KR101741594B1 - 암세포 및 종양관련 대식세포를 동시에 표적하는 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 및 암 전이 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

암세포 및 종양관련 대식세포를 동시에 표적하는 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 및 암 전이 억제용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 및 암 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 IL-4 수용체를 과발현하는 암세포 및 종양관련 대식세포(tumor associated macrophage,TAM)를 동시에 표적함으로써 우수한 항암효과 및 암 전이 억제효과를 나타내는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 종양세포 및 종양관련 대식세포(tumor associated macrophage)를 동시에 표적하여 사멸시켜 항암 효과뿐만 암전이 억제 효과를 동시에 가지고 있다. 또한 본 발명의 융합 펩타이드는 기존 항암약물과 병용투여 기존 항암효과의 부작용을 감소시키면서 항암 및 암전이 억제효과를 나타낸다.

Description

암세포 및 종양관련 대식세포를 동시에 표적하는 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 및 암 전이 억제용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising fusion peptide targeting cancer cells and tumor associated macrophages for treating cancer and inhibiting metastasis}
본 발명은 암세포 및 종양관련 대식세포를 동시에 표적하는 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 및 암 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 IL-4 수용체를 과발현하는 암세포 및 종양관련 대식세포(tumor associated macrophage,TAM)를 동시에 표적함으로써 우수한 항암효과 및 암 전이 억제효과를 나타내는 약학적 조성물에 관한 발명이다.
종양 주변의 미세환경(microenvironment)은 내피세포, 염증성 세포 및 섬유아세포로 구성되어 있으며, 1970년대에 종양관련 대식세포(tumor-associated macrophage, 이하 TAM이라 함)가 종양의 성장에 있어서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. TAM은 암의 성장, 전이 등 전반적인 종양 미세환경과 관련하여 중요한 역할을 담당하며, 종양 주변에 존재하는 TAM은 종양 세포의 성장, 전이와 밀접하게 관련이 되어 있다. 따라서, 암 환자에서 많은 숫자의 TAM이 종양 주변에 존재하면 환자의 예후 및 생존률이 좋지 못한 것으로 보고되고 있다. 대식세포 중에서도 TAM은 M2형 대식세포로 분류가 되며, 일반적인 염증성 대식세포인 M1형과 달리 M2형 대식세포는 암의 성장을 촉진하는 IL-10, TGFβ 및 CCL18과 같은 사이토카인을 생성한다. 또한, M2형 TAM의 표면에 존재하는 PDL1 및 B7-1/2와 같은 수용체들은 T 세포, NK 세포의 항종양 활성을 억제하는 것으로 보고되고 있다. 따라서, M2형 TAM이 다량으로 존재하는 미세환경에서는 종양의 성장, 분화 및 전이가 활발하게 이루어진다.
인터루킨-4(interleukin-4, IL-4)는 T-헬퍼2(T-helper2, Th2) 림프구, 호산구, 비만세포 등에서 분비되는 다양한 면역조절 기능을 가진 사이토카인이다. IL-4 수용체는 정상세포 중 T 림프구, B 림프구, CD34 골수세포 등의 세포표면에 존재한다(Nelms, Annu Rev Immunol, 1999;17:701-738). IL-4 수용체는 IL-4 수용체 α 사슬과 IL-2 수용체 γc 사슬이 복합체를 이룬 제 1형과, IL-4 수용체 α 사슬과 IL-13 수용체 α1 사슬이 복합체를 이룬 제2형의 두 가지 형태가 있다. IL-4와 수용체가 결합하면 세포 내 야누스 키나제(janus kinase)를 통하여 STAT6 신호단백질을 인산화 및 활성화시키고, 활성화된 STAT6는 이합체 형태로 핵으로 이동하여 IL-4와 관련있는 여러 유전자의 발현을 조절하여 염증을 증가시킨다. 또한, 야누스 키나제를 통하여 AKT/PKB를 활성화시켜 세포의 생존반응을 증가시킨다고 한다(Nelms et al., Annu Rev Immunol, 1999;17:701-738). IL-4는 나이브 T-헬퍼(naive T-helper, naive Th)를 Th2 림프구로 분화를 유도하고, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13과 같은 사이토카인들의 생산을 유도한다. 또한, B 림프구에 의한 IgE(immunoglobin E)의 분비를 유도한다.
IL-4는 종양세포 및 암 줄기세포에서도 합성되며, 암세포 표면의 IL-4 수용체를 통하여 세포사멸에 대한 암세포의 저항성을 부여하는 것이 최근 보고되었다(Todaro, CellDeath Differ, 2008;15:762-772; Todaro, Cell Stem Cell, 2007,1:389-402). IL-4 수용체는 비소세포 폐암, 뇌종양, 유방암, 방광암, 췌장암, 신장암, 전립선암, 신장암 및 카포시 육종(kaposi's sarcoma) 등의 여러 암세포에서 정상세포에서 보다 훨씬 더 많이 발현된다. IL-4 수용체에 의한 암세포의 항암제 내성 획득 및 암세포에서의 높은 발현 정도를 고려할 때, IL-4 수용체는 암표적을 위한 유망한 표적이라고 볼 수 있다.
상기한 바와 같이, M2형 TAM은 종양의 성장, 분화 및 전이에 있어서 중요한 역할을 담당하기 때문에, 항암 치료에 있어서 종양 또는 M2형 TAM 각각을 단독으로 타겟팅 하는 것보다 양자 모두를 치료 타겟으로 하는 표적 치료제의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 암세포 및 종양관련 대식세포(tumor-associated macrophage)를 동시에 표적할 수 있는 암 치료용 조성물을 연구하던 중, 암세포와 종양관련 대식세포에 모두 많이 발현되어 있는 IL-4 수용체에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 세포사멸유도 펩타이드(pro-apoptotic peptide)가 결합된 융합 펩타이드가 암세포 뿐만 아니라 종양관련 대식세포를 효과적으로 억제하여 우수한 항암효과 및 암 전이 억제 효과를 나타냄을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인터루킨-4(IL-4) 수용체를 특이적으로 표적하는 펩타이드 및 세포사멸유도 펩타이드(pro-apoptotic peptide)가 결합된 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 및 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인터루킨-4(IL-4) 수용체를 특이적으로 표적하는 펩타이드 및 세포사멸유도 펩타이드(pro-apoptotic peptide)가 결합된 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 및 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인터루킨-4(IL-4) 수용체를 특이적으로 표적하는 펩타이드 및 세포사멸유도 펩타이드(pro-apoptotic peptide)가 결합된 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 및 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 서열번호 1의 아미노산 서열(CRKRLDRNC)을 갖는 펩타이드(IL4RPep-1)는 IL-4 수용체(IL4R)에 특이적으로 결합하는 펩타이드이다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 마우스 유래 4T1 세포, 사람 종양세포인 A549 세포주, MDA-MB231 세포주, M1형 Raw 264.7 대식세포, M2형 Raw 246.7 대식세포, 마우스 비장 유래의 M1형 대식세포 및 M2형 대식세포에 항-IL4R 항체를 이용하여 면역염색을 하여본 결과, MDA-MB231 세포주, M2형 Raw 246.7 대식세포 및 마우스 비장 유래의 M2형 대식세포에 IL-4 수용체가 많이 발현되어 있는 것을 확인하였다. 이후, 본 발명의 IL4RPep-1이 실제로 IL-4 수용체에 특이적으로 결합하는지 여부를 확인하여 본 결과, 상기 세포들에서 IL-4 수용체가 발현된 경향과 동일한 경향으로 본 발명의 IL4RPep-1가 세포에 결합하는 것을 확인하여, IL4RPep-1가 IL-4 수용체에 특이적으로 결합한다는 것을 알 수 있었다(실시예 1).
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 IL4RPep-1가 M1형 대식세포에 비해 M2형 대식세포에 훨씬 강한 binding affinity를 보이는 것을 확인하여, IL4RPep-1가 IL-4 수용체에 특이적으로 결합하여 M2형 대식세포에 대한 표적지향적 약물전달체로서 사용 가능하다는 것을 알 수 있었다(실시예 1).
본 발명의 인터루킨-4 수용체를 특이적으로 표적하는 펩타이드는 아미노산 사슬이 연결된 펩타이드에 대하여 기능적 동등물일 수 있으며 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드와 기능적 동등물을 포함한다. 상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로서 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 여기서 실질적으로 동질의 활성이란 IL-4 수용체에 대한 결합능을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예로는 지방족 아미노산군(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산군(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산군(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산군(Asp, Glu), 염기성 아미노산군(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산군의 각 아미노산군 내부의 동일한 아미노산 산의 치환일 수 있다. 아미노산의 결실은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한 아미노산의 결실을 의미한다. 아미노산의 부가는 유전자 조작과정에서 필요한 제한효소 부위 또는 펩타이드 정제 등을 위한 histidine tag 등을 포함하는 펩타이드의 활성에 영향을 미치지 않는 범위에서 아미노산이 부가되는 것을 말한다.
본 발명에서 상기 세포사멸유도 펩타이드(pro-apoptotic peptide)는 아팝토시스(apoptosis)를 유도하는 펩타이드를 의미한다. 거의 모든 세포가 세포사멸(아폽토시스)을 매개하는데 관여하는 기작을 포함하고 있다. 따라서, 본 발명은 당해 효과를 표적 세포 내부로 매개하여 아폽토시스 기작을 통해 세포를 사멸시키는 중추 매개체인 특정 세포사멸유도 펩타이드의 표적 전달에 관한 것이다. 본 발명이 당해 기술 분야에 공지된 방법 보다 우월한 장점으로서, 세포사멸유도 펩타이드는 단백질로서 전달되고 목적하는 폴리펩타이드를 생산하도록 해독될 핵산 분자로서 전달되는 것이 아니라는 것이다. 추가의 장점으로서, 사람 서열이 본 발명의 융합 펩타이드에 사용되어 외래 폴리펩타이드에 의한 목적하지 않은 임의의 면역 반응을 극복할 수 있으며, 표적 지향적으로 본 발명의 세포사멸유도 펩타이드를 암세포에 전달할 수 있기 때문에, 원치 않는 부작용을 경감시킬 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에서 상기 세포사멸유도 펩타이드(pro-apoptotic peptide)의 비제한적인 예시로는, KLAKLAKKLAKLAK, KGGGQVGRQLAIIGDDINR(Bak BH3 펩타이드), LQHRAEVQIARKLQCIADQFHRLHT(Bmf BH3 펩타이드) 및 YGRELRRMSDEFVDS(Bad BH3 펩타이드)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자는 본 명세서에 구체적으로 제시되지 않은 것을 비롯한 세포사멸유도 펩타이드를 잘 알고 있을 것이다.
바람직하게는, 본 발명에서 상기 세포사멸유도 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열(KLAKLAKKLAKLAK)을 갖는 펩타이드일 수 있다.
본 발명에서 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 세포사멸유도 펩타이드는 체내 안정성을 고려하여 L-형 또는 D-형의 아미노산으로 구성될 수 있다.
본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 세포사멸유도 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 제공하며 본 발명의 펩타이드들은 당해 분야의 숙련가가 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 이러한 펩타이드는, 흔히 보다 큰 폴리펩타이드의 일부로서 본 발명의 펩타이드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시켜 원핵 또는 진핵 세포에서 생성시킬 수 있다.
다른 방법으로는, 이러한 펩타이드는 화학적 방법에 의해 합성할 수 있다. 재조합 숙주내의 이종성 단백질의 발현, 폴리펩타이드의 화학적 합성 및 시험관내 전사를 위한 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 문헌(참조 문헌: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Sprin Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I.M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser et al. (1989) Ann. Rev. Biochem. 57:957; and Offord, R.E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing)에 추가로 기재되어 있다.
본 발명에서 상기 융합 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드와 세포사멸유도 펩타이드가 링커를 통해 연결된 융합펩타이드일 수 있다. 상기 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 C-말단과 세포사멸유도 펩타이드의 N-말단 사이에 존재할 수 있다.
상기 링커(linker)는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드 제조과정에서 삽입되는 것으로 그 크기나 서열의 종류는 특별히 제한되지 아니한다.
상기 링커는 두 펩타이드의 잠재적 간섭을 최소화하여 융합 펩타이드의 활성을 증가시킬 수 있다. 링커는 1 내지 100개의 아미노산을 갖는 것이 바람직하나, 이에 제한되지는 않으며, 두 펩타이드를 연결하고, 분리시킬 수 있는 어떠한 펩타이드라도 가능하다. 상기 링커를 구성하는 아미노산 서열에는 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 알라닌, 글라이신 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커일 수 있다. 즉, 알라닌으로 이루어진 링커, 글라이신으로 이루어진 링커 또는 알라닌 및 글라이신으로 이루어진 링커일 수 있다. 상기와 같은 아미노산은 기능기가 없어서 비특이적 결합이 일어나지 않으며, 접힘(folding)에 있어서 문제점도 없는 것을 선택할 수 있다.
또한, 본 발명의 링커는 IL-4 수용체에 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 활성 및 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 펩타이드 각각의 활성을 방해하지 않으며, 적절한 배향성을 유지할 수 있도록 하는 유연성을 줄 수 있는 개수까지의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 상기 링커는 글라이신 세 개가 연속적으로 조합된 링커를 사용하였다.
본 발명의 일실시예에서는, IL-4 수용체에 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 링커 및 세포사멸 유도 펩타이드가 차례로 결합된 융합 펩타이드를 제작하여 그 활성을 평가하였으며, 상기 융합 펩타이드는 서열번호 3(CRKRLDRNCGGGKLAKLAKKLAKLAK)의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 융합 펩타이드를 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1 mg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 우수한 항암효과 및 암 전이 억제 효과를 나타낸다. 구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드(IL4RPep-1) 및 세포사멸유도 펩타이드(KLA)가 결합된 융합펩타이드(IL4RPep-1-KLA 펩타이드)를 마우스 4T1 종양세포 및 상기 세포가 이식된 마우스 종양 모델에 각각 처리한 결과, in vitro 및 in vivo 상으로 매우 우수한 세포사멸 및 암 성장 억제효과를 나타내어 항암 효능이 매우 우수하다는 것을 확인하였다(실시예 5).
뿐만 아니라, in vivo 마우스 종양모델에서 IL4RPep-1-KLA 펩타이드의 투여가 종료된 이후 동물의 폐와 간을 절제하여 종양의 전이 여부를 관찰한 결과, PBS 투여 대조군에서는 폐 및 간에서 종양의 전이가 상당한 정도로 관찰이 된 반면에, IL4RPep-1-KLA 펩타이드가 투여된 마우스군에서는 종양의 전이가 전혀 관찰되지 않아 본 발명의 융합 펩타이드가 암 전이 억제 효과도 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다(실시예 5).
본 발명의 융합 펩타이드가 우수한 항암 및 암 전이 억제효과를 나타내는 것은 암세포의 표면 및 종양관련 대식세포(tumor associated macrophage)의 표면에 과발현되어 있는 IL-4 수용체를 표적으로 하여 세포사멸유도 펩타이드를 전달할 수 있기 때문이다. 즉, 종양세포만을 타겟으로 하여 종양세포의 사멸을 유도하던 기존의 항암 표적치료제와는 달리, 본 발명의 융합 펩타이드는 종양의 성장, 분화 및 전이에 있어서 매우 중요한 역할을 담당하는 종양관련 대식세포(tumor associate macrophage)까지도 표적하여 사멸시킬 수 있는 효과를 나타내기 때문에(실시예 5) 우수한 항암효과 뿐만 아니라 암 전이 억제효과 또한 매우 우수하게 나타낼 수 있는 것이다.
이와 같이, 종양세포 및 종양관련 대식세포를 동시에 표적으로 하여 우수한 항암효과 및 암 전이 억제효과를 나타내는 약학적 조성물은 종래에 보고된 바 없는 새로운 표적치료제라 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 본 발명의 융합 펩타이드에서 약물의 표적 전달체로서의 역할을 담당하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드(IL4RPep-1)이 in vitro 및 in vivo 모두에서 IL-4 수용체에 매우 특이적으로, 높은 binding affinity를 나타내는 것을 확인하였다(실시예 1 및 2).
따라서, 본 발명은 상기 암은 IL-4 수용체가 과별현되는 암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 IL-4 수용체가 과발현되어 있는 암은 폐암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 및 편평상피세포암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 상기 조성물은 항암 약물과 병용하여 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 항암 약물은 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에서는, 항암제로 널리 사용되고 있는 파크리탁셀(paclitaxel)을 그 단독 투여에 의해서는 치료효과가 충분히 나타나지 않는 용량으로 IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드와 병용처리한 결과, 항암 효과가 현저히 우수해지는 것을 확인하였고, 이러한 결과를 통해 IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드를 기존의 항암약물과 함께 투여하여 그 치료효과를 극대화할 수 있는 병용약물로서 선택할 수 있음을 알 수 있었다(실시예 5).
"병용"해서 투여하는 것이란, 2종 이상의 약제가 실제로 이들을 언제 혹은 어떻게 투여하는지에 관계없이 동일한 시간에 환자의 혈류에서 발견될 수 있는 것을 의미한다. 상기 병용 투여는 본 발명의 융합 펩타이드와 항암 약물을 함께 투여하거나 순서와 무관하게 순차적으로 투여하여 수행될 수 있다. 또한, 상기 병용 투여는 본 발명의 융합 펩타이드의 약학적 유효량과 항암 약물의 약학적 유효량을 혼합한 혼합제를 투여함으로써 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 병용 투여는 본 발명의 융합 펩타이드의 약학적 유효량을 투여하는 제1 단계 및 항암 약물의 약학적 유효량을 투여하는 제2 단계를 동시에 또는 순차적으로 수행하는 것일 수 있다. 순차적으로 투여하는 경우 그 순서는 서로 바뀌어도 무방하다. 다른 구체예에서, 융합 펩타이드와 항암약물은 경구 투여, 정맥 투여 등과 같이 동일한 경로를 통해 투여되거나, 하나는 경구 투여하고 다른 쪽은 정맥 투여하는 것과 같이 상이한 경로를 통해 투여될 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 종양세포 및 종양관련 대식세포(tumor associated macrophage)를 동시에 표적하여 사멸시키는 효과가 있어 우수한 항암효과 및 암 전이 억제효과를 나타내며, 기존 항암약물과 병용투여 기존 항암효과의 부작용을 감소시키면서 항암 및 암전이 억제효과를 나타낸다.
도 1은 종양세포(4T1, A549, MDA MB231) 및 Raw 264.7 대식세포(M1형, M2형)을 항-IL4Rα, 항-IL13Rα, 항-IL2γC로 면역염색하여 각 수용체의 발현정도를 관찰하고 각 세포에 대한 IL4RPep-1의 결합정도를 면역형광염색법을 통해 관찰한 결과이다.
도 2A는 마우스 비장 유래의 대식세포를 M1형 및 M2형으로 각각 분화시킨 후 면역형광염색법을 통해 IL-4 수용체의 발현정도 및 각 세포에 대한 IL4RPep-1의 결합정도를 관찰한 결과이다.
도 2B는 M1형 대식세포 및 M2형 대식세포에 대한 IL4RPep-1의 binding affinity를 Graph Pad Prism 6 소프트웨어를 이용하여 계산한 결과이다.
도 3은 4T1 종양세포가 이식된 야생형 Balb/c 마우스(Balb/c WT mice)와 IL-4 수용체가 결손된 Balb/c 마우스(Balb/c Il4Rα K/O mice)에 Flamma 675로 표지된 대조군 펩타이드(NSSSVDK) 또는 IL4RPep-1 펩타이드를 정맥투여한 후, 1시간 및 2시간 이후에 마우스 체내 형광 이미지를 detection 하거나, 실험 종료 후 마우스에서 절제한 각 장기에서의 형광 이미지(ex vivo imaging)를 detection한 결과이다(A: 대조군 펩타이드를 투여한 마우스군, B: IL4RPep-1 펩타이드를 투여한 마우스군).
도 4는 4T1 종양세포가 이식된 야생형 Balb/c 마우스(Balb/c WT mice)와 IL-4 수용체가 결손된 Balb/c 마우스(Balb/c Il4Rα K/O mice)에 IL4RPep-1 펩타이드를 정맥투여한 후, 마우스의 종양조직을 절제하여 절편화 한 후 IL-4 수용체, F4/80(종양관련대식세포 마커), E-cadherin(상피세포 마커) 및 N-cadherin(간엽 마커)의 발현을 면역형광염색법을 통해 관찰한 결과이다(A: 야생형 Balb/c 마우스의 종양, B: IL-4 수용체 결손 마우스의 종양)
도 5는 4T1 종양세포의 IL-4 수용체, E-cadherin(상피세포 마커) 및 N-cadherin(간엽 마커)의 발현을 면역형광염색법을 통해 관찰한 결과이다.
도 6은 4T1 종양세포가 이식된 마우스에서 절제한 종양의 single cell suspension의 표면에 발현된 N-cadherin, F4/80 및 E-cadherin을 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과이다(Ncad: N-cadherin, Ecad: E-cadherin).
도 7은 4T1 종양세포를 종양관련 대식세포(TAM) conditioned media, TGFβ, IL10 및 IL4로 처리한 후 N-cadherin 및 IL-4 수용체의 발현 정도를 면역형광염색법을 통해 관찰한 결과이다(TAM CM : 종양관련 대식세포 conditioned media, Ncad: N-cadherin).
도 8은 마우스 비장유래 M1형 대식세포 또는 M2형 대식세포를 각각의 조건에 따라 처리한 후 IL-10의 분비 정도를 IL-10 ELISA 키트를 이용하여 측정한 결과이다(CM: conditioned media).
도 9A는 야생형의 4T1 세포 및 IL-10에 의해 처리된 4T1 세포에 대한 IL4RPep1 펩타이드의 binding affinity를 측정한 결과이다.
도 9B는 M2형 대식세포 엑소좀(exosome)에 의해 처리된 4T1 세포에서 IL-4 수용체, IL-13 수용체 및 IL-2 수용체의 발현정도 및 대조군 펩타이드, IL4RPep-1 펩타이드의 결합정도를 면역형광염색법을 통해 관찰한 결과이다.
도 10은 IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드의 세포독성 실험결과를 나타낸 것이다(A: 야생형 4T1 세포에 대한 세포독성 결과, B: IL-10 처리된 4T1 세포에 대한 세포독성 결과, C: M1형 대식세포에 대한 세포독성 결과, D: M2형 대식세포에 대한 세포독성 결과).
도 11은 4T1 종양세포가 이식된 마우스 동물 모델에서 IL4RPep-1-KLA의 항암효과 및 파크리탁셀과의 병용투여 효과를 평가한 실험 결과이다(IL4RPep-1, KLA: IL4RPep-1 펩타이드와 KLA 펩타이드 각각을 투여한 동물군, IL4R-Pep-KLA : 융합 펩타이드 투여군, PTX: 파크리탁셀 투여군, IL4RPep-1, KLA + PTX: IL4RPep-1 펩타이드, KLA 펩타이드 및 파크리탁셀 각각을 투여한 동물군, IL4R-Pep-KLA + PTX: 융합펩타이드 및 파크리탁셀 병용투여군).
도 12는 4T1 종양세포가 이식된 마우스 동물 모델의 각 약물 투여군의 투여가 종료된 후 마우스 폐 및 간에서의 전이성 종양 결절의 개수를 카운팅한 결과이다(IL4RPep-1, KLA: IL4RPep-1 펩타이드와 KLA 펩타이드 각각을 투여한 동물군, IL4R-Pep-KLA : 융합 펩타이드 투여군, PTX: 파크리탁셀 투여군, IL4RPep-1, KLA + PTX: IL4RPep-1 펩타이드, KLA 펩타이드 및 파크리탁셀 각각을 투여한 동물군, IL4R-Pep-KLA + PTX: 융합펩타이드 및 파크리탁셀 병용투여군).
도 13은 4T1 종양세포가 이식된 마우스 동물 모델의 각 약물 투여군의 투여가 종료된 후 마우스의 종양 조직의 동결절편을 준비하고 각각의 항체(E-cadherin, N-cadherin, F4/80, CD80, CD8 T cell 및 CD4 T cell)로 염색한 후 현미경으로 관찰한 결과이다(IL4RPep-1 + KLA: IL4RPep-1 펩타이드와 KLA 펩타이드 각각을 투여한 동물군, IL4R-Pep-KLA : 융합 펩타이드 투여군, PTX: 파크리탁셀 투여군, IL4RPep-1 + KLA + PTX: IL4RPep-1 펩타이드, KLA 펩타이드 및 파크리탁셀 각각을 투여한 동물군, IL4R-Pep-KLA + PTX: 융합펩타이드 및 파크리탁셀 병용투여군).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. 세포주 및 배양
마우스 종양세포인 4T1, 마우스 대식세포인 Raw 264.7, 인간 종양 세포인 A549 및 MDA MB 231 세포주는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Gibco, USA) 또는 RPMI medium 배지에 ATCC 의 지시에 따라 배양하였다.
비장유래 대식세포는 Alatery et al’s instruction 의 방법에 따라 추출하였다(Journal of immunological methods, 2008. 338(1): p. 47-57)
2. 대식세포의 M1형 및 M2형으로의 분화방법
종양관련 대식세포(tumor associated macrophage)인 M2형 대식세포는 Raw 264.7 세포 및/또는 마우스 비장 유래 대식세포를 10 IU/ml의 마우스 재조합 IL-4(R and D system, US)로 처리하여 얻을 수 있었고, M1형 대식세포는 100 IU/ml의 IFN-γ(R and D system, US) 및 10 ng/ml의 LPS(sigma-aldrich)를 처리하여 얻을 수 있었다.
정상적으로 분화가 완료되었는지 여부는, M2 대식세포의 경우 항-F4/80 및/또는 항CD-163 항체를 이용하여 확인하였고, M1 대식세포의 경우 항CD80 항체를 이용하여 확인하였다.
3. 융합 펩타이드의 제작
IL-4 수용체에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열(CRKRLDRNC)을 갖는 IL4RPep-1 펩타이드의 N 말단에 fluorescein isothiocyanate(FITC) 또는 비오틴을 결합하여 in vitro 실험에 사용하였다. Flamma 675에 결합된 IL4RPep-1 펩타이드를 in vivo 광학 이미징 실험에 사용하였다. NSSSVDK 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 대조군 펩타이드로 이용하였다.
IL4RPep-1-KLA 융합 단백질은 IL4RPep-1 펩타이드에 세포사멸유도 펩타이드(pro-apoptotic peptide)인 KLAKLAKKLAKLAK (서열번호 2, 이하 “KLA”라 함) 펩타이드를 triple 글라이신 링커를 사용하여 융합하였다.
모든 펩타이드는 Peptron Inc.(대전, 한국)에서 합성하였으며, 고 순도 액체 크로마토크래피(HPLC)에 의해 정제되어 90% 이상의 순도를 나타내었다. 펩타이드는 동결건조 후 사용 전 PBS에 용해하여 사용하였다.
4. IL-4 수용체 및 세포에 결합한 IL4RPep-1의 면역형광 염색법
세포에 펩타이드가 결합하는지를 테스트 하기 위해서 종양세포는 초기에 1% BSA 용액으로 블로킹 되고, 이후 10 μM의 FITC 표지된 IL4R0Pep1 펩타이드를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포를 세척한 후, 4% PFA로 고정하고 DAPI로 핵을 염색하였다.
세포 및 종양조직에서 IL-4 수용체의 발현정도를 측정하기 위해, 얼려진 조직 절편 또는 고정된 마우스 종양세포주를 항-IL4R 항체, 항-IL13Rα1 및 항-IL2RγC 항체를 이용하여 면역염색을 수행하였다.
PBS로 세포를 세척한 후, 세포를 2차 항체와 함께 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 최종적으로 세포는 DAPI로 핵 염색하고, 형광현미경(Zeiss, 독일)으로 관찰하였다.
5. IL4RPep-1 binding affinity 어세이
종양세포를 1% BSA로 30분간 상온에서 블로킹하고, 다양한 농도(1~80μM)의 비오틴 라벨된 IL4RPep-1 펩타이드를 1시간 동안 인큐베이션 하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 Neutravidin HRP(1:10000)과 함께 상온에서 30분동안 인큐베이션 하였다. HRP 활성은 TMB substrate를 이용하여 측정하였으며, 반응은 2M 황산을 이용하여 중단되었다. 흡광도는 TECAN microplate reader를 이용하여 450nm에서 측정하였다. Kd 값은 Graph Pad Prism 6 소프트웨어(GraphPad software Inc., La Jolla, LA)를 이용하여 계산하였다.
6. in vivo 광학 이미징 및 면역조직학적 분석
6-1. 동물모델
암컷 야생형 Balb/c 마우스를 오리엔트 바이오(Orient bio, korea)에서 구입하였고, IL-4 수용체 결손 마우스를 제작하였다. 마우스 종양 모델은 1 X 106 개의 4T1 종양세포를 야생형 및 IL-4 수용체 결손 마우스의 옆구리 상단 피하에 주사하여 제작하였고, orthotopic 동물 모델은 1 X 106 개의 4T1 세포를 마우스 유방 지방조직에 주입하여 제작하였다.
6-2. in vivo 이미징 및 조직학적 분석
Flamma 675로 표지된 IL4RPep-1 펩타이드와 NSSSVDK 대조군 펩타이드를 4T1 종양세포가 이식된 야생형 마우스 및 IL-4 수용체 결손 마우스의 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. in vivo 이미징은 Optix imaging system(ART Inc.,Canad)를 이용하여 1시간 및 2시간 순환 후 측정하였다. 마우스는 이미징 후 마지막에 희생시켜 종양 및 장기를 절제하여 ex vivo 이미징을 시행하였다.
면역조직학적 분석을 위하여, 절제된 종양을 4% PFA로 고정하고, 30% 수크로우스를 이용하여 탈수하였다. 8 μm 두께의 종양절편이 준비되었고, DAPI 염색을 통해 조직학적 구조를 확인하였다.
추가적으로, 종양조직 내 펩타이드 및 수용체들의 편재화 경향을 분석하기 위해, 종양 샘플들은 항-IL4Rα 항체, F4/80 항체로 면역 염색하였으며, Alexa-488/594-conjugated 2차 IgG 항체를 이용하여 검출하였다(invitrogen).
E.cadherin 및 N.caddherin은 4T1 종양세포의 마커로 사용하였다. 종양 절편은 항-E.cadherin 항체 및 항-N.cadherin 항체로 면역염색한 후 2차 항체 및 DAPI로 염색하였다. 세포는 공초점 현미경(Zeiss, 독일)을 이용하여 관찰하였다.
7. 유세포분석기(FACS)를 이용한 마우스 종양 조직의 single cell suspension 내 IL-4 수용체 발현 분석
절제된 4T1 마우스 종양은 수술가위를 이용하여 기계적으로 분쇄하였으며, LiberaseTM을 이용하여 분리하였다. 효소적으로 분리한 후에, 샘플은 얼음으로 옮겨져 반응을 중단하였다. 이후 종양세포는 세포 염색액을 이용하여 염색되었고 FACS 버퍼로 세척하였다. RBC lysis 버퍼(sigma)를 이용하여 RBC를 제거한 후, 얻어진 세포 침전물을 1차 항체(항-IL4Rα, 항-F4/80, 항-E.cadherin 및 항-N.cadherin)을 이용하여 염색하고, 이어서 2차 항체를 부착하였다. 염색된 세포는 BD FACS Calibur를 이용하여 분석하였다.
8. 4T1 종양세포의 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition) 유도
4T1 세포는 M2형 대식세포로 분화된 마우스 비장 유래 대식세포가 50% 포함된 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다. TAM 함유된 배양 배지는 사용하기 전에 원심분리 및 스트레이너를 이용하여 찌꺼기를 제거하였다. 사이토카인으로 유도된 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition)은 세포를 마우스 IL-10 및 마우스 IL-4 으로 24시간 동안 배양하거나, 마우스 TFGβ가 포함된 배양배지로 48시간 동안 배양하여 수행하였다. 이후 세포는 간엽(mesenchymal) 마커인 N.cadherin으로 염색하고, IL-4 수용체의 발현정도를 평가하였다.
9. IL-10 분비 어세이
M2형 대식세포에서 분비되는 IL-10 사이토카인 또는 엑소좀 형태는 마우스 IL-10 ELISA 키트를 제조자의 지시에 따라 평가하였다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였고, IL-10의 농도는 얻어진 표준곡선에 대입하여 환산하였다.
10. 엑소좀에 의한 4T1 세포의 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition) 유도 및 IL-4 수용체의 발현 평가
엑소좀(exosome)은 Exoquick TC kit(SBI Bioscience)를 이용하여 Conditioned media로부터 분리가 되었다. 엑소좀이 결핍된 FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양된 4T1 종양세포는 50 μg/ml의 분리된 엑소좀과 함께 24시간동안 배양되었다. 이후 세포는 IL-4 수용체 및 EMT 마커인 N.cadherin을 관찰을 위해 염색이 되었고, 형광 현미경을 통해 관찰되었다.
11.IL4RPep-1-KLA의 세포독성 평가
IL4RPep-1-KLA의 세포독성은 CCK8 키트(Dojindo laboratories,Japan)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 평가하였다. 간략하게 IL-4 수용체를 발현하는 A549 세포를 다양한 농도(0~160 μM)의 IL4RPep-1-KLA과 함께 1시간 동안 배양한 후 CCK 용액을 첨가하여 1~4시간동안 배양하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성은 다음과 같은 식으로 계산하였다.
세포생존률 = (A sample - A blank/A control - A blank) X 100
A blank = 시험물질은 포함되어 있지만 세포가 포함되어 있지 않은 well의 흡광도 값
A control = 세포 및 CCK8 용액만 포함되어 있는 well의 흡광도 값
12. in vivo 항암활성 평가
Orthotropic 4T1 종양모델은 1 X 106 개의 4T1 세포를 야생형 Balb/c 마우스의 왼쪽 유방 지방패드에 이식함으로써 제작하였다. 종양은 약 100 mm3 의 크기로 성장할 때까지 방치되었으며, 이후 랜덤하게 군을 분리하여 투여를 진행하였다. 마우스는 각 군당 5마리씩, 총 6개의 군으로 분리하였다. 펩타이드(KLA+IL4RPep-1 및 IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드)는 같은 몰의 농도(1 mM 펩타이드 200 μl/20g body weight of mice, 일주일에 3회씩 총 4주간 투여)로 꼬리정맥을 통해 투여되었다. 다른 세 그룹의 마우스군은 펩타이드 투여에 추가적으로 8 mg/kg 농도의 파크리탁셀(paclitaxel)을 일주일에 한번씩 복강투여 하였다. 두 대조군 마우스군은 PBS 또는 파크리탁셀을 각각 투여하였다.
투여 후 마우스의 체중과 종양 크기가 관찰되었다. 종양의 크기는 다지털 캘리퍼를 이용하여 측정하였고, 종양의 부피는 다음과 같은 식에 의해 계산하였다:
V=(L x W x H)/2 (L: 최장길이, W: 짧은길이, H: 높이)
마지막 투여 후에 마우스를 희생한 후 폐와 간에 종양의 전이 여부를 판단하였으며, 절제된 종양 및 장기는 4% PFA에 고정한 후 추가적인 면역조직학적 분석에 이용하였다.
13. 종양 조직의 면역조직학적 염색법
냉동보관 된 종양 조직을 1g의 BSA, 0.2g의 젤라틴 및 0.05g 의 사포닌이 PBS에 용해된 블로킹 용액으로 블로킹 한 후 1차 항체를 이용하여 1시간 30분 동안 인큐베이션 하였다. 이후 HRP 표지된 2차 항체를 이용하여 45분간 상온에서 염색하였다. 상기 염색된 조직을 DAB(DAKO)를 이용하여 노출한 뒤 헤마톡실린으로 대조염색을 5분간 상온에서 수행하였다. 각 단계는 10% 블로킹 용액이 담긴 PBS로 세척한 후 다음 단계를 진행하였다. 최종적으로 조직은 Bright Field 현미경을 이용하여 관찰하였다.
<실험결과(실시예)>
<실시예 1>
IL4RPep-1 펩타이드가 IL-4 수용체에 결합하는지 여부에 대한 in vitro 실험결과
마우스 4T1 세포, 인간 종양세포인 A549, MDA-MB 231, M1형 Raw 264.7 세포, M2형 Raw 246.7 세포, 마우스 비장 유래의 M1형 대식세포 및 M2형 대식세포에 IL-4 수용체, IL-13 수용체 및 IL-2 수용체가 각각 얼마나 발현이 되어 있는지 여부를 확인한 후, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 펩타이드(IL4RPep-1)이 어떤 수용체에 얼마나 특이적으로 결합하는지 여부를 면역염색법을 통해 평가하였다.
이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 마우스 4T1 세포, 인간 종양세포인 A549, MDA-MB 231, M1형 Raw 264.7 세포 및 M2형 Raw 246.7 세포에서 IL-4 수용체, IL-13 수용체 및 IL-2 수용체들 중 IL-4 수용체 만이 형광으로 강하게 염색되는 것을 확인하여 이들 세포주에 IL-4 수용체가 과다하게 발현되어 있다는 것을 알 수 있었다.
이후 상기 세포와 동일한 세포에, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 펩타이드(IL4RPep-1 펩타이드)를 처리한 결과, IL-4 수용체의 발현 경향과 동일하게 각각의 세포에서 IL4RPep-1 펩타이드가 결합하는 것을 확인하여, IL4RPep-1 펩타이드가 IL-4 수용체에 특이적으로 결합한다는 것을 알 수 있었다.
추가적으로, 마우스 비장 유래의 M1형 대식세포 및 M2형 대식세포에서 IL-4 수용체의 발현 경향 및 IL4RPep-1 펩타이드가 결합하는 경향을 면역 염색법을 통해 비교하고, 각각의 세포에 대한 IL4RPep-1 펩타이드의 binding affinity를 측정하였다.
이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2A에 나타낸 바와 같이, 마우스 비장 유래의 대식세포들 중 M1형 대식세포와 달리 M2형 대식세포에서 IL-4 수용체가 많이 발현되어 있는 것을 확인하였으며, IL4RPep-1 펩타이드가 세포에 결합하는 경향 역시 상기 IL-4 수용체의 발현 경향과 일치하는 양상을 나타내었다. 한편, 도 2B에 나타낸 바와 같이, IL4RPep-1 펩타이드는 M1형 대식세포에 비해 IL-4 수용체가 과발현 되어있는 M2형 대식세포에 더 강한 binding affinity를 나타내었다(M1형 대식세포: Kd -75.8 μM, M2형 대식세포: Kd -6.3 μM).
상기한 결과를 통해, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 IL4RPep-1 펩타이드가 IL-4 수용체에 특이적으로 결합하므로 IL-4 수용체를 표적으로 하는 약물 전달체로써 유용하게 사용될 수 있다는 점과, M1형 대식세포에 비해 M2형 대식세포에서 IL-4 수용체가 과발현되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 2>
IL4RPep-1 펩타이드가 IL-4 수용체에 결합하는지 여부에 대한 in vivo 실험결과
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 IL4RPep-1 펩타이드가 IL-4 수용체에 특이적으로 결합하는지 여부를 4T1 종양세포가 이식된 Balb/c 야생형 마우스 및 Balb/c IL-4 수용체 결손(knockout) 마우스에서 평가하였다. 즉, Flamma 675로 표지된 IL4RPep-1 펩타이드 및 Flamma 675로 표지된 대조군 펩타이드(NSSSVDK)를 마우스 꼬리 정맥에 투여한 후, 형광강도를 실시간 관찰하였다.
이에 대한 결과를 도3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 마우스 체내 및 마우스에서 절제한 조직 내(ex vivo)에서 형광 광도를 비교해 본 결과, IL-4가 정상적으로 발현되는 야생형 마우스의 종양 조직에서 IL4RPep-1 펩타이드의 형광이 강하게 검출되는 것을 확인할 수 있었지만, IL-4 수용체가 결손(knockout)되어 있는 마우스의 종양 조직 및 대조군 펩타이드를 투여한 마우스의 종양 조직에서는 형광이 관찰되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 IL4RPep-1 펩타이드는 in vivo 상으로도 IL-4 수용체가 발현되어 있는 마우스의 종양조직에 특이적으로 결합한다는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 추가적으로 상기 실험을 마친 마우스의 종양조직을 절제한 후 절편화 하여 면역염색을 하여 본 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스의 종양조직에서는 IL-4 수용체가 강하게 염색이 되었으며, IL4RPep-1 펩타이드가 IL-4 수용체의 염색 경향과 동일한 경향으로 마우스 종양조직에 염색되는 것을 확인할 수 있었다(도 4A). 반면에, IL-4 수용체가 결손되어 있는 마우스 종양조직에서는 IL-4 수용체가 전혀 관찰되지 않았으며, IL4RPep-1 펩타이드 또한 전혀 결합하지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 4B).
<실시예 3>
종양관련 대식세포(tumor associated macrophage, TAM)가 4T1 종양세포의 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition)을 유도하는지 여부( in vivo )
상기 실시예 2의 실험을 마친 Balb/c 야생형 마우스 및 Balb/c IL-4 수용체 결손(knockout) 마우스의 종양을 절제한 후 IL-4 수용체에 대한 항체 및 종양관련 대식세포(TAM)의 마커로 알려진 F4/80 항체로 염색하여 그 결과를 관찰하였다.
이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 비록 IL-4 수용체가 발현되고 있는 TAM에 대한 IL4RPep-1 펩타이드의 특이성에도 불구하고, IL-4 수용체 항체로 염색된 종양 조직의 일부분에서는 TAM의 마커인 F40/80과 비교했을 때 비편재화 되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 즉, TAM이 종양 미세환경에서 IL-4를 과다발현하는 유일한 세포가 아니라는 것을 알 수 있는 부분이었다.
따라서, TAM과 4T1세포를 구분하기 위해서, 4T1세포의 상피세포 마커인 E-Cadherin으로 종양절편을 염색해 보았다. 놀랍게도, 도 5의 4T1 in vitro 결과와는 대조적으로 도 4A의 in vivo 결과에서는 4T1 세포에서 E-Cadherin 발현량이 매우 낮은 것으로 관찰되었다.
이러한 결과를 좀 더 구체적으로 확인하고자 마우스 종양조직 내 4T1 세포에서 N.Cadherin의 발현량을 평가해 보았다. N.Cadherin은 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition) 상태에 있는 종양세포에서 과발현되는 것으로 알려져 있는 마커이다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, in vitro 결과와는 대조적으로 야생형 마우스의 종양조직 내 4T1 세포에서는 N.Cadherin이 과발현 되어있는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 in vivo 및 in vitro 상의 결과 차이는 in vivo 상에서 4T1 세포의 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition)과 연관이 있을 것이며, 이에 대한 결과로 4T1 세포의 N.Cadherin 및 IL-4 수용체의 발현이 증가되고 E.Cadherin의 발현이 감소된 것으로 사료되었다.
상기 결과를 좀 더 구체적으로 관찰하고자 마우스 종양조직 내 4T1 single cell을 유세포분석기(FACS)를 통해 분석하여 본 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, IL-4 수용체를 발현하는 4T1세포는 N.cadherin 및 F4/80 발현 세포와 함께 편재화 되어 있었으며, 이러한 결과는 in vivo 상으로 IL-4 수용체가 적게 발현되는 4T1세포가 in vivo 상으로는 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition) 마커의 발현 증가와 함께 IL-4 수용체의 발현 또한 증가한다는 것을 나타낸 것이다.
즉, 종양관련 대식세포(TAM)가 4T1 종양세포에서 IL-4 수용체의 발현을 유도한 것으로 판단할 수 있었다.
<실시예 4>
종양관련 대식세포(tumor associated macrophage, TAM)가 4T1 종양세포의 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition) 및 IL-4 수용체의 발현을 유도하는지 여부( in vitro )
4T1 종양세포의 IL-4 수용체 발현 양상이 in vitro 와 in vivo 상에서 일치하지 않는다는 점에 대한 의문점을 보다 확실히 해결하고, 이러한 차이를 유발하는 인자로써 종양관련 대식세포(TAM)가 밀접하게 연관되어 있다는 사실을 확인하기 위해 4T1 종양세포주를 TAM 조건의 배지, rmIL-10 함유 배지, rmTGFβ 함유 배지 및 rmIL-4 함유 배지에서 각각 배양하였다.
이에 대한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, TAM 조건의 배지 및 rmIL-10 함유 배지에서 배양된 4T1 세포에서 IL-4 수용체 뿐만 아니라 간엽(mesenchymal) 마커인 N.Cadherin의 발현이 증가하였다.
상기 결과를 토대로 TAM 및 TAM이 분비하는 IL-10이 종양세포에서 IL-4 수용체의 발현을 조절하는 중요인자라는 점 및 종양이 전이 단계로 발전하는 상태라고 할 수 있는 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition)을 유도하는 인자라는 점을 알 수 있었다.
상기한 결과를 좀 더 구체적으로 입증하기 위해, M2형 대식세포인 TAM의 IL-10 생성량을 M1형 대식세포와 비교하고, IL-10 처리된 4T1 세포에서 IL-4 수용체의 발현정도 및 IL4RPep-1 펩타이드의 결합 양상을 면역염색을 통해 확인하였다.
이에 대한 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, M2형 대식세포는 soluble cytokine의 형태 및 엑소좀의 형태로 IL-10을 다량 분비하는 것으로 확인되었으며, 대조적으로 M1형 대식세포에서는 IL-10의 분비가 거의 나타나지 않는 것으로 확인되었다.
도 9A에 나타낸 바와 같이, 야생형의 4T1 세포와 비교해 IL-10으로 처리된 4T1 세포에서 IL4RPep-1 펩타이드의 binding affinity가 현저히 우수하다는 것이 확인되었으며, 도 9B에 나타낸 바와 같이, M2형 대식세포(TAM)의 엑소좀으로 처리된 4T1 세포에서도 TAM에 의해 분비된 IL-10의 영향에 의해 IL-4 수용체가 많이 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
상기한 결과들을 토대로, 종양관련 대식세포(TAM)인 M2형 대식세포에 의해, 보다 구체적으로는 TAM에 의해 분비가 되는 IL-10에 의해, 종양세포에서 IL-4 수용체의 발현 및 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition)이 유도된다는 사실을 확인할 수 있었고, 이러한 결과는 종양이 전이단계로 진행하는데 있어서 TAM이 중요한 역할을 담당하고 있음을 나타내고 있다고 할 수 있다.
<실시예 5>
IL4RPep-1-KLA 융합펩타이드의 항암 및 암전이 억제 활성 평가
<5-1> in vitro 세포독성실험
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 IL4RPep-1 펩타이드와 세포사멸유도 펩타이드(pro-apoptotic peptide)인 (KLAKLAK)2가 결합된 융합 펩타이드(IL4RPep-1-KLA)의 세포독성을 평가하였다.
이에 대한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, IL4RPep-1-KLA는 IL-10으로 처리된 4T1 종양세포 및 종양관련 대식세포(TAM)인 M2형 대식세포에서 우수한 세포독성을 나타내었다. 이에 반해, IL-4 수용체의 발현이 거의 관찰되지 않는 야생형의 4T1 세포 및 M1형 대식세포에 대해서는 IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드의 세포독성이 우수하지 못했다.
즉, 상기한 결과는 IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드가 IL-4 수용체를 과발현하는 암세포 및 M2형 대식세포를 효과적으로 표적하여 사멸시킴으로써 우수한 항암효과 및 암전이 억제효과를 나타낼 수 있음을 의미한다고 할 수 있다.
<5-2> IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드의 in vivo 항암 및 암전이 억제활성 평가 및 병용투여 효능 평가
IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드의 항암 및 암전이 억제활성을 4T1 세포가 이식된 Balb/c 야생형 암컷 마우스에서 평가하였다.
이에 대한 결과를 도 11 내지 도 13에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드를 처리한 마우스군에서는 융합 펩타이드 투여 직후부터 실험 종료시까지 종양의 성장이 현저히 억제되는 것으로 나타났다. 한편, 이러한 결과는 IL4RPep-1 펩타이드 및 KLA 각각을 단독으로 투여한 군과 비교해 현저히 우수한 것으로, IL4RPep-1 펩타이드가 세포사멸을 유도하는 pro-apoptotic 펩타이드인 KLA를 종양세포로 효과적으로 전달하여 종양세포 및 종양관련 대식세포를 표적함으로써 나타나는 효과라고 사료된다.
한편, 항암제로 널리 사용되고 있는 파크리탁셀(PTX)을 그 단독 투여에 의해서는 치료효과가 충분히 나타나지 않는 용량으로 IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드와 병용처리한 결과, 그 항암 효과가 현저히 우수해진다는 점에서 IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드를 기존의 항암약물과 함께 투여하여 그 치료효과를 극대화할 수 있는 병용약물로서 선택할 수 있음을 알 수 있었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 모든 약물의 투여가 종료된 이후 마우스의 간과 폐를 절제하여 암의 전이 여부를 관찰하였다. 그 결과, IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드를 처리한 마우스군 및 IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드와 파크리탁셀(PTX)를 병용 처리한 마우스군에서는 폐와 간에서 암의 전이가 전혀 관찰이 되지 않아 L4R-Pep1-KLA 융합 펩타이드가 우수한 암 전이 억제활성 및 기존 항암약물과 우수한 병용효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 모든 약물의 투여가 종료된 이후 마우스의 종양 조직의 동결절편을 준비하고 각각의 항체로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드를 처리한 마우스군 및 IL4RPep-1-KLA 융합 펩타이드와 파크리탁셀(PTX)를 병용 처리한 마우스군에서는 대조군에 비해 N-cadherin의 감소, F4/80(+) 종양관련 마크로파지의 감소, CD80(+) 마크로파지의 증가, CD8(+) T 세포의 증가, 및 CD4(+) T 세포의 감소를 확인할 수 있었다.
본 발명의 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 종양세포 및 종양관련 대식세포(tumor associated macrophage)를 동시에 표적하여 사멸시키는 효과가 있어 우수한 항암효과 및 암 전이 억제효과를 나타내며, 기존 항암약물과 병용투여 기존 항암효과의 부작용을 감소시키면서 항암 및 암전이 억제효과를 나타내어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition comprising fusion peptide targeting cancer cells and tumor associated macrophages for treating cancer and inhibiting metastasis <130> NP15-0065 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 receptor targeting peptide <400> 1 Cys Arg Lys Arg Leu Asp Arg Asn Cys 1 5 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro-apoptotic peptide <400> 2 Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion peptide <400> 3 Cys Arg Lys Arg Leu Asp Arg Asn Cys Gly Gly Gly Lys Leu Ala Lys 1 5 10 15 Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 20 25

Claims (8)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 융합펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 암세포 및 종양관련 대식세포(tumor associated macrophage)를 동시에 표적하는 것을 특징으로 하는 항암 및 암 전이 억제용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 암은 IL-4 수용체가 과발현되는 암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 IL-4 수용체가 과별현되는 암은 폐암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 및 편평상피세포암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항암 약물과 병용하여 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항암 약물은 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
KR1020150093576A 2015-06-30 2015-06-30 암세포 및 종양관련 대식세포를 동시에 표적하는 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 및 암 전이 억제용 약학적 조성물 KR101741594B1 (ko)

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