BR112013016980A2 - proteína de fusão anticancerígena - Google Patents

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Abstract

PROTEÍNA DE FUSÃO ANTICANCERÍGENA. Uma proteína de fusão compreendendo domínio (à), o qual é um fragmento funcional da sequência da proteína hTRAIL, que o fragmento começa com um aminoácido em uma posição não inferior a hTRAIL95, ou um homólogo funcional do fragmento tendo pelo menos 70% da identidade da sequência; e domínio (b), o qual é uma sequência de um peptídeo efetor antiangiogênico, em que a sequência do 10 domínio (b) está ligado ao C-terminal ou N-terminal do domínio (a). A proteína de fusão pode ser usada para o tratamento de doenças cancerígenas.

Description

terapias anticancerígenas antiangiogênicas com melhores características toxicológicas. Proteína de fusão construída contendo sequências de uma vasostatina inibidora de angiogênese e TRAIL114-281 5 ligado a um ligador do sítio de clivagem de metaloprotease foi descrito como apresentando efeito indutor de apoptose nas células tumorais por AI Guo et al in Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2008, vol. 24(10), 925-
930. Proteína de fusão construída contendo sequências de um inibidor de angiogênese calreticulina e TRAIL114-281 foi descrita como exibindo efeito indutor de apoptose nas células tumorais em CN1609124A. CN 1256347C descreve proteína de fusão composta de cininogênio D5 60-148 e TRAIL114-281. Proteína de fusão construída contendo sequências de um inibidor de angiogênese cininostatina, vasostatina e canstatina ligado ao N- ou C-terminal de TRAIL114-281 ligado com ligador de codificação GGGSGGSG são mencionados em Feng Feng-Yi “Phase and Clinical Trial of Rh-Apo2L and Apo2L-Related Experimental Study", Ph.D. degree thesis, Chinese Peking Union Medical, 2006-10-01; http://www. Iw23.com/lunwen_957708432. Proteína de fusão construída contendo sequências de Tumstatina 183-230 de um inibidor de angiogênese tumstatina e TRAIL114-281 foram descritos como exibindo indução de apoptose de células de câncer de pâncreas por N. Ren et al. in Academic Journal of Second Military Medical University 2008, vol. 28(5), 676-478. US 2005/244370 WO 2004/035794 correspondente descrevem o construto de TRAIL95-281 como um domínio efetor ligado por um ligador peptídico com a parte extracelular de outro membro da família de ligantes TNF CD40 como um reconhecida pela uroquinase uPA, localizada próximo um do outro, em qualquer ordem.
Em uma modalidade, o domínio (c) é uma combinação de MMP/uPA SEQ.
No. 24/SEQ.
No. 25 ou uma combinação de 5 uPA/MMP SEQ.
No. 25/SEQ.
No. 24. Em outra modalidade, o domínio (c) é uma combinação de MMP/uPA SEQ.
No. 55/SEQ.
No. 25 ou uma combinação de uPA/ MMP SEQ.
No. 25/SEQ.
No. 55. Em outra modalidade, o domínio (c) é uma combinação de MMP/uPA SEQ.
No. 56/SEQ.
No. 25 ou uma combinação de uPA/MMP SEQ.
No. 25/SEQ.
No. 56. As proteases metaloproteases MMP e uroquinases uPA são super-expressas no ambiente tumoral.
A presença da sequência reconhecida pela protease permite a clivagem do domínio (a) a partir do domínio (b), isto é, a liberação do domínio (b) funcional e, assim, a sua ativação.
A presença do sítio de clivagem da protease, permitindo a liberação rápida do peptídeo efetor, aumenta as possibilidades de transportar o peptídeo para o local da sua ação antes que a degradação aleatória da proteína de fusão por proteases presentes na célula ocorra.
Além dos principais elementos funcionais da proteína de fusão, o(s) domínio(s) do sítio de clivagem, as proteínas de fusão da invenção podem conter uma sequência neutra/sequências de um ligador glicina-cisteína-alanina estérico flexível (espaçador). Estes ligadores/espaçadores são bem conhecidos e descritos na literatura.
Sua incorporação dentro da sequência da proteína de fusão destina-se a fornecer a dobragem correta de proteínas produzidas pelo processo da sua super-expressão nas células hospedeiras.
Em particular, o ligador estérico flexível pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ.
No.
26 e SEQ.
No. 27, os quais são combinações de resíduos de glicina, de cisteína e de alanina.
Em outra modalidade, o ligador estérico flexível pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ.
No. 28, SEQ.
No. 29, SEQ.
No. 30 5 e SEQ.
No. 54, que consiste em resíduos de glicina e serina.
Adicionalmente, o ligador estérico flexível pode ser qualquer fragmento da SEQ.
No. 28, SEQ.
No. 29, SEQ.
No. 30 e SEQ.
No. 54, atuando como um agente de ligação estérico flexível, por exemplo, um fragmento Gly Gly Gly/GGG ou um fragmento Gly Gly/GG.
Em uma modalidade, o ligador estérico flexível também pode ser selecionado a partir de resíduo único de aminoácido, tal como resíduo único de ácido glutâmico, cisteína, serina, prolina ou resíduo de glicina.
Em outra modalidade, o ligador estérico flexível pode ser qualquer combinação de ligadoroes consistindo em SEQ.
No. 26, SEQ.
No. 27, SEQ.
No. 28, SEQ.
No. 29, SEQ.
No. 30, SEQ.
No. 54 e resíduos de aminoácidos únicos de resíduos de ácido glutâmico, cisteína, serina, prolina ou glicina.
Modalidades particulares da proteína da fusão da presente invenção são proteínas de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ.
No. 1, SEQ.
No. 2, SEQ.
No. 4, SEQ.
No. 5, SEQ.
No. 6 e SEQ.
No. 46, SEQ.
No. 47 e SEQ.
No. 48, compreendendo um peptídeo efetor como um heptapeptídeo derivado de VEGF.
Outra modalidade específica da proteína de fusão da invenção é a proteína de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ.
No. 7 e SEQ.
No. 8, que compreende as sequências peptídicas efetoras que se ligam ao CD13.
Outra modalidade específica da proteína de fusão da invenção é a proteína de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ.
No. 9, SEQ.
No. 10, 5 SEQ.
No. 11 e SEQ.
No. 49 compreendendo um peptídeo efetor como um fragmento de PDGF.
Outra modalidade específica da proteína de fusão da invenção é a proteína de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ.
No. 12 e SEQ.
No. 13, compreendendo como uma tumstatina de peptídeo efetor e fragmentos II.
Outra modalidade específica da proteína de fusão da invenção é a proteína de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ.
No. 14 e SEQ.
No. 15, compreendendo um peptídeo efetor como um fragmento de EGF.
Modalidades particulares da proteína de fusão da presente invenção são proteínas de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas SEQ.
No. 3, compreendendo como um peptídeo efetor um heptapeptídeo derivado de VEGF, o fragmento I de peptídeo de tumstatina e fragmento II de peptídeo de tumastina.
Uma descrição detalhada da estrutura das proteínas de fusão representativas acima mencionadas são mostradas nas Figuras 1 a 3 e na Fig. 9, e nos Exemplos aqui apresentados abaixo.
De acordo com a presente invenção, por proteína de fusão, entende-se uma única molécula de proteína que contém duas ou mais proteínas ou seus fragmentos, ligadas covalentemente através da ligação peptídica nas respectivas cadeias peptídicas, sem ligadores químicos adicionais.
sequência de TRAIL, a glicina ligadora estérica flexível (SEQ No. 28) é incorporada.
Estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na FIG. 1, e a sua sequência de 5 aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ.
No. 1 e SEQ.
No. 31, como mostrado na Listagem de Sequências em anexa.
A sequência de aminoácidos SEQ.
No. 1 da estrutura descrita acima foi utilizada como padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ.
No. 31. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA em duas versões, uma que permite expressar marca His e um sítio reconhecido pela trombina, e o segundo, sem qualquer marcador, foi gerado e super-expressão da proteínas de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais acima descritos . A super-expressão foi realizada de acordo com o procedimento geral A, usando cepas E. coli BL21 (DE3) e Tuner(DE3)pLysS, ambas da Novagen.
As proteínas foram separadas por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 2: A proteína de fusão de SEQ.
No. 2: A proteína de fusão da SEQ.
No. 2 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 199 aminoácidos e a massa de 22,8 kDa, em que o N-terminal da sequência TRAIL 95-281 de heptapeptídeo derivada de VEGF (SEQ.
No. 17) é ligado como um peptídeo efetor.
Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, o ligador estérico de glicina flexível (SEQ No.28) é incorporado.
A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 1, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são,
respectivamente, a SEQ.
No. 2 e SEQ.
No. 32, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de aminoácidos SEQ.
No. 2 foi utilizada como padrão para gerar sequência de codificação 5 de DNA, DNA SEQ.
No. 32. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência permitindo expressar marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão de proteína de fusão foi efetuada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, usando cepa E. coli BL21(DE3) de Novagen.
A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 3: A proteína de fusão de SEQ.
No. 3: A proteína de fusão da SEQ.
No. 3 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 230 aminoácidos e a massa de 26,3 kDa, na qual o N-terminal da sequência TRAIL 121 - 281 de heptapeptídeo derivada de VEGF (SEQ.
No. 17), e no C-terminal da sequência de TRAIL 121 -281 de fragmentos I e II da tumstatina (SEQ.
No. 18 e SEQ.
No. 19, respectivamente) estão ligados como um peptídeo efetor.
Entre o peptídeo efetor ligado na extremidade N-terminal da sequência de TRAIL e a sequência de TRAIL está incorporado o ligador estérico flexível de glicina (SEQ.
No. 28). Entre o peptídeo efetor ligado ao C-terminal da sequência de TRAIL e a sequência de TRAIL está incorporado ligador estérico consistindo em três resíduos de glicina Gly Gly Gly, e sequências de sítios de clivagem reconhecidas por metaloproteases MMP (SEQ No. 24) e uroquinase uPA (SEQ.
No. 25), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 1, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, 5 respectivamente, SEQ.
No. 3 e SEQ.
No. 33, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de aminoácidos SEQ.
No. 3 foi usado como um padrão para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ.
No. 33. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência permitindo expressar marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando-se cepa E. coli BL21 (DE3) de Novagen.
A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 4: A proteína de fusão de SEQ.
No. 4: A proteína de SEQ.
No. 4 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 187 aminoácidos e a massa de 21,4 kDa, na qual o N-terminal da sequência de TRAIL 121-281, duas sequências de heptapeptídeo derivadas de VEGF (SEQ.
No.17) estão ligadas como um peptídeo efetor.
Entre as duas sequências de peptídeo efetor está incorporada a sequência do sítio de clivagem reconhecida por metaloprotease MMP (SEQ.
No. 24), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
Entre a sequência do sítio de clivagem MMP e a sequência da proteína efetora está incorporado um único resíduo do ácido glutâmico E.
Entre o peptídeo efetor (SEQ. 17) e a sequência de TRAIL está incorporado o ligador de glicina estérico flexível (SEQ.
No. 28).
A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 1, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo os códons otimizados para a expressão em E. coli são, 5 respectivamente, a SEQ.
No. 5 e a SEQ.
No. 35, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de aminoácidos SEQ.
No. 5 foi utilizada como um padrão para gerar sua sequência de codificação de DNA, SEQ de DNA.
No. 35. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA em duas versões, uma que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, e o segundo, sem qualquer marcador, foi gerado e a super-expressão das proteínas de fusão foi efetuada em conformidade com os procedimentos gerais acima descritos.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen.
As proteínas foram separadas por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 6: A proteína de fusão de SEQ.
No. 6: A proteína de SEQ.
No. 6 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 222 aminoácidos e a massa de 25,3 kDa, na qual o N-terminal da sequência TRAIL 95-281, duas sequências de heptapeptídeo derivadas de VEGF (SEQ.
No. 17) estão ligadas como um peptídeo efetor.
Entre as duas sequências de peptídeo efetor, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidas por uPA (SEQ.
No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ.
No. 55), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
Entre o peptídeo efetor (SEQ. 17) e a sequência de TRAIL está incorporado o ligador estérico flexível de cisteína (SEQ.
No. 26).
sequência de codificação de DNA em duas versões, uma que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, e o segundo, sem qualquer marcador, foi gerado e a super-expressão das proteínas de fusão foi 5 realizada em conformidade com os procedimentos gerais acima descritos.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando cepa E. coli tuner (DE3) de Novagen.
As proteínas foram separadas por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 8: A proteína de fusão de SEQ.
No. 8: A proteína de SEQ.
No. 8 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 201 aminoácidos e a massa de 23,2 kDa, em que o N-terminal da sequência de TRAIL 95 - uma sequência sendo um ligante de CD13 (SEQ.
No. 21) é ligado como um peptídeo efetor.
Entre a sequência de TRAIL e a sequência de peptídeo efetor da proteína contém uma sequência do ligador de glicina-serina flexível (SEQ No. 30). A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2, e a sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ.
No. 8 e a SEQ.
No. 38, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de aminoácidos SEQ.
No. 8 foi usada como um padrão para gerar a sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ.
No. 38. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar um marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando cepa de E. coli efetor.
Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ.
No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ.
No. 24), devido a qual o peptídeo 5 efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
Entre a sequência de TRAIL e a sequência do sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease MMP, a proteína também contém um ligador glicina-cisteína-alanina flexível (SEQ.
No. 27). A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ.
No.11 e SEQ.
No.41, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de aminoácidos SEQ.
No. 11 foi usada como um padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ.
No. 41. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, sem uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando cepas E. coli BL21 (DE3) e tuner(DE3)pLysS, ambas de Novagen.
A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 12: A proteína de fusão de SEQ.
No. 12: A proteína de SEQ.
No. 12 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 217 aminoácidos e a massa de 25 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL 121-281, fragmentos I e II da tumstatina (SEQ No. 18 e SEQ.
No.19) estão ligados como um peptídeo efetor.
Entre o peptídeo como um peptídeo efetor.
Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ.
No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ.
No. 24), devido a qual o peptídeo 5 efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
Entre a sequência do sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease MMP e a sequência de TRAIL, a proteína contém três resíduos de glicina Gly Gly Gly, e entre o C- terminal da sequência de TRAIL e do fragmento II de tumstatina, um ligador flexível consistindo em 3 resíduos de glicina Gly Gly Gly.
A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig 3, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ.
No. 13 e SEQ.
No. 43, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de aminoácidos SEQ.
No. 13 foi utilizada como padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ.
No. 43. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar um marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando cepa E. coli B.21 (DE3) de Novagen e cepa BL21DE3pLysSRIL de Stratagene.
A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 14: A proteína de fusão de SEQ.
No. 14: A proteína de SEQ.
No. 14 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 181 aminoácidos e a massa de 21 kDa, em que no N-terminal da sequência TRAIL 120-281, um efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
Entre a sequência do sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease MMP e a sequência de TRAIL, a proteína contém único resíduo de prolina seguido do ligador glicina- 5 cisteína-alanina flexível (SEQ.
No. 26). A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 3, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ.
No. 15 e a SEQ.
No. 45, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de aminoácidos SEQ.
No. 15 foi usada como um padrão para gerar a sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ No. 45. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar um marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando cepa E. coli BL21 (DE3) de Novagen.
A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 16: A proteína de fusão de SEQ.
No. 46: A proteína de fusão da SEQ.
No. 46 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 211aminoácidos e uma massa de 24,4 kDa, em que n N-terminal da sequência TRAIL 95- 281,dois heptapeptídeos de VEGF (SEQ.No. 7) ligados uns aos outros são ligados como peptídeos efetores.
Entre os peptídeos efetores, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ.
No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ.
No. 55), devido a qual o peptídeos efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 9, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E.
Coli são, 5 respectivamente, a SEQ.
No. 46 e a SEQ.
No. 50, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de aminoácidos SEQ.
No. 46 foi usada como um padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ.
No. 50. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando cepa E.
Coli BL21 (DE3) de Novagen.
A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 17: A proteína de fusão de SEQ.
No. 47: A proteína de fusão da SEQ.
No. 47 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 200 aminoácidos e a massa de 22,7 kDa, em que no N-terminal da sequência TRAIL 120- 281, dois heptapeptídeos derivados do VEGF (SEQ.
No. 17), ligados uns aos outros são ligados como peptídeos efetores.
Entre os peptídeos efetores, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ.
No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ.
No. 55), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
Entre as proteínas efetoras e o domínio TRAIL, a proteína contém um ligador flexível posteriormente (SEQ.
No. 26) promovendo formação trímero e ligador glicina-serina flexível (SEQ.
No. 54.). A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 9, e a sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ.
No. 47 e SEQ.
No. 51, como mostradas na Listagem de Sequências anexa. 5 A sequência de aminoácidos SEQ.
No. 47 foi usada como um padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ.
No. 51. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando a cepa E. coli BL21 (DE3) de Novagen.
A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 18: A proteína de fusão de SEQ.
No. 48: A proteína de fusão da SEQ.
No. 48 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 192 aminoácidos e a massa de 21,9 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL 120-281, dois heptapeptídeos derivados do VEGF (SEQ.
No. 17), ligados uns aos outros são ligados como peptídeos efetores.
Entre os peptídeos efetores, a proteína contém sequência de sítio de clivagem reconhecido pela uroquinase uPA (SEQ.
No. 25), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
Entre as proteínas efetoras e o domínio TRAIL, a proteína contém ligador flexível posteriormente (SEQ.
No. 26) promovendo formação de trímero e ligador glicina-serina flexível (SEQ.
No. 54). A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 9, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são,
respectivamente, a SEQ.
No. 48 e a SEQ.
No. 52, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de aminoácidos SEQ.
No. 48 foi usada como um padrão para gerar a sua sequência de DNA de 5 codificação, DNA SEQ.
No. 52. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando a cepa E. coli BL21 (DE3) de Novagen.
A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 19: A proteína de fusão de SEQ.
No. 49: A proteína de SEQ.
No. 49 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 206 aminoácidos e a massa de 23,3 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL120-281, um fragmento de PDGF (SEQ.
No. 22) é ligado como um peptídeo efetor.
Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ.
No. 25) e metaloproteases MMP (SEQ.
No. 55), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
Entre a sequência TRAIL e a sequência de sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease MMP, a proteína contém também localizado posteriormente ligador glicina-cisteína- alanina flexível (SEQ.
No. 26) promovendo a formação do trímero e ligador glicina-serina flexível (SEQ.
No. 54). A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 9, e a sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli
PROTEÍNA DE FUSÃO ANTICANCERÍGENA A ínvenção refere-se ao campo das proteínas de fusão terapêuticas, em particular, as proteínas de fusão recombinarites. Mais particularmente, a invenção refere-se 5 às proteínas de fusão contendo o fragmento de uma sequência da proteína TRAIL humana solúvel em combinação com uma sequêncía de um peptídeo antiangiogêríico, composições farmacêuticas contendo estas, utilização destas em terapía, particularmente, como agentes anticancerígenos, e sequências polinucleotídicas que codifica as proteínas de fusão, vetores de expressão contendo as sequências polinucleotídicas e as células hospedeiras contendo esses vetores de expressão. Proteína TRAIL pertencente à família de citocinas (Fator de Necrose Tumoral Relacionado ao Ligante Incluindo Apoptose), também conhecido como Apo2L (Apo2-ligante), é um atívador potente da apoptose em células tumorais e em células infectadas por vírus. trail é um Iigante que ocorre naturalmente no corpo. a proteína TRAIL, sua sequência de aminoácido, sequências de DNA de codificação e sístemas de expressão de proteínas foram descritos pela primeira vez em EP 0835305 Al.
a proteína TRAIL exerce a sua atividade anticancerígena por se Iigar aos receptores de superfície TRAIL pró-apoptótícos 1 e 2 (TRAIL-R1/R2) e atívação subsequen'te destes receptores. Esses reeeptores, também conhecídos como DR4 e DR5 (receptor de morte 4 e receptor de morte 5), pertencem à Eamília de receptores de TNF e sào super-expressados por diferentes tipos de células caneerosas. A ativação desses receptores pode induzir a via de sinalização externa da apoptose índependente do gene supressor p53, a qual ativada por caspase-8 leva à ativação de caspases de execúção e, assim, a degradação dos ácidos nucl-éicos.
A caspase-8 Iiberada por atívação TRAIL também pode causar a liberação de proteína BID e, desse modo, ativação indireta da via mitocondrial, proteína BID sendo translocada para a mitocôndria, onde estimula a Iiberacáo ^ 5 de citocromo c, assim, indiretamente, amplificando o sinal de apoptose de receptores da morte.
TRAIL atua seletivamente nas células tumorais essencialmente sem induzir a apoptose em células saudáveis,
as quais são resistentes a essa proteína.
Portanto, o enorme potencial de TRAIL foi reconhecído como um agente antícancerígeno, o qual atua sobre uma ampla faixa de diferentes tipos de células tumorais, incluindo doenças malignas hematológicas e tumores sólidos, enquanto poupam as células normaís e exercem efeitos colaterais potencialmente e relativamente pequenos.
Proteína TRAIL é uma proteína de membrana do tipo II que tem o comprimento de 281 aminoácidos, e a sua região extracelular eompreendendo os resíduos de aminoácidos 114- 281 sob clívagem por formas de proteases soIúveis em moléculas sTRAIL de 20 kDa de tamanho, que também está bíologicamente ativa.
Ambas as formas TRAIL e STRAIL são capazes de desencadear apoptose através da interação com os receptores TRAIL presentes nas células alvo.
A atividade antítumoral intensa e a toxicidade sístemica muito baíxa da parte solúvel da molécula TRAIL foram demonstradas por meio de testes de linhas celulares.
Mém disso, estudos clínicos em humanos com TRAIL soIúvel humano recomb'inarrte (rhTRAIL) possuindo a sequência de aminoãcidos correspondente aos aminoácidos 114-281 do hTRAIL, conhecido sob c! INN dulanermín, mostraram sua boa tol-erância e ausêneia de toxicidade limitadora de dose.
Fragmento de TRAIL menor do que 114-281 é também capaz de se ligar aos receptores de morte da membrana e induzir apoptose através desses receptores, tal como foi recerrtemente relatado para mutante permuta'do circularmente recombinante da 122-281 hTRATL, por exemplo, na EP 1 688
498. 5 Os efeitos tõxícos da proteína TRAIL recombinante em eélulas do fígado relatados até agora parecem estar associadas com a presença de rnodifícação, ísto ê, marcas de poIi-histidína, enquanto que TRAIL não marcado não mostrou nenhuma toxicidade sistemica. Ng) entanto, no curso de rriais investigação e desenvolvimento verificou-se que muitas células cancerosas mostraram resistência prímária ou adquirida para TRAIL (ver, por exemplo, WO2007/022214). Embora o mecanismo de resístência para TRAIL não seja totalmente compreendído, acredita-se que pode manifestar-se em diferentes níveis da via da apoptose induzida por TRAIL, variando desde o nível de receptores de superfície celular para as caspases executivas da via de sinalização. Esta resistê'ncia Iimita a utjlidade de TRAIL como um agente anticancerígeno. Aiém disso, em ensaios clínícos em pacientes, a eficácia real de TRAIL como uma monoterapia provou ser baixa. para superar esta baíxa efícíência e a resistência dos tumores para trail, várias terapias combínadas COIll agentes de rádío e agentes quimioterápicos foram projetadas, o que resultou em efeito sinérgico de apoptose (WO2009/002947; A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine growth Faetor Reviews 14 (2003) 337-348; rk Srivastava, Neoplasís, VoI 3, No 6, 2001, 535-546, Soria JC et al., j. Clin Oncology, Vol 28, No 9 (2010), p 1527-1533). O uso de rhTRAIL para o tratamento de câncer em combínação ccim os agentes quimíoterapêuticos cQnveneionais selecionados (paclitaxel, carbop'latina) e antícorpos monoclo.naí.s anti- vegf são descritos em WO2009/140469. No entanto, taj-
combínação implica, necessariamente, em deficiências bem conhecidas da químioterapia ou da radioterapia + convencional. Além disso, o problema relacíonado com a terapia 5 de trail provou ser a sua baixa estabilidade e rápida eliminaçáo do corpo após admínístração.
Um dos alvos na terapia do câncer é também a inibição da angiogênese tumoral. Angiogênese (neovascularização) é um processo patológico por tempo 10 ilimitado de desenvolvimento de novos vasos sanguíneos que alimentam os tumores com oxigênio e nutrientes. A angiogênese é indispensãvel para o crescimento e expansão do tumor e promoção de sua metástase.
O efeito benéfico da inibição da angíogênese 15 tumoral na terapia de câncer é conhecido. Foram feitas tentativas para a utilização clínica de substâncias que inibem ou regulam o processo de angiogênese, tanto coirq uma terapia de câncer quanto uma terapia complementar de câncer. 20 Os inibidores da angíogênese são conhecidos, tanto as endõgenos naturalmente presentes no corpo humano quanto às numerosas substãncias exógenas antiangiogênica. Entre eles estão os inibidores protéicos conhecídos de angiogênese, incluindo fragmentos proteolíticos de 25 proteínas endógenas. Como exemplos, os ínibidores da proteína de angiogênese, tais como angiostatina (um fragmento do plasminogênio), endostatina (fragmento C- terminal de colágeno XVIII), calreticulina, vasostatina - um fragmento de calreticulina, um fragmento de prolactina, 30 um fragmento de metaloproteinase 2 ou tumstatina - um fragmerrto de colãgeno IV, podem ser mencionados (cao Y. Angiogenesis modulates adipogenesis and obesity. j clin Invest. 2007; 1 17(9):2362-2368, Folkman J. Angiogenesis:
an organízíng prin'cíple for drug discovery? Nat Rev Drug Discov. 2007;6:273-286).
Por exempío, tumstatina é um peptídeo do tamanho de 28 kDa - um fragmento de colágeno tipo IV, capaz de se 5 ligar à integrina av|33 e prevenir a angiogênese por inibição da proliferação das células endoteliais. Além 'disso, tumstatina inibe independentemente a ativação da Quinase de Adesão FQcal (FAK) e fosfatidilinosito1-3- quinase PI3 e proteína quinase pKB/Akt. A atividade antiangiogênica pode também ser exe.rcida pela inibieão de proteínas pró-angiogênicas, tais ' » coimj o Fator de Crescimento Endotelial vascular (vegf), o qual atua através de rece'ptores localizados no endotélio vascular e que é o principal estimulador da neo'angiogênese. No tratamento clínico, incíuindo tera'pia de- câncer, já foram usados eomo fatores antiangiogênicos certas substâncias direcionadas contra VEGF, tais como anticorpos monoclonais bevacizumabe e ranibizumabe. Outros fatores pró-angíogênícos estimulando a proliferação e migração de células eridoteliaís, independentemente de receptores localizados no endotélio são também conhecidos, que incluem, por exemplo, citocinas, tais como Fatores de Crescimento Derivado das Plaquetas PDGF e Fator de Crescimento Epidermal EGF, TNF, e angiopoietína. No processo de angiogênese, também está envolvida 'a enzima N-aminopeptidase (ApNlcD13), a qual é uma metaloprotease transmembrana. Sabe-se que a iníbíção desta enzima pode conduzir à inibição de processos neoplásicos. tjin número de inibidores naturais e sintéticos de N- aminopeptidase são conhecidos. (Bavouis b., Dauzonne D., AIninopeptídase-N/CD13 (EC 3.4.11.2) inhibitors: chemistry, b.iological evaluations, and therapeutic prospects0 Medical Research Review, 2006, 26, (1), 88-130).
InLbidQr.es naturais de APN/CD13 i'ncluem principalmente substâncias produzidas por mícro-organismos. Como um representante, entre outras, bestatina, curcumína, e apigenina podem ser mencionadas. verificou-se també'm que 5 um pequeno peptídeo que contém o motivo CNGRC é capaz de se ligar de forma efíciente ao CDl3 (Arap et al., Science, 279:377- 380, 1998). Muitas das substâncias anti-angiogênicas estão atualmente em díferentes fases de investigações, incluindo ensaios cIínicos. No entanto, as terapias conhecídas destinadas a inibir a angiogênese tem muitas desvantagens bem conhecidas. Por exernplo, os benefícíos do anticorpo bevacizumabe monoclonal- terapêutico para o tratamento de câncer da mama foram recentemente questionados. Muitos medicainentos antiangiogênicos mostram, por exemplo, uma meia-vida muito curta, baixa solubilidade, má biodisponibilidade e efeitos colaterais tóxicos.
Segurança dos medicamentos antiangiogênicos é de especial- importãncia por causa do uso prolongado e falta de
2.Q se1etividade da terapia. Necessidade intensa para uma terapêutica eficaz e a natureza das doenças oncológicas necessítam de um procedimento de registro simplificado de La1 grupo de medicamentos, portanto, é impossível conhecer todos os efeitos colaterais e os inconvenientes do medicamento. Embora, ao cQntrário dos químoterapêuticos, que são dírigidos a todas as células que proliferam rapidamente, medicamentos antiangiogênicos são direcionados em diferentes estágios da formação de vasos sanguineos, os quais resultam na redução da toxicidade da terapia. No
30. entanto, ainda existe uma necessidade de terapia anticancerígena, a qual visa à íni-bíção da angiogênese, en'quanto assegurando a seletividade contra as células tumorais. Existe, portanto, uma necessidade de novas terapias antícancerígenas antÍangio'gênicas com inelhores característícas toxicológicas. Proteína de fusâo construída contendo sequências de uma vasostatina inibídora de angiogênese e TRATL114-281 5 ligado a um ligante do sítio de clivagem de metaloprotease foi descríto como apresentando ef.eito indutor de apoptose nas células tumorais por AI Guo et al in Chinese journal of Biochemistry and Molecular Biology 2008, vol. 24(10), 925-
930. proteína de fusão eonstruída contendo sequências de um inibídor de angiogênese calretículína e TRAIL114-281 foi descrita como exibíndo efeito indutor de apoptose nas células tumorais em CN1609124A. CN 1256347C descreve proteína de fusão composta de cininogênio D5 60-148 e TRAIL1l4-281.
proteína de fusão construída contendo sequências de um inibidor de angiogênese cininostatina, vasostatina e canstatina lígado ao N- ou C-terminal de TRAIL114-281 ligado com lígante de codificação GGGSGGSG são mencionados em Feng Feng-Vi "Phase and Clinical Trial of Rh-Apo2L and Apo2L-Related Experimental Study", Ph.D. degree thesis, Chinese Pekíng Úníon Medical., 2006-10-01; http://www. Iw23.com/lunwen 957708432. proteína de fusão construída contendo sequências de Tumstatina 183-230 de um inibidor de angíogênese tumstatina e TRAIL114-281 foram descritos como exibindo indução de apoptose de células de câncer de pâncreas por N. Ren et al. ín Academic journal of Second Military Medical Universíty 2008, vol. 28(5), 676-478. US 2005/244370 WO 2004/035794 correspondente descrevem o construto de TRAIL95-281 como um domínio efetor ligado por um Iigante peptídico com a parte extracelular de outro membro da família de ligantes TNF CD40 como um domínio de ligação da superfície da célula.
É afirmado que a ativação do construto é através da ligação de sua parte CD40. A presente invenção proporcíona uma solução para 5 este problema fornecendo novas proteínas de fusão que compreendem um domínío derivado de TRAIL e um pequeno domínio de peptídeo efetor possuindo a atividade antiangíogênica e não íncluindo fragmentos de TRAIL, em'que o peptídeo efetor potencializa ou complementa a ação de TRAIL.
Proteínas de acordo com a invenção s'ão direcionadas seletivamente às células de câncer, onde os elementos individuais da proteina exercem os seus efeitos, em particular, os peptídeos efetores iníbem a angiogênese tumoral.
Entrega das proteínas da invenção para o ambiente do tumor permite minimizar a toxicidade contra células saudáveis do corpo, bem como os efeitos colaterais e para reduzir a frequência de administração.
Além disso, a terapía alvo com o uso de proteínas de acordo com a invenção permite evitar o problema da baixa eficiência de t'erapias antiangiogênicas não específícas previamente conhecidas causadas por baixa permeabil-idade dos vasos sanguíneos.
Além disso, descobriu-se que, em muitos casos, as proteínas de fusão da invenção são mais potentes do que TRAIL solúvel e suas variantes incluindo um fragmento da sequência.
Até agora, os peptídeos efetores conhecidos utilizados na proteína de fusáo da invenção não foram utilizados na medicina, como tal, devido às cinétícas desfavoráveis, rápída degradaçâo por proteases náo específicas ou acumulaçào no corpo causada pela falta de sequência adequada de ativação de vias, as quais são necessárias para permitir a ação adequada do peptídeo efetor no sítio alvo. a incorporação do peptídeo efetor na proteína de fusão permite a sua entrega seletiva ao sítio onde a sua ação é desejável. Além disso, a anexação do peptídeo efetor aumenta a massa de proteína, resultando em 5 uma meia-vida prolongada e a retenção aumentada da proteína no tumor e sua eficiência melhorada. Mém disso, em muitos casos, as proteínas de fusão novas também ultrapassam a resistência ao TRAIL.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A invenção será agora descrita em detalhes com referência às figuras do desenho. Fig. 1 apresenta uma estrutura esquemática das proteínas de fusão da invenção de acordo com o Ex. 1 Ex. 2, Ex. 3, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. 6. Fig. 2 apresenta uma estrutura esquemática das proteínas de fusão da invenção de acordo com o Ex. 7, Ex. 8, Ex. 9, EX. 10 e Ex. 11. Fig. 3 apresenta uma estrutura esquemátíca das proteínas de fusão da invençào de acordo com o Ex. 12, Ex. 13, Ex. 14 e Ex. 15. Fíg. 4 mostra os espectros de dicroísmo circular para rhTRAIL95-281 e as proteínas de fusão de Ex. 1, Ex. 4, EX. 5, Ex. 9 e Ex. 14 expressa em elipticidade específica. Fig. 5 apresenta as mudanças do volume tumoral (£ .25 do estágio inicíal) em camundongos Crl:cD1-Foxrílnu sobrecarregados com câncer do cólon HCT116 tratados com as proteínas de fusão da ínvenção de Ex. 1, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. 9 em comparação com rhTRAILI14-281 Fig- 6 apresenta os valores de inibição do 3'0 c.rescimento do tumor (% TGI) em 1 camundongo Cr1:CD1- Foxnl"" sobrecarregado com câncer do cõlon HCT116 tratado cQm as proteínas de fusão da invençào de z Ex. 1, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. 9 em comparação com rhTRAIL114-281.
F 10·/102
Fig. 7 apresen'ta as alterações de volume t'umorál (% de estágio inicial) em camundongo Crl:cD1-Foxn1nu sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratado com as proteínas de fusão da invençào de Ex. 1 comparado ao 5 rhTRAIL114-281 Fig. 8 apresenta os valores de inibição de cresci-mento do tumor (% TGI) em 1 camundongo crl:cDl- Foxnl"" sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 comparado ao 10 rhTRAIL114-281. Fig. 9 apresenta uma estrutura esquemática das proteínas de fusão da invençâo de acordo com o Ex. 16, Ex. 17, Ex. 18 e Ex. 19. Fig. 10 apresent-a as alterações de volume tumoral 15 (% de estãgio inicial) em camundongo Crl:CD1-Foxn1nu sobrecarregado com cãncer de cóIon HCT116 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 4, EX. 9 e Ex. 1 comparado ao rhTRAIL114-281. Fig. 11 apresenta os valores de inibíção do 20 crescimento do turnor (%TGI) em 1 camundongo Crl:CD1-Foxn1"" sobrecarregado com câncer de cólon HCT116 tratado com as proteinas de fusão da invenção de ex. 5, Ex. 4, Ex. 9 e Ex. 1 comparado ao rhTRAIL114-281. Fig. 12 apresenta as alterações de volume tumoral 25 (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO-prkdc'"iaHr'" sobrecarregado com câncer de cóIon HCTI16 tratado com as proteinas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex.
Il comparado ao rhTRAILI14-281. Fig. 13 apresenta os valores de inibição do 30 crescimento do tumor (* TGÍ) em camundongo CEI:SHO- prkdc""idHr'" sobrecarregado com câncer de cólon HCT116 tratado com as proteínas de fusão da invencão de Ex. m 6 e Ex. 11 comparado ao rhTRAILI14-281.
Fíg. 14 apresenta as alterações' de volume tumoral (# de estágio inicíal) em camundongo crl:SHO-prkdc'"idHrh" sobrecarregado com câncer de cólon Colo205 tratado com proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex.19 comparado 5 com rhTRAILl14-281. Fig. 15 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% tgi) em camundongo CEL:SHO- prkcic""£dHrh" sobrecarregado com câncer de cõlon Co1o205 tXatado com proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex.19 camparado com rhTRAILl14-281. Fig. 16 apresenta as alterações de voIume tumoral (% de estágio inicial) em eamundongo Cr1:SHO-prkdc""LdHrh" sobrecarregado com câncer de cólon SW620 tratados com as proteínas de fusão da invencão de Ex. 6 e Ex. 11 em relação
J ao rhTRAIL114-281.
Fig. 17 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% TG'I) em camundongo Crl:SHO- prkdc""idHr"" sobrecarregado com câncer de cólon SW620 tratado com as proteínas de fusão da invencão de Ex. 6 e » 2'0 Ex. ll comparado ao rhTRAIL114-281.
Fig. 18 apresenta as alterações de voIume do tumor (% de estágio inicia1) em camundongo Cby.Cg- foxn1(nu)/j sobrecarregado cQm câncer de pulmão A549 tratado com a proteína de fusão da inverição de Ex. 1 comparado com rhTRAIL114-281. Fig. 19 apresenta os valores de inibíção do crescimento do tumor (% tgi) em camundongo Cby.Cg- foxn1(nü)/'j sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratadas com a proteína de fusão da invenção de ex. 1 comparado com rhTRAIL114-281.
Fig. 20 apresenta mudanças de volume tumoral (i de estágio inícíal) em camundongo Crl:SHO-prkdc""idHrh" sobrecarregado com câncer de pulinão NCI-H460 tratado com a proteína de fusão da inVencão J de Ex. 6 compara,do com rhTRAIL114-281. Fig. 21 apresenta os valores de inibiçáo do crescímento do tumor (1 TGI) em camundongo Crl:SHo- 5 prkdc""idHrh" sobrecarregado com câncer de pulmão NCI-H460 tratado com a proteína de fusão da invençào de Ex. 6 comparado com rhTRAILI14-281. Fig. 22 apresenta alteracões no volume do tumor a
(% de estágio inicial) em camundongo cr1:SHO-prkdc"idHrh" sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratado cqiíi proteína de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 6, Ex. 11 comparado com rhTRAÍL114-281. Fig. 23 apresenta os valores de inibição do crescimento do tumor (% tgi) em camundongo Crl:SHO- prkdc""ídHrh" sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratado com a proteína de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 6, Ex. 11 comparado com rhTRAIL114-281. Fig. 24 apresenta alterações de volume tumoral (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO-prkdc'"idHrh' s.obrecarregado com câncer de pulmãô NCI-H46Q-Luc2 tratado com proteína de fusão da invenção de Ex-5 compa-rado coni rhTRAIL114-281. Fig. 25 apresenta os valores de inibição do erescímento do turnor (% TGI) em camundongo Crl:SHO- prkdc""idHrh" sobrecarregado com cãncer de puhnão NCI-H460- Luc2 tratado com proteína de fusão da invençào de Ex. 5 comparado com rhTRAIL114-281. Fig. 26 apresenta mudanças de volume tumoral (% de estãgio inicial) em camundongo Crl:SHO—prkdc'"idHrh" sobrecarregado com câncer de pulmâo A549 tratado com as proteínas de fusão da invenção de ex. 5, Ex. 1 e comparado com rhTRAILI14-281.
Fig. 27 a'presenta o's valores de inibicão do crescimento do tumor (% TGI) em camundongo crl:SHo- prkdc""idHr'" sobrecarregado com câncer de pulmão A549 tratado com as proteínas de Eusão da invencão de Ex.5, Ex.l a 5 e comparado com rhTRAILI14-281.
Fig. 28 apresenta mudanças de volume tumoral (% de estágio inicial) em camundongo Crl:SHO-prkdc'"ídHrh" sobrecarregado com câncer de figado PLC/PRF/5 tratado com as proteínas de fusão da invençáo de Ex. 6 e Ex. 11 em comparação com rhTRAIL114-281.
Fig. 29 apresenta os valores de inibição do creseimento do tumor (% TGI) em camundongo Cr1:SHO- prkdc""idHrh" sobrecarregado com câncer de fígado PLC/PRF/5 tratado com as proteínas de fusâo da invenção de Ex. 6 e Ex. 11 comparado com rhTRAIL114-281.
Fig. 30 apresenta alterações no volume do tumor (% de estágio inícial) em camundongo crl:s,Ho-prkdc"'i"Hrh" sobrecarregado com câncer de fígado HepG'2 tratado com as proteínas de fusão da invenção do Ex. 6 e EX.19 comparado com rhTRAIL114-281 Fig. 31 apresenta os valores de inibição do crescímento do tumor (% TGI) em eamundongo CEL:SHO- prkdc'"idHrh" sobrecarregado com câricer de fígado com HepG2 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex.19 comparado com rhTRAIL114-281.
Fig. 32 apresenta inudanças de volume tumoral (% de estágiQ inicial) em camundongo Crl:SHO-prkdc""i'Hrh" sobrecarregado com câncer de pânereas PANC-I tratado com proteína de fusão da invenção de Ex. 11 comparado com rhTRAIL114-281.
Fig. 33 apresenta os valores de inibição do crescímento do tumor (% tgi) em camundongo Crl:SHO- prkdc'"idHrh" sobrecarregado eom câncer de pâncreas PANC-I tratado com prateína de fusão da 'in'vènção de Ex. 11 comparado com rhTRAIL114-281. Fig. 34 apresenta mudanças de volume tumoral (% de estágia inicíal) em camundongo Crl:SHO-prkdc""idHrh" 5 sobrecarregado com sarcoma uterino humano resistente aos múltiplos medicamentos MES-SA/DX5 tratado com as proteínas de fusão da i-nvenção de EX, 6 e Ex. 19 comparado com rhTRAILl14-281. Fig. 35 apresenta os valores de inibicão D do crescímento do tumor (% t'gi) em camundongo CrI:SHO- prkdc""idHrh" sobrecarregado com sarcoma uteríno humano resistente aos múltiplos medicamentos MES-SA/Dx5 tratado com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 19 comparado com rhTRAIL1l4-28l.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção refere-se a uma proteína de Eusão compreendendo: - domínío (a), o qual é q fragmento fú'nc'ional de uma sequêneia de proteína solúvel hTRAIL, a qual o fragmento que começa com um aminoácído em uma posição não inferior a hMIL95 ou um homólogo do referido fragmento fúncional tendo pelo menos 70% de identídade d'e sequência, e - domínio (b) que é unia sequência de um peptídeo
2.5 efetor antiangiogêníco, em que a sequência do domínio (b) estã ligado ao terminal-C e/ou N-terminal do domínio (a); com a condicão de que as proteínas de fusão são 0 excluídas onde o peptídeo efetor é selecionado a partir do grupo consistindo em calreticulina, tumstatina 183-230, 3"0 cininogênio D5, vasostatina, cininostatina e canstatina.
O termo "o fragmento solúvel funcional de uma sequência de hTRAIL solúvel" deve ser entendido como denotando qualquer fragmento do hTRAIL solúvel que é capaz de induzir sinal de apoptose eín células de mamífero po'r lígação aos seus receptores na superfícíe das células.
Será também apreciado por um perito ve.rsado na técnica que a existência de pelo menos 70% de homologia da 5 sequência de TRAIL é conhecida na técníca. Deve ser entendido que o domínio (b) do peptídeo efetor n-a proteína de fusão da ínvenção não é nem a proteína hTRAIL nem uma parte ou fragmento da proteína hTRAIL. O termo "peptídeo" ein conformidade com a invenção deve ser entendido como construçã.o da molécula a partir de uma pluralidade de a'minoácidos ligados juntos por meio de uma ligação peptídica. Ássini, o termo "peptídeo" de acordo com a invenção inelui polipeptídeos, oligopeptídeos e proteínas.
Na presente invenção, as sequências de aminoácidos de peptídeo serão apresentadas de uma maneira convencional- adotada na técnica na direção do N-terminal (N-extremidade) do peptídeo em direçâo ao seu C-termínal (C-extreInidade)* Qualquer sequência terá, assirn, o seu n- terminal na lateral esquerda e o C-terminal na lateral direita da sua apresentação Iinear. a proteina de fusão da invencão incorpora pelo a menos um domínio (b) do peptídeo efetor, ligado ao C- terminal ou N-terminal do domínio (a). Em uma modalidade particular, o domínio (a) é um fragmento de se'quência hTRAIL, começando com um aminoácido a partir da faixa de hTRAIL95 até hTRAIL121, inclusive, e que termina com o aminoácido hTRAIL 281. Em particuíar, o domínio (a) pode ser selecionado a partir do grupo consisti-ndo em sequências correspondentes a hTRAIL95-281, hTRAILI19-281, hTRAIL120-281 e hTRAIL121-
281. Será evidente para os peEitos na técnica que hTRAIL95-
281, 'hTRAIL119-281, hTRAIL12'0-281 e hTRAIL121-281 representam um fragmento da proteína TRAIL humana iniciado com aminoácidos marcados com o número 95, 119, 120 e 121, respectivamente, na sequência eonhecida do hTRAIL (SEQ No 5 16), publicada no GenBank sob No. de Acesso P50591. Em outra modalidade particular, o domínio m é um homólogo de um fragmento funcional de sequência de proteína hTRAIL solúvel iniciando na posição de aminoâcido não inferior a hTRAIL95 e terminando no aminoácido ÍURAIL281, a sequência dos quais é pelo menos euí 70€, de preferência em 85%, idêntica à sequência original.
Em variantes específícas desta modalidade, o domínio (a) é um homóíogo de um fragmento seleeionado a partir do grupo consistindo em sequências correspondentes a hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL116-281, hTRAIL120-281, hTRAIL122-281. Deve entender-se que um homólogo de um fragmento de hTRAIL é uina variação/alteração da sequência de aminoácidos desse fragmento, em que pelo menos um amínoácido é modíficado, incluindo 1 aminoácido, 2 aminoácidos, 3 aminoácidos, 4 aminoácidos, 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, e não mais do que 15% de aminoácídos, e em que um fragmento da sequência modificada tem a funcíonalidade preservada da sequência hTRAIL, ou seja, a capacidade de
2.5 ligar aos receptores de morte da superfície celular e induzir a apoptose em células de mamíferos. A modificação da sequência de aminoácidos pode incluir, por exemplo, substituição, eliminação e/ou adição de amínoácidos. preferencialmente, o homólogo do fragmento de hTRAIL possuindo uma sequência mod,ificada mostra uma afinidade modificada para os receptores de morte DR4 (TRAIL-RI) ou DR5 (TRAIL-R2), em comparação com o fragmento nativo de hTRAIL.
O termo "afinidade modificada" refere-se a um'a afinidade aumentada e/ou uma afinidade com a seletividade do receptor alterada.
preferencia1mente, o homólogo do fragmento de 5 hTRAII, possuindo a sequência modificada mostra afinidade aumentada para os receptores de morte DR4 e DR5 comparado ao fragmento do hTRAIL natívo. partÁcularmente, preferencialmente, o homólogo de um fragmento hTRAIL possuindo a sequência modificada mostra lO afinid-ade aumentada para o receptor de morte DR5, ein comparação com o receptor de morte DR4, ou seja, uma seletivídade aumentada de DR5/DR4.
Também, púe.fere.ncíalmente, o homólogo de um fragmento de hTRAIL possuindo a sequência modificado mostra um aumento da seletividade na direção de receptores de morte DR4 e/ou DR5 em re-lação à afinidade para os receptores de DRI (TRAIL-R3) e/ou DR2 (TRAIL-R4). Modíficações de 'hTRAIL resultando em afinidade e/ou seletividade aumentada ria direção aos receptores de morte DR4 e DR5 são conhecidas pelos peritos versados na técnica, por exemplo a partir da publicação Tür V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. Variantes (TRAIL) de ligarrte DR4 de indução de apoptose reíacionadas ao fator de necrose tumoral obtidas pelo projeto baseado em estrutura. j. Biol. Chem. 2008 jul 18, 2'83(29):20560-8, que descreve a mutação D218H tendo seletividade aumentada para DR4, ou Gasparian ME, Chernyak BV, Do1gikh DA, Yagolovich AV, popova PT, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Geração de novos mutantes 3'0 TRAIL DR5-A e DR5-B com seletivídade aumentada ao receptor de morte 5, Apoptose. 2009 jun;14(6):778-87, que descreve a mutaçâo D269H tendo uma afinidade reduzída em direção ao DR4. Mutantes hTRAIL resultando em afinidade aumentada em
18/1,02 díreçàQ a um receptor selec·ionado a partir do DR4 e DR5 em comparação com receptores de DRI e DR2 e afinidade aumentada em direção ao receptor de DR5 cornparando com DR4 são também descritos em WO2009077857 e WO2009066174. 5 As mutações adequadas são uma ou inais mutações nas posições de hTRAL nativa selecionadas a partir do grupo consistindo em 131, 149, 159, 193, 199, 201, 204, 204, 212, 215, 218 e 251, em particular, as mutações que envolvem a substituição de um aminoácído com um aminoácido básico tal como lisina, arginina ou histidina, ou aminoácidos, tais como ácido glutãmíco ou ácido aspárgico. Particularmente, uma ou mais mutações selecionadas a partir do grupo que consiste em G131R, G131K, R149Í, Rl49M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201H, K20ÍR, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251D, K251E e K251Q, como descritas em WO2009066174, podem ser especificadas.
As mutações adequadas sáo também uma gu mais mutações nas posições de hTRAL nativa selecionadas a partir do grupo consistindo eni 195, 269 e 214, em particular, as mutacões que envolvem a substituição de um aminoácido com » um aminoácido bãsico tal como lisina, arginína ou hístidina. Particularmente, pode ser especificada uma ou mais mutações selecíonadas do grupo consistindo em D269H, E195R, e T214R, tal como descritas em WO2009077857, podem ser especificadas. Em uma inodalidade particular, o dominio (a) que é um homõlogo do fragmento de hTRAIL é selecionado a partir do mutante D218H da sequência TRAIL nativa, tal como descrito em WO2009066174, ou o mutante Y189N-R191K-Q193R- H264R-I266R-D269H àa sequência TRAIL nativa, tal como descrito em Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA,
Kirpí'ehnikov MP. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 jun; 14(6):778-87.
O domínia (b) pode ser, em particular,
5. selecíonado a partir do seguinte grupo: - inibidores de receptores de fatores de crescimento selecionados a partir de receptores para VEGF, PDGF e EGF; - tumstatína ou seus fragmentos, exceto o Eragmento 183-230, e - inibidores de N-aminopeptidase (CDl3).
Dentro do grupo de inibídores de receptores de fatores de crescimento, o peptídeo efetor de domínio (b) pode ser uírt fragmento de fa.tor de crescimento endotelial vascular VEGF humano que se líga aQ receptor VEGF competitivamente ao ligant:e natural, apesar de estar destituído em si de atívidade angiogêníca. Como uma consequência, a atividade angiogênica do VEGF é bloqueada, não hã estimulação da formacão de novos vasos de sangue e o
U crescimento do tumor é inibido. Em particular, o peptídeo efetor do grupo acima é o peptídeo que inibe a via de sinal do VEGF e, especificamente, o fragmento de 7-aminoácido de VEGF humano apresentada pela SEQ. No. 17 na Listagem de Sequências anexa. Acredita-se que o peptídeo compreendendo a sequência de heptapeptídeo VEGF incorporada a proteína de fúsãcj da invencão elimine eficazmente as células cancerosas a através da inibição do processo de angiogênese. Também dentro do gru'po de ínibídores de receptores para fatores de crescimento, o peptídeo efetor de domínio (b) pode ser um fragmento do Fator de Crescimento Derivado da Plaqueta PDGF, o qual se liga ao receptor PDGF competítivamente ao ligante natural apesar de estar destituído em si de atividade ãngiogênica. como uma consequéncia, a atividade angiogêníca de PDGF é bl-oqueada, não há estimulação da formação de novos vasos de sangue e o crescimento do tumor é ínibído. 5 Em particular, tal peptídeo efetor é um peptídeo de 19-aminoácido - um fragmento do ligante PDGF, mostrado por uma sequência de SEQ. Nq. 22 na Listagem de Sequências anexa. Acredita-se que o peptídeo compreendendo a sequência de um fragmento da proteína PDGF Fator de Crescimento Derivado da Plaqueta incorporada na proteína de fusáo da invenção elimina efícazmente as células de câncer através de inibição do processo de angiogênese. Também dentro do grupo de inibidores de receptores de fatores de crescimento, o pep'tídeo efetor antiangíQgênico de domínio (b) pode ser um fragmento de peptídeo de egf Fator de Crescimento Epidérmico, o qual se liga ao receptor de EGF competitívamente ao ligante ríatural, apesar de estar destituído em si de atividade angiogênica. Como consequência, a atividade angiogênica do EGF é bloqueada, não há estímulação da formação de novos vasos de sangue e o crescimento do tumor é iníbído. Esses peptídeos de bj-oqueio Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu e Gly Leu Arg Ser Leu Arg GIu capazes de se Iigar ao recepto.r EGF sem
2.5 ativação da quínase intracelular e bloquear a atividade EGR são conhecidos, por exemplo, a partir de EP0641358. Em particular, tal peptídeo efetor- um fragmento de Iigante de EGF, é representado por urria sequêncía de SEQ. No. 23 na Lístagem de Sequência anexa. .30 Acredita-se que o peptídeo compreendendo a sequência de Fator de Crescimento Èpidérmico EGF incorporado na proteína de fusão da invenção el-imine e'ficazmente as células cancerosas através da inibição do processo de angíogênese. Dentro do grupo de tumstatina e seus fragmentos de peptídeo efetor de domínio (b) pode ser um fragmento de 5 25-aminoácido da pmteína de tumstatina (fragmento I), mostrada pela sequência de SEQ. No. 18 na Listagem de Sequência anexa. O peptídeo efetor do grupo apresentado acima é também outro fragmento de 18-aminoácidos da proteína tumstatína (fragmento ii), ilustrada por uma sequência de SEQ. No. 19 na Listagem de Sequència anexa. O peptídeo efetor antiangiogênico de domínio (b) pode ser também uma combinaçâo de fragmentos peptídicos de tumstatina, em particular, o fragmento e o fragmento II, .localizado próximo ao outro, em qualquer ordem. Em uma modalidade, o domínio (b) é uma combinação de fragmentos Ilfragmento II (SEQ. No 18/SEQ. No 19) ou uma co@inação de f'ragmento Il/fragmento I (SEQ. No 19/SEQ. No 18).
Acredita-se que o peptídeo compreendendo a sequência do fragmento de proteína tumstatina I e/ou II incorporada na proteína de fu.são da. invenção elimíne efícazmente as células cancerosas através da iníbíção do processo de angiogênese. O grupo dos ínibidores da N-aminopeptÍdase/CD13, que se liga eom enzima N-aminopeptidase/CDl3 para inibir a
2.5 sua atividade inclui pequenos pe'ptídeos, contendo mativos de NGR ou RGD. Os peptídeos incluindo motívos NGR que se ligam eficientemente a N-aminopeptidase são descritos, por exemplo, por Arap et al., Scíence, 279:377-380, 1998. No domínio extracelular de N-ami'nopeptidase, um fragmento apresentando afinidade para o motivo RGD também está presente. Ambos os motivos (RGD e NGR) ligam como antagonistas COKl fatores envolvidos nci processo da neovaseularízação.
Portanto, é provável que o motivo RGD semelhante ao motivo NGR ligue-se com a N-amínopeptidase e, consequentemente, atue ccjjno seu inibidor (Friedlander et al.
Definition of twQ angiogenic pathways by distinct av 5 integrings.
Seience (Washington DC), 270: 1500-1502, 1995; Pasqualini et al.
Aminopeptidase N is a receptor for tumor- homíng peptides and a target for inhibiting angiogenesis.
Cancer Res. 2000 Feb 1; 60(3) :722-7). Dentro do grupo dos inibidores da N- lO aminopeptidase/CD13, o peptídeo de efetor antiangiogênico de domínio (b) pode ser um peptídeo de 5-amínoácído ligando-se ao CD13 mostrado pela SEQ.
No. 20 na Listagem de Sequêncía anexa.
Outro peptídeo efetor deste grupo é também o peptídeo de 9-aminoácidos ligando-se ao CD13, mostrado pela SEQ.
No. 21 na Listagem de Seqúência anexa.
Acredita-se que o peptídeo compreendendo a sequência do fragmento de proteína de lígaçãQ com N- aminopeptida'se/CD13 incorporado na proteíria de fusão da invenção elimine eficazmente as células cancerosas através da inibição do processo de angiogênese.
As proteínas de fusão da invenção podem compreender rnais do que um peptídeQ efetor do dominio (b)t em partícular, doís ou três domíníos de (b)- Em uma modalidade, a proteína de fusão da presente invenção contém dois domínios (b) efetores semelhantes ou diferentes, selecionados a partir de Seq.
No. 17, SEQ.
No. 18, SEQ.
No. 19, SEQ.
NO.20, SEQ.
No.2l, SEQ.
No.22 e SEQ.
No.23, ein que os dcmínios (b) efetores estão localizados próxímos um do outro.
Em outra mocÍalídade, a proteína de fusão da p'res-ente invencão contém dois domínios (b) efetores semelhantes ou a diferentes, selecionados a partir de SEQ.
No. 17, SEQ.
No. 18, SEQ.
No. 19, SEQ.
NO.20, SEQ.
NO.21, SEQ.
NO.22 e SEQ.
No.23, em que os dcmínios (b) efetores estâo localizados na região N-terminal e/ou C-terminal do do[nínío (a)· Em uma modalidade particular, a proteína de fusão da presente invenção compree.nde três domínios efetores. 5 Como um exemplo, a proteína de fusão compreende o peptídeo derivado a partir de VEGF (SEQ.
No. 17), localizado na extremidade N-terminal do domínío (a) e na extremidade C-terminal do domínio (a) localizado prÓximQ um do outro fragmento I de tuínstatína (SEQ.
No. 18) e fragmento II da tumstatina (SEQ.
No. 19). Em modalidades específicas da proteína de fusão da invenção, q peptídeo efetor é um peptídeo tendo uma atividade antiangiogênica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ.
No. 17 (heptapeptídeo derivado de vegf), SEQ.
No. 18 (um fragmento [ (aminoácidos 74-98) da proteína de tumstatina), SEQ.
No. 19 (um fragmento II (aminQácidos 197-214) da proteína de tumstatina), SEQ.
No. 20 (iim peptÍdeo de ligação a CD13), SEQ.
No. 21 µim peptídeo de ligação a CD13), SEQ.
No. 22 (um fragmento de PDGF) e SEQ.
No. 23 (urn fragmento de EGF). Após Iigar aos receptores TRAIL presentes na superfície das células cancerosas, a proteína de fusão exercerá um efeito duplo.
Domínio (a), que é um fragmento funcional de TRAIL ou seú homólogo com funcionalidade preservada, exercerá a sua atividade agonistica conhecida - ou seja, a ligação aos receptores de morte na superfícíe das céluLas e a ativaçào da via extrínseca da apoptose.
Após internalização da proteina de fusão compreendendo o peptídeo antiangiogênico, q domínio (b) será capaz de exereer a sua açâo potencialmente intracelularmente em paralelo com a atividade do domínio de TRAIL.
Deste modo, a atívidade an'ticancerígena de TRAIL pode ser potencializada pela ativação de outros elementos e mecanismos, tais como a inibição estérica do sítio de ligação do VEGF natur'al, PDGF e ligantes de EGF, a inibíção da angíogênese e neovascularização, a inibícão D da ativação de fosfatidílinosito1-3-quinase, proteína quinase B (PKB/Akt) 5 ou estimulaç'ão indireta da super-expressão de TRAIL por quinase via Akt e NFk.
Em uma das modalidades da invenção, o domínío (a) e o domínio (b) estào ligados por pelo menos um domínio (c)
que compreende a sequência de um sítio de cIivagem reconhecido por proteases presentes no ambiente celular, especialmente, no ambiente de célula tumoral. a Iigação do dcsmínio (â) com o domínio (b), em pelo menos um dominio (c) significa que entre ds dominios de (a) e (b) mais do que um domínio (c) podem estar presentes, eni particular, um ou doís domínios (c)¶ Um sítio de cIivageni de protease pode ser selecionado a partir de: - Uma sequência reconhecida pela metaloprotease d'e mmp, em particular (pro Leu Gly Leu Ala Gly GIu Pro/PLgLAGÊP) desígnada como SEQ.
No. 24, ou (Pro Leu gly Ile Al-a giy Glu/PLGIAgE) designado como SEQ.
No. 55, ou (pro' Leu Gly Le'ü Àia Gly Glupro/pLGLAGEp) desígnada como SEQ.
No- 56,
- uma sequência reconhecida pela uroquinase de uPA, em particular, Arg Val Val Arg (RVVR na convenção de uma letra) designada como SEQ.
No. 25 ou um fragmerrto da mesma, que com o últímo aminoácido da sequência, ao qual está ligado, forma SEQ.
No. 25, e suas combinações.
Em uma das modalidades da invenção, o sítio de cIivagem da protease é uina combínação da sequência reconhecída pela metaloprotease de MMP e uma sequência reconhecida pela uroquinase upA, localizada próximo um do outro, em qualquer ordem. Em uma modalidade, o domínio (C) é uma combinaçáo de MMP/upA SEQ. No. 24/SEQ. No. 25 ou uma combinação de 5 úpA/MMp SEQ. No. 25/SEQ. No. 24.
Em outra modalidade, o domínio (c) é uma combinação de MMP/upA SEQ. No. 55/SEQ. No. 25 ou uma combinação de uPA/ MMP SEQ. Nq. 25/SEQ. No. 55.
Em Qutra modalidade, o domínio (C) é uma combinação de MMP/úPA SEQ. No. 56/SEQ. No. 25 ou uma eombinação de upA/MMp SEQ. No. 25/SEQ. No. 56.
As proteases metaloproteases MMP e uroquinases upA são super-expressas no ambiente tumoral. A presença da sequência reconheeida pela protease permite a clivagem do domínio (â) a partir do domínío (b), ísto é, a liberacão do » domí'nio (b) funcional e, assim, a sua ativação.
A presença do sítio de cIivagem da protease, permitindo a liberação rápída do peptídeo efetor, aumenta as possibilidades de transportar o peptíd'eo para o local da sua ação antes que a degradação aleatõria da proteína de fusào por proteases preserütes na célula ocorra. Além dos principais eíementos funcionais da proteína de fusáo, o(S) domínio(s) do sítio de clívagem, as proteínas de fusão da invenção podem conter uma sequência neutra/sequências de um Iigarrte glicina-cisteína-alanina estéríco flexível (espaçador). Estes ligantes/espaçadores são bem conhecidos e descritos na Iiteratura. Sua incorporação dentro da sequência da proteína de fusão destina—se a fornecer a dobragem correta de proteínas produzidas pelo processo da sua super-expressão nas células hospedeiras. Em particular, o Iigante estéríco flexível pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ. No.
26 e SEQ.
No. 27, os quais são combinações de resíduos de glicina, de cisteína e de alanina.
Em otrtra modalidade, o ligante estérico flexível pode ser selecionado a partir do grupo que eonsiste em SEQ.
No. 28, SEQ.
No. 29, SEQ.
No. 30 5 e SEQ.
No. 54, que consiste em resíduos de glicina e serina.
Adicionalmente, o ligante estéríco flexível pode ser qualquer fragmento da SEQ.
No. 28, SEQ.
No. 29, SEQ.
No. 30 e SEQ.
No. 54, atuando como um agente de ligação estérico flexível, por exemplo, um fragmento Gly Gly Gly/GGG ou um fragmento gIy gly/gg.
Em uma modalidade, o Iigante estérico flexível também pode ser selecíonado a partir de resíduo único de aminoácido, tal como resíduo único de ãcido glutâmíco, cisteína, serina, prolina ou resíduo de glicina.
Em outra modalídade, o Ligante estérico flexívèl pode ser qualquer combinação de Iigantes consistindo em SEQ.
No. 26, SEQ.
No. 27, SEQ.
No. 28, SEQ.
No. 29, SEQ.
No. 30, SEQ.
No. 54 e resíduos de aminoácido5 únicos de resíduos de ácido gíutàmico, cisteína, serína, prolina ou glicina.
Modalidades particulares 'da proteína da fusão da presente invenção são proteínas de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ.
No. 1, SEQ.
No. 2, SEQ.
No. 4, SEQ.
No. 5, SEQ.
No. 6 e SEQ.
No. 46, SEQ.
No. 47 e SEQ.
No. 48, compreendendo um peptídeo efetor como um heptapeptídeo derivado de VEGF.
Outra modalídade específica da pro'teína de fusão da invenção é a proteína de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico seleeionado a partir do grupo consistindo 'nas proteínas representadas por SEQ.
No. 7 e SEQ.
No. 8,
que compreende as sequências peptídícas efetoras que se ligam ao CD13.
Outra mdalidade específica da proteina de fusão da invenção é a proteína de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ.
No. 9, SEQ.
No. 10, 5 SEQ.
No. 11 e SEQ.
No. 49 compreendendo um peptídeo efetor como um fragmento de pdgf.
Outra modalidade específica da proteína de fusão da invenção é a proteína de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênico selecionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ.
No. 12 e SEQ.
Nq. 13, compreendendo como uma tumstatína de peptídeo efetor e fragmentos II.
Outra modalidade específica 'da pr'oteína de fusão da invenção é a proteína de fusão compreendendo uni peptídeo antiangiogênico seleeionado a partir do grupo consistindo nas proteínas representadas por SEQ.
No. 14 e SEQ.
No. 15, compreendendo um peptídeo efetor como um fragmento de EGF.
Modalidades particulares da proteína de fusáo da presente invenção são p'roteínas de fusão compreendendo um peptídeo antiangiogênicci selecíonado a partir do grupo consistíndo nas proteínas representadas SEQ.
No. 3, compreendendo como um peptídeo efetor um heptapeptídeo derivado de vegf, o fragm,e)nto I de peptídeo de tumstatína e f.ragmento II de peptídeo de tumastina.
Uma descríção detalhada da estrutura das proteínas de fiusão representativas acima mencionadas são mostradas nas Figuras 1 a 3 e na Fig. 9, e nos Exemplos a"qui apresentados abaixo.
De acordo com a presente invencáo, a por proteína de fusão, entende-se uma única molécula de proteína que contém duas ou mais proteínas ou seus fragmentos, ligadas covalentemente através da Iigação peptídica nas respectivas cadeias peptídicas, sem ligantes químicos adicionais.
m A pr'oteína de fusão também pode ser alternativamente descrita como um construto de proteína o"u uma proteína quimérica. De acordo com a presente invenção, os termos "construto" ou "proteína quimérica", se 5 utilizado, deve ser entendido como se referindci à proteína de fusão, tal como definído acima.
para uma pessoa versada na técnica será evidente que a proteína de fusáo assim definida pode ser sintetizada por métodos conhecidos de síntese química de peptídeos e lO proteínas. A proteína de fusão pode ser sintetizada por métodos de síntese química de peptídeo, especiahnente utilizando as técnicas de síntese de pep'tídeo em fase sólída, utilizando resinas adequadas como veículos. TaÍs 15 técnicas são convencionais e conhecidas na técnica, e descrítas, inter alia, nas monografias, tais como, por exemplo, Bodanszky e Bodanszky, The Praetice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Píerce 20 Chemical CQmpany. A prcrteína de fusào pode ser sintetízada pelos métodos de síntese química de peptídeo como uma prateína contínua. Àlternativamente, os fragmentos índividuais (domínios) da proteína podem ser sintetizados separadamente 25 e depois combínados juntos no peptídeo contínuo através de uma Iigação peptídica, por condensação do amino terminal de um fragmento de peptídeo a partir do termínal de carboxila do segundo peptídeo. Tais técnicas são convencionais e bem conhecidas. 30 Para a verifícaçâo da estrutura do peptídeo resultante, métodos conhecídos da análise da composição de aminoácidos dos peptídeos podem ser utilizados, tais como a técnica de espectrometria de massa de aíta resolução para determinar o peso molecular do peptídeci. Para confirmar a sequência do peptídeo, sequenciadores de proteínas também podem ser usados, os quais degradam sequeneialmente o peptídeo e identifícam a sequência de amínoácidos. 5 De preferência, no entanto, a proteina de fusão da invenção é uma proteína recombinante gerada por métodos de expressão de genes de uma sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão em células hospedeiras.
Um aspecto adicíonal da invenção é a sequéncía de polinucleotídeo, em particular, a sequência de DNA que codifica uma proteína de fusão, ta.l como definido acima.
De preferéncia, a sequêncía de polinucleotídeo, em particula-r, de DNA, de acordo com a ínvençâo, que codifica a proteína de fusáo, tal como definido acima, é uma sequência otimizada para a expressão em E. col-i.
Outro aspecto da invenção é também um vetor de expressão contendo a sequência de polinucleotídeos, em particular, a sequência de DNA da invenção, como definida acíma. Outro aspecto da invenção é também uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão como definido acima.
Uma célula hospedeira preferencial para a expressão de proteínas de fusão da invenção é uma célula E. coli. Métodos para a geraçáo de proteínas recombinantes, incluindo as proteínas de fusão, são bem conheeidos. Em resumo, esta técnica consíste na geração 'da molécula de poIinucleotídeo, por exemplo, a molécula de DNA que codifica a sequêncía de aIninoácidQs da proteína alvo e direciona a expressão da proteína alvo no hospedeiro. Em seguída, a. proteína alvo que codifica a molécula de poIinucleotídeo é incorporada num vetor de expressão adequado, o que garante uma expressão eficaz do polipeptídeo. Vetor de expressão recombinante é então introduzido nas células hospedeiras para a transfecção/transform'ação, e, como resultado, uma célula 5 hospedeira transformada é produzida. Isto é seguido por uma cultura de células transformadas para super-expressar a proteína alvo, a purificação de proteínas obtidas e, opcionalmente, cortar por clivagem as sequências marcadoras utilizadas para a expressâo ou a purificação da proteína. 10 As técnicas adequadas de expressão e purificação são descritas, pQr exemplo, na monografia Goeddel, Gene Expressíon Tecno1ogy, Methods in Enzymology 185, Academic press, San Diego, CA (1990), e A. Staron et al., Advances Míkrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995. 15 Cosmídeos, plasmídeos ou vírus modifícados podem ser utilizados como vetores de expressão para a introduçâo e replicaçào das sequências de DNA em células hospedeiras. Tipicamente, os plasmídeos são usados coma vetores de e'xpressão. Plasmídeos adequados são bem conhecidos e estão 20 dísponíveis comercialmente.
O vetor de expressão da invençâo compreende uma molécula de polínucleotídeo que codifica a proteína de fusào da presente invenção e as sequências reguladoras ( necessárias para a transcrição e tradução da sequência de 25 codíficação incorporadas numa célula hospedeíra adequada. A seleção das sequências reguladoras é dependente do tipo de células hospedeiras e pode ser faciímente realizada por um perito versado na técnica. Exemplos de tais sequências reguladoras sáo promotores de transcrição e intensificador 30 ou sequência de Iigação da poIimerase de RNA, sequência de Iigação ao ribossoína, contendo o sinal de iníciaçâo de transcrição, íntroduzidD antes da sequência de codificação, e uma sequência finalizadora de transcrição, introduzida depois da sequência d'e codifieação.
Além disso, dependendo da célula hospedeira e o vetor utilizada, outras sequências podem ser introduzidas no vetor de expressão, tal como a origem de replicação, sítíos de restrição adicionais de 5 DNA, intensificadQres, e sequências que perm.iteni a indução de transcrição.
O vetor de expressão também compreenderá uma sequência de gene marcador, que confere o fenótípo definido para a célula transformada e permite uma seleçãD específíca 10 de células transformadas.
Além disso, o vetor pode também conter uma segunda sequência de marcador que perrnite distinguir as células transformadas com o plasmídeo recombinante contendo a sequênciâ de codificação inserída da proteína alvo a partír daqueles recolheu até o pIasmídeo 15 sem a inserção.
Mais frequentemente, os marcadores de r.esistência a antibióti.cos típicos são utilizados, no entanto, quaisquer outros genes .repórter'es conhecidos no campo podem ser utilizados, cuja presença em uma cêlula (in vivo) pode ser facilmente determínados utilizando técnicas 20 de autoradiografia, espectrofotometria ou bioluminescência e quimoluminescência. por exemplo, dependendo da célula hospedeira, os genes repórteres, tais como [3-galactosídase,
« [kglucuronidase, luciferase, cloranfenicol acetiltransferase ou a proteína verde fluorescente podem 25 ser utilizados.
Além disso, a vetor de expressão pode conter sequência de sinal, transportar as proteínas para o compartimento celular apropriado, por exemplo, periplasma, onde a dobragem é facilitada.
Além disso, uma sequência que 30 codifica uma etiqueta/marca, tal como HisTag anexada ao N- terminal ou GST anexado ao C-terminal, pode estar presente,
que facilita a purifieação subsequente da proteína produzída utilizando o princípio da afinídade, através da cromatografia de afinidade em uma coluna de níquel. Sequências adicionaís que protegem a proteína contra a degradação proteolítica nas células hospedeiras, bem como as sequências que aumentam a sua solubilídade também podem 5 estar presentes.
Elemento auxilíar liga.do à sequência da proteína alvo pode bloquear a sua atividade, ou ser prejudicíal por outro motivo, tal como, por exemplo, devido à toxicídade. Tal elemento deve ser removído, o que pode ser conseguido 10 por cl-ivagem enzimática cjú químiea. Em particular, uma etiqueta HisTag de seis histidína ou outros mareadores desse tipo anexado para permitir a purificação da proteína por crornatografia de afinidade deve ser removida, por causa de seu efeito descrito na toxicidade para o fígad.o. de 15 proteína trail solúvel. Podem ser utilizados sistemas d'e expressão heterólogos baseados em váriãs células hQspedeiras bem conhecidas, inclui.ndo as células procarióticas: infecções bacterianas·, tais eomo.Escherichia csoIi ou Bacillus subtilis, levedüras, tais como 20 Saccharomyces cerevisiae ou pichia pastoris, e línhas de células eucarióticas (insetos, mamíferos, ,pl,antas).
De preferência, devido à facilidade de cultivo e 7 manípulação genética, e uma grande quantidade de produto - obtido, o sistema de expressâo de E. coli é utilizado. Por 25 conseguinte, a sequência de polínucleotídeo que contém a sequência alvo que codifica a proteína de fusão da ínvenção otimizará para expressão em E. coli, ou seja, que irá conter os códons na sequência de codificação ótímos para expressão em E. coli, selecionados a partír das possíveis 30 variantes de sequências conhecidas no estado da técnica. Além disso, o vetor de expressão conterá os elementos acima descritos adequados para Ê. coli ligado à sequência de codificação.
por conseguinte, em uma modalidade preferida da invenção, uma sequência de polinucleotideo compreendendo uma sequência que codifica uma proteína de fusão da invencão, a otimizada para a expressão em E. coli é 5 selecionada a partir do grupo de sequências polinucleotídicas constituídas por: SEQ. No. 31; SEQ. No. 32; SEQ. No. 33, SEQ. No. 34; SEQ. No. 35; SEQ. No. 36; SEQ. No. 37; SEQ. No. 38; S'EQ. No. 39; SEQ. No. 40; SEQ. No. 41, SEQ. No. 42; SEQ. 10 NO. 43, SEQ. No. 44; SEQ. No. 45, SEQ. No. 50, SEQ. No. 51, SEQ. No. 52; SEQ. No. 53, as quais codificam uma proteína de fusão possuindo uma sequência de aminoãcido's correspondente às sequênc:Ías de aminoácidos seleeíonadas a partir do grupo consistindo em sequências de aminoácidos, 15 respectivamente: SEQ. No. 1; SEQ. No. 2; SEQ. No. 3; SEQ. No. 4; SEQ. No. 5; SEQ. No. 6; SEQ. No. 7; SEQ. No. 8; SEQ. No. 9; SEQ. No. 10; SEQ. No. 11, SEQ. No. 12, SEQ. No. 13; SEQ. No. 14 SEQ. No. 15, SEQ. No. 46; SEQ. No. 47; SEQ. No. 48; 20 e SEQ. No. 49.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporcíona também um vetor de expressão adequado para a \ + transformação de E. coli, compreendendo a sequência polinucleotídica selecionada a partir do grupo de m 25 sequências polinucleotídica SEQ. No. 31 a SEQ. No. 45 e SEQ. Nq. 50 a SEQ. No. 53 acima indicada, assím como a célula de E. coli transform.ad.a com tal vetor de expressão.
A transformação, isto é, a introdução de uma sequêneia de DNA em células hospedeiras bacterianas, 30 particularmente, E. coli, é norinalmente realizada sobre as células competentes preparadas para recolher o DNA, por exemplo, por tratamento com íons de cáleio a baixa temperatura (4°'C), e submetendo, posteriormente, a choque
3.4/102 de calor (em 37-42"C) csu por eletroporação. Tais técnicas são bem conhecidas e são, geralmente, determinadas pelo fabricante do sístema de expressão ou estão descritas na Iiteratura e manuais para o trabalho de laboratório, tai,s 5 como Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982). O procedimento de super-expressão de proteínas d'e fusão da invenção em sistema de expressão de E. coli será ainda descrito abaixo. 10 A invenção também proporcíona uma composição farmacêutica contendo a proteína de fusão da invenção, tal como definida acima eomo um princípio ativo e um veículo farmaceuticamente aceitável adequadot diluentes e componentes auxiliares convencíonais. A composição 15 farmacêutica conterá uma quantidade eficaz da proteína de fusão da invenção e componentes auxiliares farmaceuticamente aceitãveis, dissolvidos ou dispersos em um veículo ou diluente, e de preferência estarã na forrria de uma composição farinacêutica formulada em uma forma de 20 dosagem unitária ou'uma farmulação contendo uma pluralidade de doses. As formas fiarmacêuticas e os métodos para a sua formulação, assim como outros componentes, veículos e diluentes são conhecidos dos peritos versados na técnica e .
n descritos na literatura. Por exemplo, eles são descritos na 2·5 monografia em Remington's Pharmaceutical "ciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA. Os termos "veículo farmaceutícamente aceitável, diluente, e ingrediente auxiliar" compreendem quaisquer soIventes, meios de dispersão, agentes tensoativos, 30 antioxidantes, estabilízantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngícos), agentes ísotõnícos, conhecidos na técnica. a composíção farmacêutica da invenção pode conter díversos típos de veículos, diluentes e excipíentes, dependendo da via de admínistração escolhida e da forma de dosagem desejada, tais como as formas de líquidos, sólidos e aerossóis para administraçáo oral, parenteral, por inalação, tópica, e que 5 se selecionada a forma deve ser estéril, para a via de admínistração, tais como por injeção. a vía preferída de administraçào da composição farmacêutica de acordo com a invenção é parenteral, incluindo as vias de injeção, tais como adminístração intravenosa, íntramuscular, subcutânea,
1.0. intraperitoneal, intratuinoral, ou por infiusões intravenosas únicas ou contínuas.
Em uma modalidade, a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por injeçào dire'ta no tumor.
Em outra modalídade, a composição farmacêutica da invenção 15 pode ser administrada por via intravenosa. Ainda em outra modal-idade, a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por via subcutânea ou intraperitoneal. Uma composição farmacêutica para adminístração paren'teral pode ser uma sol-ução ou dispersão em meio aquoso ou não aquoso 20 farmaceuticamente aceitável, tamponada em um pH adequado e isosmótico com os fluidos corporais, se necessário, e também pode conter antioxidantes, tampões, agentes 7 « 'bacteriostáticos e substâncias solúveis, tornando a composicão J compatível com os teeidos ou sangue do 25 destinatário. outros componentes, os quais podem ser incluídos na composição são, por exemplo, água, alcoóis, tais como etanol, polióis, tais como glicerol, propiíeno glicol, polietileno glicol líquido, lipídios, tais como triglicerideos, óleos vegetais, lipossomas. A fluídez 30 apropriada e o tamanho de partículas da substância podem ser fornecidos por meio de substâncías de revestimento, tais como Iecitina, e agentes tensoativos, taís ccjmo poIissorbatos hidroxipropil celulose, e semelhantes.
Agentes isotõnicos adequados para as composições parenterais líquidas sào, por exemplo, açúcares, tais como glicose, e cloreto de sõdio, e suas combinações.
Alternativamente, a composição farmacêutica para 5 administração por injeção ou infusão pode estar na forma de pó, tal como um pó Iiofilizado para reconstítmíção imedíatamente anterior a utilizacão em um veículo apropriado, tal como, por exemplo, água estéril isenta de pirogênío. 10 A composição farmacêutíca da invenção para administração parenteral pode também ter a forma de administração nasal, incluindo soIuções, pulverizadores ou aerossóís. De preferência, a Eorma de adminístração intranasal será uma soluçào aquosa e será iscjtônica ou 15 tamponada ou mantendo o pH entre cerca de 5,5 a cerca de 6,5, de modo a manter um caráter semelhante as secreções nasais. Além disso, essa irá conter conservarrte ou estabilizante, tais como nas preparações intranasais bem cònhecidas. 20 a composíção pode conter vários antioxidantes, os quais atrasam a Qxicíacão de um ou mais compon.entes. Além a disso, a fím de evitar a ação de mícro—organismos, a f composição pode conter vários agentes antibacterianos e antifúngicos, incluindo, por exemplo, mas não limitado aos 25 parabenos, clorobutanol, himerosal, ácido sórbico, e substâricias semelhantes conhecidas deste tipo. Em geral, a composição farmacêutíca da invencão pode incluir, por
J exemplo, pelo menos cerca de 0,01% em peso de príncípio ativo. Mais particularmente, a composíção pode conter o 30 princípio ativo na quantidade de 1% a 75% em peso da unidade de composicão ou, por exemplo, de 25% a 60% em » peso, mas não Iimitado aos valores indicados. A quantidade real da dose da comDosiçáQ de acordo com a presente ínvenção administrada aos paeientes, ineluindo homm, será determínada por fatores físicos e fisiol-õgicos, tais como o peso corpQral, a gravidade da condição, o tipo de doença a ser tratada, intervenções terapêuticas anteriores ou 5 concomitantes, o pacíente e a via de admínistração.
Uma dose unitária adequada, a dose total e a conceritracão de > princípio ativo na composíção sào para ser determínadas pelo médico do tratamento. a composição pode, por exemplo, ser administrada 10 em uma dose de cerca de 1 micrograma/kg em peso corporal até cerca de 1000 mg/kg em peso corporal do paciente, por exemplo, no intervalo de 5 mg/kg em peso corporal a 100 mg/kg em peso corporal ou na Eaixa de 5 mg/kg em peso corporal a 500 mg/kg em peso corporal.
A proteína de fusão 15 e as composições contendo-a exibem antícancerígeno ou antitumoral e podem ser utilizados para o tratamento de doenças cancerígenas.
A invenção também proporciona o uso da proteína de fusão da invenção, como acíma definida para q tratamento de doencas J cancerígenas em mamíferos, 20 incluindo os seres humanos.
A invenção também proporciona um método de tratamento de doenças caneerígenas em mamíferos, incluindo humarios, compreendendo a administração '*' .a um sujeito com necessidade de tal tratamento, uma quantidade eficaz anticancerígena da proteína de fusão da 25 i.nvenção, tal como definida acima, opcíonalmente, na forma de uma composição farmacêutica apropriada.
A prateína de fusão da invenção pode ser utilizada para o tratamento de doenças malignas hematológicas, tais como leucemia, a granulomatose, mieloma 30 e outras doenças malignas hematológicas.
A proteína de fusão também pQde ser usada para o tratamento de tumores sólídos, tais como cãncer de mama, cãncer de pulmão, inclusive câncer do pulmão de células não-pequenas, câncer de cólon, câncer pancreático, cãncer de ovário, câncer de bexiga, câncer de próstata, cãncer de rim, câncer no cérebro, e similares. A via apropriada de admínistraçâo da proteína de fusão no tratamento do câncer estarã em uma via 5 parenteral particular, a qual consiste em administrar a prote-ina de fusão da invenção, sob a forma de injeções ou infusões, na composição e. na forma apropriadas para esta via de administração. A invenção será descrita em maiores detalhes nos seguintes procedimentos gerais e exemplos de 10 proteínas de fusão específícias·.
Procedimento geral para a super-expressão da proteína de fusão Preparação de um pÍasmídeo A sequência de aminoácidos da proteína de fusão 15 alvo foi usada como padrão para gerar uma sequência de DNA que a codifica, compreendendo códons otimizados para a expressão em Escherichia coli. Tal procedimento permite aumentar a eficácia de uma etapa adicional da síntese da proteína alvo em Escherichia coli. A sequência de 20 nucj-eotídeos resultantes foi então sintetizada automaticamente. Al-ém disso, os sítios de clivagem de enzimas de restriçào Ndel (na extremidade 5' do Eilamento _1 R líder) e Xhol (na extrerriidade 3' do filamento líder) foram adicionados ao gene resultan'te codificando a proteína alvo. 25 Estes foram usados para cIonar o gene dentre do vetor pET28a (Novagen). Eles tarribém podem ser usados para cIonar o gene que eodifica a proteina para outros vetores. A proteína alvo expressa a partir deste construto pode ser opcíonalmente equipada na N-terminal com um marcador de 30 poli-histídina (seis histidinas) precedida por um sítio reconhecido pela trombina, que posteriormente serviu para a sua purificação através da cromatografía de afinidade. Alguns alvos foram expressos sem qualquer marcador, em particular, sem niarcador histid'ina, e aqueles foram posteriormente purifícados em SP Sefarose. A correção do construto resultante foí confirmada primeiramente por anãlise de restríção dos plasmídeos ísolados, utilizando as 5 enzimas Ndel e xhol, seguida de sequenciaçãQ automãtica de todo o quadro de leitura da proteína alvo. Os iniciadores utilizados para a sequenciação foram. complementares para as sequências do promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') e finalizador de T7 (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3') presente no 10 vetor. O plasmídeo resultante foi utíl-izado para a super- expressão da proteína de fusão alvn em uma cepa comercial de E. colí, a qual foi transformada de acordo com as recomendações do fabricante. As coIônias obtidas no meio de seleção (LB ágar, 50 µg/mli de canamicina, glicose a 1%) 15 Eoram usadas para a preparação de uma cultura durante a noíte em meio líquido LB suplementado com canamícína (50 ,µg/mL) e glicose a 1%. Após cerca de 15 h de crescimento em incubadora de agitação, as culturas foram utilizadas para ínocular a cultura apropriada. 20 Super-expressão e purificação de proteínas de ·fusão - procedimerrto geral A Meio lb com canamícina (30 µg/mL) e sulfato de ¶
W zinco 100 jjM foi ínoculado com a cultura durante a noít:e- A cultura foi incubada a 37"C até a densidade ótica (OD) a 25 600 nm ter atingido 0,60-0,80. Em seguida, foi adícionado IPTG à coneentração final na faixa de 0,25 - 1 rriM. Após incubação (3,5 - 20 h) com agitação a 25'"C, a cuítura foí centrifugada durante 25 min a 6000 g. Os péletes bacterianos foram ressuspensos em um tampão contendo 50 mM 30 de KH,PO,, 0,5 M de NaCl, lO mM de ímídazol, pH 7,4. A suspensão foi sonicada em gelo durante 8 minutos (40% de amplitude, 15 segundos de pulsos, lOs de intervalo). O extrato resultante foi clarifícado por centrifugação durant'e 40 minutos em 20000 g, 4°C. Resina Ni-Sefarose (GE Healthcare) foi pré-tratada ccnn por equílibrar um tampão, o qual foi utilizado para a preparação do extrata de células 5 bacterianas. A resina foi entáo incubada durante a noite a 4°C com q sobrenadante obtido após a centrifugação do extrato. Então, foi carregada na coIuna de cromatografia e lavada com 15 a 50 voIumes de tampão de 50 rrtM de KH,PO4, 0,5 M de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 7,4. A proteína obtida 10 foi eluída a partir da coluna utilizando gradiente de imidazo1 em 50 mM de tampão KH2PO4 com 0,5 M de NaCl, pH 7,4. As frações obtidas foram analisadas por SDS-PAGE. As frações apropriadas foram cQmbinadas e díalísadas durante a noite a 4"C contra 50 níM de tampão Tris, pH 7,2, 150 mM de 15 NaCl, 500 mM de L-arginína, 0,1 mM de ZnSO4, 0,01% de Tween 20, e ao mesmo tempo marcador His, se prese.nte, foi cIivada com trombina (1: 50). Após a clivagem, a trombína foi separada da proteína de fiusão expressa com marcador Histag por purificação utilizando uma resina de benzamidina 20 SefaroseTM. A purificação de proteínas de fusão alvo expressas, sem marcador Histag foi realizada em SP Sefarose. A pureza do produto foi analisada por
K P eletroforese de SDS-PAGE (Maniatís et AL., Molecular 'Cloning. cold Spring Harbor, NY, 1982). 25 Super-expressão e purifícação de proteínas de fusão - procedimento Geral b Meio lb com canamícina (30 µg/mL) e 1OOµM de sulfato de zinco foi ínoculado cam a cultura durante a 30 noite. As culturas foram incubadas a 37°C até a densidade ótica (OD) em 600 nm atingir 0,60-0,80. Em seguída, foi adicionado IPTG à concentração final na faixa de 0,5 -1 mM. Após 20h de incubação com agitação a 25°C, a cultura foi centrifugada durante 25 min a 6000 g.
As células bacterianas foram interrompidas após a super-expressão de uma prensa francesa eni uin tampão contendo 50 mM de KH2PO4, 0,5 M de NaCl, 10 mM de imidazol, 5 mM de beta- 5 mercaptoetanol, 0,5 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila), pH 7,8. Extrato resultante foi cIarificado por centrifugação durarrte 50 minutos em 8000 g.
A resina de NÍ-Sefarose foi incubada durante a noite com o sobrenadante obtido.
Em seguida, a resina com a proteína ligada foi embalada na coluna cromatográ'fica.
Para retirar as frações contendo as proteínas sem Iigação, a coIuna foi Iavada com 15 a 50 voIumes de tampão de 50 mM de KH2PO4, 0,5 m de NaCl, 10 mM de imidazol, 5 rrtM de beta- mercaptoetanol, 0,5 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfoniIa), pH 7,8 . Em seguida, para retirar a maioria das proteínas que se Iigam especifícamente com o 1eitQ, a coLuna foí lavada com um tampão contendo 50 mM de KH2PO4, 0,5 M de NaCl, 500 rriM de imidazol-, glicerol a 10%, 0,5 mM de PMSF., pH 7,5. As frações obtidas foram anali.sadas por SDS-PAGE (Maniatis et AL., Molecular Cloning.
Cold Spring Harbor, NY, 1982). as frações contendo a proteina alvo foram coInbinadas e, se a proteína foí expressa com um marc'ador de histidina, clivado com tronibina (IU por 4 mg de proteína, 8h em 16"C) para remover a marca de poli- histidina.
Em seguida, as frações foram dialísadas contra tampão de fQrmuIaçãQ (500 mM de L-arginina, 50 mM de Tris, 2,5 mM de ZnSO,, pH 7,4). Exemplo 1: A proteína de fusão de SEQ.
No. 1: A proteína de SEQ. no. 1 é uma proteína de fusão possuindo q compri-mento de 173 aminoãcidos e a massa de 19,8 kDa, em que o N-terminal da sequência TRAIL 121 -281 de heptapeptídeo derivada de VEGF (SEQ.
No. 17) é Ligado como um peptídeo efetor.
Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, a glicina lig'ante estéríca flexíveí (SEQ No. 28) é incorporada.
Estrutura da proteína de fusáo é mostrada esquematicamente na FIG. 1, e a sua sequência de 5 aminoácidos e a sequência de codificação de DNA 'compreendendo códons otímizados para a expressão em E. coIi são, respectivamente, a SEQ. No. 1 e SEQ. No. 31, eomo mostrado na Listagem de Sequências em anexa. A sequência de aminoácidos SEQ. No. 1 da estrutura descrita acima foi utilizada como padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 31. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA em duas versões, uína que permite expressar marca His e um sítio reconhecido pela trombina, e o segundo, sem qualquer marcador, foi gerado e super-expressão da proteínas de fusão foi realizada em conformi'dade com os procedimentos gerais acima descritos . A super-expressão foi realizada de acordo com o procedimerrto geral A, usandQ cepas E. coli BL21 (DE3) e Tuner(DE3)pLysS, ambas da Novagen. As proteínas foram separadas por eletroforese em eonformidade com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 2: A proteína de fusão de SEQ. No. 2: A proteína de fusão da SEQ. No. 2 é uma proteína 'de fusão tendo um comprimento de 199 aminoácidos e a massa de 22,8 kDa, em que o N-terminal da sequência TRAIL 95-281 de heptapeptídeo derivada de VEGF (SEQ. No. 17) é ligado como um peptídeo efetar. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, o Iigànte estérico de glicína flexível (SEQ No.28) é incorporado. a estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 1, e sua sequência de amínoácídos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são,
respectivamente, a SEQ. No. 2 e SEQ. No. 32, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequêncía de aminoácidos SEQ. No. 2 foi utilizada como padrão para gerar sequência de codificaçáo 5 de DNA, DNA SEQ. No. 32. Um plasmídeo contendo a sequêncía de c'odificação de DNA, com uma sequência permitindo expressar marcador His e um sítio reconhecido pela trombína, foi gerado e a super-expressão de proteíría de fusáo foi efetuada em conformidade com os procedimentos gerais descrítos acíma- A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, usando cepa E. coli BL21(DE3) de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima. Exemplo 3: A proteína de fusão de seq. No. 3: A proteína de fusão da SEQ. No. 3 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 230 aminoãcidos e a massa de 26,3 kDa, na qual o N-terminal da sequência TRAIL 121 - 281 de heptapeptídeo derivada de VEGF (SEQ. No. 17), e no C-terminal da sequência de TRAIL 121 -281 de fragmentos I e II da tumstatina (SEQ. No. 18 e SEQ. No. 19, respectivamente) estão ligados como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor ligado na extremidade N-terminal da sequência de trail e a sequêncía de TRAIL está incorporado o ligante estérico flexível de gLÍcina (SEQ. Nc). 28). Entre o peptídeo efetor ligado ao C-terminal da sequência de TRAIL e a sequência de TRAIL estã íncorporado Iigante estéríco consistindo em três resíduos de glicina Gly Gly gIy, e sequêncías de sítios de elivagem reconhecidas por metaloproteases MMP (SEQ No. 24) e uroquinase üPA (SEQ. No. 25), devído a qual o peptideo efetor irá sofrer cIivagein no ambiente tumoral.
A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematícamente na Fig. 1, e sua sequência de aminoácídos e a sequência de codificaçào de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, 5 respectivamente, SEQ. No. 3 e SEQ. No. 33, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de amínoácidos SEQ. No. 3 foi usado como um padrão para gerar sua sequência de codificação de DNA SEQ. No. 33. Um plasmídeo contendo a sequência de codíficação de DNA, com uma sequência permitindo expressar marcador His e um sítio reconhecido pela trombína, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusâo Eoi reali.zada em conformidade com os procedimentos geraís descri'tos acinta. A super-expressáo foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando-se cepa E'. coli BL21 (DE3) de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 4: A proteína de fusão de SEQ. No. 4: A proteína de SEQ. No. 4 é uma proteína de fusâo tendo um comprimento de 187 amínoácidos e a massa de 21,4 kDâ, na qual o N-terminal da sequência de TRAIL 121-281, duas sequências de heptapeptídeo derivadas de VEGF (SEQ.
NO.17) estão ligadas ccmo um peptídeo efetor. Entre as duas sequências de peptídeo efetor está incorporada a sequência do sítio de cIivagem reconhecida por metaloprotease MMP (SEQ. No. 24), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. Entre a sequência do sítio de clivagem mmp e a sequência da proteína efetora está incorporado um únicQ resíduo do ácído glutâmico E. Entre o peptídeo efetor (SEQ. 17) e a sequência de TRAIL está i.ncorporado o ligante de qliciria estérico flexível (SEQ.
N'o. 28).
A estrutura da proteína de flusão é mostrada esquematicamente na Fig. 1, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA campreendendo os códons otimizados para a expressão em E. coli são, 5 respectivamente, a SEQ. No. 4 e a SEQ. No. 34, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de aminoácidos SEQ. No. 4 foi utilizada como um padrào para gerar sua sequência de codífícação de DNA, SEQ de DNA. No. 34. Um plasmídeo cantendo a sequência de codificação de DNA em duas versões, uma que permite expressar o marca.d.or His e um sítio reconhecído pela trombina, e o segundo, sem qualquer marcador, foi gerado e a super-expressão das proteínas de fusão foi efetuada em conformidade com os procedimentos gerais acirna descritos. a super-expressão foi realizada de acordo coin o processo geral B, utilizando cepa E. cQii BL21DE3pLysSRIL de Stratagene e cepa Tuner (DE3) de Novagen. As proteínas foram separadas p0r ele'troforese em conformidade com o proeedimento geral descrito aeima. Exemplo 5: A proteína de fusão de SEQ. No. 5: A proteína de Seq. No. 5 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 187 aminoácidos e a massa de 2'1,8 kDa, na qual q N-terminal da sequência TRAIL 121 -281, duas sequências de heptapeptídeo derivado de VEGF (SEQ. No. 17) estão Iigadas como um peptídeo efetor. Entre as duas sequências de peptídeos efetores, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase upA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 24), devido a qual o peptídeQ efetor irá sofrer cIivagem no ambiente tumoral. Entre a sequência do sítio de cIivagem MMP e a sequência da proteína efetora está incorporado um resíduo único de ácido glutâmico E. Adicionalmente, no N- terminal de TRAIL, dois resíduos de glicina estão ligados.
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A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematícamente na FÍg. 1, e sua sequêncía de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo os códons otimizados para a expressão em E. coli são, 5 respectivamente, a SEQ.
No. 5 e a SEQ.
No. 35, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequêncía de aminoácidos SEQ.
No. 5 foi utilizada com'o um padrão para gerar sua sequência de codíficaçâo de DNA, SEQ de DNA.
No. 35. Um pIasmídeo lO contendo a sequêncía de codi-fícação de DNA em duas versões,
uma que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, e o segundo, sem qualquer marcador, fo:i gerado e a super-expressão das proteínas de fusão foi efetuada em conformidade com os procedimentos gerais acima descritos.
A super-expressão foi realizada de 'acordo com o processo geral B, utilizando cepa E. cali Tuner (DE3) de Novagen.
As proteínas foram separadas por èletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acíma.
Exemp1o 6: A proteína de fusão de SEQ.
No. 6: A proteína de SEQ.
No. 6 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 222 aminoãcidos e a massa de 25,3 kDa, na qual o N-terminal da sequência TRAIL 95-281, duas sequências de heptapeptídeo derivadas de VEGF (SEQ.
No. 17) estão ligadas como um peptídeo efetor.
Entre as duas sequências de peptídeo efetor, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidas por üpa (SEQ.
No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ.
No. 55), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer cIivagem no ambiente tumoral.
Entre o peptídeo efetor (SEQ. 17) e a sequência de TRATL está incorporado o Iigante estéri-co fílexível de cisteína (SEQ.
No. 26).
A estrutura da proteína de fusão é mostra"da esquematicamente na Fig. l, e sua sequência de aminoácidos e a sequência d.e codificação de DNA compreendendo cõdons otimizados para a expressão em E. coli são, 5 respectivamente, a SEQ. No. 6 e a SEQ. No. 36, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A se'quência de aminoácidos SEQ. No. 6 foí útilízada como molde para gerar sua sequêncía de DNA de codifícação DNA SEQ. No. 36. Um plasmídeo contendQ a sequência de codificacão S de DNA, sem uma sequência que permite expressar marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína .de fusão foi realizada em conformidade com os procedímentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. A prnteína foi separa'da po.r eletroforese em conformidade coin o proeedímento qeral descrito acima.
Exemplo 7: A proteína de fusão de SEQ. No. 7: A proteína de SEQ. No. 7 é uma proteína de fusão possuindo um comprimento de 168 aminoácidos e a massa de 19,4 kDa, em que o N-terminal da seqnêncía de TRAIL 119- 281, uma sequência sendo um ligante de CD13 (SEQ Nq. 20) é ligado como um peptídeo efetor. A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2, e sua sequência de amínoácidos e a sequência de codifi'cação de DNA compreendendo cõdons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 7 e a SEQ. No. 37, como mostradas na Li-stagem de Sequências anexa.
A sequêncía de aminoácidos SEQ. No. 7 foi utilizada como padrào para gerar a sua sequência de DNA de codificação DNA SEQ. No. 37. Um plasmídeo contendo a
[sequência de codificação de dna em duas versões, uma que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecído pela trombina, e o segundo, sem qualquer marcador, foi geracib e a super-expressão das proteínas de fusão foi 5 realízada em conformidade com os procedimentos gerais acíma descritos.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando cepa E. coli tuner (DE3) de Novagen.
As proteínas foram separadas por eletroforese em conformídade com c) procedimento geral descrito acima.
Exemplo 8: A proteína de fusão de SEQ.
No. 8: A proteína de SEQ.
No. 8 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 201 aminoácidos e a massa de 23,2 kDa, em que q N-terminal da sequência de TRAIL 95 - uma sequência sendo um ligante de CD13 (SEQ.
No. 21) é ligado camo um peptídeo efetor.
Errtre a sequência de TRAIL e a sequência de peptideo efetor da proteína contém uma sequência do ligante de glícina-serina flexível (SEQ No. 30). A estrutura da proteína de fusão é mostrada 2D esquematicamente na Fig. 2, e a sua sequência de amínoácidos e a sequência de codíficação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. colí sào, respectivamente, a SEQ.
No. 8 e a SEQ.
No. 38, como mostradas na Listagem de Sequências anexa. ·25 a sequência de aminoácidos SEQ.
No. 8 foi usada como um padrão para gerar a sua sequência de DNA de co"dificação, DNA SEQ.
No. 38. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar um marcadQr His e üjll sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da pro'teína de fusâo foi realizada em conformidade com as procedimentos gerais descritos acima.
A super-expressão foi realizada de acordo eom o processo geral A, utilízarído cepa de E. coli
Tuner (DE3) de Novagen. A prote'ína foi sep!zLrada por eletroforese ern conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 9: A proteína de fusâo de SEQ. No. 9: 5 a proteína de SEQ. No. 9 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 192 aminoácidos e a massa de 22,1 kjja, em que no N-terminal da sequência de TRAIL 119-281, uma sequência de um fragmento de PDGF (SEQ No. 22) é Iígado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 24), devido a qual o peptídeo efetor irã sofrer clivagem no ambiente tumoral.
A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematícamente na Fig. 2, e sua sequêncía de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otímizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a e a SEQ. No. 39, como mostradas na Listagem de Sequêncías anexa. a sequência de amínoácidos SEQ. No. 9 foí usada como um padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 39. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA em duas versões, uma que permite expressar o marcador His e utn sítio reconhecido pela trombina, e o segundo, sem qualquer marcador, foi gerado e a super-expressão das proteína.s de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais acima descritos . A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, usando cepa de E. coli Rosetta (DE3) de Novagen. As proteínas foram separadas por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 10: a proteína de fusão de SEQ.
No. 10: a proteína de SEQ.
No.lO é uma proteína de fusão tendo o comprímento de 216 aminoácidos e a massa de 24,9 kDa, em que no N-termínal da se'quència de TRAIL 95-281, um .5 fragmento de PDGF (SEQ.
No. 22) é ligado como um peptídeo efetor.
Entre a sequência do peptídeo efetor e o domínio
TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uPA (SEQ.
No. 25) e metaloprotease MMP
(SEQ.
No. 24) devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer cIivagem no ambient'e tumoral,
A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 2, e sua sequência de aminoácidos e a sequéncia de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressào em E. coIi são, respectivamente, a SEQ.
No. 10 e a SEQ.
NO.40, como mostradas na Listagem de Sequêncías anexa. a sequência de aminoácidos SEQ.
Nc). 10 foi usada eomo urn padrão para gerar a sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ.
No. 40. Um pIasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar o mareador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando as cepas E. coli BL21 (DE3) e tuner(DE3)pLysS, ambas de Novagel]. A proteína foí separada por eletroforese em conformidade com o pr-ocedímento geral descrito acima.
Exemplo 11: A proteína de fusão de SEQ.
No. 11: A proteína de SEQ.
No.ll é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 226 aminoácidos e a massa de 25,7 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL95-281 um fragmento de PDGF (SEQ.
No. 22) é ligado como um peptídeo
N efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência 'de TRAIL, a m proteína contém sequências de sítios de clivagem
N reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease mmp (SEQ. Nq. 24), devido a qual o peptídeo 5 efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. Entre a sequência de TRAIL e a sequência do sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease mp, a proteína também contém um Iigante glici.n.a-cisteína-alanina flexível (SEQ. No. 27). 10 A estrutura da proteína de fusào é mostrada esquematicamente na Fig. 2, e sua sequência de amínoácidos e a sequência de codificaçâo de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. COLí sâo, respectivamente, a SEQ. No.ll e SEQ. NO.41, como mostradas 15 na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de aminoácidos SEQ. No. 11 foi usada como um padrão para gerar sua sequêricia de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 41. Um pIasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, sem uma sequência que 20 pWmite expressar o marcador His e um sítío reconhecido pela trombína, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral A, utilizando cepas E. coli 25 BL21 (DE3) e tuner(DE3)pLysS, ambas de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conform.idade com o procedímento geral descrito acima. Exemplo 12: A proteína de fusáo de SEQ. No. 12: A proteína de SEQ. No. 12 é uma proteína de füsão 30 tendo o comprimento de 217 aminoácidos e a massa de 25 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL 121-281, fragmentos I e II da tumstatíria (SEQ No. 18 e SEQ. N'O.19) estão ligados como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, a proteína contém sequências 0 W de sítios de clívagem reconhecidos por uroquinase upA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 24), devido a qual o peptídeo efietor irá sofrer clivagem no aníbiente tumoral. 5 Entre a sequência de TRAIL e a sequência do sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease MMP, a proteína também contém um agente de Iigação flexível que consiste em três resíduos de glicina GIy Gly gly.
A estrutura da proteína de fusão é mostrada 10 esquematicainente na Fig. 3, e a sua sequência de aminoãcidos e a sequência de codificaçãci de DNA compreendendo cÓdons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 12 e SEQ. No. 42, como mostradas na Listagem de Sequências anexa. 15 A sequência de aminoácidos SEQ. No. 12 foi usada eomo um padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, dna SEQ. No. 42. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de dna, com uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecído 20 pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos geraís deseritos acima. A super-expressão foi realízada de acordo com o processo geral A, utilizando cepàs e. eoli BL21 (DE3) e Tuner(DE3)pLysS, ambas de Novagen. A proteína 25 foi separada por eletroforese em eonformídade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 13: A proteína de fusào de SEQ. No. 13: A proteína de SEQ. No. 13 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 220 aminoácídos e a massa de 25,1 30 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL 121-281, o fragmento II da tumstatina (SEQ. Nq. 19) está ligado como um peptídeo efetor e no C-terminal da sequência TRAIL 121 - 281, o fragmento I de tumstatina (SEQ. No. 18) é Iigado como um peptídeo efetor. Entre o peptídeo efetor e a sequência de TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 24), devído a qual o peptídeo 5 efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral. Entre a sequência do sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease MMP e a sequência de TRAIL, a proteína contém três resíduos de glicina Gly Gly GIy, e entre o C- terminal da sequência de TRAIL e do fragmento ii de tumstatin.a, um Iigante flexível consístindo em 3 resíduos de glicina gly Gly GIy.
A estrutura da proteina de fusão é mostrada esquematícamente na Fig 3, e sua sequência de aminoãcidos e a sequência de codificaçào de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em e. coli são, r'espectivamente, a SEQ. No. 13 e SEQ. No. 43, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequêncía de aminoácidos SEQ. No. 13 foi utilizada como padrão para gerar sua sequência de DNA de codifieação, DNA SEQ. No. 43. Um plasmídeo contendo a sequência de codificaçào de DNA, com uma sequência que permite expressar um marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima. A super-express'ão foi realizada de acordo com o processQ g'eral B, utilizando cepa E. coIi B.21 (DE3) de Novagen e cepa BI,21DE3pLysSRIL de Stratagene. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito aeima. Exemplo 14: A proteína de fusão de SEQ. No. 14: A proteína de SEQ. No. 14 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 181 aminoácidos e a massa de 21 kDa, em que río N-terminal da sequência TRAIL 120-281, um fragmeiito de EGF (SEQ.
No. 23) é' Iígado como um peptídeo efetor.
Entre o peptídeo efetor e o N-terminal do domínio TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ.
No. 25) e 5 metaloprotease MMP (SEQ.
No. 56), devido a qual o peptideo efetor irá sofrer clívagem no ambiente tumoral.
A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 3,
e a sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de dna compreendendo cõdons otimizados para a lO expressão em E. coIi sáo, respectivamente, a S'EQ.
No. 14 e a SEQ.
No. 44, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de aminoáeidos SEQ.
No. 14 foi usada como um padrão para gerar sua sequência de DNA de codifícação, DNA SEQ.
No. 44. Um plasmídeo contendo a sequência de codifícação de DNA, com uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítío reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foí realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acíma.
A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral B, utilizando a cepa E. coli BL21(DE3) de Novagen e a cepa BL21DE3pLysSRIL de Stratagene.
A proteína foi separada por eletrofores'e em conformidade com o procedimento geral descrito acima.
Exemplo 15: a proteína de fusão de SEQ.
No. 15: A proteína de SEQ.
No. 15 é uma proteína de fusão Lendo um comprimento de 217 aminoãcidos e a massa de 24,4 kDa, em que no N-terminal da sequência hTRAIL95-281, um fragmento de EGF (SEQ.
No. 23) é ligado como um peptídeo efetor.
Entre o peptídeo efetor e o N-terminal do domínio de TRAIL, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase upA (SEQ.
No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ.
No. 24), devido a qual q peptídeo efetor irá sofrer cIivagem no ambiente tumõtal. Entre a sequência do sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease MMP e a sequência de TRAIL,, a proteína contém único resíduo de prolina seguido do ligante glicina- 5 cisteína-alanina flexível (SEQ. No. 26).
A estrutura da proteína de fusão é rnostrada esquematicamente na Fig. 3, e sua sequência de aminoãcidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressâo em e. coIi são, respectivamente, a SEQ. Nq. 15 e a SEQ. No. 45, como mostradas na Listagem de Sequências anexa. A sequência de aminoãcídos SEQ. No. 15 foi usada como um padrão para gerar a sua sequència de DNA de eodificação, DNA SEQ No. 45. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com urna sequência que permite expressar um marcador His e um sítío reconhecído pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada erri conformídade com os procedímentos geraís descritos acima. A super-expressão foi realizada de a,cordo com o processo geral B, utilizando cepa E. coli BL21 (DE3) de Novagen. A proteina foi separada por eletroforese em conformidade com o procedímento geral descrito acíma. Exemp1o 16: A proteína de fusão de SEQ. No. 46: A proteína de fusão da SEQ. No. 46 é uma proteína de fusão tendo o comprimento de 211aminoácídos e uma massa de 24,4 kDa, em que n N-terminal da sequência TRAIL 95- 281,dois heptapeptídeos de VEGF (SEQ.NO. 7) ligados uns aos outros são ligados como peptídeos efetores. Entre os peptídeos efetores, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecídos por uroquinase uPA (SEQ. No. 25) e metaloprotease MMP (SEQ. No. 55), devido a qual o peptídeos efetor írá sofrer cIivagem no ambiente tumoral.
a estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 9, e sua sequência de aminoácidos e a sequência de codifícação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, 5 respectivamente, a SEQ. No. 46 e a SEQ. No. 50, como mostradas na Listagem de Sequências anexa. A sequência de aminoácidos SEQ. No. 46 foi usada conio um padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ. No. 50. Um plasmídeo contendo a sequência de eodificação de DNA, com uma sequência que permite expressar o marcador Ris e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformídade com os procedimentos geraís deseritos acima. A super-expressão foi realizada de acordo com o processo geral b, utilizando cepa E. Coli BL21 (DE3) de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade cqiti o procedimento geral descríto acíma. Exemplo 17: A proteína de fusão de SEQ. Na. 47: A proteína de füsão da SEQ. No. 47 ê uma proteína de fusão tendo o comprimento de 200 amínoácidos e a massa de 22,7 kDa, em que no N-terminal da sequência TRAIL 120- 281, dois heptapeptídeos derivados do VEGF (SEQ. No. 17), Ligados uns aos outros são ligados como peptídeos efetores. Entre os peptideos efetores, a proteína contém sequências de sítíos de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ. Nçn 25) e metaloprotease MMP (SEQ. Nq. 55), devi'do a qual o peptídeo efetor irá soErer clivagem no ambiente tumoral. Entre as proteínas efetoras e o domínio trail, a proteína 'ccmtém um ligante flexível posteríormente (SEQ. No. 26) promovendo formação trímero e ligante gíicína-serína flexível (SEQ. No. 54J.
A estrutura da proteína de fusão é mostrada esquematícamente na Fig. 9, e a sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA 'compreendendo códons otímizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ.
No. 47 e SEQ.
No. 51, como mostradas na Listagem d'e Sequências anexa. 5 A sequência de aminoácidos SEQ.
No. 47 foi usada e'omo uin padrão para gerar sua sequência de DNA de codificação, DNA SEQ.
No. 51. Um plasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusão foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acima.
A super-expressão foi realizada de acordo com o proeesso geral b, utilizando a eepa E. coli BL21 (DE3) de Novagen.
A proteína foí separada por eletrQforese em conformidade com o procedímento geral descrito acima.
Exemplo 18: a proteína de fusão de Seq.
No. 48: A proteína de fusão da SEQ.
No. 48 é úma proteína d.e fusão tendo um comprirnento de 192 aminoãcidos e a massa de 21,9 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL 120-281, dois heptapeptídeos derivados do VEGF (SEQ.
No. .17), ligados uns aos outros são ligados como peptídeos efetores.
Entre os peptídeos efetores, a proteína contém sequência de sítio de clivagem reconhecido pela uroquinase upA (SEQ.
No. 25), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer elivagem no ambiente tumoral.
Entre as proteínas efetoras e o domínio TRAIL, a proteína contém Iigante flexível posteriormente (SEQ.
No. 26) promovendo formação de trímero e ligante glicina-serina flexível (SEQ.
No. 54). A estrutura da prot·eína de fusão é mostrada esquematicamente na Fig. 9, e sua sequ.ência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são,
resp'ectivamente, a SEQ.
No. 48 e a SEQ.
No. 52, como mostradas na Lístagem de Sequências anexa.
A sequência d'e aminoácidos SEQ.
No. 48 foi usada como um padrão para gerar a sua sequência de DNA de 5 codi-fícação, DNA SEQ.
No. 52. Um píasmídeo contendo a sequência de codificação de DNA, com uma sequência que permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da proteína de fusâo foi realizada em conformidade com os procedimentos gerais descritos acíma.
A super-expressão foí realizada de acordo com o processo geral B, utilizando a cepa E. coli BL21 (DE3) de Novagen. a proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descrito acíma.
Exemplo 19: a proteína de fusão de SEQ.
No. 49: A proteína de SEQ.
No. 49 é uma proteína de fusão tendo um comprimento de 206 aminoácidos e a massa de 23,3 kDa, em que no N-terminal da sequência de TRAIL120-281, um fragmento de PDGF (SEQ.
Nc). 22) é ligado como um peptídeo efet:or.
Entre o peptídeo efetor e a sequência de trail, a proteína contém sequências de sítios de clivagem reconhecidos por uroquinase uPA (SEQ.
No. 25) e metaloproteases MMP (SEQ.
No. 55), devido a qual o peptídeo efetor irá sofrer clivagem no ambiente tumoral.
Entre a sequência TRAIL e a sequência de sítio de clivagem reconhecido por metaloprotease MMP, a proteína contém também localizado posteriormente lígante gliçina—cisteína- alanina flexível (SEQ.
No. 26) promovendo a formação do trímero e ligante glicina-serina flexível (SEQ.
No. 54'). a estrutura da proteina de fusão é mostrada esquernaticamente na Fig. 9, e a sua sequência de aminoácidos e a sequência de codificação de DNA compreendendo códons otimizados para a expressão em E. coli são, respectivamente, a SEQ. No. 49 e a SEQ. No. 5'3, como mostradas na Listagem de Sequências anexa.
A sequência de aminoácidos SEQ. No. 49 foi usada como um padrão para gerar sua sequência de DNA de 5 codificação, DNA SEQ. No. 53. Um plasmídeo contendo a sequência de codificacão de DNA, sem uma sequênci,a que » permite expressar o marcador His e um sítio reconhecido pela trombina, foi gerado e a super-expressão da prQteína de fusão foí realizada em conformidade com os procedímentos geraís descritos acima. A super-expressâo foi realízada de acordo com o processo geral A, utilízando as cepas E. còli BL21 (DE3) e Tune-r(DE3)pLysS, ambas de Novagen. A proteína foi separada por eletroforese em conformidade com o procedimento geral descríto acíma. Exemplo 20. Exame da ativídade antitunoral das proteínas de fusão Exame da atividade antitumoral das proteínas de fusào foi realizado in vitro em um ensaio de citotoxicidade sobre linhas de células tumorais e in vivo ein camundongos. Para propósíto de comparação, proteína rhTRAILI14-281 e placebo foram utilizados.
1. Mediçâo de dicroísmo círcular - determínação do teor de estruturas secundárias de proteínas obtidas A quali-dade das preparações das proteínas de fusào em termos da sua estrutura foi determinada por dicroísmo círcular (CD) para o Ex. 1, Ex. 4, E-x. 5, Ex. 9 e Ex. 14. Dicroísmo circular é utilizado para a determinação de estruturas secundárias e de conformação da proteína. Método cd utiliza uma atívida.de ótica das estruturas de proteína, que se manifesta na rotação do pLano de polarização da luz e na aparência de polarização elíptíca. Espectro de CD de proteínas no ultravioleta afastado (UV)
fornece dados precisos sobre a conformação da cadeia principal do polipeptídeo.
Diálise As amos'tras da proteína a serem analisadas após 5 formulação em um tampão consistindo ern 50 mM de Tris-Hcl pH 8,0, 100 mM de NaCl, glicerol a 10%, 0,1 mM de ZnCl2, 80 mM de sacarose, 5 mM de DTT, pH 7,4 (ou, alternativamente, 5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na,Hpo4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl,, glicerol a 10%, 80 mM de sacarose, a pH 8,0 para as proteínas super-expressadas como descritas acima, mas sem o marcador His-tag e purificadas em SP Sefarose - inarcadas nos resultados da Tabela 5 com asterisco*) foram dialisadas ew sacos de diálíse (Sigma- Aldrích) eom corte de 12 kDa. a diálíse foi realizada contra 100 vezes o excesso (V/V) de tampão comparando com as preparações de proteína com agitação durante várias horas a 4'C. após diálise ser completada, cada preparaçáo foí centrifügada (25000 rpm, 10 min, 4°C) e os sobrenadantes apropriados foram recolhidos. a concentração de proteína nas amostras assim obtídas foi determinada pelo método de Bradford como uma média de triplicados.
Determinação da concentração de proteínas utilízando o método de Bradford Em ensaios de concentração de proteína do reagente preparado por dissolver 17,5 mg de Coomassie G-250 em uma mistura de etanol (4,8% V/v), ácido fosfórico (v) (·5,95% V/V) e água. Para determinar a concentração da proteí'na de l-lO ml, de amostra foi adicionada a 800 ml, de reagente de Bradford. Uma amostra da referêneia contendo o reagente de Bradford e um voIume apropriado de tampão, no qual a proteína dissolvida foi determinada. A absorbãncia 'foi lida num espectrofcitômetro Cary 300 no comprimento de onda de 595 nm, depois de pelo menos 5 mínutos de íncubação
6ul0L2 das amostras em temperatura ambíente. A concentração de proteina foi calculada a partir da curva padrão preparada para BSA na faixa de lO concentrações de l-l0µg/mL. A concentração da proteína de iniciação foi estimada após 5 levar em consideração a diluição durante a preparação da medição da amostra.
Mediçào de dicroísmo circular A uiedição de dicroísmo circular para a proteínas na faixa de concentração de 0,1 -2,7 mg/mL foi realizada em espectropolarímetro jasco j-7l0, em uma cubeta de quartzo com 0,2 milímetros ou 1 rm de forma ótica. A medição foi realizada sob fluxo de nitrogênio em 7L/min, o que permitiu a realização da medição na faixa de ccmprimento de onda de 195-250 nm. Os parânietros de medição: resolução espectral de - 1 nin; meia largura do feixe de luz de 1 nm; sensibilidade 20 mdeg, o tempo médio para um comprimento de onda - 8 s, velocídade de varrimento de lO nm/min, com uma média de 3 medições.
Os resultados foram apresentados como a média das três medições. Os espectros de dicroísmo circular para rhTRAIL114-281 e as proteínas de Ex. 1, Ex. 4, Ex. 5, ex. 9 e Ex. 14 são apresentadas na Fig. 4. Determinação do teor de estrutmra secundária Os espectros obtidos foram analisados numericamente na faixa de 193-250 nm, utilizando o software CDPro. pontos, para os quais a tensão no fotomultiplicador excederam 700 V, foram omitidos devido ao sinal muito fraco para faixa de ruído na faixa de comprimento de onda. Os dados obtidos servidos para cãlculos de teor em estruturas secundãrias particular das proteínas analisadas com o uso de software cDpro (Tabela 1).
Tabela 1. Teor de estruturas secundárías nas proteínas analisadas
NRMSD Proteína (Exp- a- B- Deslocamento Desordein hélice lâmínas Cal) Ex . 4 0, 319 3,7ái 39,4% 20,7% 36,2% Ex . 1 0, 093 7 , 8% 8,6% 63,1g 20,5€ Ex. 5 0, 04 41,3# 15,0& 2 ,5% 41,22 Ex. 9 0, 112 2,9% 41,0% 20,7% 35,4% Ex. 14 0,244 0 ,2% 55 ,32 17,1% 27 ,4% rhTRAIL* 1,94@ 50,97# 7,74% 39,35% rhTRAIL1l4- 0,389 4,9% 33,7% 23,12 38, 3% 281 *valor obtido com base na estrutura cristalina ID4V Controles (rhTRAIL114-281) mostram característica 5 de espeetro CD para as proteínas com estruturas predomínantemente do tipo de j3-lâmimas (nítidameríte delineado com elipticidade mínima no comprimerito de onda de 220 nm). Isto confírma o cálculo dos componentes da estrutura secundária, o que sugere uin número marginal de elementos a-hélice. O resultado obtido é também consistente com os dados da estrutura cristalina da proteína hTRAIL e características para as proteínas da invenção de Ex.4, Ex. 9 e Ex. 14, em que os elementos beta constituem mais de 40E da sua composição. No caso de Lodas as proteínas fundídas, os espectros de dicroísmo são caracterizados por um mínimo em comprimento de onda de 220 nm. As pequenas moléculas de proteínas efetoras ligadas em TRAIL nas proteínas fundidas constituem a menor parte da proteína e nào necessariamente criam uma estrutura secundária defínida, as proteínas analisadas nâo devem diferenciar significativamente da proteína ínicial. Di-ferenças significativas, tais como alto teor de alfa estrutura's no caso das proteínas de acordo com o Ex. 5, ou lâminas, como observado para as proteínas do Ex. 1 são, possivelmente, devido à faixa limitada de espectro CD submetida à análise, especíalmente, na região 180-200 nrn.
2. Testes de Iinhas de células Tn vitro Linhas de células Tabela 2. As células aderentes Número de üinha de células por Tipo de cãncer Meio células cavidade (ern milhares) RPMI + FBS a Câncer Colo 205 10¥ + Colorretal 5 ATCC # CCL-222 peniciíina + humano estreptomicína McCoy's + FBS Câncer HT-29 a 10% + Colorretaí 5 ATCC # CCL-2 penicilina + humano estreptomícína câhcer de Rpmi + FBS a DU-145 prósta ta 10€+ penicilina 3 ATCC # HTB-81 humano + estreptomicína RPMI + FBS a PC-3 eâncer .de 10%+ ATÇC # CRL- prósta ta 4 penicilina + 14'35 h umanQ estreptomícína MEM + FBS a MCF-7 câ.ncer de mama 10%+ 4 ,5 ATCC # HTB-2 2 humano penicilina + estFeptamici-na DMEM + FBS a MDA-MB-231 câncer de mama 108+ 4 ,5 ATCC # HTB-26 humano penicilina + estreptoinicina
MEM + FBS a L UM-UC-3 câmer àe 10©+ ATCC # CLR- 3 ,5 bexíga humano penic-ilina + 1749
! estreptomicina
DMEM + FBS a SW780 Câncer de IOE+ ATCC # CRL- 3 h bexiga humano peníeílína + 2169 estreptomícina DMEM + FBS a Câncer SW620 10%+ Colorretal 5 ATCC # CCL-227 penícilina + humano estreptomicina
RPMI + FBS a BXPC-3 Câncer 10%+ ATCC # CRL- pan creá t ico 4,5 penicílina + 1687 humano estreptomicína
RPMI + FBS a 20%+ 0,01 mglmL de NIH: OVCAR-3 câncer àe insulína + 7 ATCC # HTB-161 Qvário humano penicilina + estreptomieina
MEM + FBS a Hepg2 Hepa toma do 10*+ 7 ATCC' # HB-8065 fígado humano penici-lina + estreptomicina
MEM + FBS a 293 céíulas 10%+ ATCC # CLR- enLbriDrjá ri a s 4 penicilina + l573 de rím humano estreptomicina
MEM + FBS a ACHN câncer de rim 10%+ 4 ATCC # CCL-222 humano penicilina + estreptomicina
I McCoy's + FBS Caki 2 câncer de riin a IOE+ 3 ,5 ATCC # HTB-47 humano peníciíína + I estreptomicina
McCoy's + FBS células de HT144 a 10%+ melanoma 7 ÃTCC # HTB-63 penicilína + hümano I e8treptomicína
RPMI + FBS a LNCap câncer de 10%+ ATCC # CRL- pzUstata 4 ,5 penícilina + 1740 humano I estreptomicina câncer de RPMI + FBS a NCI-H69 pequenas 10%+ 22 ATCC # HTB-19 células no penícílína 4 púlmão humano I estreptomicina
RPMI + FBS a Jurkat A3 Leucemia 1OÊ+ ATCC # CRL- lO humana penícilina + 2570 I estreptomicina MES-SA/Dx5 I Mccoy's + F'BS a ATCC # CRL- câncer uterino I 1CN+ penicilína 4 1977 + estreptomicína MEM + FBS a 10%+ SK-MES-I cân cer de pení'cílína + 4 ATCC # HTB- 58 pulmão humano I estreptomicína
RPMI + FBS a A549 câncer de pulmão 10%+ penícilina 2, 5 ATCC # CCL-l85 humanò + èstreptomícina
Meçoy's + FBS a Cân-cer HCTI16 10%+ penicilina colorretml 3 ATCC # CCL-247 + estreptomícína hummo
D.MEM-F12 (1:1) + 5% de soro de cavalo + MCFIOA Células 0,5µg/mL de ATCC # CRL- epiteliais hídrocortísona 4 ,5 10317 mamá rias + i0µg/m de insulína + 20ng/ml, EGF
McCoy's + FBS a 10%+ MES-SA ATCC # CRL- câncer utemno . penicilina + 3, 5 estreptomicina 1976
DMEM. + FBS a càncer PANC—I 10%+ pancreático 5 CLS # 300228 penieilina + humano I estreptomícína
Tabela 3. Células não aderentes Número de células por LÀnha de célulasj Tipo de càncer Me io cavídade (em milhares) Câjj cer RPMI + FBS a 10£ NCI-H69 Co1orEetal + penícilína + 22 ATCC # BTB-1I9 humãno estreptQmícína
RPMI + FBS a jurkat A3 L.eucemia humàna 1O'B+ penicilina 10 ATCC # CRL-257Q + estreptomicina
RPMI + FBS a HL60 Leucemia humana 20€+ penicilina 10 ATCC # CCL-240 + estreptomícina
RPMI + FBS a CCRF-CEM Leucemia humana 20€+ penicilina IQ ATCC # ccL-l19 + estreptomícina
Teste de citotoxicidade MTT MTT é um ensaio colorimétrico usado para medir a proliferação, a viabilidade e a citotoxicidade das células.
Ele consiste na decomposição de um sal de tetrazólio 5 amarelo MTT (4,5-dimetil-2-tiazo1il)-2,5-difeni1tetrazó1io)
ao formazano corante púrpuro íns'olúvel em água pela redutase de tetrazõlio-succinato na enzima mitocondrial 1. A redução do MTT ocorre apenas em células vivas.
A análise das dados consiste em determinar a concentraçào IC5d da proteína (em ng/InL), na qual a redução de 50% no número' de células ocorre na população tratada em comparação com células de controle.
Os resultados foram analisados utilízando o software Graph'Pad Prism 5,0. O teste foi realizado de acordo com as descrições da Iiteratura (Celís, JE, (1998) Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvement of viral and chemical factors wíth oral cancer in Taiwan, jpn j Clin Oncol, 34 (4), 176-183). Meio de cultura de células foí diluído até uma densidade definida (l04 - 10' células por l00µL). Então,
100 |ál de suspensão de células diluídas apropriadamente foram aplícadas a uma pIaca com 96 cavidades em tríplícado.
As'sim, as células preparadas foraín incubadas durante 24 h a 37"C em 5% ou 10% de CO2, dependendo do meio utilizado, e em seguída, para as células (em 100 µL de meio) mais l00µL do meio eontendo várias concentrações de proteínas testadas foram adicionados.
Após a incubação das células com proteínas testadas durante o próxirno período de 72 horas, o que é equivalente a 3-4 vezes da divisào celular, o meio com a proteína teste foi adicionado com 20 ml, de solução de trab'alho de MTT [5 mg/mL], e a íncubação foí mantida dürante 3h a 37°C em CO, a 5%. Então, o meio .cam uma solução de MTT foi removido e os cristais de formazano foram dissolvidos pela adição de 100 µL de DMSO. Após agitação, a absorbância foi medida a 570 nm (filtro de 5 referência 690 nm). Teste de citotoxicidade EZ4U O teste EZ4U (Biomedica) foi utilizado para testar a atividade citotõxica das proteínas em Iinhas de células não aderentes. O teste é uma modificação do MTT em que o formazano formado na redução do sal de tetrazõlio é solúvel em água. Estudo de viabilidade das células foi realizado após a incubação ccmtínua de 72 horas das células com a proteína (sete concentrações de proteína, cada um em triplicado). Nesta base, os valores de IC50 forairi determinados (como uma média de duas experiências independentes), utilizando o software Graphpad prísm 5.
Os resultados dos testes de citotoxicídade in Vitro encontram-se resumidos na Tabela 4, como os valores de IC50 (ng/InL), que correspondem a uma concentração de proteína, em que o efeito citotóxico das proteínas de fusão é observado ao nível de 50% com relação às células de controle tratadas apenas com solvente. Na Tabela 4, as proteínas que foram ínicialmente ex,pressas com marcador de histidina, o qual foi subsequentemente removído, são designadas como a) no Ex. No.. As proteínas que foram inícialmente expressas sem histídina são designadas como b) no Ex. No.. Cada experimento representa o valor médio de pelo menos duas experiêneias independentes realizadas em triplicado. Como
3.0 critérío de ausêncía de atividade de preparações de ·proteína, o limite ICs0 de 2000 ng/mL foi adotado. As proteínas de fusão com um valor de IC50 superíor a 2000 foram considerados inativas.
l As céluías para este teste foram selecionadas de modo a incluir as linhas de células de tumor, naturalmente resistentes à proteína TRAIL (o critério da resistência natural para TRAIL: IC50 para a proteína TRAIL > 2000), 5 linhas de células tumorais sensíveis à proteína TRAIL e resistentes à linha doxorrubicina MES-SA/DX5 camo uma linha de câncer resistente aos medicamentos anticancerígenos convencionais. A linha de células HUVEC não diferenciado foi 10 usada corno uma Iinha celular de controle saudável para a avaliação do efeito/toxicidade das proteínas de fusão em células não-cancerígenas. Os resultados obtidos confirmam a possibílidade de superar a resistência das linhas de células de trail 15 através da administração de certas proteínas de fusão da presente invenção para as células naturalmente resistentes a TRAIL. Quando as proteínas de fusão da presente invenção dentro das células sensíveis à TRAIL foram admínistradas, em alguns casos, observou-se uma potenciação clara e forte '20 da potência da ação, manifestando em valories de IC50 reduzidos da proteína de fusão em comparação com a IC5q para a TRAIL sozinha. Além disso, a atividade citotõxica da proteína de fusão da invenção nas células resístentes ao medicamento anticancerígeno clássico, doxorrubicina, foi 25 obtida e, em alguns casos, foi maís forte do que a atividade de TRAIL sozinha.
Os valores de IC50 acima de 2000 obtidos para as linhas de células não-cancerígenas, mostram. a ausência de efeitos tóxicos associados corn o uso das proteínas da '30 presente invenção para as células saudáveis, indicando assim uma toxicidade sistemica de baixo potencíal da proteína.
F Determiriação da at·ividade citotóxica das E£eEarações de proteína selecionadas contra o painel estendido de Iinhas de células tumorais A Tabela 5 apresenta os resultados dos testes de 5 atividade citotóxíca in vitro para as proteínas de fusão seleciDnadas da invenção contra um extenso painel de células tumorais de diferentes órgãos, correspondentes a uma ampla faixa de cânceres mais comuns.
Na Tabela 5, as proteínas que foram inicialmente 10 e-xpressas coin marcador de histidina, o qual foi subsequentemente removido, sáo designadas como: a) no Ex.
Nq.. Proteínas que foram inicialmente expressas sem histidina são designadas como b) ao Ex.
No.. Os valores obtidos de IC50 corifirmam elevada 15 atividade citotóxica da proteína de fusào e, portanto, sua utilidade potencial no tratamento do câncer.
Tabela 4. Atividade citotóxica das proteínas de fusáo da invenção Inihição Continua dé Preparàções com células durante 72h (teste MTT, Ag/mL) pmteína MES-SA I =-SA/DX5 I HCTIIG I SK-MES-I A549 MCFIOA I ICm I ±SD i IC,,, I £SD.
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'3. Efícãcia antitumo'ral das proteinas de fusão in vivo em xenoenxertos A atividade antitumoral das preparações de proteína foi testada em uni modelo de rato de células 5 HCT116, CO1O205 e SW620 de câncer de cólon humano, células A549 e NCI-H460-Luc2 de câncer de células não-pequenas do pulmão, células PLC/PRF/5 (CLS) de hepatoma humano, células Panc-l de carcinoma pancreático humano, células HepG2 carcinoma de fígado humano, células NCI-H460 de carcinoma de célu'las grandes de pulmão humano, células resistentes a múltiplos medicamentos MES-SA/Dx5 carcinoma uteríno humano. Células As células HCT116 e A549 (ATCC CCL-185) foram mantidas em meio RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT, USA) misturadas na razão de 1:I com opti-MEM (Invitrogen, Cat.22600-134) suplementadas com 10% de soro fetal de bezerro e 2 mM de glutamína. No dia do enxerto dos camindongos, as células foram separadas do suporte por lavagem das células com trípsina (Invitrogen), depois as células foram centrifugadas a 1300 rpm, 4°C, 8 min, suspensas em tampão HBSS (meio Hanks), contadas e diluídas para a concentração de 25X106 células/mL.
As célalas PLC/PRF/5 (CLS), SW620 e PANC-I Eoram mantídas em DMEM (HyCl-one, Logan, UT, USA) suplementadas com soro de bezerro fetal a 10% e 2 mM de glutamina. No dia do enxerto dos camundongos, as células foram separadas do suporee por lavagem das células com tripsina (Invitrogen), depoi's as células foram centrifugadas a 1300 rpm, 4"C, 8 min, suspensas em tampão HBSS (meio Hanks), contadas e dilüídas para a concentração de 25x106 células/mL. As célúlas HepG2 foram mantidas em MEM (HyClone, Logan, UT, USA) suplementadas com soro de bezerro fetal a 10% e 2 mM de glutamina. No dia do enxerto dos camundongos,
as células foram separadas do suporte por lavagem das células com tripsina (Invitrogen), depois as células foram centrifugadas a 1300 rpm, 4"c, 8 min, suspensas em tampão HBSS (meio Hanks), contadas e diluídas para a concentracão a 5 de 25xlO' cé1uLas/&.
As células NCI-H460-Luc2, NCI-H460 e Colo205 foram mantídas em RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT, USA) suplementadas com soro de bezerro fetal a 10& e 2 mM de glntamina. No dia do enxerto dos camundongos, as células foram separadas do suporte por lavagem das células com tripsina (Invitrogen), depois as células foram centrifugadas a 1300 rpm, 4"C, 8 min, suspensas em tampão HBSS (meio Hanks), contadas e diluídas para a concentração de '25xl06 célu1as/ml,.
As células ME-S-SA/DXS foram mantidas em McCoy's (HyClone, Logan, UT, USA) suplementadas com soro de bezerro fetal a 10% e 2 mM de glutamina. No dia do enxerto dos camundongos, as células foram separadas do suporte por lavagem das células com tripsina (Invitrogen), depois as células foram centrifugadas a 1300 rpm, 4"C, 8 min, suspensas em tampão HBSS (meio Hanks), contadas e diluídas para a concentração de 25x1O' células/mli. Camundonqos O e.xame da atividade antitumoral das proteínas da invenção foi realizado em 4-5 semanas de idade, ou 7-9 semanas de ídade CD -nude- (Crl: CDl—Foxn1"" 1) ou em 4-5 semanas de idade crl: SHO-prkdc""idHR'", camundongos obtidos a partir de Charles River Alemanha ou 4-5 semanas de idade Cby.Cg-foxn1(nu)/j, camundongo obtido a partir de Centrum Medycyny Doswiadczalnej em BÍatystok. Os camundongos foram mantidos em condíções Iivres de patógenos específicos, com livre acesso a comida e ãgua desmineralizada (ãd libitum). Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as díret.rizes: "'Interdisciplínary Prínciples and Guidelines for the Use o:E Animals in Research, Marketing and Education" emitidas pelo New York Academy çjf Sciences' Ad Hoc commíttee on Animal Research e foram aprovadas pelo 5 IV Local Ethics Committee on Animai Experimentatíon in Warsae (No. 71/2009). O curso e a avaliação das experiências O tamanho do tumor fíoi medido utilizando um compasso de ca1i,bre eletrônico, o volume do tumor foi calculado utilízando a fórmula: (a2 x b)/2, em que a = diagonal mais curto do tumor 25 (rrun) e b = diagonal mais longa do tumor (mIn). a inibição do crescimento do tumor foi calculada utilizando a fõrmula: TGI [&] (inibição do crescimento do tumor) = 1'5 (WT/WC) X 100 - 100% em que WT refere'-se ao voLume médio do 'tumor no 'grupo de tratamento, WC refere-se ao volume médio do tumor no grupo de controle.
Os resultados experimentais são apresentados como valor médio ± de desvio padrão (SD). Todos os cálculos e grãficos foram preparados utilizando q software Graphpad Prism 5,0.
Modelo de câncer do cólm humano, camundonqos Crl: CD1-FOX1"° 1 No dia 0, os camundongos Crl: CD1-Fox1"" 1 foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5xlO' de células HCT116 suspendidas em 0,2 ml, de tampão HBSS por meío de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atíngiram o tamanho de - 60-90 mm' (dia 14), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de - 70mm' e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 (10 mg/kg), Ex. 4 (10 mg/kg), Ex. 5 (lO mg/kg), e Ex. 9 (10 mg/kg), e rhTRAILll4-281 (10 mg/kg) como uma comparação.
As preparações foram adminístradas por via intravenosa (i.v.) 5 diariamente durante dez dias.
Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de -1,000 mm', os camundongos foram sacrifícados por ruptura da meduLa espinhal.
O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281. Os resultad'os experímentais obtidos em c.amundongos Crl:CD1-Foxl'" sobrecarregados com câncer do Mlon de HCT116 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 1, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. 9 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 5 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 6, que mostra a iníbiçào do crescimento do tumor (TGI'È) ccnno a percentagem de controle.
Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das FÍguras 5 e 6 mostram que a admínistração das proteinas de fusão da invencão de Ex. 1, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. -S
9 causou a iníbiçâo do crescimento do tumor HCT116, com a TGI respectivamente, 67,8, 69,8, 84,4 e 66,2% em relação ao corrtrole no 27° día do experimento.
Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento das células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 44%. Assím, as proteínas de fusáo da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
Camundongos crl: CDI-FoxI"" 1 modelo HTI16 No dia 0, os camundongos Crl: CDI-FOXI"" 1 foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5x1O' de células HCT116 suspendidas em 0,2 mlj de tampão
HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 X25 mm
(Bogmark'). Quando os tumores atingiram o tamanho de - 50-78 mIn3 (dia 8), os camundongos foram randomízados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de - 63 mN e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram 5 administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 5. (10 mg/kg), Ex. 4. (10 mg/kg), Ex. 9 (10 íng/kg), Ex. 1 (10 mg/kg) e rhTRAILl14-28l (10 mg/kg) como üma eomparação contra a formulação tampâo (50 mM de base Trizma, 150 mM de Nacl, 80 mM de sacarose, 250 mM de l- lO arginina, 1 inM de glutationa, 0,1 de inM zn'", pH 7,3) como üm controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) diariamente, durante cinco dias, seguidas por (após 2 dias de intervalo) mais cinco administrações diárias. Quando um grupo terapêutico a.lcançou o tamanho médio do tum.or de -1,000 mIn3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
Os resultados experímentaís obtidos em camundongos Crl:CD1-Fox1"" sQbrecarregados com eâncer do cõlon de HCT116 tratados com as proteínas de fusão da invencão de Ex. 5, Ex. 4, Ex. 9 e Ex. 1 e comparativamente ^ com rhTRAILI14-281 sáo mostrados na FIG. 10 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 11, que mostra a inibíção do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
Os resultados das experiências apresentados nos gráfícos das Figuras 10 e 11 mostram que a administração das proteínas de fusão da ínvenção de Ex. 5, Ex. 4, Ex. 9 e Ex. 1 causou a inibição do crescimento do tumor HCT116, com a TGI respectivamente, 80%, 79%, 66% e 68% em relação ao corrtrole no 27q día do experimento. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento das eélulas de tumor foi obtido em rela'ção ao controle, com TGI no nível de 44,3%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeíto muito mais signifícativo comparado com rhTRAIL114-281 sozínho. Camundongos Crl: SHO-prkdc""ídHRh" 5 modelo HT116 No dia 0, os camundongos crl: SHO-prkdc""idHRh" foram e-nxertados subcutaneamente (SC) na Iateral direita com 5X1O' de células HCT116 suspendidas em 0,2 itü, de tampão HBSS por meío de uma seringa com uma agulha de 0,5 X25 mm (Bogniark). Quando os tumores atingiram o tamanho de - 380- 430 mN (dia 14), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de - 400 nun' e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as prep.arações das proteínas de fusão da ínvenção de EX. 6 (30 mg./kg), Ex. 11 (45 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como uma comparaçã'o' contra a formulaçâo tampão (5 inM de NaH2pO4, 95 mM de Na,HPOq, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de znCl2, glicerol a 10%, 80 mM de sacarose, ph 8,0) 'como um controle. As preparações foram administradas por vía intravenosa (i.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médío do tumor de ml,000 mN, os 'camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espínhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-
281.
Os resultados experimentaís obtidos em camundongos Crl: SHO-prkde"""dHRh" sobrecarregados com câncer do cóIon de HCT116 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 (30 mg/kg) Ex.ll (45 mg/kg) e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 12 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 13, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI®) como a percentagem de controle.
Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 12 e 13 mostram que a administraçào das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex.ll causou inibição do crescimento do tumor HCT116, com TGI 5 respectivamente 42Qi e 44,5% em relação ao controle no 32'" dia da experíência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um Iigeiro e.feito inibitó.rio no crescimento de cêlulas de tumor foi obtído em relaçào ao controle, com TGI no nível de 5,6%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significãtivo comparado com rhTRAILI14-281 sozinho.. Camundongos Crl: SHO-PrkdC""idHRhr modelo COLO205 No dia 0, os camundongos Crl: SHO-prkdc'"'dHRh" foram enxertados subcutaneamente (SC) na Iateral díreíta com 5X106 de células CO1O205 suspend:Ídas em 0,2 mL de tampão HBSS por .meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 X25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de - 90-130 mm' (dia 13), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médío dos tumores no grupo de - 115 =3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento Íoram administrados com as preparações das proteínas de fusão da ínvenção de Ex. 6 (30 mg/kg), Ex. 19 (30 mg/kçj) e rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como uma comparação contra a formulaçào tampão (5 mM de NaH,PO,, 95 mM de Na,Hpo4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 MNI de zncI2, glicerol a 10%, 80 mM de sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seís vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de -1,000 mIn3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espínhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-
281.
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L O's resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-prkdc""idHR'" sobrecarregados com câncer do cólon de Colo205 tratados com as proteínas de fusão da invençâo de Ex. 6 (30 mg/kg) EX.19 (45 mg/kg) e 5 comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 14 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 15, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
Os resultados das experíências apresentados nos 10 gráfícos das Figuras 14 e 15 mostram que a admínistração das proteínas de fusão da invençào de Ex. 6 e EX.19 causou inibição do crescimento do tumor Colo205, com TGI respectivamente 100% e 100% em relação ao controle no 33' dia da experiência.
Para rhTRAIL114-281 utílizado como 15 referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 18,8%. Assím, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozínho. 20 Camundongos Crl: SHO-prkdc""idHRh" modelo SW620 No dia 0, os camundongos Crl: SHo-prkdc""iàHRh" foram enxertados subcutaneamente (SC) na Iateral díreíta com 5x1O' de células SW620 suspendidas em 0,2 mL de tampão
25 HBSS por meio de uma seringa com uina agulha 'de 0,5 X25 nun (BQgInark)w Quando os tumores atingiram o tamanho de - 290- 350 mm' (dia 17), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de - 320 mN e d.esignados aos grupos de tratamento.
Os grupos de 30 tratamento foram administrados com as preparações das pr'oteínas de fusão da invenção de Ex. 6 (30 mg/kg), Ex. 11 (40 mg/kg) e rhTRAILll4-28l (30 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (5 mM de NaH2pO4, 95 mM de
Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de znCl2, glicerol a 10%, 80 mM de sacarQse, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por vía intravenosa (i.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um 5 grupo terapêutico a1cançQu q tamanho médío do tumor de -1,000 mm', qs camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-
281.
Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-prkdc""iaHRh" sobrecarregados com câncer do cóIon de SW620 tratados com as proteínas de fusào da invenção de Ex. 6 e Ex.ll e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 16 como um diagrama da mdança do volume do tumor e na FIG. 17, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%.) como a percentagem de controle. Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 16 e 17 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de E:x. 6 e Ex.ll causou inibição do crescimento do tumor SW620, com tgi respectivamente 62% e 23% em relação ao controle .no 31° dia da experiência. para rhTRAILll4-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relaçào ao controle, com TGI no nível de -92. Assirn, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho'. As proteínas de fusão testadas não causaram efeítos colaterais significativos manifestados' por uma diminuição no peso corporal de camundongos (ist.o é, menor do que IOE do peso corporal inicial usado como referência). Isso mostra baixa toxicidade sístemica da p.roteín-a.
Modelo de câncer de pulmão humanc) Camundonqos Crl: CD1-Fox1" 1 No dia 0, os camundongos C'rl: CDI-FoxI'" 1 foram enxertados subcutaneamentê (SC) na lateral direita coiíi 5 5X1O' de células A549 suspendidas eni 0,2 mL de tampào HB'SS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 X25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o taman'ho de - 80- 100 mm' (dia 14), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de - 90 mn? e desígnados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 (10 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (10 mg/kg) como urrta comparação. As preparações foram administradas por via intravenosa (i—v.) dois vezes a cada doze dias. Quando um grupo terapêutíco alcançou q tamanho médio do tumor de -1,000 mm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula e.spinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
Os resultados experime.ntais obtidos ein c.amundongos Crl: CD1-FOx1"" sobrecarregados com cãncer de 'púlmão de A549 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 7 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na fig. 8, que mostra a ínibição do crescimento do tumor (TGIB) como a percentagem de controle.
Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 7 e 8 mostram que a administraçào das proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 causou inibíçáo do crescimento do tumor A549, com TGI 44,8% ein relação ao controle no 33" dia da experiêneia. Para rhTRAIL114-281 utílizado COúlO referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tu'mor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível cíe 16,5%. Assim, as proteínas de fusão da ínvenção exerceni efeito muito mais q significativo comparaào com rhTRAII,114-281 sozinho.
Cby.Cg-foxnl(nu)/j No dia 0, os camundongos Cby.Cg-foxn1(nu)/j foram 5 enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5xlO' de células A549 suspendidas em 0,2 ml) de tampão HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 X25 inm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de - 60-90 mIn3 (dia 19), os camundongos foram randomízados para obter 10 o tamanho médio dos tumores no grupo de - 75 mm3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparacões j das proteín.as de fusâo da invenção de Ex. 1 (15 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como unia cornparacão contra água @ 15 para injeção como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i.v.) seis vezes a cada doís días. Quando um grupo tera'pêutico alcançou q tamanho rnédio do tumor de -1,000 mIrl3, qs eamundongos foram sacrificados por ruptura da medula espínhal. O grupo 20 controle re'cebeu rhTRAIL114-281.
Os resultados experimentais obtidos em camundongos Cby.Cg-foxn1(nu)/j sobrecarregados com câncer de pulmâ'o de A549 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 1 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são 25' mostrados na fig. 18 como um díagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 19, que mostra a inibição do crescímento do tumor (TGlt) como a percerrtagem de controle.
Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 18 e 19 mostram que a a~nistração 30 das proteínas de Eusão da invencão de Ex. 1 causou inibição '= do crescímento do tumor A549, com TGI 44,8% em relação ao controle no 33° dia da experiêncía. Para rhTRAILI14-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito iníbitório no crescimento de células de tumo'r foi obtido em reLação ao ccmtrole, com TGI no níve'l de 16,6%. Ass.ím, ãs proteínas de fusão da invençâo exercem efeíto muito mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho.
5 Camundongos Crl: SHO-prkdc'"idHRh" A. No dia 0, os camundongos Crl: SHO-prkdc""idHRh" foram enxertados subcutaneamente (SC) na Iateral direita com 5xlO' de células NCI-H460 suspen'didas em 0,2 inL de tampão HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 X25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de - 150-170 mIn3 (dia 13), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de - 160 nun' e designadQs aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram admínistrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 (30 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como uma comparação contra a Eormulação tampão (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na2HPO4, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnC12, glicerol a 10%, 80 mM de sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (í.v.) seis vezes a cada dois dias. Quando uni grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de -1,000 mm3, os e'amundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-281.
Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHo-prkdc""idHR'"" sobrecarregados com câncer de pulmão de NCI-H460 tratados coiti as proteínas de fusào da invenção de Ex. 6 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mos'trados na FIG. 20 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na'FIG. 21, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI@) como a percentagem de corrtrole.
Os resultados das experiências apresentados nos gráfícos das Fíguras 20 e 21 mostram que a administração das proteínas dè fusão da invenção de Ex. 6 causou ínibíçã'o do crescimento do tumor NCI-H460, com tgi 88,5% em relação ao controle no 28" dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utílizado como referência comparatíva, um ligeiro efeito 5 inibítõrio no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao control-e, com TGI no nível de 17,5%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exerc-em efeito muito mais sígnificativo comparado com r-hTRAIL114-281 sozinho. B. No día 0, os camundongos crl: SHO-prkdc""ídHRh" Eoram enxertados subcutaneamente (SC) na la.teral direita com 7X1O' cie células A549 suspendidas em 0,2 mL de tampão HBSS:Matrigel na razão 3:1 pDr meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogniark). Quando os tumores 'atingiram 0 tamanho de -140-165 Tnm3 (dia 19), os camundongos foram randomízados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de - 150 mm' e designados aos grupos de tratamento.
Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 5 (60 mg/kg), Ex. 6 (50 mg/kg), Ex. 11 (50 rng/kg) e rhTRAILl14- 281 (30 mg/kg) como uma comparação contra a formulaçào tampão (5 mM de NaH,PO4, 95 mM de Na,Hpo,, 200 níM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnCl.2, 10 m de L-arginina, 80 mM de sacarose, pH 8,0) como' um controle. As preparações Eoram administradas por via intravenosa (imV.) seís vezes a eada dois dias. Qüan'do um grup'o terapéutico alcancou o » tamanho médio do tumor de -1,000 mIn3, os camundongos foram saerificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-28I. Os resultados experimentais 'obtidos em camundongos Crl: SHO-prkdc""idHRh" sobrecarregados com cãncer de pulmão de A549 tratados com as proteínas de fusão da invençãQ de Ex. 5, Ex. 6, Ex. 11 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 22 como um diagrama da mudança do volume do t'umor e na FIG. 23, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de corrtrole.
Os resu1tados das experíências apresentados nos 5 gráficos das Figuras 22 e 23 mostram que a administração das proteín,as de fusáo da ínvenção de Ex. 5, Ex. 6, Ex. 11 causou inibição do crescimento do tumor A549, com TGI, respectivamente, 39,32, 39,3% e 28% em relação ao controle no 38° dia da experiência.
Para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibi'tório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 5,3%. As"sirn, as proteínas de fusáo da invenção exercein efeíto muito mais significativo compa-rado com rhTRAILIj4-281 sozinho.
C.
No dia 0, os eamundongos Crl: SHo-prkdc'"idHRh" foram enxertados subeutaneamente (SC) na lateral direita com 7xlO' de células NCI-H460-Luc2 suspendidas em 0,1 inL de tampáo HBSS por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 X25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de '20 -100-120 mN (dia 19), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de -110 InIn3 e designados aos grupos de tratamento.
OS grupos de tratamento foram a&inistrados corri as preparações das proteínas de fusâo da inve'nção de Ex. 5 ('primeíra admínistração 40 mg/kg, seguida por 30 mg/kg) e rhTRAIL114- 281 (20 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (19 mM de NaH2pO4, 81 mM de Na,HpO,, 50 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de Zr]C12, glicerol a 10%, pH 7,4) cómo um controle.
As preparações foram. a.dministradas por via intravenosa (i.v.) seis vez.es a cada dois días.
Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de -1,000 Tnm3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-
281.
Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-prkdc'"'dHRk" sobrecarregados com câncer 5 de pulmão de NCI-H460-Luc2 tratados com as proteínas de fusão da invencào de Ex. 5 e comparativamente com » rhTRAIL114-281 são mostrados na Frg. 24 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 25, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGIZ) como a percentagem lO de controle.
Os resultados das experíências apresentados nos gráficos das Figuras 24 e 25 mostram que a administraçáo das proteínas de fusão da invenção de Ex. 5 causou íni-bícão a do crescimento do tumor NCI-H460-Luc2, com TGI 97,2% ern relaçâo ao controle no 29" dia da experiêncía. para rhTRAIL114-281 utilizado como refierència comparativa, um ligeiro efeito inibítório no crescimento de células de 'tumor foi obtido em relação ao controle, com tgi no nível de' 76%. Assim, as proteínas de fusào da invenção exercem efeíto muito mais significativo comparado com rhTRAIL114- 281 sozinho. d. No dia 0, os eamundongos Crl: SHO-prkdc'"idHRh" foram. e.nxertados subcutanearnente (SC) na lateral dire.ita coín 7xi¢ de células A549 suspendidas ém 0,1 inL de tampão HBSS:Matirigel por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram cj tamanho de -100-120 mN (dia 17), os camundongos foram r-andomizados pa-ra obter o tamanho médio dos tumores no grupo de -110 mIrl3 e designados aos grupos de tratamenLo. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da ínvenção de Ex. 5 (50 mg/kg), Ex. 1 (50 mg/kg) e rhTRAILll4-281 (20 mg/kg) como uma comparaçáo contra a formulação tampão (19 ínM de NaH,PO4, 81 mM de
Na,HPO4, 50 km de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de 2nC12, glicerol a 10%, pH 7,4) como um controle. As preparações foram admínístradas por via intravenosa (iaV.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o 5 tamanho médio do tumor de -1,000 InIn3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAI.L114-281.
Os resultados experimentais obtidos em camundongQs Crl: SHO-prkdc'"idHRh" sobrecarregados com càncer de pulmão de A549 tratados côin as proteínas de fusão da invenção de Ex. 5, Ex.. 1 e comparativamente com rhTRAIL114- 281 são mostrados na FIG. 26 como um diagrama da mudança do ·volume do tumor e na FIG. 27, que niostra a iníbição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de corrtrole. Os resultados das experíências apresentados nos grãficos das Figuras 26 e 27 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 5, Ex. 1 causou inibição do crescimento do tumor A549, com TGI, respectivamente, 52,5% e 41,6% em relação ao controle no 34° dia da experíência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como ref.erência comparatíva, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 21,8%. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muíto mais significa'tivo comp'arado com rhTRAIL114-281 sozinho.
Modelo de cãncer de fíqado camundongos Crl: SHO-prkde'"ídHRh" A. No dia 0, os camundongos Crl: SHO-prkdc'"idHRh" foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5x106 de céluías PLC/PRF/5 suspendidas em 0,2 mlj de tampão hbss por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 X25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o tamanho de -190-220 mN (di-a 31), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médio dos tumores no grupo de -200 =.3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 (40 mg/kg), Ex. 11 5 (50 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como uma comparação eontra a formulação tampão (5 mM de NaH2PO4, 95 mM de Na,HPO,, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de ZnC12, glicerol a 10%, 80 mM sacarose, pH 8,0) 'como um controle. As preparacões> foram administradas por via íntravenosa (i.v.) seguindo o esquema: 4 administrações cada três dias e 2 administrações a cada dois días. Quando um grupo terapêutico alcançau o tamanho médio do tumor de -1,000 mIn3, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-
281. Os resultados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-prkdc'"idHR'" sobrecarregados com câncer de fígado de PLC/PRF/5 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. ll e comparativameríte com rhTRAIL114-281 são mostrados na FliG. 28 como um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 29, que mostra a inibição do crescimento do tum"or (TGI%) como a perce.ntagem de controle.
Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 28 e 29 mostram que a admínístração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. ll causou inibição do crescimento do tumor PLC/PRF/5, com tgi, respectivamente, 70,6® e 63,8% em relação ao controle no 49" dia da experiência. para rhTRAIL114-281 utilizado como referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescimento de células de tumor foí obtido ext relaçâo ao controle, com TGI no nível de -18%. Assím, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais significa'tivo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho. Camundongos Crl: SHO-prkdc""ídHRh" A. No dia 0, os camundongos Crl: SHO-Prkdc·'"idHRhr 5 foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 5X106 de células HépG2 suspendidas em 0,2 mL de tampáo HBSS por meio de uma serínga com uma agulha de 0,5 X25 min (Bogmark)4 Quando os tumores atingiram o tamanho de -190- 220 md (dia 31), os camundongos foram randomizados para obter o tamanho médío dos tumores no grupo de -200 =3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as prepafações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 (30 mg/kg), Ex. 19 (30 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como uma comparação contra a formulaçâo tampão (5 mM de NaH2PO4, 95 ínM de Na,HpO,, 200 mM de NaCl, 5 mM de glwtatioria, 0,1 mM de ZTlCl2, glicerol a 10%, 80 mM sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram administradas por via intravenosa (i·v.) seis vezes a cada dois dias. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de -1,000 InIn3, os camundongos foram sacrifícados por ruptura da medula espinhai. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-
281. Os resu1tados experimentais obtidos em camundongos Crl: SHO-prkdc"""dHRh" sobrecarregados com câncer de fígado de HepG2 tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 19 e comparativamente com rhTRAIL114-281 são mostrados na FIG. 30 corno um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 31, que mostra a inibição do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 30 e 31 mostram que a administração das proteínas de fusão da in-venç'ào de Ex. 6 e Ex. 19 causou inibíção do cresciniento do tumor HepG2, com TGI, respectivamente, 82,6% e 43% em relação ao controLe no 33" dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 utilizado como 5 referência comparativa, um ligeiro efeito inibitório no crescime.nto de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de -12,6¶. Âssim, as proteínas d.e fusáo da invenção exercem efeito muito mais significativo comp'arado com rhTRAIL114-281 sozinho. Modelo de cãncer de pâncreas No dia 0, os camundongos Crl:sHO-prkdc""idHRh" foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita com 7x1O' de células PANCI suspendidas em 0,1 rnl, de HBSS:Matrigel, Mistura 3:1 por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 X25 mm (Bogmark). Quando os tumores atingiram o' tamanho de -87-110 TnIrI3 (dia 27), os camundongos foram randomizados para obter q tamanho médío dos tumores no grupo de -95 Irun3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da invenção de Ex. 11 (50 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (5 mM de NaH,pO,, 95 mM de Na,HPO4, 200 mM de NaCí, 5 inM de glutatíona, 0,1 ínM de ZnCl2, lOOmM de l- arginina, 80 mM sacarose, pH 8,0) como um controle. As
2.5 preparações foram administradas por via intravenosa (i-v-) seís vezes a cada dois días. Quando um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de -1,000 mN, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo eontrole recebeu rhTRAIL114-281. Os resul-tados experimentais obtidos em camundongos crl: SHO-prkdc'"LdHRh" sobrecarregados com cãncer de pâncreas de PANCI tratados com as proteínas de fusão da invenção de Ex. 11 e comparativamente eom rhTRAILI14-281 são mostrados na FTG. 32 eomo um diagrama da mudança do volume do tumor e na FIG. 33, que mostra a inibíção do crescimento do tumor (TGI%) como a percentagem de controle.
Os resultados das experiências apresentados nos 5 gráfícos das Figuras 32 e 33 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. ll causou inibição do crescimento do tumor PANCI, com TGI 43% em relação ao controle no 40" dia da experiência. Para rhTRAIL114-281 trtilizado como referència comparativa, um 1igeiro efeito inibitório no crescimen.to de células de tumor foi obtido em relação ao controle, com TGI no nível de 12,0%. Assiín, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muito mais signi£icativo comparado com rhTRAIL114- 281 sozinho. Modelo de sarcoma uterino humano resistente a múltiplos medicamentos No dia 0, os camundongos Crl:SHO-prkdc""LdHRh" foram enxertados subcutaneamente (SC) na lateral direita cam 7x106 de células MES-SA/Dx5 suspendidas em 0,1 mL de HBSS:Matrigel, Mistura 10:1 por meio de uma seringa com uma agulha de 0,5 x25 mm (Bogmark). Quando os tumores atíngiram o tamanho de -167-190 mN (dia 19), os camundongos foram ran:domízados para obter o tamanho médío dos tumores no grupo de -180 mn3 e designados aos grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram administrados com as preparações das proteínas de fusão da ínvenção de Ex. 6, Ex. 19 (30 mg/kg) e rhTRAIL114-281 (10 mg/kg) como uma comparação contra a formulação tampão (5 mM de NaH2PO,, 95 mM de Na,HPO,, 200 mM de NaCl, 5 mM de glutationa, 0,1 mM de zncl2, glicerol a 10%, 80 mM sacarose, pH 8,0) como um controle. As preparações foram admínistradas por via intravenosa (irV.) seis vezes a cada dois dias. Quand.o um grupo terapêutico alcançou o tamanho médio do tumor de h r 102/102 -1,000 mN, os camundongos foram sacrificados por ruptura da medula espinhal. O grupo controle recebeu rhTRAIL114-
281.
Os resultados experimentais obtidos em 5 camundongos Crl: SHO-prkdc""idHRh" sobrecarregados com sarcoma uterino de MES-SA/DX5 tratados com as proteínas de fusão da invençãa de Ex. 18, Ex. 6 e Ex. 19 e comparativamente com rhTRAILI14-281 são mostrados n.a FIG. 34 como um diagrama da mudança do voIume do tumor e na FIG. 10 35, que mostra a inibição do crescimento do tumor (Tgr%) como a percentagem de controle. Os resultados das experiências apresentados nos gráficos das Figuras 34 e 35 mostram que a administração das proteínas de fusão da invenção de Ex. 6 e Ex. 19 causou 15 inibíçào do crescímento do tumor MES-SA/DX5, com TGI, respectivamente, 99,7* e 99,7% em relacão ao controle no G¥ 33° dia da experíêncía. Para rhTRAIL1l4-28l utilizado como referência comparativa, um Iigeiro efeito ínibitórío no crescimento de células de tumor foi obtido em relação ao 20 controle, com TGI no nível de 29®. Assim, as proteínas de fusão da invenção exercem efeito muíto mais significativo comparado com rhTRAIL114-281 sozinho. As proteínas de fusão testadas não causaram efeitos colaterais significativos manifestados por uma 25 díminuição no peso corporal de camundongos (isto é, menor do que 10% do peso corporal inícial usado como reférê'ncia). Isso mostra baixa toxícidade sistemica da protein.a.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende: - domínio (a) compreendendo um fragmento 5 funcional da sequência de proteína hTRAIL solúvel iniciando com aminoácido em uma posição não inferior a hTRAIL95 ou uma sequência tendo pelo menos 70% da identidade da sequência com o fragmento funcional; e - domínio (b) constituindo uma sequência do peptídeo efetor antiangiogênico, que é o inibidor do receptor do fator de crescimento e é selecionado a partir do grupo de fragmentos de fator de crescimento consistindo de fragmento de VEGF de SEQ. No. 17, fragmento de PDGF de SEQ. No. 22 e fragmento de EGF de SEQ. No. 23; em que a sequência de domínio (b) está ligada ao C-terminal ou N-terminal do domínio (a).
2. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio (a) compreende o fragmento da sequência de proteína hTRAIL solúvel iniciando com um aminoácido a partir da faixa de hTRAIL95 a hTRAIL121, inclusive, e finalizando com o aminoácido hTRAIL281.
3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o domínio (a) é selecionado a partir do grupo consistindo em hTRAIL95-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 e hTRAIL121-281.
4. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão entre o domínio (a) e o domínio (b) contém o domínio (c) compreendendo um sítio de clivagem de protease, selecionado a partir de uma sequência reconhecida por metaloprotease MMP, uma sequência reconhecida por uroquinase uPA, e combinações destas.
5. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a sequência reconhecida por metaloprotease MMP é SEQ. No. 24, SEQ. No. 55 ou SEQ. No. 56, a sequência reconhecida por uroquinase 5 uPA é SEQ. No. 25.
6. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que o domínio (c) é uma combinação de sequências localizadas próximas umas das outras reconhecidas por metaloprotease MMP e uroquinase uPA.
7. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que a proteína entre os domínios (a), (b), (c) e/ou (d) compreende adicionalmente ligador estérico flexível de glicina, glicina-serina ou cisteína ou combinações destes.
8. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o ligador estérico flexível é selecionado a partir do grupo consistindo em GG, E, GGGCAAACAAC (SEQ. No. 26), GGCAAACAAC (SEQ. No. 27), GGGGG (SEQ. No. 28), GGGG (SEQ. No. 29), GGG (SEQ. No. 30) e GSG (SEQ. No. 54).
9. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ. No. 1; SEQ. No. 2; SEQ. No. 3; SEQ. No. 4; SEQ. No. 5; SEQ. No. 6; SEQ. No. 9; SEQ. No. 10; SEQ. No. 11; SEQ. No. 14; SEQ. No. 15; SEQ. No. 46; SEQ. No. 47; SEQ. No. 48 e SEQ. No. 49.
10. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que é uma proteína recombinante.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende como um princípio ativo a proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 em combinação com qualquer veículo farmaceuticamente aceitável.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que está em uma forma para administração parenteral.
13. Uso de uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para tratamento de doenças neoplásicas em mamíferos, incluindo humanos.
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B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: ADAMED PHARMA S.A. (PL)

B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 05/01/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.