ES2655828T3 - Proteína de fusión antineoplásica - Google Patents

Proteína de fusión antineoplásica Download PDF

Info

Publication number
ES2655828T3
ES2655828T3 ES12824731.9T ES12824731T ES2655828T3 ES 2655828 T3 ES2655828 T3 ES 2655828T3 ES 12824731 T ES12824731 T ES 12824731T ES 2655828 T3 ES2655828 T3 ES 2655828T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
domain
sequence
seq
protein
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12824731.9T
Other languages
English (en)
Inventor
Jerzy Szczepan Pieczykolan
Sebastian Dominik Pawlak
Bartlomiej Maciej Zerek
Piotr Kamil RÓZGA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Adamed Sp zoo
Original Assignee
Adamed Sp zoo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adamed Sp zoo filed Critical Adamed Sp zoo
Application granted granted Critical
Publication of ES2655828T3 publication Critical patent/ES2655828T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43572—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from bees
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/463—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from amphibians
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C07K7/086—Bombesin; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04003—Phospholipase C (3.1.4.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Una proteína de fusión que comprende: - dominio (a) que es un fragmento funcional de la secuencia de proteína hTRAIL soluble, siendo dicha secuencia de proteína hTRAIL presentada como SEQ. No. 90, fragmento que empieza con un aminoácido en una posición del intervalo hTRAIL95 a hTRAIL121, ambos incluidos, y termina con el aminoácido en la posición hTRAIL281, o un homólogo de dicho fragmento funcional que tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia, preferentemente el 85 % de identidad, en el que dicho fragmento funcional u homólogo del mismo es capaz de inducir la señal apoptósica en células de mamífero tras la unión a sus receptores sobre la superficie de las células, y - al menos un dominio (b) que es la secuencia de un péptido efector citolítico con una conformación de hélice alfa antipática que forma poros en la membrana celular, en la que la secuencia del dominio (b) está unida en el extremo C o extremo N del dominio (a),

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
la Fig. 26 presenta la inhibición del crecimiento tumoral valores (% de ICT) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr afectados con hepatoma PLC/PRF/5 tratados con la proteína de fusión de la invención del Ej. 16b en comparación con rhTRAIL114-281.
Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a una proteína de fusión que comprende:
-dominio (a) que es un fragmento funcional de la secuencia de proteína hTRAIL soluble, siendo dicha secuencia de proteína hTRAIL presentada como SEQ. No. 90, fragmento que empieza con un aminoácido en una posición del intervalo hTRAIL95 a hTRAIL121, ambos incluidos, y termina con el aminoácido hTRAIL281 o un homólogo de dicho fragmento funcional que tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia, preferentemente el 85 % de identidad, en el que dicho fragmento funcional u homólogo del mismo es capaz de inducir la señal apoptósica en células de mamífero tras la unión a sus receptores sobre la superficie de las células, y
-al menos un dominio (b) que es la secuencia de un péptido efector citolítico con una conformación de hélice alfa antipática que forma poros en la membrana celular,
en la que la secuencia del dominio (b) está unida en el extremo C o extremo N del dominio (a).
El término "péptido" según la invención debe entenderse como una molécula formada de la pluralidad de aminoácidos unidos juntos por medio de un enlace peptídico. Así, el término "péptido" según la invención incluye oligopéptidos, polipéptidos y proteínas.
En la presente invención, las secuencias de aminoácidos de péptidos se presentarán de un modo convencional adoptado en la materia en la dirección de extremo N (extremo N) del péptido hacia su extremo C (extremo C). Así, cualquier secuencia tendrá su extremo N en el lado izquierdo y el extremo C en el lado derecho de su presentación lineal.
El término "un fragmento soluble funcional de la secuencia de la proteína hTRAIL soluble" debe entenderse como que indica cualquiera de tal fragmento de la proteína hTRAIL soluble que es capaz de inducir la señal apoptósica en células de mamífero tras la unión a sus receptores sobre la superficie de las células.
También se apreciará por un experto que se conoce en la técnica la existencia de al menos el 70 % o el 85 % de homología de la secuencia de TRAIL.
Debe entenderse que el dominio (b) del péptido efector en la proteína de fusión de la invención no es ni la proteína hTRAIL ni una parte o fragmento de la proteína hTRAIL.
La proteína de fusión de la invención incorpora al menos un dominio (b) del péptido efector, unido en el extremo C y/o en el extremo N del dominio (a).
Por hTRAIL de secuencia se entiende la secuencia de hTRAIL conocida publicada en la base de datos GenBank con el número de acceso P505591, además de en el documento EP0835305A1 y presentada en el Listado de secuencias de la presente invención como SEQ. No. 90.
En una realización particular, el dominio (a) es el fragmento de la secuencia de TRAIL, que empieza con un aminoácido del intervalo de hTRAIL95 a hTRAIL121, ambos incluidos, y que termina con el aminoácido TRAIL 281.
En particular, el dominio (a) puede seleccionarse del grupo que consiste en secuencias correspondientes a hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL119-281 y hTRAIL121-281. Será evidente para aquellos expertos en la materia que hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281 y hTRAIL121-281 representan un fragmento de proteína TRAIL humana que empieza con el aminoácido indicado con el número 95, 114, 115, 116, 119 y 121, respectivamente, y que termina con el último aminoácido 281, en la secuencia conocida de hTRAIL.
En otra realización particular, el dominio (a) es el homólogo de un fragmento funcional de la secuencia de proteína TRAIL soluble que empieza en la posición de aminoácido no inferior a hTRAIL95 y que termina en el aminoácido hTRAIL281, cuya secuencia es al menos el 70 %, preferentemente el 85 %, idéntica a la secuencia original.
En variantes específicas de esta realización, el dominio (a) es el homólogo de un fragmento seleccionado del grupo que consiste en secuencias correspondientes a hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281 y hTRAIL121-281.
Debe entenderse que el homólogo de un fragmento de TRAIL es una variación/modificación de la secuencia de aminoácidos de este fragmento, en el que al menos un aminoácido se cambia, que incluye 1 aminoácido, 2 aminoácidos, 3 aminoácidos, 4 aminoácidos, 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, y no más del 15 % de los aminoácidos, y en el que el fragmento de una secuencia modificada ha preservado la funcionalidad de la secuencia de TRAIL, es decir, la capacidad de unirse a receptores de muerte de la superficie celular e inducir la apoptosis en células de
imagen6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La capacidad de un péptido para formar poros en la membrana celular o mitocondrial y así producir la lisis celular puede ser determinada por un método de prueba de la permeabilización de membranas celulares conocido para aquellos expertos en la materia, por ejemplo, midiendo la liberación de la célula de sustancias intracelulares que previamente han sido aplicadas a la célula, por ejemplo de ATP o marcador radiomarcado, o midiendo la captación de un colorante, tal como azul de tripano, que no se produce cuando las células están intactas.
El péptido efector citolítico de la invención puede ser cualquiera de un péptido natural o un péptido sintético.
El péptido efector de dominio (b) de la proteína de fusión de la invención es un péptido formador de poros que posee conformación de hélices alfa anfipáticas que permite interacciones con membranas biológicas.
Secuencias a modo de ejemplo del péptido efector en esta realización se designan SEQ. No. 36 (pilosulina-1), SEQ. No. 37 (pilosulina-5), SEQ. No. 41 (péptido lítico sintético de 14 aminoácidos), SEQ. No. 43 (péptido de 27 aminoácidos FF/CAP-18), SEQ. No. 44 (péptido BAMP-28), SEQ. No. 45 (el análogo de la isoforma C del péptido lítico de Entamoeba histolytica), SEQ. No. 46 (el análogo de la isoforma A del péptido lítico de Entamoeba histolytica), SEQ. No. 47 (el análogo de la isoforma B del péptido lítico de Entamoeba histolytica), SEQ. No. 48 (el fragmento del dominio HA2 de hemaglutinina del virus de la gripe), SEQ. No. 54 (el fragmento activo de perforina humana), SEQ. No. 55 (parasporina-2 de Bacillus thuringiensis), SEQ. No. 125 péptido de fusión sintético con motivo KLLK, SEQ. No. 126, y SEQ. No. 127 (análogos de pleurocidina), SEQ. No. 128 péptido sintético con motivo KLLK.
Otro péptido efector de dominio (b) con actividad formadora de poros contra célula eucariota puede ser un péptido pilosulina-1, que es una molécula catiónica derivada del veneno de la hormiga australiana Myrmecia pilosula. La pilosulina 1 es un péptido con alto contenido de lisina y arginina regularmente repetidas en una secuencia. Debido al alto contenido de estos aminoácidos, el péptido tiene una fuerte carga positiva que permite su interacción selectiva con membranas de células cancerosas y la formación de poros mediante el mecanismo de "duelas de barril" (Kourie et al., Am J Physiol Cell Physiol, 278: 1063 -1087, 2000).
En particular, un péptido efector tal es un péptido de 56 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 36.
Otro péptido efector de dominio (b) con actividad formadora de poros contra la célula eucariota puede ser el péptido pilosulina-5, responsable de las interacciones iónicas con la membrana celular produciendo la formación de poros, y como consecuencia, la inhibición del crecimiento tumoral. La pilosulina 5 es el péptido que pertenece a la familia de pilosulinas derivada del veneno de la hormiga australiana Myrmecia pilosula. Este péptido tiene en su estructura el patrón cíclicamente repetido de aminoácidos lisina, alanina y ácido aspártico, que confiere una carga positiva, que puede potenciar interacciones con la superficie de células tumorales.
En particular, un péptido efector tal es el péptido de 100 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 37.
Otro péptido efector citolítico de dominio (b) con actividad contra la célula eucariota puede ser un péptido lítico sintético. Péptidos sintéticos de fórmula (KLAKKLA)n (donde n es varias repeticiones del motivo) como proteínas anfipáticas y de hélice alfa después de la penetración en la célula se acumulan selectivamente en la membrana mitocondrial negativamente cargada, causando la formación de poros y la desestabilización del potencial electrostático de las mitocondrias, eliminando así selectivamente células de líneas seleccionadas de células cancerosas (Javadpour et al, J Med Chem, 39:3107-13, 1996).
En particular, un péptido efector tal es un péptido de 14 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 41.
Otro péptido efector de dominio (b) con actividad citolítica contra la célula eucariota puede ser otro péptido lítico sintético que disgrega la membrana celular en un modo de tipo detergente (Papo N, Shai Y. New lytic peptides based on the D,L-amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells. Biochemistry. 2003 Aug 12;42(31):9346-54).
En particular, un péptido efector tal es un péptido de 17 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 128.
Otro péptido efector de dominio (b) con actividad formadora de poros es el péptido FF/CAP18 descrito por Isogai E. en "Antimicrobial and Lipopolysaccharide-Binding Activities of C-Terminal Domain of Human CAP18 Peptides to Genus Leptospira", The Journal of Applied Research, Vol. 4, No. 1, 2004, 180-185). FF/CAP18 es el análogo de la secuencia del extremo C de 27 aminoácidos de catelicidina humana hCAP18109-135, que se modificó por sustitución de 2 restos de aminoácidos con fenilalaninas. FF/CAP18 tiene carácter fuertemente catiónico, elevado en relación con la secuencia nativa debido a modificación incorporada, y se une fuertemente a membranas de células eucariotas. Una vez unida a la superficie de la membrana, FF/CAP18 forma canales y poros iónicos, conduciendo a la desestabilización del equilibrio electrostático de células. Además, después de la penetración dentro de la célula, el análogo se forma en la membrana mitocondrial para formar canales de iones, desestabilizando así el potencial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
electrostático de la mitocondria y conduciendo a la liberación de mitocondria a citosol de factores tales como citocromo C, SMAC/Diablo o factor AIF, que inicia el proceso de apoptosis.
En particular, un péptido efector tal es el péptido de 27 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 43.
Otro péptido efector de dominio (b) con actividad formadora de poros es un péptido BAMP-28 con fuerte carga positiva que pertenece a la familia de las catelicidinas. Este péptido también es el análogo estructural de histatinas humanas, un grupo de 12 péptidos con una masa inferior a 4 kDa producidos por células de las glándulas salivales y que presentan propiedades antibacterianas y antifúngicas (W. Kamysz et al., Histatyny -biatka liniowe bogate w histydynę, Nowa Stomatologia 2004). El dominio del extremo N del péptido BAMP-28 está fuertemente positivamente cargado y es responsable de acoplarse a la membrana celular, mientras que la parte del extremo C es responsable de la actividad citotóxica (Hugosson, M., D. et al., 1994). Los péptidos antibacterianos y presecuencias mitocondriales afectan el acoplamiento mitocondrial, respiración e importación de proteínas. Eur. J. Biochem. 223:1027-1033). El mecanismo de actividad del péptido BMAP-28 se basa principalmente en la formación de poros en membranas celulares y mitocondriales (A. Risso et al., BMAP-28, an Antibiotic Peptide of Innate Immunity, Induces Cell Death through Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Mar. 2002, p. 1926-1935).
En particular, un péptido efector tal es el péptido de 27 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 44.
Otro péptido efector de dominio (b) con actividad formadora de poros es el análogo de la isoforma A del péptido lítico de Entamoeba histolytica responsable de la acumulación sobre la superficie celular produciendo la formación de poros, que en consecuencia conduce a la inhibición del crecimiento tumoral. Se han identificado tres isoformas A, B y C de los péptidos de Entamoeba histolytica, localizados en el citoplasma granular del parásito. Éstos son polipéptidos de 77 aminoácidos estabilizados por tres puentes de sulfuro, que contienen en la estructura secundaria cuatro hélices anfipáticas (Leippe, M et al EMBO J. 11, 3501-3506, 1992). Estos péptidos tienen propiedades líticas contra las células eucariotas (Leippe, M. y Müller-Eberhard, H.J. Toxicology 87, 5-18, 1994). La tercera hélice en la estructura de estos péptidos tiene una longitud adecuada para la penetración de la membrana celular y la formación de poros. Basándose en las secuencias de aminoácidos que comprenden solo el dominio de tercera hélice de las tres isoformas, se ha construido una serie de péptidos sintéticos análogos (A3, B3 y C3) que tienen actividad formadora de poros y citotóxica contra las líneas de células cancerosas humanas y se caracterizan por baja actividad hemolítica (Andrä et al., FEBS Letters 385: 96-100,1996).
En particular, un péptido efector tal es el péptido de 24 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 45.
Otro péptido efector de dominio (b) con actividad formadora de poros contra célula eucariota es un análogo de la isoforma B del péptido lítico de Entamoeba histolytica.
En particular, un péptido efector tal es el péptido de 24 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 46.
Otro péptido efector de dominio (b) con actividad formadora de poros contra célula eucariota es un análogo de la isoforma C del péptido lítico de Entamoeba histolytica.
En particular, un péptido efector tal es el péptido de 24 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 47.
Otro péptido efector de dominio (b) con actividad formadora de poros contra célula eucariota es un homólogo de fragmento del extremo N de 20 aminoácidos, el llamado "péptido de fusión", de dominio HA2 de hemaglutinina del virus de la gripe, responsable de la interacción de la cápside viral con la membrana de célula hospedadora (intercalación) que produce la formación de poros en la membrana celular del hospedador. La hemaglutinina (HA) del virus de la gripe es una glucoproteína homotrimérica responsable de la fusión de la cápside viral con la membrana de célula hospedadora. Pueden distinguirse dos dominios en la estructura de la proteína, HA1 responsable de la unión a receptor y H2 responsable de interacciones con la membrana celular. En la estructura de dominio HA2 solo la parte del extremo N (20 aminoácidos), el denominado "péptido de fusión", se intercala directamente en la estructura de la membrana celular (Dürrer P et al., J Biol Chem 271:13417-13421, 1996). El análisis estructural de los homólogos del péptido de fusión mostraron que su actividad está asociada con el cambio conformacional que conduce a la formación de hélices alfa anfipáticas, que son capaces de la perforación de membranas de endosoma (Takahashi S., Biochemistry 29: 6257-6264, 1990). Por tanto, los derivados de "péptido de fusión" pueden usarse como vehículos eficaces de sustancia biológicamente activa que proporciona un "escape" eficiente y rápido de endosomas.
En particular, un péptido efector tal es el péptido de 12 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 48.
5
15
25
35
45
55
Otro péptido efector de dominio (b) con actividad formadora de poros contra célula eucariota es un péptido que es un fragmento activo de perforina humana. El uso de proteínas de origen humano que son "invisibles" al sistema inmunitario, que incluyen perforina humana, puede resolver el problema de utilidad clínica limitada de quimeras de proteína que contienen toxinas de origen bacteriano, animal o vegetal debido a la fuerte inmunogenicidad generada (Frankel AE. Reducing the immune response to immunotoxin. Clin Cancer Res. 2004 Jan 1;10(1 Pt 1):13-5). El fragmento de 34 aminoácidos del extremo N de perforina humana que forma poros no específicamente en la membrana celular retiene la actividad citotóxica selectiva de la proteína completa (Liu CC, Walsh CM, Young JD. Perforin: structure and function. Immunol Today. 1995 Apr;16(4):194-201). Un fragmento de perforina fusionado con un anticuerpo que se dirige a células cancerosas retiene actividad citotóxica selectiva de la proteína completa (Wan
L. Expression, purification, and refolding of a novel immunotoxin containing humanized single-chain fragment variable antibody against CTLA4 and the N-terminal fragment of human perforin. Protein Expr. Purif. 2006 Aug;48(2):307-13. Epub 2006 Mar 9).
En particular, un péptido efector tal es el péptido de 33 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 54.
Otro péptido efector de dominio (b) con actividad formadora de poros contra célula eucariota es parasporina-2 de Bacillus thuringiensis. La familia de parasporinas comprende 13 toxinas diferentes que pertenecen a los subgrupos PS1, PS2-PS3, PS4 (Ohba M. Parasporin, a new anticancer protein group from Bacillus thuringiensis. Anticancer Res. 2009 Jan;29(1):427-33). La parasporina-2 ejerce especificidad contra células cancerosas (MOLT-4, Jurkat, HL60, HepG2, CACO-2) y existe en una forma de protoxina de 37 kDa activada cortando por proteinasa K una porción de fragmentos del extremo N y C de, respectivamente, 51 y 36 aminoácidos. La acción clave de la parasporina-2 consiste en la oligomerización dentro de la membrana celular para formar poros que tienen un diámetro de aproximadamente 3 nm, produciendo el aumento de su permeabilidad. Efectos de la actividad de parasporina-2 dependen del tipo de líneas celulares probadas e incluyen la formación de las llamadas "vesículas" o protuberancias producidas por el flujo de salida del citoplasma de las células y su lisis (células HepG2 y NIH-3T3) o formación de estructuras de tipo vacuola que producen el estallido de células (MOLT-4) (Kitada S. Cytocidal actions of parasporin-2,an anti-tumor crystal toxin from Bacillus thuringiensis. J. Biol. Chem. 2006 Sep 8;281(36):26350-60). Además, la actividad de parasporina-2 conduce a la destrucción de la estructura de microtúbulos, enredo de filamentos de actina, fragmentación de mitocondrias y retículo endoplásmico (Akiba T. Crystal structure of the parasporin-2 Bacillus thuringiensis toxin that recognizes cancer cells. J. Mol. Biol. 2009 Feb 13;386(1):121-33).
En particular, un péptido efector tal es el péptido de 251 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 55.
Otro péptido efector de dominio (b) con actividad formadora de poros contra célula eucariota es una proteína de fusión que comprende péptido lítico sintético con motivo KLLK y un péptido que es antagonista del receptor de PDGF sobre la superficie celular. La unión de un inhibidor de PDGF sobre la superficie celular permite la localización del péptido lítico a la superficie celular, y adicionalmente la unión afecta la proliferación celular y angiogénesis (Ostman A. et al., PDGF Receptors as Targets in Tumor Treatment, Adv. Cancer Res., 2007;97:247-74).
En particular, un péptido efector tal es el péptido de 39 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 125.
El péptido de fusión presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 125 y una variante de fusión del antagonista de PDGF y péptido lítico sintético de SEQ. No. 125 es novedoso y no ha sido descrito antes.
Otro péptido efector de dominio (b) con actividad formadora de poros contra célula eucariota es una proteína que es análogo de pleurocidina. Las pleurocidinas son proteínas α-helicoidales catiónicas que interaccionan con membrana celular (Cole AM et al., Isolation and characterization of pleurocidin, an antimicrobial peptide in the skin secretions of winter flounder. J Biol Chem. 1997 May 2;272(18):12008-13). Los péptidos similares a pleurocidina son activos contra células de carcinoma de mama, que incluyen células de cáncer de mama resistentes a fármaco y de crecimiento lento (Hilchie AL et al., Pleurocidin-family cationic antimicrobial peptides are cytolytic for breast carcinoma cells and prevent growth of tumor xenografts. Breast Cancer Res. 2011 Oct 24;13(5):R102).
En particular, tales péptidos efectores son el péptido de 25 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 126 y el péptido de 26 aminoácidos presentado en el listado de secuencias adjunto como SEQ. No. 127.
Tras la unión a receptores de TRAIL presentes sobre la superficie de células cancerosas, la proteína de fusión ejercerá un doble efecto. El dominio (a), que es un fragmento funcional de TRAIL o su homólogo con funcionalidad conservada, ejercerá su actividad agonista conocida, es decir, unión a receptores de muerte sobre la superficie celular y activación de la vía de apoptosis extrínseca. El péptido efector del dominio (b) de la proteína de fusión será capaz de ejercer posiblemente su acción extracelularmente o intracelularmente en paralelo a la actividad del dominio de TRAIL.
En la proteína de fusión según la invención, la actividad antitumoral de TRAIL se potencia por la formación de poros en la membrana celular o mitocondrial que producen la alteración de la carga electrostática de la célula, fuga de
imagen7
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
o fragmentos de las mismas, que con el último aminoácido de la secuencia a la que están unida forman secuencias de dominios de transporte (d1) o (d2);
y
-combinaciones de los mismos.
La combinación de dominios, por ejemplo (d1) y (d2), puede comprender en particular la combinación (d1)/(d2) y (d2)/(d1).
Además, la combinación de dominios, por ejemplo (d1) y (d2), puede incluir dominios localizados próximos entre sí y conectados en un extremo del dominio (b) y/o dominios unidos a diferentes extremos del dominio (b).
Debe entenderse que, en el caso cuando la proteína de fusión tenga tanto el dominio de transporte (d) unido al dominio (b) como el dominio (c) del sitio de escisión entre los dominios (a) y (b), entonces el dominio (c) está localizado de tal manera que después de la escisión del dominio de transporte de la construcción (d) sigue unido al dominio (b). En otras palabras, si la proteína de fusión contiene tanto el dominio de transporte (d) como el dominio de sitio de escisión (c), entonces el dominio (d) se localiza entre el dominio (b) y el dominio (c), o se localiza en el extremo del dominio (b) opuesto al sitio de unión del dominio (d).
La invención también comprende una variante, en la que el dominio (d) se localiza entre dos (c) dominios, que es la variante en la que después de la escisión del dominio de transporte de construcción, preferentemente el dominio de translocación, no se une ni al dominio de TRAIL ni al dominio de péptido efector.
La invención no comprende una variante tal en la que el dominio (d) está localizado entre el dominio (c) y el dominio (a), que es la variante en la que después de la escisión del dominio de transporte de la construcción sigue unida al dominio de TRAIL.
En otra realización, entre el dominio (a) y el dominio (b) está además localizado el dominio (e) que comprende una secuencia adecuada para la unión de una molécula de PEG a la proteína de fusión (conector de pegilación). Un conector tal puede ser la secuencia conocida Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly/ASGCGPEG o fragmentos de la misma, que con el último aminoácido de la secuencia a la que está unida forma una secuencia adecuada para la unión de una molécula de PEG. El conector de pegilación también puede seleccionarse del grupo de los siguientes:
Ala Ala Cys Ala Ala/AACAA,
Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser/SGGCGGS, y
Ser Gly Cys Gly Ser/SGCGS,
o fragmento de los mismos, que con el último aminoácido de la secuencia a la que está unida forma una secuencia adecuada para la unión de una molécula de PEG. Preferentemente, la secuencia del conector de pegilación es Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly/ ASGCGPEG.
Aparte de los principales elementos funcionales de la proteína de fusión y el (los) dominio(s) de sitio de escisión, las proteínas de fusión de la invención pueden contener una secuencia/secuencias neutras de un conector estérico flexible. Tales conectores estéricos son muy conocidos y se describen en la bibliografía. Su incorporación en la secuencia de la proteína de fusión pretende proporcionar el correcto plegamiento de proteínas producido por el proceso de su expresión en exceso en las células hospedadoras. En particular, el conector estérico puede ser un conector de glicina, glicina-serina o glicina-cisteína-alanina.
En particular, el conector estérico puede ser una combinación de restos de glicina y serina tales como Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS o cualquier fragmento de los mismos que actúa de conector estérico, por ejemplo un fragmento Gly Gly Gly Ser/GGGS, Gly Gly Gly/GGG o Gly Gly Gly Gly/GGGG, Gly Gly Ser Gly Gly, Gly Gly Ser Gly/GGSG, Gly Ser Gly/GSG o Ser Gly Gly/SGG, o combinaciones de los mismos.
En otra realización, el conector estérico puede ser cualquier combinación de restos de glicina, serina y alanina tal como Ala Ser Gly Gly/ASGG o cualquier fragmento de los mismos que actúa de conector estérico, por ejemplo Ala Ser Gly/ASG. También es posible usar la combinación de conectores estéricos, por ejemplo la secuencia Gly Gly Gly Ser Gly / GGGGS o cualquier fragmento de la misma que actúa de conector estérico, por ejemplo el fragmento Gly Gly Gly/GGG, con otro fragmento que actúa de conector estérico. En un caso tal, el conector estérico puede ser una combinación de restos de glicina, serina y alanina tal como Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly/GGGSASGG, Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly/GGSGGGSGGG, Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser/GGSGGGGGS o Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGGGS. En otra realización adicional, el conector estérico puede ser una combinación de restos de serina e histidina Ser His His Ser/SHHS o Ser His His Ala Ser/SHHAS.
En otra realización adicional, el conector estérico también puede seleccionarse de restos de aminoácidos individuales tales como resto de glicina o cisteína individual, en particular uno o dos hasta cuatro restos de glicina o cisteína.
imagen8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los métodos de generación de proteínas recombinantes, que incluyen proteínas de fusión, son muy conocidos. En resumen, esta técnica consiste en la generación de molécula de polinucleótido, por ejemplo molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína diana y que dirige la expresión de la proteína diana en el hospedador. Entonces, la proteína diana que codifica la molécula de polinucleótido se incorpora en un vector de expresión apropiado, que garantiza una expresión eficiente del polipéptido. El vector de expresión recombinante se introduce entonces en células hospedadoras para la transfección/transformación, y como resultado se produce una célula hospedadora transformada. Esto va seguido de un cultivo de células transformadas para expresar en exceso la proteína diana, purificación de proteínas obtenidas, y opcionalmente corte por escisión de las secuencias de marca usadas para la expresión o purificación de la proteína.
Técnicas adecuadas de expresión y purificación se describen, por ejemplo en la monografía Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), y A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995.
Pueden usarse cósmidos, plásmidos o virus modificados como vectores de expresión para la introducción y replicación de secuencias de ADN en células hospedadoras. Normalmente, los plásmidos se usan como vectores de expresión. Plásmidos adecuados son muy conocidos y están comercialmente disponibles.
El vector de expresión comprende una molécula de polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención y las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y traducción de la secuencia codificante incorporada en una célula hospedadora adecuada. La selección de secuencias reguladoras depende del tipo de células hospedadoras y puede ser fácilmente llevada a cabo por un experto en la materia. Ejemplos de tales secuencias reguladoras son promotor y potenciador de la transcripción o secuencia de unión a ARN polimerasa, secuencia de unión a ribosoma, que contiene la señal de iniciación de la transcripción, insertada antes de la secuencia codificante, y secuencia terminadora de la transcripción, insertada después de la secuencia codificante. Además, dependiendo de la célula hospedadora y el vector usado, pueden introducirse otras secuencias en el vector de expresión, tales como el origen de replicación, sitios de restricción de ADN adicionales, potenciadores, y secuencias que permiten la inducción de transcripción.
El vector de expresión también comprenderá una secuencia de gen marcador, que confiere fenotipo definido a la célula transformada y permite la selección específica de células transformadas. Además, el vector también puede contener una segunda secuencia de marcador que permite distinguir células transformadas con plásmido recombinante que contiene insertada la secuencia codificante de la proteína diana de aquellas que han captado el plásmido sin inserción. Casi siempre, se usan marcadores de resistencia a antibióticos típicos, sin embargo, puede usarse cualquier otro gen indicador conocido en el campo, cuya presencia en una célula (in vivo) puede ser fácilmente determinada usando técnicas de autorradiografía, espectrofotometría o bio-y quimio-luminiscencia. Por ejemplo, dependiendo de la célula hospedadora, pueden usarse genes indicadores tales como -galactosidasa, glucuronidasa, luciferasa, cloranfenicol acetiltransferasa o proteína verde fluorescente.
Además, el vector de expresión puede contener secuencia señal, que transporta proteínas al compartimento celular apropiado, por ejemplo periplasma, donde se facilita el plegamiento. Adicionalmente, puede estar presente una secuencia que codifica una etiqueta/marca, tal como HisTag unida al extremo N o GST unida al extremo C, que facilita la posterior purificación de la proteína producida usando el principio de afinidad, por cromatografía de afinidad en una columna de níquel. También pueden estar presentes secuencias adicionales que protegen la proteína contra la degradación proteolítica en las células hospedadoras, además de secuencias que aumentan su solubilidad.
El elemento auxiliar unido a la secuencia de la proteína diana puede bloquear su actividad, o ser perjudicial por otro motivo, tal como, por ejemplo, debido a toxicidad. Tal elemento debe eliminarse, que puede llevarse a cabo por escisión enzimática o química. En particular, debe eliminarse una marca de seis histidinas HisTag u otros marcadores de este tipo unidos para permitir la purificación de proteínas por cromatografía de afinidad, debido a su efecto descrito sobre la toxicidad hepática de la proteína TRAIL soluble. Pueden usarse sistemas de expresión heterólogos basados en diversas células hospedadoras muy conocidas, que incluyen células procariotas: bacterianas, tales como Escherichia coli o Bacillus subtilis, levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, y líneas celulares eucariotas (insecto, de mamífero, planta).
Preferentemente, debido a la facilidad de cultivo y manipulación genética, y una gran cantidad de producto obtenido, se usa el sistema de expresión en E. coli. Por consiguiente, la secuencia de polinucleótidos que contiene la secuencia diana que codifica la proteína de fusión de la invención se optimizará para la expresión en E. coli, es decir, contendrá en la secuencia codificante codones óptimos para la expresión en E. coli, seleccionados de las posibles variantes de secuencia conocidas en el estado de técnica. Además, el vector de expresión contendrá los elementos anteriormente descritos adecuados para E. coli unidos a la secuencia codificante.
Por consiguiente, en una realización preferida, una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia que codifica una proteína de fusión de la invención, optimizada para la expresión en E. coli, se selecciona del grupo de secuencias de polinucleótidos que consiste en:
imagen9
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La composición farmacéutica de la invención para administración parenteral puede también tener la forma de administración nasal, que incluye disoluciones, esprays o aerosoles. Preferentemente, la forma para administración intranasal será una disolución acuosa y será isotónica o tamponada o mantendrá el pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5, para mantener un carácter similar a las secreciones nasales. Además, contendrá conservantes o estabilizadores, tales como en las muy conocidas preparaciones intranasales.
La composición puede contener diversos antioxidantes que retrasan la oxidación de uno o más componentes. Además, con el fin de prevenir la acción de microorganismos, la composición puede contener diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, que incluyen, por ejemplo, y no se limitan a, parabenos, clorobutanol, timerosal, ácido sórbico, y sustancias conocidas similares de este tipo. En general, la composición farmacéutica de la invención puede incluir, por ejemplo al menos aproximadamente el 0,01 % en peso de principio activo. Más particularmente, la composición puede contener el principio activo en la cantidad del 1 % al 75 % en peso de la unidad de composición,
o por ejemplo del 25 % al 60 % en peso, pero no se limitan a los valores indicados. La actual cantidad de la dosis de la composición según la presente invención administrada a pacientes, que incluyen el hombre, se determinará por factores físicos y fisiológicos, tales como peso corporal, gravedad de la afección, tipo de enfermedad que está tratándose, intervenciones terapéuticas previas o concomitantes, el paciente y la vía de administración. Una dosis unitaria adecuada, la dosis total y la concentración de principio activo en la composición va a determinarse por el médico práctico.
La composición puede administrarse, por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 1 microgramo/kg de peso corporal a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del paciente, por ejemplo en el intervalo de 5 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal o en el intervalo de 5 mg/kg de peso corporal a 500 mg/kg de peso corporal. La proteína de fusión y las composiciones que lo contienen presentan antineoplásica o antitumoral y pueden usarse para el tratamiento de enfermedades de cáncer. La invención también proporciona el uso de la proteína de fusión de la invención como se ha definido anteriormente para tratar enfermedades de cáncer en mamíferos, que incluyen seres humanos. La invención también proporciona un método de tratamiento de enfermedades neoplásicas/ de cáncer en mamíferos, que incluyen seres humanos, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad eficaz antineoplásica de la proteína de fusión de la invención como se ha definido anteriormente, opcionalmente en forma de composición farmacéutica apropiada.
La proteína de fusión de la invención puede usarse para el tratamiento de tumores malignos hematológicos, tales como leucemia, granulomatosis, mieloma y otros tumores malignos hematológicos. La proteína de fusión también puede usarse para el tratamiento de tumores sólidos, tales como cáncer de mama, cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer cerebral, y similares. La vía de administración apropiada de la proteína de fusión en el tratamiento del cáncer será en particular la vía parenteral, que consiste en administrar la proteína de fusión de la invención en forma de inyecciones o infusiones, en la composición y forma apropiadas para esta vía de administración. La invención se describirá en más detalle en los siguientes procedimientos generales y ejemplos de proteínas de fusión específicas.
Procedimiento general para la expresión en exceso de la proteína de fusión
Preparación de un plásmido
Se usó la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión diana como molde para generar una secuencia de ADN que la codifica, que comprende codones optimizados para la expresión en Escherichia coli. Un procedimiento tal permite aumentar la eficiencia de otra etapa de síntesis de proteínas diana en Escherichia coli. La secuencia de nucleótidos resultante se sintetizó entonces automáticamente. Adicionalmente, se añadieron los sitios de escisión de enzimas de restricción Ndel (en el extremo 5' de la hebra adelantada) y Xhol (en el extremo 3' de la hebra adelantada) al gen resultante que codifica la proteína diana. Estos se usaron para clonar el gen en el vector pET28a (Novagen). También pueden usarse para clonar el gen que codifica la proteína para otros vectores. La proteína diana expresada de esta construcción puede ser opcionalmente provista en el extremo N de una marca de polihistidina (seis histidinas), precedida de un sitio reconocido por trombina, que posteriormente sirve para su purificación por cromatografía de afinidad. Algunas dianas se expresaron sin ninguna marca, en particular sin marca de histidina, y aquellas fueron posteriormente purificadas en SP Sepharose. La correctitud de la construcción resultante se confirmó en primer lugar por análisis de restricción de plásmidos aislados usando las enzimas Ndel y Xhol, seguido de secuenciación automática del marco de lectura entero de la proteína diana. Los cebadores usados para la secuenciación fueron complementarios a las secuencias del promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') y terminador T7 (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3') presentes en el vector. El plásmido resultante se usó para la expresión en exceso de la proteína de fusión diana en una cepa de E. coli comercial, que se transformó según las recomendaciones del fabricante. Se usaron las colonias obtenidas en el medio de selección (agar LB, kanamicina 50 µg/ml, 1 % de glucosa) para preparar un cultivo durante la noche en medio líquido LB complementado con kanamicina (50 µg/ml) y 1 % de glucosa. Después de aproximadamente 15 h de crecimiento en la estufa de incubación con agitación, los cultivos se usaron para inocular el cultivo apropiado.
imagen10
5
10
15
20
25
30
35
Tiempo
Voltaje
1 h
500 V
1 h
gradiente 500 -1000 V
2 h 30 min
gradiente 1000 -8000 V
30 min
8000 V
Entonces, la tira que contenía las proteínas enfocadas se lavó durante 1 min en agua desionizada, se tiñó con Coomassie Brilliant y luego se decoloró y se archivó como una imagen para marcar la localización de proteínas. La tira decolorada se equilibró 2 x 15 min con un tampón de la siguiente composición: Tris-HCl 50 mM a pH 8,8, urea 6 M, 1 % de DTT, 2 % de SDS, 30 % de glicerol.
Etapa 2. Separación en una segunda dirección por SDS-PAGE. La tira se colocó sobre 12,5 % de gel de poliacrilamida que contenía un único pocillo por tamaño estándar y entonces la separación se realizó en un aparato para SDS-PAGE, a un voltaje de 200 V durante 3 horas. El gel se tiñó con Coomassie Brilliant, luego se archivó con la escala aplicada. Las proteínas se identificaron determinando su peso basándose en el patrón de tamaño, y su IPI se leyó para la escala de 6-11 basándose en las curvas proporcionadas por el fabricante (GE Healthcare) (relación de pH con respecto al % de longitud de la tira desde el
extremo marcado como ánodo) o una escala de 3-11 basándose en la curva determinada experimentalmente por medio del kit de calibración de isoelectroenfoque (GE Healthcare). Ejemplos Los ejemplos representativos de las proteínas de fusión de la invención se muestran en los siguientes ejemplos. En los ejemplos, las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión se escriben de extremo N a extremo C de
la proteína. En los ejemplos, por TRAIL siempre se indica hTRAIL. Se usan las siguientes designaciones de componentes de secuencias de aminoácidos, en las que a continuación de
la designación de tres letras, se da la designación de una letra equivalente.
CONECTOR1: conector estérico Gly Gly /GG
CONECTOR2: conector estérico Gly Gly Gly / GGG
CONECTOR3: conector estérico Gly Ser Gly /GSG
CONECTOR4: conector estérico Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS
CONECTOR5: conector estérico Gly Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGGS
CONECTOR6: conector estérico Gly Gly Ser Gly Gly/GGSGG
CONECTOR7: conector estérico Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly/ GGGSGGG
CONECTOR8: conector estérico Gly Gly Gly Gly Ser Gly /GGGGSG
CONECTOR9: conector estérico Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser/ GGGSGGGGGS
CONECTOR10: conector estérico Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly / GGGGSGGGG
CONECTOR11: conector estérico Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly/ GSGGGSGGG
CONECTOR12: conector estérico Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys/ CAACAAAC
CONECTOR13: conector estérico Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys/ CAAACAAC
CONECTOR 14: conector estérico Cys/C
CONECTOR 15: conector estérico Gly/G
CONECTOR16: conector estérico Ser Gly Gly/SGG
FURINA: secuencia escindida por furina Arg Lys Lys Arg / RKKR
FURINA.NAT: secuencia nativa escindida por furina His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln / HRQPRGWEQ
imagen11
imagen12
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E. coli de Novagen. La proteína se separó por electroforesis según el procedimiento general descrito anteriormente. La proteína se expresó con marca de histidina.
Ejemplo 13. Proteína de fusión de SEQ. No. 13
La proteína de SEQ. No. 13 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 228 aminoácidos y la masa de 25,9 kDa, en la que el dominio (a) es la secuencia de TRAIL 95-281, y el dominio (b) del péptido efector es el péptido lítico de 14 aminoácidos (SEQ. No. 41) unido en el extremo C del dominio (a).
Adicionalmente, entre el dominio (a) y el dominio (b) están incorporados secuencialmente el conector estérico (GGGGSGGGG), el sitio de escisión de urocinasa (RVVR), el sitio de escisión de metaloproteasa (PLGLAG) y la secuencia de transporte de 8-arginina (RRRRRRRR). Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es del siguiente modo:
(TRAIL 95-281)-CONECTOR10-UROCIN-MMP-TRANS3-(SEQ. No. 41)
La secuencia de aminoácidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 13 y SEQ. No. 69, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
La secuencia de aminoácidos SEQ. No. 13 de la estructura descrita anteriormente se usó como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 69. Se generó un plásmido que contenía la secuencia codificante de ADN y se llevó a cabo la expresión en exceso de las proteínas de fusión según los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresión en exceso se realizó según el procedimiento general A, usando la cepa Tuner (DE3) de E. coli de Novagen. La proteína se separó por electroforesis según el procedimiento general descrito anteriormente. La proteína se expresó tanto con marca de histidina (Ej. 13a) como sin marca de histidina (Ej. 13b).
Ejemplo 14. Proteína de fusión de SEQ. No. 14
La proteína de SEQ. No. 14 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 192 aminoácidos y la masa de 22,1 kDa, en la que el dominio (a) es la secuencia de TRAIL 121-281, y el dominio (b) del péptido efector es el péptido lítico sintético de 14 aminoácidos (SEQ. No. 41) unido en el extremo N del dominio (a).
Adicionalmente, entre el dominio (b) y el dominio (a) están incorporados secuencialmente el conector estérico (C), el sitio de escisión de urocinasa (RWR) y el sitio de escisión de metaloproteasa (PLGLAG). Adicionalmente, en el extremo N del péptido efector está unido el dominio de transporte de polihistidina (HHHHHH). Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es del siguiente modo:
TRANS1-(SEQ. No. 41)-CONECTOR14-UROCIN-MMP-(TRAIL 121-281)
La secuencia de aminoácidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 14 y SEQ. No. 70, como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
Se usó la secuencia de aminoácidos SEQ. No. 14 de la estructura descrita anteriormente como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 70. Se generó un plásmido que contenía la secuencia codificante de ADN y se llevó a cabo la expresión en exceso de la proteína de fusión según los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresión en exceso se realizó según el procedimiento general A, usando la cepa Tuner (DE3) de
E. coli de Novagen. La proteína se separó por electroforesis según el procedimiento general descrito anteriormente. La proteína se expresó con marca de histidina.
Ejemplo 15. Proteína de fusión de SEQ. No. 15
La proteína de SEQ. No. 15 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 200 aminoácidos y la masa de 23,3 kDa, en la que el dominio (a) es la secuencia de TRAIL 121-281, y el dominio (b) del péptido efector es el péptido lítico de 14 aminoácidos (SEQ. No. 41) está unido en el extremo N del dominio (a).
Adicionalmente, entre el dominio (b) y el dominio (a) están incorporados secuencialmente el conector estérico (C), la secuencia de transporte de 8-arginina (RRRRRRRR), el sitio de escisión de urocinasa (RWR) y el sitio de escisión de metaloproteasa (PLGLAG). Adicionalmente, la secuencia de transporte de histidina (HHHHHH) está unida en el extremo N del péptido efector. Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es del siguiente modo:
TRANS1-(SEQ. No. 41)-CONECTOR14-TRANS3-UROCIN-MMP-(TRAIL 121-281)
La secuencia de aminoácidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 15 y SEQ. No. 71 como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Se usó la secuencia de aminoácidos SEQ. No. 15 de la estructura descrita anteriormente como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 71. Se generó un plásmido que contenía la secuencia codificante de ADN y se llevó a cabo la expresión en exceso de la proteína de fusión según los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresión en exceso se realizó según el procedimiento general A, usando la cepa Tuner (DE3) de
E. coli de Novagen. La proteína se separó por electroforesis según el procedimiento general descrito anteriormente. La proteína se expresó con marca de histidina.
Ejemplo 16. Proteína de fusión de SEQ. No. 16
La proteína de SEQ. No. 16 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 202 aminoácidos y la masa de 23,1 kDa, en la que el dominio (a) es la secuencia de TRAIL 121-281, y el dominio (b) del péptido efector es el péptido lítico sintético de 14 aminoácidos (SEQ. No. 41) unido en el extremo C del dominio (a).
Adicionalmente, entre el dominio (a) y el dominio (b) están incorporados secuencialmente el conector estérico (GGGGSGGGG), el sitio de escisión de metaloproteasa (PLGLAG), el sitio de escisión de urocinasa (RWR) y la secuencia de transporte de 8-arginina (RRRRRRRR). Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es del siguiente modo:
(TRAIL 121-281)-CONECTOR10-MMP-UROCIN TRANS3-(SEQ. No. 41)
La secuencia de aminoácidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 16 y SEQ. No. 72 como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
Se usó la secuencia de aminoácidos SEQ. No. 16 de la estructura descrita anteriormente como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 72. Se generó un plásmido que contenía la secuencia codificante de ADN y se llevó a cabo la expresión en exceso de la proteína de fusión según los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresión en exceso se realizó según el procedimiento general A, usando la cepa Tuner (DE3) de
E. coli de Novagen. La proteína se separó por electroforesis según el procedimiento general descrito anteriormente. La proteína se expresó tanto con marca de histidina (Ej. 16a) como sin marca de histidina (Ej. 16b).
Ejemplo 18. Proteína de fusión de SEQ. No. 18
La proteína de SEQ. No. 18 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 203 aminoácidos y la masa de 23,6 kDa, en la que el dominio (a) es la secuencia de TRAIL 116-281, y el dominio (b) del péptido efector es el péptido de 27 aminoácidos hCAP-18/LL-37 (SEQ. No. 43) unido en el extremo N del dominio (a).
Adicionalmente, entre el dominio (b) y el dominio (a) están incorporados secuencialmente el sitio de escisión de urocinasa (RWR) y el sitio de escisión de metaloproteasa (PLGLAG). Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es del siguiente modo:
(SEQ. No. 43)-UROCIN-MMP-(TRAIL116-281)
La secuencia de aminoácidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 18 y SEQ. No. 74 como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
Se usó la secuencia de aminoácidos SEQ. No. 18 de la estructura descrita anteriormente como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 74. Se generó un plásmido que contenía la secuencia codificante de ADN y se llevó a cabo la expresión en exceso de la proteína de fusión según los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresión en exceso se realizó según el procedimiento general A, usando la cepa Tuner (DE3) de
E. coli de Novagen. La proteína se separó por electroforesis según el procedimiento general descrito anteriormente. La proteína se expresó con marca de histidina.
Ejemplo 19. Proteína de fusión de SEQ. No. 19
La proteína de SEQ. No. 19 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 203 aminoácidos y la masa de 23,3 kDa, en la que el dominio (a) es la secuencia de TRAIL 116-281, y el dominio (b) del péptido efector es el péptido de 27 aminoácidos BAMP-28 (SEQ. No. 44) unido en el extremo N del dominio (a).
Adicionalmente, entre el dominio (b) y el dominio (a) están incorporados secuencialmente el sitio de escisión de urocinasa (RWR) y el sitio de escisión de metaloproteasa (PLGLAG). Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es del siguiente modo:
(SEQ. No. 44)-UROCIN-MMP-(TRAIL116-281)
La secuencia de aminoácidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 19 y SEQ. No. 75 como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
imagen13
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La secuencia de aminoácidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 22 y SEQ. No. 78 como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
Se usó la secuencia de aminoácidos SEQ. No. 22 de la estructura descrita anteriormente como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 78. Se generó un plásmido que contenía la secuencia codificante de ADN y se llevó a cabo la expresión en exceso de la proteína de fusión según los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresión en exceso se realizó según el procedimiento general A, usando la cepa Tuner (DE3) de
E. coli de Novagen. La proteína se separó por electroforesis según el procedimiento general descrito anteriormente. La proteína se expresó con marca de histidina.
Ejemplo 23. Proteína de fusión de SEQ. No. 23
La proteína de SEQ. No. 23 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 190 aminoácidos y la masa de 22,1 kDa, en la que el dominio (a) es la secuencia de TRAIL 121-281, y el dominio (b) del péptido efector es el fragmento de 12 aminoácidos del dominio HA2 de la hemaglutinina del virus de la gripe (SEQ. No. 48) unido en el extremo N del dominio (a).
Adicionalmente, entre el dominio (b) y el dominio (a) están incorporados secuencialmente la secuencia de transporte de 7-arginina (RRRRRRR), el sitio de escisión de urocinasa (RWR) y el sitio de escisión de metaloproteasa (PLGLAG). Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es del siguiente modo:
(SEQ. No. 48)-TRANS2-UROCIN-MMP-(TRAIL121-281)
La secuencia de aminoácidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 23 y SEQ. No. 79 como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
Se usó la secuencia de aminoácidos SEQ. No. 23 de la estructura descrita anteriormente como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 79. Se generó un plásmido que contenía la secuencia codificante de ADN y se llevó a cabo la expresión en exceso de la proteína de fusión según los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresión en exceso se realizó según el procedimiento general B, usando la cepa de BL21 (DE3)
o Tuner (DE3) de E. coli de Novagen. La proteína se separó por electroforesis según el procedimiento general descrito anteriormente. La proteína se expresó tanto con marca de histidina (Ej. 23a) como sin marca de histidina (Ej. 23b).
Ejemplo 30. Proteína de fusión de SEQ. No. 30
La proteína de SEQ. No. 30 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 200 aminoácidos y la masa de 22,5 kDa, en la que el dominio (a) es la secuencia de TRAIL 121-281, y el dominio (b) del péptido efector es el fragmento activo de 33 aminoácidos de perforina humana (SEQ. No. 54) unido en el extremo C del dominio (a).
Adicionalmente, entre el dominio (a) y el dominio (b) se incorpora la secuencia de conector estérico (GGGGSG). Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es del siguiente modo:
(TRAIL121-281)-CONECTOR8-(SEQ. No. 54)
La secuencia de aminoácidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 30 y SEQ. No. 86 como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
Se usó la secuencia de aminoácidos SEQ. No. 30 de la estructura descrita anteriormente como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 86. Se generó un plásmido que contenía la secuencia codificante de ADN y se llevó a cabo la expresión en exceso de la proteína de fusión según los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresión en exceso se realizó según el procedimiento general A, usando la cepa Tuner (DE3) de
E. coli de Novagen. La proteína se separó por electroforesis según el procedimiento general descrito anteriormente. La proteína se expresó con marca de histidina.
Ejemplo 31. Proteína de fusión de SEQ. No. 31
La proteína de SEQ. No. 31 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 210 aminoácidos y la masa de 23,5 kDa, en la que el dominio (a) es la secuencia de TRAIL 121-281, y el dominio (b) del péptido efector es el fragmento activo de 33 aminoácidos de perforina humana (SEQ. No. 54) unido en el extremo C del dominio (a).
Adicionalmente, entre el dominio (a) y el dominio (b) están incorporados secuencialmente el conector estérico (GGGGSG), el sitio de escisión de urocinasa (RVVR), Y el sitio de escisión de metaloproteasa (PLGLAG). Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es del siguiente modo:
(TRAIL121-281)-CONECTOR8-UROCIN-MMP-(SEQ. No. 54)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La secuencia de aminoácidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 31 y SEQ. No. 87 como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
Se usó la secuencia de aminoácidos SEQ. No. 31 de la estructura descrita anteriormente como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 87. Se generó un plásmido que contenía la secuencia codificante de ADN y se llevó a cabo la expresión en exceso de la proteína de fusión según los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresión en exceso se realizó según el procedimiento general B, usando la cepa BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de E. coli de Novagen. La proteína se separó por electroforesis según el procedimiento general descrito anteriormente. La proteína se expresó con marca de histidina.
Ejemplo 32. Proteína de fusión de SEQ. No. 32
La proteína de SEQ. No. 32 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 436 aminoácidos y la masa de 48 kDa, en la que el dominio (a) es la secuencia de TRAIL 116-281, y el dominio (b) del péptido efector es la parasporina-2 de 251 aminoácidos de Bacillus thuringiensis (SEQ. No. 55) unida en el extremo N del dominio (a).
Adicionalmente, entre el dominio (b) y el dominio (a) están incorporados secuencialmente el sitio de escisión de urocinasa (RVVR), el sitio de escisión de metaloproteasa (PLGLAG) y el conector estérico (GSGGGSGGG). Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es del siguiente modo:
(SEQ. No. 55)-UROCIN-MMP-CONECTOR11-(TRAIL116-281)
La secuencia de aminoácidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 32 y SEQ. No. 88 como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
Se usó la secuencia de aminoácidos SEQ. No. 32 de la estructura descrita anteriormente como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 88. Se generó un plásmido que contenía la secuencia codificante de ADN y se llevó a cabo la expresión en exceso de la proteína de fusión según los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresión en exceso se realizó según el procedimiento general B, usando la cepa BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de E. coli de Novagen. La proteína se separó por electroforesis según el procedimiento general descrito anteriormente. La proteína se expresó con marca de histidina.
Ejemplo 34. Proteína de fusión de SEQ. No. 91
La proteína de SEQ. No. 91 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 223 aminoácidos y la masa de 25,2 kDa, en la que el dominio (a) es la secuencia de TRAIL 121-281, y el dominio (b) del péptido efector es el péptido de fusión de 39 aminoácidos que comprende el inhibidor de PDGFR y el péptido lítico sintético (SEQ. No. 125), unido en el extremo N del dominio (a).
Adicionalmente, entre el dominio (b) y el dominio (a) están incorporados secuencialmente el sitio de escisión de urocinasa (RVVR) y el sitio de escisión de metaloproteasa (PLGLAG), el conector estérico (GG), el conector estérico (CAAACAAC) y el conector estérico (SGG). Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es del siguiente modo:
(SEQ. No. 125)-UROCIN-MMP-CONECTOR1-CONECTOR13-CONECTOR16-(TRAIL121-281)
La secuencia de aminoácidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ. No. 91 y SEQ. No. 108 como se muestra en el Listado de secuencias adjunto.
Se usó la secuencia de aminoácidos SEQ. No. 91 de la estructura descrita anteriormente como molde para generar su secuencia de ADN codificante SEQ. No. 108. Se generó un plásmido que contenía la secuencia codificante de ADN y se llevó a cabo la expresión en exceso de la proteína de fusión según los procedimientos generales descritos anteriormente. La expresión en exceso se realizó según el procedimiento general A, usando la cepa Tuner (DE3) de
E. coli de Novagen. La proteína se separó por electroforesis según el procedimiento general descrito anteriormente. La proteína se expresó sin marca de histidina.
Ejemplo 35. Proteína de fusión de SEQ. No. 92
La proteína de SEQ. No. 92 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 223 aminoácidos y la masa de 25,6 kDa, en la que el dominio (a) es la secuencia de TRAIL 95-281, y el dominio (b) del péptido efector es el péptido lítico sintético de fusión de 14 aminoácidos (SEQ. No. 41), unido en el extremo N del dominio (a).
Adicionalmente, entre el dominio (b) y el dominio (a) están incorporados secuencialmente el dominio de transporte de poliarginina (RRRRRRR), el sitio de escisión de furina (RKKR), el conector estérico (GGG) y el conector estérico (CAAACAAC). Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es del siguiente modo:
imagen14
imagen15
imagen16
imagen17
Línea celular
Tipo de cáncer Medio número de células por pocillo (miles)
DU-145 ATCC N.º HTB-81
cáncer de próstata humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3
PC-3 ATCC N.º CRL-1435
cáncer de próstata humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4
MCF-7 ATCC N.º HTB-22
cáncer de mama humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4,5
MDA-MB-231 ATCC N.º HTB-26
cáncer de mama humano DMEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4,5
MDA-MB-435s ATCC N.º HTB-129
cáncer de mama humano DMEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4
UM-UC-3 ATCC N.º CLR-1749
cáncer de vejiga humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3,5
SW780 ATCC N.º CRL-2169
cáncer de vejiga humano DMEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3
SW620 ATCC N.º CCL-227
cáncer colorrectal humano DMEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 5
BxPC-3 ATCC N.º CRL-1687
cáncer pancreático humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4,5
SK-OV-3 ATCC N.º HTB-77
cáncer de ovario humano McCoy's + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4
NIH: OVCAR-3 ATCC N.º HTB-161
cáncer de ovario humano RPMI + 20 % de FBS + 0,01 mg/ml de insulina + penicilina + estreptomicina 7
HepG2 ATCC N.º HB-8065
hepatoma de hígado humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 7
293 ATCC N.º CLR-1573
células de riñón embrionario humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4
ACHN ATCC N.º CCL-222
cáncer de riñón humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4
CAKI 1 ATCC N.º HTB-46
cáncer de riñón humano McCoy's + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3,5
CAKI 2 ATCC N.º HTB-47
cáncer de riñón humano McCoy's + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3,5
NCI-H69AR ATCC N.º CRL-11351
cáncer de pulmón de células pequeñas humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 10
HT144 ATCC N.º HTB-63
células de melanoma humanas McCoy's + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 7
NCI-H460 ATCC N.º HTB-177
cáncer de pulmón humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 2,5
A549 ATCC N.º CCL-185
cáncer de pulmón humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 2,5
MES-SA ATCC N.º CRL-1976
sarcoma uterino humano McCoy's + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3,5
Línea celular
Tipo de cáncer Medio número de células por pocillo (miles)
MES-SA/Dx5 ATCC N.º CRL1977
sarcoma uterino humano multirresistente McCoy's + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4
MES-SA/Mx2 ATCC N.º CRL2274
sarcoma uterino humano Waymouth's MB 752/1 + McCoy's (1 : 1) + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4
SK-MES-1 ATCC N.º HTB-58
cáncer de pulmón humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 5
HCT-116 ATCC N.º CCL-247
cáncer colorrectal humano McCoy's + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3
MCF10A ATCC N.º CRL-10317
células epiteliales mamarias DMEM:F12 + 5 % de plasma de caballo + 0.5 µg/ml de hidrocortisona + 10 µg/ml de insulina + 20 ng/ml de factor de crecimiento EGF 5
Panc-1 CLS 330228
cáncer pancreático humano DMEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 5
Panc03.27 ATCC N.º CRL-2549
cáncer pancreático humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 5
PLC/PRF/5 CLS 330315
hepatoma hepático humano DMEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 5
LNCaP ATCC N.º CRL-1740
cáncer de próstata humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 4,5
SK-Hep-1 CLS300334
hepatoma hepático humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 10
A498 CLS 300113
cáncer de riñón humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3
HT1080 ATCC N.º CCL-121
Fibrosarcoma humano MEM + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 3
HUV-EC-C ATCC N.º CRL-1730
células endoteliales de la vena umbilical humana M199 + 20 % de FBS + penicilina + 0,05 mg/ml de ECGS + 0,1 mg/ml de heparina + penicilina + estreptomicina 8,5
Tabla 3. Células no adherentes:
Línea celular
Tipo de cáncer Medio número de células por pocillo (miles)
NCl-H69 ATCC N.º HTB-119
cáncer de pulmón de células pequeñas humano RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 22
Jurkat A3 ATCC N.º CRL-2570
leucemia humana RPMI + 10 % de FBS + penicilina + estreptomicina 10
HL60 ATCC N.º CCL-240
leucemia humana RPMI + 20 % de FBS + penicilina + estreptomicina 10
CCRF-CEM ATCC N.º CCL-119
leucemia humana RPMI + 20 % de FBS + penicilina + estreptomicina 10
imagen18
imagen19
Tabla 4. Actividad citotóxica de proteínas de fusión de la invención Tabla 4a. Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención Tabla 4b. Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención Tabla 4c. Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención
Proteína
Incubación continua de preparaciones con células durante 72 h (prueba MTT, ng/ml)
A549
HCT116 MCF10A MES-SA MES-SA/Dx5 SK-MES-1
CI50
±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE
rhTRAIL95-281
>10000 7557 3454 >10000 >10000 29,15 12,66 39,35 8,13
Ej. 11a
115,5 60,1 6,81 4,13 103,02 18,07 7,3 1,67 1,46 0,46 1,93 0,37
Ej. 13a
909,35 169,21 112 750,5 156,27 110,85 9,69 29,04 0,65
Ej. 6a
915,2 205,8 995,7 126,1
Ej. 23a
1054,7 406,3 1054,7 406,3 245,45 25,67 48,06 1,75 22,1 0,18
NCI-H460
rhTRAIL95-281
5889 111
Ej. 6a
96,85
imagen20
Proteína
Incubación continua de preparaciones con células durante 72 h (prueba MTT, ng/ml)
COLO 205
DU 145 MDA-MB-231 PC 3 SW 620 SW 780
CI50
±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE
rhTRAIL95-281
Ej. 11a
0,42 0,57 4,74 0,104 12,54 0,74 948 42,43 735,25 45,89 0,79 0,41
UM-UC-3
HT 29 293 ACHN CAKI 2 BxPC3
TRAIL 95-281
2242 1367 >10000 >10000 >10000 >10000 64,71 31,81
Ej. 11a
0,64 0,04 4185,5 981 1152 77,78 4,86 1,06 25,42 3,22 0,43 0,114
HepG2
HT 144 NCI-H460 LNCaP OV-CAR-3 JURKAT A3
rhTRAIL 95-281
>10000 1730 218,5 5889 111 2052 466 963,00 144,25 >10000
Ej. 11a
5,63 0,45 0,26 0,065 1,8 0,34 408,15 11,8 0,114 0,07 0,29 0,24
PLC/PRF/5
PANC-1 NCI-H460
rhTRAIL95-281
>9000 >10000 5889 111
Ej. 11a
436,8 142,25 56,78
imagen21
Proteína
Incubación continua de preparaciones con células durante 72 h (prueba MTT, ng/ml)
A549
MCF10A HCT116 MES-SA MES-SA/Dx5 SK-MES-1
CI50
±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE
TRAIL 95-281
>2000 >2000 >2000 >2000 27,59 13,34 100,7 26,4
Ej. 6b
915 996 206 126 56,2 53,3
Ej. 23b
550 1342 245 26 99 48,1 1,8 22,11 0,18
Ej. 16b
10,96 2,14 4,71 1,26 1,5 0,19 0,08 0,07 0.0001 0,06 0,03
Ej. 11b
89,2 11,1 13,73 1,34
Ej. 13b
405
imagen22
Proteína
Incubación continua de preparaciones con células durante 72 h (prueba MTT, ng/ml)
SW620
Panc-1 PLC/PRF/5 HT-29 Caki-1 SK-HEP-1
CI50
±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE
TRAIL 95-281
>2000 >2000 >2000 >2000 13,42 2,16 >2000
Ej. 11b
325 24 10,87 1,8 46,4 20 893 11,57 75,1 11,3
Ej. 16b
1688 917 0,68 0,93 2,89 2,02 1063 480 3,29 1,44 4,27 2,36
Ej. 13b
4,42 26 5,8
Caki-2
SK-OV-3 BxPC-3 HT-144 OV-CAR-3 HT-1080
CI50
±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE
TRAIL 95-281
>2000 >2000 60,6 22,8 1134 375 963 144 >2000
Ej. 16b
3,54 0,52 161,2 1,8 0,55 0,12 0,13 0,05 0,12 1025 395
MES-SA/Mx2
Colo205 MCF-7 MDA-MB-231 MDA-MB-B-435S ACHN
CI50
±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE CI50 ±DE
TRAIL 95-281
38,95 6,14 59,02 21,16 >2000 >2000 >2000 >2000
Ej. 16b
0.0001 0,48 0,65 1,74 0,51 1,71 1,19 0,86 1,08 0,38 0,32
imagen23
imagen24
imagen25
imagen26
imagen27
imagen28
imagen29

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
ES12824731.9T 2011-12-28 2012-12-22 Proteína de fusión antineoplásica Active ES2655828T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL39759511 2011-12-28
PL397595A PL223487B1 (pl) 2011-12-28 2011-12-28 Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
PCT/IB2012/057657 WO2013098755A2 (en) 2011-12-28 2012-12-22 Anticancer fusion protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2655828T3 true ES2655828T3 (es) 2018-02-21

Family

ID=47716118

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12824731.9T Active ES2655828T3 (es) 2011-12-28 2012-12-22 Proteína de fusión antineoplásica

Country Status (28)

Country Link
US (1) US20140377216A1 (es)
EP (1) EP2797950B1 (es)
JP (1) JP6324905B2 (es)
KR (1) KR20140110017A (es)
CN (1) CN103987728B (es)
AU (1) AU2012360086B2 (es)
BR (1) BR112014015922A2 (es)
CA (1) CA2859494A1 (es)
CY (1) CY1120055T1 (es)
DK (1) DK2797950T3 (es)
EA (1) EA201491277A1 (es)
ES (1) ES2655828T3 (es)
HR (1) HRP20180012T1 (es)
HU (1) HUE035794T2 (es)
IL (1) IL232834A (es)
LT (1) LT2797950T (es)
MX (1) MX352796B (es)
NO (1) NO2797950T3 (es)
PH (1) PH12014501363A1 (es)
PL (2) PL223487B1 (es)
PT (1) PT2797950T (es)
RS (1) RS56758B1 (es)
SG (1) SG11201403282QA (es)
SI (1) SI2797950T1 (es)
SM (1) SMT201800026T1 (es)
UA (1) UA115436C2 (es)
WO (1) WO2013098755A2 (es)
ZA (1) ZA201405460B (es)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014141094A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Adamed Sp. Z O.O. Anticancer conjugate
GB201406705D0 (en) 2014-04-15 2014-05-28 Univ Liverpool Fusion proteins,polynucleotides,expression vectors, and their uses
US10428132B2 (en) 2015-02-11 2019-10-01 West China Hospital, Sichuan University Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand variant, as well as a preparation method and use thereof
CN107216385A (zh) * 2017-05-19 2017-09-29 何向锋 肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途
WO2018219301A1 (zh) * 2017-05-31 2018-12-06 四川大学华西医院 一种PDGFRβ靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途
US11633363B2 (en) * 2017-09-27 2023-04-25 Emory University Fusion proteins having a toxin and cancer marker, nanoparticles, and uses related thereto
CN111909275A (zh) * 2019-05-08 2020-11-10 上海大学 延长多肽药物循环半衰期的靶向载药体系及其构建方法
CN110669146B (zh) * 2019-10-24 2023-05-23 常州大学 一种可特异性阻断衔接蛋白Nck的结合位点用于预防肠道EPEC感染的活性肽
KR102659285B1 (ko) * 2020-08-11 2024-04-22 경북대학교 산학협력단 암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
CN114031673B (zh) * 2021-12-22 2023-09-22 杭州长龄生物科技有限公司 一种多肽及其制备方法
CN114605517B (zh) * 2022-05-12 2022-09-27 广东海洋大学 一种具有广谱抗癌作用的多肽lxp-7及其应用
CN116063389B (zh) * 2022-08-23 2023-07-07 广州医科大学 递送核酸药物的多肽载体、治疗肿瘤的核酸药物及其制备方法
EP4631515A1 (en) * 2024-04-12 2025-10-15 Fundació Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Antitumor parasporin-2 derived toxins

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2160909A1 (en) 1993-04-28 1994-11-10 Hagan Bayley Cell-targeted lytic pore-forming agents
ES2253753T3 (es) 1995-06-29 2006-06-01 Immunex Corporation Citocina que induce apoptosis.
US6284236B1 (en) * 1995-06-29 2001-09-04 Immunex Corporation Cytokine that induces apoptosis
JP4688678B2 (ja) 2003-11-03 2011-05-25 北京沙東生物技術有限公司 抗癌作用を有する組換えタンパク質、それをコードする遺伝子、及びそれらの使用
CN1256347C (zh) * 2003-12-10 2006-05-17 中国人民解放军第二军医大学 激肽原第五结构域－肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白及其制法和用途
PT1915626E (pt) 2005-08-16 2012-02-03 Genentech Inc Sensibilidade da apoptose a apo2l/trail por ensaio de expressão de galnac-t14 em células/tecidos
US20090131317A1 (en) 2007-06-22 2009-05-21 Affymax, Inc. Compounds and peptides that bind the trail receptor
GB0723059D0 (en) 2007-11-23 2008-01-02 Nat Univ Ireland Improved cytokine design
GB0724532D0 (en) 2007-12-17 2008-01-30 Nat Univ Ireland Trail variants for treating cancer
KR101863136B1 (ko) * 2008-01-24 2018-05-31 에스퍼란스 파마슈티컬스, 인코포레이티드 용해 도메인 융합 구성물 및 이를 제조하고 사용하는 방법
CL2009001191A1 (es) 2008-05-14 2010-07-02 Genentech Inc Uso del peptido apo2l/trail porque sirve para preparar un medicamento para tratar el cancer de pulmon y el linfoma de hodkin.

Also Published As

Publication number Publication date
JP6324905B2 (ja) 2018-05-16
EP2797950A2 (en) 2014-11-05
ZA201405460B (en) 2015-04-29
EA201491277A1 (ru) 2014-09-30
JP2015504052A (ja) 2015-02-05
PL397595A1 (pl) 2013-07-08
PH12014501363A1 (en) 2014-09-22
CA2859494A1 (en) 2013-07-04
WO2013098755A3 (en) 2013-08-29
AU2012360086A1 (en) 2014-08-07
NO2797950T3 (es) 2018-03-17
PL223487B1 (pl) 2016-10-31
US20140377216A1 (en) 2014-12-25
IL232834A (en) 2017-09-28
WO2013098755A2 (en) 2013-07-04
MX352796B (es) 2017-12-07
IL232834A0 (en) 2014-07-31
NZ627445A (en) 2016-01-29
HK1201848A1 (en) 2015-09-11
CN103987728A (zh) 2014-08-13
LT2797950T (lt) 2018-02-12
CY1120055T1 (el) 2018-12-12
SG11201403282QA (en) 2014-07-30
SMT201800026T1 (it) 2018-03-08
AU2012360086B2 (en) 2016-12-22
SI2797950T1 (en) 2018-02-28
HUE035794T2 (en) 2018-05-28
PT2797950T (pt) 2018-01-24
HRP20180012T1 (hr) 2018-02-09
KR20140110017A (ko) 2014-09-16
RS56758B1 (sr) 2018-04-30
BR112014015922A2 (pt) 2020-10-27
EP2797950B1 (en) 2017-10-18
DK2797950T3 (en) 2018-01-22
UA115436C2 (uk) 2017-11-10
PL2797950T3 (pl) 2018-03-30
CN103987728B (zh) 2017-05-10
MX2014008028A (es) 2014-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2655828T3 (es) Proteína de fusión antineoplásica
ES2628377T3 (es) Proteína de fusión antineoplásica
DK2585480T3 (en) Anticancerfusionsprotein
EP2785362A2 (en) Anticancer fusion protein
EP2646464B1 (en) Anticancer fusion protein
US20140031283A1 (en) Anticancer fusion protein
HK1201848B (en) Anticancer fusion protein
NZ627445B2 (en) Anticancer fusion protein
HK1186209B (en) Anticancer fusion protein
HK1186209A (en) Anticancer fusion protein