KR102133205B1

KR102133205B1 - PNA-pHLIP 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102133205B1
Application number: KR1020180155051A
Authority: KR
Inventors: 이옥준; 손승명
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-12-05
Filing date: 2018-12-05
Publication date: 2020-07-13
Also published as: KR20200068272A

Abstract

본 발명은 PNA-pHLIP 접합체의 암 치료 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 miR-29a를 peptide nucleic acid (PNA) 형태로 제작하고, 이를 pHLIP와 연결하여 제조한 pHLIP-PNA(miR-29a) 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 선암(adenocarcinoma)에서 과발현되는 CEACAM6를 조절하는 특정 마이크로 RNA(MicroRNA, miRNA)를 산성 미세 환경을 이용한 pHLIP로 정밀 주입하는 개념의 표적치료제로서 CEACAM6를 발현하는 여러 종류의 선암에 공통적인 치료 효과를 가진다. 본 발명의 pHLIP-PNA 접합체는 투여 농도에 의존적으로 폐 종양의 성장을 억제할 수 있으며, 특히, pHLIP-PNA 접합체와 함께 기존 항암제 시스플라틴을 병용 투여하는 경우 폐 종양 성장을 더욱 효과적으로 억제할 수 있다. 또한, 본 발명은 접합체는 pHLIP를 이용함으로써 마이크로 RNA가 암의 산성환경에만 선택적으로 작용할 수 있게 고안됨으로써 치료에 따른 정상세포 손상을 최소화할 수 있는 이점을 가진다.

Description

PNA-pHLIP 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising PNA-pHLIP Conjugates}

본 발명은 PNA-pHLIP 접합체의 암 치료 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 miR-29a를 peptide nucleic acid (PNA) 형태로 제작하고, 이를 pHLIP와 연결하여 제조한 pHLIP-PNA(miR-29a) 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

폐암(lung cancer)은 남녀 모두의 성별에서 두 번째로 흔히 발생하는 암으로, 모든 암에서 15%를 차지한다. 2011년 미국 암 학회(American cancer society)의 보고에 따르면 한 해 22만 환자 이상이 폐암으로 진단을 받으며 이중 약 70%가 사망에 이르는데, 이는 전체 암 사망 환자의 27%를 차지한다.

이러한 폐암 중에서도 비소세포성 폐암(non small lung cancer)은 상피성 암(carcinoma)의 일종으로 소세포성 폐암(small lung cancer)이 아닌 모든 상피성 폐암(epithelial lung cancer)을 일컬으며, 폐암 전체의 약 85% 내지 90%를 차지한다. 비소세포성 폐암의 증상은 지속적인 기침, 흉부 통증, 체중감소, 손톱 손상, 관절 통증, 호흡의 단기화(shortness of breath) 등이 있으나, 비소세포성 폐암은 일반적으로 천천히 진행되기 때문에 초기에는 그 증상을 거의 나타내지 않아 조기 발견 및 치료가 어렵고, 뼈, 간, 소장 및 뇌 등 전신에 전이된 후에야 발견될 가능성이 높다.

비소세포성 폐암은 암세포의 크기, 모양 및 화학적 구성에 따라 몇 가지 하위 종류로 나뉘며, 대표적으로는 선암(adenocarcinoma), 편평상피암(squamous cell carcinoma), 대세포암(large cell carcinoma) 등이 있다. 선암은 전체 폐암의 40% 이상을 차지할 정도로 가장 높은 빈도로 발생하는 폐암으로, 폐의 바깥 부위(outer region)에서 발견되며 다른 폐암보다 천천히 진행되는 경향이 있으나, 초기 높은 전이 경향 및 방사성 저항성을 나타낸다. 편평상피암은 전체 폐암의 25%-30%를 차지하는 비소세포성 폐암의 한 종류로서, 기도(airway)를 이루고 있는 세포의 초기 단계(early version)에서 시작되며, 상기 암은 주로 흡연자에서 높은 발병률을 나타낸다. 또한, 전체 폐암의 10%-15% 정도를 차지하는 대세포암은 폐의 어느 부위에서나 발병할 수 있으며, 그 진행 속도가 소세포성 폐암(small cell lung cancer)과 유사할 만큼 빠르다. 하지만, 이러한 높은 발병률과 사망률에도 불구하고 아직까지 비소세포성 폐암을 극복할 수 있는 어떤 약물 또는 치료 방법도 개발되지 못한 실정이다.

한편, CEACAM6는 CEA 패밀리에 속하는 당단백질로 대부분의 선암에서 과발현되며, 정상세포에서는 매우 낮게 발현되는 특징을 가진다. CEACAM6는 폐암과 췌장암 등에서 암 진행에 관련해서 나쁜 예후 인자로 이미 알려져 있다. 따라서 CEACAM6의 발현을 효과적으로 조절할 수 있는 마이크로 RNA (MicroRNA, miRNA)는 선암에 공통적으로 작용할 수 있는 가능성이 있다.

마이크로 RNA(MicroRNA, miRNA)는 식물, 동물, 바이러스 등에서 발견되는, 약 20-22개의 뉴클레오타이드로 구성된 작은 비발현 RNA 분자로, RNA 침묵과 전사 이후의 유전자 발현 조절 등의 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, 이러한 마이크로 RNA는 종양과 관련하여 암 유발 혹은 억제 인자로서 기능할 수 있으며, 여러 환경에서도 분해되지 않는 안정성을 가지고 있으므로 치료제로서의 가능성을 가지고 있다.

그러나 마이크로 RNA(MicroRNA, miRNA)를 구성하는 올리고뉴클레오티드 자체의 극성 때문에 부적합하며, 주입 시 종양 외 불특정 장기에 전달되는 한계가 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자는 CEACAM6 발현을 억제할 수 있는 특정 miRNA를 peptide nucleic acid (PNA) 형태로 제작하고, 암 산성 환경에서 선택적으로 나노시린지(nanosyringe) 기능을 하는 펩티드 벡터 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)를 연결하여 접합체를 제조하였다. 그리고 이렇게 제조된 본 발명의 pHLIP-PNA 접합체를 폐암 이종 이식 동물모델에 투여하는 경우 투여 농도에 의존적으로 폐 종양 성장이 억제됨을 확인하였으며, 또한, pHLIP-PNA 접합체와 함께 기존 항암제 시스플라틴을 병용 투여하는 경우 이들 각각을 단독 투여한 실험군 대비 폐 종양 성장 억제 효과가 우수한 것을 확인하였는바, 이러한 pHLIP-PNA 접합체의 폐암의 치료제로서의 유용성을 최초로 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2016-0103949호 한국공개특허 제10-2015-0140598호

따라서 본 발명의 목적은 암을 효과적으로 치료할 수 있는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암을 효과적으로 치료할 수 있는 항암 보조제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 PNA 및 종양 특이적 세포 투과성 펩티드가 결합된 형태의 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 종양 특이적 세포 투과성 펩티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 pHLIP(pH Low Insertion Peptide)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PNA는 소광자가 결합될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군으로부터 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 항암제와 병용 투여될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 네다플라틴(nedaplatin) 및 젬시타빈(Gemcitabine)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 췌장암 또는 대장암일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 PNA 및 종양 특이적 세포 투과성 펩티드가 결합된 형태의 접합체를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항암 보조제는 항암제와 병용하여 투여될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 보조제는 항암약물과 동시에(simutaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다.

본 발명은 선암(adenocarcinoma)에서 과발현되는 CEACAM6를 조절하는 특정 마이크로 RNA(MicroRNA, miRNA)를 산성 미세 환경을 이용한 pHLIP로 정밀 주입하는 개념의 표적치료제로서 CEACAM6를 발현하는 여러 종류의 선암에 공통적인 치료 효과를 가진다. 본 발명의 pHLIP-PNA 접합체는 투여 농도에 의존적으로 폐 종양의 성장을 억제할 수 있으며, 특히, pHLIP-PNA 접합체와 함께 기존 항암제 시스플라틴을 병용 투여하는 경우 폐 종양 성장을 더욱 효과적으로 억제할 수 있다. 또한, 본 발명은 접합체는 pHLIP를 이용함으로써 마이크로 RNA가 암의 산성환경에만 선택적으로 작용할 수 있게 고안됨으로써 치료에 따른 정상세포 손상을 최소화할 수 있는 이점을 가진다.

도 1은 본 발명의 pHLIP-PNA 접합체 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 PNA와 pHLIP의 반응 혼합물의 HPLC 용출 프로파일 및 PNA 올리고머 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 중성(pH 7.4) 및 산성(pH 6.2) 조건 하에서 폐암 세포주(A549 세포)에 본 발명의 pHLIP-PNA 접합체를 농도별(100, 250 또는 500nM)로 처리한 후 세포생존율를 측정한 결과이다. pHLIP-scr는 대조군이며, 값은 평균±표준편차로 나타내었다.
도 4a는 약 44.8mm³ A549 종양이 형성된 누드 마우스에 Vehicle(PBS), pHLIP-scr(음성 대조군), pHLIP-PNA 접합체를 주사한 후 기간 경과에 따른 종양 부피 크기를 측정한 결과이다.
도 4b는 약 44.8mm³ A549 종양이 형성된 누드 마우스에 Vehicle(PBS), pHLIP-scr(음성 대조군), pHLIP-PNA 접합체를 주사한 후 3주가 경과한 시점에 종양 무게를 측정한 결과이다.
도 4c는 약 44.8mm³ A549 종양이 형성된 누드 마우스에 Vehicle(PBS), pHLIP-scr(음성 대조군), pHLIP-PNA 접합체를 주사한 후 3주가 경과한 시점에 종양의 대표적인 사진을 나타낸 것이다.
도 4d는 본 발명의 pHLIP-PNA 접합체가 생체 내에서 폐암에 PNA를 전달하는 능력을 평가하기 위해 공초점현미경으로 분석한 결과이다. 붉은색은 PNA-TAMRA를 나타내며, 파란색은 세포핵을 나타낸다.
도 4e는 약 44.8mm³ A549 종양이 형성된 누드 마우스에 Vehicle(PBS), pHLIP-scr(음성 대조군), pHLIP-PNA 접합체를 주사한 후 치료 기간 동안 실험 마우스의 체중 변화를 나타낸 것이다. 값은 평균±표준편차로 나타내었다.
도 5a는 약 44.8mm³ A549 종양이 있는 누드 마우스에 본 발명의 pHLIP-PNA 접합체, 시스플라틴, pHLIP-PNA+시스플라틴을 주사한 후 시간 경과에 따른 종양 크기를 측정한 것이다.
도 5b는 약 44.8mm³ A549 종양이 있는 누드 마우스에 본 발명의 pHLIP-PNA 접합체, 시스플라틴, pHLIP-PNA+시스플라틴을 주사한 후 3주가 경과한 시점에 종량 무게를 측정한 것이다.
도 5c는 약 44.8mm³ A549 종양이 있는 누드 마우스에 본 발명의 pHLIP-PNA 접합체, 시스플라틴, pHLIP-PNA+시스플라틴을 주사한 후 3주가 경과한 시점에 종양의 대표적인 사진을 나타낸 것이다.
도 5d는 약 44.8mm³ A549 종양이 있는 누드 마우스에 본 발명의 pHLIP-PNA 접합체, 시스플라틴, pHLIP-PNA+시스플라틴을 주사한 후 치료 기간 동안 실험 마우스의 체중 변화를 나타낸 것이다. 값은 평균±표준편차로 나타내었다.

본 발명은 CEACAM6 발현을 조절할 수 있는 PNA; 및 종양 특이적 세포 투과성 펩티드가 결합된 형태의 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 "CEACAM6"은 CEA 패밀리에 속하는 당단백질로 대부분의 선암에서 과발현되며, 정상세포에서는 매우 낮게 발현되는 특징을 갖는다.

본 발명에서 "PNA(peptide nucleic acid)"란, DNA의 생화학적 불안정성을 보완하기 위해 1991년 유기합성으로 개발된 인공 DNA를 의미하며, 펩티드핵산이라고도 불린다. PNA는 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로, 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 극성을 띠지 않아 안정적이고 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하여 표적 DNA 혹은 RNA와 매우 강하게 결합하는 특징을 갖는다. 또한, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는 장점이 있으며, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 생체 내에서 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.

본 발명에서 "종양 특이적 세포 투과성 펩티드"란, 정상 세포가 아닌 암세포에만 특이적으로 세포 투과성을 갖는 펩티드를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기‘CEACAM6 발현을 조절할 수 있는 PNA’는 microRNA-29a를 PNA 형태로 제작한 것으로서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열 또는 이와 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 PNA는 일 말단에 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA(carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 TAMRA를 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 PNA가 일 말단에 소광자가 결합되는 경우, 펩타이드와 소광자를 연결시기키 위해 친수성 링커를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 11-아미노-3,6,9-트리옥사운데카노익 에시드(11-amino-3,6,9-trioxaundecanoic acid)를 사용할 수 있으나, 특별히 그 종류를 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ‘종양 특이적 세포 투과성 펩티드’는 pHLIP(pH Low Insertion Peptide)일 수 있다.

본 발명에서 “pHLIP”는 산성 환경에서만 세포막을 통과하며 안정적인 나선구조를 형성하여 나노시린지(nanosyringe) 기능을 하는 펩티드 벡터를 의미한다.

암세포는 생존을 위해 정상세포보다 많은 양의 포도당을 소모하며, 산소 농도에 관계없이 대부분을 젖산으로 대사한다. 이렇게 형성된 젖산과 수소 이온은 암세포 밖으로 배출되어 종양의 세포 외 환경은 산성화되는 특징을 갖는다.

본 발명에서는 상기와 같은 특징을 갖는 pHLIP를 이용함으로써 불특정 장기에 전달될 수 있는 microRNA를 표적 부위에 정확하게 타겟팅할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ‘pHLIP’는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명의 pHLIP-PNA 접합체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 종래 알려진 다양한 항암제와 병용 투여될 수 있다.

본 발명에서 “항암제”란 악성종양을 치료하기 위해 사용되는 화학요법제를 총칭하는 것으로, 대부분의 항암제는 암세포의 각종 대사경로에 개입하여 주로 핵산의 합성을 억제하여 항암활성을 나타내는 약제를 의미한다. 항암제는 정상세포와 암세포간의 약에 대한 감수성의 차를 이용하여, 정상세포에 대한 독성은 비교적 적고, 암세포에 대해서는 보다 선택적으로 작용하지만, 정상세포도 어느 정도의 손상을 받기 때문에 부작용이 나타나게 된다. 이는 항암제가 분열이 빠른 세포에는 어디라도 작용하는 성질이 있기 때문에 빨리 분열하는 암세포에만 작용하는 것이 아니라 역시 분열이 빠른 정상세포인 골수, 위장관, 모근세포도 항암제의 영향을 받게 된다. 따라서 이런 약의 공통된 부작용으로 일시적인 혈구감소, 구역질, 구토, 설사, 식욕감퇴, 탈모 등이 나타나게 된다. 현재 암치료에 사용되고 있는 항암제는 생화학적인 작용기전에 따라 알킬화제, 대사길항제, 항생물질, 유사분열 억제제, 호르몬제 및 기타의 6개의 범주로 분류하고 있다.

상기 항암제의 예로서, 시스플라틴(cisplatin), 독소루비신 (doxorubicin), 에토포사이드 (etoposide), 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (doxetaxel), 불소피리미딘 (fluoropyrimidine), 옥살리플라틴 (oxalplatin), 캄토테칸 (campthotecan), 벨로테칸 (Belotecan), 포도필록톡신 (podophyllotoxin), 황산빈블라스틴(vinblastine sulfate), 사이클로포스파마이드 (cyclophosphamide), 악티노마이신 (actinomycin), 빈크리스틴황산염 (vincristine sulfate), 메토트렉세이트 (methotrexate), 베바시주맙 (bevacuzum ab), 탈리도마이드(thalidomide), 엘로티닙 (eriotinib), 게피티닙 (gefitinib), 캠토세신 (camptothecin), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸 (Anasterozole), 글리벡 (Gleevec), 5-플루오로우라실 (5-FU), 플록슈리딘(Floxuridine), 류프로리드 (Leuprolide), 플로타미드 (Flutamide), 졸레드로네이트 (Zoledronate), 빈크리스틴(Vincristine), 젬시타빈 (Gemcitabine), 스트렙토조토신 (Streptozocin), 카보플라틴(Carboplatin), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 비노렐빈(Vinorelbine), 히도록시우레아(hydroxyurea), 발루비신(Valrubicin), 레티노익산 (retinoic acid), 메클로레타민(Meclorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 부술판(Busulfan), 독시플루리딘(Doxifluridine), 빈블라스틴(Vinblastin), 마이토마이신(Mitomycin), 프레드니손(Prednisone), 테스토스테론(Testosterone), 미토산트론(Mitoxantron), 아스피린 (aspirin), 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenyltazone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone) 또는 코르티코스테로이드(corticosteroid) 등이 있으며, 화합물, 호르몬제, 항체 등 그 종류를 제한하지 않는다. 가장 바람직하게, 상기 항암제는 시스플라틴일 수 있다.

시스플라틴은 신장암 및 폐암에 많이 쓰이는 항암제로서 투여로 인한 오심, 구토는 매우 심한 편에 속하며, 식욕부진 상태에서는 구토의 유발이 쉽게 일어나고, 특히 신장과 간장에 독성을 나타낸다. 다양한 항구토 약물이 임상증상에 따라 선택, 배합되어 항암요법 전후로 사용되고 있고, 다양한 경로, 다양한 시간대 투여로 구토를 성공적으로 조절할 수 있으나, 삶의 질을 많이 저하시키고 있다.

본 발명의 pHLIP-PNA 접합체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 기존 항암제 시스플라틴을 병용 투여함으로써 암의 성장을 더욱 효과적으로 억제할 수 있는바, 기존 항암제의 투여량을 감소시킴으로써 화학요법제에 의한 다양한 부작용을 완화시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1~90 중량부로 포함되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올 레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, l9th Edition, Alfonso, R., ed, Mack Publishing Co.(Easton, PA: 1995))를 추가로 포함할 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충용액, 예를 들어 인산, 시트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 0.01 - 100mg/kg/day이며, 바람직하게는 0.1 - 20mg/kg/day이며, 더욱 바람직하게는 1 - 5mg/kg/day일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 간격으로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물이 치료 효과를 나타낼 수 있는 암은 'CEACAM6'가 과발현되는 선암(adenocarcinoma)일 수 있으며, 예를 들면, 위암, 폐암, 췌장암 또는 대장암일 수 있으며, 바람직하게는 폐암일 수 있다.

또한, 본 발명은 CEACAM6 발현을 조절할 수 있는 PNA; 및 종양 특이적 세포 투과성 펩티드가 결합된 형태의 접합체를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제를 제공할 수 있다. 본 발명에서 항암 보조제란 항암제 투여시 발휘되는 부작용을 개선하거나, 기존 항암제의 항암 효과를 높일 수 있는 것을 의미한다.

즉, 본 발명의 항암 보조제를 항암제와 병용하여 투여함으로써, 항암제에 의해 유발되는 다양한 부작용들의 발생을 예방할 수 있다. 본 발명의 상기 보조제는 항암약물과 동시에(simutaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 항암 보조제의 투여 순서 즉, 항암제와 항암 보조제 중에서 어떤 것을 어느 시점에서, 동시에, 개별적 또는 순차적으로 투여할 것인지의 여부는 의사나 전문가에 의해 결정될 수 있다. 이러한 투여 순서는 많은 인자에 따라 달라질 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

1. 재료 및 방법

PNA- pHLIP의 합성

[PNA 준비]

PNA 올리고머 miR-29a (TAMRA-linker-TAGCACCATCTGAAATCGGTTA-linker-Cys) 및 스크램블된 siRNA (scr; TAMRA-linker-TCACAACCTCCTAGAAAGAGTAGA-linker-Cys)를 PANAGENE(대전, 한국)으로부터 구입하였다. linker(11-amino-3,6,9-trioxaundecanoic acid)와 시스테인을 포함하는 PNA 올리고머 서열은 Bts PNA 단량체를 갖는 automatic synthesizer를 사용하여 고상 합성에 의해 생성되었다. 올리고머는 m-cresol:TFA (1:4) 칵테일 용액을 이용하여 수지로부터 절단하였다. TAMRA(5-카르복시테트라메틸로다민, 5-carboxytetramethyl-rhodamine)는 배타적으로 PNA의 아미노 (N)-말단에 접합되었다. RP-HPLC를 이용하여 PNA 올리고머를 정제하고, Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF)를 이용하여 확인하였다. miR-29a 및 스크램블된 PNA 올리고머의 추정 용융 온도는 각각 79℃ 및 75℃ 였다.

[pHLIP 준비]

pHLIP-PNA 구조물을 생성하기 위해, AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTCG 아미노산 서열을 갖는 pHLIP(pH low insertion peptide) 서열을 합성하였다. pHLIP는 각각의 PNA 올리고머의 C- 말단에 디설파이드 결합을 통해 접합시켰다.

[pHLIP-PNA(miR-29a) 접합체 제조]

pHLIP-PNA 접합체를 합성하기 위해, pHLIP와 PNA(펩타이드:PNA, 1.5:1)를 DMF/Tris(pH 7.5)의 혼합물에서 밤새 암실에서 반응시켰다. 접합 후, RP-HPLC를 이용하여 pH-LIP-PNA를 정제하고 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF)를 이용하여 확인하였다. 제조된 pHLIP-PNA 접합체는 아래 흡광계수를 이용하여 260nm에서 UV-VIS 분광 광도계로 정량한 후 동결건조하였다. 13,700M^-1cm^-1(A), 6,600M^-1cm^-1(C), 11,700M^-1cm^-1(G), 8,800M^-1cm^-1(T), 200M^-1cm^-1(F,phenylalanine), 및 32,300M^-1cm^-1(TAMRA)

세포배양

인간 폐암세포주 A549를 American Type Culture Collection에서 구입하였으며, L-글루타민(2 mM), 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100μg/ml) 및 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에 유지하였다. 모든 pH 조절된 세포 배양 실험을 위해, 세포는 pH7.4(with HEPES) 또는 pH6.2(with MES)로 완충되어진 10% FBS 포함 RPMI 배지에서 배양하였다.

세포생존율

A549 세포에 대한 CEACAM6 억제 효과를 측정하기 위해 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 에세이(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)를 사용하였다. 96 웰 플레이트에서 A549 세포 (5×10⁴ 세포/ml)를 0, 100, 250 또는 500 nM 농도의 pHLIP-miR-29a로 48시간 동안 처리하였으며, 이때 대조군으로 pHLIP-scr를 사용하였다. 모든 처리는 지시된 pH에서 수행하였다. 48시간 후, CCK-8 분석법 (Dojindo)을 사용하여 세포 성장의 정도를 평가하였다. CCK-8 용액(10㎕)을 각 웰에 첨가한 다음, 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. multiplate reader(Lambda Bio-20, Beckman Coulter, Brea, CA, USA)에 의해 450nm에서의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존률은 대조군과 비교하여 백분율(%)로 나타내었다.

생체 내 종양 이종 이식 실험

모든 동물 실험은 한국 생명 공학 연구원 기관 동물 보호 및 사용위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었다. A549 세포를 5주령의 BALB/c 흉선 누드 마우스(n = 5 마우스/그룹, 1.2×10⁷ 세포/마우스)의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 성장은 캘리퍼스로 길이(L), 폭(W) 및 높이(H)를 측정하고, 수학식 V=(L×W×H)×0.5를 사용하여 결정하였다. 종양이 형성되면 (약 44.8 mm³), 본 발명의 pHLIP-PNA 구조물을 정맥 내 주사하고 시스플라틴(cis-Diammineplatinum(ll) dichloride, SIGMA-ALDRICH^ⓡ)은 복강 내 주사하였다.

시료의 조제 및 투여방법

본 발명의 pHLIP-PNA 구조물은 PBS(pH7.4)를 이용하여 0.2 mg/ml의 농도로 조제한 뒤 1회 사용할 양만큼 바이알에 분주 후 냉동보관 했다가 1 바이알씩 꺼내 사용 전에 70~80℃ 물에서 10분 가량 heating하여 완전히 녹인 후 사용하였다. 조제한 본 발명의 pHLIP-PNA 구조물은 마우스 당 0.2 ml씩 2회/주 반복 미정맥투여하였다.

시스타플라틴은 살린(saline)에 녹여 0.2 mg/ml로 조제하였다. 조제한 시스타플라틴은 10 ml/kg 액량으로 2 /주 반복 복강투여 하였다(days 0, 3, 7, 10, 14, 17).

공초점현미경

수확한 종양조직은 공초점 현미경 분석을 위해 OCT(Optical coherence tomography)에서 신선하게 동결처리하였고 이후 2μm 단면으로 절단하였다. 조직 절편을 차가운 아세톤으로 고정시키고, PBS로 헹구고, 내인성 퍼 옥시다아제를 불활성화시키기 위해 과산화수소와 반응시키고, PBS로 세척하였다. 이후, DAPI를 첨가하여 세포핵을 염색하였다. 표면 결합된 pHLIP를 제거하기 위해 pH 7.4의 PBS를 사용하여 세척하였다. 공초점현미경(Zeiss LSM 710 META, Jena, Germany)을 이용하여 이미지를 얻고, Zen 소프트웨어 (버전 8.0, Zeiss)를 사용하여 처리하였다.

통계분석

세 가지 그룹의 세포 생존율 데이터를 비교하기 위해 Two-way analysis를 수행하였다. 동물 실험을 위해, 각 그룹에 대한 마우스 및 종양 무게를 Student’s t-test를 사용하여 비교하였다. P 값이 ≤ 0.05인 경우 통계적으로 유의하다고 간주하였다. 모든 통계 검사는 양측검정하였고 Prism 7 (GraphPad, La Jolla, CA, USA)을 사용하여 수행하였다.

2. 결과

pHLIP -PNA( miR -29a)의 생성 및 활성도 평가

[pHLIP-PNA(miR-29a)의 생성 확인]

pHLIP-PNA(miR-29a)는 PNA 올리고머의 C- 말단을 pHLIP에 접합시킴으로써 합성되었다. pHLIP-scr는 대조군으로 사용하였다. PNA에 부착된 단일 이성질체 5-카르복시테트라메틸로다민(TAMRA) 라벨로 pHLIP-PNA를 개질하였다. pHLIP-PNA 접합체의 생성은 역상고속액체크로마토그래피 (RP-HPLC) 및 질량분광법을 이용하여 확인하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다. 도 2는 PNA (miR-29a)와 pHLIP의 반응 혼합물의 HPLC 용출 프로파일을 나타낸 것이다.

[pHLIP-PNA(miR-29a)의 활성도 평가]

pHLIP-PNA(miR-29a)가 A549 세포에 miR-29a를 전달할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, A549 세포를 중성(pH 7.4) 및 산성(pH 6.2) 조건에서 pHLIP-PNA(100, 250 또는 500nM) 또는 pHLIP-scr(대조군)과 48시간 동안 반응시켰다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, pHLIP-PNA(miR-29a)에 의한 CEACAM6의 저해 활성은 산성(pH 6.2) 조건에서 pHLIP-PNA 처리 농도에 의존적으로 폐암 세포 A549의 생존율을 감소시키는 것을 확인하였다.

폐암 이종 이식 모델에서 pHLIP -PNA( miR -29a)의 치료 효능

본 실험에서는 먼저 인 비보(in vivo)에서 전달된 miR-29a의 최저 효율을 평가하였다. 생체 내 분석을 위해 BALB/c 누드 마우스에 1.2×10⁷ A549 세포를 피하 주사하였다. 종양이 시작된 지 일주일 후, 본 발명의 pHLIP-PNA(miR-29a)를 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주입하였다. 주입을 위한 pHLIP-PNA(miR-29a)의 최적량을 결정하기 위해 두 개의 그룹(n = 5 마리/그룹)의 마우스는 3주 동안 2회 2 mg/kg 및 4 mg/kg을 주사하였다. 치료 3주 후, 모든 마우스를 희생시켰다.

폐 종양 발생에 대한 pHLIP-PNA(miR-29a) 전달의 효과를 평가하기 위해, 종양 성장을 2 ~ 3일마다 측정하였다. 그 결과 하기 표 1 및 도 4a-4c에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 pHLIP-PNA(miR-29a)를 처리한 실험군의 경우 pHLIP-scr를 처리한 대조군 대비 종양 성장을 두드러지게 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 자세하게는 pHLIP-PNA(miR-29a)를 2mg/kg의 용량으로 투여한 마우스의 경우 종양 성장이 17.6% 억제되는 것으로 나타났으며, 4mg/kg의 용량으로 투여한 마우스의 경우 종양 성장이 40.9% 억제되는 것으로 나타났다.

또한, pHLIP-PNA(miR-29a)가 생체 내에서 폐암에 miR-29a를 전달하는 능력을 평가하기 위해 공초점현미경으로 분석하였다. 그 결과 도 4d에서 나타낸 바와 같이, pHLIP-PNA(miR-29a)가 TAMRA로 표지됨에 따라, pHLIP-PNA(miR-29a) 처리된 동물의 종양 세포 표면에서 강한 형광 신호가 관찰되었으며, 생체 내에서 miR-29a의 효율적인 세포 내 전달을 확인할 수 있었다.

한편, A549 폐암세포 이식 동물모델에 음성 대조군(pHLIP-scr)과 pHLIP-PNA(miR-29a)를 2 와 2, 4 mg/kg 용량으로 반복 미정맥주사시 독성 정도를 알아보기 위해 투여기간 동안 동물의 일반증상 및 체중 변화를 관찰한 결과, 시험기간 동안 특이한 일반증상 및 통계적으로 유의한 체중 감소는 관찰되지 않았다(도 4e 및 표 2 참조).

상기와 같은 결과는, 외인성 pHLIP-PNA(miR-29a)의 전달이 고형 종양 이종 이식 마우스 모델에서 폐 종양 성장을 억제함을 시사한다.

폐암 이종 이식 모델에서 pHLIP -PNA( miR -29a) 및 시스플라틴 동시 치료 효 능

본 실험에서는 동시 화학요법과 CEACAM6 표적화의 항종양 효과를 평가하였다. A549 세포를(1.2×10⁷) 피하 주사한지 2주 후에 마우스를 무작위로 4개의 그룹(n=5 마우스/그룹)으로 나누어 (i) 비히클, (ii) pHLIP-PNA(miR-29a), (iii) 시스플라틴, (iv) pHLIP-PNA(miR-29a)+시스플라틴을 처리하였다. pHLIP-PNA(miR-29a)의 처리 용량은 2 mg/kg를 사용하였다. 폐암세포 주입 2주 후, pHLIP-PNA(miR-29a)을 꼬리 정맥을 통해 주입하고, 시스플라틴은 주당 2회 3주간 복강 내 주사하였다. 종양의 볼륨은 2 ~ 3 일마다 측정하였다.

그 결과 하기 표 3 및 도 5a-5c에서 나타낸 바와 같이, pHLIP-PNA(miR-29a)를 단독 투여한 실험군은 비히클 투여군과 비교하여 종양 부피가 18.1% 감소하였으며, 시스플라틴을 단독 투여한 실험군은 종양 부피가 29.9% 감소하는 것으로 나타났고, pHLIP-PNA(miR-29a)과 시스플라틴을 병용 처리한 실험군은 종양 부피가 39.7% 감소되는 것으로 나타났다. 종합적으로 말하자면, 이들 결과는 전신 전달된 pHLIP-PNA(miR-29a)가 원발성 종양에 대하여 유의한 치료 활성을 나타내며 세포 독성 화학요법이 부가적인 효과를 나타냄을 나타낸다.

한편, A549 폐암세포 이식 동물모델에 본 발명의 pHLIP-PNA(miR-29a)(2mg/kg, i.v), pHLIP-PNA(miR-29a)+Cisplatin(2+2mg/kg) Cisplatin(2mg/kg, i.p)을 반복 투여시 독성 정도를 알아보기 위해 투여기간 동안 동물의 일반증상 및 체중 변화를 관찰한 결과, 모든 투여군에서 시험기간 동안 특이한 일반증상 및 통계적으로 유의한 체중 감소는 관찰되지 않았다(도 5d 및 표 4 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising PNA-pHLIP Conjugates <130> NPDC-75176 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA(miR-29a) <400> 1 tagcaccatc tgaaatcggt ta 22 <210> 2 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pHLIP(pH low insertion peptide) <400> 2 Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu 1 5 10 15 Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala 20 25 30 Asp Glu Gly Thr Cys Gly 35

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 PNA; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 pHLIP(pH Low Insertion Peptide)가 결합된 형태의 접합체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 PNA는 TAMRA(carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 소광자(quencher)가 결합되어 있는 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은 항암제와 병용 투여되는 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 네다플라틴(nedaplatin) 및 젬시타빈(Gemcitabine)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 PNA; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 pHLIP(pH Low Insertion Peptide)가 결합된 형태의 접합체를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 보조제.
제8항에 있어서,
상기 보조제는 항암제와 병용하여 투여되는 것을 특징으로 하는 폐암 치료용 보조제.
제8항에 있어서,
상기 보조제는 항암약물과 동시에(simutaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 하는 폐암 치료용 보조제.