CN116440293A - 用于临床的修饰的NK-92 haNK003细胞 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及用于临床的修饰的NK‑92haNK003细胞。本文提供了修饰的NK‑92细胞群、包含所述细胞的组合物和试剂盒、以及制备和使用所述细胞群的方法。
Description
背景技术
单克隆抗体(mAbs)的抗癌治疗显著改善了癌症患者的临床结果。治疗性抗体的主要作用机制之一是通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。自然杀伤细胞可用作细胞毒性效应细胞用于基于细胞的免疫疗法，因为它们是ADCC的主要效应细胞。
NK-92是在患非霍奇金淋巴瘤的患者的血液中发现并随后离体永生化的溶细胞性癌细胞系。NK-92细胞衍生自NK细胞，但缺乏正常NK细胞展示的主要抑制性受体，同时保留了大部分激活受体。然而，NK-92细胞不攻击正常细胞，也不会在人体中引发不可接受的免疫排斥反应。NK-92细胞系的表征公开在WO1998/49268和美国专利申请公开号2002-0068044中。NK-92细胞作为治疗某些癌症的潜在治疗剂被评估。
尽管NK-92细胞保留了与NK细胞相关的几乎所有激活受体和细胞溶解途径，但它们在细胞表面上不表达CD16。CD16是Fc受体，其识别并结合抗体的Fc部分以激活NK细胞以用于ADCC效应机制。因为它们缺乏CD16受体，未修饰的NK-92细胞不能通过ADCC机制裂解靶细胞。
发明内容
本文提供了经修饰的NK-92细胞群、包含该细胞的组合物和试剂盒以及制备和使用所述细胞群的方法。
附图说明
图1A是显示haNK003细胞扩增的图。图1B是显示haNK003细胞的群体倍增水平(PDL)的图。在扩增期间监测活力(％)、细胞密度(细胞/mL)和累积PDL。
图2显示了aNK和haNK003细胞中表面标志物表达的代表性直方图。
图3A是显示haNK003细胞对K562细胞的天然细胞毒性的图。图3B是显示haNK003细胞对Raji细胞的天然细胞毒性的图。图3C是显示haNK003细胞对SKOV3细胞的天然细胞毒性的图。图3D是显示haNK003细胞对SKBR3细胞的天然细胞毒性的图。
图4A是显示haNK003细胞对Raji细胞的ADCC的图。图4B是显示haNK003细胞对SKOV3细胞的ADCC的图。图4C是显示haNK003细胞对SKBR3细胞的ADCC的图。
图5是显示辐射的haNK003细胞相对于非辐射的haNK003细胞对K562细胞的天然细胞毒活性的图。haNK003细胞进行模拟辐射(实线)或以10Gy辐射。经辐射的haNK003对K562细胞的细胞毒性活性在辐射后6小时(短划线)或24小时(点虚线)测定。
图6是显示辐射的haNK003相对于非辐射的haNK003细胞对DOHH2细胞的天然细胞毒性活性的图。对haNK003细胞进行模拟辐射(实线)或以10Gy进行辐射。经辐射的haNK003对DOHH2细胞的细胞毒性活性在辐射后6小时(短划线)或24小时(点虚线)测定。注意，对于辐射的细胞未获得E：T比率为20：1的数据点，因为细胞死亡导致haNK003细胞数量不足。
图7是辐射的haNK003细胞相对于非辐射的haNK003细胞对DOHH2细胞的ADCC活性的图。对haNK003细胞进行模拟辐射(实心符号)或以10Gy进行辐射(空心符号)。辐射和非辐射的haNK003对DOHH2细胞的ADCC活性辐射后6小时(短划线)或24小时(点虚线)与Rituxan(正方形)或与赫赛汀(三角形)(其不与DOHH2细胞反应)组合的情况下测定。注意，在24小时时间点对于辐射的细胞未获得E：T比率为20：1的数据点，因为细胞死亡导致haNK003细胞数量不足。
图8A是显示通过夹心ELISA试验#1测定的辐射的细胞相对于非辐射的细胞6、12、24和48小时(h)的每1×106个细胞的IL-2释放(pg/mL)的图。图8B是显示通过夹心ELISA试验#2测定的辐射的细胞相对于非辐射的细胞6、12、24和48小时(h)每1×106个细胞的IL-2释放(pg/mL)的图。图8C是显示通过多重ELISA试验#1测定的辐射的细胞相对于非辐射的细胞6、12、24和48小时(h)每1×106个细胞的IL-2释放(pg/mL)的图。图8D是显示通过多重ELISA试验#2测定的辐射的细胞相对于非辐射的细胞6、12、24和48小时(h)每1×106个细胞的IL-2释放(pg/mL)的图。
图9A是显示通过夹心ELISA试验#1测定的辐射的细胞相对于辐射的细胞6、12、24和48小时(h)每1×106个细胞的总细胞内IL-2含量(pg)的图。图9B是显示通过夹心ELISA试验#2测定的辐射的细胞相对于辐射的细胞6、12、24和48小时(h)每1×106个细胞的总细胞内IL-2含量(pg)的图。图9C是显示通过多重ELISA试验#1测定的辐射的细胞相对于辐射的细胞6、12、24和48小时(h)每1×106个细胞的总细胞内IL-2含量(pg)的图。图9D是显示通过多重ELISA试验#2测定的辐射的细胞相对于辐射的细胞6、12、24和48小时(h)每1×106个细胞的总细胞内IL-2含量(pg)的图。
图10A是显示通过多重和夹心ELISA测定的试验#1中每1×106个细胞的溶解IL-2的量(pg)的图。图10B是显示通过多重和夹心ELISA测定的在试验#2中每1×106个细胞的溶解IL-2的量(pg)的图。
图11是显示静脉内施用的haNK003对NOD/SCID小鼠的动物体重的影响的图。以1×107个细胞的剂量作为单个剂量分别通过静脉注射PBS、非辐射或辐射的haNK003细胞对NOD/SCID小鼠(每组3只雄性和3只雌性)进行处理。每周两次监测动物体重，持续5周。值是平均值±SEM，n＝6。
图12是显示haNK003细胞对NOD/SCID小鼠的动物体重的影响的图。每周一次用PBS、1×107个非辐射或辐射的haNK003细胞处理NOD/SCID小鼠(每组3只雄性和3只雌性)，持续4周，每周两次监测动物体重，持续5周。值是平均值±SEM，n＝6。
图13是显示aNK相对于haNK003细胞关于针对K562细胞的天然细胞毒性的比较的图。
图14是显示aNK相对于haNK003细胞关于针对Daudi细胞的天然细胞毒性的比较的图。
图15是显示aNK相对于haNK003细胞关于针对DOHH2细胞的天然细胞毒性的比较的图。
图16是显示aNK相对于haNK003细胞关于针对SKOV-3细胞的天然细胞毒性的比较的图。
图17是显示aNK相对于haNK003细胞关于针对HL-60细胞的天然细胞毒性的比较的图。
图18是显示aNK相对于haNK003细胞关于针对SR-91细胞的天然细胞毒性的比较的图。
图19是显示在雌性NSG小鼠的MDA-MB-453s.c.异种移植模型中haNK003细胞的抗肿瘤活性的图。携带MDA-MB-453人乳腺癌肿瘤的雌性NSG小鼠分别通过每周两次静脉注射PBS或2.5×106或1×107个细胞剂量的辐射的haNK003细胞进行处理，持续4周。每周两次监测肿瘤体积。值是平均值±SEM；n＝8。
图20是显示haNK003细胞对雌性NSG小鼠的动物体重的影响的图。携带MDA-MB-453人乳腺癌肿瘤的雌性NSG小鼠分别通过每周两次静脉注射PBS或2.5×106或1.0×107细胞剂量的辐射haNK003细胞进行处理，持续4周。每周两次监测小鼠体重。值是平均值±SEM；N＝4。
图21是显示在正常NK细胞950、962和996以及haNK细胞中在20％氧和0％氧(缺氧)条件下基因表达的样品成对距离的表。
图22是显示在950、962、996和haNK细胞中在20％氧条件和0％氧条件之间表现出最大的表达可变性的基因的表。
图23是显示950、962、996和haNK细胞中在20％氧条件和0％氧条件之间表现出最大变化的基因的表达变化的表。
图24是显示在20％氧条件和0％氧条件下haNK细胞和NK细胞950、962和996中与缺氧相关的基因的表达变化的表。
图25是显示在PMA处理之前和之后haNK003细胞和供体NK细胞中CD16表达的流式细胞术分析的图。供体NK细胞中CD16表达的下调为94.36％±3，而haNK003细胞中为30％±0.04。aNK(无CD16的NK-92细胞)用作对照。
图26是显示与K562细胞共培养的haNK003细胞和供体NK细胞(E：T＝1：1)中CD16表达水平的流式细胞术分析的图。4小时后，与供体NK细胞相比，haNK003细胞显示出稳定的CD16表达。与K562共培养4小时后供体NK细胞中的CD16下调为60.25％±09，haNK003细胞为4.9％±2.57。在过夜恢复后，供体NK细胞中CD16表达的下调仍有57.54％±26.82，而在haNK003细胞中，CD16水平恢复至接近正常，仅2.78％±3.5的下调。aNK(无CD16的NK-92细胞)用作对照。
图27A和27B是显示ADCC后haNK003细胞的CD16表达水平的图。通过在1μg/ml利妥昔单抗存在下以1：0(单独的效应细胞)至1：4的E：T比率共培养haNK003细胞和DoHH 4小时进行ADCC。通过流式细胞术在4小时和24小时后测量CD16表达水平。图27A显示ADCC后的haNK-003以及对照(E：T＝1：0)中的CD16表达水平的流式细胞术分析。图27B显示ADCC后和ADCC后24小时的CD16表达的平均值荧光强度(MFI)。
具体实施方式
本文提供了修饰的NK-92 haNK003细胞。该细胞表达Fc受体CD16和内质网结合形式的IL-2。因此，细胞不依赖外部IL-2进行生长。此外，修饰的NK-92细胞具有增强的细胞毒性能力，其中插入了CD16受体的高亲和力变体，因此能够具有CD16靶向的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。ADCC通过经由CD16 Fc受体的靶结合抗体(IgG)的Fc片段的识别来介导。因此，对于肿瘤学应用，经修饰细胞的ADCC通过CD16受体结合到肿瘤细胞结合的IgG的Fc片段引发，从而激活修饰的NK-92细胞用于靶向杀伤。如本文所述，所提供的修饰的NK-92细胞通过含有CD16(高亲和力Fc-γ受体(FcγRIIIa/CD16a))和靶向内质网的IL-2的序列的基于双顺反子质粒的载体的稳定转染产生。细胞含有插入染色体17上+链上的15,654,977位处的单个位置的质粒序列。经修饰的NK-92细胞产生内源性IL-2，并且表型上是CD56+、CD3-和CD16+。本申请中提供的经修饰的NK-92 haNK003细胞有时在本文中简称为haNK003细胞。
如下文实施例中更详细描述的，用pNEUKv1_FcRIL2质粒(SEQ ID NO:1)转化NK-92细胞。pNEUKv1_FcRIL2质粒是表达含有氨基酸176处的缬氨酸(当参照全长CD16肽时)的修饰的CD16和具有内质网保留信号的IL-2的双顺反子构建体。进行细胞的全基因组测序(WGS)，从而在染色体17处鉴定一个质粒插入位点。WGS证实在haNK003细胞系中双顺反子质粒的整合位于远离任何一个具有致癌潜力的基因的基因组区域中。最接近的5'基因TBC1D26在上游10,722bp，最接近的3'基因ADORA2B在下游186,828bp。当每3至4天传代并以约0.3-0.5×106个细胞/mL的密度接种时，修饰的NK-92细胞恒定地生长。从第3天到第29天，平均倍增时间为65(48-95)小时。流式细胞术数据的分析显示，经修饰的NK-92细胞表达CD54、CD56、NKG2D、NKp30和CD16表面标志物蛋白并且缺乏CD3。经修饰的NK-92细胞能够在不补充IL-2的生长培养基生长。此外，已确定表达IL-2的经修饰的NK-92细胞将低水平的IL-2释放到培养基中。单独的非辐射的haNK003细胞在培养6小时时每1,000,000个细胞分泌平均约276.1pg/mL，和在培养48小时时每1,000,000个细胞分泌至多1403.3pg/mL。所提供的经修饰的NK-92细胞对几种癌细胞系天然具有细胞毒性，并且当与抗体组合时能够通过ADCC增强特异性裂解。
发现NK-92细胞系在白细胞介素2(IL-2)存在下增殖。Gong等，Leukemia 8：652-658(1994)。这些细胞对多种癌症具有高细胞溶解活性。NK-92细胞系是具有广泛的抗肿瘤细胞毒性及扩增后可预测的产量的均一的NK细胞群。I期临床试验证实了其安全性特性。NK-92是在患非霍奇金淋巴瘤的患者的血液中发现并随后离体永生化的。NK-92细胞衍生自NK细胞，但缺乏正常NK细胞展示的主要抑制性受体，同时保留了大部分激活受体。然而，NK-92细胞不攻击正常细胞，也不会在人体中引发不可接受的免疫排斥反应。NK-92细胞系的表征公开在WO1998/49268和美国专利申请公开号2002-0068044中。
NK-92细胞是已知的，包括但不限于例如美国专利号7,618,817、8,034,332和8,313,943，美国专利申请公开号2013/0040386中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文，例如野生型NK-92、NK-92-CD16、NK-92-CD16-γ、NK-92-CD16-ζ、NK-92-CD16(F176V)、NK-92MI和NK-92CI。
本文提供了具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的经修饰的NK-92haNK003细胞群，其包含含有CD16(SEQ ID NO:3)和IL-2(SEQ ID NO:5)两者的核酸分子，其中细胞群中大于90％的细胞表达CD56、CD16、CD54和NKp30，并且细胞群中少于5％的细胞表达CD3。任选地，核酸分子是mRNA分子。任选地，mRNA分子从5'至3'包含编码CD16的序列、IRES序列和编码IL-2的序列。任选地，细胞在染色体17上包含SEQ ID NO:1。任选地，细胞的平均倍增时间为55至70小时。任选地，细胞群保持平均倍增时间1、2、3、4、5、10、15、20、25或更多天。任选地，细胞群可以传代1、2、3、4或更多天。任选地，细胞以每百万细胞10至40pg/小时的浓度分泌IL-2。任选地，细胞是经辐射的细胞。
响应于某些刺激，CD16在细胞膜附近被切割，导致受体细胞外部分的释放和激活后表达的下调(参见，Jing等，PLOS one，10(3)：e0121788DOI：10.1371/journal.pone.0121788(2015))。在正常条件下，这种机制有助于控制NK细胞的细胞毒性，但在肿瘤环境中，这可以降低ADCC效力和癌细胞杀伤。有利地，所提供的haNK003细胞具有增强的针对癌细胞的ADCC活性。不受理论束缚，据信这是由于ADCC后haNK003细胞中CD16的稳定表达。如以下实施例中所示，在用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯激活或用K562细胞刺激后，与对照细胞相比，CD16的表达保持高水平。此外，即使在ADCC后，CD16表达在haNK003细胞中仍然保持高水平。因此，与对照相比，所提供的haNK003细胞减少了CD16表达的下调。此外，与对照相比，在ADCC后haNK003细胞具有增加的CD16水平。换句话说，与对照相比，ADCC后细胞维持较高的CD16水平。因此，与对照例如正常NK细胞相比，haNK003细胞具有更稳定的CD16表达。
自然杀伤(NK)细胞裂解活性在体外缺氧环境(1％O2)中受到抑制，并且与NKG2D、穿孔素和颗粒酶的下调相关。来自正常供体的NK对缺氧(1％O2)的敏感性存在一些差异。然而，体外外源性IL-2激活(16h，1000IU/ml)可部分挽救NK细胞裂解活性。此外，NK细胞在低于1％的氧气条件下保持ADCC能力。如下文实施例中更详细描述的，与缺氧相关的基因在haNK细胞中未显示出在20％氧气条件和0％氧气(缺氧)条件之间的表达变化。然而，与缺氧相关的这些相同基因在正常NK细胞中显示具有降低的表达。
如上所述，经修饰的NK-92细胞表达Fc受体CD16。如本文所用，术语“Fc受体”是指在某些细胞(例如，天然杀伤细胞)的表面上发现的蛋白质，其通过与称为Fc区域的抗体部分结合而促成免疫细胞的保护性功能。抗体Fc区与细胞的Fc受体(FcR)的结合通过抗体介导的吞噬或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)刺激细胞的吞噬或细胞毒性活性。FcR通过他们识别的抗体的类型进行分类。例如，Fc-γ受体(FCγR)与IgG类抗体结合。FcγRIII-A(也称为CD16)是结合IgG抗体并激活ADCC的低亲和力的Fc受体。FCγRIII-A通常在NK细胞上发现。编码CD16的代表性多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:3中。编码CD16的代表性氨基酸序列显示在SEQ ID NO:4中。完整的CD16序列可在SwissProt数据库中找到，条目为P08637。
任选地，经修饰的NK-92细胞包含与SEQ ID NO:3具有70％、80％、90％或95％同一性的核酸序列。任选地，经修饰的NK-92细胞包含与SEQ ID NO:3具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。任选地，经修饰的NK-92细胞包含与SEQ ID NO:4具有70％、80％、90％或95％同一性的多肽。任选地，经修饰的NK-92细胞包含与SEQ ID NO:4具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽。
NK-92细胞的细胞毒性取决于细胞因子(例如白细胞介素-2(IL-2))的存在。在商业规模培养中使用维持和扩增NK-92细胞所需的外源添加的IL-2的成本是显著的。向人类受试者施用足够量的IL-2以继续激活NK-92细胞将引起不良副作用。任选地，IL-2与指导IL-2至内质网的信号序列一起表达。指导IL-2至内质网允许以足以自分泌激活而不向细胞外释放显著量的IL-2的水平表达IL-2。参见Konstantinidis等“Targeting IL-2to theendoplasmic reticulumconfines autocrine growth stimulation to NK-92cells”ExpHematol.2005Feb；33(2):159-64。编码IL-2的代表性核酸显示在SEQ ID NO:5中，且IL-2的代表性多肽显示在SEQ ID NO:6中。
任选地，经修饰的NK-92细胞包含与SEQ ID NO:5具有70％、80％、90％或95％同一性的核酸序列。任选地，经修饰的NK-92细胞包含与SEQ ID NO:5具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。任选地，经修饰的NK-92细胞包含与SEQ ID NO:6具有70％、80％、90％或95％同一性的多肽。任选地，经修饰的NK-92细胞包含与SEQ ID NO:6具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽。所提供的经修饰的NK-92细胞有利地能够在不存在IL-2的情况下维持而不分泌足以引起临床副作用的量的IL-2。
如本文所用，核酸是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物和互补物。该术语包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。该术语包括含有合成的、天然存在的和非天然存在的已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。这样的类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。除非另有说明，否则可以使用核酸序列的保守修饰变体(例如，简并密码子置换)和互补序列代替本文所述的特定核酸序列。具体地，简并密码子置换可以通过产生其中一个或多个选择(或所有)的密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
当核酸与另一核酸序列处于功能性关系中时，核酸可操作地连接。例如，如果它表达为参与多肽分泌的前蛋白，则编码前序列或分泌前导序列的DNA与编码多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接意指连接的DNA序列彼此接近，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的且处于阅读相中。但是，增强子不必是连续的。例如，与第二核酸序列可操作连接的核酸序列直接或间接地与这样的第二序列共价连接，尽管任何有效的三维关联都是可接受的。单个核酸序列可以与多个其他序列可操作地连接。例如，单个启动子可以指导多个RNA种类的转录。连接可以通过在方便的限制性位点处连接来完成。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景中，术语同一或百分比同一性是指相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列(即，当在比较窗口或指定区域上进行最大对应的比较和比对时，在指定区域上约60％同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST2.0序列比较算法，或通过人工比对和目测检查(参见例如，NCBI网站等)所测量的。则这样的序列称为基本相同。该定义还涉及或可以应用于测试序列的评述(compliment)。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有置换的那些。如下所述，优选算法可以考虑到缺口等。优选地，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。
对于序列比较，通常一个序列充当测试序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机中；必要时指定子序列坐标；并且指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用，比较窗口包括参考选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150的邻接位置数中任何一个的片段，其中在两个序列被最佳比对后，可以将序列与相同连续位置数的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法；Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性检索方法；通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或通过人工比对和目测检查(参见，例如,Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等,eds.1995supplement))进行。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的优选实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。以本文所述的参数使用BLAST和BLAST 2.0以确定核酸或蛋白质的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过本领域已知的国家生物技术信息中心公开获得。该算法包括首先通过识别查询序列中所选长度的短字节(W)来识别高评分序列对(HSP)，其在与数据库序列中相同长度的字节比对时匹配或满足一些正值阈值分数T。T被称为邻域字节得分阈值(Altschul等，同上)。这些最初的邻域字节命中作为种子用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。只要可以增加累积比对分数，字节命中就沿着每个序列在两个方向上延伸。使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算核苷酸序列的累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。在以下情况下停止每个方向上的字节命中的延伸：累积比对分数从其最大实现值下降量X；由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积评分达到零或低于零；或达到任一序列的结尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。期望值(E)代表着得分等同于或优于预计在数据库检索中偶然发生的分数的不同比对数量。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))，比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较作为默认值。
如本文所用，术语多肽通常具有至少三个氨基酸的聚合物的本领域公认的含义，并且旨在包括肽和蛋白质。然而，该术语还用于指多肽的特定功能类别，例如去饱和酶、延长酶等。对于每个这样的类别，本公开提供了这些多肽的已知序列的若干实例。然而，本领域普通技术人员将认识到，术语多肽旨在足够广泛以不仅包括具有本文(或在本文中具体提及的参考文献或数据库中)所述的完整序列的多肽，而且还包括包括代表这种完整多肽的功能片段(即，保留至少一种活性的片段)的多肽。此外，本领域技术人员理解蛋白质序列通常在不破坏活性的情况下耐受一些置换。因此，保留活性并且与相同种类的另一多肽共有至少约30-40％总体序列同一性，通常大于约50％、60％、70％或80％、并且通常还包含至少一个具有更高同一性的区域，通常在一个或多个高度保守的区域(通常包含至少3-4个并且通常至多20个或更多个氨基酸)中大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％，的任何多肽被包括在本文所用的相关术语多肽内。本领域技术人员可以通过分析本文所述的各种多肽的序列来确定其他相似性和/或同一性的区域。如本领域技术人员所知，已知多种策略，并且工具可用于进行氨基酸或核苷酸序列的比较以评估同一性和/或相似性的程度。这些策略包括例如人工比对、计算机辅助序列比对及其组合。用于执行序列比对的许多算法(通常是计算机实现的)可广泛获得，或者可由本领域技术人员产生。代表性算法包括例如Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.,1981,2:482)；Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.,1970,48:443)；Pearson和Lipman的相似性检索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),1988,85:2444)；和/或通过这些算法的计算机化执行(例如，在Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)。包含这些算法的容易获得的计算机程序包括例如BLASTN、BLASTP、Gapped BLAST、PILEUP、CLUSTALW等。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的默认参数。或者，实施者可以根据他或她的实验和/或其他要求使用非默认参数(例如，参见具有URL www.ncbi.nlm.nih.gov的网站)。
如本文所用，术语启动子、启动子元件以及调控序列指的是调节可操作地连接于启动子的所选择多核苷酸序列的表达，并且在细胞中影响选择的多核苷酸序列的表达的多核苷酸。
如本文所用的术语转化是指将外源或异源核酸分子(例如载体或重组核酸分子)引入受体细胞或微生物中的过程。外源或异源核酸分子可以整合(即，共价连接)或不整合到构成宿主细胞或微生物的基因组的染色体DNA中。例如，外源或异源多核苷酸可以保持在游离元件上，例如质粒。可替换地或附加地，外源或异源多核苷酸可以整合到染色体中使得通过染色体复制其由子细胞继承。转化方法包括但不限于磷酸钙沉淀；受体细胞与含有重组核酸的细菌原生质体融合；用含有重组核酸的脂质体处理受体细胞；DEAE右旋糖酐；使用聚乙二醇(PEG)的融合；电穿孔；磁穿孔；生物弹递送；逆转录病毒感染；脂质体转染；和将DNA直接微注射到细胞中。
如涉及细胞使用的，术语转化的是指已经经历如本文所述的转化的细胞，使得细胞携带外源或异源遗传物质(例如，重组核酸)。术语转化的也可以或替代地用于指含有外源或异源遗传物质的微生物、微生物株、组织、生物体等。
当涉及细胞、核酸、多肽、载体等使用时，术语修饰的和重组的表明细胞、核酸、多肽、载体等已经通过实验室方法修饰或是实验室方法的结果并且是非天然存在的。因此，例如，经修饰的细胞包括由实验室方法产生或通过实验室方法修饰的细胞，例如，用于将核酸引入细胞中的转化方法。经修饰的细胞可以包括在天然(非重组)形式的细胞内不存在的核酸序列，或者可以包括已经改变的核酸序列，例如与非天然启动子连接的核酸序列。
如本文所述，对照或标准对照是指用于与测试样品、测量或值进行比较的作为参考的样品、测量或值，通常是已知的基准。例如，可以将测试细胞(例如，用编码Fc受体的基因的核酸序列转化的细胞)与已知的正常(野生型)细胞(例如，标准对照细胞)进行比较。标准对照还可以表示从不表达Fc受体或不具有或具有最低水平的Fc受体活性的细胞群(例如，标准对照微生物)收集的平均测量或值。技术人员将认识到，可以设计标准对照以评估任何数量的参数(例如，RNA水平、多肽水平、特定细胞类型等)。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段。抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgA、IgM、IgE或IgD)。优选地，抗体是IgG。抗体可以是非人的(例如，来自小鼠、山羊或任何其他动物)、全人的、人源化的或嵌合的。抗体可以是多克隆的或单克隆的。任选地，抗体是单克隆的。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指由培养中生长的并且能够无限增殖的细胞单克隆产生的纯的靶特异性的抗体。可以使用的单克隆抗体包括附着并阻断癌细胞上的抗原的裸抗体。任选地，裸单克隆抗体是与淋巴细胞中的CD52抗原结合的阿仑单抗。可以使用的单克隆抗体还包括偶联的单克隆抗体，例如标签化、标记或装载的抗体。具体地，抗体可以用药物或毒素标签化或加载，或放射性地标记。这样的抗体的实例包括但不限于靶向CD20抗原的替伊莫单抗；靶向CD30抗原的本妥昔单抗和靶向HER2蛋白的曲妥珠单抗。可以使用的其他单克隆抗体是双特异性单克隆抗体，例如靶向淋巴瘤细胞中的CD19和T细胞中的CD3的blinatunomab。
如本文所用，术语“抗体片段”是指识别表位的抗体的任何部分。抗体片段可以是糖基化的。作为非限制性实例，抗体片段可以是Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、rIgG片段、功能性抗体片段、以上的单链重组形式等。F(ab')2、Fab、Fab'和Fv是可以从IgG和IgM的可变区产生的抗原结合片段。它们的大小、价数和Fc含量各不相同。片段可以通过任何方法产生，包括通过细胞或细胞系或者多个细胞或细胞系表达的成分(例如，重链和轻链部分)。优选地，抗体片段识别表位并含有足够的Fc区部分，使得其能够结合Fc受体。
如本文所用，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、肿瘤或恶性肿瘤，包括白血病、癌瘤和肉瘤。示例性癌症包括脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和成神经管细胞瘤。其他实例包括霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰岛软脑瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病灶、睾丸癌症、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺的肿瘤以及前列腺癌。
还提供了用如本文所述的经修饰的NK-92细胞治疗受试者的方法。任选地，受试者用经修饰的NK-92细胞和抗体治疗。
经修饰的NK-92细胞可按照细胞绝对数量施用于受试者，例如，所述受试者可施用约1000个细胞/注射至至多约100亿个细胞/注射，例如约、至少约或至多约1×1010、1×109、1×108、1×107、5×107、1×106、5×106、1×105、5×105、1×104、5×104、1×103、5×103(等等)个NK-92细胞/注射，或任何两个数字之间的任何范围(包括端点)。任选地，将1×108至1×1010个细胞施用于受试者。任选地，每周一次或多次施用细胞一周或多周。任选地，细胞每周施用一次或两次，持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周。
任选地，向受试者施用约1000个细胞/注射/m2至至多约100亿个细胞/注射/m2，例如约、至少约或至多约1×108/m2、1×107/m2、5×107/m2、1×106/m2、5×106/m2、1×105/m2、5×105/m2、1×104/m2、5×104/m2、1×103/m2、5×103/m2(等等)NK-92细胞/注射，或任何两个数字之间的任何范围(包括端点)。
任选地，NK-92细胞可以按照相对细胞数量施用于这样的个体，例如，所述个体可以施用约1000个细胞至至多约100亿个细胞/千克个体体重，例如约、至少约或至多约1×108、1×107、5×107、1×106、5×106、1×105、5×105、1×104、5×104、1×103、5×103(等等)个NK-92细胞/千克个体，或任何两个数字两个之间的任何范围(包括端点)。
任选地，总剂量可以通过身体表面积的m2计算，包括大约1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107/m2，或任何两个数字两个之间的任何范围(包括端点)。任选地，向患者施用约10亿至约30亿个NK-92细胞。任选地，每剂量注射的NK-92细胞的量可以通过身体表面积的m2计算，包括1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107/m2。
NK-92细胞和任选的其他抗癌剂可以一次施用给患有癌症的患者，可以多次施用，例如治疗期间每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时一次，或每1、2、3、4、5、6或7天一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周一次，或任何两个数字两个之间的任何范围(包括端点)。
任选地，NK-92细胞以包含NK-92细胞和培养基(例如人血清或其等同物)的组合物施用。任选地，培养基包含人血清白蛋白。任选地，培养基包含人血浆。任选地，培养基包含约1％至约15％的人血清或人血清等同物。任选地，培养基包含约1％至约10％的人血清或人血清等同物。任选地，培养基包含约1％至约5％的人血清或人血清等同物。任选地，培养基包含约2.5％的人血清或人血清等同物。任选地，血清是人AB血清。任选地，使用可接受用于人治疗剂中的血清替代物代替人血清。这样的血清替代物可以是本领域已知的。任选地，NK-92细胞以包含NK-92细胞和支持细胞存活力的等渗液体溶液的组合物施用。任选地，NK-92细胞以已从冷冻保存的样品重构的组合物施用。
根据本文提供的方法，向受试者施用有效量的一种或多种本文提供的药剂。术语有效量和有效剂量可互换使用。术语有效量定义为产生期望的生理反应(例如，减轻炎症)所需的任何量。用于施用药剂的有效量和方案可由本领域技术人员凭经验确定。用于施用的剂量范围是足够大以产生期望的效果的范围，其中疾病或病症的一种或多种症状受到影响(例如，减轻或延迟)。剂量不应大到引起显著的不良副作用，例如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随年龄、状况、性别、疾病类型、疾病或病症的程度、施用途径或其他药物是否包括在该方案中而变化，并且可由本领域技术人员确定。在任何禁忌症的情况下，个体医师可以调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天以一次或多次剂量施用，持续一天或几天。对于给定的药物产品类别，可以在文献中找到关于适当剂量的指导。例如，对于给定参数，有效量将显示至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％的增加或减少。功效也可以表示为“-倍数”增加或减少。例如，治疗有效量可以比对照具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更高的效果。确切的剂量和制剂将取决于治疗的目的，并且本领域技术人员可以使用已知技术确定(参见，例如，Lieberman,PharmaceuticalDosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology ofPharmaceutical Compounding(1999)；Remington:The Science and Practice ofPharmacy,22nd Edition,Gennaro,Editor(2012),and Pickar,Dosage Calculations(1999))。
药学上可接受的组合物可包括各种载体和赋形剂。可以使用各种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常没有不期望的物质。合适的载体和赋形剂及其制剂描述于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,DavidB.Troy,ed.,Lippicott Williams&Wilkins(2005)中。药学上可接受的载体是指不是在生物学上或其他方面不期望的材料，即，将材料施用于受试者不会引起不期望的生物学效应或以有害的方式与包含它的药物组合物的其他组分相互作用。如果施用至受试者，任选地选择载体以使活性成分的降解最小化并使受试者中的不良副作用最小化。如本文所用，术语药学上可接受的与生理学上可接受的和药理学上可接受的同义使用。药物组合物通常包含用于缓冲和在保存中防腐的药剂，并且可以包含用于适当递送的缓冲剂和载体，这取决于施用途径。
组合物可含有接近生理条件所需的可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的细胞和/或其它试剂的浓度可以变化，并且主要根据所选择的特定施用方式和受试者的需要，基于液体体积、粘度、体重等来选择。
任选地，将NK-92细胞与用于正在治疗的癌症的一种或多种其他治疗一起施用给受试者。不受理论的束缚，据信用NK-92细胞和另一种癌症疗法共同治疗受试者将允许NK-92细胞和替代疗法为内源免疫系统提供清除癌症(其迄今为止已经压倒了这样的内源作用)的机会。任选地，用于正在治疗的癌症的两种或更多种其他治疗包括例如抗体、放射、化学治疗剂、干细胞移植或激素疗法。
任选地，将抗体与NK-92细胞结合施用于患者。任选地，将NK-92细胞和抗体一起施用于受试者，例如，在相同的制剂中；单独地，例如，在单独的制剂中，同时施用于受试者；或者可以单独施用，例如，以不同的给药方案或在一天的不同时间。当单独施用时，抗体可以以任何合适的途径施用，例如静脉内或口服施用。
任选地，抗体可用于靶向癌细胞或表达癌症相关标志物的细胞。许多抗体已被批准单独用于治疗癌症。
表2.FDA批准的治疗性单克隆抗体的实例
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抗体可通过许多机制治疗癌症。当免疫细胞(例如NK细胞)与通过Fc受体(例如CD16)结合于靶细胞的抗体结合时，发生ADCC。
因此，将表达CD16的NK-92细胞与有效量的至少一种针对特定癌症相关蛋白的单克隆抗体，例如，阿仑单抗、贝伐单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、利妥昔单抗和曲妥珠单抗，一起施用于受试者。任选地，单克隆抗体是裸单克隆抗体、偶联的单克隆抗体或双特异性单克隆抗体。任选地，可以使用结合癌细胞并且还结合存在于NK-92细胞表面上的细胞表面蛋白的双特异性抗体。
癌症特异性抗体与在癌细胞表面上表达的特定蛋白质抗原结合。可以修饰NK-92细胞以使得抗体与NK-92细胞表面结合。任选地，抗体对癌症具有特异性。以这种方式，NK-92细胞可以特异性地靶向癌症。也可以分离中和抗体。例如，分泌的糖蛋白YKL-40在多种类型的晚期人类癌症中升高。预期YKL-40的抗体可用于抑制肿瘤生长、血管生成和/或转移。参见Faibish等,(2011)Mol.Cancer Ther.10(5):742-751。
针对癌症的抗体可以从市售来源购买，或者可以通过本领域已知的任何方法生产。例如，可以通过从先前被癌症感染并且在采集样品时恢复或正在恢复的一个或多个患者获得B细胞、骨髓或其他样品来产生抗体。从这些样品中鉴定、筛选和培养抗体(例如，单克隆抗体)的方法是已知的。例如，可以通过从感兴趣的样品或细胞中分离RNA，从分离的RNA制备cDNA，对于重链和/或轻链cDNA富集cDNA，以及使用噬菌体展示载体创建文库来制备噬菌体展示文库。可以如例如Maruyama等所述制备和筛选文库，其全部内容通过引用并入本文。抗体可以通过重组方法或任何其他方法制备。Beerli等，PNAS(2008)105(38)：14336-14341中也描述了人单克隆抗体的分离、筛选、表征和产生，其全部内容通过引用并入本文。
药剂或组合物的组合可以同时(例如，作为混合物)、单独但同时(例如，通过单独的静脉内线路)或顺序(例如，首先施用一种药剂，然后施用第二药剂)施用。因此，术语组合用于指两种或多种试剂或组合物的伴随、同时或顺序施用。治疗过程最好根据受试者的特定特征和所选治疗的类型逐个确定。治疗，如本文公开的那些，可以每天、每天两次、每两周、每月、或以治疗有效的任何适用基础被施用于受试者。治疗可以单独施用或与本文公开的或本领域已知的任何其他治疗组合施用。另外的治疗可以与第一治疗同时、在不同的时间或以完全不同的治疗方案(例如，第一治疗可以是每天的，而另外的治疗是每周的)施用。
还公开了包括所提供的经修饰的NK-92细胞的试剂盒。任选地，试剂盒还包括一种或多种另外的试剂，例如抗体。试剂盒的组分可以包含在一个或不同的容器中，例如一个或多个小瓶。抗体可以是液体或固体形式(例如，在冻干后)以增强保质期。如果是液体形式，组分可以包含添加剂，例如稳定剂和/或防腐剂，例如脯氨酸、甘氨酸或蔗糖或者其他增强保质期的添加剂。
任选地，试剂盒可包含另外的化合物，例如在经修饰的NK-92细胞或者NK-92细胞和抗体的施用之前、同时或之后施用的治疗性活性化合物或药物。这样的化合物的实例包括维生素、矿物质、氟氢可的松、布洛芬、利多卡因、奎尼丁、化学治疗剂等。
任选地，试剂盒的使用说明书将包括在癌症治疗中使用试剂盒组分的说明。说明书可以进一步包含关于如何制备(例如，在冷冻干燥的蛋白质的情况下，稀释或重构)抗体和NK-92细胞(例如，解冻和/或培养)的信息。说明书还可以包含关于施用剂量和频率的指导。
公开了可以用于、可以与其结合使用、可以用于制备或者作为所公开的方法和组合物的产物的材料、组合物和组分。这些和其它材料在本文中公开，并且应当理解的是，当这些材料的组合、子集、相互作用、组等被公开时，尽管可能未明确地公开对这些化合物的每种不同的个体和集体组合和排列的具体引用，但其每种都在本文中具体考虑和描述。例如，如果公开和讨论了一种方法并且讨论了可以对包括该方法的许多分子进行多种修饰，除非特别指出相反的情况，否则特别考虑可能的方法和修改的每种组合和排列。同样地，还特别考虑和公开了这些的任何子集或组合。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种另外的步骤，则应理解，这些另外的步骤中的每一个可以用所公开方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来执行，并且每个这样的组合或组合子集是特别考虑的并且应该被认为是公开的。
本文引用的出版物和引用它们的材料的全部内容通过引用并入本文。
以下实施例旨在进一步说明本文所述的方法和组合物的某些方面，并且不旨在限制权利要求的范围。
实施例
实施例1.haNK003的结构和功能特征。
NK-92[CD16.176V，ERIL-2](haNK003)通过NK-92细胞的修饰产生。NK-92细胞最初于1992年从具有快速进展的非霍奇金淋巴瘤的50岁男性患者中分离(Gong等，Leukemia，8(4)：652-8(1994))。NK-92细胞系随后表征并在表型上显示为CD56+、CD3-和CD16-，以及是IL-2依赖性的。haNK003是通过用含有CD16和IL-2序列的基于双顺反子质粒的载体进行NK-92细胞电穿孔的稳定转染而产生的异基因细胞系。转染的质粒由GeneArt AG构建。CD16序列编码氨基酸176处的缬氨酸(176V)，其允许增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)潜能。IL-2序列用内质网保留信号KDEL标记以防止IL-2蛋白从内质网(ER)分泌。包含IL-2序列使得haNKTM为IL-2非依赖性的。
EUFETS GmbH(Regensburg,Germany)通过电穿孔进行转染，并通过一轮限制稀释选择多个克隆。来自EUFETS的单个克隆被送到BioReliance以建立GMP主细胞库haNK003。对所选克隆的全基因组测序证实，质粒插入位点位于染色体17上15,654,977-15,661,403位置的单个位置处。
转染质粒
GeneArt AG基于提供的说明书构建质粒。合成基因pNEUKv1_FcRIL2由合成的寡核苷酸和PCR产物组装而成。使用EcoRI和NotI限制性位点将片段克隆到pNEUKv1_O059载体骨架中。pNEUKv1_O059是合成载体，其含有氨苄青霉素抗性盒。用于表达转基因的启动子是具有SV40多腺苷酸化序列的EF-1α。得到的质粒长度为5,491个碱基对(bp)，且含有CD16和IL-2的人源序列。CD16和IL-2都没有任何转化特性。从转化的细菌中纯化质粒DNA，并通过UV光谱确定其浓度。通过测序验证最终构建体。使用的限制性位点内的序列一致性(sequencecongruence)为100％。质粒在无TSE生产条件下制备。
pNEUKv1_FcRIL2质粒的完整核苷酸序列(SEQ ID NO:1)如下所示：
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为了产生haNK003细胞系，将一小瓶NK-92(aNK)主细胞库(MCB)(aNKCOA)和250mgpNEUKv1_FcRIL2质粒送至EUFETS GmbH。EUFET解冻MCB小瓶并将NK-92细胞培养至足够数量以用质粒转染。在转染后的前两天，转染的细胞在具有IL-2、X-Vivo 10和5％热灭活的人AB血清的培养基中生长。两天后，不再向生长培养基中加入IL-2，且任何转染并产生足够量IL-2的细胞继续生长。通过有限稀释分离多个克隆并初步筛选表型和Fc受体表达。六(6)个显示出良好的存活力(>70％)、可接受的倍增时间、预期表型和阳性Fc受体表达的克隆被送往German Red Cross GMP Testing Laboratory(GRC)进行更大量的筛选和单克隆的最终选择。在GRC处，测试所有克隆的表型(包括Fc受体表达)、ADCC、细胞因子谱、生长特征和辐射敏感性。所选择的细胞系haNK003用于生成主细胞库。
NantK west Master Cell Bank(MCB haNK003)由所选择的细胞系制备，并由BioReliance进行测试。测试MCB的纯度、效力、特性、无菌性和病毒/外来因子。将MCB以1×107个细胞/小瓶的等分试样在10％DMSO、40％X-Vivo 10、50％人AB血清的制剂中冷冻保存。在从冷冻保存产生的用于MCB的小瓶总数为218。
整合位点
将来自haNK003的DNA提取物提供给CLIA/CAP认证的NantOmics测序实验室(Culver City，CA)用于全基因组测序。使用KAPA Hyper prep试剂盒对于细胞系样品制备全基因组文库，并在Illumina HiSeq仪器上测序以提供25x的最小覆盖度，对于haNK003完成。通过bwa-mem将DNA测序数据与含有报告的plasma序列增强的Genome ReferenceConsortium Human Build37(GRCh37，也称为hg19，最初从加利福尼亚大学，Santa CruzGenome Browser-http://genome.ucsc.edu获得)比对，通过samblaster重复标记，且通过Genome Analysis Toolkit(GATK)进行indel重新比对和碱基质量重新校准。使用NantOmics Contraster分析流程进行变异分析以确定变体，包括单核苷酸的变化、小插入或缺失(indels)、拷贝数变化、重排和整合位点。通过NantOmics Genome Browser可视化整合的质粒和得到的整合位点，并在UCSC Genome Browser上进行进一步比较和可视化以鉴定与现有基因组元件的任何潜在相互作用。
haNK003显示出映射于chr17:15654977-15661403的不一致阅读取证据。最接近的5'基因TBC1D26(chr17:15,635,591-15,644,255)在上游10,722bp，和最接近的3'基因ADORA2B(chr17:15,848,231-15,871,210)在下游186,828bp。对于TBC1D26所知很少，除了UniProt中注释为Rab家族蛋白的GTP酶激活蛋白。ADORA2B注释为在腺苷存在下刺激腺苷酸环化酶活性的膜蛋白(Strohmeier等,J.Biol.Chem.270(5):2387-2394(1995))。对于标记pNEUKv1_FcRIL的编码序列，在两个注释的ORF中未发现编码变体。UCSC Encode轨迹和lincRNA显示插入位点下游的lincRNA转录物的证据(TCONS_12_00011108)，然而它在3'整合位点下游约2,450bp，表明该转录物可能仍然完整。对脊椎动物物种的100路多重比对的研究表明整个整合位点上碱基水平的保守性非常低，负对数p值在-3.874至1.507范围内，保守平均值为0.01，标准偏差为0.58。
haNK003不包含在人类基因组整合位点中的基因、转录物或调控断裂的证据。细胞系haNK003的整合距任何基因至少10kbp。细胞系是可接受的，因为没有靶细胞系人类基因组中的任何已知基因组特征破坏的证据。
生长特征
用于产生MCB haNK003的克隆细胞系haNK003的生长特征显示在图1A和1B中。分析来自生长用于主细胞库冷冻保存的细胞系haNK003的细胞培养历史的数据。从第3天到第29天，平均倍增时间为65(48-95)小时。在传代过程中达到相当的细胞密度，证明haNK003细胞在每3至4天传代和以约0.3-0.5x106个细胞/mL的密度接种时恒定生长。
表型
进行研究以量化haNK003细胞表面上的一组六种蛋白质标志物的表达，并将haNK003谱与亲本细胞系NK-92(aNK)的谱进行比较。选择天然杀伤细胞(NK)代表性的表面标志物的组。
aNK细胞在早期分化阶段表达NK细胞典型的表面标志物，其表达多种激活受体，包括NKG2D和NKp30，但缺乏FcγRIIIa(CD16)和抑制性KIR(杀伤免疫球蛋白样受体)。aNK细胞的这种特殊表面标志物表达谱为它们提供了独特的细胞毒性性质。因此，确认通过编码高亲和力FcγRIIIa和细胞内保留的IL-2(ERIL-2)的质粒的稳定转染产生的haNK003细胞系不改变亲本aNK细胞系的关键表面标志物的表达谱是重要的。分析表面标志物CD54、CD56、NKG2D、NKp30、CD3和CD16，并通过用特异性荧光染料偶联的抗体染色细胞并通过流式细胞术检测结合的抗体来确定标志物表达。
流式细胞术分析的结果总结在表1中，且代表性的直方图在图2中提供。
表1.表面标志物的表达。
％＝表达阳性细胞的百分比±标准偏差
如通过平均值荧光强度确定的，haNK003和aNK表达相当量的CD54、CD56、NKG2D和NKp30。另外，表达这些标志物的细胞的百分比是等同的。haNK003和aNK都不表达作为T细胞标志物的CD3。如预期的，haNK003表达CD16标志物，而aNK不表达。
haNK003细胞系的产生未改变亲本aNK细胞系的关键表面标志物的表达，并且仅以CD16表达的形式增加了另外的功能性。
细胞毒性
在各种效应细胞与靶细胞比率(E：T)下针对细胞系K562、Raji、SKOV3和SKBR3评估haNK003细胞系的天然细胞毒性。还以各种E：T比率针对细胞系Raji、SKOV3和SKBR3评估haNK003的ADCC活性。不同靶细胞系对通过天然细胞毒性的haNK杀伤的敏感性不同，其中K562细胞系是最敏感的并且实体肿瘤细胞系(SKOV3和SKBR3)较不敏感(图3A、3B、3C和3D)。还观察到haNK003 ADCC活性对不同靶细胞系的一些变异，其中在Raji细胞中与利妥昔单抗组合观察到最高的特异性裂解(图4A、4B和4C)。
结果表明，haNK003细胞在几种癌细胞的存在下表现出天然细胞毒性，并且能够增强通过利用抗体的ADCC的特异性裂解。表2中提供了haNKTMMCB(haNK003)的规格和结果。
表2.haNK003细胞的规格。
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a-虽然检测到EBV病毒基因组，但NK-92(aNK)的测试确定细胞不会引起EBV感染。通过将aNK细胞(辐射的和非辐射的)与B淋巴细胞共培养来进行感染性研究以确定aNK细胞是否释放能够感染正常细胞的病毒颗粒。结果显示没有B淋巴细胞增殖或生长的迹象，表明aNK细胞不会引起EBV感染的风险。
实施例2.辐射对体外增殖能力和功能的影响
haNKTM细胞经辐射以减轻不受抑制的增殖的风险。评估辐射对体外增殖能力和功能的影响。这些研究表明，10Gy的辐射抑制至少99.9％的haNK细胞的增殖能力，同时仍保持功能活性辐射后至少6小时。
haNK003细胞表现出天然(直接)细胞毒性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)两者。在两种情况下，靶细胞抗原被NK细胞上的激活受体识别。对于天然细胞毒性，这些靶细胞抗原是病毒感染或转化的细胞特征性的应激抗原。对于ADCC，抗原是被抗体识别的肿瘤特异性抗原，该抗体随之通过其恒定(Fc)区与NK细胞激活受体FcγRIIIa(CD16)结合。
NK细胞与靶细胞配体的相互作用(通过直接相互作用或通过抗体介导的相互作用)导致细胞连接的形成和随后的穿孔素和颗粒酶的释放。这反过来在靶细胞内诱导细胞凋亡过程，导致细胞膜崩解和靶细胞死亡。
进行了一项研究以确定在预先配制的细胞上10Gy的γ辐射后自然细胞毒性和ADCC活性的水平以及该活性的持续时间。对于该研究，每个烧瓶1.5×107个细胞被辐射。尽管经受辐射的细胞数量与用于制造临床剂量的细胞数量不相等，但是辐射后的功能性的测定将提供对制造能力的深入了解。
出于这些实验的目的，使用X射线放射仪以10Gy对haNK003细胞进行辐射。非辐射的细胞进行相同的操作而不辐射。选择靶细胞以代表NK细胞对不同杀伤机制的敏感性。例如，K562细胞对通过天然细胞毒性的杀伤高度敏感，而DOHH对通过天然细胞毒性的杀伤部分敏感，但对具有适当抗体的ADCC敏感。使用内部开发的基于流式细胞术的测定辐射和非辐射的细胞进行特异性细胞毒性的平行测定。用具有长脂族尾部的绿色荧光染料(PKH67)标记靶细胞以将染料稳定地掺入细胞膜的脂质区域中。通过碘化丙锭染色监测细胞裂解。
天然细胞毒活性的分析表明，辐射的影响随靶细胞和辐射后时间而变化。对于敏感的细胞例如K562，天然细胞毒性活性在辐射的6小时内维持，但在24小时后在所有效应-靶比率(E：T)下降低了40％(图5)。对于DOHH2，天然细胞毒性活性在辐射后6小时保持，但在24小时后在所有效应物-靶比率下降低了14％或更多，并且在10：1的E：T比率为下降低多达50％(图6)。
对于DCCH2靶细胞的利妥昔单抗介导ADCC活性的水平也在6小时时由辐射的细胞维持。然而，24小时时辐射细胞的利妥昔单抗介导的ADCC活性从在6小时细胞观察到的和24小时时非辐射细胞的活性降低约16％或更多(图7)。如所预期的，赫赛汀(曲妥珠单抗)与haNK003组合不诱导任何DOHH2靶细胞的ADCC杀伤(图4)，单独的抗体(利妥昔单抗或曲妥珠单抗)也不诱导任何DOHH2靶细胞杀伤(数据未显示)。
在预先配制的haNK003细胞辐射后，相关的细胞毒性活性和ADCC活性的水平维持至少6小时。
实施例3.IL-2释放的表征
进行研究以分析haNK003细胞释放到培养基中的IL-2的量以及在各个不同时间点haNK003细胞中细胞内保留的IL-2的量。在上清液中测量IL-2的量以确定haNK003的IL-2释放。在细胞沉淀裂解物中测量IL-2的量以确定haNK003的细胞内IL-2的总水平。在辐射前和辐射后分析样品以确定辐射对IL-2释放和细胞内IL-2水平的影响。
进行两个独立的测定(试验#1和试验#2)，其中haNK003细胞在T-75烧瓶中培养，并使用X射线放射仪以0Gy(无辐射)或10Gy(辐射)照射。然后将haNK003细胞(非辐射和辐射的)在含有5％热灭活的人AB血清的X-Vivo 10中培养长达48小时。收集来自培养物上清液及细胞沉淀的样品用于在各个不同时间点进行分析。使用基于去垢剂的溶液裂解细胞沉淀以定量总细胞内IL-2。使用两种不同的检测方法(夹心ELISA或多重ELISA)在NantKwest或由AllCells，LLC独立测量培养物上清液和细胞裂解物样品中的IL-2浓度。
对于相同的样品，通过两种不同方法测量的IL-2浓度值平均相差五倍。对于辐射和非辐射细胞两种方法均显示IL-2释放随时间的线性增加(表3和图8A、8B、8C和8D)。在所有时间点，辐射细胞的培养上清液中的IL-2浓度倾向于比非辐射细胞高，尽管测定试验#1和#2之间的差异是不同的。
表3.在不同时间点辐射的haNK003细胞相对于非辐射的haNK003细胞的每1×106个细胞的IL-2释放(pg/mL)(重复读数的平均值和标准偏差[StDev])
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h-小时
对于相同的样品由两种不同的方法测量的总细胞内IL-2浓度值平均相差五倍(表4和图9A、9B、9C和9D)。两种方法均显示非辐射的细胞裂解物中总细胞内IL-2随时间的增加，而辐射的细胞裂解物中总细胞内IL-2的量随时间降低。在培养6小时时，如通过两种方法测量的，辐射和非辐射细胞之间总细胞内IL-2水平相当。在辐射的细胞中，这些水平在培养48小时后降低。
表4.在各个不同时间点辐射的haNK003细胞相对于非辐射的haNK003细胞的每1×106个细胞的总细胞内IL-2含量(pg)(重复读数的平均值和标准偏差[StDev])
h-小时
为了模拟细胞坏死时IL-2的释放，细胞经历低渗性休克。将该水平与使用基于去垢剂的方法制备的细胞裂解物中测量的总细胞内IL-2浓度进行比较。对于相同的样品，由两种方法(夹心或多重ELISA)测定的溶解IL-2浓度值相差约10倍(表5和图10A和10B)。来自低渗性休克的裂解物中的IL-2浓度为181.93-289.54pg/106个细胞(夹心ELISA)和2619.15-3301.02pg/106细胞(多重ELISA)，其代表使用基于去垢剂的裂解制备的细胞裂解物中测量的总细胞内IL-2浓度的平均14％(夹心ELISA)至27％(多重ELISA)。
表5.每1×106个haNK003细胞的溶解IL-2的量(pg)(重复读数的平均值和标准偏差[StDev])。
多重ELISA IL-2定量值比夹心ELISA方法的数据高5至10倍。尽管这两种方法的绝对值存在差异，但两个数据集之间的趋势是一致的，并总结如下。随着产品的进一步开发，该数据可用于使NantKwest继续表征haNK003细胞的IL-2分泌和细胞内IL-2水平。
总之，haNK003细胞向培养基中释放可检测量的IL-2(每百万细胞10至40pg/小时)，并且在稳态培养条件下活细胞释放的IL-2的量代表平均小于总细胞内IL-2储存(stock)的10％。
10Gy剂量的haNK003细胞辐射在48小时内增加释放的IL-2的量，可能反映了垂死细胞的存在。此外，辐射不会导致IL-2的一次性释放，而是随时间逐渐释放。
为了模拟坏死细胞死亡时IL-2的释放，使haNK003细胞经受低渗性休克。在这些条件下释放的IL-2的量代表TritonX-100裂解物(其溶解来自所有细胞内区室的蛋白质)中测定的总细胞内IL-2的14至27％。
总体而言，haNK003细胞分泌低水平的IL-2(两种方法的所有试验中进行平均时，6小时内对于辐射的细胞为493.8pg/mL，和对于非辐射的细胞为276.1pg/mL)。总之，haNK003细胞分泌的低水平IL-2、血浆中IL-2的极短半衰期和辐射的haNK003细胞的体内持久性的缺乏表明通过输注haNK003的IL-2释放不太可能引起临床不良反应。
如在用预先配制的细胞进行的开发研究中所测试的，辐射对体外增殖能力和功能的影响表明haNK003细胞在体外具有有限的增殖(小于0.1％的细胞)并且细胞毒性活性和ADCC活性的水平在辐射后保持至少6小时。
辐射前和辐射后haNK003细胞的IL-2分泌和细胞内IL-2水平表明haNK003细胞分泌低水平的IL-2。辐射或非辐射的haNK003细胞不释放预期对人类具有不良影响的IL-2量。
实施例4.静脉内施用的单剂量haNK003细胞的耐受性和致瘤性。
自然杀伤(NK)细胞是用于癌症治疗并且可能用于病毒感染的有效细胞毒性效应细胞。NantKwest已经成功建立了独特的基于NK细胞的平台以产生GMP级的激活NK(aNK细胞)。aNK细胞在临床上正在积极地寻求用于对患有各种晚期血液恶性肿瘤和实体肿瘤的患者的细胞治疗。最近，利用含有ER IL-2基因的新型转染载体开发了表达高亲和力CD16受体的GMP级质粒转染的NK-92变体，使得所得的haNK003细胞能够不依赖于IL-2生长。高亲和力CD16受体的表达使得haNK003细胞与利妥昔单抗和曲妥珠单抗以及达雷木单抗组合能够对不被亲本NK-92细胞杀死的靶细胞系显示高抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，。选择一个细胞克隆以产生正在进行临床开发的主细胞库haNK003。
材料和方法
十八(18)只NOD.CB17-PRKDCSCID/J(NOD/SCID)小鼠(9只雄性和9只雌性)用于研究在NOD/SCID小鼠中静脉内施用的单剂量haNK003细胞的耐受性和致瘤性。小鼠从JacksonLaboratory(610Main Street Bar Harbor，ME04609 US)获得。
选择18只NOD/SCID小鼠并根据动物体重随机分配到每组6只小鼠的3个组(3只雄性和3只雌性)。如表6所示，小鼠静脉内施用单剂量的PBS、非辐射的或10-Gy辐射的haNK003细胞。然后通过每日观察和每周两次动物体重测量监测动物。5周后，对动物实施安乐死并收获主要器官和进一步进行组织病理学检查和用抗CD56抗体的免疫组织化学分析。
表6.研究设计
对于细胞培养，将haNK003细胞在补充有5％热灭活人AB血清(Cat#IPLA-SERAB-HI，Innovative Research)，100U青霉素/ml和100μg/ml链霉素(Corning，Cat#30-002-CI)的X-Vivo10培养基(Cat#BE02-055Q)中培养。
对于辐射，收获指数生长期生长的haNK003细胞并计数活细胞数和存活力。在适当的一天，使用JL Shephard Mark 1Model 68137Cs放射仪(由Department of RadiationOncology,the University of California,Irvine,CA 92697提供的服务)用1000cGy剂量辐射一半haNK003细胞。
对于用于给药的细胞制备物，在运输到动物中心(1124W.Carson Street，Torrance，CA，90502)期间，将非辐射或辐射的haNK003细胞保持在冰上。将细胞用冷的PBS洗涤两次，然后重悬于适量的冷PBS中，并通过40μm细胞过滤器以制备具有5×107活细胞/ml的最终细胞密度的单细胞制剂。细胞存活力用Vi-CELL细胞存活力分析仪确定，并且仅具有超过85％存活力的细胞用于本研究。然后分别将这些非辐射或辐射的haNK003细胞在室温下储存用于IV给药至适当组的动物。
选择18只NOD/SCID小鼠并根据动物体重随机分配到每组6只小鼠的3个组(3只雄性和3只雌性)。
在适当的一天，A组中的每只动物分别接受特定量的PBS。无论个体动物体重如何，给药体积为200μl。给药途径是通过尾静脉的IV注射，并且给药方案是单剂量，如研究方案中所示。在适当的一天，B组和C组中的每只动物分别接受200μl PBS中的1×107个非辐射和辐射的haNK003细胞。给药体积为200μl，给药途径为经由尾静脉的IV注射；给药方案是单剂量。
每天一次观察动物的总体外观。每天两次进行临床观察并记录。在治疗后常规监测对动物的正常行为的影响，例如移动、食物和水的消耗(通过目测)和体重(增加/减少)。
在每个时间点为每组的动物体重提供总结统计，包括平均值和平均值的标准误差(SEM)。使用重复测量的双因素ANOVA，然后Bonferroni检验来评估组间动物体重变化差异的统计学分析。使用GraphPad Prism软件版本5分析所有数据。p<0.05被认为是统计学显著的。
结果
作为单一药剂静脉内施用的1×107个细胞剂量的非辐射或辐射的haNK003细胞良好耐受，最大平均体重损失分别为5.2％和4.4％。与PBS处理的对照组相比，当施用单剂量的辐射或非辐射的haNK003细胞(1×107)时，NOD/SCID小鼠没有显著的体重减少，如表7、图11中所示。如表7所示，在所有处理组中，没有在5周的观察中发生的任何与治疗相关的死亡。
无论是雄性或雌性小鼠，在所有处理组中所评估的所有组织和器官(包括脑、心脏、肝、肺、肾、脾和胸腺)中都没有任何可见的肿瘤块。组织学分析和使用抗CD56抗体的IHC染色的结果证实组织和器官(包括脑、骨髓、心脏、肝、肺、肾、脾和胸腺)中没有任何haNK003细胞相关的淋巴聚集体，这表明非辐射和辐射的haNK003细胞两者在NOD/SCID小鼠中没有致瘤潜能。
对研究中获得的所有标本(包括脑、骨髓、心脏、肝、肺、肾、脾和胸腺)进行的病理学检查表明非辐射或辐射的haNK003细胞处理组相比于PBS处理组没有任何显著的haNK003治疗相关毒性。
表7.静脉内施用的haNK003对NOD/SCID小鼠的动物体重、死亡率和致瘤性的影响。
注：aMWL：最大体重损失；bp-值(重复测量的双因素ANOVA，然后Bonferroni检验)，相对于PBS处理；c(n/总)：治疗相关动物死亡数/单个组中动物总数。
1×107个细胞的剂量作为单一药剂静脉内施用的辐射或非辐射haNK003细胞在雄性和雌性NOD/SCID小鼠两者良好耐受。没有与辐射或非辐射的haNK003治疗相关的显著体重损失。在所有处理组中，没有在5周的观察中发生的任何治疗相关的死亡。主要器官(包括脑、骨髓、心脏、肝、肺、肾、脾和胸腺)中均无任何显著的病理改变。最重要的是，辐射或非辐射的haNK003细胞在雄性和雌性NOD/SCID小鼠两者中都没有致瘤潜能。
实施例5.静脉内施用的重复剂量haNK003细胞的耐受性和致瘤性。
材料和方法
十八(18)只NOD.CB17-Prkdcscid/J(NOD/SCID)小鼠(9只雄性和9只雌性)用于研究在NOD/SCID小鼠中静脉内施用的单剂量haNK003细胞的耐受性和致瘤性。小鼠从JacksonLaboratory(610Main Street Bar Harbor，ME 04609US)获得。
选择18只NOD/SCID小鼠并根据动物体重随机分配到每组6只小鼠的3个组(3只雄性和3只雌性)。如表8所示，小鼠分别静脉内施用重复剂量的PBS、非辐射的或10-Gy辐射的haNK003细胞，每周一次，持续4周。然后通过每日观察和每周两次动物体重测量监测动物。5周后，对动物实施安乐死并收获主要器官和进一步进行组织病理学检查和用抗CD56抗体的免疫组织化学(IHC)分析。
表8.研究设计。
对于细胞培养，haNK003细胞在补充有5％热灭活人AB血清(Cat#IPLA-SERAB-HI，Innovative Research)，100U青霉素/ml和100μg/ml链霉素(Corning，Cat#30-002-CI)的X-Vivo10培养基(Cat#BE02-055Q)中培养。
对于辐射，收获在指数生长期生长的haNK003细胞并计数活细胞数和存活力。在适当的一天，使用JL Shephard Mark 1Model 68137Cs放射仪(由Department of RadiationOncology,the University of California,Irvine,CA 92697提供的服务)用1000cGy剂量辐射一半haNK003细胞。
对于用于给药的细胞制备物，在运输到动物中心(1124W.Carson Street，Torrance，CA，90502)期间将非经辐射或辐射的haNK003细胞保持在冰上。将细胞用冷的PBS洗涤两次，然后重悬于适量冷PBS并通过40μm细胞过滤器以制备具有5×107细胞/ml的最终细胞密度的单细胞制剂。细胞存活力用Vi-CELL细胞存活力分析仪确定，并且仅具有超过85％存活力的细胞用于本研究。然后这些非辐射或辐射的haNK003细胞分别在室温下储存用于IV给药至适当组的动物。
选择18只NOD/SCID小鼠并根据动物体重随机分配到每组6只小鼠的3个组(3只雄性和3只雌性)。
在适当的一天，A组中的每只动物接受200μl PBS，无论个体动物体重如何。给药途径是通过尾静脉的静脉注射，并且给药方案是每周一次，总共4周，如研究方案(附录1)所示。B组和C组中的每只动物分别接受200μl PBS中的1×107个非辐射和辐射的haNK003细胞。给药体积为200μl，给药途径是通过尾静脉的IV注射，并且给药方案是每周一次，总共4周，如研究方案中所示。
每天一次观察动物的总体外观。每天两次进行临床观察并记录。动物常规监测在治疗后对正常行为的影响，例如移动、食物和水的消耗(通过目测)和体重(增加/减少)。
在每个时间点为每组的动物体重提供总结统计，包括平均值和平均值的标准误差(SEM)。使用重复测量的双因素ANOVA，然后Bonferroni检验评估组间动物体重变化差异的统计学分析。使用GraphPad Prism软件版本5分析所有数据。p<0.05被认为是统计学显著的。
结果
以1×107个细胞的剂量作为单一药剂静脉内施用每周一次持续4周的非辐射或辐射的haNK003细胞耐受良好，最大平均体重损失分别为3.4％和4.9％。无论是雄性或雌性小鼠，与PBS处理的对照组相比，当施用非辐射或辐射的haNK003细胞(1×107)时，NOD/SCID小鼠没有显著的体重损失，如表9、图12所示。如表9所总结的，在所有处理组中，没有在5周的观察中发生的任何与治疗相关的死亡。
表9.在NOD/SCID小鼠中haNK003细胞对动物体重、死亡率和致瘤性的影响。
注：aMWL：最大体重损失；bp值(重复测量的双因素ANOVA，然后Bonferroni检验)，相对于PBS处理；c(n/总)：治疗相关动物死亡数/单个组中动物总数。
本研究中获得的所有标本(包括脑、骨髓、心脏、肝、肺、肾、脾和胸腺)的宏观病理学和组织病理学检查表明，与PBS处理的对照组相比，在非辐射或辐射的haNK003细胞处理组中这些器官中没有任何显著的haNK003处理相关毒性。在所有动物中没有鉴定的脾肿大。在所有处理组中没有通过肉眼观察发现的肿瘤团块。使用抗CD56抗体的IHC的结果证实，在5周的随访内，组织和器官(包括骨髓、脑、肝脏、肺、心脏、肾、脾、胸腺等)中没有任何haNK003细胞相关的淋巴样聚集物，这表明在这5周内NOD/SCID小鼠中没有与辐射或非辐射的haNK003细胞相关的白血病或肿瘤发展。
所有这些组织中没有水肿、没有变性、也没有坏死存在。与PBS对照组相比，分别在非辐射和辐射的haNK003处理组中注意到肝组织中非常局灶性的轻度和最小脂肪变化。同样值得注意的是，PBS、非辐射或辐射haNK003处理组中的肝实质显示罕见的混合炎性细胞(包含嗜中性粒细胞和单核细胞)的微小病灶，因为这些小簇细胞是CD56阴性的，表明这些混合炎性细胞很可能是由重复程序(尾静脉注射)导致，与haNK003处理无关。
总之，非辐射和辐射的HaNK003细胞具有良好的耐受性。在该给药方案中，在NOD/SCID小鼠中没有任何显著的haNK003治疗相关毒性或致瘤性问题。
实施例6.aNK和haNK003天然细胞毒性活性的比较
自然杀伤(NK)细胞杀死靶细胞的主要机制是通过形成细胞连接并随后分泌穿孔素和颗粒酶。这随之在靶细胞内诱导细胞凋亡过程，导致质膜崩解和细胞死亡。靶细胞可以通过病毒感染细胞和/或转化细胞特有的应激抗原的表达来识别。通过应激抗原与NK细胞上的激活受体的啮合识别和随后靶细胞的杀灭被称为天然(或直接)细胞毒性。
由于天然细胞毒性是NK细胞的主要功能特征，因此对细胞变体的这种功能性的分析以及与激活的NK-92细胞(aNK)活性的比较可以帮助确定aNK细胞的特定遗传修饰的影响。
材料和方法
选择液体和实体肿瘤代表性的六(6)个细胞系作为靶标。还选择靶标以代表对aNK细胞杀伤的一系列敏感性，其中SR-91对杀伤相对不敏感而K562对杀伤高度敏感，且其他则介于两者之间。将靶细胞和效应细胞(haNK003或aNK)在37℃下共孵育4小时，并使用内部开发的方法通过流式细胞术测定靶细胞杀灭以确定效应细胞对加载有PKH67荧光染料染色的靶细胞的特异性细胞毒性。PKH67荧光细胞接头试剂盒使用专有的膜标记技术(Sigma-Aldrich)将绿色荧光染料与长脂族尾(PKH67)稳定地整合到细胞膜的脂质区域中。由于其较长的脂肪族碳尾，PKH67表现出减少的细胞-细胞转移。PKH67非常适合使用碘化丙啶作为存活力探针的细胞毒性测定。用碘化丙锭染色区分死的靶细胞(被加倍染色)与死的效应细胞(aNK或haNK细胞)。
对于细胞培养，在补充有5％热灭活的人AB血清(来自CMV阴性测试供体)和500IU/ml重组人IL-2的X-Vivo10培养基中培养aNK细胞。每1-4天传代aNK培养物以保持细胞密度>10e5细胞/mL和<10e6细胞/mL。将haNK003细胞在补充有5％热灭活的人AB血清(来自CMV阴性测试供体)而不含IL-2的X-Vivo10培养基中培养。每1-4天传代haNK003培养物以保持细胞密度>10e5细胞/mL和<10e6细胞/mL。K562、Daudi、DOHH2、HL-60、SR-91和SKOV3细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS)和抗生素/抗霉菌剂混合物的RPMI-1640中培养。悬浮生长的细胞通过简单稀释传代，而贴壁细胞(SKOV3)使用TrypLETM通过培养物胰蛋白酶消化来传代。每2-5天(取决于细胞系的特定倍增时间)、或每当培养基呈黄色(酸性)指示更换培养基时进行传代。
对于样品制备，通过上下吸打细胞培养物来重悬悬浮生长细胞系。使用TrypLETM将贴壁的靶细胞系(SKOV3)从培养容器酶促脱离，并通过上下吸打胰蛋白酶消化的细胞沉淀来重悬。通过人工计数(台盼蓝排除法)测定细胞存活力。在补充有10％热灭活的FBS和抗生素/抗真菌剂的RPMI-1640中制备靶细胞和效应细胞稀释液至所需细胞浓度。将效应细胞和靶细胞以不同的效应-靶标(E：T为20：1、10：1、5：1、2.5：1、1.25：1、0.62：1、0.31：1和0.15：1)比率在96孔板中混合，并且在5％CO2气氛37℃的培养箱中共孵育4小时。
使用B1(FITC)和B3(PerCP-Vio700/PI)荧光通道在MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi)上分析样品。单独靶标-PI和+PI用于确定B1/B3补偿参数。
细胞毒性％通过下式计算：[(样品中FITC+/PI+细胞％)-(仅靶细胞+PI中FITC+/PI+％)]/[100-(仅靶标PI+中FITC+/PI+PI％)]
结果
用于该研究的aNK和haNK003细胞于2016年7月22日解冻。本研究中使用的所有靶细胞培养物均不到8周龄。在测定前靶细胞和效应细胞培养物以最多48小时传代。
图13-18中显示的结果证实了靶细胞系对aNK杀伤的敏感性，其中K562是最敏感的(在1：1的低效应-靶比率下75％特异性裂解)。Daudi、DOHH2和HL-60显示出中等敏感度，需要较高的效应-靶比率(10：1)以实现65-80％的特异性裂解。SKOV3和SR-91是最具抗性的，需要超过10：1的效应-靶比率以实现约40％的特异性裂解。在每种情况下，haNK003的天然细胞毒性活性与aNK的天然细胞毒性活性相当，并且通常在实验的误差范围内遵循相同的活性分布。
aNK和haNK003细胞对测试的六种癌细胞系显示出相当的细胞毒性活性，证实aNK细胞的天然细胞毒活性基本相同，不管用于产生haNK003细胞的遗传修饰。haNK003细胞和aNK细胞在与天然细胞毒性活性相关的功能上相当。
实施例7.评估haNK003在MDA-MB-453人乳腺癌皮下小鼠模型中的抗肿瘤活性。
在这项研究中，在雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NOD scid gamma,NSG)小鼠的MDA-MB-453人乳腺癌皮下异种移植模型中评估haNK003细胞作为单一药剂的抗肿瘤活性。
材料和方法
十二只NOD.Cg-PRKDCSCIDII2rgtm1Wjl/SZJ(NOD scidγ,NSG)小鼠用于评价haNK003在MDA-MB-453人乳腺癌皮下(sc)异种移植模型中的抗肿瘤活性。小鼠从JacksonLaboratory(610Main Street Bar Harbor，ME 04609US)获得。
在雌性NSG小鼠中建立MDA-MB-453HER2阳性人乳腺癌sc异种移植模型。一旦肿瘤的平均大小达到约100mm3，就开始治疗，并且在该异种移植模型中评估haNK003细胞作为单一药剂的抗肿瘤活性。其他测试物在LABC-X01612方案下平行评估，但本文仅列出了haNK003与PBS相比的结果。表10中描述了haNK003处理组和给药方案设计。
表10.研究设计。
对于肿瘤细胞培养，MDA-MB-453人乳腺癌细胞(ATCC，Cat#HTB-131)在补充有10％热灭活FBS(GeneTex，Cat#GTX73252)、100U青霉素/ml和100μg/ml链霉素(Corning，Cat#30-002-CI)的ATCC配制的Leibovitz L-15培养基(ATCC，Cat#30-2008)中培养。
对于肿瘤细胞注射，每只动物称重，然后用25号针头将在50％Matrigel(Corning，Cat#354234)中0.1ml的1.0×108MDA-MB-453人乳腺癌细胞/毫升皮下注射至左和右侧腹区域。用Vi-CELL细胞存活力分析仪测定细胞存活力，并且仅具有超过95％存活力的细胞用于该体内研究。
对于haNK003细胞培养，将haNK003细胞在补充有5％热灭活的人AB血清(Innovative Research，Cat#IPLA-SERAB-HI)、100U青霉素/ml和100μg/ml链霉素的X-Vivo10培养基(Lonza，Cat#BE02-055Q)中培养。
对于辐射，收获在指数生长期生长的haNK003细胞并计数活细胞数和存活力。在适当的一天，使用JL Shephard Mark 1Model 68137Cs放射仪(由Department of RadiationOncology,the University of California,Irvine,CA 92697提供的服务)以1000cGy剂量辐射haNK003细胞。
对于用于给药的细胞制备，在运输到动物中心(1124W.Carson Street，Torrance，CA，90502)期间将非辐射或辐射的haNK003细胞保持在冰上。将细胞用冷的PBS洗涤两次，然后重悬于适量冷PBS中，并通过40μm细胞过滤器(Corning,Cat#431750)以制备分别具有1.25×107或5×107细胞/ml的最终细胞密度的单细胞制剂。然后将这些辐射的haNK003细胞在室温下储存分别用于IV给药至适当组的动物。
选择12只NSG小鼠并基于适当的肿瘤大小随机分配到3个研究组，每组4只小鼠。基于每只动物的总肿瘤体积和动物体重进行随机化。对于该功效研究，一旦肿瘤的平均大小达到约100mm3，就进行随机化并开始治疗。
无论个体动物体重如何，给药体积均为200μl。给药途径是通过尾静脉的IV注射，并且给药方案是每周两次，共4周，如研究方案所示。在适当的一天，F组和G组中的每只动物分别接受在200μl PBS中的2.5×106和1×107个辐射haNK003细胞。给药体积为200μl，给药途径为通过尾静脉的IV注射，给药方案为每周两次，共4周。
每天一次观察动物的总体外观。每天两次进行临床观察并记录。在治疗后常规监测对动物的正常行为的影响，例如移动、食物和水的消耗(通过目测)和体重(增加/减少)。
在第一次给药之前(一旦肿瘤出现)和在安乐死之前每周两次使用数字手持式卡尺每周两次三维测量肿瘤大小。主要终点是肿瘤生长的抑制或减少。肿瘤体积使用下式以mm3表示：V＝0.5×L×W×H，其中L、W和H分别是肿瘤的长度、宽度和高度。然后将肿瘤体积用于计算T/C值。T/C(％)＝ΔT/ΔC×100，其中ΔT和ΔC分别是处理组和对照组的观察日和第一测量日之间的平均肿瘤体积的变化。
在每个时间点对每组的肿瘤体积或动物体重提供总结统计，包括平均值和平均值的标准误差(SEM)。使用重复测量的双因素ANOVA，然后Bonferroni检验评估组间肿瘤体积或动物体重变化差异的统计学分析。使用GraphPad Prism软件版本5分析所有数据。p<0.05被认为是统计学显著的。
结果
提供了haNK003作为单一药剂在雌性NSG小鼠的s.c.MDA-MB-453HER2-阳性人乳腺癌异种移植物中的抗肿瘤活性的数据。结果总结列于表11中。haNK003细胞作为单一药剂以2.5×106或1.0×107细胞的剂量每周两次持续4周静脉内施用，显著抑制了肿瘤生长，T/C值分别为17.4％和1.3％(p＝0.043和p＝0.006，与PBS组相比)，如表11、图19所示。剂量为2.5×106或1.0×107细胞的HaNK003具有良好的耐受性，最大平均体重减轻分别为0.6％和5.6％(p＝0.203，p＝0.085，与PBS组相比)，如表11、图20所示。在本研究中没有发生任何haNK003治疗相关的死亡，如表11中总结的。
表11.haNK003细胞在雌性NSG小鼠的MDA-MB-453人乳腺癌皮下异种移植模型中的抗肿瘤活性。
注：a使用下式计算T/C(％)：T/C(％)＝ΔT/ΔC×100，其中ΔT和ΔC分别是处理组和对照组第26天和测量第一天之间平均肿瘤体积的变化。b MWL：最大动物体重减轻。c P值(重复测量的双因素ANOVA，然后Bonferroni检验)，相对于PBS处理组。
2.5×106或1.0×107个细胞的剂量的辐射haNK003细胞作为单一药剂显著抑制雌性NSG的MDA-MB-453HER2阳性人乳腺癌异种移植模型中的肿瘤生长。两种剂量的辐射haNK003细胞均具有良好的耐受性。没有发生任何与haNK003治疗相关的死亡。
实施例8.在haNK细胞中，与缺氧相关的基因的表达没有降低。
自然杀伤(NK)细胞裂解活性在体外缺氧环境(1％O2)中受到抑制，并且与NKG2D、穿孔素和颗粒酶的下调相关。来自正常供体的NK对缺氧(1％O2)的敏感性存在一些差异。然而，体外外源性IL-2激活(16h，1000IU/ml)可部分挽救NK细胞的裂解活性。此外，NK细胞在1％的氧气条件下保持ADCC能力。
为了确定缺氧条件是否改变haNK细胞中的基因表达，在暴露于20％或0％O25小时的3个正常供体NK细胞群和haNK细胞中测定RNA表达。在两种条件(0％氧气和20％氧气)下将三种患者供体NK细胞群(950、962、996)与haNK细胞进行比较。成对样本聚类揭示了将haNK与供体NK细胞分开的不同簇(参见图21)。在缺氧或缺氧前的条件下，一个患者样本表现出很小的表达变化。具体地，在20％氧气条件下962中的表达看起来非常类似于9960％氧气和9620％氧气条件。参见图21。图22中显示了在样品中表现出最大变异性的基因。图23中显示了在20％氧气条件和0％氧气条件之间表现出最大变化的基因。图24中显示了在20％氧气条件和0％氧气条件下haNK细胞没有显示表达变化的与缺氧相关的基因。与缺氧相关的这些相同基因在950、962和996样品中显示具有降低的表达，尽管950样品中较少。参见图24。
实施例9.CD16表达在hank003细胞中更稳定。
期望的是具有CD16的稳定表达以通过在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)期间连续杀死靶细胞而赋予优异的细胞毒性。与外周血NK细胞(供体NK细胞)相比，HaNK-003(具有ER-IL-2)在用PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)激活后或用K562靶细胞刺激后表达高水平的CD16。进一步，在ADCC后通过流式细胞术测量CD16水平，hank003细胞中的CD16水平在ADCC期间和之后没有受到显著影响。
已知NK细胞中的PMA/离子霉素激活导致CD16特异性蛋白酶的激活和CD16的切割，从而导致NK细胞中CD16表达水平的下调。为了确定PMA/离子霉素的影响，haNK003细胞和供体NK细胞两者与40nM的PMA和669nM的离子霉素接触1小时，然后检查CD16的表达水平。PMA/离子霉素处理导致供体NK细胞中CD16表达下调94.36％±3.00，而在haNK003细胞中，该处理仅导致30％±0.04的下调，即CD16下调比供体NK细胞低三倍(图25)。
还已知NK细胞与K562细胞的共培养刺激CD16切割蛋白酶，其导致NK细胞中CD16表面表达的脱落。因此，供体NK细胞和haNK003细胞两者均与K562细胞一起培养，然后在共培养4小时后测量CD16表达。haNK003细胞与K562(效应：靶＝1：1)的正常共培养条件导致在4小时内靶细胞的完全细胞毒性杀灭。在再24小时以允许haNK003细胞和供体NK细胞中的CD16表达恢复后再次测量CD16表达以确定haNK003细胞和供体NK细胞中CD16恢复的百分比。观察到共培养4小时后供体NK细胞中CD16表达水平下调60.25％±09。然而，在hank003细胞中，CD16表达仅下调4.9％±2.57。24小时后，供体NK细胞中CD16的下调为57.54％±26.82，而在haNK003细胞中，其仅为2.78％±3.5，即接近原始CD16水平(图26)。
还在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)后测量了haNK003细胞中的CD16表达水平。ADCC通过在利妥昔单抗(针对CD20的细胞溶解性单克隆抗体)存在下将haNK003细胞与DOHH-2(CD20+人淋巴瘤B细胞系)一起孵育，然后测量CD16表达来进行。在ADCC后，在haNK003细胞中CD16表达下调小于10％(图27A和27B)。即使在ADCC之后高水平的CD16的存在表明haNK003细胞中的CD16表达是高度稳定的。
Claims (22)
1.(a)和(b)在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途：
(a)具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的经修饰的NK-92细胞群，其中所述经修饰的NK-92细胞群包含异源核酸分子，所述异源核酸分子包含编码由与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的CD16的核酸序列和编码由与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的IL-2的核酸序列，其中所述细胞群中大于90％的细胞表达CD56、CD16、CD54和NKp30，并且所述细胞群中少于5％的细胞表达CD3；和
(b)抗体。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述核酸分子是DNA分子。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞包含17号染色体上的SEQ ID NO:1。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞的平均倍增时间为55至70小时。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞群维持所述平均倍增时间1、2、3、4、5、10、15、20或25天。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞群可以每1、2、3或4天传代。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞以每百万细胞10至60pg/小时的浓度分泌IL-2。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞是经辐射的细胞。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞相比于对照具有降低的CD16表达下调。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞在ADCC后相比于对照维持较高的CD16水平。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症是脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌或胃癌。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞群和抗体是单独地给予。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞群和抗体是在相同的制剂中给予。
15.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞群和抗体是在单独的制剂中给予。
16.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗体选自阿仑单抗、贝伐单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、利妥昔单抗和曲妥珠单抗。
17.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞群和抗体在同一天给予。
18.根据权利要求1所述的用途，其中给予受试者的细胞群的剂量为1×109至1×1010/m2。
19.根据权利要求18所述的用途，其中将多个剂量的细胞群给予受试者。
20.根据权利要求1所述的用途，其中CD16的氨基酸序列为SEQ ID NO:4和/或IL-2的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
21.根据权利要求1所述的用途，其中编码CD16的核酸序列具有与SEQ ID NO:3至少90％的同一性和/或编码IL-2的核酸序列具有与SEQ ID NO:5至少90％的同一性。
22.根据权利要求1所述的用途，其中编码CD16的核酸序列为SEQ ID NO:3和/或编码IL-2的核酸序列为SEQ ID NO:5。
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