ES2761852T3 - Proteínas agonistas del receptor MET - Google Patents

Abstract

Proteína que contiene dos dominios peptídicos, llamados respectivamente K1a y K1b, comprendiendo cada uno de dichos dominios peptídicos K1a y K1b un dominio peptídico K1 del Factor de crecimiento hepatocítico/Factor de dispersión, consistiendo dicho dominio peptídico K1 en una secuencia con al menos el 80 % de identidad, preferentemente al menos el 90 % de identidad, con la SEQ ID NO: 1, siendo capaz dicha proteína de inducir la activación del receptor tirosina quinasa MET, con la condición de que dicha proteína no comprenda el dominio N-terminal del HGF/SF.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas agonistas del receptor MET

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a proteínas que comprenden dos dominios K1 del Factor de crecimiento hepatocítico/Factor de dispersión (HGF (forma siglada de Hepatocyte Growth Factor) / SF (forma siglada de Scatter Factor).

Estado de la técnica

El factor de crecimiento hepatocítico / factor de dispersión (HGF/SF) es una proteína secretada de 90 kDa con una estructura de dominios compleja que se sintetiza como un precursor inactivo y posteriormente se convierte por proteólisis en una especie activa de dos cadenas (a/p) (Nakamura, T., Structure and function of hepatocyte growth factor. Prog Growth Factor Res 3, 67-85 (1991); Holmes et al., Insights into the structure/function of hepatocyte growth factor/scatter factor from studies with individual domains. J Mol Biol 367, 395-408 (2007)). La cadena a consiste en un dominio N terminal (N) y cuatro copias del dominio kringle (K1, K2, K3 y K4). La cadena p es un dominio de homología con serina proteinasa (SPH, forma siglada de serine proteinase homology) catalíticamente inactivo. Se han identificado en HGF/SF dos sitios de unión al receptor: un sitio de alta afinidad ubicado en la región N-terminal de la cadena a y un sitio de baja afinidad ubicado en la cadena p.

HGF/SF es un potente factor de crecimiento y motilidad descubierto independientemente como un mitógeno hepático (factor de crecimiento hepatocítico, HGF) (Miyazawa et al., Molecular cloning and sequence analysis of cDNa for human hepatocyte growth factor. Biochem Biophys Res Commun 163, 967-973 (1989); Nakamura et al., Purification and subunit structure of hepatocyte growth factor from rat platelets. FEBS Lett 224, 311-316 (1998); Zarnegar et al., Purification and biological characterization of human hepatopoietin a, a polypeptide growth factor for hepatocytes. Cancer Res 49, 3314-3320 (1989)) y como un factor de motilidad epitelial derivado de fibroblastos (factor de dispersión, SF) (Stoker et al., Scatter factor is a fibroblast-derived modulator of epithelial cell mobility. Nature 327, 239-242 (1987); Gherardi et al., Purification of scatter factor, a fibroblast-derived basic protein that modulates epithelial interactions and movement. Proc Natl Acad Sci USA 86, 5844-5848 (1989)). Posteriormente, se demostró que el receptor de1HGF/SF es un receptor tirosina quinasa MET, codificado por un protooncogén (Bottaro et al., Identification of the hepatocyte growth factor as the c-met proto-oncogene product. Science 251, 802-804 (1991)).

Resulta interesante que el transcrito primario del HGF/SF codifica dos variantes por corte y empalme alternativo. La primera variante se produce por una terminación prematura de la traducción y genera la proteína NK1 que contiene el dominio N y el primer dominio Kringle (K1) del h Gf/SF. La proteína NK1 posee una marcada actividad agonista pero precisa una interacción con heparán sulfato para inducir la activación completa de MET. Estructuralmente, la proteína NK1 consiste en dos dominios globulares que, en presencia de heparina, forman un homodímero de "cabeza a cola", probablemente responsable de la dimerización y activación de MET (Chirgadze et al., Crystal structure of the NK1 fragment of HGF/SF suggests a novel mode for growth factor dimerization and receptor binding. Nat Struct Biol 6, 72­ 79 (1999). La segunda variante de corte y empalme, también generada por una terminación prematura, produce la proteína NK2, que contiene el dominio N y los dos primeros dominios kringle. NK2 se considera un antagonista natural de MET. De hecho, NK2 mantiene su capacidad de unión a MET, pero debido a sus propiedades conformacionales, carece de la capacidad de activar a MET. Sin embargo, las mutaciones dirigidas basadas en la estructura permiten que NK2 cambie de forma eficaz de antagonista MET a agonista, al reposicionar el dominio K1 en una conformación cercana a la de NK1.

Amén de muchos intentos de proponer un modelo de interacción unificado y convergente, los mecanismos de unión a MET del HGF/SF aún no están claros y son controvertidos. En particular, todavía no está disponible ninguna estructura cristalina de NK1 formando complejo con un dominio extracelular de MET soluble. HGF/SF es un ligando bivalente que contiene sitios de unión de afinidad alta y baja para MET, ubicados respectivamente en la región N-terminal de la cadena a (dominios N y/o K1) y en la cadena p (dominio SPH). La unión de1HGF/SF al ectodominio de MET en solución produce complejos con estequiometría 2:2 (Gherardi et al., Structural basis of hepatocyte growth factor/scatter factor and met signalling. Proc Natl Acad Sci USA 103, 4046-4051 (2006)). El dominio SPH se une a MET con una interfaz bien definida. Sin embargo, la localización del sitio de unión de NK1 en MET aún no está clara, y el modelo exacto de interacción HGF/SF-MET sigue siendo controvertido (Holmes et al., Insights into the structure/function of hepatocyte growth factor/scatter factor from studies with individual domains. J Mol Biol 367, 395-408 (2007); Stamos et al., Crystal structure of the HGF beta-chain in complex with the sema domain of the met receptor. The EMBO Journal 23, 2325-2335 (2004); Merkulova-Rainon et al., The N-terminal domain of hepatocyte growth factor inhibits the angiogenic behavior of endothelial cells independently from binding to the c-Met-receptor. J Biol Chem 278, 37400­ 37408 (2003)). HGF/SF y MET desempeñan papeles fisiológicos esenciales tanto en el desarrollo como en la regeneración de tejidos/órganos. En particular, h Gf/SF-MET es esencial para la regeneración del hígado y la piel después de la hepatectomía (se requiere Huh et al., Hepatocyte growth factor/c-met signaling pathway is required for efficient liver regeneration and repair. Proc Natl Acad Sci USA 101, 4477-4482 (2004); Borowiak et al., Met provides essential signals for liver regeneration. Proc Natl Acad Sci USA 101, 10608-10613 (2004)) y heridas superficiales (Chmielowiec et al., C-met is essential for wound healing in the skin. J Cell Biol 177, 151-162 (2007)). HGF/SF protege además al músculo cardíaco y esquelético del daño experimental (Urbanek et al., Cardiac stem cells possess growth factor-receptor systems that after activation regenerate the infarcted myocardium, improving ventricular function and long-term survival. Circ Res 97, 663-673 (2005)), retrasa la progresión de un modelo transgénico de enfermedad de neuronas motoras (Sun et al., Overexpression of HGF retards disease progression and prolongs life span in a transgenic mouse model of ALS. J Neurosci 22, 6537-6548 (2002)) y un modelo inmunológico de esclerosis múltiple (Bai et al., Hepatocyte growth factor mediates mesenchymal stem cell-induced recovery in multiple sclerosis models. Nature neuroscience 15, 862-870 (2012)). Conjuntamente, estos estudios destacan un vasto potencial de1HGF/SF en medicina regenerativa, un concepto respaldado por una serie de estudios preclínicos y clínicos más recientes.

En particular, muchas investigaciones se están concentrando en la síntesis de agonistas de1HGF/SF para permitir la regeneración de tejidos, especialmente para la regeneración del hígado después de una hepatectomía o de lesiones implicada en enfermedades con diabetes.

Dado que el conocimiento actual de las interacciones HGF/SF-MET no permite el diseño racional de los agonistas de MET de HGF/SF, la utilidad del HGF/SF se ha establecido utilizando el HGF/SF nativo, métodos de suministro de genes y agonistas de MET basados en NK1.

Sin embargo, el HGF/SF nativo es una proteína con difusión tisular limitada, lo que refleja su papel como un morfógeno tisular de acción local (Birchmeier et al., Met, metástasis, mobility and more. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915-925 (2003); Ross et al., Protein Engineered Variants of Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor Promote Proliferation of Primary Human Hepatocytes and in Rodent Liver. Gastroenterology 142, 897-906 (2012)). De hecho, después de la administración local o sistémica, el HGF/SF es inmovilizado por el heparán sulfato presente en la matriz extracelular, dando como resultado una difusión severamente disminuida hacia los receptores MET en tejidos más distantes (Roos et al., Induction of liver growth in normal mice by infusion of hepatocyte growth factor/scatter factor. The American Journal of Physiology 268, G380-386 (1995); Hartmann et al., Engineered mutants of HGF/SF with reduced binding to heparan sulfate proteoglycans, decreased clearance and enhanced activity in vivo. Curr Biol 8, 125-134 (1998)). Además, el HGF/SH nativo es también difícil y muy costoso de producir debido a su compleja estructura de multidominios.

Los métodos de suministro de genes, entre ellos la inyección intramuscular de ADN desnudo que codifica e1HGF/SF, aborda varios de los problemas asociados con el uso del HGF/SF nativo como proteína terapéutica (por ejemplo, el coste de producción de la proteína HGF/SF). Actualmente, se realizan ensayos clínicos con ADN de HGF/SF en pacientes con neuropatía diabética periférica y en pacientes con esclerosis lateral amiotrófica. Los resultados de estos estudios se esperan con interés, pero siguen existiendo limitaciones con los métodos actuales de suministro de genes en términos del logro de niveles terapéuticos estables de los productos génicos y la disponibilidad relativa en el ámbito de los tejidos y órganos específicos, debido a la difusión limitada. Por ejemplo, tales métodos de suministro de genes se basan en sistemas de suministro de plásmidos (solicitudes de patente Wo 2009/093880, WO 2009/125986 y WO 2013/065913) o sistemas de suministro basados en adenovirus (Yang et al. Improvement of heart function in postinfarct heart failure swine models after hepatocyte growth factor gene transfer: comparison of low-, medium- and high-doses groups. Mol Biol Rep 37, 2075-2081 (2010)).

Los agonistas de MET basados en NK1 disponibles actualmente, tales como 1K1 (es decir un mutante de NK1), tienen una fuerte actividad agonista y ofrecen ventajas sobre HGF/SF (Lietha et al., Crystal structures of NK1-heparin complexes reveal the basis for NK1 activity and enable engineering of potent agonists of the MET receptor. The EMBO journal 20, 5543-5555 (2001) y patente de Estados Unidos 7.179.786). A diferencia de1HGF/SF nativo, este mutante de NK1 puede producirse de forma eficaz en sistemas de expresión heterólogos, es estable en tampones fisiológicos y, por lo tanto, se puede administrar con control total sobre la dosificación y la concentración plasmática. Sin embargo, una posible limitación de NK1 es su fuerte afinidad residual por el heparán sulfato que impide la difusión tisular. El documento WO 2011/116396 A2 está relacionado con fragmentos de factores de crecimiento de hepatocitos que funcionan como potentes agonistas y antagonistas del receptor MET. En particular, se describe que el fragmento NK1 del factor de crecimiento hepatocitario se une y activa el receptor MET, una receptor tirosina quinasa transmembrana que desempeña un papel fundamental en el desarrollo y la formación de órganos embrionarios.

El documento Cassie J. LIU et al. ("An engineered dimeric fragment of hepatocyte growth factor is a potent c-MET agonist" FEBS LETTERS, vol. 588, n.° 24, 21 de noviembre de 2014, páginas 4831-4837) está relacionado con un fragmento del HGF genomanipulado (eNK1) que posee una estabilidad y un rendimiento de expresión aumentados, y con un agonista de c-MET desarrollado mediante el acoplamiento de eNK1 a través de un resto de cisteína introducido. Más particularmente, se divulga la caracterización de este dímero de eNK1, así como su capacidad para suscitar una activación de c-MET, migración celular y proliferación significativamente mayores que el monómero eNK1. El documento US 2009/215686 A1 está relacionado con un polipéptido basado en NK1 con una o más sustituciones conservativas de aminoácidos, en donde el polipéptido modula la actividad de MET en comparación con NK1 de tipo silvestre. Además, se divulga un método para diseñar un antagonista mediante la conversión de un factor de crecimiento de un agonista de receptor tirosina quinasa en un antagonista, en donde el receptor nativo se dimeriza u oligomeriza para volverse activo.

Por lo tanto, existe la necesidad de potentes agonistas de MET con una estabilidad mejorada, una vida útil mejorada, una biodisponibilidad óptima, y que pueda producirse con un bajo coste y administrarse fácilmente.

Objeto de la invención

Uno de los objetivos de la invención es proporcionar una proteína capaz de inducir la activación del receptor tirosina quinasa MET.

Otro objetivo de la invención es, además, proporcionar composiciones que contengan dicha proteína. Otro objetivo de la invención se refiere adicionalmente al uso de dicha proteína, en particular para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas.

La presente invención se refiere a una proteína que contiene dos dominios peptídicos, llamados respectivamente K1^a y K1^b, comprendiendo cada uno de dichos dominios peptídicos K1^a y K1^b un dominio peptídico K1 (Kringle 1) del Factor de crecimiento hepatocítico/Factor de dispersión (HGF/SF),

consistiendo dicho dominio peptídico K1 en una secuencia con al menos el 80 % de identidad, preferentemente al menos el 90 % de identidad, con la SEQ ID NO: 1,

siendo capaz dicha proteína de inducir la activación del receptor tirosina quinasa MET.

La presente solicitud se basa en la observación inesperada en dos frentes realizada por los inventores de que el dominio K1 constituye el componente básico para agonistas de MET potentes y que es posible diseñar técnicamente dímeros de K1 con una potente actividad agonista de MET.

En la invención, las expresiones "K1^a " y "K1^b " se refieren todas a una secuencia peptídica que comprende el dominio K1 del HGF/SF.

La proteína de la invención es un dímero covalente del dominio K1 del HGF/SF, es decir dos dominios K1 están unidos covalentemente entre sí por una cadena de aminoácidos. La proteína de la invención puede designarse por la expresión "K1K1".

En particular, la invención se refiere a una proteína que contiene dos dominios peptídicos, llamados respectivamente K1^a y K1 ^b, comprendiendo cada uno de dichos dominios peptídicos K1^a y K1^b un dominio peptídico K1 (Kringle 1) del Factor de crecimiento hepatocítico/Factor de dispersión (h Gf/SF), consistiendo dicho dominio peptídico K1 en una secuencia con al menos el 80 % de identidad, preferentemente al menos el 90 % de identidad, con la SEQ ID NO: 1, siendo capaz dicha proteína de inducir la activación del receptor tirosina quinasa MET, con la condición de que dicha proteína no comprenda el dominio N-terminal del HGF/SF.

La proteína de la invención tiene muchas ventajas técnicas y financieras.

La ventaja técnica más importante es que la proteína de la invención tiene una potente actividad agonista de MET. Por lo tanto, esta proteína es capaz de activar el receptor MET y/o de inducir cualquier fenotipo asociado a la activación de MET en diversos ensayos in vitro e in vivo.

La proteína tiene una actividad agonista de MET si es capaz de:

- unirse al receptor MET,

- activar la fosforilación de MET y la señalización aguas abajo en las células, e

- inducir al menos un fenotipo celular tal como la supervivencia, proliferación, morfogénesis y/o migración.

La validación de estos criterios se puede demostrar utilizando pruebas de interacción proteína-proteína (tales como RPS (resonancia de plasmón superficial), AlphaScreen, técnica de precipitación o cromatografía de filtración en gel), pruebas de fosforilación (tales como transferencia de western, ELISA o AlphaScreen) y pruebas fenotípicas (tales como dispersión, ensayo de MTT o morfogénesis inducida por Matrigel™).

Por ejemplo, se puede analizar la activación de MET y la señalización aguas abajo en las células in vitro mediante transferencia de Western y cuantificar mediante estrategias de fluorescencia con resolución temporal homogénea (HTRF, forma siglada de homogeneous time resolved fluorescence). In vivo, también es posible analizar la angiogénesis local y la protección de ratones frente a la hepatitis fulminante inducida por Fas.

Otra ventaja técnica es que la proteína de la invención se puede administrar con control total sobre la dosificación y/o la concentración plasmática.

Además, una de las principales desventajas del HGF/SF nativo es el hecho de que se une fuertemente al heparán sulfato en la matriz extracelular. Esto limita severamente la difusión de la molécula a sitios más distantes. Por el contrario, a la proteína de la invención le falta el sitio de heparán sulfato de alta afinidad.

Por lo tanto, la proteína no se ve inmovilizada por las cadenas de heparán sulfato de la matriz extracelular, contrariamente al HGF/SF. Por lo tanto, cuando se inyecta en un paciente, la proteína de la invención puede difundir desde el área de inyección hacia los receptores MET en tejidos distantes, mientras que e1HGF/SF nativo no puede hacerlo. Esto se demuestra mediante experimentos in vivo en ratones. Sin embargo, la presencia de un sitio de unión a heparina de baja afinidad en el dominio kringle permite una purificación eficaz a través de cromatografía de afinidad de heparina-sepharose.

Algunas de las ventajas financieras son que la proteína de la invención se puede producir fácilmente en grandes cantidades a bajo coste. De hecho, la proteína se puede producir de forma recombinante en células hospedadoras utilizadas como sistemas de expresión, tales como bacterias o levaduras.

En una realización, la presente invención se refiere a una proteína que contiene dos dominios peptídicos de 70 a 100 aminoácidos, llamados respectivamente K1^a y K1^b, comprendiendo cada uno de dichos dominios peptídicos K1^a y K1^b un dominio peptídico K1 (Kringle 1) del Factor de crecimiento hepatocítico/Factor de dispersión (HGF/SF), consistiendo dicho dominio peptídico K1 en una secuencia con al menos el 80 % de identidad, preferentemente al menos el 90 % de identidad, con la SEQ ID NO: 1,

siendo capaz dicha proteína de inducir la activación del receptor tirosina quinasa MET.

En una realización, la presente invención se refiere a una proteína que contiene dos dominios peptídicos de 70 a 100 aminoácidos, llamados respectivamente K1^a y K1^b, comprendiendo cada uno de dichos dominios peptídicos K1^a y K1^b un dominio peptídico K1 (Kringle 1) del Factor de crecimiento hepatocítico/Factor de dispersión (HGF/SF), consistiendo dicho dominio peptídico K1 en una secuencia con al menos el 80 % de identidad, preferentemente al menos el 90 % de identidad, con la SEQ ID NO: 2,

siendo capaz dicha proteína de inducir la activación del receptor tirosina quinasa MET.

En una realización, la presente invención se refiere a una proteína que contiene dos dominios peptídicos, llamados respectivamente K1^a y K1^b, comprendiendo o consistiendo cada uno de dichos dominios peptídicos K1^a y K1^b en una secuencia de 70 a 100 aminoácidos con al menos el 80 % de identidad, preferentemente al menos el 90 % de identidad con la SEQ ID NO:1,

siendo capaz dicha proteína de inducir la activación del receptor tirosina quinasa MET.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde el tamaño de cada uno de dichos dominios peptídicos K1a y K1b es al menos de 70 aminoácidos, preferentemente de al menos 74 aminoácidos, más preferentemente de al menos 79 aminoácidos.

En particular, el tamaño de K1^a y/o K1^b es de 70 a 100 aminoácidos. Dicho dominio peptídico K1 puede consistir en 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 aminoácidos.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde los dominios peptídicos K1^a y K1^b son idénticos.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde los dominios peptídicos K1^a y K1^b son distintos entre sí.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde cada uno de los dominios peptídicos K1^a y K1^b consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde cada uno de los dominios peptídicos K1^a y K1^b consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde cada uno de los dominios peptídicos K1^a y K1^b consiste en una secuencia de aminoácidos elegida entre las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

En una realización, la presente invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde dichos dominios peptídicos K1^a y/o K1^b comprenden al menos una adición, deleción o sustitución de un aminoácido con respecto a la SEQ ID NO: 1,

consistiendo los dominios peptídicos K1 de K1^a y K1^b en una secuencia con al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.

En una realización, la presente invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde dichos dominios peptídicos K1^a y/o K1^b comprenden al menos una sustitución del aminoácido K en la posición 5 y/o el aminoácido R en la posición 7 con respecto a la SEQ ID NO: 1,

consistiendo los dominios peptídicos K1 de K1^a y K1^b en una secuencia con al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.

En una realización, la presente invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde dichos dominios peptídicos K1^a y/o K1^b comprenden al menos una sustitución elegida entre K5E y R7E con respecto a la SEQ ID NO: 1,

consistiendo los dominios peptídicos K1 de K1^a y K1^b en una secuencia con al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.

En una realización, la presente invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde cada uno de dichos dominios peptídicos K1^a y K1^b comprenden las sustituciones K5E y R7E con respecto a la SEQ ID NO: 1, consistiendo cada dominio peptídico K1 en una secuencia con al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia del dominio K1 humano, es decir la región desde el aminoácido en la posición 128 hasta la posición de aminoácido 206 del HGF/SF representado por la SEQ ID NO: 12.

La SEQ ID NO: 1 tiene un tamaño de 79 aminoácidos y está flanqueada por dos cisteínas.

La SEQ ID NO: 2 corresponde a la variante del dominio K1 humano en el que faltan 5 aminoácidos.

Tabla 1. Secuencias del HGF/SF los dominios K1.

La variante del dominio K1 humano, representado por la SEQ ID NO: 2, difiere del dominio K1 humano, representado por la SEQ ID NO: 1, por una deleción de 5 aminoácidos consecutivos: SFLPS.

K1 ^a y K1^b pueden consistir en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o en una secuencia de aminoácidos con al menos el 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.

La "identidad porcentual" entre dos secuencias peptídicas, como se define en la presente invención, se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima, a través de una ventana de comparación. La secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender, así, adiciones o deleciones (por ejemplo, "huecos") con respecto a la secuencia de referencia (que no incluye estas adiciones o deleciones), para obtener un alineamiento óptimo entre las dos secuencias.

El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones en las que un resto de aminoácido es idéntico en las dos secuencias comparadas y dividiendo este número por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por cien para obtener el porcentaje identidad de dos secuencias de aminoácidos entre sí.

El porcentaje de identidad se determina sobre la secuencia de aminoácidos completa del dominio K1 humano (SEQ ID NO: 1). Para alineamientos locales, es particularmente útil el algoritmo de Smith-Waterman (Smith T F, Waterman M S (1981) J. Mol. Biol. 147(1); 195-7).

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde cada uno de los dominios peptídicos K1^a y K1^b está codificado por una secuencia de ácido nucleico elegida entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4.

La SEQ ID NO: 3 corresponde a la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 4 corresponde a la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: Tabla 2. Secuencias de ácido nucleico ue codifican los dominios K1.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, comprendiendo dicha proteína un enlazador peptídico que conecta a K1^a y K1^b.

La presente invención se refiere a una proteína que consiste en dos dominios peptídicos, llamados respectivamente K1^a y K1^b, conectados entre sí por un enlazador peptídico,

comprendiendo cada uno de dichos dominios peptídicos K1^a y K1^b un dominio peptídico K1 (Kringle 1) del Factor de crecimiento hepatocítico/Factor de dispersión (HGF/SF),

consistiendo dicho dominio peptídico K1 en una secuencia con al menos el 80 % de identidad, preferentemente al menos el 90 % de identidad, con la SEQ ID NO: 1,

siendo capaz dicha proteína de inducir la activación del receptor tirosina quinasa MET.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde dicho enlazador peptídico está constituido por 1 a 50 aminoácidos, preferentemente de 10 a 20 aminoácidos.

En particular, el tamaño del enlazador es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 aminoácidos.

En una realización, el tamaño del enlazador es de 4 aminoácidos.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde dicho enlazador peptídico comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 (SEVE).

El enlazador peptídico SEQ ID NO: 5 puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 6 (TCAGAAGTT- GAA).

En una realización, la invención se refiere a una proteína que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos con al menos el 80 %, preferentemente el 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 7.

En una realización, la invención se refiere a una proteína que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoácidos con al menos el 80 %, preferentemente el 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 8.

Tabla 3. Secuencias de las roteínas K1K1.

La SEQ ID NO: 7 está constituida, del extremo N al extremo C, por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 8 está constituida, del extremo N al extremo C, por la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 2.

En una realización, la proteína de la invención comprende una etiqueta escindible, tal como una etiqueta de polihistidina en sus extremos N-terminal y / o C-terminal. Dicha etiqueta de polihistidina se puede utilizar para permitir la purificación por afinidad de proteínas etiquetadas.

En una realización, la invención se refiere a una proteína que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9.

T l 4. n i n r ín K1K1 i f rm - rmin l.

Tabla 5. Variantes de K1K1.

La SEQ ID NO: 13 corresponde a una proteína K1K1 sin etiqueta de histidina.

La SEQ ID NO: 14 corresponde a una proteína K1K1 de la invención en donde el enlazador SEVE se ha reemplazado por una secuencia de 17 aminoácidos (GGGGSLVPRGSGGGGS, SEQ ID NO: 17), como un enlazador flexible. Este enlazador alargado contiene un sitio de escisión para la trombina (LVPRGS, SEQ ID NO: 18) que permite la separación de los dos dominios K1.

La SEQ ID NO: 15 corresponde a una proteína K1K1 de la invención en donde el enlazador SEVE se ha reemplazado por un enlazador GS (GSGGS, SEQ ID NO: 19) que no presenta ninguna restricción estructural. La SEQ ID NO: 16 corresponde a una proteína K1K1 de la invención en donde se han introducido las siguientes mutaciones: K10E, R12E, K93E y R95E. Las mutaciones K10E y R12E son parte del primer dominio kringle, y K93E y R95E son parte del segundo dominio kringle. Los restos K10, R12, K93 y R95 que se tienen como objetivo son parte de una porción del dominio K1 con carga positiva, que interactúa con la heparina. Dado que se predice que esta construcción tiene una afinidad reducida por la heparina, se añade una etiqueta de hexa-histidina en el C-terminal para permitir la purificación por cromatografía de afinidad de níquel.

En particular, la invención se refiere a una proteína que comprende o que consiste en:

- una secuencia de aminoácidos elegida entre la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:

15 y SEQ ID NO: 16, o

- una secuencia de aminoácidos con al menos el 80 %, preferentemente, el 90 % de identidad con una secuencia elegida entre la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16.

En particular, una proteína de la invención comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una secuencia elegida entre la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16.

En particular, la invención se refiere a una proteína que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos elegida de la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, siendo dicha proteína una proteína sintética o recombinante.

En la invención, una "proteína sintética" es una proteína que se sintetiza utilizando métodos clásicos de química orgánica, tales como síntesis en fase líquida o sólida.

En la invención, una "proteína recombinante" es una proteína es resultado de la ingeniería genética. Una construcción genética puede insertarse en un vector y expresarse en células hospedadoras, tales como bacterias o levaduras, utilizando técnicas clásicas de biología molecular para obtener la proteína recombinante.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde la activación del receptor tirosina quinasa MET es independiente de heparán sulfato.

En condiciones in vivo, el HGF/SF es inmovilizado por las cadenas de heparán sulfato presentes en la matriz extracelular, dando como resultado una difusión y/o distribución tisular severamente reducidas. A la proteína de la invención le falta el sitio de unión a heparán sulfato de alta afinidad (dominio N) y, por lo tanto, puede difundirse hacia los receptores MET en tejidos distantes.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, en donde dicha proteína es capaz de unirse al receptor tirosina quinasa MET con una constante de disociación K^d < 200 nM, preferentemente < 100 nM, más preferentemente < 10 nM.

En particular, dicha proteína es capaz de unirse al receptor tirosina quinasa MET con una constante de disociación K^d < 200 nM, < 150 nM, < 100 nM, < 90 nM, < 80 nM, < 70 nM, < 60 nM, < 50 nM, < 40 nM, < 30 nM, < 10 nM o < 5 nM.

En otro aspecto, la invención también se refiere a un procedimiento para obtener una proteína que comprende al menos dos dominios peptídicos K1, como se ha definido anteriormente, que comprende las etapas de:

- insertar una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína recombinante que contiene al menos dos dominios peptídicos K1, que contiene preferentemente dos dominios peptídicos K1, en un vector de expresión, - clonar dicho vector en una célula hospedadora y expresar dicha proteína recombinante,

- extraer y purificar dicha proteína recombinante, siendo dicha proteína recombinante una proteína que comprende al menos dos dominios K1.

En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de la invención, consistiendo preferentemente dicho ácido nucleico en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 10.

T l . Á i n l i ifi n r ín K1K1 i f rm - rmin l.

La secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 10 codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9.

En otro aspecto, la invención se refiere a un vector de expresión que contiene una molécula de ácido nucleico como se define anteriormente, comprendiendo o consistiendo dicho vector preferentemente en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 11.

T l 7. V r x r i n ifi n r ín K1K1.

continuación

continuación

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula hospedadora que contiene un vector de expresión como se define anteriormente, eligiéndose dicha célula hospedadora preferentemente del grupo que consiste en células de levadura y células bacterianas.

En otro aspecto, la invención también se refiere a una composición que comprende:

- una proteína como se define anteriormente, o

- una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína, o

- un vector de expresión que contiene dicha molécula de ácido nucleico, o

- una célula huésped que contiene dicho vector de expresión.

En otro aspecto, la invención se refiere además a una proteína como se define anteriormente, para su uso en un método de diagnóstico in vivo.

Debido a su capacidad para unirse a MET, la proteína de la invención representa una herramienta valiosa para métodos de diagnóstico, en particular para patologías que implican la expresión de las moléculas HGF/SF y MET.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, para su uso en un método de diagnóstico de una patología elegida entre: cánceres, enfermedades de los órganos con epitelio, incluyendo enfermedades hepáticas agudas y crónicas, enfermedades renales agudas y crónicas, enfermedades pulmonares crónicas y heridas superficiales crónicas, enfermedades del sistema nervioso central, incluyendo enfermedades neuronales y esclerosis, insuficiencias cardíacas isquémicas, vasculopatías periféricas, diabetes y complicaciones asociadas tales como neuropatías periféricas.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, para su uso en un método de diagnóstico in vivo de una patología elegida entre: cánceres, enfermedades de los órganos con epitelio, incluyendo enfermedades hepáticas agudas y crónicas, enfermedades renales agudas y crónicas, enfermedades pulmonares crónicas y heridas superficiales crónicas, enfermedades del sistema nervioso central, incluyendo enfermedades neuronales y esclerosis, insuficiencias cardíacas isquémicas, vasculopatías periféricas, diabetes y complicaciones asociadas tales como neuropatías periféricas.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, para su uso en un método de diagnóstico in vivo, en donde dichos cánceres son tumores que expresan el receptor tirosina quinasa MET.

En otro aspecto, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, para su uso en diagnóstico médico por la imagen.

En otro aspecto, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, para su uso en diagnóstico médico por la imagen in vivo.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, para su uso en diagnóstico médico por la imagen, en donde dicha proteína permite la detección y/o el seguimiento de fármacos y/o agentes para la obtención de imágenes.

En particular, la proteína de la invención puede utilizarse en cirugía guiada por imagen. La obtención de imágenes pre e intraoperatorias se utilizan actualmente para ayudar a los cirujanos en el posicionamiento cuidadoso de las herramientas quirúrgicas, así como para guiar la extracción completa de tejido específico. Las sondas fluorescentes (IR/IRC) se pueden usar para la obtención de imágenes en vivo durante la operación.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una proteína como se define anteriormente, como una herramienta de diagnóstico in vitro.

En una realización, la invención se refiere al uso de una proteína como se define anteriormente para el diagnóstico de una patología in vitro, eligiéndose dicha patología entre: cánceres, enfermedades de los órganos con epitelio, incluyendo enfermedades hepáticas agudas y crónicas, enfermedades renales agudas y crónicas, enfermedades pulmonares crónicas y heridas superficiales crónicas, enfermedades del sistema nervioso central, incluyendo enfermedades neuronales y esclerosis, insuficiencias cardíacas isquémicas, vasculopatías periféricas, diabetes y complicaciones asociadas tales como neuropatías periféricas.

En una realización, la invención se refiere al uso de la proteína para diagnóstico de una patología in vitro, como se define anteriormente, en donde dichos cánceres son tumores que expresan el receptor tirosina quinasa MET.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una proteína de la invención para la obtención de imágenes in vitro o ex vivo.

En métodos de diagnóstico y el diagnóstico médico por la imagen, la proteína puede detectarse y cuantificarse en muestras biológicas mediante dosificación (por ejemplo, utilizando una biopsia) o mediante fotografías (obtenidas de tecnologías como la tomografía PET o RMN).

De hecho, la proteína de la invención puede marcarse con un marcador, y permite la detección, localización y cuantificación de los receptores MET.

Por ejemplo, la proteína puede marcarse con radiofármacos indicadores o indicadores fluorescentes.

Dichos radiofármaco indicadores incluyen, pero sin limitación, Calcio-47, Carbono-11, Carbono-14, Cromo-51, Cobalto-57, Cobalto-58, Erbio-169, Flúor-18, Galio-67, Galio-68, Hidrógeno-3, Indio-111, Yodo-123, Yodo-125, Yodo-131, Hierro-59, Criptón-81m, Nitrógeno-13, Oxígeno-15, Fósforo-32, El radio-223, Rubidio-82, Samario-153, Selenio-75, Sodio-22, Sodio-24, Estroncio-89, Tecnecio-99m, Talio-201, Xenón-133 e Itrio-90. Dichos indicadores fluorescentes incluyen, pero sin limitación, colorantes fluorescentes (tales como derivados de rodamina, derivados de cumarina, derivados de fluoresceína, ...) o proteínas fluorescentes (como GFP (verde), YFP (amarillo), RFP (rojo) o proteína fluorescente en el infrarrojo cercano basada en fitocromo (iRFP).

En particular, los colorantes y las proteínas fluorescentes en el infrarrojo (IR) e infrarrojo cercano (IRC) son indicadores preferentes para la obtención de imágenes in vivo, debido a una penetración aumentada y una autofluorescencia reducida.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para el diagnóstico de una patología in vivo, que comprende una etapa de administrar a un paciente una proteína como se define anteriormente, eligiéndose dicha patología entre: cánceres, enfermedades de los órganos con epitelio, incluyendo enfermedades hepáticas agudas y crónicas, enfermedades renales agudas y crónicas, enfermedades pulmonares crónicas y heridas superficiales crónicas, enfermedades del sistema nervioso central, incluyendo enfermedades neuronales y esclerosis, insuficiencias cardíacas isquémicas, vasculopatías periféricas, diabetes y complicaciones asociadas tales como neuropatías periféricas.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de diagnóstico médico por la imagen, que comprende una etapa de administrar a un paciente una proteína como se define anteriormente.

En una realización, la invención se refiere a un método para el diagnóstico médico por la imagen, en donde dicha proteína permite la detección del receptor tirosina quinasa MET.

En una realización, la invención se refiere a un método para el diagnóstico médico por la imagen, en donde dicha proteína permite el predireccionamiento de un anticuerpo.

De hecho, la proteína de la invención se puede unir a un anticuerpo que reconoce un epítopo específico de un indicador.

En otro aspecto, la invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende:

- una proteína como se define anteriormente o

- una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína, o

- un vector de expresión que contiene dicha molécula de ácido nucleico, o

- una célula hospedadora que contiene dicho vector de expresión, y

un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención se refiere además a una proteína como se define anteriormente, para su uso como un medicamento.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, para su uso en el tratamiento de lesiones tisulares mediante el estímulo de la supervivencia celular o de la regeneración tisular.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, para su uso en el tratamiento de una patología elegida entre: enfermedades de los órganos con epitelio, incluyendo enfermedades hepáticas agudas y crónicas, enfermedades renales agudas y crónicas, enfermedades pulmonares crónicas y heridas superficiales crónicas, enfermedades del sistema nervioso central, incluyendo enfermedades neuronales y esclerosis, insuficiencias cardíacas isquémicas, vasculopatías periféricas, diabetes y complicaciones asociadas tales como neuropatías periféricas.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, para su uso en el tratamiento de lesiones tisulares o para su uso en el tratamiento de una patología como se define anteriormente, siendo administrable dicha proteína a una dosis comprendida aproximadamente de 1 mg/kg a 1.000 mg/kg, preferentemente de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg.

En una realización, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente, para su uso en el tratamiento de lesiones tisulares o para su uso en el tratamiento de una patología como se define anteriormente, utilizándose dicha proteína en una forma susceptible de ser administrada por vía oral o intravenosa a una dosis unitaria compuesta de 1 mg a 1.000 mg, en particular de 10 mg a 1.000 mg, en particular de 100 a 1.000 mg.

En otro aspecto, la invención también se refiere al uso de la proteína como se define anteriormente para estimular la angiogénesis, en condiciones in vivo, ex vivo o in vitro.

Debido a su potente actividad agonista de MET, la proteína de la invención puede usarse para comprender el mecanismo de interacción entre MET y HGF/SF.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una proteína como se define anteriormente, como una herramienta de investigación in vitro.

En otro aspecto, la invención también se refiere a un complejo molecular entre una proteína como se define anteriormente y un receptor tirosina quinasa MET, formando complejo dicha proteína con dicho receptor tirosina quinasa MET mediante al menos dos dominios K1.

La invención se explicará mejor mediante las siguientes figuras y ejemplos. En cualquier caso, los siguientes ejemplos no deben considerarse como restrictivos del alcance de la invención.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS

Figura 1. Plásmido utilizado para la expresión de K1K1 en E. coli. Las dos copias del dominio K1 (aa 128-206) del HGF/SF están dispuestas en orientación de cabeza a cola (en tándem) y se expresan bajo el control del promotor lac.

Figura 2. Purificación por HisTrap de la proteína K1K1 a partir de cuerpos de inclusión de un cultivo de E. coli BL21. (a) Perfil de elución. Las fracciones correspondientes al pico principal de proteína unida a HisTrap (barra negra) (6, 7, 8, 9 y 10) se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y se muestran en (b).

Figura 3. Cromatografía de exclusión por tamaño de la proteína K1K1. Las fracciones correspondientes al pico principal de la columna His-Trap (Figura 2) se agruparon, se concentraron y se cargó una alícuota en una columna Superdex (a). Las fracciones de los tres picos se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras (b) o reductoras (c). Ambos picos 2 y 3 contienen, de forma predominante, la proteína K1K1 (el pico 2 contiene un dímero de dímeros mientras que el pico 3 contiene el dímero esperado). El gel no reductor muestra la purificación HisTrap de prelavado de la proteína K1K1 de los cuerpos de inclusión.

Figura 4. Cromatografía de intercambio catiónico de la proteína K1K1. Las fracciones correspondientes al pico principal procedente de la columna His-Trap (Figura 2) se agruparon, se concentraron y se cargó una alícuota en una columna Resource-S de 1 ml (a). El material no unido (pico 1) así como las fracciones eluidas con un gradiente de NaCl se analizaron en cuanto a la actividad biológica en el ensayo de dispersión de colonias de MDCK. Toda la actividad se recuperó en el pico 2.

Figura 5. Análisis de señalización de MET tras la estimulación con K1K1. Se trataron células HeLa con HGF/SF (HGF) 100 y 500 pM, K1K1 1, 10 y 100 nM y NK1 1, 10 y 100 nM. Después, se analizaron los lisados celulares mediante transferencia de western específica para MET total, Akt y ERK o fosfo-MET, fosfo-Akt y fosfo-ERK. Control: DMEM STF (suero de ternera fetal) al 0,1 %.

Figura 6. Activación de MET-Fc-K1K1 y ERK/Akt por ALPHAscreen®. (a) MET-Fc-K1K1 por Alphascreen. Se realizaron ensayos de titulación cruzada para la unión de K1K1 a la proteína MET-Fc recombinante en placas de microtitulación de 384 pocillos. Las concentraciones finales fueron de 0-300 nM para K1K1, 0-10 nM para MET-Fc, 10 |jg/ml para las perlas donantes recubiertas con estreptavidina y perlas aceptadoras conjugadas con proteína A. (b) Fosforilación de Akt y ERK mediante ensayo cuantitativo ALPHA. Las células se sembraron en placas, se estimularon con distintos agonistas (HGF/SF, n K1, K1K1 y K1B (K1 biotinilada), y después se lisaron en la misma placa de cultivo de 96 pocillos. Se añadieron e incubaron durante 2 horas cuentas aceptadoras y donantes ALPH AScreen® SureFire® Ultra™. La intensidad de la señal emitida se midió utilizando configuraciones de Alpha convencionales en un lector de placas EnSpire® Multimode (PerkinElmer).

Figura 7. Análisis de señalización de MET tras la estimulación con K1K1. Se trataron células HeLa con HGF/SF 100 pM, K1K1 100 nM o NK1 100 nM, durante 1, 5, 10 o 20 min. Después, se analizaron los lisados celulares mediante transferencia de western específica para MET total, Akt y ERK o fosfo-MET, fosfo-Akt y fosfo-ERK.

Figura 8. Actividad biológica de la proteína K1K1. Se analizó la actividad de dispersión de colonias de MDCK de la proteína K1K1 (agrupamiento de HisTrap) y se comparó con la de HGF/SF de longitud completa y NK1 purificadas recombinantes. Los datos son medias ± desviaciones típicas de 5 (HGF/SF), 7 (K1K1) y 7 (NK1) experimentos, respectivamente.

Figura 9. Fenotipos celulares inducidos por la proteína K1K1 (ensayo de dispersión celular). Los islotes de células aisladas de MDCK se incubaron en medios de cultivo con 100 pM de HGF/SF, NK1 100 nM, K1K1 100 nM. Después, las células se tiñeron y se observaron al microscopio (con un aumento de 100x).

Figura 10. Fenotipos celulares inducidos por la proteína K1K1 (ensayo de morfogénesis de Matrigel™). Se sembraron células MDCK sobre una capa de Matrigel™ y se trataron con HGF/SF 100 pM, NK1 100 nM y K1K1 100 nM. A continuación, las células se observaron al microscopio con un aumento de 40x o 100x, después de un día de cultivo (a) y después de dos días de cultivo (b).

Figura 11. Fenotipos celulares (ensayo MTT). Se cultivaron células MDCK durante una noche (15 h) en medio con o sin anisomicina (0,7 jM ) y en presencia de HGF/SF (HGF) 500 pM, K1K1 100 nM y NK1 100 nM. Después, se realizó un ensayo MTT para evaluar la supervivencia celular. Los resultados se expresan como del porcentaje de control no tratado. Se realizó una prueba de ANOVA para comparar las 3 medias, considerando estadísticamente significativo un valor de p de < 0,05. Se realizaron pruebas de ANOVA para comparar todas las medias, y se consideró un valor p <0,001 para indicar una diferencia estadísticamente significativa.

Figura 12. Análisis de señalización de MET tras la estimulación con K1K1. (A) Se trataron células HeLa con HGF/SF (HGF) 500 pM, K1K1 1 nM, variante 11 nM, variante 2 1 nM, variante 31 nM y NK1 1 y 100 nM. (B) Se trataron células HeLa con HGF/SF (HGF) 10, 100 y 500 pM, Variante 1100, 500 y 1000 pM, y K1K1 100, 500 y 1000 pM. Después, se analizaron los lisados celulares mediante transferencia de western específica para MET total, Akt y ERK o fosfo-MET, fosfo-Akt y fosfo-ERK. Control: Monómero de K1.

Figura 13. Fosforilación de Akt y ERK mediante ensayo cuantitativo ALPHA. Las células se sembraron en placas, se estimularon con concentraciones crecientes de diversos agonistas (HGF/SF, NK1, K1K1 y variantes 1, 2 y 3) durante 10 minutos, y después se lisaron en la misma placa de cultivo de 96 pocillos. Se añadieron las mezclas de reacción del ALPHAScreen® SureFire® y se incubaron durante 2 horas de acuerdo con el protocolo del fabricante (TGRES500 y TGRA4S500). La intensidad de la señal emitida se midió utilizando configuraciones de Alpha convencionales en un lector de placas EnSpire® Multimode (PerkinElmer).

Figura 14. Fenotipos celulares inducidos por la proteína K1K1 (ensayo de dispersión celular). Los islotes de células aisladas de MDc K se incubaron en medios de cultivo con 500 pM de HGF/SF, K1K1 1, 10 y 100 nM, K1K1 variante 1, 2 y 3 10 nM, y K1 monómero 100 nM. Después, las células se tiñeron y se observaron al microscopio (100x). Control: DMEM STF al 10 %.

Figura 15. Fenotipos celulares inducidos por la proteína K1K1 (ensayo de morfogénesis de Matrigel™). Se sembraron células MDCK sobre una capa de Matrigel™ y se trataron con HGF/SF 1 nM, NK1 100 nM, K1K1 variante 1, 2 o 3 100 nM, y monómero de K1 100 nM. A continuación, las células se observaron al microscopio (40x), después de uno (A), dos (B) y tres (C) días de cultivo. Control: DMEM STF al 10 %.

Figura 16. Fenotipos celulares inducidos por la proteína K1K1 (ensayo de morfogénesis tridimensional de Matrigel™). Se sembraron células MDCK en capa de Matrigel™ de colágeno tipo 1 y se añadió sobre la capa medio de cultivo que contenía HGF/SF (HGF) 1 nM, K1K1 100 nM, K1K1 variante 1100 nM y monómero de K1 100 nM. Las células se fijaron, tiñeron y después se observaron al microscopio (100x). Control: DMEM STF al 10 %.

Figura 17. Activación de MET in vivo por K1K1 variante 1 (sin etiqueta). Se inyectaron ratones (i.v.) con 5 |jg de monómero de K1 o 5 jg de K1K1 Variante 1. Después de 10 min, se extrajeron hígados, se congelaron de forma instantánea y se trituraron. El estado de fosforilación de MET, Akt y ERK en los lisados celulares se analizó mediante transferencia de Western.

Figura 18. Estructura cristalina y alineamiento molecular de K1K1 y K1K1 variante 1 (sin etiqueta). Estructura cristalina de K1K1 variante 1 (sin etiqueta) a una resolución de 1,8 A. Los restos que se sabe que son responsables de la unión al receptor MET están punteados en la figura (A). Alineamiento estructural de K1K1 (A) y K1K1 variante 1 (sin etiqueta) (B). En la esquina inferior derecha de la figura (B) se muestra el valor calculado de la RMSD (forma siglada de root-mead square deviation: desviación cuadrática media) de 0,819 A.

Figura 19. Purificación por HisTrap de la proteína K1K1 a partir de cuerpos de inclusión de un cultivo de E. coli BL21. SDS-PAGE reductor de lisados bacterianos (E. coli BL21) y de la proteína K1K1 en distintas fases de purificación. (A) Carril M: marcador de peso molecular; carril 1: Material en bruto insoluble después del tratamiento con utlrasonido; carril 2: material en bruto soluble después del tratamiento con utlrasonido; carril 3: K1K1 después de 72 horas de solubilización en L-arginina 2 M; carril 4: K1K1 después de purificación por cromatografía de afinidad (5 ml de HisTrap FF); carril 5: K1K1 después de la cromatografía de exclusión por tamaño. (B) Cromatografía HisTrap de la proteína K1K1 (H6) extraída de cuerpos de inclusión. (B) Cromatografía Superdex 75 de la proteína K1K1 (H6) extraída de cuerpos de inclusión.

Figura 20. Purificación por cromatografía de afinidad de K1K1 variante 1 (sin etiqueta) a partir de cuerpos de inclusión de cultivo de E. coli BL21 (columna HiTrapTM Heparin HP). Las fracciones correspondientes al pico principal de proteína se agruparon y concentraron hasta un volumen adecuado para la cromatografía de filtración en gel preparativa.

Figura 21. Cromatografía de exclusión por tamaño de K1K1 variante 1 (sin etiqueta). Las fracciones correspondientes al pico principal de la columna HiTrapTM Heparin HP (Figura 20) se agruparon, se concentraron y se cargó una alícuota en una columna Superdex.

Ejemplos

Ejemplo 1. Producción de K1K1 y de variantes de K1K1 (sin etiqueta)

Se construyó un plásmido de expresión procariota (pET45b(+)-K1K1) subclonando un fragmento de ADN que contiene dos repeticiones en tándem del dominio K1 (aa 128-206) del HGF/SF (Figura 1). Un enlazador corto conecta el primer y segundo dominio K1. La construcción se ha designado HGF/SF-K1K1 (abreviado como K1K1). El plásmido de expresión procariota se transfectó en células BL21 (DE3).

Después de una transformación satisfactoria, se inició la producción de proteínas y durante esta fase se cultivaron las células bacterianas a 18 °C durante 24 h después inducirlas con una baja concentración de IPTG (0,4 mM). Después de un procedimiento de extracción muy suave, se resuspendieron los cuerpos de inclusión que contenían K1K1 (o sus variantes) en un tampón que contenía una alta concentración de L-arginina, se incubó a 4 °C durante 72 horas para solubilizar y extraer la proteína. La proteína extraída se purificó a continuación por cromatografía de afinidad seguido de una etapa de cromatografía de filtración en gel.

En la Figura 2 se muestra un perfil de elución típico en la columna HisTrap de una fracción enriquecida en cuerpos de inclusión atípicos y solubilizados/renaturalizados con L-arginina 2 M después de la inducción de las células BL21 con IPTG 0,4 mM durante una noche a 25 °C. El pico principal eluye a imidazol ~ 0,2 M (Figura 2a) y contiene predominantemente la proteína K1K1 (Figura 2b).

La proteína K1K1 no es homogénea. La cromatografía de exclusión por tamaño del agrupamiento de HisTrap en Superdex 75 muestra tres picos (Figura 3a). El pico 1 representa contaminantes menores de alto peso molecular fácilmente resueltos y no siempre presentes en el agrupamiento de HisTrap. Los picos 2 y 3 se observan de forma sistemática y ambos contienen la proteína K1K1. El pico 3 contiene la proteína con el volumen de elución esperado en Superdex 75 y la masa aparente esperada en SDS-PAGE. El pico 2 contiene "un dímero de dímeros", a saber, dos moléculas de K1K1 que pueden separarse del pico principal de K1K1 y correr más lentamente en SDS-PAGE en condiciones no reductoras (Figura 3b) pero no pueden distinguirse de la proteína K1K1 principal en geles reductores (Figura 3c). (En las figuras 19 se muestran resultados complementarios).

La heterogeneidad del agrupamiento de HisTrap de la proteína K1K1 se confirmó mediante cromatografía de intercambio catiónico (Figura 4). La columna de intercambio catiónico resuelve tres picos, de los cuales el pico principal (pico 2) tiene una potente actividad biológica. El pico 1 y el pico 3 son biológicamente inactivos.

Las otras variantes de K1K1 desprovistas de la etiqueta de polihistidina se purificaron mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna de cromatografía de afinidad de heparina-sepharose. En la Figura 20 se muestra un perfil de elución de HisTrap™ heparina típico de la K1K1 variante 1 (sin etiqueta) después de la solubilización con L-arginina. El pico principal contiene la K1K1 variante 1 altamente pura (sin etiqueta), como se muestra en el cromatograma de filtración en gel (Figura 21).

El protocolo basado en la purificación por afinidad con heparina seguido de filtración en gel es independiente de la presencia de la etiqueta His. La heparina permite la purificación de la proteína plegada adecuadamente, mientras que la columna de níquel es menos específica/discriminativa. Este protocolo se puede utilizar para todas las variantes.

Ejemplo 2. K1K1 es un potente agonista de MET

La capacidad de unión de K1K1 se determinó mediante un ensayo ALPHAScreen® de titulación, cruzada utilizando una quimera recombinante MET-IgG1 (Figura 6A), y que indica una unión entre K1K1 y MET. La activación de MET y la señalización aguas abajo en células HeLa tras la incubación con HGF/SF, K1K1, K1B (dominio K1 biotinilado monomérico) o con NK1 recombinante se analizaron mediante transferencia de western (Figura 5) o mediante las estrategias cuantitativas por ALPHAscreen (Figura 6B). Normalmente, HGF/SF desencadenó la activación máxima de ERK y Akt hasta concentraciones de pM. Sorprendentemente, K1K1 fue capaz de desencadenar niveles de fosforilación de ERK y Akt hasta el bajo rango de nM y, por lo tanto, presentó una actividad agonista similar a la proteína NK1. Además, K1K1 indujo una fuerte fosforilación de MET a 10o nM.

Además, se determinó la cinética de activación (0-20 min) de MET y de la señalización aguas abajo utilizando transferencia de western (Figura 7). Normalmente, HGF/SF indujo un máximo de autofosforilación MET entre los 5 y 10 min, seguido de un máximo de fosforilación de Akt y ERK a alrededor de los 10-20 min. En comparación, la fosforilación de MET procedió mucho más rápido con K1K1 y NK1, es decir dentro del primer minuto, y después disminuyó. Por consiguiente, la máxima activación de ERK y Akt se más temprano, después de solo 3-7 min.

Ejemplo 3. K1K1 estimula la dispersión celular, la morfogénesis y los fenotipos de supervivencia

Los estudios iniciales sobre la actividad biológica de la proteína K1K1 se han llevado a cabo utilizando el ensayo de dispersión de colonias de MDCK y se resumen en la Figura 8. La actividad de los agrupamientos de HisTrap de 7 experimentos de expresión distintos se han comparado con los del HGF/SF nativo de longitud completa y de NK1, un fragmento del HGF/SF extensamente caracterizado y otro punto de referencia útil. La actividad de K1K1 es ~ 3 veces menor que la de HGF/SF en una base molar.

En presencia de HGF/SF (100 pM) durante 18-24 h, las células MDCK adquirieron un fenotipo y dispersión de tipo mesenquimático. Las proteínas NK1 y K1K1 también indujeron este marcado fenotipo (Figura 9).

Se realizaron ensayos celulares adicionales utilizando una matriz similar a la lámina basal (Matrigel™) como un mimético de la matriz basal extracelular. En estas condiciones y sin tratamiento, las células MDCK forman de forma espontánea agregados esféricos apretados en Matrigel™, dentro de las 24 h. Por el contrario, cuando se estimulan con HGF/SF, las células MDCK se autoorganizan en estructuras ramificadas y conectadas. De forma notable, NK1 y K1K1 estimularon ampliamente la formación de tales estructuras (Figura 10).

Se examinó la capacidad de los agonistas para estimular la supervivencia de las células después del estrés apoptótico. Este fenotipo es un sello distintivo de h Gf/SF, que puede proteger a muchos tipos de células frente a la muerte inducida por el agotamiento del suero, la radiación ultravioleta, la isquemia o algunas sustancias químicas. Las células MDCK se estresaron usando anisomicina, un inhibidor de la síntesis de ADN y de proteínas que induce la apoptosis. El tratamiento con anisomicina indujo el -90 % de muerte celular después de 16 h, pero solo el -10% de muerte celular cuando se pretrata con HGF/SF (Figura 11). El pretratamiento con K1K1 y NK1 dio como resultado el -25 % de muerte celular y, por lo tanto, también protege a las células en un grado significativo.

Ejemplo 4. Resultados complementarios de otras construcciones de K1K1

Se analizaron la activación de MET y la señalización aguas abajo en células HeLa, tras la incubación con HGF/SF, K1K1 (etiqueta 6xHis), K1K1 variante 1 (sin etiqueta), K1K1 variante 2 (enlazador largo), K1K1 variante 3 (enlazador de GS) o NK1 mediante transferencia de western (Figura 12) y mediante estrategias cuantitativas por ALPHAScreen® (Figura 13). Normalmente, HGF/SF desencadenó la activación máxima de ERK y Akt hasta concentraciones de pM. Sorprendentemente, K1K1 y sus variantes fueron capaces de desencadenar niveles de fosforilación de ERK y Akt hasta el rango de 100 pM y, por lo tanto, presentaron una actividad agonista al menos 10 veces más potente que NK1. Además, K1K1 y sus variantes indujeron una fuerte fosforilación de MET comenzando en 100 pM.

En presencia de HGF/SF durante 24 h, las células MDCK adquirieron un fenotipo y dispersión de tipo mesenquimático (Figura 14). K1K1 y las variantes 1,2 y 3 también indujeron este marcado fenotipo. El monómero de K1 no tiene efecto. Se realizaron ensayos celulares adicionales utilizando una matriz similar a la lámina basal (Matrigel™) como un mimético de la matriz basal extracelular. En estas condiciones y sin tratamiento, las células MDCK forman de forma espontánea agregados esféricos apretados en Matrigel™, dentro de las 24 h. Por el contrario, cuando se estimulan con HGF/SF, las células MDCK se autoorganizan en estructuras ramificadas y conectadas. De forma notable, K1K1 y sus variantes estimularon ampliamente la formación de tales estructuras (Figura 15).

De manera similar, cuando se cultivaron en una matriz de colágeno/Matrigel™, las células MDKC se autoorganizaron en estructuras ramificadas. La invasividad y la ramificación de estas estructuras tridimensionales son fuertemente estimuladas por HGF. De manera clara, K1K1 y la variante 1 estimulan una espectacular morfogénesis tridimensional (Figura 16).

Finalmente, el monómero de K1 o la K1K1 variante 1 se inyectaron por vía intravenosa para ver si podía activar a MET y las rutas aguas abajo en el hígado, un órgano que se sabe bien que expresa fuertemente el receptor MET. Después de 10 min, se extrajeron los hígados y se determinó el estado de fosforilación de MET, ERK y Akt mediante transferencia de Western (Fig. 17). La inyección de la K1K1 variante 1 indujo una fosforilación clara de MET asociada con una fuerte activación de Akt y ERK en el hígado. Por el contrario, el control de K1 condujo a una señal no detectable.

Ejemplo 5. Estructura tridimensional de K1K1 variante 1 (sin etiqueta)

Las estructuras cristalinas de K1K1 y K1K1 variante 1 (versión sin etiqueta) se resolvieron mediante cristalografía de rayos X, respectivamente a una resolución de 1,4 y 1,8 A (Angstrom). Estas estructuras muestran un hecho muy interesante e importante: en ambos casos, la molécula K1K1 adopta una conformación extendida, exponiendo de forma externa y en lados opuestos los dos sitios de unión a MET (Figura 18, panel A). Esto confirma la utilidad de la creación de una molécula capaz de unir dos receptores en la orientación correcta, formando un complejo de señalización activo. A partir del alineamiento de las estructuras tridimensionales de K1K1 y K1K1 variante 1, parece que son casi idénticas, con un RMSD (desviación cuadrática media de la posición atómica) menor a un A (Figura 18, panel B).

MÉTODOS

Construcción de vectores

Se construyó un plásmido de expresión procariota (pET45b(+)-K1 K1) subclonando un fragmento de ADN que contiene dos copias del dominio K1 en orientación cabeza a cola (N-ter a C-ter). La secuencia de ADNc que codifica K1K1 se amplificó por PCR a partir de otro plásmido de expresión (pPIC9K-K1K1), producido para la expresión de K1K1 en la levadura P. pastoris. Para ensamblar el vector de expresión (pET45b(+)-K1K1), se creó previamente el ADNc de K1K1 mediante la fusión de dos dominios kringle 1 del h Gf/SF humano, cada uno de ellos previamente amplificado por la técnica de PCR. Para amplificar el monómero N terminal de K1K1 se usó el siguiente conjunto de cebadores: el cebador directo P1 (5'-ATCATCCCATGGCCATTA- GAAACTGCATCATTGGTAAAGGACG-3') (SEQ ID NO: 22) y el cebador inverso P3 (5'-TTCAACTTCTGAACACT- GAGGA-3') (SEQ ID NO: 20). Para el monómero C terminal, se utilizó la siguiente pareja de cebadores: el cebador directo P4 (5'-CAGAAGTTGAATGCATCATTGGTGAAGGA-3') (SEQ ID NO: 21) y el cebador inverso P2 (5'-ACAGCG- GCCGCTCATCAA-3') (SEQ ID NO: 23). Para permitir la fusión de los ADNc del terminal N y el terminal C de K1, el cebador directo P3 y el cebador inverso P4 portan el sitio de restricción Hpy188I.

En la siguiente pareja de cebadores, el cebador directo P1 (5'-ATCATCCCATGGCCATTAGAAACTGCATCATT-GGTAAAGGACG-3') (SEQ ID NO: 22) y el cebador inverso P2 (5'-ACAGCGGCCGCTCATCAA-3') (SEQ ID NO: 23) portan respectivamente los sitios NcoI y NotI para permitir la inserción del ADNc de K1K1 en el vector de expresión. Las condiciones de PCR consistieron en 28 ciclos de 94 °C durante 15 segundos, 54 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 60 segundos, y la enzima utilizada para la amplificación de ADN fue la ADN polimerasa Pfx Platinum® (Invitrogen). El fragmento de ADN amplificado por PCR se separó en geles de agarosa al 1,5 % que contenían bromuro de etidio (BE) y se visualizó con luz UV (longitud de onda larga). Se recuperó la banda y se purificó a partir del gel de agarosa utilizando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymogen) y se digirió usando NcoI (New England Biolabs) y NotI (New England Biolabs). El plásmido pET45b(+) se trató con las enzimas de restricción NcoI y NotI, se desfosforiló y se aisló a partir de un gel de agarosa al 1 %. Los productos de digestión se recuperaron y purificaron a partir del gel de agarosa utilizando el kit DNA Clean & Concentrator™ (Zymogen) y sucesivamente el ADNc K1K1 se insertó en el vector abierto usando el kit Quick ligase (New England Biolabs). El producto de la ligación se transformó en células E. coli MACH1 (New England Biolabs) y las bacterias se cultivaron durante la noche en una placa de agar LB que contenía ampicilina. Las colonias individuales se exploraron por PCR utilizando el apareamiento de un cebador directo universal de T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG- 3') (Se Q ID NO: 24) y el cebador P2 (SEQ ID NO: 23) como cebador inverso. La confirmación de la orientación correcta de los dominios kringle en las construcciones de K1K1 y la ausencia de mutaciones artificiales se confirmaron mediante la secuenciación de ambas cadenas de la construcción completa.

Expresión en E. coli

La proteína K1K1 y sus variantes contienen un total de 6 enlaces disulfuro (3 en cada dominio kringle). La producción de las proteínas ricas en disulfuro en E. coli presenta desafíos importantes y, en la mayoría de los casos, tales proteínas se acumulan en grandes agregados llamados cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión típicos tienen un diámetro de 0,5-1,3 pm y se encuentran dentro del citoplasma bacteriano o en el periplasma. Los cuerpos de inclusión están compuestos predominantemente por la proteína diana (del 50 al 90 %), aunque otras proteínas citoplasmáticas y otros constituyentes celulares están casi invariablemente asociados con ellos. Los cuerpos de inclusión, sin embargo, también puede contener la proteína diana plegada de forma correcta, especialmente cuando los cultivos se cultivan a baja temperatura. Estos cuerpos de inclusión "no clásicos" son ricos en precursores plegados de forma correcta de la proteína diana, los cuales se pueden extraer de manera eficaz en condiciones no desnaturalizantes.

En este caso se ha adoptado esta última estrategia para expresar K1K1 plegada de forma correcta y biológicamente activa. Brevemente, el plásmido pET45b(+)-K1K1 se usó para transformar la cepa DH5a de E. coli (para propagación) y la cepa BL21 (para expresión). Las células BL21 se cultivaron en medio LB que contenía ampicilina, a 37 °C, hasta que las células alcanzaron una DO600 de entre 0,5 y 0,6, en ese punto, se indujo la expresión con isopropil p-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) 0,4 mM. Tras la inducción, Las células se cultivaron durante 24 horas a 18 °C en un incubador con agitación (250 rpm). Las células se recogieron por centrifugación a 5.000 g durante 30 min a 4 °C, se resuspendieron en PBS y lisado por tratamiento con ultrasonido (10 ciclos de 20 segundos a intervalos de 40 s). Como alternativa, las células se lisaron utilizando lisozima a 37 °C durante 1 h, seguido de varios ciclos de congelación y descongelación o de lisis mecánica usando Emulsyflex. Después del tratamiento con ultrasonido o con lisozima, el lisado celular se centrifugó a 5.000 g durante 30 min a 4 °C, se resuspendió en PBS que contenía Triton X-100 al 0,4 % (v/v) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave, para eliminar las proteínas adsorbidas de forma inespecífica. El lisado se centrifugó nuevamente a 5.000 g durante 30 minutos a 4 °C, el sedimento se resuspendió en PBS que contenía fenoxipolietoxietanol (NP40) al 0,025 % (v/v) y se incubó durante 1 h a 4 °C con agitación suave, para eliminar proteínas adsorbidas de forma no específica adicionales, seguido de una nueva centrifugación. Finalmente, el sedimento se lavó varias veces en PBS helado para eliminar pequeñas cantidades de detergente. Para la solubilización y renaturalización de la proteína K1K1 con L-arginina, el pellet obtenido, que consistía en cuerpos de inclusión casi puros, se resuspendió en PBS que contenía L-arginina 2 M y se incubó durante una noche a 37 °C agitando a 250 rpm.

Cromatografía de afinidad

El sobrenadante obtenido después de la incubación durante la noche con L-arginina 2 M y una etapa de centrifugación adicional (5.000 g durante 30 min a 4 °C) se filtró a través de un filtro de 0,22 pm y se cargó en una columna de afinidad FF en bruto de 1 ml equilibrada en PBS ajustado a NaCl 500 mM, a 2 ml/min. La columna se lavó hasta que los valores iniciales volvieron a cero y las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente de 130 ml de imidazol (0-500 mM) en PBS ajustado a NaCl 500 mM. Las fracciones que contenían proteína se analizaron por SDS-PAGE, por cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 75 10/30 (GE Healthcare) y en cuanto a la actividad biológica, utilizando el ensayo de dispersión de colonias de MDCK (Stoker, M. et al., Scatter factor is a fibroblast-derived modulator of epithelial cell mobility. Nature 327, 239-242 (1987)). Como alternativa, el sobrenadante obtenido después de 72 horas de incubación con L-arginina 2 M y la etapa de centrifugación adicional (15.000 g durante 30 min a 4 °C) se diluyó 100 veces en tampón de carga (Tris 25 mM pH 7,4, NaCl 500 mM) y se filtró a través de un Filtro de 0,22 pm. La muestra preparada de esta manera se cargó en la columna (HisTrapTM-FF de 5 ml) a un caudal de 1,5 ml/min durante una noche. La columna se lavó hasta que el trazado por UV registrado mostró una línea basal plana de baja absorbancia. Después, el material unido se eluyó a 5 ml/min con una elución de gradiente discontinuo utilizando el 50 % de tampón B (Tris 25 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM imidazol 1 M) en 10 volúmenes de columna, luego alcanzar el 100 % del tampón B en una etapa y mantenerlo durante otros 10 volúmenes de columna. La absorción a UV se controló a 280 nm y se recogieron fracciones de 5 ml durante todo el procedimiento de elución.

Cromatografía de filtración en gel

Se equilibró una HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 75 con tampón de columna (Tris 25 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4). Las fracciones concentradas de la etapa de cromatografía de afinidad se cargaron en la columna usando un bucle de 5 ml. La ejecución de cromatografía se realizó a un caudal de 0,5 ml/min y se recogieron fracciones de 5 ml durante todo el procedimiento de elución. Se recogieron las fracciones correspondientes al pico esperado, se agruparon, se analizaron y, de ser necesario, se congelaron instantáneamente para el almacenamiento a -80 °C.

Cromatografía de intercambio catiónico

La proteína variante 1 soluble de los cuerpos de inclusión y las fracciones que contienen proteína de la columna His-Trap (K1K1, variante 2 y variante 3) se agruparon y dializaron contra MES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0 durante 24 horas a 4 C. Las muestras se centrifugaron, se filtraron a través de un filtro de 0,22 pm y se cargaron a 0,5 ml/min en una columna Resource-S de 1 ml (GE Healthcare) equilibrada en MES 50 mM, NaCl 150 mM pH 6,0. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente de NaCl (0,25-100 M). Fracciones se recogieron y analizaron por SDS-PAGE y ensayo de dispersión de colonias de MDCK.

Ruta de señalización de MET y respuesta a la dosis (transferencia de western)

Se trataron células HeLa con HGF 500 pM, K1K1 1 nM, K1K1 variante 1, 2 y 3 1 nM o NK1 1 o 100 nM durante 10 min. Después, se analizaron los lisados celulares mediante transferencia de western específica para MET total, Akt y ERK o fosfo-MET, fosfo-Akt y fosfo-ERK. Las células se recogieron por raspado y después se lisaron en hielo con un tampón de lisis (HEPES 20 mM, pH 7,4, KCl 142 mM, MgCl25 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 5 %, NP40 al 1 % y SDS 0,1 %), complementado con proteasa recién añadida e inhibidores de fosfatasas (Sigma). Los lisados se clarificaron por centrifugación (20.000 g x 15 min) y se determinó la concentración de proteínas (kit de ensayo de proteínas por BCA, Pierce®, Thermo scientific, IL, Estados Unidos). Se separó la misma cantidad de proteína de los extractos celulares mediante SDS-PAGE clásica o NuPAGE (geles prefabricados de Bis-Tris al 4-12 % o al 10 %) (Life technologies) y se electrotransfirió a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Merck Millipore). Se exploraron las membranas con los anticuerpos primarios indicados, seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiados. Los complejos de proteína-anticuerpo se visualizaron por quimioluminiscencia con películas de rayos X SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate (película CL-XposureTM, Thermo scientific).

Para la respuesta a la dosis, se trataron células HeLa con HGF/SF (HGF) 10, 100 y 500 pM, K1K1 variante 1100, 500 y 1000 pM, y K1K1 100, 500 y 1000 pM, durante 10 min.

Cinética (transferencia de western)

Se trataron células HeLa con HGF 100 pM, K1K1 100 nM y NK1 100 nM, durante 1, 5, 10 o 20 min. Después, se analizaron los lisados celulares mediante transferencia de western específica para MET total, Akt y ERK o fosfo-MET, fosfo-Akt y fosfo-ERK. Las células se recogieron por raspado y después se lisaron en hielo con un tampón de lisis (HEPES 20 mM, pH 7,4, KCl 142 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 5 %, NP40 al 1 % y SDS 0,1 %), complementado con proteasa recién añadida e inhibidores de fosfatasas (Sigma). Los lisados se clarificaron por centrifugación (20.000 g x 15 min) y se determinó la concentración de proteínas (kit de ensayo de proteínas por b Ca , Pierce®, Thermo scientific, IL, Estados Unidos). Se separó la misma cantidad de proteína de los extractos celulares mediante SDS-PAGE clásica o NuPAGE (geles prefabricados de Bis-Tris al 4-12 % o al 10 %) (Life technologies) y se electrotransfirió a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Merck Millipore). Se exploraron las membranas con los anticuerpos primarios indicados, seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiados. Los complejos de proteína-anticuerpo se visualizaron por quimioluminiscencia con el SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate (Thermo scientific), utilizando películas de rayos X (película CL-Xposure™, Thermo scientific).

Dispersión de MDCK

Se incubaron islotes aislados de células MDCK durante 18-24 h en medio de cultivo con HGF/SF 100 pM, K1K1 100 nM y NK1 100 nM. Como alternativa, Se incubaron islotes aislados de células MDCK durante 24 h en medio de cultivo con HGF/SF 500 pM, K1K1 y variante 1, 2 o 3 10 nM, y monómero de K1 100 nM. Después, las células se tiñeron y se observaron en un microscopio (100x). Las células se sembraron a baja densidad (2.000 células/pocillo en una placa de 12 pocillos) para formar colonias compactas. Tras el tratamiento, cuando se observó dispersión de colonias, las células se fijaron y colorearon por tinción con Hemacolor® (Merck, Darmstadt, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se tomaron imágenes representativas utilizando un microscopio de contraste de fases con un aumento de 100x (Nikon Eclipse TS100, Tokio, Japón).

Morfogénesis de MDCK

Se sembraron células MDCK sobre una capa de Growth Factor Reduced Matrigel™ (BD Biosciences) (100.000 células/pocillo de una placa de 24 pocillos), se trataron durante 18-24 h con HGF/SF 100 pM, K1K1 100 nM y NK1 100 nM, y observaron al microscopio de contraste de fases. Se tomaron imágenes representativas con un aumento de 40x y 100x (Nikon Eclipse TS100).

Como alternativa, Se sembraron células MDCK sobre una capa de 10 pl de Growth Factor Reduced Matrigel™ (BD Biosciences) en 15 pocillos de microportaobjetos Ibidi® angiogenesis (2.500 células/pocillo), y se trataron con 50 pl de HGF/SF 1 nM, K1K1, variante 1, 2 o 3 100 nM y monómero de K1 100 nM. Después, se observaron las células a las 24, 48 y 72 h (40x) al microscopio de contraste de fases. Se tomaron imágenes representativas con un aumento de 40x (Nikon Eclipse TS100).

Morfogénesis tridimensional de MDCK

Se sembraron células MDCK en capa gruesa de Matrigel™ de colágeno tipo 1, en una placa de 24 pocillos cubierta con medio de cultivo que contenía HGF/SF (HGF) 1 nM, NK1 100 nM, K1K1 variante 1, 100 nM y monómero de K1 100 nM. Las células se fijaron, se tiñeron con azul de Evans (al 0,01 %) y después se observaron al microscopio de contraste (Nikon Eclipse TS100) y confocal (Leica LSM 880) (Ex405 nm/Em630). Se tomaron imágenes representativas con un aumento de 40x o 100x y se reconstituyeron en tridimensional en Z-stack.

Supervivencia de MDCK

Se cultivaron células MDCK durante una noche (15 h) en medio que contenía SFB al 0,1 % con o sin anisomicina (0,7 |jM) y en presencia de HGF/SF 500 pM, K1K1 100 nM y NK1 100 nM. Después, se realizó un ensayo MTT para evaluar la supervivencia celular. Los resultados se expresan como del porcentaje de control no tratado.

Las células se lavaron con PBS para eliminar las células muertas y después se incubaron en medio que contenía bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio 0,5 mg/ml (MTT, Invitrogen) durante 1 h. Después de una etapa de lavado con PBS, se solubilizaron los cristales de formazán y se mezclaron minuciosamente con HCl 0,04 M en isopropanol. Para cada condición, se cargaron por triplicado 60 j l de solución de formazán en una placa de 96 pocillos. Después, se midió la absorbancia con un espectrofotómetro para microplacas a 550 nm y 620 nm, como longitudes de onda de análisis y de referencia, respectivamente. La absorbancia se correlaciona con el número de células.

Ensayo de titulación cruzada

Los ensayos de titulación cruzada para la unión de K1K1 a la proteína MET-Fc recombinante se realizaron en placas de microtitulación de 384 pocillos (OptiPlateTM-384, PerkinElmer©, CA, EE. UU., 50 j l de volumen de reacción final). Las concentraciones finales fueron de 0-300 nM para K1K1, 0-10 nM para MET-Fc, 10 jg/m l para las perlas donantes recubiertas con estreptavidina y perlas aceptadoras conjugadas con proteína A. El tampón utilizado para preparar todas las soluciones de proteínas y las suspensiones de perlas fue: PBS, HEPES 5 mM pH 7,4, BSA al 0,1 %. La placa se incubó a 23 °C durante 60 min en una caja oscura. La intensidad de la señal emitida se midió utilizando configuraciones de Alpha convencionales en un lector de placas EnSpire® Multimode (PerkinElmer).

Ensayo de fosforilación de Akt y ERK por el método ALPHAScreen® SureFire® Ultra™

El ensayo se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante mencionado en ALPHAScreen® SureFire® Ultra™ (PerkinElmer ©, CA, EE. UU.). Brevemente, las células se sembraron en placas, se estimularon durante 7 min con distintos agonistas (HGF/SF, NK1, K1K1 y K1B (K1 biotinilada), y después se lisaron en la misma placa de cultivo de 96 pocillos. Los lisados (10 j l ) se transfirieron a microplacas de 384 pocillos para la detección de Akt fosforilada (ALSU-PAKT-B500, Ser473) y ERK (ALSU-PERK-A500), Thr202/Tyr204). Se añadieron e incubaron durante 2 horas las cuentas aceptadoras y donantes ALPHAScreen® SureFire® Ultra™. La intensidad de la señal emitida se midió utilizando configuraciones de Alpha convencionales en un lector de placas EnSpire® Multimode (PerkinElmer).

Ensayo de fosforilación de Akt y ERK por el método ALPHAScreen SureFire®

El ensayo se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante mencionado en ALPHAScreen® SureFire® ERK (TGRES500) y Akt (TGRA4S500) (PerkinElmer ©, CA, EE. UU.). Brevemente, las células se sembraron en placas, se estimularon durante 10 min con distintos agonistas (HGF/SF, NK1, K1K1, Variante 1, 2 o 3 y K1 (K1 biotinilada), y después se lisaron en la misma placa de cultivo de 96 pocillos. Los lisados (5 j l) se transfirieron a microplacas de 384 pocillos para la detección de Akt fosforilada (Ser473) y ERK (Thr202/Tyr204). Se añadieron e incubaron durante 2 horas las cuentas aceptadoras y donantes ALPHAScreen® SureFire® de acuerdo con el protocolo del fabricante. La intensidad de la señal emitida se midió utilizando configuraciones de Alpha convencionales en un lector de placas EnSpire® Multimode (PerkinElmer).

Activación de la señalización de MET in vivo:

Para visualizar la activación de MET en el hígado, se utilizaron ratones FVB (n=2) con un peso de 19-21 g (Charles River). Después de la anestesia con isoflurano (Aerrane, Baxter, EE. UU.), los ratones recibieron inyecciones intravenosas de 5 jg de monómero de K1 o K1K1 variante 1 en PBS. Los ratones se sacrificaron después de 10 minutos, y los hígados se perfundieron con PBS complementado con inhibidores de proteasas y fosfatasas. Los hígados se extrajeron y se analizaron por transferencia de Western en cuanto a la activación de MET, ERK y Akt.

Hepatitis fulminante inducida por Fas

Para este experimento se utilizan ratones FVB con un peso de 19-21 g. Después de la anestesia con isoflurano, los ratones reciben inyecciones intravenosas de 125 ng/g de peso corporal de anticuerpo anti-Fas (CD95, Clon Jo-2,

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Proteína que contiene dos dominios peptídicos, llamados respectivamente K1^a y K1^b, comprendiendo cada uno de dichos dominios peptídicos K1^a y K1^b un dominio peptídico K1 del Factor de crecimiento hepatocítico/Factor de dispersión,

consistiendo dicho dominio peptídico K1 en una secuencia con al menos el 80 % de identidad, preferentemente al menos el 90 % de identidad, con la SEQ ID NO: 1,

siendo capaz dicha proteína de inducir la activación del receptor tirosina quinasa MET,

con la condición de que dicha proteína no comprenda el dominio N-terminal de1HGF/SF.

2. Proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichos dominios peptídicos K1^a y K1^b son idénticos.

3. Proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde cada uno de dichos dominios peptídicos K1^a y K1^b consiste en una secuencia de aminoácidos elegida entre las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

4. Proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dicha proteína un enlazador peptídico que conecta a K1^a y K1^b, estando constituido dicho enlazador peptídico preferentemente por 1 a 50 aminoácidos, más preferentemente por 10 a 20 aminoácidos.

5. Proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo o consistiendo dicha proteína en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos con al menos el 80 %, preferentemente el 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 7.

6. Molécula de ácido nucleico que codifica una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, consistiendo preferentemente dicho ácido nucleico en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 10.

7. Vector de expresión que contiene una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 6, comprendiendo o consistiendo dicho vector preferentemente en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 11.

8. Célula hospedadora que contiene un vector de expresión como se define en la reivindicación 7, eligiéndose dicha célula hospedadora preferentemente del grupo que consiste en células de levadura y células bacterianas.

9. Composición que comprende:

- una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o

- una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, o

- un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7, o

- una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en un método de diagnóstico.

11. Proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en diagnóstico médico por la imagen.

12. Proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso como un medicamento.

13. Proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en el tratamiento de lesiones tisulares mediante el estímulo de la supervivencia celular o de la regeneración tisular.

14. Proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en el tratamiento de una patología elegida entre: enfermedades de los órganos con epitelio, incluyendo enfermedades hepáticas agudas y crónicas, enfermedades renales agudas y crónicas, enfermedades pulmonares crónicas y heridas superficiales crónicas, enfermedades del sistema nervioso central, incluyendo enfermedades neuronales y esclerosis, insuficiencias cardíacas isquémicas, vasculopatías periféricas, diabetes y complicaciones asociadas tales como neuropatías periféricas.

15. Procedimiento para obtener una proteína que comprende al menos dos dominios peptídicos K1, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las etapas de:

- insertar una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína recombinante que contiene al menos dos dominios peptídicos K1, preferentemente dos dominios peptídicos K1, en un vector de expresión,

- clonar dicho vector en una célula hospedadora y expresar dicha proteína recombinante,

- extraer y purificar dicha proteína recombinante, siendo dicha proteína recombinante una proteína que comprende al menos dos dominios K1.