformation des Fas-Liganden wieder herzustellen, an den N- oder C-Terminus des Polypeptids, von dem ein oder mehr Aminosäuren von dessen N- oder C-Terminus deletiert wurde, was zum Verlust der ursprünglichen Konformation führte, angefügt wird, das Polypeptid seine Apoptose-induzierende Aktivität wiedergewinnen würde, selbst wenn die Aminosäuresequenz, die angefügt wurde, sich von der Aminosäuresequenz, die deletiert wurde, unterscheiden würde. In ähnlicher Weise wird angenommen, dass die einmal verlorengegangene Apoptose-induzierende Aktivität den Deletionsmutanten durch Einfügen einer weiteren Mutation, die fähig ist, die ursprüngliche Konformation wieder herzustellen, in die Aminosäuresequenz des Deletionsmutanten wieder verliehen werden kann.
(Erfinderisches Beispiel 22) Expression von Deletionsmutanten der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden in E. coli.
(1) Herstellung des Plasmids pM468
Das Plasmid pM468 ist ein Plasmid, das von dem Plasmid pBR322 abgeleitet ist. Das Plasmid pM468 wurde so konstruiert, dass es die DNA, die für die Funktion kodiert, welche die Replikation in E. coli ermöglicht, ein Ampicillin-Resistenzgen, einen Tryptophan-Promotor, das Signalpeptid für alkalische Phosphatase (phoA) und den humanen Inhibitor von pankreatischem Trypsin enthält. In dem Plasmid pM468 ist das Gen für die Kanamycin-Resistenz des Plasmids pM469 (Morishita, H. et al., Thrombosis Research Band 73, Seiten 193–204, 1994) durch das Ampicillin-Resistenzgen ersetzt.
(2) Herstellung des Plasmids pM1059
Das in dem obigen Schritt (1) hergestellte Plasmid pM468 wurde doppelt verdaut mit HindIII und BamHI, und das Verdauungsprodukt wurde auf einem 0,8 %-igen Agarosegel aufgetrennt (SeakemGTG, Takara Shuzo Co., Ltd.), um das Gel zu isolieren, welches das DNA-Fragment von Interesse enthält. Ein DNA-Fragment von etwa 3,3 kbp wurde mit Hilfes des QIAEX^TM-Kits gereinigt.
Ein Antisense-Primer 17 (CGCGGATCCGGTACCTTTTTTGGTAACCGGGGTAAACAG) (SEQ ID NR. 91) und ein Sense-Primer 17 (CGCAAGTTCACGTAAAAAGC) (SEQ ID NR. 92) wurden chemisch synthetisiert. Der Antisense-Primer enthält eine BamHI-Stelle (GGATCC), eine KpnI-Stelle (GGTACC) und eine BstEII-Stelle (GGTTACC) und eine Sequenz, die für den C-Terminus des Signalpeptids der alkalischen Phosphatase kodiert. Der Sense-Primer ist die Sequenz, die in dem stromaufwärts gelegenen Bereich der HindIII-Stelle in dem Tryptophan-Promotor liegt. Eine PCR wurde wie unten beschrieben unter Verwendung der so synthetisierten Primer und des Plasmids pM468 als Template durchgeführt.
Zu 100 μl einer Lösung, welche die oben beschriebene Template-DNA für die PCR enthielt, wurden die oben beschriebenen Primer zugegeben, und eine PCR wurde durch Wiederholen von 30 Zyklen, umfassend jeweils 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten, unter Verwendung eines Gene Amp^TM-DNA Amplification Reagent Kits mit AmpliTag^TM (Takara Shuzo Co., Ltd.) durchgeführt.
Das resultierende PCR-Produkt wurde doppelt verdaut mit HindIII und BamHI, und das Verdauungsprodukt wurde auf einem 4 %-igen Agarosegel der Elektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment von etwa 120 bp abzutrennen. Das so abgetrennte DNA-Fragment wurde gereinigt und mit dem oben beschriebenen DNA-Fragment von etwa 3,3 kbp aus dem Plasmid pM468 unter Verwendung der T4DNA-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligiert. E. coli JM109 wurde mit dem resultierenden Produkt transformiert, um das Plasmid pM1059 herzustellen.
(3) Herstellung des Plasmids pM1068, das die extrazelluläre Domäne des humanen Fas-Liganden in den Zellen des Wirtes E. coli exprimiert
Ein Sense-Primer 18 (TTGAAGCTTAAAAAAGGGTATAAAATAAAATGCAGCTCTTCCACCT) SEQ ID NR. 93 und ein Antisense-Primer 18 (AAGGTCGACTATTAGAGCTTATATAAGCC) SEQ ID NR. 94 wurden in einem chemischen Synthetisierer synthetisiert. Der Sense-Primer trägt eine Sequenz, die für einen Teil des Tryptophan-Promotors/Operators von E. coli, ein Initiationscodon (ATG), eine Sequenz, die für den N-Terminus der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden der SEQ ID NR. 3 kodiert und eine HindIII-Stelle (AAGCTT) kodiert. Der Antisense-Primer enthält eine Sequenz, die für den C-Terminus der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden der SEQ ID NR. 3, Terminationscodons (TAA, TAG) und eine SalI-Stelle (GTCGAC) kodiert.
100 μl einer Lösung, die jeweils 100 pmol des Antisense-Primers und des Sense-Primers; 50 ng des Plasmids pBX-hFL1; jeweils 20 nmol dATP, dCTP, dGTP und dTTP; und 2,5 Einheiten der Pfu-DNA-Polymerase und 10 μl des dazugehörigen Pfu-Puffers enthält, wurden hergestellt, und eine PCR wurde unter Wiederholung des Verfahrens gemäß dem erfinderischen Beispiel 18(1) durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt wurde doppelt verdaut mit HindIII und SalI, und das Verdauungsprodukt wurde auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Ein DNA-Fragment von etwa 600 bp wurde gewonnen und mit Hilfe des QIAEX^TM-Kits gereinigt. Das so gereinigte DNA-Fragment von etwa 600 bp wurde zwischen die HindIII-Stelle und die SalI-Stelle des Plasmids pM468, das in dem obigen Schritt (1) hergestellt wurde, insertiert, um das Plasmid pM1068 herzustellen.
(4) Herstellung des Plasmids pM1069, das die extrazelluläre Domäne des humanen Fas-Liganden mittels Sezernierung durch den Wirt E. coli exprimiert
Ein Sense-Primer 19 (GGGGGTTACCAAAGCCCAGCTCTTCCACCT) SEQ ID NR. 95, der eine Sequenz enthält, die für einen Teil des Signalpeptids der alkalischen Phosphatase kodiert, eine Sequenz, die für den N-Terminus der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden der SEQ ID NR. 3 kodiert und eine BstEII-Stelle (GGTTACC), wurde synthetisiert.
100 μl einer Lösung, die 100 pmol des so synthetisierten Sense-Primers enthält; 100 pmol des Antisense-Primers 18 (AAGGTCGACTATTAGAGCTTATATAAGCC), der in dem obigen Schritt (3) verwendet wurde; 50 ng des Plasmids pBX-hFL1; jeweils 20 nmol dATP, dCTP, dGTP und dTTP; und 2,5 Einheiten der Pfu-DNA-Polymerase und 10 μl des dazugehörigen Pfu-Puffers wurden hergestellt, und eine PCR wurde unter Wiederholung des Verfahrens gemäß dem erfinderischen Beispiel 18(1) durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt wurde doppelt verdaut mit BstEII und SalI, und das Verdauungsprodukt wurde auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Ein DNA-Fragment von etwa 600 bp wurde gewonnen und mit Hilfe des QIAEX^TM-Kits gereinigt. Das so gereinigte DNA-Fragment von etwa 600 bp wurde zwischen die BstEII-Stelle und die SalI-Stelle des Plasmids pM1059, das in dem obigen Schritt (2) hergestellt wurde, insertiert, um das Plasmid pM1069 herzustellen.
(5) Herstellung des Plasmids pM1073, das den Deletionsmutant der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden (in dem 38 Aminosäuren vom N-Terminus deletiert sind) mittels Sezernierung durch den Wirt E. coli exprimiert
Ein Sense-Primer 20 (CCCGGTTACCAAAGCCAAGGAGCTG) SEQ ID NR. 96 und ein Antisense-Primer 20 (TAAGCCGAAAAACGTCTGAG) SEQ ID NR. 97 wurden chemisch synthetisiert. Der Sense-Primer 20 enthält eine Sequenz, die für einen Teil des Signalpeptids der alkalischen Phosphatase kodiert; eine Sequenz, die für den N-Terminus der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden der SEQ ID NR. 3 kodiert, von dem 38 Aminosäuren von dem N-Terminus fehlen; und eine BstEII-Stelle (GGTTACC). Der Antisense-Primer 20 ist die Nukleotidsequenz in dem stromabwärts gelegenen 3'-Bereich der ApaI-Stelle (GGGCCC) der SEQ ID NR. 15, welche die DNA-Sequenz ist, die für die extrazelluläre Domäne des humanen Fas-Liganden kodiert.
100 μl einer Lösung, enthaltend jeweils 100 pmol des Sense-Primers und des Antisense-Primers; 50 ng des Plasmids pBX-hFL1, das in dem erfinderischen Beispiel 12(1) hergestellt wurde; jeweils 20 nmol dATP, dCTP, dGTP und dTTP; und 2,5 Einheiten der Pfu-DNA-Polymerase und 10 μl des dazugehörigen Pfu-Puffers wurden hergestellt, und eine PCR wurde durch Wiederholen des Verfahrens gemäß dem erfinderischen Beispiel 18(1) durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt wurde doppelt verdaut mit BstEII und ApaI, und das Verdauungsprodukt wurde auf einem Agarosegel der Elektrophorese unterzogen. Ein DNA-Fragment von etwa 300 bp wurde gewonnen und mit Hilfe des QIAEX^TM-Kits gereinigt. Das so gereinigte DNA-Fragment von etwa 300 bp wurde zwischen die BstEII-Stelle und die ApaI-Stelle des Plasmids pM1069, das in dem obigen Schritt (4) hergestellt wurde, insertiert, um das Plasmid pM1073 herzustellen.
(6) Herstellung eines Transformanten und Expression des humanen Fas-Liganden
E. coli JE5505 wurde mit pM1068, pM1069 und pM1073, die in den obigen Schritten (3), (4) bzw. (5) hergestellt wurden, in Übereinstimmung mit dem in Hanahan, D., Techniques for Transformation of E. coli, In: DNA Cloning, Band 1, Glover, D. M. Hrsg., Seiten 109–136, IRL Press, 1985, beschriebenen Verfahren transformiert, um die rekombinanten E. coli JE5505(pM1068), JE5505(pM1069) und JE5505(pM1073) herzustellen.
Die resultierenden Transformanten wurden jeweils in 5 ml L-Medium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, über Nacht inkubiert. 0,5 ml des Kulturmediums wurden in 25 ml M9CA-Medium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, angeimpft, und die Kultur wurde 3 bis 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Als das Kulturmedium eine OD₅₅₀ von etwa 1 aufwies, wurde 3β-Indolacrylsäure (Wako Pure Chemicals) mit einer Endkonzentration von 10 μg/ml dazugegeben, und die Kultur wurde für weitere etwa 24 Stunden inkubiert. Die resultierende Kulturmischung wurde zentrifugiert, um den Überstand und die Zellen getrennt voneinander zu gewinnen.
(7) Western-Blotting des Transformantenüberstandes und der Zellen
Ein Western-Blotting wurde durch Wiederholen des Verfahrens gemäß dem erfinderischen Beispiel 18(5), unter Verwendung eines Kaninchen-Antiserums, das fähig ist, einen Teil der Aminosäuresequenz des humanen Fas-Liganden (PSPPPEKKELRKVAH) zu erkennen, durchgeführt.
Zu den Zellen (Zellen entsprechend 1 ml des Kulturmediums) der Transformanten JE5505(pM1068), JE5505(pM1069) und JE5505(pM1073), die in dem obigen Schritt (6) hergestellt wurden, wurde 1 ml RIPA-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, enthaltend 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,1 % Natriumdeoxycholat, 0,1 % SDS und 0,2 U/ml Aprotinin) gegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt. Die Mischung wurde anschließend zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen. 10 μl des so erhaltenen Überstandes der Zellen und des Überstandes der Kultur der in dem obigen Schritt (6) produzierten Transformanten wurden jeweils mit 5 μl destilliertem Wasser gemischt. Zu diesen Mischungen wurden jeweils 5 μl einer Lösung, die 4 % SDS, 80 % Glycerol und 0,04 % BPB enthält und 5 μl einer Lösung, die 4 % SDS, 80 % Glycerol, 8 % DTT und 0,04 % BPB enthält, gegeben. Die resultierenden Mischungen wurden jeweils 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert und anschließend einer SDS-Polyacryl-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Abschluss der Elektrophorese wurde das Gel auf eine PVDF-Membran (Atto K.K.) bei Raumtemperatur, 200 mA für 60 Minuten transferiert, und die Membran wurde mit der Lösung entrahmter Milch (Snow Brand Milk Products, Co., Ltd.) bei 4°C über Nacht geblockt. Die so geblockte Membran wurde einmal mit PBS gewaschen und zweimal mit 0,1 % Tween 20/PBS.
Das oben beschriebene Kaninchen-Antiserum wurde 1000-fach mit 0,5 % BSA/0,1 % Tween 20/PBS verdünnt, und die Membran wurde mit dem so verdünnten Kaninchen-Antiserum 1 Stunde lang bei 37°C reagieren gelassen. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Membran zweimal mit 0,1 % Tween 20/PBS gewaschen. Die Membran wurde anschließend in eine Lösung des Peroxidase-markierten anti-Kaninchen Immunglobulin-Antikörpers (Kat. Nr. P448, DAKO), der 500-fach mit 0,5 % BSA/0,1 % Tween 20/PBS verdünnt wurde, getaucht und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang reagieren gelassen. Die Membran wurde fünfmal mit 0,1 % Tween 20/PBS gewaschen, und das Wasser auf der Oberfläche wurde entfernt. Die Membran wurde anschließend mit Hilfe des ECL-Systems (Amersham) ausgewertet.
Wie in 40 gezeigt, wurden im Falle der Zellen und des Überstandes von JE5505(pM1068) 2 Banden von etwa 21 kD und etwa 23 kD unter nicht-reduzierenden Bedingungen beobachtet, die der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden entsprechen; und eine Bande wurde bei etwa 23 kD unter reduzierenden Bedingungen beobachtet.
Wie in 41 gezeigt, wurde im Falle der Zellen und des Überstandes von JE5505(pM1069) eine deutliche Bande bei etwa 23 kD sowohl unter nichtreduzierenden Bedingungen als auch unter reduzierenden Bedingungen beobachtet, die der extrazellulären Domäne des humanen Fas-Liganden entspricht.
(Referenzbeispiel 1) Klonierung der cDNA des Fas-Liganden, der aus der gld (C3H gld/gld)-Maus stammt
Splenozyten der gld (C3H gld/gld)-Maus wurden in Übereinstimmung mit dem in dem erfinderischen Beispiel 14 beschriebenen Verfahren kultiviert, und die Synthese einer einzelsträngigen cDNA und die PCR wurden auf dieselbe Weise wie in dem erfinderischen Beispiel 14 beschrieben ausgeführt. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde mit einem Restriktionsenzym XbaI verdaut und unter Verwendung eines 1 %igem Agarosegels isoliert, um ein DNA-Fragment von etwa 940 bp zu gewinnen. Dieses wurde in die XbaI-Stelle des pBluescript IIKS(+) subkloniert, um dessen Nukleotidsequenz (SEQ ID NR. 98) zu bestimmen. Als die so bestimmte Nukleotidsequenz mit der Sequenz verglichen wurde, die in dem erfinderischen Beispiel Beispiel 14 (1) bestätigt wurde, wurde festgestellt, dass die Sequenz des so erhaltenen PCR-Produkts eine Mutation aufweist, in der ein T (Thymidin) nahe dem 3'-Ende der in dem erfinderischen Beispiel 14 (1) bestätigten Sequenz (Position 849 in SEQ ID NR. 31) zu einem C (Cytosin) mutiert ist (SEQ ID NR. 98). Durch diese Mutation einer einzelnen Base trat auch eine Mutation in der Aminosäuresequenz auf. Das heißt, in der gld-Maus ist der 273te Aminosäurerest in der extrazellulären Domäne des Fas-Liganden der Maus von einem Phenylalanin zu Leucin mutiert.
(Referenzbeispiel 2) Cytotoxische Aktivität des von der gld-Maus stammenden Fas-Liganden
Das XbaI-Fragment von etwa 940 bp, das in dem Referenzbeispiel 1 erhalten wurde, wurde in die XbaI-Stelle eines Expressionsvektors pEF-BOS für tierische Zellen insertiert. COS-Zellen wurden auf dieselbe Weise wie in dem erfinderischen Beispiel 14 (2) beschrieben, transformiert. Unter Verwendung der transformierten COS-Zellen als Effektorzellen wurde die cytotoxische Aktivität auf dieselbe Weise, wie in dem erfinderischen Beispiel 14 (3) beschrieben, gemessen. Als Ergebnis zeigten die COS-Zellen, die mit der cDNA für den Fas-Liganden, die aus gld-Mäusen erhalten wurde, transformiert wurden, keine cytotoxische Aktivität (26). Auf Grundlage der obigen Ergebnisse wurde bestätigt, dass eine normale Fas-Liganden-induzierte Apoptose in der gld-Maus, die ein Modelltier für Autoimmunkrankheiten ist, nicht auftritt.
Auf Grundlage der zu diesem Zeitpunkt erhaltenen Ergebnisse und der Ergebnisse, die von Ogasawara J. et al. berichtet wurden, wurde vermutet, dass wenigstens eine Anomalität in dem Fas-Antigen und eine Anomalie in dem Fas-Liganden bei der Ursache von Autoimmunkrankheiten beteiligt sein könnte. In jedem Falle scheinen Autoimmunkrankheiten aufgrund des Fehlens der Fähigkeit, Apoptose in autoreaktiven T-Zellen zu induzieren, die daher nicht aus dem lebenden Körper entfernt werden können, aufzutreten.
Folglich ist offensichtlich, das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ein neues Protein zur Verfügung gestellt wurde, das an das Fas-Antigen bindet. Dieses neue Protein kann als therapeutisches Arzneimittel für die Behandlung von Krankheiten, in denen die Fas-Antigen-vermittelte Apoptose betroffen ist, wie z.B. Autoimmunkrankheiten und virale Infektionen, entwickelt werden. Außerdem kann das neue Protein als Antigen für die Herstellung von Antikörpern und in einem Assay-System, in dem das genannte Protein, das in Proben vorhanden ist, durch eine kompetitive Reaktion unter Verwendung der Antikörper gemessen wird, verwendet werden.
Außerdem wird in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ein DNA-Fragment zur Verfügung gestellt, welches das neue Protein kodiert, das an das Fas-Antigen bindet. Dieses DNA-Fragment kann zur industriellen Produktion des obengenannten neuen Proteins im Großmaßstab unter Anwendung gentechnologischer Verfahren verwendet werden. Es kann außerdem zur Herstellung von DNA-Sonden verwendet werden. Das neue DNA-Fragment kann auch in der Gentherapie zur Behandlung von bestimmten Fällen von Autoimmunkrankheiten, in denen der Mechanismus der Apoptose erblich bedingt fehlt, verwendet werden.
Darüber hinaus führt die Offenbarung der DNA-Sequenz zur Bereitstellung eines Oligonukleotids oder Derivates davon, das eine Nukleotidsequenz enthält, die komplementär zu einem Teil des Fas-Liganden-Gens oder der mRNA für den Fas-Liganden ist. Dieses Oligonukleotid kann nicht nur für die Regulation der Expression des Fas-Liganden, sondern auch als diagnostische Sonde verwendet werden.
Sequenzprotokoll

Claims

Ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NRN. 7 oder 8 dargestellt ist, in welchem optional eine Mutation der Aminosäuresequenz an einer oder mehreren Positionen in der genannten Aminosäuresequenz auftritt und welches fähig ist, die Apoptose einer Fas-Antigen-exprimierenden Zelle zu induzieren und/oder fähig ist, an ein Fas-Antigen zu binden, mit der Maßgabe, dass das Polypeptid kein anti-Fas Antikörper ist.
Ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID NR. 103 dargestellt ist, in welchem optional eine Mutation der Aminosäuresequenz an einer oder mehreren Positionen in der genannten Aminosäuresequenz auftritt und welches fähig ist, die Apoptose einer Fas-Antigen-exprimierenden Zelle zu inhibieren und/oder fähig ist, an ein Fas-Antigen zu binden, mit der Maßgabe, dass das Polypeptid kein anti-Fas Antikörper ist.
Ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NRN. 7, 8 und 103 dargestellt ist.
Ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die fähig ist, mit einer Nukleotidsequenz zu hybridisieren, die eine Aminosäuresequenz kodiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Aminosäuresequenzen, die in den SEQ ID NRN. 7, 8 und 103 dargestellt sind, oder mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz zu hybridisieren, die wenigstens eine Aminosäuresequenz kodiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Aminosäuresequenzen, die in den SEQ ID NRN. 7, 8 und 103 dargestellt sind, wobei das Polypeptid fähig ist, ein Fas-Antigen zu binden und/oder die Aktivität aufweist, Apoptose einer Fas-Antigen-exprimierenden Zelle zu induzieren.
Ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die fähig ist, mit einer Nukleotidsequenz zu hybridisieren, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID NRN. 19, 20 und 104 dargestellt sind oder mit einem komplementären Strang von wenigstens einer Nukleotidsequenz zu hybridisieren, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID NRN. 19, 20 und 104 dargestellt sind.
Ein Polypeptid umfassend einen Teil einer Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID NR. 8 oder SEQ ID NR. 103 dargestellt ist, wobei das Polypeptid fähig ist, an ein Fas-Antigen zu binden, die Aktivität zur Inhibierung der Apoptose einer Fas-Antigen-exprimierenden Zelle aufweist und/oder einen Antikörper gegen einen Fas-Liganden induziert und wobei der genannte Teil aus wenigstens 10 konsekutiven Aminosäuren besteht.
Ein Polypeptid, das wenigstens zwei Polypeptide umfasst, die miteinander fusioniert sind und das einen Teil einer Aminosäuresequenz umfasst, die in der SEQ ID NR. 8 oder 103 dargestellt ist, wobei der genannte Teil fähig ist, ein Fas-Antigen zu binden und/oder die Aktivität zur Induzierung, Inhibierung oder Regulierung der Apoptose einer Fas-Antigen-exprimierenden Zelle aufweist.
Das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Polypeptid durch gentechnologische Verfahren erhalten wird.
Eine DNA umfassend eine Nukleotidsequenz, die für das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.
Eine DNA, welche die Nukleotidsequenz umfasst, die in der SEQ ID NR. 17, SEQ ID NR. 18, SEQ ID NR. 19 oder SEQ ID NR. 20 dargestellt ist, oder die Nukleotidsequenz von Nukleotid 15 bis Nukleotid 404 der SEQ ID NR. 104.
Eine DNA umfassend einen Teil der Nukleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 21 oder SEQ ID NR. 104 dargestellt ist, wobei der genannte Teil wenigstens 15 konsekutive Nukleotide umfasst und fähig ist, in 5 × SSCP enthaltend 50 % Formamid, 1 × Denhardt-Lösung, 0,1 % SDS, 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 10 % (w/v) Dextransulfat bei 28°C mit einer Nukleotidsequenz zu hybridisieren, die komplementär zu den Sequenzen ist, die aus den in den SEQ ID NR. 21 oder 104 dargestellten Nukleotidsequenzen ausgewählt sind.
Eine DNA ausgewählt aus a) einer DNA, die fähig ist, in 5 × SSCP enthaltend 50 % Formamid, 1 × Denhardt-Lösung, 0,1 % SDS, 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 10 % (w/v) Dextransulfat bei 28°C mit einer Nukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID NRN. 17 bis 20 oder 104 dargestellt sind, oder mit einem komplementären Strang von wenigstens einer Nukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID NRN. 17 bis 20 oder 104 dargestellt sind, zu hybridisieren, und b) einer DNA, die als Ergebnis des genetischen Codes degeneriert ist bezogen auf die DNA-Sequenz, die in a) definiert ist, wobei die genannte DNA einen Fas-Liganden kodiert.
Ein rekombinantes DNA-Molekül, das die DNA gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 umfasst.
Eine Zelle, die mit der DNA gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 transformiert ist.
Die Zelle gemäß Anspruch 14, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) E. coli, b) Hefe und c) Säugerzellen.
Ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, das die Kultivierung des Transformanden gemäß den Ansprüchen 14 oder 15 und die Gewinnung und Reinigung des genannten Polypeptids aus der Kulturmischung umfasst.
Ein Verfahren zur Reinigung des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 aus einer Probe, die das genannte Polypeptid enthält, wobei das genannte Verfahren wenigstens eine Reinigung ausgewählt aus (1) einer Affnitäts-Chromatografie, in der das Fas-Antigen verwendet wird und (2) einer Affinitäts-Chromatografie, in der ein Antikörper verwendet wird, der das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 erkennt, umfasst.
Ein Antikörper oder ein Fragment davon, der das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 spezifisch bindet.
Der Antikörper oder das Fragment davon gemäß Anspruch 18, wobei der genannte Antikörper oder das Fragment davon ein monoklonaler Antikörper ist.
Der Antikörper oder das Fragment davon gemäß Anspruch 18, wobei der genannte Antikörper oder das Fragment davon ein polyklonaler Antikörper ist.
Der Antikörper oder das Fragment davon gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei der genannte Antikörper oder das Fragment davon fähig ist, Apoptose zu inhibieren.
Ein Oligonukleotid oder ein Derivat davon, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die komplementär zu einem Teil des Gens eines Fas-Liganden oder zu einem Teil der mRNA für einen Fas-Liganden ist, wobei das genannte Oligonukleotid oder Derivat davon wenigstens 15 Basen umfasst und fähig ist, die Expression eines Fas-Liganden zu regulieren oder fähig ist, in 5 × SSCP enthaltend 50 % Formamid, 1 × Denhardt-Lösung, 0,1 % SDS, 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 10 % (w/v) Dextransulfat bei 28°C mit einer Nukleotidsequenz zu hybridisieren, die aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID NRN. 17 bis 20, 25, 99 bis 102 und 104 dargestellt sind, ausgewählt ist.
Das Oligonukleotid oder ein Derivat davon gemäß Anspruch 22, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die komplementär zu einem Teil der Nukleotidsequenz ist, die aus der Gruppe von Nukleotidsequenzen ausgewählt ist, die in den SEQ ID NRN. 17 bis 20, 25, 104 und 99 bis 102 dargestellt sind und das fähig ist, mit der Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe von Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID NRN. 17 bis 20, 25, 99 bis 102 und 104 dargestellt sind, zu hybridisieren.
Das Oligonukleotid oder Derivat davon gemäß Anspruch 22 oder 23, wobei das genannte Oligonukleotid oder dessen Derivat fähig ist, die Expression eines Fas-Liganden zu regulieren.
Das Oligonukleotid oder Derivat davon gemäß einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei das genannte Oligonukleotid oder dessen Derivat fähig ist, die Expression des Fas-Liganden zu inhibieren.
Ein Verfahren zum Screenen einer Substanz, die mit einem Fas-Liganden oder einem Fas-Antigen in Beziehung steht, das die Verwendung von wenigstens einem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, einer DNA gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12 oder einem Tranformanden, der dieselbe exprimiert, umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26 zum Screenen einer Substanz, die mit einem Fas-Liganden oder einem Fas-Antigen in Beziehung steht, das weiterhin die Verwendung eines Fas-Antigens oder einer Fas-Antigen-exprimierenden Zelle umfasst.
Das Screeningverfahren gemäß Anspruch 26 oder 27, worin eine zu untersuchende Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Substanzen, die an den genannten Fas-Liganden binden, die einen Einfluss auf die Expression des genannten Fas-Liganden haben, die einen Einfluss auf die Expression des genannten Fas-Antigen haben und die einen Einfluss auf die Wirkung des genannten Fas-Liganden auf dessen Zielzellen haben.
Das Screeningverfahren gemäß einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei das genannte Verfahren einen Schritt enthält, der aus den folgenden Schritten (1) bis (3) ausgewählt ist (1) a) wenigstens ein Produkt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, Transformanden, die dieselben exprimieren und Kulturüberständen der Transformanden, wird zusammen mit Zellen, die Fas-Antigen exprimieren, kultiviert, b) eine zu testende Substanz oder eine Probe, welche die zu testende Substanz enthält, wird zu dem obigen System (a) gegeben, und c) wenigstens ein Parameter ausgewählt aus der Lebensfähigkeit, morphologischen Veränderungen und biochemischen Veränderungen in den Fas-Antigen-exprimierenden Zellen, wird gemessen; (2) a) eine zu testende Substanz oder eine Probe, welche die zu testende Substanz enthält, wird zusammen mit wenigstens einem Produkt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, Transformanden, welche dieselben exprimieren und Kulturüberständen der Transformanden, inkubiert, b) Zellen, die Fas-Antigen exprimieren, werden zu dem obigen System (a) gegeben und kultiviert, und c) wenigstens ein Parameter ausgewählt aus der Lebensfähigkeit, morphologischen Veränderungen und biochemischen Veränderungen in den Fas-Antigen-exprimierenden Zellen, wird gemessen; und (3) a) eine zu testende Substanz oder eine Probe, welche die zu testende Substanz enthält, wird zusammen mit Zellen, die Fas-Antigen exprimieren, inkubiert, b) wenigstens ein Produkt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, Transformanden, welche dieselben exprimieren und Kulturüberständen der Transformanden, wird zu dem obigen System (a) gegeben und kultiviert, und c) wenigstens ein Parameter ausgewählt aus der Lebensfähigkeit, morphologischen Veränderungen und biochemischen Veränderungen in den Fas-Antigen-exprimierenden Zellen, wird gemessen.
Ein Polypeptid bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die in einer der SEQ ID NRN. 1, 2, 51 bis 54, 59 und 74 bis 79 dargestellt ist.
Eine DNA, die aus einer Nukleotidsequenz besteht, welche das Polypeptid gemäß Anspruch 30 kodiert.
Eine DNA, die aus der Nukleotidsequenz besteht, die in der SEQ ID NR. 13 oder 14 dargestellt ist.
Ein Antikörper oder ein Fragment davon, der ein Peptid erkennt, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die in einer der SEQ ID NRN. 51 bis 54 und 59 dargestellt ist.
Das Oligonukleotid oder ein Derivat davon gemäß einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei das genannte Oligonukleotid oder dessen Derivat fähig ist, die Apoptose einer Fas-Antigen-exprimierenden Zelle zu regulieren.
Das Oligonukleotid oder ein Derivat davon gemäß einem der Ansprüche 22 bis 25 oder 34, wobei das genannte Oligonukleotid oder dessen Derivat fähig ist, die Apoptose einer Fas-Antigen-exprimierenden Zelle zu inhibieren.
Das Oligonukleotid oder ein Derivat davon gemäß einem der Ansprüche 22 bis 25, 34 oder 35, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die komplementär zu einem der folgenden ist: dem Translationsinitiationscodon-Bereich, der Ribosomenbindungsstelle, der Capping-Stelle, der Splicing-Stelle oder der Stem-loop-bildenden Region eines Fas-Liganden-Gens oder der mRNA für einen Fas-Liganden, oder die an den Translationsinitiationscodon-Bereich, die Ribosomenbindungsstelle, die Capping-Stelle, die Splicing-Stelle oder die Stem-loop-bildende Region eines Fas-Liganden-Gens oder die mRNA für einen Fas-Liganden bindet.
Das Oligonukleotid oder ein Derivat davon gemäß einem der Ansprüche 22 bis 25, 34 bis 36, das 15 bis 30 Basen umfasst.