DE69533941T2 - Verfahren zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung des sekundärimmunmangels - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines natürlichen Gemisches von Zytokinen.
  • TECHNISCHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • In den letzten Jahren ist es möglich geworden, das Immunsystem zu modulieren, um seine Antwort zu verbessern und, soweit Bestandteile des Systems nicht funktionsfähig sind, die Funktion des Bestandteils entweder teilweise oder völlig wiederherzustellen. Beispielsweise kann die Transplantation von Knochenmark zum Ersatz von Stammzellen oder zur Bereitstellung fehlender Stammzellen einen schweren kombinierten Immundefekt heilen. Bei einem anderen Beispiel werden Krebspatienten Immunzellen entnommen, behandelt und in den Patienten zurückgeführt, wobei Tumorregression auftritt (Hwu und Rosenberg, 1994a; Hwu und Rosenberg, 1994b). Weiterhin finden Bestandteile des humoralen Immunsystems, wie Gammaglobulin und intravenöses Immunglobulin (IVIG) ausgedehnte therapeutische Anwendung (De Simone et al., 1990; Hall, 1993). Andere Bestandteile des Immunsystems werden ebenfalls als Therapeutika verwendet (Hadden und Smith, 1992; Hadden 1993; Talmadge und Hadden, 1994).
  • Immunmodulatoren sind Verbindungen, die die Immunfunktion verändern oder eine positive oder negative Wirkung auf die Aktivität des Immunsystems haben. Die Verwendung von Immunmodulatoren in der klinischen Medizin umfaßt die Wiederherstellung der Immunfunktion (oder die Korrektur eines Immundefekts) und die Unterdrückung normaler oder übermäßiger Immunfunktion. Eine Hauptklasse der Immunmodulatoren sind die Zytokine. Viele Zytokine sind nun durch die Rekombinati onstechnik für die klinische Anwendung verfügbar geworden. Das Immunsystem ist jedoch komplex und für eine wirksame Veränderung der Immunfunktion ist häufig die Wechselwirkung verschiedener Bestandteile notwendig. Es wäre nützlich, Zubereitungen zu entwerfen, welche die verschiedenen Bestandteile und Wechselwirkungen für eine wirksame Regulation der Immunfunktion bereitstellen.
  • Zytokine sind Peptid/Protein-Immunmodulatoren, die von aktivierten Immunzellen, darunter vom Thymus abgeleitete T-Lymphozyten (T-Zellen), B-Lymphozyten und Monozyten/Makrophagen, hergestellt werden. Zytokine umfassen Interleukine (IL-1 bis IL-15), koloniestimulierende Faktoren (CSFs) für Granulozyten und/oder Makrophagen (CSF-G, CSF-M, CSF-GM), Tumornekrosefaktoren (TNFs α & β) und Interferone (IFN α, β & γ).
  • Interleukin-2 (IL-2) ist ein Lymphokin, das zuerst als T-Zellen-Wachstumsfaktor beschrieben wurde (Morgan et al., 1976). Chemisch ist IL-2 ein Glykoprotein mit 133 Aminosäuren und 15000 Da Molekulargewicht. Es wird von normalen Lymphozyten des peripheren Bluts, von T-Lymphozyten der Mandeln und der Milz und von großen granularen Lymphozyten hergestellt. IL-2 induziert und unterstützt die von durch Antigen oder Mitogen stimulierte Wucherung der T-Zellen. Außer der stimulierenden Wirkung auf T-Lymphozyten ist IL-2 wichtig bei Vorgängen wie Einleitung, Ausdehnung und Regulierung der Immunantwort, Produktion von Gammainterferon (IFNγ), Induktion der lymphokinaktivierten Killerzellen (LAK), Ausbreitung zytolytischer T-Zellen und Vergrößerung der Killeraktivität natürlicher Killerzellen (NK).
  • Rekombinantes IL-2 (rIL-2) ist ein unglykosyliertes Protein, das von der menschlichen cDNA-Sequenz erzeugt wird. Gentechnisch hergestelltes IL-2 kann nach der Beschreibung durch Taniguchi et al. (1983) und Devos (1983) und in den US-Patenten 4,604,327 und 4,569,790 erhalten werden. Ein rIL-2-Mutein, bei dem das Cystein in Position 125 des Wildtyps oder nativen Moleküls durch eine neutrale Aminosäure wie Alanin oder Serin ersetzt ist, kann erhalten werden wie in US-Patent 4,518,569 (Mark et al.) beschrieben.
  • Ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung von rIL-2 zu klinischer Reinheit kann, wie auch die Isolierung nativen IL-2 aus gezüchteten T-Zellen, im US 4,569,790 (Koths et al.) gefunden werden. Verfahren zur Herstellung von nativem IL-2 sind auch in den US 4,390,623 ; 4,454,355 und 4,448,879 zu finden. Thurman et al. (1986) offenbaren, daß verschiedene Zubereitungen von teilweise gereinigtem natürlichem IL-2 (nIL-2) und rIL-2-Zubereitungen bei verschiedenen biologischen Assays in ihrer Aktivität wesentlich voneinander abwichen.
  • Verschieden einzelne, sowohl natürliche als rekombinante, Zytokine wurden bei der Behandlung von Krebs und anderen Erkrankungen untersucht. Beispielsweise ist rekombinantes Interferon α2 (rIFN α2) von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung von Haarzell-Leukämie, Kaposi-Sarkom, Feigwarzen (condyloma accumenata) und chronischer Hepatitis zugelassen. Natürliche IFN α als Gemisch (Alferon®) der zwanzig oder mehr von Leukozyten produzierten sind für Feigwarzen erlaubt. Rekombinantes IFN-γ (rIFN-γ) ist für septische Granulomatose erlaubt. rIL-2 ist für Nierenzellkrebs erlaubt. Diese und andere rILs und rIFNs sind in aktiver Prüfung bei einer Vielzahl von Krankheiten, darunter mehrere Krebsformen.
  • Außerdem wurde die Krebstherapie mit rIL-2 in vielen Krankenhäusern und Forschungszentren weiterentwickelt. Rosenberg und Kollegen (Rosenberg et al., 1985; Mule und Rosenberg, 1987; Rosenberg, 1988; Belldegrun und Rosenberg, 1989; Chang und Rosenberg, 1989; Rosenberg, 1994) haben die Verwendung von systematisch verabreichtem rIL-2 bei der Immuntherapie von Patienten mit Nierenzellkrebs und malignem Melanom berichtet. Cortesina et al. (1988, 1994) beschrieben die Wirkungen loko-regionärer Injektionen von natürlichem und rIL-2 bei Patienten mit Krebs des Kopfs und Halses und fanden, daß natürliches IL-2 wirksamer für die Tumorregression ist. Patienten, denen große Dosen von rIL-2 gegeben wurden, erlitten lebensbedrohliche Vergiftungen (Rosenberg et al., 1994).
  • Entwicklung und Erhältlichkeit von gentechnisch hergestellten (rekombinanten) Immunmodulatoren im Handel hat die Prüfung dieser Wirkstoffe in der Krebsklinik beschleunigt. Die beschränkte Wirksamkeit und die mit hohen Dosen verbundene beträchtliche Toxizität von rIL-2, rIFN-γ, rTNF-α und anderen Monotherapien legt nahe, in den therapeutischen Strategien natürliche Kombinationen von Zytokinen wieder in Betracht zu ziehen. Außerdem wurde über hundert verschiedene Zytokin-Aktivitäten identifiziert, was erheblichen Zweifel darüber aufkommen läßt, ob die auf der Kombination von rekombinanten Zytokinen beruhende Immuntherapie in der nahen Zukunft eine vernünftige Erfolgswahrscheinlichkeit in der Krebsklinik hat.
  • Während beispielsweise IL-2 als ein T-Zellwachstumsfaktor die Wucherung der T-Lymphozyten anregen kann, werden eine Anzahl anderer Faktoren, darunter Interleukine und Thymuspeptide, im Thymus hergestellt und ebenfalls als notwendig für Entwicklung und Funktion der T-Zellen angesehen (Hadden, 1992).
  • Der Anmelder konnte zeigen, daß eine uncharakterisierte Zubereitung, bezeichnet als natürliche Interleukin-Zubereitung (NI), die Entwicklung von T-Lymphozyten fördert. Diese uncharakterisierte gemischte Zubereitung (auch als Buffy coat-Interleukin, BC-IL, bezeichnet) regte die Wucherung von Prothymozyten, unreifen und reifen Thymozyten in vitro wirksamer als eine äquivalente Konzentration von rIL-2 an (Hadden et al., 1989). Diese NI-Zubereitung steigerte die Entwicklung von T-Lymphozyten in neugeborenen Mäusen, während rIL-2 inaktiv war (Hadden et al., 1989). Außerdem steigerte diese NI-Zubereitung die Entwicklung und Funktion von T-Lymphozyten in gealterten, mit Hydrokortison behandelten Mäusen, während rIL-2 in äquivalenten Dosen inaktiv war (Hadden et al., 1992). Weiter verlängerte eine uncharakterisierte NI-Mischung in niedriger Dosis das Leben von Mäusen mit malignem Melanom; rIL-2 in äquivalenten Dosen war inaktiv (Kameda et al., 1992). Diese Befunde zeigen, daß natürliche Interleukingemische eine Aktivität haben, die von IL-2 nicht bereitgestellt wird.
  • Versuche zur Korrektur von Defekten der T-Lymphozyten wurden experimentell in mehreren Milieus unternommen, darunter Verarmung der T-Lymphozyten (Lymphopenie) und Fehlfunktion der T-Lymphozyten (Anergie), wie sie im Alter, bei Krebs, AIDS und anderen Immundefekten vorkommen. Beispielsweise wurden rIL-2 und Thymuspeptide bei AIDS (HIV)-Virusinfektion mit wechselnden Ergebnissen angewendet (Hadden, 1991). Es wurde gezeigt, daß hohe Dosierung von rIL-2 durch kontinuierliche Infusion die Zahl der T-Lymphozyten im Blut von Patienten mit HIV-Infektion vorübergehend erhöht, jedoch bei beträchtlicher Toxizität (Lane und Fauci, 1985). Pegyliertes rIL-2 bei einer und drei Millionen Einheiten ergab weniger Toxizität aber nur geringe Wirkung auf die Lymphozytenzahl bei Menschen mit HIV-Infektion (Merigan, 1993). Eine NI-Zubereitung steigerte die T-Lymphozytenzahl bei Krebspatienten mit Lymphopenie beträchtlich ohne Toxizität (Hadden et al., 1994). Diese Befunde zeigen, daß natürliche Interleuki ne beim Menschen in geringen Dosen eine Erhöhung der T-Zellen ohne Toxizität bewirken und daß rIL-2, obwohl in hohen Dosen wirksam, für die medizinische Anwendung zu toxisch ist. Die Befunde stützen auch die Fortschreibung der Daten von Mäusen auf Menschen.
  • Obenstehendes legt nahe, daß die Verwendung von Zubereitungen natürlich vorkommender Zytokine zur Beeinflussung des Immunsystems bei geringerer Toxizität wirksamer sein könnte. Die gegenwärtig erhältlichen Zubereitungen sind jedoch nicht gut charakterisiert und mühsam herzustellen, wie unten beschrieben wird. Um das Immunsystem reproduzierbar zu verändern wäre es nützlich, gut charakterisierte und von Serum und Mitogen freie Zytokin-Zubereitungen zu haben, die leicht und billig herstellbar sind und aus denen eine reproduzierbare Zubereitung mit geringer Toxizität für die klinische Anwendung gebildet werden kann.
  • US 4,985,241 (Zimmermann et al.) offenbart die Verwendung eines rekombinanten Lymphokins oder Zytokins in Kombination mit einem biologischen Modifizierer, wie einem Radikalfänger oder einem Stoffwechselhemmer, zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von biologischen Schäden, die Säugetierwirte durch Erzeugung freier Radikale erleiden, legt aber die Herstellung einer definierten Mischung natürlich vorkommender Zytokine nicht nahe.
  • Es wäre daher nützlich, eine natürliche Mischung von Zytokinen (NCM) aus Lymphozyten herzustellen, die bei der Behandlung von Erkrankungen und anderen Zuständen therapeutisch anwendbar ist, die eine verminderte Funktion, Entwicklung und Zahl von T-Lymphozyten einschließen, d. h. des zellulären Immundefekts. Um therapeutisch verwendbar zu sein, muß das NCM steril, frei von Endotoxin, Serum, Mitogen, Viren und DNA sein, um Reaktionen der Empfänger zu vermeiden. Die Molekularsiebtechnik kann viele dieser Verunreinigungen entfernen. Je mehr Verfahrensstufen zur Herstellung notwendig sind, desto höher sind jedoch die Kosten. Außerdem ist die Ausbeute um so niedriger und die Möglichkeit der Verunreinigung um so höher, je mehr Handhabungsschritte erforderlich sind. Wenn daher das NCM so hergestellt werden kann, daß diese Verunreinigungen minimiert oder eliminiert werden, wird die Herstellung um so kostengünstiger sein.
  • Die in den oben beschriebenen Untersuchungen angewendete NI-Zubereitung war serumfrei und mitogenfrei, mußte aber vor der Verwendung zehnfach konzentriert werden.
  • Natürliches Interleukin-2, hergestellt nach der Lehre der US 4,390,623 und 4,464,355 , wird in serumfreien Medien erzeugt und erfordert dadurch keine Schritte zur Entfernung von Serumproteinen. Die Zubereitung wird als serumfreies, mitogenfreies, natürliches Interleukin-2 beschrieben, das gegenüber Krebs aktiv ist. Dieses Material wurde erzeugt, indem die Zellen dem Mitogen nur kurz ausgesetzt wurden (eine Impulstechnik), erstmals von Hadden et al., (1970), beschrieben.
  • Die Impulstechnik wird angewendet, um Lymphozyten in Gewebekultur zu stimulieren, ohne daß das Mitogen im Medium vorhanden ist, wenn dieses abgeerntet wird. Die Zellen werden anfangs zwei Stunden in Gegenwart eines Mitogens in serumfreiem Medium gezüchtet. Nach dieser Inkubation werden die Zellen wieder isoliert und dreimal mit Medium gewaschen, das kein Mitogen enthält und dann mit geringer Dichte in frischer Gewebekultur in serumfreiem Medium ohne Mitogen wieder suspendiert. Hinsichtlich anderer Bestandteile als IL-2 war die Zubereitung uncharakterisiert.
  • US 4,448,879 (Fabricius et al.) lehrt ebenfalls ein Zellkulturverfahren zur Herstellung eines natürlichen serumfreien und mitogenfreien IL-2. Das Verfahren verwendet Buffy coat-Zellen in einem "roller culture"-System oder in einem System, welches das Medium mechanisch zirkulieren läßt. Das Verfahren erfordert jedoch immer noch einen Schritt, in dem die Zellen von Mitogen und Serum freigewaschen und dann in serumfreiem, mitogenfreiem Medium rekultiviert werden. Wichtig ist, daß die beschriebenen Verfahren zur Anregung der Zellen nur wenig effektiv sind und geringe Ausbeuten von IL-2 erzeugen. Die großen benötigten Mengen sind teuer, erfordern ausgedehnte erfahrene Handhabung und müssen vor der Verwendung konzentriert werden, was zu Aktivitätsverlust (etwa 50%) führt.
  • Martorell et al. (1987) stellen ein Verfahren zur Einleitung der Mitogenese bei fortdauernder Anwesenheit von Mitogen in serumhaltigem Medium bereit. In ihrem Verfahren ist die Ausbeute an IL-2 extrem gering und erfordert die Anwesenheit von Serum.
  • Es wäre nützlich, ein Verfahren zu haben, welches keinen Schritt umfaßt, in dem die Zellen serum- und mitogenfrei gewaschen werden und welches keine teuere Ausrüstung erfordert.
  • In den oben beschriebenen Systemen sind die Mitogene allgemein Pflanzenlektine wie Phytohämagglutinin (PHA) und Concanavalin A (Con A), die eine Affinität für den Antigenrezeptor der T-Lymphozyten (TCR) (Chilson und Kelly-Chilson, 1989) und eine mitogene Wirkung auf die T-Lymphozyten haben. Setzt man T-Lymphozyten solchen Lektinen aus, dann wird die Produktion natürlicher Zytokine angeregt. Enthält das Kulturmedium kein Serum, werden allgemein nur geringe Mengen an Zytokinen, speziell Interleukinen, erzeugt. Beispielsweise findet man unter serumfreien Kulturbedingungen IL-2 allgemein nur im Bereich von 0–20 Einheiten/ml ( US 4,390,623 und 4,464,355 ). Mit Serum ist der Bereich der IL-2-Produktion allgemein 10 oder mehr Einheiten/ml.
  • Es wäre nützlich, Lymphozyten zur Produktion von Zytokinen wie IL-2 in großen Mengen und in Abwesenheit von Serum anzuregen, so daß die Mischung wirkungsvoller als therapeutischer Wirkstoff verwendet werden kann, und ohne den zusätzlichen ausbeutemindernden Schritt des Waschens der Zellen nach Impulsexposition mit Mitogen oder die Verwendung spezialisierter Geräte zur Konzentrierung der Zubereitung mit dem damit verbundenen Aktivitätsverlust.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG UND DER VORTEILE
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges Verfahren zur Herstellung eines natürlichen Zytokingemischs durch die Schritte der Immobilisierung von mindestens einem Mitogen in einem Gewebekulturgefäß bereit. Eine isolierte Lymphozytenpopulation, die frei von Neutrophilen und Erythrozyten ist, wird in einem serumfreien Medium suspendiert und in das Gefäß eingebracht. Die Lymphozyten werden kultiviert, das mitogen- und serumfreie Medium wird entfernt und nach der Ausbeute an Zytokinen charakterisiert.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden leicht erkennbar, weil sie mit Bezug auf die folgende eingehende Beschreibung besser verstanden wird, wenn sie in Verbindung mit den beigegebenen Zeichnungen betrachtet wird, in denen:
  • 1 ein Säulendiagramm ist, das den Gehalt an ILs (ausgedrückt als optische Dichte von IL-2 (IL2), gemessen mit ELISA) von NCM in X vivo-10 (EX10), X vivo-15 (EX15), X vivo- 20 (EX20) und minimalem essentiellem Medium (MEM) zeigt und die kontinuierliche Exposition (offene Säule) mit der Impulsexposition (schraffiert) mit dem Mitogen PHA vergleicht;
  • 2 ein Säulendiagramm ist, das den Einfluß der Zellenkonzentration auf die NCM-Erzeugung mit PHA bei 1 μg/ml in verschiedenen Medien zeigt; 1 × 106 Zellen/ml (kreuzschraffiert), 2,5 × 106 Zellen/ml (schraffiert) und 5 × 106 Zellen/ml (offene Säule);
  • 3 ein Säulendiagramm ist, das den Einfluß der Zellkonzentration auf die NCM-Erzeugung mit PHA bei 2 μg/ml in verschiedenen Medien zeigt; 1 × 106 Zellen/ml (kreuzschraffiert), 2,5 × 106 Zellen/ml (schraffiert) und 5 × 106 Zellen/ml (offene Säule);
  • 4 ein Dosis-Antwort-Diagramm ist, das den Einfluß einer in vitro-Behandlung von Milzzellen naiver Mäuse mit NCM (durchgezogene Linie) im Vergleich zu rekombinantem IL-2 (gestrichelte Linie) auf die Inkorporierung von Thymidin (Anregung mit ConA) bei äquivalenten Konzentrationen von IL-2 zeigt;
  • 5 ein Dosis-Antwort-Diagramm ist, das den Einfluß einer in vitro-Behandlung von Milzzellen naiver Mäuse mit NCM (durchgezogene Linie) im Vergleich zu rekombinantem IL-2 (gestrichelte Linie) auf die Inkorporierung von Thymidin bei äquivalenten Konzentrationen von IL-2 zeigt;
  • 6 ein Säulendiagramm der in vitro-Antworten von Milzzellen auf rIL-1 (offene Säule), rIL-2 (dicht schraffiert), NCM (kreuzschraffiert) und Concanavalin A (weit schraffiert) nach in vivo-Behandlung mit rIL-1, rIL-2, rIL-1 + rIL-2 oder NCM ist;
  • 7 ein Säulendiagramm der in vitro-Antworten von Thymozyten auf rIL-1, rIL-2, NCM und ConA nach in vivo-Behandlung wie in 6 ist;
  • 8 ein Säulendiagramm ist, das den Einfluß einer in vivo-Behandlung von Mäusen mit Vergleichssubstanz (offene Säule) oder NCM (dicht schraffierte Säule) auf Milzzellenmarker für die Zellen CD4+, CD8+ und CD4–/CD8– (––) zeigt;
  • 9 ein Säulendiagramm ist, das den Einfluß einer in vivo-Behandlung von Mäusen mit Vergleichssubstanz (offene Säule) oder NCM (dicht schraffierte Säule) auf Thymozytenmarker für die Zellen CD4–/CD8– (––), CD4+/CD8+ (++) und CD8+ und CD4+ (CD4 + CD8) zeigt;
  • 10 ein Säulendiagramm der in vitro-Antworten von Thymozyten auf IL-1, IL-2 und NCM nach in vivo-Behandlung mit Vergleichsmedium (offene Säule) und NCM (dicht schraffierte Säule) ist;
  • 11 ein Säulendiagramm der Antworten von Milzzellen wie in 10 ist;
  • 12 ein Säulendiagramm der in vitro-Antworten von Thymozyten auf ConA und PHA nach in vivo-Behandlung mit Vergleichsmedium (offene Säule) und NCM (dicht schraffierte Säule) ist und
  • 13 ein Säulendiagramm der Antworten von Milzzellen wie in 12 ist.
  • EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur reproduzierbaren Herstellung eines charakterisierten Gemischs natürlicher Zytokine (NCM), d. h. eines Überstands einer Zellkultur mit einer Mehrzahl von Zytokinen, bereit.
  • Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Zytokingemischs werden vermischte (pooled) Lymphozyten von mehreren HIV-negativen, hepatitisvirusnegativen Spendern, allgemein aus dem Buffy coat, verwendet, die frei von Neutrophilen und Erythrozyten sind. Die Verwendung mehrerer Spender nutzt den Vorteil der gemischten, Lymphozytenantwort (MLR) aus. In einer bevorzugten Ausführungsform wurden auch zur Erzeugung der Mischung jedesmal bis zu fünfzig Spender benutzt, um sicherzustellen, daß die MLR für jede Zubereitung konstant ist, und um Schwankungen auszugleichen.
  • In einer alternativen Ausführungsform wurden autologe Lymphozyten zur Erzeugung des NCM verwendet. In diesen Fällen brauchte der Patient nicht virusfrei zu sein. Wenn autologe Lymphozyten verwendet werden, können sie auch nach Bedarf in den Patienten zurückgegeben werden. In einer alternativen Ausführungsform könnten Tiere die Zellquelle für tiermedizinische Anwendungen sein.
  • Die Lymphozyten werden in Gegenwart von immobilisierten Mitogenen in einem Gewebekulturgefäß kultiviert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mitogen auf oberflächenaktivierten Zellkulturkolben für die Auswahl von Zellsubgruppen (AIS microCELLectorTM T-25 plates) nach Beschreibung in den Anweisungen des Herstellers immobilisiert. Jedoch können andere Immobilisierungsverfahren für Mitogene auf der Oberfläche des Kulturgefäßes angewendet werden, wie Verfahren unter Einschluß anderer "Auswasch"-("panning")-Techniken o der Kupplung an Sepharose 4B-Perlen, wie sie in der Technik der Zellisolation bekannt sind. Die Anwendung der Immobilisierung von Zellen zur Selektion ist bekannt, jedoch ist die Anwendung zur Erzeugung von Zytokinen neu.
  • Die Mitogene werden allgemein aus Lektinen und monoklonalen Antikörpern ausgewählt, die Lymphozyten zur Produktion von Zytokinen anregen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Phytohämagglutinin (PHA) oder OKT3 (Orthoclone®, Ortho Pharmaceuticals) verwendet. Andere Lektine wie Concanavalin A (Con A) oder Pokeweed-Mitogen, die B-Zellen anregen, können verwendet werden. Monoklonale Antikörper für T-Zellrezeptoren wie CD2, CD28, CD45, können als Mitogene verwendet werden und sind wirksam. Anti-CD28 und -CD45-Antikörper wurden als Supererzeuger von IL-2 beschrieben (Deans et al., 1989; und June et al., 1989). Antilymphozytenglobulin (ALG) hat ebenfalls mitogene Aktivität bei T-Zellen. Außerdem können Kombinationen von Mitogenen verwendet werden, um eine Kombination von Lymphozyten-Subpopulationen zu aktivieren. In der bevorzugen Ausführungsform wird PHA verwendet und mit einer Anfangskonzentration von etwa 25 μg/ml aufgetragen.
  • Die Lymphozyten werden in einem serumfreien Medium 24–48 h bei kontinuierlicher Einwirkung des Mitogens, d. h. ohne Waschen, inkubiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Medium entweder X vivo-10 oder X vivo-15 (Whittaker). Dies ist ein serumfreies und von der FDA zugelassenes Medium für IL-2/LAK-Infusionen bei Patienten, wie in der Herstellerbroschüre ausgeführt. Es können auch serumfreie Medien, die die Wucherung menschlicher Lymphozyten unterstützen, wie RPMI-1640 (Sigma), verwendet werden.
  • Das Medium enthält auch ein 4-Aminochinolon-Antibiotikum. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Antibiotikum Ciprofloxacin. Das Antibiotikum dient der Aufrechterhaltung der Sterilität und der Hyperproduktion von Lymphokinen. Über Ciprofloxacin und verwandte Antibiotika wurde berichtet, daß sie in Gegenwart von löslichem Mitogen und Serum IL-2 und andere Zytokine erhöhen (Riesenbeck et al., 1994). Sie wurden noch nicht als wirksam in Abwesenheit von Serum beschrieben. Ihre Verwendung mit immobilisierten Mitogenen ist ebenfalls neu. In der bevorzugten Ausführungsform wird Ciprofloxacin in einer Konzentration von etwa 20 bis etwa 200 μg/ml und, mehr bevorzugt, etwa 80 μg/ml angewendet.
  • Der Überstand wird entfernt und ist die Quelle des erfindungsgemäßen natürlichen Zytokingemisches (NCM). Wie in Beispiel 1 gezeigt, ist der Überstand frei von Mitogen und braucht für Untersuchungen an Tieren und Menschen nicht konzentriert zu werden.
  • Zur Stabilisierung des NCM im Überstand kann humanes Serumalbumin (HSA) zugefügt werden. HSA wird anstatt eines Serumalbumins nicht-humaner Herkunft verwendet, weil es für Anwendung beim Menschen von der FDA genehmigt ist.
  • Unter Benutzung der folgenden Assays wird ein Zytokinprofil des Überstands aufgestellt. Der Gehalt an Interleukin (IL) der Überstände wird durch Bioassay für IL-2 und mit ELISA für die anderen Interleukine, CSFs, TNFs und IFNs festgestellt. Die Sterilität wird geprüft und Endotoxin durch Limuluslysat-Assay gemessen. Die folgenden Assays und Testsätze werden in einer bevorzugten Ausführungsform speziell verwendet: INF-γ-ELISA (ENDOGEN), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, GM-CSF, G-CSF und TNF-α ELISAs (R & D Systems). Der IL-2-Bioassay erfolgt nach dem Verfahren von Gillis et al. (1978) und wird in Einheiten/ml im Vergleich zu einem bekannten Standard für IL-2 (Schiapparelli Biosystems, Inc. Fairfield, NJ) ausgedrückt.
  • In der bevorzugten Ausführungsform, bei der PHA als Mitogen verwendet wird, hat der Überstand folgendes Profil:
    ZYTOKIN MENGE
    IL-1 10–2000 pg/ml
    IL-2 100–500 Einheiten/ml
    IL-6 250–10000 pg/ml
    IL-8 12000–100000 pg/ml
    IL-12 100–10000 pg/ml
    IFN-γ 50–15000 pg/ml
    TNF-α 50–15000 pg/ml
    CSF-G 50–1500 pg/ml
    CSF-GM 10–1500 pg/ml
    IL-3/IL-4/IL-7 Spuren
  • Die Immobilisierung des Mitogens erzeugt eine höhere Ausbeute an NCM als die Impulstechnik nach dem Stand der Technik.
  • Beispielsweise ergab die Impulstechnik mit PHA in serumfreiem Medium IL-2 bei 0–20 Einheiten/ml des Mediums ( US 4,390,623 und 4,464,355 ).
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht dagegen eine gesteigerte Produktion mit einer Impulstechnik durch Zugabe eines 4-Aminochinolon-Antibiotikums zum serumfreien Medium, um Interleukin zu hyperinduzieren, wobei die Ausbeute an IL-2 etwa 8–140 Einheiten/ml ist. Wie von den oben zitierten Tierstudien vorausgesagt, erhöhte diese Zubereitung, charakterisiert als natürliches Interleukingemisch (NIM), mit 200 Einheiten IL-2 je Dosis die Anzahl der T-Lymphozyten im Blut von Lymphopeniepatienten mit Krebs des Kopfes und Halses (Hadden et al., 1994), was bei einer so geringen Dosis für rIL-2 nicht bekannt war. Ähnliche Wirkungen von IL-2 wurden nur mit Dosen berichtet, die mehr als 5000 mal größer als die Menge des IL-2 im NCM waren. Daher ist es wichtig zu bemerken, daß die dem NCM äquivalente Dosis des IL-2 nur als Wirksamkeitsindex verwendet wird und nicht bedeuten soll, daß die gesamte biologische Aktivität des NCM nur die des IL-2 ist.
  • Bei der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform unter Anwendung kontinuierlicher Einwirkung von Mitogen durch Im mobilisierung und die Anwesenheit eines 4-Aminochinolon-Antibiotikums enthält das allgemein erzeugte NCM IL-2 mit 100–353 Einheiten/ml (ein Wirksamkeitsindex der Zubereitung). Bei der weniger bevorzugten Form kann die Erfindung mit der kontinuierlichen Anwesenheit von 4-AminochinolonAntibiotikum und gepulster Anwesenheit des Mitogens ausgeführt werden, wobei NIM erzeugt wird. Diese Kombination erzeugt eine Menge an Zytokinen, die größer als nach dem Stand der Technik nur mit gepulstem Mitogen ist, zeigt aber nicht die Mengen, die bei der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform (NCM): kontinuierlich immobilisiertes Mitogen und 4-Aminochinolon-Antibiotikum, auftreten. Die bevorzugte Ausführungsform ist in dieser Situation gekennzeichnet durch die Wirksamkeit der Zytokinzusammensetzung, die keine Aufkonzentration mit Verlust biologischer Aktivität erfordert. Die bevorzugte Ausführungsform hat bei gleicher äquivalenter IL-2-Dosis die gleiche biologische Aktivität wie die weniger bevorzugte Ausführungsform (NIM oder NI) (siehe Hadden et al. (1992) und die gleichzeitig anhängige Anmeldung des gleichen Anmelders, eingereicht am selben Tag wie die vorliegende Anmeldung und auf den Rechtsnachfolger der vorliegenden Anmeldung übertragen).
  • Die Herstellung von Gemischen natürlicher Zytokine durch mit PHA angeregte Lymphozyten ist repräsentativ für Pflanzenlektine mit Affinität für den T-Lymphozyten-Antigenrezeptor (TCR). Ein anderes solches Stimulans ist Concanavalin A (Con A). Man würde gleichermaßen erwarten, daß es unter diesen Bedingungen hohe Mengen an Interleukinen hervorruft. Die Herstellung von Gemischen natürlicher Zytokine durch einen monoklonalen Antikörper wie OKT-3, der an Oberflächenrezeptoren von T-Lymphozyten bindet, die mit dem TCR, d. h. dem CD3-Komplex, verwandt sind, ist repräsentativ für andere monoklonale Antikörper für solche Rezeptoren wie CD2, CD28, CD45, und man würde ebenso erwarten, daß sie unter diesen Bedingungen hohe Mengen von Zytokinen hervorrufen. Zur Bereitstellung eines Gemischs natürlicher Zytokine können auch andere Mitogene, die B-Zellen oder Monozyten anregen, in Kombination mit Mitogenen, die T-Zellen stimulieren, verwendet werden.
  • Es wird erwartet, daß Kombinationen dieser Stimulanzien additive Wirkung haben, wie in Tabelle III für IL-1 und IL-2 zu sehen.
  • Die hier enthaltene Beobachtung, daß das mittels PHA erzeugte NCM reich an IL-1, IL-2, IFN-γ ist, auch IL-12 (323 pg/ml) enthält und nur Spuren an IL-3, IL-4 und IL-7 aufweist, deutet darauf hin, daß PHA unter diesen Bedingungen vorzugsweise T-Helferzellen Typ I (TH-1) gegenüber T-Helferzellen Typ II anregt. Dies ermöglicht die Feststellung, daß diese Lymphokinzubereitungen eine begleitende Aktivität zur Steigerung der zellulären Immunantwort haben (siehe Hadden, 1994). Die Herstellung von NCM mit immobilisierten Mitogenen kann mit T-Zell-Subgruppen (CD4, CD8, CD30, TH-1, TH-2 usw.) unter Verwendung der geeigneten Platten für die Zellseparation benutzt werden, indem vor der Anregung mit PHA oder anderen Mitogenen separiert wird, um NCM zu erhalten, die mit für diese Zelltypen spezifischen Zytokinen angereichert sind.
  • Das NCM wird in Aliquote geteilt und bei 4°C oder darunter gelagert, um seine biologische Aktivität zu erhalten.
  • Das natürliche Zytokingemisch kann einem Säugetierwirt, bevorzugt menschlich, verabreicht werden, hat ein spezifisches Zytokinprofil und im allgemeinen etwa 200–500 Einheiten IL-2 je Dosis für Menschen.
  • Patienten, die diese Behandlung erhalten sollen, sind solche mit diagnostizierten zellulären Immundefekten, entweder für sich oder in Kombination mit anderen Krankheitszuständen. T-Zellenfunktion und -menge im Blut des Patienten werden in bekannter Weise geprüft und, wenn sie unter normal sind, kommt der Patient für die Behandlung in Frage, da er einen zellulären Immundefekt hat und die vorliegende Erfindung zur spezifischen Behandlung der T-Zellabnormität ausgestaltet ist. Wichtig zu bemerken ist, daß T-Zell-Lymphopenie nicht nur den zellulären Immundefekt bei Erkrankungen wie Krebs und AIDS widerspiegelt, sondern auch ein Vorzeichen für das Sterben bei älteren Männern ohne Krankheit ist (Bender et al., 1986).
  • Nach guter medizinischer Praxis wird das NCM mit geringen Dosen (200–500 Einheiten) IL-2-Äquivalent verabreicht, wobei der klinische Zustand des einzelnen Patienten, die Stelle und das Verfahren der Verabreichung, die Planung der Verabreichung und andere, dem medizinischen Praktiker bekannte Faktoren berücksichtigt werden. Die "wirksame Menge" ist daher für den Zweck hier durch bekannte Überlegungen bestimmt. Es ist wichtig, keine hohen Dosen (> 1000 Einheiten/Dosis) anzuwenden, da die Wirkung verlorengeht und die Toxizität ansteigt. Die Menge muß wirksam für das Auftreten von Verbesserungen der Immunfunktion bei 25% der behandelten Patienten sein, einschließend ohne Beschränkung verbesserte Antworten bei in vitro-Messungen der zellulären Immunfunktion, erhöhten T-Lymphozytenzahlen in vivo, verbesserte Reaktion beim Hauttest auf Erinnerung an Antigene und NCM, verbesserte Überlebensrate, schnellere Genesung oder Verbesserung o der Verschwinden von Symptomen und bei Krebs Reduktion der Tumormasse. NCM kann mit anderen Behandlungen zur Verbesserung der Immunfunktion und zur Krebsbehandlung angewendet werden. Beispiele für die klinische Verwendung von NCM oder NIM sind für Krebs des Kopfes und des Halses von Hadden et al., (1994) angeführt.
  • Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann das NCM auf verschiedene Weise verabreicht werden. Es sei bemerkt, daß NCM allein oder in Kombination mit pharmazeutisch zulässigen Trägern verabreicht werden kann. Es kann subkutan oder parenteral verabreicht werden einschließlich intravenöser, intraarterieller, intramuskulärer, intraperitonealer, perilymphatischer, intralymphatischer und intranasaler Verabreichung. Wenn möglich ist topische Verabreichung bevorzugt. Implantate oder Infusionen der Verbindungen sind ebenfalls brauchbar. Anleitung erhält man bei Hadden et al. (1990) und Hadden et al. (1994).
  • Zur parenteralen Verabreichung bei Menschen wird die vorliegende Erfindung im allgemeinen in Einheitsdosen in injizierbarer Form formuliert, bevorzugt in einem pharmazeutisch zulässigen Trägermedium, in bevorzugter Ausführungsform X vivo-10-Medium. Geeignete Trägermedien können, auch ohne Beschränkung darauf, umfassen: Kochsalzlösung, Squalen, Dextroselösung, normales Serumalbumin, Ringerlösung und dergleichen. Optional können geringe Mengen von Zusätzen, wie beispielsweise Stabilisatoren, Konservierungsmittel oder Puffer in einen solchen Träger eingeschlossen werden. Eine solche Rezeptur ist zur Rekonstruktion in wäßrigen Injektionen zur parenteralen Verabreichung geeignet. Typischerweise wird das Gemisch im Trägermedium mit einer Konzentration von etwa 50 bis 500 Einheiten IL-2-Äquivalent/ml, bevorzugt etwa 150–350 Einheiten IL-2-Äquivalent/ml, formuliert. Auch hat das Gemisch ein konsistentes Profil der anderen Zytokine, wie für die vorliegende Erfindung ausgeführt.
  • Optional kann das NCM in eine sterile, stabile, gefriergetrocknete Form gebracht werden, bei der die aktiven Bestandteile mit einem wasserlöslichen Träger und ggf. Stabilisator oder nichttoxischen Konservierungsmitteln vermischt sind. Diese verschiedenden Zusätze, welche die Stabilität, Sterilität und Isotonie der Zusammensetzungen verbessern, einschließlich von antimikrobialen Konservierungsmitteln, Antioxidantien, Komplexbildnern und Puffern, können zugesetzt werden. Die Einwirkung von Mikroorganismen kann sicher ver hindert werden durch Gegenwart von Ciprofloxacin und durch verschiedene antibakterielle und fungizide Wirkstoffe, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure und dergleichen. In vielen Fällen ist es erwünscht, isotonische Wirkstoffe einzuschließen, beispielsweise Zucker, Natriumchlorid und dergleichen. Eine verlängerte Aufnahme der injizierbaren pharmazeutischen Form kann durch Verwendung von Wirkstoffen, welche die Aufnahme verzögern, bewirkt werden, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine. Erfindungsgemäß muß jedoch jeder verwendete Träger, Verdünner oder Zusatz oder jedes Zuführungsmedium mit dem NCM kompatibel sein und darf die erfindungsgemäße biologische Aktivität nicht verändern.
  • Dosis und Dosierungsplan hängen hauptsächlich von dem einzelnen zu behandelnden Patienten, der Krankengeschichte des Patienten, dem Typ und Ausmaß des biologischen Schadens beim Patienten, der Behandlungsdauer und dem Behandlungsverfahren ab. Die Dosen können Einzeldosen oder Mehrfachdosen über einen Zeitraum von mehreren Tagen sein. Meist bevorzugt sind Dosen, die maximale Regression der Krankheit bei Krebs oder maximale Reduktion der Symptome bei anderen Krankheitszuständen erzielen. Es sei angemerkt, daß Menschen gewöhnlich länger als die hier beispielhaften Mäuse behandelt werden, wobei die Behandlung eine Dauer proportional zur Dauer des Krankheitsprozesses und der Wirksamkeit des Wirkstoffs hat.
  • Eine pharmakologische Rezeptur des NCM kann dem Patienten als injizierbare Rezeptur verabreicht werden, die einen kompatiblen Träger enthält, wie verschieden Trägermedien, Begleitstoffe, Zusätze und Verdünner; oder die erfindungsgemäß benutzten Verbindungen können parenteral in Form von subkutanen Depotimplantaten oder Systemen mit gezielter Abgabe, wie Infusionspumpen, Polymermatrizen, Liposomen und Mikrosphären verabreicht werden. Ein erfindungsgemäß geeignetes Implantat kann die Form einer Pille annehmen, die sich nach Implantation langsam auflöst, oder eines dem Fachmann bekannten biokompatiblen Abgabemoduls. Solche bekannten Dosierungsformen und -module sind so gestaltet, daß die aktiven Bestandteile langsam über einen Zeitraum von mehreren Tagen bis zu mehreren Wochen freigesetzt werden.
  • Beispielsweise kann man sich bei solchen Depotformen von Infusionsabgabesystemen vorstellen, daß sie bei Lungen- und Speiseröhrenkrebs eingesetzt werden, so daß sie das hier beschriebene NCM an die regionalen Lymphknoten in der Nachbarschaft des Krebses abgeben. Für andere Krebse können ähnliche regionale Abgabetechniken angewendet.
  • Beispiele bekannter Implantate und erfindungsgemäß brauchbarer Module umfassen: US 4,487,603 , das eine implantierbare Mikroinfusionspumpe zur Abgabe von Arzneimitteln mit gesteuerter Geschwindigkeit offenbart; US 4,486,194 , das eine therapeutische Vorrichtung zur Verabreichung von Arzneimitteln durch die Haut offenbart; US 4,447,233 , das eine Arzneimittelinfusionspumpe zur Abgabe von Arzneimitteln mit genauer Infusionsrate offenbart; US 4,447,224 , das eine implantierbare Infusionsapparatur mit variablem Durchfluß zur kontinu ierlichen Zufuhr von Arzneimitteln offenbart; US 4,439,196 , das ein osmotisches Arzneimittelabgabesystem mit Mehrkammerfächern offenbart und US 4,475,196 , das ein osmotisches Arzneimittelabgabesystem offenbart. Dem Fachmann sind viele andere solche Implantate, Abgabesysteme und Module bekannt.
  • Die vorliegende Erfindung ist wirksam zur Steigerung der Thymozytenzahl und -funktion und zur Umkehrung des sekundären Immundefekts, wie er bei Krebs, HIV, Infektion, Altern usw. vorkommt. Das Verfahren kann zur Behandlung von Patienten auf stationärer wie ambulanter Basis, letztere bevorzugt, angewendet werden.
  • Die obige Diskussion gibt eine tatsächliche Grundlage für die Herstellung eines natürlichen Zytokingemischs (NCM). Die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung die und dabei angewandten Verfahren können mit den folgenden Beispielen gezeigt werden.
  • Die Beispiele zeigen die Nützlichkeit der Erfindung im System der Maus, jedoch haben äquivalente Zubereitungen (NI und NIM) Aktivität beim menschlichen Immunsystem gezeigt (Pulley et al., 1994; Hadden et al., 1994). Das System Maus wurde gewählt, weil neben dem Menschen die Maus die bestuntersuchte Art bezüglich des Aufbaus und der Funktion des Immunsystems und vom Fachmann als sehr aussagekräftig für die Reaktion beim Menschen anerkannt ist. Bisher wurden zwischen Maus und Mensch nur geringe Unterschiede beobachtet. Die meisten Mechanismen, mit denen sich die Maus gegen verschiedene Pathogene und Tumoren zur Wehr setzt sind im wesentlichen die gleichen wie beim Menschen. Mausmodelle wurden bei der Prüfung von Immunmodulatoren für die Anwendung beim Menschen in großem Umfang benutzt (Talmadge et al., 1985). Wegen dieses Standes der Technik sind die laufenden Versuche mit Mäusen aussagekräftig für die Reaktion des Menschen.
  • Drei Beispiele zeigen die Aussagekraft des Systems Maus für Immunmodulatoren. Die Antitumoraktivität von Interferonen (IFNs) wurde unter Verwendung eines breiten Spektrums von Maustumormodellen gezeigt (Borden, 1979; Talmadge et al., 1985) und entsprechend haben IFNs eine Aktivität gegen eine große Vielzahl von Tumoren beim Menschen gezeigt (Goldstein und Laslo, 1988).
  • In einem zweiten Beispiel mit Maustumormodellen gab es keine Wirkung von Levamisol allein auf Tumoren, nach Chemotherapie wurde jedoch Aktivität beobachtet (Symoens uns Rosenthal, 1977; Spreafico, 1980). Gleichermaßen zeigte Levamisol bei menschlichem Dickdarmkrebs bei Anwendung mit 5-Fluorouracil Aktivität, aber nicht allein (Mutch und Hutson, 1991).
  • In einem dritten Beispiel mit Maustumormodellen wurde gezeigt, daß Interleukin 2 (IL-2) in niedriger Dosierung Antitumoraktivität ohne Toxizität besitzt, während hochdosiertes IL-2 speziell mit lymphokinaktivierten Killerzellen (LAK) aktiv war (Rosenberg et al., 1985), jedoch mit potentiell letaler Toxizität. Untersuchungen am Menschen zeigten ebenfalls die Wirksamkeit hoher Dosen IL-2 ± LAK-Zellen bei malignem Melanom und Nierenzellkrebs, jedoch mit großer Toxizität. Gleichwohl ist es nun von der FDA für Nierenzellkrebs erlaubt. Neuere Untersuchungen zeigen die Wirksamkeit niedrigdosierten IL-2 bei Krebs des Menschen ohne Toxizität (Cortesina et al., 1988 und 1994). Die Mechanismen sind gleich denen, die beim System Maus beobachtet worden waren (Chirigos und Talmadge, 1985).
  • Die obigen drei Beispiele von Immunmodulatoren sind nun zur klinischen Anwendung bei Krebs zugelassen und wurden durch Untersuchungen an Maustumoren gut vorausgesagt.
  • Zusätzlich haben Tierversuche Wirkungen von natürlichen Interleukingemischen (nILs) gezeigt, die von rekombinanten Interleukinen (rILs) nicht geteilt werden. nILs, jedoch nicht rIL-2, sind aktiv bei der Wiederherstellung und Förderung von thymusabhängigen Immunantworten (Hadden et al., 1992) und der Förderung der Widerstandsfähigkeit gegen malignes Melanom zusammen mit Cyclophosphamid (Kameda et al., 1992). Das gleiche Muster wurde bei Menschen beobachtet, indem natürliche ILs bei Krebs des Kopfs und Halses auf eine Weise wirkten, die von rekombinantem rIL-2 nicht geteilt wurde (Cortesina, 1988, 1994; Hadden et al., 1994; Mattijissen et al., 1991).
  • BEISPIELE
  • Allgemeine Verfahren:
  • Alle auf Zellkulturen bezogenen Schritte mit wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Allgemeine, hier nicht beschriebene Verfahren der Zellimmunologie wurden wie in allgemeinen Nachweisen der Zellimmunologietechnik beschrieben durchgeführt, wie Mishell und Shiigi (Selected Methods in Cellular Immunology, 1981) und wie sie dem Fachmann bekannt sind.
  • Materialien
  • Rekombinantes menschliches Interleukin beta 1 (rIL-1 Beta) war ein Geschenk von Dr. C. Reynolds, Biological Response Modifiers Program, NCl (Frederick, MD). Menschliches Interleukin 2 (IL-2; spezifische Aktivität 640 Einheiten/ml) wurden von Pharmacia AB (Silver Spring, MD) bezogen. Rekombinantes IL-2 war ein Geschenk von G. Caspritz (Hoechst Pharm., Frankfurt, Deutschland). Ciprofloxacin wurde von Miles Inc. (West Haven, CT); Ofloxacin von McNeil Pharmaceutical (Spring House, PA) und Norfloxacin von Merck & Co. (West Point, PA) gekauft. Menschliches Serumalbumin (HSA) wurde von Armour Pharmaceuticals (Kankakee, IL) bezogen. X vivo-Medien wurden von Whittaker Bioproducts (Walkersville, MD) gekauft. Hydrocortison-21-hemisuccinat und Con A wurden von Sigma Chemicals (St.Louis, MO) gekauft. PHA (HA-16) wurde von Murex Diagnostics Ltd. (Dartford, U. K.) bezogen. OKT3 wurde von Ortho Pharmaceuticals (Raritan, NJ) gekauft.
  • Herstellung des natürlichen Zytokingemischs (NCM)
  • Die weißen Zellen aus dem Buffy coat menschlichen Bluts von mehreren HIV-negativen, hepatitisvirusnegativen Spendern wurden gesammelt. In einer alternativen Ausführungsform können Tiere als Zellquelle für Anwendungen in der Tiermedizin dienen. Die Spenderzellen wurden vermischt und auf Ficoll Hypaque Gradients (Pharmacia) geschichtet, um von Neutrophilen und Erythrozyten freie Leukozyten zu erhalten ( US 4,390,623 und 4,448,879 ). Alternative Verfahren, die zur gleichen Ausgangs-Lymphozytenpopulation führen und wie sie dem Fachmann bekannt sind, können angewendet werden.
  • Die Lymphozyten werden gewaschen und in X vivo-10-Medium (Whittaker Bioproducts) auf Kolben (MicroCELLectorTM T-25 Cell Culture Flasks) verteilt, in denen sich immobilisierte Stimulanzien, z.B. Mitogene, befinden. In einer Versuchsreihe wurden X vivo-l5- und X vivo-20-Medium wie bezeichnet verwendet. Der Immobilisierungsvorgang für die Stimulanzien erfolgt nach Herstellerbeschreibung für die Immobilisierung verschiedener Substanzen für Trennverfahren, d. h. Trennung von Zellen, in den Kolben.
  • Die Zellen werden 24–48 h in X vivo-10 Medium mit 80 μg/ml Ciprofloxacin (Miles Lab) bei 37°C in einem CO2/Luft-Inkubator bebrütet. Alternativ kann RPMI 1640-Medium verwendet werden (Webb et al., 1973). Allgemein wird das HSA mit 0,1 bis 0,5% (w/v) verwendet. Nach der Bebrütung werden die Überstände abgegossen und gesammelt. Menschliches Serumalbumin (HSA) kann zur weiteren Stabilisierung der Interleukine zugesetzt werden. Die Überstände werden bei 4 bis –70°C gelagert.
  • Charakterisierung der Überstände
  • Die vereinigten Überstände werden durch Messung des Zytokingehalts mittels Bioassay für IL-2 und ELISAs für die restlichen Interleukine IL-1 bis IL-15, CSFs, TNFs und IFNs charakterisiert. Sterilität wird durch Kultur in Thioglykolatboullion und Endotoxin durch den dem Fachmann bekannten Limuluslysatassay gemessen.
  • Einstellung des Überstands auf Zytokingehalt
  • Jeder Überstand wird entweder durch Auf konzentrieren oder durch die verabreichte Menge eingestellt, so daß Vergleiche möglich sind.
  • Entfernung von Verunreinigungen aus dem Überstand
  • Wendet man DNA- und Virusausschluß an, dann benutzt man Techniken wie Ultrafiltration, Säulenchromatographie, Virasol, Ethanolfraktionierung, Fällung mit Polyethylenglykol/Bentonit, Gammabestrahlung und/oder Lösungsmittel/Netzmittelbehandlung, wie es für intravenöses Gammaglobulin und monoklonale Antikörper angewendet wurde (z.B. IGIV News Update-Broschüre).
  • Modell
  • Wenn nicht anders angegeben, wurde das Modell der hydrokortisoninduzierten Thymusinvolution bei gealterten Mäusen verwendet (Hadden et al., 1992).
  • Labortiere
  • Für die in vivo-Versuche wurden weibliche gealterte BALB/c (Life Science, St. Petersburg, FL) "retired breeder" Mäuse (8–9 Monate), deren Thymus begonnen hatte, sich zurückzubilden, benutzt. Die Mäuse wurde nach Gewicht sortiert und zufällig in Fünfergruppen zusammengestellt. Die Tiere wurden mit Standard-Labordiät gefüttert und erhielten Trinkwasser ad lib. Alle Mäuse mit Ausnahme einer Vergleichsgruppe wurden intraperitoneal (i.p.) über zwei aufeinanderfolgende Tage mit Hydrokortison (5 mg/Maus in 0,1 ml 0,9% Natriumchlorid) behandelt, um eine chemische Thymektomie und eine Verminderung des Milzgewichts hervorzurufen.
  • Die erwachsenen, mit Hydrokortison behandelten Mäuse zeigen akute Thymusinvolution (weniger als 30% des Vergleichs) und Verkleinerung der Milz (weniger als 80% des Vergleichs) am zweiten Tag, mit progressiver Erholung bis zu 10 Tagen.
  • Versuchsplan
  • Jede Behandlungsgruppe hatte fünf (5) Tiere und jeder Versuch wurde 2 bis 5 mal wiederholt. Die intraperitoneale (i.p.) Behandlung wurde am Tag 3 begonnen und einmal täglich für insgesamt fünf Tage fortgesetzt. Die Behandlungsgruppen erhielten Injektionen der folgenden in vivo-Behandlungen, wie im Text bezeichnet:
    • 1. pyrogenfreie Kochsalzlösung (Vergleich);
    • 2. rekombinantes Interleukin 1 (rIL-1, 4 ng);
    • 3. rekombinantes Interleukin 2 (rIL-2, 50 Einh.);
    • 4. rIL-1 + rIL-2 (4 ng bzw. 50 Einh.);
    • 5. natürliches Zytokingemisch (NCM; 50 Einheiten IL-2-Äquivalent).
  • Am Tag 8 wurden die Mäuse gewogen, durch Genickbruch (cervical dislocation) getötet und Milz und Thymus entfernt und gewogen. Die Organe wurden zerkleinert, die verbliebenen Erythrozyten mit Ammoniumchlorid lysiert (Mishell und Shiigi, 1981) und die Zellen gezählt.
  • Dann wurde die Wucherungsantwort der Zellen auf verschiedene Substanzen bestimmt. Für die Zellkultur bei 37°C, 5% CO2 in RPMI 1640 Medium wurde eine Zellprobe mit 5% fötalem Rinderserum, Penicillin (100 Einh./ml), Streptomycin (100 μg/ml) und 2-Mercaptoethanol (2 × 10–5 mol/l) vorbereitet. Die Zellen wurden auf 0,2 ml-Mikrowellplatten mit einer Konzentration von 1,5 × 106/ml vierfach aufgetragen und 72 h mit einem der folgenden Zusätze, wie im Text bezeichnet, bebrütet:
    • 1. Vergleichsverdünner (RPMI 1640-Medium komplett);
    • 2. rIL-1 (1 ng/ml);
    • 3. rIL-2 (2 Einheiten/ml);
    • 4. NCM (2 Einh./ml IL-2-Äquivalent);
    • 5. Concanavalin A (Con A; 1,5 μg/ml);
    • 6. Phytohämagglutinin (PHA; 0,5 μg/ml).
  • Zur Messung der DNA-Synthese und damit des Zellwachstums wurde die Kultur mit einem 18 h-Puls tritiierten Thymidins (3H-Thymidin, New England Nuclear, Boston, MA; spezifische Aktivität 6,7 Ci/mmol) beendet, mit einem automatischen Mehrfach-Probennehmer Proben genommen und für die Flüssigszintillationsmessung verarbeitet. Es wurden auch Markeruntersuchungen, wie bei Hadden et al. (1992) beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als arithmetische Mittel der Zählrate (min–1) aus drei Proben von jedem Tier ausgedrückt. Um die Darstellung der mit verschiedenen Tieren erhaltenen Daten zu vereinfachen, wurden die Ergebnisse mit den verschiedenen Tieren zusammengefaßt und gemeinsam verrechnet und in einigen Fällen als Verhältnis zum Vergleich und in anderen als Mittelwert und Klammer für die Standardabweichung (SEM) des Mittelwerts ausgedrückt.
  • Statistische Analyse
  • Wo angebracht wurde der Student-t-Test zur Analyse der Daten angewendet.
  • Beispiel 1
  • Das Ziel war, einen Weg zu finden, um Lymphozyten zur Produktion hoher Mengen von Interleukin-2 in Abwesenheit von Serum und so, daß sich im Überstand keine wesentlichen Mengen PHA ergeben, anzuregen. Um dies zu erreichen, wurde PHA auf oberflächenaktivierten Zellkulturkolben für die Selektion von Zellsubgruppen (AIS microCELLectorTM T-25 plates) wie in den Herstelleranweisungen für Zelltrennung durch "Waschen" ("panning") beschrieben.
  • Das in diesen Versuchen benutzte Medium war X vivo-10 (Whittaker), das von der U.S. Food and Drug Administration zur Verabreichung an Menschen im Rahmen von Protokollen mit Interleukin-2-Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) zugelassen ist. Es können auch serumfreie Medien, die die Wucherung menschlicher Lymphozyten unterstützen, wie minimal essentielles Medium (MEM) oder RPMI-1640 (Sigma), verwendet werden.
  • Vorversuche zeigten, daß PHA (HA-16, Murex Diagnostics Ltd., Dartford, U. K.) durch das vom Hersteller beschriebene Verfahren immobilisiert werden konnte und daß unter angemessen optimalen Bedingungen der Zellzahl von 7,5–15 × 106/ml, der Einwirkungszeit von 24 h–48 h und der PHA-Konzentration von 25 oder 50 μg/ml eine hohe Ausbeute von Interleukin-2 im serumfreien Überstand erzielt werden konnte. Die Ausbeute war den früheren Verfahren (Impulstechnik), die kurze Einwirkung von PHA (NI), gefolgt von Waschen und darauffolgender Kultivierung mit Ciprofloxacin (NIM) in serumfreiem Me dium benutzen, überlegen (Tabelle 1). Daher wird dieses Kolbenverfahren zur Erzeugung des NCM-Gemischs angewendet. TABELLE I
    IL-Gehalt des Überstands/ml
    PHA-Kurzeinwirkung (NI) 2–20 Einheiten
    PHA-Kurzeinwirkung & Ciprofloxacin (NIM) (80 μg/ml) 8–140 Einheiten
    PHA-Kolbenimmobilisierung & Ciprofloxacin (80 μg/ml) 100–353 Einheiten
  • Der IL-2-Gehalt im Überstand wurde mit der IL-2-abhängigen Zellinie CTLL nach den von Gillis et al. (1978) beschriebenen Verfahren gemessen. IL-2 wurde mit einem bekannten Standard in Internationalen Einheiten quantifiziert, der 640 Einheiten enthielt (Pharmacia AB).
  • Die zellfreien Überstände aus Kolben, die ohne Zellen bebrütet worden waren, wurden auf menschlichen Lymphozyten geprüft, um festzustellen, ob Rest-PHA in für die Erzeugung einer Wachstumsantwort ausreichenden Mengen zugegen war. Jedes Rest-PHA über 0,01 μg/ml würde eine solche Antwort hervorrufen. In Abwesenheit von Zellen wurden nach 40–48 h im Überstand kleine Mengen von PHA beobachtet; wurde jedoch PHA (25 μg/ml) nur 24 h benutzt, dann waren diese Mengen vernachlässigbar. Daher wurde 24 h Bebrütung als optimal angesehen.
  • Beim Vergleich neuer mit veralteten Kolben unter vergleichbaren Bedingungen wurde bei den älteren Kolben ein höherer IL-2-Gehalt beobachtet. Daher wurden im allgemeinen, aber nicht immer, in den Beispielen zur Erzeugung des NC-Gemischs veraltete Kolben benutzt.
  • Beispiel 2
  • Es wurde ein Vergleich von X vivo-10, X vivo-15 und X vivo-20 (Whittaker) und MEM bezüglich der vorliegenden Erfindung angestellt und in 1–3 gezeigt. X vivo-10 und X vivo-15 sind von der U.S. Food and Drug Administration zur Verabreichung an Menschen im Rahmen von Protokollen mit durch Interleukin-2-Lymphokin aktivierten Killerzellen (LAK) zugelassen. Die Erzeugung von NCM in verschiedenen Medien wurde verglichen, wobei kontinuierliche mit gepulster Einwirkung von PHA bei 1 μg/ml verglichen wurde (1). Der Einfluß der Zellkonzentration wurde mit kontinuierlicher Einwirkung von PHA bei 1 μg/ml (2) und 2 μg/ml ( 3) untersucht. Als optimale Kombination dieser Faktoren wurde kontinuierliche Einwirkung durch Immobilisierung in X vivo-10 bei einer Zellkonzentration von 2,5 oder 5,0 × 106/ml mit 2 μg/ml PHA oder 5 × 106/ml mit 1 μg/ml PHA gefunden. Da die Ausbeute je Zelle bei 2,5 × 106/ml am besten ist, wurde diese Konzentration mit 2 μg/ml PHA als Optimum gewählt.
  • Beispiel 3
  • Um die Parameter für Ciprofloxacin und zwei andere 4-Aminochinolonantibiotika (Norfloxacin und Ofloxacin) bei der Verstärkung der Zytokinproduktion mit menschlichen Leukozyten nach Einwirkung von PHA festzulegen, wurden Vorversuche in Teströhrchen statt in Kolben durchgeführt. Tabelle II zeigt, daß 80 μg/ml eines jeden dieser 4-Aminochinolonantibiotika die Erzeugung von IL-1, IL-2, IL-6, IFN-δ, TNF-α und G-CSF steigerten. Die Produktion von IL-8 war maximal. In allen Überständen waren unter diesen Umständen IL-3, IL-4 und IL-7 nicht nachweisbar. Diese Ergebnisse zeigen, daß diesen serumfreien Bedingungen alle mit 80 μg/ml geprüften 4-Aminochinolone dir durch PHA induzierte Zytokinproduktion unter serumfreien Bedingungen steigerten. TABELLE II
    Figure 00320001
    Die Einheiten für Zytokine außer IL-2 sind pg/ml; für IL-2 internationale Einheiten/ml.
    • n.n.
    nicht nachweisbar.
  • Beispiel 4
  • Es wurde ebenfalls festgestellt, daß ein monoklonaler Antikörper, OKT-3 (Ortho), der T-Lymphozyten zu Wucherung und Produktion von Interleukinen veranlaßt, unter diesen Bedingungen als Stimulans eingesetzt werden kann. Tabelle III zeigt, daß OKT-3 ähnliche wie die durch PHA plus Ciprofloxacin induzierten Zytokine bei Zellen induziert, die in Kolben, wie im Beispiel 1 ausgeführt, bebrütet wurden. Mit keinem der Stimulanziensätze wurden IL-3, 4 und 7 nachgewiesen. Wenn OKT-3 mit PHA und Ciprofloxacin (CIPRO) vereinigt wurde, erzeugte es eine kleine Zusatzwirkung. TABELLE III
    Figure 00330001
    Die Einheiten für Zytokine außer IL-2 sind pg/ml; für IL-2 internationale Einheiten/ml.
    • n. n.
    nicht nachweisbar.
  • Beispiel 5
  • Um die Überlegenheit des NCM über rIL-1 in vitro zu zeigen, wurden Milzzellen und Thymozyten der Maus mit MEM und rIL-2 bei vergleichbaren Mengen von IL-2 gemäß Bestimmung durch Bioassay und mittels Inkorporierung von tritiiertem Thymidin gemessener DNA-Synthese kultiviert. NCM induziert größere Wucherung der Milzzellen (4) und Thymozyten (5) als rIL-2 auf Basis des IL2-Gehalts.
  • Beispiel 6
  • In einer Reihe von Versuchen wie in den 6 und 7 angegeben wurden Mäuse mit rückgebildetem Thymus in vivo mit rIL-1, rIL-2, Kombinationen dieser Faktoren, NCM oder Kochsalzlösung (Vergleich) behandelt. Milz und Thymus wurden entfernt und die Zellen auf Zellwucherungsantworten gegenüber den Interleukinen (IL-1, IL-2), NCM und dem Mitogen ConA geprüft. Die Ergebnisse sind als Verhältnis zu den mit Kochsalzlösung behandelten Vergleichen ausgedrückt. In vivo- Behandlung mit rIL-1, rIL-2 und deren Kombination (rIL-1 und rIL-2) hatte keine auffallende Wirkung einer erhöhten Wucherungsantwort der Milzzellen (6) oder der Thymozyten (7) auf eine in vitro-Stimulation mit IL-1, IL-2, NCM und ConA. Behandlung mit NCM in vivo erhöhte sowohl Milzzellen als Thymozyten auf alle vier Stimuli wesentlich. Diese Ergebnisse sind mit einer erhöhten Empfindlichkeit dieser Zelle gegenüber Stimulation und/oder einer Zunahme der Anzahl der reagierenden Zellen vereinbar.
  • Beispiel 7
  • Die 8 und 9 zeigen die Wirkung einer Behandlung mit NCM in vivo auf Milzzellen- und Thymozytenmarker. Ungereifte T-Zellen sind mit –– bezeichnet und können besonders im Thymus vorkommende T-Lymphozyten-Vorstufen darstellen. NCM steigerte diese Population proportional in Milz und Thymus. Unreife T-Zellen sind mit ++ bezeichnet und diese Population nimmt durch NCM-Behandlung im Thymus proportional ab. Reife T-Zellen sind mit CD4+ und CD8+ bezeichnet. NCM steigerte die Anteile reifer T-Zellen im Thymus, aber nicht in der Milz. Diese Ergebnisse sind mit einer Wirkung des NCM zur Steigerung der T-Zellenvorstufen und zur Förderung ihrer Entwicklung zu reifen T-Zellen im Thymus vereinbar.
  • Beispiel 8
  • Die 10 und 11 zeigen die in vitro-Antwort von Milzzellen und Thymozyten auf Medium (RPMI), rIL-1 (IL1), rIL-2 (IL2) oder NCM nach in vivo-Behandlung mit Vergleichsmedium oder NCM im Hydrokortisonmodell. Die Mäuse wurden wie oben beschrieben behandelt. Diese Daten zeigen, daß NCM die Antwort von Milzzellen als Grundline sowie auf IL-1 und IL-2, jedoch nicht auf NCM, steigert und die Antwort von Thymozyten als Grundlinie sowie auf IL-1, IL-2 und NCM steigert.
  • Die 12 und 13 zeigen die in vitro-Antworten von Milzzellen und Thymozyten auf ConA und PHA nach in vivo-Behandlung mit Vergleichsmedium oder NCM. Die Mäuse wurden wie oben beschrieben behandelt.
  • Die in vitro-Untersuchungen zeigen die Überlegenheit von NCM über rIL-2 in äquivalenten Dosen bei der Sensibilisierung von Milzzellen und Thymozyten für Wucherungssignale. Die Wirkungen auf Thymozyten spiegeln ebenso die Förderung der Differenzierung wider. Die NCM-Zusammensetzung, aber nicht rIL-1, rIL-2 und auch nicht deren Kombination, fördert in vivo kräftig die Funktion der T-Lymphozyten (IL-Antwort) und ihre Entwicklung (Mitogenantwort und Zellmarker), was therapeutisch bedeutsam bei allen therapeutischen Maßnahmen ist, die eine Anregung des Immunsystems oder eine selbst teilweise Wiederherstellung der Funktion eines zerstörten oder beschädigten Immunsystems erfordern. Beispielsweise können Chemotherapeutika Zellen, einschließlich T-Lymphozyten, zerstören, die bei der Immunantwort beteiligt sind. Durch Anregung von Funktion und Entwicklung der T-Lymphozyten kann die vorliegende Erfindung dieses Merkmal der Immunsystems entweder teilweise oder völlig wiederherstellen, falls es zerstört ist.
  • In dieser Anmeldung sind verschieden Veröffentlichungen einschließlich U.S.-Patenten durch Zitat oder Nummer in Bezug genommen. Die vollständigen Zitate der Veröffentlichungen sind unten aufgelistet.
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Claims (13)

  1. Verfahren zur Herstellung eines nicht rekombinanten Zytokingemischs, umfassend die Schritte – Immobilisieren von mindestens einem Mitogen in einem Gewebekulturgefäß, – Suspendieren einer isolierten Lymphozytenpopulation, die frei von Neutrophilen und Erythrozyten ist, in einem serumfreien Medium, – Einbringen der suspendierten Lymphozyten in das Gefäß, – Kultivieren der Lymphozyten, – Entfernen des Mediums und – Charakterisieren des Mediums nach der Ausbeute an Zytokinen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das serumfreie Medium aus X vivo-10 und X vivo-15 ausgewählt ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Mitogen aus der aus einem Lektin, Phytohämagglutinin (PHA), Concanavalin A (Con A), einem monoklonalen Antikörper, der Lymphozyten zur Produktion von Zytokinen anregt, OKT3, anti-CD2, anti-CD28 und anti-CD45 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei eine Kombination von Mitogenen verwendet wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Mitogen PHA umfaßt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die zu charakterisierenden Zytokine zumindest eines von IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, GM-CSF, G-CSF und TNF-α umfassen.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das serumfreie Medium ein 4-Aminochinolon-Antibiotikum enthält, das aus der aus Ciprofloxacin, Norfloxacin und Ofloxacin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Gewebekulturgefäß eine oberflächenaktivierte Zellkultur AIS microCELLectorTM T-25 ist und 24 bis 48 Stunden kultiviert wird.
  9. Nicht rekombinantes Zytokingemisch, hergestellt mit dem Verfahren nach Anspruch 1 durch Kultivieren von Lymphozyten in Gegenwart eines immobilisierten Mitogens und eines serumfreien Mediums.
  10. Nicht rekombinantes Zytokingemisch nach Anspruch 9, wobei das serumfreie Medium ein 4-Aminochinolon-Antibiotikum enthält und das Mitogen Phytohämagglutinin ist.
  11. Nicht rekombinantes Zytokingemisch nach Anspruch 9, wobei das serumfreie Medium ein 4-Aminochinolon-Antibiotikum enthält und das Mitogen Phytohämagglutinin ist und wobei das nicht rekombinante Zytokingemisch ein Zytokinprofil mit IL-1 bei 10 bis 2000 pg/ml, IL-2 bei 100 bis 500 Einheiten/ml, IL-6 bei 250 bis 10000 pg/ml, IL-8 bei 12000 bis 100000 pg/ml, IL-12 bei 100 bis 10000 pg/ml, IFN-γ bei 50 bis 15000 pg/ml, TNF-α bei 50 bis 15000 pg/ml, G-CSF bei 50 bis 1500 pg/ml, GM-CSF bei 10 bis 1500 pg/ml und IL-3, IL-4 und IL-7 in Spuren vorhanden enthält.
  12. Nicht rekombinantes Zytokingemisch, hergestellt gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1, enthaltend zwischen 100 und 500 Einheiten/ml IL-2.
  13. Verwendung eines nicht rekombinanten Zytokingemischs, hergestellt nach Anspruch 1, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines zellulären Immundefekts.
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