ES2291460T3 - Fragmento nk1 del factor de crecimiento de hepatocito/factor de dispersion (hgf/sf) y variantes de los mismos y su utilizacion. - Google Patents
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Abstract
Polipéptido que es una variante de la SEC ID No: 1, teniendo dicha variante la secuencia de SEC ID No: 1, a excepción de una sustitución de por lo menos una de las posiciones, definidas en relación con HGF/SF de longitud completa de la SEC ID No: 2, numeradas como 132, 134, 170 y 181, manteniendo dicha variante la capacidad de mostrar una dimerización dependiente de heparina en solución y actuar como agonista contra el receptor MET, y teniendo una mayor afinidad neta por heparina que NK1, donde NK1 consiste en los residuos 32-206 de la SEC ID No: 2.
Description
Fragmento NK1 del factor de crecimiento de
hepatocito/factor de dispersión (HGF/SF) y variantes de los mismos y
su utilización.
La presente invención se refiere a variantes del
fragmento NK1 del polipéptido factor de crecimiento HGF/SF que
actúan como agonistas del receptor MET y a la utilización de NK1 y
sus variantes en procedimientos de tratamiento.
El polipéptido factor de crecimiento de factor
de crecimiento de hepatocito/factor de dispersión (HGF/SF)
(Gherardi et al., 1989; Miyazawa et al., 1989;
Nakamura et al., 1989; Stoker et al., 1987) y su
receptor MET, el producto del protooncógeno c-MET (Bottaro
et al., 1991) juega papeles esenciales en el desarrollo de
órganos epiteliales, tales como la placenta y el hígado (Schmidt
et al, 1995; Uehara et al., 1995) y en la migración
de células precursoras miogénicas (Bladt et al., 1995) y
neuronas motoras (Caton et al., 2000; Ebens et al.,
1996).
HGF/SF y MET también están implicados en la
extensión de una serie de tumores epiteliales como resultado de los
reajustes cromosómicos de MET (Yu et al., 2000), mutaciones
somáticas y/o de líneas germinales en la MET quinasa (Schmidt et
al., 1997) o, más frecuentemente, la sobreexpresión en células
tumorales de una gen MET no reajustado y no mutado (revisado
en Jeffers et al., 1996).
HGF/SF tiene una estructura de dominio único que
se parece a la del plasminógeno precursor de proteinasa sanguínea y
consiste en seis dominios: un dominio N-terminal
(N), homólogo al péptido de activación de plasminógeno, cuatro
copias de dominio kringle (K) y un dominio de serina proteinasa
catalíticamente inactivo (Donate et al., 1994). Dos
productos de "splicing" alternativo del transcrito HGF/SF
primario codifican NK1, un fragmento que contiene el dominio N y el
primer dominio K, K1, (Cioce et al., 1996) y NK2, un
fragmento que contiene los dominios N, K1 y segundo kringle, K2,
(Chan et al., 1991; Hartmann et al., 1992; Miyazawa
et al., 1991). Tanto NK1 (Lokker y Godowski, 1993) como NK2
(Chan et al., 1991) se caracterizaron inicialmente como
antagonistas de MET, aunque experimentos en ratones transgénicos
han indicado posteriormente que NK1 se comporta in vivo como
un agonista de receptor bona FIDE (Jakubczak et al.,
1998).
Existe una importante diferencia en el mecanismo
de unión al receptor y activación por HGF/SF y NK1. HGF/SF es
totalmente activo en células que carecen de heparán sulfato,
mientras que NK1 sólo es activa en células que muestran heparán
sulfato o en presencia de heparina soluble (Schwall et al.,
1996). De este modo, NK1, pero no HGF/SF, se parece a FGF
(Rapraeger et al., 1991; Yayon et al., 1991) en cuanto
a la necesidad de heparán sulfato para la unión al receptor y/o
activación.
Los experimentos de deleción temprana en el
dominio indicaron que el dominio N es importante para la unión a
heparina (Mizuno et al., y la mutagénesis dirigida de sitio
identificó residuos en este dominio esenciales para la unión
(Hartmann et al., 1998). De este modo, la mutación de carga
inversa de R73 y R76 disminuyó la afinidad de HGF/SF por heparina
en más de 50 veces (Hartmann et al., 1998). Se sugirió un
papel para otros residuos cargados positivamente, tales como K58,
K60 y K62, a partir de la estructura del dominio N en solución, ya
que estos residuos están agrupados en estrecha proximidad a R73 y
R76 (Zhou et al., 1998) y recientes experimentos de RMN han
proporcionado soporte experimental para una implicación de K60, K62,
R73, R76, R78 y algunos otros residuos en la unión de heparina al
dominio N (Zhou et al., 1999).
A pesar de este avance, el mecanismo a través
del cual la heparina y el heparán sulfato confieren actividad de
agonista a NK1 permanece completamente incomprendida. NK1 cristaliza
como dímero en ausencia de heparina (Chirgadze et al., 1999;
Ultsch et al., 1998) y las características de este dímero
seguirían que podría representar la forma biológicamente activa de
NK1 (Chirgadze et al., 1999). Sin embargo, todavía no hay una
evidencia experimental que soporte esta interpretación.
Lietha et al (EMBO J., 20;
5543-5555 (2001)) describen estructuras cristalinas
de complejos NK1-heparina. WO96/40914 se refiere a
variantes del factor de crecimiento de hepatocito truncadas.
La SEC ID No: 1 representa los aminoácidos 28 a
210 de la proteína HGF/SF humana. Los residuos
32-206 de HGF/SF son el fragmento NK1 de tipo
natural. Se han utilizado extensiones N y C-terminal
cortas por conveniencia experimental para optimizar la expresión en
levaduras. Para facilitar la referencia, las posiciones de SEC ID
No: 1 se definen en relación a HGF/SF (SEC ID No: 2) de longitud
completa, a menos que se afirme lo contrario.
La SEC ID No: 2 es la secuencio de HGF/SF de
longitud completa de la cual, los residuos 1-31 son
la secuencia líder y los residuos 32-206 son el
fragmento NK1.
La figura 1 muestra ensayos de síntesis
utilizando células MK. Las células se cultivaron para agruparse en
un medio de queratinocitos libre de suero y se transfirieron en
medio basal durante 24 horas antes de la incubación con
^{3}H-timidina y proteínas HGF/SF o NK1 en las
concentraciones (mol/L) indicadas en la figura (eje X). La síntesis
de ADN se midió como radiaoactividad insoluble en TCA; el eje Y
muestra la incorporación de ^{3}H-timidina, cpm x
10^{3}/pocillo. EL mutante HP11 es inactivo y el HP12 muestra una
menor actividad en comparación con wt-NK1. En
cambio, el mutante 1K1 es más activo que wt-NK1 y
HGF/SF de longitud completa.
La Figura 2 muestra los índices de supervivencia
de ratones Balb/c después de la administración de una dosis letal
de
N-acetil-p-aminofenol
seguido del tratamiento con NK1 y un péptido de la presente
invención.
La figura 3 muestra los índices de supervivencia
de ratones Balb/c después de la administración de una dosis letal
de alfa-amanitina.
Se han determinado dos estructuras cristalinas
por rayos X de los complejos NK1-heparina que
definen el sitio de unión a heparina de NK1. El análisis de estas
estructuras confirma que tiene lugar los contactos entre la
heparina y los residuos en el dominio N. No obstante,
sorprendentemente, el análisis también identifica un conjunto de
contactos de heparina críticos con cuatro residuos cargados
positivamente en el dominio K1. Más sorprendentemente, se ha
demostrado que la unión de heparina a estos residuos cargados
positivamente en el dominio K1 inhibe la actividad, y que la
mutagénesis de los residuos proporciona variantes de NK1 con una
actividad mayor que la actividad de tipo natural. Dichas variantes
son útiles para la producción de agonistas para el fomento del
crecimiento celular, particularmente para angiogénesis, y el
tratamiento de enfermedades cardiovasculares, hepáticas,
musculoesqueléticas y neuronales.
De este modo, la presente invención da a conocer
un polipéptido que es una variante de SEC ID No: 1, teniendo dicha
variante la secuencia de SEC ID No: 1, a excepción de una
sustitución de por lo menos una de las posiciones, definidas en
relación con HGF/SF de longitud completa de la SEC ID No: 2,
numeradas como 132, 134, 170 y 181, manteniendo dicha variante la
capacidad de mostrar una dimerización dependiente de heparina en
solución y actuar como agonista contra el receptor MET, y teniendo
una mayor afinidad neta para heparina que NK1 (residuos
32-206 de la SEC ID No: 2).
La presente invención también da a conocer un
polipéptido que es fragmento del polipéptido variante de la
presente invención, mantenido dicho fragmento la región
132-181 y manteniendo además la capacidad de
mostrar una dimerización dependiente de heparina en solución y
actuar como agonista contra el receptor MET.
La presente invención da a conocer además una
composición que comprende un polipéptido de la presente invención
junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención da a conocer además un
procedimiento para estimular en crecimiento de una célula que
expresa el receptor MET, comprendiendo dicho procedimiento poner en
contacto un polipéptido de la presente invención con dicha célula.
La célula puede ser in vitro o in vivo.
La presente invención da a conocer además un
procedimiento de tratamiento de un paciente que tiene una condición
de enfermedad que requiere la estimulación del crecimiento celular,
comprendiendo dicho procedimiento la administración a un paciente
de una cantidad eficaz de un polipéptido de la presente
invención.
La presente invención da a conocer también un
polipéptido de la presente invención para utilizar en un
procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal.
La presente invención da a conocer además un
polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente
invención, así como vectores que portan dicho polinucleótido,
incluyendo vectores de expresión en los que el polinucleótidos está
operativamente unido a un promotor.
La presente invención da a conocer además una
célula huésped que porta un vector de la presente invención, y
procedimiento para la producción de un polipéptido de la presente
invención que comprende el cultivo de las células huésped en
condiciones adecuadas para la expresión del polinucleótido portado
por el vector, y la recuperación del polipéptido de la célula o el
cultivo.
Se está realizando un gran esfuerzo para
desarrollar agonistas y antagonistas de MET para terapia. Se espera
que los antagonistas de MET tengan aplicación en una serie de
tumores epiteliales que sobreexpresan MET, mientras que los
agonistas del receptor pueden ser válidos en la regeneración del
hígado, la reparación de heridas en la piel y la angiogénesis
terapéutica. Los datos estructurales y de mutagénesis proporcionados
por la presente invención permite la generación de potentes
agonistas de MET.
Los polipéptidos de la presente invención son
aquellos en los que una de las posiciones 132, 134, 170 y 181 está
sustituida por cualquier otro aminoácido. Sin embargo, se prefiere
que las sustituciones sean aquellas que den lugar a un cambio de
carga. De este modo, las sustituciones preferidas incluyen
sustituciones de inversión de carga de ácido aspártico y ácido
glutámico.
Dos o más de las posiciones se pueden sustituir
simultáneamente. Cuando se realizan dos sustituciones, en un
aspecto preferido las dos son 132 y 134, o bien, 170 y 181. También
se pueden realizar tres sustituciones o se pueden sustituir las
cuatro posiciones. Cuando se sustituye más de una posición las
sustituciones pueden ser las mismas o diferentes.
Los polipéptidos de la presente invención se
pueden preparar en una forma aislada. Los polipéptidos aislados de
la presente invención serán aquellos que se han definido
anteriormente en forma aislada, libre o sustancialmente libre de
material con el que se pueden asociar de forma natural, tal como
otros polipéptidos con los que se encuentran en la célula.
Naturalmente, los polipéptidos se pueden formular con diluyentes o
adyuvantes y por cuestiones prácticas se pueden aislar. Los
polipéptidos se pueden glicosilar, de forma natural o mediante
sistemas de células eucariotas heterólogas, o pueden ser no
glicosiladas (por ejemplo, si se producen mediante la expresión en
una célula procariota).
Un polipéptido de la presente invención puede
estar también en forma sustancialmente purificada, en cuyo caso
comprenderá generalmente el polipéptido en una preparación en la que
más de un 90%, por ejemplo, un 95%, 98% ó 99% del polipéptido en la
preparación es un polipéptido de la presente invención.
Los polipéptidos de la presente invención se
pueden modificar, por ejemplo, mediante la adición de residuos de
histidina para ayudar a su purificación o mediante la adición de una
secuencia señal para fomentar su secreción de una célula.
La SEC ID No: 1 representa la forma humana de
tipo natural de NK1 (junto con la extensión corta N y
C-terminal). Sin embargo, los expertos en la materia
entenderán que además de las sustituciones específicas de la
presente invención que dan lugar a una mayor actividad, se pueden
variar otras posiciones de la molécula de tipo natural a un grado
pequeño sin afectar significativamente la función o la estructura
global del polipéptido. Por ejemplo, se pueden realizar
sustituciones conservativas a muchas partes de las proteínas sin un
impacto apreciable en la estructura o función de esa proteína. Los
expertos en la materia entenderán que se puede realizar un pequeño
número, por ejemplo, de 1-20, por ejemplo, 2, 3, 4 ó
5-10 sustituciones de otros aminoácidos a NK1 y
siempre y cuando las sustituciones no alteren significativamente la
actividad de polipéptidos de la presente invención, dichas
variantes se consideran aún como polipéptidos NK1.
Los fragmentos de variantes del polipéptido de
la presente invención que mantienen la región
132-181 también forman una parte adicional de la
presente invención. Dichos fragmentos pueden tener de 70 a 190
aminoácidos de tamaño, por ejemplo, de 100 a 180 aminoácidos de
tamaño. Un ejemplo de dicho fragmento se proporciona en la presente
invención como el fragmento NK1 de aminoácidos
32-206. Otro fragmento es aquel que incluye por lo
menos 70 aminoácidos contiguos del dominio Kringle 1, que se halla
en 128-206. Preferiblemente, el fragmento contiene
este dominio en su totalidad.
Los procedimientos para determinar si un
polipéptido de la presente invención mantiene la capacidad de
mostrar la dimerización dependiente de heparina en solución se
establecen en los ejemplos que se acompañan. Tal como se indica, el
polipéptido se puede incubar con una concentración equimolar de
heparina en un tampón de NaCl 300 mM y analizar mediante filtración
en gel o transferencia Western.
Asímismo, la capacidad de actuar como agonista
del receptor MET se puede determinar según los ejemplos que se
acompañan. Esto puede implicar la incubación del polipéptido con
células de queratinocitos murinos (por ejemplo, células MK) a una
concentración de 10^{-10} M o superior (por ejemplo, de 10^{-10}
a 10^{-8} M), y la determinación de si existe un incremento en la
síntesis de ADN en las células.
Un polipéptido según la presente invención se
puede aislar y/o purificar (por ejemplo, utilizando un anticuerpo),
por ejemplo, después de la producción por expresión de ácido
nucleico codificante (para el mismo véase a continuación). Los
polipéptidos según la presente invención también se pueden generar
total o parcialmente mediante síntesis química, por ejemplo, por
etapas. El polipéptido aislado y/o purificado se puede utilizar en
la formulación de una composición que puede incluir por lo menos un
componente adicional, por ejemplo, una composición farmacéutica que
incluye un excipiente, vehículo o portador farmacéuticamente
aceptables. Una composición que incluye un polipéptido según la
presente invención se puede utilizar en el tratamiento profiláctico
y/o terapéutico tal como se describe a continuación.
Un polipéptido de la presente invención se puede
marcar con un marcador revelador. El marcador revelador puede ser
cualquier marcador adecuado que permita detectar el polipéptido.
Entre los marcadores adecuados se incluyen radioisótopos, por
ejemplo, ^{125}I, enzimas, anticuerpos, polinucleótidos y
enlazadores, tales como biotina. Los polinucleótidos marcados de la
presente invención se pueden utilizar en procedimientos de
diagnóstico, tales como inmunoensayos con el fin de determinar la
cantidad de un polipéptido de la presente invención en una
muestra.
Los polipéptidos y composiciones de los mismos
según la presente invención se pueden utilizar en procedimientos de
tratamiento. Dicho tratamiento se dirigirá al fomento del
crecimiento de células en el cuerpo humano que expresa el receptor
MET. Dicha terapia será útil para el fomento de la angiogénesis y,
de este modo, será útil para el tratamiento de heridas crónicas de
la piel, enfermedades crónicas del hígado y del riñón, enfermedades
musculoesqueléticas y neuronales degenerativas y enfermedades
cardiovasculares.
Un uso particular de los polipéptidos de la
presente invención es el tratamiento o la prevención del daño
hepático causado por la intoxicación por
N-acetil-p-aminofenol
(conocido comercialmente como paracetamol o acetaminofeno). Se ha
observado que la administración de un polipéptido de la presente
invención en un modelo de ratón aumenta sustancialmente los índices
de supervivencia de ratones después de la administración de una
dosis letal de paracetamol. También se proporciona cierta protección
por el propio péptido NK1. De este modo, en un aspecto de la
presente invención, se da a conocer también la utilización de un
péptido NK1 para el tratamiento mencionado anteriormente.
De este modo, la presente invención da a conocer
un procedimiento de tratamiento o prevención de daño hepático en un
sujeto que ha ingerido
N-acetil-p-aminofenol,
comprendiendo el procedimiento la administración al sujeto de una
cantidad eficaz de un polipéptido de la presente invención o un
polipéptido NK1.
La presente invención también da a conocer un
polipéptido de la presente invención o un polipéptido NK1 para la
utilización en un procedimiento de terapia de un sujeto humano o
animal, particularmente para el tratamiento o la prevención del
daño hepático en un sujeto que ha ingerido
N-acetil-p-aminofenol.
También se ha demostrado que el péptido NK1, así
como el polipéptido 1K1, con eficaces en el tratamiento de la
insuficiencia hepática aguda causada por
\alpha-amanitina, que es un potente inhibidor
específico de ARN polimerasa II. De este modo, el péptido NK1, así
como los péptidos de la presente invención, tal y como se han
definido en el presente documento, se pueden utilizar generalmente
en un procedimiento de tratamiento de enfermedades hepáticas,
particularmente condiciones de enfermedades asociadas con la
insuficiencia hepática. Entre dichas condiciones se incluyen, no
sólo la toxicidad causada por
N-acetil-aminofenol, sino que
también incluye si está provocada por fármacos y otras causas de
insuficiencia o enfermedad hepática.
De este modo, estos péptidos se pueden utilizar
para tratar o prevenir la insuficiencia o enfermedad hepática aguda
inducida por toxinas, incluyendo una toxina seleccionada del
envenenamiento por setas (por ejemplo, Amanita phalloides),
arsénico, tetracloruro de carbono (u otros hidrocarburos clorados),
cobre, etanol, hierro, metotrexato y fósforo.
La presente invención se puede utilizar
adicionalmente para tratar o prevenir la insuficiencia o enfermedad
hepática causada por otros medios, incluyendo condiciones
seleccionadas entre infección vírica (tal como por la infección con
un virus de la hepatitis, por ejemplo, HAV, HBV o HCV) u otras
hepatitis víricas agudas, hepatitis crónica autoinmune, hígado
graso agudo del embarazo, síndrome de Budd-Chiari y
enfermedad veno-oclusiva, hipertemia, hipoxia,
infiltración maligna, síndrome de Reye, sepsis, enfermedad de Wilson
y un rechazo de transplante.
Los polipéptidos se pueden administrar en
cualquier forma adecuada, por ejemplo, en una composición
farmacéutica, tal como agua, solución salina, dextrosa, glicerol,
etanol y similares. Las composiciones se pueden formular para
inyección, por ejemplo, para inyección directa en el sitio del
tratamiento previsto o inyección intravenosa.
Las dosis adecuadas de polipéptidos serán en
última instancia a discreción del médico teniendo en cuenta la
naturaleza de la condición a tratar y la condición del paciente. En
general, los intervalos de las dosis serán de 1 \mug a 1 mg por
kg de peso corporal. Los polipéptidos se pueden administrar mediante
cualquier ruta adecuada, por ejemplo, mediante inyección i.v. o
i.p., o directamente al sitio de tratamiento.
Por "tratamiento" se entenderá que se
refiere a cualquier administración de un polipéptido que pretende
aliviar la gravedad de una enfermedad en tratamiento, para
proporcionar alivio de los síntomas de la enfermedad o para
prevenir o ralentizar el desarrollo de la enfermedad en un individuo
con una condición de enfermedad o con el riesgo de desarrollar la
condición de la enfermedad.
Un polinucleótido de la presente invención es
aquel que codifica un polipéptido de la presente invención tal como
se ha definido anteriormente. Esto incluye polinucleótidos de ADN y
ARN. Un polinucleótido de la presente invención puede ser de cadena
única o de doble cadena.
Generalmente, se proporciona un polinucleótidos
de la presente invención como un aislado, en forma aislada y/o
forma purificada, o libre o sustancialmente libre de material con el
que se asocia de forma natural, tal como libre o sustancialmente
libre del ácido nucleico que flanquea el gen en el genoma humano, a
excepción posiblemente de una o más secuencias reguladoras para la
expresión.
Las secuencias que codifican todos o parte de
los polinucleótidos de la presente invención y/o sus elementos
reguladores se pueden preparar fácilmente por un experto en la
materia utilizando la información y referencias contenidas en el
presente documento y las técnicas conocidas en el sector (por
ejemplo, véase Sambrook, Fristch y Maniatis, ``Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y
Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John
Wiley e Hijos, 1992). Entre estas técnicas se incluye la
utilización de mutagénesis dirigida de sitio de ácido nucleico que
codifica NK1, tal como se describe en los ejemplos que se
acompañan.
Los polinucleótidos de la presente invención se
pueden incorporar en una vector replicable recombinante. El vector
se puede utilizar para replicar el ácido nucleico en una célula
huésped compatible. De este modo, en una realización adicional, la
presente invención da a conocer un procedimiento para fabricar
polinucleótidos de la presente invención mediante la introducción
de un polinucleótido de la presente invención en un vector
replicable, la introducción del vector en una célula huésped
compatible, y el crecimiento de la célula huésped en condiciones
que provocan la replicación del vector. El vector se puede recuperar
de la célula huésped. Las células huésped adecuadas se describen a
continuación en relación con los vectores de expresión.
Preferiblemente, un polinucleótido de la
presente invención en un vector está operativamente unido a una
secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la
secuencia codificante por la célula huésped, es decir, el vector es
un vector de expresión.
El término "operativamente unido" se
refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos
están en una relación que les permite actuar de la manera prevista.
Una secuencia de control "operativamente unida" a una
secuencia codificante está unida de manera que la expresión de la
secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con
las secuencias de control.
Los vectores adecuados se pueden elegir o
construir, conteniendo secuencias reguladoras apropiadas,
incluyendo secuencias de promotores, fragmentos de terminación,
secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes
marcadores y otras secuencias según sea apropiado. Los vectores
pueden ser plásmidos, víricos, por ejemplo, fagos fagémidos o
baculovíricos, cósmicos, YACs, BACs o PACs según sea apropiado.
Entre los vectores se incluyen vectores de terapia génica, por
ejemplo, vectores basados en adenovirus, virus
adeno-asociados, retrovirus (tal como VIH o MLV) o
vectores de virus alfa.
Los vectores se pueden disponer en un origen de
replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho
polinucleótidos y opcionalmente un regulador del promotor. Los
vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables,
por ejemplo, un gen de resistencia a ampicilina en el caso de un
plásmido bacteriano o un gen de resistencia a neomicina para un
vector de mamífero. Los vectores se pueden utilizar in
vitro, por ejemplo, para la producción de ARN o se pueden
utilizar para transfectar o transformar una célula huésped. El
vector también se puede adaptar para utilizar in vivo, por
ejemplo, en procedimientos de terapia génica. Los sistemas para la
clonación y la expresión de un polipéptido en una serie de células
huésped diferentes son bien conocidos.
Entre las células huésped adecuadas se incluyen
bacterias, células eucariotas, tales como de mamífero y levaduras,
y sistemas de baculovirus. Entre las líneas de células de mamíferos
disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido
heterólogo se incluyen células de ovario de hámster chino, células
HeLa, células de riñón de hámster bebé, células COS y muchas
otras.
Los promotores y otras señales de regulación de
la expresión se pueden seleccionar para que sean compatibles con la
célula huésped para la que se designa el vector de expresión. Por
ejemplo, los promotores de levaduras incluyen los promotores GAL4 y
ADH de S. cerevisiae, S pombe nmt1 y el promotor adh. Los
promotores mamíferos incluyen el promotor de metalotioneína que se
puede incluir en respuesta a metales pesados, tales como el cadmio.
También se pueden utilizar promotores víricos, tales como el
promotor de antígenos T grandes de SV40 o promotores de adenovirus.
Todos estos promotores están fácilmente disponibles en la
técnica.
Los vectores pueden incluir otras secuencias,
tales como promotores o potenciadores para dirigir la expresión del
ácido nucleico o secuencias de ácidos nucleicos insertados, de
manera que el polipéptido se produce como una fusión y/o señales de
secreción codificante de ácidos nucleicos, de manera que el
polipéptido producido en la célula huésped se secreta de la
célula.
Los vectores para la producción de polipéptidos
de la presente invención para su uso en terapia génica incluye
vectores que portan una secuencia de un minigen de la presente
invención.
Los vectores se pueden introducir en una célula
huésped adecuada tal como se ha descrito anteriormente para
proporcionar la expresión de un polipéptido de la presente
invención. De este modo, en un aspecto adicional, la presente
invención da a conocer un proceso para la preparación de
polipéptidos según la presente invención que comprende el cultivo
de una célula huésped que porta un vector de expresión tal y como se
ha descrito anteriormente en condiciones para proporcionar la
expresión por el vector de una secuencia codificante que codifica
los polipéptidos, y la recuperación de los polipéptidos expresados.
Los polipéptidos también se pueden expresar en sistemas in
vitro, tales como lisado de reticulocitos.
Una realización adicional de la presente
invención proporciona células huésped que portan los vectores para
la replicación y expresión de polinucleótidos de la presente
invención, Las células se pueden seleccionar para que sean
compatibles con dicho vector y pueden ser, por ejemplo, bacterianas,
de levadura, de insectos o mamíferos.
La introducción de vectores en una célula
huésped puede ir seguida de la inducción o permisibilidad para
realizar la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, mediante el
cultivo de células huésped (que puede incluir células realmente
transformadas, aunque más probablemente las células serán
descendientes de las células transformadas) en condiciones para la
expresión del gen, de manera que se produce el polipéptido
codificado. Si el polipéptido se expresa acoplado a un péptido
líder de señal apropiado, se puede secretar desde la célula en un
medio de cultivo. Tras la producción mediante la expresión, un
polipéptido se puede aislar y/o purificar de la célula huésped y/o
el medio de cultivo, según sea el caso, y utilizarse posteriormente
según se desee, por ejemplo, en la formulación de una composición
que puede incluir uno o más componentes adicionales, tales como una
composición farmacéutica que incluye uno o más excipientes,
vehículos o portadores farmacéuticamente aceptables (por ejemplo,
ver a continuación).
Un aspecto adicional de la presente invención da
a conocer una célula huésped que contiene ácido nucleico tal y como
se ha descrito en el presente documento. Los polinucleótidos y
vectores de la presente invención se pueden integrar en el genoma
(por ejemplo, cromosoma) de la célula huésped. La integración puede
estar fomentada por la inclusión de secuencias que fomentan la
recombinación con el genoma según las técnicas estándar. El ácido
nucleico puede estar en un vector extra cromosómico en el interior
de la célula.
En los ejemplos que se acompañan se muestra que
wt-NK1 se comportaba como un agonista parcial, tal
como se esperaba de la técnica anterior. Produjo la dispersión
completa de colonias de MDCK y la estimulación de la síntesis de
ADN en células MK (figura 1). De forma interesante, la estimulación
máxima de la síntesis de ADN por wt-NK1 ocurrió a
concentraciones tan bajas como 10^{-10} M, una concentración mucho
más baja que las requeridas en otros estudios, véase, por ejemplo,
(Schwall et al., 1996). La mayor potencia de NK1 observada
en nuestros estudios puede reflejar la fuente (levadura frente a
bacteriana) y, por tanto, la actividad de la proteína
utilizada.
Mientras que wt-NK1 permanece
menos activa que HGF/SF de longitud completa, de forma destacada los
dos mutantes de dominio K mostraron una actividad biológica mucho
mayor que wt-NK1 e igual o superior que HGF/DF de
longitud completa. Nuestros datos bioquímicos sugieren que las
mutaciones del dominio K dan lugar a una mayor afinidad neta de NK1
por heparina. De este modo, el grupo de aminoácidos que consiste en
K132, R134 y R181 actúa como un efector negativo de la unión de
heparina a NK1 y las mutaciones de inversión de carga de estos
residuos aumenta la unión de heparina probablemente a través del
principal sitio en el dominio N.
Independientemente del mecanismo, se ha
demostrado que la sustitución de dos aminoácidos en el dominio K
(K132:R134 o K170:R181) es suficiente para convertir NK1 en un
agonista de receptor completo. NK1, pero no HGF/SF, se puede
producir en levaduras y se espera que muestre una cinética y una
distribución de tejido in vivo favorable en comparación con
HGF/SF de longitud completa.
Ejemplo
1
En este ejemplo, se ilustran la producción y el
análisis de la actividad biológica de dos variantes de NK1 de la
presente invención. Se muestra que estas variantes experimentan una
dimerización de manera similar a NK1 en presencia de heparina y se
convierten en potentes agonistas del receptor a través de la
mutagénesis de un conjunto de residuos cargados positivamente en el
dominio K.
La clonación, expresión y purificación de
wt-NK1 se llevó a cabo tal como se describe en
Chirgadze et al., 1999, a excepción de que la purificación
final de NK1 mediante cromatografía de intercambio catiónico se
llevó a cabo en una columna Sourcel5S (Amersham Pharmacia Biotech).
Para la expresión de mutantes de NK1, un fragmento de
EcoRI-NotI de la construcción de la expresión
wt-NK1 en pPIC9K se clonó en el vector pBluescript
KS (Stratagene) y las reacciones de amplificación de ADN se llevaron
a cabo utilizando parejas complementarias de oligonucleótidos
mutagénicos. Los mutantes del dominio N se produjeron mediante la
amplificación de ADN de los fragmentos pertinentes del ADNc de
HGF/SF humano de longitud completa que portaba las mutaciones
R73E:R76E (HP11 mutante) o las mutaciones (K58E:K60E:K62E) (HP12
mutante). Los mutantes del dominio N y el dominio K se clonaron
finalmente en el vector de expresión pPIC9K. La transformación y la
selección de P. pastoris se llevó a cabo tal y como se ha
descrito previamente (Chirgadze et al., 1999).
Se digirió heparina sódica de pulmón bovino
(Upjohn) con heparinasa I (Leo Pharmaceuticals) durante 14 minutos
a 37ºC en tampón fosfato 10 mM, 1,25 mM de CaCl_{2}, pH 7,0. El
agua se evaporó, el residuo se disolvió en 20 g/l de bicarbonato
amónico y se cargó en una columna de Biogel P-10
(Biorad). Las fracciones que contenían fragmentos de heparina de la
misma longitud (hasta hexadecasacárido) se combinaron y se
evaporaron el agua y el bicarbonato amónico en un Rotavapor
(Buechi). A continuación, los fragmentos de heparina se disolvieron
en acetato amónico 0,1 M y se pasó una alícuota a través de una
columna de GPC G3000 SW XL (30 cm x 7,8 mm) y una G2000 SW XL (30
cm x 7,8 mm) en un sistema de HPLC (Wilson) con el fin de calcular
la pureza y la concentración. A continuación, los fragmentos se
liofilizaron y se redisolvieron en agua (3 ciclos) con el fin de
eliminar el acetato amónico.
Esto se llevó a cabo mediante cromatografía de
filtración en gel y experimentos de reticulación. Para la
filtración en gel, se incubaron wt-NK1 o NK1 mutante
(0,5 mg/ml) durante 2 horas en presencia o ausencia de una
concentración equimolar de heparina de 14-mer en
tampón fosfato salino (PBS) ajustado a 300 mM de NaCl. A
continuación, se cargaron las muestras en una columna HR30 Superdex
200 (Ammersham Pharmacia Biotech) y se fluyeron a 0,5 ml/min.
Para la reticulación, se incubaron 10 \mul de
wt-NK1 o NK1 mutante (0,1 mg/ml) en presencia o
ausencia de una concentración equimolar de heparina de
14-mer en PBS. Después de 2 horas de incubación a
temperatura ambiente, se añadió 1 \mul de reticulador (BS^{3},
Pierce) en un exceso molar de 100 veces, la reacción continuó
durante 30 minutos y, a continuación, se detuvo con 1 \mul de
Tris-Cl 1 M, pH 7,4. Los productos de reacción se
cargaron en geles de SDS-poliacrilamida al 15% y se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Schleicher &
Schuell). La membrana se bloqueó en leche descremada al 2%, se
incubó durante 1 hora en presencia de anticuerpo policlonal
anti-HGF/SF de oveja (1W53, 1:1000), se lavó con PBS
+ Tween 20 al 0,2% y, a continuación, se incubó durante 1 hora con
anticuerpo de inmunoglobulina anti-oveja conjugado
con HRP (Dako). La actividad de HRP se detectó después de 3 lavados
adicionales en PBS + Tween 20 al 0,2% utilizando un sustrato
quimioluminiscente (Pierce).
Los ensayos de dispersión se llevaron a cabo tal
como se ha descrito en Gherardi et al., 1989; Stoker et
al., 1987. Brevemente, las células de MDCK se placaron a
1-2,5 x 10^{3} células/placa de 60 mm y se
cultivaron en suero de ternera fetal al 5% en DMEM durante
2-3 días antes de la adición de HGF/SF o
wt-NK1 o NK1 mutante. Después de una incubación
durante toda la noche, se inspeccionaron las placas y se
fotografiaron varias colonias de cada placa utilizando un
microscopio invertido Leica DM IRB equipado con óptica de contraste
de fase y una cámara 3CCD a color enfriada Hamamatsu.
Se cultivó la línea de queratinocitos de ratón
MK para agruparse en un medio SFM de queratinocitos (Gibco)
suplementado con 5 ng/ml de EGF-53 y extracto de
pituitaria bovina (BPE) de 50 g/ml en placas de cultivo de tejido
de 24 pocillos (Costar). En el agrupamiento, el medio completo se
sustituyó por medio basal (sin EGF y BPE) durante 24 horas antes de
la adición de 1 Ci/pocillo de ^{3}H-timidina en
medio basal que contenía 1 mg/ml de BSA y proteínas HGF/SF o NK1 en
las concentraciones especificadas en la leyenda de la figura 1.
Después de 16 horas, las células se transfirieron en hielo, se
lavaron con PBS y se incubaron en hielo frío, ácido tricloroacético
(TCA) al 5% durante 30 minutos. La radioactividad insoluble en TCA
se midió mediante centelleo después de 2 lavados con agua y lisis
en NaOH 0,2 M durante 30 minutos a 37ºC.
El fragmento NK1 de HGF/SF (aminoácidos
28-210) se expresó en la levadura metilotrófica
P. pastoris tal y como se ha descrito (Chirgadze et.
al., 1999) y se cristalizó en un complejo con un fragmento de
heparina tetrahexamérica (14-mer). El fragmento de
heparina se preparó mediante la digestión y la purificación a partir
de la heparina polidispersa extraída de pulmón bovino.
La cristalización de la proteína en el complejo
con heparina se describe en GB010430.6 del 27 de abril de 2001,
cuya prioridad es reivindicada por la presente y los contenidos de
la cual son incorporados en la presente por referencia, y en
Lietha, D. et. al.; EMBO J. 2001 Oct 15; 20(20):
5543-55, cuyos contenidos también se hayan
incorporados en la presente por referencia. La cristalización y el
análisis del complejo permitieron a los presentes inventores
identificar residuos de aminoácidos en NK1 que podrían estar
alterados. Habiendo identificado dichos residuos, los expertos en
la materia pueden producir variantes de la invención basadas en la
presente descripción del presente documento.
Brevemente, se encontraron dos tipos de cristal.
La unidad asimétrica de cristal tipo A contiene dos protómeros de
NK1, A y B, ensamblados en un dímero de cabeza a cola, como las
estructuras cristalinas previamente descritas de NK1 (Chirgadze
et. al., 1999; Ultsh et. al., 1998). Se une una
molécula de hepes a cada uno de los dominios K en el bolsillo de
unión a lisina putativo, como en la estructura 1bht (Ultsch et.
al., 1998). Se vio claramente una molécula de Heparina (H)
unida al dominio N del protómero A pero el dominio N del protómero
B se encuentra parcialmente desordenado y definido pobremente en la
periferia. De este modo, no podía verse si estaba unida una
molécula de heparina. La molécula de heparina unida al protómero A
también hace contacto con el dominio kringle del protómero A' de la
unidad asimétrica vecina de los cristales. La estructura final
refinada contenía 5 unidades de azúcar de heparina: 2 glicosaminas
(GlcN) y 3 ácidos idurónicos (IdoA) de los 14 presentes en el
complejo.
En cambio, la unidad asimétrica de cristal tipo
B contenía un montaje de cuatro dímeros NK1 (A y B, C y D, E y F, G
y H) con seis moléculas de heparina de unión. Los dímeros en la
unidad asimétrica se situaron en un círculo con un eje con dos
pseudopliegues pasando por el centro. La disposición del dímero de
NK1 fue idéntica a la observada en el cristal de tipo A y descrita
anteriormente (Chirgadze et. al., 1999; Ultsch et.
al., 1998). A diferencia de la estructura del cristal de tipo A,
todos los residuos entre 38 y 208 están bien ordenados y muestran
una densidad de electrones clara en todos los protómeros. Todos los
dominios N interactúan con las moléculas de heparina. Los dominios
N de los protómeros A y E comparten una molécula de heparina tal y
como lo hacen los dominios N de los protómeros D y G. El fragmento
de heparina más largo, que podría construirse en mapas de densidad
de electrones, tiene una longitud de nueve unidades de azúcar; está
unido al dominio N del protómero C y al dominio K del protómero F.
Otras moléculas de heparina están menos definidas conteniendo el
fragmento más corto sólo cinco unidades de azúcar (molécula N de
heparina). Cada dominio K tiene una molécula hepes unida en el
mismo bolsillo de unión que en la estructura del cristal de tipo A.
Los dímeros dentro de la unidad asimétrica muestran una buena
concordancia con los valores r.m.s.d de átomos C\alpha entre 0,50
\ring{A} (comparando el dímero que consiste en los protómeros A y
B con el que consiste en los protómeros C y D). Los dímeros NK1 en
el cristal de tipo B son también muy similares al dímero en el
cristal de tipo A, con el peor r.m.s.d. de átomos C\alpha
acumulando hasta 1,19 \ring{A} para el dímero que consiste en
protómeros A y B.
Se observaron las interacciones
heparina-dominio K en ambas estructuras cristalinas
e implicaban un grupo de residuos cargados positivamente (K132,
R134, K170, R181). Estos residuos forman un grupo de recubrimiento
de potencial electroestático positivo contra la cadena de heparina
cargada negativamente. La importancia funcional de las
interacciones heparina-dominio K fue ensayada
mediante mutagénesis.
Se generaron (Tabla 1) dos mutantes de dominio N
de carga inversa (HP11 y HP12) y dos mutantes de dominio K (1K1 y
1K2) y se caracterizaron para la unión a heparina y la actividad
biológica.
En primer lugar, se emplearon experimentos de
reticulación (Schwall et. al., 1996) y filtración en gel
(Chirgadze et. al., 1999) con el fin de caracterizar la
oligomerización mediada por heparina de wtNK1 en solución. Se
incubaron el NK1 de tipo natural y el NK1 mutante en ausencia o
presencia de concentraciones equimolares de heparina de
14-mer. Se analizaron las proteínas reticuladas
mediante transferencia western y se detectaron con un anticuerpo
policlonal anti-HGF/SF (1W53). Además, también se
llevó a cabo una filtración en gel del NK1 de tipo natural y del
NK1 mutante en ausencia o la presencia de concentraciones
equimolares de heparina 14-mer. La cromatografía se
llevó a cabo en una columna HR30 Superdex-200
equilibrada en PBS ajustada a 300 mM de NaCl.
Wt-NK1 y los diferentes mutantes mostraron ligeras
variaciones en el volumen de elución debido a la interacción
residual con la columna.
La heparina no consiguió inducir tanto la
reticulación como la oligomerización en solución del mutante HP11.
HP12, el segundo mutante del dominio N, se retículo mediante
heparina pero, del mismo modo que el mutante HP11, no se consiguió
oligomerizar en solución en presencia de heparina. Sin embargo, los
dos mutantes de dominio K (1K1 y 1K2) se comportaron como
wt-NK1 en estos experimentos. En conclusión, se
requieren los aminoácidos que hacen el contacto cristalográfico con
la heparina en el dominio N para la dimerización dependiente de
heparina de NK1 en solución indicando que estos aminoácidos son
responsables de la dimerización dependiente de heparán sulfato de
NK1 en la superficie celular.
Los experimentos con células deficientes de
heparán sulfato han establecido un requisito esencial de heparán
sulfato o heparina soluble para la actividad biológica de NK1
(Schwall et. al., 1996). Las células normales muestran
heparán sulfato unido de membrana y, de este modo, si expresan el
receptor de MET, responden a NK1. No obstante, puede que no
consigan responder a los mutantes de NK1 deficientes de heparán
sulfato tales como HP11 y HP12.
Los ensayos de dispersión de colonias (scatter)
con células MDCK se realizaron esencialmente tal y como se ha
descrito por Gherardi et. al., 1989 y Stoker et. al.,
1987 en presencia de HGF/SF de longitud completa o proteínas NK1.
Brevemente, se emplacaron células MDCK a baja densidad en placas de
60 mm y se cultivaron durante 3 días en un medio estándar, después
de lo cual el medio se sustituyó por medio nuevo o medio que
contenía 10^{-10} M de HGF/SF o 10^{-8} M de las diversas
proteínas NK1. Después de incubación durante toda la noche, se
fotografiaron diversas colonias de cada placa utilizando óptica de
contraste de fases.
Las colonias en los cultivos de control
mostraron una fuerte adhesión célula-célula y la
aparición de un "adoquín", epitelio típico. HGF/SF (10^{-10}
M), wt-NK1 o el mutante de dominio K 1K1 (10^{-8}
M) indujeron la disociación completa de las colonias de MDCK. En
cambio, ambos mutantes HP11 y HP12 (10^{-8} M) estaban inactivos.
La adición de heparina soluble (10^{-6} M) no afectó a los
cultivos control o a los cultivos que contenían HGF/SF o proteínas
NK1.
Se estudió adicionalmente la actividad biológica
de los mutantes de NK1 en una diana diferente, la línea de
queratinocitos de ratones MK, que muestra una respuesta mitogénica
fuerte a HGF/SF (Moorby et. al., 1995).
Wt-NK1, pero no los mutantes de dominio N HP11 y
HP12, indujeron una estimulación apreciable de la síntesis de ADN a
concentraciones de 10^{-10} M o mayores (Figura 1). De forma
destacable, el mutante de dominio K 1K1 mostró una actividad mucho
más elevada que wt-NK1 y comparable o incluso mayor
que la de HGF/SF de longitud completa. 1K2, el segundo mutante del
dominio K, se comportó de forma parecida al mutante 1K1 y dio un
resultado similar. De este modo, las mutaciones HP11 y HP12 que no
consiguieron inducir la dimerización de NK1 en solución, también
causaron la pérdida de actividad biológica, presumiblemente debido a
la incapacidad de estos mutantes para unir heparán sulfato asociado
a células en la superficie de células MDCK o MK. En cambio, las
mutaciones de dominio K confirieron un incremento de la actividad
biológica a NK1 y lo convirtieron en un agonista de receptor
completo.
Con el fin de establecer si la pérdida de
actividad de los mutantes HP11 y HP12 fue se debió a una unión al
receptor o activación defectuosas, los experimentos de competición
se llevaron a cabo de manera que las células MDCK se cultivaron en
presencia de HGF/SF solo (10^{-10} M) o en presencia de HGF/SF y
concentraciones en exceso (10^{-8} o 10^{-7} M) de
wt-NK1 o los dos mutantes de dominio N. Tal y como
se esperaba, wt-NK1 se comportó como un antagonista
parcial, pero HP11 y HP12 no mostraron actividad antagonista (HP11)
o bien muy poca (HP12) implicando que la falta de actividad de
estos mutantes es debida a una menor unión al receptor en lugar de
la falta de inducción de la activación del receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
A tres grupos de 12 ratones machos Balb/c (10
semanas de edad, aproximadamente 35 g) más un grupo de control de
20 de dichos animales se les administró 0,6 g/kg i.p. de
N-acetil-p-aminofenol
en 0,3 ml de PBS. Después de la dosificación, los ratones se
trataron a las dos y a las seis horas con 0,5 mg/kg i.v. de 1K1,
NK1 o HGF/SF o, en el caso del grupo de control, permanecieron sin
tratar.
Los resultados se muestran en la Figura 2.
Brevemente, el
N-acetil-p-aminofenol
causó la muerte en el 85% de los animales que recibieron el fármaco
pero no el factor de crecimiento durante un período de 3 días, con
tan sólo menos de un 50% de los animales muertos 4 horas después del
tratamiento. HGF/SF ofreció cierta protección y, de manera algo
sorprendente, NK1 fue más activo que HGF/SF, alcanzando una
supervivencia del 40% 3 días después del tratamiento. El mutante de
NK1 1K1 fue la más efectiva de las proteínas ensayadas dando lugar
a un 80% de supervivencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
A tres grupos de 12 ratones de prueba y un grupo
de control de 20 ratones de la misma cepa, tamaño y sexo que el
Ejemplo 2 se les administró i.p. 0,9 mg/kg de
\alpha-amanitina. A continuación, a los grupos de
prueba se les administraron 5 inyecciones cada 12 horas, empezando
12 horas después de la dosificación con
\alpha-amanitina, de 0,5 mg/kg i.v. de NK1, 1K1, o
HGF/SF. Los resultados se muestran en la figura 3, indicando que
tanto NK1 como 1K1 eran eficaces en la reducción de la toxicidad
hepática en una etapa temprana (3-5 días).
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SEC ID No: 1 (residuos 28-210 de
HGF/SF)
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\vskip1.000000\baselineskip
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SEC ID No: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Consejo de Investigación Médica
\hskip1cmGherardi, Ermanno
\hskip1cmLietha, Daniel
\hskip1cmBlundell, Thomas L
\hskip1cmChirgadze, Dimitry Y
\vskip0.400000\baselineskip
<120> El fragmento NK1 del Factor de
crecimiento de hepatocito/Factor de dispersión (HGF/SF) y variantes
de los mismos y su utilización.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> AHB5997788
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/GB02/01941
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-04-29
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 0110430.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-04-27
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
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<400> 2
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\cr
\cr}
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
Claims (16)
1. Polipéptido que es una variante de la SEC ID
No: 1, teniendo dicha variante la secuencia de SEC ID No: 1, a
excepción de una sustitución de por lo menos una de las posiciones,
definidas en relación con HGF/SF de longitud completa de la SEC ID
No: 2, numeradas como 132, 134, 170 y 181, manteniendo dicha
variante la capacidad de mostrar una dimerización dependiente de
heparina en solución y actuar como agonista contra el receptor MET,
y teniendo una mayor afinidad neta por heparina que NK1, donde NK1
consiste en los residuos 32-206 de la SEC ID No:
2.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, en el
que dicha sustitución es de tanto 132 como 134.
3. Polipéptido según la reivindicación 2, en el
que dicha sustitución es K132E:R134E.
4. Polipéptido según la reivindicación 1, en el
que dicha sustitución es de tanto 170 como 181.
5. Polipéptido según la reivindicación 4, en el
que dicha sustitución es K170E:R181E.
6. Fragmento del polipéptido según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, manteniendo dicho fragmento la región
132-181 y manteniendo además la capacidad de mostrar
una dimerización dependiente de heparina en solución y actuar como
agonista contra el receptor MET.
7. Composición que comprende un polipéptido
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, junto con un
diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
8. Procedimiento in vitro para estimular
el crecimiento de una célula que expresa el receptor MET,
comprendiendo dicho procedimiento el contacto de un polipéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 con dicha
célula.
9. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un procedimiento de
tratamiento terapéutico.
10. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un procedimiento de
tratamiento de una enfermedad hepática crónica.
11. Polipéptido seleccionado de un polipéptido
NK1 o un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6
para su uso en un procedimiento de tratamiento, en el que dicho
tratamiento es para el tratamiento o prevención de daño hepático en
un sujeto que ha ingerido
N-acetil-p-aminofenol.
12. Utilización de un polipéptido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de un paciente que tiene una
enfermedad hepática crónica.
13. Utilización de un polipéptido seleccionado
de un polipéptido NK1 o un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento o la prevención de daño hepático en un sujeto que ha
ingerido
N-acetil-p-aminofenol.
14. Polinucleótido que codifica el polipéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
15. Vector de expresión que comprende el
polinucleótido según la reivindicación 14 unido operativamente a un
promotor.
16. Célula huésped que porta el vector según la
reivindicación 15.
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