JP2023546326A - 抗がん薬物を含むミトコンドリア及びその使用 - Google Patents

抗がん薬物を含むミトコンドリア及びその使用 Download PDF

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Abstract

Figure 2023546326000001
本発明は、抗がん有効性を有する化合物を含むミトコンドリオン及びその使用に関する。ミトコンドリオンは化合物を効率的に腫瘍に送達することが確認され、化合物を含むミトコンドリオンの抗がん効果が確認された。特に、腫瘍に特異的に結合する抗体又はその断片がミトコンドリオンの表面に結合すれば、化合物は特異的に腫瘍に送達され得る。したがって、本発明による化合物を含むミトコンドリオンは、化合物の副作用が少ないので、がんの治療に有効に使用し得る。
【選択図】なし

Description

本発明は、ミトコンドリオンを改変することができる化合物、その化合物を含むミトコンドリオン、及び有効成分としてこれらを含む医薬組成物を提供する。
ミトコンドリアは、細胞内エネルギー源であるアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）の合成及び調節に関与する真核生物細胞の細胞オルガネラである。ミトコンドリアは、インビボにおける種々の代謝経路、例えば細胞のシグナル伝達、細胞の分化、細胞の死、並びに細胞サイクル及び細胞増殖の制御に関連している。ミトコンドリアはそれ自体のゲノムを有しており、細胞のエネルギー代謝において中心的な役割を果たすオルガネラである。ミトコンドリアは電子輸送及び酸化的リン酸化プロセスを通じてエネルギーを産生し、アポトーシスシグナル伝達経路への関与に重要な役割を果たしている。
ミトコンドリア機能の低下によるエネルギー産生の低減が種々の疾患を引き起こすことが報告されている。電子輸送連鎖反応の機能がミトコンドリアのゲノム及びプロテオームの変動によって低下すれば、ＡＴＰの産生の低減、反応性酸素種の過剰な産生、カルシウム調節機能の低下、その他が生じる。この場合、ミトコンドリアの膜透過性の変化が生じ、アポトーシスの機能が異常になり、がん及び治癒しがたい疾患がもたらされる。
したがって、ミトコンドリアの機能不全に起因することが報告されてきたヒト疾患には、ミトコンドリアに関連する遺伝的疾患、糖尿病、心疾患、パーキンソン病又はアルツハイマー病等の老人性認知症、並びに種々のがん及びがんの転移等の出現が含まれる。さらに、２００種を超える種々のがんにおいて一般的に見出される特徴は、アポトーシス機能の低下、炎症性応答の増大、及び異常な代謝の増大からなっていた。これらのプロセスの全てはミトコンドリア機能に密接に関連しており、がんとミトコンドリアとの間の相関が注目を集めている。
一方、正常な細胞は電子輸送システムプロセスを通じてグルコース１分子あたり３６個のＡＴＰを産生するが、がん細胞は正常細胞とは異なり、十分な酸素条件での解糖（好気性解糖）によってグルコース１分子あたり２個のＡＴＰを産生する。したがって、がん細胞は正常細胞とは異なり、急速な細胞増殖のために必要なアミノ酸、脂質、核酸等を産生するために、エネルギーに関しては非効率な解糖プロセスを使用していることが知られている。この理由により、がん細胞は正常細胞より酸素要求量が少なく、大量の乳酸を産生することが知られている。
したがって、がん細胞中で生じる異常な代謝によるがん微小環境の組成の変化、機能が低下したミトコンドリアによって惹起されるアポトーシスの阻害、及び免疫応答の増大、並びにがん細胞中の異常な代謝反応が、がんの増殖において極めて重要な役割を果たしている。したがって、これらの特徴を用いて代謝関連の抗がん剤を開発することは、従来の抗がん剤の副作用及び経済的な問題を解決することができる良い方法であり得る。一方、ミトコンドリアを薬物として直接投与又は発現させる試みが最近なされている（韓国特許登録第１０－２１１１３２１号）。
したがって、本発明者らは、ミトコンドリアの抗がん活性の研究のプロセスにおいて、ミトコンドリアが、従来使用された抗がん剤と組み合わせて使用した場合に、優れた抗がん効果を有していることを確認することによって、本発明を完成させた。
本発明の一態様では、抗がん剤を含むミトコンドリオン及びこれを含むがんの予防又は治療のための医薬組成物が提供される。
本発明の別の態様では、抗がん剤と単離されたミトコンドリオンを混合するステップを含む、抗がん剤を含むミトコンドリオンを調製する方法が提供される。
本発明の別の態様では、ＴＰＰが化学結合された改変された抗がん剤が提供される。
本発明の別の態様では、抗がん剤を含むミトコンドリオンを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む、がんを予防又は治療する方法が提供される。
本発明による抗がん効果を有する化合物を含むミトコンドリオンが化合物を効率的に腫瘍に送達することが確認され、化合物を含むミトコンドリオンの抗がん効果が確認された。特に、腫瘍に特異的に結合する抗体又はその断片がミトコンドリアの表面に結合すれば、その化合物は特異的に腫瘍に送達され得る。したがって、本発明による化合物を含むミトコンドリオンは、その化合物の副作用が少ないので、がんの治療に有効に使用し得る。
ミトコンドリアと融合した形態の抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片を発現する発現ベクターを図式的に示す図である。 ヒト胎児腎細胞株（ＨＥＫ２９３）で発現した抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片をウェスタンブロットによって確認した結果を示す図である。 ヒト胎児腎細胞株（ＨＥＫ２９３）で発現した抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片の細胞内の位置を共焦点顕微鏡によって確認した結果を示す図である。スケールバーは１０μｍを表す。 ヒト胎児腎細胞株（ＨＥＫ２９３）で発現した抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片が細胞中のミトコンドリアと同じ位置に存在することをウェスタンブロットによって確認した結果を示す図である。 抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片を発現するヒト胎児腎細胞株（ＨＥＫ２９３）から単離されたミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）中のＡＴＰを測定した結果を示すグラフである。この場合、対照群は抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片を発現しないＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリアである。 抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片を発現するヒト胎児腎細胞株（ＨＥＫ２９３）から単離されたミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）の膜電位を測定した結果を示すグラフである。この場合、対照群は抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片を発現しないＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリアである。 抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片を発現するヒト胎児腎細胞株（ＨＥＫ２９３）から単離されたミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）の反応性酸素種（ＲＯＳ）を測定した結果を示すグラフである。この場合、対照群は抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片を発現しないＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリアである。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、ヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、肺線維芽細胞株（ＷＩ－３８）、及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７及びＭＫＮ－７４）におけるＨＥＲ２の発現をウェスタンブロットによって確認した結果を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、ヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、ヒト肺線維芽細胞株（ＷＩ－３８）、及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７及びＭＫＮ－７４）におけるＨＥＲ２の発現を免疫細胞化学染色によって確認した結果を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、ヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７及びＭＫＮ－７４）におけるＨＥＲ２の発現をフローサイトメトリーによって確認した結果を示す図である。 抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片を発現するヒト胎児腎細胞株（ＨＥＫ２９３）から単離されたミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）のＨＥＲ２標的能力を検証するための実験方法を示す図である。 ＨＥＲ２＋細胞であるヒト乳がん細胞株ＳＫ－ＢＲ－３とＨＥＲ２－細胞株であるヒト肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞の共培養及びその後の培養液のＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後の免疫細胞化学染色によってＨＥＲ２及び抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片の細胞内発現を確認した結果を示す図である。この場合、ＭＴは、抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片が融合していない、ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリアである。 ＨＥＲ２＋細胞であるヒト乳がん細胞株ＢＴ－４７４とＨＥＲ２－細胞であるヒト肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞の共培養及びその後の細胞のＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後の、ＨＥＲ２及び抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片の細胞内発現を免疫細胞化学染色によって確認した結果を示す図である。この場合、ＭＴは、抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片が融合していない、ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリアである。 ＨＥＲ２＋細胞であるヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７とＨＥＲ２－細胞であるヒト胃がん細胞株ＭＫＮ－７４細胞の共培養及びその後の細胞のＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後の、ＨＥＲ２及び抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片の細胞内発現を免疫細胞化学染色によって確認した結果を示す図である。この場合、ＭＴは、抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片が融合していない、ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリアである。 ＨＥＲ２＋細胞であるヒト乳がん細胞株ＳＫ－ＢＲ－３とＨＥＲ２－細胞であるヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の共培養及びその後の細胞のＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後の、ＨＥＲ２及び抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片の細胞内発現を免疫細胞化学染色によって確認した結果を示す図である。この場合、ＭＴは、抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片が融合していない、ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリアである。 ＨＥＲ２＋細胞であるヒト乳がん細胞株ＢＴ－４７４とＨＥＲ２－細胞であるヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の共培養及びその後の細胞のＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後の、ＨＥＲ２及び抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片の細胞内発現を免疫細胞化学染色によって確認した結果を示す図である。この場合、ＭＴは、ＨＥＫ２９３細胞から単離された、抗ＨＥＲ２抗体の一本鎖可変領域断片が融合していないミトコンドリアである。 ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーンで染色したＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖとドキソルビシンの複合ペイロードが結合したＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを調製する方法を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）及びヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）をＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後に共焦点顕微鏡によって観察した結果を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）のＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後のがん細胞の形態変化及び死滅過程を共焦点顕微鏡によって経時的に観察した結果を示す図である。 それぞれの濃度のドキソルビシンについて吸光度を測定することによって得られた標準曲線を示すグラフである。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、ヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７及びＭＫＮ－７４）のＤＯＸ又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理による細胞傷害性を測定した結果を示すグラフである。この場合、ＭＴはＤＯＸが負荷されていないＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖである。 ヒト肺線維芽細胞株（ＷＩ－３８及びＣＣＤ－８Ｌｕ）のＤＯＸ又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理による細胞傷害性を測定した結果を示すグラフである。この場合、ＭＴはＤＯＸが負荷されていないＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖである。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、ヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、ヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７及びＭＫＮ－７４）、及びヒト肺線維芽細胞株（ＷＩ－３８及びＣＣＤ－８Ｌｕ）におけるＤＯＸ又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのＩＣ５０値を確認した結果を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、ヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、ヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７及びＭＫＮ－７４）、ヒト肺線維芽細胞株（ＷＩ－３８及びＣＣＤ－８Ｌｕ）の０．５μＭのＤＯＸ又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理による細胞傷害性を測定した結果を示すグラフである。この場合、ＭＴはＤＯＸが負荷されていないＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖである。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）のＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理によるアポトーシスをＴＵＮＥＬアッセイによって確認した結果を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）のＭＴα－ＨＥＲｓｃＦｖ又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理によって惹起されたアポトーシスをウェスタンブロットによって確認した結果を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）のＭＴα－ＨＥＲｓｃＦｖ又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理によって惹起されたアポトーシスをフローサイトメトリーによって確認した結果を示すグラフである。この場合、ＭＴはＤＯＸが負荷されていないＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖである。 ＨＥＲ２発現がん細胞のＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる選択的殺滅効果を確認するための実験方法を示す図である。 ヒト乳がん細胞株ＢＴ－４７４（ＨＥＲ２＋、白色矢印）とヒト肺線維芽細胞株ＷＩ－３８（ＨＥＲ２－）の共培養及びＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した細胞の処理によるアポトーシスをＴＵＮＥＬアッセイによって確認した結果を示す図である。 トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）ドキソルビシン（ＴＰＰ－ＤＯＸ）の合成プロセスを示す図である。 ＴＰＰ－ＤＯＸのＭＲＩ解析の結果を示す図である。 ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーンで染色したＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖとＴＰＰ－ＤＯＸの複合ペイロードが結合したＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを調製する方法を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）及び肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）をＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後に共焦点顕微鏡によって観察した結果を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）のＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後のがん細胞の形態変化及び死滅過程を共焦点顕微鏡によって経時的に観察した結果を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、ヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７及びＭＫＮ－７４）のＴＰＰ－ＤＯＸ及びＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理による細胞傷害性を測定した結果を示す図である。この場合、ＭＴはＤＯＸが負荷されていないＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖである。 ヒト肺線維芽細胞株（ＷＩ－３８及びＣＣＤ－８Ｌｕ）のＴＰＰ－ＤＯＸ及びＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理による細胞傷害性を測定した結果を示すグラフである。この場合、ＭＴはＤＯＸが負荷されていないＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖである。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、ヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、ヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７及びＭＫＮ－７４）、及びヒト肺線維芽細胞株（ＷＩ－３８及びＣＣＤ－８Ｌｕ）におけるＴＰＰ－ＤＯＸ及びＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのＩＣ５０値を確認した結果を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、ヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、ヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７及びＭＫＮ－７４）、ヒト肺線維芽細胞株（ＷＩ－３８及びＣＣＤ－８Ｌｕ）の０．５μＭのＴＰＰ－ＤＯＸ又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理による細胞傷害性を測定した結果を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）のＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理によるアポトーシスをＴＵＮＥＬアッセイによって確認した結果を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）のＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理によって惹起されたアポトーシスをウェスタンブロットによって確認した結果を示す図である。 ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及び胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）のＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理によって惹起されたアポトーシスをフローサイトメトリーによって確認した結果を示すグラフである。 ＨＥＲ２発現細胞のＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる選択的殺滅効果を確認するための実験法を示す図である。 ヒト乳がん細胞株ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋、白色矢印）とヒト肺線維芽細胞株ＣＣＤ－８Ｌｕ（ＨＥＲ２－）の共培養及びその後のＴＴＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した細胞の処理によるアポトーシスをＴＵＮＥＬアッセイによって確認した結果を示す図である。 ミトコンドリアと融合した形態の抗ＰＤＬ１抗体の一本鎖可変領域断片を発現する発現ベクターを図式的に示す図である。 ヒト胎児腎細胞株（ＨＥＫ２９３）で発現した抗ＰＤＬ１抗体の一本鎖可変領域断片をウェスタンブロットによって確認した結果を示す図である。 ヒト膵がん細胞株（ＢＸＰＣ－３及びＣＦＰＡＣ－１）及びヒト胃がん細胞株（ＳＮＵ－２１６及びＳＮＵ－４８４）におけるＰＤ－Ｌ１の発現をウェスタンブロットによって確認した結果を示す図である。 ＰＤＬ１＋細胞とＰＤＬ１－細胞の共培養及びその後の抗ＰＤＬ１抗体の一本鎖可変領域断片を発現するヒト胎児腎細胞株（ＨＥＫ２９３）から単離されたミトコンドリア（ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ）による細胞の処理の後の、ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖのＰＤＬ１標的能力を検証するための実験方法を示す図である。 ヒト胃がん細胞株ＳＮＵ－２１６（ＰＤＬ１＋、白色矢印）とＳＮＵ－４８４（ＰＤＬ１－）の共培養又はヒト膵がん細胞株ＢＸＰＣ－３（ＰＤＬ１＋、白色矢印）とヒト膵がん細胞株ＣＦＰＡＣ－１（ＰＤＬ１－）の共培養及びその後の細胞のＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖによる処理の後の、抗ＰＤＬ１抗体の一本鎖可変領域断片の細胞内発現を免疫細胞化学染色によって確認した結果を示す図である。この場合、ＭＴは、抗ＰＤＬ１抗体の一本鎖可変領域断片が融合していない、ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリアである。 ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーンで染色したＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖとドキソルビシン（ＤＯＸ）の複合ペイロードが結合したＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖを調製する方法を示す図である。 ヒト膵がん細胞株（ＢＸＰＣ－３及びＣＦＰＡＣ－１）及びヒト胃がん細胞株（ＳＮＵ－２１６及びＳＮＵ－４８４）のＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖを使用した処理による細胞傷害性を測定した結果を示すグラフである。 ヒト膵がん細胞株（ＢＸＰＣ－３及びＣＦＰＡＣ－１）及びヒト胃がん細胞株（ＳＮＵ－２１６及びＳＮＵ－４８４）のＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖを使用した処理によるアポトーシスをウェスタンブロットによって確認した結果を示す図である。 ミトコンドリアと融合した形態の抗メソテリン（ＭＳＬＮ）抗体の一本鎖可変領域断片を発現する発現ベクターを図式的に示す図である。 ヒト胎児腎細胞株（ＨＥＫ２９３）で発現した抗ＭＳＬＮ抗体の一本鎖可変領域断片をウェスタンブロットによって確認した結果を示す図である。 ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーンで染色したＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖとフェノフォルバイドＡ（ＰＢＡ）の複合ペイロードが結合したＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖを調製する方法を示す図である。 ヒト膵がん細胞株（ＡｓＰＣ－１）のＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ又はＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖを使用した処理による細胞傷害性を測定した結果を示す図及びグラフである。ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖはＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖの陰性対照である。 ヒト膵がん細胞株（Ｃａｐａｎ－１）のＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ又はＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖを使用した処理による細胞傷害性を測定した結果を示す図及びグラフである。ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖはＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖの陰性対照である。 ヒト膵がん細胞株（Ｃａｐａｎ－２）のＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ又はＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖを使用した処理による細胞傷害性を測定した結果を示す図及びグラフである。ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖはＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖの陰性対照である。 ヒト膵がん細胞株（Ｍｉａ ＰａＣａ－２）のＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ又はＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖを使用した処理による細胞傷害性を測定した結果を示す図及びグラフである。ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖはＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖの陰性対照である。 ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーンで染色したＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖとゲムシタビンの複合ペイロードが結合したＧｅｍ－ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖを調製する方法を示す図である。 ヒト膵がん細胞株（ＡｓＰＣ－１、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、及びＭｉａ ＰａＣａ－２）のＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ又はＧｅｍ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖを使用した処理による細胞傷害性を測定した結果を示す図及びグラフである。ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖはＧｅｍ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖの陰性対照である。 ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーンで染色したＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖとビノレルビンの複合ペイロードが結合したＶＩＢＥ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖを調製する方法の概略図を示す図である。 ヒト膵がん細胞株（ＡｓＰＣ－１、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、及びＭｉａ ＰａＣａ－２）のＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ又はＶＩＢＥ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖを使用した処理による細胞傷害性を測定した結果を示すグラフである。ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖはＶＩＢＥ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖの陰性対照である。 ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７（ＨＥＲ２＋）を移植することによって形成された異種移植マウスモデルにＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを投与した後の、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのＨＥＲ２標的能力を検証するための実験方法を示す図である。 ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７（ＨＥＲ２＋）を移植することによって形成された異種移植マウスモデルにＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを投与した後で、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖが腫瘍中に位置することを観察した結果を示す図である。 ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７（ＨＥＲ２＋）を移植することによって形成された異種移植マウスモデルにおけるＴＰＰ－ＤＯＸ又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの抗がん有効性を確認するための実験方法を示す図である。 ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７（ＨＥＲ２＋）を移植することによって形成された異種移植マウスモデルにＴＰＰ－ＤＯＸ又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを投与した後の経日的な腫瘍サイズ（腫瘍体積）を測定した結果を示すグラフである。 ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７（ＨＥＲ２＋）を移植することによって形成された異種移植マウスモデルにＴＰＰ－ＤＯＸ又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの投与を開始した２５日後に抽出した腫瘍のサイズを確認する図である。 ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７（ＨＥＲ２＋）を移植することによって形成された異種移植マウスモデルにＴＰＰ－ＤＯＸ又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの投与を開始した２５日後に抽出した腫瘍の重量を測定した結果を示すグラフである。 ヒトＨＥＲ２を過剰発現するマウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を移植することによって形成された同種移植マウスモデルにおけるＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ、ＴＰＰ－ＤＯＸ、又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの抗がん有効性を確認するための実験方法を示す図である。 ヒトＨＥＲ２を過剰発現するマウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を移植することによって形成された同種移植マウスモデルにＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ、ＴＰＰ－ＤＯＸ、又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを投与した後の経日的な腫瘍サイズ（腫瘍体積）を測定した結果を示すグラフである。 ヒトＨＥＲ２を過剰発現するマウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を移植することによって形成された同種移植マウスモデルにＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ、ＴＰＰ－ＤＯＸ、又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを投与した２１日後に抽出した腫瘍のサイズを確認する図である。 ヒトＨＥＲ２を過剰発現するマウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を移植することによって形成された同種移植マウスモデルにＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ、ＴＰＰ－ＤＯＸ、又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの投与を開始した２１日後に抽出した腫瘍の重量を測定した結果を示すグラフである。 ヒトＨＥＲ２を過剰発現するマウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を移植することによって形成された同種移植マウスモデルにおけるＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ、ＤＯＸ、又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの抗がん有効性を確認するための実験方法を示す図である。 ヒトＨＥＲ２を過剰発現するマウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を移植することによって形成された同種移植マウスモデルにＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ、ＤＯＸ、又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを投与した後、経日的に腫瘍のサイズを測定した結果を示すグラフである。 ヒトＨＥＲ２を過剰発現するマウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を移植することによって形成された同種移植マウスモデルにＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ、ＴＰＰ－ＤＯＸ、又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの投与を開始した２１日後に抽出した腫瘍のサイズを確認する図である。 ヒトＨＥＲ２を過剰発現するマウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を移植することによって形成された同種移植マウスモデルにＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ、ＤＯＸ、又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの投与を開始した２１日後に抽出した腫瘍の重量を測定した結果を示すグラフである。
抗がん剤を含むミトコンドリオン
本発明の一態様では、抗がん剤を含むミトコンドリオンが提供される。さらに本発明の別の態様では、抗がん剤を有効成分として含むミトコンドリオンを含む、がんの予防又は治療のための医薬組成物が提供される。
本明細書で使用される場合、用語「ミトコンドリオン」は、細胞内エネルギー源であるアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）の合成及び調節に関与する真核生物細胞の細胞オルガネラである。ミトコンドリアは、インビボにおける種々の代謝経路、例えば細胞のシグナル伝達、細胞の分化、細胞の死、並びに細胞サイクル及び細胞増殖の制御に関連している。したがって、遺伝的、環境的、又は未知の原因によるミトコンドリアの機能低下又は機能不全が、ミトコンドリアに関連する遺伝的疾患、リウマチ性関節炎等の炎症性疾患、虚血性疾患、感染性疾患、心疾患、筋肉疾患、パーキンソン病及びアルツハイマー病等の退行性疾患、その他の発症、並びに発癌及びがんの転移等の種々の疾患の進行に関連していることが報告されている。
ミトコンドリオンは真核生物から得ることができ、哺乳動物又はヒトから得ることができる。具体的には、ミトコンドリオンは細胞又は組織から単離することができる。例えば、ミトコンドリオンは体細胞、生殖細胞、又は幹細胞から得ることができ、血液細胞又は血小板から単離することができる。さらに、ミトコンドリオンは組織又は細胞を濃縮することによって破壊した後で単離することができ、又は凍結及び保存の後で解凍された組織又は細胞の試料から破壊した後で単離することができる。
具体的には、体細胞は筋肉細胞、肝細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、血小板、又は粘膜細胞であってよい。
さらに、幹細胞は種々の型の組織細胞に分化する能力を有する未分化の細胞であり、間葉系幹細胞、成人幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚幹細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞、四肢幹細胞、及び組織誘導幹細胞からなる群から選択されるいずれか１つであってよいが、これらに限定されない。この場合、間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、滑液、精巣、羊膜、及び胎盤からなる群から選択されるいずれか１つから得ることができる。
さらに、ミトコンドリオンは細胞又は組織をインビトロで培養することによって単離することができ、又は凍結及び保存の後で解凍した試料から単離することができる。
さらに、ミトコンドリオンは自家、同種、又は異種の対象から得ることができる。具体的には、自家ミトコンドリオンは、同じ対象の組織又は細胞から得られたミトコンドリオンを意味する。さらに、同種ミトコンドリオンは、対象と同じ種に属し、対立遺伝子の異なる遺伝子型を有する対象から得られたミトコンドリオンを意味する。さらに、異種ミトコンドリオンは、対象とは異なる種に属する対象から得られたミトコンドリオンを意味する。
さらに、ミトコンドリオンは細胞から単離されたミトコンドリオンであってよい。さらに、ミトコンドリオンは元のままで、ミトコンドリア活性を有していてよい。
一方、ミトコンドリアが特定の細胞から単離される場合には、ミトコンドリアは、種々の既知の方法を含む種々の改変された方法、例えば特定の緩衝溶液を使用するか、電位差及び磁場等を使用して、単離することができる。
ミトコンドリアの単離は、ミトコンドリアの活性を維持するという観点で細胞を破壊し、遠心分離することによって得ることができる。
この場合、抗がん剤がミトコンドリオンの外膜に存在してもよい。具体的には、抗がん剤は外膜と内膜の間に位置してもよい。さらに、抗がん剤はクリステに位置してもよい。また抗がん剤は内膜の内側のマトリックス中に存在してもよい。
さらに、ミトコンドリオンは改変されたミトコンドリオンであってよい。この場合、改変されたミトコンドリオンは、その中で腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合する抗体又はその断片が細胞の表面に存在するミトコンドリオンであってよい。
この場合、腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、黒色腫抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質２（ｔｙｒｐ２）、ブラキウリ、メソテリン、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ＥＲＢＢ２、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、ＦＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ－Ｌ１、ＡＣＰＰ、ＣＰＴ１Ａ、ＩＦＮＧ、ＣＤ２７４、ＦＯＬＲ１、ＥＰＣＡＭ、ＩＣＡＭ２、ＮＣＡＭ１、ＬＲＲＣ４、ＵＮＣ５Ｈ２ ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ、ＭＳＬＮ、ネクチン－３、及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つであってよいが、上記の型に限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「がん」は、正常組織の細胞がある理由で無制限に増殖し、生体の生命現象又は周囲の組織の状態に関わらず急速に増殖し続ける疾患として分類される。本発明では、がんは、乳がん、肺がん、膵がん、膠芽細胞腫、胃がん、肝がん、大腸がん、前立腺がん、卵巣がん、頸がん、甲状腺がん、喉頭がん、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽腫、網膜芽腫、頭頚部がん、唾液腺がん、及びリンパ腫等の、人体の種々のがんからなる群から選択されるいずれか１つのがんであってよいが、上記の型に限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「抗がん剤」は、がん細胞の増殖を阻害するために使用される薬物である。本発明では、抗がん剤は、化学的抗がん剤、標的抗がん剤、及び駆虫剤からなる群から選択してもよいが、これらに限定されない。
具体的には、「化学的抗がん剤」は、アルキル化剤、微小管阻害剤、代謝拮抗剤、及びトポイソメラーゼ阻害剤からなる群から選択されるいずれか１つであってよいが、これらに限定されない。
アルキル化剤は、メクロレタミン、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、チオテパ、アルトレタミン、プロカルバジン、ブスルファン、ストレプトゾシン、カルムスチン、イオムスチン、ダカルバジン、ドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンからなる群から選択されるいずれか１つであってよいが、これらに限定されない。微小管阻害剤は、ドセタキセル、ビンブラスチン、オンコビン、及びビノレルビンからなる群から選択されるいずれか１つであってよいが、これらに限定されない。代謝拮抗剤は、フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、フルダラビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、及びメルカプトプリンからなる群から選択されるいずれか１つであってよいが、これらに限定されない。トポイソメラーゼ阻害剤は、ヒカムチン、カンプトサル、ベペシド、タキソール、ブレオマイシン、アドリアマイシン、及びセルビジンからなる群から選択されるいずれか１つであってよいが、これらに限定されない。
さらに、「標的抗がん剤」は、特定の標的バイオマーカーを調節する化合物であってよい。例えば、標的抗がん剤は、ＢＴＫ、Ｂｃｒ－ａｂｌ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ／ＶＥＧＦＲ／ＦＧＦＲファミリー、ＭＥＫ／ＲＡＦ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＣＤＫ、ユビキチン、ＪＡＫ、ＭＡＰ２Ｋ、ＡＬＫ、ＰＡＲＰ、ＴＧＦβＲＩ、プロテアソーム、Ｂｃｌ－２、Ｂｒａｆ、Ｃ－Ｍｅｔ、ＶＲ１、ＶＲ２、ＶＲ３、ｃ－ｋｉｔ、ＡＸＬ、及びＲＥＴを標的とする化合物からなる群から選択されるいずれか１つであってよいが、これらに限定されない。
標的抗がん剤の中の化合物の一実施形態は、ＢＴＫを標的とするイブルチニブであってよい。さらに、これはＢｃｒ－ａｂｌを標的とするダサチニブ、ニロチニブ、イマチニブ、又はボスチニブであってよい。さらに、これはＥＧＦＲを標的とするオシメルチニブ、エルロチニブ、又はゲフィチニブであってよいが、これらに限定されない。さらに、これはＰＤＧＦＲ／ＶＥＧＦＲ／ＦＧＦＲファミリーを標的とするニンテダニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、カボザンチニブ、レンバチニブ、レゴラフェニブ、マシチニブ、セマキサニブ、チボザニブ、バンデタニブ、アキシチニブ、又はパゾパニブであってよいが、これらに限定されない。さらに、これはＭＥＫ／ＲＡＦを標的とするトラメチニブ／ダブラフェニブであってよいが、これらに限定されない。
さらに、これはＨＥＲ２／Ｎｅｕを標的とするアファチニブ、ラパチニブ、又はネラチニブであってよいが、これらに限定されない。さらに、これはＣＤＫを標的とするアベマシクリブ又はパルボシクリブであってよいが、これらに限定されない。さらに、これはユビキチンを標的とするレナリドミドであってよいが、これに限定されない。さらに、これはＪＡＫを標的とするルキソリチニブ、レスタウルチニブ、又はパクリチニブであってよいが、これらに限定されない。さらに、これはＭＡＰ２Ｋを標的とするコビメチニブ、セルメチニブ、トラメチニブ、又はビニメチニブであってよいが、これらに限定されない。さらに、これはＡＬＫを標的とするアレクチニブ又はクリゾチニブであってよいが、これらに限定されない。さらに、これはＰＡＲＰを標的とするオラパリブであってよいが、これに限定されない。さらに、これはＴＧＦβＲＩを標的とするガルニセルチブであってよいが、これに限定されない。さらに、これはプロテアソームを標的とするイキサゾミブであってよいが、これに限定されない。さらに、これはＢｃｌ－２を標的とするベネトクラクスであってよいが、これに限定されない。さらに、これはＢｒａｆを標的とするベムラフェニブであってよいが、これに限定されない。
さらに、「駆虫剤」は、ＯＸＰＨＯＳ（酸化的リン酸化）阻害剤、解糖阻害剤、解糖関連間接的阻害剤、ＰＰＰ（ペントースリン酸経路）阻害剤、及びオートファジー阻害剤からなる群から選択されるいずれか１つであってよいが、これらに限定されない。具体的には、駆虫剤は、ピルビニウム、ニクロサミド、ニタゾキサニド、イベルメクチン、フェンベンダゾール、ニタゾキサニド、及びアルベンダゾールから選択されるいずれか１つであってよいが、これらに限定されない。
改変されたミトコンドリオン
改変されたミトコンドリオンは、外来のタンパク質がミトコンドリオンの外膜に結合したミトコンドリオンを意味する。この場合、改変されたミトコンドリオンは、韓国特許出願公開第１０－２０１９－００４８２７９号に開示されたものでよい。
本明細書で使用される場合、用語「外来のタンパク質」は、細胞の内側及び外側で機能することができる標的タンパク質を含むタンパク質を意味する。この場合、外来のタンパク質は、ミトコンドリオンの中には存在せず、組換えタンパク質であってよいタンパク質である。具体的には、外来のタンパク質は、ミトコンドリアのアンカーペプチド及び標的タンパク質を含んでよい。さらに、外来のタンパク質は、ミトコンドリアのアンカーペプチド及び標的タンパク質を含む組換え融合タンパク質であってよい。この場合、融合タンパク質は、ミトコンドリアのアンカーペプチドを含んでよい。好ましくは、ミトコンドリアのアンカーペプチドは、ミトコンドリアの外膜に位置するペプチドであってよい。したがって、外来のタンパク質は、ミトコンドリアのアンカーペプチドによってミトコンドリオンの外膜に結合してもよい。ミトコンドリアのアンカーペプチドは、ミトコンドリアの膜タンパク質中に存在するタンパク質のＮ末端領域又はＣ末端領域を含むペプチドであってよく、ミトコンドリア膜タンパク質の外膜に存在するタンパク質のＮ末端領域又はＣ末端領域は、ミトコンドリアの外膜の上に位置してもよい。この場合、アンカーペプチドはミトコンドリアのシグナル配列をさらに含んでよい。
ミトコンドリア膜タンパク質中に存在するタンパク質の一実施形態は、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０、ＯＭ４５、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ、及びＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択されるいずれか１つであってよい。特に、ミトコンドリアアンカーペプチドがＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０、及びＯＭ４５からなる群から選択されるいずれか１つから誘導される場合には、これはＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０、又はＯＭ４５のＮ末端領域を含んでよい。ミトコンドリアアンカーペプチドの一実施形態は、配列番号７５で表される酵母から誘導されるＴＯＭ７０、又は配列番号７６で表されるヒト由来のＴＯＭ７０であってよい。別の実施形態は、配列番号７７で表される酵母から誘導されるＴＯＭ２０、又は配列番号７８で表されるヒト由来のＴＯＭ２０であってよい。別の実施形態は、配列番号７９で表される酵母から誘導されるＯＭ４５であってよい。
さらに、ミトコンドリアアンカーペプチドがＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ、及びＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択されるいずれか１つから誘導される場合には、これはＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ、及びＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択されるいずれか１つのＣ末端領域を含んでよい。ミトコンドリアアンカーペプチドの一実施形態は、配列番号８０で表される酵母から誘導されるＴＯＭ５、又は配列番号８１で表されるヒト由来のＴＯＭ５であってよい。別の実施形態は、配列番号８２で表される酵母から誘導されるＴＯＭ７、又は配列番号８３で表されるヒト由来のＴＯＭ７であってよい。別の実施形態は、配列番号８４で表される酵母から誘導されるＴＯＭ２２、又は配列番号８５で表されるヒト由来のＴＯＭ２２であってよい。別の実施形態は、配列番号８６で表される酵母から誘導されるＦｉｓ１、又は配列番号８７で表されるヒト由来のＦｉｓ１であってよい。別の実施形態は、配列番号８８で表されるヒト由来のＢｃｌ－２アルファであってよい。別の実施形態は、配列番号８９で表される酵母から誘導されるＶＡＭＰ１、又は配列番号９０で表されるヒト由来のＶＡＭＰ１であってよい。
この場合、外来のタンパク質に含まれる、細胞の内部及び外部で機能することができる標的タンパク質は、細胞中で活性を呈する活性タンパク質、細胞中に存在するタンパク質、及び細胞膜中に存在するリガンド又は受容体に結合する能力を有するタンパク質からなる群から選択されるいずれか１つであってよい。
活性タンパク質又は細胞中に存在するタンパク質の実施形態は、ｐ５３、グランザイムＢ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＰＤＣＤ５、Ｅ２Ｆ、ＡＰ－１（Ｊｕｎ／Ｆｏｓ）、ＥＧＲ－１、網膜芽細胞腫（ＲＢ）、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、Ｅ－カドヘリン、ニューロフィブロミン－２（ＮＦ－２）、ポリ［ＡＤＰ－リボース］シンターゼ１（ＰＡＲＰ－１）、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＣＡ－２、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ＲＡＦキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ）、ｐ１６、ＫＬＦ－１０、ＬＫＢ１、ＬＨＸ６、Ｃ－ＲＡＳＳＦ、ＤＫＫ－３ＰＤ１、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ－Ｍｙｃからなる群から選択されるいずれか１つであってよい。標的タンパク質が上の群から選択される場合には、標的タンパク質は、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０、又はＯＭ４５のＮ末端領域を含むアンカーペプチドに結合していてよい。
そのような融合タンパク質は、以下の順で結合していてよい。
Ｎ末端－ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０、又はＯＭ４５のＮ末端領域を含むアンカーペプチド－標的タンパク質－Ｃ末端。
さらに、外来のタンパク質は、真核生物細胞中のタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列又はミトコンドリアアンカーペプチドと標的タンパク質との間のユビキチン若しくはその断片をさらに含んでよい。真核生物細胞中のタンパク質分解酵素は、真核生物細胞中に存在するタンパク質を分解する酵素を意味する。この場合、外来のタンパク質は、タンパク質を分解する酵素によって認識されるアミノ酸配列を含んでいるので、ミトコンドリアの外膜に結合した外来のタンパク質は、アンカーペプチドと細胞中の標的タンパク質との中に単離され得る。
この場合、ユビキチン断片は配列番号７１のアミノ酸配列のＣ末端Ｇｌｙ－Ｇｌｙを含んでよく、Ｃ末端から連続的に３～７５個のアミノ酸を含んでよい。さらに、外来のタンパク質は、標的タンパク質とユビキチン又はその断片との間にリンカーをさらに含んでよい。この場合、リンカーは１～１５０個のアミノ酸からなっていてよく、１０～１００個のアミノ酸からなっていてもよく、２０～５０個のアミノ酸からなっていてもよいが、それらに限定されない。リンカーは、２０個のアミノ酸から適切に選択されるアミノ酸からなっていてよく、好ましくはグリシン及び／又はセリンからなっていてよい。リンカーの一実施形態は、グリシン及びセリンからなる５～５０個のアミノ酸からなっていてよい。リンカーの一実施形態は（Ｇ４Ｓ）ｎであってよく、ここでｎは１～１０の整数であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０であってよい。
さらに、細胞膜中に存在するリガンド又は受容体に結合する能力を有するタンパク質は、腫瘍細胞の表面上に存在するリガンド又は受容体であってよい。この場合、腫瘍細胞の表面上に存在するリガンド又は受容体は、それだけに限らないが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、黒色腫抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質２（ｔｙｒｐ２）、ブラキウリ、メソテリン、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ＥＲＢＢ２、Ｗｉｌｍｓ腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、ＦＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ－Ｌ１、ＡＣＰＰ、ＣＰＴ１Ａ、ＩＦＮＧ、ＣＤ２７４、ＦＯＬＲ１、ＥＰＣＡＭ、ＩＣＡＭ２、ＮＣＡＭ１、ＬＲＲＣ４、ＵＮＣ５Ｈ２ ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ、ネクチン－３、及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つであってよい。
さらに、細胞膜中に存在するリガンド又は受容体に結合する能力を有するタンパク質は、上の群から選択されるいずれか１つに結合する抗体又はその断片であってよい。特に、抗体の断片は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と同じＣＤＲを有する断片を意味する。具体的には、これはＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、又はこれらの組合せであってよい。
この場合、標的タンパク質は、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ、及びＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択されるいずれか１つのＣ末端領域を含むアンカーペプチドに結合していてよく、外来のタンパク質は以下の順で結合していてよい。
Ｎ末端－標的タンパク質－ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ、及びＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択されるいずれか１つのＣ末端領域を含むアンカーペプチド－Ｃ末端。
さらに、外来のタンパク質は、標的タンパク質と、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ、及びＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択されるいずれか１つのＣ末端領域との間にリンカーをさらに含んでよい。この場合、リンカーは上記の通りである。この場合、標的タンパク質、活性タンパク質、細胞中に存在するタンパク質、及び細胞膜中に存在するリガンド又は受容体に結合する能力を有するタンパク質等は、上記の通りである。
標的タンパク質の一実施形態では、特定の細胞を標的とする抗体又はその断片は、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ、及びＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択されるいずれか１つのＣ末端領域を含むアンカーペプチドに結合した形態であってよい。標的タンパク質が結合した改変されたミトコンドリオンは特定の標的に容易に導入することができ、それにより、ミトコンドリオンは特定の細胞中に効率的に進入することができる。
改変されたミトコンドリオンの一実施形態は、１つ又は複数の標的タンパク質が結合した形態であってよい。具体的には、これはｐ５３を含む標的タンパク質及び抗ＨＥＲ－２抗体又はその断片を含む標的タンパク質が結合した形態であってよい。そのような改変されたミトコンドリオンは、ＨＥＲ－２を発現しているがん細胞中にミトコンドリオンを効果的に送達することができる。さらに、がん細胞は改変されたミトコンドリオンに結合したｐ５３によって効果的に殺滅される。
改変されたミトコンドリオンの目的に応じて、１つ又は複数の活性タンパク質を含む標的タンパク質が構築され、ミトコンドリオンに結合させられる。さらに、細胞を標的とする標的タンパク質は標的とされる細胞に応じて種々の方法で構築される。
ミトコンドリア外膜を標的とするタンパク質と標的タンパク質とを含む融合タンパク質は、ミトコンドリア活性を改変する融合タンパク質と称してもよい。そのような融合タンパク質は、以下の構造のいずれか１つを有し得る。
＜構造式１＞
Ｎ末端－ミトコンドリア外膜アンカーペプチド－標的タンパク質－Ｃ末端
＜構造式２＞
Ｎ末端－ミトコンドリア外膜アンカーペプチド－ユビキチン又はその断片－標的タンパク質－Ｃ末端
＜構造式３＞
Ｎ末端－ミトコンドリア外膜標的ペプチド－リンカー１－ユビキチン又はその断片－標的タンパク質－Ｃ末端
＜構造式４＞
Ｎ末端－ミトコンドリア外膜アンカーペプチド－ユビキチン又はその断片－リンカー２－標的タンパク質－Ｃ末端
＜構造式５＞
Ｎ末端－ミトコンドリア外膜アンカーペプチド－リンカー１－ユビキチン又はその断片－リンカー－２－標的タンパク質－Ｃ末端
上記の構造式１～５において、外膜アンカーペプチドはＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０、及びＯＭ４５からなる群から選択されるタンパク質の末端配列であってよく、標的タンパク質は、ｐ５３、グランザイムＢ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＰＤＣＤ５、Ｅ２Ｆ、ＡＰ－１（Ｊｕｎ／Ｆｏｓ）、ＥＧＲ－１、網膜芽細胞腫（ＲＢ）、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、Ｅ－カドヘリン、ニューロフィブロミン－２（ＮＦ－２）、ポリ［ＡＤＰ－リボース］シンターゼ１（ＰＡＲＰ－１）、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＣＡ－２、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ＲＡＦキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ）、ｐ１６、ＫＬＦ－１０、ＬＫＢ１、ＬＨＸ６、Ｃ－ＲＡＳＳＦ、及びＤＫＫ－３ＰＤ１からなる群から選択されるいずれか１つであってよい。
この場合、リンカー１又は２は、それぞれ１～１００、１～８０、１～５０、又は１～３０個のアミノ酸からなるポリペプチドであってよく、好ましくはセリン、グリシン、又はスレオニンの単独又は組合せからなる１～３０個のアミノ酸からなるポリペプチドであってよい。さらに、リンカー１又は２は、それぞれ５～１５個のアミノ酸からなるポリペプチドであってよく、好ましくはセリン、グリシン、又はスレオニンの単独又は組合せからなる５～１５個のアミノ酸からなるポリペプチドであってよい。リンカーの一実施形態は、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号７０）であってよい。
＜構造式６＞
Ｎ末端－標的タンパク質－ミトコンドリア外膜アンカーペプチド－Ｃ末端
＜構造式７＞
Ｎ末端－標的タンパク質－ユビキチン又はその断片－ミトコンドリア外膜アンカーペプチド－Ｃ末端
＜構造式８＞
Ｎ末端－標的タンパク質－リンカー１－ユビキチン又はその断片－ミトコンドリア外膜アンカーペプチド－Ｃ末端
＜構造式９＞
Ｎ末端－標的タンパク質－ユビキチン又はその断片－リンカー２－ミトコンドリア外膜アンカーペプチド－Ｃ末端
＜構造式１０＞
Ｎ末端－標的タンパク質－リンカー１－ユビキチン又はその断片－リンカー２－ミトコンドリア外膜アンカーペプチド－Ｃ末端
上記の構造式６～１０において、外膜アンカーペプチドは、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－Ｘ、及びＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択されるタンパク質の末端配列であってよく、標的タンパク質は、ｐ５３、グランザイムＢ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＰＤＣＤ５、Ｅ２Ｆ、ＡＰ－１（Ｊｕｎ／Ｆｏｓ）、ＥＧＲ－１、網膜芽細胞腫（ＲＢ）、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、Ｅ－カドヘリン、ニューロフィブロミン－２（ＮＦ－２）、ポリ［ＡＤＰ－リボース］シンターゼ１（ＰＡＲＰ－１）、ＢＲＣＡ－１、ＢＲＣＡ－２、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ＲＡＦキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ）、ｐ１６、ＫＬＦ－１０、ＬＫＢ１、ＬＨＸ６、Ｃ－ＲＡＳＳＦ、ＤＫＫ－３ＰＤ１、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ－Ｍｙｃからなる群から選択されるいずれか１つであってよい。この場合、リンカー１又は２は上記の通りである。
医薬組成物のために、ミトコンドリオンを約０．１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約０．２μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、又は約０．５μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬの濃度で含ませてよいが、これらに限定されない。ミトコンドリアを上記の範囲に含ませることによって、投与に際してのミトコンドリアの用量調整を容易にすることができ、患者の疾患の症状の改善の程度を増強することができる。この場合、ミトコンドリアの用量は、単離されたミトコンドリアの膜タンパク質を定量することによるミトコンドリアの定量によって決定してもよい。具体的には、単離されたミトコンドリアは、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによって定量してもよい。
さらに、医薬組成物のために、ミトコンドリオンに結合する抗がん剤を０．１μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ～４５０μｇ／ｍＬ、又は０．５μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬの濃度で含ませてもよいが、これらに限定されない。抗がん剤を上記の範囲で含ませることによって、投与に際しての抗がん剤の用量調整を容易にすることができ、患者の疾患の症状の改善の程度を増強することができる。
ミトコンドリオンに結合する抗がん剤は、ミトコンドリア１μｇあたり約０．０１μｇ～１μｇ、約０．０５μｇ～０．５μｇ、又は約０．１μｇ～０．３μｇの量で含まれてよい。好ましくは、これは約０．２μｇの量で含まれてよい。
抗がん剤及びミトコンドリオンは、抗がん剤がミトコンドリオンの中に含まれるように適切な比で混合してもよい。例えば、抗がん剤とミトコンドリオンの重量比に基づく混合比は、約１：１０～約１０：１、約１：９～約９：１、約１：８～約８：１、約１：７～約７：１、約１：６～約６：１、約１：５～約５：１、約１：４～約４：１、約１：３～約３：１、約１：２～約２：１、又は約１：１の重量比であってよい。好ましくは、これは約１：５であってよい。
特に、抗がん剤はトリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）が結合した抗がん剤であってよい。
本明細書で使用される場合、用語「トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）」は親油性カチオン性化合物であり、細胞膜及びミトコンドリア膜に容易に浸透し、ミトコンドリア膜の内側に存在する負電圧（－１５０～－１７０ｍＶ）に応答してミトコンドリオンの中に直接吸収される。これらの特性により、ＴＰＰは、正常細胞と比較してミトコンドリアの膜電位に大きな相違を有するがん細胞又は心筋細胞のミトコンドリアにより多く集積するので、がん細胞、がん幹細胞、及び線維芽細胞を標的とするための材料として使用される。
この場合、その中でＴＰＰがミトコンドリオンに結合している抗がん剤は、ミトコンドリア１μｇあたり約０．０１μｇ～１μｇ、約０．０５μｇ～０．５μｇ、又は約０．１μｇ～０．３μｇの量で含まれていてよい。好ましくは、これは約０．２５μｇの量で含まれていてよい。
さらに、抗がん剤とＴＰＰが結合しているミトコンドリオンは、抗がん剤がミトコンドリオン中に含まれるように適切な量で混合してもよい。例えば、抗がん剤とＴＰＰが結合しているミトコンドリオンとの混合比は、重量比に基づいて約１：１０～約１０：１、約１：９～約９：１、約１：８～約８：１、約１：７～約７：１、約１：６～約６：１、約１：５～約５：１、約１：４～約４：１、約１：３～約３：１、約１：２～約２：１、又は約１：１の重量比であってよい。好ましくは、これは約１：４であってよい。
本明細書の一実施形態では、その中でＴＰＰがドキソルビシン（ＤＯＸ）に結合したＴＰＰ－ＤＯＸを含み、抗ＨＥＲ２抗体断片と融合したミトコンドリオン（ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）を構築し（図３０～図３２）、これを使用してがん細胞（図３３～図４３）及び腫瘍マウスモデル（図６５～図６８）において優れた抗がん活性を確認した。
さらに、ＴＰＰはＴＰＰ誘導体を含んでよい。ＴＰＰ誘導体は、２－ブテン－１，４－ビス－ＴＰＰ、２－クロロベンジル－ＴＰＰ、３－メチルベンジル－ＴＰＰ、２，４－ジクロロベンジル－ＴＰＰ、１－ナフチルメチル－ＴＰＰ、及びｐ－キシリレンビスＴＰＰ等であってよいが、これらに限定されない。さらに、ＴＰＰ誘導体はその誘導体をさらに含んでよい。例えば、これは２－ブテン－１，４－ビス－ＴＰＰの誘導体、２－クロロベンジル－ＴＰＰの誘導体、３－メチルベンジル－ＴＰＰの誘導体、２，４－ジクロロベンジル－ＴＰＰの誘導体、１－ナフチルメチル－ＴＰＰの誘導体、及びｐ－キシリレンビスＴＰＰの誘導体等であってよいが、これらに限定されない。
本発明の抗がん剤を含むミトコンドリオンを含む医薬組成物はがんの予防又は治療のためであってよく、及び／又は治療効果（効率）を増大させてもよい。この場合、ミトコンドリオン及び抗がん剤は上記の通りである。
がんは、乳がん、肺がん、膵がん、膠芽細胞腫、胃がん、肝がん、大腸がん、前立腺がん、卵巣がん、頸がん、甲状腺がん、喉頭がん、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽腫、網膜芽腫、頭頚部がん、唾液腺がん、及びリンパ腫からなる群から選択されるいずれか１つであってよいが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「予防」は、医薬組成物の投与によってがんの発症を阻止し又は遅延させる任意の行動を意味する。さらに、「治療」は、医薬組成物の投与によってがんの症状を改善し又は有益に変化させる任意の行動を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「有効性」は、ある期間、例えば１年、５年、又は１０年にわたる生存率又は無病生存率等の１つ又は複数のパラメーターによって決定され得る。さらに、パラメーターには、対象における少なくとも１つの腫瘍のサイズの阻止が含まれ得る。
生体利用効率等の薬物動態パラメーター及びクリアランス速度等の基礎的パラメーターも、有効性に影響を有し得る。したがって、「増強された有効性」（例えば有効性の改善）は増強された薬物動態パラメーター及び増強された有効性に起因すると考えられ、試験動物若しくはヒト対象におけるクリアランス速度及び腫瘍増殖を比較することによって、又は生存率、再発率、若しくは無病生存率等のパラメーターを比較することによって、測定することができる。
医薬組成物の好ましい投薬量は、患者の状態及び体重、疾患の重症度、薬物の形態、投与の経路及び期間によって変動するが、当業者によって適切に選択され得る。本発明のがんの予防又は治療のための医薬組成物において、有効成分は、これが抗がん活性を示す限り、使用、処方、組合せの目的、その他に応じて任意の量（有効量）で含まれてよい。ここで「有効量」は、抗がん効果を誘起することができる有効成分の量を意味する。そのような有効量は、当業者の通常の能力の範囲内で実験的に決定してもよい。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含んでよい。薬学的に許容できる担体は、これが対象への送達に好適な非毒性の材料である限り、任意の担体であってよい。蒸留水、アルコール、脂肪、ワックス、及び不活性固体は、担体として含まれてよい。さらに、薬学的に許容できるアジュバント（緩衝剤、分散剤）が医薬組成物中に含まれてよい。
具体的には、医薬組成物は、有効成分に加えて薬学的に許容できる担体を含めて、当技術で既知の従来の方法によって、投与の経路に従った非経口製剤として調製してもよい。ここで「薬学的に許容できる」は、これが有効成分の活性を阻害せず、適用（処方）される標的が適合できる以上の毒性を有しないことを意味する。
本発明の医薬組成物が非経口製剤として調製される場合には、これは当技術で既知の方法に従った好適な担体とともに注射剤、経皮製剤、及び経鼻吸入の形態で製剤化され得る。これが注射剤として製剤化される場合には、好適な担体として無菌水、エタノール、グリセロール若しくはプロピレングリコール等のポリオール、又はそれらの混合物を使用してもよく、リンゲル液、トリエタノールアミンを含むＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩液）、又は無菌注射用水、５％デキストロース等の等張溶液等が好ましく使用され得る。
本発明の医薬組成物は、注射可能な製剤であってよい。したがって、本発明による医薬組成物は、処方された注射剤の流通による製品安定性を保証するために、注射剤として使用される酸性水溶液又はリン酸塩等の緩衝液を使用してｐＨを調整することによって、物理的又は化学的に極めて安定な注射剤として製造することができる。
具体的には、本発明の医薬組成物は注射用水を含んでよい。注射用水は、固体注射剤を溶解するため又は水溶性注射剤を希釈するために調製された蒸留水を意味する。これは、グルコース注射剤、キシリトール注射剤、Ｄ－マンニトール注射剤、フルクトース注射剤、生理的食塩水、デキストラン４０注射剤、デキストラン７０注射剤、アミノ酸注射剤、リンゲル液、乳酸リンゲル液、又は約３．５～７．５のｐＨを有するリン酸塩緩衝液若しくはリン酸クエン酸二水素ナトリウム緩衝液であってよい。
一方、本発明の医薬組成物は、薬学的有効量で投与される。用語「治療有効量」又は「薬学的有効量」は、標的疾患を予防又は治療するために有効な化合物又は組成物の量を意味し、これは医学的治療に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で疾患を治療するために十分であり、且つ副作用を生じない量である。有効量のレベルは、患者の健康状態、疾患の型及び重症度、薬物の活性、薬物への感受性、投与方法、投与時間、投与経路及び排泄速度、投与期間、組合せ又は同時使用の薬物、及び医学分野で周知の他の因子を含む因子に従って決定され得る。一実施形態では、治療有効量はがんを治療するために有効な薬物の量を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「投与」は、所定の物質を適切な方法で対象に導入することを意味し、組成物の投与の経路は、それが標的の組織に到達する限り、任意の一般的な経路を通ってよい。これは腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、局所投与、鼻内投与、直腸内投与であってよいが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物の好ましい投薬量は、投与される対象の体重に基づいて０．０１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～４ｍｇ／ｋｇ、又は０．２５ｍｇ／ｋｇ～２．５ｍｇ／ｋｇミトコンドリアの量で一回投与してもよいが、これらに限定されない。即ち、がん組織を有する対象の体重に基づいて上記の範囲の量で抗がん剤を含む改変されたミトコンドリオンを含む医薬組成物が投与されることが、細胞活性の観点から最も好ましい。さらに、医薬組成物は、１～１０回、３～８回、又は５～６回、好ましくは５回、投与してもよい。この場合、投与間隔は１～７日又は２～５日の間隔、好ましくは３日の間隔であってよい。そのような投薬量は、いずれの態様においても本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
用語「対象」は、本発明の組成物が適用（処方）される対象を意味し、がんに罹患した対象であってよい。さらに、対象はラット、マウス、又は家畜等の、ヒトを含む哺乳動物、好ましくはヒトであってよい。本発明の組成物は、抗がん剤を含むミトコンドリオンに加えて、抗がん活性の増強及び強化のために、既に検証された抗がん活性及び安全性を有することが知られている任意の化合物又は天然の抽出物をさらに含んでよい。この場合、医薬組成物と抗がん活性を有する化合物又は天然の抽出物は、同時又は連続的に投与してもよい。
本発明の別の態様では、抗がん剤と単離されたミトコンドリオンを混合するステップを含む、抗がん剤を含むミトコンドリオンを調製する方法が提供される。この場合、抗がん剤及びミトコンドリオンは上記の通りである。
抗がん剤及びミトコンドリオンは、抗がん剤がミトコンドリオンの中に含まれるように適切な比で混合してもよい。例えば、抗がん剤とミトコンドリオンの重量比に基づく混合比は、約１：１０～約１０：１、約１：９～約９：１、約１：８～約８：１、約１：７～約７：１、約１：６～約６：１、約１：５～約５：１、約１：４～約４：１、約１：３～約３：１、約１：２～約２：１、又は約１：１の重量比であってよい。好ましくは、これは約１：５であってよい。
本発明の別の態様では、ＴＰＰが化学的に結合した改変された抗がん剤が提供される。この場合、ＴＰＰ及び抗がん剤は上記の通りである。
本発明の別の態様では、がんの予防又は治療効果の増強のための抗がん剤を含むミトコンドリオンを含む医薬組成物の使用が提供される。この場合、抗がん剤及びミトコンドリオンは上記の通りである。
本発明の別の態様では、抗がん剤を含むミトコンドリオンを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む、がんを治療する方法及び／又は治療効果を増強するための方法が提供される。この場合、抗がん剤、ミトコンドリオン、及び投与は、上記の通りである。対象はがんに罹患した対象であってよい。さらに、対象は哺乳動物、好ましくはヒトであってよい。
発明を実施するための様式
これ以降、以下の実施例によって本発明をより詳細に説明する。しかし、以下の実施例は本発明を例示することのみに対するものであり、本発明の範囲はこれに限定されない。
Ｉ．標的タンパク質が結合しているミトコンドリアの標的能力の確認
調製例１．抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリオンを含むＨＥＫ２９３細胞株の調製
ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞の中にミトコンドリアを特異的に導入するため、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体（配列番号９８）をミトコンドリアの外膜と融合させたミトコンドリアを構築した（図１及び図２）。具体的な構築方法は、韓国特許出願公開第１０－２０１９－０１２４６５６号に記載された方法に従って実施した。
実施例１．抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアの特性の確認
実施例１．１．抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体の発現の解析
上の調製例１で構築した抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）を含むＨＥＫ２９３細胞における抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖの発現レベルを確認するため、免疫細胞化学染色によって細胞を染色し、共焦点顕微鏡を使用して画像を観察した。
具体的には、ＨＥＫ２９３細胞を３×１０４細胞／ウェルで２４ウェルプレートに接種し、２４時間培養した。２４時間の培養の後、細胞をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで約３０分染色し、ＰＢＳで洗浄し、次いで３．７％ホルムアルデヒドで固定した。ホルムアルデヒドを除去し、一次抗体である抗ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ、１１６６７１４９００１）を１％ヤギ血清含有ＰＢＳ中で１：１０００希釈し、細胞を希釈液で処理して１８時間反応させた。反応が完了した後、ＰＢＳによる洗浄で一次抗体を除去し、次いでアレクサ・フルオル（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１００１）で標識した二次抗体である抗マウスＩｇＧ抗体を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１：５００希釈し、細胞を希釈液で処理して約１時間反応させた。反応が完了した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、マウントして、細胞を共焦点顕微鏡によって観察した。このとき、細胞の核をＤＡＰＩ染色によって観察した。
結果として、ミトコンドリアを標識した赤色蛍光の位置が抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体を標識した緑色蛍光の位置と一致していることが確認された（図３）。
実施例１．２．抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体の発現位置の確認
上の調製例１と同じ方法で構築した抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体がＨＥＫ２９３細胞のミトコンドリア内で発現されたか否かを確認するために、ウェスタンブロットを実施した。
具体的には、その中で抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体が発現された細胞を破壊した後、細胞抽出物を遠心分離によってミトコンドリア分画と細胞質分画に分離した。それぞれの分画を電気泳動し、ウェスタンブロットを実施した。抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖを同定するため、それぞれミトコンドリアマーカー及び細胞質マーカータンパク質である抗ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ、１１６６７１４９００１）、抗ＣＯＸ４抗体（ａｂｃａｍ、３３９８５）、及び抗βチューブリン抗体（Ｔｈｅｒｍｏ、ＭＡ５－１６３０８）を一次抗体として使用した。抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ又は抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰを二次抗体として使用した。
結果として、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体がミトコンドリア陽性マーカーとして使用したＣＯＸ４とともにミトコンドリア分画中に存在し、細胞質の陽性マーカーであるβ－チューブリンが存在する分画には存在しないことが確認された（図４）。上記実施例における免疫細胞化学染色及びウェスタンブロットの結果によって、ＨＥＫ２９３細胞のミトコンドリア中で抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体が発現されることが確認された。
実施例１．３．抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアのＡＴＰを産生する能力の測定
上の調製例１と同じ方法で構築した抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアと正常なミトコンドリアとの間の機能性の相違を比較するため、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアを発現する細胞株であるＨＥＫ２９３細胞（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）及びＨＥＫ２９３細胞からミトコンドリアを単離し、ミトコンドリアの主要な機能の１つであるＡＴＰを産生する能力を比較した。
具体的には、５μｇ／１００μＬの単離されたミトコンドリアを２５μＭのＡＤＰ及び１００μＬのルシフェリンで処理し、ミトコンドリア中で産生されるＡＴＰとルシフェリンとの反応によって生成される発光値（ＲＬＵ）を測定することによって、ＡＴＰを産生する能力を確認した。結果として、ＭＴとＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのＡＴＰを産生する能力に差異はなかった（図５）。
実施例１．４．抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアの膜電位の測定
上の調製例１と同じ方法で構築した抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアと正常なミトコンドリアとの間の機能性の相違を比較するため、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）を含むＨＥＫ２９３細胞と未処理のＨＥＫ２９３細胞（ＭＴ）の、ミトコンドリアの主要な特徴の１つである膜電位を比較した。
具体的には、細胞を３×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養した。２４時間後、細胞をＤＣＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ６８２７）色素で処理し、１時間反応させた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２４２で処理して細胞を１０分、染色した。ＤＣＦＤＡ及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２４２の蛍光値を測定し、次いでそれらの比（ＤＡＦＤＡの蛍光値／Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２４２の蛍光値）を計算することによって、膜電位を決定した。結果として、ＭＴとＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの膜電位の間に差異はなかった（図６）。
実施例１．５．抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアの反応性酸素種の測定
上の調製例１と同じ方法で構築した抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアと正常なミトコンドリアの反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生レベルを比較するため、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）を含むＨＥＫ２９３細胞と未処理のＨＥＫ２９３細胞（ＭＴ）の反応性酸素種を測定した。
具体的には、細胞を３×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養した。２４時間後、それぞれの細胞をＴＭＲＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔ６６９）色素で処理し、１時間反応させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いでＨｏｅｃｈｓｔ３３２４２で１０分、染色した。ＴＭＲＥ及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２４２の蛍光値を測定し、次いでそれらの比（ＴＭＲＥの蛍光値／Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２４２の蛍光値）を計算することによって、反応性酸素種の産生量を決定した。結果として、細胞から分離したＭＴとＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの反応性酸素種の産生量に差異はなかった（図７）。
実施例２．ヒトがん細胞株及び正常細胞株におけるＨＥＲ２発現の解析
実施例２．１．ウェスタンブロット解析によるヒトがん細胞株及び正常細胞株におけるＨＥＲ２発現の確認
ヒト乳がん、肺がん、胃がん細胞株、及び肺線維芽細胞株におけるＨＥＲ２の発現レベルを確認するため、ウェスタンブロットを実施した。
具体的には、ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、ヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、ヒト胃がん細胞株（ＭＫＮ－７４及びＮＣＩ－Ｎ８７）、及びヒト肺線維芽細胞株（ＷＩ－３８）を６ウェルプレートに約１×１０６細胞／ウェルで接種し、２４時間培養した。このとき、ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＮＣＩ－Ｎ８７細胞は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養することによって調製し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＭＫＮ－７４、及びＷＩ－３８細胞は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で培養することによって調製した。
２４時間後、培養液を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いでプロテアーゼ阻害剤を含む１００μＬのＲＩＰＡ緩衝液を細胞に直接加えた。１０分後、スクレーパーを使用して細胞を回収し、マイクロチューブに移し、次いで約１２，０００×ｇで１０分、遠心分離した。分離した上清を得て、新たなマイクロチューブに移し、次いでＢＣＡ分析によってタンパク質を定量した。各試料について同じ量のタンパク質を電気泳動し、次いでウェスタンブロットを実施した。一次抗体として抗ＨＥＲ２抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２９Ｄ８）及び抗βアクチン抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ２２０８）を使用し、二次抗体として抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ及び抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰを使用した。
結果として、ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＮＣＩ－Ｎ８７細胞は、ＨＥＲ２を発現するＨＥＲ２＋細胞であることが確認された。一方、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＭＫＮ－７４、及びＷＩ－３８細胞はＨＥＲ２発現を殆ど示さないことが見出され、これらがＨＥＲ２－細胞であることが示された（図８）。
実施例２．２．免疫細胞化学染色によるヒトがん細胞株及び正常細胞株におけるＨＥＲ２発現の確認
ヒト乳がん、肺がん、胃がん細胞株、及びヒト肺線維芽細胞株におけるＨＥＲ２の発現レベルを確認するため、抗ＨＥＲ２抗体を使用して免疫細胞化学染色を実施した。
具体的には、細胞を２４ウェルプレートにそれぞれ３×１０４細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。２４時間後、３．７％のホルムアルデヒドで細胞を固定した。ホルムアルデヒドを除去し、一次抗体である抗ＨＥＲ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１６５）を１％ヤギ血清含有ＰＢＳで１：１０００希釈し、細胞を希釈液で処理して１８時間、反応させた。ＰＢＳで洗浄して一次抗体を除去し、次いでアレクサ・フルオル（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１００８）で標識した二次抗体である抗ウサギＩｇＧ抗体を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１：５００希釈し、細胞を希釈液で処理して１時間、反応させた。反応が完了した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、マウントして共焦点顕微鏡で観察した。このとき、細胞の核をＤＡＰＩ染色によって観察した。
結果として、ＨＥＲ２＋細胞であるＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＮＣＩ－Ｎ８７細胞の場合には、ＨＥＲ２が細胞表面上に発現して緑色蛍光が観察され、ＨＥＲ２－細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＭＫＮ７４、及びＣＣＤ－８Ｌｕ細胞の場合には、緑色蛍光は観察されなかった（図９）。
実施例２．３．フローサイトメトリーによるヒトがん細胞株におけるＨＥＲ２発現の確認
ヒト乳がん、肺がん、及び胃がん細胞株におけるＨＥＲ２の発現レベルを確認するため、抗ＨＥＲ２抗体を使用してフローサイトメトリーを実施した。
具体的には、ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、ヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７及びＭＫＮ－７４）、及びヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）を６ウェルプレートにそれぞれ約１×１０６細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。２４時間後、培養液を除去し、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用した処理によって細胞を収集して、３．７％のホルムアルデヒドで固定した。一次抗体である抗ＨＥＲ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１６５）を１％ヤギ血清含有ＰＢＳで１：１０００希釈し、細胞を希釈液で処理して１８時間、反応させた。ＰＢＳを使用した洗浄によって一次抗体を除去し、次いでアレクサ・フルオル（登録商標）５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２１４２８）で標識した二次抗体である抗ウサギＩｇＧ抗体を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１：５００希釈し、細胞を希釈液で処理して１時間、反応させた。反応が完了した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメーターによってＨＥＲ２の発現を確認した。
結果として、ＨＥＲ２＋細胞であるＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＮＣＩ－Ｎ８７細胞の場合には、ＨＥＲ２が細胞表面で発現して蛍光値（ＰＥ－Ａ）が高いことが観察された一方、ＨＥＲ２－細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、及びＭＫＮ－７４細胞はＨＥＲ２＋細胞より低い蛍光値を示した（図１０）。
ウェスタンブロット解析、免疫細胞化学染色、及びフローサイトメトリーの上記の結果から、ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＮＣＩ－Ｎ８７細胞はＨＥＲ２を発現するＨＥＲ２＋細胞であり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＭＫＮ－７４、ＷＩ－３８細胞及びＣＣＤ－８Ｌｕ細胞はＨＥＲ２－細胞であることが確認された。
実施例３．抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアのＨＥＲ２標的の検証
上の調製例１と同じ方法で構築した抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアのＨＥＲ２標的能力を確認するため、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）を、共培養したＨＥＲ２＋細胞及びＨＥＲ２－細胞で処理し、次いで免疫細胞化学染色を実施した。
具体的には、ＨＥＲ２＋細胞とＨＥＲ２－細胞を一緒に２４ウェルプレートに１．５×１０４細胞／ウェルで接種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で２４時間、共培養した。このとき、ＨＥＲ２＋細胞ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＮＣＩ－Ｎ８７は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養することによって調製し、ＨＥＲ２－細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、及びＭＫＮ－７４は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で培養することによって調製した。ミトコンドリアは、未処理のＨＥＫ２９３細胞（ＭＴ）及び抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアを含むＨＥＫ２９３細胞（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）をそれぞれＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで処理し、染色されたミトコンドリアを単離することによって調製した。２４時間の共培養の後、それぞれの単離されたミトコンドリアを共培養した細胞で処理し、１２時間、反応させた（図１１）。
実施例３．１．ＨＥＲ陽性及び陰性の細胞株における抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアの位置の確認
上の実施例３と同じ方法で処理した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、３．７％のホルムアルデヒドを加えることによって室温で３０分、固定し、次いで免疫細胞化学染色を実施した。このとき、一次抗体として抗ＨＥＲ２抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２９Ｄ８）を使用し、二次抗体としてアレクサ・フルオル（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１００８）で標識した抗ウサギＩｇＧ抗体を使用した。細胞の核をＤＡＰＩ染色によって観察した。
結果として、図１２に示すように、共培養したＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋）とＮＣＩ－Ｈ１９７５（ＨＥＲ２－）細胞を未処理のＨＥＫ２９３細胞由来ミトコンドリア（ＭＴ）と処理すると、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（赤色蛍光）で染色されたミトコンドリアが、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋）細胞とＮＣＩ－Ｈ１９７５（ＨＥＲ２－）細胞で等しく観察された。一方、細胞を抗ＨＥＲ２抗体と融合したミトコンドリアを含むＨＥＫ２９３細胞から誘導されたミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）で処理すると、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで染色されたミトコンドリアがＨＥＲ２＋細胞であるＳＫ－ＢＲ－３細胞で特異的に観察された。
共培養したＢＴ－４７４（ＨＥＲ２＋）及びＮＣＩ－Ｈ１９７５（ＨＥＲ２－）細胞の場合には、ＭＴ処理群の場合に、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで染色されたミトコンドリアがＢＴ－４７４（ＨＥＲ２＋）細胞とＮＣＩ－Ｈ１９７５（ＨＥＲ２－）細胞で等しく観察された一方、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群の場合には、これらはＨＥＲ２＋細胞であるＢＴ－４７４細胞においてのみ特異的に観察された（図１３）。
共培養したＮＣＩ－Ｎ８７（ＨＥＲ２＋）及びＭＫＮ－７４（ＨＥＲ２－）細胞の場合には、ＭＴ処理群の場合にＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで染色されたミトコンドリアがＮＣＩ－Ｎ８７（ＨＥＲ２＋）細胞とＭＫＮ－７４（ＨＥＲ２－）細胞で等しく観察された一方、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群の場合には、これらはＨＥＲ２＋細胞であるＮＣＩ－Ｎ８７においてのみ特異的に観察された（図１４）。
共培養したＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＥＲ２－）細胞の場合には、ＭＴ処理群の場合にＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで染色されたミトコンドリアがＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋）細胞とＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＥＲ２－）細胞で等しく観察された一方、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群の場合には、これらはＨＥＲ２＋細胞であるＳＫ－ＢＲ－３細胞においてのみ特異的に観察された（図１５）。
共培養したＢＴ－４７４（ＨＥＲ２＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＥＲ２－）細胞の場合には、ＭＴ処理群の場合にＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで染色されたミトコンドリアがＢＴ－４７４（ＨＥＲ２＋）細胞とＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＥＲ２－）細胞で等しく観察された一方、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群の場合には、これらはＨＥＲ２＋細胞であるＢＴ－４７４細胞においてのみ特異的に観察された（図１６）。
これらの結果から、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）が、ＨＥＲ２抗原を発現するＨＥＲ２＋細胞を特異的に標的とし得ることが確認された。
ＩＩ．抗がん剤を含み、標的タンパク質が結合しているミトコンドリアの調製及びそれらの活性の確認
調製例２．抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアとドキソルビシンとの複合体の調製
抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアを含むＨＥＫ２９３細胞をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーンで処理し、ミトコンドリアを染色（緑色蛍光）し、次いでミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）を単離した。単離したミトコンドリア３０μｇを１００μＭのドキソルビシン（ＤＯＸ）と４℃で１０分、反応させ、次いで約１２，０００×ｇで１０分、遠心分離して、未反応のドキソルビシンを除去した。その後、これらを５００μＬのＳＨＥ（２５０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、２ｍＭのＥＧＴＡ）緩衝液で２回洗浄して、最終的にドキソルビシンを含むミトコンドリア（ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）を得た（図１７）。
実施例４．がん細胞に対するＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの抗がん活性の評価
実施例４．１．がん細胞へのＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの送達特性の確認
ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）及びヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）を、それぞれ上の調製例２と同じ方法で得られたＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理し、次いで細胞を共焦点顕微鏡で観察した。このとき、細胞の核をＤＡＰＩ染色によって観察した。
結果として、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーンで染色したミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ、緑色蛍光）が細胞質で観察され、赤色蛍光を示すドキソルビシン（ＤＯＸ）が核で観察された（図１８）。上記の結果から、細胞内に輸送されたＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのドキソルビシンが核に移動し、核のＤＮＡ中に位置していることが見出された。
実施例４．２．ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理によるがん細胞中の形態変化の確認
ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）を、それぞれ上の調製例２と同じ方法で得られたＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理し、次いで経時的ながん細胞の形態変化を共焦点顕微鏡で観察した。このとき、細胞の核をＤＡＰＩ染色によって観察した。
結果として、ドキソルビシン（ＤＯＸ、赤色蛍光）の大部分はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ（黄色蛍光）との６時間の処理の後でミトコンドリア（緑色蛍光）とともに存在していることが観察された。しかし、ドキソルビシンは経時的に核内で観察され、細胞内の形態変化がＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖとの７２時間の処理の後で顕著に観察された（図１９）。
実施例４．３．ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖに結合したドキソルビシンの濃度の決定
上の調製例２と同じ方法で得られたＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖに結合したドキソルビシンの濃度を定量するため、ドキソルビシンのそれぞれの濃度についての吸光度を測定することによって標準曲線を準備し、次いでＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖに結合したドキソルビシンの濃度を計算した。
具体的には、それぞれ１００μＬの２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、及び０μＭの濃度のドキソルビシン溶液並びにＰＢＳで１／２０希釈したＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを９６ウェルプレートに分注した。その後、吸光度（発光波長５９０ｎｍ）をマルチリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｅ ＨＴＸ）によって測定した。ドキソルビシンの濃度による吸光度値を使用して標準曲線を準備し、次いでＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ希釈溶液の吸光度値を代入することによって、ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖに結合したドキソルビシンの濃度を決定した（図２０）。
実施例４．４．それぞれの濃度についてのＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理によるがん細胞増殖阻害能力の確認
２００μｇのＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及び１００μＭのドキソルビシン（ＤＯＸ）を使用して上の調製例２と同じ方法で得られたＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの抗がん活性を確認するため、ヒト乳がん、肺がん、及び胃がんの細胞株のＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理による細胞増殖阻害効果を評価した。
具体的には、ヒト乳がん（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、肺がん（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、及び胃がん（ＮＣＩ－Ｎ８７及びＭＫＮ－７４）細胞株を９６ウェルプレートにそれぞれ約３×１０３細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。このとき、ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＮＣＩ－Ｎ８７細胞は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、及びＭＫＮ－７４細胞は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で培養した。２４時間の培養の後、各細胞を、２μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ、０．１μＭ、０．０５μＭ、０．０２５μＭ、及び０．０１μＭの濃度のドキソルビシン（ＤＯＸ）又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理した。１４４時間の試料処理の後、細胞増殖をＷＳＴ－１アッセイによって測定した。
結果として、図２１に示すように、未処理群（ＮＣ）に対し、細胞増殖阻害効果はミトコンドリアのみで処理した群（ＭＴ）では観察されなかった。一方、ＤＯＸ処理群及びＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群では、がん細胞増殖は濃度依存的に阻害された。特に、１μＭのＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理した場合は、細胞増殖は未処理群と比較してがん細胞株に応じて約６０％～９０％阻害されることが確認された（図２１）。
実施例４．５．正常細胞における各濃度についてのＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理による増殖阻害能力の確認
２００μｇのＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及び１００μＭのドキソルビシン（ＤＯＸ）を上の調製例２と同じ方法で反応させた。得られたＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの正常細胞における細胞増殖に対する影響を確認するため、ヒト肺線維芽細胞におけるＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理による細胞増殖阻害効果を評価した。
具体的には、ヒト肺線維芽細胞株ＷＩ－３８及びＣＣＤ－８Ｌｕを９６ウェルプレートにそれぞれ約３×１０３細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。このとき、ＷＩ－３８及びＣＣＤ－８Ｌｕは１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で培養した。２４時間の培養の後、各細胞を、２μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ、０．１μＭ、０．０５μＭ、０．０２５μＭ、及び０．０１μＭの濃度のドキソルビシン（ＤＯＸ）又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理した。１４４時間の試料処理の後、細胞増殖をＷＳＴ－１アッセイによって測定した。
結果として、図２２に示すように、未処理群（ＮＣ）に対し、細胞増殖阻害効果はミトコンドリアのみで処理した群（ＭＴ）では観察されなかった。さらに、ＤＯＸ処理群及びＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群では、細胞増殖阻害能力はがん細胞に対する細胞増殖阻害効果より弱いことが確認された。
実施例４．６．がん細胞及び正常細胞におけるＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理によるＩＣ５０値の解析
実施例４．４及び実施例４．５における各濃度についてのＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの細胞増殖阻害効果に基づいて、各ウェルにおけるＩＣ５０値を解析し、図２３に示す。
実施例４．７．がん細胞及び正常細胞におけるＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理による増殖阻害能力の比較
２００μｇのＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及び１００μＭのドキソルビシン（ＤＯＸ）を上の調製例２と同じ方法で反応させた。得られたＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのがん細胞及び正常細胞の細胞増殖に対する影響を比較するため、ヒト乳がん、肺がん、胃がん細胞株、及び肺線維芽細胞株における同じ濃度のＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後で、細胞増殖阻害能力を測定した。
具体的には、ヒト乳がん（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、肺がん（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、胃がん（ＭＫＮ－７４及びＮＣＩ－Ｎ８７）細胞株及び肺線維芽細胞株（ＣＣＤ－８Ｌｕ及びＷＩ－３８）を９６ウェルプレートにそれぞれ３×１０３細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。このとき、ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＮＣＩ－Ｎ８７細胞は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＭＫＮ－７４、ＣＣＤ－８Ｌｕ、及びＷＩ－３８細胞は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養した。２４時間の培養の後、細胞をそれぞれ０．５μＭのドキソルビシン（ＤＯＸ）又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理し、１４４時間後に細胞増殖阻害能力をＷＳＴ－１アッセイによって評価した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）をＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの陰性対照として使用した。Ｇｒａｐｈｐａｄ ５．０ソフトウェアを使用して統計処理を行ない、一方向ＡＮＯＶＡ（Ｔｕｒｋｅｙ）検定によってｐ値を測定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１）。
結果として、図２４に示すように、がん細胞及び正常細胞における未処理群（ＮＣ）に対し、細胞増殖阻害効果はミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）では観察されなかった。ＤＯＸ処理群及びＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群では、細胞増殖阻害効果はがん細胞における未処理群と比較して約５０％～８０％又はそれ以上高いことが示された一方、細胞増殖阻害効果は正常細胞において約２５％又はそれより低いことが示された。
実施例４．８．ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理によるがん細胞のアポトーシスのＴＵＮＥＬアッセイによる確認
がん細胞における上の調製例２と同じ方法で得られたＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのアポトーシス誘起活性を確認するため、ヒト乳がん細胞及び胃がん細胞株におけるＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後、ＴＵＮＥＬアッセイを実施した。
具体的には、ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）を２４ウェルプレートに約３×１０４細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。２４時間の培養の後、細胞をＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ又は１μＭのＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理し、４８時間後にＴＵＮＥＬアッセイを実施してアポトーシスを確認した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）をＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの対照群として使用した。細胞の核をＤＡＰＩ染色によって観察した。
結果として、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）ではアポトーシス（緑色蛍光）は殆ど観察されなかった。しかし、ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群の細胞核ではアポトーシスの増大が確認された。上記の結果から、ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理によってアポトーシスが誘起されることが確認された（図２５）。
実施例４．９．ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理によるがん細胞のアポトーシスのウェスタンブロット解析による確認
がん細胞における上の調製例２と同じ方法で得られたＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのアポトーシス効果を確認するため、ヒト乳がん細胞株におけるＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後、アポトーシスマーカーに対する抗体を使用してウェスタンブロットを実施した。
具体的には、ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）を６ウェルプレートにそれぞれ約５×１０６細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。２４時間の培養の後、細胞をそれぞれＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理し、９６時間後に細胞を溶解し、タンパク質を抽出して、ウェスタンブロットを実施した。抗切断ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４１Ｓ）、抗切断カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６４Ｓ）、抗ホスホ－ｐ５３抗体（ＡＢｃｌｏｎａｌ、ＡＰ０７６２）、及び抗βアクチン抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ２２２８）を一次抗体として使用した。抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ又は抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰを二次抗体として使用した。タンパク質の量は、βアクチンタンパク質の発現レベルによって補正した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）をＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの陰性対照として使用した。
結果として、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）において、未処理群（処理なし）と同様に、アポトーシスの間に観察されるＰＡＲＰ及びカスパーゼ３の切断型は観察されず、ｐ５３のリン酸化型も観察されなかった。一方、ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群においては、リン酸化ｐ５３並びにＰＡＲＰ及びカスパーゼ３の切断型の発現が観察された（図２６）。上記の結果から、ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理によってアポトーシスが誘起されることが確認された。
実施例４．１０．ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによるがん細胞のアポトーシスのフローサイトメトリーによる確認
がん細胞における上の調製例２と同じ方法で得られたＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによるアポトーシス効果を確認するため、ヒト乳がん細胞及び胃がん細胞株におけるＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後、アネキシンＶ／ＰＩを使用する染色によってフローサイトメトリーを実施した。
具体的には、ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）を６ウェルプレートにそれぞれ５×１０６細胞で接種して２４時間培養した。２４時間の培養の後、細胞をＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ又は１μＭのＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理した。９６時間の処理の後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用する処理によって得た。得られた細胞を遠心分離し、次いでＰＢＳで洗浄して、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを除去した。その後、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ染色キット（Ｒｏｃｈｅ、１１９８８５４９００１）を使用して細胞を１０分染色し、染色した細胞を、ＦＡＣＳ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ）を使用して解析した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）をＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの陰性対照として使用した。
結果として、未処理群（ＮＣ）に対し、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）ではアネキシンＶ／ＰＩ値に変化は観察されなかった。一方、アネキシンＶ／ＰＩ値はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群で増大した（図２７）。上記の結果から、ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理によってアポトーシスが誘起されることが確認された。
実施例４．１１．ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのＨＥＲ２発現細胞選択的アポトーシス誘起活性の評価
上の調製例２と同じ方法で得られたＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによるＨＥＲ２選択的アポトーシス誘起効果を確認するため、共培養したＨＥＲ２＋がん細胞及びＨＥＲ２－正常細胞をＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによって処理し、次いでＴＵＮＥＬアッセイ及び免疫細胞化学染色を実施した。
具体的には、ヒト乳がん細胞株ＢＴ－４７４（ＨＥＲ２＋）及びヒト肺線維芽細胞株ＷＩ－３８（ＨＥＲ２－）を一緒に２４ウェルプレートに３×１０４細胞／ウェルで接種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で２４時間、共培養した。このとき、ＢＴ－４７４細胞は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養することによって調製し、ＷＩ－３８細胞は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で培養することによって調製した。２４時間の培養の後、共培養した細胞を１μＭのＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理し、さらに４８時間、培養した。アポトーシスはＴＵＮＥＬアッセイ及び免疫細胞化学染色によって評価した（図２８）。
実施例４．１２．ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのＨＥＲ２発現細胞選択的アポトーシス誘起活性のＴＵＮＥＬアッセイによる確認
上の実施例４．１１と同じ方法で処理した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで３．７％のホルムアルデヒドを室温、３０分で加えることによって固定した。その後、抗ＨＥＲ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１６５）を一次抗体として使用し、アレクサ・フルオル（登録商標）５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２１４２８）で標識した抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として使用して、ＨＥＲ２＋細胞を赤色蛍光で標識した。その後、細胞をＴＵＮＥＬ溶液で３０分、染色し、アポトーシスが生じている細胞を緑色蛍光で標識してマウントし、細胞を共焦点顕微鏡で観察した。このとき、細胞の核をＤＡＰＩ染色によって観察した。
結果として、強い緑色の蛍光が、ＨＥＲ２＋がん細胞であるＢＴ－４７４細胞（白色矢印）においてのみ選択的に観察された（図２９）。上記の結果から、ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによるアポトーシスがＨＥＲ２の発現の有無に応じて選択的に誘起されることが確認された。
調製例３．トリフェニルホスホニウム－ドキソルビシンが結合した化合物の調製
単離されたミトコンドリアの中に抗がん剤ドキソルビシン（ＤＯＸ）を効率的に送達するため、ミトコンドリアを標的とすることができる化合物をドキソルビシンと融合させた。最も代表的なミトコンドリア標的化合物はトリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）であり、“Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｖｉａ Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ＭＤＡ－ＭＢ－４３５／ＤＯＸ Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１１（８），２６４０－２６４９）で知られている方法を使用して、図３０に示すように、ＴＰＰが結合する抗がん剤を反応させて、ＴＰＰ－ドキソルビシン（ＴＰＰ－ＤＯＸ）を調製した。この化合物がＴＰＰ－ドキソルビシンであることが、この化合物のＭＲＩ解析によって確認された（図３１）。
調製例４．ミトコンドリア－ＴＰＰとドキソルビシンの複合体の調製
その中で抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体が発現しているＨＥＫ２９３細胞をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーンで処理してミトコンドリアを染色し、次いでミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）を単離した。その後、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体と融合した３０μｇのミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）を１００μＭのＴＰＰ－ドキソルビシンと４℃で１０分、反応させ、次いで約１２，０００×ｇで１０分、遠心分離して未反応のＴＰＰ－ドキソルビシンを除去した。反応生成物を５００μＬのＳＨＥ（２５０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、２ｍＭのＥＧＴＡ）緩衝液で２回洗浄して、最終的にＴＰＰ－ドキソルビシンを含むミトコンドリア（ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴαＨＥＲ２ｓｃＦｖを得た（図３２）。
実施例５．ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのがん細胞に対する抗がん活性の評価
実施例５．１．ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのがん細胞への送達特性の確認
ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）及びヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）を、それぞれ上の調製例４と同じ方法で得たＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理し、次いで細胞を共焦点顕微鏡によって観察した。このとき、細胞の核をＤＡＰＩ染色によって観察した。
結果として、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーンで染色したミトコンドリア（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）及び赤色蛍光を示すドキソルビシン（ＴＰＰ－ＤＯＸ）は細胞質中の同じ位置で観察された（図３３）。上記の結果から、ＴＰＰ－ＤＯＸとＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによって輸送されたＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの両方が細胞質中に存在していることが確認された。
実施例５．２．ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用した処理によるがん細胞の形態変化の確認
ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）を、それぞれ上の調製例４と同じ方法で得られたＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによって処理し、次いで経時的ながん細胞の形態変化を共焦点顕微鏡で観察した。このとき、細胞の核をＤＡＰＩ染色によって観察した。
結果として、ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ（黄色蛍光）による処理の１２時間後にＴＰＰ－ＤＯＸ（赤色蛍光）の大部分がミトコンドリア（緑色蛍光）の中にともに存在していることが確認された。しかし、ＴＰＰ－ＤＯＸは核内に経時的に観察され、ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の７２時間後に、顕著な細胞の形態変化が観察された（図３４）。
実施例５．３．それぞれの濃度についてのＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理によるがん細胞増殖阻害能力の確認
上の調製例４と同じ方法で得られたＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの抗がん活性を確認するため、ヒト乳がん、肺がん、及び胃がんの細胞株をＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理することによる細胞増殖阻害効果を評価した。
具体的には、ヒト乳がん（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、肺がん、（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、及び胃がん（ＮＣＩ－Ｎ８７及びＭＫＮ－７４）の細胞株を９６ウェルプレートにそれぞれ約３×１０３細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。このとき、ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で培養し、ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）及びヒト胃がん細胞株ＭＫＮ－７４は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で培養した。２４時間の培養の後、各細胞を２μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ、０．１μＭ、０．０５μＭ、０．０２５μＭ、及び０．０１μＭの濃度のＴＰＰ－ＤＯＸ又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理した。試料処理の１４４時間後に、細胞増殖をＷＳＴ－１アッセイによって測定した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴ、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）をＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの陰性対照として使用した。
結果として、図３５に示すように、未処理群（ＮＣ）に対し、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴ）では細胞増殖阻害効果は見られなかった。一方、ＴＰＰ－ＤＯＸ処理群及びＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群では、がん細胞の増殖は濃度依存的に阻害された。特に、１μＭのＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理した場合に、細胞増殖ががん細胞株に応じて未処理群と比較して約６０％～７０％阻害されることが確認された。
実施例５．４．正常細胞におけるそれぞれの濃度についてのＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理による増殖阻害能力の確認
上の調製例４と同じ方法で得られたＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの正常細胞における細胞増殖に対する影響を確認するため、ヒト肺線維芽細胞をＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理した後の細胞増殖阻害効果を評価した。
具体的には、ヒト肺線維芽細胞株ＷＩ－３８及びＣＣＤ－８Ｌｕを９６ウェルプレートにそれぞれ約３×１０３細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。このとき、ＷＩ－３８及びＣＣＤ－８Ｌｕは１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養した。２４時間の培養の後、各細胞を２μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ、０．１μＭ、０．０５μＭ、０．０２５μＭ、及び０．０１μＭの濃度のＴＰＰ－ＤＯＸ又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理した。１４４時間の試料処理の後、細胞増殖をＷＳＴ－１アッセイによって測定した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴ、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）をＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの陰性対照として使用した。
結果として、図３６に示すように、未処理群（ＮＣ）に対し、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴ）において細胞増殖阻害効果は観察されなかった。さらに、ＴＰＰ－ＤＯＸ処理群及びＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群において、細胞増殖阻害能力はがん細胞に対する細胞増殖阻害能力より小さいことが確認された。
実施例５．５．がん細胞及び正常細胞におけるＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理によるＩＣ５０値の解析
実施例５．３及び実施例５．４における各濃度についてのＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの細胞増殖阻害の結果に基づいて、各細胞におけるＩＣ５０値を解析し、図３７に示す。
実施例５．６．がん細胞及び正常細胞におけるＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理による増殖阻害能力の比較
上の調製例４と同じ方法で得られたＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのがん細胞及び正常細胞における細胞増殖に対する影響を比較するため、ヒト乳がん、肺がん、胃がん細胞株、及び肺線維芽細胞株における同じ濃度のＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後で、細胞増殖阻害能力を測定した。
具体的には、ヒト乳がん（ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、肺がん（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、胃がん（ＭＫＮ－７４及びＮＣＩ－Ｎ８７）細胞株及び肺線維芽細胞株（ＣＣＤ－８Ｌｕ及びＷＩ－３８）を９６ウェルプレートにそれぞれ約３×１０３細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。このとき、ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、及びＮＣＩ－Ｎ８７細胞は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＭＫＮ－７４、ＣＣＤ－８Ｌｕ、及びＷＩ－３８細胞は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で培養した。２４時間の培養の後、細胞をそれぞれ０．５μＭのＴＰＰ－ＤＯＸ又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理し、１４４時間後に細胞増殖阻害能力をＷＳＴ－１アッセイによって評価した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）をＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの陰性対照として使用した。統計処理はＧｒａｐｈｐａｄ ５．０ソフトウェアを使用して実施し、一方向ＡＮＯＶＡ（Ｔｕｒｋｅｙ）検定によってｐ値を測定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１）。
結果として、図３８に示すように、がん細胞及び正常細胞における未処理群（ＮＣ）に対し、細胞増殖阻害効果はミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）では観察されなかった。ＴＰＰ－ＤＯＸのみの処理群及びＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群の場合には、がん細胞における未処理群と比較して約６０％～７５％又はそれ以上高い細胞増殖阻害効果が示された。しかし、正常細胞ではがん細胞と異なって増殖阻害能力は弱いことが確認された。
実施例５．７．ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによるがん細胞アポトーシスのＴＵＮＥＬアッセイによる確認
がん細胞における上の調製例４と同じ方法で得られたＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのアポトーシス誘起活性を確認するため、ヒト乳がん及び胃がん細胞株におけるＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後で、ＴＵＮＥＬアッセイを実施した。
具体的には、ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）を２４ウェルプレートにそれぞれ約３×１０４細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。２４時間の培養の後、細胞をＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ又は１μＭのＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理し、４８時間後にＴＵＮＥＬアッセイを実施してアポトーシスを確認した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）をＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの対照群として使用した。細胞の核をＤＡＰＩ染色によって観察した。
結果として、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）ではアポトーシス（緑色蛍光）は殆ど観察されなかった。しかし、ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群の細胞核ではアポトーシスの増大が観察された。上記の結果から、ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理によってアポトーシスが誘起されることが確認された（図３９）。
実施例５．８．ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理によるがん細胞のアポトーシスのウェスタンブロット解析による確認
がん細胞における上の調製例４と同じ方法で得られたＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理によるアポトーシス効果を確認するため、ヒト乳がん及び胃がん細胞株におけるＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後で、アポトーシスマーカーに対する抗体を使用してウェスタンブロットを実施した。
具体的には、ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）を６ウェルプレートにそれぞれ約５×１０６細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。２４時間の培養の後、細胞をそれぞれＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ又は１μＭのＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理し、９６時間後に細胞を破壊してタンパク質を抽出し、ウェスタンブロットを実施した。抗切断ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４１Ｓ）、抗切断カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６４Ｓ）、抗ホスホ－ｐ５３抗体（ＡＢｃｌｏｎａｌ、ＡＰ０７６２）、及び抗βアクチン抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ２２２８）を一次抗体として使用した。抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ又は抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰを二次抗体として使用した。タンパク質の量は、βアクチンタンパク質の発現レベルによって補正した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）をＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの対照群として使用した。
結果として、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）において、未処理群（処理なし）と同様に、アポトーシスの間に観察されるＰＡＲＰ及びカスパーゼ３の切断型は観察されず、ｐ５３のリン酸化型も観察されなかった。一方、ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群においては、リン酸化ｐ５３並びにＰＡＲＰ及びカスパーゼ３の切断型の発現が観察された（図４０）。上記の結果から、ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理によってアポトーシスが誘起されることが確認された。
実施例５．９．ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理によるがん細胞のアポトーシスのフローサイトメトリーによる確認
がん細胞における上の調製例４と同じ方法で得られたＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理によるアポトーシス効果を確認するため、ヒト乳がん及び胃がん細胞株におけるＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによる処理の後で、アネキシンＶ／ＰＬを使用する染色によるフローサイトメトリーを実施した。
具体的には、ヒト乳がん細胞株（ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４）及びヒト胃がん細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７）を６ウェルプレートにそれぞれ約５×１０６細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。２４時間の培養の後、細胞をＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ又は１μＭのＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理した。９６時間後に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用する処理によって得た。得られた細胞を遠心分離し、次いでＰＢＳで洗浄して０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを除去した。その後、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ染色キット（Ｒｏｃｈｅ、１１９８８５４９００１）を使用して細胞を１０分、染色し、染色した細胞を、ＦＡＣＳ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ）を使用して解析した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）をＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの陰性対照として使用した。
結果として、未処理群（ＮＣ）に対し、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）ではアネキシンＶ／ＰＩ値の変化は観察されなかった。一方、ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処理群ではアネキシンＶ／ＰＩ値が増大した（図４１）。上記の結果から、ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを使用する処理によってアポトーシスが誘起されることが確認された。
実施例５．１０．ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのＨＥＲ２発現細胞選択的アポトーシス誘起活性の評価
上の調製例４と同じ方法で得られたＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖのＨＥＲ２選択的アポトーシス誘起効果を確認するため、共培養したＨＥＲ２＋がん細胞及びＨＥＲ２－正常細胞をＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理し、次いでＴＵＮＥＬアッセイ及び免疫細胞化学染色を実施した。
具体的には、ヒト乳がん細胞株ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋）及びヒト肺線維芽細胞株ＣＣＤ－８Ｌｕ（ＨＥＲ２－）を一緒に２４ウェルプレートに３×１０４細胞／ウェルで接種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で２４時間、共培養した。このとき、ＳＫ－ＢＲ－３細胞は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養することによって調製し、ＷＩ－３８細胞は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で培養することによって調製した。２４時間の培養の後、共培養した細胞を１μＭのＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで処理し、さらに４８時間培養した。アポトーシスはＴＵＮＥＬアッセイ及び免疫細胞化学染色によって評価した（図４２）。
実施例５．１１．ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによるＨＥＲ２発現細胞選択的アポトーシス誘起活性のＴＵＮＥＬアッセイによる確認
上記の実施例５．１０と同じ方法で処理した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで３．７％のホルムアルデヒドを室温で３０分、加えることによって固定した。その後、抗ＨＥＲ２抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２９Ｄ８）を一次抗体として使用し、アレクサ・フルオル（登録商標）５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２１４２８）を二次抗体として使用して、ＨＥＲ２＋細胞を赤色蛍光で標識した。その後、細胞をＴＵＮＥＬ溶液で３０分、染色し、アポトーシスが生じた細胞を緑色蛍光で標識してマウントし、細胞を共焦点顕微鏡によって観察した。このとき、細胞の核をＤＡＰＩ染色によって観察した。
結果として、強い緑色蛍光がＨＥＲ２＋細胞であるＳＫ－ＢＲ－３細胞のみで選択的に観察された（白色矢印）（図４３）。上記の結果から、ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖによるアポトーシスがＨＥＲ２の発現の有無に応じて選択的に誘起されることが確認された。
調製例５．抗ＰＤＬ１ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアを含むＨＥＫ２９３細胞株の調製
ＰＤＬ１を発現する腫瘍細胞中にミトコンドリアを特異的に導入するため、ＰＤＬ１に特異的に結合する抗ＰＤＬ１ｓｃＦｖ抗体（配列番号９４）がミトコンドリアの外膜と融合したミトコンドリアを構築した（図４４及び図４５）。具体的な構築法は、韓国特許出願公開第１０－２０１９－０１２４６５６号に記載された方法に従って実施した。
実施例６．ヒトがん細胞株におけるＰＤＬ１発現のウェスタンブロット解析による解析
ヒト膵がん細胞株（ＢＸＰＣ－３及びＣＦＰＡＣ－１）及びヒト胃がん細胞株（ＳＮＵ－２１６及びＳＮＵ－４８４）におけるＰＤＬ１の発現レベルを確認するため、ウェスタンブロットを実施した。
具体的には、ヒト膵がん細胞株（ＢＸＰＣ－３及びＣＦＰＡＣ－１）及びヒト胃がん細胞株（ＳＮＵ－２１６及びＳＮＵ－４８４）を６ウェルプレートに約１×１０６細胞／ウェルで接種し、次いで１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で２４時間、培養した。２４時間後、培養液を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いでプロテアーゼ阻害剤を含む１００μＬのＲＩＰＡ緩衝液を細胞に直接加えた。１０分後、スクレーパーを使用して細胞を回収し、マイクロチューブに移し、次いで約１２，０００×ｇで１０分、遠心分離した。分離した上清を得て新たなマイクロチューブに移し、次いでＢＣＡ解析によってタンパク質を定量した。各試料について同じ量のタンパク質を電気泳動し、次いでウェスタンブロットを実施した。抗ＰＤＬ１抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１３６８４）及び抗βチューブリン抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＭＡ５－１６３０８）を一次抗体として使用し、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ抗体又は抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ抗体を二次抗体として使用した。
結果として、図４６に示すように、ＢＸＰＣ－３及びＳＮＵ－２１６細胞がＰＤＬ１を発現するＰＤＬ１＋細胞であることが確認された。一方、ＣＦＰＡＣ－１及びＳＮＵ－４８４細胞はＰＤＬ１発現を殆ど示さないことが確認され、これらがＰＤＬ１－細胞であることが示された。
実施例７．抗ＰＤＬ１ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアのＰＤＬ１標的の検証
上の調製例５で構築した抗ＰＤＬ１ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアのＰＤＬ１標的能力を確認するため、抗ＰＤＬ１ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリア（ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ）を、共培養したＰＤＬ１＋細胞及びＰＤＬ１－細胞と処理し、次いで免疫細胞化学染色を実施した。
具体的には、ＢＸＰＣ－３（ＰＤＬ１＋）及びＣＦＰＡＣ－１（ＰＤＬ１－）、又はＳＮＵ－２１６（ＰＤＬ１＋）及びＳＮＵ－４８４（ＰＤＬ１－）を一緒に２４ウェルプレートに１．５×１０４細胞／ウェルで接種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で２４時間、共培養した。試料として使用するミトコンドリアは、未処理のＨＥＫ２９３細胞（ＭＴ）及び抗ＰＤＬ１ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアを含むＨＥＫ２９３細胞（ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ）をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで処理してミトコンドリアを染色し、次いでミトコンドリアを単離することによって調製した。２４時間の共培養の後、それぞれの単離されたミトコンドリオンを、共培養した細胞と処理し、２４時間反応させた（図４７）。
実施例７．１．ＰＤＬ１陽性及び陰性の細胞株における抗ＰＤＬ１ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアの位置の確認
上の実施例４と同じ方法で処理した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドを加えることによって室温で３０分、固定し、次いで免疫細胞化学染色を実施した。このとき、抗ＰＤＬ１抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、８６７４４）を一次抗体として使用し、アレクサ・フルオル４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を二次抗体として使用した。細胞の核をＤＡＰＩ染色によって観察した。
結果として、図４８に示すように、共培養したＢＸＰＣ－３（ＰＤＬ１＋）及びＣＦＰＡＣ－１（ＰＤＬ１－）細胞を未処理のＨＥＫ２９３細胞由来ミトコンドリア（ＭＴ）で処理した場合には、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（赤色蛍光）で染色されたミトコンドリアがＢＸＰＣ－３（ＰＤＬ１＋）及びＣＦＰＡＣ－１（ＰＤＬ１－）細胞で等しく観察された。一方、抗ＰＤＬ１ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアを含むＨＥＫ２９３細胞から誘導されたミトコンドリア（ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ）で細胞を処理した場合には、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで染色されたミトコンドリアがＰＤＬ１＋細胞であるＢＸＰＣ－３細胞で特異的に観察された。
さらに、同じように、共培養したＳＮＵ－２１６（ＰＤＬ１＋）及びＳＮＵ－４８４（ＰＤＬ１－）細胞の場合、ＭＴ処理群の場合には、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで染色されたミトコンドリアがＰＤＬ１＋（ＳＮＵ－２１６）及びＳＮＵ－４８４（ＰＤＬ１－）細胞で等しく観察された一方、ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ処理群の場合には、これらはＰＤＬ１＋細胞であるＳＮＵ－２１６細胞においてのみ特異的に観察された。上記の結果から、抗ＰＤＬ１ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアがＰＤＬ１抗原を発現する細胞を特異的に標的とすることが見出された。
調製例６．抗ＰＤＬ１ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアとドキソルビシンとの複合体の調製
抗ＰＤＬ１ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアを含むＨＥＫ２９３細胞から単離した３０μｇのミトコンドリア（ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ）を１００μＭのドキソルビシン（ＤＯＸ）と４℃で１０分、反応させ、次いで約１２，０００×ｇで１０分、遠心分離して未反応のドキソルビシンを除去した。その後、細胞を５００μＬのＳＨＥ（２５０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、２ｍＭのＥＧＴＡ）緩衝液で２回洗浄して最終的にドキソルビシンを含むミトコンドリア（ＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ）を得た（図４９）。
実施例８．がん細胞に対するＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖの抗がん活性の評価
実施例８．１．それぞれの濃度についてのＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖを使用する処理による細胞増殖阻害能力の確認
上の調製例６と同じ方法で得られたＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖの抗がん活性を確認するため、ヒト膵がん及び胃がんの細胞株をＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖで処理した後、細胞増殖阻害効果を評価した。
具体的には、ヒト膵がん細胞株（ＢＸＰＣ－３及びＣＦＰＡＣ－１）及びヒト胃がん細胞株（ＳＮＵ－２１６及びＳＮＵ－４８４）を９６ウェルプレートに約５×１０３細胞／ウェルで接種して、２４時間培養した。２４時間の培養の後、各細胞を０．０１μＭ、０．０２５μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、及び１μＭの濃度のＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖで処理した。細胞増殖は、試料処理の後、１６８時間まで２４時間ごとにＷＳＴ－１アッセイによって測定した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ）をＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖの陰性対照として使用した。
結果として、未処理（ＮＣ）群については、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ）では細胞増殖阻害効果は観察されなかった。一方、ＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ処理群では、がん細胞の増殖は濃度依存的に長期にわたって阻害された（図５０）。
実施例８．２．ＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖによるがん細胞のアポトーシスのウェスタンブロット解析による確認
がん細胞におけるＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖによるアポトーシス効果を確認するため、ヒト膵がん及び胃がんの細胞株におけるＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖによる処理の後、アポトーシスマーカーに対する抗体を使用してウェスタンブロットを実施した。
具体的には、ヒト膵がん細胞株（ＢＸＰＣ－３及びＣＦＰＡＣ－１）及びヒト胃がん細胞株（ＳＮＵ－２１６及びＳＮＵ－４８４）をそれぞれ５×１０６細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。
２４時間の培養の後、細胞をそれぞれＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖによって処理し、９６時間後に細胞を破壊してタンパク質を抽出し、ウェスタンブロットを実施した。抗切断ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４１Ｓ）、抗切断カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６４）、抗ホスホ－ｐ５３抗体（ＡＢｃｌｏｎａｌ、ＡＰ０７６２）、及び抗βアクチン抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ２２２８）を一次抗体として使用し、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ又は抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰを二次抗体として使用した。タンパク質の量はβアクチンタンパク質の発現レベルによって補正した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ）をＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖの陰性対照として使用した。
結果として、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ）では、未処理群（処理なし）と同様に、アポトーシスの間に観察されるＰＡＲＰ及びカスパーゼ３の切断型は観察されず、ｐ５３のリン酸化型も観察されなかった。一方、ＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖ処理群では、リン酸化ｐ５３並びにＰＡＲＰ及びカスパーゼ３の切断型の発現が観察された（図５１）。上記の結果から、ＤＯＸ＿ＭＴα－ＰＤＬ１ｓｃＦｖを使用する処理によってアポトーシスが誘起されることが確認された。
調製例７．抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアを含むＨＥＫ２９３細胞株の調製
メソテリン（ＭＳＬＮ）を発現する腫瘍細胞中にミトコンドリアを特異的に導入するため、ＭＳＬＮに特異的に結合する抗ＭＳＬＮｓｃＦｖ抗体（配列番号１０２）がミトコンドリアの外膜に融合したミトコンドリアを構築した（図５２及び図５３）。具体的な方法は、韓国特許出願公開第１０－２０１９－０１２４６５６号に記載された方法に従って実施した。
調製例８．抗ＭＳＬＮｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアとフェオフォルバイドＡとの複合体の調製
抗ＭＳＬＮｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアを含むＨＥＫ２９３細胞から単離した１００μｇのミトコンドリア（ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ）を１００μＭのフェオフォルバイドＡ（ＰＢＡ）と４℃で１０分、反応させ、次いで約１２，０００×ｇで１０分、遠心分離して未反応のフェオフォルバイドＡを除去した。その後、細胞を５００μＬのＳＨＥ（２５０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、２ｍＭのＥＧＴＡ）緩衝液で２回洗浄して最終的にフェオフォルバイドＡを含むミトコンドリア（ＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ）を得た（図５４）。
実施例９．ＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖを使用する処理による細胞増殖阻害能力の確認
上の調製例８と同じ方法で得られたＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖの抗がん活性を確認するため、ヒト膵がん細胞株をＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖで処理した後、細胞増殖阻害効果を評価した。
具体的には、ヒト膵がん細胞株ＡｓＰＣ－１、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、及びＭｉａ ＰａＣａ－２を９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。その後、細胞をＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ又は１μｇのＰＢＡ－ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖで処理し、さらに７２時間、培養し、次いで細胞増殖をＷＳＴ－１アッセイによって評価した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ）をＰＢＡ－ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖの陰性対照として使用した。
結果として、未処理群（ＣＴＲ）に対し、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ）では細胞増殖阻害効果は観察されなかった。一方、ＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ処理群では、細胞増殖は未処理群と比較して約８０％～９５％阻害されることが確認された（図５５～図５８の下図）。
さらに、それぞれの膵がん細胞株におけるＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ及びＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖを使用する処理による形態変化を、倒立顕微鏡によって観察した。ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ処理群では未処理群と比較して形態変化は殆ど観察されなかった一方、ＰＢＡ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ処理群では、全てのがん細胞株において細胞形態が変化したことが確認された（図５５～図５８の上図）。
調製例９．抗ＭＳＬＮｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアとゲムシタビンとの複合体の調製
抗ＭＳＬＮｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアを含むＨＥＫ２９３細胞から単離した１００μｇのミトコンドリアを１００μＭのゲムシタビン（Ｇｅｍ）と４℃で１０分、反応させ、次いで約１２，０００×ｇで１０分、遠心分離して未反応のゲムシタビンを除去した。その後、細胞を５００μＬのＳＨＥ（２５０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、２ｍＭのＥＧＴＡ）緩衝液で２回洗浄して最終的にゲムシタビンを含むミトコンドリア（Ｇｅｍ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ）を得た（図５９）。
実施例１０．Ｇｅｍ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖを使用する処理による細胞増殖阻害能力の確認
上の調製例９と同じ方法で得られたＧｅｍ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖの抗がん活性を確認するため、ヒト膵がん細胞株をＧｅｍ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖで処理した後、細胞増殖阻害効果を評価した。
具体的には、ヒト膵がん細胞株ＡｓＰＣ－１、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、及びＭｉａ ＰａＣａ－２を９６ウェルプレートにそれぞれ約５×１０３細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。２４時間の培養の後、各細胞をＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ又は２μｇのＧｅｍ－ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖで処理し、さらに７２時間、培養し、次いで細胞増殖をＷＳＴ－１アッセイによって測定した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ）をＧｅｍ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖの陰性対照として使用した。
結果として、未処理群（ＣＴＲ）に対し、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ）では細胞増殖阻害効果は観察されなかった。一方、Ｇｅｍ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ処理群は、がん細胞株に応じて未処理群と比較して約２０％～３０％の細胞増殖阻害効果を示すことが確認された（図６０）。
調製例１０．抗ＭＳＬＮｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアとビノレルビンとの複合体の調製
抗ＭＳＬＮｓｃＦｖ抗体と融合したミトコンドリアを含むＨＥＫ２９３細胞から単離した１００μｇのミトコンドリア（ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ）を１００μＭのビノレルビン（ＶＩＢＥ）と４℃で１０分、反応させ、次いで約１２，０００×ｇで１０分、遠心分離して未反応のビノレルビンを除去した。その後、細胞を５００μＬのＳＨＥ（２５０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、２ｍＭのＥＧＴＡ）緩衝液で２回洗浄して、ビノレルビンを含むミトコンドリア（ＶＩＢＥ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ）を得た（図６１）。
実施例１１．ＶＩＢＥ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖを使用する処理による細胞増殖阻害能力の確認
上の調製例１０と同じ方法で得られたＶＩＢＥ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖの抗がん活性を確認するため、ヒト膵がん細胞株をＶＩＢＥ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖで処理した後、細胞増殖阻害効果を評価した。
具体的には、ヒト膵がん細胞株ＡｓＰＣ－１、Ｃａｐａｎ－１、Ｃａｐａｎ－２、及びＭＩＡ ＰａＣａ－２を９６ウェルプレートにそれぞれ約５×１０３細胞／ウェルで接種して２４時間培養した。２４時間の培養の後、各細胞をＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ又は２μｇのＶＩＢＥ－ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖで処理し、さらに７２時間、培養し、次いで細胞増殖をＷＳＴ－１アッセイによって測定した。このとき、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ）をＶＩＢＥ－ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖの陰性対照として使用した。
結果として、未処理群（ＣＴＲ）に対し、ミトコンドリアのみの処理群（ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ）では細胞増殖阻害効果は観察されなかった。一方、ＶＩＢＥ＿ＭＴα－ＭＳＬＮｓｃＦｖ処理群は、がん細胞株に応じて未処理群と比較して約５０％の細胞増殖阻害効果を示すことが確認された（図６２）。
実施例１２．異種移植腫瘍マウスモデルにおけるＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの腫瘍細胞標的の検証
５週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄ヌードマウス（初期体重１８～２０ｇ）（Ｎａｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１週間、馴化し、次いでＨＥＲ２＋ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７を１×１０７細胞／マウスで側腹部に皮下移植して、異種移植腫瘍モデルマウスを構築した。腫瘍の平均体積が５０ｍｍ３又はそれ以上に達したとき、２０μｇのＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを静脈内投与した。２４時間後、マウスの組織を抽出した。抽出したそれぞれの組織を、抗ｍｙｃ抗体を使用する免疫組織化学染色によって解析し、マウス組織中におけるＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの分布を確認した（図６３）。
実施例１２．１．異種移植腫瘍マウスモデルにおけるＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの腫瘍細胞標的の確認
上の実施例１２と同じ方法で処理したマウスの組織について免疫組織化学染色を実施した。ミトコンドリアＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖで標識した抗ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ、１１６６７１４９００１）を一次抗体として使用し、アレクサ・フルオル（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１００１）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として使用した。このとき、細胞の核をＤＡＰＩ染色によって観察した。
結果として、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖは腎及び肝の組織では観察されなかったが、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖは腫瘍組織で観察された（図６４）。上記の結果から、マウス静脈に注射されたＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖがマウスの側腹部に皮下移植されたＮＣＩ－Ｎ８７（ＨＥＲ２＋）腫瘍細胞を特異的に標的とすることが確認された。
実施例１３．異種移植腫瘍マウスモデルにおけるＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの抗がん活性の評価
５週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄ヌードマウス（初期体重１８～２０ｇ）（Ｎａｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１週間、馴化し、次いでＨＥＲ２＋ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７を１×１０７細胞／マウスで側腹部に皮下移植して、異種移植腫瘍モデルマウスを構築した。腫瘍の平均体積が５０～１００ｍｍ３に達したとき、マウスを試験群あたり７匹の３群に分け、４μｇのＴＰＰ－ＤＯＸ又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖを週１回で４週間、合計７回、静脈内投与した。腫瘍のサイズを２～４日の間隔で測定し、投与開始から２５日後に腫瘍組織を抽出して、サイズ及び重量を測定した（図６５）。
実施例１３．１．異種移植腫瘍マウスモデルにおけるＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの腫瘍細胞増殖阻害能力の確認
上の実施例１３の方法による実験の結果として、ＴＰＰ－ＤＯＸ投与群の場合には、腫瘍サイズは対照群（ＣＴＲ）と比較して３０日目まで同様であった。一方、ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ投与群の腫瘍サイズは、対照群と比較して有意に低減していた（図６６）。さらに、実験の終了後に抽出した腫瘍のサイズ（図６７）及び重量（図６８）は、ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処置群で有意に低減していた。Ｇｒａｐｈｐａｄ ５．０ソフトウェアを使用して統計処理を実施し、一方向ＡＮＯＶＡ（Ｔｕｒｋｅｙ）検定によってｐ値を測定した（＊ｐ＜０．０５）。
実施例１４．同種移植腫瘍マウスモデルにおけるＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの抗がん活性の評価
７週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｓａｍｔａｋｏ Ｂｉｏ Ｋｏｒｅａ）を１週間、馴化し、次いでマウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を約５×１０５細胞／マウスでマウスの側腹部に皮下移植して、同種移植腫瘍マウスを構築した。このとき、レンチウイルスを使用してヒトＨＥＲ２遺伝子を過剰発現させたＢ１６Ｆ１０細胞をＢ１６Ｆ１０細胞として使用した。腫瘍の平均体積が１００～２００ｍｍ３に達したとき、マウスを試験群あたりマウス３匹の４群に分けて、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ（２０μｇ）、ＴＰＰ－ＤＯＸ（５μｇ）、又はＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ（ＴＰＰ－ＤＯＸ／ＭＴ：５μｇ／２０μｇ）を週３回で３週間、静脈内投与した。腫瘍サイズを週３回測定し、実験の終了後（投与開始の３週後）に、マウスの腫瘍組織を抽出してサイズ及び重量を測定した（図６９）。
実施例１４．１．同種がん細胞移植動物モデルにおけるＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの腫瘍細胞増殖阻害能力の確認
上の実施例１４の方法による実験の結果として、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ及びＴＰＰ－ＤＯＸ投与群の場合には、腫瘍サイズは対照群（ＣＴＲ）の腫瘍サイズと同様であった。一方、ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ投与群の腫瘍サイズは対照群と比較して有意に低減していた（図７０）。さらに、実験の終了後に抽出した腫瘍のサイズ（図７１）及び重量（図７２）は、ＴＰＰ－ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ処置群で低減していた。
実施例１５．同種移植腫瘍動物モデルにおけるＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの抗がん活性の評価
７週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｓａｍｔａｋｏ Ｂｉｏ Ｋｏｒｅａ）を１週間、馴化し、次いでマウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を約５×１０５細胞／マウスでマウスの側腹部に皮下移植して、同種移植腫瘍マウスを構築した。このとき、レンチウイルスを使用してヒトＨＥＲ２遺伝子を過剰発現させたＢ１６Ｆ１０細胞をＢ１６Ｆ１０細胞として使用した。腫瘍の平均体積が１００～２００ｍｍ３に達したとき、マウスを試験群あたりマウス３匹の４群に分けて、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ（２０μｇ）、ＤＯＸ（４μｇ）、又はＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ（ＴＰＰ－ＤＯＸ／ＭＴ：４μｇ／２０μｇ）を週３回で３週間、静脈内投与した。腫瘍サイズを週３回測定し、実験の終了後（投与開始の３週後）に、マウスの腫瘍組織を抽出してサイズ及び重量を測定した（図７３）。
実施例１５．１．同種移植腫瘍動物モデルにおけるＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖの腫瘍細胞増殖阻害能力の確認
上の実施例１４の方法による実験の結果として、ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ投与群の場合には、腫瘍サイズは対照群（ＣＴＲ）の腫瘍サイズと同様であった。一方、ＤＯＸ投与群及びＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ投与群の腫瘍サイズは対照群と比較して有意に低減していた。さらに、ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ投与群の腫瘍サイズはＤＯＸ処置群と比較してさらに低減していた（図７４）。さらに、実験の終了後に抽出した腫瘍のサイズ（図７５）及び重量（図７６）は、ＤＯＸ＿ＭＴα－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ投与群で対照群と比較して低減していた。
配列表のフリーテキスト
配列番号１：Ｔ２ｐ５３プライマー
配列番号２：Ｘｐ５３プライマー
配列番号３：ｐ５３をコードするヌクレオチド配列
配列番号４：ＮｄｅＵＢプライマー
配列番号５：Ｔ２ＵＢプライマー
配列番号６：ＵＢ－ｐ５３をコードするヌクレオチド配列
配列番号７：ＮｄｅＴＯＭ７０プライマー
配列番号８：ＴＯＭ７０－ＡＳプライマー
配列番号９：ＴＯＭ７０ＵＢ－Ｓプライマー
配列番号１０：Ｔ２ＵＢ－ＡＳプライマー
配列番号１１：ＴＯＭ７０－ＵＢ－ｐ５３をコードするヌクレオチド配列
配列番号１２：ＴＯＭ７０（Ｇ）３－ＡＳプライマー
配列番号１３：（Ｇ）３ＵＢ－Ｓプライマー
配列番号１４：Ｘｐ５３（ｎｏＴ）プライマー
配列番号１５：ＴＯＭ７０－（ＧＧＧＧＳ）３－ＵＢ－ｐ５３をコードするヌクレオチド配列
配列番号１６：Ｂ（Ｇ）３ｐ５３
配列番号１７：ＴＯＭ７０－（ＧＧＧＧＳ）３－ｐ５３をコードするヌクレオチド配列
配列番号１８：Ｘｐ５３（ｎｏＴ）プライマー
配列番号１９：ＸＴＯＭ７プライマー
配列番号２０：ＬＴＯＭ７プライマー
配列番号２１：ＵＢ－ｐ５３－ＴＯＭ７をコードするヌクレオチド配列
配列番号２２：Ｒｐ５３プライマー
配列番号２３：ｐ５３－ｍｙｃ／Ｈｉｓをコードするヌクレオチド配列
配列番号２４：Ｔ２ＧＺＭＢプライマー
配列番号２５：ＸＧＺＭＢ（ｎｏＴ）プライマー
配列番号２６：グランザイムＢをコードするヌクレオチド配列
配列番号２７：ＴＯＭ７０－（ＧＧＧＧＳ）３－ＵＢ－グランザイムＢをコードするヌクレオチド配列
配列番号２８：ＵＢ－グランザイムＢ－ＴＯＭ７をコードするヌクレオチド配列
配列番号２９：Ｔ２ＲＫＩＰプライマー
配列番号３０：ＸＲＫＩＰ（ｎｏＴ）プライマー
配列番号３１：ＲＫＩＰをコードするヌクレオチド配列
配列番号３２：ＴＯＭ７０－（ＧＧＧＧＳ）３－ＵＢ－ＲＫＩＰをコードするヌクレオチド配列
配列番号３３：Ｔ２ＰＴＥＮプライマー
配列番号３４：ＸＰＴＥＮ（ｎｏＴ）プライマー
配列番号３５：ＰＴＥＮをコードするヌクレオチド配列
配列番号３６：ＴＯＭ７０－（ＧＧＧＧＳ）３－ＵＢ－ＰＴＥＮをコードするヌクレオチド配列
配列番号３７：ｓｃＦｖＨＥＲ２をコードするヌクレオチド配列
配列番号３８：ＵＢ－ｓｃＦｖＨＥＲ２－ＴＯＭ７をコードするヌクレオチド配列
配列番号３９：ＲｓｃＦｖＨＥＲ２プライマー
配列番号４０：ＸＴＯＭ７（ｎｏＴ）プライマー
配列番号４１：ｓｃＦｖＨＥＲ２－ＴＯＭ７－ｍｙｃ／Ｈｉｓをコードするヌクレオチド配列
配列番号４２：ｓｃＦｖＭＥＬをコードするヌクレオチド配列
配列番号４３：ＵＢ－ｓｃＦｖＭＥＬ－ＴＯＭ７をコードするヌクレオチド配列
配列番号４４：ＲｓｃＦｖＭＥＬプライマー
配列番号４５：ｓｃＦｖＭＥＬ－ＴＯＭ７－ｍｙｃ／Ｈｉｓをコードするヌクレオチド配列
配列番号４６：ｓｃＦｖＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列
配列番号４７：ｓｃＦｖＰＤ－Ｌ１－ＴＯＭ７－ｍｙｃ／Ｈｉｓをコードするヌクレオチド配列
配列番号４８：ｐ５３のアミノ酸配列
配列番号４９：ＵＢ－ｐ５３のアミノ酸配列
配列番号５０：ＴＯＭ７０－ＵＢ－ｐ５３のアミノ酸配列
配列番号５１：ＴＯＭ７０－（ＧＧＧＧＳ）３－ＵＢ－ｐ５３のアミノ酸配列
配列番号５２：ＴＯＭ７０－（ＧＧＧＧＳ）３－ｐ５３のアミノ酸配列
配列番号５３：ＵＢ－ｐ５３－ＴＯＭ７のアミノ酸配列
配列番号５４：ｐ５３－ｍｙｃ／Ｈｉｓのアミノ酸配列
配列番号５５：グランザイムＢのアミノ酸配列
配列番号５６：ＴＯＭ７０－（ＧＧＧＧＳ）３－ＵＢ－グランザイムＢのアミノ酸配列
配列番号５７：ＵＢ－グランザイムＢ－ＴＯＭ７のアミノ酸配列
配列番号５８：ＲＫＩＰのアミノ酸配列
配列番号５９：ＴＯＭ７０－（ＧＧＧＧＳ）３－ＵＢ－ＲＫＩＰのアミノ酸配列
配列番号６０：ＰＴＥＮのアミノ酸配列
配列番号６１：ＴＯＭ７０－（ＧＧＧＧＳ）３－ＵＢ－ＰＴＥＮのアミノ酸配列
配列番号６２：ｓｃＦｖＨＥＲ２のアミノ酸配列
配列番号６３：ＵＢ－ｓｃＦｖＨＥＲ２－ＴＯＭ７のアミノ酸配列
配列番号６４：ｓｃＦｖＨＥＲ２－ＴＯＭ７－ｍｙｃ／Ｈｉｓのアミノ酸配列
配列番号６５：ｓｃＦｖＭＥＬのアミノ酸配列
配列番号６６：ＵＢ－ｓｃＦｖＭＥＬ－ＴＯＭ７のアミノ酸配列
配列番号６７：ｓｃＦｖＭＥＬ－ＴＯＭ７－ｍｙｃ／Ｈｉｓのアミノ酸配列
配列番号６８：ｓｃＦｖＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号６９：ｓｃＦｖＰＤ－Ｌ１－ＴＯＭ７－ｍｙｃ／Ｈｉｓのアミノ酸配列
配列番号７０：リンカー
配列番号７１：ユビキチンのアミノ酸配列
配列番号７２：ユビキチンをコードするヌクレオチド配列
配列番号７３：ｐ５３のアミノ酸配列
配列番号７４：ｐ５３をコードするヌクレオチド配列
配列番号７５：Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＯＭ７０
配列番号７６．ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のＴＯＭ７０
配列番号７７：Ｓ．セレビシアエのＴＯＭ２０
配列番号７８：ホモ・サピエンスのＴＯＭ２０
配列番号７９：Ｓ．セレビシアエのＯＭ４５
配列番号８０：Ｓ．セレビシアエのＴＯＭ５
配列番号８１：ホモ・サピエンスのＴＯＭ５
配列番号８２：Ｓ．セレビシアエのＴＯＭ７
配列番号８３：ホモ・サピエンスのＴＯＭ７
配列番号８４：Ｓ．セレビシアエのＴＯＭ２２
配列番号８５：ホモ・サピエンスのＴＯＭ２２
配列番号８６：Ｓ．セレビシアエのＦｉｓ１
配列番号８７：ホモ・サピエンスのＦｉｓ１
配列番号８８：ホモ・サピエンスのＢｃｌ－２アルファ
配列番号８９：Ｓ．セレビシアエのＶＡＭＰ１
配列番号９０：ホモ・サピエンスのＶＡＭＰ１
配列番号９１：Ｐ５３－プロモーター－Ｓ
配列番号９２：Ｐ５３－プロモーター－ＡＳ
配列番号９３：ｓｃＦｖＰＤＬ１－ｍｙｃ－ＴＯＭ７をコードするヌクレオチド配列
配列番号９４：ｓｃＦｖＰＤＬ１－ｍｙｃ－ＴＯＭ７のアミノ酸配列
配列番号９５：ｓｃＦｖＨＥＲ２をコードするヌクレオチド配列
配列番号９６：ｓｃＦｖＨＥＲ２のアミノ酸配列
配列番号９７：ｓｃＦｖＨＥＲ２－ｍｙｃ－ＴＯＭ７をコードするヌクレオチド配列
配列番号９８：ｓｃＦｖＨＥＲ２－ｍｙｃ－ＴＯＭ７のアミノ酸配列
配列番号９９：ｓｃＦｖＭＳＬＮをコードするヌクレオチド配列
配列番号１００：ｓｃＦｖＭＳＬＮのアミノ酸配列
配列番号１０１：ｓｃＦｖＭＳＬＮ－ｍｙｃ－ＴＯＭ７をコードするヌクレオチド配列
配列番号１０２：ｓｃＦｖＭＳＬＮ－ｍｙｃ－ＴＯＭ７のアミノ酸配列

Claims (14)

  1. 抗がん剤を含む改変されたミトコンドリオン。
  2. 前記抗がん剤が、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）又はその誘導体が結合した抗がん剤である、請求項１に記載の改変されたミトコンドリオン。
  3. 前記抗がん剤が、化学的抗がん剤、標的抗がん剤、及び駆虫剤からなる群から選択される、請求項１に記載の改変されたミトコンドリオン。
  4. 前記化学的抗がん剤が、アルキル化剤、微小管阻害剤、代謝拮抗剤、及びトポイソメラーゼ阻害剤からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項３に記載の改変されたミトコンドリオン。
  5. 前記標的抗がん剤が、ＢＴＫ、Ｂｃｒ－ａｂｌ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ／ＶＥＧＦＲ／ＦＧＦＲファミリー、ＭＥＫ／ＲＡＦ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＣＤＫ、ユビキチン、ＪＡＫ、ＭＡＰ２Ｋ、ＡＬＫ、ＰＡＲＰ、ＴＧＦβＲＩ、プロテアソーム、Ｂｃｌ－２、Ｂｒａｆ、Ｃ－Ｍｅｔ、ＶＲ１、ＶＲ２、ＶＲ３、ｃ－ｋｉｔ、ＡＸＬ、及びＲＥＴを標的とする化合物からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項３に記載の改変されたミトコンドリオン。
  6. 前記駆虫剤が、ＯＸＰＨＯＳ（酸化的リン酸化）阻害剤、解糖阻害剤、解糖関連間接的阻害剤、ＰＰＰ（ペントースリン酸経路）阻害剤、及びオートファジー阻害剤からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項３に記載の改変されたミトコンドリオン。
  7. 前記ミトコンドリオンが、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体が細胞に存在する改変されたミトコンドリオンである、請求項１に記載の改変されたミトコンドリオン。
  8. 前記腫瘍関連抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、黒色腫抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１細胞表面関連（ＭＵＣ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質２（ｔｙｒｐ２）、ブラキウリ、メソテリン、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ＥＲＢＢ２、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、ＦＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ－Ｌ１、ＡＣＰＰ、ＣＰＴ１Ａ、ＩＦＮＧ、ＣＤ２７４、ＦＯＬＲ１、ＥＰＣＡＭ、ＩＣＡＭ２、ＮＣＡＭ１、ＬＲＲＣ４、ＵＮＣ５Ｈ２ ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ、ネクチン－３、及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の改変されたミトコンドリオン。
  9. 前記がんが、乳がん、肺がん、膵がん、膠芽細胞腫、胃がん、肝がん、大腸がん、前立腺がん、卵巣がん、頸がん、甲状腺がん、喉頭がん、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽腫、網膜芽腫、頭頚部がん、唾液腺がん、及びリンパ腫からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の改変されたミトコンドリオン。
  10. 請求項１に記載の改変されたミトコンドリオンを有効成分として含む、がんの予防又は治療のための医薬組成物。
  11. がんの治療のための医薬組成物の製造のための、請求項１に記載の改変されたミトコンドリオンの使用。
  12. 請求項１に記載の改変されたミトコンドリオンを対象に投与することを含む、がんを治療する方法。
  13. 抗がん剤と単離されたミトコンドリオンとを混合することを含む、抗がん剤を含むミトコンドリオンを調製する方法。
  14. ＴＰＰ又はその誘導体が抗がん剤に結合した、改変された抗がん剤。

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