DE69834257T2

DE69834257T2 - Natürliche killerzelllinien und verfahren zu ihrer verwendung

Info

Publication number: DE69834257T2
Application number: DE69834257T
Authority: DE
Inventors: Hans Boston Klingemann
Original assignee: Klingemann, Hans
Current assignee: ZELLERX CORP., RANCHO SANTA FE, CALIF., US
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2018-05-01
Also published as: US20040018182A1; US20040022773A1; US20020068044A1; US20040018183A1; EP1007630B1; ES2263205T3; WO1998049268A9; ATE323756T1; WO1998049268A1; AU7267398A; EP1007630A4; DE69834257D1; US10138462B2; EP1690927A1; EP1007630A1; US20060110360A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Mediums, das natürliche Killerzellen umfasst, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Pathologien, die auf Krebs oder Virusinfektionen bezogen sind. Spezifisch wird eine bestimmte Zelllinie, NK-92, und deren Modifikationen offenbart. Diese Zellen sind Befunden zufolge bei der Behandlung dieser Pathologien hocheffizient.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bestimmte Zellen des Immunsystems haben zytotoxische Aktivität gegen bestimmte Zielzellen. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) sind über Antigen-abgeleitete Peptide, die an MHC-Klasse-I-spezifische Marker gebunden sind, spezifisch auf ihre Ziele gerichtet. Natürliche Killer (NK)-Zellen sind jedoch nicht so eingeschränkt. NK-Zellen, die gewöhnlich etwa 10 bis 15% der zirkulierenden Lymphozyten ausmachen, binden und töten Zielzellen, einschließlich virusinfizierter Zellen und vieler maligner Zellen, nichtspezifisch in Bezug auf das Antigen und ohne vorherige Immunsensibilisierung (Herberman et al., Science 214; 24 (1981)). Das Abtöten der Zielzellen erfolgt durch die Induktion der Zelllyse. Eine MHC-Klassen-Restriktion ist ebenfalls nicht beteiligt. Auf diese Weise unterscheidet sich die Aktivität der NK-Zellen von antigenspezifischen und MHC-Klassenspezifischen T-Zellen, wie zytotoxischen T-Lymphozyten. Die Verwendung von NK-Zellen in der Immuntherapie von Tumoren und Malignitäten wird durch diese Eigenschaften erwogen, da viele Tumore MHC-Klasse-I-defizient sind und daher keine CTL-Aktivität anziehen. Adhäsionsmoleküle können ebenfalls an dem Targeting von NK-Zellen beteiligt sein; es wird beispielsweise beobachtet, dass der Fcγ-Rezeptor (CD16) auf NK-Zellen exprimiert wird. NK-Zellen sind große granuläre Lymphozyten, denen CD3 fehlt, und die neben CD16 auch Leu19 exprimieren können (Lanier et al., J. Immunol. 136; 4480 (1986)).
NK-Zellen werden aktiviert, wenn sie Cytokinen, wie Interleukin-2 (IL-2), IL-7, IL-12 und Interferonen ausgesetzt sind (Alderson et al., J. Exp. Med. 172: 577–587 (1990); Robertson et al., J. Exp. Med. 175: 779–788 (1992)). Die resultierenden Zellen werden als lymphokinaktivierte Killer (LAK)-Zellen bezeichnet. Das Spektrum der Zielzellen ist in aktivierten NK-Zellen verglichen mit nichtaktivierten Zellen verändert, obschon der Mechanismus der Abtötung identisch oder ähnlich ist (Philips et al., J. Exp. Med. 164: 814–825 (1986)).
Die Abtötungsaktivität in den Zellen des Immunsystems kann allgemeiner induziert werden durch Behandeln einer Population von Zellen, wie peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) mit Lymphokinen. Solche Präparate enthalten LAK-Zellen. LAK-Zellen können auch aus autologen Proben von peripheren Blutlymphozyten erzeugt werden. LAK-Zellen haben eine Antitumorabtötungsaktivität, und haben im Wesentlichen keine Auswirkung auf normale Zellen. Sie scheinen eine Leukämie (Longe et al., Transplantation 46: 433 (1988); Xhou et al., Proc Am. Assoc. Cancer Res. 34: 469 (1993, Abstract)), Lymphom (Schmidt-Wolf et al., J. Exp. Med. 174: 139 (1991); Gambacorti-Passerini et al., Br. J. Haematol. 18: 197 (1991)) und Neuroblastom (Ades et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 46: 150 (1988)) zu eliminieren. NK-Zellen, aktivierte NK-Zellen und LAK-Zellen sind aufgrund ihrer Zelloberflächenmarker und aufgrund ihrer Identität der Zielzellen, die sie töten unterscheidbar.
Aktivierte und expandierte (d.h. zur Proliferation gezüchtete) NK-Zellen und LAK-Zellen wurden sowohl bei der Ex-vivo-Therapie als auch bei der In-vivo-Behandlung in Patienten mit fortgeschrittenem Krebs verwendet. Etwas Erfolg mit der Ex-vivo-Therapie wurde bei Knochenmarks-spezifischen Erkrankungen beobachtet, wie bei Leukämie, Brustkrebs und bestimmten Lymphom-Arten. Die In-vivo-Behandlung kann auf diese und andere Formen von Krebs gerichtet werden, einschließlich malignem Melanom und Nierenkrebs (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 316: 889–897 (1987)): Die LAK-Zellbehandlung erfordert, dass der Patient zuerst IL-2 erhält, gefolgt von Leukophorese und anschließend einer Ex-vivo-Inkubation und Anzucht der geernteten autologen Blutzellen in der Gegenwart von IL-2 für einige Tage. Die LAK-Zellen müssen zusammen mit relativ hohen Dosen von IL-2 reinfundiert werden, damit die Therapie beendet wird. Die Spülungsbehandlung ist teuer und kann schwere Nebenwirkungen verursachen. Diese umfassen Flüssigkeitsretention, Lungenödem, Blutdruckabfall, und hohes Fieber. Bei einigen Fällen, in denen diese Nebenwirkungen auftreten, ist eine medizinische Versorgung in der Intensivstation vonnöten.
Spülungstechniken wurden ebenfalls in anderen Fällen angewendet. Zytotoxische Medikamente oder monoklonale Antikörper, kombiniert mit Komplement, und Toxine, können verabreicht werden, damit eine Remission hervorgerufen wird. In solchen Fällen werden Knochenmarks- oder Blutstammzellen, die zur Reduktion der Anzahl der restlichen vorhandenen Leukämiezellen gespült wurden, nach der Medikamentenbehandlung zurück in den Patienten infundiert (Uckun et al., Blood 79: 1094 (1992)). Genmarkierungsuntersuchungen zeigten, dass ungespültes Knochenmark zu einem Rezidiv bei Patienten führt, von denen man annahm, dass sie in Remission sind (Brenner et al., Lancet 341: 85 (1993)). Dies legt nahe, dass eine gewisse Form der Spülung von autologem Mark oder Blut vor der Transplantation nötig ist (Klingemann et al., Biol. Blood Marrow Transplant 2: 68–69 (1996)).
Vor kurzem zeigten vorklinische Studien auch eine vielversprechende Antitumoraktivität in vivo mit einem lethal bestrahlten MHC-unrestringierten, zytotoxischen T-Zell-Leukämie-Klon (TALL-104) (Cesano et al., Cancer Immunol. Immunother. 40: 139–151 (1995); Cesano et al., Blood 87: 393–403 (1996)). Diese Zellen wurden von Leukämie-T-Zellenlinien abgeleitet, die von Patienten mit akuten T-lymphoblastischen Leukämien (ALL) erhalten wurden. Sie tragen im Unterschied zu NK-Zellen, welche den umgekehrten Immunophänotyp (CD3^– CD56⁺) haben, den Zell-Oberflächenmarker CD3, aber nicht den CD56-Marker. Eine adoptive Übertragung dieser Zellen konnte Human-Leukämiezelllinien in fremdtransplantierten Mäusen mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID) eliminieren, und Remissionen spontaner Lymphome in Hunden induzieren, ohne dass eine T-Zell-Leukämie in den Tiermodellen induziert wurde (Cesano et al., (1995); Cesano et al., (1996); Cesano et al., J. Clin. Invest. 94: 1076–1084 (1994); Cesano et al., Cancer Res. 56: 3021–3029 (1996)).
Die NK-Zellen haben beim Abtöten der Tumorzellen und virusinfizierten Zellen zwar vorteilhafte Eigenschaften, jedoch bleiben sie bei der Immuntherapie schwierig zu bearbeiten und anzuwenden. Es ist schwierig, NK-Zellen ex vivo zu expandieren, die ihre tumoranzielenden, tumoriziden und viriziden Eigenschaften in vivo beibehalten. Dies bleibt ein größeres Hindernis bei der Verwendung bei der adoptiven Zell-Immuntherapie (Melder et al., Cancer Research 48: 3461–3469 (1988); Stephen et al., Leuk. Lymphoma 377–399 (1992); Rosenberg et al., New Engl. J. Med. 316: 889–897 (1987)). Untersuchungen der Mechanismen, durch die NK-Zellen ihre tumoriziden und viriziden Auswirkungen ausüben, sind ebenfalls eingeschränkt durch Schwierigkeiten bei der Anreicherung der NK-Zellfraktionen, ohne dass ihre biologischen Funktionen beeinträchtigt werden, und bei der Gewinnung reiner NK-Zellen, die nicht durch T-Zellen oder andere Immuneffektorzellen verunreinigt sind. Bei einem Versuch, diese Probleme zu bewältigen, haben sich viele Forscher der Verwendung etablierter NK-ähnlicher Zelllinien zugewandt, um die Mechanismen zu untersuchen, wodurch die Zielzellen gegenüber zytotoxischen Zellen anfällig sind (Hercend et al., Nature 301: 158–160 (1983); Yodoi et al., J. Immunol. 134: 1623–1630 (1985); Fernandez et al., Blood 67: 925–930 (1986); Robertson et al., Exp. Hematol. 24: 406–415 (1996); Gong et al., Leukemia 8; 652–658 (1994)). NK-Zelllinien, die in einer früheren Arbeit beschrieben wurden, tragen T-Lymphozyten-assoziierte Oberflächenmarker, trotz der Tatsache, dass sie sich aus einer an T-Zellen abgereicherten Vorläuferzelle entwickelten (Rosenberg et al. (1987); Hercend et al., (1983)).
Es besteht somit weiterhin ein Bedarf für ein Verfahren zur Behandlung einer mit Krebs oder einer Virusinfektion einhergehenden Pathologie mit einer natürlichen Killerzellinie, die die Lebensfähigkeit und therapeutische Wirksamkeit gegen eine Vielzahl von Tumorklassen beibehält. Dieser Bedarf umfasst therapeutische Verfahren, in denen Proben aus einem Säugetier ex vivo mit natürlichen Killerzellen behandelt werden sowie Verfahren zur Behandlung dieser Pathologien mit natürlichen Killerzellen in vivo in einem Säugetier. Es besteht auch ein Bedarf an einer natürlichen Killerzellinie, die ihre eigene Neigung zum Überleben und die zytolytische Aktivität beibehält, indem ein Cytokin sezerniert wird, das diese Eigenschaften fördert. Es besteht auch ein Bedarf an solchen natürlichen Killerzelllinien, die derart modifiziert sind, dass sie bei der Behandlung von Krebs und Virusinfektion effizienter, zweckdienlicher und/oder geeigneter sind. Die Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von NK-Zellen und Verfahren, die diese Bedürfnisse angehen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die von Gong et al., (1994) beschriebene Zelllinie mit der Bezeichnung NK-92, proliferiert in der Gegenwart von IL-2 und hat eine hohe zytolytische Aktivität gegen eine Reihe von Krebserkrankungen. Die Erfindung nutzt die NK-92-Zelllinie, sowie modifizierte NK-92-Zelllinien, für die Bereitstellung eines Medikamentes zur Krebsbehandlung. Die Beschreibung beschreibt Vektoren, die NK-92-, sowie modifizierte NK-92-Zellen, transfizieren. Für erfindungsgemäße Zwecke und wenn nicht anders angegeben, betrifft der Begriff "NK-92" die ursprüngliche NK-92-Zelllinien, sowie die hier offenbarten modifizierten NK-92-Zelllinien.
Ein Aspekt der Beschreibung beschreibt einen Vektor zum Transfizieren von NK-92-Zellen, wobei der Vektor eine Nukleinsäuresequenz beinhaltet, die ein Protein codiert, das entweder ein Cytokin, das das Wachstum der NK-92-Zellen fördert, eine Zellkomponente, die auf ein Mittel reagiert, ein Krebszell-Rezeptormolekül, oder eine jede Kombination dieser Proteine ist. Bei der Transfektion mit dem Vektor exprimieren die NK-92-Zellen konstitutiv das Protein. Das Protein kann das Cytokin Interleukin 2 sein. Die Vektoren können MFG-hIL-2 und pCEP4-LTRhIL-2 sein. Das Protein kann eine Zellkomponente sein, die auf ein Mittel reagiert, so dass beim Transfizieren des Vektors mit NK-92-Zellen und bei der Aufnahme des Mittels durch die Zellen, diese inaktiviert werden. Das Mittel kann entweder Acyclovir oder Gancyclovir sein.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt eine Zellpopulation bereit, die durch eine physikalische Behandlung oder durch Transfektion mit einem Vektor modifizierte NK-92-Zellen enthält. Bei signifikanten Ausführungsformen dieser Population macht die physikalische Behandlung diese nicht-proliferativ, und verringert die Zytotoxizität der Zellen nicht signifikant, und bei besonders signifikanten Ausführungsformen ist die Behandlung Bestrahlung. Bei zusätzlichen wichtigen Ausführungsformen wurden die Zellen mit einem Vektor transfiziert, der ein Cytokin codiert, das das Wachstum von Zellen fördert. Die Zellen sezernieren das Cytokin, sowohl wenn sie unter Bedingungen gezüchtet werden, die die Cytokin-Sekretion fördern, oder wenn sie in vivo in ein Säugetier eingebracht werden. Bei besonders wichtigen Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist das Cytokin Interleukin 2. Bei weiteren wichtigen Ausführungsformen sind die NK-92-Zellen die Zellen NK-92MI, die durch Transfektion mit dem codierenden Vektor MFG-hIL-2 modifiziert wurden, und die Zellen MK-92CI, die durch Transfektion mit dem Interleukin-2 codierenden Vektor pCEP4-LTRhIL-2 modifiziert wurden. Die Zelllinien NK-92MI und NK-92CI sind in der American Type Culture Collection hinterlegt.
Bei zusätzlichen wichtigen Ausführungsformen werden die NK-92-Zellen durch einen Vektor transfiziert, der eine Sequenz enthält. Diese codiert eine auf ein Mittel reagierende Zellkomponente, so dass die so transfizierte NK-92-Zelle bei Aufnahme des Mittels inaktiviert wird. Bei besonders wichtigen Ausführungsformen davon ist das Mittel Acyclovir oder Gancyclovir. Bei weiteren zusätzlichen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit einem Vektor transfiziert, der ein Krebszell-Rezeptormolekül codiert.
Die Erfindung stellt zudem die Verwendung eines NK-92-Zellen enthaltenden Mediums zur Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln einer Pathologie in vivo in einem Säugetier bereit, die geeignet ist zum Verabreichen an ein Säugetier eines Mediums, das natürliche Killerzellen, entweder NK-92-Zellen oder NK-92-Zellen, die modifiziert wurden durch eine physikalische Behandlung, die diese nicht proliferativ macht und dennoch nicht signifikant ihre Zytotoxizität verringert, durch Behandlung, die die Expression von HLA-Antigenen auf der NK-92-Zelloberfläche hemmt oder durch Transfektion mit einem Vektor, enthält. Der Vektor codiert ein Cytokin, das das Wachstum von Zellen fördert, oder ein Protein, das auf ein Mittel reagiert oder ein Krebszellrezeptormolekül, oder sie wurden mit einer beliebigen Kombination dieser Modifikationen behandelt. Bei wichtigen Ausführungsformen ist die Pathologie ein Krebs, wie Leukämie, ein Lymphom, oder ein multiples Myelom. Alternativ ist bei wichtigen Ausführungsformen die Pathologie eine Infektion durch ein pathogenes Virus, wie HIV, EBV, CMV oder Herpes. Vorteilhafte Ausführungsformen dieses Verfahrens umfassen die intravenöse Verabreichung der Zellen an einen Mensch und das Verabreichen eines Cytokins, das das Wachstum der Zellen fördert, an das Säugetier zusammen mit der Verabreichung des Mediums, das die natürliche Killerzelle enthält. Die erfindungsgemäßen Verfahren werden insbesondere an die Behandlung von Leukämie, Lymphom oder multiples Myelom angepasst.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform der Verwendung eines Mediums, das NK-92-Zellen umfasst, zur Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln von Krebs wird NK-92 durch Transfektion mit einem Vektor modifiziert, der ein auf ein Mittel reagierendes Element umfasst, so dass die Zelle bei Aufnahme des Mittels inaktiviert wird. Gemäß dieser Verwendung ist eine zur Inaktivierung der Zelle effiziente Menge des Mittels zur Verabreichung an ein Säugetier geeignet, und zwar nach einer so langen Dauer, dass die natürliche Killerzelle den Krebs behandelt, oder nach einer Zeit, an der man die Behandlung effizient beenden möchte. Bei einem signifikanten Aspekt dieser Ausführungsform ist das Mittel Acyclovir oder Gancyclovir. Solche transfizierten Zellen können bei Bedarf eigentlich " durch Verabreichen des Mittels abgeschaltet" werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
Es zeigt:
1 die zytotoxische Aktivität von NK-92 gegen verschiedene leukämische Zielzelllinien, die in einem 4-Std.-⁵¹Cr-Freisetzungstest untersucht wurden. Die Ergebnisse veranschaulichen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) für drei wiederholte Experimente.
2 die Zytotoxizität von NK-92 nach IL-2-Entzug. NK-92-Zellen wurden in einem angereicherten Alphamedium (Myelocult^TM, StemCell Technologies, Vancouver, BC) ohne IL-2 gezüchtet. Die Zytotoxizität wurde täglich mit dem ⁵¹Cr-Freisetzungstest gegen K562-neo'- oder Daudi-Zielzellen gemessen. Die Figur zeigt die Ergebnisse aus einem veranschaulichenden Experiment bei einem E. T.-Verhältnis von 10:1.
3 die Wirkung verschiedener Dosen der γ-Strahlung auf das zytolytische Potential von NK-92-Zellen. Die NK-92-Zellen wurden mit einer ¹³⁷Cs-Quelle unter Verwendung von Dosen bestrahlt, die von 200 bis 1000 cGy reichten. Zur Ermöglichung der Gewinnung wurden die Zellen in einem IL-2-haltigen Medium für 24 Std. belassen, bevor die Zytoxizität in einem 4 Std. ⁵¹Cr-Freisetzungsassay gegen die Zielzelllinie K562 gemessen wurde.
4 die Überlebenskurven der NK-92-Zellen nach der γ-Bestrahlung. Die NK-92-Zellen wurden mit einer γ-Strahlenquelle bei Dosen von 300, 500, 1000 und 3000 cGy bestrahlt. Die Überlebensfähigkeit von NK-92-Zellen wurden mittels Trypan-Blaufärbung bestimmt. Die maximal erzielbare Konzentration der nichtbestrahlten NK-92-Zellen in der Kultur betrug etwa 1,5 × 10⁶/ml. Die Zellen mussten zur Verhinderung des Überwachsens genährt werden.
5 die Auswirkung der γ-Strahlung auf die In-vitro-Koloniebildung von NK-92-Zellen. Die NK-92-Zellen wurden in Medium auf Agarbasis gezüchtet, das mit rekombinantem Human-IL-2 (rhIL-2) angereichert war.
6 die Wirkung verschiedener Strahlungsdosen auf das zytolytische Potential von NK-92-Zellen. Die NK-92-Zellen wurden γ-bestrahlt bei Dosen von 300, 500, 1000, und 3000 cGy. ⁵¹Cr-markierte leukämische Zielzellen K562 (Feld A) und HL60 (Feld B) sowie 2 von Patienten-abgeleitete Leukämieproben TA27 (Feld C) und BA25 (Feld C) und BA25 (Feld D) wurden auf Anfälligkeit gegenüber Zytolyse durch bestrahlte und nichtbestrahlte (NR) NK-92-Zellen untersucht. Die Ergebnisse der 4 Std. Chrom-Freisetzungstests sind ausgedrückt als 30% Lyseeinheiten/10⁸ Effektorzellen.
7 die selektive Abtötung von aus Patienten stammenden Leukämiezellen durch NK-92-Zellen. ⁵¹Cr-markierte Leukämie-Zielzellen, hergeleitet von 40 Patienten [9 Fälle mit akuter Myeloidleukämie (AML), 11 Fälle mit chronischer Myeloid-Leukämie (CML), 14 Fälle mit akuter lymphoblastischer B-Familien-Leukämie (ALL) und 6 T-ALL-Fälle] und T-Zell-abgereicherte normale Knochenmarkszellen aus 14 normalen Spendern wurden auf die Anfälligkeit gegenüber Zytolyse durch NK-92-Zellen bei vier verschiedenen E/T-Verhältnissen untersucht. Die Ergebnisse eines 4-Std. Chrom-Freisetzungstests sind ausgedrückt als 30% Lyseeinheiten/10⁸-Effektor-Zellen bei einem E:T-Verhältnis von...
8 die In-vitro- (Felder A und B) und In-vivo- (Felder C und D) Antileukämie-Effizienz von NK-92-Zellen gegen K562 und HL560-Leukämien verglichen mit humanen LAK-Zellen und anderen Effektoren. ⁵¹Cr-markierte K562-(Feld A) und HL60 (Feld B)-Zellen wurden auf ihre Anfälligkeit gegenüber Zytolyse durch NK-92-Zellen im Vergleich mit verschiedenen bekannten Effektorzellen [LAK, NK (CD3^– CD56⁺), und T-Zellen (CD3⁺ CD56^–)] bei den angegebenen E/T-Verhältnissen in einem 4 Std.-CRA-Test untersucht. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SD von drei gesonderten Tests für NK-92-Zellen und zwei Tests von verschiedenen donor-hergeleiteten Effektoren für LAK-, CD56⁺- und CD3^–-Zellen. SCID-Mäuse wurden subkutan mit K562-Zellen (Feld C) oder HL60-Zellen (Feld D) (5 × 10⁶ Zellen pro Maus) allein oder in Kombination mit NK92-, LAK- oder NK-Zellen bei einem 4:1 E/T-Verhältnis beimpft. Als Maß für die Tumorgrößen wurden ihre Oberflächen einmal pro Woche nach dem Animpfen gemessen (n = 5).
9 die Antileukämie-Wirkung von NK-92-Zellen, allogenen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL)-Zellen und anderen Effektor-Zellen gegen eine von Patienten hergeleitete akute T-Lymphoblasten-Leukämie (T-ALL), die in vitro- und in vivo bestimmt wurde. Feld A: Die spezifische In-vitro-Abtötung von T-ALL (TA27) Zielzellen durch NK-92-, CTL- und andere Effektor-Zellen, wurde bestimmt durch einen 4 Std. ⁵¹Cr-Freisetzungs-Test mit Hilfe der angegeben E/T-Verhältnisse. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SD von zwei oder drei gesonderte Tests. Feld B: SCID-Mäuse wurden subkutan mit TA27-Zellen (5 × 10⁶ für jede Maus) beimpft, und zwar allein oder zusammen mit NK-92-, CTL- oder anderen Effektor-Zellen bei einem E/T-Verhältnis von 4:1. Rekombinantes Human-IL-2 (rhIL-2) wurde an die Mäuse intraperitoneal für zwei Wochen bei der Dosis von 5 × 10⁴ U an jedem zweiten Tag verabreicht. Die Leukämie-Tumorbereiche wurden einmal wöchentlich nach der Beimpfung gemessen (n = 5).
10 das Überleben von SCID-Mäusen, die T-ALL (TA27)-Leukämie hatten, welche gemeinsam mit NK92-Zellen beimpft wurden, verglichen mit allogenen CTL- oder bestrahlten TALL-104-Zellen.
11 das Überleben von SCID-Mäusen, die T-ALL (TA27) aufweisen, nach der Behandlung mit NK-92-Zellen. Die Mäuse erhielten 5 × 10⁶ TA27-Zellen intraperitoneal (I. P.). Die NK-92-Zellen (2 × 10⁷) wurden einmal I. P. beimpft oder 5 Mal (an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9) und zwar mit oder ohne Zugabe von rhIL-2 an jedem zweiten Tag während zwei Wochen.
12 das Überleben von SCID-Mäusen, die pre-B-ALL (BA31) aufweisen, nach der Behandlung mit NK-92-Zellen. Die Mäuse erhielten 5 × 10⁶ BA31-Zellen I. P. NK-92- (2 × 10⁷) Zellen wurden I. P. mit insgesamt 5 Dosen an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9 beimpft. Die Mäuse in den angegebenen Gruppen erhielten rhIL-2 an jedem zweiten Tag während zwei Wochen.
13 das Überleben von SCID-Mäusen die Human-AML (MA26) aufweisen, nach der Behandlung mit NK-92-Zellen. Die Mäuse erhielten 5 × 10⁶ MA26-Leukämie-Zellen I. P. NK-92 (2 × 10⁷)-Zellen wurden an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9 mit insgesamt 5 Dosen beimpft. Die Mäuse in den angegebenen Gruppen erhielten rhIL-2 an jedem zweiten Tag während zwei Wochen.
14 eine schematische Karte von Plasmid MFG-hIL-2.
15 eine schematische Karte von Plasmid pCEP4-LTR.hIL-2.
16 eine PCR-Analyse von NK-92, NK-92MI und NK-92CI für Human-IL-2-cDNA. DNA, welche aus dem parentalen NK-92 und aus den NK-92MI- und NK-92CI-Transfektanten isoliert wurde, wurde einer PCR-Analyse mit Primern unterworfen, die das erste Exon des Human-IL-2-Gen flankieren. Die PCR-Produkte wurde auf einem 2% Agarosegel aufgelöst, mit Ethidiumbromid gefärbt und auf einem UV-Transilluminator angeschaut (Feld A). Die DNA wurde auf eine Nylonmembran überführt und durch Southern-Blot-Analyse mit einer radioaktiv markierten Sonde für das hIL-2-Gen analysiert (Feld B).
17 die Northern-Blot-Analyse der Cytokin-Expression in NK-92, NK-92MI und NK-92CI. Die RNA-Proben, isoliert aus den parentalen und transfizierten Zelllinien, wurden durch Agarosegelelektrophorese getrennt, durch Kapillartransfer auf eine Nylon-Membran geblottet und mit Sonden für Human-IL-2 (Feld A) und TNF-α (Feld B) hybridisiert.
18 die Zytotoxizität von NK-92, NK-92MI und NK-92CI gegen K562- und Raji-Zielzellen. Die zytotoxischen Aktivitäten der IL-2-Transfektanten wurden mit denen der Parentalzelllinie verglichen. Die NK-Zellen wurden mit ⁵¹Cr-markiertem K562 (Feld A) oder Raji (Feld B)-Zellen bei Effektor-Zielverhältnissen von 1:1, 5:1, 10:1 und 20:1 für einen 4 Std. Chrom-Freisetzungstest gemischt. Die Zytotoxizitäten von NK-92 (
), NK-92MI (
) und NK-92CI (
) sind gezeigt.
19 die Wirkung von NK-92MI und NK-92CI auf hämatopoetische Vorläufer. Zur Untersuchung der Wirkung der NK-92-Zellen auf normale hämatopoetische Vorläufer wurde ein klonogener Test durchgeführt. Normale PBMCs wurden mit bestrahlten NK-92MI oder NK-92CI bei verschiedenen NK:PBMC-Verhältnissen im Bereich von 1:1 bis 1:1000 für 48 Std. inkubiert. Die Zellen wurden in Methylcellulose bei Konzentrationen plattiert, die 10 bis 100 Kolonien pro Schale nach 14 Tagen ergaben. Der klonogene Output von PBMCs, die mit NK-92MI (weiße Balken) und NK-92CI (graue Balken) inkubiert wurden, ist ausgedrückt entweder als Gesamtzahl von Kolonien oder subklassifiziert auf der Basis des Kolonietyps (BFU-E, CFU-GM und CFU-GEMM).
20 die Wirkung der Bestrahlung auf die NK-92-, NK-92MI- und NK-92CI-Proliferation und die Lebensfähigkeit. Zur Bestimmung der Wirkung der Bestrahlung auf parentale und transfizierte NK-92-Zellen wurden die Zellen Strahlungsdosen von 0, 500, 1000, 1500 und 2000 cGy ausgesetzt und auf Proliferation durch einen Standard-³H-Thymidin-Einbau-Assay untersucht. Feld A: Die Proliferation von NK-92 (
), NK-92MI (
) und NK-92CI (
) ist ausgedrückt als Prozentsatz der Kontrolle (unbestrahlte Zellen). Feld B: Die Zellen wurden 0, 250, 500, 1000 und 2000 cGy Strahlung ausgesetzt und durch Trypan-Blau-Ausschluss auf die Lebensfähigkeit nach 24 (schwarze Balken, 48 (graue Balken) und 72 Std. (weiße Balken) untersucht.
21 die Wirkung der Strahlung auf NK-92-, NK-92MI- und NK-92CI-Zytotoxizität. Zur Bestimmung der Wirkung der Strahlung auf die Zytotoxizität der NK-Zellen, wurden NK-92, NK-92MI und NK-92CI bei 0, 1000 und 2000 cGy und nach drei Tagen auf die Zytotoxizität gegen K562- (Feld A) und Raji (Feld B)-Zellen untersucht.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Mediums, umfassend NK-92-Zellen, für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer biologischen Probe oder eines Säugetiers, das mutmaßlich eine Pathologie hat, wie Krebs. Bestimmte natürliche Killerzellen, die für die Zellen zytolytisch sind, welche von der Pathologie betroffen sind, werden eingesetzt. Die Behandlung führt zu einer signifikanten Verringerung der Anzahl oder in einigen Fällen, zur Eliminierung von malignen oder kanzerogenen Zellen oder virus-infizierten Zellen, in der Probe oder in dem Säugetier. Die erfindungsgemäßen natürlichen Killerzellen werden als NK-92-Zellen bezeichnet und umfassen bestimmte behandelte oder transfizierte Modifikationen von NK-92-Zellen. Diese Zellen sind hocheffizient bei dem Spülen von Krebszellen ex vivo und bei der Zerstörung von Krebszellen in vivo.
Wie hier zur Beschreibung der Erfindung verwendet betreffen "zytotoxische T-Lymphozyten" (CTL) Immunzellen, die antigenspezifische Zielzellen abtöten. CTL sind MHC-Klasse-I-restringiert. Wie zur Beschreibung der Erfindung verwendet betreffen lymphokinaktivierte Killer (LAK)-Zellen Zellen des Immunsystems, die eine Antitumor-abtötende Aktivität aufweisen. Sie werden aus einer Population von Zellen erhalten, wie peripheren mononukleären Blutzellen, beim Aktivieren durch Behandlung mit Lymphokinen. Die LAK-Zellen haben im Wesentlichen keine Wirkung auf normale Zellen.
Wie hier zur Beschreibung der Erfindung verwendet sind "natürliche Killer (NK)-Zellen" Zellen des Immunsystems, die Zielzellen in der Abwesenheit eines spezifischen Antigenstimulus abtöten und ohne Restriktion in Bezug auf die MHC-Klasse. Zielzellen können Tumorzellen oder Zellen sein, die Viren enthalten. NK- Zellen sind durch die Anwesenheit von CD56 und die Abwesenheit von CD3-Oberflächen-Markern charakterisiert. Die Erfindung beruht auf einer unsterblichen NK-Zelllinie, NK-92, die ursprünglich erhalten wurde von einem Patient mit Non-Hodgkin-Lymphom. Wie zur Beschreibung der Erfindung verwendet ist eine modifizierte NK-92-Zelle eine NK-92-Zelle, die weiterhin so behandelt wurde, dass sie Eigenschaften erhielt, die nicht in der Parentalzelle vorkommen, aus der sie abgeleitet ist. Solche Behandlungen umfassen beispielsweise physikalische Behandlungen, chemische und/oder biologische Behandlungen, und dergleichen. Die Behandlungen verleihen den modifizierten NK-92-Zellen Eigenschaften, die diese vorteilhafter für die erfindungsgemäßen Zwecke machen.
Wie hier zur Beschreibung der Erfindung verwendet, sollen die Begriffe "zytotoxisch" und "zytolytisch", wenn sie zur Beschreibung der Aktivität der Effektorzellen, wie NK-Zellen, verwendet werden, synonym sein. Im Allgemeinen betrifft die zytotoxische Aktivität das Abtöten von Zielzellen durch eine Vielzahl von biologischen, biochemischen oder biophysikalischen Mechanismen. Die Zytolyse betrifft insbesondere die Aktivität, bei der der Effektor die Plasmamembran der Zielzelle lysiert, wodurch deren physikalische Integrität zerstört wird. Dies führt zur Abtötung der Zielzelle. Man möchte zwar nicht an die Theorie gebunden sein, jedoch nimmt man an, dass die zytotoxische Wirkung der NK-Zellen auf der Zytolyse beruht.
Wie hier zur Beschreibung der Erfindung verwendet sind "Zielzellen" Zellen, die durch die zytotoxische Aktivität der erfindungsgemäßen NK-Zellen getötet werden. Diese umfassen insbesondere Zellen, die maligne sind oder sonst wie von einem Krebs hergeleitet sind, und Zellen, die durch pathogene Viren infiziert sind, wie HIV, EBV, CMV oder Herpes.
Wie hier zur Beschreibung der Erfindung verwendet bedeutet "Spülen" das Töten von Zielzellen, wie NK-Zellen, ex vivo. Die Zielzellen können in einer biologischen Probe enthalten sein, die aus einem Säugetier erhalten wurden, von dem man annimmt, dass es an einer Pathologie leidet, die auf die Anwesenheit der Zielzelle in der Probe bezogen sind. Die Pathologie kann ein Krebs oder eine Malignität aufgrund von Tumorzellen in der Probe sein, und kann behandelt werden durch Spülen der Probe der Tumorzellen und Rückführen der Probe in den Körper des Säugetiers.
Wie hier zur Beschreibung der Erfindung verwendet macht eine "Inaktivierung" der NK-92-Zellen sie unfähig zum Wachstum und/oder ihre normale Funktion, insbesondere ihre zytotoxische Aktivität. Die Inaktivierung kann ebenfalls den Tod der NK-Zellen betreffen. Es wird angestrebt, dass die NK-92-Zellen inaktiviert werden können, nachdem sie effizient als Ex-vivo-Probe von Zellen gespült wurden, die bei der therapeutischen Anwendung einer Pathologie entsprechen oder nachdem sie in dem Körper eines Säugetiers solange geruht haben, dass sie viele oder alle im Körper vorhandenen Zielzellen töten. Die Inaktivierung kann induziert werden, anhand von einem nichteinschränkenden Beispiel, indem ein inaktivierendes Mittel verabreicht wird, gegen das die NK-92-Zellen empfindlich sind.
Wie hier verwendet betrifft ein "Vektor" eine Nukleinsäure, die ein bestimmtes Nukleinsäuresegment aufnimmt, wie beispielsweise eine Sequenz, die ein bestimmtes Gen codiert, und dieses in eine Zelle überführt. In den meisten Fällen enthält die Zelle nicht natürlicherweise das Gen, so dass das bestimmte eingeführte Gen ein heterologes Gen ist. Ein Vektor kann zusätzliche Funktionselemente umfassen, die die Transkription des eingeführten Gens oder Fragments leiten und/oder regulieren. Die regulatorische Sequenz ist funktionsfähig in Bezug auf die proteincodierende Sequenz positioniert, so dass wenn der Vektor in eine geeignete Wirtszelle eingebracht ist und die regulatorische Sequenz ihre Wirkung ausübt, das Protein exprimiert wird. Regulatorische Sequenzen können anhand eines nichteinschränkenden Beispiels einen Promotor, Regionen stromauf- oder stromabwärts des Promoters, wie Enhancer, die die Transkriptionsaktivität des Promotors regulieren können, und einen Replikationsursprung umfassen. Ein Vektor kann zudem geeignete Restriktionsstellen, Antibiotika-Resistenzen oder andere Marker zur Selektion vektorhaltiger Zellen, RNA-Spleißstellen, eine Transkriptionsterminationsregion usw. umfassen.
Wie hier zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendet betreffen "Krebs", "Tumor", und Malignität" jeweils äquivalent eine Hyperplasie eines Gewebes oder Organs. Ist das Gewebe eine Teil des Lymph- oder Immunsystems, können maligne Zellen nichtfeste Tumore zirkulierender Zellen umfassen. Malignitäten anderer Gewebe oder Organe können feste Tumore umfassen. Im Allgemeinen können die erfindungsgemäßen Verfahren bei der Behandlung lymphatischer Zellen, zirkulierender Immunzellen und solider Tumore verwendet werden.
Natürliche Killerzelle NK-92
Die NK-92-Zelllinie wurde von Gong et al. (1994) beschrieben. Es hat sich herausgestellt, dass sie die Oberflächenmarker CD56^bright, CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45 und CD54 aufweist. Sie hat darüber hinaus nicht die Marker CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23 und CD34. Das Wachstum von NK-92-Zellen in der Kultur hängt ab von der Anwesenheit von rekombinantem Interleukin 2 (rIL-2), wobei eine Dosis von nur 10 IU/ml hinreicht, dass die Proliferation aufrechterhalten wird. IL-7 und IL-12 unterstützen das Langzeitwachstum nicht und auch nicht von anderen untersuchten Zytokinen, einschließlich IL-1α, IL-6, Tumornekrosefaktor α, Interferon α, und Interferon γ. NK-92 ist beim Abtöten bestimmter Tumorzellen, wie K562 (Erythroleukämie) und Daudi (Burkitt-Lymphom)-Zellen, hocheffizient, weil es sogar bei einem niedrigen Effektor:Ziel (E/T)-Verhältnis von 1:1 eine hohe Zytotoxizität hat (Gong et al., (1994)). Zudem haben NK-92-Zellen eine hohe zytotoxische Aktivität gegen 8E5-Zellen, die mit HIV infiziert sind, und die HIV-Virionen produzieren. NK-92 sind bei der American Type Culture Collection hinterlegt.
NK-92-Zellen werden leicht in Kulturmedium gehalten, wie in angereichertem essentiellem Alpha-Minimalmedium (MEM; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), das mit fötalem Kalbsserum angereichert ist (Beispielsweise bei 12,5%; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), und Pferdeserum (beispielsweise bei 12,5%; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Zu Beginn sind 10^–6 M Hydrocortison erforderlich, aber in anschließenden Durchgängen stellt sich heraus, dass Hydrocortison weggelassen werden kann. Zudem ist IL-2, wie rekombinantes Human-IL-2 (500 U/ml; Chiron, Emeryville, CA) für das Langzeit-Wachstum erforderlich. Werden Suspensionskulturen auf diese Weise mit halbwöchentlichem Mediumswechsel gehalten, weisen die Zellen eine Verdopplungszeit von etwa 24 Std. auf.
NK-92-Zellen zeigen in vitro eine lytische Aktivität gegen einen breiten Bereich maligner Zielzellen. Diese umfassen Zelllinien, die vonzirkulierenden Zielzellen hergeleitet sind wie akute und chronische lymphoblastische Leukämie, Lymphom, Myelom, Melanom, sowie Zellen von festen Tumoren, wie Prostatakrebs, Neuroblastom, und Brustkrebs-Zelllinien. Diese Wirkung wird sogar bei sehr niedrigen Effektor:Ziel-Verhältnissen beobachtet. Diese Lyse ist besser als die Zytotoxizität, die man bei normalen peripheren mononukleären Blutzellen erhält, die vier Tage mit IL-2 stimuliert wurden.
Vektor zum Transfizieren der Säugetierzellen zur Produktion von Cytokin
Die Erfindung stellt NK-92-Zellen bereit, die durch Transfektion mit einem Vektor modifiziert wurden, der die Sekretion eines Cytokins, wie IL-2, steuert. Damit die NK-92-Zellen ein Langzeitwachstum und die zytolytische Funktion beibehalten, müssen sie mit IL-2 versorgt werden. Ein Vektor, der das Gen für Human-IL-2 codiert, und der ebenfalls ein Steuersegment enthält, das die Synthese des IL-2-Genprodukts steuert, ist daher von großem Nutzen in der Erfindung. NK-92-Zellen, die einen solchen Vektor enthalten, sezernieren das IL-2, das für die zytolytische Aktivität in einem therapeutischen Setting erforderlich ist; somit ist IL-2 aus einer exogenen Quelle nicht erforderlich. Das Steuerelement steuert die Synthese von IL-2 als konstitutives Produkt, d.h. es ist nicht von der Induktion abhängig. Verfahren zum Konstruieren und zum Einsatz von Vektoren sind in allgemeinen Ausdrücken beschrieben in "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al., John Wiley and Sons, New York (1987, vierteljährlich aktualisiert) und "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2te Auflage", Sambrook Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Modifiziertes NK-92 das so transfiziert ist, dass Cytokin hergestellt wird, und Transfektionsverfahren.
Modifizierte NK-92-Zellen, die ein Cytokin sezernieren, können hergestellt werden durch Einbringen eines Vektors, der die Synthese und die Sekretion des Cytokins in die Zellen steuert. Bei wichtigen Aspekten der Erfindung ist es das Cytokin IL-2. Verfahren zum Einbringen eines Vektors in eine Säugetierzelle sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie und Zellimmunologie bekannt und beschrieben in Ausubel et al. (1987, vierteljährlich aktualisiert) und Sambrook et al. (1989). Die Vektoren, die das Cytokin codieren, umfassen auch Steuerelemente, die zu einer konstitutiven Synthese des Cytokins beim Einbringen in die NK-92-Zellen führen.
Bei der Anzucht unter geeigneten Bedingungen, die die Cytokin-Sekretion fördern, sezernieren die transfizierten NK-92-Zellen IL-2 oder ein anderes Cytokin. Da der Vektor die konstitutive Synthese des Cytokins steuert, sind Nährkulturen, in denen NK-92-Zellen bekanntlich wachsen und ihre normale zytolytische Funktion aufweisen, hinreichend für transfizierte Zellen, damit sie das Cytokin sezernieren. Aus dem gleichen Grund sezernieren die transfizierten Zellen das Cytokin in vivo, wenn sie in den Körper eines Säugetiers eingebracht werden.
NK-92-Zellen, die mit einem Vektor transfiziert sind, der die Sekretion eines Cytokins, wie IL-2, steuert, eignen sich zur Ex-vivo-Behandlung einer biologischen Probe, die einem Säugetier entnommen wurde, das unter dem Verdacht steht, dass es maligne Zellen enthält. Durch Behandeln der malignen Zellen mit diesen modifizierten NK-92-Zellen wird der Bedarf zur Anwendung von exogenen IL-2 oder einem anderen Cytokin vermieden. Diese modifizierten NK-92-Zellen eignen sich aus den gleichen Gründen für die In-vivo-Behandlung eines Säugetiers, das an einer Malignität leidet. Die modifizierten NK-92-Zellen üben ihre zytolytische Wirkung gegen die malignen Zellen aus, wenn sie in den Körper des Säugetiers eingebracht werden. Beispiele für solche Zellen werden in der Erfindung als NK-92MI und NK-92CI bezeichnet.
NK-92-Zellen, die zytolytisch sind, die aber nicht proliferieren können
Eine zusätzliche erfindungsgemäße modifizierte NK-92-Zelle ist derart behandelt, dass sie nicht länger proliferieren kann, aber deren zytotoxische Aktivität bewahrt bleibt. Ein Weg zur Erzielung dieses Zustands ist durch γ-Bestrahlung. Zusätzliche Formen der Bestrahlung, einschließlich beispielsweise Ultraviolettstrahlung, können eingesetzt werden. Geeignete Quellen zur Verwendung für diesen Zweck umfassen beispielsweise eine ¹³⁷Cs-Quelle (Cis-USA, Bedford, MA, Gammacell 40, Atomic Energy of Canada, Ltd., Canada). Zusätzlich kann eine proliferative Aktivität durch Behandlung mit Chemikalien aufgehoben werden, die die DNA-Synthese hemmen. Ein Beispiel für ein solches Mittel ist Mitomycin C.
Vektor zum Transfizieren von NK-92 mit einem Element, das auf ein inaktivierendes Mittel reagiert
Die NK-92-Zellen können auch durch Transfektion mit einem Vektor modifiziert werden, so dass die Zelle bei der Aufnahme eines spezifischen Mittels inaktiviert wird. Der Vektor umfasst eine Sequenz, die eine zelluläre Komponente codiert, die auf das Mittel reagiert, so dass die Zelle, wenn der Vektor eine Zelle transfiziert und das Mittel von der Zelle aufgenommen wird, inaktiviert wird. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel Acylovir und Gancylovir. Der Vektor enthält auch ein Steuerelement, das die Synthese der zellulären Komponente als konstitutives Produkt steuert.
Die mit dem Vektor transfizierte NK-92-Zelle, die in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben wurde, behält ihr charakteristisches Wachstum und die zytolytische Aktivität in der Abwesenheit des Mittels. An einem bestimmten Zeitpunkt, wenn eine Ex-vivo-Probe durch die Wirkung der NK-92-Zellen von malignen Zellen gespült wird, oder wenn die in vivo verabreichten NK-92-Zellen effizient ihre zytolytische Aktivität in einem Säugetierkörper ausüben, oder wenn es gewünscht ist, dass die Behandlung aus einem beliebigen Grund gestoppt wird, kann das Mittel verabreicht werden. Das Mittel wirkt zusammen mit der Zellkomponente, die gegenüber dem im Vektor codierten Mittel empfindlich ist. Das Zusammenwirken von Mittel und Zellkomponente induziert die Inaktivierung der NK-92-Zellen. Die Inaktivierung kann vom Verlust der charakteristischen zytolytischen Funktion bis hin zum Tod der Zellen reichen.
Die Eigenschaft der modifizierten NK-92-Zellen ist signifikant, weil die parentalen NK-92-Zellen hergeleitet sind von einer Tumorzelllinie, die sich nach der Ex-vivo-Therapie oder in vivo bei einer solchen Verabreichung in einer Probe weiter fortpflanzt, welche in ein Säugetier zurück eingebracht wurde. Es ist daher wichtig, die Zellen nach der Durchführung ihrer therapeutischen Funktion abzutragen. Das Sensibilisieren der Zelle gegenüber einem Mittel, wie Acyclovir oder Gancylovir, ist ein vorteilhafter Weg zur Erzielung dieser Aufgabe.
Vektor zum Transfizieren von NK-92 mit einem veränderten HLA-Zelloberflächen-Molekül
Das HLA-Zelloberflächenprotein, das an der Präsentation der Antigene an andere Zellen des Immunsystems beteiligt ist, umfasst eine nicht-immunospezifische Untereinheit, das Protein β₂-Mikroglobulin. Wenn dieses Protein verändert oder mutiert wird, verliert das HLA-Protein seine Affinität für den T-Zellrezeptor, an den es gewöhnlich bindet. Das β₂-Mikroglobulin-Gen in den erfindungsgemäßen NK-92-Zellen kann durch stellenspezifische Mutagenese mutiert werden, um deren Eigenschaften auf diese Weise zu transformieren. Das Ergebnis ist eine NK-92-Zelle, die nicht länger eine hohe Affinität für T-Zellrezeptoren hat. Demnach bleibt die derart modifzierte NK-92-Zelle für eine längere Zeit in dem Wirtsorganismus und wird nicht durch die Wirkung des zellulären Immunreaktion des Wirts eliminiert.
Vektor zum Transfizieren von NK-92 mit einem Gen, das ein Krebszellrezeptormolekül codiert.
Die NK-92-Zellen können ebenfalls durch Transfektion mit einem Vektor modifiziert werden, so dass die Zellen konstitutiv einen Rezeptor für eine Krebszelle exprimieren. Krebszellen exprimieren Zelloberflächenmoleküle, die für den Krebsursprung idiosynkratisch sind und die häufig auch für den einzelnen Wirt idiosynkratisch sind. Die CTL-Population in solchen erkrankten Patienten kann durch Aussetzen der Zellen des wachsenden Krebs aktiviert werden. Solche aktivierten CTL exprimieren Zelloberflächenproteine, die für den Krebszellen spezifisch sind, oder dies anzielen. Diese CTL können isoliert werden, das Gen für den Targeting-Rezeptor identifiziert, isoliert und in die erfindungsgemäßen NK-92-Zellen transfiziert werden. Dies verleiht den NK-92-Zellen die Fähigkeit, dass die Krebszellen, die in dem jeweiligen Wirt zugegen sind, entsprechend spezifisch angezielt werden. Dies bewirkt die Steigerung der Spezifität der zytotoxischen Aktivität der NK-92-Zellen gegenüber den Krebszellen dieses Individuums. Der entsprechende Prozess erfolgt für jeden Wirt, der an Krebs leidet, wobei der Vorteil der idiosynkratischen Spezifität der CTL-Targeting-Einheit in jedem Fall ausgenutzt wird.
Verwendung
Die erfindungsgemäßen natürlichen Killerzellen werden zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von biologischen Proben eingesetzt, damit diese von Krebszellen, einer Malignität oder einem Tumor freigespült werden. Die NK-Zellen umfassen, anhand von einem nicht-einschränkenden Beispiel NK-92- und modifizierte NK-92-Zellen, wie NK-92MI, und NK-92CI, sowie andere modifizierte NK-92-Zellen, die im Schutzbereich der Erfindung liegen. Die NK-92MI- und NK-92CI-Zellen werden durch Transfektion mit Vektoren modifiziert, die die Sekretion von IL bewirken. Zudem kann eine jede der NK-92-, NK-92MI- und NK-92CI-Zellen derart behandelt werden, dass sie die zytolytische Aktivität der unbehandelten Zellen behalten, aber nicht proliferieren können. Die so behandelten NK-Zellen können ebenfalls äquivalente Zelllinien sein, die Eigenschaften, wie Zytotoxizität und die hier beschriebenen NK-spezifischen Zelloberflächenmarker, haben. Malignitäten des Immunsystems, des lymphatischen Systems, und des hämatopoietischen Systems, können durch die erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden. Zudem können entstandene Tumore und feste Tumore auch behandelt werden. Infektionen durch pathogene Viren, wie HIV, EBV, CMV und Herpes, können ebenfalls behandelt werden.
Behandlung einer biologischen Probe.
Biologische In-vitro-Proben können experimentell oder therapeutisch behandelt werden, um maligne Zellen oder virusinfizierte Zellen auf effiziente Weise zu eliminieren. Die Probe kann einem Säugetier entnommen werden und in vitro in einem geeigneten Anzuchtmedium gehalten werden. Diese Medien sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Zellbiologie, zellulären Immunologie und Onkologie bekannt. Medien und Zellkulturtechniken sind allgemein dargestellt in beispielsweise Freshney, R. I., "Culture of Animal Cells, 3te Aufl.", Wiley-Liss. New York (1994) und in Martin B. M., "Tissue Culture Techniques, An Introduction", Birkhäuser, Boston, MA (1994). Die biologische Probe wird in vitro in Kultur etabliert und mit einem Medium zusammengebracht, das die erfindungsgemäßen natürlichen Killerzellen enthält. Die zytolytische Aktivität der NK-Zellen eliminiert effizient die malignen Zellen oder die virusinfizierten Zellen aus der Probe. Die Prävalenz und die Abreicherung der Zielzellen kann durch eine jede einer Anzahl von Verfahren erfasst werden, die dem Fachmann auf den Gebieten der Zellbiologie und zellulären Immunologie bekannt sind. Diese umfassen indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der intakten Tumorzellen oder virustragenden Zellen, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, Chromfreisetzungstests und dergleichen.
Behandeln eines Krebs oder einer Virusinfektion ex vivo: Spülen.
Die Beschreibung beschreibt zudem die Ex-vivo-Behandlung einer biologischen Probe, die unter dem Verdacht steht, dass sie Krebszellen oder virusinfizierte Zellen enthält, durch Zusammenbringen der Probe mit den NK-Zellen. Die biologische Probe wird dem Körper eines Säugetiers entnommen, wie einem Mensch, und sie kann Blut, Knochenmarkzellen oder ähnliche Gewebe oder Zellen aus einem Organ, das von Krebs betroffen ist, sein. Verfahren zur Gewinnung solcher Proben sind den Fachleuten auf den Gebieten der zellulären Immunologie, Onkologie und Chirurgie bekannt. Sie umfassen die Blutentnahme auf bekannte Weise, oder die Gewinnung von Biopsien aus dem Knochenmark oder einem anderen Gewebe oder Organ. Die Krebszellen oder virusinfizierten Zellen, die in der Probe enthalten sind, werden effizient eliminiert aufgrund der zytolytischen Aktivität der NK-92-Zellen. Die Probe kann dann zu dem Körper des Säugetiers zurückgeführt werden, aus dem sie erhalten wurde.
Die NK-92-Zellen, die zur Behandlung der Probe verwendet wurden, können frei im Medium suspendiert werden. Es ist gewöhnlich bevorzugt, dass die gespülte Probe vor dem Rückführen in den Körper des Säugetiers, aus dem sie erhalten wurde, von NK-92-Zellen befreit wird, die weiter wachsen können, da die ursprünglich aus einem proliferierenden Lymphom hervorgingen. Die Beschreibung sieht mehrere Wege zur Bewerkstelligung dieser Aufgabe vor. Die NK-Zellen können vor dem Gebrauch mit γ-Strahlen oder mit Ultraviolettlicht insoweit bestrahlt werden, dass sie ihre zytologische Aktivität beibehalten, aber nicht wachsen können. Die NK-Zellen können permanent auf einem makroskopischen festen Träger immobilisiert werden. Der Träger mit den gebundenen NK-Zellen, kann dann physikalisch von den Zellen der biologischen Probe getrennt werden, beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtration mit einer Säule, die es ermöglicht, dass die ungebundenen Zellen der Probe durchpassen, oder eine ähnliche Technik. Geeignete feste Träger umfassen Teilchen von Polyacrylamid, Agarose, Cellulose, Sepharose^TM (Pharmacia, Piscataway, NJ), Celit und dergleichen und können dann mit Gruppen, wie einem Aldehyd, Carbonyldiimidazol, Bromacetyl, Epichlorhydrin und dergleichen versehen werden, die zur Reaktion mit Zelloberflächengruppen aktiviert werden. Die aktivierten Gruppen auf dem Träger reagieren mit Gruppen, wie Amino- oder Carboxylgruppen, beispielsweise auf der Zelloberfläche, wodurch die Zellen auf dem Träger immobilisiert werden.
Die Zellen können mit einem Vektor modifiziert werden, der die Synthese einer Zellkomponente steuert, die gegenüber einem Mittel empfindlich ist, so dass die NK-92-Zellen bei der Verabreichung des Mittels zur Ex-vivo-Probe, inaktiviert werden. Beispiele für solche Mittel sind gemäß einem nicht-einschränkenden Beispiel u.a. Acyclovir oder Gancyclovir. Funktionell äquivalente Vektoren, die die Synthese von alternativen Zellkomponenten zu verschiedenen Zielen steuern, sind ebenfalls vorgesehen.
Die NK-Zellen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden sollen, können ein Cytokin erfordern, wie IL-2, so dass ihre funktionelle Wirksamkeit als zytolytische Zellen gewahrt bleibt. Das Cytokin kann einfach zu dem Ex-vivo-Präparat gegeben werden. Alternativ kann wenn gewünscht eine modifizierte NK-Zelle, die einen Vektor trägt, der die konstitutive Synthese des Cytokins steuert, eingesetzt werden. Auf diese Weise wird die Notwendigkeit zur Bereitstellung von exogenem Cytokin umgangen.
Behandlung eines Krebs oder einer Virusinfektion in vivo: Verabreichung von NK-92.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Mediums, das NK-92-Zellen umfasst, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krebs in vivo in einem Säugetier. Die Zellen eignen sich zur Verabreichung auf eine Vielzahl von Wegen. Mit Hilfe eines nicht-einschränkenden Beispiels können die Zellen intravenös abgegeben werden oder in einen Körperhohlraum nahe der Stelle eines festen Tumors, wie die Intraperitonealhöhle oder direkt in oder nächst einem festen Tumor injiziert werden. Die intravenöse Verabreichung ist beispielsweise vorteilhaft zur Behandlung von Leukämien, Lymphomen und vergleichbaren Malignitäten des lymphatischen Systems, sowie bei der Behandlung von Virusinfektionen.
Wie eingehend in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben ist es wünschenswert, Verfahren einzusetzen, die die NK-92-Zellen eliminieren oder abtragen, nachdem sie die Zielzellen effizient lysiert haben (oder sonst wie zerstört haben). Bestimmte vorstehend beschriebene Verfahren können zu diesem Zweck eingesetzt werden, nämlich die Verwendung bestrahlter NK-92-Zellen und die Verwendung von NK-92-Zellen, die einen Vektor enthalten, der die Synthese einer Zellkomponente steuert, die gegenüber einem Mittel empfindlich ist, so dass die NK- 92-Zellen bei Verabreichung des Mittels inaktiviert werden, und äquivalente Verfahren. Wenn die Zellen ein solche Komponente produzieren, die gegenüber einem spezifischen Mittel empfindlich ist, inaktiviert die Verabreichung des Mittels an das Säugetier die NK-92-Zellen in dem Säugetier.
Die NK-92-Zellen können zusammen mit einem Cytokin, wie IL-2, verabreicht werden, damit die funktionelle Wirksamkeit der Zellen als zytotoxische Effektoren gewahrt bleibt. Der Begriff "zusammen mit", wie er zur Beschreibung der Erfindung verwendet wird, zeigt, dass das Cytokin kurz vor der Verabreichung der NK-92-Zellen verabreicht werden kann, oder es kann zugleich mit den Zellen oder kurz nach der Verabreichung der Zellen gegeben werden. Das Cytokin kann auch an zwei solchen Zeitpunkten gegeben werden oder an allen drei Zeitpunkten in Bezug auf die Zeit der Verabreichung der NK-92-Zellen. Alternativ können die NK-92-Zellen, die einen Vektor enthalten, der die konstitutive Synthese des Cytokins steuert, bei dem In-vivo-Verfahren zur Krebsbehandlung eingesetzt werden. Dies eliminiert effizient den Bedarf zur Bereitstellung von exogenem Cytokin.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen.
BEISPIELE
Beispiel 1. NK-92-Zellen.
NK-92-Zellen (Gong et al. (1994)) wurden hergeleitet von Zellen, die von einem Patienten erhalten wurden, der an Non-Hodgkin-Lymphom litt. PBMC aus dem Patient wurden in angereichertem Alpha-MEM, zusätzlich versetzt mit fötalem Kalbsserum (12,5%) und Pferdeserum (12,5%) plus 10^–6 M Hydrocortison und 1000 U/ml rekombinantem Human-IL-2 (rhIL-2) gezüchtet. Die Zellen wurden bei 37°C in feuchter Luft mit 5% CO₂ gezüchtet. Es wurden nach 4 Wochen Subkulturen erstellt, und unbegrenzt mit zweimal wöchentlichem Mediumwechsel vermehrt. In diesen späteren Stufen konnte das Hydrokortison ohne jegliche Wirkung auf das Zellwachstum weggelassen werden. Diese Kultur hatte die Bezeichnung NK-92 und wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD) hinterlegt.
Die Zellen haben die Morphologie großer granulärer Lymphozyten. Die Zellen tragen die Oberflächenmarker CD56^bright, CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45 und CD54. Sie haben dagegen nicht die Marker CD1, CD3, CD4, CDS, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23 und CD34. Das Wachstum von NK-92-Zellen in Kultur hängt ab von der Anwesenheit von rekombinantem Interleukin 2 (IL-2), wobei eine Dosis von nur 10 IU/ml hinreicht, dass eine Proliferation gewahrt bleibt. IL-7 und IL-12 unterstützen genau wie die andern untersuchten Cytokine IL-1α, IL-6, Tumornekrosefaktor α und Interferon γ nicht das Langzeit-Wachstum.
Beispiel 2. Zytotoxizitäts-Aktivität von NL-92 gegen verschiedene leukämische Zelllinien.
Die zytotoxische Aktivität von NK-92- gegen K562-, Daudi-, TF-1-, AML-193-, und SR-91-Zellen wurden bestimmt (Gong et al., (1994)). K562 (Erythroleukämie) und Daudi (Burkitt-Lymphom-Zelllinie) wurden von der ATCC erhalten. Sie wurden in einer kontinuierlichen Suspensionskultur in RPMI 1640-Medium gehalten, das mit 10% fötalem Kalbsserum (FCS) angereichert war. TF-1 ist eine myelomonocytische Zelllinie (Kitamura et al., J. Cell Physiol. 140: 323–334 (1989)), die die Anwesenheit von Medium erfordert, das 2 ng/ml Human-GM-CSF enthält. AML-193 ist eine Myeloid-Zelllinie, die in Gegenwart von 10% 5673-konditioniertem Medium gehalten wird (Lange et al., Blood 70: 192–199 (1987)). Sowohl TF-1 als auch AML-193-Zellen wurden von Dr. D. Hogge, Terry Fox Laboratory, University of British Columbia, Vancouver, Block-Copolymer, erhalten. SR-91 ist eine Zelllinie mit Eigenschaften von frühen Vorläuferzellen, die von Gong et al. (1994) aus einem Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) etabliert wurde (Klingemann et al., Leuk. Lymphoma, 12, 463–470 (1994). Sie ist resistent gegenüber NK- als auch aktivierter NK-(A-NK) Zellzytotoxizität. SR-91 wird ebenfalls gehalten in RPMI 1640/10% FCS. Diese Zelllinie kann ebenfalls gegenüber dem Abtöten durch NK-92 empfindlich gemacht werden. Naki et al., "Induction of sensitivity to the NK-mediated cytotoxicity by TNF-α-treatment. Possible role of ICAH-3 und CD44", Leukemia, (im Druck).
Die zytotoxische Aktivität von NK-92 (Effektor) gegen diese Zielzellen wurde bestimmt mittels ⁵¹-Cr-Freisetzungstest (Gong et al., (1994)), wobei das von Klingemann et al., (Cancer Immunol. Immunother. 33: 395–397 (1991)) beschriebene Verfahren verwendet wurde. Der Prozentsatz der spezifischen Zytotoxizität in dreifachen Proben wurden berechnet als:
Die 1 veranschaulicht die Ergebnisse dieser Bestimmung. Es ist ersichtlich, dass NK-92-Zellen K562- und Daudi-Zellen mit hoher Effizienz töten. Selbst bei dem niedrigen E/T-Verhältnis von 1:1, wurden 83% der K562-Zellen und 76% der Daudi-Zellen durch NK-92-Zellen getötet. Die Anfälligkeit gegenüber dem Abtöten durch NK-92-Zellen war niedriger für TF-1-Zellen (23% bei E/T = 1:1) und für AML-193-Zellen (6% bei E/T = 1:1). SR-91-Zellen scheinen gegenüber der zytotoxischen Wirkung der NK-92-Zellen resistent zu sein. Man möchte zwar nicht an die Theorie gebunden sein, jedoch nimmt man an, dass SR-91-Zellen Adhäsionsmoleküle fehlen, die zum Vermitteln der Anfangsbindung an NK-92-Zellen nötig sind.
Beispiel 3. Zytotoxizität von NK-92 gegen Leukämie-, Lymphom- und Myelom-Zielzelllinien.
K562 (Ph-Chromosom-positiv [Ph+] Erythroleukämie), HL60 (promyelocytisch, U937 (myelomonocytisch), KG1a (variante Sublinie der AML-Zellinie KG1), DHL-10 (B-Zelllymphom), Daudi (Burkitt-Lymphom), Raji (B-Zelllymphom), Jurkat (T-Zelllymphom), U266 (IgE-Myelom), NCI H929 (IgA-Myelom), und RPMI 8226 (Myelom, leichte Kette sezernierende) Zelllininen wurden von ATCC erhalten. Die von Lymphom abgeleiteten Zelllinien Ly3 (B-Linie, diffus großzellig), Ly8 (immunoblastisch), und Ly13.2 (T-Familie, diffus großzellig) wurden bereitgestellt von Dr. H. Messner, Toronto, Ontario. Ihre Eigenschaften wurden beschrieben (Chang et al., Leuk. Lymphoma 19: 165 (1995)). Alle Linien wurden in RPMI 1640 Medium, angereichert mit 2 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 50 U/ml Penicillin, 25 mM HEPES (StemCell Technologies) und 5% wärmeinaktiviertem FCS (RPMI/5% FCS), bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO₂ in Luft gehalten.
Die Zelllyse wurde bestimmt durch einen 4stündigen ⁵¹Cr-Freisetzungstest mittels verschiedener E/T-Verhältnisse. Zur Ermöglichung des Vergleichs, wurden PBMCs aus normalen Donatoren mit IL-2 (500 U/ml) für 4 Tage aktiviert, und die ⁵¹Cr-Freisetzung gegen die gleichen Zielzellen gleichzeitig gemessen. Der Mittelwert von zwei gesonderten Experimenten ist dargestellt.
Die Ergebnisse der NK-92-vermittelten Zytotoxizität (⁵¹Cr-Freisetzungs-Test) gegen verschiedene Leukämie-, Lymphom-, und Myelom-Zielzelllinien sind in der Tabelle 1 zusammengefasst. Zum Vergleich wurde ebenfalls die Lyse der gleichen Tumorzielzellen ebenfalls im gleichen Experiment mit PBMCs untersucht, die von normalen Spendern erhalten wurde. Solche Zellen wurden durch IL-2 (500 U/ml) für 4 Tage vor der Untersuchung aktiviert. Die Ergebnisse zeigen, dass NK-92-Zellen sehr effizient sämtliche untersuchten Zielzellen lysieren. Eine hohe Zytotoxizität wird sogar bei dem niedrigen E/T-Verhältnis von 1:1 beobachtet. Die mit diesen Zellen erreichte Zytotoxizität ist signifikant höher als mit normalen (allogenen) PBMCs, die unter optimalen Bedingungen mit IL-2 für sämtliche Zielzellen außer RPMI 8226 und U266 erhalten wurden.
Tabelle 1. Zytotoxische Aktivität von NK-92-Zellen gegen verschiedene Leukämie-, Lymphom- und Myelom-Zelllinien.
Beispiel 4. Wirkung der Abreicherung von IL-2 auf die zytotoxische Aktivität von NL-92.
Zur Untersuchung, wie lange NK-92-Zellen ihre zytolytische Aktivität ohne IL-2 im Anzuchtmedium erhalten, wurden die NK-92-Zellen von IL-2 abgereichert, und die ⁵¹Cr-Freisetzung wurde in 24-Stunden-Intervallen gemessen. Die in der 2 zusammengefassten Ergebnisse legen nahe, dass die Zellen volle zytotoxische Aktivität für mindestens 48 Std. behalten. Danach fällt die Aktivität steil auf vernachlässigbare Werte. Somit muss IL-2 zum Kurzzeitspülen nicht in den Kulturen zugegen sein, damit eine geeignete Wirkung erzielt wird.
Beispiel 5. Co-Kultur der K562-neo^r-Zellen mit PBMCs und NK-92.
Die Transfektion der K562-Zellen mit dem Neomycin-Resistenz (neo^r)-Gen wurde beschrieben (Wong et al., Bone Marrow Transplant 18:63 (1966)). Kurz gesagt wurden 5 × 10⁷ K562-Zellen in 0,8 ml RPMI 1640/5% FCS suspendiert und für 10 min auf Eis mit 30 μg des pMC1-Neo-Plasmids (von Dr. K. Humphries, Terry Fox Laboratory, Vancouver, Block-Copolymer zur Verfügung gestellt) inkubiert. Die Zellen wurden dann einem einzelnen Spannungsimpuls (125 μF/0,4 kV) bei Raumtemperatur ausgesetzt, 10 min. in Puffer belassen, in 25 cm² Gewebekulturflaschen (Falcon, Lincoln Park, NJ) überführt, und bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft für 2 Tage inkubiert. Transfizierte Zellen wurden in 0,8% Iscove's Methylcellulose-Medium (StemCell Technologies) selektiert, das mit 30% FCS, 10⁴ M 2-Mercaptoethanol und 2 mM Glutamin angereichert war und 0,8 mg/ml G418 (Neomycin) (Gibco-BRL, Grand Island, NY) enthielt. Neo^r-Klone von K562-Zellen wurden nach 2 Wochen identifiziert, ausgestochen und in RPMI/10% FCS gehalten, das 0,8 mg/ml Neomycin enthielt. K562-neo^r-Zellen, die 2 Tage gezüchtet wurden, zeigten eine neo^r-klonogene Zellverdopplungszeit von 36–42 Stunden.
Normale PBMCs (10⁴/ml) wurden mit 10% K562-neo^r-Zellen versetzt, und NK-92-Zellen wurden dazu gegeben, so dass verschiedene Effektor:Ziel- (E/T)-Verhältnisse von NK-92:K562-neo^r-Zellen erhalten wurden (Wong et al., (1996)). Zusammengefasst wurden PBMCs in angereichertem Alpha-Medium (Myelocult^TM) wie oben beschrieben suspendiert. Dieses Medium stellt optimale Bedingungen zur Unterstützung der IL-2-Aktivierung von PBMCs und der hämatopoietischen Vorläuferzellfunktion bereit (Klingemann et al., Exp. Hematol. 21: 1263 (1993)). Die Endkonzentration von PBMCs in 35 mm-Gewebekulturschalen (Corning, East Brunswick, NJ) war 1 × 10⁶/ml, und der Anteil von eingegebenen K562-neo^r-Zellen wurde bei 10% für alle Experimente gehalten. Verschiedene Zahlen bestrahlter (1000 cGy) NK-92-Zellen (siehe Beispiele 7 und 8) wurden dazu gegeben, was zu verschiedenen E. T.-Verhältnissen führte, wie sie in der Tabelle 2 angegeben sind. Diese Gemische wurden in einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft für 4 oder 48 Std. bei 37°C mit und ohne IL-2 (500 Einheiten/ml) gezüchtet.
Nach der Anzucht wurden die Zellen in RPMI/5% FCS gewaschen. 10³ Zellen wurden in 0,8% Iscove's Methylcellulose mit 0,8 mg/ml Neomycin suspendiert, und 1,1 ml Volumina wurden in 3 mm-Petrischalen plattiert. Nach 7 Tagen bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft wurden die Zellen gezählt. Die Anzahl der neo^r-Kolonien schuf ein Maß für die Anzahl der überlebenden klonogenen K562-neo^r-Zellen, die in der Zellsuspension ursprünglich plattiert wurden. Die prozentualen Überlebenswert für Cokulturen mit verschiedenen NK-92-Zellen wurden bestimmt durch Vergleich der Anzahl klonogener K562-neo^r-Zellen, die in den Testcokulturen zugegen sind, mit der Anzahl von denjenigen, die in den Kontrollcokulturen (ohne zugefügte NK-92-Zellen) zugegen sind, und durch Ernten nach dem gleichen Inkubationszeitraum. Bei einer Eingangszahl von 10³ K562-neo^r-Zellen vor dem Spülen betrug die absolute Anzahl der klonogenen K562-neo^r-Zellen nach 4 Std. ohne vorhandene NK-92-Zellen 6400 ± 820 Zeilen und nach 48 Std. 28300 ± 2100 Zellen. Der Mittelwert ± SEM von vier bis acht Experimenten ist aufgeführt.
Wurden nur PBMCs in dem neomycinhaltigen Methylcellulosemedium plattiert, wurden überhaupt keine Kolonien beobachtet. Zur Quantifizierung der Spülkapazität von NK-92-Zellen wurden PBMCs mit 10% K562-neo^r-Zellen und 4 oder 48 Std. in Medium in der Anwesenheit oder Abwesenheit von IL-2 gezüchtet. Die in der Tabelle 2 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass die NK-92-Zellen, die bei E/T-Verhältnissen von 10:1 und 5:1 verwendet wurden, die K562-neo^r-Zellen aus den PBMCs eliminierten und dass ein sehr schwaches Überleben bei einem E/T von 1:1 beobachtet wurde. Die Anwesenheit von IL-2 während des Spülens führte nicht zu einem Anstieg der Anzahl von gespülten K562-Zellen, im Vergleich zum Fehlen von IL-2 (Tabelle 2).
Tabelle 2. Spülwirkung von NK-92-Zellen
Beispiel 6. Wirkung von NK-92-Zellen auf hämatopoetische Vorläuferzellen.
Die Wirkung von NK-92-Zellen auf PBMCs wurden bestimmt (Cashman et al. Blood 75, 96 (1990)). Zusammengefasst wurden normale PBMCs mit bestrahlten (1000 cGy) NK-92-Zellen (siehe Beispiele 7 und 8) für 2 Tage cokultiviert. Die Zellen wurden dann in wiederholten 1,1 ml-Aliquoten von Methylcellulose-haltigen Medien bei Dichten plattiert, die so eingestellt wurden, dass etwa 10 bis 100 große Kolonien erythroider Zellen (aus burst-bildenden Einheiten-Eryhthroid [BFU-E]), Granulocyten und Makrophagen (aus koloniebildenden Einheiten-Granulocyt/Makrophage [CFU-GM], und Kombinationen von all diesen (aus CFU Granulocyten/Erythroid/Makrophage/Megakaryocyt [CFU-GEMM]) erhalten wurden. Die Kolonien wurden unter einem inversen Mikroskop 2 Wochen später gezählt.
Die Zahl und die Wachstumskinetiken der klonogenen hämatopoietischen Zellen wurden bei einem 1:1-Verhältnis von NK-92 PBMC nach 2 Tagen Cokultur mit bestrahlten (1000 cGy) NK-92-Zellen quantifiziert. Die Zellen wurden in Standard-Methylcellulose plattiert und 2 Wochen später gezählt. Die aus diesen drei verschiedenen normalen Spendern erhaltenen Ergebnisse sind dargestellt als Prozentsatz von normalen Kontrollen in der Tabelle 3. Es wurde keine wachstuminhibitorische Wirkung auf hämatopoietische Vorläufer durch NK-92-Zellen vermerkt.
Tabelle 3. Wirkung von NK-92-Zellen auf die Koloniebildung normaler hämatopoetischer Vorläuferzellen.
Beispiel 7. γ-Strahlung von NK-92-Zellen.
NK-92-Zellen wurden in T25-Kolben (Corning, Newark, NJ) mit den angegeben Dosen mit Hilfe einer Cäsiumquelle (Cis-US, Bedford, MA) bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurden die Zellen zweimal in RPMI gewaschen, in Medium resuspendiert und für 72 Std. bei 37°C in der Gegenwart von 500 IU/ml IL-2 gezüchtet. Die Zytotoxizität (der ⁵¹Cr-Freisetzungstest) wurde mit diesen Zellen wie oben in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Vor der Durchführung des ⁵¹Cr-Freisetzungstests wurden die Zellen für 24 Std. in Medium belassen, das mit IL-2 angereichert war, so dass eine Gewinnung möglich war. Die Proliferation wurde mit Hilfe eines ³H-Thymidin-Einbau-Tests bestimmt. Vor der Zugabe von ³H-Thymidin (0,5 μCi/Zelle) wurden NK-92-Zellen in Thymidin-freiem RPMI resuspendiert. Die Aufnahme von ³H-Thymidin wurde in einem Flüssigszintillationszähler 4 Std. später gemessen. (Klingemann et al., Leuk. Lymphoma 12: 463 (1994)). Die Zählimpulse pro Minute (cpm) aus diesen verschiedenen Experimenten werden veranschaulicht.
Die klinische Verwendung dieser Zelllinie zum Spülen kanzerogener Zellen erfordert, dass NK-92-Zellen kein signifikantes Wachstum und Proliferation durchlaufen. Dies wurde durch Bestrahlen der Zellen erzielt. Die Proliferation, wie sie durch ³H-Einbau gemessen wurde, wurde bei einer Dosis von 1000 cGy effizient reduziert (Tabelle 4). Die Zytotoxizität der NK-92-Zellen nach der Verabreichung verschiedener Strahlungsdosen ist in der 3 dargestellt. Bei Dosen bis zu 1000 cGy wurde eine im Wesentlichen unverringerte zytolytische Reaktion erhalten.
Tabelle 4. Wirkung der Strahlung auf die Proliferation von NK-92-Zellen
Beispiel 8. Strahlungsanfälligkeit von NK-92-Zellen.
Die NK-92-Zellen wurden mit einer γ-Strahlungsquelle (Gammacell 40, Atomic Energy of Canada, Ltd. Canada) bestrahlt. Ein Dosisbereich von 100–3000 cGy wurde untersucht. Nach der Bestrahlung wurden die Zellen gewaschen und in Kulturmedium mit rhIL-2 resuspendiert. Kolonie-Tests, Lebensfähigkeit und zytotoxische Aktivität der bestrahlten NK-92-Zellen wurden mit Standard-Techniken durchgeführt. (Yan et al., Leukemia, 7: 131–139 (1993)). Zur Quantifizierung der klonogenen NK-92-Zellen wurden die NK-92-Zellen (500 Zellen pro ml Kulturmedium) in einem Medium auf 0,3% Agarbasis, das mit 12,5% FCS, 12,5% Pferdeserum, 2 mM L-Glutamin, 100 μg/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 10^–5 M Mercaptoethanol und 500 U/ml rhIL-2 angereichert war, bei 37°C für 14 Tage gezüchtet. Ein zusätzliches Aliquot von 500 U/ml rhIL-2 wurde an Tag 7 während der Anzucht zugefügt. Es wurden für jeden Datenpunkt Dreifachkulturen durchgeführt.
Die Lebensfähigkeit von NK-92-Zellen, bestimmt durch Trypan-Blau-Färbung, und die Gewinnung der Fähigkeit der NK-92-Zellen zur Erzeugung von Kolonien nach dem Aussetzen gegenüber verschiedenen Strahlungsdosen ist in den 4 bzw. 5 gezeigt. Die NK-92-Zellen hielten ein substantielles Überleben für 3 oder 4 Tage nach dem Aussetzen gegenüber hohen Strahlungsdosen (1000–3000 cGy). Die klonogenen In-vitro-NK-92-Zellen wurden jedoch nach niedrigen Strahlungsdosen signifikant abgereichert und vollständig eliminiert durch Dosen oberhalb von 300 cGy. Die 6 zeigt die Zytotoxizität von NK-92-Zellen gegen K562, HL60 und 2 von Patienten hergeleiteten Leukämieproben nach dem Aussetzen gegenüber verschiedenen Strahlungsdosen. Dosen von 300, 500 und 1000 cGy ermöglichen eine substantielle Zytolyse gegenüber leukämischen Zelllinien und primären Leukämien 1 bis 2 Tage nach der Bestrahlung.
Diese Experimente legen nahe, dass NK-92-Zellen, die in dem Maße bestrahlt werden, dass sie nichtklonogen gemacht werden, ihre zytolytische Aktivität gegen ein breites Spektrum von Zielzellen behalten. Sie können daher ex vivo beim Spülen der Tumorzellen sowie bei der Behandlung verschiedener Krebserkrankungen in vivo verwendet werden.
Beispiel 9. Zytolyse von humanen primären Leukämiezellen durch NK-92
a. Von Patienten hergeleitete Proben.
Die Proben wurden erhalten mit Hilfe einer Einverständniserklärung während routinemäßiger Diagnoseblutuntersuchungen oder Knochenmarks (BM)-Aspiraten aus Patienten mit neuerlich diagnostizierten oder rezidivierten Leukämien. 9 Fälle mit akuter Myeloid-Leukämie (AML), 11 Fälle mit chronischer Myeloid-Leukämie (CML) (6 in der chronischen Phase, 1 in der beschleunigten Phase, und 4 in der Ausbruchskrise), 14 Fälle mit akuter B-Familen-Lymphoblasten-Leukämie (ALL) (13 Prä-B-ALLs und 1 B-ALL) und 6 T-ALL-Fälle, wurden untersucht (siehe Tabelle 5). Ausbruchs-angereicherte mononukleäre Zellen wurden durch Ficoll Hypaque- (Pharmacia, Piscataway, NJ) Dichtegradienten-Trennung isoliert und in RPMI 1640-Medium gewaschen.
b. Effektor-Zellen.
NK-92-Zellen wurden gezüchtet und in α-MEM-Medium gehalten, das mit 12,5% FCS, 12,5% Pferdeserum und rhIL-2 (500 U/ml Chiron, Emeryville, CA) angereichert war. TALL-104-Zellen (ein MHC-unrestringierter zytotoxischer Human-T-Zellklon, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. D. Santoli und Dr. A. Cesano, The Wistar Institute, Philadelphia) wurden in Iscove's modifiziertem Dulbecco's Medium gehalten, das mit 10% FCS und rhIL-2 (100 U/ml) angereichert war (Cesano et al., Blood, 87: 393–403 (1996)). Ein weiterer Human-NK-Zellklon YT wurde in RPMI 1640-Medium mit 10% FCS und rhIL-2 (100 U/ml) gehalten (Yodoi et al., J. Immunol., 134: 1623–1630 (1985)).
c. Zytotoxizitätsassays.
Die zytotoxische Aktivität nicht-bestrahlter NK-92 und reagierender T-Zellen gegen Leukämie-Ziele wurde in einem Standard-4-Std.-Chromfreisetzungstest (CRA) gemessen. Einige der Proben wurden ebenfalls in einem 18-Std.-CRA gemessen. Eine feste Zahl von ⁵¹Cr-markierten Zielzellen (5 × 10³/Vertiefung) wurde auf Anfälligkeit gegenüber 4 Effektorzellkonzentrationen untersucht. Die ⁵¹Cr-Freisetzung von Zielzellen allein (spontane Freisetzung, bestimmt durch Platzieren von Zielzellen in 5% Triton) war immer < 25% der maximalen ⁵¹Cr-Freisetzung. Die CRA-Daten wurden ausgedrückt als spezifische Lyse (%) bei einem gegebenen Eftektor/Ziel (E/T)-Verhältnis oder wurden umgewandelt in lytische Einheiten (LU), definiert als die Zahl der Effektoren, die zu einer 30%igen Lyse von Zielzellen führte (Cesano et al., Cancer Immunol. Immunother. 40: 139–151 (1995)). Der Grad der Empfindlichkeit der von Patenten abgeleiteten leukämischen Zielzellen zu jedem Effektor waren definiert als inempfindlich (–/+ < 10/10–19% Lyse), empfindlich (++/+++/++++: 20–29/30–39/40–49% Lyse) und hochsensitiv (+++++/++++++: 50–59/> 60% Lyse) bei einem E/T-Verhältnis von 9:1.
d. Ergebnisse. Zytolyse von primären Human-Leukämie-Zellen durch NK-92-Zellen.
Die Empfindlichkeit der patienten-abgeleiteten Leukämiezellen gegen die zytotoxische Wirkung von NK-92-Zellen ist in der Spalte 4 von Tabelle 5 zusammengefasst. Von den 40 Patienten-abgeleiteten Leukämie-Proben, die in der Tabelle 5 gezeigt sind, sind 26 (65%) empfindlich oder hochempfindlich gegenüber NK-92-vermittelter In-vitro-Zytotoxizität. Sechs der Proben, die unempfindlich gegenüber den NK-92-Zellen in den Standard-4-Std. CRA (einzige oder erste Einträge) waren, wurden nach 18 Std. Inkubation empfindlich (zweite Einträge, in Klammern). Leukämie-Ausbrüche, hergeleitet von 6 aus 9 (67%) Ausgangsmaterial, 6 von 6 (100%) T-ALL und 6 von 14 (43%) B-Familien-ALL, waren entweder empfindlich oder hochempfindlich gegen die NK-92-vermittelte Lyse. 7 von 8 akute-Leukämie-Proben, die eine hohe Empfindlichkeit gegen die zytotoxische Wirkung von NK-92-Zellen aufwiesen, wurden von rezidivierten Patienten hergeleitet und 1 stammte von einem neu diagnostizierten Patient. Von 11 CML-Proben waren 8 (73%) empfindlich (5 in der chronischen Phase) oder hochempfindlich (2 in der Ausbruchskrise, 1 in der beschleunigten Phase) gegenüber der NK-92-vermittelten Zytolyse (Tabelle 5).
Im Vergleich veranschaulichen die letzten beiden Spalten in der Tabelle 5 die Ergebnisse, die mit Zelllinien erhalten wurden, von denen man auf dem Gebiet weiß, dass sie zytolytische Aktivität gegen Tumorzellen aufweisen, nämlich TALL-104-Zellen und YT-Zellen. Nur 16 der untersuchten 37 Leukämieproben (43%) waren empfindlich (4 AMLs, 5 B-Familien-ALLs und 3 CMLs) oder hochempfindlich (1 AML, 1 B-Familien-ALL und 2 CMLs) gegenüber der durch den MHC-unrestringierten zytotoxischen T-Zellklon TALL-104-vermittelten Zytolyse. Leukämien, die gegenüber TALL-104-Zellen empfindlich waren, waren nicht konsistent empfindlich gegenüber NK-92-Zellen, und Zellen, die durch NK-92-Zellen lysiert wurden, wurden nicht immer durch TALL-104-Zellen lysiert. Zudem wurde die zytolytische Aktivität von TALL-104-Zellen gewöhnlich nach nur 18 Std. Inkubation erfasst (zweite Einträge, in Klammern). Nur vier von 16 (25%) Zielproben, die nach 18 Std. lysiert wurden, wurden auch in der Standard-4-Std. CRA lysiert. Die restlichen 12 (75%) reagierten nur nach der 18-Std.-Inkubation, wobei die Reaktion gewöhnlich niedriger ist als diejenige, die mit den erfindungsgemäßen NK-92-Zellen beobachtet wurde. Man möchte zwar nicht durch die Theorie gebunden sein, jedoch können diese Beobachtungen auf der Möglichkeit beruhen, dass 1) verschiedene Zielstrukturen erkannt werden durch TALL-104 vs NK-92-Zellen, oder 2) ein anderer Weg an der durch NK-92- und TALL-104-Zellen vermittelten Zytolyse beteiligt ist.
Der Großteil der mit YT-Zellen behandelten Leukämie-Proben, der andere untersuchte NK-artige Klon, erwies sich als resistent, mit Ausnahme von 2 Proben (einer CML in der Ausbruchskrise und 1 T-ALL) (siehe Tabelle 5).
Zusammengefasst sind die erfindungsgemäßen NK-92-Zellen überraschend und signifikant effizienter bei der Lyse von patienten-abgeleiteten Tumorzellen, und üben ihre Wirkung in kürzerer Zeit aus als die Zellen aus zwei zytolytischen Zelllinien, die im Stand der Technik bekannt sind.
Tabelle 5. Zytotoxizität von NK-92-, T-ALL104- und YT-Klon gegenüber von Patienten hergeleiteten Leukämie-Zellen^a
Tabelle 5 (Fortsetzung)

Bemerkungen und Abkürzungen a) Die Spalten zeigen Ergebnisse der Chrom-Freisetzungstests bei E. T. = 9:1 nach 4 Std. ohne Klammern und (Ergebnisse nach 18 Std. in Klammern); Neu: neuerlich diagnostiziert; ND nicht durchgeführt, o: FAB-Klassifizierung, D: Ausbruch und Promyelocyt, BM: Knochenmark; PB peripheres Blut, I: B-ALL, BC: Ausbruchskrise. AC: beschleunigte Phase. CP: chronische Phase.

Beispiel 10 Zytotoxizität von NK-92 gegenüber menschlichen Leukämiezelllinien
Folgende menschliche Leukämiezelllinien wurden gezüchtet bei 37°C unter 5% CO₂ in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% wärmeinaktiviertem fötalen Kälberserum (FCS), L-Glutamin und Antibiotika: K562 (chronische Myeloidleukämie in Blastkrisis), HL60 (akute promyelozytische Leukämie), KG1 (Erythroleukämie), NALM6 (aktue prä-B lymphoplastische Leukämie), Raji (Burkitt-Lymphom), CEM/S (akute T lymphoplastische Leukämiezellinie, sensitiv auf Methotrexat (MTX), ein gewöhnlich eingesetztes Antitumormedikament) sowie CEM/T (Methotrexat-resistente Sublinie von CEM/S) (Mini, E. et al., Cancer Res. 45: 325–330 (1985)).
Die NK-92-Zellen waren hoch-zytotoxisch gegenüber allen 8 Leukämie-Zelllinien, die im 4-Stunden-Standard-CRA (Tabelle 6) getestet wurden. Die MTX-sensitive-T-ALL Zelllinie CEM/S sowie die MTX-Transport-resistente Sublinie CEM/T zeigten ähnliche Sensitivität auf NK-92-Zellen. Dies legt nahe, dass die Tumore nicht auf eine MTX-Behandlung ansprechen und durch Verabreichen von NK-92-Zellen gemäß der Erfindung behandelt werden könnten. Die Tabelle 6 zeigt eine überraschend hochwirksame zytolytische Aktivität der NK-92 gegenüber alle getesteten Zielzellen. Die bei einem niedrigen E/T-Verhältnis von 1:1 erhaltenen Ergebnisse sind besonders hervorzuheben.
Im Gegensatz dazu besaßen die zytolytischen Zelllinen TALL-104 und YT keine oder scheinbar keine zytolytische Aktivität gegen die meisten dieser Zielzellen unter diesen Bedingungen. Falls vorhanden, war deren Aktivität in der Regel niedriger als die für NK-92 bei einem E/T von 1:1. TALL-104 war zytotoxisch für K562, NALM6 und HL60-Zellen. Die Raji-Zellen zeigten nur eine 22,2%ige Lysis bei einem E/T-Verhältnis von 9:1 und die KG1-Zellen, CEM/S sowie CEM/T waren resistent. Der YT-Klon zeigte keine signifikante zytotoxische Aktivität. Eine Aktivität wurde nur gegen K562-Zellen und Raji-Zellen gefunden. Sie zeigten eine 32%ige bzw. 25%ige Lysis bei einem E/T-Verhältnis von 9:1.
Siehe Tabelle 6. Die erfindungsgemäßen NK-92-Zellen besaßen einen signifikant breiteren Wirkbereich und höhere Aktivitäten als die bekannten zytolytischen Zelllinien TALL-104 und YT. Die Aktivitäten sind höher als die zuvor berichteten Werte im Bereich der Tumor-Zytotherapie.
Tabelle 6 Spezifische Lysis von menschlichen Leukämiezelllinien durch die natürlichen Killerzellklone NK-92, TALL-104 und YT
Beispiel 11 – Wirkung der NK-92-Zellen auf normale hämatopoetische Zellen des menschlichen Knochenmarks
Es wurden heparinisierte Knochenmarkzellen von normalen Spendern gesammelt und auf einem Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten getrennt und isoliert. Es wurden mononucleare Zellen erhalten. Die Anreicherung und die Entfernung der T-Zellen erfolgte durch eine Sojabohnen-Lektin-Agglutination (SLA) der reifen Markelemente und Entfernen von verbliebenen T-Zellen durch ein Zurücksetzen mit roten Blutzellen aus Schaf (Reisner et al., Lancet 2: 327–31 (1981)).
Die Fraktionen mit angereicherten hematopoetischen Zellen aus normalem Knochenmark von 14 normalen Spendern wurden in einem Standard-CRA getestet und deren Empfänglichkeit einer Lysis durch NK-92-Zellen gegenüber bestimmt. Die normalen Knochenmarkproben waren unempfindlich gegenüber einer NK-92 vermittelten Zytolyse (7).
Beispiel 12 – In-vivo-Leukämiegenese der NK-92-Zellen in SCID-Mäusen
a) Versuchstiere:
SCID-Mäuse (SCID – severe combined immunodeficient) CB17 scid/scid und pfp/Rag-2 im Alter von 6 bis 8 Wochen (Taconic Farms, Germantown, NY) wurden gehalten in Mikroisolationskäfigen unter Sterilbedingungen in einer speziell pathogenfreien Umgebung. Für die Bestimmung des Potentials der NK-92-Zellen wurde in vivo eine Leukämie induziert. Hierzu wurden 2 × 107 lebende NK-92-Zellen in 0,3 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) entweder intraperitoneal (I. P.) oder intravenös verabreicht, jeden Tag durch fünf Injektionen in jedem Tier. Die subkutanen (S. C.) Impfungen mit 2 × 107 NK-92-Zellen erfolgten durch Injektion in die rechte Seite der SCID-Maus, wie zuvor beschrieben von Yan et al. in Blood 88: 3137–3146 (1996). Danach wurden allen Versuchstieren jeden Tag über zwei Wochen 5 × 104 Einheiten rhIL-2 durch subkutane Injektion verabreicht. Das Überleben der Tiere wurde über mindestens 6 Monate nach Animpfen verfolgt.
b) Gewebeanalyse:
Aus jeder Gruppe wurden 2 SCID-Mäuse am Ende der Beobachtungszeit geopfert und Gewebe aus peripherem Blut, Knochenmark, Milz, Leber, Niere, Lunge und Hirn gesammelt für eine histopathologische Untersuchung bzw. für ein fluoreszenzaktiviertes Zellsorten (FACS). Die Gewebeschnitte aus den geopferten SCID-Mäusen wurden fixiert in 10% neutralem gepufferten Formalin, dehydratisiert und in Paraffin gebettet, geschnitten und gemäß standardhistologischen Verfahren gefärbt.
Aus den verschiedenen Geweben gewonnene lebende Zellen wurden mit Fluoresceinisothiocyanat-konjugiertem (FITC) oder Phycoerythrin-konjugiertem (PE)-Mab angefärbt, wie beschrieben von Yan et al. (1996). Die Analyse erfolgte mit einem FACS-Reihenfluss-Zytometer (Becton Dickinson). Es wurden monoklonale Antikörper (Mabs) gegen die jeweiligen menschlichen Zelloberflächenantigene verwendet. Es wurde auf die Anwesenheit untersucht von CD2, CD3, CD5, CD7, HLA-DR, CD45, CD56 (Becton Dickinson). Für die Charakterisierung der Maus-Leukozyten-Antigen wurde der Fluorescein-isothiocynat (FITC)-konjugierte Ratte-anti-Maus-Mab mCD45 (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) verwendet.
c) Leukämiegenese
Es wurden CB-17 scid/scid-Mäuse sowie pfp-Rag-2-Mäuse mit NK-92-Zellen i. v. (n = 3, in den jeweiligen Gruppen), S. C. (n = 2, in den jeweiligen Gruppen) und I. P. (CB-17, n = 8, pfp-Rag-2 n = 3)-Injektion inokkuliert. Das Überleben der Tiere wurde nach Animpfen über 6 Monate verfolgt. Am Ende des Sechsmonatszeitraums waren alle Tiere scheinbar gesund. Es lag keine Hepatosplenomegalie vor, keine Lymphadenopathie oder ein leukämisches Knotenwachstum, was das Entstehen einer Leukämie angezeigt hätte. In der Histopathologie war keine Infiltration mit leukämischen Zellen in den verschiedenen Geweben der geopferten Mäuse zu sehen. Es waren keine Zellen menschlichen Ursprungs in den Geweben durch FACS-Analyse festzustellen.
Beispiel 13 – Vergleich der antileukämischen Wirkung von NK-92-Zellen mit LAK-, NK-, und T-Zellen gegen menschliche Leukämiezelllinien
Für die Isolierung der NK-Zellpropulationen wurde ein Ceprate^®-Zelltrennsystem, basierend auf einer Avidin-Biotin-Immunoaffinität (CellPro, Bothel, WA) verwendet. Es wurde eine Fraktion mit CD56+-Zellen aus kultivierten LAK-Zellen aufgereinigt. Die geernteten Zellen wurden kurz gesagt gewaschen und in PBS mit 1% BSA (Rinderserumalbumin) resuspendiert. Zu jeweils 1–2 × 10⁸ Zellen/mL wurden 40 μl primärer monoklonaler Antikörper (Maus-Anti-Human-CD56) zugesetzt und die Zellen 25 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und bei einer Konzentration von 1 × 10⁸ Zellen/mL in PBS mit 1% BSA resuspendiert. Zu jeweils 1 ml Zellsuspension wurde dann 20 μl Biotin-markierte Ratte-Antimaus-IgG1-Antikörper zugesetzt und die Zellen dann wiederum 25 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden nach Inkubation gewaschen und bei einer Konzentration von 1 × 10⁸ Zellen/mL in PBS mit 5% BSA resuspendiert und dann langsam über eine Avidin-Säule geschickt. Die CD56⁺-Zellen banden an; die anderen Zellen, einschließlich die T-Zellfraktion wurde von der Säule entfernt. Nach dem Waschen der Säule wurden die anhaftenden Zellen von der Säule durch Schütteln und Entfernen dissoziiert. Nach dem Auftrennen enthielten die NK-Zellreichen Populationen mehr als > 85% CD56+CD3-NK-Zellen. Die Mehrzahl der anderen Zellen in der Fraktion (> 95%) waren CD3+CD56-T-Zellen.
Zur Bildung von Leukämie-reaktiven allozytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs), wurden periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) aus normalen Spendern isoliert und mit zusammen mit bestrahlten leukämiestimulierten Zielzellen und bestrahlten autologen PBMC als Feeder-Zellen gezüchtet. Die Kulturen wurden in Platten mit 60 Vertiefungen bei 1000 Responder-Zellen pro Vertiefung gestartet in RPMI 1640-Medium, das 15% Humanserum und 100 Einheiten pro mL rhIL-2 bei 37°C und 5% CO₂. Das Verhältnis von Stimulatorzellen und Feeder-Zellen zu Responder-Zellen betrug 5:1 bzw. 10:1. Nach 10 bis 12 Tagen Kultur wurden die CTLs aus wachstumspositiven Vertiefungen geerntet, die spezifische Lyse gegenüber Leukämie-Zielzellen und K562-Zellen wurde durch einen ⁵¹Cr-Freisetzungsassay quantifiziert. Die CTLs wurden kontinuierlich in Flaschen gezüchtet und mit Stimulator- und Feeder-Zellen gefüttert. Nach zwei bis drei Wochen Kultur wurde monoglonaler Antikörper OKT3 (Ortho Biotech, Raritan, N. J.) zur Kultur zugesetzt, um eine rasche Expansion der CTL-Linien zu erhalten.
Die antileukämischen Wirkungen der NK-92-Zellen, der menschlichen LAK-Zellen, der NK-Zellen (CD56+, CD3-, CD56+ in 8) und T-Zellen (CD3+CD56-, CD3+ in 8) wurden bestimmt durch Messen der in vitro zytolytischen Aktivität im Standard-CRA (8, Felder A und B) und durch Messen der Inhibierung des Leukämiezellen-Xenotransplantatwachstums in vivo (8, Felder C und D), wenn Effektorzellen und Zielzellen subkutan in SCID-Mäusen ko-inokkuliert wurden. Für die Bewertung der Wachstumsinhibierung in vivo wurde der Bereich des subkutanen Wachstums der Leukämieknoten als Maß für deren Größe einmal die Woche nach Inokulation bestimmt und auch das Überleben der Tiere verfolgt. Die NK-92-Zellen zeigten die höchste in vitro Zytotoxitität gegen K562 (8, Feld A) und HL60 (8, Feld B) von den getesteten Zellen bei einer mittleren spezifischen Lyse von 89% bzw. 78%. Dies lag über der Tötungsrate durch menschliche LAK (52% bzw. 11%), NK (72% bzw. 28%) und T-Zellen (12% bzw. 12%).
Die NK-92-Zellen zeigten eine stärkere in vivo Inhibierung des Wachstums der K562- (8, Feld C) und HL60- (8, Feld D) Leukämiezell-Xenotransplantat als dies be Human-LAK und NK-Zellen der Fall war. Die in 8 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäßen NK-92-Zellen eine in vitro zytolytische Aktivität besitzen sowie in vivo eine tumorinhibierende Aktivität, welche größer sind als die Aktivitäten für bekannte Präparationen zytolytischer Zellen, wie sie normalerweise in Menschen vorhanden sind. Diese Wirkungen sind daher für den Fachmann auf dem Gebiet der Tumorzytotherapie unerwartet.
Beispiel 14 – Vergleich der antileukämischen Wirkung von NK-92-Zellen und allogenesische Leukämie-reaktiver CTL-Zellen
Für die Untersuchung der in vivo Wirkungen von NK-92-Zellen und anderen Effektorzellen auf das Wachstum von Humanleukämie-Xenotransplantate wurden 5 × 10⁶ Leukämie-Zielzellen allein oder gemischt mit 2 × 10⁷ NK-92-Zellen oder anderen Effektorzellen (E/T-Verhältnis gleich 4:1) S. C. in SCID-Mäuse injiziert. Die TALL-104 Effektorzellen wurden vor Animpfen mit 3000 cGy bestrahlt, und um eine Leukämogenese in SCID-Mäusen zu verhindern, wurde rhIL-2 wie in Beispiel 13 verabreicht. Der Log-Rank-Test und der Wilcoxon-Test wurden zum Vergleich der Überlebensrate der leukämietragenden SICD-Mäuse eingesetzt.
Die Antileukämiewirkung der NK-92-Zellen wurde mit Hilfe von allogeneisch erzeugten Leukämie-reaktiven CTL-Zellen (stammend aus einem Patienten mit T-ALL (TA27)) bewertet. Sowohl die NK-92 als auch die CTL-Zellen aktivierten bei einer Exposition gegen TA27 eine signifikant höhere spezifische Zytolyse (70 bzw. 58%) bei einem E/T-Verhältnis von 9:1 als die anderen Effektoren (LAK-Zellen: 22%; NK-Zellen (benannt CD56+ in 9): 38%; TALL-104: 8%; und T-Zellen (CD3+ in 9): 1,5% spezifische Lyse) gegen die TA27-Leukämiezellen (9, Feld A). Das subkutane Wachstum der TA27-Leukämiezellen wurde entsprechend inhibiert durch Koinjektion von entweder NK-92-Zellen oder Anti-TA27-CTL-Zellen (9, Feld B). Das Überleben dieser Tiere, die mit TA27-Leukämiezellen plus NK-92 oder mit Anti-TA27-CTL-Zellen inokkuliert waren, wurde signifikant verlängert über das von Tieren, die allein TA27-Leukämie trugen (NK-92-Zellen: p = 0,001; TA27-CTL-Zellen: p = 0,002; siehe 10). Im Gegensatz dazu zeigten die TALL-104-Zellen keine signifikante in-vitro-Tötung von TA27-Leukämiezellen durch CRA (9, Feld A). Die moderate Inhibierung des Leukämie-Tumorwachstums in-vitro (9, Feld B), gekoppelt mit einer statistisch unbedeutenden (p > 0,05) Erhöhung der Überlebensrate, wurde bei Tieren beobachtet, die koinokkuliert waren mit TA27-Leukämiezellen und bestrahlten TALL-104-Zellen (10).
Beispiel 15 – Antileukämiewirkung von NK-92-Zellen im Human-Leukämie-Xenotransplantat-SCID-Mausmodell.
Für die Untersuchung der in vivo-tumortötenden Kapazität der NK-92-Zellen wurden Leukämiezellen aus einem T-ALL-Patienten (TA27) einem AML-Patienten (MA26) und einem präB-ALL-Patienten (BA31) adaptiv wachsen gelassen und in SCID-Mäusen durch S. C.-Impfung expandiert. In diesen Versuchen wurden Leukämiezellen verwendet, die aus Leukämieknoten von Mäusen (erste Passage) gewonnen wurden. Die SCID-Mäuse in jeder Gruppe wurden mit 5 × 10⁶-Leukämiezellen aus der ersten Passage in 0,2 mL PBS I. P. inokkuliert. 24 Stunden später wurden 2 × 10⁷-NK-92-Zellen in 0,4 ml PBS durch I. P. Injektion verabreicht. Die Tiere erhielten entweder eine Dosis oder eine Serie Impfdosen NK-92-Zellen. Diese wurden verabreicht an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9 mit und ohne rhIL-2, wie in den Figuren angegeben.
Alle menschliche Leukämien wuchsen in den SCID-Mäusen aggressiv. Die Leukämiezellen aus einem Patienten (TA27) mit T-ALL und einem Patienten mit AML-M4-Leukämie waren in vitro hochsensitiv auf NK-92-Zellen (73% bzw. 66% spezifische Abtötung bei einem E/T-Verhältnis von 9:1, bestimmt durch CRA), wohingegen Zellen aus einem Patienten mit prä-B-ALL (BA31) unempfindlich waren auf NK-92-Zellen (4% spezifische Abtötung bei einem E/T-Verhältnis von 9:1, bestimmt durch CRA). 11 zeigt, dass das Überleben von Mäusen mit TR-27-Leukämie signifikant verlängert wurde durch Verabreichen von NK-92-Zellen. Die mittlere Überlebenszeit (MST) von Tieren ohne Behandlung oder nur rhIL-2 allein betrug 72 Tage (n = 5) bzw. 63 Tage (n = 5) bei p > 0,05. Alle diese Tiere starben an Leukämie. Die Behandlung mit NK-92-Zellen (allein oder mit rhIL-2) erhöhte die MST auf 102 Tage (n = 6) bzw. 114 Tage (n = 6) bei einer einzigen Injektion von 2 × 10⁷ NK-92-Zellen am Tag 1. Die MST erhöhte sich auf 160 Tage (n = 6) bzw. 129 Tage (n = 6) mit 5 Dosen NK-92 mit oder ohne rhIL-2-Injektion (11). Tiere, welche 5 Dosen NK-92-Zellen injiziert erhielten mit oder ohne rhIL-2 überlebten ohne Zeichen einer Leukämie die sechs Monate nach Impfung. Es traten keine merklichen Unterschiede auf im Überleben von Mäusen, mit oder ohne rhIL-2-Behandlung, sei es in der Gruppe mit einer Dosis NK-92 (p = 0,75) oder der Gruppe mit 5 Dosen (p = 0,45). Verglichen zur Gruppe mit einer Dosis NK-92-Zellen mit oder ohne rhIL-2-Behandlung war das Überleben signifikant länger in Tieren mit 5 Dosen NK-92-Zellen ohne rhIL-2-Behandlung (p = 0,009 bzw. p = 0,009).
Die MST betrug 63 Tage (n = 5) bzw. 64 Tage (n = 5) – siehe 12 – in SCID-Mäusen, die inokkuliert wurden mit humaner prä-B-ALL (BA31)-Leukämie, mit und ohne rhIL-2-Behandlung. In Tieren mit 5 Dosen 2 × 10⁷ NK-92-Zellen und mit und ohne rhIL-2-Verabreichung war die MST erhöht auf 79 Tage (n = 5) bzw. 76 Tage (n = 5). Die Überlebenszeiten waren nicht signifikant verschieden von denen bei Tieren, die nicht mit NK-92-Zellen (p > 0,05) behandelt wurden.
In Tieren, die Human-AML (MA26) trugen, war die MST 97 Tage (n = 6); siehe 13. Die MST verlängerte sich auf 173 Tage bei Tieren, die 5 Dosen 2 × 10⁷ NK-92-Zellen erhielten (p < 0,01) (n = 6). Drei der sechs Tiere, die NK-92-Zellen erhielten überlebten 6 Monate nach Leukämieinokkulation. Zwei von diesen schienen gesund zu sein, ohne jedes Zeichen einer Leukämieentwicklung. Eine Maus hatte einen vergrößerten Unterleib, was auf Leukämiereste hinweist. Die sechs Tiere, die NK-92 sowie eine rhIL-2-Behandlung erhielten, überlebten alle sechs Monate die Leukämieinokkulation ohne irgendein Zeichen auf eine Leukämieentwicklung.
Die in den 11 bis 13 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die in vivo-Behandlung von Leukämietumoren zu einer längeren Lebensdauer der betroffenen Mäuse führt. Das Ausmaß der Lebensverlängerung und die Gesundheitsverbesserung der Mäuse ist unabhängig von dem jeweils involvierten Leukämietumor und reicht von bescheiden oder nichtsignifikant (12) bis zu sehr dramatisch (13). Aufgrund dieser Ergebnisse kann man schließen, dass die Behandlung der Tumoren in vivo durch Verabreichung von NK-92-Zellen je nach Tumor überraschend wirksam sein kann.
Beispiel 16 – Herstellung von modifizierten NK-92-Zelllinien, die IL-2 sekretieren.
Die Herstellung von NK-92-Zellen, die konstitutiv Interleukin-2 sekretieren, erfolgt mit zwei Plasmiden, die humanes Interleukin-2 enthielten.
a. Methoden DNA-Klone:
Der MG-hIL-2-Vektor (7) stammte großzügig von Dr. Craig Jordan (vormals Somatix Corp., Alameda, Kalifornien). Der pCEP4-LTR-hIL-2-Vektor (8) wurde hergestellt durch Ausschneiden des HindIII-BamHI-Fragments aus dem MG-hIL-2-Vektor, enthaltend das 5'-LTR und das hIL-2-Gen, und Einsetzen in die Komplementärstelle der episomalen pCEP4-Vektorstruktur (in vitro-Gen, Carlsbad, CA).
Partikel-vermittelter Gentransfer:
NK-Zellen wurden transduziert durch partikel-vermittelten Gentransfer mit dem Biolistic PDS-1000/He-Particle-Delivery-System (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Die Zellen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers transduziert. Kurz gesagt wurden 1,0 oder 1,6 μm Goldpartikel mit 5 μg DNA mit Hilfe von Calciumchloridspermidin und Ethanol beschichtet. Die NK-92-Zellen wurden durch Anheften auf poly-L-Lysin (Sigma, ST. Louis, MO)-beschichteten 35 mm Gewebekulturplatten für die Bombardierung vorbereitet. Die Zellen wurden in einer evakuierten Kammer (20 mm Quecksilbervakuum) bombardiert und die DNA-beschichteten Teilchen durch einen 1100 psi Helium-Impuls beschleunigt. Unmittelbar nach der Bombardierung wurden die Zellen auf IL-2 supplementiertes Myelocult-Medium zurückgebracht und sie konnten sich dann 24 Stunden bis zum Transfer in das IL-2-freie Medium erholen. Das Medium wurde regelmäßig gewechselt. Die Zellen wurden auf IL-2-unabhängiges Wachstum selektiert. Die vorläufigen Ergebnisse zeigen das Wärmeübertragungswirksamkeiten von 5 bis 15% unter diesen Bedingungen erreicht wurden.
PCR und Southernblot-Analyse:
Die Transfektion der NK-92-Zellen wurde durch eine Kettenpolymeraseanalyse (PCR) der DNA, isoliert sowohl aus dem Eltern- als auch den transfektierten NK-92-Zelllinien, auf die Gegenwart von genomischer und cDNA-Formen des Human-IL-2-Gens analysiert. Die DNA wurde mit DNAzol (Gibco Life Technologies Inc., Burlington, ON) isoliert. Die Zellen wurden kurz gesagt in DNAzol lysiert und die DNA bei Raumtemperatur mit Ethanol präzipitiert. Die DNA-Pellets wurden gesammelt, in 95% Ethanol gewaschen und kurz an Luft getrocknet. Die DNA wurde in 8 mM NaOH bei 62°C resuspendiert und die Lösung mit HEPES-Puffer neutralisiert. Die DNA wurde durch Absorption bei 260 nm quantifiziert. Für die Amplifikation der DNA (30 Zyklen, 1 Min 95°C, 2 min 50°C und 2 Min 72°C) wurden Primer verwendet, flankierenden das Exon-1 des Human-IL-2-Gens (vorwärts: 5'-CAA CTC CTG TCT TGC ATT GC-3' sowie rückwärts: 5'-GCA TCC TGG TGA GTT TGG G-3', Gibco Lift Technologies Inc., Burlington, ON). Die PCR-Produkte wurden auf einem zweiprozentigen Agarosegel aufgelöst. Für die Southernblot-Analyse wurde die DNA auf eine Hybond + Nylon-Membran überführt (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL), durch Kapillartransfer in 10 × SSC (1,5 M NaCL, 1,5 M NaCitrat) und fixiert durch UV-Quervernetzen (StrataLinker Stratagene, La Jolla, CA). Der Blot wurde mit ³²P-radiomarkierte Human-IL-2-Probe 8 bis 12 Stunden hybridisiert, gewaschen und entwickelt durch Autoradiographie bei –70°C auf Kodak X-Omat XAR-Film.
Northernblot-Analyse:
Die Cytokin- und Chemokin-Genexpression wurde durch Northernblot-Analyse untersucht. Die RNA wurde aus Eltern- und transfektierten NK-92-Zelllinien mit Triazol-Reagenz extrahiert (Gibco Life Technologies Inc., Burlington, ON) und zwar entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die Zellen wurden, kurz gesagt in Triazol lysiert und das Lysat mit Chloroform extrahiert. Die wässrige Phase wurde sodann mit Isopropanol extrahiert. Das RNA-Pellet wurde gesammelt, kurz an Luft getrocknet und in DEPC-behandeltem Wasser (Diethylpyrocarbonat, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) resuspendiert. Die RNA wurde quantifiziert durch Bestimmen der OD bei 260 nm. Es wurden 15 μg RNA auf einem 1%-igen Formaldehyd-Agarosegel in 1% MOPS (3-[N-Morpholino]propansulfonsäure, Sigma, St. Louis, MO) aufgelöst und dann geblottet, wie vorstehend beschrieben bei der Southernblot-Analyse. Der Blot wurde mit ³²P-radiomarkierter Sonden für Human-IL-2 und TNFα hybridisiert.
Die DNA-Proben für die Northern- and Southernblot-Analysen wurden durch Random-Primer-Extension radiomarkiert. Die DNA-Proben für Human-IL-2 und TNFα wurden durch Verbau mit geeigneten Restriktionsendonukleasen und durch Agarose-Gelelektrophorese aufgereinigt.
Die DNA wurde aus dem Gel geschnitten und aufgereinigt durch Zentrifugation durch einen Spin-X-Tubefilter (Corning Costar, Cambridge, MA), Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation. Die DNA-Probe wurde mit α-³²P-dCTP (spez. Aktivität 3000 Ci/mmol; ICN, Montreal, PQ) markiert.
Cytokin-Bestimmung:
Die IL-2-Produktion durch die NK-92-Zelllinien wurde mit ELISA bestimmt. Es wurden Aliquote von 1 × 10⁶-Eltern oder transfektierten NK-92-Zellen in 8 ml IL-2-freien Myelocult-Medium 1, 2 und 3 Tage gezüchtet. Die Rückstände wurden bei –20°C gesammelt, bis alle Überstände aufgesammelt waren. Die Proben wurden getrocknet und die IL-2-Spiegel mit ELISA gemäß Herstellerangaben untersucht (Quantikine; R&D Systems, Minneapolis, MN). Der ELISA ist ein colorimetrischer Assay mit Meerrettichperoxidase/Tetramethylbenzidin, und die ELISA-Mikrotiterplatten wurden bei 450 nm (mit einer 540 nm-Korrektur) in einem Mikroplattenleser (Model EK309, Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT) ausgelesen.
Bestrahlung der NK-92-Zellen:
Zur Bestimmung der Sensitivität der Eltern und der transfektierten NK-92-Zellen auf Bestrahlung wurden die Zellen bestrahlt mit einer Cis-BioInternational 437c-Cäsiumquelle (Cis-US, Bedford, MA). Die Zellen wurden gesammelt, gewaschen, in Medium suspendiert und in 15 oder 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurden die Zellen gewaschen und in Myelocult mit (für die Eltern-NK-92) oder ohne (für die transfektierten Zellen) IL-2 resuspendiert. Die Zellen wurden 24, 48 und 72 Stunden gezüchtet und getestet auf Lebensfähigkeit und Trypanblau-Exklusion, auf Vermehrung durch ³H-Thymidin-Inkorperation und auf Zytotoxität durch ⁵¹Cr-Freisetzung (wie oben beschrieben).
b. Plasmid MFG-hIL-2
Bei NK-Zellen transfektiert mit MFG-hIL-2-Vektor starben 85 bis 95% der Zellen 4 bis 7 Tagen nach der Überführung in nicht-supplementiertes Medium. Eine kleine Zahl Zellen blieb jedoch am Leben. Es wird angenommen, dass diese Zellen erfolgreich transfektiert wurden. Aber auch bei diesen Zellen waren nach 2 bis 3 Wochen keine lebenden Zellen mehr zu finden. Es wird angenommen, dass das MFG-hIL-2-Vektorkonstrukt nicht die genetischen Elemente enthielt für eine Replikation und den Erhalt in eukaryotischen Zellen wie z.B. den Säugetierzell-Replikationsursprung. Nachdem die transfektierten Zellen in Kultur gehalten wurden, und sie sich dann vermehrten, ging das Vektorkonstrukt aus diesen Zellen verloren und die Zellen konnten wieder in den IL-2-abhängigen Phänotyp zurückkehren.
Diese Kulturen wurden nichts desto trotz für mehrere Wochen propagiert. Nach etwa 4 bis 5 Wochen nach dem ersten Transfer der Zellen in IL-2 freiem Medium trat wieder eine kleine Zahl lebensfähiger Zellen in den Kulturen auf. Diese Zellen waren in der Lage zum IL-2 unabhängigen Wachstum bei Subkultur in frisches Medium. Sie schienen stabil transfektiert zu sein und sie hielten ihren IL-2 unabhängigen Phänotyp auch bei längerer Kultur. Da der Vektor sich nicht replizieren konnte, legt das Auftreten von stabil transfektierten Zellen nahe, dass der Vektor in das Genom der transfektierten Zelle sich integriert hatte. Da dies ein sehr seltenes Ereignis ist, stammten die transfektierten Zellen daher wahrscheinlich von einer oder einer sehr kleinen Zahl Zellen ab. Die IL-2 NK-92-Zellen aus der Transfektion mit MFG-hIL-2 wurden NK-92MI genannt.
c. Plasmid pCEP4-LTR.hIL-2.
Die ersten Beobachtungen mit dem episomalen Vektor pCEP4-LTR.hIL-2 transfektierten Zellen waren identisch zu denen mit NK-92MI. Die Mehrzahl der transfektierten Zellen starben 4 bis 7 Tage nach Transfer in IL-2-freies Myelokultmedium. Anders als die NK-92MI-Zellen verloren die verbliebenen Zellen nicht ihren IL-2-unabhängigen Phänotyp oder ihre Vitalität, und sie starben auch nicht nach den ersten zwei bis drei Wochen. Statt dessen waren die anfänglich IL-2-unabhängigen Zellen sofort zum Langzeit-IL-2-unabhängiges Wachstum und Überleben fähig. Dies war zu erwarten, da der pCEP-LTR.hIL-2-Vektor Elemente enthält, die sich in eukaryotischen Zellen als autonom replizierendes genetisches Element erhalten. Daher konnten alle anfänglich transfektierten Zellen ihren IL-2-unabhänigen Phänotyp für eine unbestimmte Zeitdauer halten. Wenngleich Zellen, die episomale Vektoren beherbergen, nicht stabil im strikten Sinne transfektiert sind, so sind diese Zellen bei konstantem Selektionsdruck in IL-2-freiem Medium gegenüber Zellen, die den Vektor enthalten, im Vorteil. Daher können die Zellen über lange Zeit gezüchtet werden. IL-2-unabhänige NK-92-Zellen aus der Transfektion mit pCEP4-LTR.hIL-2 werden NK-92CI genannt.
Zur Bestätigung, dass NK-92MI und NK-92CI in der Tat mit dem hIL-2-Gen transfektiert sind, erfolgte eine PCR-Analyse an Eltern und transfektierten Zelllinien. Als Primer wurde das flankierende Exon I des hIL-2-Gens mit 88 Basenpaaren (bp) für die Amplifikation der DNA verwendet, die aus NK-92, NK-92MI und NK-92CI isoliert wurde. Diese wurde auf die Anwesenheit von genomischer und cDNA-Formen untersucht. Die Agarosegelelektrophorese der PCR-Produkte aus der Elternlinie zeigte ein einzelnes 263 Basenpaarfragment, entsprechend der Größe des erwarteten DNA-Fragments, das aus dem genomischen IL-2-Gen amplifiziert wurde (16, Feld A). Die Analyse der NK-92MI- bzw. der NK-92CI-Produkte lieferte jedoch zwei Banden, das 263 Basenpaarfragment gemäß dem genomischen hIL-2-Gen und auch ein 175 Basenpaarfragment aus der Amplifikation der hIL-2-cDNA. Die Identität dieser DNA-Fragmente wurde durch Southernblot-Analyse mit einer radiomarkierter Probe, spezifisch für hIL-2, bestätigt. Siehe 16, Feld B. Sowohl das 263 Basenpaar-Genomfragment als auch das 175 bp cDNA-Fragment hybidisierten mit der Probe. Diese Daten zeigen, dass sowohl NK-92MI als auch NK-92CI erfolgreich transfektiert waren und die cDNA für hIL-2 enthielten.
d. Analyse der Genexpression.
Die Analyse der Expression der spezifischen Cytokine in den Eltern und transfektierten Zelllinien erfolgte durch Northernblots. Hierzu aus NK-92, NK-92MI und NK-92CI-Zellen die RNA isoliert und durch Elektrophorese aufgetrennt. Die DNA wurde auf Nylonmembranen transferiert und mit Proben auf die Cytokine hIL-2 und hTNFα hybridisiert; siehe 17. Der Northernblot auf IL-2 in diesen Zellen zeigte, dass in der Elternzelllinie keine IL-2 RNA war; 17, Feld A, Spur 1. In den RNAs von NK-92MI und NK-92-CI (Spuren 2 bzw. 3) wurde hIL-2 gefunden. Zwei mRNA-Transkripte sind in NK-92MI zu sehen, eine größere RNA-Spezies von etwa 1,9 kDa und ein weniger starkes Transkript bei 2,4 kDa. In NK-92CI ist das hIL-2 mRNA-Transkript etwa 1,4 kDa. Gleichzeitig ist auch eine sehr schwache Bande bei 2,5 kDa zu sehen. Diese Daten bestätigen, dass die transfektierten Zellen IL2 exprimieren, wohingegen die Eltern-NK92-Zellen es nicht taten. Die Signifikanz der mehreren hIL-2-mRNA-Transkripten in den beiden Transfektanten ist nicht klar, wenngleich dies möglicherweise eine Konsequenz der unterschiedlichen Vektorkonstrukte ist. Zudem kann im Fall der NK-92MI die Integration des hIL-2-Gen in die genomische DNA gleichfalls die RNA-Größe beeinflussen. xxxyyx
Die TNFα-Expression in NK-Zellen wurde auch untersucht mit Hilfe dieses Verfahrens. 17, Feld B. Es ist zu sehen, dass alle drei Linien das Gen für dieses Cytokin exprimieren. Die TNFα-Sonde hybridisierte mit einer 1,6 kDa-Bande in RNA aus NK92, NK-92MI und NK-92CI; 17, Feld B. Obwohl die Transfektion der NK92-Zellen mit dem IL-2-Gen in den Transfektanten zu einer Expression des IL-2 führte, zeigten die Ergebnisse, dass dies die Expression des anderen Cytokins nicht beeinflusste.
e. Sekretion von hIL-2.
Nachdem die Expression des IL-2-Gens durch Northernblot-Analyse feststand, wurden die Zellen auf die Produktion und Sekretion von hIL-2 im ELISA untersucht. Es wurde eine Quote von 10⁶ NK-92, NK-92MI und NK-92CI-Zellen in 8 ml Aliquoten ausplattiert und in Myelokult in Abwesenheit von IL-2 gezüchtet. Nach 24, 48 und 72 Stunden wurden für eine IL-2 Analyse durch ELISA die Überstände gesammelt. Die IL-2 Hintergrundspiegel wurden im Überstand der NK-92-Zellen zu drei Zeitpunkten erfasst (2–3 pg/mL). Erhöhte IL-2-Spiegel wurden sowohl in NK-92MI als auch MK-92CI-Überständen (Tabelle 7) gefunden. NK-92MI produzierte sehr viel höhere Spiegel an IL-2 als NK-92CI, wobei die Spiegel nach 24 Stunden 60mal höher waren (9,3 pg/mL gegenüber 549,3 pg/mL) bis zu 80mal höher nach 48 Stunden (15,7 pg/mL gegenüber 1.260,3 pg/mL) und 72 Stunden (27,2 pg/mL gegenüber 2.248,3 pg/mL).
Tabelle 7 – Synthese von Human-IL-2 durch NK-92, NK-92MI und NK-92CI
f. Vergleich der Zelloberflächenantigene in NK-92, NK-92MI und NK-92CI.
Für den Vergleich der IL-2 unabhängigen Transfektanten mit den Elternzellen wurden NK-92MI und NK-92CI auf CD2, CD3, CD4, CD8, CD10, CD16, CD28, CD56, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 und LFA-1-Expression durch fluoreszenzaktiviertes Zellsorting (FACS) angesehen. Die transfektierten Zellen zeigten ein Expressionsmuster, welches identisch war zu dem der nicht-transfektierten Elternzelllinie, ausgenommen dem IL-2-Rezeptor. Die FACS-Analyse auf CD25 (die IL-2-Rezeptor-α-Kette) auf NK-92-Zellen zeigte, dass auf der Oberfläche der NK-92-Zellen der Rezeptor exprimiert wurde und dessen Expression auf IL-2 hin abgeriegelt wurde. Dies bestätigte ähnliche Befunde früherer Arbeiten (Gong et al., 1994). Die NK-92-Zellen besaßen daher im nicht-supplementierten Medium vergleichsweise hohe CD25-Spiegel auf ihrer Oberfläche, wohingegen Zellen im Medium, das mit 100 U/mL ergänzt war, einen niedrigen Expressionsspiegel von CD25 auf der Zelloberfläche besaßen.
Die CD25-Expression in dem hoch IL-2-produzierenden Transfektanten NK-92MI war sowohl in nicht-supplementiertem als auch in Medium supplementiert mit 100 Einheiten IL-2 pro mL oder 1000 Einheiten IL-2 pro mL herabgesetzt. Diese Ergebnisse stimmen überein mit denen bei den Elternzellen. Da die Spiegel an endogen produziertem IL-2 in NK-92MI hoch sind, darf erwartet werden, dass in Abwesenheit von exogen verabreichten IL-2 der IL-2-Rezeptorspiegel abgeregelt ist.
Die Kultur von NK-92CI in Medium supplementiert mit 100 Einheiten IL-2 pro ml und 1000 Einheiten IL-2 pro ml führte zu einer Hochregelung von CD25 und erhöhter Zelloberflächenexpression. Die Ergebnisse für NK-92CI in nicht-supplementierten Medium sind aber nicht klar. Zwei unterschiedliche Populationen treten auf: eine Population, die sehr niedrige CD25-Spiegel exprimiert, ähnlich NK-92MI, sowie eine Population mit hohen Spiegeln, ähnlich NK-92-Elternzellen. Dies legt nahe, dass NK-92CI eine polyklonale Population ist mit hoch und nieder IL-2 exprimierenden Zellen und nicht eine uniforme Population von Zellen mit einem mittleren bis niedrigen IL-Spiegel. Werden die Zellen daher in IL-2-freiem Medium abgezüchtet, haben Zellen mit einem hohen IL-2-Expressionsspiegel daher niedrige CD25-Oberflächenspiegel, wohingegen Zellen mit niederer IL-2-Expression einen hohen CD25-Spiegel auf ihrer Oberfläche haben.
Beispiel 17 – Zytotoxizität von NK-92, transfektiert für eine Produktion von IL-2
Zur Bewertung der Zytotoxität dieser transfektierten Zellen erfolgte ein standardmäßiger 4 Stunden ⁵¹Cr-Freisetzungsassay. Es wurde die Toxizität der Elternzellen gegenüber NK-92MI und NK-92CI bestimmt und vergleichen mit den Standard-Testzielzellen K562 und Raji. Die Zytotoxität von NK-92MI und NK-92CI war vergleichbar zu der der Elternzellen (18). Die transfektierten Zelllinien zeigten zytotoxische Aktivität gegenüber K562 und Raji, welche sehr ähnlich waren zu denen der Elternzellen. Die Zytotoxität von NK-92 gegenüber K562 reichte von 82 bis 67%. Demgegenüber hatten NK-92MI und NK-92CI Zytotoxizitäten im Bereich von 67 bis 62% bzw. 82 bis 62%. Bei Raji-Zellen hatten NK-92 eine Zytotoxizität von 81 bis 47%, und NK-92MI von 75 bis 65% und NK-92CI hatten eine Zytotoxizität von 82 bis 52%.
Beispiel 18 – Wirkung der transfektierten NK-92-Zellen auf hematopoetische Vorläuferzellen.
Eine mögliche klinische Anwendung der NK-92, NK-92MI und NK-92CI-Zellen ist die eines ex-vivo-Reinigungsmittel für autologe Transplantate. Damit sich die NK-Zellen hierfür eignen, müssen sie kranke Zellen entfernen – ohne ein Abtöten der hematopoetischen Vorläuferzellen im Transplantat und ohne deren hematopoetisches Potential zu beeinflussen. Um dies überprüfen zu können, erfolgte ein Colony-Forming Cells (CFC) – Versuch auf kolonienbildende Zellen – wo der klonogene Output der PBMCs untersucht wurde nach 48 Stunden Inkubation mit NK-92MI und NK-92CI bei verschiedenen E/T-Verhältnissen. Bereits früher wurde gezeigt, dass NK-92 eine minimale Wirkung auf hematopoetische Stammzellen (Beispiel 6) besitzt. In diesem Versuch besaßen NK-92MI und NK-92CI geringe oder keine Wirkung auf das klonogene Resultat. Die Zahl der Kolonien insgesamt nach Inkubation mit entweder NK-92MI oder NK-92CI war ähnlich der Kontrolle, wenngleich eine geringe Abnahme zu beobachten war bei einem maximalen Effektor/PBMC-Verhältnis von 1:1 (19). Der gesamte klonogene Ertrag von NK-92MI und NK-92CI war etwa 80% der Kontrolle unter diesen Verhältnissen. Ein einheitlicher Trend war aber hinsichtlich des klonogenen Ertrags mit Bezug auf die NK/PBMC-Verhältnisse nicht zu erkennen. Hinsichtlich der speziellen Kolonietypen gab es keine merkbaren Unterschiede in der Zahl der resultierenden BFU-E-Kolonien, welche hier die zahlreichsten waren. Etwas Wirkung war zu beobachten bei sowohl den CFU-GM- als auch den CFU-GEMM-Kolonien. Die absolute Zahl dieser Kolonien war jedoch klein, was die Ergebnisbewertung schwierig macht, da eine kleine Variation in der Kolonienzahl eine große Wirkung auf die Berechnung des klonogenen Ertrags hat. Ein Einfluss auf CFU-GM und CFU-GEMM kann bei höheren Verhältnissen gesehen werden, aber es war keine einheitliche Korrelation zwischen Verhältnis und Ertrag zu sehen.
Beispiel 19 – Bestrahlung der transfektierten NK-92-Zellen.
Um eine wirksame Strahlungsdosis für eine Inhibierung der Proliferation und zur Aufrechterhaltung der Zytotoxizität zu finden, wurden NK-92MI und NK-92CI mit 500, 1000, 1500 und 2000 cGy bestrahlt und die Proliferation bestimmt über den ³H-Thymidin-Einbau (siehe Beispiele 7 und 8). Sowohl NK-92MI als auch NK-92CI waren gegenüber der Strahlung empfindlicher als die Eltern-NK-92-Zellen. Die Proliferation der NK-92MI und NK-92CI war bei allen verwendeten Strahlungsdosen stärker unterdrückt als bei NK-92 (20, Feld A). Eine Dosis zwischen 500 und 1000 cGy unterdrückte eine Vermehrung der NK-92MI und NK-92CI völlig. Die Thymidin einbauhöhe erreichte ein Plateau von etwa 20% bei den nicht-bestrahlten Kontrollzellen aus NK-92CI und 10% für NK-92MI.
Zur Bestimmung der Lebensfähigkeit wurden NK-92, NK-92MI und NK92-CI-Zellen mit 250, 500, 1000 und 2000 cGy bestrahlt und 24, 48 und 52 Stunden danach in Trypanblau-Exklusion bestimmt. Bei äquivalenten Dosen werden größere Prozentsätze von sowohl NK-92MI als NK-92CI von der Strahlung getötet als bei den Elternzellen; 20, Feld B. Bei allen untersuchten Dosen war die Endlebensfähigkeit von NK92 höher als bei den beiden Transfektanten.
21 zeigt die Zytotoxizität dieser Zellen nach der Bestrahlung. Es wurden Zellen, die mit 0, 1000 und 2000 cGy bestrahlt waren, nach drei Tagen auf ihre Zytotoxizität gegen K562 und Raji-Zellen mit einem Effektor/Target-Verhältnis von 20:1, 10:1, 5:1 und 1:1 untersucht. Die Zytotoxizität der NK-92-Zellen drei Tage nach der Bestrahlung mit 1000 cGy war in der Untersuchung etwa 10 bis 30% gegen K562 (21, Feld A) und 30 bis 50% gegen Raji (21, Feld B). Die Bestrahlung mit 2000 cGy gab eine Zytotoxizität von 1 bis 5% gegen K562 und 3 bis 13% gegen Raji. Dem gegenüber besaß NK-92MI nur eine zytotoxische Wirkung von 0 bis 5% und 0 bis 1% gegen K562 und 0 bis 1% und 0 bis 1% gegen Raji drei Tage nach Bestrahlungsdosen von 1000 bzw. 2000 cGy. NK92-CI hat eine 1- bis 4%-ige Zytotoxizität auf K562 und 2 bis 7% auf Raji drei Tage nach einer Bestrahlung mit 1000 cGy und 0% K562 und 0 bis 2% nach Bestrahlung mit 2000 cGy.
Die hier beschriebenen Daten zeigen, dass IL-2-Transfektanten empfindlicher gegenüber Strahlung sind als ihre Elternzellen. Die Proliferation und Zytotoxizität von NK92 und NK92CI-Zellen war bei niedrigem Strahlungsspiegel gegenüber den Elternstämmen unterdrückt und die strahlungsinduzierte Letalität war viel größer in IL-2-unabhängig modifizierten Zellen in NK92 bei äquivalenten Strahlungsdosen. Der stark IL-2-produzierende NK-92-MI ist auf Strahlung empfindlicher als die nieder IL-2-produzierende NK-92CI-Variante. Wegen der höheren Strahlungssensitivität würde eine niedrigere Bestrahlungshöhe ausreichen, um die Vermehrung adäquat zu regeln, und gleichzeitig die Letalität der Zellen zu minimieren und auch deren Zytotoxizität. Der Fachmann kann die in dem Beispiel beschriebenen Versuche leicht wiederholen. Durch Verwendung geringer Strahlungsdosen im Bereich zwischen 0 und 1000 cGy könnte eine optimale Dosis bestimmt werden, welche die Proliferation inhibiert und gleichzeitig die Lebensfähigkeit sowie die zytolytische Wirkung von NK92-MI und NK92-CI erhält.
Beispiel 20 Transfektion von NK-92 mit einem Gen für Thymidinkinase
Es sind NK-92-Zellen mit einem Vektor zu transfektieren, der das Gen für Thymidinkinase (TK) enthält. Die resultierenden NK-modifizierten NK-92-Zellen sind somit empfindlich gegenüber der toxischen Wirkung von Guanosinanalogen, Gancyclovir und Acyclovir. Es kann ein Vektor für die Transfektion von Säugetierzellen konstruiert werden, bspw. ein retroviraler Vektor mit dem TK-Gen aus Herpes Simplex-Virus (HSV) unter der Kontrolle des HSV-TK-Promotors und dessen eigener polyA-Inhibierungsstelle. Die Transfektion kann nach dem bekannten Verfahren in der Biologie und in der Molekularbiologie von Säugetierzellen erfolgen, bspw. durch Elektroporation (BioRad Gene Pulser^TM) oder durch Lipofektion (Felgner et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413 (1987)). Die so hergestellten transfektierten NK-92-Zellen sind dann empfindlich gegenüber einer Inaktivierung durch die Verabreichung von Gancyclovir oder Acyclovir.
Beispiel 21 Mutation des NK-92 HLA-Zelloberflächenproteins.
Es können NK-92-Zellen aus der von Gong et al. (1994) beschriebenen Zelllinie erhalten werden. Das Chromosom mit dem β₂-Microglobulin-Gen ist zu isolieren und die DNA in diesem Chromosom ist von den Histonen und anderen DNA-Proteinen wegzureinigen. Das Genfragment mit dem β₂-Microglobulin ist dann mit Restriktionsnukleasen auszuschneiden und es kann eine ortsspezifische Mutagenese erfolgen mittels einer Oligonukleotid-Kassette, welche die mutierte Nukleotidsequenz enthält. Diese Verfahren verwenden übliche bekannte Methoden aus der rekombinanten DNA-Technologie, wie beschrieben bspw. in "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al., John Wiley and Sons, New York 1987 und in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Das mutierte β₂-Microglobulin kann dann wieder in die Zell-DNA eingebaut und in NK-92 zurückgeführt werden. Die so hergestellten Zellen werden dann HLA-Oberflächenmoleküle exprimieren mit einem modifizierten β₂-Microglobulin-Rest, der nicht länger in der Lage ist T-Zellrezeptoren zu binden.
Beispiel 22 NK-92-Zellen, die Rezeptoren für eine Krebszelle exprimieren.
Es sind die CTL von einem Krebspatienten durch Differentialzentrifugation zu ernten. Die CTL werden immunoaffinitätsgereinigt und enthalten überwiegend CTL gegen einen Rezeptor auf den Krebszellen des Patienten. Die DNA der erhaltenen CTL-Population ist dann zu isolieren und die Gene für den MHC-Klasse-I-Rezeptor der gegen den Krebs gerichteten CTL, isoliert durch Restriktionsnukleaseverbau, zu isolieren. Die so aufgereinigten Gene werden mit Hilfe einer Kettenpolymerasereaktion amplifiziert und die resultierenden amplifizierten Gene in einen Vektor eingebaut, der für eine konstruktive Expression der Gene in NK-92-Zellen geeignet ist. Die Vektoren werden dann in NK-92-Zellen gebracht und die so modifizierten NK-92-Zellen bspw. über einen Antibiotika-resistenten Marker, der mit dem Vektor eingebracht wurde, selektiert. Die so selektierten Zellen werden zur Erhöhung ihrer Zahl angezüchtet. Sie können dann eingesetzt werden für einen spezifischen Angriff auf Krebszellen des Patienten und den Krebs, der in dem Patienten vorhanden ist, entweder ex vivo oder in vivo behandeln.
Beispiel 23 Verwendung von NK-92-Zellen zum Abtöten von HIV-infizierten Zellen
8E5 ist eine Zelllinie, die HIV enthält und HIV-virale Partikel produziert. 8E5-L ist die mit HIV entsprechend infizierte Zelllinie, die keine Virionen produziert. Es erfolgte ein Versuch zur zytoxischen Wirkung, wobei der Chrom-Freisetzungsassay die Bestimmung der Aktivität eingesetzt wurde. Es wurden die in Tabelle 8 gezeigten Ergebnisse erhalten. In diesen Versuchen sind A3.01-Zellen eine nichtinfizierte Kontrollzelllinie.
Tabelle 8 – Zytotoxische Wirkung von NK-92-Zellen auf HIV-infizierte Zellen
Tabelle 8 ist zu entnehmen, dass 8E5-Zellen, welche HIV-Partikel produzieren, eine höhere zytotoxische Wirkung besitzen als 8E5L-Zellen, die keine HIV-Partikel produzieren, und auch höher als die Kontrollzellen. Ohne an die Theorie gebunden zu sein, wird vermutet, dass die antivirale Wirkung der NK-92-Zellen von der direkten zytotoxischen Wirkung herkommt sowie von einer Inhibierung durch MIP-1α, welches von NK-92-Zellen in hoher Konzentration produziert wird (Bluman et al., J. Clin. Investig. 97, 2722 (1996)). Diese Versuche zeigen, dass NK-92-Zellen wirksam HIV-produzierende Zellen in vitro lysieren können.

Claims

Verwendung eines Mediums, enthaltend NK-92-Zellen, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebses oder Tumoren, wobei die NK-92-Zellen, werden sie einem Patienten verabreicht, die Zellen abtöten, welche der Krebs oder Tumor in vivo enthält.
Verwendung des Mediums nach Anspruch 1, wobei der Krebs und der Tumor ein solider Tumor ist.
Verwendung eines Mediums nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Krebs zugehörig ist zu Melanom, Prostatakrebs, Neuroplastom, kleinzelliger Lungenkrebs oder Brustkrebs.
Verwendung des Mediums nach Anspruch 1, wobei der Krebs ein hämatologischer Krebs ist.
Verwendung eines Mediums nach Anspruch 1 oder 4, wobei der Krebs ist akute und chronische lymphoplastische und myelogene Leukämie, Lymphom oder Myelom.
Verwendung eines Mediums nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Medikament geeignet ist zur Verabreichung in dem Patienten durch intravenöse Infusion, intraperitoneale Injektion, subkutane Injektion oder intratumorale Injektion.
Verwendung des Medium nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Patient ein Mensch ist.