DE69733773T2 - Fas ANTIGEN-DERIVATE - Google Patents

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Norio Nakamura
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Mochida Pharmaceutical Co Ltd
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Description

  • Technisches Gebiet
  • Diese Erfindung stellt auf dem Gebiet der Medikamente ein neues Fas Antigen-Derivat zur Verfügung, dessen Aktivitäten und dergleichen verbessert sind und ein neues DNA-Fragment, welches dasselbe kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein rekombinantes DNA-Molekül zur Verfügung, das das genannte DNA-Fragment enthält, einen Transformanten und ein Verfahren zur Herstellung des genannten neuen Fas Antigen-Derivates.
  • Hintergrund
  • Das humane Fas Antigen ist ein Polypeptid, das auf der Oberfläche von verschiedenen Zellen verteilt ist und mit einer Art des Zelltods, die Apoptose genannt wird, in Zusammenhang gebracht wird. Die Homöostase des lebenden Körpers wird geschickt durch das Wachstum und die Differenzierung von Zellen sowie deren Tod reguliert, und Apoptose ist eine Art des Zelltodes, die sich von der Nekrose unter den Sterbearten von Zellen unterscheidet. Es ist bekannt, dass der Tod von Zellen, der für die Aufrechterhaltung der Homöostase des lebenden Körpers erforderlich ist, nämlich ein Fall des Zelltodes, in dem Zellen, die für den lebendigen Körper unnötig sind, entfernt werden oder virusinfizierte Zellen oder Tumorzellen angegriffen und durch cytotoxische T-Lymphozyten (CTL) oder natürliche Killerzellen (NK-Zellen) entfernt werden, hauptsächlich auf Apoptose basiert.
  • Die genaue Beschaffenheit des Fas Antigens, das ein monoklonaler Antikörper ist, der durch Immunisieren von Mäusen mit humanen Fibroblasten erhalten wurde, wie ursprünglich von Yonehara, S. et al. (J. Exp. Med., Band 169, Seiten 1747–1756, 1989) als ein Zelloberflächenantigen entdeckt, das durch einen anti-Fas Antikörper erkannt wird, der fähig ist, Apoptose in bestimmten Zellen zu induzieren (Yonehara S. et al.) und ein Apoptosesignal an die Zellen überträgt, blieb lange Zeit unerklärt.
  • Kürzlich wurde ein Fas Antigen-Gen kloniert, das zeigte, dass das Fas Antigen ein Typ I-Transmembranglycoprotein ist, das gemäß seiner Aminosäuresequenz zu der NGFR (nerve growth factor receptor, Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor)/TNFR (TNF-Rezeptor)-Familie gehört, die physiologisch wichtige Zelloberflächen-Membranproteine bildet (Itoh, N. et al., Cell, Band 66, Seiten 233–243, 1991). Ein Maus-Fas Antigen-Gen wurde ebenfalls kloniert (Watanabe-Fukunaga, R. et al., J. Immunol., Band 148, Seiten 1274–1279, 1992), was bestätigte, dass die Fas Antigen-mRNA in Thymus, Leber, Lunge, Herz und Ovarium der Maus exprimiert wird. Von seiner Expression im Menschen in verschiedenen Geweben und Zellen, wie z.B. Lymphozyten, Hepatozyten, Epithelzellen des Dünndarms, Haut-Keratinozyten und Osteoblasten wurde ebenfalls berichtet (Leithauser, F. et al., Lab. Invest., Band 69, Seiten 415–429, 1993).
  • Das Fas Antigen, von dem ursprünglich angenommen wurde, dass es auf der Oberfläche von Zellen vorhanden ist, wurde auch im Blut und in Kulturüberständen nachgewiesen, und seine Präsenz in Form eines löslichen Fas Antigens (sFas) wurde ebenfalls gefunden, so dass dessen physiologische Funktionen und dergleichen in den letzten Jahren interessant geworden sind.
  • Cheng et al. (Science, Band 263, Seiten 1759–1762, 1994) berichteten, dass sie ein mRNA-Molekül, das für eine lösliche Form des Fas Antigens des ΔTM-Typs kodiert, gefunden haben, das durch die Deletion des Exon IV (entspricht 14 Basenpaaren der extrazellulären Region und 49 Basenpaaren der Transmembranregion) aufgrund von alternativem Splicing ein secretor-Molekül kodieren zu schien, dass die Konzentration des löslichen Fas Antigens in den Sera von Patienten mit systemischem Lupus Erythematosus (SLE) hoch war und dass ein Anstieg in den autologen gemischten Lymphozytenreaktionen beobachtet wurde, zusammen mit einem Anstieg der Anzahl von Splenozyten, wenn ein chimäres Molekül, zusammengesetzt aus der extrazellulären Region des Fas Antigens der Maus und der Fc-Einheit des humanen IgG, Mäusen verabreicht wurde. Ferner haben Cascino, I. et al. (J. Immunol., Band 154, Seiten 2706–2713, 1995) berichtet, dass wenigstens drei Fas Antigen-kodierende mRNA-Moleküle existieren, ein schließlich der gerade beschriebenen Fas Antigen-mRNA. Obwohl ihre physiologischen Funktionen, Expressionsbereiche und dergleichen noch unklar sind, wurde gezeigt, dass das rekombinante Fas Antigen vom ΔTM-Typ die cytotoxische Aktivität des Fas Liganden in einer konzentrationsabhängigen Weise inhibiert und dass die meisten Fas Antigene vom löslichen Typ, die in den Sera von gesunden Menschen und SLE-Patienten vorkommen, Fas Antigene vom ΔTM-Typ sind, die von Splice-Varianten kodiert werden (Advance in Medical Science), Band 174, Seiten 1136–1140, 1995).
  • Darüber hinaus haben Kimura, K. et al. kürzlich ein Fas Antigen-Gen aus der Ratte kloniert und berichtet, dass zwei Arten von Fas Antigen-mRNA in mRNA aus Rattenleber detektiert werden können, die auf alternativem Splicen beruhen, und dass ein mRNA-Molekül, das ein Peptid kodiert, welches ein geringeres Molekulargewicht hat, zusätzlich zu den mRNAs des Fas Antigens des Membranbindungstyps vorhanden ist (Biochemical and Biophysical Research Comunications, Band 198 (2), Seiten 666–674 (1994)), und sie haben ferner Mutanten (Varianten) des korrespondierenden humanen Fas Antigens isoliert und identifiziert (japanische Patentanmeldung Kokai Nr. 7-289266).
  • Andererseits ist der humane Fas Ligand ein Polypeptid, von dem von Nagata et al. berichtet wurde, dass es ein biologisches Molekül ist, das die Apoptose von Fas Antigenexprimierenden Zellen induziert (Takahashi, T. et al., International Immunology, Band 6, Seiten 1567–1574, 1994). Der humane Fas Ligand ist ein Typ II-Membranprotein der TNF-Familie mit einem Molekulargewicht von etwa 40 kD. Wie in dem Fall von TNF wird von dem humanen Fas Liganden angenommen, dass er im menschlichen Körper in der Form eines Trimers vorliegt (Tanaka, M. et al., EMBO Journal, Band 14, Seiten 1129–1135, 1995). Die extrazelluläre Domäne des humanen Fas Liganden ist stark homolog mit der extrazellulären Domäne des Fas Liganden aus der Ratte (Suda, T. et al., Cell, Band 75, Seiten 1169–1178, 1993) und dem Fas Liganden aus der Maus (Takahashi, T. et al., Band 76, Seiten 969–976, 1994). Der humane Fas Ligand erkennt nicht nur das humane Fas Antigen, sondern auch das Maus-Fas Antigen und induziert Apoptose. Andererseits erkennen der Fas Ligand aus der Ratte und der Fas Ligand aus der Maus das humane Fas Antigen, um die Apoptose zu induzieren.
  • Die Apoptose hat für Aufmerksamkeit aufgrund ihrer engen Beteiligung an der Homöostase eines Organismus gesorgt. Die Homologie der Fas Liganden unter den verschiedenen Spezies, wie oben erwähnt, legt eine wichtige Rolle für die Apoptose, die durch den Fas Liganden und das Fas Antigen vermittelt wird, bei der Homöostase von Organismen nahe.
  • Kürzlich wurde von einem interessanten Zusammenhang von einer Anomalie des Fas Liganden und des Fas Antigens mit einer Autoimmunkrankheit berichtet. In diesem Bericht wird nahegelegt, dass MRL-Ipr/Ipr (ein Modell-Mausstamm für eine Autoimmunkrankheit) eine Mutation in seinem Fas Antigen-Gen aufweist und dass in den Zellen, die solche Mutanten-Fas Antigen-Gene exprimieren, keine Apoptose induziert wird (Watanabe-Fukunaga, R. et al., Nature, Band 356, Seiten 314–317, 1993; Adachi, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 90, 1993). In der Zwischenzeit wurde außerdem berichtet, dass C3H-gld/gld (ein weiterer Modell-Mausstamm für eine Autoimmunkrankheit) eine Mutation in seinem Fas Liganden-Gen aufweist und dass der Fas Ligand der gld-Maus keine Apoptose-induzierende Wirkung hat. Bei der Mutation in dem Fas Liganden-Gen der gld-Maus handelt es sich um eine Punktmutation, und als Folge einer derartigen Punktmutation ist die 7. Aminosäure ausgehend von dem C-Terminus der extrazellulären Domäne des Fas Liganden durch eine andere Aminosäure ersetzt (Tomohiro Takahashi, et al., Cell, Band 76, Seiten 969–976, 1994). Der Fas Ligand der oben beschriebenen gld-Maus ist unfähig, das Fas Antigen zu binden (Fred Ramsdell, et al., Eur. J. Immunol., Band 24, Seiten 928–933, 1994).
  • Ferner wurde im Falle von SLE-Patienten eine Erhöhung der Menge an Fas Antigen des löslichen Typs im Blut (Cheng et al., Science, Band 263, Seiten 1759–1762, 1994) und ein Anstieg der Expression eines Fas Antigens auf der Oberfläche von Lymphozyten (Amasaki T. et al., Clin. Exp. Immunol., Band 99, Seiten 245–250, 1995) berichtet, und es wurde eine Möglichkeit angedeutet, dass die Anormalität eines Fas Antigen-Gens, einhergehend mit der anormalen Expression und Funktion des Fas Antigens, auch am Lymphozytosesyndrom beteiligt ist (Rieux Laucat et al., Science, Band 268, Seiten 1347–1349, 1995 und Fisher G. H. et al., Cell, Band 81, Seiten 935–946, 1995).
  • Die oben beschriebene Entdeckung führte zu der Hypothese, dass einige Autoimmunkrankheiten durch die Anormalität des Fas Antigens oder des Fas Liganden, und zwar durch die autoreaktiven T-Zellen, die in dem Körper zurückbleiben und die durch Apoptose aus dem Körper hätten entfernt werden sollen, wenn die Zellen normal gewesen wären, induziert werden.
  • In letzter Zeit wird erwägt, dass die anormale Vermehrung und Gelenkzytoklase der Synovialmembran, die bei Gelenkrheumatismus stattfindet, ebenfalls durch das Fehlen einer normalen Apoptose der Zelle induziert wird. Kobayashi, N. et al. nehmen weiterhin an, dass die Verringerung der Anzahl der T-Zellen nach Infektion durch das AIDS-Virus durch den Fas Liganden vermittelt wird, da die Expression des Fas Antigens auf der T-Zell-Membran nach Infektion durch das AIDS-Virus induziert wird (Nikkei Science, Band 6, Seiten 34–41, 1993).
  • Eine Beteiligung der Apoptose durch den Fas Liganden wurde ebenfalls für die fulminante virale Hepatitis und ähnliche Krankheiten vorgeschlagen (Nagata, S. et al., Immunol. Today, Band 16, Seiten 39–43, 1995). Folglich wurde, da der Zusammenhang zwischen Fas Antigen-vermittelter Apoptose und Krankheiten aufgedeckt wurde, großes Interesse auf den Einsatz von Fas Ligand oder Fas Antigen zur Behandlung von Krankheiten, die von einer anormalen Apoptose begleitet werden, nämlich den zuvor genannten Autoimmunkrankheiten, Rheuma, AIDS und dergleichen, gerichtet.
  • Beispiele für Substanzen, die eine Fas Antigen-vermittelte Apoptose inhibieren und bisher beschrieben wurden, schließen ein Fas Antigen des ΔTM-Typs, ein Fusionsprotein der extrazellulären Region des Fas Antigens mit der Fc-Region von Immunglobulin G (IgG) sowie ein Fragment des anti-Fas Antikörpers (Dhein J. et al., Nature, Band 373, Seiten 438–441, 1995) und einen anti-Fas antagonistischen Antikörper (Alderson M. A. et al., Int. Immunol., Band 6, Seiten 1799–1806, 1994) ein.
  • Nagata et al. haben ebenfalls berichtet, dass es ihnen gelungen ist, einen Antikörper gegen den Fas Liganden zu erhalten, und dass ein solcher Antikörper fähig war, die Apoptose zu unterdrücken (Masato Tanaka, et al., EMBO Journal, Band 14, Seiten 1129–1135, 1995; internationale veröffentlichte Patentanmeldung Nr. WO95/13293).
  • Wie vorhergehend beschrieben, wurde, da die Fas Antigene isoliert worden sind, aufgedeckt, dass die Apoptose im lebenden Körper über diese Fas Antigene induziert werden, und dass die Fas Antigen-vermittelte Apoptose an verschiedenen Krankheiten beteiligt ist, so dass man der Ansicht ist, dass eine Substanz, die fähig ist, die Fas Antigenvermittelte Apoptose zu kontrollieren, nützlich bei der Prävention, Behandlung und Diagnose von Krankheiten sein wird, an denen Apoptose vermutlich beteiligt ist. Obwohl die Nützlichkeit einer pharmazeutischen Herstellung im lebenden Körper unter Berücksichtigung seiner Aktivität, biologischem Verhalten, Sicherheit, Nebenwirkungen und dergleichen bewertet werden sollte, wird eine Substanz, die eine besonders hohe Aktivität hat, ihre Wirkungskraft auf den lebenden Körper bei einer geringen Dosierung ausüben, so dass sie eine hohe industrielle Nutzbarkeit haben wird. Daher wurde ein starkes Interesse auf die Entwicklung eines verbesserten neuen Fas Antigen-Derivates, insbesondere eines Fas Antigen-Derivates, das eine höhere Aktivität aufweist und die Aufklärung seiner Eigenschaften gerichtet, insbesondere, wenn man seine Anwendung für den lebenden Körper, wie z.B. die Behandlung eines Menschen, berücksichtigt, wird vom Standpunkt der Effizienz und Sicherheit ein neues Fas Antigen-Derivat erwartet, das fähig ist, die Fas Antigen-vermittelte Apoptose bei einer geringeren Dosis zu kontrollieren.
  • Außerdem ist die Errungenschaft eines neuen Fas Antigen-Derivates auch wichtig für die Aufklärung z.B. von der Interaktion des Fas Antigens und des Fas Liganden und des Mechanismus der Fas Antigen-vermittelten Apoptose.
  • Es ist bekannt, dass ein Polypeptid seine Aktivität sogar in Form eines partiellen Fragmentes zeigen kann, wenn das Fragment seine intrinsische Struktur an dem aktiven Zentrum behält. Dagegen sind jedoch auch viele Fälle bekannt, bei denen sich die Aktivität eines Polypeptids durch eine Mutation oder Deletion von selbst einer Aminosäure in dem Polypeptid verändert oder im extremen Fall verloren geht.
  • Daher war es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, auf dem Gebiet der Medikamente ein neues Fas Antigen-Derivat zur Verfügung zu stellen, dessen Aktivität und dergleichen verbessert sind sowie ein neues DNA-Fragment, das dasselbe kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein rekombinantes DNA-Molekül und einen Transformanten zur Verfügung, der das genannte DNA-Fragment enthält sowie ein Verfahren für die Herstellung des genannten neuen Fas Antigen-Derivates.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Unter den oben erwähnten Umständen haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass ein neues Fas Antigen-Derivat, in dem wenigstens 13 Aminosäurereste von dem N-terminalen Bereich des Fas Antigens deletiert sind, eine verbesserte Aktivität oder Funktion im Vergleich mit dem Fas Antigen oder dem Fas Antigen-Derivat aus dem Stand der Technik zeigt, und die vorliegende Erfindung ist als ein Ergebnis intensiver Bemühungen zustande gekommen.
  • Folglich wird gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein neues Fas Antigen-Derivat zur Verfügung gestellt, wenigstens ein neues Fas Antigen-Derivat, das wenigstens einen Bestandteil oder den gesamten Teil des Polypeptids der extrazellulären Region des Fas Antigens umfasst, in dem wenigstens 13 Aminosäurereste von einer Gruppe von Aminosäureresten, beginnend vom N-terminalen Aminosäurerest des Fas Antigen-Polypeptids, bis zu einem Cysteinrest, das am Nächsten an der N-terminalen Seite liegt (ausschließlich dem genannten Cysteinrest), deletiert sind. Es wird außerdem ein neues Fas Antigen-Derivat gemäß dem oben beschriebenen zur Verfügung gestellt, worin es einen Bestandteil oder den gesamten Teil der extrazellulären Region des Fas Antigen-Polypeptids enthält, in dem wenigstens 13 Aminosäurereste von dem 1. bis 42. Aminosäurerest, gezählt von dem N-Terminus der SEQ ID NO: 15 in dem Sequenzprotokoll, deletiert sind und ein neues Fas Antigen-Derivat gemäß dem oben beschriebenen, worin die Anzahl der deletierten Aminosäurereste 29 oder mehr beträgt, insbesondere ein neues Fas Antigen-Derivat gemäß dem oben beschriebenen, worin die Anzahl der deletierten Aminosäurereste 29 ist.
  • Es wird außerdem ein neues Fas Antigen-Derivat zur Verfügung gestellt, das eine neue Fas Antigen-Variante des oben erwähnten Derivates ist, wobei es ein oder zwei oder mehr Teile des Fas Antigens umfasst oder es ein Fusionspolypeptid ist, das entweder eine der neuen Fas Antigen-Varianten umfasst oder andere (Poly)peptide, insbesondere wenigstens ein (Poly)peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Peptiden, das in dem C-terminalen Bereich des neuen Fas Antigen-Derivates enthalten ist:
    • a. Ein Anteil oder der gesamte Teil der Hinge-Region von Immunglobulin.
    • b. Ein Anteil oder der gesamte Teil des Fc-Fragments von Immunglobulin.
  • Es wird außerdem ein neues Fas Antigen-Derivat zur Verfügung gestellt, das ein Polymer des zuvor erwähnten Fas Antigen-Derivates ist.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein DNA-Fragment zur Verfügung gestellt, das eine DNA-Sequenz umfasst, die für das zuvor erwähnte neue Fas Antigen-Derivat kodiert, insbesondere ein DNA-Fragment, das die DNA-Sequenz umfasst, die in den SEQ ID NO: 12 bis 14 des Sequenzprotokolls beschrieben sind.
  • Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes DNA-Molekül zur Verfügung gestellt, das die Nukleotidsequenz des genannten DNA-Fragments umfasst.
  • Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Transformant zur Verfügung gestellt, der mit dem gerade beschriebenen neuen rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist.
  • Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird unter den Herstellungsverfahren für das oben erwähnte neue Fas Antigen-Derivat ein Verfahren für die Herstellung des obengenannten neuen Fas Antigen-Derivates zur Verfügung gestellt, das die folgenden Schritte umfasst: Kultivieren des gerade beschriebenen Transformanten und Gewinnen und Reinigen des neuen Fas Antigen-Derivates aus der genannten Kulturmischung.
  • Gemäß einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Medikament zur Verfügung gestellt, das das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt oder ein physiologisch annehmbares Salz davon als seine Wirksubstanz umfasst.
  • Gemäß einem siebenten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung der Aktivität oder Funktion des Fas Antigens oder des Fas Antigen-Derivates zur Verfügung gestellt, welches das Deletieren von wenigstens 13 der Aminosäurereste, beginnend von dem N-terminalen Aminosäurerest des Fas Antigens bis zu einem Cysteinrest, der am Nächsten an der N-terminalen Seite liegt (ausschließlich dem genannten Cysteinrest), umfasst.
  • In diesem Zusammenhang enthält das bekannte humane Fas Antigen eine Aminosäuresequenz, die von der cDNA-Sequenz abgeleitet ist, die in 1 und 2 (SEQ ID NO: 16) gezeigt ist. Es wird angenommen, dass das Antigen als ein Typ I-Transmembranprotein vorliegt, das als Ergebnis der Abspaltung seines Signalpeptids, das aus 16 Resten der Aminosäuresequenz besteht, aus 319 Aminosäuren besteht und dass es eine extrazelluläre Region aus 157 Aminosäuren (vom 1. bis 157. Rest), eine Transmembranregion aus 17 Aminosäuren (vom 158. bis 174. Rest) und eine cytoplasmatische Region (cytoplasmic tail region) von 145 Aminosäuren (175. bis 319. Rest) hat. Die extrazelluläre Region des humanen Fas Antigens hat eine Funktion, Fas-Ligand zu bilden, und ein Polypeptid, das aus der Expression der extrazellulären Region allein resultiert, existiert als ein löslicher Typ und zeigt eine Apoptose-inhibierende Aktivität durch Binden an den Fas Liganden. Zusätzlich besteht gemäß den Computeranalysen der vorliegenden Erfindung, die später im Detail beschrieben werden, die Möglichkeit, dass der 43. Cysteinrest, gezählt von dem N-Terminus, eine bestimmte Bindung mit anderen Aminosäureresten eingeht, wodurch er zu der Aufrechterhaltung der Domänenstruktur der extrazellulären Region des Fas Antigens beiträgt. Andererseits scheint der Cysteinrest, der am Nächsten an dem C-Terminus der extrazellulären Region des Fas Antigens liegt, ebenfalls für die Aufrechterhaltung der Struktur notwendig zu sein, jedoch wird angenommen, da das zuvor erwähnte Fas Antigen vom ΔTM-Typ an den Fas Liganden bindet, dass die fünf Reste im C-Terminus, nämlich von dem 153. Glycinrest bis zum 157. Asparaginrest, nicht für die Aktivität notwendig sind.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist ein Bild, das die Nukleotidsequenz eines DNA-Fragments zeigt, das für humanes Fas Antigen kodiert sowie eine Aminosäuresequenz, die daraus hergeleitet ist. Das Symbol * zeigt mögliche N-Glycosylierungsstellen und der unterstrichene Teil zeigt die vorhergesagte Transmembranregion.
  • 2 ist ein Bild, das die Nukleotidsequenz eines DNA-Fragments zeigt, das für humanes Fas Antigen kodiert sowie eine Aminosäuresequenz, die daraus hergeleitet ist. Das Symbol * zeigt mögliche N-Glycosylierungsstellen und der unterstrichene Teil zeigt die vorhergesagte Transmembranregion.
  • 3 ist ein Bild, das die Teil-Nukleotidsequenz in einem Vektor zeigt, der eine cDNA-Nukleotidsequenz enthält (SEQ ID NO: 17), die für shFas(nd29) kodiert, das eines der neuen Fas Antigen-Derivate gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist und die daraus hergeleitete Aminosäuresequenz. Das Symbol * zeigt mögliche N-Glycosylierungsstellen.
  • 4 ist ein Bild, das die Teil-Nukleotidsequenz in einem Vektor zeigt, der eine cDNA-Nukleotidsequenz enthält (SEQ ID NO: 18), die für shFas(nd29)-Fc kodiert, das eines der neuen Fas Antigen-Derivate gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist und die daraus hergeleitete Aminosäuresequenz. Das Symbol * zeigt mögliche N-Glycosylierungsstellen.
  • 5 ist ein Bild, das die Teil-Nukleotidsequenz in einem Vektor zeigt; der eine cDNA-Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 19) enthält, die für shFas(nd29)-hinge kodiert, das eines der neuen Fas Antigen-Derivate gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist und eine Aminosäuresequenz, die daraus hergeleitet ist. Das Symbol * zeigt mögliche N-Glycosylierungsstellen.
  • 6 ist eine fotografische Aufnahme, die das Ergebnis der Gelelektrophorese von shFas(nd29)-Fc und hFas-Fc zeigt.
  • 7 ist eine fotografische Aufnahme, die das Ergebnis der Gelelektrophorese von shFas(nd29)-hinge vor der Gelfiltrationschromatografie zeigt.
  • 8 ist eine fotografische Aufnahme, die das Ergebnis der Gelelektrophorese von shFas(nd29)-hinge nach der Gelfiltrationschromatografie zeigt.
  • 9 ist eine grafische Darstellung, die die Zell-Apoptose-inhibierende Aktivität von hFas-Fc und shFas(nd29)-Fc zeigt.
  • 10 ist eine grafische Darstellung, die die Zell-Apoptose-inhibierende Aktivität von hFas-Fc und shFas(nd29)-Fc zeigt.
  • 11 ist eine grafische Darstellung, die die Zell-Apoptose-inhibierende Aktivität von hFas-Fc und shFas(nd29)-hinge zeigt.
  • 12 ist eine grafische Darstellung, die die Zell-Apoptose-inhibierende Aktivität von hFas-Fc und shFas(nd29)-hinge zeigt.
  • 13(a) bis (d) sind Diagramme, die die Aktivitäten von hFas-Fc und shFas(nd29)-Fc, die Zunahme an GOT und GPT zu inhibieren, zeigen.
  • 14(a) bis (d) sind Diagramme, die die Wirkung von hFas-Fc und shFas(nd29)-hinge, die Zunahme an GOT und GPT zu inhibieren, zeigen.
  • 15(a) bis (c) sind schematische Darstellungen, die den Vergleich der Aminosäuresequenzen von humanem Fas Antigen, der extrazellulären Region von humanen Fas Antigen (shFas), hFas-Fc, shFas(nd29)-Fc und shFas(nd29)-hinge zeigen.
  • Beste Ausführungsform der Erfindung
  • Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
  • Bei der Beschreibung des neuen Fas Antigen-Derivates gemäß der vorliegenden Erfindung hat der Ausdruck "ein neues Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz (oder (Poly)peptid oder dergleichen) enthält" die folgende Bedeutung: Es bedeutet erstens, dass das neue Polypeptid durch seine Aminosäuresequenz definiert werden kann, zweitens dass wenigstens eine optionale Aminosäure an den N-Terminus oder C-Terminus der Aminosäure oder an beide angefügt werden kann und dass, wenn das neue Polypeptid ein Fusionspolypeptid ist oder ein Polypeptid, das zwei oder mehr funktionelle Regionen enthält, wenigstens eine optionale Aminosäure an deren Fusionspunkt oder einer Stelle zwischen den funktionellen Regionen angefügt (eingefügt) werden kann.
  • Außerdem bezeichnet der Ausdruck "ein Polypeptid, das wenigstens einen Teil einer Aminosäuresequenz (oder (Poly)polypeptid oder dergleichen) enthält" ein neues Polypeptid, das den gesamten Teil der Aminosäuresequenz enthält, oder ein Polypeptid, das eine beliebige Teilsequenz mit einer beliebigen Länge der Aminosäuresequenz enthält.
  • Außerdem meint in der Beschreibung des neuen Fas Antigen-Derivates der vorliegenden Erfindung der Ausdruck "Fas Antigen-Derivat" oder "Fas Antigen-Derivat-Polypeptid" ein Polypeptid, das wenigstens einen Anteil des Fas Antigens enthält, und Beispiele dafür schließen Fas Antigen-Varianten, ein Fusionspolypeptid des Fas Antigens oder eine Fas Antigen-Variante mit anderen (Poly)peptiden sowie Polymere davon, ebenso wie solche, die andere Verbindungen als die (Poly)peptide enthalten, ein.
  • Der Ausdruck "Fas Antigen-Variante" oder "Fas Antigen-Variante-Polypeptid", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Polypeptid, das einen Teil oder zwei oder mehr Teile des Fas Antigens umfasst, das im Grunde kein (Poly)peptid einer anderen Herkunft als das Fas Antigen enthält und das wenigstens eine der Aktivitäten und Funktionen des Fas Antigens aufweist, und Beispiele dafür schließen verkürze (trunkierte) Fas Antigene und Varianten von Fas Antigenen ein, in denen eine oder mehrere Aminosäuren deletiert oder substituiert sind (nachstehend in einigen Fällen als Deletionsprodukt oder Substitu tionsprodukt bezeichnet), wie z.B. Fas Antigene, in denen die extrazelluläre Region, die Transmembranregion (wie das ΔTM-Typ Fas Antigen (Fas ΔTM)) oder die cytoplasmatische Region deletiert sind und dergleichen.
  • Der Ausdruck "Fusionsprotein", wie hierin verwendet, meint ein Polypeptid, in dem zwei oder mehr (Poly)peptide in einer Kombination, die nicht natürlicherweise vorkommt, direkt oder indirekt, vorzugsweise direkt, durch chemische Bindung, vorzugsweise Peptidbindung, miteinander verbunden sind.
  • Der Ausdruck "N-terminaler Bereich" des Fas Antigens, wie hierin verwendet, kann, z.B. in dem Fall des humanen Fas Antigens (1 und 2), im weiteren Sinne Aminosäurereste des Signalpeptids (von -16 Position Met bis -1 Position Ala in 1) enthalten, im Fall des neuen Fas Antigen-Derivates der vorliegenden Erfindung jedoch wird ein N-terminaler Aminosäurerest (Arg), der aus der Trunkierung des Signalpeptids von dem Fas Antigen resultiert, als der N-Terminus verwendet, so dass der Ausdruck eine Region bezeichnet, die an dem N-terminalen Aminosäurerest (Arg) beginnt und an einem Aminosäurerest (42 Position Phe) kurz vor dem ersten Cysteinrest (43 Position) endet.
  • Beispiele für den Ausdruck "Aktivität oder Funktion", wie hierin verwendet, schließen Fas Liganden-Bindungsaktivität, biologische Aktivitäten wie z.B. Apoptose-inhibierende Aktivität, Apoptose-induzierende Aktivität und dergleichen, die später beschrieben werden, sowie Funktionen, die sich aus der Stabilität, dem biologischen Verhalten, der Löslichkeit und ähnlichen physiko-chemischen Eigenschaften ergeben, ein, von denen die Fas Liganden-Bindungsaktivität und Wirkungen auf die Apoptose wünschenswert sind und die Apoptose-inhibierende Aktivität besonders wünschenswert ist.
  • Des Weiteren bedeutet der Ausdruck "hat eine verbesserte Aktivität oder Funktion", wie hierin verwendet, dass wenigstens eine der Aktivitäten und ähnlicher Werte zumindest größer ist, z.B. 1,4 mal oder mehr, vorzugsweise 2 mal oder mehr, bevorzugter 3 mal oder mehr, am bevorzugtesten 5 mal oder mehr und insbesondere bevorzugt 10 mal oder mehr, als die eines Polypeptides, von dem die entsprechende N-terminale Region nicht deletiert ist (Produkt mit nicht-deletiertem N-terminalen Bereich). Die Aktivitätswerte und dergleichen können durch allgemein verwendete Verfahren gemessen werden und als ihre Aktivitätswerte pro Einheitswert, nämlich spezifische Aktivitäten, verglichen werden. Die spezifische Aktivität wird im Allgemeinen als 50%ige Hemmkonzentration (inhibition concentration, IC50) oder mittlere Effektivdosis (50% effective dose, ED50) berechnet.
  • Das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist wenigstens ein neues Fas Antigen-Derivat, das zumindest einen Anteil oder den gesamten Teil der extrazellulären Region des Fas Antigen-Polypeptids umfasst, indem wenigstens ein Aminosäurerest von einer Gruppe von Aminosäureresten, beginnend von dem N-terminalen Aminosäurerest des Fas Antigen-Polypeptids bis zu einem Cysteinrest, der am Nächsten an der N-terminalen Seite liegt (ausschließlich dem genannten Cysteinrest), deletiert ist. In diesem Zusammenhang verfügen der gerade beschriebene Anteil oder gesamte Teil der extrazellulären Region des Fas Antigen-Polypeptids, in dem wenigstens ein Aminosäurerest deletiert ist und das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung über wenigstens eine Funktion, einen Fas Liganden zu binden.
  • Die Herkunft des Fas Antigens, von dem ein oder mehrere Aminosäurereste deletiert werden sollen, ist nicht besonders beschränkt, jedoch ist ein Fas Antigen von einem Säuger, insbesondere ein humanes Antigen, wie z.B. ein Antigen, das die in den 1 und 2 gezeigte bekannte Aminosäuresequenz des humanen Fas Antigens enthält, wünschenswert.
  • Wenn es sich bei dem Fas Antigen, von dem ein oder mehr Aminosäuren deletiert werden sollen, um das in 1 und 2 gezeigte humane Fas Antigen handelt, ist das neue Fas Antigen-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung ein neues Fas Antigen-Derivat, in dem wenigstens ein Aminosäurerest von dem 1. bis 42. Aminosäurerest, gezählt von dem N-Terminus der SEQ ID NO: 15 in dem Sequenzprotokoll (extrazelluläre Region des humane Fas Antigens) deletiert ist, vorzugsweise ein neues Fas Antigen-Denvat, in dem die Anzahl der deletierten Aminosäurereste 29 oder mehr beträgt, bevorzugter 29.
  • Die zu deletierenden Aminosäuren können fortlaufend oder nicht-fortlaufend in der Aminosäuresequenz vorliegen, vorzugsweise jedoch fortlaufend und in diesem Falle ist es wünschenswert, sie vorzugsweise von der N-terminalen Seite zu deletieren. Das heißt, ein neues Fas Antigen-Derivat, in dem 29 Aminosäurereste von der 1. bis 29. Position, gezählt vom N-Terminus der SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls, deletiert sind, so dass es mit dem 30. Thr-Rest beginnt, ist besonders wünschenswert.
  • Ferner können im Hinblick auf die Anzahl und die Position der Aminosäurereste der N-terminalen Region, von denen wünschenswert ist, dass sie deletiert werden, die Ergebnisse der dreidimensionalen Strukturanalyse der extrazellulären Region des Fas Antigens und dergleichen durch einen Computer verwendet werden, wie im Detail in den Beispielen beschrieben werden wird. Das heißt, es ist möglich, die Affinität und dergleichen mit einem Fas Liganden durch Entwerfen des Fas Antigens in der dreidimensionalen Strukturanalyse in einer solchen Art und Weise, dass die Struktur der N-terminalen Region des Antigens keine sterischen Hindernisse für seine Bindung mit dem Fas Liganden verursacht, zu optimieren oder zu kontrollieren.
  • Außerdem besteht die Möglichkeit, dass die N-terminale Region des Antigens geneigt ist, aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften durch eine Protease hydrolysiert zu werden und dergleichen. Ferner können, da die Möglichkeit besteht, dass die Prozessierung des Polypeptids sich qualitativ und quantitativ in Abhängigkeit von dem Wirt unterscheidet, diese Punkte sowie die Löslichkeit, die Stabilität und dergleichen berücksichtigt werden, wenn die N-terminale Region deletiert wird.
  • Wenn die obigen Punkte berücksichtigt werden, beträgt die Anzahl der Aminosäurereste, von denen wünschenswert ist, dass sie von dem N-terminalen Bereich deletiert werden, vorzugsweise 13 bis 18 oder mehr, bevorzugter 23 oder mehr, am bevorzugtesten 29 oder mehr; in dem Fall des humanen Fas Antigens und in jedem Fall ist es wünschenswert, nicht die 36. bis 42. Aminosäurereste, gezählt von dem N-Terminus, zu deletieren.
  • In Hinblick auf die Aminosäurereste des N-terminalen Bereiches, insbesondere in dem Fall des humanen Fas Antigens, beinhaltet das neue Fas Antigen-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung ein neues Fas Antigen-Derivat, das eine neue Fas Antigen-Variante ist, die einen Anteil oder den gesamten Teil der extrazellulären Region des Fas Antigens umfasst, in dem wenigstens ein Aminosäurerest von den 1. bis 42. Aminosäu reresten, gezählt von dem N-Terminus der SEQ ID NO: 15 im Sequenzprotokoll deletiert ist, insbesondere eine neue Fas Antigen-Variante, die einen oder zwei oder mehr Teile des Fas Antigens umfasst, in dem die Anzahl der deletierten Aminosäurereste vorzugsweise 29 oder mehr, bevorzugter 29 beträgt.
  • Veranschaulichende Beispiele für die Fas Antigen-Variante gemäß der vorliegenden Erfindung schließen solche ein, die ein Polypeptid aus den 158. bis 174. Resten, ein Polypeptid aus den 175. bis 319. Resten und ein Polypeptid aus den 158. bis 319. Resten enthalten, ebenso wie eine Variante, in der beliebige Fragmente mit beliebigen Längen, die aus dem Polypeptid aus den Resten 158 bis 319 erhalten wurden, in beliebiger Reihenfolge kombiniert sind und in der C-terminalen oder N-terminalen Seite der Fas Antigen-Variante enthalten sind, vorzugsweise in der C-terminalen Seite.
  • In diesem Zusammenhang ist die neue Fas Antigen-Variante, in der die Anzahl der deletierten Aminosäure 29 beträgt, vorzugsweise eine Variante, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 9 (shFas(nd29)) des Sequenzprotokolls enthält, bevorzugter eine Variante, die die genannte Aminosäuresequenz umfasst.
  • Kombinierte Produkte mit anderen chemischen Substanzen, wie z.B. (Poly)peptiden, Zuckerketten, Lipiden oder anderen hochmolekularen oder niedrigmolekularen Verbindungen und dergleichen sind in dem neuen Fas Antigen-Derivat inbegriffen, von denen ein Fusionspolypeptid mit anderen (Poly)peptiden wünschenswert ist. Das genannte (Poly)peptid ist nicht besonders beschränkt, und zwei oder mehr (Poly)peptide können einbezogen werden, und in dem letzteren Fall kann die Bindungsreihenfolge der genannten zwei oder mehr (Poly)peptide geändert werden und andere Substanzen als Aminosäuren können eingeschlossen werden.
  • Die Bindungsart der anderen chemischen Substanzen und dergleichen mit der wesentlichen neuen Fas Antigen-Variante ist nicht besonders beschränkt, und die Bindung kann durch jegliche kovalente Bindungen und nicht-kovalente Bindungen erreicht werden, in Hinblick auf die Bindungsstabilität jedoch vorzugsweise durch eine kovalente Bindung. Insbesondere eine Peptidbindung ist wünschenswert, wenn es sich bei der anderen chemischen Substanz um ein (Poly)peptid handelt.
  • Die Bindungsstelle kann ebenfalls nach Wunsch ausgewählt werden und sowohl der N-Terminus, der C-Terminus und die Seitenketten können als Bindungsstelle verwendet werden, jedoch wird die Bindung bevorzugt durch entweder einen oder beide Termini vermittelt bewirkt, bevorzugter durch den C-Terminus.
  • Wenn die andere chemische Substanz ein (Poly)peptid ist, ist es wünschenswert, dass das genannte (Poly)peptid ein (Poly)peptid ist, das eine Wirkung zur Verbesserung oder Modifizierung der Aktivität oder Funktion des genannten neuen Fas Antigen-Derivates hat. Zum Beispiel sind solche eingeschlossen, die die Stabilität oder Halbwertszeit im Blut verbessern oder die die Akkumulation in einem bestimmten Gewebe, bestimmten Zellen oder anderen spezifischen Regionen erhöhen, und das Fc-Fragment kann als ein Beispiel genannt werden, das die Halbwertszeit im Blut verlängern kann. Besonders bevorzugt ist ein (Poly)peptid, das eine derartige Funktion hat, dass das genannte neue Fas Antigen-Derivat zu einem Polymer wird. Beispiele für polymerisierbare (Poly)peptide schließen den gesamten Teil oder einen Anteil der konstanten Region der Immunglobulin schweren Kette oder leichten Kette ein, den gesamten Teil oder einen Anteil der konstanten Region der schweren Kette ausschließlich seiner ersten Region (CH1) und den gesamten Teil des Fc-Fragments (dieses kann im Falle von IgG die Hinge-Region, die CH2-Region und die CH3-Region umfassen) oder einen Teil davon (z.B. jeweils die Hinge-Region, die CH2-Region, die CH3-Region und die CH4-Region oder eine beliebige Kombination daraus), wobei ein Teil, der das Fc-Fragment oder wenigstens einen Teil der Hinge-Region umfasst, wünschenswert ist, ein Anteil der Hinge-Region, der wenigstens eines, bevorzugt sämtliche der Cysteinreste der Hinge-Region enthält oder ein Fc-Fragment, das die genannte Hinge-Region oder die CH3-Region (die CH4-Region im Falle von IgM und IgE) oder einen Anteil der Hinge-Region enthält, ist noch wünschenswerter, und der gesamte Teil oder ein Anteil des Fc-Fragmentes, das die gesamte Hinge-Region enthält oder die Hinge-Region selbst ist am wünschenswertesten.
  • Das Immunglobulin in dem vorliegenden Fall kann jeglicher Herkunft sein, bevorzugt ist jedoch eines menschlichen Ursprungs. Außerdem sind seine Klasse und Unterklasse nicht notwendigerweise beschränkt, und jedes von IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgE und IgD und dergleichen kann verwendet werden, wobei IgG darunter ein be vorzugtes Beispiel ist. Das neue Fas Antigen-Derivat, das ein Fc-Fragment und dergleichen enthält, kann im Allgemeinen ein Dimer bilden, es kann jedoch auch ein Dekamer bilden, wenn die ursprüngliche Klasse IgM ist oder ein Tetramer im Falle von IgA.
  • Im übrigen ist bekannt, dass die konstante Region, insbesondere die Fc-Region, von Immunglobulin wichtig für verschiedene Effektorfunktionen und dergleichen des Antikörpermoleküls ist, die nicht direkt an der Antigenspezifität des Antikörpers beteiligt sind. Beispiele für solche Funktionen schließen die Bindung und die Aktivierung von Komplement, die Bindung mit Fc-Rezeptoren (FcR), die Induktion der ADCC-Aktivität, die Fähigkeit zur Passage der Plazenta, die Degranulation von Mastzellen und die Protein-A-Reaktivität ein.
  • Obwohl diese Funktionen effektiv genutzt werden können, wenn sie in das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden, besteht die Möglichkeit, dass sie in bestimmten Fällen die Induktion von Nebenwirkungen verursachen, wenn sie als Medikament an den lebenden Körper verabreicht werden, wie z.B. bei einer spezifischen Krankheit. In diesem Fall ist daher ein Fc-Fragment oder dergleichen, von dem alle oder ein Teil dieser Effektorfunktionen und dergleichen entfernt wurden, wünschenswert und bevorzugte Beispiele dafür schließen eine Fc-Variante, in der eine Mutation in die Zuckeradditionsstelle der CH2-Region von IgG eingeführt wurde, wodurch die Zuckerkette der genannten Stelle deletiert wird, die konstante Region oder das Fc-Fragment von IgG, wovon die CH2-Region deletiert wurde sowie die Hinge-Region ein.
  • In dem neuen Fas Antigen-Derivat kann die Bindung der neuen Fas Antigen-Variante mit einem anderen (Poly)peptid und dergleichen vorzugsweise direkt bewirkt werden, in einigen Fällen jedoch indirekt, wie z.B. ihre Bindung über einen Peptidlinker oder einen geeigneten chemischen Spacer, der die Aktivitäten und Funktionen des neuen Fas Antigen-Derivates nicht signifikant beeinträchtigt.
  • Aktivitäten und Funktionen des neuen Fas Antigen-Derivates der vorliegenden Erfindung werden weiterhin durch dessen Polymerisierung verbessert.
  • Das Polymer schließt alles ein, von dessen Dimer bis zu größeren, jedoch vorzugsweise Dimer bis Decamer, bevorzugter Dimer oder Trimer, am meisten bevorzugt Dimer. Es schließt Homo- und Heteropolymere ein, jedoch ist ein Homopolymer wünschenswerter.
  • Im Hinblick auf das Polymerisierungsverfahren ist es wünschenswert, eine Polymerisierungseigenschaft eines (Poly)peptids zu verwenden, das selbst polymerisierbar ist. Ein Verfahren, in dem die zuvor erwähnte Polymerisierungseigenschaft der konstanten Region von Immunglobulin oder seinen Teilen (z.B. Fc-Fragment und Hinge-Region) verwendet wird, ist besonders wünschenswert, jedoch kann ein Cystein-enthaltendes Peptid, das eine Hinge-ähnliche Struktur bilden kann oder ein Polypeptid, das das genannte Peptid enthält, ebenfalls verwendet werden. Zusätzlich zu den oben genannten kann außerdem die cytoplasmatische Region des Fas Antigens, TNF-R oder dergleichen ebenfalls verwendet werden. Obwohl die Bindung von Monomeren in dem Polymer durch jegliche Bindungen bewirkt werden kann, ist eine kovalente Bindung (z.B. Disulfidbindung oder Peptidbindung) bevorzugt, während eine nicht-kovalente Bindung (z.B. Bindung zwischen zwei CH3-Regionen von Immunglobulin oder zwischen den cytoplasmatischen Regionen von Fas Antigen oder TNF-R) ebenfalls verwendet werden kann.
  • Zusätzlich zu den oben genannten können die folgenden Verfahren durch chemisches Cross-linking angewendet werden. Zum Beispiel
    • 1) Cystein wird in den C-Terminus eingefügt und anschließend wird ein Cross-linking unter Verwendung von zwei Arten von Aktivierungslinkern bewirkt. Es gibt ein Verfahren zur Einführung von Cystein, in dem Cysteinamid oder Carboxypeptidase Y verwendet wird. Wenn der C-Terminus ein Lysin ist, wird Lysin-Endopeptidase verwendet. Außerdem wird, wenn freies Cystein vorhanden ist, zuvor ein Schutz durch Alkylierung durchgeführt, bevor Cystein in den C-Terminus eingefügt wird. Danach wird das Cross-linking unter Verwendung von Aktivierungslinkern ausgeführt. Zum Beispiel wurde N,N'-o-Phenylendimaleimid (Glennie, M. J. et al., J. Immunol., Band 139, Seiten 2367–2375, 1987) oder ähnliches als ein divalentes Cross-linking-Agens sowie eine tris-Maleimid-Verbindung (japanische Patentanmeldung Kokai Nr. 6-228091) oder dergleichen als ein trivalentes Cross-linking- Agens für das Cross-linking von Antikörpern verwendet und kann für das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um ein Dimer bzw. ein Trimer zu bilden.
    • 2) Biotin wird in den C-Terminus eingeführt und Cross-linking wird unter Verwendung von Avidin durchgeführt. Es wird in den C-Terminus unter Verwendung von Biotinamid eingeführt, ähnlich wie in dem Fall von Cystein. Ein Tetramer wird durch das Cross-linking mit Avidin gebildet, höhere Aggregate können jedoch abhängig von den Reaktionsbedingungen gebildet werden. Außerdem können alle funktionelle Polypeptide oder dergleichen gebunden werden. Die Bindung zwischen Biotin und Avidin ist ein Beispiel für starke, nicht-kovalente Bindungen.
    • 3) Cross-linking wird ausgeführt unter Verwendung eines Cross-linking-Agens, das spezifisch für Cystein-, Thiol- oder Aminogruppen ist, die in der Sequenz des neuen Fas Antigen-Derivates oder des (Poly)peptids oder dergleichen, das an das Derivat gebunden ist, vorhanden sind.
  • In den oben genannten Fällen kann ein Peptid oder chemischer Linker oder ein Spacer mit geeigneter Länge verwendet werden.
  • Es ist außerdem möglich, das neue Fas Antigen-Derivat in Liposomen herzustellen, indem Lipide, hydrophobe Peptide oder ähnliche fettlösliche Substanzen gemäß den bekannten Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel kann das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung, das die Transmembranregion des Fas-Antigens enthält, selbst in Liposomen und dergleichen eingeschlossen werden. Diese Liposomen sind hochgradige Polymere und deren geeignete Modifikationen machen weitere Anwendungen möglich, wie z.B. deren Einschluss in bestimmte Zellen und Gewebe.
  • Unter den neuen Fas Antigen-Derivaten der vorliegenden Erfindung schließen bevorzugte Beispiele mit Polymerisierungsfähigkeit solche ein, die die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 10 (shFas(nd29)-hinge) und 11 (shFas(nd29)-Fc) des Sequenzprotokolls enthalten, bevorzugter ein Derivat, das aus den genannten Sequenzen zusammengesetzt ist.
  • Unter den Polymeren der Polypeptide der SEQ ID NO: 10 und 11 ist das Dimer ein Dimerisierungsprodukt des Fas Antigen-Derivates der vorliegenden Erfindung, in dem dessen Aktivitäten durch Deletieren von 29 Aminosäureresten von dem N-Terminus der extrazellulären Region des humanen Fas Antigens verbessert werden und die verbesserten Aktivitäten nicht durch die Dimerisierung beeinträchtigt sind, so dass das resultierende Dimer eine deutlich hohe Fas Liganden-Bindungsaktivität und Apoptose-inhibierende Aktivität besitzt.
  • Im Allgemeinen erzeugt ein Polypeptid in unterschiedlichen Spezies oder Individuen verschiedene Aminosäuresequenzen, verursacht durch Mutation während des Verlaufs seiner Evolution, während die ursprünglichen Funktionen des Peptids im Grunde erhalten bleiben. Der Begriff Mutation einer Aminosäuresequenz, wie hierin verwendet, bedeutet 1) Deletion von einer oder mehreren Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz des Polypeptids, 2) Substitution durch andere Aminosäurereste oder 3) Insertion oder Addition von einem oder mehreren Aminosäureresten in oder an beliebige Stellen der zuvor erwähnten Aminosäuresequenz. Solche Mutationen können künstlich unter Verwendung von gentechnologischen Methoden erzeugt werden, und Polypeptide, die solche Mutationen aufweisen, sind ebenfalls in dem neuen Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
  • Außerdem kann das neue Fas Antigen-Derivat einen Methioninrest oder ein oder mehrere Aminosäurereste, die von einem Signalpeptid oder Propeptid stammen, an den N-Terminus angefügt aufweisen.
  • Das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann jegliche Modifikationen haben, unter dem Vorbehalt, dass dessen Eigenschaften nicht beeinträchtigt werden. Beispiele für die Modifikationen schließen Modifikationen während oder nach der Translation des Polypeptids ein, die im Allgemeinen in natürlichen Proteinen auftreten, sowie chemische Modifikationen. Das Anfügen von Zuckerketten und dergleichen kann als Beispiel genannt werden für natürliche Modifikationen, N-Glycosylierung, O-Glycosylierung, nicht-enzymatische Zuckeraddition und dergleichen sind bekannt als Zuckeranlagerungen an Protein, und das neue Fas Antigen-Derivat gemäß des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung kann oder kann nicht Zuckerketten aufweisen.
  • Das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung kann N-Glycosylierungsstelle(n) haben, wie es z.B. der Fall ist für die extrazelluläre Region des Fas Antigens, von dem 29 N-terminale Aminosäuren deletiert wurden, die zwei N-Glycosylierungsstellen aufweist. Folglich kann das genannte neue Fas Antigen-Derivat Zuckerketten haben, abhängig von dem Wirt, der das Derivat produziert. Das heißt, es wird berücksichtigt, dass das soeben beschriebene Protein an den zuvor erwähnten N-Glycosylierungsstellen Zuckerketten haben kann, wenn es durch Verwendung eukaryontischer Zellen, wie z.B. tierischer Zellen oder Hefe als Wirtszellen hergestellt wird, jedoch keine Zuckerketten aufweisen darf, wenn prokaryontische Zellen, wie z.B. Escherichia coli als Wirte verwendet werden. Außerdem ist die Anzahl und Länge der Zuckerkette oder Zuckerzusammensetzung und die Sequenz der Zuckerkette nicht besonders beschränkt, da sie von der Zusammensetzung des Mediums und dergleichen zum Zeitpunkt der Kultivierung dieser Wirtszellen abhängig sind. Weitere Beispiele für die natürliche Modifikation schließen die Bindung von Lipid und dergleichen ein.
  • Im Zuge der technischen Entwicklung der letzten Jahre wurde es möglich, Polypeptide auf verschiedene Weisen zu modifizieren. Beispiele für mögliche Modifikationsstellen schließen Aminosäurereste des N-Terminus oder C-Terminus und funktionelle Gruppen auf den Seitenketten ein. Zum Beispiel ist es möglich geworden, ein Polypeptid mit Polyethylenglycol, Styren-Maleinsäure-Copolymer, Dextran, Pyran-Copolymer, Polylysin und ähnlichen synthetischen Hochpolymeren, Lipiden, Polysacchariden, (Poly)peptiden und dergleichen natürlichen Molekülen, Hormonen und ähnlichen physiologisch aktiven Molekülen oder Magnetit und ähnlichen anorganischen Substanzen zu kombinieren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 84, Seiten 1487–1491, (1981); Biochemistry, Band 28, Seiten 6619–6624 (1989)).
  • Beispiele für weitere modifizierte Derivate schließen N-Acylderivate ein von freien Aminogruppen eines Aminosäurerestes, gebildet durch die Amid- oder Acylreste von Carboxylgruppen, resultierend aus der Reaktion eines aliphatischen Esters der Carboxylgruppe mit Ammoniak oder einem primären oder sekundären Amin (z.B. einer Alkanoyl- oder Carboxylaroyl-Gruppe) und O-Acylderivate von einer freien Hydroxylgruppe, gebildet durch einen Acylrest (z.B. eine Hydroxylgruppe eines Serin- oder Threoninrestes) ein.
  • Das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung kann außerdem in der zuvor erwähnten Weise durch die Kombination der zuvor erwähnten Methoden modifiziert werden. Folglich sind auch die Produkte solcher Modifikationen ebenfalls in dem neuen Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, unter der Bedingung, dass die Eigenschaften des Polypeptids des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung nicht beeinträchtigt werden. Außerdem ist es möglich, die Aktivität oder Funktion des neuen Fas Antigen-Derivates gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung zu modifizieren oder zu verbessern, oder weitere Aktivitäten oder Funktionen durch solche Modifikationen hinzuzufügen oder zu kombinieren. Beispiele für solche Aktivitäten oder Funktionen beinhalten die Stabilität, die Löslichkeit, das biologische Verhalten und die Gerichtetheit gegenüber bestimmten Zellen, Geweben oder Organen. Die neuen Antigen-Derivate, die solche Modifikationen erhalten haben, sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
  • Das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung kann in der Form von Salzen auftreten, die ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind. Der Begriff "Salze", wie hierin verwendet, bezeichnet sowohl die Salze von Carboxylgruppen der Proteinmoleküle als auch Säure-Additionssalze an Aminogruppen. Die Salze von Carboxylgruppen können durch die auf dem Gebiet dieser Methoden wohlbekannte Verfahren gebildet werden, und Beispiele dafür schließen anorganische Salze, wie z.B. Salze von Natrium, Calcium, Ammonium, trivalentem Eisen, Zink und dergleichen sowie organische Salze, wie z.B. solche, die durch Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin, Procain und dergleichen gebildet werden, ein. Beispiele für Säure-Additionssalze schließen Salze mit Salzsäure, Schwefelsäure und ähnlichen mineralischen Säuren und Salze mit Essigsäure, Oxasäure und ähnlichen organischen Säuren ein.
  • Das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung kann in Medikamenten Anwendung finden, und in diesem Fall ist es wünschenswert, dass die zuvor genannten Modifikationen und ähnliche Verfahren die pharmazeutische Annehmbarkeit gewährleisten.
  • Außerdem ist das Verfahren zur Herstellung des zuvor erwähnten neuen Fas Antigen-Derivates gemäß dem ersten Aspekt nicht besonders eingeschränkt, so dass es aus einer natürlichen Quelle isoliert und gereinigt werden kann, künstlich synthetisiert werden kann unter Verwendung eines gewöhnlich verwendeten chemischen Synthetisierers (Peptide Synthesizer Model 430A, Perkin-Elmer, Japan) oder durch rekombinante DNA-Verfahren erhalten werden kann. Außerdem kann das so isolierte und gereinigte Peptid einer geeigneten chemischen Behandlung unterzogen werden, wie z.B. einer enzymatischen Behandlung, um Deletions- oder Fragmentierungsprodukte zu erhalten, die weiterhin miteinander chemisch verbunden werden oder polymerisiert werden können. Das heißt, Monomere des neuen Fas Antigen-Derivates der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls nützlich als Intermediate oder intermediäre Materialien für die Herstellung von Polymeren.
  • Unter den oben erwähnten Derivaten ist ein Peptid, das auf dem Wege von gentechnologischen Verfahren hergestellt wird, das später als fünfter Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben werden wird, von dem Gesichtspunkt der Produktivität und Homogenizität oder Reinheit des hergestellten Proteins, wie z.B. dessen Wesen, frei von weiteren kontaminierenden, humanen Proteinen zu sein, wünschenswert.
  • Ein Beispiel für die Herstellung durch gentechnologische Verfahren wird im Folgenden kurz beschrieben. Das Plasmid pM1097, das in dem erfindungsgemäßen Beispiel 1 (1) später beschrieben werden wird, enthält ein DNA-Fragment, das durch die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 12 dargestellt wird, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 9, wie im Sequenzprotokoll gezeigt, kodiert sowie ein weiteres DNA-Fragment, das das Signalpeptid des Fas Antigens kodiert. Unter Verwendung eines geeigneten Vektors, wie z.B. eines Expressionsvektors, wie in den Beispielen gezeigt, der durch Integration des eben beschriebenen Plasmides in das Plasmid pM1103 hergestellt wird, das durch Integrieren des dhfr-Gens in pEF-BOS hergestellt wurde, werden COS-1-Zellen transformiert, um einen Transformanten zu erhalten und anschließend wurde shFas(nd29) aus dem Kulturüberstand erhalten.
  • Unter den Aktivitäten und Funktionen des neuen Fas Antigen-Derivates der vorliegenden Erfindung kann die Apoptose-inhibierende Aktivität durch Messen des Inhibierungsverhältnisses von Fas Antigen-exprimierenden Zellen zu Apoptose untersucht werden. Zum Beispiel wird dies durch das 51Cr-Freisetzungsassay oder MTT-Assay (Mosmann T., J. Immunol. Methods, Band 65, Seiten 55 – 63, 1983) unter Verwendung eines kultivierten Zellstammes oder transformierter Zellen, die fähig sind, Fas Antigen zu exprimieren, als Fas Antigen-Expression-Target-Zellen, und Fas Ligand-exprimierende Zellen, die durch Transformation erhalten wurden oder einen Fas Liganden der löslichen Art, wie z.B. die extrazelluläre Region des Fas Liganden als den Effektor, gemessen. Veranschaulichende Verfahren werden in den Beispielen gezeigt. Die Apoptose-inhibierende Aktivität des genannten neuen Fas Antigen-Derivates auf WC 8-Zellen, die durch Transformieren von Maus WR19L-Zellen zum Erhalt einer Fas Antigen-Expressionsfähigkeit erhalten wurden, ist zumindest größer, z.B. 1,4 mal so groß oder mehr, vorzugsweise 2 mal so groß oder mehr, am bevorzugtesten 5 mal größer oder mehr und insbesondere 10 mal größer oder mehr als die ihres korrespondierenden Fas Antigens, bei dem die N-terminale Region nicht deletiert ist (Derivat).
  • Da das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung die Fas Antigen-vermittelte Apoptose kontrollieren kann, ist es nützlich für die Prävention und Behandlung von Krankheiten, die mit der Sthenie oder dem Versagen der Fas Antigen-vermittelten Apoptose, die im lebenden Körper induziert wird, zusammenhängen. Da ein bevorzugtes neues Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung die Induktion der Apoptose durch kompetitive Inhibierung der Bindung zwischen Fas Ligand und Fas Antigen inhibieren kann, ist es z.B. möglich, die Verringerung der Gewebe- und Organfunktionen durch Inhibierung der Apoptose von hepatischen Zellen und dergleichen im Falle von Hepatitis und ähnlichen ernsthaften Infektionserkrankungen vorzubeugen und dadurch die rasche Verringerung von Zellen in wichtigen Organen und Geweben vorzubeugen, und es kann für die Behandlung von Infektionserkrankungen, die durch Viren und dergleichen sowie für daraus resultierende Komplikationen, z.B. als ein Arzneimittel für die Verwendung in der Behandlung von Influenza, AIDS, Hepatitis und ähnlichen Krankheiten, verwendet werden. Es ist außerdem nützlich für die Behandlung von bestimmten Autoimmunkrankheiten, wie z.B. Diabetes, Myokardiopathie in Reperfusionsschäden und ähnlichen ischämischen Herzerkrankungen, Nephritis, multiplem Organversagen und Organerhaltung und Graft versus host Erkrankung (GVHD) zum Zeitpunkt der Organtransplantation.
  • Da das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung mit höherer Spezifität und höherer Affinität an Fas Liganden bindet, kann es für die Detektion des Fas Liganden verwendet werden. Außerdem kann es, da es wenigstens einen Teil der Antigenizität des Fas Antigens behält, an anti-Fas Antikörper binden und ist daher wirksam bei der Inhibierung der Apoptose, die durch den anti-Fas Antikörper verursacht wird.
  • Zusätzlich ist es, wenn der Fas Ligand selbst in Behandlungen und Studien verwendet wird, notwendig, das genannte Protein in großen Mengen mit einer hohen Reinheit herzustellen, und, da das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung für die Herstellung von Affinitätschromatographie-Säulen verwendet werden kann, ist es außerdem nützlich bei der Aufreinigung des Fas Liganden und ähnlichen Substanzen, die an das Fas Antigen binden.
  • Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein DNA-Fragment, das das neue Fas Antigen-Derivat des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung kodiert.
  • Bei der Beschreibung der DNA-Fragmente und DNA-Moleküle in dieser Beschreibung bedeutet der Begriff "ein DNA-Fragment, das eine Nukleotidsequenz enthält", dass das DNA-Fragment ein DNA-Fragment sein kann, das die Nukleotidsequenz umfasst oder ein Fragment, das eine Variante der Nukleotidsequenz umfasst, in der wenigstens eine optionale Base an eines seiner 5'-Enden oder 3'-Enden oder an beide angehängt ist.
  • Die neuen DNA-Fragmente der vorliegenden Erfindung enthalten wenigstens einen Teil einer Nukleotidsequenz, die das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung kodiert, vorzugsweise die Aminosäuresequenzen mit den SEQ ID NO: 9 bis 11 des Sequenzprotokolls. Da es allgemein bekannt ist, dass es 1 bis 6 verschiedene DNA-Triplets (Codons) gibt, die eine Aminosäure kodieren, abhängig von der jeweiligen Aminosäure, sind die DNA-Nukleotidsequenzen, die die Aminosäuresequenz des neuen Fas Antigen-Derivates gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung kodiert, nicht auf eine bestimmte Art eingeschränkt. Folglich sind sämtliche DNA-Fragmente, die in jeder Nukleotidsequenz umfasst sind, in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, vorausgesetzt, dass es DNA-Fragmente sind, die wenigstens einen Anteil, vorzugsweise den gesamten Teil einer Nukleotidsequenz enthalten, die das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung kodiert, vorzugsweise die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 9 bis 11 des Sequenzprotokolls. Das neue DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung ist bevorzugter ein DNA-Fragment, das wenigstens einen Teil der SEQ ID NO: 12 bis 14 des Sequenzprotokolls von den Nukleotidsequenzen, die für die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 9 bis 11 des Sequenzprotokolls kodieren, enthält, am bevorzugtesten ein DNA-Fragment, das sämtliche der Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 12 bis 14 des Sequenzprotokolls enthält.
  • Das DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung kann ein cDNA-Molekül sein, ein chromosomales DNA-Fragment, eine Kombination daraus oder ein cDNA-Molekül, das Introns enthält, die in geeigneter Weise gespliced werden können. Jedoch ist es wünschenswert, dass das DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung ein cDNA-Molekül ist, da dieses in gentechnologischen Verfahren leicht handhabbar ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein RNA-Molekül zur Verfügung gestellt, das dem neuen DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung entspricht und ein DNA-Fragment, das eine Sequenz enthält, die komplementär zu dem neuen DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung ist und dessen korrespondierendes RNA-Molekül. Das neue DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung und dessen komplementäre DNA und RNA kann eine doppelsträngige oder dreifachsträngige Kette durch deren gegenseitige komplementäre Bindung bilden. Ebenfalls zur Verfügung gestellt werden ein DNA-Fragment, das eine Nukleotidsequenz enthält, die fähig ist, mit dem neuen DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung zu hybridisieren und dessen korrespondierendes RNA-Molekül. In diesem Falle können sie ebenfalls eine doppelsträngige oder dreifachsträngige Kette durch gegenseitige Bindung bilden. In dem oben genannten Fall kann Inosin oder eine ähnliche universelle Base als eine Nukleinsäurebase verwendet werden.
  • Das DNA-Fragment gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann durch jegliche Verfahren erhalten werden. Es kann z.B. chemisch synthetisiert werden, aus einer geeigneten DNA-Bibliothek erhalten werden oder durch PCR (Polymerasekettenreaktion) unter Verwendung eines DNA-Fragments, das ein DNA-Fragment enthält, das für die gesamte Länge oder einen Teil des humanen Fas Antigens kodiert, erhalten werden.
  • Außerdem können die durch diese Verfahren erhaltenen DNA-Fragmente oder deren kleinere Fragmente weiterhin einem Annealing und einer Ligation unterzogen werden, wie es die Umstände erfordern.
  • Das DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung kann auf folgende Art und Weise chemisch synthetisiert werden. Veranschaulichend dargestellt, wird das DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung in Fragmente von etwa 20 bis 30 Basen geteilt und als eine Vielzahl von Fragmenten unter Verwendung eines DNA-Synthesizers (z.B. Modell 394, hergestellt von Applied Biosystems) synthetisiert, und anschließend wird jedes der Fragmente der Phospholysierung seines 5'-Endes, falls dies erforderlich ist, und anschließend dem Annealing und der Ligierung unterzogen, wodurch das DNA-Fragment von Interesse erhalten wird.
  • Das DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung kann außerdem durch PCR-Verfahren unter Verwendung einer genomischen Bibliothek, cDNA-Bibliothek oder dergleichen als Template erhalten werden. Wenn das PCR-Verfahren verwendet wird, kann es dadurch erhalten werden, dass Sense- und Antisense-Primer hergestellt werden, die auf Grundlage von bekannten Nukleotidsequenzen und der Nukleotidsequenz eines DNA-Fragmentes, das das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung kodiert, entworfen wurden, falls notwendig in Kombination mit einer Restriktionsenzym-Erkennungssequenz und dergleichen, und anschließend durch Ausführen der Reaktion in Übereinstimmung mit dem bekannten Verfahren (vgl. Polymerase Chain Reaction, PCR Protocols, a guide to methods and applications (1990), herausgegeben durch Michael A. I. et al., veröffentlicht durch Academic Press) mit einer beliebigen DNA-Bibliothek oder dergleichen. Ein typisches Beispiel wird in den Beispielen beschrieben.
  • Die oben erwähnte DNA-Bibliothek ist nicht besonders eingeschränkt, unter der Bedingung, dass es das DNA-Fragment gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung oder einen Teil davon enthält. Folglich kann eine kommerziell erhältliche DNA-Bibliothek verwendet werden, oder eine cDNA-Bibliothek kann in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Sambrook et al. aus Lymphozyten aus humanem peripherem Blut, einer etablierten humanen Zelllinie, Hybridomen und ähnlich geeigneten Zellen hergestellt werden, wenn nötig nach Aktivierung der Zellen mit einem geeigneten aktivierenden Agens. In diesem Zusammenhang wurde ein Transformant, der ein für das humane Fas Antigen kodierendes DNA-Fragment enthält, durch den Anmelder der vorliegenden Erfindung beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry, Higashi-1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan (im Folgenden als National Institute of Bioscience and Human Technology bezeichnet) hinterlegt und wurde mit der Bezeichnung FERM BP-3826 versehen.
  • Das neue DNA-Fragment gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann in der Herstellung des rekombinanten DNA-Moleküls des dritten Aspekts der vorliegenden Erfindung verwendet werden und kann, durch Transformieren eines Wirtes mit dem rekombinanten DNA-Molekül, für die homogene Produktion und Produktion in großem Maßstab des neuen Fas Antigen-Derivates gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Aus den genannten Gründen wird es möglich, auf dem Gebiet der Medikamente das neue Fas Antigen-Derivat als eine Hauptkomponente von therapeutischen Arzneimitteln und diagnostischen Arzneimitteln zur Verfügung zu stellen. Verfahren zur Herstellung des neuen Fas Antigen-Derivates gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung, welche das neue DNA-Fragment gemäß der vorliegenden Erfindung verwenden, werden später im Zusammenhang mit dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben werden.
  • Außerdem kann das DNA-Fragment gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung bei der Gentherapie von Patienten angewendet werden, die erbliche oder erworbene Anormalitäten bei der Apoptose aufweisen, die durch Fas Ligand oder Fas An tigen vermittelt wird. Das heißt, therapeutische und präventive Behandlungen von Patienten, die unter Gelenkrheumatismus, SLE und ähnlichen Autoimmunkrankheiten sowie AIDS, Hepatitis, Nephritis und ähnlichen Krankheiten leiden, können durch Verbindung des neuen DNA-Fragments der vorliegenden Erfindung mit einem geeigneten Vektor und dessen direkte Einführung in den lebenden Körper oder Zellen ausgeführt werden.
  • Als Nächstes wird das rekombinante DNA-Molekül gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben. Das rekombinante DNA-Molekül gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es das oben erwähnte neue DNA-Fragment gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält.
  • Das neue rekombinante DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung kann in jeglicher Form, wie z.B. in cyclischer Form, linear, einzelsträngig, doppelsträngig oder einer komplexen Kette davon vorliegen, die nach Belieben abhängig von dem jeweiligen Zweck ausgewählt werden kann, jedoch ist eine cyclische Form im Hinblick auf die einfache Handhabung und einfache Integration in Wirtszellen wünschenswert, und eine doppelsträngige Form ist wünschenswert von dem Blickpunkt der Stabilität und dergleichen.
  • Das neue rekombinante DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung kann ein Molekül sein, in dem ein oder mehrere beliebige Basen entweder an das 5'- oder das 3'-Ende oder beide Enden der Nukleotidsequenz des DNA-Fragments gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung angefügt sind.
  • Die zu addierenden Basen sind nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt, dass sie keine Verschiebung des Leserasters in dem neuen DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung verursachen, und Beispiele dafür schließen eine Adaptersequenz, eine Linkersequenz oder eine Nukleotidsequenz, die eine Signalsequenz kodiert, eine Nukleotidsequenz, die β-Galactosidase oder ähnliche andere Polypeptide kodiert und eine Sequenz, die angefügt wird, wenn eine DNA-Sonde oder dergleichen hergestellt wird, um die Detektionssensitivität zu erhöhen, ein.
  • Es ist wünschenswert, dass das rekombinante DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung weitere Nukleotidsequenzen zusätzlich zu dem neuen DNA-Fragment gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält, wie es die Umstände verlangen. Der Begriff "weitere Nukleotidsequenzen", wie hierin verwendet, bezeichnet z.B. eine Enhancersequenz, eine Promotorsequenz, eine Ribosomen-Bindungsstellen-Sequenz, eine Nukleotidsequenz, die mit dem Ziel verwendet wird, die DNA-Kopienzahl zu amplifizieren, ein Translations-Initiations-Kodon, eine Nukleotidsequenz, die ein Signalpeptid kodiert, eine Nukleotidsequenz, die ein anderes Polypeptid kodiert, ein Translations-Terminations-Kodon, eine Poly(A)-Anfügungssequenz, eine gesplicte Sequenz, einen Replikationsorigin und eine Gensequenz, die als Selektionsmarker verwendet werden soll.
  • Obwohl die Auswahl nötiger Nukleotidsequenzen auf Grundlage der Verwendung des rekombinanten DNA-Moleküls, das hergestellt werden soll, getroffen wird, handelt es sich bei den Nukleotidsequenzen vorzugsweise um solche, die Wirtszellen derart transformieren, dass sie ihnen die Fähigkeit zur Produktion des neuen Fas Antigen-Derivates gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung verleihen, so dass das genannte rekombinante DNA-Molekül vorzugsweise wenigstens ein Translations-Initiations-Kodon, ein Terminationskodon, einen Replikationsursprung und eine Sequenz für ein Selektionsmarkergen zusätzlich zu dem neuen DNA-Fragment gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthalten kann, und es kann bevorzugter eine Promotorsequenz enthalten, die in den Wirtszellen funktioniert. Insbesondere ist es wünschenswert, eine Sequenz zuzufügen, die ein Signalpeptid zusätzlich zu diesen Sequenzen kodiert, da solch eine Sequenz eine Transformation von Wirtszellen derart ermöglicht, dass das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung exprimiert und sezerniert werden kann. Zum Beispiel wird, wenn ein rekombinantes DNA-Molekül durch Einfügen eines DNA-Fragments, das die gesamten Anteile der Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 12 bis 14 des Sequenzprotokolls enthält, in einen geeigneten Vektor, stromabwärts einer Signalsequenz, die für ein Signalpeptid kodiert, hergestellt wird und ein geeigneter Wirt mit dem so hergestellten Molekül transformiert wird, durch Kultivieren des resultierenden Transformanten die Sezernierung eines Polypeptids, das die Aminosäuresequenzen wie in den SEQ ID NO: 9 bis 11 des Sequenzprotokolls beschrieben enthält, in den Kulturüberstand möglich. Obwohl die einzufügende Signalsequenz beliebig wählbar ist, ist eine Signalsequenz wünschenswert, die das Signalpeptid eines Fas Antigens kodiert, insbesondere eines humanen Fas Antigens, wie z.B. eine Signalsequenz, die das Signalpeptid von humanem Fas Antigen, wie in 1 oder 3 angegeben, kodiert.
  • Zusätzlich zu dem oben Gesagten können weitere geeignete Sequenzen, abhängig von dem zu verwendenden Wirt und den anzuwendenden Bedingungen, durch Auswahl dieser Sequenzen aus Sequenzen, die z.B. das Signalpeptid von TNF oder G-CSF kodieren, das Signalpeptid von E. coli alkaliner Phosphatase, das Signalpeptid von Hefe PHO1 und das Signalpeptid von Hefe α-Faktor, verwendet werden.
  • Beispiele für das Selektionsmarkergen schließen das Ampicillin-Resistenz-Gen, Kanamycin-Resistenz-Gen, Neomycin-Resistenz-Gen, Thymidin-Kinase-Gen und dergleichen ein, und das neue rekombinante DNA-Molekül, das wenigstens zwei Selektionsmarker enthält, ist wünschenswert, aus dem Grunde, dass Klone, die mit dem Gen von Interesse transformiert worden sind, leicht selektiert werden können, wenn Hefe- und Säuerzellen als Wirte verwendet werden. Im Hinblick auf die Sequenz, die zum Zwecke der Amplifizierung der Kopienanzahl verwendet wird, können Sequenzen des Dihydrofolatreduktasegens (dhfr) und ähnliche verwendet werden.
  • Beispiele für Promotorsequenzen, die in Wirtszellen funktionieren, schließen Sequenzen des trp-Promotors und lac-Promotors ein, wenn der Wirt E. coli ist und Sequenzen des Alkoholoxidase 1 (AOX 1)-Promotors, Polyhydrin-Promotors, SV40-Promotors, SRα-Promotors und humanen Elongationsfaktor 1α(EF 1α)-Promotors, wenn der Wirt Hefe, COS-Zellen oder ähnliche eukaryontische Zellen sind.
  • Bevorzugte Beispiele für das rekombinante DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung schließen aus Sicht des Wirtes solche ein, die E. coli-Zellen derart transformieren können, dass das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung exprimiert werden kann. Folglich ist es wünschenswert, dass das rekombinante DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung über wenigstens eine Promotorsequenz verfügt, die in E. coli-Zellen funktioniert, zusätzlich zu einem Replikationsursprung und ei ner Markersequenz von E. coli, wobei es noch wünschenswerterweise weiterhin eine Sequenz hat, die ein Signalpeptid kodiert.
  • Der trp-Promotor, lac-Promotor und ähnliche sind wünschenswert als die geeignete Promotorsequenz, die in E. coli-Zellen funktioniert, und das Signalpeptid von E. coli alkaliner Phosphatase ist wünschenswert als das Signalpeptid, das in E. coli-Zellen funktioniert.
  • Weitere bevorzugte Beispiele sind solche, die tierische Zellen, Hefezellen und ähnliche eukaryontische Zellen transformieren können, wodurch diese Zellen befähigt werden, das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. In diesem Fall kann ein geeignetes Beispiel des rekombinanten DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung wenigstens eine Poly(A)-Anfügungssequenz zusätzlich zu einem Translations-Initiationskodon, Terminationskodon und einem Selektionsmarkergen, ebenso wie einen SV40-Promotor, humanen Elongationsfaktor 1α(EF 1α)-Promotor oder SRα-Promotor, die in tierischen Zellen funktionieren, dem Alkoholoxidase 1(AOX 1)-Promotor, der in Hefezellen funktioniert und dem SV40-Replikationsursprung haben.
  • Das rekombinante DNA-Molekül gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann z.B. durch ein Verfahren erhalten werden, in welchem dem neuen DNA-Fragment gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung erlaubt wird, eine Ligation mit einem weiteren DNA-Fragment einzugehen, das eine beliebige Nukleotidsequenz aufweist, oder durch ein Verfahren, in dem das genannte Fragment in einen wählbaren Vektor eingeführt wird (vgl. Sambrook J. et al.; Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989).
  • Veranschaulichend dargestellt werden das DNA-Fragment bzw. ein Vektor mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und die so erhaltenen Fragmente werden einer Ligation unter Verwendung einer DNA-Ligase unterzogen. Der Vektor kann jeder beliebige Plasmid-Vektor, Phagen-Vektor, Virus-Vektor und dergleichen sein, und ein kommerziell erhältlicher Artikel kann ebenfalls verwendet werden. Beispiele für typische Vektoren schließen pUC118, pBR322, pSV2-dhfr, pBluescriptII, PHIL-S1, λZapII, λgt10, pAc700, YRP17, pEF-BOS, pEFN-II und ähnliche ein, wobei pEF-BOS oder ein ähnlicher aufgrund seiner Fähigkeit, hohe Expression zu vermitteln, wünschenswert ist.
  • Zusätzlich kann das rekombinante DNA-Molekül gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung in jeder beliebigen Anwendung verwendet werden. Zum Beispiel kann es verwendet werden, wenn das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung in industriellem Maßstab hergestellt wird oder zum Zwecke der Herstellung des neuen DNA-Fragments gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung in großem Maßstab durch dessen Amplifikation. Außerdem kann das rekombinante DNA-Molekül gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung zur Herstellung des Transformanten gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Im Folgenden wird der Transformant gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben. Der Transformant der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass er mit dem rekombinanten DNA-Molekül gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung transformiert wird. In anderen Worten kann der Transformant der vorliegenden Erfindung durch Einführen des rekombinanten DNA-Moleküls gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung in Zellen oder Mikroorganismen, die als Wirt verwendet werden sollen, erhalten werden.
  • Der Transformant der vorliegenden Erfindung wird durch Transformieren entweder von prokaryontischen Zellen oder von eukaryontischen Zellen erhalten. Beispiele für prokaryontische Zellen schließen Zellen von E. coli, Bacillus subtilis und dergleichen ein. Beispiele für eukaryontische Zellen schließen COS-Zellen, CHO-Zellen, HeLa-Zellen, Namalwa-Zellen und ähnliche Säugerzellen, ebenso wie Sf-Zellen und ähnliche Insektenzellen sowie Hefezellen ein. Unter diesen Wirten sind E. coli-Zellen, Säugerzellen oder Hefezellen wünschenswert, da Transformanten, die durch Transformieren dieser Zellen erhalten werden, einfach zu handhaben sind und von ihnen hohe Expressionsmengen erwartet werden können.
  • Da die Kopienzahl des Gens in Säugerzellen erhöht werden kann, ist es wünschenswert, dhfr-defiziente CHO-Zellen als Wirte zu verwenden. Da die Menge der Sekretions produktion von exogenen Proteinen in Hefezellen groß ist, ist es außerdem wünschenswert, eine Hefe vom Genus Pichia als Wirtszelle zu verwenden.
  • Um die Funktion des rekombinanten DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung ausreichend auszuüben, sollte ein Vektor, der bei der Herstellung des rekombinanten DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, für die Wirtszellen geeignet sein.
  • Beispiele für die wünschenswerte Kombination des in dem rekombinanten DNA-Molekül zu verwendenden Vektors mit dem Wirt schließen pUC118 mit E. coli, pEF-BOS mit COS-Zellen oder CHO-Zellen, Yac mit Hefezellen und AcNPV mit Sf-Zellen ein (vgl. Genetic Engineering Handbook, eine spezielle Ausgabe von Experimental Medicine, publiziert durch Yodo-sha, Japan, 20. März 1991). In gleicher Weise sollten der Promotor, ein Signalpeptid, das die Nukleotidsequenz kodiert, Markergene und dergleichen, die in dem rekombinanten DNA-Molekül enthalten sein sollen, so verwendet werden, dass solche ausgewählt werden, die für den zu verwendenden Wirt geeignet sind.
  • Um einen Transformanten zu erhalten, der fähig ist, das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, sollte das genannte rekombinante DNA-Molekül auch eine Sequenz aufweisen, die notwendig für die Expression ist, wie z.B. einen geeigneten Promotor oder dergleichen.
  • Um einen Transformanten zu erhalten, der fähig ist, das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung zu sezernieren und zu produzieren, werden Wirtszellen mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das das zuvor erwähnte rekombinante DNA-Molekül gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist und für die Produktion geeignet ist, transformiert, und zwar mit einem Molekül, in dem eine Nukleotidsequenz, das ein Signalpeptid kodiert, stromaufwärts von dem DNA-Fragment gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung eingefügt ist.
  • Im Hinblick auf das Verfahren zur Einführung des rekombinanten DNA-Moleküls gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung in die Wirtszellen kann ein für den Wirt oder das rekombinante DNA-Molekül geeignetes Verfahren ausgewählt werden, z.B. aus folgenden: einem Elektroporationsverfahren, einem Protoplastenverfahren, einem Alkalimetallverfahren, einem Calciumphosphatverfahren, einem DEAE-Dextran-Verfahren, einem Mikroinjektionsverfahren, einem Verfahren, in dem eine Infektion unter Verwendung von Viruspartikeln herbeigeführt wird und anderen bekannten Verfahren (vgl. Genetic Engineering Handbook, eine spezielle Ausgabe von Experimental Medicine, publiziert durch Yodo-sha, Japan am 20. März 1991). Da eine hohe Transformationseffizienz von Säugerzellen erreicht wird, wenn das Calciumphosphatverfahren oder DEAE-Dextranverfahren verwendet wird, ist es wünschenswert, diese Verfahren zu verwenden, wenn die Wirtszellen Säugerzellen sind.
  • Der Transformant der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Transformant, der das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung exprimieren kann, bevorzugter ein Transformant, der das genannte Polypeptid exprimieren kann und es in den Kulturüberstand sezerniert. Die Verwendung eines solchen Transformanten erleichtert die Herstellung in großem Maßstab des neuen Fas Antigen-Derivates der vorliegenden Erfindung.
  • Obwohl der Transformant gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung für jegliche Zwecke verwendet werden kann, kann es für den Zweck der Herstellung der DNA gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung oder des rekombinanten DNA-Moleküls gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung in großem Maßstab verwendet werden, sowie zur Herstellung des neuen Fas Antigen-Derivates gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung in industriellem Maßstab.
  • Das Herstellungsverfahren gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des neuen Fas Antigen-Derivates gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung, das gekennzeichnet ist durch Verwendung des Transformanten gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung. Gemäß dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird der Transformant gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung kultiviert und es wird, falls nötig, eine Induktion der Amplifikation und Expression des Genes durchgeführt. Anschließend wird die resultierende Kulturmischung gewonnen und dann wird, wie es die Umstände erfordern, die Reinigung des neuen Fas Antigen-Derivates der vorliegenden Erfindung durch wahlwei ses Kombinieren von Konzentration, Löslichmachen, Dialyse, verschiedenen chromatographischen Methoden und ähnlichen Mitteln ausgeführt.
  • In dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Kulturmischung" einen Transformanten, ein Medium, das den Transformanten enthält, einen Kulturüberstand oder ein Lysat der Zellen. Wenn das hergestellte zuvor erwähnte neue Fas Antigen-Derivat in den Zellkulturüberstand sezerniert wird, kann das genannte Polypeptid aus diesem Kulturüberstand gereinigt werden. Andererseits werden die Zellen, wenn das neue Fas Antigen-Derivat in den Zellen der Transformanten akkumuliert wird, aufgelöst oder durch wahlweise Auswahl eines Verfahrens, das für die Wirtszellen geeignet ist, aus Lysozymbehandlung, Behandlung mit Detergens, einfrieren-auftauen, Druckbeaufschlagung, Ultraschall oder andere Verfahren aufgeschlossen, und anschließend wird das genannte Polypeptid als eine lösliche Fraktion oder unlösliche Fraktion gewonnen und gereinigt.
  • Wenn der Wirt E. coli-Zellen sind und das zuvor erwähnte neue Polypeptid im Periplasma akkumuliert wird, kann das genannte Polypeptid durch Anwenden des Verfahrens nach Willsky et al. (J. Bacteriol., Band 127, Seiten 595–609, 1976) gewonnen werden.
  • Die Kultivierung des Transformanten kann auf herkömmliche Art und Weise, bezugnehmend auf verschiedene Lehrbücher, ausgeführt werden (vgl. "Methods for Microbial Experiments", herausgegeben durch die Japanese Biochemical Society, publiziert durch Tokyo Kagaku Dojin, 1992).
  • Wenn eine Induktion der Expression des Gens durchgeführt wird, wird ein geeignetes Agens ausgewählt und abhängig von dem integrierten Promotor verwendet. Zum Beispiel kann 3β-Indolacrylsäure verwendet werden, wenn der trp-Promotor integriert ist, Dexamethason kann verwendet werden im Falle des MMTV-Promotors und Methanol im Falle des AOX1-Promotors.
  • Ein typisches Beispiel für das Gen-Amplifikationsverfahren ist ein Verfahren, in dem dhfr-defiziente CHO-Zellen als Wirt verwendet werden und Methotrexat verwendet wird, wenn ein dhfr-enthaltender Vektor verwendet wird.
  • Der in dem genannten Herstellungsverfahren zu verwendende Transformant ist nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt, dass es der Transformant gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, jedoch ist ein Transformant wünschenswert, der erhalten wurde unter Verwendung eines Wirtes, ausgewählt aus: COS-Zellen, CHO-Zellen und ähnlichen Säugerzellen, Hefezellen und E. coli Zellen.
  • Im Folgenden werden Beispiele für die Kultivierung und die Expressionsinduktion gezeigt, wenn E. coli-, CHO-Zellen oder ähnliche Säugerzellen oder eine Hefe des Genus Pichia als Transformanten verwendet werden.
  • Im Falle, dass E. coli mit einem rekombinanten DNA-Molekül mit einem trp-Promotor transformiert wird, werden die Zellen in L-Fermentationslösung vorkultiviert und in M9-CA-Medium mit einer Inokulierungsgröße von 1/50 Volumen inokuliert, um die Kultivierung bei 37°C auszuführen. Wenn der OD550-Wert 1 bis 4 erreicht (nämlich die logarithmische Wachstumsphase), mehrere Stunden nach dem Beginn der Kultivierung, wird 3β-Indolacrylsäure mit einer Endkonzentration von 10 μg/ml dazugegeben, um die Induktion der Expression auszuführen. Durch Ausführen von 1 bis 2 Tagen weiterer Kultivierung kann eine Mischung, die das Protein von Interesse enthält, erhalten werden.
  • Wenn eine Hefe des Genus Pichia, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül mit einem AOX1-Promotor transformiert wird, verwendet wird, wird die Hefe etwa 2 Tage lang unter Verwendung von BMGY-Medium vorkultiviert, das Medium wird ausgetauscht, und anschließend wird eine Induktion der Expression durch Zugabe von Methanol bewirkt. Durch weitere Kultivierung von 1 bis 2 Tagen bei 30°C kann eine Kulturmischung erhalten werden, die das Protein von Interesse enthält.
  • Ein Transformant, der durch Transformieren von CHO-Zellen oder ähnlichen Säugerzellen mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das den Elongationsfaktor-Promotor hat, erhalten wird, wird unter Verwendung von DMEM-Medium, das 10% fötales Kälberserum enthält, kultiviert. Die Zellen werden mit einer Konzentration von etwa 1–10 × 104 Zellen/ml inokuliert und bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid/95% Luft kultiviert. Da die Zellen im Allgemeinen 2 bis 3 Tage danach ein konfluen tes Stadium erreichen, wird das Medium zu diesem Zeitpunkt durch serumfreies D-MEM ausgetauscht. Durch weitere Durchführung einer Kultivierung für 2 bis 3 Tage kann eine Kulturmischung erhalten werden, die das Protein von Interesse enthält. In diesem Zusammenhang ist es möglich, wenn die Menge des hergestellten Proteins von Interesse klein ist, die Produktion durch Amplifizierung des Genes mit Methotrexat, wie zuvor beschrieben, zu erhöhen.
  • Die Aufreinigung des neuen Fas Antigen-Derivates gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung aus der zuvor erwähnten Kulturmischung wird durch wahlweise Auswahl geeigneter Mittel unter solchen, wie sie im Allgemeinen bei der Reinigung von Polypeptiden verwendet werden, ausgeführt. Zur Veranschaulichung kann die Reinigung ausgeführt werden durch wahlweise Kombination geeigneter Mittel, die aus den gewöhnlich verwendeten Methoden, wie z.B. Aussalzen (salting-out), Ultrafiltration, isoelektrische Präzipitation, Gelfiltration, Elektrophorese, Ionenaustauschchromatografie, hydrophobe Chromatografie, Antikörper-Chromatografie und ähnliche verschiedene Affinitätschromatografiemethoden, Chromatofokussierung (chromatofocasing), Absorptionschromatografie, Reverse-Phase-Chromatografie und dergleichen, wenn nötig unter weiterer Verwendung eines HPLC-Systems und dergleichen ausgewählt werden. Insbesondere sind eine Affinitätschromatografie, die einen anti-Fas Antikörper verwendet, der in der Lage ist, das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung zu erkennen, einen Fas Liganden, Protein A oder ähnliches als Ligand ebenfalls nützlich für die Reinigung des genannten neuen Polypeptids.
  • In dem genannten Herstellungsverfahren kann das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung als Fusionsprotein mit β-Galactosidase aus E. coli oder einem anderen Polypeptid exprimiert werden, jedoch ist es in diesem Fall notwendig, einen Schritt zur Abtrennung des genannten Proteins durch dessen Behandlung mit Cyanogenbromid, Hydroxylamin oder ähnlichen chemischen Substanzen oder einer Protease oder einem ähnlichen Enzym in einem der Reinigungsschritte abzutrennen.
  • Außerdem kann, wenn der verwendete Transformant E. coli ist und das genannte Protein als ein unlösliches Protein in Form eines Einschlusskörpers produziert wird, ein Ver fahren aufgeführt werden, in dem der Einschlusskörper (inclusion body) dem Löslichmachen, der Denaturierung und der Renaturierung in dieser Reihenfolge in einem geeigneten Schritt der Reinigung unterzogen wird (Thomas E. und Creighton J., J. Molecular Biology, Band 87, Seiten 563–577, 1974).
  • Zur Veranschaulichung werden die Zellen aufgeschlossen und zentrifugiert, und das resultierende Pellet wird aufgenommen. Als Nächstes wird ein Puffer zum Löslichmachen, der geeignete Mengen an Harnstoff oder Guanidin-Hydrochlorid und ein Detergenz, eine reduzierte Form von Glutathion und eine oxidierte Form von Glutathion enthält (z.B. ein Puffer, der 5 M Guanidin-Hydrochlorid, 0,005% Tween 80, 50 mM Tris-HCl (pH 8), 5 mM EDTA, 2 mM reduzierte Form von Glutathion und 0,02 mM oxidierte Form von Glutathion enthält) zu dem Pellet dazugegeben, die Mischung wird der Denaturierung durch Zugabe von 2-Mercaptoethanol unterzogen, und die resultierende Probe wird der Renaturierung unterzogen durch Dialysieren gegen den Puffer zum Löslichmachen, aus dem Guanidin-Hydrochlorid zuvor eliminiert wurde. Wird das Produkt als Fusionsprotein exprimiert, wird die unnötige Komponente des Proteins unter Verwendung von Cyanogenbromid oder einer ähnlichen chemischen Substanz oder einer Protease oder einem ähnlichen Enzym nach diesen Behandlungen abgetrennt, und anschließend wird eine geeignete Chromatografie durchgeführt.
  • Gemäß dem genannten Herstellungsverfahren kann das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung, das Fas Antigen-Aktivitäten aufweist, was in pharmazeutischen Herstellungen und dergleichen nützlich ist, homogen mit hoher Effizienz in industriellem Großmaßstab hergestellt werden.
  • Im Folgenden wird das Medikament gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben. Das Medikament gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält das neue Fas Antigen-Derivat gemäß dem ersten Aspekt oder ein physiologisch annehmbares Salz davon als seinen aktiven Wirkstoff.
  • Es kann außerdem in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden durch wahlweises Hinzufügen von pharmazeutisch annehmbaren Trägem, Füllstoffen, Stabilisatoren, Schmierstoffen, Farbmitteln, Stabilisierungsmitteln, Dispergiermitteln, An tioxidantien, Puffern, Konservierungsmitteln, Suspensionsmitteln, Emulgatoren und gewöhnlich verwendeten geeigneten Lösungsmitteln (sterilisiertes Wasser, Pflanzenöl und dergleichen), ebenso wie physiologisch annehmbaren Lösungsmitteln und dergleichen.
  • Das Medikament der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedenen Verabreichungswegen verwendet werden, wovon die parenterale Verabreichung wünschenswert ist. Beispiele für die parenterale Verabreichung schließen intravenöse Verabreichung, intraarterielle Verabreichung, subkutane Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung und ähnliche Injektionen, die herkömmlich sind, ebenso wie rektale Verabreichung, perkutane Absorption, transmukosale Absorption und dergleichen ein. In diesem Falle sind Suppositorien, Inhalationen, insbesondere Injektionen und dergleichen als Dosierungsform wünschenswert.
  • Das Medikament gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann überschüssige Apoptose kontrollieren und kann daher verschiedene krankhafte Zustände und Krankheiten vorbeugen und behandeln, die durch anormale Apoptose verursacht werden, indem es Menschen oder Tieren verabreicht wird, die an anormaler Fas Antigen-vermittelter Apoptose leiden, insbesondere an übermäßiger Apoptose, die durch Überproduktion von endogenem Fas Liganden im Rahmen einer Erkrankung oder einer Überdosis an exogenem Fas Liganden induziert wurde. Der wirksame Inhalt oder die Dosierung und Formulierung des neuen Fas Antigen-Derivates oder eines physiologisch annehmbaren Salzes davon als dem aktiven Wirkstoff werden wahlweise, abhängig von dem krankhaften Zustand, bestimmt.
  • Der siebte Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Verbesserung der Aktivität oder der Funktion des Fas Antigens oder Fas Antigen-Derivates, welches gekennzeichnet ist durch die Deletion von wenigstens einem der Aminosäurereste, beginnend vom N-terminalen Aminosäurerest des Fas Antigens bis zu einem Cysteinrest, der am Nächsten an der N-terminalen Seite liegt (ausschließlich dem genannten Cysteinrest). Ebenfalls zur Verfügung gestellt wird ein Verfahren zur Konstruktion oder ein Verfahren zur Herstellung des Fas Antigens oder Fas Antigen-Derivates mit verbesserter Aktivität oder Funktion, das gekennzeichnet ist durch die Deletion von wenigstens einem der 1. bis 42. Aminosäureresten, gezählt von dem N-Terminus des Fas Antigens. Das genannte Herstellungsverfahren umfasst die Schritte der Herstellung des neuen Fas Antigen-Derivates gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung und des Bestätigens der Verbesserung durch Messen seiner Aktivität und dergleichen. Ein Verfahren zur Auswahl der von der N-terminalen Region zu deletierenden Aminosäurereste, ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides, das die genannte Deletion aufweist und ein Verfahren zur Messung der Aktivität sind in dem vorangehenden Text beschrieben.
  • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele werden zur weiteren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt, aber die Beispiele dienen lediglich dem Zwecke der Erläuterung und sind nicht als Definition der Beschränkungen der Erfindung gemeint. Ferner beruhen die in der folgenden Beschreibung verwendeten Abkürzungen auf den auf dem genannten Gebiet gewöhnlich verwendeten Abkürzungen. In diesem Zusammenhang wurden die verschiedenen Techniken, die in den folgenden Beispielen angewandt wurden, hauptsächlich unter Bezugnahme auf die unten angegebenen Zeitschriften und Bücher ausgeführt.
    • 1. Michael A. I. et al., Polymerase Chain Reaction, PCR Protocols, a guide to methods and applications (1990), Academis Press
    • 2. Sambrook J. et al., Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989
    • 3. Genetic Engineering Handbook, a supplement of Experimental Medicine, publiziert von Yodo-sha, Japan, am 20. März 1991
    • 4. "Methods for Microbial Experiments", publiziert von Japanese Biochemical Society; veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin, 1992
    • 5. Methods for Immunological Experiments, editiert von The Japanese Society for Immunology, publiziert von Japanese Society for Immunology
    • 6. Fumio Imamoto et al., "Introduction of Recombinant Genes into Cells and their Expression", Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Supplement 28(14), 1983
    • 7. Yoshio Okada, "General Cell Technology Techniques", Experimental Medicine, Anhang 7(13), 1989 (Erfindungsgemäßes Beispiel 1) Herstellung eines neuen Polypeptid-Expressionsvektors,
  • (1) Herstellung des Plasmids pM1097
  • Sense-Prmer 1 (CTGACTAGTGTCGCTACTCAGAACTTGGAA) und Antisense-Primer 2 (GTCAAGCTTGGTACCCTATTAGTTAGATCTGGATCCTTC) wurden chemisch synthetisiert (SEQ ID NO: 1 und 2 in dem Sequenzprotokoll). Dieser Sense-Primer 1 enthält eine SpeI-Stelle (ACTAGT), die 3'-Endregion einer Nukleotidsequenz, die das humane Fas Antigen-Signalpeptid kodiert und eine Nukleotidsequenz, die die 30. bis 34. Aminosäure des humanen Fas Antigens kodiert. Demgegenüber enthält der Anti-Sense-Primer 2 eine Nukleotidsequenz, die die C-terminale Seite der extrazellulären Region des humanen Fas Antigens kodiert, eine HindIII-Stelle (AAGCTT) und eine KpnI-Stelle (GGTACC).
  • Eine 100 μl große Menge an Lösung wurde hergestellt, die 100 pmol von jedem der so erhaltenen Sense-Primer 1 und Antisense-Primer 2 enthielt, 0,5 μg eines Plasmids pBLF58-1, das ein für das humane Fas Antigen kodierendes DNA-Fragment enthält (Itoh N. et al., Cell, Band 66, Seiten 233–243, 1991), jeweils 20 nmol von dATP, dCTP, dGTP und dTTP und 2,5 Einheiten der Pfu-DNA-Polymerase sowie 10 μl des beigefügten Pfu-Puffers (beide von Stratagene hergestellt). Unter Verwendung eines DNA-Thermocyclers (PCR System 9600, hergestellt von Perkin-Elmer Corp.) wurden 30 Zyklen PCR ausgeführt, wobei jeder Zyklus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 1 Minute bei 72°C war. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde doppelt verdaut mit SpeI und HindIII, das resultierende DNA-Fragment von etwa 410 Basenpaar Länge wurde in die SpeI, HindIII-Stelle eines Plasmides pM1081 integriert, das ein DNA-Fragment, das in Beispiel 21 der internationalen Patentanmeldung WO 95/13293 offenbart ist, enthält, das das humane Fas Antigen-Signalpeptid und die extrazelluläre Region des humanen Fas Liganden kodiert, und das so erhaltene Plasmid wurde pM1097 genannt. Dieses Plasmid enthält ein DNA-Fragment, das durch die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 12 des Sequenzprotokolls dargestellt wird.
  • (2) Herstellung des Plasmids pM 1303
  • Zunächst wurden der Sense-Primer 3 (TCACAAGCCCAGCAACACCAAG), der Antisense-Primer 4 (GCTTGCCGGCCGTCGCACTC), der Sense-Primer 5 (GAAGGATCCAGATCTAACGAGCCCAAATCTTGT) und der Antisense-Primer 6 (GTCGGTACCCTATCATTTACCCGGAGACAG) chemisch synthetisiert (SEQ ID NOs: 3, 4, 5 und 6 in dem Sequenzprotokoll). Der Sense-Primer 3 enthält eine Nukleotidsequenz, die die C-terminale Seite der CH1-Region des humanen Immunglobulin G1 kodiert, und der Antisense-Primer 4 enthält eine Sequenz, die den 3'-nicht-translatierten Bereich des humanen Immunglobulin G1 kodiert. Der Sense-Primer 5 enthält eine Nukleotidsequenz, die die Aminosäuren der C-terminalen Seite der extrazellulären Region des humanen Fas Antigens kodiert, eine Nukleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der N-terminalen Seite der Hinge-Region des humanen Immunglobulin G1 kodiert und eine BamHI-Stelle (GGATCC). Der Antisense-Primer 6 enthält eine Nukleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz für die C-terminale Seite der CH3-Region des humanen Immunglobulin G1 kodiert und eine KpnI-Stelle (GGTACC). Die PCR-Reaktion wurde unter denselben Bedingungen wie in Schritt (1) durch Herstellen von 100 μl einer Lösung, die 100 pmol von jedem der so erhaltenen Sense-Primer 3 und Antisense-Primer 4 enthält, 1 μl der 5'-Stretch cDNA-Bibliothek von humaner Milz (hergestellt von Clontech), jeweils 20 nmol von dATP, dCTP, dGTP und dTTP und 2,5 Einheiten der Pfu-DNA-Polymerase und 10 μl des beigefügten Pfu-Puffers enthält, ausgeführt. Unter Verwendung des so erhaltenen PCR-Produktes von etwa 750 bp Länge als Template wurde die PCR-Reaktion in der gleichen Weise ausgeführt wie in dem Schritt (1) beschrieben, durch Herstellen von 100 μl einer Lösung, die jeweils 100 pmol des Sense-Primers 5 und Antisense-Primers 6 enthält, jeweils 20 nmol von dATP, dCTP, dGTP und dTTP und 2,5 Einheiten der Pfu-DNA-Polymerase und 10 μl des beigefügten Pfu-Puffers. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde doppelt verdaut mit BamHI und KpnI, das resultierende DNA-Fragment von etwa 720 bp Länge wurde in die BamHI, KpnI-Stelle des Plasmids pM1097, das in dem Schritt (1) hergestellt wurde, integriert und das so erhaltene Plasmid wurde pM1303 genannt. Dieses Plasmid enthält ein DNA-Fragment, das durch die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls dargestellt wird.
  • (3) Herstellung des Plasmids pM1304
  • Das Plasmid pM1303, das in dem Schritt (2) hergestellt wurde, wurde mit EcoRI und KpnI doppelverdaut, das resultierende DNA-Fragment von etwa 1150 Basenpaaren Länge wurde in die EcoRI, KpnI-Stelle eines Plasmids pM1103, das durch Integration des dhfr-Gens in pEF-BOS modifiziert wurde (Mizushima S. und Nagata S., Nucleic Acids Res., Band 18, Seite 5322, 1990) integriert, und das so erhaltene Plasmid wurde pM1304 genannt. Dieses Plasmid ist ein Expressionsvektor eines Polypeptids, das aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 des Sequenzprotokolls besteht (hierin in einigen Fällen als shFas(nd29)-Fc bezeichnet).
  • (4) Herstellung des Plasmids pM1317
  • Zunächst wurden der Sense-Primer 7 (TGCGAATTCACCATGCTGGGCATCTGG) und der Antisense-Primer 8 (CGGGGTACCTCACTATGGGCACGGTGGGCA) chemisch synthetisiert (SEQ ID NOs: 7 und 8 in dem Sequenzprotokoll). Dieser Sense-Primer 7 enthält eine EcoRI-Stelle (GGATCC) und die 5'-Endregion einer Sequenz, die das humane Fas Antigen-Signalpeptid kodiert. Der Antisense-Primer 8 enthält eine Nukleotidsequenz, die die Aminosäuren der C-terminalen Seite der Hinge-Region des humanen Immunglobulin G1 kodiert und eine KpnI-Stelle (GGTACC). Die PCR-Reaktion wurde in der gleichen Weise wie in dem Schritt (1) beschrieben durchgeführt durch Herstellung von 100 μl einer Lösung, die jeweils 100 pmol der so erhaltenen Sense-Primer 7 und Antisense-Primer 8 enthält; 0,3 μg des Plasmids 1304, das in (3) hergestellt wurde, jeweils 20 nmol von dATP, dCTP, dGTP und dTTP und 2,5 Einheiten der Pfu-DNA-Polymerase und 10 μl des beigefügten Pfu-Puffers. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde mit EcoRI und KpnI doppelverdaut, das resultierende DNA-Fragment von etwa 450 bp Länge wurde in die EcoRI, KpnI-Stelle des Plasmids pM1103, das in Schritt (3) verwendet wurde, integriert und das so erhaltene Plasmid wurde pM1317 genannt. Dieses Plasmid ist ein Expressionsvektor eines Polypeptids, das aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 10 des Sequenzprotokolls besteht (hierin in einigen Fällen als shFas(nd29)-Hinge bezeichnet). In diesem Zusammenhang wurde ein E. coli-Stamm JM109 mit den Plasmiden pM1304 und pM1317 auf herkömmliche Art und Weise transformiert, und die so erhaltenen Transformanten JM109(pM1304) und JM109(pM1317) wurden von den Erfindern der vorliegenden Erfindung beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Higashi-1-1-3, Tsukubashi, Ibaraki, Japan, am 14. März 1996 hinterlegt, die am 6. März 1997 gemäß dem Budapester Abkommen überführt wurden (FERM BP-5854 und FERM BP-5855).
  • (Erfindungsgemäßes Beispiel 2) Herstellung und Kultivierung eines Transformanten
  • Unter Verwendung von pM1304, pM1317 und pBF-Fc1, das in Beispiel 1 der internationalen Patentanmeldung WO 95/13293 beschrieben wurde (ein Expressionsplasmid eines chimären Proteins (hierin in einigen Fällen als hFas-Fc bezeichnet) aus der extrazellulären Region des humanen Fas Antigens und der Fc-Region des humanen IgG1), wurden die Transformanten COS-1/pM1304, COS-1/pM1317 und COS-1/pBF-Fc1 auf die folgende Art und Weise hergestellt. Das heißt, 100 μg von jeder Plasmid-DNA wurden in 500 μl einer 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM Ethylendiamintetraessigsäurelösung (hierin im folgenden als TE-Puffer bezeichnet) gelöst. Zu jeder der resultierenden Lösungen wurden 125 ml D-MEM (Nissui Pharmaceutical), enthaltend 0,2 mg/ml DEAE-Dextran und 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) dazugegeben, wodurch eine DNA-DEAE-Dextran-Lösungsmischung erhalten wurde. Die DNA-DEAE-Dextran-Lösungsmischung wurde zu COS-1-Zellen gegeben, die in Monolayerkultur bis zum Erreichen eines semikonfluenten Stadiums unter Verwendung einer Rollenflasche mit 1700 cm2 Kapazität (von Corning hergestellt) kultiviert wurden, und die Zellen wurden bei 37°C kultiviert, um die Transformanten COS-1/pM1304, COS-1/pM1317 und COS-1/pBF-Fc1 zu erhalten. Nach 4 Stunden Kultivierung wurde die DNA-DEAE-Dextran-Lösungsmischung entfernt und durch D-MEM-Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum (hergestellt von Lifetech Oriental) ersetzt, und die Zellen wurde für weitere 24 Stunden kultiviert. Anschließend wurde das Medium durch Phenol Red-freies D-MEM ersetzt (kein Zusatz von FBS und BSA), die Zellen wurden erneut 72 Stunden lang kultiviert, und anschließend wurde der Kulturüberstand gewonnen.
  • (Erfindungsgemäßes Beispiel 3) Reinigung von shFas(nd29)-Fc
  • (1) Affinitätschromatografie
  • Ammoniumsulfat (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) wurde zu einem Liter COS-1/pM1304 Kulturüberstand bis 70% Sättigung zugefügt und aufgelöst, und die Lösung wurde über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Das auf diese Weise gebildete Präzipitat wurde durch 30 Minuten Zentrifugation bei 8000 rpm und bei 4°C gewonnen, in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert und anschließend gegen PBS dialysiert. Eine 57 ml große Menge der so hergestellten Suspension wurde mit zwei Volumen eines Affi-prep Protein A-Bindungspuffers (hergestellt von Bio-Rad) verdünnt. Nach Entfernen des unlöslichen Materials durch Filtration wurde die resultierende Lösung auf eine Affi-prep Protein A Praparative Cartridge (7,3 ml, hergestellt von Bio-Rad)-Säule gegeben, die gemäß Anleitung äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit 90 ml Affi-prep-Protein A-Bindungspuffer gewaschen und anschließend wurde shFas(nd29)-Fc mit dem Affi-prep-Protein A-Elutionspuffer (hergestellt von Bio-Rad) eluiert. Fraktionen, die shFas(nd29)-Fc enthielten, das durch ELISA mittels eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch für humanes Fas Antigen ist, detektiert wurde, wurden vereinigt, einer Ultrafiltration unter Verwendung von Filtron Omega Cell (hergestellt von Fuji Filter; nominaler Molekulargewichts-Cutoff von 30 kD) unterzogen und anschließend konzentriert. Die auf diese Weise konzentrierte Lösung wurde gegen 0,9% NaCl dialysiert, wodurch gereinigtes shFas(nd29)-Fc erhalten wurde. Außerdem wurde hFas-Fc auf die gleiche Art und Weise gereinigt. Der Proteingehalt der jeweiligen Probe wurde gemäß dem Verfahren von Lowry unter Verwendung von bovinem Serumalbumin als der Standardsubstanz gemessen.
  • (2) SDS-PAGE
  • Das gereinigte shFas(nd29)-Fc, das in dem obengenannten Schritt (1) erhalten wurde, wurde einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung eines 5 bis 20% Gelgradienten, enthaltend 0,1% SDS, unterzogen und die Bande wurde durch Färben des Gels mit 2D-Silver Staining Reagent II "Daiichi" (hergestellt von Daiichi Pure Chemicals) detektiert. Die Ergebnisse der Reinigung von shFas(nd29)Fc sind in 6 gezeigt. In dem Bild zeigen die Spuren 1 bis 4 die Resultate unter nicht-reduzierenden Bedingungen und die Spuren 5 bis 8 unter reduzierenden Bedingungen. Wie in 6 gezeigt, wurde das gereinigte shFas(nd29)-Fc als nahezu einzige Bande, die seinem Dimer mit einem Molekulargewicht von etwa 85 kD unter nicht-reduzierenden Bedingungen entspricht (Spuren 1 bis 3) oder seinem Monomer mit einem Molekulargewicht von etwa 43 kD unter reduzierenden Bedingungen entspricht (Spuren 5 bis 7), detektiert.
  • (Erfindungsgemäßes Beispiel 4) Analyse der shFas(nd29)-Fc N-terminalen Aminosäuresequenz
  • (1) Entsalzen der Testprobe durch Reverse-Phase HPLC
  • Das in dem erfindungsgemäßen Beispiel 3 erhaltene gereinigte shFas(nd29)-Fc wurde einer Reversen-Phase HPLC auf die folgende Art und Weise unterzogen. Zunächst wurde das oben erwähnte gereinigte shFas(nd29)-Fc auf eine VYDAC C4-Säule aufgetragen (4,6 mm 0 × 25 cm, hergestellt von Cypress), die mit 0,05% Trifluoressigsäure zuvor äquilibriert worden ist, und die Säule wurde anschließend mit 0,05% Trifluoressigsäure gewaschen. Nach dem Waschen wurde die Elution durch ein lineares Dichtegradientenverfahren bei einer Durchflussrate von 1 ml/min unter Verwendung von 0,05% Trifluoressigsäure/0–100% Acetonitril, durchgeführt.
  • (2) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
  • Die eluierte Hauptpeak-Fraktion wurde lyophilisiert und in 70% Ameisensäure aufgelöst, und die N-terminale Aminosäuresequenz der auf diese Weise hergestellten Probe wurde unter Verwendung des Modell 477A Protein-Sequenziersystem-120 APTH-Analyzer (hergestellt von Perkin-Elmer) bestimmt. Das heißt, PTH-Aminosäuren wurden bei einer ultravioletten Absorption von 270 nm detektiert, und die Aminosäuren wurden basierend auf der Retentionszeit der Standard-PTH-Aminosäuren (hergestellt von Perkin-Elmer) identifiziert, die zuvor durch das glei che Verfahren isoliert wurden. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die Probe eine N-terminale Aminosäuresequenz (Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp) hat, in welcher 29 Aminosäurereste von dem N-Terminus des humanen Fas Antigens deletiert sind.
  • (Erfindungsgemäßes Beispiel 5) Vergleich der Apoptose-Inhibitionsaktivitäten von shFas(nd29)-Fc und hFas-Fc
  • Die Messung wurde basierend auf der Aktivität von shFas(nd29)-Fc und hFas-Fc zur Inhibierung cytotoxischer Aktivitäten von 1A12-Zellen und FLm14-Zellen auf WC8-Zellen und W4-Zellen ausgeführt. Die 1A12-Zellen sind Zellen, die durch Transformieren von Maus WR19L-Zellen zur Expression von humanem Fas Liganden erhalten wurden und die FLm14-Zellen sind Zellen, die durch Transformieren von Maus-FDC-P1-Zellen zur Expression von Maus Fas Liganden erhalten wurden. Die WC8-Zellen und W4-Zellen sind Zellen, die durch Transformieren von Maus-WR19L-Zellen zur Expression von humanem Fas Antigen bzw. Maus Fas Antigen erhalten wurden. Die WR19L-Zellen sind Zellen, die kaum Maus Fas Antigen exprimieren können und sensitiv gegenüber der Toxizität von TNF sind. Messungen der cytotoxischen Aktivität wurden in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Rouvier E. et al. (J. Exp. Med., Band 177, Seiten 195–200, 1993) durchgeführt. Zunächst wurden 1A12-Zellen oder FLm14-Zellen mit RPMI 1640, enthaltend 10% immobilisiertes FBS, gewaschen und als Effektorzellen verwendet. Andernteils wurden 1 × 106 WC8-Zellen oder W4-Zellen bei 37°C für 2 Stunden in 100 μl RPMI 1640, enthaltend 10% immobilisiertes FBS zusammen mit 20 μCi [51Cr] Natriumchromat (hergestellt von NEN) inkubiert. Nach dem Waschen mit RPMI 1640, enthaltend 10% immobilisiertes FBS, wurden die Zellen als Targetzellen verwendet. Zusammen mit verschiedenen Mengen an shFas(nd29)-Fc und hFas-Fc wurden 1 × 104 1A12-Zellen oder 1 × 105 FLm14-Zellen mit 1 × 104 der Targetzellen in jeder runden Vertiefung einer Mikrotiterplatte gemischt. In diesem Fall wurde das Gesamt-Flüssigkeitsvolumen auf 100 μl eingestellt. Die so hergestellte Platte wurde bei 800 rpm 2 Minuten lang zentrifugiert und anschließend bei 37°C 4 Stunden lang inkubiert. Danach wurde die Platte bei 1200 rpm 5 Minuten lang zentrifugiert und eine 50 μl große Menge des Überstandes wurde von jeder Vertiefung abgenommen, um die Radioaktivität unter Verwen dung eines Gammazählers zu messen, wodurch der spezifische Zell-Lysis-Anteil berechnet wurde.
  • Die spontane Freisetzung von 51Cr wurde durch Inkubieren der Targetzellen in dem Medium allein bestimmt und seine maximale Freisetzung wurde durch Zugabe von Triton X-100 zu den Targetzellen mit einer Konzentration von 0,1% bestimmt. Der spezifische Zell-Lysis-Anteil wurde durch die folgende Formel berechnet.
  • Figure 00500001
  • 9 zeigt die spezifischen Zytotoxizitäts-Inhibitionsaktivitäten von shFas(nd29)-Fc und hFas-Fc, wenn 1A12-Zellen als Effektorzellen und WC8-Zellen als Target-Zellen verwendet wurden, und 10 zeigt die spezifischen Zytotoxizitäts-Inhibitionsaktivitäten von shFas(nd29)-Fc und hFas-Fc, wenn FLm14 als Effektorzellen und W4-Zellen als Targetzellen verwendet wurden. Wie in den 9 und 10 gezeigt, wies shFas(nd29)-Fc eine 3- bis 10mal höhere Zytotoxizitäts-Inhibitionsaktivität als die von Fas-Fc auf.
  • (Erfindungsgemäßes Beispiel 6) Reinigung von shFas(nd29)-hinge
  • (1) Herstellung einer Affinitätssäule mit immobilisiertem anti-Fas Antigen monoklonalem Antikörper
  • Eine 350 mg große Menge eines anti-Fas Antigen monoklonalen Antikörpers (4B4-B3), der in Übereinstimmung mit einem bekannten Verfahren hergestellt wurde (Kohler und Milstein, Nature, Band 256, Seite 495, 1975) unter Verwendung von Maus-Myelomzellen und Milzzellen einer Maus, die mit humanem Fas Antigen immunisiert wurde, wurde mit 120 ml Formyl-Cellulofine (hergestellt von Seikagaku Kogyo) gemischt und bei 4°C 2 Stunden lang gerührt. Dies wurde anschließend mit 650 mg Trimethylaminboran (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gemischt und über Nacht gerührt, um die Bindung des Antikörpers zu erreichen. Um nicht-immobilisierte Antikörpermoleküle zu entfernen, wurde das Harz mit 2,4 Litern ultragereinigtem Wasser gewaschen. Anschließend wurde dies bei 4°C 3 Stunden lang in 0,2 M Tris-HCl (pH 8,0) zusammen mit 650 mg Trimetylaminboran gerührt, um nicht-reagierte Formylgruppen zu blockieren, wodurch die Antikörper-Affinitätssäule erhalten wurde.
  • (2) Affinitätschromatografie
  • Eine 10 Liter große Menge des COS-1/pM1317-Kulturüberstandes wurde durch Ultrazentrifugation unter Verwendung des Filtron Mini Sets (hergestellt von Fuji filtert 10 kD als nominaler Molekulargewichts-Cutoff) auf 1,5 Liter konzentrier. Anschließend wurde das Konzentrat durch Zugabe von 1 M Tris-HCl (pH 9,0) auf pH 8,0 eingestellt und auf die Affinitätssäule aus immobilisiertem anti-Fas Antigen monoklonalem Antikörper gegeben, die zuvor mit 320 ml von 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), enthaltend 1 M NaCl, äquilibriert wurde. Nach dem Waschen der Säule mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), enthaltend 1 M NaCl, wurde das shFas(nd29)-hinge mit 0,1 M Glycin-HCl (pH 2,5), enthaltend 1 M NaCl, eluiert. Die Fraktionen, die mit Hilfe von ELISA detektiertes shFas(nd29)-hinge enthielten, wurden vereinigt, einer Ultrazentrifugation unter Verwendung von Filtron Omega Cell (hergestellt von Fuji filtert mit 10 kD als nominalem Molekulargewichts-Cutoff) unterzogen und anschließend konzentriert. Durch Dialysieren des Konzentrates gegen 0,9% NaCl wurde gereinigtes shFas(nd29)-hinge erhalten.
  • (3) SDS-PAGE
  • Das gereinigte shFas(nd29)-hinge, das in dem oben genannten Schritt (2) erhalten wurde, wurde einer Polyacrylamidgelelektrophorese unter Verwendung eines 5 bis 20-%igen Gelgradienten, enthaltend 0,1% SDS, unterzogen, und die Bande wurde durch Färben des Gels mit 2D-Silver Staining Reagenz II "Daiichi" (hergestellt von Daiichi Pure Chemicals) detektiert. Die Ergebnisse der Reinigung des shFas(nd29)-hinge sind in 7 gezeigt. In der Abbildung zeigt die Spur 1 die Resultate unter nicht-reduzierenden Bedingungen und Spur 2 unter reduzierenden Bedingungen. Wie in 7 gezeigt, wurde gereinigtes shFas(nd29)-hinge als zwei Banden mit Molekulargewichten von etwa 43 kD und etwa 27 kD unter nichtreduzierenden Bedingungen oder als zwei Banden mit Molekulargewichten von etwa 23 kD und 27 kD unter reduzierenden Bedingungen detektiert.
  • (4) Gelfiltrationschromatografie
  • Die Gelfiltration des shFas(nd29)-hinge, das in dem erfindungsgemäßen Beispiel 6 (2) erhalten wurde, wurde durch dessen Auftragen auf eine Sephadex 75 Säule (hergestellt von Pharmacia), die zuvor mit 50 mM Tris-HCl/0,5 M NaCl (pH 8,0) äquilibriert wurde, und dessen anschließendem Eluieren mit 50 mM Tris-HCl/0,5 M NaCl (pH 8,0) durchgeführt, und die Fraktionierung wurde unter Verwendung einer Absorption bei 214 nm als Indikator erreicht. Auf dieselbe Art und Weise wie in dem erfindungsgemäßen Beispiel 6 (2) beschrieben, wurde jede Fraktion konzentriert und einer Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen. Wie in 8 gezeigt, war es möglich, eine Bande abzutrennen, die in der höhermolekulargewichtigen Fraktion (Fraktionen 1 und 2) enthalten war und schien einem Dimer einer anderen Bande zu entsprechen, die in der Niedrigmolekularfraktion (Fraktionen 3 und 4) enthalten war und einem Monomer zu entsprechen schien. Obwohl beide Fraktionen in den in dem erfindungsgemäßen Beispiel 8 beschriebenen Assay Zytotoxizitäts-Inhibitionsaktivität zeigten, zeigte die Neben-Fraktion mit höherem Molekulargewicht eine stärkere Aktivität (etwa 50 mal stärker oder mehr).
  • (Erfindungsgemäßes Beispiel 7) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz von shFas(nd29)-hinge
  • Unter Verwendung des in dem erfindungsgemäßen Beispiel 6 (2) erhaltenen gereinigten shFas(nd29)-hinge wurde dessen N-terminale Aminosäuresequenz unter Verwendung des Modell 477A Protein-Sequenzierungssystem-120 APTH-Analyzers (hergestellt von Perkin-Elmer) bestimmt. Das heißt, PTH-Aminosäuren wurden bei einer ultravioletten Absorption von 270 nm detektiert, und die Aminosäuren wurden basierend auf der Retentionszeit der Standard-PTH-Aminosäuren (hergestellt von Perkin-Elmer) identifiziert, die zuvor durch dasselbe Verfahren isoliert worden sind. Als Ergebnisse wurde bestätigt, dass die Probe eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, in der 29 Aminosäurereste von dem N-Terminus des humanen Fas-Antigens deletiert sind.
  • (Erfindungsgemäßes Beispiel 8) Vergleich der Apoptose-Inhibitionsaktivitäten von shFas(nd29)-hinge und hFas-Fc
  • Die Aktivität von shFas(nd29)-hinge und hFas-Fc, die cytotoxischen Aktivitäten von 1A12-Zellen und FLm14-Zellen auf WC8-Zellen und W4-Zellen zu inhibieren, wurde auf die gleiche Art und Weise wie in dem erfindungsgemäßen Beispiel 5 beschrieben, gemessen. Die spezifischen Zytotoxizitäts-Inhibitionsaktivitäten von shFas(nd29)-hinge und hFas-Fc, wenn 1A12-Zellen als Effektorzellen und WC8-Zellen als Targetzellen verwendet wurden, sind in 11 gezeigt, und die spezifischen Zytotoxizitäts-Inhibitionsaktivitäten von shFas(nd29)-hinge und hFas-Fc, wenn FLm14-Zellen als die Effektorzellen und W4-Zellen als die Targetzellen verwendet wurden, sind in 12 gezeigt. Wie in den 11 und 12 gezeigt, besaß shFas(nd29)-hinge eine 3- bis 10 mal höhere Zytotoxizitäts-Inhibitionsaktivität als die von Fas-Fc.
  • (Erfindungsgemäßes Beispiel 9) Analyse der Struktur innerhalb und rund um den N-terminalen Bereich der extrazellulären Region des Fas Antigens
  • Durch Konstruieren eines sterischen Strukturmodells der extrazellulären Region des Fas Antigens wurde eine Analyse der Beziehung zwischen der Deletion von Aminosäureresten in dem N-terminalen Bereich und der Fas Antigen-Fas Liganden-Bindung gemacht. Proteine, deren sterische Strukturen bekannt sind und die eine hohe Homologie mit der Aminosäuresequenz der extrazellulären Region des Fas Antigens aufweisen, wurden aus der PROTEIN DATA BANK (PDB), bei der es sich um eine Datenbank von biologischen hochpolymeren, dreidimensionalen Strukturen handelt, mit Hilfe des FASTA-Programms im Homology-Modul, das von BIOSYM hergestellt wird, abgerufen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die extrazelluläre Region des TNF-Rezeptors p55 (PDB-ID ITNR) eine hohe Homologie in der Gesamtstruktur aufweist. Da diese Struktur in Form eines Komplexes mit TNF-β vorlag, war es auch am geeignetsten als Referenzprotein bei der Konstruktion einer Modellstruktur des Fas Antigen-Fas Liganden-Komplexes. Außerdem wurde die TNF-α (PDB-ID INTF)-Struktur als ein Referenzprote in in der Fas Ligandenstruktur verwendet. Die Konstruktion der Modellstruktur wurde durch ein Homology-Modeling-Verfahren unter Verwendung des Homology-Moduls, das von BIOSYM hergestellt wird, ausgeführt. Das so konstruierte anfängliche Strukturmodell wurde einem Energy Optimization Computing (MM-Computing) unter Verwendung einer molecular force field computing Software, DISCOVERY, hergestellt von BIOSYM, unterzogen, um eine Fas Antigen-Fas Liganden-Komplex-Modellstruktur zu erhalten. Als Nächstes wurde, da ein Teil der N-terminalen Region der so erhaltenen Struktur nicht aus den Koordinaten des Referenzproteins erzeugt werden konnte, eine strukturelle Voraussage für diesen Teil durchgeführt. Aus der Komplexstruktur wurde eine Modellstruktur des Monomers der extrazellulären Region des Fas Antigens extrahiert und die Deletion der 31 Aminosäurereste wurde automatisch an dessen N-Terminus eingefügt durch das BIOPOLYMER Modul, das von BIOSYM hergestellt wird, um die Struktur zu minimieren. Als Nächstes wurde ein Molecular Dynamics Computing (MD Computing) von 1000 K und 100 Picosekunden im Vakuum durchgeführt, und die Strukturen wurden alle 10 Picosekunden aufgenommen. Jede der so gesampelten Strukturen wurde minimiert, um als endgültige Modellstruktur des Monomers der extrazellulären Region des Fas Antigens verwendet zu werden. Als diese Struktur erneut als Komplex mit der Fas Liganden-Modellstruktur zusammengefügt wurde, wurde vorhergesagt, dass die N-terminale Struktur der extrazellulären Region des Fas Antigens eine sterische Behinderung für dessen Bindung mit dem Fas Liganden verursachen könnte. Andererseits wurde, als die nd29-Modellstruktur einer Simulationsanalyse durch MD Computing unterzogen wurde, vorhergesagt, dass es den Fas Liganden schneller binden könnte, da ein größerer Teil der Struktur, die seine Bindung mit dem Fas Liganden behindert, deletiert war. Außerdem eine Analyse des Zustands der sterischen Behinderung in Komplexmodellen für eine Vielzahl von Konformationen der gesampelten Strukturen mit der Fas Ligandstruktur vorgenommen. Als Ergebnis wurde vorhergesagt, dass innerhalb des Bereiches vom Argininrest in der 1. Position bis zum Glutaminrest in der 31. Position, gezählt von dem N-Terminus des Fas Antigens, der Grad der sterischen Behinderung durch Deletion von mehr Aminosäureresten reduziert werden würde und die Apoptose-Inhibitionsaktivität der extrazellulären Region des Fas Antigens sich erhöhen würde, wenn insbesondere 13 oder 18 oder mehr Aminosäurereste deletiert würden. Es wurde auch vorhergesagt, dass eine Erhöhung der Aktivität kaum erwartet werden könnte durch eine Deletion innerhalb des Bereiches des Leucinrestes an der 36. Position bis zum Phenylalaninrest an der 42. Position, gezählt von dem N-Terminus, und dass eine Deletion des Cysteinrestes an der 43. Position, gezählt von dem N-Terminus des Fas Antigens, in dem Verlust der Apoptose-Inhibitionsaktivität aufgrund der Zerstörung der Sekundärstruktur, die durch das Antigen gebildet wird, resultieren würde. Die Analyse der dreidimensionalen Struktur, die diesmal ausgeführt wurde, zeigte, dass die Affinität für den Fas Liganden durch Kürzen der N-terminalen Struktur der extrazellulären Region des Fas Antigens kontrolliert werden kann.
  • (Erfindungsgemäßes Beispiel 10) Inhibition der Maus-Hepatopathie durch shFas(nd29)-Fc
  • C57BL/6Cr Slc Mäuse (männlich, 9 Wochen alt, von Japan S L C erworben) wurden in 3 Gruppen eingeteilt, mit je 5 Tieren pro Gruppe und als zu testende Tiere verwendet. Zellen von Propionibacterium acnes wurden mit Hitze getötet (hergestellt von RIBI Immunochemical Corp.), in physiologischer Salzlösung (hergestellt von Otsuka Pharmaceutical) bis zu einer Konzentration von 1,5 mg/ml aufgelöst, und eine 0,2 ml große Menge der resultierenden Lösung wurde jeder der Mäuse über die Schwanzvene verabreicht. Nach 8 Tagen der Verabreichung wurde das shFas(nd29)-Fc, das in dem erfindungsgemäßen Beispiel 3 hergestellt wurde, mit einer Verdünnungslösung verdünnt (physiologische Salzlösung, enthaltend 0,1% humanes Serumalbumin (The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute)) und über die Schwanzvene mit einer Dosierung von 0,3 mg/8 ml/kg oder 1 mg/8 ml/kg verabreicht. Die Verdünnungslösung allein wurde der Kontrollgruppe verabreicht. Fünf Minuten danach wurden 0,2 ml einer Lipopolysaccharid (hergestellt von Sigma)-Lösung durch Einstellen einer Konzentration von 5 μg/ml mit physiologischer Salzlösung intraperitoneal verabreicht. Nach 8 oder 24 Stunden der Verabreichung von Lipopolysaccharid wurden 75 μl Blut von der Vena fundus oculi gewonnen. Das so gewonnene Blut wurde mit 8,3 μl 3,8% Natriumcitrat (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) wässriger Lösung gemischt und bei 3000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde das so erhaltene Blutplasma mit Flüssigstickstoff eingefroren und bei –30°C bis zu dessen Verwendung gelagert. Messungen von GOT und GPT wurden unter Verwendung des GOT-FA Test Wako (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries), GPT-FA Test Wako (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) und einem automatischen Analyzer (Cobasfara, hergestellt von Roche) durchgeführt. Als Ergebnis waren die GOT- und GPT-Werte in einer Testgruppe, in der 1 mg/8 ml/kg shFas(nd29)-Fc verabreicht wurde, niedriger als die der Kontrollgruppe, was dessen Hepatopatie-Inhibitionswirkung bestätigt (13).
  • (Erfindungsgemäßes Beispiel 11) Maus-Hepatopathie-Inhibitionswirkung von shFas(nd29)-hinge
  • sC57BL/6Cr Slc Mäuse (Männchen, 9 Wochen alt, erworben von Japan S L C) wurden in 4 Gruppen eingeteilt, mit 5 Tieren pro Gruppe, und als die zu testenden Tiere verwendet. Zellen von Propionibacterium acnes wurden mit Hitze getötet (hergestellt von RIBI Immunochemical Corp.), in physiologischer Salzlösung (hergestellt von Otsuka Pharmaceutical) mit einer Konzentration von 1,5 mg/ml aufgelöst, und eine 0,2 ml große Menge der resultierenden Lösung wurde jeder der Mäuse über die Schwanzvene verabreicht. Nach 8 Tagen der Verabreichung wurde das in dem erfindungsgemäßen Beispiel 6 hergestellte shFas(nd29)-hinge mit einer Verdünnungslösung (physiologische Salzlösung, enthaltend 0,1% humanes Serumalbumin (The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute)) verdünnt und über die Schwanzvene mit einer Dosierung von 0,3 mg/8 ml/kg, 1 mg/8 ml/kg oder 3 mg/8 ml/kg verabreicht. Die Verdünnungslösung alleine wurde der Kontrollgruppe verabreicht. Fünf Minuten danach wurden 0,2 ml einer Lipopolysaccharidlösung (hergestellt von Sigma) die durch Einstellen einer Konzentration von 5 μg/ml mit physiologischer Salzlösung hergestellt wurde, intraperitoneal verabreicht. Nach 8 oder 24 Stunden der Lipopolysaccharid-Verabreichung wurden 75 μl Blut aus der Vena fundus oculi gewonnen. Das so gewonnene Blut wurde mit 8,3 μl 3,8% Natriumcitrat (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) wässriger Lösung gemischt und bei 3000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde das so erhaltene Blutplasma mit Flüssigstickstoff eingefroren und bei –30°C bis zu dessen Verwendung gelagert. Messungen von GOT und GPT wurden unter Verwendung des GOT-FA Test Wako (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries), GPT-FA Test Wako (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) und einem automatischen Analyzer (Cobasfara, hergestellt von Roche) durchgeführt. Als Ergebnis waren die GOT- und GPT-Werte in den Gruppen, denen das shFas(nd29)-hinge verabreicht wurde, niedriger als die der Kontrollgruppe, was ihre Hepatopathie-Inhibitionswirkung bestätigt (14).
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Da das neue Polypeptid (das neue Fas Antigen-Derivat) der vorliegenden Erfindung die Induktion der Apoptose durch kompetitive Inhibierung der Bindung eines Fas Liganden mit einem Fas Antigen inhibieren kann, kann es für die Prävention und Behandlung von verschiedenen Krankheiten verwendet werden, in denen die Beteiligung der durch das Fas Antigen vermittelten Apoptose indiziert ist, indem die durch das Fas Antigen vermittelte Apoptose kontrolliert wird, insbesondere eine Apoptose, die in dem lebenden Körper durch endogenen oder exogenen Fas Liganden verursacht wird. Zum Beispiel wird es möglich sein, in dem Falle von bestimmten Autoimmunkrankheiten die Zerstörung von Organen durch Inhibierung des raschen Zelltodes, der durch den Angriff von Autoantigen-reaktiven Tierzellen verursacht wird, durch die künstliche Inhibition der Apoptose unter Verwendung des neuen Fas Antigen-Derivates vorzubeugen. Veranschaulichende Beispiele für solche Krankheiten schließen die Graft Versus Host Disease (GVHD) und Diabetes ein. Es ist bekannt, dass nicht nur infizierte Zellen, sondern auch nicht-infizierte Zellen durch Immunreaktionen beseitigt werden, wenn sie mit Viren infiziert werden. Zum Beispiel ist man der Ansicht, dass die Abnahme der immunologischen Leistungsfähigkeit in dem letzten Stadium der AIDS-Virusinfektion und die Verringerung der Leberfunktionen durch Hepatitis, insbesondere durch fulminante Hepatitis, die Ergebnisse einer extremen Verringerung der Gewebefunktionen, verursacht durch die Apoptose von Immunozyten oder Hepatozyten, sind. Im Falle solcher Krankheitszustände kann das neue Fas Antigen-Derivat, das fähig ist, Apoptose zu inhibieren, zur Behandlung von durch Viren verursachte, mit Apoptose in Beziehung stehende Krankheiten verwendet werden, wie z.B. Influenza, AIDS, Hepatitis und dergleichen sowie Komplikationen davon. Außerdem kann das Fas Antigen, da es mit dem Zelltod in verschiedenen Organen aufgrund seiner weiten Verbreitung in Organen in Zusammenhang zu stehen scheint, ebenfalls nützlich zur Behandlung von Myokardiopathie beim Myokardinfarkt und ähnlichen ischämischen Herzerkrankungen, wie z.B. Reperfusionsschäden, bei Nephritis und multiplem Organversagen sowie für die Bewahrung von Organen zum Zeitpunkt der Organtransplantation sein. Insbesondere wird das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung, da es Apoptose in geringen Dosen stark inhibieren kann, ebenfalls im lebenden Körper auch bei geringer Dosis und mit weniger Nebenwirkungen wirksam sein, so dass es vom Standpunkt der Wirkungskraft, der Sicherheit und der Kosten eine hohe Nutzbarkeit hat. Das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung, das eine Sequenz humanen Ursprungs umfasst, ist besonders wünschenswert bei der Anwendung am Menschen.
  • Auch ist das neue Fas Antigen-Derivat, das Apoptose induzieren kann, wenn es in geeigneter Weise in Zellen eingeschlossen wird, wirksam bei der Beschleunigung der Apoptose, indem es richtig in die Zellen in den Liposomen oder ähnlicher Form inkorporiert wird oder indem es richtig auf Zellen, z.B. mit Hilfe der Gentherapie unter Verwendung der DNA gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung, exprimiert wird. Folglich ist es wirksam bei der Entfernung unnötiger Zellen wie z.B. virusinfizierten Zellen in dem frühen Stadium einer viralen Infektion und kann außerdem für die Prävention und Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die durch einen Defekt in der Apoptose verursacht zu sein scheinen, wie z.B. Gelenkrheumatismus, SLE und dergleichen.
  • Außerdem kann es, da es wenigstens einen Teil der Antigenizität des Fas Antigens beibehält, mit einem Fas Antigen-Antikörper verbunden werden, so dass es wirksam bei der Inhibition von Apoptose ist, die durch den anti-Fas Antigen-Antikörper verursacht wird.
  • Außerdem kann das neue Fas Antigen-Derivat der vorliegenden Erfindung, da es den Fas Liganden mit höherer Spezifität und höherer Affinität bindet, angewendet werden, um Fas Liganden in humanen Körperflüssigkeiten nachzuweisen. Da es für die Detektion von Erhöhung, Verringerungen oder Anormalitäten des Fas Liganden in verschiedenen Krankheiten, in denen eine Beteiligung des Fas Liganden indiziert ist, verwendet werden kann, kann es für die Voraussage, den Nachweis und die Diagnose von spezifischen Krankheiten und krankhaften Zuständen und für die Auswahl von therapeutischen Verfahren davon verwendet werden. Es ist außerdem nützlich bei der Überwachung von Patienten, die eine medizinische Behandlung mit Fas Liganden, Fas Liganden-verwandten Substanzen oder Arzneimitteln, die die Expression des Fas Liganden beeinflussen, unterzogen werden und bei der Beurteilung der therapeutischen Wirkung und Prognose.
  • Andererseits ist die DNA gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung und dergleichen nützlich für die industrielle Herstellung des neuen Fas Antigen-Derivates in großen Mengen und mit hoher Reinheit. Aus diesem Grund kann das neue Fas Antigen-Derivat auf dem Gebiet der Medikamente als ein Hauptbestandteil von therapeutischen Arzneimitteln bereitgestellt werden und kann außerdem für diagnostische Arzneimittel verwendet werden. Zusätzlich kann die Nukleotidsequenz, die das neue Fas Antigen-Derivat kodiert, bei der Gentherapie und dergleichen angewendet werden.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (15)

  1. Fas Antigen-Derivat, das wenigstens einen Anteil oder einen Teil des Polypeptids für die extrazelluläre Region des Fas Antigens umfasst, in welchem wenigstens 13 Aminosäurereste an irgendeiner Position im Bereich von dem 1. bis 42. Aminosäurerest, gezählt von dem N-Terminus der SEQ ID NO. 15 in dem Sequenzprotokoll, deletiert sind.
  2. Fas Antigen-Derivat gemäß Anspruch 1, worin die genannten deletierten Aminosäurereste eine Anzahl von Aminosäureresten im Bereich von 13–42 hintereinander sind.
  3. Fas Antigen-Derivat, das wenigstens einen Anteil oder den gesamten Teil des Polypeptids für die extrazelluläre Region des Fas Antigens umfasst, in welchem wenigstens 13 Aminosäurereste an irgendeiner Position im Bereich von dem 1. bis 31. Aminosäurerest, gezählt von dem N-Terminus der SEQ ID NO. 15 im Sequenzprotokoll, deletiert sind.
  4. Fas Antigen-Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Anzahl an deletierten Aminosäureresten in dem genannten Polypeptid für die extrazelluläre Region des Fas Antigens, von welchem die Aminosäurereste deletiert sind, 29 oder mehr beträgt.
  5. Fas Antigen-Derivat umfassend wenigstens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und weiterhin umfassend 1 oder 2 oder mehr Anteile des Fas Antigens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, die einen Anteil oder den gesamten Teil der Transmembran-Region des Fas Antigens und/oder der Cytoplasmatischer-Rest-Region des Fas Antigens enthalten.
  6. Fas Antigen-Derivat umfassend 1-1) wenigstens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 1-2) die Fas Antigen-Variante gemäß Anspruch 5; 2) und weiterhin umfassend ein anderes (Poly)Peptid als das Fas Antigen, das mit dem Polypeptid aus 1-1) oder 1-2) fusioniert ist.
  7. Fas Antigen-Derivat gemäß Anspruch 6, wobei es wenigstens ein (Poly)Peptid enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Substanzen a und b, das in dem C-terminalen Teil des Fusionsproteins gemäß Anspruch 6 enthalten ist, a. ein Anteil oder der gesamte Teil der Hinge-Region eines Immunglobulins, und b. ein Anteil oder der gesamte Teil des Fc-Fragments eines Immunglobulins.
  8. Fas Antigen-Derivat, das ein Polymer von einem der in den Ansprüchen 1 bis 7 offenbarten Fas Antigen-Derivate ist.
  9. DNA-Fragment, das eine DNA-Sequenz umfasst, die für eines der Polypeptide für das Fas Antigen-Derivat, wie in den Ansprüchen 1 bis 8 offenbart, kodiert.
  10. DNA-Fragment gemäß Anspruch 9, wobei es eine der in den SEQ ID NRN. 12 bis 14 des Sequenzprotokolls gezeigten DNA-Sequenzen enthält.
  11. Rekombinantes DNA-Molekül, das die in Anspruch 9 oder 10 offenbarte DNA-Sequenz umfasst.
  12. Transformantenzelle, die mit dem rekombinanten DNA-Molekül gemäß Anspruch 11 transformiert ist.
  13. Verfahren zur Herstellung des Fas Antigen-Derivates gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, das die folgenden Schritte umfasst: Kultivieren des Transformanten gemäß Anspruch 12 und Gewinnen und Reinigen des Fas Antigen-Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 von dem genannten Kulturgemisch.
  14. Medikament, welches das Fas Antigen-Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 oder ein physiologisch annehmbares Salz davon als seinen aktiven Anteil enthält.
  15. Verfahren zur Verbesserung der Aktivität oder Funktion des Fas Antigens oder eines Fas Antigen-Derivates, welches das Deletieren von wenigstens 13 Aminosäureresten im Bereich von dem 1. bis 42. Aminosäurerest, gezählt von dem N-terminalen Aminosäurerest des Fas Antigens, umfasst.
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