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Die
vorliegende Erfindung betrifft Varianten des NK1-Fragments des Polypeptidwachstumsfaktors HGF/SF,
die als Agonisten des MET-Rezeptors wirken, sowie die Verwendung
von NK1 und seiner Varianten in Behandlungsverfahren.
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Hintergrund der Erfindung
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Der
Polypeptidwachstumsfaktor Hepatozytenwachstumsfaktor/Streufaktor
(HGF/SF) [Gherardi et al. (1989); Miyazawa et al. (1989), Nakamura
et al. (1989); Stoker et al. (1987)] und sein Rezeptor MET, das
Produkt des c-MET-Proto-Onkogens [Bottaro et al. (1991)] spielen
wesentliche Rollen bei der Entwicklung von Epithelorganen, wie z.B.
Plazenta und Leber [Schmidt et al. (1995), Uehara et al. (1995)],
und bei der Migration von myogenen Vorläuferzellen [Bladt et al. (1995)]
und Motorneuronen [Caton et al. (2000); Ebens et al. (1996)].
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HGF/SF
und MET sind auch in die Verbreitung einer Vielzahl von Epitheltumoren
als Folge von MET-Chromosom-Umordnungen [Yu et al. (2000)], somatischen
und/oder Keimlinien-Mutationen in der MET-Kinase [Schmidt et al.
(1997)] oder, häufiger,
in die Überexpression
eines nicht umgeordneten und nichtmutierten MET-Gens in Tumorzellen
[von Jeffers et al (1996) diskutiert] involviert.
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HGF/SF
hat eine einzigartige Domänenstruktur,
die jener des Blutproteinase-Vorläuferplasminogens ähnelt und
aus sechs Domänen
besteht: einer N-terminalen (N-)Domäne, die homolog zu einem Plasminogenaktivierungspeptid
ist, vier Kopien der Kringel-(K-)Domäne und einer katalytisch inaktiven
Serinproteinase-Domäne
[Donate et al. (1994)]. Zwei Produkte von alternativem Spleißen des
primären
HGF/SF-Transkripts
kodieren für
NK1, ein Fragment, das die N- und die erste K-Domäne enthält [Cioce
et al. (1996)] und NK2, ein Fragment, das die N-, die K1- und die
zweite Kringel-(K2-)Domäne
enthält
[Chan et al. (1991); Hartmann et al. (1992); Miyazawa et al. (1991)].
Sowohl NK1 [Lokker und Godowski (1993)] als auch NK2 [Chan et al.
(1991)] wurden anfänglich
als MET-Antagonisten charakterisiert, obwohl Versuche an transgenen
Mäusen
in der Folge zeigten, dass NK1 sich in vivo wie ein echter Rezeptoragonist
verhält
[Jakubczak et al. (1998)].
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Es
gibt einen wichtigen Unterschied im Mechanismus von Rezeptorbindung
und Aktivierung durch HGF/SF und NK1. HGF/SF ist in Zellen, denen
Heparansulfat fehlt, voll aktiv, während NK1 nur in Zellen, die Heparansulfat
aufweisen, oder in Gegenwart von löslichem Heparin aktiv ist [Schwall
et al. (1996)]. Daher ähnelt
NK1, nicht aber HGF/SG, hinsichtlich des Bedarfs an Heparansulfat
für Rezeptorbindung
und/oder Aktivierung FGF [Rapraeger et al. (1991); Yayon et al.,
(1991)].
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Frühe Domänendeletionsversuche
zeigten, dass die N-Domäne
für die
Heparinbindung [Mizuno et al. (1994)] wichtig ist, und ortsspezifische
Mutagenese identifizierte Reste in dieser Domäne, die für die Bindung essentiell sind
[Hartmann et al., (1998)]. So verringerte Ladungsumkehrmutation
von R73 und R76 die Affinität von
HGF/SF für
Heparin um einen Faktor von über
50 [Hartmann et al. (1998)]. Anhand der Lösungsstruktur der N-Domäne wurde
eine Rolle für
mehrere andere positiv geladene Reste, wie z.B. K58, K60 und K62,
vorgeschlagen, da diese Reste sehr nahe an R73 und R76 Cluster bilden
[Zhou et al. (1998)], und jüngste
Ergebnisse von NMR-Versuchen haben die Annahme einer Beteiligung
von K60, K62, R73, R76, R78 und mehreren anderen Resten an der Heparinbindung
an die N-Domäne
unterstützt.
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Trotz
dieses Fortschritts bleibt der Mechanismus, durch den Heparin und
Heparansulfat NK1 agonistische Aktivität verleihen, vollkommen unverständlich.
NK1 kristallisiert als Dimer in Abwesenheit von Heparin [Chirgadze
et al. (1999); Ultsch et al. (1998)], und die Eigenschaften dieses
Dimers legten nahe, dass es die biologisch aktive Form von NK1 darstellen
könnte
[Chirgadze et al. (1999)]. Bisher unterstützen jedoch keinerlei Versuchsergebnisse
diese Interpretation.
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Lietha
et al. [EMBO J. 20, 5543–5555
(2001)] beschreiben Kristallstrukturen von NK1-Heparin-Komplexen.
WO 96/40914 betrifft trunkierte
Hepatozytenwachstumsfaktor-Varianten.
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Sequenzprotokoll
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Seq.-ID
Nr. 1 repräsentiert
die Aminosäuren
28 bis 210 des menschlichen HGF/SF-Proteins. Die Reste 32-206 von HGF/SF
sind das Wildtyp-NK1-Fragment. Die Erfinder haben aufgrund ihrer
experimentellen Eignung kurze N- und C-terminale Extensionen verwendet,
um die Expression in Hefe zu optimieren. Zur Erleichterung der Bezugnahme
sind die Positionen von Seq.-ID Nr. 1, sofern nicht anders angegeben,
im Verhältnis
zu Volllängen-HGF/SF
(Seq.-ID Nr. 2) definiert.
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Seq.-ID
Nr. 2 ist die Volllängen-HGF/SF-Sequenz,
wovon die Reste 1-31 die Leadersequenz und 32-206 das NK1-Fragment
sind.
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Beschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
DNA-Synthesetests unter Verwendung von MK-Zellen. Die Zellen wurden
in serumfreiem Keratinozytenmedium bis zur Konfluenz kultiviert
und 24 Stunden vor Inkubation mit 3H-Thymidin
und HGF/SGF oder NK1-Protein in den in der Figur (x-Achse) angegebenen
Konzentrationen (mol/l) in Grundmedium transferiert. DNA-Synthese wurde als
TCA-unlösliche
Radioaktivität
gemessen, wobei die Y-Achse die 3H-Thymidin-Aufnahme
(cpm × 103/Well) zeigt. Die HP11-Mutante ist inaktiv,
und HP12 zeigt im Vergleich zu wt-NK1 eine stark reduzierte Aktivität. Hingegen
ist die 1K1-Mutante aktiver als wt-NK1 und Volllängen-HGF/SF.
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2 zeigt
die Überlebensraten
von Balb/c-Mäusen
nach Verabreichung einer letalen Dosis von N-Acetyl-p-aminophenol,
gefolgt von einer Behandlung mit NK1 und einem Peptid der Erfindung.
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3 zeigt
die Überlebensraten
von Balb/c-Mäusen
nach Verabreichung einer letalen Dosis von α-Amanitin.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
Erfinder haben zwei Röntgen-Kristallstrukturen
von NK1-Heparinkomplexen bestimmt, welche die Heparinbindungsstelle
von NK1 definieren. Eine Analyse dieser Strukturen durch die Erfinder
bestätigt,
dass Kontakte zwischen Heparin und Resten in der N-Domäne auftreten. Überraschenderweise
identifiziert die Analyse der Erfinder auch ein Reihe von kritischen
Heparinkontakten mit vier positiv geladenen Resten in der K1-Domäne. Noch überraschender
haben die Erfinder weiters gezeigt, dass die Heparinbindung an diese
positiv geladenen Reste in der K1-Domäne die Aktivität hemmt
und dass die Mutagenese der Reste NK1-Varianten mit höherer Aktivität als der
Wildtyp liefert. Solche Varianten sind zur Produktion von Agonisten
zur Förderung
von Zellwachstum nützlich,
insbesondere zur Angiogenese und Behandlung von Herz-Kreislauf-,
Leber-, Nervenerkrankungen und Erkrankungen des Bewegungsapparats.
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Daher
stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit, das eine
Variante von Seq.-ID Nr. 1 ist, wobei die Variante die Sequenz der
Seq.-ID Nr. 1 aufweist, mit Ausnahme einer Substitution zumindest
einer von mehreren Positionen, die unter Bezug auf Volllängen-HGF/SF
von Seq.-ID Nr. 2 definiert und mit 132, 134, 170 und 181 nummeriert
wrden, wobei die Variante die Fähigkeit
beibehält,
heparinabhängige
Dimerisierung in Lösung
zu erfahren und als Agonist gegen den MET-Rezeptor zu wirken, und
im Vergleich zu NK1 (Reste 32-206 der Seq.-ID Nr. 2) erhöhte Nettoaffinität für Heparin
aufweist.
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Die
Erfindung stellt auch ein Polypeptid bereit, das ein Fragment der
Polypeptidvariante der Erfindung ist, wobei das Fragment die 132-181-Region
beibehält
und außerdem
die Fähigkeit
beibehält,
heparinabhängige
Dimerisierung in Lösung
zu erfahren und als Agonist gegen den MET-Rezeptor zu wirken.
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Die
Erfindung stellt weiters eine Zusammensetzung bereit, die ein Polypeptid
der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünner oder
Träger
umfasst.
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Die
Erfindung stellt weiters ein Verfahren zur Stimulation des Wachstums
einer Zelle bereit, die den MET-Rezeptor exprimiert, wobei das Verfahren
das In-Kontakt-Bringen eines Polypeptids der Erfindung mit dieser
Zelle umfasst. Die Zelle kann in vitro oder in vivo vorliegen.
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Die
Erfindung stellt weiters ein Behandlungsverfahren für einen
Patienten bereit, der eine Erkrankung aufweist, welche eine Stimulierung
des Zellwachstums erfordert, wobei das Verfahren die Verabreichung
einer wirksamen Menge eines Polypeptids der Erfindung an einen Patienten
umfasst.
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Die
Erfindung stellt auch ein Polypeptid der Erfindung zur Verwendung
in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen
Körpers
bereit.
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Die
Erfindung stellt weiters ein Polynucleotid bereit, das für ein Polypeptid
der Erfindung kodiert, sowie Vektoren, die dieses Polynucleotid
tragen, einschließlich
Expressionsvektoren, worin das Polynucleotid operabel mit einem
Promotor verbunden ist.
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Die
Erfindung stellt weiters eine Wirtszelle bereit, die einen Vektor
der Erfindung trägt,
und ein Verfahren zur Produktion eines Polypeptids der Erfindung,
welches das Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen umfasst,
die zur Expression des Polynucleotids, das vom Vektor getragen wird,
und zur Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle oder Kultur geeignet
sind.
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Es
werden derzeit große
Bemühungen
zur Entwicklung von MET-Antagonisten und -Agonisten für Therapiezwecke
unternommen. Von MET-Antagonisten wird erwartet, dass sie bei einer
Vielzahl von Epitheltumoren, die MET überexprimieren, Anwendung finden,
während
Rezeptoragonisten in der Leberregeneration, der Reparatur von Hautwunden
und der therapeutischen Agiogenese wertvoll sein können. Die
Strukturdaten und Mutagenesedaten, die gemäß vorliegender Erfindung bereitgestellt
werden, ermöglichen
die Erzeugung von potenten MET-Agonisten.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Polypeptide
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Polypeptide
der Erfindung sind jene, in denen eine der Positionen 132, 134,
170 und 181 durch eine andere Aminosäure substituiert ist. Es ist
jedoch bevorzugt, dass die Substitutionen jene sind, die zu einer Änderung
der Ladung führen.
Bevorzugte Substitutionen umfassen daher Ladungsumkehrsubstitutionen
von Asparaginsäure
und Glutaminsäure.
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Zwei
oder mehrere der Positionen können
gleichzeitig substituiert werden. Wenn zwei Substitutionen erfolgen,
sind in einem bevorzugten Aspekt die zwei entweder 132 und 143 oder
170 und 181. Es können
auch drei Substitutionen erfolgen oder alle vier Positionen substituiert
werden. Wenn mehr als eine Position substituiert wird, können die
Substitutionen dieselben oder unterschiedlich sein.
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Polypeptide
der Erfindung können
in isolierter Form hergestellt werden. Isolierte Polypeptide der
Erfindung sind jene oben definierten, die in isolierter Form, frei
oder im Wesentlichen frei von Material, mit dem sie natürlich assoziiert
sind, wie z.B. anderen Polypeptiden, mit denen sie in der Zelle
vorkommen, vorliegen. Die Polypeptide können natürlich mit Verdünnern oder
Adjuvanzien formuliert werden und für praktische Zwecke weiterhin
isoliert sein. Die Polypeptide können
glykosyliert werden, entweder natürlich oder durch Systeme heterologer
eukaryotischer Zellen, oder sie können (wenn sie beispielsweise
durch Expression in einer prokaryotischen Zelle produziert werden)
unglykosyliert sein.
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Ein
Polypeptid der Erfindung kann auch in im Wesentlichen gereinigter
Form vorliegen; in diesem Fall umfasst es im Allgemeinen das Polypeptid
in einem Präparat,
in dem mehr als 90 %, z.B. 95 %, 98 % oder 99 %, des Polypeptids
im Präparat
ein Polypeptid der Erfindung sind.
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Polypeptide
der Erfindung können
z.B. durch Hinzufügung
von Histidinresten modifiziert werden, um ihre Reinigung zu unterstützen, oder
durch Hinzufügung
einer Signalsequenz, um ihre Sekretion aus einer Zelle zu fördern.
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Seq.-ID
Nr. 1 repräsentiert
die menschliche Wildtypform von NK1 (gemeinsam mit einer kurzen
N- und C-terminalen Extension). Allerdings ist Fachleuten klar,
dass zusätzlich
zu den speziellen Substitutionen der Erfindung, die zu erhöhter Aktivität führen, andere
Positionen des Wildtypmoleküls
in geringfügigem
Ausmaß variiert
werden können,
ohne die Gesamtfunktion oder -struktur des Polypeptids signifikant
zu beeinflussen. Beispielsweise können konservative Substitutionen
an vielen Teilen von Proteinen ohne erkennbare Auswirkung auf die
Struktur oder Funktion dieses Proteins durchgeführt werden. Fachleuten ist
klar, dass Varianten mit einer geringen Anzahl, beispielsweise 1–20, z.B.
2, 3, 4 oder 5–10,
anderer Aminosäuresubstitutionen,
die hauptsächlich
an NK1 vorgenommen werden, immer noch als NK1-Polypeptide angesehen
werden, solange die Substitutionen die Aktivität von Polypeptiden der Erfindung
nicht signifikant ändern.
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Fragmente
der Polypeptidvarianten der Erfindung, welche die 132-181-Region
beibehalten, bilden auch einen weiteren Teil der Erfindung. Solche
Fragmente können
eine Größe von 70
bis 190 Aminosäuren aufweisen,
z.B. von 100 bis 180 Aminosäuren.
Ein Beispiel für
ein solches Fragment wird hierin als das NK1-Fragment aus den Aminosäuren 32-206
bereitgestellt. Ein anderes Fragment ist eines, das zumindest 70 zusammenhängende Aminosäuren der
Kringel-1-Domäne
umfasst, die an 128-206
zu finden ist. Vorzugsweise enthält
das Fragment diese Domäne
in ihrer Gesamtheit.
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Verfahren
zur Bestimmung, ob ein Polypeptid der Erfindung die Fähigkeit
beibehält,
heparinabhängige Dimerisierung
in Lösung
zu erfahren, werden in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
Wie angegeben kann das Polypeptid mit einer äquimolaren Konzentration von
Heparin in einem 300 mM NaCl-Puffer inkubiert und durch Gelfiltration
oder Western-Blotting analysiert werden.
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In ähnlicher
Weise kann gemäß den nachfolgenden
Beispielen die Fähigkeit,
als Agonist des MET-Rezeptors zu wirken, bestimmt werden. Dies kann
die Inkubation des Polypeptids mit murinen Keratinozytenzellen (z.B.
MK-Zellen) in einer Konzentration von 10-10 M
oder höher
(z.B. 10–10 bis
10–8 M)
und die Bestimmung, ob es einen Anstieg der DNA-Synthese in den
Zellen gibt, umfassen.
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Ein
Polypeptid gemäß vorliegender
Erfindung kann isoliert und/oder gereinigt werden (z.B. unter Verwendung
eines Antikörpers),
beispielsweise nach Produktion durch Expression aus kodierender
Nucleinsäure (siehe
unten). Polypeptide gemäß vorliegender
Erfindung können
auch zur Gänze
oder teilweise durch chemische Synthese hergestellt werden, z.B.
stufenweise. Das isolierte und/oder gereinigte Polypeptid kann zur
Formulierung einer Zusammensetzung verwendet werden, die zumindest
eine weitere Komponente umfassen kann, beispielsweise eine pharmazeutische
Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten,
Arzneimittelträger
oder Träger
umfasst. Eine Zusammensetzung, die ein Polypeptid gemäß der Erfindung
enthält,
kann zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung wie
nachstehend beschrieben verwendet werden.
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Ein
Polypeptid der Erfindung kann mit einer detektierbaren Markierung
markiert werden. Die detektierbare Markierung kann jede beliebige
geeignete Markierung sein, die ermöglicht, dass das Polypeptid
detektiert wird. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope, z.B. 125I, Enzyme, Antikörper, Polynucleotide und Linker,
wie z.B. Biotin. Markierte Polypeptide der Erfindung können in
Diagnoseverfahren wie z.B. Immuntests, verwendet werden, um die
Menge eines Polypeptids der Erfindung in einer Probe zu bestimmen.
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Polypeptide
und Zusammensetzungen davon gemäß der Erfindung
können
in Behandlungsverfahren verwendet werden. Eine solche Behandlung
wird auf die Förderung
der Vermehrung von Zellen im menschlichen Körper, die den MET-Rezeptor
exprimieren, ausgerichtet sein. Eine solche Therapie wird zur Förderung der
Angiogenese nützlich
sein und daher zur Behandlung von chronischen Hautwunden, chroni scher
Leber- und Nierenerkrankung, degenerativen Erkrankungen des Bewegungsapparats
und Nervenerkrankungen und Herz-Kreislauferkrankungen nützlich sein.
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Eine
besondere Verwendung der Polypeptide der Erfindung ist die Behandlung
oder Prävention
von Leberschäden,
verursacht durch Vergiftung mit N-Acetyl-p-aminophenol (im Handel
als Paracetamol oder Acetaminophen bekannt. Die Erfinder haben festgestellt,
dass die Verabreichung eines Polypeptids der Erfindung in einem
Mausmodell die Überlebensraten
von Mäusen
nach Verabreichung einer letalen Dosis von Paracetamol deutlich
erhöht.
Ein gewisser Schutz wird also durch das NK1-Peptid selbst bereitgestellt.
Daher wird in diesem Aspekt der Erfindung auch die Verwendung eines
NK1-Peptids für
die oben erwähnte
Behandlung bereitgestellt.
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Daher
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention
von Leberschäden
in einem Subjekt bereit, das N-acetyl-p-aminophenyl eingenommen
hat, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge
eines Polypeptids der Erfindung oder eines NK1-Polypeptids an ein
Individuum umfasst.
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Die
Erfindung stellt auch ein Polypeptid der Erfindung oder ein NK1-Polypeptid
zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren eines menschlichen
oder tierischen Individuums bereit, insbesondere zur Behandlung
oder Prävention
von Leberschäden
bei einem Individuum, das N-Acetyl-p-aminophenyl eingenommen hat.
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Die
Erfinder haben auch gezeigt, dass das NK1-Peptid sowie das 1K1-Polypeptid
zur Behandlung von akutem Leberschaden, verursacht durch α-Amanitin
wirksam ist, das ein potenter spezifischer Inhibitor von RNA-Polymerase-II
ist. Daher können
sowohl das NK1-Peptid als auch die Peptide der Erfindung wie hierin definiert
allgemein in einem Verfahren zur Behandlung von Lebererkrankungen
verwendet werden, insbesondere von Erkrankungen, die mit Leberschäden assoziiert
sind. Solche Leiden umfassen nicht nur Toxizität, die durch N-Acetyl-aminophenyl
verursacht wird, sondern auch andere arzneimittelinduzierte und
andere Ursachen für
Leberschäden
oder -erkrankungen.
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Daher
können
diese Peptide dazu verwendet werden, akutes Leberversagen oder Lebererkrankungen zu
behandeln oder zu vermeiden, die durch Toxine induziert werden,
einschließlich
eines Toxins, das aus Pilzgift (z.B. Amanita phalloides), Arsen,
Tetrachlorkohlenstoff (oder andere chlorierte Kohlenwasserstoffe),
Kupfer, Ethanol, Eisen, Methotrexat und Phosphor ausgewählt ist.
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Die
Erfindung kann weiters dazu verwendet werden, Leberschäden oder
Lebererkrankungen, die durch andere Mittel verursacht werden, einschließlich Leiden,
die aus Virusinfektionen (wie z.B. Infektion mit einem Hepatitisvirus,
z.B. HAV, HBV oder HCV) oder einer anderen akuten viralen Hepatitis,
chronischer Autoimmunhepatitis, akuter Fettleber bei Schwangerschaft,
Budd-Chiari-Syndrom und Venenverschlusserkrankung, Hyperthermie,
Hypoxie, maligner Infiltration, Reye-Syndrom, Sepsis, Wilson-Krankheit
und Transplantatabstoßung
ausgewählt
sind.
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Polypeptide
können
in beliebiger geeigneter Form verabreicht werden. Beispielsweise
in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie z.B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose,
Glycerin, Ethanol und dergleichen. Zusammensetzungen können zu
Injektionszwecken formuliert werden, beispielsweise zur direkten
Injektion in die Stelle der beabsichtigten Behandlung oder zur intravenösen Injektion.
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Geeignete
Dosen von Polypeptiden werden letztlich nach Entscheidung des Arztes
ausgewählt,
der das Wesen des zu behandelnden Leidens und des Leidens des Patienten
berücksichtigt.
Im Allgemeinen sind die Dosisbereiche 1 μg bis 1 mg pro kg Körpergewicht.
Die Polypeptide können über beliebige
geeignete Wege verabreicht werden, z.B. i.v.- oder i.p.-Injektion,
oder direkt an der Behandlungsstelle.
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Unter „Behandlung" versteht man die
Verabreichung eines Polypeptids, das zur Linderung der Schwere einer
zu behandelnden Erkrankung dient, um bei einer Person mit einer
Erkrankung oder mit dem Risiko, eine solche Erkrankung zu entwickeln,
die Krankheitssymptome zu verringern oder die Entwicklung der Erkrankung
zu verhindern oder zu verlangsamen.
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Polynucleotide
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Ein
Polynucleotid der Erfindung ist eines, das wie oben definiert für ein Polypeptid
der Erfindung kodiert. Dieses umfasst DNA- und RNA-Polynucleotide.
Ein Polynucleotid der Erfindung kann einzel- oder doppelsträngig sein.
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Im
Allgemeinen wird ein Polynucleotid gemäß der vorliegenden Erfindung
als Isolat bereitgestellt, in isolierter und/oder gereinigter Form
oder frei oder im Wesentlichen frei von Material, mit dem es natürlich assoziiert
ist, wie z.B. frei oder im Wesentlichen frei von Nucleinsäure, die
das Gen im menschlichen Genom flankiert, mit der Ausnahme von möglicherweise
einer oder mehren regulierenden Sequenz(en) für die Expression.
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Sequenzen,
die für
die gesamten oder einen Teil der Polypeptide der Erfindung kodieren,
und/oder ihre regulierenden Elemente können vom Fachmann unter Nutzung
der hierin enthaltenen Informationen und Referenzen und fachbekannter
Verfahren [siehe z.B. Sambrook, Fritsch und Maniatis, "Molecular Cloning:
A Laborstory Manual",
Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989) und Ausubel et al., "Short Protocols in
Molecular Biology",
John Wiley and Sons (1992)] einfach hergestellt werden. Diese Verfahren
umfassen die Anwendung ortsgerichteter Mutagenese von Nucleinsäure, die
für NK1
kodiert, wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
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Vektoren
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Polynucleotide
der Erfindung können
in einen rekombinanten replizierbaren Vektor eingebaut werden. Der
Vektor kann dazu verwendet werden, die Nucleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle
zu replizieren. Daher stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform
ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden der Erfindung
durch Einführung
eines Polynucleotids der Erfindung in eine kompatible Wirtszelle
und Züchtung der
Wirtszelle unter Bedingungen bereit, welche die Replikation des
Vektors zur Folge haben. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen
werden. Geeignete Wirtszellen werden nachstehend in Verbindung mit
Expressionsvektoren beschrieben.
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Expressionsvektoren
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Vorzugsweise
ist ein Polynucleotid der Erfindung in einem Vektor mit einer Kontrollsequenz
operabel verbunden, die in der Lage ist, für die Expression der kodierenden
Sequenz durch die Wirtszelle zu sorgen, d.h. der Vektor ist ein
Expressionsvektor.
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Der
Begriff „operabel
verbunden" bezeichnet
eine Juxtaposition, worin die beschriebenen Komponenten in einer
Beziehung stehen, die ihnen ermöglicht,
in der beabsichtigten Art und Weise zu wirken. Eine Kontrollsequenz, „operabel
verbunden" mit einer
kodierenden Sequenz ist in solcher Art und Weise ligiert, dass die Expression
der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erzielt wird, die mit
den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
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Es
können
geeignete Vektoren ausgewählt
oder hergestellt werden, die geeignete regulierende Sequenzen umfassen,
einschließlich
Promotorensequenzen, Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen,
Enhancersequenzen, Markergene und andere geeignete Sequenzen. Vektoren
können
geeignete Plasmide sein, virale, z.B. Phagen-, Phagemid- oder bakulovirale
Plasmide, Cosmide, YACs BACs oder PACs. Vektoren umfassen Gentherapievektoren,
zum Beispiel Vektoren, basierend auf einem Adenovirus, adenoassoziierten
Virus, Retrovirus (wie z.B. HIV oder MLV) oder Alphavirusvektoren.
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Die
Vektoren können
mit einem Replikationsstartpunkt bereitgestellt werden, optional
mit einem Promotor für
die Expression des Polynucleotids und optional einem Regulator des
Promotors. Die Vektoren können
ein oder mehrere selektierbare Markergene enthalten, zum Beispiel
ein Ampicillinresistenz-Gen im Fall eines bakteriellen Plasmids
oder ein Neomycinresistenz-Gen für
einen Säugetiervektor.
Vektoren können
in vitro verwendet werden, zum Beispiel zur Produktion von RNA oder
zur Transfektion oder Transformation einer Wirtszelle. Der Vektor
kann auch angepasst werden, um in vivo verwendet zu werden, zum
Beispiel in Gentherapieverfahren. Systeme zum Klonieren und Expression
eines Polypeptids in einer Vielzahl verschiedener Wirtszellen sind
fachbekannt.
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Geeignete
Wirtszellen umfassen Bakterien, eukaryotische Zellen, wie z.B. Säugetier- und Hefezellen und
Baculovirussysteme. Im Fachgebiet verfügbare Säugetierzelllinien zur Expression
eines heterologen Polypeptids umfassen Eizellen des chinesischen
Hamsters, HeLa-Zellen, Babyhamsternierenzellen, COS-Zellen und viele
andere.
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Promotoren
und andere Expressionsregulationssignale können ausgewählt werden, um mit der Wirtszelle
kompatibel zu sein, für
welche der Expressionsvektor entworfen wird. Beispielsweise umfassen
Hefepromotoren S. cerevisiae GAL4 und ADH-Promotoren, S. pombe nmt1 und adh-Promotor.
Säugetierpromotoren umfassen
den Metallothioneinpromotor, der als Reaktion auf Schwermetalle,
wie z.B. Cadmium, enthalten sein kann. Viruspromotoren, wie z.B.
der große
SV40-T-Antigenpromotor oder Adenoviruspromotoren, können ebenfalls
verwendet werden. All diese Promotoren sind im Fachbereich leicht
erhältlich.
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Die
Vektoren können
andere Sequenzen umfassen, wie z.B. Promotoren oder Enhancer, um
die Expression von insertierter Nucleinsäure zu steuern, Nucleinsäuresequenzen,
sodass das Polypeptid als Fusion produziert wird, und/oder Nucleinsäure, die
für Sekretionssignale
kodiert, sodass die Polypeptide, die in der Wirtszelle produziert
werden, aus der Zelle sekretiert werden.
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Vektoren
zur Produktion von Polypeptiden der Erfindung zur Verwendung in
der Gentherapie umfassen Vektoren, die eine Minigensequenz der Erfindung
tragen.
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Vektoren
können
wie oben beschrieben in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden,
um für
die Expression eines Polypeptids der Erfindung zu sorgen. Daher
stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt der Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden gemäß der Erfindung bereit, das
die Kultivierung einer Wirtszelle, die wie oben beschrieben einen
Expressionsvektor trägt,
unter Bedingungen, welche die Expression einer kodierenden Sequenz,
die für
die Polypeptide kodiert, durch den Vektor ermöglichen, und die Gewinnung
der exprimierten Polypeptide umfasst.
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Polypeptide
können
auch in In-vitro-Systemen exprimiert werden, wie z.B. Retikulozytenlysat.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung stellt Wirtszellen bereit, welche die Vektoren für die Replikation
und Expression von Polynucleotiden der Erfindung tragen. Die Zellen
werden ausgewählt,
um mit dem Vektor kompatibel zu sein, und können zum Beispiel bakteriell,
Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen
sein.
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Die
Einführung
von Vektoren in eine Wirtszelle ist von der Verursachung oder Ermöglichung
der Expression aus der Nucleinsäure
gefolgt, z.B. durch Kultivierung der Wirtszellen (die Zellen umfassen,
die tatsächlich
transformiert wurden, obwohl die Zellen wahrscheinlicher von den
transformierten Zellen abstammen) unter Bedingungen zur Expression
des Gens, sodass das kodierte Polypeptid produziert wird. Wenn das
Polypeptid gebunden an ein geeignetes Signalleaderpeptid exprimiert
wird, kann es aus der Zelle in das Kulturmedium sekretiert werden.
Nach der Produktion durch Expression kann ein Polypeptid isoliert
und/oder aus der Wirtszelle und/oder dem Kulturmedium, je nach Fall,
gereinigt werden und in der Folge wie gewünscht verwendet werden, z.B.
zur Formulierung einer Zusammensetzung, die eine oder mehrere zusätzliche
Komponenten enthalten kann, wie z.B. eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die eine oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Exzipienten, Vehikel
oder Träger
umfasst (z.B. wie unten beschrieben).
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine Wirtszelle
bereit, die eine hierin offenbarte Nucleinsäure enthält. Die Polynucleotide und
Vektoren der Erfindung können
in das Genom (z.B. Chromosom) der Wirtszelle integriert werden.
Integration kann gemäß Standardverfahren
durch Einschluss von Sequenzen gefördert werden, die eine Rekombination
mit dem Genom fördern.
Die Nucleinsäure
kann auf einem extrachromosomalen Vektor innerhalb der Zelle vorliegen.
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In
den nachstehenden Beispielen zeigen die Erfinder, dass wt-NK1 sich
wie ein partieller Agonist verhielt, wie nach dem Stand der Technik
zu erwarten war. Es bewirkte eine vollständige Dispersion von MDCK-Kolonien
und Stimulierung von DNA-Synthe se in MK-Zellen (1).
Interessanterweise trat eine maximale Stimulierung der DNA-Synthese
durch wt-NK1 in Konzentrationen von nur 10–10 M
auf, eine viel geringere Konzentration als jene, die in anderen
Studien erforderlich sind, siehe beispielsweise (Schwal et al. (1996)).
Die beobachtete höhere
Wirksamkeit von NK1 in den Studien der Erfinder kann die Quelle
(Hefe im Vergleich zu bakteriell) und daher die Aktivität des verwendeten
Proteins widerspiegeln.
-
Während wt-NK1
weniger aktiv bleibt als Volllängen-HGF/SF,
zeigten insbesondere die zwei K-Domänen-Mutanten eine biologische
Aktivität,
die viel höher
war als von wt-NK1 und gleich hoch oder höher als von Volllängen-HGF/SF.
Die biochemischen Daten der Erfinder lassen vermuten, dass die K-Domänen-Mutationen zu
erhöhter
Nettoaffinität
von NK1 für
Heparin führen.
Daher wirkt der Satz von Aminosäuren
K132, R134 und R181 als negativer Effektor der Heparinbindung an
NK1, und Ladungsumkehrmutationen dieser Reste erhöhen Heparinbindung
wahrscheinlich über
die Hauptstelle in der N-Domäne.
-
Unabhängig vom
Mechanismus haben die Erdinder gezeigt, dass die Substitution zweier
Aminosäuren in
der K-Domäne
(K132:R134 oder K170:R181) zur Konvertierung von NK1 zu einem Vollrezeptoragonisten ausreicht.
NK1, nicht aber HGF/SF kann in Hefe produziert werden und soll günstige In-vivo-Kinetik
und Gewebeverteilung im Vergleich zu Volllängen-HGF/SF zeigen.
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Beispiel 1
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In
diesem Beispiel wird die Produktion und Analyse der biologischen
Aktivität
zweier NK1-Varianten der Erfindung veranschaulicht. Die Erfinder
zeigen, dass diese Varianten in Gegenwart von Heparin eine Dimerisierung
in ähnlicher
Art und Weise wie NK1 erfahren und durch Mutagenese eines Clusters
von positiv geladenen Resten auf der K-Domäne zu wirksamen Rezeptoragonisten
werden.
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Materialien und Verfahren
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Klonierung, Mutagenese, Expression und
Reinigung
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Klonierung,
Expression und Reinigung von wt-NK1 wurden wie von Chirgadze et
al. (1999) beschrieben durchgeführt,
mit der Ausnahme, dass die Endreinigung von NK1 durch Kationenaustauschchromatographie
auf einer Source15S-Säule
(Amersham Pharmacia Biotech) erfolgte. Zur Expression von NK1-Mutanten, wurde
ein EcoRI-NotI-Fragment
des wt-NK1-Expressionskonstrukts in pPIC9K in den pBluescript-KS-Vektor (Stratagene)
kloniert, und DNA-Amplifikationsreaktionen wurden unter Einsatz
komplementärer
Paare von mutagenen Oligonucleotiden durchgeführt. Die N-Domänen-Mutanten
wurden durch DNA-Amplifikation der relevanten Fragmente aus menschlicher
Volllängen-HGF/SF-cDNA
produziert, die R73E:R76E-Mutationen (mutiertes HP11) oder die (K58E:K60E:K62E)-Mutationen
(mutiertes HP12) enthielt. N-Domänen-
und K-Domänenmutanten
wurden letztlich in den Expressionsvektor pPIC9K kloniert. Transformation
und Selektion von P. pastoris wurde wie zuvor beschrieben ausgeführt (Chirgadze
et al. (1991)).
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Reinigung von Heparinfragmenten
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Natriumheparin
aus Rinderlunge (Upjohn) wurde mit Heparinase-I (Leo Pharmaceuticals)
14 min lang bei 37°C
in 10 mM Phosphatpuffer, 1,25 mM CaCl2,
pH 7,0 verdaut. Das Wasser wurde abgedampft, der Rückstand
in 20 g/l Ammoniumbicarbonat gelöst
und auf eine Biogel-P-10-(Biorad-) Säule geladen. Fraktionen, die Heparinfragmente
derselben Länge
enthielten (bis zu Hexadecasacchariden), wurden kombiniert und Wasser und
Ammoniumbicarbonat auf einem Rotavapor (Buechi) abgedampft. Die
Heparinfragmente wurden dann in 0,1 M Ammoniumacetat gelöst, und
eine Aliquote wurde über
eine G3000-SW-XL-(30 cm × 7,8
mm) und eine G2000-SW-XL-(30
cm × 7,8
mm) GPC-Säule
auf einem HPLC-System (Gilson) laufen gelassen, um die Reinheit
und Konzentration zu bestimmen. Die Fragmente wurden als Nächstes gefriergetrocknet
und in Wasser (3 Zyklen) erneut gelöst, um Ammoniumacetat zu entfernen.
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Charakterisierung von wt- und mutierten
NK1-Heparin-Komplexen
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Dies
wurde durch Gelfiltrationschromatographie und Vernetzungsversuche
durchgeführt.
Zur Gelfiltration wurden wt- oder mutiertes NK1 (0,5 mg/ml) 2 Stunden
lang in Gegenwart oder Abwesenheit äquimolarer Konzentrationen
von 14-mer-Heparin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
inkubiert, die auf 300 mM NaCl eingestellt war. Proben wurden dann
auf eine HR30-Superdex-200-Säule
(Amersham Pharmacia Biotech) geladen und bei 0,5 ml/min eluiert.
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Zur
Vernetzung wurden 10 μl
von wt- oder mutiertem NK1 (0,1 mg/ml) in Abwesenheit oder Gegenwart einer äquimolaren
Konzentration von 14-mer-Heparin in PBS inkubiert. Nach 2 Stunden
Inkubation bei Raumtemperatur wurde 1 μl Vernetzer (BS3,
Pierce) in 100fachem molarem Überschuss
zugesetzt, die Reaktion 30 Minuten lang fortgesetzt und dann mit
1 μl von
1 M Tris-Cl, pH 7,4 gequencht. Reaktionsprodukte wurden auf 15 %
SDS-Polyacrylamid-Gele geladen und auf eine Nitrocellulosemembran
(Schleicher & Schuell)
geblottet. Die Membran wurde in 2%iger Magermilch blockiert, 1 Stunde
lang in Gegenwart von polyklonalem Schafs-Anti-HGF/SF-Antikörper (1W53,
1:1000) inkubiert, mit PBS + 0,2 % Tween 20 gewaschen und als Nächstes 12 Stunden
lang mit HRP-konjugiertem Anti-Schafs-Immunglobulin-Antikörper (Dako)
inkubiert. HRP-Aktivität wurde
nach 3 weiteren Waschungen in PBS + 0,2 % Tween 20 unter Verwendung
eines chemolumineszierenden Substrats (Pierce) detektiert.
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MDCK-Kolonie-Streuungstests
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Streuungstests
wurden wie von Gherardi et al. (1989), Stoker et al. (1987) beschrieben
durchgeführt. Kurz
gesagt wurden MDCK-Zellen in 1-2,5 × 103 Zellen/60
mm Schale ausplattiert und in 5%igem fötalem Rinderserum in DMEM 2–3 Tage
lang vor Hinzufügung
von HGF/SGF oder wt- oder mutiertem NK1 kultiviert. Nach Inkubation über Nacht
wurden die Platten untersucht, und mehrere Kolonien jeder Platte
wurden unter Einsatz eines Leica-DM-IRB-Inversionsmikroskops, das
mit einer Phasenkontrastoptik und einer Hamamatsu-Colour-chilled-3CCD-Kamera
ausgestattet war.
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DNA-Synthese in MK-Zellen
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Die
Mäuse-Keratinozytenlinie
MK wurde in Keratinozyten-SEM-Medium (Gibco), das mit 5 ng/ml EGF-53
und 50 g/ml Rinderhirnanhangdrüsenextrakt
(BPE) ergänzt
war, in 24 Well Gewebekulturplatten (Costar) bis zur Konfluenz kultiviert.
Bei Konfluenz wurde das gesamte Medium 24 h vor Hinzufügung von
1 Ci/Well 3H-Thymidin in Grundmedium, das
1 mg/ml BSA und HGF/SF oder NK1-Proteine in den in der Legende zu 1 angegebenen
Konzentrationen enthielt, durch Grundmedium ersetzt (kein EGF und
BPE). Nach 16 Stunden wurden die Zellen auf Eis transferiert, mit
PBS gewaschen und in eiskalter 5%iger Trichloressigsäure (TCA)
30 min lang inkubiert. TCA-unlösliche
Radioaktivität
wurde anhand von Szintillation nach 2 Waschungen mit Wasser und
Lyse in 0,2 M NaOH 30 Minuten lang bei 37°C gemessen.
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Ergebnisse
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Das
NK1-Fragment von HGF/SF (Aminosäuren
28-210) wurde in der methylotrophen Hefe P. pastoris wie beschrieben
exprimiert (Chirgadze et al. (1991)) und als Komplex mit einem Tetrahexamer-(14-mer-)Heparinfragment
kristallisiert. Das Heparinfragment wurde durch Verdau und Reinigung
aus polydispersem Heparin hergestellt, das aus Rinderlunge extrahiert
wurde.
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Die
Kristallisation des Proteins als Komplex mit Heparin wird in der
GB 0110430.6 vom 27. April
2001, deren Priorität
hierin beansprucht wird und deren Inhalt hierin durch Verweis aufgenommen
ist, und von D. Lietha et al., EMBO J. 20 (20), 5543-55 (15. Oktober
2001) beschrieben, dessen Inhalt hierin durch Verweis aufgenommen
ist. Die Kristallisation und Analyse des Komplexes ermöglichte
den vorliegenden Erfindern die Identifikation von Aminosäureresten
in NK1, die geändert
werden konnten. Nach Identifikation solcher Reste können Fachleute
Varianten der Erfindung basierend auf der hierin angeführten vorliegenden
Offenbarung erzeugen.
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Kurz
gesagt wurden zwei Kristalltypen gefunden. Die asymmetrische Einheit
des Kristalltyps A enthält zwei
NK1-Promotoren A und B, die zu einem Kopf-Schwanz-Dimer assembliert
sind, wie in den zuvor beschriebenen Kristallstrukturen von NK1 (Chirgadze
et al. (1999), Ultsch et al. (1998)). Ein Hepes-Molekül ist jede
der K-Domänen in der
vermeintlichen Lysinbindungstasche gebunden, wie in der 1bht-Struktur (Ultsch
et al. (1998)). Ein Heparinmolekül
(H) wurde eindeutig an die N-Domäne
des Protomers A gebunden erkannt, aber die N-Domäne von Protomer B ist teilweise
ungeordnet und am Rand kaum definiert. Daher war nicht festzustellen,
ob ein Heparinmolekül
gebunden war. Das an Protomer A gebundene Heparinmolekül tritt
auch mit der Kringeldomäne
von Protomer A' aus
der benachbarten asymmetrischen Einheit der Kristalle in Kontakt.
Die verfeinerte endgültige
Struktur enthielt 5 Heparin-Zuckereinheiten, 2 Glykosamine (GlcN)
und 3 Iduronsäuren (IdoA),
der 14 im Komplex vorliegenden.
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Hingegen
enthielt die symmetrische Einheit vom Kristalltyp B eine Anordnung
von vier NK1-Dimeren (A & B,
C & D, E & F, G & H) mit sechs
gebundenen Heparinmolekülen.
Die Dimere in der asymmetrischen Einheit waren in einem Kreis mit
einer pseudozweifachen Achse positioniert, die durch das Zentrum
verlief. Die NK1-Dimer-anordnung
war mit jener im Kristalltyp A identisch und wie zuvor beschrieben
(Chirgadze et al. (1999) Ultsch et al. (1998)). Anders als bei der
Struktur vom Kristalltyp A sind alle Reste zwischen 38 und 208 gut
geordnet und zeigen klare Elektronendichte in allen Protomeren.
Alle N-Domänen
Wechselwirken mit Heparinmolekülen.
Die N-Domänen
der Protomere A und E teilen ebenso ein Heparinmolekül wie die
N-Domänen der
Protomere D und G. Das längste
Heparinfragment, das in Elektronendichtekarten eingebaut werden
konnte, ist neun Zuckereinheiten lang; es ist an die N-Domäne von Protomer
C und die K-Domäne
von Protomer F gebunden. Andere Heparinmoleküle sind weniger gut definiert,
wobei das kürzeste
Fragment nur fünf
Zuckereinheiten enthielt (Heparinmolekül N). Jede K-Domäne hat ein
Hepes-Molekül,
gebunden in derselben Bindungstasche wie in der Struktur vom Kristalltyp
A. Die Dimere innerhalb der asymmetrischen Einheit zeigen eine gute
Einhaltung der r.m.s.d-Werte von Cα-Atomen zwischen 0,50 Å (bei Vergleich
des Dimers, bestehend aus den Protomeren A und B, mit jenem, bestehend
aus den Protomeren G und H) und 1,32 Å (bei Vergleich des Dimers,
bestehend aus den Protomeren A und B, mit jenem, bestehend aus den
Protomeren C und D). Die NK1-Dimere in Kristalltyp B ähneln stark
dem Dimer in Kristalltyp A, mit dem schlechtesten r.m.s.d von Cα- Atomen, das 1,19 Å für das Dimer
bestehend aus den Protomeren A und B ausmacht.
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Heparin-K-Domänen-Wechselwirkungen
waren in beiden Kristallstrukturen zu beobachten und umfassten einen
Cluster von positiv geladenen Resten (K132, R134, K170, R181). Diese
Reste bilden einen Satz einer Auskleidung mit positiv elektrostatischem
Potential gegenüber
der negativ geladenen Heparinkette. Die funktionelle Bedeutung der
Heparin-K-Domänen-Wechselwirkungen
wurde mithilfe von Mutagenese mit einer Sonde untersucht.
-
Neue NK1-Mutanten
-
Es
wurden zwei Ladungsumkehr-N-Domänen-Mutanten
(HP11 und HP12) und zwei K-Domänenmutanten
(1K1 und 1K2) erzeugt (Tabelle 1) und bezüglich Heparinbindung und biologischer
Aktivität
charakterisiert.
| TABE | LLE
1 |
| NK1-Mutante | Substitutionen |
| HP11 | R73E:R76E |
| HP12 | K58E:K60E:K62E |
| 1K1 | K132E:R134E |
| 1K2 | K170E:R181E |
-
Vernetzungs-(Schwall
et al. (1996)) und Gelfiltrations-(Chirgadze et al. (1999)) Versuche
wurden zuerst verwendet, um heparinvermittelte Oligomerisierung
von wt-NK1 in Lösung
zu charakterisieren. Wildtyp- und mutiertes NK1 wurden in Abwesenheit
oder Gegenwart äquimolarer
Konzentrationen von 14-mer-Heparin inkubiert. Vernetzte Proteine
wurden durch Western-Blotting analysiert und mit einem polyklonalen
Anti-HGF/SF-Antikörper
(1W53) detektiert. Zusätzlich
wurde auch Gelfiltration von Wildtyp und mutiertem NK1 in Abwesenheit
oder Gegenwart äquimolarer
Konzentrationen von 14-mer-Heparin durchgeführt. Chromatographie wurde
auf einer HR30-Superdex-200-Säule durchgeführt, die
in PBS äquilibriert
wurde, das auf 300 mM NaCl eingestellt war. Wt-NK1 und die verschiedenen
Mutanten zeigten leichte Variationen im Elutionsvolumen aufgrund
von Restwechselwirkung mit der Säule.
-
Heparin
konnte in Lösung
weder Vernetzung noch Oligomerisierung der HP11-Mutante induzieren. HP12,
die zweite N-Domänen-Mutante
wurde durch Heparin vernetzt, aber wie die HP11-Mutante konnte sie nicht
in Lösung
in Gegenwart von Heparin oligomerisieren. Die zwei K-Domänen-Mutanten
(1K1 und 1K2) verhielten sich in diesen Versuchen jedoch wie wt-NK1.
Letztlich sind die Aminosäuren,
die kristallographischen Kontakt mit Heparin in der N-Domäne herstellen,
für heparinabhängige Dimerisierung
von NK1 in Lösung
erforderlich, was zeigt, dass diese Aminosäuren für heparansulfatabhängige Dimerisierung
von NK1 auf der Zelloberfläche
verantwortlich sind.
-
Biologische Aktivität von NK1-Mutanten
-
Versuche
mit heparansulfatdefizienten Zellen haben eine essenziellen Bedarf
an Heparansulfat oder löslichem
Heparin für
die biologische Aktivität
von NK1 gezeigt (Schwall et al. (1996)). Normale Zellen präsentieren
membrangebundenes Heparansulfat und reagieren daher, wenn sie den
MET-Rezeptor exprimieren, auf NK1. Sie reagieren möglicherweise
nicht auf heparansulfatdefiziente NK1-Mutanten, wie z.B. HP11 und
HP12.
-
Koloniestreuungstests
mit MDCK-Zellen wurden im Wesentlichen wie von Gherardi et al. (1989)
und Stoker et al. (1987) in Gegenwart der Volllängen-HGF/SF- oder -NK1-Proteinen
durchgeführt.
Kurz gesagt wurden MDCK-Zellen in geringer Dichte in 60 mm Schalen
ausplattiert und 3 Tage lang in Standardmedium kultiviert, das 10–10 M
HGF/SG oder 10–8 M der verschiedenen
NK1-Proteine enthielt. Nach Inkubation über Nacht wurden mehrere Kolonien
aus jeder Schale unter Einsatz von Phasenkontrastoptik fotografiert.
-
Die
Kolonien in Kontrollkulturen zeigten starke Zell-Zell-Adhäsion und
ein typisches epitheliales „Pflasterstein"-Aussehen. HGF/SF
(10–10 M),
wt-NK1 oder die K-Domänen-Mutante
1K1 (10–8 M)
induzierte volle Dissoziation von MDCK-Kolonien. Hinge gen waren
sowohl die HP11- als auch die HP12-Mutante (10–8 M)
inaktiv. Die Hinzufügung
von löslichem
Heparin (10–6 M)
beeinflusste die Kontrollkulturen oder Kulturen, die HGF/SF- oder
NK1-Proteine enthielten, nicht.
-
Die
biologische Aktivität
der NK1-Mutanten wurde mit einem anderen Ziel näher untersucht, wobei die MK-Mäuse-Keratinozytenlinie,
die eine starke mitogene Reaktion auf HGF/SF zeigte (Moorby et al.
(1995)). Wt-NK1, nicht aber die N-Domänen-Mutanten HP11 und HP12, induzierte eine
wertvolle Stimulierung von DNA-Synthese in Konzentrationen von 10–10 M
oder höher
(1). Bemerkenswerterweise zeigte die K-Domänen-Mutante
1K1 höhere
Aktivität
als wt-NK1 und war mit jener von Volllängen-HGF/SF vergleichbar oder sogar
höher.
1K2, die zweite K-Domänen-Mutante,
verhielt sich wie die 1K1-Mutante und erbrachte ein ähnliches
Ergebnis wie die 1K1-Mutante.
Daher verursachten die HP11 und HP12-Mutationen, die keine Dimerisierung
von NK1 in Lösung
induzierten, auch den Verlust der biologischen Aktivität, vermutlich
aufgrund des Unvermögens
dieser Mutanten, zellassoziiertes Heparansulfat auf der Oberfläche der
MDCK- oder MK-Zellen zu binden. Hingegen verliehen die K-Domänen-Mutationen
NK1 erhöhte
biologische Aktivität
und wandelten sie in einen vollständigen Rezeptoragonisten um.
-
Um
festzustellen, ob der Verlust der Aktivität der HP11- und der HP12-Mutante
auf defekte Rezeptorbindung oder -aktivierung zurückzuführen war,
wurden Konkurrenzversuche durchgeführt, in denen MDCK-Zellen in
Gegenwart von HGF/SF alleine (10–10 M)
oder in Gegenwart von HGF/SF und Überschuss-Konzentrationen (10–8 oder
10–7 M)
von wt-NK1 oder der zwei N-Domänen-Mutanten
kultiviert wurden. Wie erwartet, verhielt sich wt-NK1 wie ein partieller
Antagonist, aber HP11 und HP12 zeigten keine (HP11) oder sehr wenig
(HP12) antagonistische Aktivität,
was impliziert, dass das Fehlen von Aktivität dieser Mutanten auf die reduzierte
Rezeptorbindung anstatt auf das Versagen, Rezeptoraktivierung zu
induzieren, zurückzuführen ist.
-
Beispiel 2: In-vitro-Aktivität von 1K1
-
Drei
Gruppen von 12 männlichen
Balb/c-Mäusen
(10 Wochen alt, etwa 35 g) plus einer Kontrollgruppe aus 20 solchen
Tieren wurden i.p. 0,6 g/kg von N-Acetyl-p-aminophenol in 0,3 ml PBS verabreicht.
Nach zwei Stunden und sechs Stunden nach der Dosierung wurden die
Mäuse i.v.
mit 0,5 mg/kg 1K1, NK1 oder HGF/SGF behandelt; die Kontrollgruppe
blieb unbehandelt.
-
Die
Ergebnisse sind in 2 veranschaulicht. Kurz gesagt
führte
N-Acetyl-p-aminophenol bei 85 % der Tiere, die über einen Zeitraum von 3 Tagen
das Arzneimittel, aber keinen Wachstumsfaktor erhielten, zum Tod,
wobei knapp weniger als 50 % der Tiere 4 Stunden nach der Behandlung
tot waren. HGF/SF bot gewissen Schutz, und überraschenderweise war NK1
aktiver als HGF/SF, wobei eine 40%ige Überlebensrate 3 Tage nach der
Behandlung erreicht wurde. Die NK1-Mutante 1K1 war das wirkungsvollste
der getesteten Proteine und führte
zu einer Überlebensrate
von 80 %.
-
Beispiel 3: Aktivität von NK1 und 1K1 bei Amanitin-induziertem
Leberversagen
-
Drei
Gruppen von 12 Testmäusen
und eine Kontrollgruppe von 20 Mäusen
desselben Stamms, derselben Größe und desselben
Geschlechts wie in Beispiel 2 wurden i.p. 0,9 mg/kg α-Amanitin
verabreicht. Den Testgruppen wurden dann alle 12 Stunden 5 Injektionen
gegeben, wobei 12 Stunden nach der α-Amanitin-Dosierung mit 0,5
mg/kg i.v. von NK1, 1K1 oder HGF/SF begonnen wurde. Die Ergebnisse
sind in 3 dargestellt, die zeigt, dass
sowohl 1K1 als auch NK1 wirksam eine Reduktion der Lebertoxizität im frühen Stadium (3–5 Tage)
ergaben.
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