CN103228788A - 抗癌融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
融合蛋白，其包含：结构域（a），其为hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和结构域（b），其为抗血管生成效应子肽的序列，其中结构域（b）的序列连接于结构域（a）的C末端或N末端。所述融合蛋白可用于治疗癌症疾病。
Description
本发明涉及治疗性融合蛋白、特别是重组融合蛋白的领域。更具体地，本发明涉及包含可溶性人TRAIL蛋白序列的片段和抗血管生成肽的序列的融合蛋白，包含它们的药物组合物，它们在治疗、特别是抗癌试剂中的用途，以及编码所述融合蛋白的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的表达载体，以及包含这些表达载体的宿主细胞。
TRAIL蛋白属于细胞因子家族（肿瘤坏死因子相关的细胞调亡诱导性配体），也被称作Apo2L(Apo2-配体)，是肿瘤细胞和被病毒感染的细胞中的细胞调亡的强有力的激活子。TRAIL是体内天然产生的配体。TRAIL蛋白，其氨基酸序列，编码DNA序列和蛋白表达系统首次公开于EP0835305A1。
TRAIL蛋白通过与促细胞调亡TRAIL表面受体1和2（TRAIL-R1/R2）结合并随后激活这些受体来发挥其抗癌活性。这些受体，也被称作DR4和DR5（死亡受体4和死亡受体5），属于TNF受体家族并且在不同类型的癌症细胞上过表达。这些受体的激活能诱导阻抑基因p53非依赖性细胞调亡的外部信号传导途径，其通过激活的胱天蛋白酶-8引起执行性胱天蛋白酶的激活，从而降解核酸。在TRAIL激活后释放的胱天蛋白酶-8也可引起Bid蛋白的释放，从而间接激活线粒体途径，Bid蛋白转位至线粒体，在那里其刺激细胞色素c的释放，因此间接扩大来自死亡受体的细胞调亡信号。
TRAIL选择性作用于肿瘤细胞，基本上不诱导健康细胞的调亡，健康细胞对该蛋白是抗性的。因此，认识到TRAIL作为抗癌试剂的巨大潜力，其作用于多种不同类型的肿瘤细胞，包括血液恶性肿瘤和实体肿瘤，同时极少影响正常细胞并显示出潜在相对小的副作用。
TRAIL蛋白是II型膜蛋白，其具有281个氨基酸的长度，在被蛋白酶切割后，它的包含氨基酸残基114-281的细胞外区域形成大小为20kDa的可溶性sTRAIL分子，其也是具有生物活性的。TRAIL和sTRAIL这两种形式都能通过与存在于靶细胞上的TRAIL受体相互作用而激发细胞调亡。使用细胞系测试证明了TRAIL分子的可溶性部分的强烈的抗肿瘤活性和非常低的系统性毒性。
同样，对于具有对应于hTRAIL的氨基酸114-281的氨基酸序列的重组人可溶性TRAIL（rhTRAIL）（在INN下称作dulanermin）的人类临床研究显示出其良好的耐受性并且没有剂量限制性毒性。
短于114-281的TRAIL片段也能结合膜死亡受体并通过这些受体诱导细胞调亡，如最近就122-281hTRAIL的重组循环序列改变的突变体所报道的，例如见EP1688498。
到目前为止所报道的重组TRAIL蛋白对于肝细胞的毒性效应似乎与修饰即多聚组氨酸标签的存在相关，而非标签化的TRAIL不显示系统性毒性。
然而，在进一步研究和开发的过程中，很多癌症细胞似乎显示出对于TRAIL的原发性或获得性抗性（见例如WO2007/022214）。虽然对于TRAIL的抗性的机理尚未完全了解，但是相信其可在TRAIL诱导的细胞调亡途径的不同水平表现其自己，从细胞表面受体水平到信号传导途径内的执行性胱天蛋白酶。这种抗性限制了TRAIL作为抗癌试剂的有用性。
此外，在对患者进行的临床试验中证明，TRAIL作为单一治疗的实际有效性是低下的。为了克服这种低的效率和肿瘤对TRAIL的抗性，设计了与放疗和化疗试剂的多种组合治疗，其产生了协同性细胞调亡效应(WO2009/002947;A.Almasan and A.Ashkenazi,CytokineGrowth Factor Reviews14(2003)337-348;RK Srivastava,Neoplasis,Vol3,No6,2001,535-546,Soria JC et al.,J.Clin.Oncology,Vol28,No9(2010),p.1527-1533)。在WO2009/140469中描述了rhTRAIL与所选择的常规的化疗试剂(紫杉醇、卡铂)和单克隆抗-VEGF抗体组合用于癌症治疗的用途。然而，此类组合必然意味着公知的常规化疗或放疗的缺陷。
此外，已经证明与TRAIL治疗法相关的问题是其低稳定性以及在施用之后迅速从身体清除。
癌症治疗的靶标之一还在于抑制肿瘤血管生成。血管生成（血管新生）是病理性的、时间非限制性的产生新血管的过程，其为肿瘤提供氧和营养。血管生成对于肿瘤的生长和扩增是必不可少的，并促进其转移。
抑制肿瘤血管生成在癌症治疗中的有益效应是已知的。尝试了临床使用抑制或调节血管生成过程的物质，既作为癌症治疗又补充癌症治疗。
血管生成抑制剂是已知的，有内源性的天然存在于人体中的，也有多种外源性的抗血管生成物质。其中有血管生成的蛋白质抑制剂，包括内源性蛋白质的蛋白水解片段。举例而言，血管生成的蛋白质抑制剂例如血管抑素(angiostatin)(纤维蛋白原的片段)、内皮抑素(endostatin)(胶原XVIII的C末端片段)、钙网蛋白(calreticulin)、血管抑制素(vasostatin)-钙网蛋白片段，催乳素片段，金属蛋白酶2片段，或肿瘤抑素(tumstatin)-胶原IV的片段(Cao Y.Angiogenesismodulates adipogenesis and obesity.J Clin Invest.2007;117(9):2362–2368,Folkman J.Angiogenesis:an organizingprinciple for drug discovery?Nat Rev Drug Discov.2007;6:273–286)。
例如，肿瘤抑素是大小为28kDa的肽，IV型胶原的片段，能够结合整合素αvβ3并通过抑制内皮细胞增殖而阻止血管生成。此外，肿瘤抑素独立地抑制局部粘着斑激酶(Focal Adhesion Kinase，FAK)和磷脂酰肌醇3-激酶PI3和蛋白激酶PKB/Akt的激活。
抗血管生成活性也可通过抑制促血管生成蛋白来实现，例如血管内皮生长因子(VEGF)，其通过位于血管内皮上的受体来发挥作用，其是血管新生的主要刺激剂。
在临床处理包括癌症治疗中，某些针对VEGF的物质已经被用作抗血管生成因子，例如单克隆抗体贝伐单抗和雷珠单抗。也已知其它的刺激内皮细胞增殖和迁移的、独立于位于内皮上的受体的促血管生成因子，其包括例如，细胞因子例如血小板衍生的生长因子PDGF和表皮生长因子EGF、TNF和血管生成素(angiopoietin)。
在血管生成的过程中，还涉及酶氨基肽酶N(APN/CD13)，其为跨膜金属蛋白酶。已知抑制该酶可导致对于肿瘤生成过程的抑制。多种氨基肽酶N的天然和合成抑制剂是已知的(Bavouis B.,DauzonneD.,Aminopeptidase-N/CD13(EC3.4.11.2)inhibitors:chemistry,biological evaluations,and therapeutic prospects.Medical ResearchReview,2006,26,(1),88-130)。
APN/CD13的天然抑制剂主要包括由微生物产生的物质。其中的代表为贝他定(bestatin)、姜黄素(curcumin)和芹菜素(apigenin)。还发现含有CNGRC基序的短肽能够有效结合CD13(Arap et al.,Science,279:377-380,1998)。
很多抗血管生成物质目前处于不同的研究阶段，包括临床试验。然而，旨在抑制血管生成的已知疗法具有很多熟知的缺点。例如，治疗性单克隆抗体贝伐单抗在治疗乳腺癌中的益处最近遭到质疑。很多抗血管生成药物显示出例如非常短的半衰期、低溶解性、差的生物可获得性和毒性副作用。
抗血管生成药物的安全性是特别重要的，因为其延长的使用和缺乏治疗的选择性。对于有效的治疗剂的强烈需求和肿瘤疾病的性质使得需要对于此类药物的简化的注册程序，因此不可能知道所述药物的所有副作用和缺点。虽然，与化疗剂不同(化疗剂是针对所有迅速增殖中的细胞)，抗血管生成药物是针对不同阶段的血管形成，其导致治疗的毒性的减少。然而，仍然需要旨在抑制血管生成同时确保针对肿瘤细胞的选择性的抗癌治疗。因此，需要具有改善的毒性特性的新的抗血管生成性抗癌治疗。
包含通过金属蛋白酶切割位点连接子连接的血管生成抑制剂血管抑制素(vasostatin)和TRAIL114-281的序列的构建的融合蛋白被描述为在肿瘤细胞中显示出诱导细胞调亡的效应，见A.I.Guo et al,Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology2008,vol.24(10),925-930。
包含血管生成抑制剂钙网蛋白和TRAIL114-281的序列的构建的融合蛋白被描述为在肿瘤细胞中显示诱导细胞凋亡的效应，见CN1609124A。
CN1256347C公开了由激肽原(kininogen)D560-148和TRAIL114-281组成的融合蛋白。
包含通过编码GGGSGGSG的连接子连接于TRAIL114-281的N或C末端的血管生成抑制剂kininostatin、血管抑制素和canstatin的构建体的融合蛋白描述于Feng Feng-Yi“Phase and Clinical Trial ofRh-Apo2L and Apo2L-Related Experimental Study”,Ph.D.degreethesis,Chinese Peking Union Medical,2006-10-01;http://www.lw23.com/lunwen_957708432。
包含血管生成抑制剂肿瘤抑素(tumstatin)的Tumstatin183-230和TRAIL114-281的序列的构建的融合蛋白被描述为显示出诱导胰腺癌细胞的细胞调亡，见N.Ren et al,Academic Journal of Second MilitaryMedical University2008,vol.28(5),676-478。
US2005/244370和对应的WO2004/035794公开了TRAIL95-281的构建体，其作为效应子结构域，通过肽连接子与作为细胞表面结合结构域的TNF家族配体的另一成员CD40的细胞外部分连接。其指出该构建体的激活是通过其CD40部分的结合。
本发明提出了解决该问题的方案：提供了新的融合蛋白，其包含源自TRAIL的结构域和具有抗血管生成活性并不包括TRAIL片段的短的效应子肽结构域，其中所述效应子肽加强或补充TRAIL的作用。
根据本发明的蛋白选择性针对癌细胞，其中蛋白的各个元件发挥它们的效应，特别地，效应子肽抑制肿瘤血管生成。本发明的蛋白向肿瘤环境的递送使得针对体内的健康细胞的毒性以及副作用最小化，并且减小了施用频率。此外，通过使用本发明的蛋白的靶向治疗允许避免之前已知的由血管的低渗透性引起的非特异性抗血管生成治疗法的低效率问题。
此外，在很多情况下，本发明的融合蛋白比可溶性TRAIL及其变体、包括序列的片段更强。直至目前，用于本发明的融合蛋白中的已知的效应子肽未被用于药物，因为例如不理想的动力学、被非特异性蛋白酶迅速降解或由于缺乏正确的激活途径次序(这对于使效应子肽在靶位点的正确作用是必须的)而在体内积累。效应子肽向融合蛋白中的掺入允许使它们选择性地递送至需要它们发挥作用的位点。此外，效应子肽的连接增大了蛋白质量，这产生了延长的半衰期并增加了肿瘤中蛋白的保持以及其增强的效率。另外，在很多情况下，新的融合蛋白还克服了对于TRAIL的抗性。
附图说明
现在将通过阅读附图详细描述本发明。
图1显示了根据Ex.1、Ex.2、Ex.3、Ex.4、Ex.5和Ex.6的本发明的融合蛋白的示意性结构。
图2显示了根据Ex.7、Ex.8、Ex.9、Ex.10和Ex.11的本发明的融合蛋白的示意性结构。
图3显示了根据Ex.12、Ex.13、Ex.14和Ex.15的本发明的融合蛋白的示意性结构。
图4显示了以比椭圆率(specific ellipticity)表示的rhTRAIL95-281和Ex.1,Ex.4,Ex.5,Ex.9和Ex.14的融合蛋白的圆二色性光谱。
图5显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.1,Ex.4,Ex.5和Ex.9的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:CD1-Foxn1nu小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图6显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.1,Ex.4,Ex.5和Ex.9的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:CD1-Foxn1nu1小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图7显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.1的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Crl:CD1-Foxn1nu小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图8显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.1的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Crl:CD1-Foxn1nu1小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图9显示了Ex.16,Ex.17,Ex.18和Ex.19的本发明的融合蛋白的示意结构。
图10显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.5,Ex.4,Ex.9和Ex.1的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:CD1-Foxn1nu小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图11显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.5,Ex.4,Ex.9和Ex.1的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:CD1-Foxn1nu1小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图12显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6和Ex.11的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图13显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6和Ex.11的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图14显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6和Ex.19的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌Colo205的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图15显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6和Ex.19的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌Colo205的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图16显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6和Ex.11的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌SW620的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图17显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6和Ex.11的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌SW620的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图18显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.1的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Cby.Cg-foxn1(nu)/J小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图19显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.1的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Cby.Cg-foxn1(nu)/J小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图20显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌NCI-H460的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图21显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌NCI-H460的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图22显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.5,Ex.6,Ex.11的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图23显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.5,Ex.6,Ex.11的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图24显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.5的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌NCI-H460-Luc2的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图25显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.5的发明的融合蛋白处理的具有肺癌NCI-H460-Luc2的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图26显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.5和Ex.1的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）
图27显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.5和Ex.1的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌A549的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图28显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6和Ex.11的本发明的融合蛋白处理的具有肝癌PLC/PRF/5的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图29显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6和Ex.11的本发明的融合蛋白处理的具有肝癌PLC/PRF/5的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图30显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6和Ex.19的本发明的融合蛋白处理的具有HepG2肝癌的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图31显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6和Ex.19的本发明的融合蛋白处理的具有HepG2肝癌的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图32显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.11的本发明的融合蛋白处理的具有PANC-1胰腺癌的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图33显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.11的本发明的融合蛋白处理的具有PANC-1胰腺癌的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
图34显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6和Ex.19的本发明的融合蛋白处理的具有多药物抗性人子宫肉瘤MES-SA/Dx5的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化（初始阶段的百分率）。
图35显示了，相对于以rhTRAIL114-281处理，以Ex.6和Ex.19的本发明的融合蛋白处理的具有多药物抗性人子宫肉瘤MES-SA/Dx5的Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值（%TGI）。
发明详述
本发明涉及融合蛋白，其包含：
-结构域（a），其为可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和
-结构域（b），其为抗血管生成效应子肽的序列，
其中结构域（b）的序列连接于结构域（a）的C末端和/或N末端；
条件是排除这样的融合蛋白：其中效应子肽选自钙网蛋白(calreticulin)、肿瘤抑素(tumstatin)183-230、激肽原(kininogen)D5、血管抑制素(vasostatin)、kininostatin和canstatin。
术语“可溶性hTRAIL的序列的功能性可溶性片段”应该被理解为指可溶性hTRAIL的任何能够在结合于哺乳动物细胞表面上的其受体之后在该细胞中诱导细胞调亡信号的片段。
本领域技术人员还将认识到：TRAIL序列的至少70%的同源性的存在是本领域已知的。
应该理解，本发明的融合蛋白中的效应子肽结构域（b）不是hTRAIL蛋白，也不是hTRAIL蛋白的一部分或片段。
根据本发明的术语“肽”应被理解为从通过肽键连接在一起的多个氨基酸的分子构建物。因此，根据本发明的术语“肽”包括寡肽、多肽和蛋白质。
在本发明中，肽的氨基酸序列将以本领域采纳的常规方式表示，从肽的N末端（N-端）至其C末端（C-端）。因此，任何序列均为左侧为N末端，右侧为C末端。
本发明的融合蛋白在结构域（a）的C末端或N末端连接至少一个效应子肽结构域（b）。
在具体的实施方式中，结构域（a）是hTRAIL序列的片段，起始于hTRAIL95至hTRAIL121的氨基酸，含端点，结束于氨基酸hTRAIL281。
具体地，结构域（a）可选自对应于hTRAIL95-281,hTRAIL119-281,hTRAIL120-281和hTRAIL121-281的序列。本领域技术人员将认识到，hTRAIL95-281,hTRAIL119-281,hTRAIL120-281和hTRAIL121-281分别代表GenBank中登记号P50591的hTRAIL（SEQ ID NO:16）的已知序列中的起始于编号95,119,120和121的氨基酸的人TRAIL蛋白的片段。
在另一个具体实施方式中，结构域（a）是起始于不低于hTRAIL95的氨基酸位置并结束于氨基酸hTRAIL281的可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段的同源物，该序列与原始序列至少70%、优选85%同一。
在该实施方式的具体变体中，结构域（a）是选自对应于hTRAIL95-281,hTRAIL114-281,hTRAIL116-281,hTRAIL120-281,hTRAIL121-281和hTRAIL122-281的序列的片段的同源物。
应该理解，hTRAIL片段的同源物是该片段的氨基酸序列的变体/修饰，其中至少一个氨基酸被改变，包括1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸，和不超过15%的氨基酸，并且其中修饰的序列的片段具有hTRAIL序列的保留的功能，即结合细胞表面死亡受体和在哺乳动物细胞中诱导细胞凋亡的能力。氨基酸序列的修饰可以包括例如，置换、缺失和/或添加氨基酸。
优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出相对于hTRAIL的天然片段而言，与死亡受体DR4（TRAIL-R1）或DR5（TRAIL-R2）的改变的亲和性。
术语“改变的亲和性”是指增加的亲和性和/或具有改变的受体选择性的亲和性。
优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出相对于hTRAIL的天然片段而言对于死亡受体DR4和DR5的增加的亲和性。
特别优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出相对于死亡受体DR5比对于死亡受体DR4增加的亲和性，即增加的选择性DR5/DR4。
同样优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出对于死亡受体DR4和/或DR5的比对于受体DR1（TRAIL-R3）和/或DR2（TRAIL-R4）的与亲和性相关的增加的选择性。
产生对于死亡受体DR4和DR5的增加的亲和性和/或选择性的hTRAIL的修饰是本领域已知的，例如见Tur V,van der Sloot AM,Reis CR,Szegezdi E,Cool RH,Samali A,Serrano L,Quax WJ.DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)variants obtained by structure-based design.J.Biol.Chem.2008Jul18;283(29):20560-8，其描述了D218H突变具有对于DR4的增加的选择性；或Gasparian ME,Chernyak BV,Dolgikh DA,Yagolovich AV,Popova EN,Sycheva AM,Moshkovskii SA,Kirpichnikov MP.Generation of new TRAIL mutants DR5-A andDR5-B with improved selectivity to death receptor5,Apoptosis.2009Jun;14(6):778-87，其描述了D269H突变对于DR4具有降低的亲和性。产生对于选自DR4和DR5的一种受体的增加的亲和性（相对于DR1和DR2受体）和对于受体DR5的增加的亲和性（相对于DR4）的hTRAIL突变体也描述于WO2009077857和WO2009066174。
合适的突变是选自下列的天然hTRAIL位置中的一个或多个突变：131,149,159,193,199,201,204,204,212,215,218和251，特别地，涉及以碱性氨基酸例如赖氨酸、组氨酸或精氨酸，或诸如谷氨酸或天冬氨酸的氨基酸置换某氨基酸的突变。特别地可提及选自下列的一个或多个突变：G131R,G131K,R149I,R149M,R149N,R149K,S159R,Q193H,Q193K,N199H,N199R,K201H,K201R,K204E,K204D,K204L,K204Y,K212R,S215E,S215H,S215K,S215D,D218Y,D218H,K251D,K251E和K251Q，描述于WO2009066174。
合适的突变还有选自195、269和214的天然hTRAIL位置中的一个或多个突变，特别是涉及以碱性氨基酸例如赖氨酸、组氨酸或精氨酸置换某氨基酸的突变。具体地可提及选自D269H,E195R和T214R的一个或多个突变，描述于WO2009077857。
在具体的实施方式中，为hTRAIL的片段的同源物的结构域（a）选自天然TRAIL序列的D218H突变体，如WO2009066174所描述，或天然TRAIL序列的Y189N-R191K-Q193R-H264R-I266R-D269H突变体，如Gasparian ME,Chernyak BV,Dolgikh DA,Yagolovich AV,Popova EN,Sycheva AM,Moshkovskii SA,Kirpichnikov MP.Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improvedselectivity to death receptor5,Apoptosis.2009Jun;14(6):778-87中所描述。
结构域（b）可以特别地选自下组：
-选自VEGF、PDGF和EGF的生长因子受体的抑制剂；
-肿瘤抑素或除了片段183-230之外的其片段；和
-氨基肽酶N（CD13）的抑制剂。
在生长因子的受体的抑制剂组内，结构域（b）的效应子肽可以是人血管内皮生长因子VEGF的片段，其与天然配体竞争性结合VEGF受体，同时其本身缺乏血管生成活性。结果为，VEGF的血管生成活性被阻断，没有对于新血管形成的刺激，肿瘤生长被抑制。特别地，上述组的效应子肽是抑制VEGF信号途径的肽，具体为序列表中SEQ ID NO:17所示的人VEGF的7个氨基酸的片段。
据信包含VEGF七肽序列的肽掺入到本发明的融合蛋白中将通过抑制血管生成过程而有效清除癌细胞。
在生长因子的受体的抑制剂组内，结构域（b）的效应子肽可以是血小板衍生的生长因子PDGF的片段，其与天然配体竞争性结合PDGF受体，同时其本身缺乏血管生成活性。结果为，PDGF的血管生成活性被阻断，没有对于新血管形成的刺激，肿瘤生长被抑制。
特别地，所述效应子肽是序列表中SEQ ID NO:22所示的PDGF配体的片段—19个氨基酸的肽。
据信包含血小板衍生的生长因子PDGF蛋白片段的序列的肽掺入到本发明的融合蛋白中将通过抑制血管生成过程而有效清除癌细胞。
在生长因子的受体的抑制剂组内，结构域（b）的抗血管生成效应子肽可以是表皮生长因子EGF的肽片段，其与天然配体竞争性结合EGF受体，同时其本身缺乏血管生成活性。结果为，EGF的血管生成活性被阻断，没有对于新血管形成的刺激，肿瘤生长被抑制。能够结合EGF受体而不激活细胞内激酶并且能够阻断EGR活性的此种阻断性肽Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu和Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu是已知的，例如见EP0641358。特别地，此类效应子肽为EGF配体的片段，如序列表中SEQ ID NO:23所示。
据信包含表皮生长因子EGF的序列的肽掺入到本发明的融合蛋白中将通过抑制血管生成过程而有效清除癌细胞。
在肿瘤抑素及其片段的组内，结构域（b）的效应子肽可以是肿瘤抑素蛋白的25个氨基酸的片段（片段I），如序列表中SEQ ID NO:18所示。上述组的效应子肽也为肿瘤抑素蛋白的另一个18个氨基酸的片段（片段II），如序列表中SEQ ID NO:19所示。结构域（b）的抗血管生成效应子肽也可以是肿瘤抑素肽片段的组合，特别是片段I和片段II的组合，彼此以任意顺序相邻。在一个实施方式中，结构域（b）是片段I/片段II的组合（SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:19）或片段II/片段I的组合（SEQ ID NO:19/SEQ ID NO:18）。
据信包含肿瘤抑素蛋白片段I和/或片段II的序列的肽掺入到本发明的融合蛋白中将通过抑制血管生成过程而有效清除癌细胞。
氨基肽酶N/CD13的抑制剂（其结合酶氨基肽酶N/CD13以抑制其活性）的组将包括包含基序NGR或RGD的短肽。
包含基序NGR的有效结合氨基肽酶N的肽如例如Arap et al.,Science,279:377-380,1998所描述。在氨基肽酶N的细胞外结构域中，也存在显示出对于RGD基序的亲和性的片段。两个基序(RGD和NGR)都作为拮抗剂结合参与血管新生过程的因子。因此，类似于NGR基序的RGD基序可能与氨基肽酶N结合，从而作为其抑制剂发挥作用(Friedlander et al.Definition of two angiogenic pathways by distinct αvintegrins.Science(Washington DC),270:1500-1502,1995;Pasqualiniet al Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and atarget for inhibiting angiogenesis.Cancer Res.2000Feb1;60(3):722-7)。
在氨基肽酶N/CD13的抑制剂的组内，结构域（b）的抗血管生成效应子肽可以是序列表中SEQ ID NO:20所示的结合CD13的5个氨基酸的肽。该组的另一个效应子肽是序列表中SEQ ID NO:21所示的结合CD13的9个氨基酸的肽。
据信包含结合氨基肽酶N/CD13的蛋白片段的序列的肽掺入到本发明的融合蛋白中将通过抑制血管生成过程而有效清除癌细胞。
本发明的融合蛋白可包含不止一个效应子肽结构域（b），特别是2个或3个结构域（b）。在一个实施方式中，本发明的融合蛋白包含2个相似或不同的效应子结构域（b），选自SEQ.No.17,SEQ.No.18,SEQ.No.19,SEQ.No.20,SEQ.No.21,SEQ.No.22和SEQ.No.23，其中效应子结构域（b）彼此相邻。在其它实施方式中，本发明的融合蛋白包含2个相似或不同的效应子结构域（b），选自SEQ.No.17,SEQ.No.18,SEQ.No.19,SEQ.No.20,SEQ.No.21,SEQ.No.22和SEQ.No.23，其中效应子结构域（b）位于结构域（a）的N末端和/或C末端。
在具体的实施方式中，本发明的融合蛋白包含3个效应子结构域。
作为一个例子，融合蛋白包含位于结构域（a）的N末端的源自VEGF的肽（SEQ ID NO:17）和位于结构域（a）的C末端的彼此相邻的肿瘤抑素的片段I（SEQ ID NO:18）和肿瘤抑素的片段II（SEQID NO:19）。
在本发明的融合蛋白的具体实施方式中，效应子肽是选自下列的具有抗血管生成活性的肽：SEQ ID NO:17（源自VEGF的七肽），SEQ ID NO:18（肿瘤抑素蛋白的片段I（氨基酸74-98）），SEQ IDNO:19（肿瘤抑素蛋白的片段II（氨基酸197-214）），SEQ ID NO:20（结合CD13的肽），SEQ ID NO:21（结合CD13的肽），SEQ IDNO:22（PDGF的片段）和SEQ ID NO:23（EGF的片段）。
在与存在于癌细胞表面上的TRAIL受体结合之后，融合蛋白将显示出双重效应。结构域（a），其为TRAIL的功能片段或具有保留的功能的其同源物，将显示出其已知的激动剂活性，即结合细胞表面上的死亡受体并激活细胞凋亡的外部途径。包含抗血管生成肽的融合蛋白内化之后，结构域（b）将能够与TRAIL结构域平行地潜在地细胞内地发挥其作用。通过这种方式，TRAIL的抗癌活性可通过其它元件和机制的激活而被加强，例如天然VEGF、PDGF和EGF配体的结合位点的空间抑制、血管生成和血管新生的抑制、磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B(PKB/Akt)的激活的抑制或激酶Akt和NFk途径对TRAIL过表达的间接刺激。
在另一实施方式中，结构域（a）和结构域（b）通过至少一个结构域（c）连接，结构域（c）包含被存在于细胞环境、特别是肿瘤细胞环境中的蛋白酶识别的切割位点序列。结构域（a）和结构域（b）通过至少一个结构域（c）连接意思是在结构域（a）和（b）之间可以存在不止一个结构域（c），特别是1个或2个结构域（c）。
蛋白酶切割位点可以选自：
-被金属蛋白酶MMP识别的序列，特别是表示为SEQ ID NO:24的(Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP)或表示为SEQ IDNO:55的(Pro Leu Gly Ile Ala Gly Glu/PLGIAGE)或表示为SEQ IDNO:56的(Pro Leu Gly Leu Ala Gly GluPro/PLGLAGEP)；
-被尿激酶uPA识别的序列，特别是表示为SEQ ID NO:25的Arg Val Val Arg(以单字符表示为RVVR)，或其片段，其与其所结合的序列的最后一个氨基酸形成SEQ ID NO:25；
以及它们的组合。
在本发明的一个实施方式中，蛋白酶切割位点是被金属蛋白酶MMP识别的序列与被尿激酶uPA识别的序列的组合，以任何顺序彼此相邻。
在一个实施方式中，结构域（c）是MMP/uPA SEQ.NO.24/SEQ.NO.25的组合，或uPA/MMP SEQ.No25/SEQ.No.24的组合。
在一个实施方式中，结构域（c）是MMP/uPA SEQ.NO.55/SEQ.NO.25的组合，或uPA/MMP SEQ.No25/SEQ.No.55的组合。
在一个实施方式中，结构域（c）是MMP/uPA SEQ.NO.56/SEQ.NO.25的组合，或uPA/MMP SEQ.No25/SEQ.No.56的组合。
蛋白酶金属蛋白酶MMP和尿激酶uPA在肿瘤环境中过表达。被蛋白酶识别的序列的存在能够使结构域（a）从结构域（b）切割下来，即释放功能性结构域（b）并由此实现其激活。
蛋白酶切割位点的存在允许迅速释放效应子肽，增加融合蛋白被存在于细胞中的蛋白酶随机降解之前肽向其作用位点转运的机会。
除了融合蛋白的主要功能元件，切割位点结构域之外，本发明的融合蛋白可包含中性序列/柔性空间甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸连接子（间隔子）的序列。此类连接子/间隔子是本领域熟知的并且在文献中有描述。将它们掺入融合蛋白的序列中是为了使得通过在宿主细胞中过表达而产生的蛋白的正确折叠。
特别地，柔性空间连接子可以选自SEQ.No.26和SEQ.No.27，其为甘氨酸、半胱氨酸和丙氨酸残基的组合。在另一实施方式中，柔性空间连接子可以选自SEQ.No.28,SEQ.No.29,SEQ.No.30和SEQ.No.54，其由甘氨酸和丝氨酸组成。另外，柔性空间连接子可以是SEQ.No.28,SEQ.No.29,SEQ.No.30和SEQ.No.54的任何片段，作为柔性空间连接子发挥作用，例如片段Gly Gly Gly/GGG或片段GlyGly/GG。
在一个实施方式中，柔性空间连接子也可以选自单一的氨基酸残基，例如谷氨酸残基、半胱氨酸、丝氨酸、脯氨酸或甘氨酸残基。
在其它实施方式中，柔性空间连接子可以是SEQ.No.26,SEQ.No.27,SEQ.No.28,SEQ.No.29,SEQ.No.30,SEQ.No.54组成的连接子与谷氨酸残基、半胱氨酸、丝氨酸、脯氨酸或甘氨酸的单一氨基酸残基的任意组合。
本发明的融合蛋白的具体实施方式为包含选自SEQ.No.1,SEQ.No.2,SEQ.No.4,SEQ.No.5,SEQ.No.6,SEQ.No.46,SEQ.No.47和SEQ.No.48的抗血管生成肽和包含源自VEGF的七肽的效应子肽的融合蛋白。
本发明的融合蛋白的其它具体实施方式是包含选自SEQ.No.7和SEQ.No.8的抗血管生成肽和包含结合CD13的效应子肽的融合蛋白。
本发明的融合蛋白的其它具体实施方式是包含选自SEQ.No.9,SEQ.No.10,SEQ.No.11和SEQ.No.49的抗血管生成肽和包含PDGF的片段作为效应子肽的融合蛋白。
本发明的融合蛋白的其它具体实施方式是包含选自SEQ.No.12和SEQ.No.13的抗血管生成肽和包含肿瘤抑素I和II片段作为效应子肽的融合蛋白。
本发明的融合蛋白的其它具体实施方式是包含选自SEQ.No.14和SEQ.No.15的抗血管生成肽和包含EGF的片段作为效应子肽的融合蛋白。
本发明的融合蛋白的具体实施方式是包含选自SEQ.No.3的抗血管生成肽和包含源自VEGF的七肽、肿瘤抑素肽的片段I和肿瘤抑素肽的II片段作为效应子肽的融合蛋白。
上述代表性融合蛋白的详细描述显示于图1-3和图9，以及如下文的实施例所描述。
根据本发明，融合蛋白意思是包含2个或更多个蛋白或其片段的单一的蛋白分子，所述2个或更多个蛋白或其片段通过它们各自的肽链内的肽键共价连接而无另外的化学连接子。
融合的蛋白也可另外被描述为蛋白构建体或嵌合蛋白。根据本发明，术语“构建体”或“嵌合蛋白”如果被使用的话，应该被理解为是指上文定义的融合蛋白。
对于本领域技术人员，显而易见的是由此定义的融合蛋白可通过肽和蛋白的已知的化学合成方法来合成。
融合蛋白可通过化学肽合成的方法来合成，特别是使用合适的树脂作为载体，使用固相肽合成技术进行。此类技术是常规的和本领域已知的，特别描述于例如下列专论中：Bodanszky和Bodanszky,ThePractice of Peptide Synthesis,1984,Springer-Verlag,New York,Stewart et al.,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Edition,1984,PierceChemical Company。
融合蛋白可通过肽的化学合成方法作为连续蛋白来合成。或者，可以单独合成蛋白的各个片段（结构域），然后通过一个肽片段的氨基末端与另一个肽的羧基末端的缩合经由肽键而组合在一起。此类技术是常规的和本领域已知的。
为了验证得到的肽的结构，可以使用肽的氨基酸组成的已知的分析方法，例如高分辨率质谱技术，以确定肽的分子量。为了确认肽的序列，也可以使用蛋白测序仪，其依次降解肽并鉴定氨基酸的序列。
然而，优选地，本发明的融合蛋白是重组蛋白，通过编码融合蛋白的多核苷酸序列在宿主细胞中的基因表达的方法来产生。
本发明的另一方面是编码如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特别是DNA序列。
优选地，根据本发明的编码如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特别是DNA序列是针对在大肠杆菌中表达而优化的序列。
本发明的另一个方面是包含多核苷酸序列、特别是如上所述的本发明的DNA序列的表达载体。
本发明的另一个方面是包含上文所述的表达载体的宿主细胞。
用于表达本发明的融合蛋白的优选宿主细胞是大肠杆菌细胞。
用于产生重组蛋白、包括融合蛋白的方法是熟知的。简而言之，该技术为：产生编码靶蛋白的氨基酸序列和在宿主中指导靶蛋白的表达的多核苷酸分子例如DNA分子。然后，将编码靶蛋白的多核苷酸分子掺入合适的表达载体，其确保多肽的有效表达。然后将重组表达载体导入宿主细胞以进行转染/转化，由此产生转化的宿主细胞。然后培养转化的细胞以过表达靶蛋白，纯化所获得的蛋白，任选地通过切割用于表达或纯化蛋白的标签序列而切下来。
用于表达和纯化的合适的技术描述于例如下列专著：Goeddel,Gene Expression Technology,Methods in Enzymology185,AcademicPress,San Diego,CA(1990)和A.Staron et al.,Advances Mikrobiol.,2008,47,2,1983-1995。
作为用于导入和在宿主细胞中复制DNA序列的表达载体，可以使用粘粒、质粒或修饰的病毒。通常使用质粒作为表达载体。合适的质粒是熟知的和商业上可获得。
本发明的表达载体包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸分子和用于转录和翻译掺入合适的宿主细胞的编码序列的必要的调节序列。调节序列的选择取决于宿主细胞的类型，可以由本领域技术人员容易地进行。此类调节序列的实例是包含转录起始信号的、插入编码序列之前的转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，和插入编码序列之后的转录终止序列。此外，取决于所用的宿主细胞和载体，可以将其它序列导入表达载体，例如复制起始子，另外的DNA限制性位点，增强子和允许诱导转录的序列。
表达载体还包含标记物基因序列，其赋予转化的细胞确定的表型并使得能够特异性选择转化的细胞。此外，载体还可以包含第二标记物序列，其允许将以包含插入的编码靶蛋白序列的重组质粒转化的细胞与摄取了无插入物的质粒的细胞区分开。通常，使用典型的抗生素抗性标记物，然而，任何其它本领域已知的报告子基因均可使用，其在细胞（在体内）中的存在可使用放射自显影技术、分光光度法或生物和化学发光法容易地确定。例如，取决于宿主细胞，可使用例如下列报告基因：β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶或绿色荧光蛋白。
此外，表达载体可包含信号序列，将蛋白转运至合适的细胞腔室，例如周质，在那里促进折叠。另外，可以存在编码标记物/标签例如连接于N末端的HisTag或连接于C末端的GST的序列，其促进后续使用亲和法、通过镍柱上的亲和层析纯化所产生的蛋白。也可以存在另外的序列，其保护蛋白免于宿主细胞中的蛋白水解降解，以及增强其溶解性的序列。
连接于靶蛋白的序列的辅助元件可能阻断其活性，或者由于别的原因而具有有害效应，例如由于毒性。此类元件必须被除掉，这可通过酶促或化学切割来完成。特别地，为了允许通过亲和层析而纯化蛋白而连接的6个组氨酸的标签HisTag或这种类型的其它标记物应该被除去，因为其被描述对于可溶性TRAIL蛋白的肝毒性具有影响。可以使用基于多种熟知的宿主细胞的异源表达系统，包括原核细胞：细菌，例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；酵母，例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母；和真核细胞系（昆虫、哺乳动物、植物）。
优选地，由于培养和遗传操作的容易性和大量的获得的产物，使用大肠杆菌表达系统。因此，包含编码本发明的融合蛋白的靶序列的多核苷酸序列将针对在大肠杆菌中的表达而进行优化，即，其将包含在大肠杆菌中表达优化的编码序列密码子，选自本领域已知的可能的序列变体。此外，表达载体将包含适合大肠杆菌的连接于编码序列的上述元件。
因此，在本发明的优选实施方式中，针对在大肠杆菌中表达而优化的包含编码本发明的融合蛋白的序列的多核苷酸序列选自下组的多核苷酸序列：
SEQ.No.31;SEQ.No.32;SEQ.No.33,SEQ.No.34;SEQ.No.35;SEQ.No.36;SEQ.No.37;SEQ.No.38;SEQ.No.39;SEQ.No.40;SEQ.No.41,SEQ.No.42;SEQ.No.43SEQ.No.44;SEQ.No.45,SEQ.No.50,SEQ.No.51,SEQ.No.52;SEQ.No.53；其分别编码具有对应于选自下列的氨基酸序列的氨基酸序列的融合蛋白：
SEQ.No.1;SEQ.No.2;SEQ.No.3;SEQ.No.4;SEQ.No.5;SEQ.No.6;SEQ.No.7;SEQ.No.8;SEQ.No.9;SEQ.No.10;SEQ.No.11,SEQ.No.12,SEQ.No.13;SEQ.No.14SEQ.No.15,SEQ.No.46;SEQ.No.47;SEQ.No.48;和SEQ.No.49。
在优选实施方式中，本发明还提供了适合于转化大肠杆菌的表达载体，其包含上述选自SEQ.NO.31至SEQ.NO.45和SEQ.NO.50至SEQ.NO.53的多核苷酸序列，以及以此类表达载体转化的大肠杆菌细胞。
转化，即将DNA序列导入细菌宿主细胞特别是大肠杆菌，通常在准备好摄取DNA的感受态细胞上进行，例如通过以钙离子在低温(4°C)处理，然后进行热击(37-42°C)或通过电穿孔进行。此类技术是熟知的并且通常由表达系统的生产商确定，或描述于文献和实验室工作手册中，例如Maniatis et al.,Molecular Cloning.Cold Spring Harbor,N.Y.,1982)。
在大肠杆菌表达系统中过表达本发明的融合蛋白的程序将在下文详述。
本发明还提供了包含如上文所述的本发明的融合蛋白作为活性成分以及合适的药学上可接受的载体、稀释剂和常规辅助性成分的药物组合物。药物组合物将包含有效量的本发明的融合蛋白和药学上可接受的溶解或分散于载体或稀释剂中的辅助性成分，优选是配制为单元剂型或包含多剂的制剂的药物制剂的形式。药物形式和其配制方法以及其它成分、载体和稀释剂是本领域技术人员已知的并且在文献中有描述。例如，描述于下列专著：Remington's Pharmaceutical Sciences,ed.20,2000,Mack Publishing Company,Easton,USA。
术语“药学上可接受的载体、稀释剂和辅助性成分”包含本领域已知的任何溶剂、分散介质、表面活性剂、抗氧化剂、稳定剂、防腐剂（例如抗细菌剂、抗真菌剂）等渗剂。本发明的药学上可接受的载体可包含多种类型的载体、稀释剂和赋形剂，这取决于所选的施用途径和需要的剂型，例如液体、固体和气雾剂形式，用于口服、胃肠外、吸入、表面，以及所选的形式对于施用途径(例如注射)是否必须是无菌的。本发明的药物组合物的优选施用途径是胃肠外，包括注射途径，例如静脉内、肌内、皮下、腹膜内、肿瘤内或通过单次或连续静脉内输注。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物可以通过直接注射至肿瘤来施用。在另一实施方式中，本发明的药物组合物可通过静脉内施用。在另一实施方式中，本发明的药物组合物可皮下或腹膜内施用。用于胃肠外施用的药物组合物可以是药学上可接受的水性或非水性介质中的溶液或分散体，所述介质缓冲至合适的pH和与体液等渗（如果必要），并且还可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和可溶性物质，其使得组合物与受体的组织或血液相容。可包含于组合物中的其它成分是例如水、醇例如乙醇、多元醇例如甘油、丙二醇，液体乙二醇，脂质例如甘油三酯，植物油，脂质体。合适的流动性和物质粒度可通过涂覆性物质例如卵磷脂和表面活性剂例如羟丙基纤维素、聚山梨酸酯等来提供。用于液体胃肠外组合物的合适的等渗剂是例如糖，例如葡萄糖，和氯化钠，及其组合。
或者，用于通过注射或输注施用的药物组合物可以是粉末形式，例如冻干的粉末，用于在临使用前以合适的载体例如无菌无热源水进行重构。
用于胃肠外施用的本发明的药物组合物也可具有经鼻施用的形式，包括溶液、喷雾剂或气雾剂。优选地，用于经鼻施用的形式可以是水溶液，并且是等渗的或缓冲至保持从大约5.5至大约6.5的pH，以维持类似于鼻分泌物的性质。此外，其将包含防腐剂或稳定剂，例如熟知的鼻内制剂中包含的那些。
组合物可包含多种抗氧化剂，其延迟一种或多种成分的氧化。此外，为了防止微生物的作用，组合物可包含多种抗细菌和抗真菌试剂，包括例如，但不限于，尼铂金酯类，氯丁醇，硫柳汞，山梨酸和这种类型的类似的已知物质。一般地，本发明的药物组合物可以包含例如至少大约0.01wt%的活性成分。更具体地，组合物可包含1%至75%重量的活性成分，或例如25%至60%重量，但不限于这些数值。施用于患者包括人类的根据本发明的组合物的实际剂量将由物理和生理因素决定，例如体重、病况的严重性、被治疗的疾病的类型，之前或同时的治疗性干预，患者和施用途径。合适的单元剂量，总剂量和组合物中的活性成分的浓度将由主治医生决定。
组合物可例如以下列剂量施用：大约1μg/kg体重至大约1000mg/kg患者体重，例如5mg/kg体重至100mg/kg体重，或5mg/kg体重至500mg/kg体重。融合蛋白和包含它的组合物显示出抗癌或抗肿瘤活性，可用于治疗癌症疾病。本发明还提供了如上所述的本发明的融合蛋白用于治疗哺乳动物包括人类中的癌症疾病的用途。本发明还提供了治疗哺乳动物包括人类中的癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用抗癌有效量的如上所述的本发明的融合蛋白，任选为合适的药物组合物的形式。
本发明的融合蛋白可用于治疗血液恶性肿瘤，例如白血病，肉芽肿病，骨髓瘤和其它血液恶性肿瘤。融合蛋白也可用于治疗实体瘤，例如乳腺癌、肺癌包括非小细胞肺癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，膀胱癌，前列腺癌，肾癌，脑癌等。用于治疗癌症的融合蛋白的合适的施用途径特别为胃肠外途径：以注射或输注的形式、在组合物中和以适合于该施用途径的形式施用本发明的融合蛋白。本发明将以下列一般性程序和具体融合蛋白的实例进行更详细的描述。
用于过表达融合蛋白的一般性程序
质粒的制备
靶融合蛋白的氨基酸序列用作模板以产生编码它的DNA序列，包含针对在大肠杆菌中的表达优化了的密码子。此程序允许增大在大肠杆菌中进行靶蛋白合成的后续步骤的效率。然后自动化合成得到的核苷酸序列。另外，将限制性酶Ndel(在引导链的5’末端)和Xhol(在引导链的3’末端)的切割位点添加到得到的编码靶蛋白的基因中。它们用于将基因克隆进入载体pET28a(Novagen)。它们也可用于将编码蛋白的基因克隆进入其它载体。从该构建体表达而来的靶蛋白在N末端可以任选地具有多聚组氨酸标签（6个组氨酸），其之前是凝血酶识别的位点，该位点用于后续通过亲和层析进行纯化。一些靶在不使用任何标签的情况下表达，特别是不使用组氨酸标签，随后在SP琼脂糖上纯化。首先通过使用酶Ndel和Xhol对分离的质粒进行限制性分析、然后通过靶蛋白的整个阅读框的自动化测序来确认得到的构建体的正确性。用于测序的引物互补于存在于载体中的T7启动子的序列(5'-TAATACGACTCACTATAGG-3')和T7终止子的序列(5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')。得到的质粒用于在商业化大肠杆菌菌株中过表达靶融合蛋白，其根据生产商的推荐进行转化。在选择性培养基(LB琼脂，卡那霉素50μg/ml，1%葡萄糖)上获得的菌落用于制备LB液体培养基(补充了50μg/ml的卡那霉素和1%葡萄糖)中的过夜培养物。在摇动的温育箱中生长大约15小时之后，培养物用于接种合适的培养物。
融合蛋白的过表达和纯化——一般程序A
以过夜培养物接种含有卡那霉素(30μg/ml)和100μM硫酸锌的LB培养基。将培养物在37℃温育直至600nm下的光密度(OD)达到0.60-0.80。然后加入IPTG至终浓度为0.25-1mM。在25℃摇动温育后(3.5-20h)，将培养物在6,000g离心25分钟。将细菌沉淀物重悬于含有50mM KH2PO4,0.5M NaCl,10mM咪唑,pH7.4的缓冲液中。将悬浮液在冰上超声8分钟(40%振幅，15秒脉冲，10秒间隔)。通过在20000g、4℃离心40分钟而使得到的提取物澄清。以用于制备细菌细胞提取物的缓冲液平衡来预处理Ni-Sepharose树脂(GEHealthcare)。然后使用离心提取物后获得的上清液将树脂在4℃过夜温育。然后将其载入色谱柱并以15-50倍体积的缓冲液50mM KH2PO4,0.5M NaCl,20mM咪唑,pH7.4洗涤。使用含有0.5M NaCl pH7.4的50mM KH2PO4缓冲液中的咪唑梯度从柱洗脱获得的蛋白。通过SDS-PAGE分析获得的级份。将合适的级份组合并针对50mM Tris缓冲液,pH7.2,150mM NaCl,500mM L-精氨酸,0.1mM ZnSO4,0.01%Tween20在4℃过夜透析，同时，以凝血酶(1:50)切割Histag(如果存在的话)。切割之后，通过使用Benzamidine SepharoseTM树脂纯化而从与Histag一起表达的靶融合蛋白分离凝血酶。在SP琼脂糖上进行不与Histag一起表达的靶融合蛋白的纯化。通过SDS-PAGE电泳分析产物的纯度(Maniatis et al,Molecular Cloning.Cold SpringHarbor,NY,1982)。
融合蛋白的过表达和纯化——一般程序B
以过夜培养物接种含有卡那霉素(30μg/ml)和100μM硫酸锌的LB培养基。将培养物在37℃温育直至600nm下的光密度(OD)达到0.60-0.80。然后加入IPTG至终浓度为0.5-1mM。在25℃摇动温育20h后，将培养物在6000g离心25分钟。将过表达后的细菌细胞在弗氏细胞压碎器中在含有50mM KH2PO4,0.5M NaCl,10mM咪唑,5mMβ-巯基乙醇,0.5mM PMSF(苯基甲基磺酰氟),pH7.8的缓冲液中破碎。通过在8000g离心50分钟使得到的提取物澄清。使用获得的上清液过夜温育Ni-Sepharose树脂。然后将结合了蛋白的树脂载入色谱柱。为了洗掉含有非结合性蛋白的级份，以15-50倍体积的缓冲液50mM KH2PO4,0.5M NaCl,10mM咪唑,5mMβ-巯基乙醇,0.5mMPMSF(苯基甲基磺酰氟),pH7.8洗涤柱。然后，为了洗掉大部分的特异性与床结合的蛋白，以含有50mM KH2PO4,0.5M NaCl,500mM咪唑,10%甘油,0.5mM PMSF,pH7.5的缓冲液洗涤柱。通过SDS-PAGE分析获得的级份(Maniatis et al,Molecular Cloning.ColdSpring Harbor,NY,1982)。将含有靶蛋白的级份组合(如果蛋白是与组氨酸标签一起表达)，以凝血酶切割(1U/4mg蛋白，16℃，8小时)以除掉多聚组氨酸标签。然后将级份针对配制缓冲液(500mM L-精氨酸,50mM Tris,2.5mM ZnSO4,pH7.4)透析。
实施例1：SEQ ID NO:1的融合蛋白
SEQ ID NO:1的蛋白是具有173个氨基酸的长度和19.8kDa的质量的融合蛋白，其中源自VEGF的七肽（SEQ ID NO:17）连接于序列TRAIL121-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间插入了柔性甘氨酸空间连接子（SEQ ID NO:28）。
该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:31。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:1用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:31。产生了两种形式的包含DNA编码序列的质粒，一种允许表达His标签和被凝血酶识别的位点，另一种不含任何标签，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用大肠杆菌BL21(DE3)和Tuner(DE3)pLysS菌株，二者均来自Novagen。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例2：SEQ ID NO:2的融合蛋白
SEQ ID NO:2的蛋白是具有199个氨基酸的长度和22.8kDa的质量的融合蛋白，其中源自VEGF的七肽（SEQ ID NO:17）连接于序列TRAIL95-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间插入了柔性甘氨酸空间连接子（SEQ ID NO:28）。
该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:2用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:32。产生了包含DNA编码序列的质粒，含有允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列。根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用大肠杆菌BL21(DE3)菌株，其来自Novagen。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例3：SEQ ID NO:3的融合蛋白
SEQ ID NO:3的蛋白是具有230个氨基酸的长度和26.3kDa的质量的融合蛋白，其中源自VEGF的七肽（SEQ ID NO:17）连接于序列TRAIL121-281的N末端、肿瘤抑素的片段I和II（分别为SEQID NO:18和SEQ ID NO:19）连接于序列TRAIL121-281的C末端作为效应子肽。在连接于序列TRAIL的N末端的效应子肽和TRAIL序列之间插入了柔性甘氨酸空间连接子（SEQ ID NO:28）。在连接于序列TRAIL的C末端的效应子肽和TRAIL序列之间插入了由3个甘氨酸残基Gly Gly Gly组成的空间连接子，和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点序列（SEQ ID NO:24）和被尿激酶uPA识别的切割位点序列（SEQ ID NO:25），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。
该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:33。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:3用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:33。产生了包含DNA编码序列的质粒，含有允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列。根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用大肠杆菌BL21(DE3)菌株，其来自Novagen。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例4：SEQ ID NO:4的融合蛋白
SEQ ID NO:4的蛋白是具有187个氨基酸的长度和21.4kDa的质量的融合蛋白，其中源自VEGF的七肽（SEQ ID NO:17）的2个序列连接于序列TRAIL121-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽的2个序列之间插入了被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列（SEQ ID NO:24），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在MMP切割位点的序列与效应子蛋白的序列之间插入了单一的谷氨酸残基E。在效应子肽（SEQ ID NO:17）与TRAIL序列之间插入了柔性空间甘氨酸连接子（SEQ ID NO:28）。
该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:34。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:4用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:34。产生了两种形式的包含DNA编码序列的质粒，一种允许表达His标签和被凝血酶识别的位点，另一种不含任何标签，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Stratagene的大肠杆菌BL21DE3pLysSRIL菌株和来自Novagen的Tuner(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例5：SEQ ID NO:5的融合蛋白
SEQ ID NO:5的蛋白是具有187个氨基酸的长度和21.8kDa的质量的融合蛋白，其中源自VEGF的七肽（SEQ ID NO:17）的2个序列连接于序列TRAIL121-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽的2个序列之间插入了被尿激酶uPA识别的切割位点序列（SEQ IDNO:25）和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列（SEQ ID NO:24），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在MMP切割位点的序列与效应子蛋白的序列之间插入了单一的谷氨酸残基E。另外在TRAIL的N末端连接了2个甘氨酸残基。
该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:35。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:5用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:35。产生了两种形式的包含DNA编码序列的质粒，一种允许表达His标签和被凝血酶识别的位点，另一种不含任何标签，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例6：SEQ ID NO:6的融合蛋白
SEQ ID NO:6的蛋白是具有222个氨基酸的长度和25.3kDa的质量的融合蛋白，其中源自VEGF的七肽（SEQ ID NO:17）的2个序列连接于序列TRAIL95-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽的2个序列之间，蛋白包含被uPA识别的切割位点序列（SEQ ID NO:25）和被MMP识别的切割位点的序列（SEQ ID NO:55），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在效应子肽（SEQ ID NO:17）和TRAIL序列之间插入了半胱氨酸柔性空间连接子（SEQ ID NO:26）。
该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:36。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:6用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:36。产生了包含DNA编码序列的质粒，不含允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列。根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例7：SEQ ID NO:7的融合蛋白
SEQ ID NO:7的蛋白是具有168个氨基酸的长度和19.4kDa的质量的融合蛋白，其中CD13的配体序列（SEQ ID NO:20）连接于序列TRAIL119-281的N末端作为效应子肽。
该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:37。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:7用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:37。产生了两种形式的包含DNA编码序列的质粒，一种允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列，另一种不含任何标签。根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例8：SEQ ID NO:8的融合蛋白
SEQ ID NO:8的蛋白是具有201个氨基酸的长度和23.2kDa的质量的融合蛋白，其中CD13的配体序列（SEQ ID NO:21）连接于序列TRAIL95-的N末端作为效应子肽。在TRAIL序列和效应子肽序列之间，蛋白包含柔性甘氨酸-丝氨酸连接子序列（SEQ ID NO:30）。
该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:38。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:8用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:38。产生了包含DNA编码序列的质粒，具有允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例9：SEQ ID NO:9的融合蛋白
SEQ ID NO:9的蛋白是具有192个氨基酸的长度和22.1kDa的质量的融合蛋白，其中PDGF片段的序列（SEQ ID NO:22）连接于序列TRAIL119-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL序列之间，蛋白包含被尿激酶uPA识别的切割位点序列（SEQ ID NO:25）和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列（SEQ ID NO:24），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。
该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:39。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:9用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:39。产生了两种形式的包含DNA编码序列的质粒，一种允许表达His标签和被凝血酶识别的位点，另一种不含任何标签，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例10：SEQ ID NO:10的融合蛋白
SEQ ID NO:10的蛋白是具有216个氨基酸的长度和24.9kDa的质量的融合蛋白，其中PDGF片段的序列（SEQ ID NO:22）连接于序列TRAIL95-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL序列之间，蛋白包含被uPA识别的切割位点序列（SEQ ID NO:25）和被MMP识别的切割位点的序列（SEQ ID NO:24），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。
该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:40。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:10用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:40。产生了包含DNA编码序列的质粒，具有允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)和Tuner(DE3)pLysS菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例11：SEQ ID NO:11的融合蛋白
SEQ ID NO:11的蛋白是具有226个氨基酸的长度和25.7kDa的质量的融合蛋白，其中PDGF片段的序列（SEQ ID NO:22）连接于序列TRAIL95-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL序列之间，蛋白包含被尿激酶uPA识别的切割位点序列（SEQ ID NO:25）和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列（SEQ ID NO:24），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在TRAIL序列和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点序列之间，蛋白还包含柔性甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸连接子（SEQ ID NO:27）。
该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:41。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:11用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:41。产生了包含DNA编码序列的质粒，不具有允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)和Tuner(DE3)pLysS菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例12：SEQ ID NO:12的融合蛋白
SEQ ID NO:12的蛋白是具有217个氨基酸的长度和25kDa的质量的融合蛋白，其中肿瘤抑素的片段I和II（分别为SEQ ID NO:18和19）连接于序列TRAIL121-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL序列之间，蛋白包含被尿激酶uPA识别的切割位点序列（SEQ ID NO:25）和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列（SEQ ID NO:24），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在TRAIL序列和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点序列之间，蛋白还包含由3个甘氨酸残基Gly Gly Gly组成的柔性连接子。
该融合蛋白的结构显示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:42。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:12用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:42。产生了包含DNA编码序列的质粒，具有允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)和Tuner(DE3)pLysS菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例13：SEQ ID NO:13的融合蛋白
SEQ ID NO:13的蛋白是具有220个氨基酸的长度和25.1kDa的质量的融合蛋白，其中肿瘤抑素的片段II（SEQ ID NO:19）连接于序列TRAIL121-281的N末端、肿瘤抑素的片段I（SEQ ID NO:18）连接于序列TRAIL121-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL序列之间，蛋白包含被尿激酶uPA识别的切割位点序列（SEQID NO:25）和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列（SEQ IDNO:24），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在TRAIL序列和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点序列之间，蛋白包含3个甘氨酸残基Gly Gly Gly，在TRAIL序列的C末端与肿瘤抑素的片段II之间包含由3个甘氨酸残基Gly Gly Gly组成的柔性连接子。
该融合蛋白的结构显示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:43。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:13用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:43。产生了包含DNA编码序列的质粒，具有允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21(DE3)菌株和来自Stratagene的BL21DE3pLysSRIL菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例14：SEQ ID NO:14的融合蛋白
SEQ ID NO:14的蛋白是具有181个氨基酸的长度和21kDa的质量的融合蛋白，其中EGF的片段（SEQ ID NO:23）连接于序列TRAIL120-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL结构域的N末端之间，蛋白包含被尿激酶uPA识别的切割位点序列（SEQ ID NO:25）和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列（SEQ ID NO:56），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。
该融合蛋白的结构显示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:44。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:14用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:44。产生了包含DNA编码序列的质粒，具有允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)菌株和来自Stratagene的BL21DE3pLysSRIL菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例15：SEQ ID NO:15的融合蛋白
SEQ ID NO:15的蛋白是具有217个氨基酸的长度和24.4kDa的质量的融合蛋白，其中EGF的片段（SEQ ID NO:23）连接于序列TRAIL95-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL结构域的N末端之间，蛋白包含被尿激酶uPA识别的切割位点序列（SEQ IDNO:25）和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列（SEQ ID NO:24），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在被金属蛋白酶MMP识别的切割位点序列和TRAIL序列之间，蛋白包含单一脯氨酸残基，后跟柔性甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸连接子（SEQ ID NO:26）。
该融合蛋白的结构显示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:45。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:15用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:45。产生了包含DNA编码序列的质粒，具有允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例16：SEQ ID NO:46的融合蛋白
SEQ ID NO:46的蛋白是具有211个氨基酸的长度和24.4kDa的质量的融合蛋白，其中彼此连接的源自VEGF的2个七肽（SEQ ID NO:17）连接于序列TRAIL95-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽之间，蛋白包含被尿激酶uPA识别的切割位点序列（SEQ ID NO:25）和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列（SEQ ID NO:55），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。
该融合蛋白的结构显示于图9，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:50。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:46用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:50。产生了包含DNA编码序列的质粒，具有允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例17：SEQ ID NO:47的融合蛋白
SEQ ID NO:47的蛋白是具有200个氨基酸的长度和22.7kDa的质量的融合蛋白，其中彼此连接的源自VEGF的2个七肽（SEQ ID NO:17）连接于序列TRAIL120-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽之间，蛋白包含被尿激酶uPA识别的切割位点序列（SEQ ID NO:25）和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列（SEQ ID NO:55），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在效应子蛋白和TRAIL结构域之间，蛋白包含促进三聚体形成的柔性连接子（SEQ ID NO:26）和柔性甘氨酸-丝氨酸连接子（SEQ ID NO:54）。
该融合蛋白的结构显示于图9，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:51。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:47用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:51。产生了包含DNA编码序列的质粒，具有允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例18：SEQ ID NO:48的融合蛋白
SEQ ID NO:48的蛋白是具有192个氨基酸的长度和21.9kDa的质量的融合蛋白，其中彼此连接的源自VEGF的2个七肽（SEQ ID NO:17）连接于序列TRAIL120-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽之间，蛋白包含被尿激酶uPA识别的切割位点序列（SEQ ID NO:25），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在效应子蛋白和TRAIL结构域之间，蛋白包含促进三聚体形成的柔性连接子（SEQ ID NO:26）和柔性甘氨酸-丝氨酸连接子（SEQ ID NO:54）。
该融合蛋白的结构显示于图9，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:52。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:48用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:52。产生了包含DNA编码序列的质粒，具有允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例19：SEQ ID NO:49的融合蛋白
SEQ ID NO:49的蛋白是具有206个氨基酸的长度和23.3kDa的质量的融合蛋白，其中PDGF片段（SEQ ID NO:22）连接于序列TRAIL120-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间，蛋白包含被尿激酶uPA识别的切割位点序列（SEQ ID NO:25）和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列（SEQ ID NO:55），因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在TRAIL序列和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点序列之间，蛋白还包含促进三聚体形成的柔性甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸连接子（SEQ ID NO:26）和柔性甘氨酸-丝氨酸连接子（SEQ ID NO:54）。
该融合蛋白的结构显示于图9，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:53。
上述结构的氨基酸序列SEQ ID NO:49用作模板以产生其编码DNA序列SEQ ID NO:53。产生了包含DNA编码序列的质粒，不具有允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)和Tuner(DE3)pLysS菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
实施例20：融合蛋白的抗肿瘤活性的测定
在体外在肿瘤细胞系中在细胞毒性测定中以及在体内在小鼠中进行了融合蛋白的抗肿瘤活性的测定。为了比较目的，使用了rhTRAIL114-281蛋白和安慰剂。
1.圆二色性(circular dichroism)测定-获得的蛋白的二级结构含量的测定
通过Ex.1,Ex.4,Ex.5,Ex.9和Ex.14的圆二色性（CD）测定融合蛋白的制备物的质量（就它们的结构而言）。圆二色性用于测定蛋白质的二级结构和构象。CD方法使用蛋白结构的光学活性，表现为使光偏振平面旋转和椭圆偏振的出现。远紫外(UV)中的蛋白的CD光谱提供了关于主要多肽链的构象的精确数据。
透析
待分析的蛋白的样品配制于由50mM Tris-HCl pH8,0,100mMNaCl,10%甘油,0.1mM ZnCl2,80mM蔗糖,5mM DTT,pH7.4组成的缓冲液(或者，对于上文所述过表达的但不含His标签并在SP琼脂糖上纯化的蛋白而言，是5mM NaH2PO4,95mM Na2HPO4,200mMNaCl,5mM谷胱甘肽,0,1mM ZnCl2,10%甘油,80mM蔗糖,pH8.0，所述蛋白在表5的结果中以星号＊标示)中之后，在具有12kD截留值的透析袋(Sigma-Aldrich)中透析。针对相对于蛋白制剂100倍过量(v/v)的缓冲液进行透析，同时搅拌，在4℃持续数个小时。透析完成之后，将每个制剂离心(25000rpm,10min,4℃)，收集适当的上清液。通过Bradford法测定由此获得的样品中的蛋白浓度（一式三份的平均值）。
使用Bradford方法测定蛋白质浓度
通过将17.5mg Coomassie G-250溶解于乙醇(4.8%v/v)磷酸(V)(5.95%v/v)和水的混合物中来制备蛋白浓度测定试剂。为了测定蛋白浓度，将1-10ml样品加入至800ml Bradford试剂中。测定参考样品，其中含有Bradford试剂和适当体积的其中溶解了蛋白的缓冲液。在室温温育样品至少5分钟之后，在595nm的波长在分光光度计Cary300上读取吸光度。根据就1-10μg/ml范围内10个浓度的BSA制备的标准曲线来计算蛋白质浓度。考虑了样品测定制备过程中的稀释度之后，估计起始蛋白质的浓度。
圆二色性测定
在Jasco J-710分光偏振计中，在具有0.2mm或1mm光程的石英杯中进行浓度范围为0.1-2.7mg/ml的蛋白的圆二色性测定。在7l/min的氮气流下进行该测定，这允许在195至250nm波长范围内进行测定。测量参数：光谱分辨率-1nm；光束的半宽1nm;灵敏性20mdeg,一个波长的平均时间-8s,扫描速度10nm/min，取三次测量的平均值。
结果显示为3次测量的平均值。rhTRAIL114-281和Ex.1,Ex.4,Ex.5,Ex.9和Ex.14的蛋白的圆二色性光谱显示于图4。
二级结构含量的测定
使用CDPro软件在193-250nm范围内对获得的光谱进行数值分析。忽略掉光电倍增管中的电压超过700V的点，因为该波长范围内的信噪比太低。
获得的数据用于计算所分析的蛋白中的特定二级结构含量，使用CDPro软件(表1)。
表1：所分析的蛋白中的二级结构的含量
＊基于晶体结构1D4V获得的值
对照(rhTRAIL114-281)显示出蛋白的特征性CD光谱，主要类型为β-层结构(在波长220nm处锐利刻画出最小椭圆率)。这确认了二级结构成分的计算，其表明有少量的α-螺旋元件。获得的结果与来自hTRAIL蛋白的晶体结构和Ex.4,Ex.9和Ex.14的本发明的蛋白的特征的数据也是一致的，其中β元件构成40%以上的其成分。
在所有融合蛋白的情况下，二色性光谱的特征在于220nm波长处的一个最小值。在融合蛋白中连接于TRAIL的小的效应子蛋白分子构成蛋白的小的部分，不一定产生确定的二级结构，所分析的蛋白应该不与初始蛋白有显著不同。在根据Ex.5的蛋白的情况下的显著差异例如高含量的α结构，或片层例如就Ex.1的蛋白所观察到的，可能是由于经历分析的CD光谱的有限范围，特别是在180-200nm区域。
2.体外细胞系测试
细胞系
表2.粘附性细胞
表3：非粘附性细胞
MTT细胞毒性测试
MTT测试法是用于测定细胞增殖、存活性和细胞毒性的比色测定法。黄色的四唑盐MTT(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑)通过线粒体酶琥珀酸盐-四唑还原酶1分解为不溶于水的紫色染料甲瓒。MTT还原仅在活细胞中发生。数据分析：测定蛋白的IC50浓度(ng/ml)，即相对于对照细胞，经处理的群体中的细胞数目减少50%时的蛋白浓度。使用GraphPad Prism5.0软件分析结果。根据文献中的描述进行测试(Celis,JE,(1998).Cell Biology,a Laboratory Handbook,second edition,Academic Press,San Diego;Yang,Y.,Koh,LW,Tsai,JH.,(2004);Involvment of viral and chemical factors with oral cancerin Taiwan,Jpn J Clin Oncol,34(4),176-183)。
将细胞培养基稀释至确定的密度(104-105个细胞/100μl)。然后将100μl适当稀释的细胞悬浮液加至96孔板中，一式三份。将这样制备的细胞在37°C在5%或10%CO2(取决于所用的培养基)中温育24小时，然后向细胞(在100μl培养基中)中再加入100μl含有各种浓度的测试蛋白的培养基中。将细胞与测试蛋白温育72小时，相当于3-4次细胞分裂，然后向含有测试蛋白的培养基中加入20ml MTT工作溶液[5mg/ml]，并在37°C在5%CO2中温育3小时。然后除去含有MTT溶液的培养基，通过加入100μl DMSO溶解甲瓒晶体。搅拌之后，在570nm(参考滤波器690nm)测定吸收值。
EZ4U细胞毒性测试
EZ4U(Biomedica)测试用于测定非粘附性细胞系中的蛋白的细胞毒性活性。该测试是MTT法的修改形式，其中还原四唑盐而形成的甲瓒是可溶于水的。将细胞与蛋白（7个蛋白浓度，每个一式三份）连续温育72小时之后进行细胞存活性研究。基于此，使用GraphPadPrism5软件测定IC50值(两次独立实验的平均值)。
体外细胞毒性测试的结果以IC50值(ng/ml)总结于表4，IC50值对应于：相对于仅以溶剂温育的对照细胞，在50%水平观察到融合蛋白的细胞毒性效应时的蛋白浓度。
在表4中，最初与组氨酸标签一起表达、随后除去标签的蛋白在Ex.编号中被称作a）。最初不与组氨酸标签一起表达的蛋白在Ex.编号中被称作b）。每个实验代表以一式三份进行的至少2次独立实验的平均值。作为缺乏蛋白制剂活性的标准，采用了2000ng/ml的IC50限值。具有大于2000的IC50值的融合蛋白被认为是无活性的。
将用于此测试的细胞选择为：使得包括对于TRAIL蛋白具有天然抗性的肿瘤细胞系(对于TRAIL的天然抗性的标准：对于TRAIL蛋白IC50>2000)，对于TRAIL蛋白敏感的肿瘤细胞系，对于阿霉素抗性的细胞系MES-SA/DX5作为对于常规抗癌药物有抗性的癌细胞系。
未分化的HUVEC细胞系用作健康对照细胞系，用于测定融合蛋白对于非癌细胞的影响/毒性。
获得的结果确认了通过向对于TRAIL具有天然抗性的细胞施用本发明的某些融合蛋白而克服细胞系对于TRAIL的抗性的可能性。当将本发明的融合蛋白施用于对于TRAIL敏感的细胞时，在一些情况下观察到作用效力的明显的、强烈的加强，表现为融合蛋白的IC50值相对于单独的TRAIL的IC50降低。此外，在对于常规抗癌药物阿霉素有抗性的细胞中获得了本发明的融合蛋白的细胞毒性活性，在一些情况下比仅有TRAIL的活性更强。
对于非癌细胞系所获得的大于2000的IC50值显示：对于健康细胞使用本发明的蛋白，不存在毒性效应，这表明这些蛋白的潜在的低系统性毒性。
选择的蛋白制剂对于延伸的肿瘤细胞系组的细胞毒性活性的测定
表5显示了选择的本发明的融合蛋白针对来自不同器官的一大组肿瘤细胞(对应于宽范围的多数常见癌症)的体外细胞毒性活性测试结果。
在表5中，最初与组氨酸标签一起表达、随后除去标签的蛋白在Ex.编号中被称作a）。最初不与组氨酸标签一起表达的蛋白在Ex.编号中被称作b）。获得的IC50值确认了融合蛋白的高细胞毒性活性，由此确认了它们对于治疗癌症的潜在有用性。
3.融合蛋白在体内对于异种移植物的抗肿瘤有效性
在人结肠癌HCT116,Colo205和SW620细胞，人非小细胞肺癌A549和NCI-H460-Luc2细胞，人肝细胞癌PLC/PRF/5(CLS)细胞，人胰腺癌PANC-1细胞，人肝癌HepG2细胞，人大细胞肺癌NCI-H460细胞和人子宫癌MES-SA/Dx5多药物抗性细胞的小鼠模型中测试了蛋白制剂的抗肿瘤活性。
细胞
HCT116和A549(ATCC CCL-185)细胞维持于以1:1比例混合的补充了10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基(Hyclone,Logan,UT,USA)和Opti-MEM((Invitrogen,Cat.22600-134)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4°C离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中，计数并稀释至25x106个细胞/ml的浓度。
PLC/PRF/5(CLS),SW620和PANC-1细胞维持于补充了10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4°C离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中，计数并稀释至25x106个细胞/ml的浓度。
HepG2细胞维持于补充了10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的MEM培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4°C离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中，计数并稀释至25x106个细胞/ml的浓度。
NCI-H460-Luc2,NCI-H460和Colo205细胞维持于补充了10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4°C离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中，计数并稀释至25x106个细胞/ml的浓度。
MES-SA/Dx5细胞维持于补充了10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的McCoy’s培养基(HyClone,Logan,UT,USA)中。在小鼠移植之日，通过以胰蛋白酶(Invitrogen)洗涤细胞将细胞从支持物分离下来，然后将细胞在1300rpm,4°C离心8分钟，悬于HBSS缓冲液(Hanks培养基)中，计数并稀释至25x106个细胞/ml的浓度。
小鼠
在获自Charles River Germany的4-5周龄或7-9周龄CD-裸鼠(Crl:CD1-Foxn1nu1)或4-5周龄Crl:SHO-PrkdcscidHrhr小鼠上，或获自
的Centrum Medycyny 
的4-5周龄Cby.Cg-foxn1(nu)/J小鼠中进行本发明的蛋白的抗肿瘤活性测定。将小鼠保持于特定的无病原体条件下，自由获取食物和去矿物水(随意)。所有的动物实验根据下列指引进行："Interdisciplinary Principles andGuidelines for the Use of Animals in Research,Marketing andEducation"，由New York Academy of Sciences'Ad Hoc Committee onAnimal Research颁布并由IV Local Ethics Committee on AnimalExperimentation in Warsaw(No.71/2009)批准。
实验进程和评价
使用电子卡尺测定肿瘤大小，使用公式(a2x b)/2计算肿瘤体积，其中a=肿瘤的较短的对角线(mm)，b=肿瘤的较长的对角线(mm)。使用下列公式计算肿瘤生长的抑制：
TGI[%](肿瘤生长抑制)=(WT/WC)x100-100%
其中WT是指处理组中的平均肿瘤体积，WC是指对照组中的平均肿瘤体积。
实验结果表示为平均值±标准偏差(SD)。使用GraphPad Prism5.0软件进行所有计算和作图。
人结肠癌模型
小鼠Crl:CD1-Foxn1
nu
1
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:CD1-Foxn1nu1的右侧皮下(sc)移植悬于0.2ml HBSS缓冲液中的5x106个HCT116细胞。当肿瘤达到～60-90mm3(第14天)时，将小鼠随机化以获得～70mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.1(10mg/kg),Ex.4(10mg/kg),Ex.5(10mg/kg)和Ex.9(10mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(10mg/kg)作为对比。持续10天每日静脉内(i.v.)施用制剂。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.1,Ex.4,Ex.5和Ex.9的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有HCT116结肠癌的小鼠Crl:CD1-Foxn1nu中获得的实验结果显示于图5，作为肿瘤体积的变化图；和图6，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图5和6中的图显示的实验结果显示：施用Ex.1,Ex.4,Ex.5和Ex.9的本发明的融合蛋白引起肿瘤HCT116生长抑制，在实验的第27天相对于对照的TGI分别是67.8;69.8;84.4和66.2%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为44%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
小鼠Crl:CD1-Foxn1
nu
HT116模型
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:CD1-Foxn1nu的右侧皮下(sc)移植悬于0.2ml HBSS缓冲液中的5x106个HCT116细胞。当肿瘤达到～50-78mm3(第8天)时，将小鼠随机化以获得～63mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.5(10mg/kg),Ex.4(10mg/kg),Ex.9(10mg/kg)和Ex.1(10mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(10mg/kg)作为对比，配制缓冲液(50mM Trizma Base,150mM NaCl,80mM蔗糖,250mM L-精氨酸,1mM谷胱甘肽,Zn2+0.1mM,pH7.3)作为对照。持续5天每日静脉内(i.v.)施用制剂，然后（间歇2天后）再进行5天的每日施用。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.5,Ex.4,Ex.9和Ex.1的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有HCT116结肠癌的小鼠Crl:CD1-Foxn1nu中获得的实验结果显示于图10，作为肿瘤体积的变化图；和图11，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图10和11中的图显示的实验结果显示：施用Ex.5,Ex.4,Ex.9和Ex.1的本发明的融合蛋白引起肿瘤HCT116生长抑制，在实验的第27天相对于对照的TGI分别是80%,79%,66%和68%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为44.3%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr
HT116模型
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.2ml HBSS缓冲液中的5x106个HCT116细胞。当肿瘤达到～380-430mm3(第14天)时，将小鼠随机化以获得～400mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.6(30mg/kg),Ex.11(45mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(20mg/kg)作为对比，配制缓冲液(5mM NaH2PO4,95mM Na2HPO4,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10%甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.6(30mg/kg),Ex.11(45mg/kg)的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有HCT116结肠癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图12，作为肿瘤体积的变化图；和图13，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图12和13中的图显示的实验结果显示：施用Ex.6,Ex.11的本发明的融合蛋白引起肿瘤HCT116生长抑制，在实验的第32天相对于对照的TGI分别是42%和44.5%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为5.6%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr
COLO205模型
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.2ml HBSS缓冲液中的5x106个Colo205细胞。当肿瘤达到～90-130mm3(第13天)时，将小鼠随机化以获得～115mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.6(30mg/kg),Ex.19(30mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(30mg/kg)作为对比，配制缓冲液(5mM NaH2PO4,95mM Na2HPO4,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10%甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.6(30mg/kg),Ex.19(45mg/kg)的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有Colo205结肠癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图14，作为肿瘤体积的变化图；和图15，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图14和15中的图显示的实验结果显示：施用Ex.6和Ex.19的本发明的融合蛋白引起肿瘤Colo205生长抑制，在实验的第33天相对于对照的TGI分别是100%和100%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为18.8%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr
SW620模型
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.2ml HBSS缓冲液中的5x106个SW620细胞。当肿瘤达到～290-350mm3(第17天)时，将小鼠随机化以获得～320mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.6(30mg/kg),Ex.11(40mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以TRAIL114-281(30mg/kg)作为对比，配制缓冲液(5mM NaH2PO4,95mM Na2HPO4,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10%甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.6和Ex.11的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有SW620结肠癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图16，作为肿瘤体积的变化图；和图17，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图16和17中的图显示的实验结果显示：施用Ex.6和Ex.11的本发明的融合蛋白引起肿瘤SW620生长抑制，在实验的第31天相对于对照的TGI分别是62%和23%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为-9%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
所测试的融合蛋白未引起显著的副作用(表现为小鼠体重的下降)(即小于10%的基线体重)。这显示出蛋白的低系统性毒性。
人肺癌模型
小鼠Crl:CD1-Foxn1nu1
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:CD1-Foxn1nu1的右侧皮下(sc)移植悬于0.2ml HBSS缓冲液中的5x106个A549细胞。当肿瘤达到～80-100mm3(第14天)时，将小鼠随机化以获得～90mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.1(10mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(10mg/kg)作为对比。每2天静脉内(i.v.)施用制剂，持续12天。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.1的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有A549肺癌的小鼠Crl:CD1-Foxn1nu中获得的实验结果显示于图7，作为肿瘤体积的变化图；和图8，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图7和8中的图显示的实验结果显示：施用Ex.1的本发明的融合蛋白引起肿瘤A549生长抑制，在实验的第33天相对于对照的TGI是44.8%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为16.5%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的TRAIL显示出强得多的效应。
Cby.Cg-foxn1(nu)/J
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Cby.Cg-foxn1(nu)/J的右侧皮下(sc)移植悬于0.2ml HBSS缓冲液中的5x106个A549细胞。当肿瘤达到～60-90mm3(第19天)时，将小鼠随机化以获得～75mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.1(15mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(20mg/kg)作为对比。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.1的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有A549肺癌的小鼠Cby.Cg-foxn1(nu)/J中获得的实验结果显示于图18，作为肿瘤体积的变化图；和图19，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图18和19中的图显示的实验结果显示：施用Ex.1的本发明的融合蛋白引起肿瘤A549生长抑制，在实验的第33天相对于对照的TGI是44.8%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为16.6%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr
A.在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.2ml HBSS缓冲液中的5x106个NCI-H460细胞。当肿瘤达到～150-170mm3(第13天)时，将小鼠随机化以获得～160mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.6(30mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(30mg/kg)作为对比，配制缓冲液(5mMNaH2PO4,95mM Na2HPO4,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mMZnCl2,10%甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.6的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有NCI-H460肺癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图20，作为肿瘤体积的变化图；和图21，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图20和21中的图显示的实验结果显示：施用Ex.6的本发明的融合蛋白引起肿瘤NCI-H460生长抑制，在实验的第28天相对于对照的TGI是88.5%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为17.5%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
B.在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.2ml HBSS缓冲液:Matrigel的3:1混合物中的7x106个A549细胞。当肿瘤达到～140-165mm3(第19天)时，将小鼠随机化以获得～150mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.5(60mg/kg),Ex.6(50mg/kg),Ex.11(50mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(20mg/kg)作为对比，配制缓冲液(5mM NaH2PO4,95mM Na2HPO4,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,100mM L-精氨酸,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.5,Ex.6,Ex.11的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有A549肺癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图22，作为肿瘤体积的变化图；和图23，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图22和23中的图显示的实验结果显示：施用Ex.5,Ex.6,Ex.11的本发明的融合蛋白引起肿瘤A549生长抑制，在实验的第38天相对于对照的TGI分别是39.3%,39.3%和28%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为5.3%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
C.在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.1ml HBSS缓冲液中的7x106个NCI-H460-Luc2细胞。当肿瘤达到～100-120mm3(第19天)时，将小鼠随机化以获得～110mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.5的本发明的融合蛋白制剂（首先施用40mg/kg，然后30mg/kg），以rhTRAIL114-281(20mg/kg)作为对比，配制缓冲液(19mM NaH2PO4,81mM Na2HPO4,50mMNaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10%甘油,pH7.4)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.5的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有NCI-H460-Luc2肺癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图24，作为肿瘤体积的变化图；和图25，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图24和25中的图显示的实验结果显示：施用Ex.5的本发明的融合蛋白引起肿瘤NCI-H460-Luc2生长抑制，在实验的第29天相对于对照的TGI是97.2%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为76%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
D.在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.1ml HBSS缓冲液:Matrigel中的7x106个A549细胞。当肿瘤达到～100-120mm3(第17天)时，将小鼠随机化以获得～110mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.5(50mg/kg),Ex.1(50mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(20mg/kg)作为对比，配制缓冲液(19mM NaH2PO4,81mM Na2HPO4,50mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10%甘油,pH7.4)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.5和Ex.1的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有A549肺癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图26，作为肿瘤体积的变化图；和图27，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图26和27中的图显示的实验结果显示：施用Ex.5和Ex.1的本发明的融合蛋白引起肿瘤A549生长抑制，在实验的第34天相对于对照的TGI分别是52.5%和41.6%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为21.8%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
肝癌模型
小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr
A.在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.2ml HBSS缓冲液中的5x106个PLC/PRF/5细胞。当肿瘤达到～190-220mm3(第31天)时，将小鼠随机化以获得～200mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.6(40mg/kg)和Ex.11(50mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(30mg/kg)作为对比，配制缓冲液(5mM NaH2PO4,95mM Na2HPO4,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10%甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。根据下列方案静脉内(i.v.)施用制剂：每3天4次，每2天2次。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.6和Ex.11的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有PLC/PRF/5肝癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图28，作为肿瘤体积的变化图；和图29，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图28和29中的图显示的实验结果显示：施用Ex.6和Ex.11的本发明的融合蛋白引起肿瘤PLC/PRF/5生长抑制，在实验的第49天相对于对照的TGI分别是70.6%和63.8%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为-18%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr
A.在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.2ml HBSS缓冲液中的5x106个HepG2细胞。当肿瘤达到～190-220mm3(第31天)时，将小鼠随机化以获得～200mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.6(30mg/kg),Ex.19(30mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(30mg/kg)作为对比，配制缓冲液(5mM NaH2PO4,95mM Na2HPO4,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0,1mM ZnCl2,10%甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.6和Ex.19的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有HepG2肝癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图30，作为肿瘤体积的变化图；和图31，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图30和31中的图显示的实验结果显示：施用Ex.6和Ex.19的本发明的融合蛋白引起肿瘤HepG2生长抑制，在实验的第33天相对于对照的TGI分别是82.6%和43%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为12.6%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
胰腺癌模型
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.1ml HBSS缓冲液:Matrigel3:1混合物中的7x106个PANC1细胞。当肿瘤达到～87-110mm3(第27天)时，将小鼠随机化以获得～95mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.11(50mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(20mg/kg)作为对比，配制缓冲液(5mM NaH2PO4,95mM Na2HPO4,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0,1mM ZnCl2,100mM L-精氨酸,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.11的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有PANC1胰腺癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图32，作为肿瘤体积的变化图；和图33，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图32和33中的图显示的实验结果显示：施用Ex.11的本发明的融合蛋白引起肿瘤NCI-H460-Luc2生长抑制，在实验的第40天相对于对照的TGI是43%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为12.0%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
多药物抗性人子宫癌模型
在第0天通过使用装有0.5x25mm针头(Bogmark)的注射器在小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr的右侧皮下(sc)移植悬于0.1ml HBSS缓冲液:Matrigel10:1混合物中的7x106个MES-SA/Dx5细胞。当肿瘤达到～167-190mm3(第19天)时，将小鼠随机化以获得～180mm3的平均肿瘤尺寸的组，并分为不同的处理组。处理组施以Ex.6，Ex.19(30mg/kg)的本发明的融合蛋白制剂，以rhTRAIL114-281(10mg/kg)作为对比，配制缓冲液(5mM NaH2PO4,95mM Na2HPO4,200mM NaCl,5mM谷胱甘肽,0.1mM ZnCl2,10%甘油,80mM蔗糖,pH8.0)作为对照。每2天静脉内(i.v.)施用制剂6次。当治疗组达到～1000mm3的平均肿瘤尺寸时，通过破坏脊髓杀死小鼠。对照组接受rhTRAIL114-281。
在以Ex.18,Ex.6,Ex.19的本发明的融合蛋白处理、作为对比以rhTRAIL114-281处理的、具有MES-SA/Dx5子宫癌的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中获得的实验结果显示于图34，作为肿瘤体积的变化图；和图35，其显示了作为对照的百分率的肿瘤生长抑制（%TGI）。
图34和35中的图显示的实验结果显示：施用Ex.6,Ex.19的本发明的融合蛋白引起肿瘤MES-SA/Dx5生长抑制，在实验的第33天相对于对照的TGI分别是99.7%和99.7%。对于用作比较参考的rhTRAIL114-281，相对于对照获得了对于肿瘤细胞生长的轻微抑制效应，TGI水平为29%。因此，本发明的融合蛋白相对于单独的rhTRAIL114-281显示出强得多的效应。
所测试的融合蛋白未引起显著的副作用(表现为小鼠体重的下降)(即小于10%的基线体重)。这显示出蛋白的低系统性毒性。
Claims (30)
1.融合蛋白，其包含：
-结构域（a），其包含：可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和
-结构域（b），其构成抗血管生成效应子肽的序列，
其中结构域（b）的序列连接于结构域（a）的C末端和/或N末端；并且其中所述效应子肽不选自钙网蛋白、肿瘤抑素183-230、激肽原D5、血管抑制素、kininostatin和canstatin。
2.权利要求1的融合蛋白，其中结构域（a）包含可溶性hTRAIL（SEQ ID NO:16）蛋白序列的片段，起始于hTRAIL95至hTRAIL121的氨基酸，含端点，结束于氨基酸hTRAIL281。
3.权利要求1或2的融合蛋白，其中结构域（a）选自hTRAIL95-281,hTRAIL119-281,hTRAIL120-281和hTRAIL121-281。
4.权利要求1-3任一项的融合蛋白，其中结构域（b）选自
-选自VEGF、PDGF和EGF的生长因子受体的抑制剂；
-肿瘤抑素的片段；和
-氨基肽酶N（CD13）的抑制剂。
5.权利要求1-4任一项的融合蛋白，其中由生长因子的抑制剂组组成的结构域（b）选自VEGF、PDGF和EGF，分别是SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。
6.权利要求1-4任一项的融合蛋白，其中由肿瘤抑素或其片段组成的结构域（b）是SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19，分别代表肿瘤抑素片段I和肿瘤抑素片段II。
7.权利要求1-4任一项的融合蛋白，其中由氨基肽酶N（CD13）的抑制剂组成的结构域（b）是SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。
8.权利要求1-7任一项的融合蛋白，其中在结构域（a）与结构域（b）之间，融合蛋白包含结构域（c），结构域（c）包含蛋白酶切割位点，其选自被金属蛋白酶MMP识别的序列、被尿激酶uPA识别的序列，及其组合。
9.权利要求8的融合蛋白，其中被金属蛋白酶MMP识别的序列是SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56，被尿激酶uPA识别的序列是SEQ ID NO:25。
10.权利要求8或9的融合蛋白，其中结构域（c）是彼此相邻的被金属蛋白酶MMP识别的序列和被尿激酶uPA识别的序列的组合。
11.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中在结构域（a）、（b）、（c）和/或（d）之间，蛋白包含另外的甘氨酸，甘氨酸-丝氨酸或半胱氨酸柔性空间连接子或其组合。
12.权利要求11的融合蛋白，其中柔性空间连接子选自GG,E,GGGCAAACAAC(SEQ.No.26),GGCAAACAAC(SEQ.No.27),GGGGG(SEQ.No.28),GGGG(SEQ.No.29),GGG(SEQ.No.30)和GSG(SEQ.No.54)。
13.权利要求1的融合蛋白，由对应于选自SEQ.No.1;SEQ.No.2;SEQ.No.3;SEQ.No.4;SEQ.No.5;SEQ.No.6;SEQ.No.7;SEQ.No.8;SEQ.No.9;SEQ.No.10;SEQ.No.11;SEQ.No.12;SEQ.No.13;SEQ.No.14;SEQ.No.15;SEQ.No.46;SEQ.No.47;SEQ.No.48和SEQ.No.49的序列的氨基酸序列组成。
14.权利要求1的融合蛋白，由对应于选自SEQ.No.1;SEQ.No.2;SEQ.No.3;SEQ.No.4;SEQ.No.5;SEQ.No.6;SEQ.No.9;SEQ.No.10;SEQ.No.11;SEQ.No.14;SEQ.No.15;SEQ.No.46;No.47;SEQ.No.48和SEQ.No.49的序列的氨基酸序列组成。
15.权利要求1的融合蛋白，由对应于选自SEQ.No.7和SEQ.No.8的序列的氨基酸序列组成。
16.权利要求1的融合蛋白，由对应于选自SEQ.No.12和SEQ.No.13的序列的氨基酸序列组成。
17.前述权利要求任一项的融合蛋白，其为重组蛋白。
18.编码权利要求1-16任一项中定义的融合蛋白的多核苷酸序列。
19.根据权利要求18的序列，其针对在大肠杆菌中的遗传表达进行了优化。
20.权利要求19的序列，其选自SEQ.No.31;SEQ.No.32;SEQ.No.33;SEQ.No.34;SEQ.No.35;SEQ.No.36;SEQ.No.37;SEQ.No.38;SEQ.No.39;SEQ.No.40;SEQ.No.41;SEQ.No.42;SEQ.No.43;SEQ.No.44;SEQ.No.45;SEQ.No.50;SEQ.No.51;SEQ.No.52和SEQ.No.53。
21.根据权利要求19的序列，其选自SEQ.No.31;SEQ.No.32;SEQ.No.33;SEQ.No.34;SEQ.No.35;SEQ.No.36;SEQ.No.39;SEQ.No.40;SEQ.No.41;SEQ.No.44;SEQ.No.45;SEQ.No.50;SEQ.No.51;SEQ.No.52和SEQ.No.53。
22.根据权利要求19的序列，其选自No.37和SEQ.No.38。
23.根据权利要求19的序列，其选自SEQ.No.42和SEQ.No.43。
24.包含根据权利要求18-23任一项的多核苷酸序列的表达载体。
25.包含权利要求24中定义的表达载体的宿主细胞。
26.权利要求25的宿主细胞，其为大肠杆菌细胞。
27.药物组合物，其包含与任何药学上可接受的载体组合的作为活性成分的权利要求1-17任一项中定义的融合蛋白。
28.根据权利要求27的药物组合物，其为用于胃肠外施用的形式。
29.权利要求1-17任一项中定义的融合蛋白用于治疗哺乳动物、包括人中的肿瘤疾病的用途。
30.用于治疗有此需要哺乳动物、包括人中的癌症疾病的方法，包括向受试者施用抗肿瘤有效量的权利要求27或28定义的融合蛋白。
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