BR112013016980B1 - Proteína de fusão anticancerígena - Google Patents
Proteína de fusão anticancerígena Download PDFInfo
- Publication number
- BR112013016980B1 BR112013016980B1 BR112013016980-0A BR112013016980A BR112013016980B1 BR 112013016980 B1 BR112013016980 B1 BR 112013016980B1 BR 112013016980 A BR112013016980 A BR 112013016980A BR 112013016980 B1 BR112013016980 B1 BR 112013016980B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- fusion protein
- protein
- domain
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 287
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 title abstract description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 285
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 167
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 163
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 134
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 100
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 78
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 44
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 147
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 49
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 49
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 26
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 22
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 22
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 16
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 12
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 9
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 3
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 45
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 125
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 120
- 102000046283 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Human genes 0.000 description 94
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 description 94
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 description 90
- 101100369992 Homo sapiens TNFSF10 gene Proteins 0.000 description 83
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 63
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 51
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 50
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 46
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 46
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 46
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 45
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 44
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 44
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 41
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 40
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 26
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 23
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 23
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 22
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 22
- 108010012374 type IV collagen alpha3 chain Proteins 0.000 description 22
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 21
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 20
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 20
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 20
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 20
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 20
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 18
- 102400000731 Tumstatin Human genes 0.000 description 18
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 18
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 18
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 18
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 17
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 16
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 15
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 15
- 230000008859 change Effects 0.000 description 15
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 15
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 15
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 15
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 13
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 13
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 13
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 13
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 13
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 12
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 12
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 12
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 12
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 12
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 12
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 12
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 12
- 102100040113 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Human genes 0.000 description 10
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 9
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 9
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 8
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 description 8
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 8
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 7
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 6
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 6
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 5
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 5
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 5
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 5
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical group NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 5
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 4
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 description 4
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 description 4
- 102100031186 Chromogranin-A Human genes 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 4
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 208000037965 uterine sarcoma Diseases 0.000 description 4
- 108010060757 vasostatin Proteins 0.000 description 4
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000830565 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- -1 glucose Chemical class 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 3
- 102000044949 human TNFSF10 Human genes 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 108700042769 prolyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QZDDFQLIQRYMBV-UHFFFAOYSA-N 2-[3-nitro-2-(2-nitrophenyl)-4-oxochromen-8-yl]acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(C(C=2[N+]([O-])=O)=O)=C1OC=2C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O QZDDFQLIQRYMBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000055105 BH3 Interacting Domain Death Agonist Human genes 0.000 description 2
- 108700000712 BH3 Interacting Domain Death Agonist Proteins 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010049990 CD13 Antigens Proteins 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 102400000730 Canstatin Human genes 0.000 description 2
- 101800000626 Canstatin Proteins 0.000 description 2
- 102100026548 Caspase-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 2
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 2
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102000016621 Focal Adhesion Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010067715 Focal Adhesion Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 2
- 102100035792 Kininogen-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010077861 Kininogens Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N Pro-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N curcumin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)CC(=O)\C=C\C=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- YEIPDMVCOQKQHV-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-diphenyltetrazol-1-ium-1-yl)-4,5-dimethyl-1,3-thiazole Chemical compound S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=C(C=2C=CC=CC=2)N=NN1C1=CC=CC=C1 YEIPDMVCOQKQHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009840 Angiopoietins Human genes 0.000 description 1
- 108010009906 Angiopoietins Proteins 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N Bestatin Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010667 Carcinoma of liver and intrahepatic biliary tract Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000573945 Coccidioides posadasii (strain C735) Neutral protease 2 homolog MEP2 Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010001463 Collagen Type XVIII Proteins 0.000 description 1
- 102000047200 Collagen Type XVIII Human genes 0.000 description 1
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- SWQALSGKVLYKDT-UHFFFAOYSA-N Gly-Ile-Ala Natural products NCC(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(C)C(O)=O SWQALSGKVLYKDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010066476 Haematological malignancy Diseases 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000610602 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Proteins 0.000 description 1
- 101000610609 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Proteins 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101100163901 Rattus norvegicus Asic2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UBRMZSHOOIVJPW-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Lys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O UBRMZSHOOIVJPW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091007178 TNFRSF10A Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100040115 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Human genes 0.000 description 1
- 102100040110 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Human genes 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- RTJPAGFXOWEBAI-SRVKXCTJSA-N Val-Val-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RTJPAGFXOWEBAI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000011759 adipose tissue development Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000006481 angiogenic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000011122 anti-angiogenic therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940124650 anti-cancer therapies Drugs 0.000 description 1
- KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N apigenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117893 apigenin Drugs 0.000 description 1
- XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N apigenin Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008714 apigenin Nutrition 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012152 bradford reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940109262 curcumin Drugs 0.000 description 1
- 235000012754 curcumin Nutrition 0.000 description 1
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N diferuloylmethane Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C=CC(=O)CC(=O)C=CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 231100000371 dose-limiting toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 229950000317 dulanermin Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000006624 extrinsic pathway Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical group [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 201000002250 liver carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007056 liver toxicity Effects 0.000 description 1
- 201000009546 lung large cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006667 mitochondrial pathway Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- HYWYRSMBCFDLJT-UHFFFAOYSA-N nimesulide Chemical compound CS(=O)(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1OC1=CC=CC=C1 HYWYRSMBCFDLJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N peptide a Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCCC[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C/C=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C\C1=CC=CC=C1 LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001047 purple dye Substances 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000000547 structure data Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000012991 uterine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1808—Epidermal growth factor [EGF] urogastrone
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4747—Apoptosis related proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
PROTEÍNA DE FUSÃO ANTICANCERÍGENA. Uma proteína de fusão compreendendo domínio (à), o qual é um fragmento funcional da sequência da proteína hTRAIL, que o fragmento começa com um aminoácido em uma posição não inferior a hTRAIL95, ou um homólogo funcional do fragmento tendo pelo menos 70% da identidade da sequência; e domínio (b), o qual é uma sequência de um peptídeo efetor antiangiogênico, em que a sequência do 10 domínio (b) está ligado ao C-terminal ou N- terminal do domínio (a). A proteína de fusão pode ser usada para o tratamento de doenças cancerígenas.
Description
[001] A invenção refere-se ao campo das proteínas de fusão terapêuticas, em particular, as proteínas de fusão recombinantes. Mais particularmente, a invenção refere-se às proteínas de fusão contendo o fragmento de uma sequência da proteína TRAIL humana solúvel em combinação com uma sequência de um peptídeo antiangiogênico, composições farmacêuticas contendo estas, utilização destas em terapia, particularmente, como agentes anticancerígenos, e sequências polinucleotídicas que codifica as proteínas de fusão, vetores de expressão contendo as sequências polinucleotídicas e as células hospedeiras contendo esses vetores de expressão.
[002] Proteína TRAIL pertencente à família de citocinas (Fator de Necrose Tumoral Relacionado ao Ligante Incluindo Apoptose), também conhecido como Apo2L (Apo2- ligante), é um ativador potente da apoptose em células tumorais e em células infectadas por vírus. TRAIL é um ligante que ocorre naturalmente no corpo. A proteína TRAIL, sua sequência de aminoácido, sequências de DNA de codificação e sistemas de expressão de proteínas foram descritos pela primeira vez em EP 0835305 A1.
[003] A proteína TRAIL exerce a sua atividade anticancerígena por se ligar aos receptores de superfície TRAIL pró-apoptóticos 1 e 2 (TRAIL-R1/R2) e ativação subsequente destes receptores. Esses receptores, também conhecidos como DR4 e DR5 (receptor de morte 4 e receptor de morte 5), pertencem à família de receptores de TNF e são super-expressados por diferentes tipos de células cancerosas. A ativação desses receptores pode induzir a via de sinalização externa da apoptose independente do gene supressor p53, a qual ativada por caspase-8 leva à ativação de caspases de execução e, assim, a degradação dos ácidos nucléicos. A caspase-8 liberada por ativação TRAIL também pode causar a liberação de proteína BID e, desse modo, ativação indireta da via mitocondrial, proteína BID sendo translocada para a mitocôndria, onde estimula a liberação de citocromo c, assim, indiretamente, amplificando o sinal de apoptose de receptores da morte.
[004] TRAIL atua seletivamente nas células tumorais essencialmente sem induzir a apoptose em células saudáveis, as quais são resistentes a essa proteína. Portanto, o enorme potencial de TRAIL foi reconhecido como um agente anticancerígeno, o qual atua sobre uma ampla faixa de diferentes tipos de células tumorais, incluindo doenças malignas hematológicas e tumores sólidos, enquanto poupam as células normais e exercem efeitos colaterais potencialmente e relativamente pequenos.
[005] Proteína TRAIL é uma proteína de membrana do tipo II que tem o comprimento de 281 aminoácidos, e a sua região extracelular compreendendo os resíduos de aminoácidos 114-281 sob clivagem por formas de proteases solúveis em moléculas sTRAIL de 20 kDa de tamanho, que também está biologicamente ativa. Ambas as formas TRAIL e sTRAIL são capazes de desencadear apoptose através da interação com os receptores TRAIL presentes nas células alvo. A atividade antitumoral intensa e a toxicidade sistemica muito baixa da parte solúvel da molécula TRAIL foram demonstradas por meio de testes de linhas celulares.
[006] Além disso, estudos clínicos em humanos com TRAIL solúvel humano recombinante (rhTRAIL) possuindo a sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos 114281 do hTRAIL, conhecido sob o INN dulanermin, mostraram sua boa tolerância e ausência de toxicidade limitadora de dose.
[007] Fragmento de TRAIL menor do que 114-281 é também capaz de se ligar aos receptores de morte da membrana e induzir apoptose através desses receptores, tal como foi recentemente relatado para mutante permutado circularmente recombinante da 122-281 hTRAIL, por exemplo, na EP 1 688 498.
[008] Os efeitos tóxicos da proteína TRAIL recombinante em células do fígado relatados até agora parecem estar associadas com a presença de modificação, isto é, marcas de poli-histidina, enquanto que TRAIL não marcado não mostrou nenhuma toxicidade sistemica.
[009] No entanto, no curso de mais investigação e desenvolvimento verificou-se que muitas células cancerosas mostraram resistência primária ou adquirida para TRAIL (ver, por exemplo, WO2007/022214). Embora o mecanismo de resistência para TRAIL não seja totalmente compreendido, acredita-se que pode manifestar-se em diferentes níveis da via da apoptose induzida por TRAIL, variando desde o nível de receptores de superfície celular para as caspases executivas da via de sinalização. Esta resistência limita a utilidade de TRAIL como um agente anticancerígeno.
[0010] Além disso, em ensaios clínicos em pacientes, a eficácia real de TRAIL como uma monoterapia provou ser baixa. Para superar esta baixa eficiência e a resistência dos tumores para TRAIL, várias terapias combinadas com agentes de rádio e agentes quimioterápicos foram projetadas, o que resultou em efeito sinérgico de apoptose (WO2009/002947; A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348; RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, No 6, 2001, 535-546, Soria JC et al., J. Clin Oncology, Vol 28, No 9 (2010), p 1527-1533). O uso de rhTRAIL para o tratamento de câncer em combinação com os agentes quimioterapêuticos convencionais selecionados (paclitaxel, carboplatina) e anticorpos monoclonais anti- VEGF são descritos em WO2009/140469. No entanto, tal combinação implica, necessariamente, em deficiências bem conhecidas da quimioterapia ou da radioterapia convencional.
[0011] Além disso, o problema relacionado com a terapia de TRAIL provou ser a sua baixa estabilidade e rápida eliminação do corpo após administração.
[0012] Um dos alvos na terapia do câncer é também a inibição da angiogênese tumoral. Angiogênese (neovascularização) é um processo patológico por tempo ilimitado de desenvolvimento de novos vasos sanguíneos que alimentam os tumores com oxigênio e nutrientes. A angiogênese é indispensável para o crescimento e expansão do tumor e promoção de sua metástase.
[0013] O efeito benéfico da inibição da angiogênese tumoral na terapia de câncer é conhecido. Foram feitas tentativas para a utilização clínica de substâncias que inibem ou regulam o processo de angiogênese, tanto como uma terapia de câncer quanto uma terapia complementar de câncer.
[0014] Os inibidores da angiogênese são conhecidos, tanto os endógenos naturalmente presentes no corpo humano quanto às numerosas substâncias exógenas antiangiogênica. Entre eles estão os inibidores protéicos conhecidos de angiogênese, incluindo fragmentos proteolíticos de proteínas endógenas. Como exemplos, os inibidores da proteína de angiogênese, tais como angiostatina (um fragmento do plasminogênio), endostatina (fragmento C-terminal de colágeno XVIII), calreticulina, vasostatina - um fragmento de calreticulina, um fragmento de prolactina, um fragmento de metaloproteinase 2 ou tumstatina - um fragmento de colágeno IV, podem ser mencionados (Cao Y. Angiogenesis modulates adipogenesis and obesity. J Clin Invest. 2007; 1 17(9):2362-2368, Folkman J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery? Nat Rev Drug Discov. 2007;6:273-286).
[0015] Por exemplo, tumstatina é um peptídeo do tamanho de 28 kDa - um fragmento de colágeno tipo IV, capaz de se ligar à integrina αvβ3 e prevenir a angiogênese por inibição da proliferação das células endoteliais. Além disso, tumstatina inibe independentemente a ativação da Quinase de Adesão Focal (FAK) e fosfatidilinositol-3-quinase PI3 e proteína quinase PKB/Akt.
[0016] A atividade antiangiogênica pode também ser exercida pela inibição de proteínas pró-angiogênicas, tais como o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF), o qual atua através de receptores localizados no endotélio vascular e que é o principal estimulador da neoangiogênese.
[0017] No tratamento clínico, incluindo terapia de câncer, já foram usados como fatores antiangiogênicos certas substâncias direcionadas contra VEGF, tais como anticorpos monoclonais bevacizumabe e ranibizumabe. Outros fatores pró- angiogênicos estimulando a proliferação e migração de células endoteliais, independentemente de receptores localizados no endotélio são também conhecidos, que incluem, por exemplo, citocinas, tais como Fatores de Crescimento Derivado das Plaquetas PDGF e Fator de Crescimento Epidermal EGF, TNF, e angiopoietina.
[0018] No processo de angiogênese, também está envolvida a enzima N-aminopeptidase (APN/CD13), a qual é uma metaloprotease transmembrana. Sabe-se que a inibição desta enzima pode conduzir à inibição de processos neoplásicos. Um número de inibidores naturais e sintéticos de N- aminopeptidase são conhecidos. (Bavouis B., Dauzonne D., Aminopeptidase-N/CD13 (EC 3.4.11.2) inhibitors: chemistry, biological evaluations, and therapeutic prospects. Medical Research Review, 2006, 26, (1), 88-130).
[0019] Inibidores naturais de APN/CD13 incluem principalmente substâncias produzidas por micro-organismos. Como um representante, entre outras, bestatina, curcumina, e apigenina podem ser mencionadas. Verificou-se também que um pequeno peptídeo que contém o motivo CNGRC é capaz de se ligar de forma eficiente ao CD13 (Arap et al., Science, 279:377- 380, 1998).
[0020] Muitas das substâncias anti-angiogênicas estão atualmente em diferentes fases de investigações, incluindo ensaios clínicos. No entanto, as terapias conhecidas destinadas a inibir a angiogênese tem muitas desvantagens bem conhecidas. Por exemplo, os benefícios do anticorpo bevacizumabe monoclonal terapêutico para o tratamento de câncer da mama foram recentemente questionados. Muitos medicamentos antiangiogênicos mostram, por exemplo, uma meia-vida muito curta, baixa solubilidade, má biodisponibilidade e efeitos colaterais tóxicos.
[0021] Segurança dos medicamentos antiangiogênicos é de especial importância por causa do uso prolongado e falta de seletividade da terapia. Necessidade intensa para uma terapêutica eficaz e a natureza das doenças oncológicas necessitam de um procedimento de registro simplificado de tal grupo de medicamentos, portanto, é impossível conhecer todos os efeitos colaterais e os inconvenientes do medicamento. Embora, ao contrário dos quimoterapêuticos, que são dirigidos a todas as células que proliferam rapidamente, medicamentos antiangiogênicos são direcionados em diferentes estágios da formação de vasos sanguíneos, os quais resultam na redução da toxicidade da terapia. No entanto, ainda existe uma necessidade de terapia anticancerígena, a qual visa à inibição da angiogênese, enquanto assegurando a seletividade contra as células tumorais. Existe, portanto, uma necessidade de novas terapias anticancerígenas antiangiogênicas com melhores características toxicológicas.
[0022] Proteína de fusão construída contendo sequências de uma vasostatina inibidora de angiogênese e TRAIL114-281 ligado a um ligador do sítio de clivagem de metaloprotease foi descrito como apresentando efeito indutor de apoptose nas células tumorais por AI Guo et al in Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2008, vol. 24(10), 925-930.
[0023] Proteína de fusão construída contendo sequências de um inibidor de angiogênese calreticulina e TRAIL114-281 foi descrita como exibindo efeito indutor de apoptose nas células tumorais em CN1609124A.
[0024] CN 1256347C descreve proteína de fusão composta de cininogênio D5 60-148 e TRAIL114-281.
[0025] Proteína de fusão construída contendo sequências de um inibidor de angiogênese cininostatina, vasostatina e canstatina ligado ao N- ou C-terminal de TRAIL114-281 ligado com ligador de codificação GGGSGGSG são mencionados em Feng Feng-Yi “Phase and Clinical Trial of Rh- Apo2L and Apo2L-Related Experimental Study", Ph.D. degree thesis, Chinese Peking Union Medical, 2006-10-01; http://www. Iw23.com/lunwen_957708432.
[0026] Proteína de fusão construída contendo sequências de Tumstatina 183-230 de um inibidor de angiogênese tumstatina e TRAIL114-281 foram descritos como exibindo indução de apoptose de células de câncer de pâncreas por N. Ren et al. in Academic Journal of Second Military Medical University 2008, vol. 28(5), 676-478.
[0027] US 2005/244370 WO 2004/035794 correspondente descrevem o construto de TRAIL95-281 como um domínio efetor ligado por um ligador peptídico com a parte extracelular de outro membro da família de ligantes TNF CD40 como um domínio de ligação da superfície da célula. É afirmado que a ativação do construto é através da ligação de sua parte CD40.
[0028] A presente invenção proporciona uma solução para este problema fornecendo novas proteínas de fusão que compreendem um domínio derivado de TRAIL e um pequeno domínio de peptídeo efetor possuindo a atividade antiangiogênica e não incluindo fragmentos de TRAIL, em que o peptídeo efetor potencializa ou complementa a ação de TRAIL.
[0029] Proteínas de acordo com a invenção são direcionadas seletivamente às células de câncer, onde os elementos individuais da proteína exercem os seus efeitos, em particular, os peptídeos efetores inibem a angiogênese tumoral. Entrega das proteínas da invenção para o ambiente do tumor permite minimizar a toxicidade contra células saudáveis do corpo, bem como os efeitos colaterais e para reduzir a frequência de administração. Além disso, a terapia alvo com o uso de proteínas de acordo com a invenção permite evitar o problema da baixa eficiência de terapias antiangiogênicas não específicas previamente conhecidas causadas por baixa permeabilidade dos vasos sanguíneos.
[0030] Além disso, descobriu-se que, em muitos casos, as proteínas de fusão da invenção são mais potentes do que TRAIL solúvel e suas variantes incluindo um fragmento da sequência. Até agora, os peptídeos efetores conhecidos utilizados na proteína de fusão da invenção não foram utilizados na medicina, como tal, devido às cinéticas desfavoráveis, rápida degradação por proteases não específicas ou acumulação no corpo causada pela falta de sequência adequada de ativação de vias, as quais são necessárias para permitir a ação adequada do peptídeo efetor no sítio alvo. A incorporação do peptídeo efetor na proteína de fusão permite a sua entrega seletiva ao sítio onde a sua ação é desejável. Além disso, a anexação do peptídeo efetor aumenta a massa de proteína, resultando em uma meia-vida prolongada e a retenção aumentada da proteína no tumor e sua eficiência melhorada.
[0031] Além disso, em muitos casos, as proteínas de fusão novas também ultrapassam a resistência ao TRAIL.
[0032] A invenção será agora descrita em detalhes com referência às figuras do desenho.
[0033] Fig. 1 apresenta uma estrutura esquemática das proteínas de fusão da invenção de acordo com o Ex. 1 Ex. 2, Ex. 3, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. 6.
[0034] Fig. 2 apresenta uma estrutura esquemática das proteínas de fusão da invenção de acordo com o Ex. 7, Ex. 8, Ex. 9, Ex. 10 e Ex. 11.
[0035] Fig. 3 apresenta uma estrutura esquemática das proteínas de fusão da invenção de acordo com o Ex. 12, Ex. 13, Ex. 14 e Ex. 15.
[0036] Fig. 4 mostra os espectros de dicroísmo circular para rhTRAIL95-281 e as proteínas de fusão de Ex. 1, Ex. 4, EX. 5, Ex. 9 e Ex. 14 expressa em elipticidade específica.
[0037] Fig. 5 apresenta as mudanças do volume tumoral (% do estágio inicial) em camundongos Crl:CD1- Foxn1nu sobrecarregados com câncer do cólon HCT116 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 1, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. 9 em comparação com rhTRAIL114-281
[0038] Fig. 6 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em 1 camundongo Crl:CD1-Foxn1nu sobrecarregado com câncer do cólon HCT116 tratado com as proteínas de fusão da invenção de z Ex. 1, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. 9 em comparação com rhTRAIL114-281.
[0039] Fig. 7 apresenta as alterações de volume tumoral (% de estágio inicial) em camundongo Crl:CD1-Foxn1nu sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 comparado ao rhTRAIL114-281
[0040] Fig. 8 apresenta os valores de inibição de crescimento do tumor (% TGI) em 1 camundongo Crl:CD1-Foxn1nu sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 comparado ao rhTRAIL114-281.
[0041] Fig. 9 apresenta uma estrutura esquemática das proteínas de fusão da invenção de acordo com o Ex. 16, Ex. 17, Ex. 18 e Ex. 19.
[0042] Fig. 10 apresenta as alterações de volume tumoral (% de estágio inicial) em camundongo Crl:CD1-Foxn1nu sobrecarregado com câncer de cólon HCT116 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 4, Ex. 9 e Ex. 1 comparado ao rhTRAIL114-281.
[0043] Fig. 11 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (%TGI) em 1 camundongo Crl:CD1-Foxn1nu sobrecarregado com câncer de cólon HCT116 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 4, Ex. 9 e Ex. 1 comparado ao rhTRAIL114-281.
[0044] Fig. 12 apresenta as alterações de volume tumoral (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de cólon HCT116 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 11 comparado ao rhTRAIL114-281.
[0045] Fig. 13 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de cólon HCT116 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 11 comparado ao rhTRAIL114-281.
[0046] Fig. 14 apresenta as alterações de volume tumoral (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de cólon Colo205 tratado com proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex.19 comparado com rhTRAIL114-281.
[0047] Fig. 15 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de cólon Colo205 tratado com proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex.19 comparado com rhTRAIL114-281.
[0048] Fig. 16 apresenta as alterações de volume tumoral (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de cólon SW620 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 11 em relação ao rhTRAIL114-281.
[0049] Fig. 17 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de cólon SW620 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 11 comparado ao rhTRAIL114-281.
[0050] Fig. 18 apresenta as alterações de volume do tumor (% de estágio inicial) em camundongo Cby.Cg- foxn1(nu)/J sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratado com a proteína de fusão da invenção de Ex. 1 comparado com rhTRAIL114-281.
[0051] Fig. 19 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongo Cby.Cg- foxn1(nu)/J sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratadas com a proteína de fusão da invenção de Ex. 1 comparado com rhTRAIL114-281.
[0052] Fig. 20 apresenta mudanças de volume tumoral (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO-PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de pulmão NCI-H460 tratado com a proteína de fusão da invenção de Ex. 6 comparado com rhTRAIL114-281.
[0053] Fig. 21 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de pulmão NCI-H460 tratado com a proteína de fusão da invenção de Ex. 6 comparado com rhTRAIL114-281.
[0054] Fig. 22 apresenta alterações no volume do tumor (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratado com proteína de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 6, Ex. 11 comparado com rhTRAIL114-281.
[0055] Fig. 23 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratado com a proteína de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 6, Ex. 11 comparado com rhTRAIL114-281.
[0056] Fig. 24 apresenta alterações de volume tumoral (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de pulmão NCI-H460- Luc2 tratado com proteína de fusão da invenção de Ex.5 comparado com rhTRAIL114-281.
[0057] Fig. 25 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de pulmão NCI-H460- Luc2 tratado com proteína de fusão da invenção de Ex. 5 comparado com rhTRAIL114-281.
[0058] Fig. 26 apresenta mudanças de volume tumoral (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO-PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 1 e comparado com rhTRAIL114-281.
[0059] Fig. 27 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex.5, Ex.1 e comparado com rhTRAIL114-281.
[0060] Fig. 28 apresenta mudanças de volume tumoral (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO-PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de fígado PLC/PRF/5 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 11 em comparação com rhTRAIL114-281.
[0061] Fig. 29 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de fígado PLC/PRF/5 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 11 comparado com rhTRAIL114-281.
[0062] Fig. 30 apresenta alterações no volume do tumor (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de fígado HepG2 tratado com as proteínas de fusão da invenção do Ex. 6 e Ex.19 comparado com rhTRAIL114-281
[0063] Fig. 31 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de fígado com HepG2 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex.19 comparado com rhTRAIL114-281.
[0064] Fig. 32 apresenta mudanças de volume tumoral (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO-PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de pâncreas PANC-1 tratado com proteína de fusão da invenção de Ex. 11 comparado com rhTRAIL114-281.
[0065] Fig. 33 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com câncer de pâncreas PANC-1 tratado com proteína de fusão da invenção de Ex. 11 comparado com rhTRAIL114-281.
[0066] Fig. 34 apresenta mudanças de volume tumoral (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO-PrkdcscidHrhr sobrecarregado com sarcoma uterino humano resistente aos múltiplos medicamentos MES-SA/Dx5 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 19 comparado com rhTRAIL114-281.
[0067] Fig. 35 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TGI) em camundongo Crl:SHO- PrkdcscidHrhr sobrecarregado com sarcoma uterino humano resistente aos múltiplos medicamentos MES-SA/Dx5 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 19 comparado com rhTRAIL114-281.
[0068] A invenção refere-se a uma proteína de fusão compreendendo: - domínio (a), o qual é o fragmento funcional de uma sequência de proteína solúvel hTRAIL, a qual o fragmento que começa com um aminoácido em uma posição não inferior a hTRAIL95 ou um homólogo do referido fragmento funcional tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, e - domínio (b) que é uma sequência de um peptídeo efetor antiangiogênico, em que a sequência do domínio (b) está ligado ao terminal-C e/ou N-terminal do domínio (a); com a condição de que as proteínas de fusão são excluídas onde o peptídeo efetor é selecionado a partir do grupo consistindo em calreticulina, tumstatina 183-230, cininogênio D5, vasostatina, cininostatina e canstatina.
[0069] O termo "o fragmento solúvel funcional de uma sequência de hTRAIL solúvel" deve ser entendido como denotando qualquer fragmento do hTRAIL solúvel que é capaz de induzir sinal de apoptose em células de mamífero por ligação aos seus receptores na superfície das células.
[0070] Será também apreciado por um perito versado na técnica que a existência de pelo menos 70% de homologia da sequência de TRAIL é conhecida na técnica.
[0071] Deve ser entendido que o domínio (b) do peptídeo efetor na proteína de fusão da invenção não é nem a proteína hTRAIL nem uma parte ou fragmento da proteína hTRAIL.
[0072] O termo "peptídeo" em conformidade com a invenção deve ser entendido como construção da molécula a partir de uma pluralidade de aminoácidos ligados juntos por meio de uma ligação peptídica. Assim, o termo "peptídeo" de acordo com a invenção inclui polipeptídeos, oligopeptídeos e proteínas.
[0073] Na presente invenção, as sequências de aminoácidos de peptídeo serão apresentadas de uma maneira convencional adotada na técnica na direção do N-terminal (N- extremidade) do peptídeo em direção ao seu C-terminal (C- extremidade). Qualquer sequência terá, assim, o seu N- terminal na lateral esquerda e o C-terminal na lateral direita da sua apresentação linear.
[0074] A proteína de fusão da invenção incorpora pelo menos um domínio (b) do peptídeo efetor, ligado ao C- terminal ou N-terminal do domínio (a).
[0075] Em uma modalidade particular, o domínio (a) é um fragmento de sequência hTRAIL, começando com um aminoácido a partir da faixa de hTRAIL95 até hTRAIL121, inclusive, e que termina com o aminoácido hTRAIL 281.
[0076] Em particular, o domínio (a) pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em sequências correspondentes a hTRAIL95-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 e hTRAIL121-281. Será evidente para os peritos na técnica que hTRAIL95-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 e hTRAIL121- 281 representam um fragmento da proteína TRAIL humana iniciado com aminoácidos marcados com o número 95, 119, 120 e 121, respectivamente, na sequência conhecida do hTRAIL (SEQ No 16), publicada no GenBank sob No. de Acesso P50591.
[0077] Em outra modalidade particular, o domínio (a) é um homólogo de um fragmento funcional de sequência de proteína hTRAIL solúvel iniciando na posição de aminoácido não inferior a hTRAIL95 e terminando no aminoácido hTRAIL281, a sequência dos quais é pelo menos em 70%, de preferência em 85%, idêntica à sequência original.
[0078] Em variantes específicas desta modalidade, o domínio (a) é um homólogo de um fragmento selecionado a partir do grupo consistindo em sequências correspondentes a hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL116-281, hTRAIL120-281,hTRAIL122-281.
[0079] Deve entender-se que um homólogo de um fragmento de hTRAIL é uma variação/alteração da sequência de aminoácidos desse fragmento, em que pelo menos um aminoácido é modificado, incluindo 1 aminoácido, 2 aminoácidos, 3 aminoácidos, 4 aminoácidos, 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, e não mais do que 15% de aminoácidos, e em que um fragmento da sequência modificada tem a funcionalidade preservada da sequência hTRAIL, ou seja, a capacidade de ligar aos receptores de morte da superfície celular e induzir a apoptose em células de mamíferos. A modificação da sequência de aminoácidos pode incluir, por exemplo, substituição, eliminação e/ou adição de aminoácidos.
[0080] Preferencialmente, o homólogo do fragmento de hTRAIL possuindo uma sequência modificada mostra uma afinidade modificada para os receptores de morte DR4 (TRAIL- R1) ou DR5 (TRAIL-R2), em comparação com o fragmento nativo de hTRAIL.
[0081] O termo "afinidade modificada" refere-se a uma afinidade aumentada e/ou uma afinidade com a seletividade do receptor alterada.
[0082] Preferencialmente, o homólogo do fragmento de hTRAIL possuindo a sequência modificada mostra afinidade aumentada para os receptores de morte DR4 e DR5 comparado ao fragmento do hTRAIL nativo.
[0083] Particularmente, preferencialmente, o homólogo de um fragmento hTRAIL possuindo a sequência modificada mostra afinidade aumentada para o receptor de morte DR5, em comparação com o receptor de morte DR4, ou seja, uma seletividade aumentada de DR5/DR4.
[0084] Também, preferencialmente, o homólogo de um fragmento de hTRAIL possuindo a sequência modificado mostra um aumento da seletividade na direção de receptores de morte DR4 e/ou DR5 em relação à afinidade para os receptores de DR1 (TRAIL-R3) e/ou DR2 (TRAIL-R4).
[0085] Modificações de hTRAIL resultando em afinidade e/ou seletividade aumentada na direção aos receptores de morte DR4 e DR5 são conhecidas pelos peritos versados na técnica, por exemplo a partir da publicação Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. Variantes (TRAIL) de ligante DR4 de indução de apoptose relacionadas ao fator de necrose tumoral obtidas pelo projeto baseado em estrutura. J. Biol. Chem. 2008 Jul 18, 283(29):20560-8, que descreve a mutação D218H tendo seletividade aumentada para DR4, ou Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova PT, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Geração de novos mutantes TRAIL DR5-A e DR5-B com seletividade aumentada ao receptor de morte 5, Apoptose. 2009 Jun;14(6):778-87, que descreve a mutação D269H tendo uma afinidade reduzida em direção ao DR4. Mutantes hTRAIL resultando em afinidade aumentada em direção a um receptor selecionado a partir do DR4 e DR5 em comparação com receptores de DR1 e DR2 e afinidade aumentada em direção ao receptor de DR5 comparando com DR4 são também descritos em WO2009077857 e WO2009066174.
[0086] As mutações adequadas são uma ou mais mutações nas posições de hTRAL nativa selecionadas a partir do grupo consistindo em 131, 149, 159, 193, 199, 201, 204, 204, 212, 215, 218 e 251, em particular, as mutações que envolvem a substituição de um aminoácido com um aminoácido básico tal como lisina, arginina ou histidina, ou aminoácidos, tais como ácido glutâmico ou ácido aspárgico. Particularmente, uma ou mais mutações selecionadas a partir do grupo que consiste em G131R, G131K, R149I, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201H, K201R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251D, K251E e K251Q, como descritas em WO2009066174, podem ser especificadas.
[0087] As mutações adequadas são também uma ou mais mutações nas posições de hTRAL nativa selecionadas a partir do grupo consistindo em 195, 269 e 214, em particular, as mutações que envolvem a substituição de um aminoácido com um aminoácido básico tal como lisina, arginina ou histidina. Particularmente, pode ser especificada uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em D269H, E195R, e T214R, tal como descritas em WO2009077857, podem ser especificadas.
[0088] Em uma modalidade particular, o domínio (a) que é um homólogo do fragmento de hTRAIL é selecionado a partir do mutante D218H da sequência TRAIL nativa, tal como descrito em WO2009066174, ou o mutante Y189N-R191K-Q193R- H264R-I266R-D269H da sequência TRAIL nativa, tal como descrito em Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun; 14(6):778-87.
[0089] O domínio (b) pode ser, em particular, selecionado a partir do seguinte grupo: - inibidores de receptores de fatores de crescimento selecionados a partir de receptores para VEGF, PDGF e EGF; - tumstatina ou seus fragmentos, exceto o fragmento 183-230, e - inibidores de N-aminopeptidase (CD13).
[0090] Dentro do grupo de inibidores de receptores de fatores de crescimento, o peptídeo efetor de domínio (b) pode ser um fragmento de fator de crescimento endotelial vascular VEGF humano que se liga ao receptor VEGF competitivamente ao ligante natural, apesar de estar destituído em si de atividade angiogênica. Como uma consequência, a atividade angiogênica do VEGF é bloqueada, não há estimulação da formação de novos vasos de sangue e o crescimento do tumor é inibido. Em particular, o peptídeo efetor do grupo acima é o peptídeo que inibe a via de sinal do VEGF e, especificamente, o fragmento de 7-aminoácido de VEGF humano apresentada pela SEQ. No. 17 na Listagem de Sequências anexa.
[0091] Acredita-se que o peptídeo compreendendo a sequência de heptapeptídeo VEGF incorporada a proteína de fusão da invenção elimine eficazmente as células cancerosas através da inibição do processo de angiogênese.
[0092] Também dentro do grupo de inibidores de receptores para fatores de crescimento, o peptídeo efetor de domínio (b) pode ser um fragmento do Fator de Crescimento Derivado da Plaqueta PDGF, o qual se liga ao receptor PDGF competitivamente ao ligante natural apesar de estar destituído em si de atividade angiogênica. Como uma consequência, a atividade angiogênica de PDGF é bloqueada, não há estimulação da formação de novos vasos de sangue e o crescimento do tumor é inibido.
[0093] Em particular, tal peptídeo efetor é um peptídeo de 19-aminoácido - um fragmento do ligante PDGF, mostrado por uma sequência de SEQ. No. 22 na Listagem de Sequências anexa.
[0094] Acredita-se que o peptídeo compreendendo a sequência de um fragmento da proteína PDGF Fator de Crescimento Derivado da Plaqueta incorporada na proteína de fusão da invenção elimina eficazmente as células de câncer através de inibição do processo de angiogênese.
[0095] Também dentro do grupo de inibidores de receptores de fatores de crescimento, o peptídeo efetor antiangiogênico de domínio (b) pode ser um fragmento de peptídeo de EGF Fator de Crescimento Epidérmico, o qual se liga ao receptor de EGF competitivamente ao ligante natural, apesar de estar destituído em si de atividade angiogênica. Como consequência, a atividade angiogênica do EGF é bloqueada, não há estimulação da formação de novos vasos de sangue e o crescimento do tumor é inibido. Esses peptídeos de bloqueio Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu e Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu capazes de se ligar ao receptor EGF sem ativação da quinase intracelular e bloquear a atividade EGR são conhecidos, por exemplo, a partir de EP0641358. Em particular, tal peptídeo efetor- um fragmento de ligante de EGF, é representado por uma sequência de SEQ. No. 23 na Listagem de Sequência anexa.
[0096] Acredita-se que o peptídeo compreendendo a sequência de Fator de Crescimento Epidérmico EGF incorporado na proteína de fusão da invenção elimine eficazmente as células cancerosas através da inibição do processo de angiogênese.
[0097] Dentro do grupo de tumstatina e seus fragmentos de peptídeo efetor de domínio (b) pode ser um fragmento de 25-aminoácido da proteína de tumstatina (fragmento I), mostrada pela sequência de SEQ. No. 18 na Listagem de Sequência anexa. O peptídeo efetor do grupo apresentado acima é também outro fragmento de 18-aminoácidos da proteína tumstatina (fragmento II), ilustrada por uma sequência de SEQ. No. 19 na Listagem de Sequência anexa. O peptídeo efetor antiangiogênico de domínio (b) pode ser também uma combinação de fragmentos peptídicos de tumstatina, em particular, o fragmento e o fragmento II, localizado próximo ao outro, em qualquer ordem. Em uma modalidade, o domínio (b) é uma combinação de fragmentos I/fragmento II (SEQ. No 18/SEQ. No 19) ou uma combinação de fragmento II/fragmento I (SEQ. No 19/SEQ. No 18).
[0098] Acredita-se que o peptídeo compreendendo a sequência do fragmento de proteína tumstatina I e/ou II incorporada na proteína de fusão da invenção elimine eficazmente as células cancerosas através da inibição do processo de angiogênese.
[0099] O grupo dos inibidores da N-aminopeptidase/CD13, que se liga com enzima N- aminopeptidase/CD13 para inibir a sua atividade inclui pequenos peptídeos, contendo motivos de NGR ou RGD.
[00100] Os peptídeos incluindo motivos NGR que se ligam eficientemente a N-aminopeptidase são descritos, por exemplo, por Arap et al., Science, 279:377-380, 1998. No domínio extracelular de N-aminopeptidase, um fragmento apresentando afinidade para o motivo RGD também está presente. Ambos os motivos (RGD e NGR) ligam como antagonistas com fatores envolvidos no processo da neovascularização. Portanto, é provável que o motivo RGD semelhante ao motivo NGR ligue-se com a N-aminopeptidase e, consequentemente, atue como seu inibidor (Friedlander et al. Definition of two angiogenic pathways by distinct av integrings. Science (Washington DC), 270: 1500-1502, 1995; Pasqualini et al. Aminopeptidase N is a receptor for tumorhoming peptides and a target for inhibiting angiogenesis. Cancer Res. 2000 Feb 1; 60(3) :722-7).
[00101] Dentro do grupo dos inibidores da N- aminopeptidase/CD13, o peptídeo de efetor antiangiogênico de domínio (b) pode ser um peptídeo de 5-aminoácido ligando-se ao CD13 mostrado pela SEQ. No. 20 na Listagem de Sequência anexa. Outro peptídeo efetor deste grupo é também o peptídeo de 9-aminoácidos ligando-se ao CD13, mostrado pela SEQ. No. 21 na Listagem de Sequência anexa.Acredita-se que o peptídeo compreendendo a sequência do fragmento de proteína de ligação com N- aminopeptidase/CD13 incorporado na proteína de fusão da invenção elimine eficazmente as células cancerosas através da inibição do processo de angiogênese.
[00102] As proteínas de fusão da invenção podem compreender mais do que um peptídeo efetor do domínio (b), em particular, dois ou três domínios de (b). Em uma modalidade, a proteína de fusão da presente invenção contém dois domínios (b) efetores semelhantes ou diferentes, selecionados a partir de SEQ. No. 17, SEQ. No. 18, SEQ. No. 19, SEQ. No.20, SEQ. No.21, SEQ. No.22 e SEQ. No.23, em que os domínios (b) efetores estão localizados próximos um do outro. Em outra modalidade, a proteína de fusão da presente invenção contém dois domínios (b) efetores semelhantes ou diferentes, selecionados a partir de SEQ. No. 17, SEQ. No. 18, SEQ. No. 19, SEQ. No.20, SEQ. No.21, SEQ. No.22 e SEQ. No.23, em que os domínios (b) efetores estão localizados na região N-terminal e/ou C-terminal do domínio (a).
[00103] Em uma modalidade particular, a proteína de fusão da presente invenção compreende três domínios efetores.
[00104] Como um exemplo, a proteína de fusão compreende o peptídeo derivado a partir de VEGF (SEQ. No. 17), localizado na extremidade N-terminal do domínio (a) e na extremidade C-terminal do domínio (a) localizado próximo um do outro fragmento I de tumstatina (SEQ. No. 18) e fragmento II da tumstatina (SEQ. No. 19).
[00105] Em modalidades específicas da proteína de fusão da invenção, o peptídeo efetor é um peptídeo tendo uma atividade antiangiogênica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. No. 17 (heptapeptídeo derivado de VEGF), SEQ. No. 18 (um fragmento I (aminoácidos 74-98) da proteína de tumstatina), SEQ. No. 19 (um fragmento II (aminoácidos 197-214) da proteína de tumstatina), SEQ. No. 20 (um peptídeo de ligação a CD13), SEQ. No. 21 (um peptídeo de ligação a CD13), SEQ. No. 22 (um fragmento de PDGF) e SEQ. No. 23 (um fragmento de EGF).
[00106] Após ligar aos receptores TRAIL presentes na superfície das células cancerosas, a proteína de fusão exercerá um efeito duplo. Domínio (a), que é um fragmento funcional de TRAIL ou seu homólogo com funcionalidade preservada, exercerá a sua atividade agonística conhecida - ou seja, a ligação aos receptores de morte na superfície das células e a ativação da via extrínseca da apoptose. Após internalização da proteína de fusão compreendendo o peptídeo antiangiogênico, o domínio (b) será capaz de exercer a sua ação potencialmente intracelularmente em paralelo com a atividade do domínio de TRAIL. Deste modo, a atividade anticancerígena de TRAIL pode ser potencializada pela ativação de outros elementos e mecanismos, tais como a inibição estérica do sítio de ligação do VEGF natural, PDGF e ligantes de EGF, a inibição da angiogênese e neovascularização, a inibição da ativação de fosfatidilinositol-3-quinase, proteína quinase B (PKB/Akt) ou estimulação indireta da super-expressão de TRAIL por quinase via Akt e NFk.
[00107] Em uma das modalidades da invenção, o domínio (a) e o domínio (b) estão ligados por pelo menos um domínio (c) que compreende a sequência de um sítio de clivagem reconhecido por proteases presentes no ambiente celular, especialmente, no ambiente de célula tumoral. A ligação do domínio (a) com o domínio (b), em pelo menos um domínio (c) significa que entre os domínios de (a) e (b) mais do que um domínio (c) podem estar presentes, em particular, um ou dois domínios (c).
[00108] Um sítio de clivagem de protease pode ser selecionado a partir de: - Uma sequência reconhecida pela metaloprotease de MMP, em particular (Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP) designada como SEQ. No. 24, ou (Pro Leu Gly Ile Ala Gly Glu/PLGIAGE) designado como SEQ. No. 55, ou (Pro Leu Gly Leu Ala Gly GluPro/PLGLAGEP) designada como SEQ. No. 56, - uma sequência reconhecida pela uroquinase de uPA, em particular, Arg Val Val Arg (RVVR na convenção de uma letra) designada como SEQ. No. 25 ou um fragmento da mesma, que com o último aminoácido da sequência, ao qual está ligado, forma SEQ. No. 25, e suas combinações.
[00109] Em uma das modalidades da invenção, o sítio de clivagem da protease é uma combinação da sequência reconhecida pela metaloprotease de MMP e uma sequência reconhecida pela uroquinase uPA, localizada próximo um do outro, em qualquer ordem.
[00110] Em uma modalidade, o domínio (c) é uma combinação de MMP/uPA SEQ. No. 24/SEQ. No. 25 ou uma combinação de uPA/MMP SEQ. No. 25/SEQ. No. 24.
[00111] Em outra modalidade, o domínio (c) é uma combinação de MMP/uPA SEQ. No. 55/SEQ. No. 25 ou uma combinação de uPA/ MMP SEQ. No. 25/SEQ. No. 55.
[00112] Em outra modalidade, o domínio (c) é uma combinação de MMP/uPA SEQ. No. 56/SEQ. No. 25 ou uma combinação de uPA/MMP SEQ. No. 25/SEQ. No. 56.
[00113] As proteases metaloproteases MMP e uroquinases uPA são super-expressas no ambiente tumoral. A presença da sequência reconhecida pela protease permite a clivagem do domínio (a) a partir do domínio (b), isto é, a liberação do domínio (b) funcional e, assim, a sua ativação.
[00114] A presença do sítio de clivagem da protease, permitindo a liberação rápida do peptídeo efetor, aumenta as possibilidades de transportar o peptídeo para o local da sua ação antes que a degradação aleatória da proteína de fusão por proteases presentes na célula ocorra.
[00115] Além dos principais elementos funcionais da proteína de fusão, o(s) domínio(s) do sítio de clivagem, as proteínas de fusão da invenção podem conter uma sequência neutra/sequências de um ligador glicina-cisteína-alanina estérico flexível (espaçador). Estes ligadores/espaçadores são bem conhecidos e descritos na literatura. Sua incorporação dentro da sequência da proteína de fusão destina-se a fornecer a dobragem correta de proteínas produzidas pelo processo da sua super-expressão nas células hospedeiras.
[00116] Em particular, o ligador estérico flexível pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ. No. 26 e SEQ. No. 27, os quais são combinações de resíduos de glicina, de cisteína e de alanina. Em outra modalidade, o ligador estérico flexível pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ. No. 28, SEQ. No. 29, SEQ. No. 30 e SEQ. No. 54, que consiste em resíduos de glicina e serina. Adicionalmente, o ligador estérico flexível pode ser qualquer fragmento da SEQ. No. 28, SEQ. No. 29, SEQ. No. 30 e SEQ. No. 54, atuando como um agente de ligação estérico flexível, por exemplo, um fragmento Gly Gly Gly/GGG ou um fragmento Gly Gly/GG.
[00117] Em uma modalidade, o ligador estérico flexível também pode ser selecionado a partir de resíduo único de aminoácido, tal como resíduo único de ácido glutâmico, cisteína, serina, prolina ou resíduo de glicina.
[00118] Em outra modalidade, o ligador estérico flexível pode ser qualquer combinação de ligadoroes consistindo em SEQ. No. 26, SEQ. No. 27, SEQ. No. 28, SEQ. No. 29, SEQ. No. 30, SEQ. No. 54 e resíduos de aminoácidos únicos de resíduos de ácido glutâmico, cisteína, serina, prolina ou glicina.
[00119] Modalidades particulares da proteína da fusão da presente invenção são proteínas de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ. No. 1, SEQ. No. 2, SEQ. No. 4, SEQ. No. 5, SEQ. No. 6 e SEQ. No. 46, SEQ. No. 47 e SEQ. No. 48, compreendendo um peptídeo efetor como um heptapeptídeo derivado de VEGF.
[00120] Outra modalidade específica da proteína de fusão da invenção é a proteína de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ. No. 7 e SEQ. No. 8, que compreende as sequências peptídicas efetoras que se ligam ao CD13.
[00121] Outra modalidade específica da proteína de fusão da invenção é a proteína de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ. No. 9, SEQ. No. 10, SEQ. No. 11 e SEQ. No. 49 compreendendo um peptídeo efetor como um fragmento de PDGF.
[00122] Outra modalidade específica da proteína de fusão da invenção é a proteína de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ. No. 12 e SEQ. No. 13, compreendendo como uma tumstatina de peptídeo efetor e fragmentos II.
[00123] Outra modalidade específica da proteína de fusão da invenção é a proteína de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ. No. 14 e SEQ. No. 15, compreendendo um peptídeo efetor como um fragmento de EGF.
[00124] Modalidades particulares da proteína de fusão da presente invenção são proteínas de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas SEQ. No. 3, compreendendo como um peptídeo efetor um heptapeptídeo derivado de VEGF, o fragmento I de peptídeo de tumstatina e fragmento II de peptídeo de tumastina.
[00125] Uma descrição detalhada da estrutura das proteínas de fusão representativas acima mencionadas são mostradas nas Figuras 1 a 3 e na Fig. 9, e nos Exemplos aqui apresentados abaixo.
[00126] De acordo com a presente invenção, por proteína de fusão, entende-se uma única molécula de proteína que contém duas ou mais proteínas ou seus fragmentos, ligadas covalentemente através da ligação peptídica nas respectivas cadeias peptídicas, sem ligadores químicos adicionais.
[00127] A proteína de fusão também pode ser alternativamente descrita como um construto de proteína ou uma proteína quimérica. De acordo com a presente invenção, os termos "construto" ou "proteína quimérica", se utilizado, deve ser entendido como se referindo à proteína de fusão, tal como definido acima.
[00128] Para uma pessoa versada na técnica será evidente que a proteína de fusão assim definida pode ser sintetizada por métodos conhecidos de síntese química de peptídeos e proteínas.
[00129] A proteína de fusão pode ser sintetizada por métodos de síntese química de peptídeo, especialmente utilizando as técnicas de síntese de peptídeo em fase sólida, utilizando resinas adequadas como veículos. Tais técnicas são convencionais e conhecidas na técnica, e descritas, inter alia, nas monografias, tais como, por exemplo, Bodanszky e Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company.
[00130] A proteína de fusão pode ser sintetizada pelos métodos de síntese química de peptídeo como uma proteína contínua. Alternativamente, os fragmentos individuais (domínios) da proteína podem ser sintetizados separadamente e depois combinados juntos no peptídeo contínuo através de uma ligação peptídica, por condensação do amino terminal de um fragmento de peptídeo a partir do terminal de carboxila do segundo peptídeo. Tais técnicas são convencionais e bem conhecidas.
[00131] Para a verificação da estrutura do peptídeo resultante, métodos conhecidos da análise da composição de aminoácidos dos peptídeos podem ser utilizados, tais como a técnica de espectrometria de massa de alta resolução para determinar o peso molecular do peptídeo. Para confirmar a sequência do peptídeo, sequenciadores de proteínas também podem ser usados, os quais degradam sequencialmente o peptídeo e identificam a sequência de aminoácidos.
[00132] De preferência, no entanto, a proteína de fusão da invenção é uma proteína recombinante gerada por métodos de expressão de genes de uma sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão em células hospedeiras.
[00133] Um aspecto adicional da invenção é a sequência de polinucleotídeo, em particular, a sequência de DNA que codifica uma proteína de fusão, tal como definido acima.
[00134] De preferência, a sequência de polinucleotídeo, em particular, de DNA, de acordo com a invenção, que codifica a proteína de fusão, tal como definido acima, é uma sequência otimizada para a expressão em E. coli.
[00135] Outro aspecto da invenção é também um vetor de expressão contendo a sequência de polinucleotídeos, em particular, a sequência de DNA da invenção, como definida acima.
[00136] Outro aspecto da invenção é também uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão como definido acima.
[00137] Uma célula hospedeira preferencial para a expressão de proteínas de fusão da invenção é uma célula E. coli.
[00138] Métodos para a geração de proteínas recombinantes, incluindo as proteínas de fusão, são bem conhecidos. Em resumo, esta técnica consiste na geração da molécula de polinucleotídeo, por exemplo, a molécula de DNA que codifica a sequência de aminoácidos da proteína alvo e direciona a expressão da proteína alvo no hospedeiro. Em seguida, a proteína alvo que codifica a molécula de polinucleotídeo é incorporada num vetor de expressão adequado, o que garante uma expressão eficaz do polipeptídeo. Vetor de expressão recombinante é então introduzido nas células hospedeiras para a transfecção/transformação, e, como resultado, uma célula hospedeira transformada é produzida. Isto é seguido por uma cultura de células transformadas para super-expressar a proteína alvo, a purificação de proteínas obtidas e, opcionalmente, cortar por clivagem as sequências marcadoras utilizadas para a expressão ou a purificação da proteína.
[00139] As técnicas adequadas de expressão e purificação são descritas, por exemplo, na monografia Goeddel, Gene Expression Tecnology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), e A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995.
[00140] Cosmídeos, plasmídeos ou vírus modificados podem ser utilizados como vetores de expressão para a introdução e replicação das sequências de DNA em células hospedeiras. Tipicamente, os plasmídeos são usados como vetores de expressão. Plasmídeos adequados são bem conhecidos e estão disponíveis comercialmente.
[00141] O vetor de expressão da invenção compreende uma molécula de polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão da presente invenção e as sequências reguladoras necessárias para a transcrição e tradução da sequência de codificação incorporadas numa célula hospedeira adequada. A seleção das sequências reguladoras é dependente do tipo de células hospedeiras e pode ser facilmente realizada por um perito versado na técnica. Exemplos de tais sequências reguladoras são promotores de transcrição e intensificador ou sequência de ligação da polimerase de RNA, sequência de ligação ao ribossoma, contendo o sinal de iniciação de transcrição, introduzido antes da sequência de codificação, e uma sequência finalizadora de transcrição, introduzida depois da sequência de codificação. Além disso, dependendo da célula hospedeira e o vetor utilizado, outras sequências podem ser introduzidas no vetor de expressão, tal como a origem de replicação, sítios de restrição adicionais de DNA, intensificadores, e sequências que permitem a indução de transcrição.
[00142] O vetor de expressão também compreenderá uma sequência de gene marcador, que confere o fenótipo definido para a célula transformada e permite uma seleção específica de células transformadas. Além disso, o vetor pode também conter uma segunda sequência de marcador que permite distinguir as células transformadas com o plasmídeo recombinante contendo a sequência de codificação inserida da proteína alvo a partir daqueles recolheu até o plasmídeo sem a inserção. Mais frequentemente, os marcadores de resistência a antibióticos típicos são utilizados, no entanto, quaisquer outros genes repórteres conhecidos no campo podem ser utilizados, cuja presença em uma célula (in vivo) pode ser facilmente determinados utilizando técnicas de autoradiografia, espectrofotometria ou bioluminescência e quimoluminescência. Por exemplo, dependendo da célula hospedeira, os genes repórteres, tais como β-galactosidase, β-glucuronidase, luciferase, cloranfenicol acetiltransferase ou a proteína verde fluorescente podem ser utilizados.
[00143] Além disso, o vetor de expressão pode conter sequência de sinal, transportar as proteínas para o compartimento celular apropriado, por exemplo, periplasma, onde a dobragem é facilitada. Além disso, uma sequência que codifica uma etiqueta/marca, tal como HisTag anexada ao N- terminal ou GST anexado ao C-terminal, pode estar presente, que facilita a purificação subsequente da proteína produzida utilizando o princípio da afinidade, através da cromatografia de afinidade em uma coluna de níquel. Sequências adicionais que protegem a proteína contra a degradação proteolítica nas células hospedeiras, bem como as sequências que aumentam a sua solubilidade também podem estar presentes.
[00144] Elemento auxiliar ligado à sequência da proteína alvo pode bloquear a sua atividade, ou ser prejudicial por outro motivo, tal como, por exemplo, devido à toxicidade. Tal elemento deve ser removido, o que pode ser conseguido por clivagem enzimática ou química. Em particular, uma etiqueta HisTag de seis histidina ou outros marcadores desse tipo anexado para permitir a purificação da proteína por cromatografia de afinidade deve ser removida, por causa de seu efeito descrito na toxicidade para o fígado de proteína TRAIL solúvel. Podem ser utilizados sistemas de expressão heterólogos baseados em várias células hospedeiras bem conhecidas, incluindo as células procarióticas: infecções bacterianas, tais como Escherichia coli ou Bacillus subtilis, leveduras, tais como Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris, e linhas de células eucarióticas (insetos, mamíferos, plantas).
[00145] De preferência, devido à facilidade de cultivo e manipulação genética, e uma grande quantidade de produto obtido, o sistema de expressão de E. coli é utilizado. Por conseguinte, a sequência de polinucleotídeo que contém a sequência alvo que codifica a proteína de fusão da invenção otimizará para expressão em E. coli, ou seja, que irá conter os códons na sequência de codificação ótimos para expressão em E. coli, selecionados a partir das possíveis variantes de sequências conhecidas no estado da técnica. Além disso, o vetor de expressão conterá os elementos acima descritos adequados para E. coli ligado à sequência de codificação.
[00146] Por conseguinte, em uma modalidade preferida da invenção, uma sequência de polinucleotídeo compreendendo uma sequência que codifica uma proteína de fusão da invenção, otimizada para a expressão em E. coli é selecionada a partir do grupo de sequências polinucleotídicas constituídas por:SEQ. No. 31; SEQ. No. 32; SEQ. No. 33, SEQ. No. 34; SEQ. No. 35; SEQ. No. 36; SEQ. No. 37; SEQ. No. 38; SEQ. No. 39; SEQ. No. 40; SEQ. No. 41, SEQ. No. 42; SEQ. No. 43, SEQ. No. 44; SEQ. No. 45, SEQ. No. 50, SEQ. No. 51, SEQ. No. 52; SEQ. No. 53, as quais codificam uma proteína de fusão possuindo uma sequência de aminoácidos correspondente às sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo consistindo em sequências de aminoácidos, respectivamente:SEQ. No. 1; SEQ. No. 2; SEQ. No. 3; SEQ. No. 4;SEQ. No. 5; SEQ. No. 6; SEQ. No. 7; SEQ. No. 8; SEQ. No. 9; SEQ. No. 10; SEQ. No. 11, SEQ. No. 12, SEQ. No. 13; SEQ. No. 14 SEQ. No. 15, SEQ. No. 46; SEQ. No. 47; SEQ. No. 48; e SEQ. No. 49.
[00147] Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona também um vetor de expressão adequado para a transformação de E. coli, compreendendo a sequência polinucleotídica selecionada a partir do grupo de sequências polinucleotídica SEQ. No. 31 a SEQ. No. 45 e SEQ. No. 50 a SEQ. No. 53 acima indicada, assim como a célula de E. coli transformada com tal vetor de expressão.
[00148] A transformação, isto é, a introdução de uma sequência de DNA em células hospedeiras bacterianas, particularmente, E. coli, é normalmente realizada sobre as células competentes preparadas para recolher o DNA, por exemplo, por tratamento com íons de cálcio a baixa temperatura (4°C), e submetendo, posteriormente, a choque de calor (em 37-42°C) ou por eletroporação. Tais técnicas são bem conhecidas e são, geralmente, determinadas pelo fabricante do sistema de expressão ou estão descritas na literatura e manuais para o trabalho de laboratório, tais como Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).
[00149] O procedimento de super-expressão de proteínas de fusão da invenção em sistema de expressão de E. coli será ainda descrito abaixo.
[00150] A invenção também proporciona uma composição farmacêutica contendo a proteína de fusão da invenção, tal como definida acima como um princípio ativo e um veículo farmaceuticamente aceitável adequado, diluentes e componentes auxiliares convencionais. A composição farmacêutica conterá uma quantidade eficaz da proteína de fusão da invenção e componentes auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, dissolvidos ou dispersos em um veículo ou diluente, e de preferência estará na forma de uma composição farmacêutica formulada em uma forma de dosagem unitária ou uma formulação contendo uma pluralidade de doses. As formas farmacêuticas e os métodos para a sua formulação, assim como outros componentes, veículos e diluentes são conhecidos dos peritos versados na técnica e descritos na literatura. Por exemplo, eles são descritos na monografia em Remington’s Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA.
[00151] Os termos "veículo farmaceuticamente aceitável, diluente, e ingrediente auxiliar" compreendem quaisquer solventes, meios de dispersão, agentes tensoativos, antioxidantes, estabilizantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, conhecidos na técnica. A composição farmacêutica da invenção pode conter diversos tipos de veículos, diluentes e excipientes, dependendo da via de administração escolhida e da forma de dosagem desejada, tais como as formas de líquidos, sólidos e aerossóis para administração oral, parenteral, por inalação, tópica, e que se selecionada a forma deve ser estéril, para a via de administração, tais como por injeção. A via preferida de administração da composição farmacêutica de acordo com a invenção é parenteral, incluindo as vias de injeção, tais como administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal, intratumoral, ou por infusões intravenosas únicas ou contínuas.
[00152] Em uma modalidade, a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por injeção direta no tumor. Em outra modalidade, a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por via intravenosa. Ainda em outra modalidade, a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por via subcutânea ou intraperitoneal. Uma composição farmacêutica para administração parenteral pode ser uma solução ou dispersão em meio aquoso ou não aquoso farmaceuticamente aceitável, tamponada em um pH adequado e isosmótico com os fluidos corporais, se necessário, e também pode conter antioxidantes, tampões, agentes bacteriostáticos e substâncias solúveis, tornando a composição compatível com os tecidos ou sangue do destinatário. Outros componentes, os quais podem ser incluídos na composição são, por exemplo, água, alcoóis, tais como etanol, polióis, tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido, lipídios, tais como triglicerídeos, óleos vegetais, lipossomas. A fluidez apropriada e o tamanho de partículas da substância podem ser fornecidos por meio de substâncias de revestimento, tais como lecitina, e agentes tensoativos, tais como polissorbatos hidroxipropil celulose, e semelhantes.
[00153] Agentes isotônicos adequados para as composições parenterais líquidas são, por exemplo, açúcares, tais como glicose, e cloreto de sódio, e suas combinações.
[00154] Alternativamente, a composição farmacêutica para administração por injeção ou infusão pode estar na forma de pó, tal como um pó liofilizado para reconstituição imediatamente anterior a utilização em um veículo apropriado, tal como, por exemplo, água estéril isenta de pirogênio.
[00155] A composição farmacêutica da invenção para administração parenteral pode também ter a forma de administração nasal, incluindo soluções, pulverizadores ou aerossóis. De preferência, a forma de administração intranasal será uma solução aquosa e será isotônica ou tamponada ou mantendo o pH entre cerca de 5,5 a cerca de 6,5, de modo a manter um caráter semelhante as secreções nasais. Além disso, essa irá conter conservante ou estabilizante, tais como nas preparações intranasais bem conhecidas.
[00156] A composição pode conter vários antioxidantes, os quais atrasam a oxidação de um ou mais componentes. Além disso, a fim de evitar a ação de micro-organismos, a composição pode conter vários agentes antibacterianos e antifúngicos, incluindo, por exemplo, mas não limitado aos parabenos, clorobutanol, himerosal, ácido sórbico, e substâncias semelhantes conhecidas deste tipo. Em geral, a composição farmacêutica da invenção pode incluir, por exemplo, pelo menos cerca de 0,01% em peso de princípio ativo. Mais particularmente, a composição pode conter o princípio ativo na quantidade de 1% a 75% em peso da unidade de composição ou, por exemplo, de 25% a 60% em peso, mas não limitado aos valores indicados. A quantidade real da dose da composição de acordo com a presente invenção administrada aos pacientes, incluindo homem, será determinada por fatores físicos e fisiológicos, tais como o peso corporal, a gravidade da condição, o tipo de doença a ser tratada, intervenções terapêuticas anteriores ou concomitantes, o paciente e a via de administração. Uma dose unitária adequada, a dose total e a concentração de princípio ativo na composição são para ser determinadas pelo médico do tratamento.
[00157] A composição pode, por exemplo, ser administrada em uma dose de cerca de 1 micrograma/kg em peso corporal até cerca de 1000 mg/kg em peso corporal do paciente, por exemplo, no intervalo de 5 mg/kg em peso corporal a 100 mg/kg em peso corporal ou na faixa de 5 mg/kg em peso corporal a 500 mg/kg em peso corporal. A proteína de fusão e as composições contendo-a exibem anticancerígeno ou antitumoral e podem ser utilizados para o tratamento de doenças cancerígenas. A invenção também proporciona o uso da proteína de fusão da invenção, como acima definida para o tratamento de doenças cancerígenas em mamíferos, incluindo os seres humanos. A invenção também proporciona um método de tratamento de doenças cancerígenas em mamíferos, incluindo humanos, compreendendo a administração a um sujeito com necessidade de tal tratamento, uma quantidade eficaz anticancerígena da proteína de fusão da invenção, tal como definida acima, opcionalmente, na forma de uma composição farmacêutica apropriada.
[00158] A proteína de fusão da invenção pode ser utilizada para o tratamento de doenças malignas hematológicas, tais como leucemia, a granulomatose, mieloma e outras doenças malignas hematológicas. A proteína de fusão também pode ser usada para o tratamento de tumores sólidos, tais como câncer de mama, câncer de pulmão, inclusive câncer do pulmão de células não-pequenas, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de rim, câncer no cérebro, e similares. A via apropriada de administração da proteína de fusão no tratamento do câncer estará em uma via parenteral particular, a qual consiste em administrar a proteína de fusão da invenção, sob a forma de injeções ou infusões, na composição e na forma apropriadas para esta via de administração. A invenção será descrita em maiores detalhes nos seguintes procedimentos gerais e exemplos de proteínas de fusão específicas.
[00159] A sequência de aminoácidos da proteína de fusão alvo foi usada como padrão para gerar uma sequência de DNA que a codifica, compreendendo códons otimizados para a expressão em Escherichia coli. Tal procedimento permite aumentar a eficácia de uma etapa adicional da síntese da proteína alvo em Escherichia coli. A sequência de nucleotídeos resultantes foi então sintetizadaautomaticamente. Além disso, os sítios de clivagem de enzimas de restrição Ndel (na extremidade 5’ do filamento líder) e XhoI (na extremidade 3’ do filamento líder) foram adicionados ao gene resultante codificando a proteína alvo. Estes foram usados para clonar o gene dentre do vetor pET28a (Novagen).Eles também podem ser usados para clonar o gene que codifica a proteína para outros vetores. A proteína alvo expressa a partir deste construto pode ser opcionalmente equipada na N- terminal com um marcador de poli-histidina (seis histidinas) precedida por um sítio reconhecido pela trombina, que posteriormente serviu para a sua purificação através da cromatografia de afinidade. Alguns alvos foram expressos sem qualquer marcador, em particular, sem marcador histidina, e aqueles foram posteriormente purificados em SP Sefarose. A correção do construto resultante foi confirmada primeiramente por análise de restrição dos plasmídeos isolados, utilizando as enzimas Ndel e Xhol, seguida de sequenciação automática de todo o quadro de leitura da proteína alvo. Os iniciadores utilizados para a sequenciação foram complementares para as sequências do promotor T7 (5'- TAATACGACTCACTATAGG-3') e finalizador de T7 (5'- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3') presente no vetor. O plasmídeo resultante foi utilizado para a super-expressão da proteína de fusão alvo em uma cepa comercial de E. coli, a qual foi transformada de acordo com as recomendações do fabricante. As colônias obtidas no meio de seleção (LB ágar, 50 μg/mL de canamicina, glicose a 1%) foram usadas para a preparação de uma cultura durante a noite em meio líquido LB suplementado com canamicina (50 μg/mL) e glicose a 1%. Após cerca de 15 h de crescimento em incubadora de agitação, as culturas foram utilizadas para inocular a cultura apropriada.
[00160] Meio LB com canamicina (30 μg/mL) e sulfato de zinco 100 μM foi inoculado com a cultura durante a noite. A cultura foi incubada a 37°C até a densidade ótica (OD) a 600 nm ter atingido 0,60-0,80. Em seguida, foi adicionado IPTG à concentração final na faixa de 0,25 - 1 mM. Após incubação (3,5 - 20 h) com agitação a 25°C, a cultura foi centrifugada durante 25 min a 6000 g. Os péletes bacterianos foram ressuspensos em um tampão contendo 50 mM de KH2PO4, 0,5 M de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 7,4. A suspensão foi sonicada em gelo durante 8 minutos (40% de amplitude, 15 segundos de pulsos, 10s de intervalo). O extrato resultante foi clarificado por centrifugação durante 40 minutos em 20000 g, 4°C. Resina Ni-Sefarose (GE Healthcare) foi pré-tratada com por equilibrar um tampão, o qual foi utilizado para a preparação do extrato de células bacterianas. A resina foi então incubada durante a noite a 4°C com o sobrenadante obtido após a centrifugação do extrato. Então, foi carregada na coluna de cromatografia e lavada com 15 a 50 volumes de tampão de 50 mM de KH2PO4, 0,5 M de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 7,4. A proteína obtida foi eluída a partir da coluna utilizando gradiente de imidazol em 50 mM de tampão KH2PO4 com 0,5 M de NaCl, pH 7,4. As frações obtidas foram analisadas por SDS-PAGE. As frações apropriadas foram combinadas e dialisadas durante a noite a 4°C contra 50 mM de tampão Tris, pH 7,2, 150 mM de NaCl, 500 mM de L-arginina, 0,1 mM de ZnSO4, 0,01% de Tween 20, e ao mesmo tempo marcador His, se presente, foi clivada com trombina (1: 50). Após a clivagem, a trombina foi separada da proteína de fusão expressa com marcador Histag por purificação utilizando uma resina de benzamidina SefaroseTM. A purificação de proteínas de fusão alvo expressas, sem marcador Histag foi realizada em SP Sefarose. A pureza do produto foi analisada por eletroforese de SDS-PAGE (Maniatis et AL., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982).
[00161] Meio LB com canamicina (30 μg/mL) e 100μM de sulfato de zinco foi inoculado com a cultura durante a noite. As culturas foram incubadas a 37°C até a densidade ótica (OD) em 600 nm atingir 0,60-0,80. Em seguida, foi adicionado IPTG à concentração final na faixa de 0,5 -1 mM. Após 20h de incubação com agitação a 25°C, a cultura foi centrifugada durante 25 min a 6000 g. As células bacterianas foram interrompidas após a super-expressão de uma prensa francesa em um tampão contendo 50 mM de KH2PO4, 0,5 M de NaCl, 10 mM de imidazol, 5 mM de beta-mercaptoetanol, 0,5 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila), pH 7,8. Extrato resultante foi clarificado por centrifugação durante 50 minutos em 8000 g. A resina de Ni-Sefarose foi incubada durante a noite com o sobrenadante obtido. Em seguida, a resina com a proteína ligada foi embalada na coluna cromatográfica. Para retirar as frações contendo as proteínas sem ligação, a coluna foi lavada com 15 a 50 volumes de tampão de 50 mM de KH2PO4, 0,5 M de NaCl, 10 mM de imidazol, 5 mM de beta-mercaptoetanol, 0,5 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila), pH 7,8 . Em seguida, para retirar a maioria das proteínas que se ligam especificamente com o leito, a coluna foi lavada com um tampão contendo 50 mM de KH2PO4, 0,5 M de NaCl, 500 mM de imidazol, glicerol a 10%, 0,5 mM de PMSF, pH 7,5. As frações obtidas foram analisadas por SDS-PAGE (Maniatis et AL., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982). As frações contendo a proteína alvo foram combinadas e, se a proteína foi expressa com um marcador de histidina, clivado com trombina (1U por 4 mg de proteína, 8h em 16°C) para remover a marca de poli-histidina. Em seguida, as frações foram dialisadas contra tampão de formulação (500 mM de L-arginina, 50 mM de Tris, 2,5 mM de ZnSO4, pH 7,4).
[00162] A proteína de SEQ. No. 1 é uma proteína de fusão possuindo o comprimento de 173 aminoácidos e a massa de 19,8 kDa, em que o N-terminal da sequência TRAIL 121 -281 de heptapeptídeo derivada de VEGF (SEQ. No. 17) é ligado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, a glicina ligadora estérica flexível (SEQ No. 28) é incorporada.
[00163] Estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na FIG. 1, e a sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 1 e SEQ. No. 31, como mostrado na Listagem de Sequências em anexa.
[00164] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 1 da estrutura descrita acima foi utilizada como padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 31. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA em duas versões, uma que permite expressar marca His e um sítio reconhecido pela trombina, e o segundo, sem qualquer marcador, foi gerado e super-expressão da proteínas de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais acima descritos . A super-expressão foi realizada de acordo com o procedimento geral A, usando cepas E. coli BL21 (DE3) e Tuner(DE3)pLysS, ambas da Novagen. As proteínas foram separadas por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00165] A proteína de fusão da SEQ. No. 2 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 199 aminoácidos e a massa de 22,8 kDa, em que o N-terminal da sequência TRAIL 95-281 de heptapeptídeo derivada de VEGF (SEQ. No. 17) é ligado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, o ligador estérico de glicina flexível (SEQ No.28) é incorporado.
[00166] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 1, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 2 e SEQ. No. 32, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00167] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 2 foi utilizada como padrão para gerar sequência de codificação de DNA, DNA SEQ. No. 32. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência permitindo expressar marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão de proteína de fusão foi efetuada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, usando cepa E. coli BL21(DE3) de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00168] A proteína de fusão da SEQ. No. 3 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 230 aminoácidos e a massa de 26,3 kDa, na qual o N-terminal da sequência TRAIL 121 -281 de heptapeptídeo derivada de VEGF (SEQ. No. 17), e no C-terminal da sequência de TRAIL 121 -281 de fragmentos I e II da tumstatina (SEQ. No. 18 e SEQ. No. 19, respectivamente) estão ligados como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor ligado na extremidade N-terminal da sequência de TRAIL e a sequência de TRAIL está incorporado o ligador estérico flexível de glicina (SEQ. No. 28). Entre o peptídeo efetor ligado ao C-terminal da sequência de TRAIL e a sequência de TRAIL está incorporado ligador estérico consistindo em três resíduos de glicina Gly Gly Gly, e sequências de sítios de clivagem reconhecidas por metaloproteases MMP (SEQ No. 24) e uroquinase uPA (SEQ. No. 25), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
[00169] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 1, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, SEQ. No. 3 e SEQ. No. 33, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00170] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 3 foi usado como um padrão para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. No. 33. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência permitindo expressar marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando-se cepa E. coli BL21 (DE3) de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00171] A proteína de SEQ. No. 4 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 187 aminoácidos e a massa de 21,4 kDa, na qual o N-terminal da sequência de TRAIL 121281, duas sequências de heptapeptídeo derivadas de VEGF (SEQ. No.17) estão ligadas como um peptídeo efetor. Entre as duas sequências de peptídeo efetor está incorporada a sequência do sítio de clivagem reconhecida por metaloprotease MMP (SEQ. No. 24), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. Entre a sequência do sítio de clivagem MMP e a sequência da proteína efetora está incorporado um único resíduo do ácido glutâmico E. Entre o peptídeo efetor (SEQ. 17) e a sequência de TRAIL está incorporado o ligador de glicina estérico flexível (SEQ. No. 28).
[00172] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 1, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo os códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 4 e a SEQ. No. 34, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00173] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 4 foi utilizada como um padrão para gerar sua sequência de codificação de DNA, SEQ de DNA. No. 34. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA em duas versões, uma que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, e o segundo, sem qualquer marcador, foi gerado e a super-expressão das proteínas de fusão foi efetuada em conformidade com os procedimentos gerais acima descritos. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando cepa E. coli BL21DE3pLysSRIL de Stratagene e cepa Tuner (DE3) de Novagen. As proteínas foram separadas por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00174] A proteína de SEQ. No. 5 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 187 aminoácidos e a massa de 21,8 kDa, na qual o N-terminal da sequência TRAIL 121 -281, duas sequências de heptapeptídeo derivado de VEGF (SEQ. No. 17) estão ligadas como um peptídeo efetor. Entre as duas sequências de peptídeos efetores, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 24), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. Entre a sequência do sítio de clivagem MMP e a sequência da proteína efetora está incorporado um resíduo único de ácido glutâmico E. Adicionalmente, no N-terminal de TRAIL, dois resíduos de glicina estão ligados.
[00175] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 1, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo os códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 5 e a SEQ. No. 35, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00176] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 5 foi utilizada como um padrão para gerar sua sequência de codificação de DNA, SEQ de DNA. No. 35. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA em duas versões, uma que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, e o segundo, sem qualquer marcador, foi gerado e a super-expressão das proteínas de fusão foi efetuada em conformidade com os procedimentos gerais acima descritos. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. As proteínas foram separadas por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00177] A proteína de SEQ. No. 6 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 222 aminoácidos e a massa de 25,3 kDa, na qual o N-terminal da sequência TRAIL 95-281, duas sequências de heptapeptídeo derivadas de VEGF (SEQ. No. 17) estão ligadas como um peptídeo efetor. Entre as duas sequências de peptídeo efetor, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidas por uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 55), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. Entre o peptídeo efetor (SEQ. 17) e a sequência de TRAIL está incorporado o ligador estérico flexível de cisteína (SEQ. No. 26).
[00178] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 1, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 6 e a SEQ. No. 36, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00179] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 6 foi utilizada como molde para gerar sua sequência de DNA de codificação DNA SEQ. No. 36. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, sem uma sequência que permite expressar marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00180] A proteína de SEQ. No. 7 é uma proteína de fusão possuindo um comprimento de 168 aminoácidos e a massa de 19,4 kDa, em que o N-terminal da sequência de TRAIL 119281, uma sequência sendo um ligante de CD13 (SEQ No. 20) é ligado como um peptídeo efetor.
[00181] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 7 e a SEQ. No. 37, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00182] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 7 foi utilizada como padrão para gerar a sua sequência de DNA de codificação DNA SEQ. No. 37. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA em duas versões, uma que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, e o segundo, sem qualquer marcador, foi gerado e a super-expressão das proteínas de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais acima descritos. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando cepa E. coli tuner (DE3) de Novagen. As proteínas foram separadas por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00183] A proteína de SEQ. No. 8 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 201 aminoácidos e a massa de 23,2 kDa, em que o N-terminal da sequência de TRAIL 95 - uma sequência sendo um ligante de CD13 (SEQ. No. 21) é ligado como um peptídeo efetor. Entre a sequência de TRAIL e a sequência de peptídeo efetor da proteína contém uma sequência do ligador de glicina-serina flexível (SEQ No. 30).
[00184] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2, e a sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 8 e a SEQ. No. 38, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00185] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 8 foi usada como um padrão para gerar a sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 38. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar um marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando cepa de E. coli Tuner (DE3) de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00186] A proteína de SEQ. No. 9 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 192 aminoácidos e a massa de 22,1 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL 119281, uma sequência de um fragmento de PDGF (SEQ No. 22) é ligado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 24), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
[00187] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a e a SEQ. No. 39, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00188] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 9 foi usada como um padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 39. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA em duas versões, uma que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, e o segundo, sem qualquer marcador, foi gerado e a super-expressão das proteínas de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais acima descritos . A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, usando cepa de E. coli Rosetta (DE3) de Novagen. As proteínas foram separadas por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00189] A proteína de SEQ. No.10 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 216 aminoácidos e a massa de 24,9 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL 95-281, um fragmento de PDGF (SEQ. No. 22) é ligado como um peptídeo efetor. Entre a sequência do peptídeo efetor e o domínio TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 24) devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
[00190] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 10 e a SEQ. No.40, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00191] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 10 foi usada como um padrão para gerar a sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 40. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando as cepas E. coli BL21 (DE3) e tuner(DE3)pLysS, ambas de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00192] A proteína de SEQ. No.11 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 226 aminoácidos e a massa de 25,7 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL95-281 um fragmento de PDGF (SEQ. No. 22) é ligado como um peptide efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 24), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. Entre a sequência de TRAIL e a sequência do sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease MMP, a proteína também contém um ligador glicina-cisteína-alanina flexível (SEQ. No. 27).
[00193] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No.11 e SEQ. No.41, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00194] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 11 foi usada como um padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 41. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, sem uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando cepas E. coli BL21 (DE3) e tuner(DE3)pLysS, ambas de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00195] A proteína de SEQ. No. 12 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 217 aminoácidos e a massa de 25 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL 121-281, fragmentos I e II da tumstatina (SEQ No. 18 e SEQ. No.19) estão ligados como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 24), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. Entre a sequência de TRAIL e a sequência do sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease MMP, a proteína também contém um agente de ligação flexível que consiste em três resíduos de glicina Gly Gly Gly.
[00196] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 3, e a sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 12 e SEQ. No. 42, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00197] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 12 foi usada como um padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 42. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando cepas E. coli BL21 (DE3) e Tuner(DE3)pLysS, ambas de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00198] A proteína de SEQ. No. 13 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 220 aminoácidos e a massa de 25,1 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL 121281, o fragmento II da tumstatina (SEQ. No. 19) está ligado como um peptídeo efetor e no C-terminal da sequência TRAIL 121 -281, o fragmento I de tumstatina (SEQ. No. 18) é ligado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 24), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. Entre a sequência do sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease MMP e a sequência de TRAIL, a proteína contém três resíduos de glicina Gly Gly Gly, e entre o C-terminal da sequência de TRAIL e do fragmento II de tumstatina, um ligador flexível consistindo em 3 resíduos de glicina Gly Gly Gly.
[00199] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig 3, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 13 e SEQ. No. 43, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00200] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 13 foi utilizada como padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 43. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar um marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando cepa E. coli B.21 (DE3) de Novagen e cepa BL21DE3pLysSRIL de Stratagene. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00201] A proteína de SEQ. No. 14 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 181 aminoácidos e a massa de 21 kDa, em que no N-terminal da sequência TRAIL 120-281, um fragmento de EGF (SEQ. No. 23) é ligado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e o N-terminal do domínio TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 56), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 3, e a sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 14 e a SEQ. No. 44, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00202] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 14 foi usada como um padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 44. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando a cepa E. coli BL21(DE3) de Novagen e a cepa BL21DE3pLysSRIL de Stratagene. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00203] A proteína de SEQ. No. 15 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 217 aminoácidos e a massa de 24,4 kDa, em que no N-terminal da sequência hTRAIL95-281, um fragmento de EGF (SEQ. No. 23) é ligado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e o N-terminal do domínio de TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 24), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. Entre a sequência do sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease MMP e a sequência de TRAIL, a proteína contém único resíduo de prolina seguido do ligador glicina- cisteína-alanina flexível (SEQ. No. 26).
[00204] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 3, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 15 e a SEQ. No. 45, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00205] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 15 foi usada como um padrão para gerar a sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ No. 45. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar um marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando cepa E. coli BL21 (DE3) de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 16: A proteína de fusão de SEQ. No. 46:
[00206] A proteína de fusão da SEQ. No. 46 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 211aminoácidos e uma massa de 24,4 kDa, em que n N-terminal da sequência TRAIL 95-281,dois heptapeptídeos de VEGF (SEQ.No. 7) ligados uns aos outros são ligados como peptídeos efetores. Entre os peptídeos efetores, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 55), devido a qual o peptídeos efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
[00207] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 9, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. Coli são, respectivamente, a SEQ. No. 46 e a SEQ. No. 50, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00208] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 46 foi usada como um padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 50. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando cepa E. Coli BL21 (DE3) de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00209] A proteína de fusão da SEQ. No. 47 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 200 aminoácidos e a massa de 22,7 kDa, em que no N-terminal da sequência TRAIL 120-281, dois heptapeptídeos derivados do VEGF (SEQ. No. 17), ligados uns aos outros são ligados como peptídeos efetores. Entre os peptídeos efetores, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 55), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. Entre as proteínas efetoras e o domínio TRAIL, a proteína contém um ligador flexível posteriormente (SEQ. No. 26) promovendo formação trímero e ligador glicina-serina flexível (SEQ. No. 54.).
[00210] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 9, e a sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 47 e SEQ. No. 51, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00211] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 47 foi usada como um padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 51. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando a cepa E. coli BL21 (DE3) de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00212] A proteína de fusão da SEQ. No. 48 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 192 aminoácidos e a massa de 21,9 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL 120-281, dois heptapeptídeos derivados do VEGF (SEQ. No. 17), ligados uns aos outros são ligados como peptídeos efetores. Entre os peptídeos efetores, a proteína contém sequência de sítio de clivagem reconhecido pela uroquinase uPA (SEQ. No. 25), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. Entre as proteínas efetoras e o domínio TRAIL, a proteína contém ligador flexível posteriormente (SEQ. No. 26) promovendo formação de trímero e ligador glicina-serina flexível (SEQ. No. 54).
[00213] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 9, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 48 e a SEQ. No. 52, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00214] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 48 foi usada como um padrão para gerar a sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 52. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando a cepa E. coli BL21 (DE3) de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00215] A proteína de SEQ. No. 49 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 206 aminoácidos e a massa de 23,3 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL120- 281, um fragmento de PDGF (SEQ. No. 22) é ligado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloproteases MMP (SEQ. No. 55), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. Entre a sequência TRAIL e a sequência de sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease MMP, a proteína contém também localizado posteriormente ligador glicina-cisteína-alanina flexível (SEQ. No. 26) promovendo a formação do trímero e ligador glicina-serina flexível (SEQ. No. 54).
[00216] A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 9, e a sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 49 e a SEQ. No. 53, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
[00217] A sequência de aminoácidos SEQ. No. 49 foi usada como um padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 53. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, sem uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando as cepas E. coli BL21 (DE3) e Tuner(DE3)pLysS, ambas de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
[00218] Exame da atividade antitumoral das proteínas de fusão foi realizado in vitro em um ensaio de citotoxicidade sobre linhas de células tumorais e in vivo em camundongos. Para propósito de comparação, proteína rhTRAIL114-281 e placebo foram utilizados. 1. Medição de dicroísmo circular - determinação do teor de estruturas secundárias de proteínas obtidas
[00219] A qualidade das preparações das proteínas de fusão em termos da sua estrutura foi determinada por dicroísmo circular (CD) para o Ex. 1, Ex. 4, Ex. 5, Ex. 9 e Ex. 14. Dicroísmo circular é utilizado para a determinação de estruturas secundárias e de conformação da proteína. Método CD utiliza uma atividade ótica das estruturas de proteína, que se manifesta na rotação do plano de polarização da luz e na aparência de polarização elíptica. Espectro de CD de proteínas no ultravioleta afastado (UV) fornece dados precisos sobre a conformação da cadeia principal do polipeptídeo.
[00220] As amostras da proteína a serem analisadas após formulação em um tampão consistindo em 50 mM de Tris- HCl pH 8,0, 100 mM de NaCl, glicerol a 10%, 0,1 mM de ZnCl2, 80 mM de sacarose, 5 mM de DTT, pH 7,4 (ou, alternativamente, 5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, glicerol a 10%, 80 mM de sacarose, a pH 8,0 para as proteínas super-expressadas como descritas acima, mas sem o marcador His-tag e purificadas em SP Sefarose - marcadas nos resultados da Tabela 5 com asterisco*) foram dialisadas em sacos de diálise (Sigma- Aldrich) com corte de 12 kDa. A diálise foi realizada contra 100 vezes o excesso (v/v) de tampão comparando com as preparações de proteína com agitação durante várias horas a 4°C. Após diálise ser completada, cada preparação foi centrifugada (25000 rpm, 10 min, 4°C) e os sobrenadantes apropriados foram recolhidos. A concentração de proteína nas amostras assim obtidas foi determinada pelo método de Bradford como uma média de triplicados.
[00221] Em ensaios de concentração de proteína do reagente preparado por dissolver 17,5 mg de Coomassie G-250 em uma mistura de etanol (4,8% v/v), ácido fosfórico (V) (5,95% v/v) e água. Para determinar a concentração da proteína de 1-10 mL de amostra foi adicionada a 800 mL de reagente de Bradford. Uma amostra da referência contendo o reagente de Bradford e um volume apropriado de tampão, no qual a proteína dissolvida foi determinada. A absorbância foi lida num espectrofotômetro Cary 300 no comprimento de onda de 595 nm, depois de pelo menos 5 minutos de incubação das amostras em temperatura ambiente. A concentração de proteína foi calculada a partir da curva padrão preparada para BSA na faixa de 10 concentrações de 1-10μg/mL. A concentração da proteína de iniciação foi estimada após levar em consideração a diluição durante a preparação da medição da amostra.
[00222] A medição de dicroísmo circular para a proteínas na faixa de concentração de 0,1 -2,7 mg/mL foi realizada em espectropolarímetro Jasco J-710, em uma cubeta de quartzo com 0,2 milímetros ou 1 mm de forma ótica. A medição foi realizada sob fluxo de nitrogênio em 7L/min, o que permitiu a realização da medição na faixa de comprimento de onda de 195-250 nm. Os parâmetros de medição: resolução espectral de - 1 nm; meia largura do feixe de luz de 1 nm; sensibilidade 20 mdeg, o tempo médio para um comprimento de onda - 8 s, velocidade de varrimento de 10 nm/min, com uma média de 3 medições.
[00223] Os resultados foram apresentados como a média das três medições. Os espectros de dicroísmo circular para rhTRAIL114-281 e as proteínas de Ex. 1, Ex. 4, Ex. 5, Ex. 9 e Ex. 14 são apresentadas na Fig. 4.
[00224] Os espectros obtidos foram analisados numericamente na faixa de 193-250 nm, utilizando o software CDPro. Pontos, para os quais a tensão no fotomultiplicador excederam 700 V, foram omitidos devido ao sinal muito fraco para faixa de ruído na faixa de comprimento de onda.
[00225] Os dados obtidos servidos para cálculos de teor em estruturas secundárias particular das proteínas analisadas com o uso de software CDPro (Tabela 1).Tabela 1. Teor de estruturas secundárias nas proteínas analisadas*valor obtido com base na estrutura cristalina 1D4V
[00226] Controles (rhTRAIL114-281) mostram característica de espectro CD para as proteínas com estruturas predominantemente do tipo de P-lâminas (nitidamente delineado com elipticidade mínima no comprimento de onda de 220 nm). Isto confirma o cálculo dos componentes da estrutura secundária, o que sugere um número marginal de elementos a-hélice. O resultado obtido é também consistente com os dados da estrutura cristalina da proteína hTRAIL e características para as proteínas da invenção de Ex.4, Ex. 9 e Ex. 14, em que os elementos beta constituem mais de 40% da sua composição.
[00227] No caso de todas as proteínas fundidas, os espectros de dicroísmo são caracterizados por um mínimo em comprimento de onda de 220 nm. As pequenas moléculas de proteínas efetoras ligadas em TRAIL nas proteínas fundidas constituem a menor parte da proteína e não necessariamente criam uma estrutura secundária definida, as proteínas analisadas não devem diferenciar significativamente da proteína inicial. Diferenças significativas, tais como alto teor de alfa estruturas no caso das proteínas de acordo com o Ex. 5, ou lâminas, como observado para as proteínas do Ex. 1 são, possivelmente, devido à faixa limitada de espectro CD submetida à análise, especialmente, na região 180-200 nm. 2. Testes de linhas de células In vitro Linhas de células Tabela 2. As células aderentes
Tabela 3. Células não aderentes
[00228] MTT é um ensaio colorimétrico usado para medir a proliferação, a viabilidade e a citotoxicidade das células. Ele consiste na decomposição de um sal de tetrazólio amarelo MTT (4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio) ao formazano corante púrpuro insolúvel em água pela redutase de tetrazólio-succinato na enzima mitocondrial 1. A redução do MTT ocorre apenas em células vivas. A análise dos dados consiste em determinar a concentração IC50 da proteína (em ng/mL), na qual a redução de 50% no número de células ocorre na população tratada em comparação com células de controle. Os resultados foram analisados utilizando o software GraphPad Prism 5,0. O teste foi realizado de acordo com as descrições da literatura (Celis, JE, (1998) Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvement of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183).
[00229] Meio de cultura de células foi diluído até uma densidade definida (104 - 105 células por 100μL). Então, 100 μL de suspensão de células diluídas apropriadamente foram aplicadas a uma placa com 96 cavidades em triplicado. Assim, as células preparadas foram incubadas durante 24 h a 37°C em 5% ou 10% de CO2, dependendo do meio utilizado, e em seguida, para as células (em 100 μL de meio) mais 100μL do meio contendo várias concentrações de proteínas testadas foram adicionados. Após a incubação das células com proteínas testadas durante o próximo período de 72 horas, o que é equivalente a 3-4 vezes da divisão celular, o meio com a proteína teste foi adicionado com 20 mL de solução de trabalho de MTT [5 mg/mL], e a incubação foi mantida durante 3h a 37°C em CO2 a 5%. Então, o meio com uma solução de MTT foi removido e os cristais de formazano foram dissolvidos pela adição de 100 μL de DMSO. Após agitação, a absorbância foi medida a 570 nm (filtro de referência 690 nm).
[00230] O teste EZ4U (Biomedica) foi utilizado para testar a atividade citotóxica das proteínas em linhas de células não aderentes. O teste é uma modificação do MTT em que o formazano formado na redução do sal de tetrazólio é solúvel em água. Estudo de viabilidade das células foi realizado após a incubação contínua de 72 horas das células com a proteína (sete concentrações de proteína, cada um em triplicado). Nesta base, os valores de IC50 foram determinados (como uma média de duas experiências independentes), utilizando o software GraphPad Prism 5.
[00231] Os resultados dos testes de citotoxicidade in vitro encontram-se resumidos na Tabela 4, como os valores de IC 50 (ng/mL), que correspondem a uma concentração de proteína, em que o efeito citotóxico das proteínas de fusão é observado ao nível de 50% com relação às células de controle tratadas apenas com solvente.
[00232] Na Tabela 4, as proteínas que foram inicialmente expressas com marcador de histidina, o qual foi subsequentemente removido, são designadas como a) no Ex. No.. As proteínas que foram inicialmente expressas sem histidina são designadas como b) no Ex. No.. Cada experimento representa o valor médio de pelo menos duas experiências independentes realizadas em triplicado. Como critério de ausência de atividade de preparações de proteína, o limite IC50 de 2000 ng/mL foi adotado. As proteínas de fusão com um valor de IC50 superior a 2000 foram considerados inativas.
[00233] As células para este teste foram selecionadas de modo a incluir as linhas de células de tumor, naturalmente resistentes à proteína TRAIL (o critério da resistência natural para TRAIL: IC50 para a proteína TRAIL > 2000), linhas de células tumorais sensíveis à proteína TRAIL e resistentes à linha doxorrubicina MES-SA/DX5 como uma linha de câncer resistente aos medicamentos anticancerígenos convencionais.
[00234] A linha de células HUVEC não diferenciado foi usada como uma linha celular de controle saudável para a avaliação do efeito/toxicidade das proteínas de fusão em células não-cancerígenas.
[00235] Os resultados obtidos confirmam a possibilidade de superar a resistência das linhas de células de TRAIL através da administração de certas proteínas de fusão da presente invenção para as células naturalmente resistentes a TRAIL. Quando as proteínas de fusão da presente invenção dentro das células sensíveis à TRAIL foram administradas, em alguns casos, observou-se uma potenciação clara e forte da potência da ação, manifestando em valores de IC50 reduzidos da proteína de fusão em comparação com a IC50 para a TRAIL sozinha. Além disso, a atividade citotóxica da proteína de fusão da invenção nas células resistentes ao medicamento anticancerígeno clássico, doxorrubicina, foi obtida e, em alguns casos, foi mais forte do que a atividade de TRAIL sozinha.
[00236] Os valores de IC50 acima de 2000 obtidos para as linhas de células não-cancerígenas, mostram a ausência de efeitos tóxicos associados com o uso das proteínas da presente invenção para as células saudáveis, indicando assim uma toxicidade sistemica de baixo potencial da proteína.
[00237] A Tabela 5 apresenta os resultados dos testes de atividade citotóxica in vitro para as proteínas de fusão selecionadas da invenção contra um extenso painel de células tumorais de diferentes órgãos, correspondentes a uma ampla faixa de cânceres mais comuns.
[00238] Na Tabela 5, as proteínas que foram inicialmente expressas com marcador de histidina, o qual foi subsequentemente removido, são designadas como: a) no Ex. No.. Proteínas que foram inicialmente expressas sem histidina são designadas como b) ao Ex. No..
[00239] Os valores obtidos de IC50 confirmam elevada atividade citotóxica da proteína de fusão e, portanto, sua utilidade potencial no tratamento do câncer.
[00240] A atividade a das preparações de proteína foi testada em um modelo de rato de células HCT116, Colo205 e SW620 de câncer de cólon humano, células A549 e NCI-H460- Luc2 de câncer de células não-pequenas do pulmão, células PLC/PRF/5 (CLS) de hepatoma humano, células Panc-1 de carcinoma pancreático humano, células HepG2 carcinoma de fígado humano, células NCI-H460 de carcinoma de células grandes de pulmão humano, células resistentes a múltiplos medicamentos MES-SA/Dx5 carcinoma uterino humano.
[00241] As células HCT116 e A549 (ATCC CCL-185) foram mantidas em meio RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT, USA) misturadas na razão de 1:1 com Opti-MEM (Invitrogen, Cat.22600-134) suplementadas com 10% de soro fetal de bezerro e 2 mM de glutamina. No dia do enxerto dos camundongos, as células foram separadas do suporte por lavagem das células com tripsina (Invitrogen), depois as células foram centrifugadas a 1300 rpm, 4°C, 8 min, suspensas em tampão HBSS (meio Hanks), contadas e diluídas para a concentração de 25x106 células/mL.
[00242] As células PLC/PRF/5 (CLS), SW620 e PANC-1 foram mantidas em DMEM (HyClone, Logan, UT, USA) suplementadas com soro de bezerro fetal a 10% e 2 mM de glutamina. No dia do enxerto dos camundongos, as células foram separadas do suporte por lavagem das células com tripsina (Invitrogen), depois as células foram centrifugadas a 1300 rpm, 4°C, 8 min, suspensas em tampão HBSS (meio Hanks), contadas e diluídas para a concentração de 25x106 células/mL.
[00243] As células HepG2 foram mantidas em MEM (HyClone, Logan, UT, USA) suplementadas com soro de bezerro fetal a 10% e 2 mM de glutamina. No dia do enxerto dos camundongos, as células foram separadas do suporte por lavagem das células com tripsina (Invitrogen), depois as células foram centrifugadas a 1300 rpm, 4°C, 8 min, suspensas em tampão HBSS (meio Hanks), contadas e diluídas para a concentração de 25x106 células/mL.
[00244] As células NCI-H460-Luc2, NCI-H460 e Colo205 foram mantidas em RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT, USA) suplementadas com soro de bezerro fetal a 10% e 2 mM de glutamina. No dia do enxerto dos camundongos, as células foram separadas do suporte por lavagem das células com tripsina (Invitrogen), depois as células foram centrifugadas a 1300 rpm, 4°C, 8 min, suspensas em tampão HBSS (meio Hanks), contadas e diluídas para a concentração de 25x106 células/mL.
[00245] As células MES-SA/Dx5 foram mantidas em McCoy’s (HyClone, Logan, UT, USA) suplementadas com soro de bezerro fetal a 10% e 2 mM de glutamina. No dia do enxerto dos camundongos, as células foram separadas do suporte por lavagem das células com tripsina (Invitrogen), depois as células foram centrifugadas a 1300 rpm, 4°C, 8 min, suspensas em tampão HBSS (meio Hanks), contadas e diluídas para a concentração de 25x106 células/mL.
[00246] O exame da atividade antitumoral das proteínas da invenção foi realizado em 4-5 semanas de idade, ou 7-9 semanas de idade CD -nude- (Crl: CD1-Foxn1nu 1) ou em 4-5 semanas de idade Crl: SHO-PrkdcscidHRhr, camundongos obtidos a partir de Charles River Alemanha ou 4-5 semanas de idade Cby.Cg-foxn1(nu)/J, camundongo obtido a partir de Centrum Medycyny Doswiadczalnej em Biatystok. Os camundongos foram mantidos em condições livres de patógenos específicos, com livre acesso a comida e água desmineralizada (ad libitum). Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes: “Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education” emitidas pelo New York Academy of Sciences’ Ad Hoc Committee on Animal Research e foram aprovadas pelo IV Local Ethics Committee on Animal Experimentation in Warsae (No. 71/2009).
[00247] O tamanho do tumor foi medido utilizando um compasso de calibre eletrônico, o volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula: (a2 x b)/2, em que a =diagonal mais curto do tumor 25 (mm) e b = diagonal mais longa do tumor (mm). A inibição do crescimento do tumor foi calculada utilizando a fórmula: TGI [%] (inibição do crescimento do tumor) = (WT/WC) x 100 - 100% em que WT refere-se ao volume médio do tumor no grupo de tratamento, WC refere-se ao volume médio do tumor no grupo de controle. Os resultados experimentais são apresentados como valor médio ± de desvio padrão (SD). Todos os cálculos e gráficos foram preparados utilizando o software GraphPad Prism 5,0.
[00248] No dia 0, os camundongos Crl: CD1-Fox1nu 1 foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5x106 de células HCT116 suspendidas em 0,2 mL de tampão HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~ 60-90 mm3 (dia 14), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~ 70mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 (10 mg/kg), Ex. 4 (10 mg/kg), Ex. 5 (10 mg/kg), e Ex. 9 (10 mg/kg), e rhTRAIL114-281 (10 mg/kg) como uma comparação. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) diariamente durante dez dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00249] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl:CD1-Fox1nu sobrecarregados com câncer do cólon de HCT116 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 1, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. 9 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 5 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 6, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00250] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 5 e 6 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 1, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. 9 causou a inibição do crescimento do tumor HCT116, com a TGI respectivamente, 67,8, 69,8, 84,4 e 66,2% em relação ao controle no 27° dia do experimento. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento das células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 44%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00251] No dia 0, os camundongos Crl: CD1-Fox1nu 1 foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5x106 de células HCT116 suspendidas em 0,2 mL de tampão HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~ 50-78 mm3 (dia 8), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~ 63 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 5. (10 mg/kg), Ex. 4. (10 mg/kg), Ex. 9 (10 mg/kg), Ex. 1 (10 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (10 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (50 mM de base Trizma, 150 mM de NaCl, 80 mM de sacarose, 250 mM de L- arginina, 1 mM de glutationa, 0,1 de mM Zn2+, pH 7,3) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) diariamente, durante cinco dias, seguidas por (após 2 dias de intervalo) mais cinco administrações diárias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00252] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl:CD1-Fox1nu sobrecarregados com câncer do cólon de HCT116 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 4, Ex. 9 e Ex. 1 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 10 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 11, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00253] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 10 e 11 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 4, Ex. 9 e Ex. 1 causou a inibição do crescimento do tumor HCT116, com a TGI respectivamente, 80%, 79%, 66% e 68% em relação ao controle no 27° dia do experimento. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento das células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 44,3%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00254] No dia 0, os camundongos Crl: SHO- PrkdcscidHRhr foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5x106 de células HCT116 suspendidas em 0,2 mL de tampão HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~ 380-430 mm3 (dia 14), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~ 400 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 (30 mg/kg), Ex. 11 (45 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, glicerol a 10%, 80 mM de sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00255] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-PrkdcscidHRhr sobrecarregados com câncer do cólon de HCT116 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 (30 mg/kg) Ex.11 (45 mg/kg) e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 12 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 13, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00256] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 12 e 13 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex.11 causou inibição do crescimento do tumor HCT116, com TGI respectivamente 42% e 44,5% em relação ao controle no 32° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 5,6%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00257] No dia 0, os camundongos Crl: SHO- PrkdcscidHRhr foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5x106 de células Colo205 suspendidas em 0,2 mL de tampão HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~ 90-130 mm3 (dia 13), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~ 115 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 (30 mg/kg), Ex. 19 (30 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, glicerol a 10%, 80 mM de sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00258] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-PrkdcscidHRhr sobrecarregados com câncer do cólon de Colo205 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 (30 mg/kg) Ex.19 (45 mg/kg) e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 14 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 15, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00259] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 14 e 15 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex.19 causou inibição do crescimento do tumor Colo205, com TGI respectivamente 100% e 100% em relação ao controle no 33° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 18,8%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00260] No dia 0, os camundongos Crl: SHO- PrkdcscidHRhr foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5x106 de células SW620 suspendidas em 0,2 mL de tampão HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~ 290-350 mm3 (dia 17), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~ 320 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 (30 mg/kg), Ex. 11 (40 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, glicerol a 10%, 80 mM de sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00261] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-PrkdcscidHRhr sobrecarregados com câncer do cólon de SW620 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex.11 e comparativamente com rhTRAIL114- 281 são mostrados na FIG. 16 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 17, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00262] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 16 e 17 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex.11 causou inibição do crescimento do tumor SW620, com TGI respectivamente 62% e 23% em relação ao controle no 31° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de ~9%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00263] As proteínas de fusão testadas não causaram efeitos colaterais significativos manifestados por uma diminuição no peso corporal de camundongos (isto é, menor do que 10% do peso corporal inicial usado como referência). Isso mostra baixa toxicidade sistemica da proteína.
[00264] No dia 0, os camundongos Crl: CD1-Fox1nu 1 foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5x106 de células A549 suspendidas em 0,2 mL de tampão HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~ 80-100 mm3 (dia 14), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~ 90 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 (10 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (10 mg/kg) como uma comparação. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) dois vezes a cada doze dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00265] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: CD1-Fox1nu sobrecarregados com câncer de pulmão de A549 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 7 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 8, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00266] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 7 e 8 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 causou inibição do crescimento do tumor A549, com TGI 44,8% em relação ao controle no 33° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 16,5%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.Cby.Cg-foxn1(nu)/J
[00267] No dia 0, os camundongos Cby.Cg- foxn1(nu)/J foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5x106 de células A549 suspendidas em 0,2 mL de tampão HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~ 60-90 mm3 (dia 19), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~ 75 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 (15 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como uma comparação contra água para injeção como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00268] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Cby.Cg-foxn1(nu)/J sobrecarregados com câncer de pulmão de A549 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 18 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 19, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00269] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 18 e 19 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 causou inibição do crescimento do tumor A549, com TGI 44,8% em relação ao controle no 33° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 16,6%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00270] A. No dia 0, os camundongos Crl: SHO- PrkdcscidHRhr foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5x106 de células NCI-H460 suspendidas em 0,2 mL de tampão HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~ 150-170 mm3 (dia 13), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~ 160 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 (30 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, glicerol a 10%, 80 mM de sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00271] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-PrkdcscidHRhr sobrecarregados com câncer de pulmão de NCI-H460 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 20 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 21, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00272] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 20 e 21 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 causou inibição do crescimento do tumor NCI-H460, com TGI 88,5% em relação ao controle no 28° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 17,5%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00273] B. No dia 0, os camundongos Crl: SHO- PrkdcscidHRhr foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 7x106 de células A549 suspendidas em 0,2 mL de tampão HBSS:Matrigel na razão 3:1 por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~140-165 mm3 (dia 19), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~ 150 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 5 (60 mg/kg), Ex. 6 (50 mg/kg), Ex. 11 (50 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, 10 mM de L-arginina, 80 mM de sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00274] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-PrkdcscidHRhr sobrecarregados com câncer de pulmão de A549 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 6, Ex. 11 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 22 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 23, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00275] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 22 e 23 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 6, Ex. 11 causou inibição do crescimento do tumor A549, com TGI, respectivamente, 39,3%, 39,3% e 28% em relação ao controle no 38° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 5,3%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00276] C. No dia 0, os camundongos Crl: SHO- PrkdcscidHRhr foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 7x106 de células NCI-H460-Luc2 suspendidas em 0,1 mL de tampão HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~100-120 mm3 (dia 19), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~110 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 5 (primeira administração 40 mg/kg, seguida por 30 mg/kg) e rhTRAIL114- 281 (20 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (19 mM de NaH2PO4, 81 mM de Na2HPO4, 50 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, glicerol a 10%, pH 7,4) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00277] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-PrkdcscidHRhr sobrecarregados com câncer de pulmão de NCI-H460-Luc2 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 5 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 24 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 25, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00278] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 24 e 25 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 5 causou inibição do crescimento do tumor NCI-H460-Luc2, com TGI 97,2% em relação ao controle no 29° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 76%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00279] D. No dia 0, os camundongos Crl: SHO- PrkdcscidHRhr foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 7x106 de células A549 suspendidas em 0,1 mL de tampão HBSS:Matrigel por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~100-120 mm3 (dia 17), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~110 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 5 (50 mg/kg), Ex. 1 (50 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (19 mM de NaH2PO4, 81 mM de Na2HPO4, 50 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, glicerol a 10%, pH 7,4) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00280] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-PrkdcscidHRhr sobrecarregados com câncer de pulmão de A549 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 1 e comparativamente com rhTRAIL114- 281 são mostrados na FIG. 26 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 27, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00281] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 26 e 27 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 1 causou inibição do crescimento do tumor A549, com TGI, respectivamente, 52,5% e 41,6% em relação ao controle no 34° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 21,8%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00282] A. No dia 0, os camundongos Crl: SHO- PrkdcscidHRhr foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5x106 de células PLC/PRF/5 suspendidas em 0,2 mL de tampão HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~190-220 mm3 (dia 31), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~200 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 (40 mg/kg), Ex. 11 (50 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, glicerol a 10%, 80 mM sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seguindo o esquema: 4 administrações cada três dias e 2 administrações a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00283] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-PrkdcscidHRhr sobrecarregados com câncer de fígado de PLC/PRF/5 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 11 e comparativamente com rhTRAIL114- 281 são mostrados na FIG. 28 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 29, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00284] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 28 e 29 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 11 causou inibição do crescimento do tumor PLC/PRF/5, com TGI, respectivamente, 70,6% e 63,8% em relação ao controle no 49° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de ~18%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00285] A. No dia 0, os camundongos Crl: SHO- PrkdcscidHRhr foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5x106 de células HepG2 suspendidas em 0,2 mL de tampão HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~190-220 mm3 (dia 31), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~200 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 (30 mg/kg), Ex. 19 (30 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, glicerol a 10%, 80 mM sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00286] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-PrkdcscidHRhr sobrecarregados com câncer de fígado de HepG2 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 19 e comparativamente com rhTRAIL114- 281 são mostrados na FIG. 30 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 31, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00287] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 30 e 31 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 19 causou inibição do crescimento do tumor HepG2, com TGI, respectivamente, 82,6% e 43% em relação ao controle no 33° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de ~12,6%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00288] No dia 0, os camundongos Crl:SHO- PrkdcscidHRhr foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 7x106 de células PANC1 suspendidas em 0,1 mL de HBSS:Matrigel, Mistura 3:1 por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de ~87-110 mm3 (dia 27), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~95 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 11 (50 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, 100mM de L- arginina, 80 mM sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00289] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-PrkdcscidHRhr sobrecarregados com câncer de pâncreas de PANC1 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 11 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 32 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 33, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00290] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 32 e 33 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 11 causou inibição do crescimento do tumor PANC1, com TGI 43% em relação ao controle no 40° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 12,0%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00291] No dia 0, os camundongos Crl:SHO- PrkdcscidHRhr foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 7x106 de células MES-SA/Dx5 suspendidas em 0,1 mL de HBSS:Matrigel, Mistura 10:1 por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumors atingiram o tamanho de ~167-190 mm3 (dia 19), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de ~180 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6, Ex. 19 (30 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (10 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl2, glicerol a 10%, 80 mM sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de ~1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
[00292] Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-PrkdcscidHRhr sobrecarregados com sarcoma uterino de MES-SA/Dx5 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 18, Ex. 6 e Ex. 19 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 34 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 35, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
[00293] Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 34 e 35 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 19 causou inibição do crescimento do tumor MES-SA/Dx5, com TGI, respectivamente, 99,7% e 99,7% em relação ao controle no 33° dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 29%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
[00294] As proteínas de fusão testadas não causaram efeitos colaterais significativos manifestados por uma diminuição no peso corporal de camundongos (isto é, menor do que 10% do peso corporal inicial usado como referência). Isso mostra baixa toxicidade sistemica da proteína.
Claims (9)
1. Proteína de fusão caracterizada por compreender: - domínio (a) selecionado a partir do grupo que consiste em hTRAIL95 a 281, hTRAIL119 a 281, hTRAIL120 a 281 e hTRAIL121 a 281; e - domínio (b) constituindo uma sequência do peptídeo efetor antiangiogênico que é o inibidor do receptor do fator de crescimento e é selecionado a partir do grupo de fragmentos de fator de crescimento consistindo em fragmento de VEGF de SEQ ID No. 17, fragmento de PDGF de SEQ ID No. 22 e fragmento de EGF de SEQ ID No. 23; em que a sequência de domínio (b) está ligada ao C-terminal ou N-terminal do domínio (a).
2. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela proteína de fusão entre o domínio (a) e o domínio (b) conter o domínio (c) compreendendo um sítio de clivagem de protease, selecionado a partir de uma sequência reconhecida por metaloprotease MMP, uma sequência reconhecida por uroquinase uPA e combinações destas; e em que a sequência reconhecida por metaloprotease MMP é SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 55 ou SEQ ID No. 56, e a sequência reconhecida por uroquinase uPA ser SEQ ID No. 25.
3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo domínio (c) ser uma combinação das sequências reconhecidas por metaloprotease MMP e uroquinase uPA localizadas uma ao lado da outra.
4. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela proteína entre os domínios (a), (b), (c) e/ou (d) compreender adicionalmente um ligante estérico flexível de glicina, glicina-serina ou cisteína ou combinações destes; e em que o ligante estérico flexível é selecionado a partir do grupo que consiste em GG, E, GGGCAAACAAC (SEQ ID No. 26), GGCAAACAAC (SEQ ID No. 27), GGGGG (SEQ ID No. 28), GGGG (SEQ ID No. 29), GGG (SEQ ID No. 30) e GSG (SEQ ID No. 54).
5. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por possuir a sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID No. 1; SEQ ID No. 2; SEQ ID No. 4; SEQ ID No. 5; SEQ ID No. 6; SEQ ID No. 9; SEQ ID No. 10; SEQ ID No. 11; SEQ ID No. 14; SEQ ID No. 15; SEQ ID No. 46; SEQ ID No. 47; SEQ ID No. 48 e SEQ ID No. 49.
6. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por ser uma proteína recombinante.
7. Composição farmacêutica caracterizada por compreender como um princípio ativo a proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por estar em uma forma para administração parenteral.
9. Uso de uma proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças neoplásicas em mamíferos, incluindo os seres humanos.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PLPL393578 | 2011-01-05 | ||
PL393578A PL219845B1 (pl) | 2011-01-05 | 2011-01-05 | Przeciwnowotworowe białko fuzyjne |
PCT/EP2012/050145 WO2012093158A1 (en) | 2011-01-05 | 2012-01-05 | Anticancer fusion protein |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BR112013016980A2 BR112013016980A2 (pt) | 2020-08-04 |
BR112013016980B1 true BR112013016980B1 (pt) | 2022-10-11 |
Family
ID=45476512
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BR112013016980-0A BR112013016980B1 (pt) | 2011-01-05 | 2012-01-05 | Proteína de fusão anticancerígena |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9175059B2 (pt) |
EP (1) | EP2661496B1 (pt) |
JP (1) | JP5797773B2 (pt) |
KR (1) | KR101950043B1 (pt) |
CN (1) | CN103228788B (pt) |
AU (1) | AU2012204900B2 (pt) |
BR (1) | BR112013016980B1 (pt) |
CA (1) | CA2814597C (pt) |
CY (1) | CY1119149T1 (pt) |
DK (1) | DK2661496T3 (pt) |
EA (1) | EA025830B1 (pt) |
ES (1) | ES2628377T3 (pt) |
HR (1) | HRP20170905T1 (pt) |
HU (1) | HUE032576T2 (pt) |
IL (1) | IL226205B (pt) |
LT (1) | LT2661496T (pt) |
ME (1) | ME02756B (pt) |
MX (1) | MX339203B (pt) |
PL (2) | PL219845B1 (pt) |
PT (1) | PT2661496T (pt) |
RS (1) | RS56095B1 (pt) |
SG (1) | SG190049A1 (pt) |
SI (1) | SI2661496T1 (pt) |
UA (1) | UA108778C2 (pt) |
WO (1) | WO2012093158A1 (pt) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105051067B (zh) | 2013-03-12 | 2020-04-17 | 分子模板公司 | 用于引起细胞内化的cd20结合免疫毒素及其使用方法 |
WO2014141094A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Adamed Sp. Z O.O. | Anticancer conjugate |
EP2995626B1 (en) | 2013-05-06 | 2018-07-11 | China Pharmaceutical University | Bifunctional fusion proteins to inhibit angiogenesis in tumour microenvironment and to activate adaptive immune responses and the genes and uses thereof |
KR102514910B1 (ko) | 2014-01-27 | 2023-03-29 | 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. | 폴리펩티드를 전달하는 mhc 클래스 i 항원결정기 |
US10421958B2 (en) | 2014-02-05 | 2019-09-24 | Molecular Templates, Inc. | Methods of screening, selecting, and identifying cytotoxic recombinant polypeptides based on an interim diminution of ribotoxicity |
US11142584B2 (en) | 2014-03-11 | 2021-10-12 | Molecular Templates, Inc. | CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same |
EP3137488B1 (en) | 2014-06-11 | 2019-01-02 | Molecular Templates, Inc. | Protease-cleavage resistant, shiga toxin a subunit effector polypeptides and cell-targeting molecules comprising the same |
AU2016215205B2 (en) | 2015-02-05 | 2021-10-21 | Molecular Templates, Inc. | Multivalent CD20-binding molecules comprising shiga toxin a subunit effector regions and enriched compositions thereof |
WO2016127346A1 (zh) * | 2015-02-11 | 2016-08-18 | 四川大学华西医院 | 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途 |
EP3303373B1 (en) | 2015-05-30 | 2020-04-08 | Molecular Templates, Inc. | De-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same |
US20210008208A1 (en) | 2016-12-07 | 2021-01-14 | Molecular Templates, Inc. | Shiga toxin a subunit effector polypeptides, shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation |
CN110536695B (zh) | 2017-01-25 | 2024-05-10 | 分子模板公司 | 包括去免疫化的志贺毒素a亚基效应子和cd8+ t细胞表位的细胞靶向分子 |
EP3573652A1 (en) | 2018-04-17 | 2019-12-04 | Molecular Templates, Inc. | Her2-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU676476B2 (en) | 1992-04-29 | 1997-03-13 | Georgetown University | Binding peptides which interact with ligand growth factors of the epidermal growth factor receptor and erbB-2-receptor |
AU708239B2 (en) | 1995-06-29 | 1999-07-29 | Immunex Corporation | Cytokine that induces apoptosis |
JPH11513249A (ja) * | 1995-09-27 | 1999-11-16 | メディカル・リサーチ・カウンシル | プロテアーゼにより開裂可能なタンパク質を組込んだ組換えウイルス |
US7786282B2 (en) * | 2001-12-06 | 2010-08-31 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acid molecules encoding TNF-α ligand polypeptides having a CD154 domain |
DE10247755B4 (de) | 2002-10-14 | 2006-01-19 | Pfizenmaier, Klaus, Prof. Dr. | Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine |
CN1257187C (zh) * | 2003-10-22 | 2006-05-24 | 上海恰尔生物技术有限公司 | 钙网蛋白-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白及其制法和用途 |
US7431915B2 (en) * | 2003-10-31 | 2008-10-07 | The Regents Of The University Of California | Peptides whose uptake by cells is controllable |
DE60336353D1 (de) | 2003-11-03 | 2011-04-21 | Beijing Sunbio Biotech Co Ltd | Rekombinantes protein mit krebsunterdrückender wirkung, sein codierendes gen und seine verwendung |
CN1256347C (zh) * | 2003-12-10 | 2006-05-17 | 中国人民解放军第二军医大学 | 激肽原第五结构域-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白及其制法和用途 |
ATE540318T1 (de) | 2005-08-16 | 2012-01-15 | Genentech Inc | Apoptosesensitivität gegenüber apo2l/trail mittels testen auf galnac-t14-expression in zellen/gewebe |
US20090131317A1 (en) | 2007-06-22 | 2009-05-21 | Affymax, Inc. | Compounds and peptides that bind the trail receptor |
GB0723059D0 (en) | 2007-11-23 | 2008-01-02 | Nat Univ Ireland | Improved cytokine design |
GB0724532D0 (en) | 2007-12-17 | 2008-01-30 | Nat Univ Ireland | Trail variants for treating cancer |
CL2009001191A1 (es) | 2008-05-14 | 2010-07-02 | Genentech Inc | Uso del peptido apo2l/trail porque sirve para preparar un medicamento para tratar el cancer de pulmon y el linfoma de hodkin. |
JP5475766B2 (ja) * | 2008-06-30 | 2014-04-16 | ユニバーシティ オブ ペンシルベニア | Fn14/TRAIL融合タンパク質 |
PL391627A1 (pl) | 2010-06-25 | 2012-01-02 | Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością | Przeciwnowotworowe białko fuzyjne |
RS54057B1 (en) * | 2010-12-03 | 2015-10-30 | Adamed Sp. Zo.O. | ANTIKANCERSKI PROTEIN FUNCTIONS |
-
2011
- 2011-01-05 PL PL393578A patent/PL219845B1/pl unknown
-
2012
- 2012-01-05 US US13/978,090 patent/US9175059B2/en active Active
- 2012-01-05 EA EA201391005A patent/EA025830B1/ru unknown
- 2012-01-05 SI SI201230978T patent/SI2661496T1/sl unknown
- 2012-01-05 KR KR1020137020558A patent/KR101950043B1/ko active IP Right Grant
- 2012-01-05 RS RS20170597A patent/RS56095B1/sr unknown
- 2012-01-05 PL PL12700215T patent/PL2661496T3/pl unknown
- 2012-01-05 EP EP12700215.2A patent/EP2661496B1/en active Active
- 2012-01-05 PT PT127002152T patent/PT2661496T/pt unknown
- 2012-01-05 AU AU2012204900A patent/AU2012204900B2/en active Active
- 2012-01-05 SG SG2013032768A patent/SG190049A1/en unknown
- 2012-01-05 DK DK12700215.2T patent/DK2661496T3/en active
- 2012-01-05 HU HUE12700215A patent/HUE032576T2/en unknown
- 2012-01-05 JP JP2013547859A patent/JP5797773B2/ja active Active
- 2012-01-05 LT LTEP12700215.2T patent/LT2661496T/lt unknown
- 2012-01-05 CN CN201280003863.3A patent/CN103228788B/zh active Active
- 2012-01-05 BR BR112013016980-0A patent/BR112013016980B1/pt active IP Right Grant
- 2012-01-05 WO PCT/EP2012/050145 patent/WO2012093158A1/en active Application Filing
- 2012-01-05 ES ES12700215.2T patent/ES2628377T3/es active Active
- 2012-01-05 CA CA2814597A patent/CA2814597C/en active Active
- 2012-01-05 ME MEP-2017-131A patent/ME02756B/me unknown
- 2012-01-05 MX MX2013007872A patent/MX339203B/es active IP Right Grant
- 2012-05-01 UA UAA201309548A patent/UA108778C2/ru unknown
-
2013
- 2013-05-07 IL IL226205A patent/IL226205B/en active IP Right Grant
-
2017
- 2017-06-13 HR HRP20170905TT patent/HRP20170905T1/hr unknown
- 2017-06-15 CY CY20171100632T patent/CY1119149T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
BR112013016980B1 (pt) | Proteína de fusão anticancerígena | |
DK2585480T3 (en) | Anticancerfusionsprotein | |
JP6324905B2 (ja) | 抗がん融合タンパク質 | |
BR112013013548B1 (pt) | Proteína de fusão anticancerígena | |
US20140031283A1 (en) | Anticancer fusion protein | |
NZ609219B2 (en) | Anticancer fusion protein | |
NZ617353B2 (en) | Anticancer fusion protein |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] |
Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS. |
|
B07E | Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette] | ||
B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
B25A | Requested transfer of rights approved |
Owner name: ADAMED PHARMA S.A. (PL) |
|
B350 | Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette] | ||
B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 05/01/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO. |