ES2628377T3 - Proteína de fusión antineoplásica - Google Patents

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Abstract

Una proteína de fusión que comprende: - dominio (a) que comprende un fragmento funcional de la secuencia de proteína hTRAIL soluble que empieza con un aminoácido en una posición no inferior a hTRAIL95 y capaz de inducir la señal apoptósica en células de mamífero tras la unión a sus receptores sobre la superficie de las células, u homólogo de dicho fragmento funcional que tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con dicho fragmento funcional; y - dominio (b) que constituye una secuencia de péptido efector antiangiogénico que es el inhibidor del receptor de factores de crecimiento y está seleccionado del grupo de fragmentos de factores de crecimiento que consisten en fragmento de VEGF de SEQ. No. 17, fragmento de PDGF de SEQ. No. 22 y fragmento de EGF de SEQ. No. 23; en la que la secuencia de dominio (b) está unida en el extremo C o extremo N del dominio (a).

Description

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DESCRIPCION
Protema de fusion antineoplasica
La invencion se refiere al campo de las protemas de fusion terapeuticas, en particular protemas de fusion recombinantes. Mas particularmente, la invencion se refiere a protemas de fusion que contienen el fragmento de una secuencia de la protema TRAIL humana soluble en combinacion con una secuencia de un peptido antiangiogenico, composiciones farmaceuticas que las contienen, y su uso en terapia, particularmente como agentes antineoplasicos.
La protema TRAIL, que pertenece a la familia de citocinas (ligando inductor de la apoptosis relacionada con el factor de necrosis tumoral), tambien conocida como Apo2L (ligando de Apo2), es un potente activador de la apoptosis en celulas tumorales y en celulas infectadas por virus. TRAIL es un ligando que existe de forma natural en el cuerpo. La protema TRAIL, su secuencia de aminoacidos, secuencias de ADN codificantes y sistemas de expresion de protemas se desvelaron por primera vez en el documento EP0835305A1.
La protema TRAIL ejerce su actividad antineoplasica por la union a los receptores 1 y 2 de superficie de TRAIL pro- apoptosica (TRAIL-R1/R2) y posterior activacion de estos receptores. Estos receptores, tambien conocidos como DR4 y DR5 (receptor 4 de muerte y receptor 5 de muerte), pertenecen a la familia de receptores de TNF y son expresados en exceso por diferentes tipos de celulas cancerosas. La activacion de estos receptores puede inducir la via de senalizacion externa de apoptosis independiente del gen supresor p53, que por caspasa-8 activada conduce a la activacion de caspasas ejecutoras y asf la degradacion de acidos nucleicos. La caspasa-8 liberada tras la activacion de TRAIL tambien pueden producir la liberacion de protema Bid y asf la activacion indirecta de la via mitocondrial, siendo la protema Bid translocada a la mitocondria, donde estimula la liberacion de citocromo c, amplificando asf indirectamente la senal apoptosica de receptores de muerte.
TRAIL actua selectivamente sobre celulas tumorales esencialmente sin inducir la apoptosis en celulas sanas que son resistentes a esta protema. Por tanto, se reconocio el enorme potencial de TRAIL como un agente antineoplasico que actua sobre una amplia variedad de tipos diferentes de celulas tumorales, que incluyen tumores malignos hematologicos y tumores solidos, mientras que se ahorran celulas normales y que ejercen efectos secundarios potencialmente relativamente pequenos.
La protema TRAIL es una protema de membrana de tipo II que tiene la longitud de 281 aminoacidos, y su region extracelular que comprende los restos de aminoacidos 114-281 tras la escision por proteasas forma la molecula soluble sTRAIL de 20 kDa de tamano, que tambien es biologicamente activa. Tanto las formas TRAIL como sTRAIL son capaces de desencadenar la apoptosis mediante la interaccion con receptores de TRAIL presentes en celulas diana. Se demostro la fuerte actividad antitumoral y la muy baja toxicidad sistemica de la parte soluble de la molecula TRAIL usando pruebas de lmeas celulares.
Por tanto, estudios clmicos humanos con TRAIL soluble humana recombinante (rhTRAIL) que tiene la secuencia de aminoacidos correspondiente a los aminoacidos 114-281 de hTRAIL, conocida con el nombre INN dulanermina, mostraron su buena tolerancia y ausencia de toxicidad limitante de dosis.
El fragmento de TRAIL mas corto de 114-281 tambien es capaz de unirse con los receptores de muerte de membrana e inducir la apoptosis mediante estos receptores, como se ha informado recientemente para el mutante circularmente permutado recombinante de 122-281hTRAIL, por ejemplo, en el documento EP 1 688 498.
Efectos toxicos de la protema TRAIL recombinante sobre las celulas del tugado informados hasta ahora parecen estar asociados a la presencia de modificacion, es decir, marcas de polihistidina, mientras que TRAIL no marcada no mostro toxicidad sistemica.
Sin embargo, en el transcurso de investigacion adicional y desarrollo parecio que muchas celulas cancerosas mostraron resistencia a TRAIL primaria o adquirida (vease, por ejemplo, el documento WO2007/022214). Aunque el mecanismo de resistencia a TRAIL no ha sido completamente entendido, se cree que puede manifestarse el mismo a diferentes niveles de la via de apoptosis inducida por TRAIL, que oscila del nivel de receptores de la superficie celular a las caspasas ejecutoras dentro de la via de senalizacion. Esta resistencia limita la utilidad de TRAIL como agente antineoplasico.
Ademas, en ensayos clmicos en pacientes la eficacia actual de TRAIL como monoterapia demostro ser baja. Para vencer esta baja eficiencia y la resistencia de tumores a TRAIL, se disenaron diversas terapias de combinacion con agentes radio- y quimioterapeuticos, que produjeron efecto apoptosico sinergico (documento WO2009/002947; A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348; RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, No 6, 2001, 535-546, Soria JC et al., J. Clin. Oncology, Vol 28, No 9 (2010), p. 1527-1533). El uso de rhTRAIL para el tratamiento de cancer en combinacion con agentes quimioterapeuticos convencionales seleccionados (paclitaxel, carboplatino) y anticuerpos anti-VEGF monoclonales se describen en el documento WO2009/140469. Sin embargo, una combinacion tal necesariamente implica deficiencias muy conocidas de quimioterapia o radioterapia convencionales.
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Ademas, el problema conectado con la terapia de TRAIL ha demostrado ser su baja estabilidad y rapida eliminacion del cuerpo despues de la administracion.
Una de las dianas en la terapia del cancer tambien es la inhibicion de la angiogenesis tumoral. La angiogenesis (neovascularizacion) es un proceso patologico ilimitado en el tiempo de desarrollo de nuevos vasos sangumeos que suministran a los tumores oxfgeno y nutrientes. La angiogenesis es indispensable para el crecimiento y la expansion del tumor y promover su metastasis.
Se conoce el efecto beneficioso de la inhibicion de la angiogenesis tumoral en la terapia del cancer. Se hicieron intentos para el uso clmico de sustancias que inhiben o regulan el proceso de angiogenesis, tanto como una terapia del cancer como una terapia del cancer complementaria.
Se conocen inhibidores de la angiogenesis, tanto los endogenos naturalmente presentes en el cuerpo humano como numerosas sustancias antiangiogenicas exogenas. Entre ellos se conocen inhibidores de la angiogenesis proteinaceos, que incluyen fragmentos proteoltticos de protemas endogenas. Como ejemplos, pueden mencionarse inhibidores de protema de la angiogenesis tales como angiostatina (un fragmento de plasminogeno), endostatina (fragmento del extremo C de colageno XVIII), calreticulina, vasostatina - un fragmento de calreticulina, un fragmento de prolactina, un fragmento de metaloproteinasa 2, o tumstatina - un fragmento de colageno IV (Cao Y. Angiogenesis modulates adipogenesis and obesity. J Clin Invest. 2007;117(9):2362-2368, Folkman J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery? Nat Rev Drug Discov. 2007;6:273-286).
Por ejemplo, la tumstatina es un peptido del tamano de 28 kDa - un fragmento de colageno de tipo IV, capaz de unirse a integrina avl33 y prevenir la angiogenesis por inhibicion de la proliferacion de celulas endoteliales. Ademas, la tumstatina inhibe independientemente la activacion de la cinasa de adhesion focal (FAK) y fosfatidilinositol 3- cinasa PI3 y protema cinasa PKB/Akt.
La actividad antiangiogenica tambien puede ser ejercida por la inhibicion de protemas pro-angiogenicas, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que actua mediante receptores localizados sobre el endotelio vascular y que es el principal estimulante de la neoangiogenesis.
En el tratamiento clmico, que incluye terapia del cancer, ya se han usado como factores antiangiogenicos ciertas sustancias dirigidas contra VEGF, tales como los anticuerpos monoclonales bevacizumab y ranibizumab. Tambien se conocen otros factores proangiogenicos que estimulan la proliferacion y migracion de celulas endoteliales independientemente de los receptores localizados en el endotelio, que incluyen, por ejemplo, citocinas tales como factores de crecimiento derivados de plaquetas PDGF y factor de crecimiento epidermico eGf, TNF y angiopoyetina.
En el proceso de la angiogenesis tambien participa la enzima aminopeptidasa N (APN/CD13), que es una metaloproteasa transmembranaria. Se sabe que la inhibicion de esta enzima puede conducir a la inhibicion de procesos neoplasicos. Se conocen varios inhibidores de aminopeptidasa N naturales y sinteticos (Bavouis B., Dauzonne D., Aminopeptidase-N/CD13 (EC 3.4.11.2) inhibitors: chemistry, biological evaluations, and therapeutic prospects. Medical Research Review, 2006, 26, (1), 88-130).
Los inhibidores naturales de APN/CD13 incluyen principalmente sustancias producidas por microorganismos. Como representativas, entre otras, puede mencionarse bestatina, curcumina y apigenina. Tambien se encontro que un peptido corto que contema el motivo CNGRC era capaz de unirse eficientemente a CD13 (Arap et al., Science, 279:377-380, 1998).
Muchas de las sustancias antiangiogenicas estan actualmente en diferentes etapas de investigaciones, que incluyen ensayos clmicos. Sin embargo, las terapias conocidas que pretenden inhibir la angiogenesis tienen muchas desventajas muy conocidas. Por ejemplo, recientemente se han cuestionado los beneficios del anticuerpo monoclonal terapeutico bevacizumab en el tratamiento de cancer de mama. Muchos farmacos antiangiogenicos muestran, por ejemplo, una semivida muy corta, baja solubilidad, mala biodisponibilidad y efectos secundarios toxicos.
La seguridad de farmacos antiangiogenicos es de especial importancia debido al uso prolongado y la falta de selectividad de terapia. La fuerte necesidad de un terapeutico eficaz y la naturaleza de las enfermedades oncologicas necesitan un procedimiento de registro simplificado para tal grupo de farmacos, por tanto es imposible conocer todos los efectos secundarios e inconvenientes del farmaco. Aunque, al contrario de los quimioterapeuticos, que se dirigen a todas las celulas de proliferacion rapida, los farmacos antiangiogenicos se dirigen a diferentes estadios de formacion de vasos sangumeos, produciendo la reduccion de la toxicidad de la terapia. Sin embargo, todavfa existe la necesidad de terapia antineoplasica que pretenda inhibir la angiogenesis, mientras que se asegure la selectividad contra celulas tumorales. Por tanto, existe la necesidad de nuevas terapias antineoplasicas antiangiogenicas con caractensticas toxicologicas mejoradas.
Se describio por A.I. Guo et al. en Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2008, vol. 24(10), 925-930 que la protema de fusion construida que contiene secuencias de un inhibidor de la angiogenesis vasostatina y TRAIL114-281 asociadas con un conector de sitio de escision de metaloproteasa presentaba el efecto inductor de la apoptosis en celulas tumorales.
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Se describio en el documento CN1609124A que la protema de fusion construida que contiene secuencias de un inhibidor de la angiogenesis calreticulina y TRAIL114-281 presentaba efecto inductor de la apoptosis en celulas tumorales.
El documento CN 1256347C desvela protema de fusion compuesta de cininogeno D5 60-148 y TRAIL 114-281.
La protema de fusion construida que contiene secuencias de un inhibidor de la angiogenesis kininostatina, vasostatina y canstatina unida al extremo N o C de TRAIL114-281 unida con el conector que codifica GGGSGGSG se menciona en Feng Feng-Yi "Phase and Clinical Trial of Rh-Apo2L and Apo2L-Related Experimental Study", tesis doctoral, Chinese Peking Union Medical, ;
http://www.lw23.com/lunwen_957708432.
Se describio que la protema de fusion construida que contiene las secuencias tumstatina 183-230 de un inhibidor de la angiogenesis tumstatina y TRAIL114-281 presentaba induccion de la apoptosis de celulas de cancer pancreatico por N. Ren et al. en Academic Journal of Second Military Medical University 2008, vol. 29(5), 474-478.
El documento US2005/244370 y el documento WO2004/035794 correspondiente desvelan la construccion de TRAIL95-281 como un dominio efector unido por un conector peptfdico con parte extracelular de otro miembro de ligandos CD40 de la familia TNF como dominio de union de superficie celular. Se establece que la activacion de la construccion es mediante la union de su parte CD40.
El documento WO2010/005519 desvela protema de fusion que comprende el dominio extracelular de TRAIL y un polipeptido que se une al ligando TWEAk, espedficamente el receptor de Fn14 soluble, que es el receptor de TWEAK relacionado. La protema de fusion tiene actividad de aniquilacion contra celulas cancerosas debido a la union del dominio de TRAIL a sus receptores de muerte de membrana. El dominio Fn14 de la protema de fusion, debido a su actividad de union a TWEAK, bloquea el eje Fn14/TWEAK celular y los efectos celulares de TWEAK, que incluyen sus efectos pro-tumorigenicos y pro-apoptosicos, dependiente de la union de TWEAK al receptor de Fn14 no soluble de membrana.
La presente invencion proporciona una solucion de este problema proporcionando novedosas protemas de fusion que comprenden un dominio derivado de TRAIL y un dominio de peptido efector corto que tiene la actividad antiangiogenica y que no incluye fragmentos de TRAIL, en la que el peptido efector potencia o complementa la accion de TRAIL.
Las protemas segun la invencion se dirigen selectivamente a celulas cancerosas, donde los elementos individuales de la protema ejercen sus efectos, en particular los peptidos efectores inhiben la angiogenesis tumoral. La administracion de las protemas de la invencion en el entorno tumoral permite minimizar la toxicidad contra celulas sanas en el cuerpo, ademas de los efectos secundarios y para reducir la frecuencia de administracion. Ademas, la terapia dirigida con el uso de protemas segun la invencion permite evitar el problema de la baja eficiencia de terapias antiangiogenicas no espedficas previamente conocidas producidas por la baja permeabilidad de los vasos sangumeos.
Ademas, resulto que en muchos casos las protemas de fusion de la invencion son mas potentes que TRAIL soluble y sus variantes que incluyen un fragmento de la secuencia. Hasta ahora, los peptidos efectores conocidos usados en la protema de fusion de la invencion no se usaron en medicina como tales debido a la cinetica desfavorable, rapida degradacion por proteasas no espedficas o acumulacion en el cuerpo producida por la falta de una secuencia apropiada de activacion de vfas que son necesarias para permitir la accion apropiada del peptido efector en el sitio diana. La incorporacion del peptido efector en la protema de fusion permite su administracion selectiva al sitio donde se desea su accion. Ademas, la union del peptido efector aumenta la masa de protema, produciendo semivida prolongada y elevada retencion de la protema en el tumor y su eficiencia potenciada.
Adicionalmente, en muchos casos, protemas de fusion novedosas tambien vencen la resistencia a TRAIL.
Descripcion de las figuras
La invencion se describira ahora en detalle con referencia a las figuras del dibujo.
La Fig. 1 presenta una estructura esquematica de protemas de fusion de la invencion segun el Ej. 1, Ej. 2, Ej. 4, Ej. 5
y Ej. 6.
La Fig. 2 presenta una estructura esquematica de protemas de fusion de la invencion segun el Ej. 9, Ej. 10 y Ej. 11.
La Fig. 3 presenta una estructura esquematica de protemas de fusion de la invencion segun el Ej. 14 y Ej. 15.
La Fig. 4 muestra espectros de dicndsmo circular para rhTRAIL95-281 y protemas de fusion del Ej. 1, Ej. 4, Ej. 5, Ej.
9 y Ej. 14 expresadas en elipticidad espedfica.
La Fig. 5 presenta los cambios de volumen del tumor (% del estadio inicial) en ratones Crl:CD1-Foxn1nu afectados con cancer de colon HCT116 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 1, Ej. 4, Ej. 5 y Ej. 9 en comparacion con rhTRAIL114-281.
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La Fig. 6 presenta la inhibicion de los valores de crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crl:CD1 -Foxn1nu 1 afectados con cancer de colon HCT116 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 1, Ej. 4, Ej. 5 y Ej. 9 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 7 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Crl:CD1-Foxn1nu afectados con cancer de pulmon A549 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 1 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 8 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crl:CD1-Foxn1nu 1 afectados con cancer de pulmon A549 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 1 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 9 presenta una estructura esquematica de protemas de fusion de la invencion segun el Ej. 16, Ej. 17, Ej. 18 y Ej. 19.
La Fig. 10 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Crl:CD1-Foxn1nu afectados con cancer de colon HCT116 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 5, Ej. 4, Ej. 9 y Ej. 1 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 11 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crt:CD1 -Foxn1nu 1 afectados con cancer de colon HCT116 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 5, Ej. 4, Ej. 9 y Ej. 1 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 12 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de colon HCT116 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 11 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 13 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de colon HCT116 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 11 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 14 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de colon Colo205 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 19 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 15 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de colon Colo205 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 19 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 16 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de colon SW620 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 11 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 17 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de colon SW620 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 11 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 18 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Cby.Cg-foxn1(nu)/J afectados con cancer de pulmon A549 tratados con protema de fusion de la invencion del Ej. 1 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 19 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Cby.Cg-foxn1(nu)/J afectados con cancer de pulmon A549 tratados con protema de fusion de la invencion del Ej. 1 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 20 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de pulmon NCI-H460 tratados con protema de fusion de la invencion del Ej. 6 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 21 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de pulmon NCI-H460 tratados con protema de fusion de la invencion del Ej. 6 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 22 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de pulmon A549 tratados con protema de fusion de la invencion del Ej. 5, Ej. 6, Ej. 11 en comparacion con rhTRAIL114-281.
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La Fig. 23 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crl:SHO-PrkdcsCidHrhr afectados con cancer de pulmon A549 tratados con protema de fusion de la invencion del Ej. 5, Ej. 6, Ej. 11 en comparacion con rhTRAILll4-281.
La Fig. 24 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de pulmon NCI-H460-Luc2 tratados con protema de fusion de la invencion del Ej. 5 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 25 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de pulmon NCI-H460-Luc2 tratados con protema de fusion de la invencion del Ej. 5 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 26 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de pulmon A549 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 5 y Ej. 1 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 27 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de pulmon A549 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 5 y Ej. 1 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 28 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de hngado PLC/PRF/5 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 11 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 29 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de hngado PLC/PRF/5 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 11 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 30 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de hngado HepG2 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 19 en comparacion con rhTRAIL114-281
La Fig. 31 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de hngado HepG2 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 19 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 32 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de pancreas PANC-1 tratados con protema de fusion de la invencion del Ej. 11 en comparacion con rhTRAIL114-281
La Fig. 33 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de pancreas PANC-1 tratados con protema de fusion de la invencion del Ej. 11 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 34 presenta los cambios de volumen tumoral (% del estadio inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con sarcoma uterino humano multirresistente MES-SA/Dx5 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 19 en comparacion con rhTRAIL114-281.
La Fig. 35 presenta los valores de inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con sarcoma uterino humano multirresistente MES-SA/Dx5 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 19 en comparacion con rhTRAIL114-281.
Descripcion detallada de la invencion
La invencion se refiere a una protema de fusion que comprende:
- dominio (a) que es el fragmento funcional de una secuencia de protema hTRAIL soluble que empieza con un aminoacido en una posicion no inferior a hTRAIL95 y capaz de inducir la senal apoptosica en celulas de mairnfero tras la union a sus receptores sobre la superficie de las celulas, o un homologo de dicho fragmento funcional que tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con dicho fragmento funcional, y
- dominio (b) que es una secuencia de un peptido efector antiangiogenico, que es el inhibidor del receptor de factores de crecimiento y esta seleccionado del grupo de fragmentos de factores de crecimiento que consiste en fragmento de VEGF de SEQ. No. 17, fragmento de PDGF de SEQ. No. 22 y fragmento de EGF de SEQ. No. 23;
en la que la secuencia del dominio (b) esta unida en el extremo C o extremo N del dominio (a).
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El termino "el fragmento soluble funcional de una secuencia de hTRAIL soluble" debe entenderse como que indica cualquiera de tal fragmento de hTRAIL soluble que es capaz de inducir la senal apoptosica en celulas de mai^ero tras la union a sus receptores sobre la superficie de las celulas.
Tambien se apreciara por un experto que se conoce en la tecnica la existencia de al menos el 70 % de homologfa de la secuencia de TRAIL.
Debe entenderse que el dominio (b) del peptido efector en la protema de fusion de la invencion no es ni la protema hTRAIL ni una parte o fragmento de la protema hTRAIL.
El termino "peptido" segun la invencion debe entenderse como una molecula formada de la pluralidad de aminoacidos unidos juntos por medio de un enlace peptfdico. Asf, el termino "peptido" segun la invencion incluye oligopeptidos, polipeptidos y protemas.
En la presente invencion, las secuencias de aminoacidos de peptidos se presentaran de un modo convencional adoptado en la materia en la direccion de extremo N (extremo N) del peptido hacia su extremo C (extremo C). Asf, cualquier secuencia tendra su extremo N en el lado izquierdo y el extremo C en el lado derecho de su presentacion lineal.
La protema de fusion de la invencion incorpora al menos un dominio (b) del peptido efector, unido en el extremo C o extremo N del dominio (a).
En una realizacion particular, el dominio (a) es un fragmento de la secuencia de hTRAIL, que empieza con un aminoacido del intervalo de hTRAIL95 a hTRAIL121, ambos incluidos, y que termina con el aminoacido hTRAIL 281.
En particular, el dominio (a) puede seleccionarse del grupo que consiste en secuencias correspondientes a hTRAIL95-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 y hTRAIL121-281. Sera evidente para aquellos expertos en la materia que hTRAIL95-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 y hTRAIL121-281 representan un fragmento de protema TRAIL humana que empieza con el aminoacido marcado con el numero 95, 119, 120 y 121, respectivamente, en la secuencia de hTRAIL conocida (SEQ. No. 16) publicada en GenBank con el N.° de acceso P50591.
En otra realizacion particular, el dominio (a) es un homologo de fragmento funcional de la secuencia de protema hTRAIL soluble que empieza en la posicion de aminoacido no inferior a hTRAIL95 y que termina en el aminoacido hTRAIL281, cuya secuencia es al menos el 70 %, preferentemente el 85 %, identica a la secuencia original.
En variantes espedficas de esta realizacion, el dominio (a) es un homologo de un fragmento seleccionado del grupo que consiste en secuencias correspondientes a hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL116-281, hTRAIL120-281, hTRAIL121-281 y hTRAIL122-281.
Debe entenderse que un homologo de un fragmento de hTRAIL es una variacion/modificacion de la secuencia de aminoacidos de este fragmento, en el que al menos un aminoacido se cambia, que incluye 1 aminoacido, 2 aminoacidos, 3 aminoacidos, 4 aminoacidos, 5 aminoacidos, 6 aminoacidos, y no mas del 15 % de los aminoacidos, y en el que un fragmento de la secuencia modificada ha preservado la funcionalidad de la secuencia de hTRAIL, es decir, la capacidad de union a receptores de muerte de la superficie celular e induccion de apoptosis en celulas de mairnfero. La modificacion de la secuencia de aminoacidos puede incluir, por ejemplo, sustitucion, delecion y/o adicion de aminoacidos.
Preferentemente, el homologo de fragmento de hTRAIL que tiene secuencia modificada muestra una afinidad modificada por los receptores de muerte DR4 (TRAIL-R1) o DR5 (TRAIL-R2) en comparacion con el fragmento nativo de hTRAIL.
El termino "afinidad modificada" se refiere a una elevada afinidad y/o afinidad con selectividad por receptor alterada.
Preferentemente, el homologo del fragmento de hTRAIL que tiene secuencia modificada muestra elevada afinidad por los receptores de muerte DR4 y DR5 en comparacion con fragmento nativo de hTRAIL.
Particularmente preferentemente, el homologo del fragmento de hTRAIL que tiene secuencia modificada muestra elevada afinidad por el receptor de muerte DR5 en comparacion con el receptor de muerte DR4, es decir, un aumento de la selectividad DR5/DR4.
Tambien preferentemente, el homologo de fragmento de hTRAIL que tiene secuencia modificada muestra un aumento de la selectividad hacia los receptores de muerte DR4 y/o DR5 en relacion con la afinidad hacia los receptores DR1 (TRAIL-R3) y/o DR2 (TRAIL-R4).
Las modificaciones de hTRAIL que producen elevada afinidad y/o selectividad hacia los receptores de muerte DR4 y DR5 son conocidas para aquellos expertos en la materia, por ejemplo de la publicacion Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. J. Biol. Chem. 2008 Jul
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18;283(29):20560-8, que describe la mutacion D218H que tiene elevada selectividad hacia DR4, o Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun;14(6):778-87, que describe la mutacion D269H que tiene una reducida afinidad hacia DR4. Los mutantes de hTRAIL que producen elevada afinidad hacia un receptor seleccionado de DR4 y DR5 en comparacion con los receptores DRl y DR2 y elevada afinidad hacia el receptor DR5 en comparacion con DR4 tambien se describen en los documentos WO2009077857 y WO2009066174.
Mutaciones adecuadas son una o mas mutaciones en las posiciones de hTRAIL nativo seleccionadas del grupo que consiste en 131, 149, 159, 193, 199, 201,204, 204, 212, 215, 218 y 251, en particular, mutaciones que implican a la sustitucion de un aminoacido con un aminoacido basico tal como lisina, histidina o arginina, o aminoacido tal como acido glutamico o acido asparagmico. Particularmente, pueden especificarse una o mas mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en G131R, G131K, R1491, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201H, K201R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251D, K251E y K251Q, como se describe en el documento WO2009066174.
Mutaciones adecuadas tambien son una o mas mutaciones en las posiciones de hTRAIL nativo seleccionadas del grupo que consiste en 195, 269 y 214, particularmente mutaciones que implican la sustitucion de un aminoacido con un aminoacido basico tal como lisina, histidina o arginina. Particularmente, pueden especificarse una o mas mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en D269H, E195R, y T214R, como se describe en el documento WO2009077857.
En una realizacion particular, el dominio (a) que es un homologo del fragmento de hTRAIL esta seleccionado del mutante D218H de la secuencia de TRAIL nativa, como se describe en el documento WO2009066174, o el mutante Y189N-R191K-Q193R-H264R-I266R-D269H de la secuencia de TRAIL nativa, como se describe en Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun;14(6):778-87.
Dentro del grupo de inhibidores de receptores para los factores de crecimiento, el peptido efector de dominio (b) puede ser un fragmento de factor de crecimiento endotelial vascular humano VEGF que une el receptor de VEGF competitivamente al ligando natural, aunque el mismo carece de actividad angiogenica. Como consecuencia, la actividad angiogenica de VEGF se bloquea, no hay estimulacion de la formacion de nuevos vasos sangumeos y se inhibe el crecimiento tumoral. El peptido efector del grupo anterior es el peptido que inhibe la via de senalizacion de VEGF y espedficamente el fragmento de 7 aminoacidos de VEGF humano presentado por SEQ. No. 17 en el Listado de secuencias adjunto.
Se cree que el peptido que comprende la secuencia del heptapeptido de VEGF incorporado en la protema de fusion de la invencion eliminara eficazmente celulas cancerosas por la inhibicion del proceso de angiogenesis.
Tambien dentro del grupo de inhibidores de receptores para factores de crecimiento, el peptido efector del dominio (b) puede ser un fragmento de factor de crecimiento derivado de plaquetas PDGF, que une el receptor de PDGF competitivamente al ligando natural, aunque el mismo carece de actividad angiogenica. Como consecuencia, se bloquea la actividad angiogenica de PDGF, no hay estimulacion de la formacion de nuevos vasos sangumeos y se inhibe el crecimiento tumoral.
Un peptido efector tal es un peptido de 19 aminoacidos - un fragmento de ligando de PDGF, mostrado por una secuencia de SEQ. No. 22 en el Listado de secuencias adjunto.
Se cree que el peptido que comprende la secuencia del fragmento de la protema factor de crecimiento derivado de plaquetas PDGF incorporado en la protema de fusion de la invencion eliminara eficazmente las celulas cancerosas por inhibicion del proceso de angiogenesis.
Tambien dentro del grupo de inhibidores de receptores para factores de crecimiento, el peptido efector antiangiogenico del dominio (b) puede ser un fragmento de peptido del factor de crecimiento epidermico EGF, que une el receptor de EGF competitivamente al ligando natural, aunque el mismo carece de actividad angiogenica. Como consecuencia, se bloquea la actividad angiogenica de EGF, no hay estimulacion de la formacion de nuevos vasos sangumeos y se inhibe el crecimiento tumoral. Tales peptidos de bloqueo Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu y Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu capaces de unirse al receptor de EGF sin activacion de cinasa intracelular y de bloquear la actividad de EGR se conocen, por ejemplo, del documento EP0641358. Un peptido efector tal - un fragmento de ligando de EGF, se muestra por una secuencia de SEQ. No. 23 en el Listado de secuencias adjunto.
Se cree que el peptido que comprende la secuencia de factor de crecimiento epidermico EGF incorporada en la protema de fusion de la invencion eliminara eficazmente celulas cancerosas por inhibicion del proceso de angiogenesis.
Tras la union a receptores de TRAIL presentes sobre la superficie de celulas cancerosas, la protema de fusion ejercera un doble efecto. El dominio (a), que es un fragmento funcional de TRAIL o su homologo con funcionalidad
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conservada, ejercera su actividad agonista conocida - es dedr, union a receptores de muerte sobre la superficie celular y activacion de la v^a de apoptosis extrmseca. Despues de la internalizacion de la protema de fusion que comprende el peptido antiangiogenico, el dominio (b) sera capaz de ejercer posiblemente su accion intracelularmente en paralelo a la actividad del dominio de TRAIL. De esta forma, la actividad antineoplasica de TRAIL puede potenciarse por la activacion de otros elementos y mecanismos - tales como la inhibicion esterica del sitio de union de los ligandos de VEGF, PDGF y EGF naturales, e inhibicion de la angiogenesis y neovascularizacion.
En una de las realizaciones de la invencion, el dominio (a) y el dominio (b) estan unidos por al menos un dominio (c) que comprende la secuencia de un sitio de escision reconocido por proteasas presentes en el entorno celular, especialmente en el entorno de la celula tumoral. El enlace del dominio (a) con el dominio (b) por al menos un dominio (c) significa que entre los dominios (a) y (b) puede estar presente mas de un dominio (c), en particular uno o dos dominios (c).
Puede seleccionarse un sitio de escision de proteasa de:
- una secuencia reconocida por metaloproteasa MMP, en particular (Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP) designada como SEQ. No. 24, o (Pro Leu Gly Ile Ala Gly Glu /PLGIAGE) designada como SEQ. No. 55, o (Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro /PLGLAGEP) designada como SEQ. No. 56;
- una secuencia reconocida por urocinasa uPA, en particular Arg Val Val Arg (RVVR en el uso de una letra) designada como SEQ. No. 25 o un fragmento de la misma, que con el ultimo aminoacido de la secuencia con el que esta unida, forma SEQ. No. 25,
y sus combinaciones.
En una de las realizaciones de la invencion, el sitio de escision de proteasa es una combinacion de la secuencia reconocida por metaloproteasa MMP y una secuencia reconocida por urocinasa uPA, localizadas proximas entre sf en cualquier orden.
En una realizacion, el dominio (c) es una combinacion de MMP/uPA SEQ. No. 24/SEQ. No. 25 o una combinacion de uPA/MMP SEQ. No. 25/SEQ. No. 24.
En otra realizacion, el dominio (c) es una combinacion de MMP/uPA SEQ. No 55/SEQ. No. 25 o una combinacion de uPA/MMP SEQ. No. 25/SEQ. No. 55.
En otra realizacion, el dominio (c) es una combinacion de MMP/uPA SEQ. No 56 /SEQ. No. 25 o una combinacion de uPA/MMP SEQ. No. 25/SEQ. No. 56. La proteasas metaloproteasa MMP y urocinasa uPA se expresan en exceso en el entorno tumoral. La presencia de la secuencia reconocida por la proteasa permite la escision del dominio (a) del dominio (b), es decir, la liberacion del dominio funcional (b) y asf su activacion.
La presencia del sitio de escision de proteasa, permitiendo la rapida liberacion del peptido efector, aumenta las probabilidades de transportar el peptido al sitio de su accion antes de que se produzca la degradacion aleatoria de la protema de fusion por proteasas presentes en la celula.
Aparte de los principales elementos funcionales de la protema de fusion, el (los) dominio(s) de sitio de escision, las protemas de fusion de la invencion pueden contener una secuencia/secuencias neutras de un conector de glicina- cistema-alanina esterico flexible (espaciador). Tales conectores/espaciadores son muy conocidos y se describen en la bibliograffa. Su incorporacion en la secuencia de la protema de fusion pretende proporcionar el correcto plegamiento de protemas producido por el proceso de su expresion en exceso en las celulas huesped.
En particular, el conector esterico flexible puede seleccionarse del grupo que consiste en SEQ. No. 26 y SEQ. No. 27, que son combinaciones de restos de glicina, cistema y alanina. En otra realizacion, el conector esterico flexible puede seleccionarse del grupo que consiste en SEQ. No. 28, SEQ. No. 29, SEQ. No. 30 y SEQ. No. 54, que consiste en restos de glicina y serina. Adicionalmente, el conector esterico flexible puede ser cualquier fragmento de SEQ. No. 28, SEQ. No. 29 SEQ. No. 30 y SEQ. No. 54, que actua de conector esterico flexible, por ejemplo un fragmento Gly Gly Gly / GGG o un fragmento Gly Gly / GG.
En una realizacion, el conector esterico flexible tambien puede seleccionarse de resto de aminoacido individual tal como resto de acido glutamico, resto de cistema, serina, prolina o de glicina.
En otra realizacion, el conector esterico flexible puede ser cualquier combinacion de conectores que consiste en SEQ. No. 26, SEQ. No. 27 SEQ. No. 28, SEQ. No. 29, SEQ. No. 30, SEQ. No. 54 y restos de aminoacidos individuales de resto de acido glutamico, cistema, serina, prolina o glicina.
Realizaciones particulares de la protema de fusion de la invencion son protemas de fusion que comprenden un peptido antiangiogenico seleccionado del grupo que consiste en las protemas representadas por SEQ. No. 1, SEQ. No. 2, SEQ. No. 4, SEQ. No. 5, SEQ. No. 6 y SEQ. No. 46, SEQ. No. 47 y SEQ. No. 48, que comprenden como peptido efector un heptapeptido derivado de VEGF.
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Otra realizacion espedfica de la protema de fusion de la invencion es la protema de fusion que comprende un peptido antiangiogenico seleccionado del grupo que consiste en las protemas representadas por SEQ. No. 9, SEQ. No. 10, SEQ. No. 11 y SEQ. No. 49 que comprenden como peptido efector un fragmento de pDgF.
Otra realizacion espedfica de la protema de fusion de la invencion es la protema de fusion que comprende un peptido antiangiogenico seleccionado del grupo que consiste en las protemas representadas por SEQ. No. 14 y SEQ. No. 15 que comprenden como peptido efector un fragmento de eGf.
Una descripcion detallada de la estructura de protemas de fusion representativas mencionadas anteriormente se muestra en las Figuras 1 a 3 y en la Fig. 9, y en los ejemplos presentados en el presente documento mas adelante.
Segun la presente invencion, por protema de fusion se indica una unica molecula de protema que contiene dos o mas protemas o fragmentos de la misma, covalentemente unidos mediante enlace peptfdico dentro de sus cadenas peptfdicas respectivas, sin conectores qmmicos adicionales.
La protema de fusion tambien puede describirse alternativamente como una construccion de protema o una protema quimerica. Segun la presente invencion, los terminos "construccion" o "protema quimerica", si se usan, deben entenderse como con referencia a la protema de fusion como se ha definido anteriormente.
Para un experto en la materia sera evidente que la protema de fusion asf definida pueda sintetizarse por metodos conocidos de smtesis qmmica de peptidos y protemas.
La protema de fusion puede sintetizarse por metodos de smtesis de peptidos qmmica, especialmente usando las tecnicas de smtesis de peptidos en fase solida usando resinas adecuadas como vehmulos. Tales tecnicas son convencionales y conocidas en la tecnica, y se describen, entre otros, en las monograffas, tales como, por ejemplo, Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Edicion, 1984, Pierce Chemical Company.
La protema de fusion puede sintetizarse por los metodos de smtesis qmmica de peptidos como una protema continua. Alternativamente, los fragmentos individuales (dominios) de protema pueden sintetizarse por separado y luego combinarse juntos en un peptido continuo mediante un enlace peptfdico, por condensacion del extremo amino de un fragmento de peptido a partir del extremo carboxilo del segundo peptido. Tales tecnicas son convencionales y muy conocidas.
Para la verificacion de la estructura del peptido conocido pueden usarse metodos de analisis de la composicion de aminoacidos de peptidos, tales como la tecnica de espectrometna de masas de alta resolucion para determinar el peso molecular del peptido. Para confirmar la secuencia de peptidos tambien pueden usarse secuenciadores de protemas, que degradan secuencialmente el peptido e identifican la secuencia de aminoacidos.
Preferentemente, sin embargo, la protema de fusion de la invencion es una protema recombinante, generada por metodos de expresion genica de una secuencia de polinucleotidos que codifica la protema de fusion en celulas huesped.
Tambien se desvela la secuencia de polinucleotidos, particularmente la secuencia de ADN que codifica una protema de fusion como se ha definido anteriormente.
Preferentemente, la secuencia de polinucleotidos, particularmente ADN, que codifica la protema de fusion como se ha definido anteriormente, es una secuencia optimizada para la expresion en E. coli.
Tambien se desvela un vector de expresion que contiene la secuencia de polinucleotidos, particularmente la secuencia de ADN, como se ha definido anteriormente.
Tambien se desvela una celula huesped que comprende un vector de expresion como se ha definido anteriormente.
Una celula huesped preferida para la expresion de protemas de fusion de la invencion es una celula de E. coli.
Los metodos de generacion de protemas recombinantes, que incluyen protemas de fusion, son muy conocidos. En resumen, esta tecnica consiste en la generacion de molecula de polinucleotido, por ejemplo molecula de ADN que codifica la secuencia de aminoacidos de la protema diana y que dirige la expresion de la protema diana en el huesped. Entonces, la protema diana que codifica la molecula de polinucleotido se incorpora en un vector de expresion apropiado, que garantiza una expresion eficiente del polipeptido. El vector de expresion recombinante se introduce entonces en celulas huesped para la transfeccion/transformacion, y como resultado se produce una celula huesped transformada. Esto va seguido de un cultivo de celulas transformadas para expresar en exceso la protema diana, purificacion de protemas obtenidas, y opcionalmente corte por escision de las secuencias de marca usadas para la expresion o purificacion de la protema.
Tecnicas adecuadas de expresion y purificacion se describen, por ejemplo en la monograffa Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), yA. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995.
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Pueden usarse cosmidos, plasmidos o virus modificados como vectores de expresion para la introduccion y replicacion de secuencias de ADN en celulas huesped. Normalmente, los plasmidos se usan como vectores de expresion. Plasmidos adecuados son muy conocidos y estan comercialmente disponibles.
El vector de expresion comprende una molecula de polinucleotido que codifica la protema de fusion de la invencion y las secuencias reguladoras necesarias para la transcripcion y traduccion de la secuencia codificante incorporada en una celula huesped adecuada. La seleccion de secuencias reguladoras depende del tipo de celulas huesped y puede ser facilmente llevada a cabo por un experto en la materia. Ejemplos de tales secuencias reguladoras son promotor y potenciador de la transcripcion o secuencia de union a ARN polimerasa, secuencia de union a ribosoma, que contiene la senal de iniciacion de la transcripcion, insertada antes de la secuencia codificante, y secuencia terminadora de la transcripcion, insertada despues de la secuencia codificante. Ademas, dependiendo de la celula huesped y el vector usado, pueden introducirse otras secuencias en el vector de expresion, tales como el origen de replicacion, sitios de restriccion de ADN adicionales, potenciadores, y secuencias que permiten la induccion de transcripcion.
El vector de expresion tambien comprendera una secuencia de gen marcador, que confiere fenotipo definido a la celula transformada y permite la seleccion espedfica de celulas transformadas. Ademas, el vector tambien puede contener una segunda secuencia de marcador que permite distinguir celulas transformadas con plasmido recombinante que contiene insertada la secuencia codificante de la protema diana de aquellas que han captado el plasmido sin insercion. Casi siempre, se usan marcadores de resistencia a antibioticos tfpicos, sin embargo, puede usarse cualquier otro gen indicador conocido en el campo, cuya presencia en una celula (in vivo) puede ser facilmente determinada usando tecnicas de autorradiograffa, espectrofotometna o bio- y quimio-luminiscencia. Por ejemplo, dependiendo de la celula huesped, pueden usarse genes indicadores tales como p-galactosidasa, p- glucuronidasa, luciferasa, cloranfenicol acetiltransferasa o protema verde fluorescente.
Ademas, el vector de expresion puede contener secuencia senal, que transporta protemas al compartimento celular apropiado, por ejemplo periplasma, donde se facilita el plegamiento. Adicionalmente, puede estar presente una secuencia que codifica una etiqueta/marca, tal como HisTag unida al extremo N o GST unida al extremo C, que facilita la posterior purificacion de la protema producida usando el principio de afinidad, por cromatograffa de afinidad en una columna de mquel. Tambien pueden estar presentes secuencias adicionales que protegen la protema contra la degradacion proteolftica en las celulas huesped, ademas de secuencias que aumentan su solubilidad.
El elemento auxiliar unido a la secuencia de la protema diana puede bloquear su actividad, o ser perjudicial por otro motivo, tal como, por ejemplo, debido a toxicidad. Tal elemento debe eliminarse, que puede llevarse a cabo por escision enzimatica o qmmica. En particular, debe eliminarse una marca de seis histidinas HisTag u otros marcadores de este tipo unidos para permitir la purificacion de protemas por cromatograffa de afinidad, debido a su efecto descrito sobre la toxicidad hepatica de la protema TRAIL soluble. Pueden usarse sistemas de expresion heterologos basados en diversas celulas huesped muy conocidas, que incluyen celulas procariotas: bacterianas, tales como Escherichia coli o Bacillus subtilis, levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, y lmeas celulares eucariotas (insecto, de mairnfero, planta).
Preferentemente, debido a la facilidad de cultivo y manipulacion genetica, y una gran cantidad de producto obtenido, se usa el sistema de expresion en E. coli. Por consiguiente, la secuencia de polinucleotidos que contiene la secuencia diana que codifica la protema de fusion de la invencion se optimizara para la expresion en E. coli, es decir, contendra en la secuencia codificante codones optimos para la expresion en E. coli, seleccionados de las posibles variantes de secuencia conocidas en el estado de tecnica. Ademas, el vector de expresion contendra los elementos anteriormente descritos adecuados para E. coli unidos a la secuencia codificante.
Por consiguiente, en una realizacion preferida, una secuencia de polinucleotidos que comprende una secuencia que codifica una protema de fusion de la invencion, optimizada para la expresion en E. coli, se selecciona del grupo de secuencias de polinucleotidos que consiste en:
SEQ. No. 31; SEQ. No. 32; SEQ. No. 34; SEQ. No. 35; SEQ. No. 36; SEQ. No. 39; SEQ. No. 40; SEQ. No. 41 SEQ. No. 44; SEQ. No. 45, SEQ. No. 50, SEQ. No. 51, SEQ. No. 52; SEQ. No. 53; que codifican una protema de fusion que tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a secuencias de aminoacidos seleccionadas del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos, respectivamente:
SEQ. No. 1; SEQ. No. 2; SEQ. No. 4; SEQ. No. 5; SEQ. No. 6; SEQ. No. 9; SEQ. No. 10; SEQ. No. 11; SEQ. No. 14 SEQ. No. 15, SEQ. No. 46; SEQ. No. 47; SEQ. No. 48; y SEQ. No. 49.
En una realizacion preferida, un vector de expresion adecuado para la transformacion de E. coli comprende la secuencia de polinucleotidos seleccionada del grupo de secuencias de polinucleotidos SEQ. No. 31 a SEQ. No. 45 y SEQ. No 50 a SEQ. No. 53 indicadas anteriormente, ademas de celula de E. coli transformada con un vector de expresion tal.
La transformacion, es decir, introduccion de una secuencia de ADN en celulas huesped bacterianas, particularmente E. coli, se realiza normalmente en las celulas competentes, preparadas para captar el ADN, por ejemplo, mediante tratamiento con iones calcio a baja temperatura (4 °C), y luego sometiendo a choque termico (a 37-42 °C) o por
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electroporacion. Tales tecnicas son muy conocidas y normalmente son determinadas por el fabricante del sistema de expresion o se describen en la bibliograffa y manuales para el trabajo de laboratorio, tales como Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).
El procedimiento de expresion en exceso de protemas de fusion de la invencion en el sistema de expresion en E. coli se describira ademas mas adelante.
La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que contiene la protema de fusion de la invencion como se ha definido anteriormente como principio activo y un vehmulo farmaceuticamente aceptable adecuado, diluyente y componentes auxiliares convencionales. La composicion farmaceutica contendra una cantidad eficaz de la protema de fusion de la invencion y componentes auxiliares farmaceuticamente aceptables disueltos o dispersados en un vehmulo o diluyente, y preferentemente estara en forma de una composicion farmaceutica formulada en una forma de dosificacion unitaria o formulacion que contiene una pluralidad de dosis. Formas farmaceuticas y metodos de su formulacion, ademas de otros componentes, vehmulos y diluyentes, son conocidos para el experto y se describen en la bibliograffa. Por ejemplo, se describen en la monograffa Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, EE.UU.
Los terminos "vehmulo, diluyente y componente auxiliar farmaceuticamente aceptables" comprenden cualquier disolvente, medio de dispersion, tensioactivo, antioxidante, estabilizador, conservante (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifungicos), agente isotonico, conocido en la tecnica. La composicion farmaceutica de la invencion puede contener diversos tipos de vehmulos, diluyentes y excipientes, dependiendo de la via de administracion elegida y forma de dosificacion deseada, tales como formas ffquidas, solidas y de aerosol para oral, parenteral, inhalada, topica, y si esa forma seleccionada debe ser esteril para la via de administracion tal como mediante inyeccion. La via de administracion preferida de la composicion farmaceutica segun la invencion es parenteral, que incluye vfas de inyeccion tales como intravenosa, intramuscular, subcutanea, intraperitoneal, intratumoral, o por infusiones intravenosas unicas o continuas.
En una realizacion, la composicion farmaceutica de la invencion puede administrarse mediante inyeccion directamente al tumor. En otra realizacion, la composicion farmaceutica de la invencion puede administrarse por via intravenosa. En otra realizacion mas, la composicion farmaceutica de la invencion puede administrarse por via subcutanea o por via intraperitoneal. Una composicion farmaceutica para administracion parenteral puede ser una disolucion o dispersion en un medio acuoso o no acuoso farmaceuticamente aceptable, tamponada a un pH apropiado e isosmotico con ffquidos corporales, si fuera necesario, y tambien puede contener antioxidantes, tampones, agentes bacteriostaticos y sustancias solubles, que hacen la composicion compatible con los tejidos o sangre del receptor. Otros componentes, que pueden incluirse en la composicion, son, por ejemplo, agua, alcoholes tales como etanol, polioles tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol ffquido, ffpidos tales como trigliceridos, aceites vegetales, liposomas. La fluidez apropiada y el tamano de parffculas de la sustancia pueden proporcionarse recubriendo sustancias, tales como lecitina, y tensioactivos, tales como polisorbatos de hidroxipropilcelulosa, y similares.
Agentes isotonicos adecuados para las composiciones parenterales ffquidas son, por ejemplo, azucares tales como glucosa, y cloruro sodico, y combinaciones de los mismos.
Alternativamente, la composicion farmaceutica para administracion mediante inyeccion o infusion puede estar en una forma de polvo, tal como un polvo liofilizado para reconstitucion inmediatamente antes de uso en un vehmulo adecuado tal como, por ejemplo, agua libre de pirogenos esteril.
La composicion farmaceutica de la invencion para administracion parenteral puede tambien tener la forma de administracion nasal, que incluye disoluciones, esprays o aerosoles. Preferentemente, la forma para administracion intranasal sera una disolucion acuosa y sera isotonica o tamponada o mantendra el pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5, para mantener un caracter similar a las secreciones nasales. Ademas, contendra conservantes o estabilizadores, tales como en las muy conocidas preparaciones intranasales.
La composicion puede contener diversos antioxidantes que retrasan la oxidacion de uno o mas componentes. Ademas, con el fin de prevenir la accion de microorganismos, la composicion puede contener diversos agentes antibacterianos y antifungicos, que incluyen, por ejemplo, y no se limitan a, parabenos, clorobutanol, timerosal, acido sorbico, y sustancias conocidas similares de este tipo. En general, la composicion farmaceutica de la invencion puede incluir, por ejemplo al menos aproximadamente el 0,01 % en peso de principio activo. Mas particularmente, la composicion puede contener el principio activo en la cantidad del 1 % al 75 % en peso de la unidad de composicion, o por ejemplo del 25 % al 60 % en peso, pero no se limitan a los valores indicados. La actual cantidad de la dosis de la composicion segun la presente invencion administrada a pacientes, que incluyen el hombre, se determinara por factores ffsicos y fisiologicos, tales como peso corporal, gravedad de la afeccion, tipo de enfermedad que esta tratandose, intervenciones terapeuticas previas o concomitantes, el paciente y la via de administracion. Una dosis unitaria adecuada, la dosis total y la concentracion de principio activo en la composicion va a determinarse por el medico practico.
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La composicion puede administrate, por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 1 microgramo/kg de peso corporal a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del paciente, por ejemplo en el intervalo de 5 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal o en el intervalo de 5 mg/kg de peso corporal a 500 mg/kg de peso corporal. La protema de fusion y las composiciones que lo contienen presentan antineoplasica o antitumoral y pueden usarse para el tratamiento de enfermedades de cancer. La invencion tambien proporciona la protema de fusion de la invencion como se ha definido anteriormente para su uso en un metodo de tratamiento de enfermedades de cancer en mairnferos, que incluyen seres humanos. El metodo de tratamiento de enfermedades de cancer en mairnferos, que incluyen seres humanos, comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad eficaz antineoplasica de la protema de fusion de la invencion como se ha definido anteriormente, opcionalmente en forma de composicion farmaceutica apropiada.
La protema de fusion de la invencion puede usarse para el tratamiento de tumores malignos hematologicos, tales como leucemia, granulomatosis, mieloma y otros tumores malignos hematologicos. La protema de fusion tambien puede usarse para el tratamiento de tumores solidos, tales como cancer de mama, cancer de pulmon, que incluye cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de colon, cancer pancreatico, cancer de ovario, cancer de vejiga, cancer de prostata, cancer de rinon, cancer cerebral, y similares. La via de administracion apropiada de la protema de fusion en el tratamiento del cancer sera en particular la via parenteral, que consiste en administrar la protema de fusion de la invencion en forma de inyecciones o infusiones, en la composicion y forma apropiadas para esta via de administracion. La invencion se describira en mas detalle en los siguientes procedimientos generales y ejemplos de protemas de fusion espedficas.
Procedimiento general para la expresion en exceso de la protema de fusion Preparacion de un plasmido
Se uso la secuencia de aminoacidos de la protema de fusion diana como molde para generar una secuencia de ADN que la codifica, que comprende codones optimizados para la expresion en Escherichia coli. Un procedimiento tal permite aumentar la eficiencia de otra etapa de smtesis de protemas diana en Escherichia coli. La secuencia de nucleotidos resultante se sintetizo entonces automaticamente. Adicionalmente, se anadieron los sitios de escision de enzimas de restriccion Ndel (en el extremo 5' de la hebra adelantada) y Xhol (en el extremo 3' de la hebra adelantada) al gen resultante que codifica la protema diana. Estos se usaron para clonar el gen en el vector pET28a (Novagen). Tambien pueden usarse para clonar el gen que codifica la protema para otros vectores. La protema diana expresada de esta construccion puede ser opcionalmente provista en el extremo N de una marca de polihistidina (seis histidinas), precedida de un sitio reconocido por trombina, que posteriormente sirvio para su purificacion por cromatograffa de afinidad. Algunas dianas se expresaron sin ninguna marca, en particular sin marca de histidina, y aquellas fueron posteriormente purificadas en SP Sepharose. La correctitud de la construccion resultante se confirmo en primer lugar por analisis de restriccion de plasmidos aislados usando las enzimas Ndel y Xhol, seguido de secuenciacion automatica del marco de lectura entero de la protema diana. Los cebadores usados para la secuenciacion fueron complementarios a las secuencias del promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') y terminador T7 (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3') presentes en el vector. El plasmido resultante se uso para la expresion en exceso de la protema de fusion diana en una cepa de E. coli comercial, que se transformo segun las recomendaciones del fabricante. Se usaron las colonias obtenidas en el medio de seleccion (agar LB, kanamicina 50 |jg/ml, 1 % de glucosa) para preparar un cultivo durante la noche en medio lfquido LB complementado con kanamicina (50 jg/ml) y 1 % de glucosa. Despues de aproximadamente 15 h de crecimiento en la estufa de incubacion con agitacion, los cultivos se usaron para inocular el cultivo apropiado.
Expresion en exceso y purificacion de protemas de fusion - procedimiento general A
Se inoculo medio LB con kanamicina (30 jg/ml) y sulfato de cinc 100 jM con cultivo durante la noche. El cultivo se incubo a 37 °C hasta que la densidad optica (DO) a 600 nm alcanzo 0,60-0,80. Entonces se anadio IPTG a la concentracion final en el intervalo de 0,25 - 1 mM. Despues de la incubacion (3,5 - 20 h) con agitacion a 25 °C el cultivo se centrifugo durante 25 min a 6.000 g. Se resuspendieron sedimentos bacterianos en un tampon que contema KH2PO4 50 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 10 mM, pH 7,4. La suspension se sonico sobre hielo durante 8 minutos (40 % de amplitud, pulso de 15 segundos, intervalo de 10 s). El extracto resultante se clarifico por centrifugacion durante 40 minutos a 20000 g, 4 °C. Se pretrato resina de Ni-Sepharose (GE Healthcare) por equilibrado con tampon, que se uso para la preparacion del extracto de celulas bacterianas. La resina se incubo entonces durante la noche a 4 °C con el sobrenadante obtenido despues de la centrifugacion del extracto. Entonces se cargo en columna de cromatograffa y se lavo con 15 a 50 volumenes de tampon KH2PO4 50 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 20 mM, pH 7,4. La protema obtenida se eluyo de la columna usando gradiente de imidazol en tampon KH2PO4 50 mM con NaCl 0,5 M, pH 7,4. Las fracciones obtenidas se analizaron por SDS-PAGE. Se combinaron fracciones apropiadas y se dializaron durante la noche a 4 °C contra tampon Tris 50 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, L- arginina 500 mM, ZnSO4 0,1 mM, 0,01 % de Tween 20, y al mismo tiempo Histag, si esta presente, se escindio con trombina (1:50). Despues de la escision, se separo trombina de la protema de fusion diana expresada con Histag por purificacion usando la resina Benzamidine SepharoseTM. La purificacion de protemas de fusion diana expresadas sin Histag se realizo en SP Sepharose. La pureza del producto se analizo por electroforesis SDS-PAGE (Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, Ny, 1982).
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Expresion en exceso y purificacion de protemas de fusion - procedimiento general B
Se inoculo medio LB con kanamicina (30 pg/ml) y sulfato de cinc 100 pM con cultivo durante la noche. Los cultivos se incubaron a 37 °C hasta que la densidad optica (DO) a 600 nm alcanzo 0,60-0,80. Entonces se anadio IPTG a la concentracion final en el intervalo 0,5 - 1 mM. Despues de 20 h de incubacion con agitacion a 25 °C el cultivo se centrifugo durante 25 min a 6000 g. Las celulas bacterianas despues de la expresion en exceso se rompieron en una prensa francesa en un tampon que contema KH2PO4 50 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 10 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM, PMSF 0,5 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), pH 7,8. El extracto resultante se clarifico por centrifugacion durante 50 minutos a 8000 g. Se incubo la resina de Ni-Sepharose durante la noche con el sobrenadante obtenido. Entonces la resina con protema unida se cargo en la columna de cromatograffa. Para lavar las fracciones que conteman proteinas no de union, la columna se lavo con 15 a 50 volumenes de tampon KH2PO4 50 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 10 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM, PMSF 0,5 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), pH 7,8. Entonces, para lavar la mayona de las proteinas que se uman espedficamente con el lecho, la columna se lavo con un tampon que contema KH2PO4 50 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 500 mM, 10 % de glicerol, PMSF 0,5 mM, pH 7,5. Las fracciones obtenidas se analizaron por SDS-PAGE (Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982). Se combinaron las fracciones que conteman la protema diana y, si la protema se expreso con marca de histidina, se escindio con trombina (1 U por 4 mg de protema, 8 h a 16 °C) para eliminar la marca de polihistidina. Entonces las fracciones se dializaron contra el tampon de formulacion (L-arginina 500 mM, Tris 50 mM, ZnSO4 2,5 mM, pH 7,4).
Ejemplo 1. La protema de fusion de SEQ. No. 1
La protema de SEQ. No. 1 es una protema de fusion que tiene la longitud de 173 aminoacidos y la masa de 19,8 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia TRAIL 121-281 esta unido el heptapeptido derivado de VEGF (SEQ. No. 17) como un peptido efector. Entre el peptido efector y la secuencia de TRAIL se incorpora el conector esterico de glicina flexible (sEq. No. 28).
La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en la Fig. 1, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 1 y SEQ. No. 31, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 1 de la estructura descrita anteriormente se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 31 de ADN. Se genero un plasmido que contema la secuencia codificante de ADN en dos versiones, una que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina y la segunda sin ninguna marca, y se llevo a cabo la expresion en exceso de las protemas de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general A, usando las cepas BL21 (DE3) y Tuner(DE3)pLysS de E. coli, ambas de Novagen. Las protemas se separaron por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 2. La protema de fusion de SEQ. No. 2
La protema de fusion de SEQ. No. 2 es una protema de fusion que tiene la longitud de 199 aminoacidos y la masa de 22,8 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia TRAIL 95-281 esta unido el heptapeptido derivado de VEGF (SEQ. No. 17) como un peptido efector. Entre el peptido efector y la secuencia de TRAIL se incorpora el conector esterico de glicina flexible (SEQ. No. 28).
La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en la Fig. 1, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 2 y SEQ. No. 32, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 2 se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 32 de ADN. Se genero un plasmido que contiene la secuencia codificante de ADN, con una secuencia que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina, y se llevo a cabo la expresion en exceso de la protema de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general A, usando la cepa BL21 (DE3) de E. coli de Novagen. La protema se separo por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 4. La protema de fusion de SEQ. No. 4
La protema de SEQ. No. 4 es una protema de fusion que tiene la longitud de 187 aminoacidos y la masa de 21,4 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia TRAIL 121-281 estan unidas dos secuencias de heptapeptido derivado de VEGF (SEQ. No. 17) como peptido efector. Entre las dos secuencias de peptido efector se incorpora la secuencia de sitio de escision reconocido por metaloproteasa MMP (SEQ. No. 24), debido a que el peptido efector experimental escision en el entorno tumoral. Entre la secuencia del sitio de escision de MMP y la secuencia de protema efectora se incorpora un unico resto de acido glutamico E. Entre el peptido efector (SEQ. 17) y la secuencia de TRAIL se incorpora el conector de glicina esterico flexible (SEQ. No. 28).
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La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en la Fig. 1, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 4 y SEQ. No. 34, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 4 se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 34 de ADN. Se genero un plasmido que contiene la secuencia codificante de ADN en dos versiones, una que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina y la segunda sin ninguna marca, y se llevo a cabo la expresion en exceso de las protemas de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general B, usando la cepa BL21DE3pLysSRIL de E. coli de Stratagene y Tuner (DE3) de Novagen. Las protemas se separaron por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 5. La protema de fusion de SEQ. No. 5
La protema de SEQ. No. 5 es una protema de fusion que tiene la longitud de 187 aminoacidos y la masa de 21,8 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia TRAIL 121-281 estan unidas dos secuencias de heptapeptido derivado de VEGF (SEQ. No. 17) como peptido efector. Entre las dos secuencias de peptidos efectores la protema contiene secuencias de sitios de escision reconocidos por urocinasa uPA (SEQ. No. 25) y metaloproteasa MMP (SEQ. No. 24), debido a que el peptido efector experimental escision en el entorno tumoral. Entre la secuencia de sitio de escision de MMP y la secuencia de protema efectora se incorpora el unico resto de acido glutamico E. Adicionalmente, en el extremo N de TRAIL estan unidos dos restos de glicina.
La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en la Fig. 1, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 5 y SEQ. No. 35, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 5 se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 35 de ADN. Se genero un plasmido que contiene la secuencia codificante de ADN en dos versiones, una que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina y la segunda sin ninguna marca, y se llevo a cabo la expresion en exceso de las protemas de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general A, usando la cepa Tuner (DE3) de E. coli de Novagen. Las protemas se separaron por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 6. La protema de fusion de SEQ. No. 6
La protema de SEQ. No. 6 es una protema de fusion que tiene la longitud de 222 aminoacidos y la masa de 25,3 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia TRAIL 95-281 estan unidas dos secuencias de heptapeptido derivado de VEGF (SEQ. No. 17) como un peptido efector. Entre las dos secuencias de peptido efector la protema contiene secuencias de sitios de escision reconocidos por uPA (SEQ. No. 25) y metaloproteasa MMP (SEQ. No. 55) debido a que el peptido efector experimental escision en el entorno tumoral. Entre el peptido efector (SEQ. 17) y la secuencia de TRAIL se incorpora el conector esterico flexible de cistema (SEQ. No. 26).
La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en la Fig. 1, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 6 y SEQ. No. 36, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 6 se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 36 de ADN. Se genero un plasmido que contiene la secuencia codificante de ADN, sin una secuencia que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina, y se llevo a cabo la expresion en exceso de la protema de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general A, usando la cepa Tuner(DE3) de E. coli de Novagen. La protema se separo por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 9. La protema de fusion de SEQ. No. 9
La protema de SEQ. No. 9 es una protema de fusion que tiene la longitud de 192 aminoacidos y la masa de 22,1 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia TRAIL 119-281 esta unido una secuencia de fragmento de PDGF (SEQ. No. 22) como un peptido efector. Entre el peptido efector y la secuencia de TRAIL la protema contiene secuencias de sitios de escision reconocidos por urocinasa uPA (SEQ. No. 25) y metaloproteasa MMP (SEQ. No. 24), debido a que el peptido efector experimental escision en el entorno tumoral.
La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en la Fig. 2, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 9 y SEQ. No. 39, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 9 se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 39 de ADN. Se genero un plasmido que contiene la secuencia codificante de ADN en dos versiones, una que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina y la segunda sin ninguna marca, y se llevo a cabo la
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expresion en exceso de las protemas de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general A, usando la cepa Rosetta (DE3) de E. coli de Novagen. Las protemas se separaron por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 10. La protema de fusion de SEQ. No. 10
La protema de SEQ. No. 10 es una protema de fusion que tiene la longitud de 216 aminoacidos y la masa de 24,9 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia TRAIL 95-281 esta unido un fragmento de PDGf (SEQ. No. 22) como un peptido efector. Entre la secuencia de peptido efector y el dominio de TRAIL la protema contiene secuencias de sitios de escision reconocidos por uPA (SEQ. No. 25) y metaloproteasa MMP (SEQ. No. 24), debido a que el peptido efector experimental escision en el entorno tumoral.
La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en la Fig. 2, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 10 y SEQ. No. 40, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 10 se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 40 de ADN. Se genero un plasmido que contiene la secuencia codificante de ADN, con una secuencia que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina, y se llevo a cabo la expresion en exceso de la protema de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general A, usando las cepas BL21 (DE3) y Tuner(DE3)pLysS de E. coli, ambas de Novagen. La protema se separo por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 11. La protema de fusion de SEQ. No. 11
La protema de SEQ. No. 11 es una protema de fusion que tiene la longitud de 226 aminoacidos y la masa de 25,7 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia TRAIL95-281 esta unido un fragmento de PDGf (SEQ. No. 22) como un peptido efector. Entre el peptido efector y la secuencia de TRAIL la protema contiene secuencias de sitios de escision reconocidos por urocinasa uPA (SEQ. No. 25) y metaloproteasa MMP (SEQ. No. 24), debido a que el peptido efector experimental escision en el entorno tumoral. Entre la secuencia de TRAIL y la secuencia de sitio de escision reconocido por metaloproteasa MMP la protema contiene tambien conector de glicina-cistema-alanina flexible (SEQ. No. 27).
La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en la Fig. 2, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 11 y SEQ. No. 41, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 11 se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 41 de ADN. Se genero un plasmido que contiene la secuencia codificante de ADN, sin una secuencia que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina, y se llevo a cabo la expresion en exceso de la protema de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general A, usando las cepas BL21 (DE3) y Tuner(DE3)pLysS de E. coli, ambas de Novagen. La protema se separo por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 14. La protema de fusion de SEQ. No. 14
La protema de SEQ. No. 14 es una protema de fusion que tiene la longitud de 181 aminoacidos y la masa de 21 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia TRAIL 120-281 esta unido un fragmento de EGF (SEQ. No. 23) como un peptido efector. Entre el peptido efector y el extremo N de TRAIL dominio la protema contiene secuencias de sitios de escision reconocidos por urocinasa uPA (SEQ. No. 25) y metaloproteasa MMP (SEQ. No. 56), debido a que el peptido efector experimental escision en el entorno tumoral.
La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en la Fig. 3, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 14 y SEQ. No. 44, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 14 se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 44 de ADN. Se genero un plasmido que contiene la secuencia codificante de ADN, con una secuencia que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina, y se llevo a cabo la expresion en exceso de la protema de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general B, usando la cepa BL21 (DE3) de E. coli de Novagen y la cepa BL21DE3pLysSRIL de Stratagene. La protema se separo por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 15. La protema de fusion de SEQ. No. 15
La protema de SEQ. No. 15 es una protema de fusion que tiene la longitud de 217 aminoacidos y la masa de 24,4 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia hTRAIL95-281 esta unido un fragmento de EGF (SEQ. No. 23) como un peptido efector. Entre el peptido efector y el extremo N del dominio de TRAIL la protema contiene secuencias de
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sitios de escision reconocidos por urocinasa uPA (SEQ. No. 25) y metaloproteasa MMP (SEQ. No. 24), debido a que el peptido efector experimental escision en el entorno tumoral. Entre la secuencia de sitio de escision reconocido por metaloproteasa MMP y la secuencia de TRAIL la protema contiene un unico resto de prolina seguido del conector de glicina-cistema-alanina flexible (SEQ. No. 26).
La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en la Fig. 3, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 15 y SEQ. No. 45, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 15 se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 45 de ADN. Se genero un plasmido que contiene la secuencia codificante de ADN, con una secuencia que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina, y se llevo a cabo la expresion en exceso de la protema de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general B, usando la cepa BL21 (DE3) de E. coli de Novagen. La protema se separo por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 16. La protema de fusion de SEQ. No. 46
La protema de fusion de SEQ. No. 46 es una protema de fusion que tiene la longitud de 211 aminoacidos y la masa de 24,4 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia TRAIL 95-281 estan unidos dos heptapeptidos derivados de VEGF (SEQ. No. 17) unidos entre sf como peptido efector. Entre los peptidos efectores la protema contiene secuencias de sitios de escision reconocidos por urocinasa uPA (SEQ. No. 25) y metaloproteasa MMP (SEQ. No. 55), debido a que el peptido efector experimentara escision en el entorno tumoral.
La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en la Fig. 9, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 46 y SEQ. No. 50, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 46 se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 50 de ADN. Se genero un plasmido que contiene la secuencia codificante de ADN, con una secuencia que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina, y se llevo a cabo la expresion en exceso de la protema de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general B, usando la cepa BL21 (DE3) de E. coli de Novagen. La protema se separo por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 17. La protema de fusion de SEQ. No. 47
La protema de fusion de SEQ. No. 47 es una protema de fusion que tiene la longitud de 200 aminoacidos y la masa de 22,7 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia TRAIL 120-281 estan unidos dos heptapeptidos derivados de VEGF (SEQ. No. 17) unidos entre sf como peptido efector. Entre los peptidos efectores la protema contiene secuencias de sitios de escision reconocidos por urocinasa uPA (SEQ. No. 25) y metaloproteasa MMP (SEQ. No. 55), debido a que el peptido efector experimentara escision en el entorno tumoral. Entre la protema efectora y el dominio de TRAIL la protema contiene posteriormente el conector flexible (SEQ. No. 26) que promueve la formacion de tnmero y el conector de glicina-serina flexible (SEQ. no. 54).
La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en la Fig. 9, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 47 y SEQ. No. 51, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 47 se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 51 de ADN. Se genero un plasmido que contiene la secuencia codificante de ADN, con una secuencia que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina, y se llevo a cabo la expresion en exceso de la protema de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general B, usando la cepa BL21 (DE3) de E. coli de Novagen. La protema se separo por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 18. La protema de fusion de SEQ. No. 48
La protema de fusion de SEQ. No. 48 es una protema de fusion que tiene la longitud de 192 aminoacidos y la masa de 21,9 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia TRAIL 120-281 estan unidos dos heptapeptidos derivados de VEGF (SEQ. No. 17) unidos entre sf como peptido efector. Entre los peptidos efectores la protema contiene secuencia de sitio de escision reconocido por urocinasa uPA (SEQ. No. 25), debido a que el peptido efector experimentara escision en el entorno tumoral. Entre la protema efectora y el dominio de TRAIL la protema contiene posteriormente el conector flexible (SEQ. No. 26) que promueve la formacion de tnmero y el conector de glicina- serina flexible (SEQ. no. 54).
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La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en la Fig. 9, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 48 y SEQ. No. 52, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 48 se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 52 de ADN. Se genero un plasmido que contiene la secuencia codificante de ADN, con una secuencia que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina, y se llevo a cabo la expresion en exceso de la protema de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general B, usando la cepa BL21 (DE3) de E. coli de Novagen. La protema se separo por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 19. La protema de fusion de SEQ. No. 49
La protema de SEQ. No. 49 es una protema de fusion que tiene la longitud de 206 aminoacidos y la masa de 23,3 kDa, en la que en el extremo N de la secuencia TRAIL120-281 esta unido un fragmento de PDGF (SEQ. No. 22) como un peptido efector. Entre el peptido efector y la secuencia de TRAIL la protema contiene secuencias de sitios de escision reconocidos por urocinasa uPA (SEQ. No. 25) y metaloproteasa MMP (SEQ. No. 55), debido a que el peptido efector experimental escision en el entorno tumoral. Entre la secuencia de TRAIL y la secuencia de sitio de escision reconocido por metaloproteasa MMP la protema contiene tambien localizada posteriormente el conector de glicina-cistema-alanina flexible (SEQ. No. 26) que promueve la formacion de tnmero y el conector de glicina-serina flexible (SEQ. No. 54).
La estructura de la protema de fusion se muestra esquematicamente en Fig. 9, y su secuencia de aminoacidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresion en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 49 y SEQ. No. 53, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoacidos SEQ. No. 49 se uso como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 53 de ADN. Se genero un plasmido que contiene la secuencia codificante de ADN, sin una secuencia que permite expresar His tag y un sitio reconocido por trombina, y se llevo a cabo la expresion en exceso de la protema de fusion segun los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresion en exceso se realizo segun el procedimiento general A, usando las cepas BL21 (DE3) y Tuner(DE3)pLysS de E. coli, ambas de Novagen. La protema se separo por electroforesis segun el procedimiento general descrito anteriormente.
Ejemplo 20. Examen de actividad antitumoral de las protemas de fusion
Se llevo a cabo el examen de actividad antitumoral de las protemas de fusion in vitro en un ensayo de citotoxicidad en lmeas de celulas tumorales e in vivo en ratones. Para fines de comparacion, se usaron la protema rhTRAIL114- 281 y placebo.
1. Medicion de la determinacion de dicrofsmo circular del contenido de estructuras secundarias de protemas obtenidas
Se determino la calidad de las preparaciones de protemas de fusion en terminos de su estructura por dicrofsmo circular (CD) para el Ej. 1, Ej. 4, Ej. 5, Ej. 9 y Ej. 14.
El dicrofsmo circular se usa para la determinacion de estructuras secundarias y la conformacion de protema. El metodo de CD usa la actividad optica de las estructuras de protema, manifestada en girar el plano de polarizacion de la luz y la aparicion de polarizacion elfptica. El espectro de protemas de CD en el ultravioleta (UV) lejano proporciona datos precisos sobre la conformacion de la principal cadena de polipeptidos.
Dialisis
Se dializaron muestras de la protema a analizar despues de la formulacion en un tampon que consiste en Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, NaCl 100 mM, 10% de glicerol, ZnCl2 de 0,1 mM, sacarosa 80 mM, DTT 5 mM, pH 7,4 (o alternativamente NaH2PO4 5 mM, Na2HPO4 95 mM, NaCl 200 mM, glutation 5 mM, ZnCl2 0,1 mM, 10 % de glicerol, sacarosa 80 mM, pH 8,0 para protemas expresadas en exceso como se ha descrito anteriormente, pero que carecen de la His-tag y purificadas en Sp Sepharose - marcadas en la Tabla 5 de resultados con el asterisco *) en las bolsas de dialisis (Sigma-Aldrich) con el corte 12 kDa. La dialisis se realizo contra un exceso de 100 veces (v/v) de tampon en comparacion con las preparaciones de protema con agitacion durante varias horas a 4 °C. Despues de completarse la dialisis, se centrifugo cada preparacion (25.000 rpm, 10 min, 4 °C) y se recogieron los sobrenadantes apropiados. Se determino la concentracion de protema en las muestras asf obtenidas por el metodo de Bradford como un promedio de triplicados.
Determinacion de la concentracion de protema usando el metodo de Bradford
En ensayos de concentracion de protema del reactivo preparado disolviendo 17,5 mg de Coomassie G-250 en una mezcla de etanol (4,8 % v / v), acido fosforico (V) (5,95 % v / v) y agua. Para determinar la concentracion de protema se anadieron 1-10 ml de muestra a 800 ml de reactivo de Bradford. Una muestra de referencia que contiene reactivo
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de Bradford y un volumen apropiado de tampon en el que se determino la protema disuelta. La absorbancia se leyo en un espectrofotometro Cary 300 a una longitud de onda de 595 nm despues de al menos 5 minutos de incubacion de las muestras a temperatura ambiente. La concentracion de protema se calculo a partir de la curva patron preparada para el BSA en el intervalo de 10 concentraciones 1-10 |jg/ml. La concentracion de protema de partida se estimo despues de tener en cuenta la dilucion durante la preparacion de la medicion de muestra.
Medicion de dicroismo circular
Se realizo la medicion de dicrofsmo circular para protemas en el intervalo de concentracion de 0,1-2,7 mg/ml en el espectropolanmetro Jasco J-710, en una cubeta de cuarzo con un paso optico de 0,2 mm o 1 mm. La medicion se realizo bajo el flujo de nitrogeno a 7 l/min, que permitio realizar la medicion en el intervalo de longitud de onda de 195 a 250 nm. Parametros de la medicion: resolucion espectral de - 1 nm; mitad de la anchura del haz de luz 1 nm; sensibilidad 20 mdeg, el tiempo promedio para una longitud de onda - 8 s, velocidad de barrido 10 nm/min, promedio de 3 mediciones.
Los resultados se presentaron como el promedio de tres mediciones. Los espectros de dicrofsmo circular para rhTRAIL114-281 y las protemas de Ej. 1, Ej. 4, Ej. 5, Ej. 9 y Ej. 14 se presentan en la Fig. 4.
Determinacion del contenido de estructura secundaria
Se analizaron numericamente los espectros obtenidos en el intervalo de 193-250 nm usando el software CDPro. Se omitieron los puntos para los que la tension en el fotomultiplicador supero los 700 V, debido a la relacion demasiado baja de senal con respecto a ruido en este intervalo de longitud de onda. Los datos obtenidos sirvieron para los calculos del contenido de estructuras secundarias particulares en las protemas analizadas usando el software CDPro (Tabla 1).
Tabla 1. Contenido de estructuras secundarias en las protemas analizadas
Protema
NRMSD (Exp-Cal) helice a hoja p Desplazamiento Trastorno
Ej. 4
0,319 3,7 % 39,4 % 20,7 % 36,2 %
Ej. 1
0,093 7,8 % 8,6 % 63,1 % 20,5 %
Ej. 5
0,04 41,3 % 15,0 % 2,5 % 41,2 %
Ej. 9
0,112 2,9 % 41,0 % 20,7 % 35,4 %
Ej. 14
0,244 0,2 % 55,3 % 17,1 % 27,4 %
rhTRAIL*
1,94 % 50,97 % 7,74 % 39,35 %
rhTRAIL 114-281
0,389 4,9 % 33,7 % 23,1 % 38,3 %
* valor obtenido basandose en la estructura cristalina 1D4V
Los controles (rhTRAIL114-281) muestran el espectro de CD caractenstico para las protemas con predominantemente estructuras de tipo hoja p (elipticidad rapidamente delineada minima a la longitud de onda 220 nm). Esto confirma el calculo de los componentes de estructuras secundarias, que sugiere un numero marginal de elementos de helice a. El resultado obtenido tambien esta de acuerdo con los datos de la estructura cristalina de la protema hTRAIL y caractenstica para las protemas de la invencion del Ej. 4, Ej. 9 y Ej. 14, en las que los elementos de beta constituyen mas del 40 % de su composicion.
En el caso de todas las protemas fusionadas, los espectros de dicrofsmo se caracterizan por un mmimo a la longitud de onda 220 nm. Moleculas de protemas efectoras pequenas unidas a TRAIL en las protemas fusionadas constituyen la parte minoritaria de la protema y no crean necesariamente una estructura secundaria definida, las protemas analizadas no deben diferir significativamente de la protema inicial. Diferencias significativas, tales como alto contenido de estructuras alfa en el caso de protema segun el Ej. 5, u hojas tal como se observan para protemas del Ej. 1, son posiblemente debidas al limitado intervalo del espectro de CD sujeto a analisis, especialmente en la region 180 -200 nm.
2. Pruebas de lineas celulares in vitro
Lineas celulares
Tabla 2. Celulas adherentes
Lmea celular
Tipo de cancer Medio Numero de celulas por pocillo (miles)
Colo 205 ATCC N.° CCL-222
cancer colorrectal humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 5
HT-29 ATCC N.° CCL-2
cancer colorrectal humano McCoy's + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 5
DU-145 ATCC N.° HTB-81
cancer de prostata humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3
PC-3 ATCC N.° CRL-1435
cancer de prostata humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4
MCF-7 ATCC N.° HTB-22
cancer de mama humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4,5
MDA-MB-231 ATCC N.° HTB-26
cancer de mama humano DMEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4,5
UM-UC-3 ATCC N.° CLR-1749
cancer de vejiga humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3,5
SW780 ATCC N.° CRL-2169
cancer de vejiga humano DMEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3
SW620 ATCC N.° CCL-227
cancer colorrectal humano DMEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 5
BxPC-3 ATCC N.° CRL-1687
cancer pancreatico humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4,5
NIH: OVCAR-3 ATCC N.° HTB-161
cancer de ovario humano RPMI + 20 % de FBS + 0,01 mg/ml de insulina + penicilina + estreptomicina 7
HepG2 ATCC N.° HB-8065
hepatoma de h^gado humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 7
293 ATCC N.° CLR-1573
celulas de rinon embrionario humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4
ACHN ATCC N.° CCL-222
cancer de rinon humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4
CAKI 2 ATCC N.° HTB-47
cancer de rinon humano McCoy's + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3,5
HT144 ATCC N.° HTB-63
celulas de melanoma humanas McCoy's + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 7
LNCaP ATCC N.° CRL-1740
cancer de prostata humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4,5
NCI-H69 ATCC N.° HTB-119
cancer de pulmon de celulas pequenas humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 22
Jurkat A3 ATCC N.° CRL-2570
leucemia humana RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 10
Lmea celular
Tipo de cancer Medio Numero de celulas por pocillo (miles)
MES-SA/Dx5 ATCC N.° CRL- 1977
cancer uterino McCoy's + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4
SK-MES-1 ATCC N.° HTB-58
cancer de pulmon humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4
A549 ATCC N.° CCL-185
cancer de pulmon humano RPMI + 20 % de FBS + penicilina + estreptomicina 2,5
HCT116 ATCC N.° CCL-247
cancer colorrectal humano McCoy's + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3
MCF10A ATCC N.° CRL-10317
celulas epiteliales mamarias DMEM-F12 (1:1) + 5 % de suero de caballo + 0,5 pg/ml de hidrocortisona + 10 pg/ml de insulina + 20 ng/ml de EGF 4,5
MES-SA ATCC N.° CRL-1976
cancer uterino McCoy's + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3,5
PANC-1 CLS N.° 300228
cancer pancreatico humano DMEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 5
Tabla 3. Celulas no adherentes:
Lmea celular
Tipo de cancer Medio Numero de celulas por pocillo (miles)
NCl-H69 ATCC N.° HTB-119
cancer de pulmon de celulas pequenas humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 22
Jurkat A3 ATCC N.° CRL-2570
leucemia humana RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 10
HL60 ATCC N.° CCL-240
leucemia humana RPMI + 20 % de FBS + penicilina + estreptomicina 10
CCRF-CEM ATCC N.° CCL-119
leucemia humana RPMI + 20 % de FBS + penicilina + estreptomicina 10
Prueba de toxicidad de MTT
5 El ensayo de MTT es un ensayo colorimetrico usado para medir la proliferacion, viabilidad y citotoxicidad de celulas. Consiste en la descomposicion de una sal de tetrazolio amarilla MTT (bromuro de 4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5- difeniltetrazolio) dando el colorante purpura insoluble en agua formazano por la enzima mitocondrial succinato- tetrazolio reductasa 1. La reduccion de MTT se produce solo en celulas vivas. El analisis de datos consiste en determinar la concentracion CI50 de la protema (en ng/ml), a la que se produce el 50 % de reduccion en el numero 10 de celulas en la poblacion tratada en comparacion con las celulas de control. Los resultados se analizaron usando el software GraphPad Prism 5.0. La prueba se realizo segun las descripciones de bibliograffa (Celis, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, segunda edicion, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvement of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183).
Se diluyo medio de cultivo celular a una densidad definida (104 - 105 celulas por 100 pl). Entonces se aplicaron 100 15 pl de suspension de celulas apropiadamente diluida a una placa de 96 pocillos por triplicado. Asf, las celulas preparadas se incubaron durante 24 h a 37 °C en 5 % o 10 % de CO2, dependiendo del medio usado, y luego a las celulas (en 100 pl de medio) se anadieron adicionalmente 100 pl del medio que contema diversas concentraciones de protemas probadas. Despues de la incubacion de las celulas con protemas probadas durante el periodo de las siguientes 72 horas, que es equivalente a 3-4 veces de la division celular, el medio con la protema de prueba se 20 anadio a 20 ml de la disolucion de trabajo de MTT [5 mg/ml], y la incubacion continuo durante 3 h a 37 °C en 5 % de CO2. Entonces se elimino el medio con disolucion de MTT, y los cristales de formazano se disolvieron anadiendo 100 pl de DMSO. Despues de agitar, la absorbancia se midio a 570 nm (filtro de referencia 690 nm).
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Prueba de citotoxicidad de EZ4U
Se uso la prueba de EZ4U (Biomedica) para probar la actividad citotoxica de las protemas en lmeas de celulas no adherentes. La prueba es una modificacion de MTT en la que el formazano formado en la reduccion de sal de tetrazolio es soluble en agua. Se llevo a cabo el estudio de viabilidad celular despues de la incubacion de 72 horas continua de las celulas con protema (siete concentraciones de protema, cada una por triplicado). Sobre esta base se determinaron los valores de CI50 (como un promedio de dos experimented independientes) usando el software GraphPad Prism 5.
Los resultados de las pruebas de citotoxicidad in vitro se resumen en la Tabla 4 como valores de CI50 (ng/ml), que se corresponden con una concentracion de protema a la que el efecto citotoxico de las protemas de fusion se observa al nivel del 50 % con respecto a las celulas de control tratadas solo con disolvente.
En la Tabla 4, las protemas que se expresaron originalmente con marca de histidina que se elimino posteriormente se designan como a) en el Ej. N.°. Las protemas que se expresaron originalmente sin marca de histidina se designan como b) en el Ej. N.° Cada experimento representa el valor promedio de al menos dos experimentos independientes realizados por triplicado. Como criterio de ausencia de actividad de preparaciones de protema se adopto el lfmite de CI 50 de 2000 ng/ml. Las protemas de fusion con un valor de CI50 por encima de 2000 se consideraron inactivas.
Se seleccionaron celulas para esta prueba para incluir las lmeas celulares tumorales naturalmente resistentes a la protema TRAIL (el criterio de resistencia natural a TRAIL: CI50 para la protema TRAIL > 2000), lmeas celulares tumorales sensibles a protema TRAIL y resistentes a la lmea de doxorubicina MES-SA/DX5 como una lmea de cancer resistente a los medicamentos antineoplasicos convencionales.
Se uso la lmea celular HUVEC no diferenciada como lmea celular de control sana para la evaluacion del efecto/toxicidad de las protemas de fusion en celulas no cancerosas.
Los resultados obtenidos confirman la posibilidad de vencer la resistencia de las lmeas celulares a TRAIL por administracion de ciertas protemas de fusion de la invencion a celulas naturalmente resistentes a TRAIL. Cuando se administraron las protemas de fusion de la invencion en las celulas sensibles a TRAIL, en algunos casos se observo una clara y fuerte potenciacion de la potencia de accion, que se manifiesta en valores de CI50 reducidos de la protema de fusion en comparacion con CI50 para TRAIL sola. Ademas, se obtuvo la actividad citotoxica de la protema de fusion de la invencion en las celulas resistentes al medicamento antineoplasico clasico doxorubicina, y en algunos casos fue mas fuerte que la actividad de TRAIL sola.
Los valores de CI50 por encima de 2000 obtenidos para las lmeas de celulas no cancerosas muestran la ausencia de efectos toxicos asociados al uso de protemas de la invencion para celulas sanas, que indica la posible baja toxicidad sistemica de la protema.
Determinacion de la actividad citotoxica de preparaciones de protema seleccionadas contra el panel extendido de lmeas celulares tumorales
La Tabla 5 presenta los resultados de las pruebas de actividad citotoxica in vitro para protemas de fusion seleccionadas de la invencion contra un amplio panel de celulas tumorales de diferentes organos, correspondiente al amplio intervalo de canceres mas comunes.
En la Tabla 5, las protemas que se expresaron originalmente con marca de histidina que fue posteriormente eliminada se designan a) en el Ej. N.°. Las protemas que se expresaron originalmente sin marca de histidina se designan b) en el Ej. N.°. Los valores de CI50 obtenidos confirman la alta actividad citotoxica de la protema de fusion y asf su posible utilidad en el tratamiento de cancer.
Protefna
Incubacion continua de preparaciones con celulas durante 72 h (prueba de MTT, ng/ml)
MES-SA MES-SA/Dx5 HCT116 SK-MES-1 A549 MCF10A
Cl50 ±DE Cl50 ±DE Cl50 ±DE Cl50 ±DE Cl50 ±DE Cl50 ±DE
rhTRAIL114-281
>2000 32,2 2,40 173 31,3 12,2 2,33 >2000 >2000
Ej. 9 a'
3,96 1,44 3,250 0,95 3,95 9,95 3,00 2,34 131,10 43,98 1420,5 451,22
Ej. 14 a'
2000 1738,1 1,47 632,05 26,94 81,27 13,41 2000 2000
Ej. 7 a'
2000 6,822 2,83 38,66 11,34 5,80 1,93 2000 2000
Ej. 1 a'
7,96 0,72 0,743 0,15 25,23 21,98 0,64 0,12 513,10 38,33 131,90 77,92
Ej. 4 a'
4,79 0,78 3,69 1,05 14,27 2,48 0,43 0,15 705,15 40,38 >2000
Ej. 5 a'
1,03 0,08 0,699 0,06 2,48 2,03 0,54 0,34 9,95 0,88 13,01 2,17
K)
CO
Linea celular
COLO 205 HT 29 SW 620 MCF 7 MDA-MB-231 DU 145 LNCaP PC 3
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
24,90 17,68 10000 10000 10000 10000 10000 2052,00 466,0 10000
Ej. 14 a)
3,19 1,68 10000 10000 8839 1642,60 10000 8928,00 543,06 792,70 96,66 10000
SW 780 UM-UC-3 293 CAKI 2 SK-OV-3 OV-CAR-3 H69AR NCI-H69
Linea celular
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
120,00 42,43 2242 1367 10000 10000 10000 93,10 8,34 10000 10000
Ej. 14 a)
93,13 33,76 30,37 3,10 8538 2068 10000 10000 190,80 143,17 10000 10000
NCI-H460 BxPC3 HepG2 HT 144 ACHN JURKAT A3 HL60 CCRF-CEM
Linea celular
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
5889 111,0 64,71 31,81 10000 1734 218,5 10000 10000 10000 10000
Ej. 14 a)
186,80 76,72 79,60 18,81 6153 808,22 1130 26,16 10000 10000 10000 10000
Linea celular
COLO 205 HT 29 SW 620 MCF 7 MDA-MB-231 DU 145 LNCaP PC 3
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
24,90 17,68 10000 10000 10000 10000 10000 2052,00 466,0 10000
Ej. 1 a)
0,87 0,19 852,60 1,06 3650 128,70 832 329,20 23,83 0,54 64,33 22,31 254,00 4,24 980,60
SW 780 UM-UC-3 293 CAKI 2 SK-OV-3 OV-CAR-3 H69AR NCI-H69
Linea celular
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
120,00 42,43 2242 1367 10000 10000 10000 93,10 8,34 10000 10000
Ej. 1 a)
3,78 0,22 7,03 0,13 84350 3,80 230,50 61,50 2116 379 5,58 2,94 1530 137 1436
NCI-H460 BxPC3 HepG2 HT 144 ACHN JURKAT A3 HL60 CCRF-CEM
Linea celular
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
5889 111,0 64,71 31,81 10000 1734 218,5 10000 10000 10000 10000
Ej. 1 a)
7,71 0,09 2,57 0,43 633 89,73 4,47 1,11 71,19 8,92 5,09 2,40 1339 1357
Linea celular
COLO 205 HT 29 SW 620 MCF 7 MDA-MB-231 DU 145 LNCaP PC 3
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
24,90 17,68 10000 10000 10000 10000 10000 2052 466,0 10000
Ej. 5 a)
12,24 3,65 1600 1600 684,50 17,00 345 11,17 473 63,64 1600 1056
SW 780 UM-UC-3 293 CAKI 2 SK-OV-3 OV-CAR-3 H69AR NCI-H69
Linea celular
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
120,00 42,43 2242 1367 10000 10000 10000 93,10 8,34 10000 10000
Ej. 5 a)
38,46 1,03 134,80 9,55 1600 1303 2,10 1600 79,25 27,93 1600 1600
NCI-H460 BxPC3 HepG2 HT 144 ACHN JURKAT A3 HL60 CCRF-CEM
Linea celular
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
5889 111,0 64,71 31,81 10000 1734 218,5 10000 10000 10000 10000
Ej. 5 a)
118,90 28,14 93,90 1,41 1315 389,62 57,44 1,89 510,00 76,37 30,15 4,00 1600 1600
Linea celular
COLO 205 HT 29 SW 620 MCF 7 MDA-MB-231 DU 145 LNCaP PC 3
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
24,90 17,68 10000 10000 10000 10000 10000 2052 466,0 10000
Ej. 9 a)
0,013 0,01 264,20 46,95 47,86 12,50 1025 190,10 1,276 0,40 15,77 9,81 32,90 27,01 463,90
SW 780 UM-UC-3 293 CAKI 2 SK-OV-3 OV-CAR-3 H69AR NCI-H69
Linea celular
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
120,00 42,43 2242 1367 10000 10000 10000 93,10 8,34 10000 10000
Ej. 9 a)
1,006 0,136 0,07 181,60 44,50 24,42 0,10 2500 0,456 0,64 818,60 130,67 2500
NCI-H460 BxPC3 HepG2 HT 144 ACHN JURKAT A3 HL60 CCRF-CEM
Linea celular
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
5889 111,0 64,71 31,81 10000 1734 218,5 10000 10000 10000 10000
Ej. 9 a)
0,004 0,01 0,001 9,78 1,31 0,845 1,20 4,46 1,98 0,615 1,00 2500 2500
Linea celular
A549 HCT116 MCF10A MES-SA/Dx5 SK-MES-1
media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95- 281
>10000 7557 3454 >10000 29,15 12,66 39,35 8,13
Ej. 9
391,00 52,33 3,44 1169 <0,001 3,58 0,81
Linea celular
A549 HCT116 MCF10A MES-SA MES-SA/Dx5 SK-MES-1 NCI-H460
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95- 281
>10000 7557 3454 >10000 29,15 12,66 29,15 12,66 39,35 8,13 5889 111
Ej. 16 a'
224,84 268,26 2473 500 99,27 51,24 0,36 0,25 0,007 0,00 5 22,76
Linea celular
A549 HCT116 MCF10A MES-SA MES-SA/Dx5 SK-MES-1 HT29 NCI-H460
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95- 281
>10000 7557 3454 >10000 29,15 12,66 29,15 12,66 39,35 8,13 >10000 5889 111
Ej. 6 a'
422,70 0,014 129,90 0,01 0,0068 0,0043 1,41 69,19 18,79 0,02
Linea celular
PANC1 PLC/PRF/5 Colo 205 HepG2 BxPc3 SW 620
media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
>10000 >9000 24,90 17,68 >10000 64,71 31,81 >10000
Ej. 6 a'
2,15 0,79 2,35 0,003 0,062 0,014 398,80 80,89
A549 MCF10A MES-SA/Dx5 SK-MES-1 PANC1 293 UM-UC-3
Linea celular
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
>10000 >10000 29,15 12,66 39,35 8,13 >10000 >10000 2242 1367
Ej. 1 u'
346,75 102,18 147,80 3,96 4,677 2,23 3,29 1,07 12,38 4,20 84,50 3,82 7,03 0,13
Linea celular
A549 HCT116 MCF10A MES-SA MES-SA/Dx5 SK-MES-1 HT29 NCI-H460
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
>10000 7557 3454 >10000 >10000 29,15 12,66 39,35 8,13 >10000 5889 111
Ej. 11 a'
106,66 41,49 11,50 3,42 95,44 5,28 3,50 0,445 0,30 4,99 911,50 282,14 9,34 5,27
Linea celular
PANC1 PLC/PRF/5
media DE media DE
rhTRAIL 95-281
>10000 >9000
Ej. 11 a'
3,07 <0,001
Linea celular
A549 HCT116 MCF10A MES-SA MES-SA/Dx5 SK-MES-1 NCI-H460 Colo 205
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
>10000 7557 3454 >10000 >10000 29,15 12,66 39,35 8,13 5889 111 24,90 17,68
Ej. 19 a)
4,31 <0,001 0,19 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,004
Linea celular
HepG2 BxPc3 Linea celular HCT116 MCF10A MES-SA/Dx5 SK-MES-1
media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
>10000 64,71 31,81 rhTRAIL 95-281 7557 3454 >10000 29,15 12,66 39,35 8,13
Ej. 19 a'
0,20 0,013 Ej- a| 58,86 306,05 7,00 3,492 0,07 9,13 1,31
Linea celular
A549 HCT116 MCF10A MES-SA SK-MES-1 Linea celular HCT116 BxPc3
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
Linea celular
A549 HCT116 MCF10A MES-SA MES-SA/Dx5 SK-MES-1
media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
>10000 7557 3454 >10000 >10000 29,15 12,66 39,35 8,13
Ej. 17 a'
233,90 30,33 174,10 7,4 1,589 2,9
Linea celular
A549 HCT116 MCF10A MES-SA MES-SA/Dx5 SK-MES-1
media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
>10000 7557 3454 >10000 >10000 29,15 12,66 39,35 8,13
Ej. 18 a'
34,28 15,04 11,67 2,39 19,29 4,33 1,24 0,97 0,264 0,35 0,615
Linea celular
HCT116 MES-SA SK-MES-1 HT29 NCI-H460 PANC1 PLC/PRF/5 Colo 205
media DE media DE media DE media DE mea n DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
7557 3454 >10000 39,35 8,13 >10000 5889 111 >10000 >9000 24,90 17,68
Ej. 5 u'
0,036 0,01 0,005 0,007 0,004 0,005 783,50 34,65 0,25 0,25 1,05 0,56 5,54 12,24 3,65
Linea celular
HepG2 BxPc3 ACHN OV-CAR-3 Linea celular DU 145 OV-CAR-3
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95-281
>10000 64,71 31,81 >10000 963,00 144,25 rhTRAIL 95-281 >10000 963 144,25
Ej. 5 u'
9,27 0,36 0,44 0,5 0,09 <0,001 0,001 Ej. 7 a' 4061 1109 15,14 2,62
Linea celular
MCF10A MES-SA MES-SA/Dx5 SK-MES-1 HT29 NCI-H460 PANC1 PLC/PRF/5
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95- 281
>10000 >10000 29,15 12,66 39,3 8,1 >10000 5889 111 >10000 >9000
Ej. 9 0>
10,30 4,15 <0,001 0,008 0,02 264,2 46,9 0,87 0,01 0,025 0,035 21,87 3,58
Linea celular
ACHN SW 780 UM-UC-3 Linea celular PANC1 PLC/PRF/5 NCI-H460 PANC1
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95- 281
>10000 120 42,43 2242 1367 rhTRAIL 95-281 >10000 >9000 5889 111 >10000
Ej. 9 D)
4,46 1,98 <0,001 0,14 0,07 Ej. 15 a' 128,00 3722 15,20 128
Linea celular
HCT116 MES-SA MES-SA/Dx5 SK-MES-1 PC 3 Linea celular UM-UC-3
media DE media DE media DE media DE media DE media DE media DE
rhTRAIL 95- 281
7557 3454 >10000 29,15 12,66 39,3 8,13 >10000 rhTRAIL 95-281 2242 1367
Ej. 4 u'
14,27 2,48 4,79 0,78 3,69 1,05 0,43 0,15 1056 180,9 Ej. 14 a' 30,37 3,10
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
3. Eficacia antitumoral de protemas de fusion in vivo en xenoinjertos
Se probo la eficacia antitumoral de preparaciones de protema en un modelo de raton de celulas HCT116, Colo205 y SW620 de cancer de colon humano, celulas A549 y NCI-H460-Luc2 de cancer de pulmon de celulas no pequenas humano, celulas PLC/PRF/5 (CLS) de hepatoma humano, celulas PANC-1 de carcinoma pancreatico humano, celulas HepG2 de carcinoma de tngado humano, celulas NCI-H460 de carcinoma de pulmon de celulas grandes humano y celulas multirresistentes MES-SA/Dx5 de carcinoma uterino humano.
Celulas
Las celulas HCT116 y A549 (ATCC CCL-185) se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.) mezcladas en la relacion de 1:1 con Opti-MEM (Invitrogen, Cat. 22600-134) complementado con 10 % de suero de ternero fetal y glutamina 2 mM. El dfa del injerto de los ratones, las celulas se desprendieron del soporte lavando las celulas con tripsina (Invitrogen), luego las celulas se centrifugaron a 1300 rpm, 4 °C, 8 min, se suspendieron en tampon HBSS (medio de Hanks), se contaron y se diluyeron a la concentracion de 25x106 celulas/ml.
Las celulas PLC/PRF/5 (CLS), SW620 y PANC-1 se mantuvieron en DMEM (HyClone, Logan, UT, EE.UU.) complementado con 10 % de suero de ternero fetal y glutamina 2 mM. El dfa del injerto de los ratones, las celulas se desprendieron del soporte lavando las celulas con tripsina (Invitrogen), luego las celulas se centrifugaron a 1300 rpm, 4 °C 8 min, se suspendieron en tampon HBSS (medio de Hanks), se contaron y se diluyeron a la concentracion de 25x106 celulas/ml.
Las celulas HepG2 se mantuvieron en MEM (HyClone, Logan, UT, EE.UU.) complementado con 10 % de suero de ternero fetal y glutamina 2 mM. El dfa del injerto de los ratones, las celulas se desprendieron del soporte lavando las celulas con tripsina (Invitrogen), luego las celulas se centrifugaron a 1300 rpm, 4 °C, 8 min, se suspendieron en tampon HBSS (medio de Hanks), se contaron y se diluyeron a la concentracion de 25x106 celulas/ml.
Se mantuvieron NCI-H460-Luc2, NCI-H460 y Colo205 en RPMI1640 (HyClone, Logan, UT, EE.UU.) complementado con 10 % de suero de ternero fetal y glutamina 2 mM. El dfa del injerto de los ratones, las celulas se desprendieron del soporte lavando las celulas con tripsina (Invitrogen), luego las celulas se centrifugaron a 1300 rpm, 4 °C, 8 min se suspendieron en tampon HBSS (medio de Hanks), se contaron y se diluyeron a la concentracion de 25x106 celulas/ml.
Las celulas MES-SA/Dx5 se mantuvieron en McCoy's (HyClone, Logan, UT, EE.UU.) complementado con 10% de suero de ternero fetal y glutamina 2 mM. El dfa del injerto de los ratones, las celulas se desprendieron del soporte lavando las celulas con tripsina (Invitrogen), luego las celulas se centrifugaron a 1300 rpm, 4 °C, 8 min, se suspendieron en tampon HBSS (medio de Hanks), se contaron y se diluyeron a la concentracion de 25x106 celulas/ml.
Ratones
Se realizo el examen de actividad antitumoral de proteinas de la invencion en ratones desnudos CD- (Crl:CD1- Foxn1nu 1) de 4-5 semana semanas de edad o 7-9 semanas de edad o en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr de 4-5 semanas de edad obtenidos de Charles River Germany o ratones Cby.Cg-foxn1(nu)/J de 4-5 semanas de edad obtenidos del Centrum Medycyny Doswiadczalnej en Biatystok. Los ratones se mantuvieron bajo condiciones libres de patogenos espedficas con acceso libre a comida y agua desmineralizada (a voluntad). Todos los experimentos en animales se llevaron a cabo segun las pautas: "Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education" publicado por la New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Research y fueron aprobados por el IV Comite de Etica Local sobre Experimentacion en Animales en Varsovia (N.° 71/2009).
El curso y evaluacion de los experimentos
Se midio el tamano del tumor usando un compas electronico, el volumen del tumor se calculo usando la formula: (a2 x b)/2, donde a = diagonal mas corta del 25 tumor (mm) y b = diagonal mas larga del tumor (mm). La inhibicion del crecimiento tumoral se calculo usando la formula:
ICT [%] = (Inhibicion del crecimiento tumoral) = (WT / WC) x 100 -100 %
en la que WT se refiere al volumen promedio del tumor en el grupo de tratamiento, WC se refiere al volumen promedio del tumor en el grupo de control.
Los resultados experimentales se presentan como un valor medio ± desviacion estandar (DE). Todos los calculos y graficos se prepararon usando el software GraphPad Prism 5.0.
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Modelo de cancer de colon humano ratones Crl:CD1-Foxn1nu 1
En el dfa 0, se injertaron ratones Crl:CD1 -Foxn1nu 1 por v^a subcutanea (sc) en el lado derecho con 5x106 celulas HCT116 suspensas en 0,2 ml de tampon HBSS por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de ~ 60-90 mm3 (dfa 14), los ratones se aleatorizaron para obtener el tamano promedio de tumores en el grupo de ~70 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de protemas de fusion de la invencion del Ej. 1 (10 mg/kg), Ej. 4 (10 mg/kg), Ej. 5 (10 mg/kg) y Ej. 9 (10 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (10 mg/kg) como comparacion. Las preparaciones se administraron por via intravenosa (i.v.) diariamente durante diez dfas. Cuando un grupo terapeutico alcanzo el tamano de tumor promedio de ~1000 mm3, los ratones se sacrificaron por rotura de la medula espinal. El grupo de control recibio rhTRAIL114-281.
Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:CD1-Foxn1nu afectados con cancer de colon HCT116 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 1, Ej. 4, Ej. 5 y Ej. 9 y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la Fig. 5 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Fig. 6 que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) como el porcentaje de control.
Los resultados de experimentos presentados en los graficos en las Figuras 5 y 6 muestran que la administracion de las protemas de fusion de la invencion del Ej. 1, Ej. 4, Ej. 5 y Ej. 9 causo la inhibicion del crecimiento del tumor HCT116, con ICT respectivamente 67,8; 69,8; 84,4 y 66,2 % con respecto al control en el dfa 27° del experimento. Para rhTRAIL114-281 usada como referencia comparativa, se obtuvo un ligero efecto inhibidor sobre el crecimiento de celulas tumorales con respecto al control, con ICT al nivel del 44 %. Asf, las protemas de fusion de la invencion ejercen un efecto mucho mas fuerte en comparacion con rhTRAIL114-281 sola.
Ratones Crl:CD1-Foxn1nu
modelo HT116
En el dfa 0, se injertaron ratones Crl:CD1-Foxn1nu por via subcutanea (sc) en el lado derecho con 5x106 celulas HCT116 suspensas en 0,2 ml de tampon HBSS por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de ~ 50-78 mm3 (dfa 8), los ratones se aleatorizaron para obtener el tamano promedio de tumores en el grupo de ~ 63 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de protemas de fusion de la invencion del Ej. 5. (10 mg/kg), Ej. 4. (10 mg/kg), Ej. 9 (10 mg/kg), Ej. 1 (10 mg/kg) y rhTRAlL114-281 (10 mg/kg) como una comparacion contra el tampon de formulacion (base Trizma 50 mM, NaCl 150 mM, sacarosa 80 mM, L-arginina 250 mM, glutation 1 mM, Zn2+ 0,1 mM, pH 7,3) como control. Las preparaciones se administraron por via intravenosa (i.v.) diariamente durante cinco dfas, seguido de (despues de una pausa de 2 dfas) otras cinco administraciones diarias. Cuando un grupo terapeutico alcanzo el tamano de tumor promedio de ~ 1000 mm3, los ratones se sacrificaron por rotura de la medula espinal. El grupo de control recibio rhTRAIL114-281.
Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:CD1-Foxn1nu afectados con cancer de colon HCT116 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 5, Ej. 4, Ej. 9, Ej. 1 y comparativamente con rhTRAIL114- 281 se muestran en la Fig. 10 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Fig. 11 que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) como el porcentaje de control.
Los resultados de experimentos presentados en los graficos en las Figuras 10 y 11 muestran que la administracion de las protemas de fusion de la invencion del Ej. 5, Ej. 4, Ej. 9 y Ej. 1 causo la inhibicion del crecimiento del tumor HCT116, con ICT respectivamente 80 %, 79 %, 66 % y 68 % con respecto al control en el dfa 27° del experimento. Para rhTRAIL114-281 usada como referencia comparativa, se obtuvo un ligero efecto inhibidor sobre el crecimiento de celulas tumorales con respecto al control, con iCt al nivel del 44,3 %. Asf, las protemas de fusion de la invencion ejercen un efecto mucho mas fuerte en comparacion con rhTRAIL114-281 sola.
Ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr
modelo HT116
En el dfa 0, se injertaron ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr por via subcutanea (sc) en el lado derecho con 5x106 celulas HCT116 suspensas en 0,2 ml de tampon HBSS por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de ~ 380-430 mm3 (dfa 14), los ratones se aleatorizaron para obtener el tamano promedio de tumores en el grupo de ~ 400 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 (30 mg/kg), Ej. 11 (45 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como una comparacion contra el tampon de formulacion (NaH2PO4 5 mM, Na2HPO4 95 mM, NaCl 200 mM, glutation 5 mM, ZnC^0,1 mM, 10% de glicerol, sacarosa 80 mM, pH 8,0) como control. Las preparaciones se administraron por via intravenosa (i.v.) seis veces cada dos dfas. Cuando un grupo terapeutico alcanzo el tamano de tumor promedio de ~ 1000 mm3, los ratones se sacrificaron por rotura de la medula espinal. El grupo de control recibio rhTRAIL114-281.
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Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:SHO-PrkdcsCidHrhr afectados con cancer de colon HCT116 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 (30 mg/kg), Ej. 11 (45 mg/kg) y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la Fig. 12 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Fig. 13 que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) como el porcentaje de control.
Los resultados de experimentos presentados en los graficos en las Fig. 12 y 13 muestran que la administracion de las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 11 causo la inhibicion del crecimiento del tumor HCT116, con ICT respectivamente 42 % y 44,5 % con respecto al control en el dfa 32° del experimento. Para rhTRAIL114-281 usada como referencia comparativa, se obtuvo un ligero efecto inhibidor sobre el crecimiento de celulas tumorales con respecto al control, con ICT al nivel del 5,6 %. Asf, las protemas de fusion de la invencion ejercen un efecto mucho mas fuerte en comparacion con rhTRAIL114-281 sola.
Ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr
modelo COLO205
En el dfa 0, se injertaron ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr por via subcutanea (sc) en el lado derecho con 5x106 celulas Colo205 suspensas en 0,2 ml de tampon HBSS por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de ~ 90-130 mm3 (dfa 13), los ratones se aleatorizaron para obtener el tamano promedio de tumores en el grupo de ~ 115 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 (30 mg/kg), Ej. 19 (30 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como una comparacion contra el tampon de formulacion (NaH2PO4 5 mM, Na2HPO4 95 mM, NaCl 200 mM, glutation 5 mM, ZnC^0,1 mM, 10% de glicerol, sacarosa 80 mM, pH 8,0) como control. Las preparaciones se administraron por via intravenosa (i.v.) seis veces cada dos dfas. Cuando un grupo terapeutico alcanzo el tamano de tumor promedio de ~ 1000 mm3, los ratones se sacrificaron por rotura de la medula espinal. El grupo de control recibio rhTRAIL114-281.
Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de colon Colo205 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 (30 mg/kg), Ej. 19 (45 mg/kg) y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la Fig. 14 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Fig. 15 que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) como el porcentaje de control.
Los resultados de experimentos presentados en los graficos en las Figuras 14 y 15 muestran que la administracion de las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 19 causo la inhibicion del crecimiento del tumor Colo205, con ICT respectivamente 100% y 100% con respecto al control en el dfa 33° del experimento. Para rhTRAIL114-281 usada como referencia comparativa, se obtuvo un ligero efecto inhibidor sobre el crecimiento de celulas tumorales con respecto al control, con ICT al nivel del 18,8 %. Asf, las protemas de fusion de la invencion ejercen un efecto mucho mas fuerte en comparacion con rhTRAIL114-281 sola.
Ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr
modelo SW620
En el dfa 0, se injertaron ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr por via subcutanea (sc) en el lado derecho con 5x106 celulas SW620 suspensas en 0,2 ml de tampon HBSS por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de ~ 290-350 mm3 (dfa 17), los ratones se aleatorizaron para obtener el tamano promedio de tumores en el grupo de ~ 320 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 (30 mg/kg), Ej. 11 (40 mg/kg) y TRAIL114-281 (30 mg/kg) como una comparacion contra el tampon de formulacion (NaH2PO4 5 mM, Na2HPO4 95 mM, NaCl 200 mM, glutation 5 mM, ZnC^0,1 mM, 10% de glicerol, sacarosa 80 mM, pH 8,0) como control. Las preparaciones se administraron por via intravenosa (i.v.) seis veces cada dos dfas. Cuando un grupo terapeutico alcanzo el tamano de tumor promedio de ~ 1000 mm3, los ratones se sacrificaron por rotura de la medula espinal. El grupo de control recibio rhTRAIL114-281.
Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de colon SW620 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6, Ej. 11 y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la Fig. 16 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Fig. 17 que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) como el porcentaje de control.
Los resultados de experimentos presentados en los graficos en las Figuras 16 y 17 muestran que la administracion de las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 11 causo la inhibicion del crecimiento del tumor SW620, con ICT respectivamente 62 % y 23 con respecto al control en el dfa 31 del experimento. Para rhTRAIL114-281 usada como referencia comparativa, no se obtuvo efecto inhibidor sobre el crecimiento de celulas tumorales con respecto al control, con ICT al nivel del -9 %. Asf, las protemas de fusion de la invencion ejercen un efecto mucho mas fuerte en comparacion con rhTRAIL114-281 sola.
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Las protemas de fusion probadas no produjeron efectos secundarios significativos manifestados por una disminucion en el peso corporal de ratones (es decir, inferior al 10% del peso corporal del nivel inicial). Esto muestra baja toxicidad sistemica de la protema.
Modelo de cancer de pulmon humano
Ratones Crl:CD1-Foxn1nu 1
En el dfa 0, se injertaron ratones Crl:CD1 -Foxn1nu 1 por via subcutanea (sc) en el lado derecho con 5x106 celulas A549 suspensas en 0,2 ml de tampon HBSS por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de ~ 80-100 mm3 (dfa 14), los ratones se aleatorizaron para obtener el tamano promedio de tumores en el grupo de ~90 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con la preparacion de protema de fusion de la invencion del Ej. 1 (10 mg/kg), y rhTRAIL114-281 (10 mg/kg) como una comparacion. Las preparaciones se administraron por via intravenosa (i.v.) cada dos dfas durante doce dfas. Cuando un grupo terapeutico alcanzo el tamano de tumor promedio de ~ 1000 mm3, los ratones se sacrificaron por rotura de la medula espinal. El grupo de control recibio rhTRAIL114-281.
Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:CD1-Foxn1nu afectados con cancer de pulmon A549 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 1 y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la Fig. 7 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Fig. 8 que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) como el porcentaje de control.
Los resultados de experimentos presentados en los graficos en las Figuras 7 y 8 muestran que la administracion de la protema de fusion de la invencion del Ej. 1 causo la inhibicion del crecimiento del tumor A549, con ICT 44,8 % con respecto al control en el dfa 33° del experimento. Para rhTRAIL114-281 usada como referencia comparativa, se obtuvo un ligero efecto inhibidor sobre el crecimiento de celulas tumorales con respecto al control, con ICT al nivel del 16,5%. Asf, las protemas de fusion de la invencion ejercen un efecto mucho mas fuerte en comparacion con TRAIL sola.
Cby.Cg-foxn1(nu)/J
En el dfa 0, se injertaron ratones Cby.Cg-foxn1(nu)/J por via subcutanea (sc) en el lado derecho con 5x106 celulas A549 suspensas en 0,2 ml de tampon HBSS por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de ~ 60-90 mm3 (dfa 19), los ratones se aleatorizaron para obtener el tamano promedio de tumores en el grupo de ~ 75 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de protema de fusion de la invencion del Ej. 1 (15 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como una comparacion contra agua para inyeccion como control. Las preparaciones se administraron por via intravenosa (i.v.) seis veces cada dos dfas. Cuando un grupo terapeutico alcanzo el tamano de tumor promedio de ~ 1000 mm3, los ratones se sacrificaron por rotura de la medula espinal. El grupo de control recibio rhTRAIL114-281.
Los resultados experimentales obtenidos en ratones Cby.Cg-foxn1(nu)/J afectados con cancer de pulmon A549 tratados con protema de fusion de la invencion del Ej. 1 y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la Fig. 18 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Fig. 19 que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) como el porcentaje de control.
Los resultados de experimentos presentados en los graficos en las Figuras 18 y 19 muestran que la administracion de la protema de fusion de la invencion Ej. 1 causo la inhibicion del crecimiento del tumor A549, con ICT 44,8 % con respecto al control en el dfa 33° del experimento. Para rhTRAIL114-281 usada como referencia comparativa, se obtuvo un ligero efecto inhibidor sobre el crecimiento de celulas tumorales con respecto al control, con ICT al nivel del 16,6%. Asf, las protemas de fusion de la invencion ejercen un efecto mucho mas fuerte en comparacion con rhTRAIL114-281 sola.
Ratones: Crl:SHO-PrkdcscidHrhr
A. En el dfa 0, se injertaron ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr por via subcutanea (sc) en el lado derecho con 5x106 celulas NCI-H460 suspensas en 0,2 ml de tampon HBSS por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de ~ 150-170 mm3 (dfa 13), los ratones se aleatorizaron para obtener el tamano promedio de tumores en el grupo de ~ 160 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de protema de fusion de la invencion del Ej. 6 (30 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como una comparacion contra el tampon de formulacion (NaH2PO4 5 mM, Na2HPO4 95 mM, NaCl 200 mM, glutation 5 mM, ZnC^0,1 mM, 10% de glicerol, sacarosa 80 mM, pH 8,0) como control. Las preparaciones se administraron por via intravenosa (i.v.) seis veces cada dos dfas. Cuando un grupo terapeutico alcanzo el tamano de tumor promedio de ~ 1000 mm3, los ratones se sacrificaron por rotura de la medula espinal. El grupo de control recibio rhTRAIL114-281.
Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de pulmon NCI- H460 tratados con protema de fusion de la invencion del Ej. 6 y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran
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en la Fig. 20 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Fig. 21 que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) como el porcentaje de control.
Los resultados de experimented presentados en los graficos en las Figuras 20 y 21 muestran que la administracion de la protema de fusion de la invencion Ej. 6 causo la inhibicion del crecimiento del tumor NCI-H460, con ICT 88,5 % con respecto al control en el dfa 28° del experimento. Para rhTRAIL114-281 usada como referencia comparativa, se obtuvo un ligero efecto inhibidor sobre el crecimiento de celulas tumorales con respecto al control, con ICT al nivel del 17,5%. Asf, las protemas de fusion de la invencion ejercen un efecto mucho mas fuerte en comparacion con rhTRAIL114-281 sola.
B. En el dfa 0, se injertaron ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr por via subcutanea (sc) en el lado derecho con 7x106 celulas A549 suspensas en una mezcla de 0,2 ml de HBSS:Matrigel en relacion 3:1 por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de ~ 140-165 mm3 (dfa 19), los ratones se aleatorizaron para obtener el tamano promedio de tumores en el grupo de ~ 150 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de protemas de fusion de la invencion del Ej. 5 (60 mg/kg), Ej. 6 (50 mg/kg), Ej. 11(50 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como una comparacion contra el tampon de formulacion (NaH2PO4 5 mM, Na2HPO4 95 mM, NaCl 200 mM, glutation 5 mM, ZnCh 0,1 mM, L-arginina 100 mM, sacarosa 80 mM, pH 8,0) como control. Las preparaciones se administraron por via intravenosa (i.v.) seis veces cada dos dfas. Cuando un grupo terapeutico alcanzo el tamano de tumor promedio de ~ 1000 mm3, los ratones se sacrificaron por rotura de la medula espinal. El grupo de control recibio rhTRAIL114- 281.
Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de pulmon A549 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 5, Ej. 6, Ej. 11 y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la Fig. 22 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Fig. 23 que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) como el porcentaje de control.
Los resultados de experimentos presentados en los graficos en las Figuras 22 y 23 muestran que la administracion de las protemas de fusion de la invencion Ej. 5, Ej. 6, y Ej. 11 causo la inhibicion del crecimiento del tumor A549, con ICT respectivamente 39,3 %, 39,3 % y 28 % con respecto al control en el dfa 38° del experimento. Para rhTRAIL114- 281 usada como referencia comparativa, se obtuvo un ligero efecto inhibidor sobre el crecimiento de celulas tumorales con respecto al control, con ICT al nivel del 5,3 %. Asf, las protemas de fusion de la invencion ejercen un efecto mucho mas fuerte en comparacion con rhTRAIL114-281 sola.
C. En el dfa 0, se injertaron ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr por via subcutanea (sc) en el lado derecho con 7x106 celulas NCI-H460-Luc2 suspensas en 0,1 ml de HBSS por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de ~ 100-120 mm3 (dfa 19), los ratones se aleatorizaron para obtener el tamano promedio de tumores en el grupo de ~ 110mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de protema de fusion de la invencion del Ej. 5 (primera administracion 40 mg/kg, seguido de 30 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) as una comparacion contra tampon de formulacion (NaH2PO4 19 mM, Na2HPO4 81 mM, NaCl 50 mM, glutation 5 mM, ZnCl2 0,1 mM, 10 % de glicerol, pH 7,4) como control. Las preparaciones se administraron por via intravenosa (i.v.) seis veces cada dos dfas. Cuando un grupo terapeutico alcanzo el tamano de tumor promedio de ~ 1000 mm3, los ratones se sacrificaron por rotura de la medula espinal. El grupo de control recibio rhTRAIL114-281.
Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de pulmon NCI- H460-Luc2 tratados con protema de fusion de la invencion del Ej. 5 y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la Fig. 24 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Fig. 25 que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) como el porcentaje de control.
Los resultados de experimentos presentados en los graficos en las Figuras 24 y 25 muestran que la administracion de la protema de fusion de la invencion del Ej. 5 causo la inhibicion del crecimiento del tumor NCI-H460-Luc2, con ICT 97,2% con respecto al control en el dfa 29 del experimento. Para rhTRAIL114-281 usada como referencia comparativa, se obtuvo un ligero efecto inhibidor sobre el crecimiento de celulas tumorales con respecto al control, con ICT al nivel del 76 %. Asf, las protemas de fusion de la invencion ejercen un efecto mucho mas fuerte en comparacion con rhTRAIL114-281 sola.
D. En el dfa 0, se injertaron ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr por via subcutanea (sc) en el lado derecho con 7x106 celulas A549 suspensas en 0,1 ml de mezcla de HBSS:Matrigel por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de 100-120mm3 (dfa 17), los ratones se aleatorizaron para obtener el tamano promedio de tumores en el grupo de ~ 110mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de protemas de fusion de la invencion del Ej. 5 (50 mg/kg), Ej. 1 (50 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como una comparacion contra tampon de formulacion (NaH2PO4 19 mM, Na2HPO4 81 mM, NaCl 50 mM, glutation 5 mM, ZnCl2 0,1 mM, 10 % de glicerol, pH 7,4) como control. Las preparaciones se administraron por via intravenosa (i.v.) seis veces cada dos dfas. Cuando un grupo terapeutico alcanzo el tamano de tumor promedio de ~ 1000 mm3, los ratones se sacrificaron por rotura de la medula espinal. El grupo de control recibio rhTRAIL114-281.
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Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:SHO-PrkdcsCidHrhr afectados con cancer de pulmon A549 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 5, Ej. 1 y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la Fig. 26 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Fig. 27 que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) como el porcentaje de control.
Los resultados de experimentos presentados en los graficos en las Figuras 26 y 27 muestran que la administracion de las protemas de fusion de la invencion del Ej. 5 y Ej. 1 causo la inhibicion del crecimiento del tumor A549, con ICT respectivamente 52,5 % y 41,6 % con respecto al control en el dfa 34 del experimento. Para rhTRAIL114-281 usada como referencia comparativa, se obtuvo un ligero efecto inhibidor sobre el crecimiento de celulas tumorales con respecto al control, con ICT al nivel del 21,8 %. Asf, las protemas de fusion de la invencion ejercen un efecto mucho mas fuerte en comparacion con rhTRAIL114-281 sola.
Modelo de cancer de higado
Ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhrA. En el dfa 0, se injertaron ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr por via subcutanea (sc) en el lado derecho con 5x106 celulas PLC/PRF/5 suspensas en 0,2 ml de tampon HBSS por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de ~ 190-220 mm3 (dfa 31), los ratones se aleatorizaron para obtener el tamano promedio de tumores en el grupo de ~ 200 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de protema de fusion de la invencion del Ej. 6 (40 mg/kg) y Ej. 11 (50 mg/kg), y rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como una comparacion contra el tampon de formulacion (NaH2PO4 5 mM, Na2HPO4 95 mM, NaCl 200 mM, glutation 5 mM, ZnCl2 0,1 mM, 10% de glicerol, sacarosa 80 mM, pH 8,0) como control. Las preparaciones se administraron por via intravenosa (i.v.) siguiendo el esquema: 4 administraciones cada tres dfas y 2 administraciones cada dos dfas. Cuando un grupo terapeutico alcanzo el tamano de tumor promedio de ~ 1000 mm3, los ratones se sacrificaron por rotura de la medula espinal. El grupo de control recibio rhTRAIL114-281.
Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de hngado PLC/PRF/5 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6 y Ej. 11 y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la Fig. 28 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Fig. 29 que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) como el porcentaje de control.
Los resultados de experimentos presentados en los graficos en las Figuras 28 y 29 muestran que la administracion de las protemas de fusion de la invencion Ej. 6 y Ej. 11 causo la inhibicion del crecimiento del tumor PLC/PRF/5, con ICT respectivamente 70,6 % y 63,8 % con respecto al control en el dfa 49 del experimento. Para rhTRAIL114-281 usada como referencia comparativa, el efecto inhibidor sobre el crecimiento de celulas tumorales no se obtuvo con respecto al control, con ICT al nivel del -18 %. Asf, las protemas de fusion de la invencion ejercen un efecto mucho mas fuerte en comparacion con rhTRAIL114-281 sola.
Ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr
A. En el dfa 0, se injertaron ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr por via subcutanea (sc) en el lado derecho con 5x106 celulas HepG2 suspensas en 0,2 ml de tampon HBSS por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de ~ 190-220 mm3 (dfa 31), los ratones se aleatorizaron para obtener el tamano promedio de tumores en el grupo de ~ 200 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de protema de fusion de la invencion del Ej. 6 (30 mg/kg), Ej. 19 (30 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como una comparacion contra el tampon de formulacion (NaH2PO4 5 mM, Na2HPO4 95 mM, NaCl 200 mM, glutation 5 mM, ZnCl2 0,1 mM, 10 % de glicerol, sacarosa 80 mM, pH 8,0) como control. Las preparaciones se administraron por via intravenosa (i.v.) seis veces cada dos dfas. Cuando un grupo terapeutico alcanzo el tamano de tumor promedio de ~ 1000 mm3, los ratones se sacrificaron por rotura de la medula espinal. El grupo de control recibio rhTRAIL114-281.
Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con cancer de hngado HepG2 tratados con las protemas de fusion de la invencion del Ej. 6, Ej. 19 y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la Fig. 30 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Fig. 31 que muestra la inhibicion del crecimiento tumoral (% de ICT) como el porcentaje de control.
Los resultados de experimentos presentados en los graficos en las Figuras 30 y 31 muestran que la administracion de las protemas de fusion de la invencion Ej. 6 y Ej. 19 causo la inhibicion del crecimiento del tumor HepG2, con ICT respectivamente 82,6 % y 43 % con respecto al control en el dfa 33° del experimento. Para rhTRAIL114-281 usada como referencia comparativa, se obtuvo un ligero efecto inhibidor sobre el crecimiento de celulas tumorales con respecto al control, con ICT al nivel del 12,6 %. Asf, las protemas de fusion de la invencion ejercen un efecto mucho mas fuerte en comparacion con rhTRAIL114-281 sola.
Modelo de cancer de pancreas
En el dfa 0, se injertaron ratones Crt:SHO-PrkdcscidHrhr por via subcutanea (sc) en el lado derecho con 7x106 celulas PANC1 suspensas en 0,1 ml de mezcla HBSS:Matrigel 3:1 por medio de una jeringa con una aguja de 0,5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamano de ~ 87-110 mm3 (dfa 27), los ratones se aleatorizaron para

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Una protema de fusion que comprende:
    - dominio (a) que comprende un fragmento funcional de la secuencia de protema hTRAIL soluble que empieza con un aminoacido en una posicion no inferior a hTRAIL95 y capaz de inducir la senal apoptosica en celulas de mai^ero tras la union a sus receptores sobre la superficie de las celulas, u homologo de dicho fragmento funcional que tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con dicho fragmento funcional; y
    - dominio (b) que constituye una secuencia de peptido efector antiangiogenico que es el inhibidor del receptor de factores de crecimiento y esta seleccionado del grupo de fragmentos de factores de crecimiento que consisten en fragmento de vEgF de SEQ. No. 17, fragmento de PDGF de SEQ. No. 22 y fragmento de EGF de SEQ. No. 23;
    en la que la secuencia de dominio (b) esta unida en el extremo C o extremo N del dominio (a).
  2. 2. La protema de fusion segun la reivindicacion 1, en la que el dominio (a) comprende un fragmento de la secuencia de protema hTRAIL soluble que empieza con un aminoacido a partir del intervalo hTRAIL95 a hTRAIL121, ambos incluidos, y que termina con el aminoacido hTRAIL281.
  3. 3. La protema de fusion segun la reivindicacion 1 o 2, en la que el dominio (a) esta seleccionado del grupo que consiste en hTRAIL95-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 y hTRAIL121-281.
  4. 4. La protema de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la protema de fusion entre el dominio (a) y el dominio (b) contiene el dominio (c) que comprende un sitio de escision de proteasa, seleccionado de una secuencia reconocida por metaloproteasa MMP, una secuencia reconocida por urocinasa uPA, y combinaciones de las mismas.
  5. 5. La protema de fusion segun la reivindicacion 4, en la que la secuencia reconocida por metaloproteasa MMP es SEQ. No. 24, SEQ. No. 55 o SEQ. No. 56, y la secuencia reconocida por urocinasa uPA es SEQ. No. 25.
  6. 6. La protema de fusion segun la reivindicacion 4 o 5, en la que el dominio (c) es una combinacion de secuencias localizadas proximas entre sf reconocidas por metaloproteasa MMP y urocinasa uPA.
  7. 7. La protema de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la protema entre los dominios (a), (b), (c) y/o (d) comprende ademas conector esterico flexible de glicina, glicina-serina o cistema o combinaciones de los mismos.
  8. 8. La protema de fusion segun la reivindicacion 7, en la que el conector esterico flexible esta seleccionado del grupo que consiste en GG, E, GGGCAAACAAC (SEQ. No. 26), GGCAAACAAC (SEQ. No. 27), GGGGG (SEQ. No. 28), GGGG (SEQ. No. 29), GGG (SEQ. No. 30) y GSG (SEQ. No. 54).
  9. 9. La protema de fusion segun la reivindicacion 1 que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ. No. 1; SEQ. No. 2; SEQ. No. 4; SEQ. No. 5; SEQ. No. 6; SEQ. No. 9; SEQ. No. 10; SEQ. No. 11; SEQ. No. 14; SEQ. No. 15; SEQ. No. 46; SEQ. No. 47; SEQ. No. 48 y SEQ. No. 49.
  10. 10. La protema de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es una protema recombinante.
  11. 11. Una composicion farmaceutica, que comprende como principio activo la protema de fusion como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en combinacion con un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
  12. 12. La composicion farmaceutica segun la reivindicacion 11, en una forma para administracion parenteral.
  13. 13. La protema de fusion como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en el tratamiento de enfermedades neoplasicas en mairnferos, que incluyen seres humanos.
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