JP2014504868A

JP2014504868A - 抗がん性融合タンパク質

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Abstract

ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的フラグメントであり、そのフラグメントがｈＴＲＡＩＬ９５より小さくない位置のアミノ酸で始まり、または、少なくとも７０％の配列同一性を有する当該機能的フラグメントのホモログである、ドメイン（ａ）および、抗血管新生エフェクターペプチドの配列であるドメイン（ｂ）を含み、ドメイン（ｂ）の配列がドメイン（ａ）のＣ末端またはＮ末端に付着される融合タンパク質。当該タンパク質は、がん性疾患の処置のために使用することができる。

Description

本発明は、治療的な融合タンパク質、具体的には、組換え融合タンパク質の分野に関する。より具体的には、本発明は、抗血管新生ペプチドの配列と組み合わされる可溶性ヒトＴＲＡＩＬタンパク質の配列のフラグメントを包含する融合タンパク質、それらを包含する医薬組成物、治療における、具体的には抗がん剤としての、それらの使用、および、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列を包含する発現ベクター、および、これらの発現ベクターを包含する宿主細胞に関する。

ＴＲＡＩＬタンパク質はサイトカインファミリー（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド）に属し、Ａｐｏ２Ｌ (Ａｐｏ２-リガンド)としてもまた知られ、腫瘍細胞およびウイルスに感染した細胞におけるアポトーシスの強力なアクチベーターである。ＴＲＡＩＬは体内に自然に生じるリガンドである。ＴＲＡＩＬタンパク質、そのアミノ酸配列、ＤＮＡコード配列、および、タンパク質発現システムは、EP0835305A1において最初に開示された。

ＴＲＡＩＬタンパク質は、アポトーシス促進性のＴＲＡＩＬ表面受容体１および２（ＴＲＡＩＬ-Ｒ１／Ｒ２）に結合することにより、その抗がん活性および、それに続くこれらの受容体の活性化を発揮する。これらの受容体は、ＤＲ４およびＤＲ５（デスレセプター４およびデスレセプター５）としてもまた知られ、ＴＮＦ受容体ファミリーに属し、様々なタイプのがん細胞によって過剰発現される。これらの受容体の活性化は、抑制遺伝子p53―非依存型アポトーシスの外部シグナル経路を誘導することができ、それにより、活性化されたカスパーゼ−８が実行に係る（executive）カスパーゼの活性化を導き、それによって、核酸の分解を導く。ＴＲＡＩＬが活性化し次第、放出されたカスパーゼ−８は、Ｂｉｄタンパク質の放出および、それによるミトコンドリア経路の間接的な活性化もまた引き起こすことがあり得、ミトコンドリアへ移行されるＢｉｄタンパク質は、そこで、チトクロムＣの放出を刺激し、それゆえ、デスレセプターからのアポトーシスシグナルを間接的に増幅する。

ＴＲＡＩＬは、このタンパク質に抵抗性のある健常細胞において、本質的にアポトーシスを誘導することなく、腫瘍細胞に対して選択的に作用する。それゆえに、血液系悪性腫瘍および固形がんを含む、様々なタイプの腫瘍細胞の広範囲に対し作用し、一方で、正常な細胞を残し、潜在的に、比較的少ない副作用をもたらす抗がん剤として、ＴＲＡＩＬの大きな可能性が認識された。

ＴＲＡＩＬタンパク質は、２８１アミノ酸の長さを有するタイプII膜タンパク質の１つであり、そして、プロテアーゼによる切断を受けるアミノ酸残基１１４−２８１を含むその細胞外領域は、２０ｋＤａサイズの可溶性ｓＴＲＡＩＬ分子を形成し、それもまた生物学的活性がある。ＴＲＡＩＬおよびｓＴＲＡＩＬの両形態ともに、標的細胞上に存在しているＴＲＡＩＬ受容体との相互作用を介して、アポトーシスの引き金を引く能力がある。ＴＲＡＩＬ分子の可溶性部位の強い抗腫瘍性活性および、非常に低い全身的な有毒性が細胞株試験を使用して示された。

ｈＴＲＡＩＬのアミノ酸１１４−２８１に相当するアミノ酸配列を有し、国際一般名称ではデュラナミン（dulanermin）で知られる、組換ヒト可溶性ＴＲＡＩＬ（ｒｈＴＲＡＩＬ）を用いた人間の臨床試験もまた、その良好な耐性および用量規制毒性の欠如を示した。

例えばEP 1 688 498において、ｈＴＲＡＩＬ１２２−２８１の組換え円順列変異体に対して最近報告されたように、１１４−２８１より短いＴＲＡＩＬのフラグメントもまた、細胞膜のデスレセプターと結合し、これらの受容体を介したアポトーシスの誘導が可能である。

今までに報告された肝細胞に対する組換えＴＲＡＩＬタンパク質の毒性効果は、修飾、すなわち、ポリヒスチジンタグの存在と関係しているように思われ、一方、タグされていないＴＲＡＩＬは全身的な有毒性がないことを示した。

しかしながら、さらなる研究および開発の過程において、多くのがん細胞がＴＲＡＩＬに対して本来的に、または獲得された抵抗性を示したように思われる（例えばWO2007/022214を参照）。ＴＲＡＩＬに対する抵抗性の機序は完全には理解されていないが、細胞表面受容体のレベルからシグナル経路内の実行に係るカスパーゼまでの範囲のＴＲＡＩＬ誘導アポトーシス経路の様々なレベルで、それが現れ得ると信じられる。この抵抗性が、抗がん剤としてのＴＲＡＩＬの有用性を制限する。

さらに、患者に対する臨床試験において、単独療法としてのＴＲＡＩＬの実際の有効性は低いと証明された。
この低効率およびＴＲＡＩＬに対する腫瘍の抵抗性を克服するために、放射線治療薬や化学療法薬を用いた様々な併用療法が計画され、相乗的にアポトーシスを起こす効果を得られた (WO2009/002947; A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348; RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, No 6, 2001, 535-546, Soria JC et al., J. Clin. Oncology, Vol 28, No 9 (2010), p. 1527-1533)。厳選された従来の化学療法薬（パクリタキセル、カルボプラチン）および、モノクローナル抗―ＶＥＧＦ抗体との組み合わせにおける、がん治療のためのｒｈＴＲＡＩＬの使用が、WO2009/140469において記述されている。しかしながら、かかる組み合わせの必要性が、従来の化学治療または放射線治療の周知の欠陥を意味する。

さらには、ＴＲＡＩＬ治療に関連する問題は、その低い安定性および投与後の体内からの急速な排出であることが証明された。

がん治療における標的の１つは、腫瘍血管新生の阻害でもある。血管新生（新血管形成）は、腫瘍に酸素および栄養を供給する新しい血管を発達させる、病的、時間無制限な、プロセスである。血管新生は腫瘍の成長および拡大、およびその転移の促進に不可欠である。

がん治療における腫瘍血管新生の阻害の有益な効果は知られている。がん治療および補完的がん治療の両方として、血管新生のプロセスを阻害または制御する物質の臨床用途への試みがなされた。

多数の外在性の抗血管新生の物質と、人体において生まれつき存在している内在性のものと、両方の血管新生のインヒビターが知られている。それらの中で、内在性のタンパク質分解フラグメントを含む、タンパク質性の血管新生インヒビターが知られている。例として、アンジオスタチン（プラスミノーゲンフラグメント）のようなタンパク質性血管新生インヒビター、エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩのＣ−末端フラグメント）、カルレティキュリン、バソスタチン―カルレティキュリンフラグメント、プロラクチンフラグメント、メタロプロテイナーゼ２、またはタムスタチン―コラーゲンＩＶのフラグメントがあげられる(Cao Y. Angiogenesis modulates adipogenesis and obesity. J Clin Invest. 2007;117(9):2362-2368, Folkman J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery? Nat Rev Drug Discov. 2007;6:273-286)。
例えば、タムスタチンは２８ｋＤＡの大きさのペプチド―コラーゲンタイプＩＶフラグメントであり、インテグリンαｖβ３と結合し、内皮細胞増殖の抑制によって血管新生を防止する能力がある。さらに、タムスタチンは独立して接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）およびホスファチジルイノシトール３キナーゼＰＩ３およびプロテインキナーゼＰＫＢ／Ａｋｔの活性化を阻害する。

抗血管新生活性は、血管内皮に位置している受容体を通じて作用し、血管新生の主な促進因子である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような血管新生促進性（pro-angiogenic）タンパク質の阻害によってもまた、もたらされ得る。

がん治療を含む臨床治療において、モノクローナル抗体ベバシズマブおよびラニビズマブのような特定の物質が、抗血管新生因子として、直接ＶＥＧＦに対して既に使用されている。内皮にある受容体を通じて独立して血管内皮細胞の増殖と転移を刺激する他の血管新生促進因子もまた知られており、血小板由来増殖因子ＰＤＧＦおよび上皮増殖因子ＥＧＦ、ＴＮＦおよびアンジオポエチンのようなサイトカインが例として含まれる。

血管新生の過程において、膜貫通メタロプロテアーゼの１つである、アミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ／ＣＤ１３）酵素もまた関係している。この酵素の阻害は結果として腫瘍形成過程の阻害に繋がる可能性があると知られている。多くの天然および合成のアミノペプチダーゼＮインヒビターが知られている(Bavouis B., Dauzonne D., Aminopeptidase-N/CD13 (EC 3.4.11.2) inhibitors: chemistry, biological evaluations, and therapeutic prospects. Medical Research Review, 2006, 26, (1), 88-130)。

ＡＰＮ／ＣＤ１３の天然のインヒビターは、主に微生物によって産生された物質を含む。代表として、とりわけベスタチン、クルクミンおよびアピゲニンがあげられる。ＣＮＧＲＣモチーフを含む短いペプチドがＣＤ１３に効果的に結合することが可能なこともまた発見された(Arap et al., Science, 279:377-380, 1998)。

多くの抗血管新生物質は現在、臨床治験を含む異なる調査段階にある。しかしながら、血管新生の阻害を目的とした既知の療法は、多くの周知な不都合をかかえている。例えば、乳がんの治療におけるモノクローナル抗体薬ベバシズマブの利点については最近、疑問視されている。多くの抗血管新生剤は例えば、極めて短い半減期、難溶解性、乏しい生物学的利用率および有害な副作用を示す。

抗血管新生剤の安全性は、長期間の使用および療法の選択性の欠如から、特に重要である。効果的な治療に対しての強い必要性と腫瘍性疾患の性質がかかる薬物群に対する簡素化された登録手続を余儀なくさせており、そのため、その薬剤のすべての副作用および欠点を知ることは不可能である。
すべての固定した増殖細胞に向けられた化学療法とは逆であるが、抗血管新生剤は血管形成の異なる段階に向けられており、治療の毒性が減少する結果となっている。しかしながら、腫瘍細胞に対する選択性を確保したとはいえ、血管新生を阻害することを目的とした抗がん治療の必要性がまだある。そのため、改善された毒性評価を伴った新しい抗血管新生抗がん治療の必要性がある。

血管新生インヒビターバソスタチンおよび、メタロプロテアーゼ切断部位リンカーと関連づけられたＴＲＡＩＬ１１４−２８１配列を包含する作成された融合タンパク質は、腫瘍細胞におけるアポトーシス誘導効果を示すとしてA.I. Guo et al in Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2008, vol. 24(10), 925-930によって記述された。

血管新生インヒビターカルレティキュリンおよび、ＴＲＡＩＬ１１４−２８１配列を包含する作成された融合タンパク質は、腫瘍細胞におけるアポトーシス誘導効果を示すとしてCN1609124Aにおいて記述された。

CN 1256347CはキニノーゲンD5 60-148およびＴＲＡＩＬ１１４−２８１から作られる融合タンパク質を開示している。

ＧＧＧＳＧＧＳＧをコードするリンカーと関連づけられてＴＲＡＩＬ１１４−２８１のＮ末端またはＣ末端に結合された血管新生インヒビターキニノスタチン、バソスタチンおよびカンスタチン配列を包含する、構築された融合タンパク質はFeng Feng-Yi “Phase and Clinical Trial of Rh-Apo2L and Apo2L-Related Experimental Study”, Ph.D. degree thesis, Chinese Peking Union Medical, 2006-10-01; http://www.lw23.com/lunwen_957708432の中で言及されている。

血管新生インヒビタータムスタチンおよびＴＲＡＩＬ１１４−２８１のタムスタチン１８３−２３０配列を包含する、構築された融合タンパク質は、膵がん細胞のアポトーシス誘導を示すとしてN.Ren et al in Academic Journal of Second Military Medical University 2008, vol. 28(5), 676-478によって記述された。

US2005/244370および対応するWO2004/035794は、細胞表面結合ドメインとしての他のＴＮＦファミリーの一員であるＣＤ４０リガンドの細胞外部位と伴にリンカーペプチドによって関連づけられたエフェクタードメインとしてのＴＲＡＩＬ９５−２８１のコンストラクトを開示する。当該コンストラクトの活性化はそのＣＤ４０部位の結合を介すると書かれている。

本発明は、ＴＲＡＩＬに由来したドメインおよび、抗血管新生活性があり、ＴＲＡＩＬフラグメントを含有しない、エフェクターペプチドがＴＲＡＩＬの作用を増強または補完することを特徴とする、短いエフェクターペプチドドメインを含む新規融合タンパク質を提供することにより、この問題の解決手段を提供する。

本発明によるタンパク質はがん細胞に選択的に向けられ、そこでタンパク質の個々の要素がそれらの効果を発揮し、特にエフェクターペプチドが腫瘍血管新生を阻害する。腫瘍環境への本発明のタンパク質の輸送は、副作用だけでなく、体内の正常細胞に対する毒性を最小化し、投与の頻度を減らすことを可能にする。さらに、本発明によるタンパク質を使用した標的療法は、従来知られた非特異的な抗血管新生療法の血管透過性の低下による低効率の問題を避けることを可能にする。

さらには、多くの場合に本発明の融合タンパク質は、可溶性ＴＲＡＩＬおよびその配列フラグメントを含むその変異体よりも強力であることが判明した。これまで本発明の融合タンパク質において使用された既知のエフェクターペプチドは、好ましくない動態、非特異的プロテアーゼによる急速な分解または標的部位におけるエフェクターペプチドの適切な作用を可能にするために必要な経路の活性化の順序の欠如により引き起こされる体内における蓄積などのために、医学の分野では使用されなかった。融合タンパク質へのエフェクターペプチドの取り込みは、それらが作用することが望ましい場所への選択的な配送を可能にする。
さらに、エフェクターペプチドの連結はタンパク質の量を増やし、半減期の延長および腫瘍におけるタンパク質の保持そしてその効率を高めることに繋がる。
さらに、多くの場合で新規の融合タンパク質はＴＲＡＩＬへの耐性をもまた克服する。
本発明は図面の図を参照して詳細に記述される。

図１は、例１、例２、例３、例４、例５および例６に従う本発明の融合タンパク質の構造概略図を示す。図２は、例７、例８、例９、例１０および例１１に従う本発明の融合タンパク質の構造概略図を示す。図３は、例１２、例１３、例１４および例１５に従う本発明の融合タンパク質の構造概略図を示す。図４は、特定の楕円率で表した、ｒｈＴＲＡＩＬ９５−２８１ならびに例１、例４、例５、例９および例１４の融合タンパク質の円二色性スペクトルを示す図である。図５は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例１、例４、例５および例９の本発明の融合タンパク質で処理された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:CD1-Foxn1^nuマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図６は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例１、例４、例５および例９の本発明の融合タンパク質で処理された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:CD1-Foxn1^nu 1マウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図７は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例１の本発明の融合タンパク質で処理された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:CD1-Foxn1^nuマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図８は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例１の発明の融合タンパク質で処理された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:CD1-Foxn1^nu 1マウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図９は、例１６、例１７、例１８および例１９に従う本発明の融合タンパク質の構造概略図を示す。図１０は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例５、例４、例９および例１の本発明の融合タンパク質で処理された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:CD1-Foxn1^nuマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図１１は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例５、例４、例９および例１による本発明の融合タンパク質で処理された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:CD1-Foxn1^nu 1マウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図１２は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例６および例１１による本発明の融合タンパク質で処理された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図１３は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例６および例１１による本発明の融合タンパク質で処理された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図１４は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例６および例１９による本発明の融合タンパク質で処理された、結腸がんＣｏｌｏ２０５を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図１５は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例６および例１９による発明の融合タンパク質で処理された、結腸がんＣｏｌｏ２０５を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図１６は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例６および例１１による本発明の融合タンパク質で処理された、結腸がんＳＷ６２０を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図１７は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例６および例１１による本発明の融合タンパク質で処理された、結腸がんＳＷ６２０を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図１８は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例１による本発明の融合タンパク質で処理された、肺がんＡ５４９を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図１９は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例１による本発明の融合タンパク質で処理された、肺がんＡ５４９を負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図２０は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例６による本発明の融合タンパク質で処理された、肺がんＮＣＩ−Ｈ４６０を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図２１は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例１による本発明の融合タンパク質で処理された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図２２は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例５、例６、例１１による本発明の融合タンパク質で処理された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図２３は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例５、例６、例１１による本発明の融合タンパク質で処理された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図２４は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例５による本発明の融合タンパク質で処理された、肺がんＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図２５は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例５による本発明の融合タンパク質で処理された、肺がんＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図２６は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例５および例１による本発明の融合タンパク質で処理された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図２７は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例５および例１による本発明の融合タンパク質で処理された、肺がんＡ５４９を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図２８は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例６および例１１による本発明の融合タンパク質で処理された、肝がんＰＬＣ／ＰＲＦ／５を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図２９は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例６および例１１による本発明の融合タンパク質で処理された、肝がんＰＬＣ／ＰＲＦ／５を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図３０は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例６および例１９による本発明の融合タンパク質で処理された、ＨｅｐＧ２肝がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図３１は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例６および例１９による本発明の融合タンパク質で処理された、ＨｅｐＧ２肝がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図３２は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例１１による本発明の融合タンパク質で処理された、ＰＡＮＣ−１膵がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図３３は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例１１による本発明の融合タンパク質で処理された、ＰＡＮＣ−１膵がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。図３４は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例６および例１９による本発明の融合タンパク質で処理された、多剤耐性ヒト子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す図である。図３５は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１との比較において、例６および例１９による本発明の融合タンパク質で処理された、多剤耐性ヒト子宮肉腫ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおける腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を示す図である。

発明の詳細な説明
本発明は、
― ｈＴＲＡＩＬ９５よりも小さくない位置のアミノ酸から始まる可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質の機能的な配列フラグメント、または、少なくとも７０％の配列の同一性を有する当該機能的なフラグメントのホモログであるドメイン（ａ）、および、
― 抗血管新生エフェクターペプチドの配列であるドメイン（ｂ）を含み、
ここで、ドメイン（ｂ）の配列がドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端に付着される、
但し、エフェクターペプチドが、カルレティキュリン、タムスタチン１８３−２３０、キニノーゲンＤ５、バソスタチン、キニノスタチンおよびカンスタチンからなる群から選ばれる融合タンパク質が除外される、融合タンパク質に関する。

「可溶性ｈＴＲＡＩＬ配列の機能的な可溶性フラグメント」という用語は、細胞表面にある受容体に結合することで、哺乳動物細胞におけるアポトーシスシグナルを誘導する能力がある、かかるいかなる可溶性ｈＴＲＡＩＬのフラグメントを意味すると理解されるべきである。

ＴＲＡＩＬ配列の少なくとも７０％の相同性の存在が当該技術分野で知られているということもまた、当業者に認められるだろう。

本発明の融合タンパク質におけるエフェクターペプチドのドメイン(ｂ)はｈＴＲＡＩＬタンパク質でも、ｈＴＲＡＩＬタンパク質のフラグメントの一部のいずれでもないことが理解されるべきである。

「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結合された複数のアミノ酸から作られる分子として本発明に従い理解されるべきである。それゆえに、本発明による「ペプチド」という用語はオリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。

本発明においてペプチドのアミノ酸配列は、ペプチドのＮ末端（Ｎ末）からＣ末端（Ｃ末）の方向へ、当該技術分野で採用されている従来の方式で提示されるだろう。それゆえに、いかなる配列も、線状で提示したものの左側にＮ末端を、そして右側にＣ末端を持つ。

本発明の融合タンパク質は、ドメイン（ａ）のＣ末端またはＮ末端に結合されたエフェクターペプチドのドメイン（ｂ）を少なくとも１つ含む。

特定の態様において、ドメイン（ａ）はｈＴＲＡＩＬ９５からｈＴＲＡＩＬ１２１までの範囲の１つのアミノ酸で始まり、アミノ酸ｈＴＲＡＩＬ２８１で終わるｈＴＲＡＩＬ配列のフラグメントである。

具体的には、ドメイン（ａ）はｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１９−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１に対応する配列からなる群から選ばれ得る。ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１９−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１が、GenBankのアクセッションナンバーP50591に公表されているｈＴＲＡＩＬ（配列番号１６）の既知の配列においてそれぞれ９５番、１１９番、１２０番、１２１番でマークされたアミノ酸で始まるヒトＴＲＡＩＬタンパク質のフラグメントを表していることは当業者にとって明白であろう。

他の具体的態様において、ドメイン（ａ）はｈＴＲＡＩＬ９５より上流に位置するアミノ酸で始まり、アミノ酸ｈＴＲＡＩＬ２８１で終わる可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的フラグメントのホモログであり、その配列は少なくとも７０％、好ましくは８５％オリジナル配列に一致する。

この態様の具体的な変形において、ドメイン（ａ）はｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１６−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１およびｈＴＲＡＩＬ１２２−２８１に対応する配列からなる群から選ばれたフラグメントのホモログである。

ｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、このフラグメントのアミノ酸配列の変更／改変であると理解されるべきであり、アミノ酸１つ、アミノ酸２つ、アミノ酸３つ、アミノ酸４つ、アミノ酸５つ、アミノ酸６つ、および、アミノ酸の１５％以下を含む、少なくとも１つのアミノ酸が変化しており、改変された配列のフラグメントがｈＴＲＡＩＬ配列の機能性すなわち、細胞表面のデスレセプターへの結合および哺乳動物細胞におけるアポトーシス誘導能力を保持している。

好ましくは、ｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、ネイティブな（native）ｈＴＲＡＩＬのフラグメントとの比較において、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）またはＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）デスレセプターとの改変された親和性を示す改変された配列を有する。

「改変された親和性」という用語は親和性の上昇および／または受容体の選択性が変更された親和性意味する。

好ましくは、ｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、ネイティブのｈＴＲＡＩＬのフラグメントとの比較において、ＤＲ４およびＤＲ５デスレセプターとの親和性の上昇を示す改変された配列を有する。

特に好ましくは、ｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、デスレセプターＤＲ４との比較において、デスレセプターＤＲ５の親和性の上昇、すなわちＤＲ５／ＤＲ４選択性の上昇を示す改良された配列を有する。

また好ましくは、ｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、ＤＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３）および／またはＤＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）受容体についての親和性の関係において、ＤＲ４および／またはＤＲ５デスレセプターについての選択性の上昇を示す改変された配列を有する。

ＤＲ４およびＤＲ５デスレセプターについての親和性および／または選択性の上昇となるｈＴＲＡＩＬの改変は、例えばTur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ の刊行物から、当業者に知られている。ＤＲ４―選択性腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）変異は構造に基づく設計により得た。J. Biol. Chem. 2008 Jul 18;283(29):20560-8はＤ２１８Ｈ突然変異体がＤＲ４についての選択性の上昇を示すことを述べており、または、Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP.Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis.2009 Jun;14(6):778-87はＤ２６９Ｈ突然変異がＤＲ４に対する親和性の減少を示すことを述べている。ｈＴＲＡＩＬ突然変異はＤＲ１およびＤＲ２受容体と比較して、ＤＲ４およびＤＲ５から選択した１つの受容体に対しての親和性が上昇し、そしてＤＲ４と比較してＤＲ５受容体の親和性が上昇したことがWO2009077857およびWO2009066174の中でもまた記述されている。

適切な突然変異は、ネイティブのｈＴＲＡＬの位置における１３１、１４９、１５９、１９３、１９９、２０１、２０４、２０４、２１２、２１５、２１８および２５１からなる群から選択される１つまたは２つ以上の突然変異であり、特に、突然変異がリジン、ヒスチジンまたはアルギニンのような塩基性アミノ酸、またはグルタミン酸またはアスパラギン酸のようなアミノ酸の置換を伴う突然変異である。特に、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｎ１９９Ｈ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｌ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｙ、Ｄ２１８Ｈ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１ＥおよびＫ２５１ＱとしてWO2009066174において記述されているからなる群から選択された１つまたは２つ以上の突然変異が明記され得る。

適切な突然変異は、特に突然変異がリジン、ヒスチジンまたはアルギニンのような塩基性アミノ酸の置換を伴う、９５, ２６９および２１４からなる群から選択されるネイティブのｈＴＲＡＩＬの位置における１つまたは２つ以上の突然変異でもある。特に、WO2009077857において記述されるようなＤ２６９Ｈ、Ｅ１９５Ｒ、およびＴ２１４Ｒからなる群から選択される、１つまたは２つ以上の突然変異と明記され得る。

具体的な態様において、ｈＴＲＡＩＬのフラグメントのホモログであるドメイン（ａ）は、WO2009066174において記述されているような、ネイティブのＴＲＡＩＬ配列のＤ２１８Ｈ突然変異、または、Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Generation of new ＴＲＡＩＬ mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun;14(6):778-87において記述されているような、ネイティブのＴＲＡＩＬ配列のＹ１８９Ｎ−Ｒ１９１Ｋ−Ｑ１９３Ｒ−Ｈ２６４Ｒ−Ｉ２６６Ｒ−Ｄ２６９Ｈ突然変異から選択される。

ドメイン（ｂ）は、具体的には以下の群：
―ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦおよびＥＧＦの受容体から選択される増殖因子のための受容体のインヒビター、
―タムスタチンまたはそのフラグメント１８３−２３０以外のフラグメント、および、
―アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）のインヒビター、
から選択され得る。

増殖因子受容体のインヒビター群の中では、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、それ自体が血管新生活性を欠き、天然のリガンドと競合的にＶＥＧＦ受容体に結合する、ヒト血管内皮増殖因子ＶＥＧＦのフラグメントであってもよい。結果として、ＶＥＧＦの血管新生活性はブロックされ、新しい血管形成の刺激は起こらず、そして腫瘍増殖が抑制される。具体的には、上記群のエフェクターペプチドは、ＶＥＧＦシグナル経路を阻害するペプチドであり、そして具体的には添付された配列表における配列番号１７によって表された、ヒトＶＥＧＦの７アミノ酸フラグメントのペプチドである。

本発明の融合タンパク質に組み込まれるＶＥＧＦヘプタペプチドの配列を含むペプチドは、血管新生過程を阻害することにより、効果的にがん細胞を排除するであろうと信じられている。

増殖因子受容体のインヒビター群の中でもまた、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、それ自体が血管新生活性を欠き、天然のリガンドと競合的にＰＤＧＦ受容体に結合する、血小板由来増殖因子フラグメントであってもよい。結果として、ＰＤＧＦの血管新生活性はブロックされ、新しい血管形成の刺激は起こらず、そして腫瘍増殖が抑制される。

具体的には、かかるエフェクターペプチドは、ＰＤＧＦリガンドのフラグメントである、１９アミノ酸ペプチドであり、添付の配列表における配列番号２２の配列で示される。

本発明の融合タンパク質に組み込まれる血小板由来増殖因子ＰＤＧＦタンパク質フラグメントの配列を含むペプチドは、血管新生過程を阻害することにより、効果的にがん細胞を排除するであろうと信じられている。

増殖因子受容体のインヒビター群の中でもまた、ドメイン（ｂ）の抗血管新生エフェクターペプチドは、それ自体が血管新生活性を欠き、天然のリガンドと競合的にＥＧＦ受容体に結合する、上皮増殖因子ＥＧＦペプチドフラグメントであってもよい。結果として、ＥＧＦの血管新生活性はブロックされ、新しい血管形成の刺激は起こらず、そして腫瘍増殖が抑制される。細胞内キナーゼを活性化することなく、ＥＧＦ受容体に結合し、ＥＧＦ活性を阻害する能力がある、かかるペプチドGly Leu Arg Ser Leu Lys GluおよびGly Leu Arg Ser Leu Arg Gluは、例えばEP0641358により知られている。

本発明の融合タンパク質に組み込まれる上皮増殖因子ＥＧＦの配列を含むペプチドは、血管新生過程を阻害することにより、効果的にがん細胞を排除するであろうと信じられている。

タムスタチンおよびそのフラグメント群の中では、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、添付の配列表における配列番号１８の配列で示される、タムスタチンタンパク質の２５アミノ酸フラグメント（フラグメントＩ）であってもよい。上記の表した群のエフェクターペプチドは、添付の配列表における配列番号１９の配列で示される、タムスタチンタンパク質１８アミノ酸フラグメント（フラグメントＩＩ）でもある。ドメイン（ｂ）の抗血管新生エフェクターペプチドは、特に、フラグメントおよびフラグメントＩＩが順序に関係なく、互いに隣り合って位置するような、タムスタチンペプチドフラグメントの組み合わせであってもまたよい。ある態様において、ドメイン（ｂ）はフラグメントＩ／フラグメントＩＩ（配列番号１８／配列番号１９）、またはフラグメントＩＩ／フラグメントＩ（配列番号１９／配列番号１８）の組み合わせである。

本発明の融合タンパク質に組み込まれるタムスタチンタンパク質フラグメントＩおよび／またはＩＩの配列を含むペプチドは、血管新生過程を阻害することにより、効果的にがん細胞を排除するであろうと信じられている。

アミノペプチターゼＮ／ＣＤ１３酵素の活性化を抑制するために、それと結合する、アミノペプチターゼＮ／ＣＤ１３のインヒビター群は、ＮＧＲまたはＲＧＤモチーフを含む短いペプチドを含むであろう。

アミノペプチターゼＮと効果的に結合するＮＧＲモチーフを含有するペプチドは、例えばArap et al., Science, 279:377-380, 1998によって記述されている。アミノペプチターゼＮの細胞外領域にはＲＧＤモチーフに対して親和性を示すフラグメントもまた存在している。両モチーフ（ＲＧＤおよびＮＧＲ）はアンタゴニストとして血管新生過程に関係する因子と結合する。それゆえに、ＮＧＲモチーフと似ているＲＧＤモチーフは、アミノペプチターゼＮと結合し、結果としてインヒビターとして作用するであろうと思われる(Friedlander et al. Definition of two angiogenic pathways by distinct αv integrins. Science (Washington DC), 270: 1500-1502, 1995; Pasqualini et al Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis. Cancer Res. 2000 Feb 1;60(3):722-7)。

アミノペプチターゼＮ／ＣＤ１３のインヒビター群の中では、ドメイン（ｂ）の抗血管新生エフェクターペプチドは、添付の配列表における配列番号２０で示される、ＣＤ１３に結合する５アミノ酸ペプチドであってよい。この群の他のエフェクターペプチドは、添付の配列表における配列番号２１で示される、ＣＤ１３に結合する９アミノ酸ペプチドでもある。

本発明の融合タンパク質に組み込まれるアミノペプチターゼＮ／ＣＤ１３と結合するタンパク質フラグメントの配列を含むペプチドは、血管新生過程を阻害することにより、効果的にがん細胞を排除するであろうと信じられている。

本発明の融合タンパク質は、エフェクターペプチドドメイン（ｂ）を１つ以上、具体的には２つまたは３つのドメイン（ｂ）含むこともある。１つの態様において本発明の融合タンパク質は、エフェクタードメイン（ｂ）と互いに隣り合って配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３から選択される２つの同様な、または異なるエフェクタードメイン（ｂ）を包含する。他の態様において本発明の融合タンパク質は、エフェクタードメイン（ｂ）がドメイン（ａ）のＮ末端および／またはＣ末端に位置する、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３から選択される２つの同様な、または異なるエフェクタードメイン（ｂ）を包含する。

具体的な態様において、本発明の融合タンパク質は３つのエフェクタードメインを含む。

例として、融合タンパク質はドメイン（ａ）のＮ末端に位置するＶＥＧＦ（配列番号１７）に由来するペプチドを含み、ドメイン（ａ）のＣ末端には互いに隣り合ってタムスタチン（配列番号１８）のフラグメントＩおよびタムスタチン（配列番号１９）のフラグメントＩＩが位置する。

本発明の融合タンパク質の具体的な態様において、エフェクターペプチドは配列番号１７（ＶＥＧＦ由来のヘプタペプチド）、配列番号１８（タムスタチンタンパク質のフラグメントＩ（７４−９８アミノ酸））、配列番号１９（タムスタチンタンパク質のフラグメントＩＩ（１９７−２１４アミノ酸））、配列番号２０（ＣＤ１３に結合するペプチド）、配列番号２１（ＣＤ１３に結合するペプチド）、配列番号２２（ＰＤＧＦのフラグメント）および配列番号２３（ＥＧＦのフラグメント）からなる群から選択される抗血管新生活性を有するペプチドである。

がん細胞の表面に存在するＴＲＡＩＬ受容体と結合する上で、融合タンパク質は二重の効果を発揮する。ＴＲＡＩＬの機能的フラグメントまたはその機能性を保持したホモログであるドメイン（ａ）は、その知られたアゴニスト活性―すなわち、細胞表面にあるデスレセプターへの結合および、外因性のアポトーシス経路の活性化を発揮するであろう。抗血管新生ペプチドを含む融合タンパク質の内部移行後に、ドメイン（ｂ）はＴＲＡＩＬドメインの活性と並行して、細胞内にその作用を潜在的に発揮できるであろう。このようにして、ＴＲＡＩＬの抗がん活性は他の要素および、天然のＶＥＧＦ、ＰＤＧＦおよびＥＧＦリガンドの結合領域のステリック阻害、血管新生および新生血管形成の阻害、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ活性の阻害、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）またはＡｋｔおよびＮＦｋキナーゼ経路によるＴＲＡＩＬ過剰発現の間接的な刺激といった機序を活性化することにより促進することができる。

本発明の態様の１つにおいて、ドメイン（ａ）およびドメイン（ｂ）は、セル環境、特に腫瘍セル環境に存在するプロテアーゼによって認識される切断部位の配列を含む、少なくとも１つのドメイン（ｃ）によって連結されている。少なくとも１つのドメイン（ｃ）によるドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の連結は、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）の間に１つ以上のドメイン（ｃ）、具体的には１つまたは２つのドメイン（ｃ）があってよいことを意味する。

プロテアーゼ切断部位は以下から選択することができる：
―メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列、具体的には配列番号２４に指定される (Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro /ＰＬＧＬＡＧＥＰ)または、配列番号５５に指定される(Pro Leu Gly Ile Ala Gly Glu /ＰＬＧＩＡＧＥ)、または配列番号５６に指定される(Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro /ＰＬＧＬＡＧＥＰ);
―ウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列、具体的には配列番号２５に指定されるArg Val Val Arg（一文字の慣習においてはＲＶＶＲ）または配列の最後のアミノ酸と結合され配列番号２５を編成するそのフラグメントおよび、それらの組み合わせ。

本発明の一態様において、タンパク質切断部位は、順序に関係なく互いに隣り合わせに位置するメタロプロテアーゼＭＭＰによって認識される配列およびウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列の組み合わせである。

一態様において、ドメイン（ｃ）はＭＭＰ／ｕＰＡ配列番号２４／配列番号２５の組み合わせまたはｕＰＡ／ＭＭＰ配列番号２５／配列番号２４の組み合わせである。

他の態様において、ドメイン（ｃ）はＭＭＰ／ｕＰＡ配列番号５５／配列番号２５の組み合わせまたは、ｕＰＡ／ＭＭＰ配列番号２５／配列番号５５の組み合わせである。

他の態様において、ドメイン（ｃ）はＭＭＰ／ｕＰＡ配列番号５６／配列番号２５の組み合わせまたは、ｕＰＡ／ＭＭＰ配列番号２５／配列番号５６の組み合わせである。

メタロプロテアーゼＭＭＰおよびウロキナーゼｕＰＡプロテアーゼは腫瘍環境において過剰発現される。プロテアーゼによって認識される配列の存在は、ドメイン（ｂ）からドメイン（ａ）の切断すなわち、機能的なドメイン（ｂ）の放出、ひいてはその活性化を可能にする。

プロテアーゼ切断部位の存在は、エフェクターペプチドの即座の放出を可能にすることにより、細胞内に存在するプロテアーゼによる融合タンパク質の無作為分解が起こる前に、ペプチドのその作用場所への輸送機会を増大させる。

融合タンパク質の主な機能的な要素である切断部位ドメインはさておき、本発明の融合タンパク質は、グリシン―システイン―アラニンフレキシブルステリックリンカー（スペーサー）の天然の配列（複数を含む）を含んでもよい。かかるリンカー／スペーサーは良く知られており、文献に記述されている。それらの融合タンパク質配列への組み込みは、宿主細胞におけるその過剰発現過程によって産生されるタンパク質の正確な折り畳み（folding）を提供することを目的としている。

具体的には、フレキシブルステリックリンカーは、グリシン、システインおよびアラニン残基の組み合わせである配列番号２６および配列番号２７からなる群から選択されてもよい。他の態様において、フレキシブルステリックリンカーは、グリシンおよびセリン残基からなる配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０および配列番号５４からなる群から選択されてもよい。さらに、フレキシブルステリックリンカーは、例えば、Gly Gly Gly /GGGフラグメントまたは、Gly Gly/GGフラグメントのような、フレキシブルステリックリンカーとして作用する配列番号２８、配列番号２９配列番号３０および配列番号５４のいかなるフラグメントであってもよい。

一態様において、フレキシブルステリックリンカーは、１つのグルタミン酸残基、システイン、セリン、プロリンまたはグリシン残基のような、１つのアミノ酸残基から選択されてもよい。

他の態様において、フレキシブルステリックリンカーは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号５４および、グルタミン酸残基、システイン、セリン、プロリンまたはグリシン残基の１つのアミノ酸残基からなる、いかなるリンカーの組み合わせであってもよい。

本発明の融合タンパク質の具体的な態様は、エフェクターペプチドとしてＶＥＧＦ由来のヘプタペプチドを含む、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号４６、配列番号４７および配列番号４８で表されるタンパク質からなる群から選択される抗血管新生ペプチドを含む、融合タンパク質である。

本発明の融合タンパク質の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとしてＣＤ１３に結合する配列を含む配列番号７および配列番号８で表されるタンパク質からなる群から選択される抗血管新生ペプチドを含む、融合タンパク質である。

本発明の融合タンパク質の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとしてＰＤＧＦのフラグメントを含む、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号４９で表されるタンパク質からなる群から選択される抗血管新生ペプチドを含む、融合タンパク質である。

本発明の融合タンパク質の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとしてタムスタチンおよびフラグメントＩＩを含む配列番号１２および配列番号１３で表されるタンパク質からなる群から選択される抗血管新生ペプチドを含む、融合タンパク質である。

本発明の融合タンパク質の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとしてＥＧＦフラグメントを含む配列番号１４および配列番号１５で表されるタンパク質からなる群から選択される抗血管新生ペプチドを含む、融合タンパク質である。

本発明の融合タンパク質の具体的態様は、エフェクターペプチドとしてＶＥＧＦ由来のヘプタペプチド、タムスタチンフラグメントＩおよびタムスタチンペプチドフラグメントＩＩを含む、配列番号３で表されるタンパク質からなる群から選択される抗血管新生ペプチドを含む、融合タンパク質である。

上述の代表的な融合タンパク質の構造の詳細な説明は、図１〜３および図９および以下の本明細書に示された例において提示される。

本発明によると、融合タンパク質によって、２つまたは３つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを包含する１つのタンパク質分子が、付加的な化学的リンカーなしで、各ペプチド鎖内のペプチド結合を介して共有結合されることを意味する。

融合タンパク質はまた、代替的にタンパク質コンストラクトまたはキメラタンパク質としても記述され得る。本発明によると、「コンストラクト」または「キメラタンパク質」という用語が使用された場合、上記に定義された融合タンパク質を指していると理解されるべきである。

当業者にとっては、それゆえに定義された融合タンパク質が、ペプチドおよびタンパク質の化学合成の既知の方法により合成されることができることは明らかであろう。

融合タンパク質は化学的ペプチド合成の方法、特に、適した樹脂をキャリアとして用いた固相におけるペプチド合成の技術を使用した方法により合成されることができる。かかる技術は従来の、そして当技術分野において既知であり、とりわけ、例えばBodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer- Verlag, New York, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Companyのような研究論文で記述されている。

融合タンパク質はペプチドの化学合成の方法により、１つの連続したタンパク質として合成されることができる。あるいは、タンパク質の個々のフラグメント（ドメイン）は別々に合成され、それから、一方のペプチドのカルボキシル末端からもう一方のペプチドフラグメントのアミノ末端が縮合することによるペプチド結合によって１つの連続したペプチドに合体されてもよい。

結果として生じたペプチドの構造を検証するために、ペプチドの分子量を測定するための高分解能質量分析技術のような、アミノ酸ペプチド組成を分析する既知の方法が使用されてもよい。ペプチド配列を確認するために、経時的にペプチドを分解してアミノ酸の配列を同定するタンパク質シーケンサーもまた用いられうる。

しかしながら、好ましくは、本発明の融合タンパク質は、宿主細胞において融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の遺伝子発現の方法によって生成された、組み換えタンパク質である。

本発明の他の側面は、ポリヌクレオチド配列、特に、上記に定義される融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。望ましくは、ポリヌクレオチド配列、特に本発明により、上記に定義される融合タンパク質をコードするＤＮＡは大腸菌における発現のために最適化される配列である。

本発明の他の側面は、ポリヌクレオチド配列、特に上記に定義される本発明のＤＮＡ配列を包含する、発現ベクターでもある。

本発明の他の側面は、上記に定義される発現ベクターを含む宿主細胞でもある。

本発明の融合タンパク質の発現にとって、好ましい宿主細胞は大腸菌細胞である。融合タンパク質を含む、組み換えタンパク質の生成のための方法は周知である。簡単に言うと、この技術はポリヌクレオチド分子、例えば標的タンパク質のアミノ酸配列をコードし、宿主における標的タンパク質の発現に向かわせるＤＮＡ分子の生成にある。次に、ポリヌクレオチド分子をコードする標的タンパク質は、ポリペプチドの有効な発現を確保する、適した発現ベクターに取り込まれる。次に、組み換え発現ベクターが遺伝子導入／形質転換のために宿主細胞に導入され、結果として、形質転換された宿主細胞が産生される。これに、標的タンパク質を過剰発現させるための、形質転換細胞の培養、獲得されたタンパク質の精製、任意に切断部位によって、タンパク質の発現または精製のために使用された、タグ配列の切断が続く。

発現および精製の適した技術は、例えば、研究論文Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), and A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995に記述されている。

コスミド、プラスミドまたは改変されたウイルスは、宿主細胞におけるＤＮＡ配列の導入および複製のための発現ベクターとして使用することができる。典型的にプラスミドが、発現ベクターとして使用される。適したプラスミドは周知であり、市販されている。

本発明の発現ベクターは、本発明の融合タンパク質および、適した宿主細胞に取り込まれたコード配列の転写および翻訳に必要な制御配列をコードするポリヌクレオチド分子を含む。制御配列の選択は宿主細胞のタイプに依存し、当業者によって容易に実施することができる。かかる制御配列の例は、転写プロモーターおよび、エンハンサーまたは、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列であり、コード配列の前に挿入される転写開始シグナル、および、コード配列の後に挿入される転写終結配列を包含する。また、宿主細胞および使用するベクターに依存して、複製開始点、追加のＤＮＡ制限酵素部位、エンハンサーおよび、転写の誘導を可能にする配列のような他の配列が発現ベクターに導入され得る。

発現ベクターは、形質転換された細胞に区別された形質を与え、形質転換細胞の特異的な選択を可能にするマーカー遺伝子配列もまた含むであろう。さらに、ベクターは、挿入された標的タンパク質のコード配列を包含する組換えプラスミドにより形質転換された細胞を、挿入のないプラスミドを取り込んだ細胞から識別すること可能にする、第二マーカー配列をもまた包含し得る。ほとんどの場合、典型的な抗生物耐性マーカーが使用されるが、細胞内(in vivo)におけるその存在が、オートラジオグラフィー技術、分光光度法または、生物および化学発光を使用して容易に判定することができる、当該分野で知られる他のいかなるレポーター遺伝子が使用され得る。例えば、宿主細胞に依存して、β―ガラクトシダーゼ、β―グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素または、緑色蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子が使用され得る。

さらに、発現ベクターは、適切な細胞区画、例えば、フォールディングが促進される周辺質にタンパク質を輸送するシグナル配列を包含し得る。加えて、それに続く、ニッケルカラムでのアフィニティークロマトグラフィーを通じて、親和性の原理を使用して産生されたタンパク質の精製を促進する、Ｎ末端に付着されるHisTag（登録商標）または、C末端に付着されるＧＳＴのようなラベル／タグをコードする配列が存在し得る。溶解性を増大させる配列だけでなく、宿主細胞におけるタンパク質分解からタンパク質を保護する、さらなる配列もまた存在し得る。

標的タンパク質の配列に付着された補助的な要素が、それの活性をブロックし、例えば毒性が原因などの他の理由により有害となるかもしれない。かかる要素は除去されなければならず、それは酵素的または、化学的切断によって達成され得る。具体的には、６−ヒスチジンタグのHisTag（登録商標）または、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製を可能にするために付着された、この種の他のマーカーは、その上述された可溶性ＴＲＡＩＬタンパク質の肝毒性の効果のために、除去されるべきである。
原核細胞すなわち、Escherichia coliまたはBacillus subtilisのようなバクテリア、Saccharomyces cervisiaeまたはPichia pastorisのような酵母および、真核細胞株（昆虫、哺乳動物、植物）を含む、様々な周知の宿主細胞に基づく異種発現系が使用されてよい。

好ましくは、培養および遺伝子操作の容易さおよび、得られる産生物が大量であるために、大腸菌発現系が使用される。したがって、本発明の融合タンパク質をコードする標的配列を包含するポリヌクレオチド配列は大腸菌における発現のために最適化されるであろう。すなわち、コード配列の中に、既知の技術水準における可能な変異体配列から選択された、大腸菌における発現のために最適なコドンを包含するであろう。さらに、発現ベクターは、コード配列に付着させて上述の大腸菌に適した要素を包含するであろう。

したがって、本発明の好ましい態様において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３からなるポリヌクレオチド配列の群から選択される、大腸菌における発現のために最適化された、本発明の融合タンパク質をコードする配列であって、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする。

好ましい態様において、本発明は、発現ベクターなどで形質転換された大腸菌細胞だけでなく、上記に示される配列番号３１から配列番号４５および配列番号５０から配列番号５３のポリヌクレオチド配列の群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、大腸菌の形質転換のために適した発現ベクターもまた提供する。

形質転換、すなわちバクテリアの宿主細胞、具体的には大腸菌へのＤＮＡ配列の導入は、通常、例えば、低温（４℃）でカルシウムイオンでの処理の後、熱ショック（３７―４２℃）に曝すか、または、電気穿孔によって、ＤＮＡを受け入れる準備ができている、形質転換受容性のある細胞に対して実施される。かかる技術は周知であり、通常は発現系の製造業者によって決められるか、またはManiatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982のような文献および、実験室での作業のためのマニュアルの中に記述されている。

大腸菌発現系における本発明の融合タンパク質の過剰発現の手順は、下記にさらに記述されるであろう。

本発明は、上記定義された、有効成分、適した薬学的に許容し得る担体、希釈剤および従来型の補助成分として、本発明の融合タンパク質を包含する医薬組成物もまた提供する。医薬組成物は、本発明の融合タンパク質の効果的な量および、担体または希釈剤の中に溶解されるか、または散在された薬学的に許容し得る補助的な成分を包含し、好ましくは、単位剤形において処方された医薬組成物、または、複数回の用量を包含する処方の形をとるであろう。他の成分や担体および希釈剤だけでなく、剤形およびそれらの処方の方法は当業者に既知であり、文献に記述されている。例えば、研究論文Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USAにおいて記述されている。

用語「薬学的に許容し得る担体、希釈剤、補助成分」は、当技術分野で既知のいかなる溶剤、分散媒、界面活性剤、抗酸化剤、安定剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、イソトン剤を含む。本発明の医薬組成物は、選ばれた投薬ルートおよび、経口、非経口、吸入、局所用の液剤、固形および噴霧剤のような、望ましい剤形、および、選択される形は、注射によるように、投薬ルートのために無菌であるべきかどうかに依存して、様々なタイプの担体、希釈剤および賦形剤を包含し得る。本発明に従い、医薬組成物の投薬の好ましいルートは、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、腫瘍内のような注入ルートまたは、単発または連続的な静脈注入を含む、非経口ルートである。

一態様において、本発明の医薬組成物は直接腫瘍に注射によって投与され得る。他の態様において、本発明の医薬組成物は静脈内に投与され得る。さらに他の態様において、本発明の医薬組成物は皮下または、腹腔内に投与することができる。非経口投与のための医薬組成物は、必要であれば、適正なｐHおよび、体液と等張に緩衝された、薬学的に許容し得る水溶性または、非水溶性培養液における溶剤または散布剤であってよく、抗酸化剤、緩衝剤、静菌性剤および、組成物をレシピエントの組織または血液に適合させる可溶性物質もまた包含し得る。当該組成物に含有され得る他の構成成分は、例えば、水、エタノールのようなアルコール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールのようなポリオール、トリグリセリド、植物油、リポソームなどの脂質である。妥当な流動性および物質の粒子のサイズは、レシチンのようなコーティング物質、および、ヒドロキシプロピルセルロースポリソルベートおよび同類のもののような界面活性剤により提供されてよい。

液体非経口組成物のための適切なイソトン剤は、例えば、グルコースのような糖質および、塩化ナトリウムおよびそれらの組み合わせである。

また、注射または注入による投薬のための医薬組成物は、例えば、発熱性物質除去蒸留水のような、使用直前の適切な担体における再構成のための凍結乾燥粉末のような粉末形状であり得る。

非経口投与のための本発明の医薬組成物はまた、溶液、スプレーまたはエアロゾルを含む経鼻投与の形態を有しうる。好ましくは、鼻腔内投与のための形態は、水溶液であり、鼻の分泌物と類似の特徴を維持するように、等張であるか、またはｐＨ約５．５〜約６．５に維持するために緩衝化されているであろう。さらに、それは、周知の鼻内用調製物中のもののような保存剤または安定化剤を包含する。

組成物は、１または２つ以上の成分の酸化を遅延させる多様な抗酸化剤を包含し得る。
さらに、微生物の作用を防止するために、組成物は、例えば非限定的にパラベン類、クロロブタノール、チメロサール、ソルビン酸、およびこのタイプの類似の既知の物質を含む多様な抗菌剤および抗真菌剤を包含し得る。一般に、本発明の医薬組成物は、例えば少なくとも約０．０１ｗｔ％の活性成分を含み得る。とりわけ、組成物は、活性成分を、組成物の単位の１％〜７５重量％、または例えば２５％〜６０重量％において包含し得るが、示された値に限定されるものではない。ヒトを含む患者に投与される本発明による組成物の用量の実際の量は、体重、状態の重篤度、処置される疾患の型、先のまたは併用の治療的介入、患者および投薬ルートなどの、物理的および生理学的要因により決定される。
好適な単位用量、全用量および組成物中の活性成分の濃度は、処置する医師により決定されるべきである。

組成物は、例えば、患者の体重１ｋｇあたり約１マイクログラム〜約１０００ｍｇの用量において、例えば体重１ｋｇあたり５ｍｇ〜１００ｍｇの範囲において、または体重１ｋｇあたり５ｍｇ〜５００ｍｇの範囲において、投与され得る。融合タンパク質およびそれを包含する組成物は、抗がん性または抗腫瘍性を発揮し、がん性疾患の処置のために使用され得る。本発明はまた、上で定義される本発明の融合タンパク質の、ヒトを含む哺乳動物におけるがん性疾患を処置するための使用をも提供する。本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物におけるがん性疾患を処置する方法を提供し、該方法は、かかる処置を必要とする対象に、上で定義されたような本発明の抗がん性の融合タンパク質の有効量を、任意に適切な医薬組成物の形態において、投与することを含む。

本発明の融合タンパク質は、白血病、肉芽種症、ミエローマなどの血液系悪性腫瘍および他の血液系悪性腫瘍の処置のために使用され得る。融合タンパク質はまた、乳がん、非小細胞肺がんを含む肺がん、結腸がん、膵がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、腎臓がん、脳腫瘍および同類のものなどの固形腫瘍の処置のためにもまた使用され得る。がんの処置における融合タンパク質の適切な投薬ルートは、具体的には、本発明の融合タンパク質を注射または注入の形態において、この投薬ルートに適切な組成および形態において投与することからなる、非経口ルートである。本発明は、以下の一般的手法および具体的な融合タンパク質の例において、より詳細に記載されるであろう。

融合タンパク質の過剰発現のための一般的手法
プラスミドの調製
標的融合タンパク質のアミノ酸配列は、それをコードし、Escherichia coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。
かかる手法により、Escherichia coliにおける標的タンパク質の合成のさらなる段階の効率を増大させることができる。生じたヌクレオチド配列を、次いで、自動合成した。さらに、生じた標的タンパク質をコードする遺伝子に、制限酵素NdeIの切断部位（リーディング鎖の５’末端において）およびXhoIの切断部位（リーディング鎖の３’末端において）を追加した。これらを使用して、遺伝子をベクターpET28a（Novagen）中にクローニングした。それらはまた、他のベクターにタンパク質をコードする遺伝子をクローニングするためにも使用し得る。このコンストラクトから発現される標的タンパク質は、Ｎ末端において、前にトロンビンにより認識される部位を有し、その後、アフィニティークロマトグラフィーを介した精製に役立つ、ポリヒスチジンタグ（６ヒスチジン）を任意に備え得る。いくつかの標的はタグなしで、具体的にはヒスチジンタグなしで発現され、それらは次に、SP Sepharose（登録商標）で精製された。生じたコンストラクトの正確さを、第１に、NdeIおよびXhoI酵素を使用した、単離したプラスミドの制限酵素分析により確認し、その後、標的タンパク質の全リーディングフレームを自動シークエンシングすることにより確認した。シークエンシングのために使用したプライマーは、ベクター中に存在するＴ７プロモーター（5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’）およびＴ７ターミネーター（5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’）の配列に相補的となった。生じたプラスミドは、製造業者の推奨に従って形質転換された市販のE. coli株において、標的の融合タンパク質を過剰発現させるために使用された。選択培地（ＬＢ寒天、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、１％グルコース）上で得られたコロニーは、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）および１％グルコースを添加されたＬＢ液体培地中で、一晩の培養物の調製のために使用された。振盪培養器における約１５ｈの増殖の後で、培養物は、適切な培養物を播種するために使用された。

融合タンパク質の過剰発現および精製−一般的手法Ａ
カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）および１００μＭの硫酸亜鉛を含むＬＢ培地に、一晩培養物を播種した。培養物を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．６０〜０．８０に達するまで３７℃でインキュベートした。次いで、ＩＰＴＧを、０．２５〜１ｍＭの範囲の最終濃度まで添加した。２５℃で振盪してのインキュベーション（３．５〜２０ｈ）の後で、培養物を２５分間、６，０００ｇで遠心分離した。細菌ペレットを５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールを含むｐＨ７．４の緩衝液中で再懸濁した。懸濁液を氷上で８分間超音波処理した（４０％の振幅、１５秒パルス、１０ｓのインターバル）。生じた抽出物を、４０分間、２０．０００ｇ、４℃における遠心分離により清澄化した。Ｎｉ−セファロース（GE Healthcare）樹脂を、緩衝液での平行化により前処理し、これを、細菌細胞抽出物の調製のために使用した。樹脂を、次いで、抽出物の遠心分離の後で得られた上清と共に一晩４℃でインキュベートした。次いで、それをクロマトグラフィーカラム中へロードし、１５〜５０容積の緩衝液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄した。得られたタンパク質を、０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）中のイミダゾール勾配を用いてカラムから溶出させた。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。適切な画分を組み合わせて、４℃で、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのＬ−アルギニン、０．１ｍＭのＺｎＳＯ４、０．０１％のTween 20に対して一晩透析し、同時に、Hisタグが存在している場合は、Hisタグをトロンビン（１：５０）で切断した。切断の後で、ベンズアミジンセファロース（登録商標）樹脂を使用した精製によりHistag（登録商標）を伴って発現した標的の融合タンパク質から、トロンビンを分離した。Histag（登録商標）なしで発現した標的融合タンパク質の精製はSP Sepharose（登録商標）で行った。生成物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析した（Maniatisら、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、NY、1982年）。

融合タンパク質の過剰発現および精製−一般的手法Ｂ
カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）および１００μＭの硫酸亜鉛を含むＬＢ培地に、一晩培養物を播種した。培養物を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．６０〜０．８０に達するまで３７℃でインキュベートした。次いで、ＩＰＴＧを、０．５〜１ｍＭの範囲の最終濃度まで添加した。２５℃で振盪しての２０ｈのインキュベーションの後で、培養物を２５分間、６，０００ｇで遠心分離した。過剰発現後の細菌細胞を、フレンチプレスにおいて、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのベータ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を含む緩衝液（ｐＨ７．８）中で破壊した。生じた抽出物を、５０分間、８，０００ｇでの遠心分離により清澄化した。Ｎｉ−セファロース樹脂を、一晩、得られた上清と共にインキュベートした。次いで、タンパク質が結合した樹脂を、クロマトグラフィーカラム中へ充填した。未結合のタンパク質を含む画分を洗い流すために、カラムを１５〜５０容積の緩衝液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのベータ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）（ｐＨ７．８））で洗浄した。次いで、特異的にベッドに結合しているタンパク質の大部分を洗い流すために、カラムを、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。得られた画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（Maniatisら、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、NY、1982年）。標的タンパク質を含む画分を組み合わせて、タンパク質がヒスチジンタグを伴って発現された場合は、トロンビン（タンパク質４ｍｇあたり１Ｕ、８ｈ、１６℃で）で切断し、ポリヒスチジンタグを除去した。次いで、画分を、調製用緩衝液（５００ｍＭのＬ−アルギニン、５０ｍＭのＴｒｉｓ、２．５ｍＭのＺｎＳＯ４（ｐＨ７．４））に対して透析した。

例１．配列番号１の融合タンパク質
配列番号１のタンパク質は、１７３アミノ酸の長さおよび１９．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２１-２８１配列のＮ末端にＶＥＧＦ由来のヘプタペプチド（配列番号１７）がエフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列の間に、フレキシブルグリシンステリックリンカー（配列番号２８）が組み込まれている。

融合タンパク質の構造を、図１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号１および配列番号３１である。

上記構造の配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号３１のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。ＤＮＡのコード配列を２つの型、１つはHis tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させ、２つ目はいかなるタグもない型において包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。E. coli BL21 (DE3) および Tuner(DE3)pLysS株（いずれもNovagen社製）を使用して、一般的手法Ａに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例２．配列番号２の融合タンパク質
配列番号２の融合タンパク質は、１９９アミノ酸の長さおよび２２．８ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ９５-２８１配列のＮ末端にＶＥＧＦ由来のヘプタペプチド（配列番号１７）がエフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列の間に、フレキシブルグリシンステリックリンカー（配列番号２８）が組み込まれている。

融合タンパク質の構造を、図１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号２および配列番号３２である。

配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号３２のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列を備えたＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製のE. coli BL21 (DE3) および Tuner(DE3)pLysS株を使用して、一般的手法Ａに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例３．配列番号３の融合タンパク質
配列番号３の融合タンパク質は、２３０アミノ酸の長さおよび２６．３ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２１-２８１配列のＮ末端にＶＥＧＦ由来のヘプタペプチド（配列番号１７）が、ＴＲＡＩＬ１２１-２８１配列のＣ末端にはタムチタチンフラグメントIおよびII（それぞれ、配列番号１８および１９）がエフェクターペプチドとして付着されている。ＴＲＡＩＬ配列のＮ末端に付着されたエフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列の間に、グリシンフレキシブルステリックリンカー（配列番号２８）が組み込まれている。ＴＲＡＩＬ配列のＣ末端に付着されたエフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列の間に、３つのグリシン残基Gly Gly Glyからなるステリックリンカーおよび、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号２４)およびウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２５）により認識される切断部位の配列が組み込まれており、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。

融合タンパク質の構造を、図１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号３および配列番号３３である。

配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号３３のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列を備えたＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製のE. coli BL21 (DE3)株を使用して、一般的手法Ｂに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例４．配列番号４の融合タンパク質
配列番号４のタンパク質は、１８７アミノ酸の長さおよび２１．４ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２１-２８１配列のＮ末端にＶＥＧＦ由来の２つのヘプタペプチド配列（配列番号１７）がエフェクターペプチドとして付着されている。２つのエフェクターペプチドの間に、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号２４)により認識される切断部位の配列が組み込まれており、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。ＭＭＰ切断部位の配列とエフェクタータンパク質の配列の間に、１つのグルタミン酸残基Ｅが組み込まれている。エフェクターペプチド（配列番号１７）およびＴＲＡＩＬ配列の間には、フレキシブルステリックグリシンリンカー（配列番号２８）が組み込まれている。

融合タンパク質の構造を、図１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号４および配列番号３４である。

配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号３４のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。ＤＮＡのコード配列を２つの型、１つはHis tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させ、２つ目はいかなるタグもない型において包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製StratageneおよびTuner (DE3)からのE. coli BL21DE3pLysSRIL株を使用して、一般的手法Ｂに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例５．配列番号５の融合タンパク質
配列番号５のタンパク質は、１８７アミノ酸の長さおよび２１．８ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２１-２８１配列のＮ末端にＶＥＧＦ由来の２つのヘプタペプチド配列（配列番号１７）がエフェクターペプチドとして付着されている。２つのエフェクターペプチドの間に、当該タンパク質は、ウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２５）および、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号２４)により認識される切断部位の配列を包含し、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。ＭＭＰ切断部位の配列とエフェクタータンパク質の配列の間に、１つのグルタミン酸残基Ｅが組み込まれている。ＴＲＡＩＬのＮ末端には付加的に、２つのグリシン残基が付着される。

融合タンパク質の構造を、図１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号５および配列番号３５である。

配列番号５のアミノ酸配列は、配列番号３５のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。ＤＮＡのコード配列を２つの型、１つはHis tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させ、２つ目はいかなるタグもない型において包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製のE. coli Tuner (DE3)株を使用して、一般的手法Ａに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例６．配列番号６の融合タンパク質
配列番号６のタンパク質は、２２２アミノ酸の長さおよび２５．３ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ９５-２８１配列のＮ末端にＶＥＧＦ由来の２つのヘプタペプチド配列（配列番号１７）がエフェクターペプチドとして付着されている。２つのエフェクターペプチドの間に、当該タンパク質は、ｕＰＡ（配列番号２５）および、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号５５)により認識される切断部位の配列を包含し、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。エフェクターペプチド（配列番号１７）とＴＲＡＩＬ配列の間に、システインフレキシブルステリックリンカー（配列番号２６）が組み込まれている。

融合タンパク質の構造を、図１において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号６および配列番号３６である。

配列番号６のアミノ酸配列は、配列番号３６のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列がないＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製のE. coli Tuner(DE3)株を使用して、一般的手法Ａに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例７．配列番号７の融合タンパク質
配列番号７のタンパク質は、１６８アミノ酸の長さおよび１９．４ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１１９-２８１配列のＮ末端にＣＤ１３のリガンドである配列（配列番号２０）がエフェクターペプチドとして付着されている。

融合タンパク質の構造を、図２において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号７および配列番号３７である。

配列番号７のアミノ酸配列は、配列番号３７のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。ＤＮＡのコード配列を２つの型、１つはHis tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させ、２つ目はいかなるタグもない型において包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製のE. coli Tuner (DE3)株を使用して、一般的手法Ａに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例８．配列番号８の融合タンパク質
配列番号８のタンパク質は、２０１アミノ酸の長さおよび２３．２ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ９５−配列のＮ末端にＣＤ１３のリガンドである配列（配列番号２１）がエフェクターペプチドとして付着されている。ＴＲＡＩＬ配列とエフェクターペプチドの間に、当該タンパク質はフレキシブルグリシン―セリンリンカー（配列番号３０）の配列を包含する。

融合タンパク質の構造を、図２において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号８および配列番号３８である。

配列番号８のアミノ酸配列は、配列番号３８のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列を備えたＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製のE. coli Tuner (DE3)株を使用して、一般的手法Ａに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例９．配列番号９の融合タンパク質
配列番号９のタンパク質は、１９２アミノ酸の長さおよび２２．１ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１１９-２８１配列のＮ末端にＰＤＧＦフラグメントの配列（配列番号２２）がエフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列の間に、当該タンパク質は、ウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２５）および、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号２４)により認識される切断部位の配列を包含し、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。

融合タンパク質の構造を、図２において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号９および配列番号３９である。

配列番号９のアミノ酸配列は、配列番号３９のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。ＤＮＡのコード配列を２つの型、１つはHis tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させ、２つ目はいかなるタグもない型において包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製のE. coli Rosetta (DE3)株を使用して、一般的手法Ａに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例１０．配列番号１０の融合タンパク質
配列番号１０のタンパク質は、２１６アミノ酸の長さおよび２４．９ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ９５-２８１配列のＮ末端にＰＤＧＦフラグメント（配列番号２２）がエフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチド配列とＴＲＡＩＬドメインの間に、当該タンパク質は、ｕＰＡ（配列番号２５）および、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号２４)により認識される切断部位の配列を包含し、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。

融合タンパク質の構造を、図２において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号１０および配列番号４０である。

配列番号１０のアミノ酸配列は、配列番号４０のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列を備えたＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。E. coli BL21 (DE3) および Tuner(DE3)pLysS株（いずれもNovagen社製）を使用して、一般的手法Ａに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例１１．配列番号１１の融合タンパク質
配列番号１１のタンパク質は、２２６アミノ酸の長さおよび２５．７ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ９５-２８１配列のＮ末端にＰＤＧＦフラグメント（配列番号２２）がエフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列の間に、当該タンパク質は、ウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２５）および、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号２４)により認識される切断部位の配列を包含し、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。ＴＲＡＩＬ配列とメタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される切断部位の配列の間に、当該タンパク質はフレキシブルグリシン―システイン―アラニンリンカー（配列番号２７）の配列をもまた包含する。

融合タンパク質の構造を、図２において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号１１および配列番号４１である。

配列番号１１のアミノ酸配列は、配列番号４１のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列がないＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。E. coli BL21 (DE3) および Tuner(DE3)pLysS株（いずれもNovagen社製）を使用して、一般的手法Ａに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例１２．配列番号１２の融合タンパク質
配列番号１２のタンパク質は、２１７アミノ酸の長さおよび２５ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２１-２８１配列のＮ末端にタムスタチンフラグメントIおよびII（配列番号１８および配列番号１９）がエフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列の間に、当該タンパク質は、ウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２５）および、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号２４)により認識される切断部位の配列を包含し、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。ＴＲＡＩＬ配列とメタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される切断部位の配列の間に、当該タンパク質は３つのグリシン残基Gly Gly Glyからなるフレキシブルリンカーをもまた包含する。

融合タンパク質の構造を、図２において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号１２および配列番号４２である。

配列番号１２のアミノ酸配列は、配列番号４２のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列を備えたＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。E. coli BL21 (DE3) および Tuner(DE3)pLysS株（いずれもNovagen社製）を使用して、一般的手法Ａに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例１３．配列番号１３の融合タンパク質
配列番号１３のタンパク質は、２２０アミノ酸の長さおよび２５．１ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２１-２８１配列のＮ末端にタムチタチンフラグメントII（配列番号１９）がエフェクターペプチドとして付着され、ＴＲＡＩＬ１２１-２８１配列のＣ末端にはタムチタチンフラグメントI（配列番号１８）がエフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列の間に、当該タンパク質は、ウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２５）および、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号２４)により認識される切断部位の配列を包含し、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される切断部位の配列とＴＲＡＩＬ配列との間に、当該タンパク質は３つのグリシン残基Gly Gly Glyを包含し、ＴＲＡＩＬ配列のＣ末端とタムチタチンフラグメントIIの間に、３つのグリシン残基Gly Gly Glyからなるフレキシブルリンカーを包含する。

融合タンパク質の構造を、図３において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号１３および配列番号４３である。

配列番号１３のアミノ酸配列は、配列番号４３のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列を備えたＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製のE. coli B.21 (DE3)株およびStratagene社製のBL21DE3pLysSRIL株を使用して、一般的手法Ｂに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例１４．配列番号１４の融合タンパク質
配列番号１４のタンパク質は、１８１アミノ酸の長さおよび２１ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２０-２８１配列のＮ末端にＥＧＦフラグメント（配列番号２３）がエフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬドメインのＮ末端の間に、当該タンパク質は、ウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２５）および、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号５６)により認識される切断部位の配列を包含し、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。

融合タンパク質の構造を、図３において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号１４および配列番号４４である。

配列番号１４のアミノ酸配列は、配列番号４４のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列を備えたＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製のE. coli BL21 (DE3) 株および、Stratagene 社製のBL21DE3pLysSRIL株を使用して、一般的手法Ｂに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例１５．配列番号１５の融合タンパク質
配列番号１５のタンパク質は、２１７アミノ酸の長さおよび２４．４ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ｈＴＲＡＩＬ９５-２８１配列のＮ末端にＥＧＦフラグメント（配列番号２３）がエフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬドメインのＮ末端の間に、当該タンパク質は、ウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２５）および、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号２４)により認識される切断部位の配列を包含し、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される切断部位の配列とＴＲＡＩＬ配列の間に、当該タンパク質はフレキシブルグリシン―システイン―アラニンリンカー（配列番号２６）が続く、１つのプロリン残基を包含する。

融合タンパク質の構造を、図３において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号１５および配列番号４５である。

配列番号１５のアミノ酸配列は、配列番号４５のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列を備えたＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製のE. coli BL21 (DE3)株を使用して、一般的手法Ｂに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例１６．配列番号４６の融合タンパク質
配列番号４６の融合タンパク質は、２１１アミノ酸の長さおよび２４．４ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ９５-２８１配列のＮ末端に、互いに連結したＶＥＧＦ（配列番号１７）由来の２つのヘプタペプチド配列がエフェクターペプチドとして付着されている。２つのエフェクターペプチドの間に、当該タンパク質は、ウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２５）および、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号５５)により認識される切断部位の配列を包含し、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。

融合タンパク質の構造を、図９において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号４６および配列番号５０である。

配列番号４６のアミノ酸配列は、配列番号５０のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列を備えたＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製のE. coli BL21 (DE3)株を使用して、一般的手法Ｂに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例１７．配列番号４７の融合タンパク質
配列番号４７の融合タンパク質は、２００アミノ酸の長さおよび２２．７ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２０-２８１配列のＮ末端に、互いに連結したＶＥＧＦ（配列番号１７）由来の２つのヘプタペプチド配列がエフェクターペプチドとして付着されている。２つのエフェクターペプチドの間に、当該タンパク質は、ウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２５）および、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号５５)により認識される切断部位の配列を包含し、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。エフェクタータンパク質とＴＲＡＩＬドメインの間に、当該タンパク質は、三量体の形成を促進するフレキシブルリンカー（配列番号２６）およびフレキシブルグリシン―セリンリンカー（配列番号５４）を続いて包含する。

融合タンパク質の構造を、図９において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号４７および配列番号５１である。

配列番号４７のアミノ酸配列は、配列番号５１のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列を備えたＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製のE. coli BL21 (DE3)株を使用して、一般的手法Ｂに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例１８．配列番号４８の融合タンパク質
配列番号４８の融合タンパク質は、１９２アミノ酸の長さおよび２１．９ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２０-２８１配列のＮ末端に、互いに連結したＶＥＧＦ（配列番号１７）由来の２つのヘプタペプチド配列がエフェクターペプチドとして付着されている。２つのエフェクターペプチドの間に、当該タンパク質は、ウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２５）により認識される切断部位の配列を包含し、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。エフェクタータンパク質とＴＲＡＩＬドメインの間に、当該タンパク質は、三量体の形成を促進するフレキシブルリンカー（配列番号２６）およびフレキシブルグリシン―セリンリンカー（配列番号５４）を続いて包含する。

融合タンパク質の構造を、図９において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号４８および配列番号５２である。

配列番号４８のアミノ酸配列は、配列番号５２のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列を備えたＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。Novagen社製のE. coli BL21 (DE3)株を使用して、一般的手法Ｂに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例１９．配列番号４９の融合タンパク質
配列番号４９のタンパク質は、２０６アミノ酸の長さおよび２３．３ｋDaの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ｈＴＲＡＩＬ１２０-２８１配列のＮ末端にＰＤＧＦフラグメント（配列番号２２）がエフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列の間に、当該タンパク質は、ウロキナーゼｕＰＡ（配列番号２５）および、メタロプロテアーゼＭＭＰ(配列番号５５)により認識される切断部位の配列を包含し、それによってエフェクターペプチドが腫瘍環境において切断を受ける。ＴＲＡＩＬ配列とメタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される切断部位の配列の間に、当該タンパク質は、続いて位置する、三量体の形成を促進するフレキシブルグリシン―システイン―アラニンリンカー（配列番号２６）および、フレキシブルグリシン―セリンリンカー（配列番号５４）をもまた包含する。

融合タンパク質の構造を、図９において模式的に表わし、そのアミノ酸配列、およびE. coliにおける発現のために最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号４９および配列番号５３である。

配列番号４９のアミノ酸配列は、配列番号５３のそのコードＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用された。His tag（登録商標）および、トロンビンによって認識される部位を発現させる配列を備えたＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドは、生成され、上記一般的手法に従って融合タンパク質の過剰発現が行われた。E. coli BL21 (DE3) および Tuner(DE3)pLysS株（いずれもNovagen社製）を使用して、一般的手法Ａに従って過剰発現が行われた。当該タンパク質は上記一般的手法に従った電気泳動により分離された。

例２０．融合タンパク質の抗腫瘍活性試験
融合タンパク質の抗腫瘍活性試験は、腫瘍細胞株に対する細胞毒性試験においてin vitroで行われ、マウスにおいてはin vivoで行われた。比較目的のために、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１タンパク質および、プラシーボが使用された。

１．円二色性の測定−得られたタンパク質の二次構造含量の決定
例１、例４、例５、例９および例１４の融合タンパク質の調製物の構造品質を、円二色性（ＣＤ）により決定した。

円二色性は、タンパク質の二次構造および高次構造の決定のために使用される。
ＣＤ法は、タンパク質構造の光学活性を利用しており、光の偏光面の回転や楕円偏光として観察される。遠紫外（ＵＶ）におけるタンパク質のＣＤスペクトルにより、ポリペプチド主鎖の高次構造に関する正確なデータが得られる。

透析
ｐＨ８．０の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセリン、０．１ｍＭＺｎＣｌ_２、８０ｍＭショ糖、および５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．４（または、代わりとして、上記過剰発現されたHis tag（登録商標）のない、SP Sepharose（登録商標）で精製されたタンパク質用に、５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、９５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０，１ｍＭＺｎＣｌ_２、１０％グリセロール、８０ｍＭサッカロース、ｐＨ８.０―表５の結果においてアスタリスク＊でマークされる）からなる緩衝液中で製剤したタンパク質の分析試料は、カットオフ値１２ｋＤａの透析バッグ（シグマ・アルドリッチ社）中で透析した。透析は、タンパク質調製物に対して１００倍量（ｖ／ｖ）過剰の緩衝液中で４°Ｃで数時間撹拌しながら行った。透析が完了した後、各調製物は遠心分離（２５０００ｒｐｍ、１０分間、４°Ｃ）し、適切な上澄み液を採取した。このようにして得た試料中のタンパク質濃度は、ブラッドフォード法により３検体の平均値として決定した。

ブラッドフォード法を使用するタンパク質濃度の定量
タンパク質濃度の定量において、試薬は、エタノール（４．８％ｖ／ｖ）リン酸（Ｖ）（５．９５％ｖ／ｖ）および水の混合物にクマーシーＧ−２５０を１７．５ｍｇ溶解することで調製した。タンパク質濃度を決定するために、サンプル1-10ｍｌをブラッドフォード試薬８００ｍｌに加えた。標準試料には、ブラッドフォード試薬と溶解したタンパク質が決まっている適量の緩衝液が含まれる。室温でサンプルを少なくとも５分間培養した後、分光光度計Cary 300で５９５ｎｍの波長における吸光度を読み取った。１−１０μｇ／ｍｌの１０濃度の範囲においてＢＳＡのために作成された検量線から、タンパク質濃度を計算した。試料測定の調製の間の希釈を考慮した後、初期タンパク質濃度を推定した。

円二色性測定
濃度範囲が０．１〜２．７ｍｇ／ｍＬのタンパク質の円二色性は、ジャスコＪ−７１０分光偏光計で光路長０．２ｍｍまたは１ｍｍの石英キュベットを使用して測定した。
測定は７Ｌ／分で窒素を流しながら行ったので、波長範囲１９５〜２５０ｎｍにおける測定が可能であった。測定のパラメーター：スペクトル分解能１ｎｍ；光線の半値幅１ｎｍ；感度２０ｍｄｅｇ、１つの波長での平均時間８秒、スキャン速度１０ｎｍ／分、三回の測定の平均。

結果は、３回の測定の平均として示した。ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１および例１、例４、例５、例９および例１４のタンパク質の円二色性スペクトルを図５に示す。

二次構造含量の定量
得られたスペクトルは、ＣＤＰｒｏソフトウェアを使用して１９３〜２５０ｎｍの範囲で数値解析した。光電子倍増管での電圧が７００Ｖを超える点は、この波長範囲でのシグナル・ノイズ比が小さすぎるため排除した。

得られたデータを使用して、タンパク質分析試料における特定の二次構造含量をＣＤＰｒｏソフトウェアにより計算した（表１）。

対照サンプル（ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１）は、大多数がβシート構造型（波長２２０ｎｍでの楕円率が明らかに最小となる）であるタンパク質に特有のＣＤスペクトルを示した。これは、二次構造成分の計算と一致しており、αへリックス要素が極少ないことを示唆している。また、得られた結果は、β要素が組成物の４０％より多く構成しているｈＴＲＡＩＬタンパク質の結晶構造から得たデータおよび、例４、例９および例１４タンパク質の特徴とも一致している。

すべての融合タンパク質の場合、二色性スペクトルは、波長２２０ｎｍにおける１つの極小値により特徴付けられる。融合タンパク質において、ＴＲＡＩＬに付着する小さいエフェクタータンパク質分子は、タンパク質の小さな部分を構成し、必ずしも明確な二次構造を形成せず、分析されるタンパク質は元々のタンパク質から有意に異なるべきではない。例５によるタンパク質、または、例１によるタンパク質で観察されるようなシートの場合、アルファ構造の高含量のような有意差は、もしかしたら、分析によるＣＤスペクトルの範囲が、特に１８０〜２００ｎｍ領域に限られることが原因である。

２．Ｉｎｖｉｔｒｏによる細胞株テスト
細胞株

ＭＴＴ細胞毒性テスト
ＭＴＴ試験は、細胞の増殖、生存能力および細胞毒性を測定するために使用される比色定量試験である。ミトコンドリア酵素であるコハク酸塩テトラゾリウム還元酵素１による、黄色いテトラゾリウム塩ＭＴＴ（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の非水溶性紫染料ホルマザンへの分解を利用する。ＭＴＴの還元は、生細胞においてのみ進行する。データ解析には、対照細胞と比較して処理された集団の細胞数の５０％で還元が進行する濃度である、タンパク質のＩＣ_５０濃度（単位ｎｇ／ｍＬ）の決定が含まれる。結果は、グラフパッド・プリズム５．０ソフトウェアを使用して解析した。テストは、文献の記載に基づいて行った（Celis JE, (1998), Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang Y., Koh LW, Tsai JH., (2004) "Involvement of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan" Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183）。

細胞培養培地を、所定の密度（１００μＬあたりの細胞数１０^４〜１０^５）に希釈した。その後、適切に希釈された細胞懸濁液１００μＬを、９６ウェルプレートに３ウェルずつ添加した。このように調製した細胞を、使用した培地に応じて５％または１０％ＣＯ_２中３７°Ｃで２４時間培養し、その後、細胞（１００μＬ培地中）に、様々な濃度のタンパク質試料を含んだ１００μＬの培地を更に添加した。細胞分裂３〜４回分に相当する７２時間、タンパク質被検体と共に細胞を培養した後、タンパク質被検体を含む培地に２０ｍＬのＭＴＴ標準溶液［５ｍｇ／ｍＬ］を添加し、さらに５％ＣＯ_２中３７°Ｃで３時間培養を続けた。その後、ＭＴＴ溶液を含む培地を除去し、１００μＬのＤＭＳＯを添加してホルマザン結晶を溶解した。撹拌後、５７０ｎｍでの吸光度を測定した（参照フィルター６９０ｎｍ）。

ＥＺ４Ｕ細胞毒性テスト
ＥＺ４Ｕ（バイオメディカ社）テストを使用して、非接着性細胞株におけるタンパク質の細胞障害活性をテストした。このテストは、テトラゾリウム塩の還元で生成されるホルマザンが水に可溶であるようにＭＴＴを改変したものである。細胞生存能力の試験は、タンパク質（タンパク質を７つの濃度で各３ウェルずつ）と共に細胞を連続７２時間培養した後に行った。これに基づいて、グラフパッド・プリズム５ソフトウェアによりＩＣ_５０値（２回の独立した実験の平均値として）を決定した。

in vitro細胞毒性テストの結果は、ＩＣ_５０値（ｎｇ／ｍＬ）として表４にまとめて示してあり、溶媒のみで処理した対照細胞に対して融合タンパク質の細胞障害効果が５０％のレベルで観察されたタンパク質濃度に対応する。

表４において、その後に取り除かれたヒスチジンタグを伴って初めに発現したタンパク質は、a)として例番号に示される。初めからヒスチジンタグを伴わずに発現したタンパク質は、b)として例番号に示される。各実験は、３ウェルずつで行った少なくとも２つの独立した実験の平均値を示す。タンパク質調製物に活性が無いと判断する基準としては、ＩＣ_５０限度値２０００ｎｇ／ｍＬを採用した。ＩＣ_５０値が２０００を超える融合タンパク質は不活性とみなした。

このテストに使用した細胞は、ＴＲＡＩＬタンパク質に対して自然耐性のある腫瘍細胞株（ＴＲＡＩＬに対する自然耐性の基準：ＴＲＡＩＬタンパク質のＩＣ_５０＞２０００）、従来の抗がん薬物耐性がん系統として、ＴＲＡＩＬタンパク質感受性、ドキソルビシンＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５系統耐性の腫瘍細胞株を含むように選択された。

未分化ＨＵＶＥＣ細胞株を、非がん性細胞における融合タンパク質の効能／毒性の評価用の健常な対照細胞株として使用した。

得られた結果により、本発明の特定の融合タンパク質をＴＲＡＩＬ自然耐性細胞に投与することにより、細胞株のＴＲＡＩＬ耐性を克服できる可能性が確認された。ＴＲＡＩＬ感受性細胞へ本発明の融合タンパク質を投与した時、いくつかのケースでは、ＴＲＡＩＬのみの場合のＩＣ_５０値と比べて融合タンパク質のＩＣ_５０値が減少し、作用効力が明白に相乗強化されたことが観察された。更に、一般的な抗がん薬物であるドキソルビシン耐性細胞においても、本発明の融合タンパク質の細胞障害活性が得られており、いくつかのケースでは、ＴＲＡＩＬのみの活性よりも高い活性となっている。

非がん性細胞株で得られた２０００を超えるＩＣ_５０値は、健常な細胞に対しては本発明のタンパク質の使用に関連する毒性作用が無いこと示しており、本タンパク質の全身毒性の可能性が低いことを示唆している。

広範な腫瘍細胞株パネルに対する選択されたタンパク質調製物の細胞障害活性の決定

表５は、広範囲の最も一般的ながんに対応している様々な臓器由来の広範な腫瘍細胞パネルに対する、本発明の選択された融合タンパク質のin vitroでの細胞障害活性テストの結果を示すものある。

表５において、初めにその後に取り除かれたヒスチジンタグを伴って発現したタンパク質は、a)として例番号に示される。初めにヒスチジンタグを伴わずに発現したタンパク質は、b)として例番号に示される。

得られたＩＣ_５０値により、融合タンパク質の高い細胞障害活性が確認され、したがって、がんの治療における潜在的有用性が確認された。

３．異種移植におけるin vivo融合タンパク質抗腫瘍有効性
タンパク質調製物の抗腫瘍活性を、ヒト結腸がんＨＣＴ１１６、Ｃｏｌｏ２０５およびＳＷ６２０細胞、ヒト非小細胞肺がんＡ５４９およびＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２細胞、ヒト肝細胞がんＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ＣＬＳ）細胞、ヒト膵癌ＰＡＮＣ−１細胞、ヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞、ヒト肺大細胞癌ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞および、ヒト子宮癌ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５多剤耐性細胞のマウスモデルにおいてテストした。

細胞
ＨＣＴ１１６およびＡ５４９（ＡＴＣＣＣＣＬ−１８５）細胞は、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを補充したＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロジェン社、カタログ番号２２６００−１３４）を１：１の比率で添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン社、ローガン、ユタ州、米国）中で維持した。マウスへの移植の日に、トリプシン（インビトロジェン社）で細胞を洗浄して、細胞をサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ，４°Ｃで８分間遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁し、カウントし、細胞数を２５ｘ１０^６個／ｍＬに希釈した。

ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ＣＬＳ）、ＳＷ６２０およびＰＡＮＣ−１細胞は、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを補充したＤＭＥＭ（ハイクローン社、ローガン、ユタ州、米国）中で維持した。マウスへの移植の日に、トリプシン（インビトロジェン社）で細胞を洗浄して、細胞をサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ，４°Ｃで８分間遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁し、カウントし、細胞数を２５ｘ１０^６個／ｍＬに希釈した。

ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを補充したＭＥＭ（ハイクローン社、ローガン、ユタ州、米国）中で維持した。マウスへの移植の日に、トリプシン（インビトロジェン社）で細胞を洗浄して、細胞をサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ，４°Ｃで８分間遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁し、カウントし、細胞数を２５ｘ１０^６個／ｍＬに希釈した。

ＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２、ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＣｏｌｏ２０５は、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０（ハイクローン社、ローガン、ユタ州、米国）中で維持した。マウスへの移植の日に、トリプシン（インビトロジェン社）で細胞を洗浄して、細胞をサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ，４°Ｃで８分間遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁し、カウントし、細胞数を２５ｘ１０^６個／ｍＬに希釈した。

１０％ウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを補充したＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞は、ＭｃＣｏｙ’ｓ（ハイクローン社、ローガン、ユタ州、米国）中で維持した。マウスへの移植の日に、トリプシン（インビトロジェン社）で細胞を洗浄して、細胞をサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ，４°Ｃで８分間遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁し、カウントし、細胞数を２５ｘ１０^６個／ｍＬに希釈した。

マウス
本発明のタンパク質の抗腫瘍活性は、チャールス・リバー社（独国）から入手した４〜５週齢または７〜９週齢ＣＤヌード（Crl:CD1-Foxn1^nu1）または４〜５週齢Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウス、または、ビャウィストクにある医学研究センター（Centrum Medycyny Doswiadczalnej）から入手した４〜５週齢Cby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスを使用して試験した。マウスは、食糧および蒸留水は（適宜）自由摂取として、特定病原体感染防止条件下で保持した。動物を使用したすべての実験は、「Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education」 issued by the New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Research and were approved by the IV Local Ethics Committee on Animal Experimentation in Warsaw （No.71/2009）のガイドラインに従って行った。

実験の過程および評価
腫瘍サイズは電子式キャリパーを使用して測定し、腫瘍体積は、
式：（ａ^２ｘｂ）／２
ここでa＝２５腫瘍の短い対角線（ｍｍ）および、b＝腫瘍の長い対角線（ｍｍ）を使用して計算した。
腫瘍増殖の阻害は、以下の式を使用して計算した。
式：ＴＧＩ［％］（腫瘍増殖阻害）＝（ＷＴ／ＷＣ）ｘ１００−１００％
ここで、ＷＴは処置群における腫瘍体積の平均をいい、ＷＣは対照群における腫瘍体積の平均をいう。

実験結果は平均値±標準偏差（ＳＤ）で示した。
すべての計算とグラフはGraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して作成した。

ヒト結腸がんモデル
Crl:CD1-Foxn1 ^nu 1マウス
０日目に、０．２ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５ｘ１０^６個のＨＣＴ１１６細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:CD1-Foxn1^nu1マウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約６０〜９０ｍｍ^３となったとき（１４日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約７０ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例１（１０ｍｇ／ｋｇ）、例４（１０ｍｇ／ｋｇ）、例５（１０ｍｇ／ｋｇ）および、例９（１０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（１０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は１０日間毎日静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例１、例４、例５および例９の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＨＣＴ１１６結腸がんを負ったＣrl:CD1-Foxn1^nuマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図５に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図６に示す。

図５および６におけるグラフに示す実験結果は、例１、例４、例５および例９の本発明の融合タンパク質の投与が、実験２７日目における対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ６７．８％、６９．８％、８４．４％および６６．２％でＨＣＴ１１６腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが４４％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

Crl:CD1-Foxn1 ^nu マウス
ＨＴ１１６モデル
０日目に、０．２ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５ｘ１０^６個のＨＣＴ１１６細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:CD1-Foxn1^nu1マウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約５０〜７８ｍｍ^３となったとき（８日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約６３ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例５（１０ｍｇ／ｋｇ）、例４（１０ｍｇ／ｋｇ）、例９（１０ｍｇ／ｋｇ）および、例１（１０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物および、対照としての調製用緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｚｍａＢａｓｅ（登録商標）、１５０ｍＭＮａＣｌ、８０ｍＭサッカロース、２５０ｍＭＬ−アルギニン、１ｍＭグルタチオン、Ｚｎ^２＋０．１ｍＭ、ｐＨ７．３）に対しての比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（１０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は５日間毎日静脈内投与した後（ｉ．ｖ．）、（２日の間をおいて）さらに５日間毎日投与した。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例５、例４、例９、例１の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＨＣＴ１１６結腸がんを負ったＣrl:CD1-Foxn1^nuマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図１０に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図１１に示す。

図１０および１１におけるグラフに示す実験結果は、例５、例４、例９および例１の本発明の融合タンパク質の投与が、実験２７日目における対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ８０％、７９％、６６％および６８％でＨＣＴ１１６腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが４４．３％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

Crl:SHO-Prkdc ^scid Hr ^hr マウス
ＨＴ１１６モデル
０日目に、０．２ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５ｘ１０^６個のＨＣＴ１１６細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約３８０〜４３０ｍｍ^３となったとき（１４日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約４００ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例６（３０ｍｇ／ｋｇ）、例１１（４５ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物および、対照としての調製用緩衝液（５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、９５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ_２、１０％グリセロール、８０ｍＭサッカロース、ｐＨ８．０）に対しての比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は隔日に６回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例６（３０ｍｇ／ｋｇ）、例１１（４５ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＨＣＴ１１６結腸がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図１２に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図１３に示す。

図１２および１３におけるグラフに示す実験結果は、例６、例１１の本発明の融合タンパク質の投与が、実験３２日目における対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ４２％および４４．５％でＨＣＴ１１６腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが５．６％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

Crl:SHO-Prkdc ^scid Hr ^hr マウス
ＣＯＬＯ２０５モデル
０日目に、０．２ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５ｘ１０^６個のＣｏｌｏ２０５細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約９０〜１３０ｍｍ^３となったとき（１３日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約１１５ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例６（３０ｍｇ／ｋｇ）、例１９（３０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物および、対照としての調製用緩衝液（５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、９５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ_２、１０％グリセロール、８０ｍＭサッカロース、ｐＨ８．０）に対しての比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は隔日に６回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例６（３０ｍｇ／ｋｇ）、例１９（４５ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＣｏｌｏ２０５結腸がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図１４に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図１５に示す。

図１４および１５におけるグラフに示す実験結果は、例６および例１９の本発明の融合タンパク質の投与が、実験３３日目における対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ１００％、１００％でＣｏｌｏ２０５腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが１８．８％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウス
ＳＷ６２０モデル
０日目に、０．２ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５ｘ１０^６個のＳＷ６２０細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約２９０〜３５０ｍｍ^３となったとき（１７日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約３２０ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例６（３０ｍｇ／ｋｇ）、例１１（４０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物および、対照としての調製用緩衝液（５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、９５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ_２、１０％グリセロール、８０ｍＭサッカロース、ｐＨ８．０）に対しての比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は隔日に６回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例６および１１の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＳＷ６２０結腸がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図１６に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図１７に示す。

図１６および１７におけるグラフに示す実験結果は、例６、例１１の本発明の融合タンパク質の投与が、実験３１日目における対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ６２％、２３％でＳＷ６２０腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが−９％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対して阻害効果は得られなかった。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少（すなわち、体重基準値の１０％より低下）にみられる有意な副作用は引き起こさなかった。このことは当該タンパク質の低い全身毒性を示す。

ヒト肺がんモデル
Crl:CD1-Foxn1^nu1マウス
０日目に、０．２ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５ｘ１０^６個のＡ５４９細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:CD1-Foxn1^nu1マウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約８０〜１００ｍｍ^３となったとき（１４日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約９０ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例１（１０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（１０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は１２日間隔日に静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例１の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＡ５４９肺がんを負ったCrl:CD1-Foxn1^nuマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図７に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図８に示す。

図７および８におけるグラフに示す実験結果は、例１の本発明の融合タンパク質の投与が、実験３３日目における対照と比較して、ＴＧＩが４４．８％でＡ５４９腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが１６．５％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

Cby.Cg-foxn1(nu)/Jマウス
０日目に、０．２ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５ｘ１０^６個のＡ５４９細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Cby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約６０〜９０ｍｍ^３となったとき（１９日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約７５ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例１（１５ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物および、対照としての水注射に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は隔日に６回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例１の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＡ５４９肺がんを負ったCby.Cg-foxn1(nu)/Jマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図１８に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図１９に示す。

図１８および１９におけるグラフに示す実験結果は、例１の本発明の融合タンパク質の投与が、実験３３日目における対照と比較して、ＴＧＩが４４．８％でＡ５４９腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが１６．６％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウス
Ａ．０日目に、０．２ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５ｘ１０^６個のＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約１５０〜１７０ｍｍ^３となったとき（１３日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約１６０ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例６（３０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物および、対照としての調製用緩衝液（５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、９５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ_２、１０％グリセロール、８０ｍＭサッカロース、ｐＨ８．０）に対しての比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は隔日に６回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例６の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＮＣＩ−Ｈ４６０肺がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図２０に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図２１に示す。

図２０および２１におけるグラフに示す実験結果は、例６の本発明の融合タンパク質の投与が、実験２８日目における対照と比較して、ＴＧＩが８８．５％でＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが１７．５％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

Ｂ．０日目に、０．２ｍＬのＨＢＳＳ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）が３：１の比率における混合物に懸濁した７ｘ１０^６個のＡ５４９細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約１４０〜１６５ｍｍ^３となったとき（１９日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約１５０ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例５（６０ｍｇ／ｋｇ）、例６（５０ｍｇ／ｋｇ）、例１１（５０ｍｇ／ｋｇ）、の本発明の融合タンパク質調製物および、対照としての調製用緩衝液（５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、９５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ_２、１００ｍＭＬ−アルギニン、８０ｍＭサッカロース、ｐＨ８．０）に対しての比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は隔日に６回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例５、例６および例１１の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＡ５４９肺がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図２２に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図２３に示す。

図２２および２３におけるグラフに示す実験結果は、例５、例６および例１１の本発明の融合タンパク質の投与が、実験３８日目における対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ、３９．３％、３９．３％および２８％でＡ５４９腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが５．３％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

Ｃ．０日目に、０．１ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した７ｘ１０^６個のＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約１００〜１２０ｍｍ^３となったとき（１９日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約１１０ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例５（初回投与４０ｍｇ／ｋｇ、続いて３０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物および、対照としての調製用緩衝液（１９ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、８１ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ_２、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）に対しての比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は隔日に６回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例５の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２肺がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図２４に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図２５に示す。

図２４および２５におけるグラフに示す実験結果は、例５の本発明の融合タンパク質の投与が、実験２９日目における対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ９７．２％でＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが７６％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

Ｄ．０日目に、ＨＢＳＳ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）が３：１の比率における０．１ｍＬの混合物に懸濁した７ｘ１０^６個のＡ５４９細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約１００〜１２０ｍｍ^３となったとき（１７日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約１１０ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例５（５０ｍｇ／ｋｇ）、例１（５０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物および、対照としての調製用緩衝液（１９ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、８１ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ_２、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）に対しての比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は隔日に６回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例５、例１の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＡ５４９肺がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図２６に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図２７に示す。

図２６および２７におけるグラフに示す実験結果は、例５、例１の本発明の融合タンパク質の投与が、実験３４日目における対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ、５２．５％、４１．６％でＡ５４９腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが２１．８％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

肝がんモデル
Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウス
Ａ．０日目に、０．２ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５ｘ１０^６個のＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約１９０〜２２０ｍｍ^３となったとき（３１日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約２００ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例６（４０ｍｇ／ｋｇ）および、例１１（５０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物および、対照としての調製用緩衝液（５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、９５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ_２、１０％グリセロール、８０ｍＭサッカロース、ｐＨ８．０）に対しての比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物はスキーマすなわち、３日おきに４回および、２日おきに２回に従って静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例６および例１１の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＰＬＣ／ＰＲＦ／５肝がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図２８に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図２９に示す。

図２８および２９におけるグラフに示す実験結果は、例６および例１１の本発明の融合タンパク質の投与が、実験４９日目における対照と比較して、ＴＧＩが７０．６％および、６３．８％でＰＬＣ／ＰＲＦ／５腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが−１８％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対する阻害効果が得られなかった。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウス
Ａ．０日目に、０．２ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５ｘ１０^６個のＨｅｐＧ２細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約１９０〜２２０ｍｍ^３となったとき（３１日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約２００ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例６（３０ｍｇ／ｋｇ）、例１９（３０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物および、対照としての調製用緩衝液（５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、９５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ_２、１０％グリセロール、８０ｍＭサッカロース、ｐＨ８．０）に対しての比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は隔日に６回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例６、例１９の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＨｅｐＧ２肝がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図３０に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図３１に示す。

図３０および３１におけるグラフに示す実験結果は、例６、例１９の本発明の融合タンパク質の投与が、実験３３日目における対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ、８２．６％、４３％でＨｅｐＧ２腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが１２．６％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

膵がんモデル
０日目に、ＨＢＳＳ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）が３：１の比率における０．１ｍＬの混合物に懸濁した７ｘ１０^６個のＰＡＮＣ１細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約８７〜１１０ｍｍ^３となったとき（２７日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約９５ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例１１（５０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物および、対照としての調製用緩衝液（５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、９５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ_２、１００ｍＭＬ−アルギニン、８０ｍＭサッカロース、ｐＨ８．０）に対しての比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（２０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は隔日に６回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。
対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例１１の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＰＡＮＣ１膵がんを負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図３２に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図３３に示す。

図３２および３３におけるグラフに示す実験結果は、例１１の本発明の融合タンパク質の投与が、実験４０日目における対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ、４３％でＰＡＮＣ１腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが１２０％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

多剤耐性ヒト子宮肉腫モデル
０日目に、ＨＢＳＳ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）が１０：１の比率における０．１ｍＬの混合物に懸濁した７ｘ１０^６個のＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞を０．５ｘ２５ｍｍ針付きシリンジ（ＢｏｇＭａｒｋ社）を使用して、Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍の大きさが約１６７〜１９０ｍｍ^３となったとき（１９日目）、処置群の平均腫瘍サイズが約１８０ｍｍ^３となるようにマウスをランダムに分別した。処置群には、例６、例１９（３０ｍｇ／ｋｇ）の本発明の融合タンパク質調製物および、対照としての調製用緩衝液（５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、９５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭグルタチオン、０．１ｍＭＺｎＣｌ_２、１０％グリセロール、８０ｍＭサッカロース、ｐＨ８．０）に対しての比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（１０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物は隔日に６回静脈内投与した（ｉ．ｖ．）。治療群の平均腫瘍サイズが約１０００ｍｍ^３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。

例１８、例６、例１９の本発明の融合タンパク質および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１で処置されたＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５子宮肉腫を負ったCrl:SHO-Prkdc^scidHr^hrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図３４に、対照との比率としての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を図３５に示す。

図３４および３５におけるグラフに示す実験結果は、例６、例１９の本発明の融合タンパク質の投与が、実験３３日目における対照と比較して、ＴＧＩがそれぞれ、９９．７％および９９．７％でＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５腫瘍増殖阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが２９％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。

Claims

ｈＴＲＡＩＬ９５よりも小さくない位置のアミノ酸から始まる可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的フラグメント、または、少なくとも７０％の配列同一性を有する前記機能的フラグメントのホモログ、を含むドメイン（ａ）、および、
抗血管新生エフェクターペプチドの配列から構成されるドメイン（ｂ）を含み、
ここで、ドメイン（ｂ）の配列が、ドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端に付着されており、エフェクターペプチドが、カルレティキュリン、タムスタチン１８３−２３０、キニノーゲンＤ５、バソスタチン、キニノスタチンおよびカンスタチンからなる群から選択されない、融合タンパク質。
ドメイン（ａ）が、ｈＴＲＡＩＬ９５からｈＴＲＡＩＬ１２１までの範囲（両端を含む）のアミノ酸から始まり、アミノ酸２８１で終わる可溶性ｈＴＲＡＩＬ（配列番号１６）タンパク質配列のフラグメントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
ドメイン（ａ）が、ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１９−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１、およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１からなる群から選択される、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
ドメイン（ｂ）が、
― ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦおよびＥＧＦに対する受容体から選択される増殖因子に対する受容体のインヒビター、
― タムスタチンのフラグメント、および、
― アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）のインヒビター、
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
増殖因子のインヒビターの群からなるドメイン（ｂ）が、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦおよびＥＧＦから選択され、配列番号１７、配列番号２２および配列番号２３からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
タムスタチンまたはそのフラグメントからなるドメイン（ｂ）が、タムスタチンフラグメントＩおよびタムスタチンフラグメントＩＩを夫々表す配列番号１８および配列番号１９からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）のインヒビターからなるドメイン（ｂ）が、配列番号２０および配列番号２１からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
融合タンパク質が、ドメイン（ａ）およびドメイン（ｂ）の間に、メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列、ウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列およびそれらの組み合わせから選択される、プロテアーゼ切断部位を含むドメイン（ｃ）を包含する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
メタロプロテアーゼＭＭＰにより認識される配列が、配列番号２４、配列番号５５または配列番号５６であり、ウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列が、配列番号２５である、請求項８に記載の融合タンパク質。
ドメイン（ｃ）が、メタロプロテアーゼＭＭＰおよびウロキナーゼｕＰＡにより認識される配列と互いに隣り合って位置する組み合わせである、請求項８または９に記載の融合タンパク質。
タンパク質が、ドメイン（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）の間に、付加的に、グリシン、グリシン―セリンまたはシステインフレキシブルステリックリンカーまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
フレキシブルステリックリンカーが、ＧＧ，Ｅ，ＧＧＧＣＡＡＡＣＡＡＣ（配列番号２６）、ＧＧＣＡＡＡＣＡＡＣ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＧ（配列番号２８）、ＧＧＧＧ（配列番号２９）、ＧＧＧ（配列番号３０）およびＧＳＧ（配列番号５４）からなる群から選択される、請求項１１に記載の融合タンパク質。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９からなる群から選択される配列に対応するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９からなる群から選択される配列に対応するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列に対応するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択される配列に対応するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
組み換えタンパク質である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
請求項１〜１６のいずれか一項において定義された融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド配列。
大腸菌における遺伝子発現のために最適化された、請求項１８に記載の配列。
配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２および配列番号５３からなる群から選択される、請求項１９に記載の配列。
配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２および配列番号５３からなる群から選択される、請求項１９に記載の配列。
配列番号３７および配列番号３８からなる群から選択される、請求項１９に記載の配列。
配列番号４２および配列番号４３からなる群から選択される、請求項１９に記載の配列。
請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
請求項２４において定義された発現ベクターを含む、宿主細胞。
大腸菌細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。
薬学的に許容し得る任意の担体との組み合わせにおいて、活性成分として、請求項１〜１７のいずれか一項において定義された融合タンパク質を含む、医薬組成物。
非経口投与のための形態における、請求項２７に記載の医薬組成物。
哺乳動物（ヒトを含む）における腫瘍性疾患の処置のための、請求項１〜１７のいずれか一項において定義された融合タンパク質の使用。
処置が必要な哺乳動物（ヒトを含む）におけるがん性疾患の処置の方法であって、
請求項２７または２８において定義された、融合タンパク質の抗腫瘍効果のある量を、対象へ投与することを含む、前記方法。