CN115190910A - 细胞介导的免疫增强分子到肿瘤微环境中的瞬时递送 - Google Patents
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Abstract
用编码以下物质的核酸转染重组自然杀伤(NK)细胞或T‑细胞组合物：i)归巢受体，ii)特异性结合靶抗原的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，iii)Fc受体，和/或iv)选自TGFβ抑制剂和/或IL‑12的分泌型免疫调节蛋白，其中对该重组细胞进行伽马(γ)‑辐射，赋予了长达72小时的细胞增殖抑制和转染分子(包括分泌型免疫调节剂)的瞬时活性。
Description
本申请要求2019年11月20日提交的美国临时申请号62/938,201的优先权和权益，其全部内容通过援引并入本文。
通过引用并入
本申请含有序列表，该序列表已以ASCII格式通过EFS-Web提交，并通过援引以其整体并入本文。所述ASCII复本创建于2020年11月2日，命名为104077_0017PCT_Seq_listing_ST25，并且大小为98,502字节。
技术领域
本发明的领域是工程化细胞的靶向，其使用细胞毒性的活化自然杀伤细胞系(NK-92)作为基础，以改善针对癌症和肿瘤的免疫疗法；并且特别是经辐射的细胞的靶向，其用于瞬时存在的免疫增强疗法。
背景技术
以下描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
肿瘤微环境调节剂(例如细胞因子(IL-2、IL-12、IL-15)、趋化因子或抗体(抗-PD1、抗-CTLA4、TGFβ阻断抗体))的全身性递送可能会导致显著的副作用，因为必须输注非常大的剂量以实现有意义的局部效果，或导致显著的多重活性；这有时还可能由于输注的药物在体内持续时间很长而加剧。
以更有靶向性的方式递送这些调节剂可以通过细胞工程来实现，以组成型分泌或诱导型分泌它们，并通过肿瘤归巢或局部注射将这些细胞提供至肿瘤微环境。然而，组成型表达(例如，使用装甲CAR-T细胞)可能导致长时间暴露(只要细胞持续存在)。可以通过使用可诱导的自杀机制(例如iCasp9)杀死分泌细胞来终止表达。然而，这种机制并不能可靠地杀死100％的细胞，并且它们依赖于诱导分子的全身性施用。虽然可以实现表达的瞬时诱导，但它需要使用通常专有的诱导型启动子的复杂细胞工程，以及诱导分子的全身给药。此外，通过用mRNA加载细胞的瞬时表达可确保分泌在时间上受到限制，然而载体细胞将可能持续存在，并且mRNA翻译和蛋白质分泌的时间可能因不同分子而是可变的，因此并不适合所有情况。
为了确保活性分子不以有害剂量施用或在需要它的一个或多个位点以有意义的量存在，可以施用局部注射的产品(例如，瘤内注射、切除空间注射、皮内)。然而，靶位点可能难以进入(例如，脑肿瘤)、或者可能不能注射、不够明确(弥漫性肿瘤)或太多个(转移)。克服局部注射问题的一种方法是将活性分子连接到靶向剂，例如抗体。抗体-药物偶联物(ADC)不能进入身体的所有部位(如大脑)，并且仍可能显示出剂量相关的毒性。局部注射的另一种方法是使靶向剂成为能够归巢至正确位点并能够分泌活性分子的细胞。例如，免疫细胞能够到达身体所有部位的肿瘤位点。因此，工程化T-细胞或NK细胞以表达活性分子可能是确保在肿瘤中局部递送的有效方式。已经产生了表达IL-12(组成型或诱导型)的T-细胞，以及表达IL-15的NK-细胞。然而，由于这些细胞目前是自体的(即来自患者)，它们可以在体内扩增，使得其难以控制活性分子的量和暴露至活性分子的持续时间。尽管将自杀系统引入工程化细胞已示出可以成功地限制体内的扩增，但这种系统并不能实现100％完全去除该工程化细胞。此外，自体T-细胞或NK-细胞的工程化是劳动密集型和昂贵的，并且仅限于单个患者。工程化同种异体T-细胞或NK-细胞的努力正在进行中，但这些细胞很可能被患者的免疫系统排斥。
综上所述，工程化T细胞和NK细胞在患者中的治疗应用存在很多问题和不足。因此，仍然需要改善工程化T-细胞或NK细胞的功能，以便有效地将这些细胞及其免疫活性分子治疗靶向肿瘤微环境，同时在患者中限制该疗法的过度暴露。
本文中鉴定的所有出版物均通过援引并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体且单独地指示通过援引并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。
发明内容
本发明的主题提供了组合物和方法，其中对重组自然杀伤(NK)细胞或T-细胞进行辐射，从而赋予受试者瞬时的抗肿瘤治疗并限制在受试者的肿瘤治疗中的副作用。
为了有效靶向肿瘤微环境，用一种或多种重组核酸转染待辐射的重组NK细胞或T-细胞。优选地，用一种或多种重组核酸转染待辐射的NK细胞或T-细胞，这些重组核酸编码i)归巢受体和/或细胞因子，ii)与靶抗原特异性结合的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，iii)Fc受体和/或iv)分泌型免疫调节剂，其中该一种或多种核酸与启动子可操作地连接。在更优选的实施例中，重组NK细胞或T-细胞是NK-92细胞并且转染的核酸是具有由单个启动子控制表达的三顺反子载体或四顺反子载体。最优选地，用四顺反子载体转染待辐射的重组NK-92细胞，该四顺反子载体编码i)细胞因子，ii)与靶抗原特异性结合的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，iii)Fc受体，和iv)选自TGFβ抑制剂和/或IL-12的分泌型免疫调节剂。
在典型的实施例中，TGF-β抑制剂是TGF-β阱(TGF-beta trap)。额外地，TGF-β阱可包含TGFβRII分子的细胞外结构域。更具体地，该TGF-β阱包含TGF-β受体II胞外域(TGFβRIIecd)的单链二聚体。
额外地或可替代地，在待辐射的重组NK细胞或T-细胞中转染的细胞因子是IL2、IL-15、er-IL2或er-IL15。
作为上述额外地或可替代地，在待辐射的重组NK细胞或T-细胞中转染的抗原结合蛋白特异性结合肿瘤相关抗原。通常，该肿瘤相关抗原选自CD19、CD20、GD2、HER-2、CD30、EGFR、FAP、CD33、CD123、PD-L1、IGF1R、CSPG4或B7-H4。
作为上述额外地或可替代地，在待辐射的重组NK细胞或T-细胞中转染的抗原结合蛋白结合肿瘤中的免疫调节蛋白。在肿瘤中的免疫调节蛋白的实例包括CTLA-4、PD-1、IDO-1、CD39或CD73。
作为上述额外地或可替代地，在待辐射的重组NK细胞或T-细胞中转染的Fc受体是CD16或高亲和力CD16。
作为上述额外地或可替代地，在待辐射的重组NK细胞或T-细胞中转染的抗原结合蛋白包含嵌合抗原受体(CAR)。
作为上述额外地或可替代地，在待辐射的重组NK细胞或T-细胞中转染的启动子包含至少一种活化T细胞核因子(NFAT)结合结构域。
在一些实施例，该归巢受体是G蛋白偶联受体(GPCR)、趋化因子受体、细胞因子受体、细胞粘附分子、选择素或整合素。
本发明主题的方面还包括如本文所披露的经辐射的重组NK细胞或T-细胞与药学上可接受的赋形剂组合的组合物。
本发明主题的方面还包括治疗受试者的癌症或肿瘤的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的经辐射的重组NK细胞或T-细胞和本文所披露的组合物，其中施用治疗癌症或减少该受试者的肿瘤的大小。在典型的实施例中，经辐射的重组NK细胞或T-细胞在暴露至辐射后不增殖并且具有瞬时活性。例如，用一种或多种重组核酸转染的经辐射的重组NK细胞或T-细胞赋予长达72小时(例如长达48小时)的抗肿瘤活性，该核酸编码i)归巢受体和/或细胞因子，ii)与靶抗原特异性结合的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，iii)Fc受体和/或iv)分泌型免疫调节剂。
在优选的实施例中，治疗受试者的癌症或肿瘤的方法包括向该受试者施用治疗有效量的本文披露的经辐射的重组NK-92细胞，其被一种或多种重组核酸稳定转染，该重组核酸编码i)归巢受体和/或细胞因子，ii)与靶抗原特异性结合的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，iii)Fc受体，和/或iv)分泌型免疫调节剂，其中一种或多种核酸与启动子可操作地连接。更优选地，用四顺反子载体转染经辐射的重组NK-92细胞，该四顺反子载体编码i)细胞因子，ii)与靶抗原特异性结合的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，iii)Fc的受体，和iv)分泌型TGFβ抑制剂和/或IL-12。
本发明主题的类似方面还包括减少受试者中癌症转移的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所披露的经辐射、经修饰的NK-92细胞或组合物，从而减少受试者中的癌症转移。
在优选的实施例中，施用如本文所披露的经辐射、经修饰的NK-92细胞或组合物的方法，其中向受试者每m2施用1×103至1×1010个经修饰的NK-92细胞。额外地，经辐射、经修饰的NK-92细胞和组合物的施用包括肠胃外、静脉内、瘤周或通过输注的施用。
在示例性实施例中，在患者中减少癌症转移、肿瘤大小和/或降低癌细胞的方法包括施用本文披露的经辐射的重组NK-92细胞，其中在辐射之前，用重组核酸转染NK-92细胞，该重组核酸编码分泌型免疫调节剂、趋化因子或细胞因子受体和/或与靶抗原特异性结合的抗原结合蛋白或嵌合抗原受体(CAR)，所有这些都与启动子可操作地连接。更具体地，分泌型免疫调节剂包括IL-12和/或TGF-β抑制剂。优选地，TGF-β抑制剂是TGF-β阱。在优选的实施例中，用四顺反子载体转染待辐射的、经修饰的NK-92细胞，该四顺反子载体编码：i)包含IL-2或IL-15的细胞因子，ii)与靶抗原特异性结合的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，iii)Fc受体，和iv)选自TGFβ抑制剂和/或IL-12的分泌型免疫调节剂。
根据优选实施例的以下详细描述以及附图(其中相同的附图标记表示相同的组件)，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1是具有所示的可能的肿瘤靶向元件的基因修饰的自然杀伤(NK-92)细胞的示意图。
图2A是在所示0、2、5、10和30Gy辐射后0、24、48、72、96和120小时的存活野生型(WT)NK-92细胞数量的图。
图2B是图2A中在所示0、2、5、10和30Gy辐射后0、24、48、72、96和120小时的野生型(WT)NK-92细胞的细胞活力百分比图。
图3是示出在用10Gy辐射aNK和haNK细胞后在所示时间点(小时)直至约144小时(6天)的存活细胞百分比的图，其中未辐射的aNK和haNK细胞作为对照。
图4A阐明了编码TGFβ-阱装甲的PD-L1CAR核酸的四顺反子载体的一个实施例。
图4B是如本文所示和进一步披露的(用四顺反子载体或图4A转染)未经辐射和经辐射t-haNK(NK-92)细胞的细胞浓度图，其中从左到右示出每个所示细胞组的第0天、第1天、第2天的细胞计数。
图4C是图4B的未经辐射和经辐射的t-hank(NK-92)细胞的每百万个细胞测量的TGFBRIIecd浓度(pg/mL)的图。
图4D阐明了编码IL-12装甲的PD-L1 CAR核酸的四顺反子载体的一个实施例。
图5A是示出在所示0、2.5、5、10、15、20和30Gy辐射后在第1、2、3、4、7、10、15、21、28和35天后每体积的PD-L1 t-haNK细胞数量(细胞x 106/毫升(mL))的图。
图5B是为如图5A所示的PD-L1 t-haNK细胞收集的原始数据的表格。
图6示出了使用EVOS显微镜捕获的明场图像，以在所示0、2.5、5、10、15、20或30Gy辐射后在第0、2、9、21、30和35天时可视化PD-L1 t-haNK细胞的细胞形态。
图7A示出了在所示0、2.5、5、10、15、20或30Gy辐射后在第0、2、4、17、30和35天时来自膜联蛋白V染色的PD-L1 t-haNK细胞的膜联蛋白测定的细胞计数图像。
图7B示出了在所示0、2.5、5、10、15、20或30Gy辐射后在第0、2、4、17、30和35天时来自PD-L1 t-haNK细胞的谷胱甘肽(GSH)活力测定的细胞计数图像。
具体实施方式
发明人惊讶地发现，本文所披露的重组(即工程化或经修饰的同种异体)T-细胞或NK-细胞的辐射可以维持这些免疫疗法递送细胞用于治疗患者中的癌症肿瘤的治疗效果，同时还在患者中限制过度暴露和副作用。特别地，发明人有利地发现，经工程化以表达分泌型免疫调节剂的经辐射的NK细胞被有效地抑制复制(例如，细胞增殖)，同时维持经辐射的重组NK细胞的瞬时活性，包括分泌型免疫调节剂的瞬时活性。人们应该认识到，限制同种异体细胞疗法的患者过度暴露和/或副作用确实需要工程化的肿瘤靶向细胞。
考虑到当被输注到受试者(例如癌症患者)中时同种异体细胞(诸如重组NK细胞)可引起有害影响，令人惊讶地发现，对用编码分泌型免疫调节剂(例如TGFβ抑制剂或IL-12)的核酸转染的同种异体细胞进行辐射，正如预期地抑制细胞增殖，同时在辐射后的短暂时间内维持分泌型免疫调节剂的活性。与细胞表面表达的重组分子不同，分泌型细胞因子不是膜结合的，而是依赖于宿主细胞的核机制进行表达。伽马(γ)-辐射破坏宿主细胞的核机制，从而阻止细胞增殖。额外地，γ-辐射抑制与细胞类型特异性免疫相关的通路中基因的表达，特别是NK细胞。参见，Paul等人，2013年，Radiat.Res[辐射研究]，180：575-583。然而，值得注意的是，经γ-辐射的NK细胞能够表达分泌型细胞因子(例如，TGFβ抑制剂或IL-12)。因此，用编码以下物质的四顺反子载体转染的重组NK细胞的γ-辐射抑制重组NK细胞复制，同时保持包括分泌型免疫调节剂的被编码重组分子的瞬时活性：i)归巢受体和/或细胞因子，ii)与靶抗原特异性结合的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，iii)Fc受体和iv)分泌型免疫调节剂。例如，瞬时活性被维持长达72小时，包括例如长达48小时。
因此，所考虑的发明主题包括提供和治疗经辐射的肿瘤靶向细胞(例如，T-细胞或NK-细胞)，该细胞经工程改造以组成型表达分泌型调节剂、抗原结合蛋白、Fc受体和归巢受体或细胞因子/趋化因子来帮助靶向肿瘤。图1中的示意描绘了示例性肿瘤靶向细胞NK-92细胞，其具有用于靶向肿瘤的嵌合抗原受体(CAR)和CD16受体的肿瘤靶向元件以及分泌型免疫调节分子(例如TGFβ抑制剂和/或IL-12)。这些能够归巢至肿瘤的工程化NK-92细胞的实例披露于例如WO 2020/028656中，其全部内容通过援引并入本文。如本文更详细地披露，同种异体工程化T-细胞或NK-细胞的受控辐射维持这些肿瘤靶向细胞的有效治疗功能，同时限制这些细胞增殖约48至72小时(例如，2至3天)。
优选地，工程化NK细胞包括以其作为基础来改善针对癌症细胞和肿瘤的免疫疗法和/或增加向目的靶标的归巢(迁移)的细胞毒性的活化自然杀伤细胞系(例如NK-92)。在一些实施例中，NK-92细胞经工程改造以表达已知会在表达时将淋巴细胞引导至淋巴结的归巢受体。在一些实施例中，用核酸转染NK细胞，该核酸编码调节肿瘤微环境的分泌型细胞因子或阻断调节肿瘤微环境的细胞因子的抑制剂。
更优选地，在辐射之前，用核酸转染NK细胞以表达分泌型免疫调节剂(例如TGFβ抑制剂和/或IL-12)，和特异性结合靶抗原(例如抗PD-L1)的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，和任选地选自归巢受体和Fc受体中的一种或两种，其中核酸与三顺反子构建体(载体)中的启动子可操作地连接。在另一个优选的实施例中，用核酸转染NK细胞以表达分泌型免疫调节剂(例如TGFβ抑制剂和/或IL-12)、与靶抗原(例如抗PD-L1)特异性结合的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)和Fc受体(例如CD16或CD16-158V)，其中核酸与三顺反子构建体(载体)中的启动子可操作地连接。在另一个优选的实施方案中，用核酸转染NK细胞以表达分泌型免疫调节剂(例如TGFβ抑制剂和/或IL-12)、与靶抗原(例如抗PD-L1)特异性地结合的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，和归巢受体，其中核酸与三顺反子载体中的启动子可操作地连接。
最优选地，用核酸转染NK细胞以表达分泌型免疫调节剂(例如TGFβ抑制剂和/或IL-12)、归巢受体、Fc受体(例如CD16或CD16-158V)，和特异性结合靶抗原的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，其中核酸可操作地连接至四顺反子载体中的启动子。
如本文所揭露的，治疗功能可以通过测定细胞的完整性和其中转染的重组分子来确定，如图2A、2B、3、4A、4B、4C、5A、5B、6、7A和7B所示。细胞完整性可以通过测定已知细胞分子(包括重组分子以及内源分子)的存在和/或功能来测量。例如，参考图7B，辐射后的细胞活力通过细胞内还原硫醇(谷胱甘肽；GSH)的存在来测量。
具体而言，可以用5到30之间的戈瑞(Gy)对同种异体的、经修饰的T-细胞或NK-细胞进行辐射。如本领域技术人员所理解的，戈瑞是国际单位制中电离辐射剂量的导出单位。戈瑞(Gy)被定义为每千克物质吸收一焦耳的辐射能量。
为了在限制细胞增殖的同时维持肿瘤靶向元件的表达功能，可以用5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30Gy辐射工程化的同种异体T-细胞或NK-细胞。如本领域技术人员可以确定的，一些工程化T-细胞或NK-细胞可能需要5至15Gy范围内的辐射(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15Gy)以维持治疗效果，同时将细胞增殖限制在不超过72小时。在又一些实施例中，辐射范围可以在5到10Gy之间(例如，5、6、7、8、9或10Gy)。
术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应意指排除对组合具有任何重要意义的其他要素。例如，基本上由本文定义的要素组成的组合物将不排除未实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖性特征的其他要素。“由……组成”是指排除多于痕量的其他成分和所列举的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例在本披露内容的范围内。
如本文所用，术语“转染”是指核酸插入细胞中。可以使用允许核酸进入细胞的任何方式进行转染。DNA和/或mRNA可以被转染进入细胞中。优选地，转染的细胞表达由核酸编码的基因产物(即蛋白)。
术语“归巢受体”是指激活细胞途径的受体，该细胞途径直接或间接导致细胞向靶细胞或靶组织迁移。例如，由白细胞表达的归巢受体被白细胞和淋巴细胞用于经由高内皮小静脉进入次级淋巴组织。归巢受体也可以被细胞用于向化学梯度源诸如趋化因子梯度源迁移。
归巢受体的非限制性实例包括G蛋白偶联受体，诸如趋化因子受体，包括但不限于CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CX3CR1、XCR1、CCXCKR、D6、DARC或CXCL14受体；细胞因子受体；细胞粘附分子，诸如选择素，包括L-选择素(CD62L)；整合素，诸如α4β7整合素、LPAM-1和LFA-1。归巢受体通常与靶组织或靶细胞上的同源配体结合。在一些实施例中，归巢受体与小静脉内皮上的地址素(Addressin)，诸如粘膜血管地址素蛋白细胞粘附分子1(MAdCAM-1)结合。在一些实施例中，编码CCR7的核酸与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些示例性实施例中，本文考虑的趋化因子和归巢受体可以包含与SEQ ID NO：44(CCR7氨基酸序列)、或SEQ ID NO：45(CCL19氨基酸序列)、或SEQ ID NO：46(CCL21氨基酸序列)或SEQ ID NO：47(CXCR2核苷酸序列)、或SEQ ID NO：48(CXCR2氨基酸序列)、或SEQ ID NO：49(CXCL14核苷酸序列)、或SEQ ID NO：50(CXCL14氨基酸序列)、或SEQ ID NO：51(CD62L核苷酸序列)、或SEQ ID NO：52(CD62L氨基酸序列)、或SEQID NO：53(IL-8核苷酸序列)、或SEQ ID NO：54(IL-8氨基酸序列)、或SEQ ID NO：55(CXCL1核苷酸序列)、或SEQ ID NO：56(CXCL1氨基酸序列)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列或多核苷酸序列。
如本文所用，“免疫疗法”是指单独或组合使用经修饰或未修饰的、自然存在的或经修饰的NK细胞或T-细胞的NK-92细胞，无论其是单独使用还是组合使用，并能够在与靶细胞接触时诱导细胞毒性。
如本文所用的术语“肿瘤特异性抗原”是指存在于癌细胞或赘生性细胞上但不能在来源于与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞上检测到的抗原。如本文所用，肿瘤特异性抗原还指肿瘤相关抗原，即与来源于与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞相比，在癌细胞上以更高水平表达的抗原。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多核苷酸组装之前或之后进行核苷酸结构修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本发明的多核苷酸的任何实施例既涵盖双链形式，也涵盖已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式的每一个。
多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；当多核苷酸为RNA时，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。
如本文所用，“自然杀伤(NK)细胞”是免疫系统的细胞，其在没有特定抗原刺激的情况下杀伤靶细胞，并且根据主要组织相容性复合物(MHC)类别没有限制。NK细胞的特征在于存在CD56和不存在CD3表面标志物。
所考虑的主题包括用5至30Gy辐射重组同种异体NK细胞或T-细胞。优选地，重组同种异体细胞是用5至30Gy辐射的NK-92细胞。参考图2A-2B，在所示的辐射后测量野生型NK-92细胞的细胞活力。如本文所披露和引用，NK-92细胞可以被工程化以产生可以在培养物中无限期生长的独特细胞系。在临床试验中，它们已示出被患者很好地耐受并且不会引起有害的免疫反应。它们可作为“现成”产品提供，不受患者限制，因此比自体T-细胞或NK-细胞更易于使用。可以使它们优先归巢于肿瘤部位，从而能够局部递送分泌型分子。有利地，在暴露于致死剂量的γ辐射后，本文揭露的重组NK细胞保持归巢、细胞毒性和分泌功能持续48至72小时，但随后死亡，从而消除了与细胞扩增和延长的持久性相关的问题。如本文所披露的重组NK细胞可以被辐射和反复地输注，这允许了对暴露于活性分子的持续时间的控制。
在示例性实施例中，待辐射的NK-92细胞可以通过用编码一种或多种基因的DNA构建体转染或转导进行基因工程改造。特别地，本发明的主题包括待辐射的、经修饰的NK-92细胞，该细胞能够调节肿瘤微环境。这些经修饰的NK-92细胞优选包含多顺反子载体，该多顺反子载体包含一个或多个编码以下物质的核酸：i)归巢受体和/或细胞因子，ii)与靶抗原特异性结合的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，iii)Fc受体(例如CD16或CD16-158V，和/或iv)分泌型免疫调节剂，其中一个或多个核酸与启动子可操作地连接。
值得注意的是，已发现经过工程改造以组成型表达分泌型TGFβ-阱分子或单链IL-12的NK-92细胞能够分泌大量的活性分子(在ng/ml范围内)。此外，已经观察到NK-92细胞具有归巢至肿瘤位点的能力，并且可以通过表达肿瘤特异性CAR分子(诸如PD-L1CAR)和/或趋化因子受体来增强归巢。例如，经过工程改造以表达CCR7趋化因子受体的NK-92细胞也已显示出比亲本NK-92细胞更有效地归巢于产生CCL19的肿瘤。用临床相容剂量的辐射(例如，高达10、15、20或30Gy)辐射的NK-92细胞存活长达48小时或长达72小时，同时能够维持细胞毒性和分泌功能(图4B-4C)。因此，输注经辐射的工程化NK-92细胞提供了在空间(肿瘤归巢)和时间(因为经辐射的细胞的寿命有限)上控制分泌型分子传递的方法。在一些实施例中，如本文所披露的已用临床相容剂量的10或15Gy伽马(γ)辐射所辐射的重组NK-92细胞存活高达24、30、36、42、48、54、60、66、或72小时，同时能够维持细胞毒性和分泌功能。
如本文所用，术语“细胞毒性的”和“细胞溶解的”当用于描述效应细胞(诸如NK-92细胞)的活性时，旨在同义。通常，细胞毒性活性涉及通过多种生物学、生化或生物物理机制中的任一种杀灭靶细胞。细胞溶解更具体地是指效应子裂解靶细胞的质膜从而破坏其物理完整性的活性。这导致靶细胞的杀灭。不希望受理论的约束，认为NK-92细胞的细胞毒性作用是部分由于细胞溶解。
针对细胞/细胞群的术语“杀灭”旨在包括将导致该细胞/细胞群死亡的任何类型的操纵。
术语“NK-92”是指源自Gong等人(1994)描述的高效独特细胞系(其权利归
所有)的自然杀伤细胞(以下简称“NK-92细胞”)。永生化的NK细胞系最初获自患有非霍奇金淋巴瘤的患者。除非另有说明，否则术语“NK-92”是指原始的NK-92细胞系以及已经修饰(例如，通过引入外源基因)的NK-92细胞系。NK-92细胞及其示例性和非限制性的修饰描述于美国专利号7,618,817；8,034,332；8,313,943；9,181,322；9,150,636；和公开的美国申请号10/008,955中，这些专利均通过援引以其全文并入本文，并且包括野生型NK-92、NK-92-CD16、NK-92-CD16-γ、NK-92-CD16-ζ、NK-92-CD16(F176V)、NK-92MI和NK-92-CI。NK-92细胞是本领域普通技术人员已知的，可从南特圭斯特公司(NantKwest，Inc.)容易获得此类细胞。
术语“aNK”是指源自Gong等人(1994)描述的高效独特细胞系(其权利归南特西部公司所有)的未修饰的自然杀伤细胞(以下简称“
细胞”)。术语“haNK”是指源自Gong等人(1994)所述的高效独特细胞系(其权利归南特圭斯特公司所有)，经修饰以在细胞表面上表达CD16的自然杀伤细胞(以下简称“CD16+NK-92细胞”或“haNK细胞”)。在一些实施例中，CD16+NK-92细胞在细胞表面上包含高亲和力CD16受体。高亲和力CD16的实例包括CD16-F158V。术语“taNK”是指源自Gong等人(1994)所述的高效独特细胞系(其权利归南特圭斯特公司所有)，经修饰以表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞(以下简称“CAR修饰的NK-92细胞”或“
细胞”)。术语“t-haNK”是指源自Gong等人(1994)所述的高效独特细胞系(其权利归南特西部公司所有)，经修饰以在细胞表面上表达CD16并表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞(以下简称“CAR修饰的CD16+NK-92细胞”或“t-haNK细胞”)。在一些实施例中，t-haNK细胞在细胞表面上表达高亲和力CD16受体。
此外，如本文所披露的经辐射的重组NK-92细胞还可以包括启动子，该启动子具有引入启动子中用于表达细胞因子、趋化因子和/或抗原结合蛋白的NFAT结合结构域(序列)。经工程改造以在活化T细胞核因子(NFAT)转录因子启动子序列的控制下表达荧光素酶报告基因的NK-92细胞已被证明响应于通过NFAT途径发出信号的活化受体(如募集CD3ζ或FcεRIγ衔接子分子的受体)的刺激来诱导高荧光素酶表达。因此，分泌型分子的这种诱导型表达依赖于被合适靶标激活的细胞，而不依赖于外部诱导分子。在一个实施例中，本文考虑的CD3ζ信号传导结构域可以包含与SEQ ID NO：40具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多肽序列。
如在WO 2020/028656(其全部内容通过援引并入本文)中披露的，通过NFAT转录因子的活化及其核易转位，证实在NK-92细胞中识别易感细胞系的靶标接合。涉及FcεRIγ或CD3ζ途径的靶标结合(包括ADCC或CAR介导的靶标识别)足以在NK-92细胞中诱导NFAT活化。这是通过插入含有3个NFAT响应元件和驱动萤火虫荧光素酶的最小启动子的报告基因盒来证明的。通过将CD19 CAR mRNA电穿孔到该报告细胞系中，通过CD3ζ途径激活NFAT，接着与SUP-B15(CD19+，但对非特异性细胞毒性有抵抗力)共同培养，引起荧光素酶表达。
在示例性的实施例中，驱动CCL21+聚A的NFAT应答盒和由CMV驱动的FRT嵌入型杀稻瘟素抗性基因的完整序列包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。
术语“Fc受体”是指在某些细胞(例如，自然杀伤细胞)的表面发现的蛋白，其通过与称为Fc区的抗体的一部分结合而有助于免疫细胞的保护功能。抗体的Fc区与细胞的Fc受体(FcR)的结合经由抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来刺激细胞的吞噬或细胞毒性活性。FcR根据其识别的抗体类型进行分类。例如，Fc-γ受体(FCγR)与IgG类抗体结合。FCγRIII-A(也称为CD16)是与IgG抗体结合并激活ADCC的低亲和力Fc受体。FCγRIII-A通常在NK细胞上发现。NK-92细胞不表达FCγRIII-A。Fc-ε受体(FcεR)与IgE抗体的Fc区结合。在一些实施例中，CD16受体在成熟形式的多肽(SEQ ID NO：12)的氨基酸位置158(F158V)(对应于包含信号序列的全长形式的多肽的位置176)处包含苯丙氨酸(F)-缬氨酸(V)取代。在一个实施例中，Fc受体包含SEQ ID NO：13的核酸序列或SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指与细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域。CAR可以在T细胞或NK细胞中表达以增加细胞毒性。通常，细胞外抗原结合结构域是对目的细胞上发现的抗原具有特异性的scFv。例如，基于关于scFv结构域的特异性，本文所披露的待辐射的表达CAR的NK-92细胞(例如，与归巢受体、Fc受体和分泌型细胞因子一起表达)靶向在细胞表面表达某些抗原的细胞。可以对scFv结构域进行工程改造以识别任何抗原，包括肿瘤特异性抗原。例如，CD19-CAR识别CD19，CD19是某些癌症表达的细胞表面标志物。
在额外的实施例中，重组CAR包含FcεRIγ的胞质结构域。例如，FcεRIγ的胞质结构域可包含与SEQ ID NO：31具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。可替代地，FcεRIγ的胞质结构域由与SEQ ID NO：32具有至少95％序列同一性的核酸编码。在其它实施例中，CAR包含来自CD8的铰链区。在一些实施例中，CAR包含来自CD28的跨膜结构域。
因此，用包含SEQ ID NO：31(FcεRIγ细胞内胞质结构域)、SEQ ID NO：32(FcεRIγ细胞内信号传导域减去跨膜结构域)、SEQ ID NO：33(CD8铰链区)、SEQ ID NO：34(CD8铰链区DNA)、SEQ ID NO：35(CD28跨膜结构域)和/或SEQ ID NO：36(CD28跨膜结构域，减去ITAM或细胞内序列)的核酸构建体(例如四顺反子载体)对重组NK-29细胞进行转染。在一个实施例中，CD8铰链区、CD28跨膜和FcεRIγ(FceRI伽马)信号传导结构域的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽或多核苷酸序列。在一个实施例中，CAR scFv可以包含与SEQ ID NO：39具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多肽序列。
值得注意的是，本发明的主题包括经辐射、经修饰的NK-92细胞，该细胞能够调节肿瘤微环境。经辐射、经修饰的NK-92细胞优选包括四顺反子载体，该四顺反子载体包含一个或多个编码以下物质的核酸：i)IL-12或TGF-β阱，ii)与靶抗原特异性结合的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，iii)Fc受体，诸如CD16或CD16-158V，和/或iv)细胞因子(例如erIL-2或erIL-15)，其中核酸序列与启动子可操作地连接。
在另一方面，调节肿瘤微环境的分泌型细胞因子可以是IL-12或TGF-β抑制剂。因此，核酸构建体可以编码IL-12和/或TGF-β抑制剂。
在示例性实施例中，本文考虑的IL-12可以包含与SEQ ID NO：57(p35核苷酸序列)或SEQ ID NO：59(p40核苷酸序列)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。本文考虑的IL-12还可以包含与SEQ ID NO：58(p35氨基酸序列，同种型1前体)或SEQ ID NO：60(p40氨基酸序列，前体)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个示例性的实施例中，IL-2/PD-L1四顺反子载体中的IL-12单链p40_p35序列可以包括与SEQ ID NO：61具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列，或者可以包含与SEQ ID NO：62具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。
已知肿瘤内的TGF-β表达会抑制肿瘤微环境中白细胞的抗肿瘤活性。因此，在一些实施例中，待辐射的、经修饰的NK-92细胞包括重组核酸构建体，该重组核酸构建体编码TGF-β抑制剂，例如抑制TGF-β的肽。在一些实施例中，核酸构建体编码TGF-β阱。在一些实施例中，TGF-β阱包括TGFβRII分子的细胞外结构域。在一些实施例中，TGF-β阱包括TGFβRII分子的细胞外结构域的单链二聚体，并且最优选地包括TGF-β受体II胞外域的单链二聚体。在示例性的实施例中，本文考虑的TGF-β阱可以包含与SEQ ID NO：63(TGFBRII细胞外结构域)或SEQ ID NO：65(TGFb阱序列)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。本文考虑的TGF-β阱还可以包含与SEQ IDNO：64(TGFBRII细胞外结构域)或SEQ ID NO：66(TGFb阱序列)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。其他合适的TGF-β阱包括在Mol.Canc.Ther.[分子癌症治疗学]2012，Vol 11(7)，1477-1487中描述的那些。
在一些实施例中，本文所述的待辐射的、经修饰的NK-92细胞与TGF-β抑制剂一起施用以阻断TGF-β并帮助去除免疫抑制。在一些实施例中，本文所述的NK-92细胞与其他免疫疗法一起施用以帮助减小或消除肿瘤。例如，可以通过肿瘤内注射抑制肽并结合肿瘤内注射聚(I：C)和α-CD40抗体来抑制TGF-β。在一些实施例中，将TGF-β抑制剂与IL-2组合。
在另外的实施例中，如本文所述的经辐射的重组NK-92细胞包括编码细胞因子的核酸，该细胞因子为表达该细胞因子(诸如IL-2、IL-12、IL-15、IL-18或IL-21)的NK-92细胞提供选择。在示例性的实施例中，该核酸编码细胞因子，诸如IL-2或IL-15。在一个实施例中，诸如IL-2多肽的细胞因子可以具有与SEQ ID NO：42具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施例中，IL-2多肽可以具有与SEQ ID NO：43具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一个实施例中，IL-2在具有将IL-2引导至内质网IL-2(“erIL-2”)的信号序列的情况下表达。在另一个实施例中，IL-15在具有将IL-15引导至内质网IL-15(“erIL-15”)的信号序列的情况下表达。
因此，在一些实施例中，本文所披露的经辐射的NK-92细胞的细胞毒性取决于细胞因子(例如，白细胞介素-2(IL-2))的存在。因此，任选地，经修饰的NK-92细胞经进一步修饰以表达至少一种细胞因子。任选地，该至少一种细胞因子是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或其变体。任选地，该至少一种细胞因子是IL-2、IL-15或它们的组合。任选地，在具有将细胞因子引导至内质网的信号序列的情况下表达IL-2和/或IL-15。将IL-2引导至内质网容许IL-2以足以自分泌激活的水平表达，而不会在细胞外释放大量IL-2。参见Konstantinidis等人“Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confinesautocrine growth stimulation to
cells[使IL-2靶向内质网将自分泌生长刺激限制于
细胞中]”Exp Hematol.[实验血液学]2005年2月；33(2)：159-64。编码IL-2的代表性核酸如SEQ ID NO：14所示，并且IL-2的代表性多肽如SEQ ID NO：15所示。
经辐射、经修饰的NK-92细胞可包含与SEQ ID NO：14具有70％、80％、90％或95％同一性的编码IL-2的核酸序列。任选地，经辐射、经修饰的NK-92细胞可包括与SEQ ID NO：14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。任选地，经辐射、经修饰的
细胞可包括与SEQ ID NO：15具有70％、80％、90％或95％同一性的IL-2多肽。任选地，经辐射、经修饰的NK-92细胞可包括与SEQ ID NO：15具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的IL-2多肽。所披露的经辐射、经修饰的NK-92细胞有利地能够在不存在IL-2的情况下得以维持，而不会分泌引起临床副作用的量的IL-2。
此外，核酸构建体(例如四顺反子载体)还可以包括编码2A肽(诸如T2A、P2A、E2A或F2A肽)的序列，以便产生由相同mRNA编码的等摩尔水平的多肽。本文考虑的E2A肽可以包含与SEQ ID NO：17具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。本文考虑的T2A肽可以包含与SEQ ID NO：18具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。
在一个示例性的非限制性实例中，本文披露的核酸构建体(例如四顺反子载体)可以包括与SEQ ID NO：19(AAVS1的5’同源臂)、SEQ ID NO：20(EF1a启动子)、SEQ ID NO：21(T7启动子)、SEQ ID NO：22(CCR7cDNA)、SEQ ID NO：23(P2A元件)、SEQ ID NO：24(IgHC前导序列)、SEQ ID NO：25(CD19CAR减去信号肽)、SEQ ID NO：26(高亲和力CD16)、SEQ ID NO：27(IRES)、SEQ ID NO：28(SC40聚A)、SEQ ID NO：29(AAVS1的3’同源臂)和/或SEQ ID NO：30(AAVS1的同源臂)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列，用于靶向AAVS1基因座(SEQ ID NO：7)。
在一些实施例中，如本文所述的待辐射的经修饰的NK-92细胞可以包括或还包括编码抗原结合蛋白(“ABP”)的核酸构建体。在一些实施例中，抗原结合蛋白特异性结合肿瘤相关抗原。在一些实施例中，ABP包括抗体的片段，诸如scFv。在一些实施例中，抗原结合蛋白包括嵌合抗原受体(CAR)或者是嵌合抗原受体的一部分。在一些实施例中，核酸编码ABP、CAR、或包括特异性结合以下物质的CAR的ABP：CD19、CD20、NKG2D配体、CS1、GD2、CD138、EpCAM、HER-2、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、MUC-1、ETA、MAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAP、WT-1、PSMA、NY-ESO1、CSPG-4、IGF1-R、Flt-3、CD276、CD123、PD-L1、BCMA、CD33、B7-H4或41BB。
额外地或可替代地，如本文所披露的待辐射的经修饰的NK-92细胞编码与肿瘤中的免疫调节蛋白结合的抗原结合蛋白。在肿瘤中发现的免疫调节蛋白的实例包括CTLA-4、PD-1、IDO-1、CD39和CD73。
在示例性实施例中，用编码与程序性细胞死亡配体1(PD-L1)特异性结合的一种或多种CAR(例如抗PD-L1CAR)的核酸构建体转染如本所披露的待辐射的经修饰的NK-92细胞。例如，编码特异性结合PD-L1的一种或多种CAR分子的核酸构建体具有与SEQ ID NO：69至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列(其可以由与SEQ ID NO：68至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列编码)。
在特别的实施例中，用表达载体(例如，四顺反子载体)转染NK-92细胞，该表达载体包含：SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸；SEQ ID NO：25(CD19CAR)或与SEQ ID NO：13(CD16F158V)具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸，或与SEQ ID NO：14(erIL-2核苷酸序列)具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸或多肽序列；和/或SEQ ID NO：15(erIL-2氨基酸序列)，或与SEQ ID NO：14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。
在其他特别的实施例中，用表达载体(例如，四顺反子载体)转染NK-92细胞，该表达载体包含：SEQ ID NO：47(CXCR2)或与SEQ ID NO：47具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸；SEQ ID NO：25(CD19 CAR)或与SEQ ID NO：12具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸；和SEQ IDNO：13(CD16 158V)，和/或与SEQ ID NO：14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸；和/或SEQ ID NO：15(erIL-2)，或与SEQ ID NO：14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。合适的表达载体是本领域已知的并且可以使用。在另外的方面，重组核酸包含编码erIL-15的区段，并且编码erIL-15的核酸与SEQ ID NO：67具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。任选地，表达载体是质粒。
在可选的实施例中，CAR可以包含CD19CAR_CD3a，其具有与SEQ ID NO：41具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多肽序列。
从不同的视角考虑，可以向癌症患者施用经辐射的具有维持活性的重组NK-92细胞，用于减少癌细胞或肿瘤大小。因此，用于治疗受试者的癌症或肿瘤的方法包括向受试者施用治疗有效量的经辐射的重组NK-92细胞。首先，其中用如本文所披露的核酸转染重组NK-92细胞编码，该核酸编码i)归巢受体，ii)特异性结合靶抗原的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，iii)Fc受体，和/或iv)选自TGFβ抑制剂和/或IL-12的分泌型免疫调节剂，其中该核酸与启动子可操作地连接。随后用2.5、5、10或15戈瑞辐射经转染的重组NK-92细胞。随后向受试者(例如癌症患者)施用经辐射的重组KN-92细胞。在一些实施例中，向该受试者每m2施用约1×103至1×1010个经辐射的重组NK-92细胞。如本文所披露的经辐射的重组NK-92细胞的施用可以是肠胃外、静脉内、瘤周或输注到受试者中。
根据本文提供的方法，向受试者施用有效量的本文公开的经辐射的重组NK细胞。术语有效量和有效剂量可以互换使用。术语有效量定义为产生期望的生理反应(例如减轻炎症)所必需的任何量。本领域技术人员可以凭经验确定施用药剂的有效量和时间表。施用的剂量范围是足够大以产生期望效果的那些剂量范围，在期望效果中疾病或病症的一种或多种症状受到影响(例如，减轻或延迟)。剂量不应如此大以致引起严重的不良副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随年龄、病状、性别、疾病类型、疾病或病症的程度、施用途径或方案中是否包括其他药物而变化，并且可以由本领域技术人员确定。如果发生任何禁忌症，则剂量可由个体医师调整。剂量可以变化，并且可以每天施用一次或多次，持续一天或几天。对于给定类别的药物产品，可以在文献中找到适当剂量的指南。例如，对于给定参数，有效量将显示至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％的增加或减少。功效也可以表示为增加或减少“多少倍”。例如，治疗有效量可以相对于对照具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍的作用。确切的剂量和配方将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知的技术来确定(参见，例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型](第1-3卷，1992)；Lloyd，The Art，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding[药物复合的领域、科学和技术](1999)；Remington：The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践]，第22版，Gennaro编辑(2012)，和Pickar，Dosage Calculations[剂量计算](1999))。
药学上可接受的组合物可以包括多种载剂和赋形剂。可以使用各种水性载剂，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，并且通常不含不需要的物质。合适的载剂及其配制品在Remington：The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践]，第22版，Loyd V.Allen等编辑，医药出版社(Pharmaceutical Press)(2012)中有描述。药学上可接受的载剂意指不是生物学上或其他方面不希望的材料，即，向受试者施用该材料不会引起不希望的生物学效应或以有害的方式与药物组合物中含有的其他组分相互作用。如果向受试者施用，则任选地选择载剂以最小化活性成分的降解和最小化受试者的不良副作用。如本文所用，术语药学上可接受与生理学上可接受以及药理学上可接受同义使用。药物组合物通常包含用于在储存中缓冲和保存的药剂，并且可以根据施用途径而定包括用于适当递送的缓冲剂和载剂。
这些组合物可以含有接近生理条件所需的可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些配制品和/或其他药剂中的细胞浓度可以变化，并且将根据所选择的特定施用模式和受试者的需要，主要根据流体体积、粘度、体重等进行选择。
试剂盒
本文提供了包含本文所述的重组NK-92细胞的试剂盒。在一些实施例中，该试剂盒包含重组NK-92细胞，这些细胞包含编码以下物质的一种或多种核酸序列：i)归巢受体，ii)与靶抗原特异性结合的ABP或CAR，iii)Fc受体，和/或iv)选自TGFβ抑制剂和/或IL-12的分泌型免疫调节剂。任选地，由核酸序列编码的一种或多种蛋白质在重组NK-92细胞的细胞表面上表达。在一些实施例中，试剂盒包含重组NK-92细胞，该细胞包含与启动子可操作地连接的编码C-C趋化因子受体7型(CCR7)、CXCR2或CXCL14受体的核酸。任选地，编码CCR7的核酸与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。任选地，归巢受体在重组NK-92细胞的细胞表面上表达。任选地，启动子包含一个或多个NFAT结合元件和最小启动子。任选地，启动子与SEQ ID NO：6具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。任选地，由核酸序列编码的一种或多种蛋白质在重组NK-92细胞的细胞表面上表达。
任选地，在包含药学上可接受的赋形剂的组合物中提供重组NK-92细胞。任选地，试剂盒可以含有其他化合物，诸如治疗活性化合物或欲在施用重组NK-92细胞之前、同时或之后施用的药物。任选地，试剂盒的使用说明书将包括在癌症治疗中使用试剂盒组分的指导。说明书可以进一步含有关于如何制备抗体(例如，在冷冻干燥的蛋白质的情况下，稀释或重构)和重组NK-92细胞(例如，解冻和/或培养)的信息。说明书可以进一步包括关于施用剂量和频率的指南。
以下讨论提供了本发明主题的许多示例性实施例。尽管每个实施例代表发明要素的单个组合，但是本发明的主题被认为包括所披露的要素中的所有可能的组合。因此，如果一个实施例包含要素A、B和C，并且第二实施例包含要素B和D，则本发明的主题还被认为包括A、B、C或D的其他剩余组合，即使不是明确披露。
在一些实施例中，用于描述和要求保护本发明某些实施例的表达成分、特性(如浓度)、反应条件等的量的数字应被理解为在一些情况下由术语“约”来修饰。因此，在一些实施例中，书面说明书和所附权利要求中列出的数值参数是近似值，其可以根据特定实施例试图获得的所需特性而变化。在一些实施例中，数值参数应当按照报告的有效数字的数量以及通过应用普通的舍入技术来解释。虽然阐述本发明一些实施例的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可行地精确地报告。在本发明的一些实施例中呈现的数值可以含有必然由其各自测试测量中所发现的标准偏差引起的某些误差。
除非上下文指明相反，否则本文阐述的所有范围应当被解释为包括其端点，并且开放式范围应当被解释为仅包括商业实用值。类似地，除非上下文指明相反，否则应将所有值的列表视为包含中间值。
实例
参考图2A-2B，用0至30Gy范围内的辐射剂量对野生型NK-92细胞进行辐射，并在5天(120小时)内相应地测量细胞浓度和存活百分比。在图3中示出经辐射(10Gy)和未经辐射的aNK和haNK细胞中的细胞浓度和活力百分比。
PD-L1 t-haNK细胞系已被开发用于施用至患有表达PD-LI抗原的肿瘤的癌症患者，并且还可用于与识别肿瘤特异性抗原的抗体的联合方案。通过用四顺反子载体(在图4A中示意性地描绘)转染分泌TGFβ拮抗剂的PD-L1 t-haNK细胞系(TGFβ-阱/PD-L1 t-haNK)被开发用于阻断肿瘤中的TGFβ活性。然而，同种异体细胞在输注到癌症患者中时会产生有害影响。因此，为了避免这些有害影响，在输注前对TGFβ-阱/PD-L1 t-haNK细胞进行辐射。考虑到较高的辐射剂量也可能对细胞功能(特别是TGFβ的分泌)产生负面影响，因此非常需要最佳辐射剂量来抑制增殖能力而不影响细胞功能。因此，图4B中示出辐射后TGFβ-阱/PD-L1t-haNK细胞的细胞浓度，而图4C示出了辐射后TGFβ-阱分子的分泌(TGFβ-RII胞外域的测定)。
在另一个实施例中，图4D中示意性地描绘了用于在PD-L1 t-haNK细胞系(IL-12/PD-L1 t-haNK)中表达IL-12的四顺反子载体。在一些实施例中，将经辐射的PD-L1 t-haNK细胞施用到受试者中，赋予了在受试者中对癌细胞和/或肿瘤细胞中的IL-12活性的抑制。
参考图5A-5B，使用RS-2000辐照器对PD-L1 t-haNK细胞进行增加剂量的X射线辐射。辐射后，将细胞设置为使用完全生长培养基在最佳生长条件下进行长期培养。使用各种方法(包括细胞密度(图5A和5B)、细胞健康测定(图7A和7B)和成像细胞计数方法(图6、7A、7B))定期评估活细胞，为期35天。
研究设计
在5％白蛋白(人类)中以4.0 x 107个细胞/mL配制PD-LI t-haNK细胞，并使用RS-2000辐照器以0、2.5、5、10、15、20和30Gy的水平进行辐射。辐射后立即将细胞在完全生长培养基(cGM)中稀释并置于维持在37℃和5％CO2环境的培养箱中。未经辐射(0Gy)细胞用作对照。在研究的第一周期间隔日进行分析测试，然后在整个研究的剩余时间内每周进行测试。每周用新鲜培养基(三分之二体积)补充细胞培养物。
PD-L1 t-haNK细胞浓度和辐射
通过以336 x g离心5分钟来浓缩PD-L1 t-haNK细胞。将细胞沉淀悬浮在5％白蛋白(人类)USP中，并将浓度调整为4.0 x 107个细胞/mL。使用RadSource RS-2000在室温下用不同剂量的X射线对不同T-25烧瓶中的浓缩细胞进行辐射。该机器被编程为以指定的剂量辐射细胞，辐射时间由机器自动设置(表1)。
表1.辐射时间与剂量
分析测试
为了评估辐射对细胞增殖能力的影响，在培养的35天内监测了细胞健康(细胞活力)和活力。参考图6、7A和7B，在第1、2、3、4、7、10、15、21、28和35天从烧瓶中取出样品并进行分析测试以测量；(a)CCVNC-200测试方法的细胞活力和活细胞计数；(b)明场显微镜下的细胞形态和(c)使用
NC3000TM图像细胞计数器的细胞健康。未经辐射的细胞用作研究对照。
PD-L1 t-haNK辐射后的细胞生长分析
细胞活力和活细胞计数通过CCV NC-200测试方法确定。在含有经辐射的细胞的烧瓶中，细胞的活细胞密度(VCD)从最初的5 x 105个细胞/mL到培养第7天显著地下降，而未经辐射的烧瓶中的细胞数量在7天内展示出快速生长(图5A-5B)。在任何含有用约5Gy剂量的辐射长达35天的经辐射的细胞的烧瓶中都没有观察到细胞生长。
通过使用EVOS显微镜的明场成像进一步确认CCV NC-200测试方法的细胞计数。培养期间细胞形态的可视化证实到第9天经辐射的烧瓶中的细胞数量显著下降(图6)，并且从第15天到研究结束没有观察到活细胞。
在膜联蛋白测定中，使用荧光标记的膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)对细胞进行染色，后者用于区分早期和晚期凋亡/坏死细胞。使用
NC3000TM的成像细胞计数仪通过膜联蛋白V染色评估培养细胞的健康。膜联蛋白V染色与Hoeschst 33342和碘化丙啶(PI)结合显示，在用2.5Gy及以上剂量辐射的烧瓶中培养两天后凋亡(膜联蛋白+PI+，右上象限)和凋亡前(膜联蛋白+PI-，右下象限)细胞数量增加(图7A)。
使用活力测定进行PD-L1 t-haNK细胞健康评估
通过检测细胞内还原硫醇(谷胱甘肽；GSH)水平的变化来测量细胞活力，这是细胞死亡进展的早期标志。使用
NC3000TM的成像细胞计数仪通过活力测定评估培养物中的细胞健康。在培养两天后，在用2.5Gy及以上剂量辐射的烧瓶中观察到细胞GSH浓度(GSH+，右下象限)显著降低和PI阳性死细胞(上象限)增加(图7B)。
本研究的目的是评估不同剂量的X射线辐射对PD-LI t-haNK细胞增殖能力的影响。这些结果共同表明，以15Gy剂量编程的RS-2000辐照器可以阻止PD-LI t-haNK细胞的增殖能力。然而，当在5至30Gy X射线辐射剂量范围内对培养物进行辐射时，没有观察到细胞生长。未经辐射的细胞(对照样品)能够在培养物中生长长达35天。
如本文的说明书和随后的整个权利要求中所使用，“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”以及“该/这些(the)”的含义包括复数参照物，除非上下文清楚地另外指明。而且，如本文的说明书中所使用，“在……中(in)”的含义包括“在……中(in)”和“在……上(on)”，除非上下文另有明确说明。
本文中对值的范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非在本文中另外指示，否则具有一定范围的每个单独的值被并入本说明书中，如同其在本文中单独陈述一样。除非在本文中另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则本文所述的所有方法能以任何合适顺序进行。关于本文某些实施例提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对原本要求保护的本发明范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应当被解释为指示任何未要求保护的要素是实践本发明所必需的。
本文披露的本发明的可替代的要素或实施例的分组不应被解释为限制。每个组成员可以单独或以与组中其他成员或本文发现的其他要素的任何组合被提及和要求保护。出于方便和/或专利性的原因，组中的一个或多个成员可以包括在组中或从组中删除。当发生任何这种包括或删除时，在本文中认为本说明书含有经修改从而满足所附权利要求中使用的所有马库什群组(Markush group)的书面描述的组。
对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，除了在所附权利要求的精神中之外，本发明主题不受限制。此外，在解释本说明书和权利要求时，所有术语都应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。特别地，术语“包含/包括”(“comprises”和“comprising”)应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在本说明书的权利要求提及选自由A、B、C……和N组成的组的某物中的至少一种的情况下，该文本应当被解释为仅需要该组中的一种要素，而不是A加N或B加N等。
Claims (29)
1.一种用核酸转染并经伽马(γ)-辐射的重组自然杀伤(NK)-92细胞，
其中该核酸编码：i)归巢受体，ii)特异性结合靶抗原的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，iii)Fc受体，和/或iv)选自TGFβ抑制剂和/或IL-12的分泌型免疫调节蛋白，并且
其中该核酸与启动子可操作地连接。
2.如权利要求1所述的重组NK-92细胞，其中该重组NK-92细胞在2.5至20 Gy之间进行辐射。
3.如权利要求1所述的重组NK-92细胞，其中经修饰的NK-92细胞在5、10或15 Gy进行辐射。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组NK-92细胞，其中该核酸是三顺反子载体或四顺反子载体。
5.如权利要求1所述的重组NK-92细胞，其中该归巢受体选自G蛋白偶联受体(GPCR)、趋化因子受体、细胞因子受体、细胞粘附分子、选择素或整合素。
6.如权利要求1所述的重组NK-92细胞，其中该归巢受体是选自IL2、IL-15、er-IL2或er-IL15的细胞因子。
7.如权利要求1所述的重组NK-92细胞，其中该抗原结合蛋白选自与CD19、CD20、GD2、HER-2、CD30、EGFR、FAP、CD33、CD123、PD-L1、IGF1R、CSPG4或B7-H4结合的蛋白或抗体。
8.如权利要求1所述的重组NK-92细胞，其中该抗原结合蛋白与PD-L1结合。
9.如权利要求1所述的重组NK-92细胞，其中该Fc受体是CD16或高亲和力CD16。
10.如权利要求1-9中任一项所述的重组NK-92细胞，其中该分泌型免疫调节剂是TGF-β抑制剂。
11.如权利要求10所述的重组NK-92细胞，其中该TGF-β抑制剂是TGF-β阱。
12.如权利要求11所述的重组NK-92细胞，其中该TGF-β阱包含TGFβRII分子的细胞外结构域。
13.如权利要求11所述的重组NK-92细胞，其中该TGF-β阱包含TGF-β受体II胞外域(TGFβRIIecd)的单链二聚体。
14.如权利要求1-13中任一项所述的重组NK-92细胞，其中该抗原结合蛋白包含嵌合抗原受体(CAR)。
15.如权利要求14所述的重组NK-92细胞，其中该CAR特异性结合PD-L1。
16.如权利要求1-15中任一项所述的重组NK-92细胞，其中该启动子包含至少一个活化T细胞核因子(NFAT)结合结构域。
17.如权利要求1-16中任一项所述的重组NK-92细胞，其中该重组NK-92细胞在暴露至γ辐射后抑制细胞复制，并且其中分泌型TGFβ抑制剂和/或IL-12瞬时活化长达约72小时。
18.如权利要求17所述的重组NK-92细胞，其中该重组NK-92细胞在5、10或15 Gy进行辐射。
19.如权利要求18所述的重组NK-92细胞，其中该分泌型TGFβ抑制剂和/或IL-12瞬时活化长达约72小时。
20.一种组合物，该组合物包含如权利要求1-19中任一项所述的重组NK-92细胞和药学上可接受的赋形剂。
21.一种试剂盒，该试剂盒包含如权利要求1-20中任一项所述的重组NK-92细胞和使用说明书。
22.一种治疗受试者中的癌症或肿瘤的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的如权利要求1-19中任一项所述的重组NK-92细胞或如权利要求20所述的组合物，其中施用治疗该受试者中的该癌症或缩小该受试者中的该肿瘤的大小。
23.如权利要求22所述的方法，其中该重组NK-92细胞或该组合物在该受试者中存活不超过72小时。
24.一种减少受试者中的癌症转移的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的如权利要求1-19中任一项所述的重组NK-92细胞或如权利要求20所述的组合物，从而减少该受试者中的癌症转移。
25.如权利要求22或24所述的方法，其中向该受试者每m2施用1×103至1×1010个重组NK-92细胞。
26.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其中该重组NK-92细胞经肠胃外、静脉内、瘤周或通过输注施用。
27.一种治疗受试者中的癌症或肿瘤的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的经辐射的重组NK-92细胞，
其中该经辐射的重组NK-92细胞包含：
用核酸转染的重组NK-92细胞，该核酸编码：i)归巢受体，ii)特异性结合靶抗原的抗原结合蛋白(ABP)或嵌合抗原受体(CAR)，iii)Fc受体，和/或iv)选自TGFβ抑制剂和/或IL-12的分泌型免疫调节蛋白，
其中该核酸与启动子可操作地连接；
以2.5至15 Gy对该转染的重组NK-92细胞进行辐射；并且
向该受试者施用该经辐射的转染的重组NK-92细胞。
28.如权利要求27所述的方法，其中向该受试者每m2施用1×103至1×1010个经辐射的重组NK-92细胞。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中该重组NK-92细胞经肠胃外、静脉内、瘤周或通过输注施用。
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