KR102659285B1 - 암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102659285B1
KR102659285B1 KR1020210105103A KR20210105103A KR102659285B1 KR 102659285 B1 KR102659285 B1 KR 102659285B1 KR 1020210105103 A KR1020210105103 A KR 1020210105103A KR 20210105103 A KR20210105103 A KR 20210105103A KR 102659285 B1 KR102659285 B1 KR 102659285B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cancer
peptide
exosomes
cells
exopep
Prior art date
Application number
KR1020210105103A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220020220A (ko
Inventor
이병헌
채영지
칸 파티마
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to CN202180055380.7A priority Critical patent/CN116194462A/zh
Priority to PCT/KR2021/010657 priority patent/WO2022035222A1/ko
Priority to US18/020,082 priority patent/US20230295229A1/en
Priority to EP21856228.8A priority patent/EP4198042A1/en
Publication of KR20220020220A publication Critical patent/KR20220020220A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102659285B1 publication Critical patent/KR102659285B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 암세포에서 유래한 엑소좀에 특이적인 결합력을 가진 펩타이드를 발굴하기 위해 파지 디스플레이 기법을 이용하여 ExoPep(CRKVAKG)의 펩타이드를 발굴하였고, 상기 펩타이드는 암 부위 및 암의 전이 장소로 이동하는 성질을 가지는 암세포 유래 엑소좀과 결합함으로써 항암 약물을 암의 전이 장소로 전달하는 효과를 가질 수 있다.

Description

암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도{Peptides that selectively bind to tumor-derived exosomes and use thereof}
본 발명은 암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것이다.
엑소좀(exosome)은 세포가 분비하는 작은 소낭으로 세포가 표현하는 단백질, mRNA, miRNA를 가지고 있어, 그 자체로 한 세포의 특징을 대변한다. 엑소좀은 상기 물질을 다른 세포에게 전하여 세포-세포간의 의사소통에 관여하고, 특히 암세포 유래 엑소좀은 혈액 내 높은 농도로 존재하며 암이 전이하는 곳으로 이동하여 이를 도와주는 것으로 알려졌다. 많은 연구들에서 엑소좀이 종양세포에서 매우 활발히 분비되고 암의 전이와 발달에 필요한 물질을 전이 장소에 전달하는 역할을 한다고 밝히고 있다.
전 세계적으로 암은 가장 일반적인 질환 중에 하나이며, 현재 일반적으로 수행되어지고 있는 치료법으로는 수술요법, 방사선요법, 화학요법이 있으며, 암의 분자적인 메커니즘이 연구가 활발히 진행되고 있지만, 현재 개발된 치료법들의 상당수가 외과적인 수술에 의존하고 있다. 하지만 최근에는 소분자 저해제(small molecule nihibitor), 단일항체(monoclonal antibody), 암세포를 표적으로 하는 짧은 펩타이드(short targeting peptide) 등과 같은 다양한 표적치료제(targeted therapeutic agents)가 개발되어 치료제로서 활용되고 있다. 특히 짧은 표적 펩타이드(short targeting peptide)는 조직 투과성이 높으며, 독성과 면역반응이 작아 효과적인 항암제로서 높은 가능성을 가지고 있다.
펩타이드 및 항체의 파지 디스플레이(phage display)는 타겟 세포에 대한 특이적인 리간드(ligand)를 확인하는데 매우 유용한 방법이며, 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 암세포를 표적으로 하는 펩타이드 및 항체를 발굴하는데 널리 사용 되어지고 있다. 이에, 본 발명의 연구자들은 최근 큰 관심을 받고 있는 암세포 유래 엑소좀이 혈액 내 순환하면서 암이 발생한 부위 및 암이 전이할 부위로 이동하는 성질이 있음을 이용하여 엑소좀을 표적으로 하는 펩타이드를 발굴하고 이를 이용하여 항암제의 전달 및 항암치료에 이용하고자 하였다.
일본공개특허 2017-038566 (2017.02.23 공개)
본 발명은 암세포 유래 엑소좀에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것으로, 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 암세포 유래 엑소좀에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물, 약물전달용 조성물, 암세포 영상화용 조성물 및 암세포 유래 엑소좀 검출용 조성물, 상기 펩타이드에 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 세포사멸 유도 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드, 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물 및 상기 융합 펩타이드 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 암세포 유래 엑소좀에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드에 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 세포사멸 유도 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드 및 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 펩타이드 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암세포 영상화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암세포 유래 엑소좀 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 암세포에서 유래한 엑소좀에 특이적인 결합력을 가진 펩타이드를 발굴하기 위해 파지 디스플레이 기법을 이용하여 ExoPep(CRKVAKG)의 펩타이드를 발굴하였고, 상기 펩타이드는 암 부위 및 암의 전이 장소로 이동하는 성질을 가지는 암세포 유래 엑소좀과 결합함으로써 항암 약물을 암의 전이 장소로 전달하는 효과를 가질 수 있다.
도 1은 다양한 세포주로부터 초원심분리기 및 ExoQuick 시약으로 분리된 엑소좀의 특성 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 종양 유래 엑소좀 결합 펩타이드의 발굴을 위한, 파지 라이브러리 스크리닝 과정, 파지 타이터의 변동, 및 선별된 후보 펩타이드의 서열을 나타낸다.
도 3은 스크리닝을 통해 선별된 10개의 파지 클론의 엑소좀과 엑소좀 생성 세포에 대한 결합능을 ELISA 에세이를 통해 평가한 결과를 나타낸다.
도 4는 ExoPep 펩타이드의 A549, MDA-MB231, MCF7, HEK293, MCF10A 세포 유래 엑소좀과 각각의 생성 세포에 대한 결합능을 유세포분석기를 이용해 평가한 결과 및 엑소좀과 결합된 ExoPep 펩타이드의 세포 내 유입을 공초점 현미경으로 평가한 결과를 나타낸다.
도 5는 A549 종양 세포 유래 엑소좀을 자성입자에 표지한 ExoPep 펩타이드와 반응시킨 다음, 자석을 이용하여 펩타이드와 결합한 엑소좀을 제거함으로써 세포 내 유입되는 엑소좀을 억제하는 것을 공초점 형광현미경을 통해 조사한 결과를 나타낸다.
도 6은 엑소좀 생성 억제제인 GW4869 처리에 의한 A549 세포의 엑소좀 방출 억제 및 세포 생존에 대한 영향과 이에 따른 ExoPep 펩타이드의 세포 내 유입 변동을 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 A549 종양 마우스 혈액 및 정상 마우스 혈액 유래 엑소좀을 분리하고 이에 대한 ExoPep 펩타이드의 시험관내 결합을 유세포 분석기로 분석한 결과 및 세포 내 유입을 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 8은 바이오틴-ExoPep 펩타이드를 A549 종양 마우스 및 정상 마우스 혈액에 주입한 다음 스트렙트아비딘 비드 또는 CD63 항체 비드로 각각 분리한 엑소좀의 특성에 대한 웨스턴 블롯팅 분석과 적혈구에 대한 ExoPep 펩타이드의 농도에 따른 용해작용 결과를 나타낸다.
도 9는 ExoPep 펩타이드와 결합되거나 되지 않은 A549 종양 마우스 혈액 유래 엑소좀 및 A549 세포 유래 엑소좀의 A549 종양 마우스 생체 내 분포에 대한 영상 및 조직학적 분석 결과를 나타낸다.
도 10은 암세포(A549, MDA-MB231, Panc-1, HT29, HepG2) 및 HEK293 정상세포에서 분리된 엑소좀과 ExoPep-KLA 펩타이드를 반응시킨 다음, 각 엑소좀을 생성한 각각의 세포에 처리한 후 세포독성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 A549 및 MDA-MB231 세포주에서 분리된 엑소좀과 ExoPep-KLA 펩타이드를 반응시킨 다음, 엑소좀을 생성한 각각의 세포에 처리한 후 세포사멸 유도를 세포에서 방출되는 인광 세기로 측정한 결과를 나타낸다.
도 12는 A549 세포 유래 엑소좀 및 A549 종양 마우스 혈액 유래 엑소좀에 결합한 ExoPep-KLA 펩타이드에 의한 A549 세포사멸을 아넥신 V로 염색되는 세포의 퍼센트로 측정한 결과를 나타낸다.
도 13은 혈청 내 ExoPep-KLA 펩타이드의 안정성 분석 결과를 나타낸다.
도 14는 A549 인간 폐암세포 마우스 종양 모델에서 ExoPep-KLA 펩타이드에 의한 종양 성장 및 전이 억제 분석 결과를 나타낸다.
도 15는 A549 인간 폐암세포 마우스 종양 모델에서 ExoPep-KLA 펩타이드로 치료 후 혈액 수치와 간 및 신장 기능 분석 결과를 나타낸다.
도 16은 A549 인간 폐암세포 마우스 종양 모델에서 ExoPep-KLA 펩타이드 및 독소루비신의 병용투여에 의한 종양 성장 및 전이 억제 분석 결과를 나타낸다.
도 17은 A549 인간 폐암세포 마우스 종양모델에서 독소루비신 및 ExoPep-KLA 펩타이드의 병용투여 후 혈액 수치와 간 및 신장 기능 분석 결과를 나타낸다.
도 18은 Panc-1 췌장암 마우스 모델에서 ExoPep-KLA 펩타이드 단독 및 젬시타빈 병용 투여에 의한 종양 성장 및 전이 억제 분석 결과를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 암세포 유래 엑소좀에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
바람직하게는, 상기 암세포는 폐암세포, 유방암세포 또는 췌장암세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되지만(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989), 이들로 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 합성한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 합성할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 AppliedBiosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 이의 기능적 변이체를 포함하는 개념이다. “기능적 변이체”란 암세포 유래 엑소좀에 특이적으로 결합하는 본 발명의 펩타이드의 성질에는 영향을 미치지 않는 아미노산 위치에서 일부 아미노산의 치환이 발생된 모든 유사한 서열을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
상기 “폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다.
또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체(단, 인간을 제외함)를 제공한다.
본 발명에 있어서,“벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “재조합벡터”는 숙주 세포 내에서 삽입된 핵산을 발현할 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미하는 것으로서, 당업계에 공지된 통상의 발현벡터에 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 재조합벡터는 일반적으로 숙주세포에서 증식할 수 있는 복제원점, 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(예. 프로모터, 인핸서 등), 선별 마커(selective marker) 및 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 형질전환체는 상기 재조합벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.
바람직하게는 형질전환체는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 숙주세포에 도입하여 수득할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 펩타이드는 암세포 유래 엑소좀에 특이적으로 결합할 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 암은 폐암, 유방암, 췌장암, 뇌종양, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암 및 편평상피세포암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "진단"이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암의 존재 또는 특징을 확인하는 것이다.
본 발명의 펩타이드를 이용한 암의 진단은 혈액, 소변이나 바이옵시(biopsy)에 의해 직접 얻은 해당 조직 또는 세포에 본 발명의 펩타이드를 반응시켜 이들의 결합을 검출함으로써 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드가 암 조직에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(예: 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 시아닌(cyanine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots))등 일 수 있다.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 암을 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 순환시키고 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 암으로 진단된다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 약물은 펩타이드 약물 또는 항암제일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 펩타이드 약물은 세포 사멸 또는 괴사 유도 활성을 갖는 세포 독성 펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 펩타이드는 약물을 암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 종래 공지의 약물과 연결하여 암 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 약물이 암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 전달되기 때문에 약물의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 약물의 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
상기 약물은 항암제로서, 본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 항암제로는 종래 암의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 메르탄신(mertansine), 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea) 등이 있다. 항암제와 본 발명의 펩타이드 간의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드에 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 세포사멸 유도 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 제공한다.
상기 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 세포사멸 유도 펩타이드는 "KLAKLAKKLAKLAK"로서, 본 명세서에서는 "KLA"로 약칭하였다.
또한, 본 발명은 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 펩타이드 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 항암제는 메르탄신(mertansine), 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 또는 니트로소우레아 (nitrosourea)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 암은 폐암, 유방암, 췌장암, 뇌종양, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암 및 편평상피세포암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg 용량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암세포 영상화용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(superparamagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
암세포 영상화 및 암 진단은, 이에 한정되지는 않으나, 암 질환의 초진 목적 뿐만아니라, 진행 경과, 치료에 대한 치료 경과, 치료제에 대한 반응 모니터링 등을 포괄하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암세포 유래 엑소좀 검출용 조성물을 제공한다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
< 실시예 1> A549 종양세포로부터 분리된 엑소좀의 특성 분석
초원심분리기 또는 상업적 시약인 Exoquick을 사용하여, A549 폐암세포 배지로부터 엑소좀을 분리하였다. 먼저, 분리된 엑소좀의 특성을 웨스턴 블롯팅으로 분석하기 위하여, 엑소좀 추출물을 SDS 폴리아크릴아미드 젤에 로딩하고, 젤을 전기영동한 다음, NC 멤브레인으로 옮기고, 5% 스킴밀크 및 Tween-20이 포함된 Tris 완충액(TBST) 성분의 블롯킹 용액으로 1시간 동안 반응하여 비특이적 반응을 블롯킹 하였다. 이후, TBST로 10분 동안 3번 멤브레인을 씻어내고, CD63 및 Alix에 대한 항체(Abcam, 미국)로 밤새도록 4 ℃에서 반응시켰다. 다음날, 멤브레인을 상온에서 TBST로 여러 번 씻어내고, horse radish peroxidase 접합 2차 항체로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, West Femto Maximum Sensitivity Substrate (ThermoFisher, 미국) 시약 및 LAS를 사용하여 분석하였다.
그 결과, A549, MDA-MB231 및 HEK293 세포주에서 유래한 엑소좀에서 세포 추출물과 비교하여 CD63, Alix, 및 Tsg 101와 같은 엑소좀 마커의 양적 수준이 더 높게 나타났고, 칼넥신(calnexin)은 오직 세포 추출물에서만 발현되었다(도 1a). 한편, 세포주에 따른 엑소좀 마커의 수준에는 유의성 있는 차이는 없었다.
또한, 분리된 엑소좀의 크기를 측정하기 위해서, NanoSight 기기를 사용하여 엑소좀을 분석하였다. 그 결과, 초원심분리 및 Exoquick을 통해 분리된 엑소좀의 크기는 각각 193 nm 및 103 nm로서 정상적인 엑소좀의 크기 범위 내였다(도 1b).
또한, CD63 항체가 표지된 비드 (Invitrogen, 미국)로 포획한 엑소좀 및 바이오틴-표지 후 아비딘 마그네틱 비드로 포획한 엑소좀을 상기와 같은 방법으로 젤 전기영동 및 CD63 항체로 웨스턴 블랏팅 하였다. 그 결과, 두 경우 모두 엑소좀 마커인 CD63이 잘 관찰 되었다(도 1c).
< 실시예 2> 파지 스크리닝을 통한 A549 종양세포 유래 엑소좀에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 발굴
파지 스크리닝은 T7 파지 소수성 아미노산 라이브러리 (1.3 × 1010 pfu)를 이용하여 수행하였다. 본 라이브러리는 양 말단에 시스테인과 중간에 7 개의 무작위 아미노산으로 구성된 CXXXXXXXC (X = 무작위 서열) 아미노산 서열을 가지면서, 7 개의 무작위 아미노산 중 최소 한 개 이상에서 소수성 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하고 있다. 폐암세포주로는 A549를 이용하였다. 엑소좀은 초원심분리기를 사용하여 종양세포 배지로부터 분리하였다. A549 유래의 엑소좀에만 선택적으로 결합하는 T7 파지를 선택하기 위해, CD63 항체로 표지된 비드와 파지를 반응한 다음, 비드에 결합되지 않은 상층액의 파지를 수집함으로써 비드에 비특이적으로 결합하는 파지를 제거하는 과정을 먼저 실시하였다. 그 후 상층액의 파지를 CD63 항체로 표지된 비드에 포획된 엑소좀과 함께 반응하였다(도 2a).
엑소좀에 결합된 파지를 숙주인 대장균(E. coli)을 이용하여 회수하고 플라크 어세이(plaque assay)에 의해 각 라운드에서 회수된 파지의 수(titer)를 계산하였다. 플라크 어세이에 사용하지 않고 남은 파지는 대장균을 이용해 증폭을 함으로써 그 다음 라운드에 사용할 파지를 확보하였다. 이와 같은 과정을 5 라운드까지 반복하여 수행하였다.
그 결과, 각 라운드 별 회수된 파지의 수를 계산하였다. 1 라운드를 수행했을 때, 회수된 파지의 수는 약 5.7 × 106 개였고, 최종적으로 5 라운드를 진행한 이후 2.06 × 107 개의 파지가 회수되었음을 알 수 있었다. 즉, 1 라운드에서 5 라운드 까지 진행한 결과, 약 4배의 파지 수의 증가를 볼 수 있었다(도 2b).
선별된 파지에 디스플레이된 펩타이드의 아미노산 서열분석을 위해, 4, 5 라운드의 역가 측정에 쓰인 플라크 어세이의 결과물로부터, 각각 50개 (총 100개)의 클론들을 취합하여 10 ul의 Tris 완충액에 보관하였으며, PCR을 통해 이들 파지에 삽입된 펩타이드를 코딩하는 유전자를 증폭하고 염기서열 파악과 이에 따른 아미노산 서열분석을 수행하고, Clustal X 프로그램을 사용하여 펩티드 서열의 정렬 및 분석을 수행 하였다(도 2c). 이 중 7 내지 9 개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 나타내는 10 개의 파지 클론을 추후 연구를 위해 선택하였다.
< 실시예 3> A549 종양세포 유래 엑소좀과 엑소좀 생성 세포에 대한 파지 클론의 선택적 결합능 평가
A549 세포 유래 엑소좀 및 엑소좀 생성 세포에 대한 파지 클론의 선택적 결합을 조사하기 위해, 파지 엑소좀 결합 ELISA 및 파지 세포 결합 ELISA를 수행하였다. 파지 엑소좀 결합 ELISA를 위해 엑소좀은 먼저 바이오틴화되고 단량체 아비딘 표지 자성 비드에 의해 고정되었다(도 3a). 엑소좀에 결합된 파지는 겨자무 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase)가 달린 T7 파지에 대한 항체로 검출하고, 효소에 대한 기질을 이용하여 반응 및 발색 정도에 따라 양을 정량하였다.
그 결과, CTDTKIK(4R-3), CRLSKKS(5R-25) 및 CRKVAKG(5R-34)의 서열을 갖는 펩타이드를 각각 디스플레이하는 3 개의 파지 클론이 A549 유래 엑소좀에 다른 클론보다 더 많이 결합하는 것을 확인하였다(도 3b).
또한, 엑소좀을 생성한 세포에 대한 파지의 결합을 파지 세포 결합 ELISA를 통해 측정하기 위해, 세포를 플레이트에 배양하고, 상기와 같은 항체 및 기질을 사용하여 세포에 결합한 파지를 정량하였다. 그 결과, CRKRPAL(4R-12) 및 CAVRRKL(5R-47)의 서열을 갖는 펩타이드를 각각 디스플레이하는 2 개의 클론이 엑소좀 생성 A549 세포에 다른 클론보다 더 많이 결합하는 것을 확인하였다(도 3c).
< 실시예 4> A549 종양세포 유래 엑소좀에 대한 ExoPep 펩타이드의 결합 및 세포 내 유입(internalization) 분석
도 3의 ELISA 결과를 바탕으로 5종의 펩타이드(CTDTKIK, CRLSKKS, CRKVAKG, CRKRPAL, CAVRRKL)를 합성하였다. 후보 펩타이드의 결합을 FACS 방법으로 조사하기 위해 (주) 펩트론(Peptron Co, Daegeon, Korea.)에 의뢰하여 카복시말단에 형광물질인 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC)가 접합된 펩타이드를 합성하였다. 각 펩타이드들은 표준 Fmoc 방법에 의하여 합성되었고 질량분석기에 의하여 정제되었다. 그리고 FITC로 표지된 NSSSVDK 펩타이드를 대조군으로 사용하였다.
엑소좀에 대한 펩타이드 결합을 보기 위해서는 먼저 도 3에서 언급한 것과 같은 방법으로 바이오틴과 엑소좀을 결합한 뒤 아비딘 비드와 결합시켜 엑소좀을 고정하였다. 엑소좀-비드 복합체는 실온에서 30 분 동안 포스페이트 완충액에 녹인 1 % 소 혈청 알부민(BSA) 처리를 하여 비특이적 결합에 대한 블롯킹을 하였다. 세척 후, FITC 표지 된 펩타이드를 엑소좀-비드 복합체와 4 ℃에서 30 분간 결합하였다. 반응이 끝난후, 유세포분석기를 이용하여 엑소좀에 대한 펩타이드의 결합을 분석하였다.
한편, 엑소좀 생성 세포에 대한 펩타이드 결합을 보기 위해서는 우선 1 × 106 세포를 준비하였다. 37 ℃에서 30 분 동안 각 세포의 배지에서 1 % BSA 처리를 하였다. 그 후, FITC 표지된 펩타이드를 4 ℃에서 1 시간 동안 결합시켰다. 반응이 끝난후, 유세포분석기를 이용하여 세포에 대한 펩타이드의 결합을 분석하였다.
그 결과, 도 4a에서 보듯이 본 발명의 펩타이드(서열: CRKVAKG, 명칭: ExoPep; 서열번호 1)는 A549 폐암세포, H460 폐암세포, MDA-MB231 유방암세포, 및 Panc-1 췌장암세포 유래 엑소좀에 각각의 엑소좀 생성 세포에 비해 더 높은 결합을 보였다. 반면, 정상세포인 HEK293 및 MCF10A 세포와 다른 종류의 종양세포인 LLC 마우스 폐암세포, HT-29 대장암세포, 및 HepG2 간암세포 유래 엑소좀에서는 매우 낮은 결합을 보이거나, 각각의 엑소좀 생성 세포에 비해 더 높은 결합을 보이지 않았다. 한편, 다른 종류의 펩타이드는 정상세포에 대한 결합이 높은 편이여서 후보군에서 제외하였다.
도 4b는 엑소좀과 ExoPep 펩타이드의 결합 및 세포 유입에 대한 실험 모식도를 나타낸다. A549, HEK293 및 MDA-MB231 세포의 배지를 수집하였고, 초원심분리를 통해 엑소좀을 분리하였으며, DiD 형광시약(붉은 색)으로 엑소좀을 표지한 후, ExoPep 펩타이드(FITC 표지, 녹색)와 반응시켰다. 반응 후 세포들은 고정시켰고, 핵은 DAPI (청색)로 염색하여 공초점 현미경으로 분석하였다. 보다 상세하게는, 분리된 엑소좀과 DiD (1:200 희석)를 37 ℃에서 30분 동안 교반기에서 반응시키고, Exoquick 시약을 첨가한 후, 4 ℃에서 30분 동안 유지시키고, 13000 rpm으로 3분 동안 원심분리하여 DiD 표지된 엑소좀을 가라앉혔다. 이후, 10 uM FITC-접합 펩타이드 및 DiD 표지 엑소좀의 혼합물을 A549 세포와 함께 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 3번 씻어내고, 2% PFA (paraformaldehyde)로 고정하였다. 다시 씻어낸 후, 핵 염색을 위해 세포를 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌 (4'-6-Diamidino-2-phenylindole; DAPI)로 처리하였다. 최종적으로 마운팅하고, 공초점 현미경 (Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 관찰하였다.
그 결과, ExoPep 펩타이드는 A549 세포 내에 엑소좀과 함께 관찰되었으나 대조군 펩타이드(c.p)는 관찰되지 않았다(도 4c). 이것은 A549 세포 유래 엑소좀에 대조군 펩타이드는 결합하지 않으나 ExoPep 펩타이드는 결합하여 세포 내로 효과적으로 유입된 것을 시사한다. 한편, HEK293 정상세포 유래 엑소좀을 상기와 같은 방법으로 처리한 다음, 공초점 현미경 (Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 관찰한 결과, HEK293 세포 내로의 엑소좀 유입은 효과적으로 일어났으나, 대조군 펩타이드 또는 ExoPep 펩타이드는 세포 내에서 관찰 되지 않았다(도 4c). 이것은 정상세포 엑소좀에는 ExoPep 펩타이드가 결합하지 않음을 시사한다.
또한, CD63-GFP를 발현함으로써 녹색 형광을 띤 엑소좀을 분비하도록 만들어진 MDA-MB231 세포 유래 엑소좀을 대상으로 실험을 수행하였다. GFP 엑소좀(녹색) 및 10 uM TAMARA-접합 펩타이드(붉은색)를 MDA-MB231 세포와 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 상기와 같이 고정 및 DAPI 핵 염색, 및 마운팅을 하고 공초점 현미경 (Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 관찰하였다. 그 결과, ExoPep 펩타이드는 MDA-MB231 세포 유래 엑소좀과 결합하여 엑소좀과 함께 세포 내로 유입 되었고, 대조군 펩타이드에 비해 더 많이 세포 내에 관찰 되었다(도 4d).
< 실시예 5> A549 종양세포 유래 엑소좀에 대한 ExoPep 펩타이드의 결합을 이용한 엑소좀의 수용 세포로의 유입 억제
A549 세포 유래 엑소좀에 대한 ExoPep 펩타이드의 결합 특이성을 보다 더 확인하기 위해, 엑소좀을 DID 형광 염료로 표지하고, 이어서 바이오틴 표지된 ExoPep 펩타이드로 반응시킨 다음, 자성입자에 표지된 아비딘을 반응시켜 바이오틴과 결합시켰다. 상기 반응을 통해 생성된 엑소좀/바이오틴-펩타이드/아비딘-자성입자의 복합체를 자석을 이용하여 포획 및 제거하고 그 나머지 엑소좀을 수용 세포에 처리하였다(도 5a).
그 결과, 세포 유래 엑소좀을 수용 세포에 바로 처리하거나, 엑소좀과 ExoPep 펩타이드를 반응시켰으나 제거과정을 거치지 않은 경우와 비교하여, ExoPep 펩타이드로 A549 세포 유래 엑소좀을 전처리 및 제거시킴으로써, 수용 세포로의 엑소좀의 유입이 유의하게 억제되었다(도 5b). 반면, 대조군 펩타이드(서열: NSSSVDK)의 전처리에 의해서는 수용 세포로의 엑소좀 유입이 감소되지 않았다(도 5b). 또한, HEK293 정상세포에서 유래한 엑소좀을 대상으로 유사한 실험을 한 경우, 대조군 펩타이드뿐만 아니라 본 발명의 ExoPep 펩타이드에 의해서도 수용 세포로의 엑소좀 유입이 억제되지 않았다(도 5c).
< 실시예 6> A549 종양세포 유래 엑소좀의 방출 억제로 인한 ExoPep 펩타이드의 엑소좀 결합 및 세포 내 유입 감소
엑소좀에 대한 ExoPep의 결합 특이성을 더욱 확인하기 위해서, 세포 밖으로 엑소좀 방출을 억제하는 약물인 GW4869 (스핑고미엘린 억제제) (Sigma-Aldrich사)를 여러 농도(2.5, 5, 및 10 μM)로 세포에 처리하였다. 이후 엑소좀을 분리하고, 도 1에서 기술한 것과 같은 방법으로 전기영동 및 CD63, Alix, Tsg101, 및 calnexin (Abcam)에 대한 항체로 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.
그 결과, 2.5 및 5 μM 농도에 비해, 10 μM의 GW4869 억제제 농도에서 CD63, Alix, Tsg101 등 엑소좀 마커들이 크게 감소하는 것을 확인하였다(도 6a).
한편, GW4869 억제제의 세포 생존능에 대한 영향을 확인하기 위해서, A549 세포(96-well 세포배양용기에 well당 5 × 103 개)를 무혈청 배지에서 GW4869를 여러 농도로 37 ℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이후 10% 소혈청(FBS)가 포함된 배양 배지로 교체하여, 세포를 24시간 동안 배양한 후, CCK-8 assay (Dojindo사, 일본)를 이용하여 세포 독성을 측정하였다.그 결과, GW4869는 고농도에서도 독성을 나타내지 않았다(도 6b). 이상의 결과를 바탕으로, 10 μM의 GW4869 억제제를 사용하여, ExoPep 펩타이드의 엑소좀에 대한 결합 및 세포 내 유입을 분석하였다. 면역형광염색 결과, 10 μM의 GW4869를 처리한 경우 엑소좀의 방출 감소로 인해 엑소좀 및 이와 결합을 통한 펩타이드의 세포 내 유입이 상당히 감소하였다(도 6c).
< 실시예 7> A549 종양 마우스 혈액 및 정상 마우스 혈액 유래 엑소좀에 대한 ExoPep 펩타이드의 결합 및 세포 내 유입 분석
A549 세포를 BALB/c 누드마우스에 주입하였고, 종양이 자라면 혈액을 수집하고, 엑소좀 분리 키트를 사용하여 엑소좀을 분리하였다. 유세포 분석기로 엑소좀에 대한 펩타이드의 결합을 측정하기 위해, 엑소좀을 CD63 항체 비드로 표지하였다. 대조군으로는 정상 마우스의 혈액에서 분리한 엑소좀을 사용하였다. CD63 비드로 표지한 엑소좀-비드 복합체는 비특이적 결합을 줄이기 위해 1% BSA/PBS로 상온에서 30분 동안 반응시켜 블롯킹을 실시하였다. 세척 후, FITC 표지된 ExoPep 펩타이드를 엑소좀-비드 복합체와 4 ℃에서 30분 동안 결합시켰다. PBS로 다시 씻어낸 후, 유세포 분석기 (ThermoFisher Scientific, USA)를 사용하여 엑소좀-비드 복합체에 대한 펩타이드의 결합을 분석하였다(도 7a).
그 결과, ExoPep 펩타이드는 정상 마우스 혈액 유래 엑소좀 보다 A549 종양 마우스 혈액 유래 엑소좀에 더 잘 결합하는 것으로 나타났다(도 7b 및 도 7c).
펩타이드의 세포 내 유입을 보기 위해, 엑소좀을 DiD로 표지한 후, FITC 표지된 펩타이드와 반응 시킨 다음 A549 세포에 처리하고, 4 % 파라포름알데히드로 세포를 5분 동안 고정시키고, DAPI 염색 후 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 본 발명의 ExoPep 펩타이드는 정상 마우스 혈액 유래 엑소좀 보다 종양 마우스 혈액 유래 엑소좀과 결합하여 수용 세포인 A549에 더 많이 유입되는 것으로 나타났으며, 세포 내부에 펩타이드(녹색)와 종양 유래 엑소좀(붉은색)의 형광이 함께 관찰되었다(도 7e).
< 실시예 8> A549 종양 마우스에서 혈액 내 순환 엑소좀에 대한 ExoPep 펩타이드의 결합 분석
마우스 혈액 내 순환 엑소좀과 펩타이드의 결합을 확인하기 위해서, 바이오틴 표지된 펩타이드를 A549 종양 마우스 및 건강한 마우스의 정맥으로 주입하고 순환 시킨 후, 혈청을 수집하고, 수집 30분 후에 CD63 항체 비드 및 스트렙트아비딘(streptavidin) 비드로 각각 반응시켰다. CD63 항체 비드로 처리한 혈청은 밤새도록 반응시켰고, 다음날 자석을 사용하여 비드를 가라앉혔다. 비드에 결합한 엑소좀은 RIPA 용해액을 사용하여 용해시켰고, 이후 CD63 및 ALIX 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 스트렙트아비딘 비드로 처리한 혈청은 1시간 동안 반응시켰고, 자석을 사용하여 가라앉혔다. 비드에 결합한 엑소좀은 용출 완충액(2 mM D-biotin in PBS)을 사용하여 용출시킨 후, CD63 및 ALIX 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다(도 8a).
그 결과, 건강한 마우스에 비해, 종양 마우스의 혈액에서 CD63 항체 비드로 분리한 경우 엑소좀 마커가 훨씬 더 높게 나타났다(도 8b, 왼쪽). 스트렙트아비딘 비드로 분리한 경우에도 종양 마우스의 혈액에서 엑소좀 마커가 더 높게 나타났으나, CD63 비드로 분리한 경우 보다 엑소좀 마커의 양이 상대적으로 적었다.(도 8b, 오른쪽). 이것은 CD63 항체는 모든 혈액 내 엑소좀과 결합하지만 바이오틴-ExoPep 펩타이드는 종양 유래 엑소좀에 선별적으로 결합하기 때문에 분리된 엑소좀의 양이 상대적으로 적은 것을 시사한다. 이상의 결과는 본 발명의 펩타이드가 순환하는 혈액 내 엑소좀과 결합을 하며 특히 종양 유래 엑소좀과 선택적으로 결합하는 것을 보여준다.
다음으로, 시험관 내 용혈 분석을 수행하였다. 시험관 내 용혈 분석은 약물 또는 제제에 노출된 후의 적혈구 세포 용혈의 지표로서, 혈장 내 헤모글로빈 방출을 측정하였다. 이는 약물의 용혈 활성을 예측하는데 정확하고 민감한 방법이다. 신선한 혈액을 500×g으로 10분 동안 원심분리하였고, 적혈구 펠렛은 3번 씻어냈고, pH 7.4, 10 mM PBS에 재현탁시켰다. 동등한 부피의 적혈구를 다양한 농도의 ExoPep 펩타이드로 37 ℃에서 1시간 동안 교반하여 반응시켰다. 이후 샘플을 4 ℃에서 500×g으로 10분 동안 원심분리하였다. RBC 용해는 여러 펩타이드 농도에 따라 OD 540 nm에서 흡광도를 분석하여 측정하였다. 대조군으로 사용한 1% Triton X 100 샘플이 100% 용혈을 나타낸다고 간주하고, 용혈 백분율을 측정하였다. 펩타이드의 용혈 활성은 다음의 식을 사용하여 백분율로 계산하였다.
사용식: H= 100 × (OP-OB)/(OT-OB)
상기 식에서, OP는 표시된 농도에서의 펩타이드 용액의 광학 밀도이고, OB는 완충액의 광학 밀도이며, OT은 Triton X 100의 광학 밀도이다.
그 결과, 최종 농도 200 μM 까지의 여러 농도의 펩타이드에서 낮은 수준의 용혈 활성만을 나타냈다(도 8c).
< 실시예 9> ExoPep 펩타이드 결합 여부에 따른 A549 종양 마우스 혈액 유래 엑소좀 및 A549 세포 유래 엑소좀의 A549 종양 마우스 생체 내 분포
DiD 표지된 A549 종양 마우스 혈액 유래 엑소좀 및 A549 세포 유래 엑소좀을 ExoPep 펩타이드와 반응하여, 생체 내 분포에 대한 영상 모니터링을 수행하였다. 종양 이종 이식 마우스는 A549 세포 부유물 (5×106 cells)을 PBS와 함께, 5주령 BALB/c 누드 암컷 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하로 이식하여 제작되었다. 종양 크기가 약 100-200 mm3의 부피에 도달하면, 마우스를 마취시켰고, DiD-표지된 A549 종양 마우스 혈액 유래 엑소좀(mEXO) 및 이와 펩타이드를 반응한 것(mEXO+ExoPep) (n = 3)과, DiD-표지된 A549 세포 유래 엑소좀(cEXO) 및 이와 펩타이드를 반응한 것(cEXO+ExoPep) (n = 3)을 A549 종양 마우스에 정맥 투여하였다. 본 발명자들은 대조군으로 FITC-표지된 대조군 펩타이드 및 ExoPep (n = 3)을 사용하였다. DiD-표지된 엑소좀 투여 후 여러 시간 포인트(각각 2, 4, 8 및 24 시간)에서 IVIS imaging system (Caliper Life Sciences, Massachusetts, USA)를 사용하여 생체 내 형광 이미지를 분석하였다. 잘라낸 종양 및 기관의 생체 외 형광 이미지는 투여 24시간 후에 수집하였다. 종양 조직을 가진 모든 주요 기관 (간, 신장, 비장, 심장 및 폐)을 분리하였고, PBS로 씻어낸 후 생체 외 형광 분석을 수행하였다 (n = 3).
그 결과, mEXO 및 cEXO에 비해 mEXO+ExoPep 및 cEXO+ExoPep 조합은 주입 후 4 시간 이후부터 종양 조직에 더 많이 축적되는 경향을 보였다(도 9a). 전체 신체 중 관심 영역(region of interest; ROI), 즉 종양 부위의, 형광 세기를 분석한 결과에서도 통계학적 유의성을 보였다(도 9c). 주입 후 24 시간 뒤에 장기를 적출하여 형광을 촬영하고(도 9b), 그 세기를 측정한 결과, mEXO에 비해 mEXO+ExoPep는 종양조직에 축적은 차이가 없었으나 간에 축적이 더 적게 되는 경향이 있었다(도 9d). 한편, cEXO에 비해 cEXO+ExoPep는 종양조직 및 간에 더 많이 축적되는 경향을 보였다(도 9d). FITC 표지된 대조군 및 ExoPep 펩타이드 자체는 낮은 신호를 나타냈다(도 9a-d).
< 실시예 10> ExoPep 펩타이드와 세포사멸 유도 펩타이드로 구성된 ExoPep-KLA 펩타이드의 세포독성 IC50 분석
ExoPep 펩타이드는 엑소좀과 결합하여 함께 세포 내로 유입이 잘 되는 점을 이용하여, 세포 내 미토콘드리아 막에 손상을 야기하여 세포사멸을 유도하는 펩타이드(KLA)와 융합한 펩타이드(ExoPep-KLA로 명칭)를 제작하였다. A549, MDA-MB231, HEK293, Panc-1, HT29 및 HepG2 세포 (96-well 세포배양용기에 well 당 5 × 103 개)에서 ExoPep-KLA의 세포 독성을 확인하기 위해서, 상기 세포들을 무혈청 배지에서 여러 농도의 ExoPep-KLA로 37 ℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이후, 10% FBS가 포함된 배지로 교체하여, 세포를 24시간 동안 배양한 후, CCK-8 assay (Dojindo)를 이용하여 세포 독성을 측정하였다. 여러 농도의 ExoPep-KLA를 A549, MDA-MB231, Panc-1, HT29, HepG2 및 HEK293 세포에서 분리된 각각의 엑소좀(5 μg)과 반응시킨 다음, 해당 세포에 처리하였다. 대조군으로는 ExoPep-KLA 단독 또는 ExoPep-KLA를 먼저 세포에 처리 후 엑소좀을 그 이후 처리 한 것을 사용하였다.
그 결과, 펩타이드 단독 처리군 및 펩타이드 처리 후 엑소좀 처리군에 비해 펩타이드와 엑소좀을 함께 처리한 군에서 더 효과적인 세포독성(즉, 더 낮은 IC50 값)을 보이는 것으로 나타났다. 특히, ExoPep-KLA 펩타이드는 HEK293 정상세포, HT-29 대장암세포, 및 HepG2 간암세포에서는 세포독성을 거의 보이지 않았으나, A549 폐암세포, MDA-MB231 유방암세포, 및 Panc-1 췌장암세포에 특이적으로 더 높은 세포 독성을 나타냈다(도 10a-f). 한편, HEK293 정상세포 엑소좀과 ExoPep-KLA를 반응시킨 후, HEK293 세포에 처리시 세포 독성을 거의 보이지 않았다. 반면, A549 세포 엑소좀과 ExoPep-KLA를 반응시킨 후, 이를 HEK293 세포에 처리한 결과, 펩타이드 단독 처리 및 펩타이드 처리 후 엑소좀 처리에 비해 엑소좀과 ExoPep-KLA 펩타이드를 함께 처리한 경우 HEK293 세포에 대한 세포독성을 나타내었다(도 10g). 이것은 ExoPep-KLA 펩타이드의 종양세포 유래 엑소좀에 대한 결합 특이성을 나타낸다.
< 실시예 11> ExoPep - KLA의 세포사멸 유도 효과
ExoPep-KLA에 의한 세포사멸 유도를 조사하기 위해, 검은색 96-well ELISA 플레이트 상에, 인광을 띄는 A549-luc 및 MDA-MB231-luc 세포를 1 × 104 cells/well로 접종하였다. ExoPep-KLA을 각 세포의 엑소좀(5 μg)과 함께 24시간 세포에 반응시킨 후, 3 μl (3 mg/mL) D-luciferin을 각 웰에 첨가하였고, IVIS imaging system (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 인광의 세기(effluc 활성)을 측정하였다. 그 결과, ExoPep-KLA 펩타이드 단독 및 펩타이드 처리 후 엑소좀 처리한 군에 비해, 엑소좀과 함께 반응시킨 ExoPep-KLA에 의해 처리 농도 및 반응 시간이 증가할수록, 세포사멸 효과는 증가하고 luc 신호 강도는 감소하였다(도 11).
< 실시예 12> A549 세포 유래 엑소좀 및 A549 종양 마우스 혈액 유래 엑소좀과 반응시킨 ExoPep-KLA의 A549 세포에 대한 세포사멸 효과
A549 세포 유래 엑소좀과 결합 여부에 따른 ExoPep-KLA의 세포사멸 유도 효과를 확인하기 위해서, 본 발명자들은 5 μg의 세포 유래 엑소좀과 사전 반응한 ExoPep-KLA 또는 반응하지 않은 ExoPep-KLA를 A549 세포에 처리한 후, Annexin V-647로 염색하고, 세포를 유세포 분석기(ThermoFisher Scientific, USA)를 통해 분석하여 사멸세포(Annexin+/PI-)를 정량화하였다. 엑소좀과 사전 반응한 ExoPep-KLA 그룹(cEXO+ExoPep-KLA)은 ExoPep-KLA 단독 처리 그룹에 비해 각각 62.9% 및 20.3%로 더 높은 사멸세포 비율을 나타냈다(p < 0.05, 도 12a). 상기 결과는 엑소좀과 결합한 ExoPep-KLA가 ExoPep-KLA 단독에 비해 세포 사멸을 더 효과적으로 유도한다는 것을 보여준다.
또한, A549 종양을 피부하에 심은 마우스 혈액 유래 엑소좀과 결합 여부에 따른 ExoPep-KLA의 세포사멸 유도 효과를 측정하기 위해서, 본 발명자들은 A549 종양을 심은 마우스 혈액 유래 엑소좀(5 μg)을 ExoPep-KLA와 사전 반응하거나 반응하지 않고, A549 세포에 처리한 후, Annexin V-647로 염색하고, 세포를 유세포 분석기(ThermoFisher Scientific, USA)를 통해 분석하여 사멸세포(Annexin+/PI-)를 정량화하였다. 엑소좀과 사전 반응한 ExoPep-KLA 그룹(mEXO+ExoPep-KLA)은 ExoPep-KLA 단독 처리 그룹에 비해 각각 19.1% 및 6.1%로 더 높은 사멸세포 비율을 나타내었으나 비율 자체가 높은 편은 아니였다(p < 0.05, 도 12b). 상기 결과는 종양을 심은 마우스 혈액 유래 엑소좀에 비해, 종양세포 유래 엑소좀과 결합한 ExoPep-KLA가 더 많으며, A549 세포에서 보다 높은 세포 사멸을 유도한다는 것을 보여 준다.
< 실시예 13> 혈청 내 ExoPep - KLA의 안정성 분석
본 발명자들은 마우스 혈청에서 ExoPep-KLA 펩타이드의 안정성을 확인하고자 하였다. ExoPep-KLA 펩타이드를 마우스 혈청과 24시간 반응시킨 후, 혈청 내 잔여 펩타이드 양을 분석하였다. 펩타이드 피크는 혈청의 비특이적 피크로부터 분리되었고, 혈청 내 펩타이드의 잔여량은 피크 영역을 통해 계산되었다. ExoPep-KLA 펩타이드는 4시간까지는 거의 분해 되지 않았으며, 8시간째 일부 분해 되었으며, 반감기는 약 24시간이였다(도 13a 및 13b). 각 펩타이드 피크의 mass spectrometry 분석 결과, ExoPep-KLA 펩타이드임을 확인하였다. 상기 결과는 펩타이드가 혈청 내에서 비교적 안정하다는 것을 보여준다.
< 실시예 14> A549 종양 마우스 모델에서 ExoPep-KLA 펩타이드에 의한 종양 성장 및 전이 억제
A549 종양 누드 마우스 모델에서 ExoPep-KLA을 이용한 항암 효과를 시험하고자, ExoPep-KLA 펩타이드를 단독 또는 시험관에서 엑소좀과 미리 반응한 후, 프로토콜상 표시된 시간 포인트에서 3주 동안 정맥을 통해 전신 투여되었고, 독소루비신은 3주 동안 1주에 한번씩 투여하였다(도 14a).
그 결과, 인산 완충액 및 종양 마우스 혈액 유래 엑소좀(mEXO only)을 투여한 경우는 종양 성장을 억제하지 못하였으나, 독소루비신, ExoPep-KLA, 및 엑소좀(mEXO)과 ExoPep-KLA을 미리 반응한 mEXO+ExoPep-KLA를 투여한 군은 종양 성장을 상당히 억제하는 것으로 나타났다(도 14b). 특히, ExoPep-KLA를 단독으로 주입한 경우에도 시험관에서 엑소좀과 미리 반응시키고 주입한 경우와 비교해 유사한 수준으로 종양 성장을 억제하는 효과를 보였다. 이 것은 ExoPep-KLA 펩타이드가 혈액 내 순환하는 종양 유래 엑소좀(mEXO)과 결합하여 종양 조직으로 효과적으로 이동하였음을 시사한다. 상기 치료군의 연속적인 투여에도 치료 기간 동안 마우스의 체중은 변하지 않았다(도 14c). 한편, 종양의 무게는 독소루비신, ExoPep-KLA, 및 mEXO+ExoPep-KLA를 처리한 경우 감소하였다(도 14d).
A549 폐암세포를 누드 마우스 피부하에 이종이식한 경우 폐 전이로 인한 종양 결절의 수는 적었다(도 14e). 또한 mEXO+ExoPep-KLA 군과 ExoPep-KLA 단독 투여한 군의 경우 종양 결절의 수를 인산 완충액 및 독소루비신 대비 약간 감소시키는 듯하였으나 유의한 차이는 없었다(도 14e). 폐의 무게도 다른 군과 큰 차이가 없었다(도 14f). 그런데, 종양 마우스 혈액에서 분리한 엑소좀을 단독으로 투여한 경우(mExo only), 폐로 전이된 결절과 폐의 무게가 다른 그룹에 비해 유의하게 증가하였다(도 14e 및 14f). 이것은 예상 못한 결과로서 종양 마우스 혈액 내 순환하는 엑소좀을 체외로 분리한 다음 다시 체내로 투여하는 경우 종양의 전이를 촉진하는 성질이 있음을 시사한다.
한편, 간 무게를 측정한 결과, 모든 그룹 간에 큰 차이점은 없었다(도 14g). 인산 완충액, mEXO 단독 처리군 및 독소루비신 투여군에 비해, mEXO+ExoPep-KLA, 및 ExoPep-KLA 처리군에서는 생존률을 크게 연장시키는 결과를 나타냈다(도 14h). 상기 결과는 정맥으로 주입된 ExoPep-KLA 펩타이드는 종양 마우스에서 순환 엑소좀에 특이적으로 결합하여, 종양조직 및 종양세포 내로 유입이 촉진될 뿐만 아니라 이후 암세포의 세포사멸을 유도하는 것을 시사한다. 또한 혈액 유래 엑소좀을 ExoPep과 결합한 상태로 투여한 경우에도 유사한 항암치료 효과를 가지는 것을 시사한다. 치료를 마친 후, 간 조직을 절단하여 엑소좀(mEXO-DiD 표지)의 축적을 확인하였으나, 모든 처리군에서 어떠한 축적도 확인되지 않았다(도 14i).
< 실시예 15> A549 종양 마우스 모델에서 ExoPep-KLA 펩타이드 투여 후 혈액 수치와 간 및 신장 기능 분석
ExoPep-KLA 펩타이드 처리에 의한 전신 부작용을 조사하기 위해, 실시예 14에서 치료를 마친 후 마우스 혈액을 수거하여 혈액 수치 및 간과 신장 기능 수치를 분석하였다.
그 결과, ExoPep-KLA 또는 mEXO+ExoPep-KLA 펩타이드 처리군 및 건강한 마우스 사이에 있어서, 백혈구 세포수를 포함한 혈액 수치에 정상 범위를 벗어나는 유의성 있는 차이는 없었다(도 15). 또한, 상기 처리군에서 간 및 신장 기능 시험 결과, 별다른 독성을 나타내지 않았다(도 15).
< 실시예 16> A549 종양 마우스 모델에서 독소루비신과 ExoPep-KLA 펩타이드 병용투여에 의한 종양 성장 및 전이 억제
A549 종양 누드 마우스 모델에서 ExoPep-KLA 펩타이드는 표시된 시간 포인트에서 1주에 세 번씩 투여되었고, 독소루비신은 3주 동안 1주에 한번씩 투여하였으며, 단독 및 병용투여는 시기는 치료 프로토콜에 나타내었다(도 16a).
그 결과, 독소루비신 (2.5 mg/kg), ExoPep-KLA (5 mg/kg) 및 ExoPep-KLA (10 mg/kg)을 단독 처리한 군에서는 인산 완충액 처리군에 비해 종양 크기를 약간 감소시키는 것으로 나타났으나 유의한 차이는 없었다(도 16b). 한편, 독소루비신 (5 mg/kg), 독소루비신+ExoPep-KLA (2.5+5 mg/kg) 및 독소루비신+ExoPep-KLA (2.5+10 mg/kg)을 병용 투여한 경우 종양을 더욱 강력하게 억제하였다. 상기 엑소좀 펩타이드의 연속적인 투여 및 독소루비신과의 조합에도 치료 기간 동안 마우스의 체중은 변하지 않았다(도 16c). 또한 독소루비신+ExoPep-KLA (2.5+10 mg/kg) 및 독소루비신 + ExoPep-KLA (2.5+5 mg/kg) 병용투여는 종양의 무게를 유의하게 감소시켰다. 이러한 효과는 다른 군에 비해 독소루비신 + ExoPep-KLA (2.5+10 mg/kg) 조합군에서 가장 효과적으로 나타났다(도 16d). 또한 완충액 처리군에 비해, 독소루비신 (5 mg/kg), 독소루비신+ExoPep-KLA (2.5+5 mg/kg), 및 독소루비신+ExoPep-KLA (2.5+10 mg/kg) 처리군에서는 전이 결절 및 미세 결절이 크게 감소하였다(도 16e).
또한, 폐 무게를 측정한 결과, 모든 그룹 간에 큰 차이점은 없었다(도 16f). 간 무게를 측정한 결과에서도 모든 그룹 간에 큰 차이점은 없었다(도 16g).
한편, 인산 완충액 및 단독 처리군에 비해, 독소루비신+ExoPep-KLA (2.5+5 mg/kg) 및 독소루비신 + ExoPep-KLA (2.5+10 mg/kg) 병용 처리군에서는 생존률을 크게 높이는 결과를 나타냈다(도 16h). 또한, 처리 후, 종양 조직을 절단하여, 조직에서 TUNEL 염색(녹색)을 확인하였다. 면역조직화학 분석 결과, 독소루비신+ExoPep-KLA (2.5+5 mg/kg) 및 독소루비신 + ExoPep-KLA (2.5+10 mg/kg) 처리는 종양 조직에서 TUNEL-양성 세포사멸 세포의 비율을 크게 증가시켰다(도 16i). 상기 결과는 ExoPep-KLA 및 독소루비신을 병용 투여한 경우 독소루비신의 치료효과를 높일 수 있으며 향후 용량 감소 등을 통해 그 부작용을 줄일 수 있음을 시사한다.
< 실시예 17> A549 종양 마우스 모델에서 ExoPep-KLA 펩타이드 및 독소루비신 병용 투여 후 혈액 수치 및 간과 신장 기능 수치 분석
도 16에서 치료를 마친 후, 혈액을 수거하여 혈액 및 간과 신장 기능 수치를 분석하였다. 그 결과, 처리군 및 건강한 마우스 사이에 있어서, 백혈구 세포수를 포함한 혈액 수치에서 정상 범위를 크게 벗어나는 유의성 있는 차이는 없었는데, 이는 ExoPep-KLA 또는 독소루비신+ExoPep-KLA (2.5+10 mg/kg) 조합 처리에 의한 전신 부작용은 없다는 것을 뒷받침한다. 또한, 간과 신장 기능 시험 결과, 건강한 마우스에 비교해도, ExoPep-KLA 또는 독소루비신+ExoPep-KLA (2.5+10 mg/kg) 조합 처리는 독성을 나타내지 않았다(도 17).
< 실시예 18> Panc -1 췌장암 마우스 모델에서 ExoPep - KLA 펩타이드 단독 및 젬시타빈 병용 투여에 의한 종양 성장 및 전이 억제
Panc-1 종양 모델에서 ExoPep-KLA 단독 및 젬시타빈과의 병용에 대한 항-종양 효과를 확인하였다(도 18A). ExoPep-KLA 및 젬시타빈의 전신 병용 투여는 종양 성장을 상당히 억제시켰고, ExoPep-KLA 단독 투여군 및 PBS 군은 종양 성장을 크게 억제시키지 않았다(도 18B). 엑소좀 펩타이드 및 병용 투여군의 생물학적 안전성을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 투여 기간 중 체중 변화를 관측하였다. 상기 엑소좀 펩타이드의 투여 과정 중에 마우스의 체중 변화는 확인할 수 없었다(도 18C). 중요하게도, ExoPep-KLA 및 젬시타빈의 병용 투여군은 원발성 종양 성장을 감소시켰다.
ExoPep-KLA 단독 투여군 및 PBS 군에 비해 병용 투여군은 종양 무게가 감소되는 것을 관측하였다(도 18D). PBS 군에 비해 ExoPep-KLA 및 젬시타빈의 병용 투여군은 전이 결절 또는 미세 결절이 거의 나타나지 않았다(도 18E). 또한, 폐 무게를 투여 마지막에 측정하였다(도 18F). 한편, 병용 투여군에서 원발성 종양 무게는 감소하였고, 수명은 증가하였다(도 18G). 모든 그룹에서 투여에 따른 전신 부작용은 관측되지 않았다(도 18H).
<110> KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Peptides that selectively bind to tumor-derived exosomes and use thereof <130> ADP-2021-0354 <150> KR 10-2020-0100354 <151> 2020-08-11 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Cys Arg Lys Val Ala Lys Gly 1 5 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Pro-apoptotic peptide <400> 2 Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 1 5 10

Claims (20)

  1. 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 암세포 유래 엑소좀에 특이적으로 결합하는 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암세포는 폐암세포, 유방암세포 또는 췌장암세포인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제1항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제3항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터.
  5. 제4항의 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체(단, 인간을 제외함).
  6. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드는 암세포 유래 엑소좀에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 췌장암, 뇌종양, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암 및 편평상피세포암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
  9. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 약물은 펩타이드 약물 또는 항암제인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 펩타이드 약물은 세포 사멸 또는 괴사 유도 활성을 갖는 세포 독성 펩타이드인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 항암제는 메르탄신(mertansine), 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  13. 제1항의 펩타이드에 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 세포사멸 유도 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드.
  14. 제13항의 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  15. 제13항의 융합 펩타이드 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항암제는 메르탄신(mertansine), 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 췌장암, 뇌종양, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암 및 편평상피세포암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  18. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암세포 영상화용 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(superparamagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 암세포 영상화용 조성물.
  20. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암세포 유래 엑소좀 검출용 조성물.
KR1020210105103A 2020-08-11 2021-08-10 암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 KR102659285B1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202180055380.7A CN116194462A (zh) 2020-08-11 2021-08-11 选择性结合癌细胞来源外泌体的肽及其用途
PCT/KR2021/010657 WO2022035222A1 (ko) 2020-08-11 2021-08-11 암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
US18/020,082 US20230295229A1 (en) 2020-08-11 2021-08-11 Peptide selectively binding to cancer cell-derived exosome, and uses thereof
EP21856228.8A EP4198042A1 (en) 2020-08-11 2021-08-11 Peptide selectively binding to cancer cell-derived exosome, and uses thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200100354 2020-08-11
KR20200100354 2020-08-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220020220A KR20220020220A (ko) 2022-02-18
KR102659285B1 true KR102659285B1 (ko) 2024-04-22

Family

ID=80495307

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210105103A KR102659285B1 (ko) 2020-08-11 2021-08-10 암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102659285B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080050774A1 (en) 2004-01-09 2008-02-28 Novozymes A/S Bacillus licheniformis chromosome
US20180104187A1 (en) 2016-10-19 2018-04-19 Northwestern University Extracellular vesicle-based diagnostics and engineered exosomes for targeted therapeutics against cancer

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201302800A (zh) * 2011-06-10 2013-01-16 Oncotherapy Science Inc Ｓｅｍａ５ｂ胜肽及含其之疫苗
PL223487B1 (pl) * 2011-12-28 2016-10-31 Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
KR101741594B1 (ko) * 2015-06-30 2017-05-30 경북대학교 산학협력단 암세포 및 종양관련 대식세포를 동시에 표적하는 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 및 암 전이 억제용 약학적 조성물
JP2017038566A (ja) 2015-08-20 2017-02-23 国立大学法人広島大学 エクソソームの精製用組成物
US20200407422A1 (en) * 2017-09-05 2020-12-31 GLAdiator Biosciences, Inc. A method of intracellular delivery

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080050774A1 (en) 2004-01-09 2008-02-28 Novozymes A/S Bacillus licheniformis chromosome
US20180104187A1 (en) 2016-10-19 2018-04-19 Northwestern University Extracellular vesicle-based diagnostics and engineered exosomes for targeted therapeutics against cancer

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220020220A (ko) 2022-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10391180B2 (en) Self-assembling complex for targeting chemical agents to cells
JP2014516975A (ja) 脳腫瘍を治療するためのペプチドおよびその方法
US10370410B2 (en) Cancer cell-targeting peptide and use thereof
KR102150419B1 (ko) Pd-l1에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
US11306119B2 (en) Peptide bound to PD-L1 and use thereof
US9387257B2 (en) Lung cancer specific peptides for targeted drug delivery and molecular imaging
US20100076175A1 (en) Molecules that selectively home to vasculature of premalignant or malignant lesions of the pancreas and other organs
KR101844571B1 (ko) 오토파지 세포 표적용 펩타이드 및 이의 용도
JP2011504361A (ja) 肝細胞癌細胞に特異的なペプチドおよびその適用
JP2010506905A (ja) 血管形成を誘導するための組成物および方法
US11192920B2 (en) Peptides for binding to CD44v6 and use thereof
EP2865686B1 (en) Egfr-binding peptide
KR102659285B1 (ko) 암세포 유래 엑소좀에 선택적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
WO2020000634A1 (zh) 一种与cd105特异性结合的多肽及其应用
CN108697693B (zh) 用于靶向、成像和治疗前列腺癌的肽共轭的纳米粒子
US20230295229A1 (en) Peptide selectively binding to cancer cell-derived exosome, and uses thereof
JP2022529765A (ja) 組成物、脂質粒子製造用キット、物質送達方法及び検出方法
KR102194026B1 (ko) Trail 수용체에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
KR20240032207A (ko) Trop2에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
KR102133205B1 (ko) PNA-pHLIP 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20230121560A (ko) 메소세린에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
TWI578999B (zh) 用於標靶藥物輸送及分子造影之肺癌特異性胜肽
RU2577993C2 (ru) Способ терапии злокачественной опухоли
JP2014156401A (ja) Ｉｇｆ−１ｒ結合性ペプチド
US9233121B2 (en) Compositions and methods for the treatment of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant