DE69203443T2 - Verwendung von interleukin-10 in der adoptive immunotherapie von krebs. - Google Patents
Verwendung von interleukin-10 in der adoptive immunotherapie von krebs.Info
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Description
- Die Erfindung bezieht sich allgemein auf die Herstellung von Zusammensetzungen zur Behandlung von Neoplasmen oder Krebserkrankungen beim Menschen und insbesondere auf die Verwendung von Interleukin-10 (IL-10) zur Herstellung von Zusammensetzungen in der passiven Immunotherapie menschlicher Krebserkrankungen.
- Immunologische Ansätze zur Krebstherapie beruhen auf der Ansicht, daß Krebszellen sich irgendwie der Abwehr des Körpers gegen anomale oder fremde Zellen und Moleküle entzogen haben und daß diese Abwehrkräfte therapeutisch stimuliert werden könnten, um den verlorenen Boden zurückzugewinnen: z.B. S. 623-648 in Klein, Immunology (Wiley-Interscience, New York, 1982). Die neueren Beobachtungen, daß verschiedene Immuneffektoren das Tumorwachstum direkt oder indirekt hemmen können, führte zu einem erneuten Interesse an diesem Ansatz zur Krebstherapie: z.B. Herberman, Concepts Immunopathol., Vol. 1, S.96-132 (1985) (natürliche Killerzellen leisten dem Wachstum von Tumorzellen Widerstand) Rosenberg et al., Ann. Rev. Immunol., Vol. 4, S. 681-709 (1988) (klinische Verwendung von IL-2-aktivierten Killerzellen zur Behandlung von Krebs); Ralph et al., J. Exp. Med., Vol. 167, S. 712-717 (1988) (tumorizide Wirkung von durch Lymphokine stimulierten Makrophagen), Tepper et al., Cell, Vol. 57, S. 503-512 (1989) (IL-4 besitzt Antitumorwirkung), M. Cohen, "Lymphokines and Tumor Immunity", S. 237-253 in S. Cohen, Hrsg., Lymphokines and the Immune Response (CRC Press, Boca Raton, 1990) und ähnliche.
- Ein immunologischer Ansatz, der klinisch vielversprechend war, war die sogenannte passive Immuntherapie unter Verwendung von durch Interleukin-2 (IL-2) aktivierten Killerzellen: Rosenberg et al. (oben zitiert) und Rosenberg, Sci. Amer., S. 62-69 (Mai 1990). Unglücklicherweise waren die durch IL-2 direkt oder indirekt verursachten schweren Nebenwirkungen ein Hindernis bei der Entwicklung von Routinebehandlungen auf der Basis dieses Ansatzes: z.B. Gaynor et al., Ann. Int. Med., Vol. 109, S. 953- 958 (1988); Lee et al., J. Clin. Oncol., Vol. 7, S. 7-20 (1989); und Rosenberg et al., Human Path., Vol. 22, S. 493-502 (1990). Es wäre ein großer Fortschritt bei diesem Ansatz zur Krebstherapie, wenn Verfahren gefunden werden könnten, um die Stärke der durch IL-2 direkt und/oder indirekt verursachten Nebenwirkungen zu reduzieren.
- Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Interleukin-10 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung in der passiven Immunotherapie von Krebserkrankungen. Die Erfindung schließt auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die Interleukin- 10 umfassen, für die Verwendung in der passiven Immunotherapie ein. Die Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung, daß IL-10 die Erzeugung von Cytokinen, von denen man glaubt, daß sie für viele der schädlichen Nebenwirkungen, die zur Zeit bei der passiven Immunotherapie auftreten, verantwortlich sind, verhindern oder reduzieren kann. Der hier verwendete Ausdruck "passive Immuntherapie" bedeutet eine Therapie, bei der funktionelle krebsbekämpfende Immunzellen auf einen Patienten übertragen werden. Die krebsbekämpfenden Immunzellen umfassen vorzugsweise tumorinfiltrierende Lymphocyten (TILs), die von dem Patienten selbst stammen. In großen Zügen umfaßt das Verfahren der Verwendung der Erfindung die Schritte: (i) Kultivieren von TILs in Gegenwart von IL-2 und IL-10, (ii) Verabreichen der kultivierten TILs an den Patienten und (iii) Verabreichen von IL-2 und IL-10 an den Patienten nach der Verabreichung der TILs.
- Vorzugsweise wird das Interleukin-10 der Erfindung aus der Gruppe ausgewählt, die aus den reifen Polypeptiden besteht, die die offenen Leseraster haben, die durch die in SEQ.-ID. Nr. 1 und 2 (alle SEQ.-ID.s werden unmittelbar vor den Ansprüchen angegeben) gegebenen Aminosäuresequenzen definiert sind, wobei die Standard- Dreibuchstabenabkürzung verwendet wird, um L-Aminosäuren zu bezeichnen, ausgehend vom N-Terminus. Diese beiden Formen von IL-10 werden zuweilen als Human-IL-10 (oder Human-Cytokinsynthese- Inhibitionsfaktor) bzw. virales IL-10 (oder BCRF1) bezeichnet: z.B. Moore et al., Science, Vol. 248, S. 1230-1234 (1990); Vieira et al., Science, Vol. 88, S. 1172-1176 (1991); Fiorentino et al., J. Exp. Med., Vol. 170, S. 2081-2095 (1989); und Hsu et al., Science, Vol. 250, S. 830-832 (1990). Noch bevorzugter wird das im Verfahren der Erfindung verwendete reife IL-10 aus der Gruppe ausgewählt, die aus den reifen Polypeptiden besteht, die die offenen Leseraster haben, die durch die in SEQ.-ID. Nr. 3 und 4 gegebenen Aminosäuresequenzen definiert sind.
- Figur 1 ist eine diagrammartige Darstellung des Säuger-Expressionsvektors pcD(SRα).
- Figur 2 ist eine diagrammartige Darstellung des Bakterien-Expressionsvektors TRP-C11.
- Figur 3 veranschaulicht Daten über die Cytokinsynthese IL-2- aktivierter mononuclearer Zellen des peripheren Blutkreislaufs (PBMCs), die in Gegenwart von IL-2 und/oder IL-4, vIL-10 und hIL-10 (wobei der Buchstabe 'v' viral bedeutet und der Buchstabe 'h' human bedeutet) kultiviert wurden.
- Figur 4(a) veranschaulicht Daten, die die Wirkung von IL-4, vIL-10 und hIL-10 auf die IL-2-induzierte Cytotoxizität von PBMCs zeigen.
- Figur 4 (b) veranschaulicht Daten, die zeigen, daß CD56&spplus;-(Leu19&spplus;)- PBMCs in Gegenwart von IL-10 und IL-2 LAK-Aktivität zeigen.
- Figur 5(a) veranschaulicht Daten, die die Wirkung von IL-4, vIL-10 und hIL-10 auf die IFNγ-Produktion in gereinigte NK- Zellen zeigen.
- Die Figuren 5(b) und (c) veranschaulichen Daten, die die Wirkung von Mooncyten auf die IFNγ-Produktion durch gereinigte NK-Zellen, die in Gegenwart von IL-2 und/oder hIL-10 und vIL-10 kultiviert wurden, zeigen.
- Die Erfindung betrifft die Verwendung von IL-10 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Reduktion Cytokin-induzierter Nebenwirkungen bei der passiven Immunotherapie von Krebs. Die Erfindung beinhaltet auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die IL-10 umfassen, zur Durchführung des Verfahrens. IL-10 zur Verwendung in der Erfindung wird vorzugsweise aus der Gruppe reifer Polypeptide ausgewählt, die durch die offenen Leseraster codiert werden, die durch die cDNA-Inserts von pH5C, pH15C und pBCRF1(SRα) definiert sind, die bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, unter den Zugriffsnummern 68191, 68192 bzw. 68193 hinterlegt sind.
- In der passiven Immunotherapie wird IL-10 vorzugsweise in Kombination mit IL-2 verwendet, wie es von Rosenberg et al., Ann. Rev. Immunol., Vol. 4, S. 681-709 (1988), von Topalian et al., J. Immunol. Meth., Vol. 102, S. 127-141 (1987), und von Rosenberg et al., New Eng. J. Med., Vol. 319, S. 1676-1680 (1988) beschrieben wird.
- TILs werden wie folgt hergestellt. Unter Verwendung einer sterilen Technik werden feste Tumore (vorzugsweise 10-30 g) , die aus einem Patienten herausgeschnitten wurden, in 5 mm³ große Stücke zerschnitten, die in RPMI-1640-Medium eingetaucht werden, welches Hyaluronidase Typ V (0,01%), DNAse Typ I (0,002%), Collagenase Typ IV (0,1%, z.B. Sigma, St. Louis, MO), Penicillin (50 E/ml), Streptomycin (50 ug/ml, z.B. Flow Laboratories, McLean, VA) und Gentamicin (50 ug/ml, z.B. Gibco Laboratories, Chagrin Falls, OH) enthält. Dieses Gemisch wird 6 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, woraufhin es durch ein grobes Drahtnetz filtriert wird, um nicht verdaute Gewebefragmente auszuschließen. Die resultierende Tumorzellsuspension wird dann 10 min bei 400 x g zentrifugiert. Das Sediment wird zweimal mit Hanks's ausgewogener Salzlösung (HBSS) ohne Ca/Mg/Phenolrot (z.B. Whittaker MA Bioproducts, Walkersville, MD) gewaschen, dann in HBSS resuspendiert und durch Ficoll-Hypaque-Gradienten (z.B. LSM, Bionetics, Kensington, MD) geschickt. Die Flächen innerhalb des Gradienten, die lebensfähige Tumorzellen, Lymphocyten und Monocyten enthalten, werden gewonnen und noch zweimal mit HBSS gewaschen. Die Zahl der Lymphocyten kann visuell, durch cytologische Untersuchung und/oder durch Fließcytometrie abgeschätzt werden. Die gewonnenen Zellen können zur Lagerung in einem typkompatiblen Humanserum, das 10% (v/v) DMSO enthält, eingefroren werden.
- Bei einer Konzentration von etwa 2,5-5,0 x 10&sup5; lebensfähigen Zellen/ml werden einzelzellige Tumorsuspensionen, die entweder direkt mit dem oben beschriebenen Verfahren des enzymatischen Verdauens oder durch rasches Auftauen gefrorener Proben erhalten wurden, in Kulturmedium verdünnt, das aus 20 Vol.-% LAK-Zellen- Überstand (unten beschrieben) und 80 Vol.-% RPMI-1640-Medium, das 10% hitzeinaktiviertes Humanserum, Penicillin, Streptomycin, Gentamicin und Amphotericin (250 ng/ml; Fungizone, Squibb, Flow Laboratories, Mclean, VA), Hepes-Puffer (10 mM) und L-Glutamin (2 mM) enthält, besteht. IL-2 wird auf eine endgültige Konzentration von 1000 E/ml hinzugefügt (wobei Einheiten der IL-2- Aktivität wie von Rosenberg et al., Science (oben zitiert) definiert sind), und IL-10 wird auf eine endgültige Konzentration von zwischen etwa 10 und 100 E/ml hinzugefügt (wobei Einheiten unten definiert werden). TIL-Kulturen werden angesetzt, indem man die Zellen auf 175-cm³-Kolben (z.B. Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, CA) oder ähnliches verteilt, wo sie in einer angefeuchteten 5%-CO&sub2;-Atmosphäre bei 37ºC gehalten werden. TIL-Kulturen werden wöchentlich, oder wie es die Wachstumsrate der Kultur erfordert, entnommen, sedimentiert und in frischem Medium und frischem IL-2 resuspendiert. Bei jedem Durchlauf werden die TIL-Kulturen bei einer Konzentration von etwa 2,5 x 10&sup5; lebensfähige Zellen/ml neu angesetzt. Nach 9- bis 28-tägigem oder vorzugsweise sogar 30- bis 40-tägigem Kultivieren verschwinden die Tumorzellen aus den Kulturen. TILs werden durch Zentrifugation gewonnen, in einer isotonischen Salzlösung oder einem ähnlichen pharmazeutischen Träger resuspendiert und in einen Patienten infundiert (z.B. maximal 2 x 10¹¹ Zellen in 200-250 ml Trägerlösung während einer Zeit von 30-60 Minuten). Im Anschluß an die Infusion von TILs werden dem Patienten IL-2 und IL-10 verabreicht, wie unten beschrieben.
- LAK-Zellen-Überstände werden wie folgt erhalten. Human-Lymphocyten des peripheren Blutkreislaufs, die nach Standard-Ficoll- Hypaque-Abtrennungstechniken entweder aus Leukapherese-Proben oder aus peripherem venösem Blut erhalten wurden, werden mit einer Zellkonzentration von etwa 1,0 x 10&sup6; Zellen/ml mit 2% hitzeinaktiviertem Human-AB-Serum, Penicillin, Streptomycin und Gentamicin in RPMI-1640-Medium suspendiert. IL-2 wird auf eine Konzentration von etwa 1000 E/ml hinzugefügt, und die Zellen werden 3-5 Tage inkubiert. Die Kulturüberstände werden durch Zentrifugation gewonnen und zur Verwendung in den TIL-Kulturen bei 4ºC aufbewahrt.
- Ein großer Bereich einzelzelliger und mehrzelliger Expressionssysteme (d.h. Wirt/Expressionsvektor-Kombinationen) kann verwendet werden, um die Polypeptide der Erfindung zu erzeugen. Mögliche Typen von Wirtszellen umfasssen Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Säugerzellen und ähnliche, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Es stehen viele Übersichtsartikel zur Verfügung, die Anleitung zur Auswahl und/oder Modifikation spezifischer Expressionssysteme geben: z.B. geben, um nur einige zu nennen, de Boer und Shepard, "Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli", S.205-247, in Kroon, Hrsg., Genes: Structure and Expression (John Wiley & Sons, New York, 1983), eine Übersicht über mehrere E.-coli-Expressionssysteme; Kucherlapati et al., Critical Reviews in Biochemistry, Vol. 16, Issue 4, S. 349-379 (1984), und Banerji et al., Genetic Engineering, Vol. 5, S. 19-31 (1983), geben eine Übersicht über Verfahren zum Transfizieren und Transformieren von Säugerzellen; Reznikoff und Gold, Hrsg., Maximizing Gene Expression (Butterworths, Boston, 1986) geben eine Übersicht über ausgewählte Themen der Genexpression in E. coli, Hefe und Säugerzellen; und Thilly, Mammalian Cell Technology (Butterworths, Boston, 1986) gibt eine Übersicht über Säugerexpressionssysteme. Ähnlich stehen viele Übersichtsartikel zur Verfügung, die Techniken und Bedingungen zur Verknüpfung und/oder Manipulation spezifischer cDNAs und Expressionsregulationssequenzen beschreiben, um Expressionsvektoren, die sich zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung eignen, zu schaffen und/oder zu modifizieren, z.B. Sambrook et al. (oben zitiert) .
- Ein E.-coli-Expressionssystem wird von Riggs im U.S.-Patent 4,431,739 offenbart. Ein besonders geeigneter prokaryontischer Promotor für hohe Expression in E. coli ist der tac-Promotor, der von de Boer im U.S.-Patent 4,551,433 offenbart wird, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Für E.-coli-Wirte stehen auch Sekretionsexpressionsvektoren zur Verfügung. Besonders geeignet sind die von Ghrayeb et al. in EMBO J., Vol. 3, SS. 2437-2442 (1984) offenbarten pIN-III-ompA-Vektoren, bei denen die zu transcribierende cDNA mit dem Teil des E.-coli-OmpA-Gens verknüpft wird, der für das Signalpeptid des ompA-Proteins codiert, welches wiederum bewirkt, daß das reife Protein in den periplasmatischen Raum der Bakterien sezerniert wird. Die U.S.-Patente 4,336,336 und 4,338,397 offenbaren ebenfalls Sekretionsexpressionsvektoren für Prokaryonten.
- Zahlreiche Bakterienstämme sind geeignete Wirte für prokaryontische Expressionsvektoren einschließlich Stämmen von E. coli, wie W3110 (ATCC-Nr. 27325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB101, X1776 (ATCC-Nr. 31244), X2282, RR1 (ATCC-Nr. 31343), MRCI; Stämme von Bacillus subtilis; und andere Darmbakterien, wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens sowie verschiedene Pseudomonas-Arten. Allgemeine Verfahren zur Ableitung von Bakterienstämmen, wie E. coli K12 X1776, die sich zur Expression eukaryontischer Proteine eignen, sind von Curtis III im U.S.-Patent 4,190,495 offenbart.
- Neben prokaryontischen und eukaryontischen Mikroorganismen können auch Expressionssysteme, die von mehrzelligen Organismen stammende Zellen umfassen, verwendet werden, um Proteine der Erfindung zu erzeugen. Von besonderem Interesse sind Säugerexpressionssysteme, da ihre Maschinerie zur posttranslationalen Prozessierung mit höherer Wahrscheinlichkeit biologisch aktive Säugerproteine erzeugt. Mehrere DNA-Tumorviren wurden als Vektoren für Säugerwirtszellen verwendet. Besonders wichtig sind die zahlreichen Vektoren, die an bakterielle Replikationsregulationssequenzen gekoppelte Replikations-, Transcriptions- und/oder Translationsregulationssequenzen von SV40 umfassen: z.B. die von Okayama und Berg entwickelten pcD-Vektoren, die in Mol. Cell. Biol., Vol. 2, S. 161-170 (1982), und Mol. Cell. Biol., Vol. 3, S. 280-289 (1983), offenbart wurden und von Takebe et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 8, S. 466-472 (1988), verbessert wurden. Entsprechend wird hier auf diese Literaturstellen ausdrücklich Bezug genommen. Weitere Säugerexpressionsvektoren auf SV40-Basis umfassen die von Kaufman und Sharp in Mol. Cell. Biol., Vol. 2, S. 1304-1319 (1982), und Clark et al. im U.S.-Patent 4,675,285 offenbarten. Affenzellen sind gewöhnlich die bevorzugten Wirte für die obigen Vektoren. Solche Vektoren, die die SV40-ori- Sequenzen und ein intaktes A-Gen enthalten, können sich in Affenzellen autonom replizieren (was höhere Kopienzahlen und/oder stabilere Kopienzahlen ergibt als bei nichtautonom replizierenden Plasmiden). Überdies können sich Vektoren, die die SV40-ori- Sequenzen ohne ein intaktes A-Gen enthalten, können sich in COS7- Affenzellen autonom zu hohen Kopienzahlen (aber nicht stabil) replizieren; sie werden von Gluzman, Cell, Vol. 23, S. 175-182 (1981), beschrieben und sind vom ATCC (Zugriffs-Nr. CRL 1651) erhältlich. Die obigen Vektoren auf SV40-Basis sind auch in der Lage, andere Säugerzellen, wie Maus-L-Zellen, durch Integration in die DNA der Wirtszelle zu transformieren.
- Mehrzellige Organismen können ebenfalls als Wirte für die Erzeugung von Polypeptiden der Erfindung dienen, z.B. Insektenlarven (Maeda et al., Nature, Vol. 315, S. 592-594 (1985) und Ann. Rev. Entomol., S. 351-372 (1989)) und transgene Tiere (Jaenisch, Science, Vol. 240, S. 1468-1474 (1988)).
- IL-10s zeigen mehrere biologische Wirkungen, die die Grundlage für Assays und Einheiten bilden könnten. Insbesondere haben IL-10s die Eigenschaft, die Synthese wenigstens eines Cytokins in der Gruppe, die aus IFN-' q, Lymphotoxin, IL-2, IL-3 und GM-CSF besteht, in einer Population von T-Helferzellen, die durch Einwirkung syngener antigenpräsentierender Zellen (APCs) und von Antigen zum Synthetisieren eines oder mehrerer dieser Cytokine induziert wurden, zu hemmen. Bei dieser Aktivität werden die APCs so behandelt, daß sie replikationsunfähig werden, ihre antigenverarbeitende Maschinerie bleibt jedoch funktionsfähig. Dies wird zweckmäßigerweise erreicht, indem man die APCs bestrahlt, z.B. mit etwa 1500-3000 R (Gamma- oder Röntgenstrahlung), bevor man sie mit den T-Zellen mischt.
- Alternativ dazu kann auf Cytokin-Inhibition in primären oder vorzugsweise sekundären Mischlymphocyten-Reaktionen (MLR) getestet werden; in diesem Fall brauchen keine syngenen APCs verwendet zu werden. MLRs sind in der Technik wohlbekannt: z.B. Bradley, S. 162-166, in Mishell et al., Hrsg., Selected Methods in Cellular Immunology (Freeman, San Francisco, 1980) ; und Battisto et al., Meth. in Enzymol., Vol. 150, S. 83-91 (1987). In Kürze: Zwei Populationen allogener lymphoider Zellen werden gemischt, wobei eine der Populationen vor dem Mischen zum Verhindern der Vermehrung behandelt wurde, z.B. durch Bestrahlung. Vorzugsweise werden die Zellpopulationen mit einer Konzentration von etwa 2 x 10&sup6; Zellen/ml in ergänztem Medium, z.B. RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum, hergestellt. Sowohl für Kontrollen als auch für Testkulturen werden für den Assay 0,5 ml jeder Population vermischt. Für eine sekundäre MLR werden die nach 7 Tagen in der primären MLR verbleibenden Zellen durch frisch hergestellte bestrahlte Stimulatorzellen wieder stimuliert. Die Probe, von der man annimmt, daß sie IL-10 enthält, kann zum Zeitpunkt des Mischens zu den Testkulturen gegeben werden, und sowohl Kontrollen als auch Testkulturen können ab 1 bis 3 Tage nach dem Mischen auf Cytokinproduktion getestet werden.
- Zum Erhalten von T-Zellpopulationen und/oder APC-Populationen für IL-10-Assays werden Techniken verwendet, die in der Technik wohlbekannt sind und in DiSabato et al., Hrsg., Meth. in Enzymol., Vol. 108 (1984), vollständig beschrieben sind. APCs für den bevorzugten IL-10-Assay sind Monocyten des peripheren Blutkreislaufs. Diese werden mit Standardtechniken erhalten: wie z.B. beschrieben von Boyum, Meth. in Enzymol., Vol. 108, S. 88-102 (1984), von Mage, Meth. in Enzymol., Vol. 108, S. 118-132 (1984), von Litvin et al., Meth. in Enzymol., Vol. 108, S. 298-302 (1984), von Stevenson, Meth. in Enzymol., Vol. 108, S. 242-249 (1989), und von Romain et al., Meth. in Enzymol., Vol. 108, S. 148-153 (1984). Vorzugsweise werden in den IL-10-Assays Helfer-T- Zellen verwendet, die erhalten werden, indem man zuerst Lymphocyten aus dem peripheren Blutkreislauf abtrennt und dann, z.B. durch Panning oder Fließcytometrie, Helferzellen ausselektiert, indem man einen kommerziell erhältlichen Anti-CD4-Antikörper verwendet, z.B. OKT4, der im U.S.-Patent 4,381,295 beschrieben und von der Ortho Pharmaceutical Corp. erhältlich ist. Die erforderlichen Techniken sind von Boyum in Scand. J. Clin. Lab. Invest., Vol. 21 (Suppl. 97), S. 77 (1968), und in Meth. in Enzymol., Vol. 108 (oben zitiert), sowie von Bram et al., Meth. in Enzymol., Vol. 121, S. 737-748 (1986) vollständig offenbart. Im allgemeinen werden PBLs durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientzentrifugation aus Frischblut erhalten.
- In dem Assay kann eine Vielzahl von Antigenen eingesetzt werden, z.B. KLH (Keyhole limpet hemocyanin, Hämocyanin aus der Schlitzschnecke), Hühner-γ-Globulin oder ähnliche. In dem Assay werden Helfer-T-Zellen anstatt mit Antigen bevorzugter mit monoklonalem Anti-CD3-Antikörper stimuliert, z.B. OKT3, der im U.S.-Patent 4,361,549 offenbart ist.
- Cytokinkonzentrationen in Kontroll- und Testproben werden durch biologische und/oder immunochemische Standardassays gemessen. Der Aufbau immunochemischer Assays für spezifische Cytokine ist in der Technik wohlbekannt, wenn das gereinigte Cytokin erhältlich ist: z.B. Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984) ; Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); und U.S.-Patent 4,486,530 sind Beispiele für die ausgedehnte Literatur zu diesem Thema. ELISA-Kits für Human-IL-2, Human-IL-3 und Human-GM-CSF sind von der Genzyme Corp. (Boston, MA) kommerziell erhältlich, und ein ELISA-Kit für Human-IFN-γ ist von der Endogen, Inc. (Boston, MA) kommerziell erhältlich. Polyklonale Antikörper, die spezifisch für Human-Lymphotoxin sind, sind von der Genzyme Corp. erhältlich und können in einem Radioimmunoassay für Human-Lymphotoxin verwendet werden, z.B. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques (Elsevier, Amsterdam, 1982).
- Biologische Assays für die oben aufgeführten Cytokine können ebenfalls verwendet werden, um die IL-10-Aktivität zu bestimmen. Ein biologisches Assay für Human-Lymphotoxin ist offenbart von Aggarwal, Meth. inenzymol., Vol. 116, S. 441-447 (1985), und von Matthews et al., S. 221-225, in Clemens et al., Hrsg., Lymphokines and Interferons: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1987). Human-IL-2 und GM-CSF können mit den faktorabhängigen Zellinien CTLL-2 und KG-1, die von der ATCC unter den Zugriffs-Nummern TIB 214 bzw. CCL 246 erhältlich sind, getestet werden. Human-IL-3 kann anhand seiner Fähigkeit, die Bildung eines großen Bereichs hämatopoietischer Zellkolonien in Weichagarkulturen zu stimulieren, getestet werden, wie z.B. von Metcalf, The Hemopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, Amsterdam, 1984), beschrieben. INF-γ kann mit Antivirenassays quantifiziert werden, z.B. Meager, S. 129-147, in Clemens et al., Hrsg. (oben zitiert).
- Die Cytokinproduktion kann auch durch mRNA-Analyse bestimmt werden. Cytokin-mRNAs können durch cytoplasmatische Punkthybridisierung gemessen werden, wie es von White et al., J. Biol. Chem., Vol. 257, S. 8569-8572 (1982), und Gillespie et al., U.S.- Patent 4,483,920, beschrieben wird. Entsprechend wird auf diese Literaturstellen ausdrücklich Bezug genommen. Weitere Ansätze umfassen das Dot-Blotting unter Verwendung gereinigter RNA, z.B. Kapitel 6 in Hames et al., Hrsg., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1985).
- Einige der auf IL-10-Aktivität zu testenden Proben müssen vorbehandelt werden, um vorbestimmte Cytokine zu entfernen, die den Assay stören könnten. Zum Beispiel erhöht IL-2 in einigen Zellen die Produktion von IFN-γ. Je nach den bei dem Assay verwendeten Helfer-T-Zellen muß IL-2 also gegebenenfalls aus der getesteten Probe entfernt werden. Solche Entfernungen werden zweckmäßigerweise durchgeführt, indem man die Probe durch eine Standard-Anti-Cytokin-Affinitätssäule laufen läßt.
- Zweckmäßigerweise werden Einheiten der IL-10-Aktivität definiert anhand der Fähigkeit von IL-10, die IL-4-induzierte Vermehrung von MC/9-Zellen, die im U.S.-Patent 4,559,310 beschrieben sind und von der ATCC unter der Zugriffsnummer CRL 8306 erhältlich sind, zu verstärken. 1 Einheit/ml ist definiert als die Konzentration an IL-10, die 50% der maximalen Stimulierung der MC/9- Vermehrung über dem Niveau von IL-4 in dem folgenden Assay ergibt. Verdünnungen von IL-4 und IL-10 in 50 ul Medium pro Vertiefung werden in doppelter oder dreifacher Ausführung in einer Standard-Mikrotiterplatte hergestellt. Das Medium besteht aus RPMI 1640, 10% fetalem Kälberserum, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin, Penicillin (100 E/l) und Streptomycin (100 ug/l) Man gibt IL-4 in einer Menge von 25 ul/Vertiefung einer in Medium verdünnten Lösung von 1600 E/ml (Endkonzentration 400 E/ml IL-4) hinzu und inkubiert über Nacht, z.B. 20-24 Stunden. Man gibt ³H-Thymidin (z.B. 50 uCi/ml in Medium) in einer Menge von 0,5-1,0 uCi/Vertiefung hinzu und inkubiert die Zellen wiederum über Nacht; danach werden die Zellen abgetrennt und die aufgenommene Radioaktivität gemessen.
- Wenn Polypeptide der vorliegenden Erfindung in löslicher Form exprimiert werden, zum Beispiel als sezerniertes Produkt transformierter Hefe- oder Säugerzellen, können sie nach Standardverfahren der Technik gereinigt werden, einschließlich Schritten der Fällung mit Ammoniumsulfat, Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltration, Elektrophorese, Affinitätschromatographie und/oder ähnliches; z.B. geben Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in Enzymology, 22:233-577 (1977), und Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York, 1982), Anleitungen für solche Reinigungen. Ähnlich können Polypeptide der Erfindung, wenn sie in unlöslicher Form exprimiert werden, zum Beispiel als Aggregate, Inklusionskörper oder ähnliches, nach Standardverfahren der Technik gereinigt werden, einschließlich des Antrennens der Inklusionskörper von zerkleinerten Wirtszellen durch Zentrifugation, des Löslichmachens der Inklusionskörper mit chaotropen Mitteln und Reduktionsmitteln, des Verdünnens des in Lösung gebrachten Gemischs und des Senkens der Konzentration des chaotropen Mittels und des Reduktionsmittels, so daß das Polypeptid eine biologisch aktive Konformation annimmt. Letztere Verfahren sind in den folgenden Literaturstellen offenbart: Winkler et al., Biochemistry, 25: 4041-4045 (1986); Winkler et al., Biotechnology, 3: 992-998 (1985); Koths et al., U.S.-Patent 4,569,790; und Europäische Patentanmeldungen 86 306 917.5 und 86 306 353.3. Vorzugsweise wird IL-10 in Kombination mit Human-Interleukin-2 (hIL-2) verwendet. IL-2 kann gemäß Taniguchi et al., U.S.-Patent 4,738,927; Rosenberg et al., Science, Vol. 223, S. 1412-1415 (1984); Dorin et al., U.S.-Patent 4,748,234; Koth et al., U.S.-Patent 4,569,790; und ähnlichen hergestellt werden.
- Im allgemeinen wird IL-10 als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die einen pharmazeutischen Träger, eine wirksame Menge von IL-10 sowie IL-2 umfaßt. Ein pharmazeutischer Träger kann jede verträgliche, nichttoxische Substanz sein, die geeignet ist, einem Patienten die Zusammensetzungen der Erfindung zu verabreichen. Im allgemeinen sind Zusammensetzungen, die sich für die parenterale Verabreichung solcher Medikamente eignen, wohl bekannt, z.B. Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed. (Mack Publishing Company, Easton, PA 1980). Alternativ dazu können Zusammensetzungen der Erfindung durch ein implantierbares oder injizierbares Medikamentendarreichungssystem in den Körper eines Patienten eingeführt werden: z.B. Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol. 24, S. 199-236 (1984); Lewis, Hrsg., Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981); U.S.-Patent 3,773,919; U.S.-Patent 3,270,960; und ähnliche.
- Bei parenteraler Verabreichung wird das IL-10 in Assoziation mit einem pharmazeutischen Träger in einer injizierbaren Einheitsdarreichungsform (Lösung, Suspension, Emulsion) zubereitet. Beispiele für solche Träger sind normale Kochsalzlösung, Ringers Lösung, Dextroselösung und Hanks's Lösung. Nichtwäßrige Träger, wie fette Öle und Ethyloleat, können ebenfalls verwendet werden. Ein bevorzugter Träger ist 5% Dextrose/Kochsalzlösung. Der Träger kann kleinere Mengen von Additiven enthalten, wie Substanzen, die die Isotonizität und chemische Stabilität erhöhen, z.B. Puffer und Konservierungsmittel. Das IL-10 wird vorzugsweise in einer Konzentration im Bereich von etwa 5 bis 20 ug/ml in gereinigter Form und im wesentlichen frei von Aggregaten und anderen Proteinen zubereitet.
- Der hier verwendete Ausdruck "wirksame Menge" von IL-10 bedeutet eine Menge, die ausreicht, um Nebenwirkungen in der passiven Immunotherapie zu reduzieren oder zu verhindern. Die für einen bestimmten Patienten wirksame Menge kann in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie dem Zustand und Typ der behandelten neoplastischen Krankheit, dem gesamten Gesundheitszustand des Patienten, dem Gewicht des Patienten, dem Darreichungsverfahren, der Stärke von Nebenwirkungen, der Menge und der Art anderer, gleichzeitig verwendeter Medikamente und ähnlichem variieren. Vorzugsweise wird IL-10 in der maximal tolerierbaren Dosis verabreicht. Genauso wird auch IL-2 in der maximal tolerierbaren Dosis verabreicht (z.B. etwa 10&sup5; E/kg, intravenös alle 8 Stunden in 50 ml einer 0,9-prozentigen Salzlösung mit 5 Prozent Albumin oder einem ähnlichen Träger). Vorzugsweise werden IL-2 und IL-10 gleichzeitig verabreicht.
- Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Die ausgewählten Vektoren und Wirte, die Konzentration der Reagentien, die Temperaturen und die Werte anderer Variablen sollen nur Beispiele für die Anwendung der vorliegenden Erfindung sein und nicht als Einschränkungen betrachtet werden.
- Ein synthetisches Human-CSIF-Gen wird aus mehreren chemisch synthetisierten doppelsträngigen DNA-Fragmenten unter Bildung eines als TAC-RBS-hCSIF bezeichneten Expressionsvektors zusammengesetzt. Das Klonieren und die Expression werden in einem bakterieilen Standardsystem durchgeführt, zum Beispiel im E. -coli-K-12- Stamm JM101, JM103 oder ähnlichen, wie es von Viera und Messing in Gene, Vol. 19, S. 259-268 (1982), beschrieben ist. Der Abbau mit Restriktions-Endonucleasen und Reaktionen mit Ligasen werden nach Standardvorschriften durchgeführt, z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).
- Das alkalische Verfahren (Maniatis et al., oben zitiert) wird für Plasmidpräparationen in kleinem Maßstab verwendet. Für Präparationen in großem Maßstab wird eine Abwandlung des alkalischen Verfahrens verwendet, bei der ein gleiches Volumen Isopropanol verwendet wird, um Nucleinsäuren aus dem geklärten Lysat auszufällen. Eine Fällung mit kaltem 2,5 M Ammoniumacetat wird verwendet, um RNA vor der Gleichgewichts-Dichtezentrifugation mit Cäsiumchlorid und Nachweis mit Ethidiumbromid zu entfernen.
- Für Filterhybridisierungen werden Whatman-540-Filterscheiben verwendet, um Kolonien auszuheben, die dann durch Behandlung (jeweils 2 Minuten) mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl und dann mit 1 M Tris HCl (pH 8,0), 1,5 M NaCl und dann durch Erhitzen auf 80ºC (30 min) lysiert und fixiert werden. Hybridisierungen erfolgen 6 h in 6xSSPE, 20% Formamid, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 100 mg/ml E.-coli-tRNA, 100 mg/ml Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio-Rad) bei 42ºC unter Verwendung ³²P-markierter (mit Kinase behandelter) synthetischer DNAs. (20xSSPE wird hergestellt, indem man 174 g NaCl, 27,6 g NaH&sub2;PO&sub4; 9H&sub2;O und 7,4 g EDTA in 800 ml H&sub2;O löst; der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,4 eingestellt, das Volumen wird auf 1 Liter aufgefüllt, und die Probe wird im Autoklaven sterilisiert.) Die Filter werden zweimal (15 min, Raumtemperatur) mit 1xSSPE, 0,1% SDS gewaschen. Nach Autoradiographie (Fuji RX Film) werden positive Kolonien lokalisiert, indem man die wiedergezüchteten Kolonien mit den blaugefärbten Kolonien auf den Filtern in einer Linie aufträgt. Die DNA wird nach dem Didesoxy- Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 74, S. 5463 (1977), sequenziert. Matrizen für die Didesoxy-Reaktionen sind entweder einzelsträngige DNAs relevanter Bereiche, die in M13mp-Vektoren rekloniert wurden (z.B. Messing et al., Nucleic Acids Res., Vol. 9, S. 309 (1981)), oder doppelsträngige DNA, die nach dem alkalischen Miniverfahren hergestellt und mit 0,2 M NaOH denaturiert (5 Minuten, Raumtemperatur) und durch Zugabe von 2 Volumina Ethanol aus 0,2 M NaOH, 1,43 M Ammoniumacetat ausgefällt wurde. DNA wird durch Phosphoramidit-Chemie unter Verwendung von 380A-Synthesegeräten (Applied-Biosystems) synthetisiert; Synthese, Entfernung der Schutzgruppen, Spaltung und Reinigung (7 M Harnstoff PAGE, Elution, DEAE-Cellulose-Chromatographie) erfolgen wie im Handbuch des 380A-Synthesegeräts beschrieben.
- Komplementäre Stränge synthetischer DNAS, die kloniert werden sollen (jeweils 400 ng), werden in einem Reaktionsvolumen von 50 ml gemischt und mit Polynucleotid-Kinase phosphoryliert. Diese DNA wird in einem Volumen von 50 ml bei Raumtemperatur 4 bis 12 Stunden mit 1 mg Vektor-DNA, die mit geeigneten Restriktionsenzymen abgebaut wurde, ligasiert. Die Bedingungen für die Phosphorylierung, Abbau mit Restriktionsenzymen, Polymerasereaktionen und Ligasierung sind beschrieben worden (Maniatis et al., oben zitiert). Die Kolonien werden auf lacZ+ durchmustert (falls gewünscht), indem man sie auf L-Agarplatten ausbreitet, die mit Ampicillin, Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid (IPTG) (0,4 mM) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (x-gal) (40 mg/ml) versetzt wurden.
- Der TAC-RBS-Vektor wird aufgebaut, indem man mit DNA-Polymerase die einzelne Bam-HI-Stelle des tacP-tragenden Plasmids pDR540 (Pharmacia) auffüllt. Dieser wird dann mit unphosphorylierten synthetischen Oligonucleotiden (Pharmacia) ligasiert, die ein doppelsträngiges Fragment bilden, das für einen Consensus-Ribosombindungsbereich codiert, wie er hier in SEQ.-ID. Nr. 5 angegeben und als RBS bezeichnet wird. Nach der Ligasierung wird das Gemisch phosphoryliert und wieder mit dem SstI-Linker ATGAGCTCAT ligasiert. Dieser Komplex wird dann mit SstI und EcoRI gespalten, und das Fragment mit 173 Basenpaaren (bp) wird durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) isoliert und in EcoRI-SstI-restringiertes pUClg (Pharmacia) einkloniert (wie unten beschrieben). Die Sequenz der RBS-ATG-Polylinker-Bereiche der endgültigen Konstruktion (TAC-RBS genannt) ist in Figur 3 gezeigt.
- Das synthetische IL-10-Gen wird in acht Schritten in ein pUC19- Plasmid eingebaut. Nach jedem Schritt können Einschübe, die frei von Deletionen und/oder Insertionen sind, nach dem Klonieren nachgewiesen werden, indem man das lacZ(α)-Gen von pUC19 im selben Raster wie das in Schritt 1 eingefügte Startcodon ATG hält. Klone, die Deletions- und/oder Insertionsveränderungen enthalten, können ausgefiltert werden, indem man auf L-Ampicillin-Platten, die x-gal und IPTG enthalten, auf blaue Kolonien hin durchmustert. Alternativ dazu lassen sich Einschubsequenzen bei jedem Schritt leicht bestätigen, indem man einen Universal- Sequenzierungs-Primer für Plasmid-DNA-Präparationen in kleinem Maßstab verwendet, wie er z.B. von Boehringer Mannheim erhältlich ist.
- In Schritt 1 wird der TAC-RBS-Vektor mit SstI abgebaut, mit T4- DNA-Polymerase (deren 3'-Exonuclease-Aktivität die auf der 3'- Seite hervorstehenden Stränge der SstI-Schnittstellen unter Bildung von Fragmenten mit glatten Enden abbaut) behandelt und nach der Desaktivierung der T4-DNA-Polymerase mit EcoRI behandelt, wobei sich ein 173-bp-Fragment bildet, das den TAC-RBS- Bereich enthält und ein glattes Ende am Startcodon ATG sowie die EcoRI-Schnittstelle am anderen Ende aufweist. Schließlich wird das 173-bp-TAC-RBS-Fragment isoliert.
- In Schritt 2 wird das isolierte TAC-RBS-Fragment aus Schritt 1 gemischt mit einem EcoRI/KpnI-abgebauten Plasmid pUC19 und dem in SEQ.-ID. Nr. 6 gezeigten synthetischen Fragment 1A/B, das, wie unten gezeigt, an seinem Upstream-Terminus ein glattes Ende und an seinem Downstream-Terminus ein versetztes Ende, das einer KpnI-Schnittstelle entspricht, aufweist. Dieses KpnI-Ende liegt stromabwärts in der Nähe einer BstEII-Stelle. Die Fragmente werden unter Bildung des pUC19 von Schritt 2 ligasiert.
- In Schritt 3 werden die synthetischen Fragmente 2A/B, das in SEQ.-ID. Nr. 7 gezeigt ist, und 3A/B, das in SEQ.-ID. Nr. 8 gezeigt ist, mit dem BstEII/SmaI-abgebauten pUC19 von Schritt 2 (nach Amplifikation und Reinigung) gemischt und unter Bildung von pUC19 von Schritt 3 ligasiert. Man beachte, daß der Downstream- Terminus des Fragments 3A/B zusätzliche Basen enthält, die das glatte Ende an der SmaI-Stelle bilden. Diese zusätzlichen Basen werden in Schritt 4 abgespalten. Außerdem weisen die Fragmente 2A/B und 3A/B komplementäre einzelsträngige Enden mit 9 Resten auf, die sich beim Zusammenmischen aneinanderlegen, so daß zur Ligasierung an das pUC19 stromaufwärts die BstEII-Schnittstelle von 2A/B und stromabwärts das glatte Ende von 3A/B zurückbleiben.
- In Schritt 4 wird das pUC19 von Schritt 3 mit AflII/XbaI abgebaut, amplifiziert, gereinigt, erneut gereinigt, mit dem in SEQ.- ID. Nr. 9 gezeigten synthetischen Fragment 4A/B gemischt und unter Bildung von pUC19 von Schritt 4 ligasiert.
- In Schritt 5 wird das pUC19 von Schritt 4 mit XbaI/SalI abgebaut, amplifiziert und gereinigt und mit dem in SEQ.-ID. Nr. 10 gezeigten synthetischen Fragment 5A/B gemischt und unter Bildung von pUC19 von Schritt 5 ligasiert. Man beachte, daß das versetzte SAlI-Ende von Fragment 5A/B durch Abbau mit HpaI in Schritt 6 eliminiert wird.
- In Schritt 6 wird das pUC19 von Schritt 5 mit HpaI/PstI abgebaut, amplifiziert und gereinigt und mit dem in SEQ.-ID. Nr. 11 gezeigten synthetischen Fragment 6A/B gemischt und unter Bildung von pUC19 von Schritt 6 ligasiert.
- In Schritt 7 wird das pUC19 von Schritt 6 mit ClaI/SphI abgebaut, amplifiziert und gereinigt und mit dem in SEQ.-ID. Nr. 12 gezeigten synthetischen Fragment 7A/B gemischt und unter Bildung von pUC19 von Schritt 7 ligasiert.
- In Schritt 8 wird das pUC19 von Schritt 7 mit MluI/HindIII abgebaut, amplifiziert und gereinigt und mit den synthetischen Fragmenten 8A/B, das in SEQ.-ID. Nr. 13 gezeigt wird, und 9A/B, das in SEQ.-ID. Nr. 14 gezeigt wird, gemischt und mit Standardtechniken unter Bildung der endgültigen Konstruktion, die dann in den E.-coli-K-12-Stamm JM101, der z.B. von der ATCC unter der Zugriffsnummer 33876 erhältlich ist, eingefügt wird, ligasiert. Nach der Kultivierung wird Protein aus den JM101-Zellen extrahiert, und Verdünnungen der Extrakte werden auf biologische Aktivität getestet.
- Ein Gen, das das offene Leseraster für vIL-10 codiert, wurde durch Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert, wobei Primer verwendet wurden, die ein späteres Einfügen des amplifizierten Fragments in einen EcoRI-abgebauten pcD(SRα)-Vektor (Figur 1) erlauben. Der codierende Strang des eingefügten Fragments ist in SEQ.-ID. Nr. 15 gezeigt.
- Klone, die den Einschub in der richtigen Orientierung trugen, wurden durch Expression von vIL-10 und/oder das Elektrophoresemuster von Restriktionsabbauprodukten identifiziert. Ein solcher Vektor, der das vIL-10-Gen trug, wurde als pBCRF1 (SRα) bezeichnet und bei der ATCC unter der Zugriffsnummer 68193 hinterlegt. pBCRF1(SRα) wurde in E. coli MC1061 amplifiziert, mit Standardtechniken isoliert und wie folgt verwendet, um COS7-Affenzellen zu transfizieren: Einen Tag vor der Transfektion wurde eine Kultur von ungefähr 1,5 x 10&sup6; COS7-Affenzellen auf einzelnen 100- mm-Platten in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DME), das 5% fetales Kälberserum (FCS) und 2 mM Glutamin enthielt, angesetzt. Zur Durchführung der Transfektion wurden COS7-Zellen durch Inkubation mit Trypsin aus den Schalen entnommen, zweimal in serumfreiem DME gewaschen und mit 10&sup7; Zellen/ml in serumfreiem DME suspendiert. Ein 0,75-ml-Aliquot wurde mit 20 ug DNA gemischt und in eine sterile 0,4-cm-Elektroporationsküvette übergeführt. Nach 10 Minuten wurden die Zellen in einer BioRad-Gene-Pulser-Einheit bei 200 Volt mit 960 uf gepulst. Nach weiteren 10 Minuten wurden die Zellen aus der Küvette entnommen und zu 20 ml DME, das 5% FCS, 2 mM Glutamin, Penicillin, Streptomycin und Gentamicin enthielt, gegeben. Das Gemisch wurde in Aliquoten auf vier 100-mm- Gewebekulturschalen verteilt. Nach 12-24 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2; wurde das Medium durch ein ähnliches Medium ersetzt, das nur 1% FCS enthielt, und die Inkubation wurde weitere 72 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;, fortgesetzt; danach wurde das Medium entnommen und auf seine Fähigkeit, IFN-γ-Synthese zu hemmen, getestet.
- 10-ml-Aliquote frisch isolierter PBLs (etwa 2 x 10&sup6; Zellen/ml) wurden bei 37ºC mit PHA (100 ng/ml) in einem Medium inkubiert, das aus (i) 90% DME, dem 5% FCS und 2 mM Glutamin zugesetzt worden war, und (ii) 10% Überstand von COS7-Zellen, die zuvor mit pBCRF1(SRα) transfiziert worden waren, bestand. Nach 24 Stunden wurden die Zellen und Überstände abgetrennt, um sie auf die Gegenwart von IFN-γ-mRNA bzw. IFN-γ-Protein zu testen. Kontrollen wurden genauso behandelt, außer daß die 10% Überstand von COS7- Kulturen stammten, die zuvor mit einem Plasmid transfiziert worden waren, das einen ganz anderen cDNA-Einschub trug. Die mit vIL-10 behandelten Proben zeigten eine etwa 50%ige Inhibition der IFN-γ-Synthese im Vergleich zu den Kontrollen.
- Ein Gen, das für das in SEQ.-ID. Nr. 4 gezeigte vIL-10 codiert, kann in E. coli exprimiert werden.
- Der cDNA-Einschub von pBCRF1(SRα) wird in ein M13-Plasmid rekloniert, wo er durch ortsspezifische Mutagenese zweimal abgeändert wird: zuerst unter Bildung einer ClaI-Stelle am 5'-Ende des für das reife vIL-10-Polypeptid codierenden Bereichs und zweitens unter Bildung einer BamHI-Stelle am 3'-Ende des für das reife vIL-10-Polypeptid codierenden Bereichs. Die mutierte Sequenz wird dann leicht in den unten beschriebenen TRPC11- Expressionsvektor eingefügt.
- Der TRPC11-Vektor wurde aufgebaut, indem man ein synthetisches Consensus-RBS-Fragment an ClaI-Linker (ATGCAT) ligasierte und die resultierenden Fragmente in ClaI-restringiertes pMT11hc (das zuvor so abgeändert wurde, daß es die ClaI-Stelle enthielt) einklonierte. pMT11hc ist ein kleines (2,3 kb) High-Copy-AMPR-TETS- Derivat von pBR322, das den EcoRI-HindIII-Polylinkerbereich des πVX-Plasmids trägt. (πVX wird beschrieben von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.) Dieses wurde so abgeändert, daß es die ClaI- Stelle enthielt, indem man pMT11hc mit EcoRI und BamHI restringierte, die resultierenden klebrigen Enden auffüllte und mit ClaI-Linker (CATCGATG) ligasierte, wodurch die EcoRI- und die BamHI-Stelle wiederhergestellt wurden und die SmaI-Stelle durch eine ClaI-Stelle ersetzt wurde. Ein Transformant aus der TRPC11- Konstruktion hatte eine von ClaI-Stellen flankierte Tandem-RBS- Sequenz. Eine der ClaI-Stellen und ein Teil der zweiten Kopie der RBS-Sequenz wurden entfernt, indem man dieses Plasmid mit PstI abbaute, mit Bal31-Nuclease behandelte, mit EcoRI restringierte und in Gegenwart aller vier Desoxyribonucleotidtriphosphate mit T4-DNA-Polymerase behandelte. Die resultierenden 30-40-bp-Fragmente wurden durch PAGE gewonnen und in SmaI-restringiertes pUC12 einkloniert. Ein von pKC101 abgeleitetes E.-coli-trpP-tragendes 248-bp-EcoRI-Fragment (beschrieben von Nichols et al. in Methods in Enzymology, Vol. 101, S. 155 (Academic Press, N.Y. 1983)) wurde dann in den EcoRI-Bereich einkloniert, wodurch der Aufbau des TRPC11, der in Figur 2 veranschaulicht ist, beendet wurde. TRPC11 wird als Vektor für vIL-10 verwendet, indem man es zuerst mit ClaI und BamHI abbaute, reinigte und dann in einer Standard- Ligasierungslösung mit dem ClaI-BamHI-Fragment des M13, das die für das reife BCRF1 codierende Nucleotidsequenz enthielt, mischte. Das den Einschub enthaltende TRPC11, das als TRPC11- BCRF1 bezeichnet wird, kann im E.-coli-K12-Stamm JM101, der z.B. von der ATCC unter der Zugriffsnummer 33876 erhältlich ist, vermehrt werden.
- Dieses Beispiel zeigt, daß IL-4, hIL-10 und vIL-10 die Synthese von Interferon-γ (INFγ) und von Tumornekrosefaktor-α (TNFα) durch IL-2-stimulierte mononucleare Zellen des peripheren Blutkreislaufs (PBMCs) hemmen, daß aber nur IL-4 die INFγ-Synthese durch gereinigte NK-Zellen hemmt. Bei Zugabe von Monocyten, aber nicht von T-Zellen, als Hilfszellen tritt die inhibitorische Wirkung von hIL-10/vIL-10 auf die INFγ-Synthese durch NK-Zellen wieder auf. Im Unterschied zu IL-4 hemmen hIL-10 und vIL-10 nicht die Induktion lymphokin-aktivierter Killeraktivität (LAK) in PBMCs durch IL-2. IL-4 und IL-10 wirken also durch unterschiedliche Mechanismen auf NK-Zellen.
- Rekombinantes hIL-10, vIL-10 und hIL-4 wurden auf ihre Wirkungen auf die Synthese von INFγ und TNFα sowie auf die durch IL-2 in PBMCs induzierte LAK-Aktivität getestet. Zellen wurden 5 Tage in 200 E/ml rIL-2 mit entweder IL-4 (200 Einheiten/ml) oder COS7- Überständen, die hIL-10, vIL-10 oder kein Cytokin (Blindprobe) enthielten, kultiviert; danach wurde die Cytokinsynthese gemessen. Die LAK-Aktivität gegen die Burkitt-Lymphomzellinie Daudi, die durch LAK-Zellen wirksam abgetötet wird, nicht jedoch durch frische NK-Zellen, wurde ebenfalls bewertet. Die IL-2-induzierte INFγ- und TNFα-Synthese in Kulturen, die hIL-10, vIL-10 oder IL-4 enthielten, wurde wesentlich gehemmt (Fig. 3). Dagegen wurde die IL-2-induzierte LAK-Aktivität gegen Daudi-Zellen nur in Kulturen gehemmt, die IL-4 enthielten, und wurde in den hIL-10- und vIL- 10-Kulturen nicht verändert oder sogar leicht erhöht (Fig. 4a). Die IL-2-induzierte LAK-Aktivität wird in erster Linie durch CD56&spplus;-(Leu19&spplus;)-NK-Zellen vermittelt; siehe Phillips et al., J. Exp. Med., Vol. 164, S. 814-825 (1986), und Ortaldo et al., J. Exp. Med., Vol. 164, S. 1193-1205 (1986). Um den Phänotyp von LAK-Zellen zu bestimmen, der in PBMCs induziert wird, die mit IL-2 und hIL-10 oder vIL-10 kultiviert wurden, wurden CD56&spplus;- und CD56&supmin;-Populationen durch FACS sortiert und auf Cytotoxizität gegen Daudi-Zellen getestet. Figur 4b zeigt, daß, wie mit IL-2 allein, eine signifikante LAK-Aktivität nur in der CD56&spplus;-Population beobachtet wurde. Während also IL-4 und IL-10 beide die IL-2-induzierte Synthese von INFγ und TNFα hemmen, hemmt nur IL-4 die IL-2-induzierte Cytotoxizität in PBMCs.
- Der größte Teil der IL-2-induzierten IFNγ-Synthese in PBMCs stammt von NK-Zellen und nicht von T-Zellen, z.B. Trinchieri et al., J. Ex-. Med., Vol. 160, S. 1147-1169 (1984). Daher wurde die Wirkung von hIL-10, vIL-10 und IL-4 auf die IL-2-induzierte IFNγ- Synthese durch FACS-gereinigte NK-Zellen (Reinheit > 99,5%) getestet. IL-4 hemmte die die IL-2-induzierte IFNγ-Sekretion durch diese Zellen; dagegen unterdrückten weder hIL-10 noch vIL-10 die IFNγ-Synthese durch gereinigte frische NK-Zellen (Fig. 5a).
- Daß die IFNγ-Synthese in Kulturen von PBMC, aber nicht von reinen NK-Zellen durch IL-10 gehemmt wurde, legte nahe, daß diese Wirkung von IL-10 durch eine Hilfszellpopulation vermittelt wurde. NK-Zellen wurden durch Aussortieren von CD56&spplus;-Zellen aus der durch Percoll-Gradientenzentrifugation erhaltenen Zellfraktion mit geringer Dichte gereinigt und mit an Kunststoff haftenden Zellen oder mit der Zellpopulation mit hoher Dichte (98% T-Zellen) gemischt. Die Zugabe haftender Zellen zu den NK-Zellen erhöhte stark die IL-2-induzierte IFNγ-Produktion durch NK-Zellen. Diese stimulierende Wirkung haftender Zellen wurde durch IL-10 blockiert (Fig. 5b). Die T-Zellen-haltige Fraktion hatte keine Wirkung auf die IL-2-induzierte IFNγ-Produktion durch NK-Zellen und vermittelte nicht die Inhibition der IFNγ-Produktion durch IL-10 (Fig. 5b). Obwohl die meisten der an Kunststoff haftenden Zellen Monocyten sind, wurde bestätigt, daß Monocyten sowohl die IL-2-induzierte IFNγ-Produktion erhöhen als auch ihre Hemmung durch IL-10 vermitteln: NK-Zellen und CD14&spplus;-Monocyten wurden durch Aussortieren gereinigt und in Gegenwart von IL-2 und IL-10 kultiviert. Fig. 3c zeigt, daß die Zugabe gereinigter Monocyten zu NK-Zellen die IL-2-induzierte IFNγ-Produktion erhöhte. Überdies hemmte IL-10 die IL-2-induzierte IFNW-Produktion nur in Gegenwart von Monocyten.
- Diese Ergebnisse zeigen, daß IL-4 und IL-10 (human oder viral) die IFNγ- und TNFα-Synthese durch IL-2-stimulierte PBMCs unterdrückte, daß aber nur IL-4 die IL-2-induzierte LAK-Aktivität hemmte. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, daß die IL-2- induzierte Cytokinproduktion und Cytotoxizität durch NK-Zellen auf verschiedenen Wegen reguliert werden. Weiterhin ist die inhibitorische Wirkung von IL-10 auf die IFNγ-Synthese durch NK-Zellen indirekt und wird durch Monocyten vermittelt, während IL-4 in Abwesenheit von Hilfszellen auf NK-Zellen wirkt.
- IL-4, hIL-10 und vIL-10 hemmen die INFγ-Synthese durch IL-2-aktivierte PBFMCs (Fig. 3). Human-PBMCs wurden durch Zentrifugation über Ficoll-Hypaque aus Leukozytenstrata von gesunden Spendern isoliert und mit 10&sup6;/ml in rIL-2 (200 Einheiten/ml) mit entweder rIL-4 (200 Einheiten/ml), 10% COS-hIL-10, 10% COS-vIL-10 oder 10% COS-Blindprobe in Yssels Medium mit 1% Human-AB+-Serum (siehe Yssel et al., Immunol. Meth., Vol. 72, S. 219-227 (1984)) kultiviert. Die Kulturen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen durchgeführt, und die Überstände wurden abgenommen, um INFγ durch ELISA zu messen, wie z.B. von Hsu et al., Science, Vol. 250, S. 830-832 (1990), beschrieben. TNFα wurde ebenfalls durch ELISA gemessen (Endogen, Boston, MA). Die Cytokinproduktion in Abwesenheit von IL-2 war unterhalb der Empfindlichkeitsgrenzen der INFγ- und TNFα-ELISAs, die 0,3 ng/ml bzw. 10 pg/ml betrugen. Die Fehlerbalken zeigen den Bereich von zwei Proben. PBMCs von verschiedenen Spendern variierten in ihrer Fähigkeit, bei Stimulation durch IL-2 IFNγ und TNFα zu erzeugen; diese Experimente wurden jedoch mehr als ein Dutzend mal (für IFNγ) und dreimal (für TNFα) mit qualitativ ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
- IL-4, aber nicht hIL-10 oder vIL-10, hemmt die durch IL-2 in PBMCs induzierte Cytotoxizität (Fig. 4a). PBMCs aus einem ähnlichen Experiment wie das von Fig. 1 wurden zusammen mit den Überständen gewonnen und auf Cytotoxizität gegen &sup5;¹Cr-markierte Daudi-Zellen getestet. Die LAK-Aktivität wird durch CD56&spplus;-Zellen in mit IL-2 und IL-10 kultivierten PBMCs ausgedrückt (Fig. 4b). PBMCs wurden mit an FITC konjugiertem Anti-CD56-Antikörper angefärbt und auf einem FacStar Plus (Becton-Dickinson, San Jose, CA) aussortiert. Die cytotoxische Aktivität in den CD56&spplus;- und CD56&supmin;Fraktionen (Reinheit 99,7%) wurde getestet, wie von Spits et al., J. Immunol., Vol. 141, S. 29-36 (1988) beschrieben.
- Die IL-2-induzierte INFγ-Synthese durch gereinigte NK-Zellen wird durch IL-4 direkt gehemmt, nicht aber durch hIL-10 oder vIL-10 (Fig. 5a). FACS-gereinigte NK-Zellen (Reinheit > 99,5%) wurden 4-5 Tage mit 106 Zellen/ml mit 200 Einheiten/ml rIL-2 mit entweder 500 Einheiten/ml rIL-4 oder COS-hIL-10-, COS-vIL-10- oder COS-Blindprobe-Überständen (10%) in Yssels Medium kultiviert, und dann wurden die Überstände von je zwei Kulturen gewonnen und zur Messung von IFNγ durch ELISA gemischt. Bei Zugabe von haftenden Zellen, aber nicht von T-Zellen, trat die IL-10-vermittelte Hemmung der IL-2-induzierten INFγ-Synthese durch gereinigte NK-Zellen (Fig. 5b) wieder auf. Bei Zugabe gereinigter Monocyten trat die IL-10-vermittelte Hemmung der IL-2-induzierten INFγ- Synthese durch gereinigte NK-Zellen wieder auf. Monocyten allein erzeugten kein IFNγ (Fig. 5c). PBMCs wurden gewaschen und 40 Minuten bei 37ºC in Gewebekulturschalen inkubiert. Haftende Zellen wurden durch Abkratzen mit einem Gummiwischer gewonnen. Nichthaftende Zellen wurden entnommen, sedimentiert und auf eine Nylonwollesäule aufgetragen und 40 min bei 37ºC inkubiert. Nach der Elution von der Säule wurden die Zellen sedimentiert und in 30% Percoll mit 10% FCS/PBS resuspendiert und auf 40% Percoll geschichtet. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei Raumtemperatur wurden die großen granulären Lymphocyten an der Grenzfläche gewonnen und zweimal gewaschen. Diese Zellen wurden 30 min bei 4º mit Anti-CD56-Antikörper (Becton-Dickinson, San Jose, CA) inkubiert, gewaschen und dann vor dem Aussortieren durch FACS mit Ziegen-Anti-Maus-FITC (Jackson Immunoresearch, Avondale, PA) angefärbt. CD56&spplus;-Zellen machten etwa 35-50% der aussortierten Zellen aus. Bei der erneuten Analyse waren mehr als 99,5% der aussortierten Zellen CD56&spplus;. 9 10&sup5; gereinigte NK-Zellen wurden mit 3 x 10&sup5; haftenden Zellen oder T-Zellen in einem Endvolumen von 100 ml gemischt und wie oben beschrieben mit IL-2 + hIL-10, vIL-10 oder Blindprobenüberstand kultiviert. Die Überstände wurden entnommen und auf IFNγ-Produktion getestet. Die Fehlerbalken zeigen den Bereich von zwei Proben. NK-Zellen und Monocyten von demselben Spender wurden wie folgt erhalten: PBMCs wurden über Nacht mit roten Blutkörperchen vom Schaf inkubiert; rosettenbildende (CD2&spplus;) und nichtrosettenbildende Zellen wurden durch Zentrifugation über einen Ficoll-Hypaque-Gradienten getrennt. E&spplus;-Zellen wurden demselben Reinigungsverfahren unterworfen, wie es für PBMCs beschrieben wurde (siehe oben), um gereinigte NK-Zellen zu erhalten. E&supmin;-Zellen wurden anschließend mit Anti-CD14-mAB (LeuM3) und FITC-markiertem Ziegen-Anti-Maus- IgG-Antikörper inkubiert, und die CD14&spplus;-Zellen wurden mit dem FACStar plus aussortiert. Die Reinheit dieser Zellen betrug mehr als 98%. 10&sup6; gereinigte NK-Zellen wurden mit 10&sup5; reinen Monocyten in 100 ml gemischt und wie oben beschrieben allein oder mit IL-2 + hIL-10, vIL-10 oder Blindprobenüberstand kultiviert. Die Überstände wurden entnommen und auf IFNγ-Produktion getestet. Die IFNγ-Produktion in Abwesenheit von IL-2 war unterhalb der Nachweisgrenzen. Fehlerbalken zeigen den Bereich von zwei Proben. NK-Zellen von verschiedenen Spendern variierten in ihrer Fähigkeit, IFNγ zu erzeugen.
- Die Beschreibungen der obigen Ausführungsformen der Erfindung wurden zum Zwecke der Erläuterung und Beschreibung angegeben. Sie sollen nicht erschöpfend sein oder die Erfindung auf die genauen offenbarten Formen einschränken, und offensichtlich sind im Lichte der obigen Lehre viele Abwandlungen und Variationen möglich. Die Ausführungsformen wurden ausgewählt und beschrieben, um die Prinzipien der Erfindung optimal zu erklären und dadurch andere Fachleute in die Lage zu versetzen, die Erfindung in verschiedenen Ausführungsformen und mit verschiedenen Abwandlungen, die für die besondere betrachtete Verwendung geeignet sind, optimal zu nutzen. Der Umfang der Erfindung soll durch die beigefügten Ansprüche definiert werden.
- Am 20. Dezember 1989 hinterlegten die Anmelder getrennte Kulturen von E. coli MC1061, die pH5C, pH15C und pBCRF1(SRα) trugen, bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) unter den Zugriffsnummern 68191, 68192 bzw. 68193. Diese Hinterlegungen erfolgten unter den Bedingungen der Zustimmung der ATCC zum Culture Deposit for Patent Purposes, das gewährleistet, daß die Hinterlegung gemäß 35 USC 122 und 37 CFR 1.14 dem US Commissioner of Patents and Trademarks zugänglich gemacht wird und bei Erteilung eines US-Patents der Öffentlichkeit zugänglich gemacht werden wird, was erfordert, daß die Hinterlegung aufrechterhalten wird. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Stammes soll nicht als eine Lizenz zur Durchführung der Erfindung entgegen den unter der Autorität irgendeiner Regierung im Einklang mit ihren Patentgesetzen erteilten Rechten angesehen werden.
- Die Hinterlegungen wurden so abgeändert, daß sie die Forderungen des Budapester Abkommens erfüllen.
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 178 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- EIGENSCHAFTEN: Human-IL-10 (Human-Cytokin-Syntheseinhibitorischer Faktor, Human-CSIF)
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 170 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
- EIGENSCHAFTEN: Virales IL-10 (BCRF1)
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 160 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
- (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- (A) ORGANISMUS: Homo sapiens
- EIGENSCHAFTEN: Reifes Human-IL-10 (reifes Human-CSIF)
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 147 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
- EIGENSCHAFTEN: Virales IL-10 (BCRF1)
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 15 Basen
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS
- UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: synthetisch (kommerziell, Pharmacia)
- MERKMALE: doppelsträngiges Fragment, das eine Consensus-Ribosombindungsstelle codiert
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5: GTAAGGAGGT TTAAC
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 56 Basenpaare mit klebrigem Ende aus 4 Basen
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Doppel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS
- UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: synthetisch
- MERKMALE: Kleinbuchstaben zeigen an, daß eine Base von der der nativen Sequenz an derselben Stelle abweicht
- EIGENSCHAFTEN: Fragment 1A/B von synthetischem CSIF-Gen
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 48 Basenpaare mit klebrigen Enden aus 5 bzw. 9 Basen
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Doppel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS
- UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: synthetisch
- MERKMALE: Kleinbuchstaben zeigen an, daß eine Base von der der nativen Sequenz an derselben Stelle abweicht
- EIGENSCHAFTEN: Fragment 2A/B von synthetischem CSIF-Gen
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 35 Basenpaare mit klebrigem Ende aus 9 Basen
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Doppel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS
- UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: synthetisch
- MERKMALE: Kleinbuchstaben zeigen an, daß eine Base von der der nativen Sequenz an derselben Stelle abweicht
- EIGENSCHAFTEN: Fragment 3A/B von synthetischem CSIF-Gen
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 69 Basenpaare mit klebrigem Ende aus 4 Basen
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Doppel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS
- UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: synthetisch
- MERKMALE: Kleinbuchstaben zeigen an, daß eine Base von der der nativen Sequenz an derselben Stelle abweicht
- EIGENSCHAFTEN: Fragment 4A/B von synthetischem CSIF-Gen
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 61 Basenpaare mit klebrigem Ende aus 4 Basen
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Doppel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS
- UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: synthetisch
- MERKMALE: Kleinbuchstaben zeigen an, daß eine Base von der der nativen Sequenz an derselben Stelle abweicht
- EIGENSCHAFTEN: Fragment 5A/B von synthetischem CSIF-Gen
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 11:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 61 Basenpaare mit klebrigem Ende aus 4 Basen
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Doppel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS
- UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: synthetisch
- MERKMALE: Kleinbuchstaben zeigen an, daß eine Base von der der nativen Sequenz an derselben Stelle abweicht
- EIGENSCHAFTEN: Fragment 6A/B von synthetischem CSIF-Gen
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 12:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE:
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Doppel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS
- UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: synthetisch
- MERKMALE: Kleinbuchstaben zeigen an, daß eine Base von der der nativen Sequenz an derselben Stelle abweicht
- EIGENSCHAFTEN: Fragment 7A/B von synthetischem CSIF-Gen (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 13:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 45 Basenpaare mit klebrigen Enden aus 4 bzw. 9 Basen
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Doppel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS
- UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: synthetisch
- MERKMALE: Kleinbuchstaben zeigen an, daß eine Base von der der nativen Sequenz an derselben Stelle abweicht
- EIGENSCHAFTEN: Fragment 8A/B von synthetischem CSIF-Gen
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 14:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 51 Basenpaare mit klebrigen Enden aus 9 bzw. 4 Basen
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Doppel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS
- UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: synthetisch
- MERKMALE: Kleinbuchstaben zeigen an, daß eine Base von der der nativen Sequenz an derselben Stelle abweicht
- EIGENSCHAFTEN: Fragment 9A/B von synthetischem CSIF-Gen
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
- (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 15:
- (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 499 Basen
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS
- EIGENSCHAFTEN: codiert virales IL-10
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
Claims (10)
1. Verwendung von Interleukin-10 bei der Herstellung eines
Medikaments zur Verabreichung an einen Patienten, um
Cytokin-induzierte Nebenwirkungen bei der passiven
Immunotherapie von Krebs zu reduzieren.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die passive
Immunotherapie das Übertragen funktionaler krebsbekämpfender
Zellen auf einen Patienten umfaßt.
3. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei die krebsbekämpfenden
Zellen kultivierte tumorinfiltrierende Lymphocyten sind.
4. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die kultivierten
tumorinfiltrierenden Lymphocyten hergestellt werden, indem man
tumorinfiltrierende Lymphocyten in Gegenwart von
Interleukin-2 und Interleukin-10 kultiviert, so daß die
tumorinfiltrierenden Lymphocyten sich vermehren.
5. Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die kultivierten
tumorinfiltrierenden Lymphocyten von einem aus dem Patienten
herausgeschnittenen Tumor stammen.
6. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die
passive Immunotherapie den Schritt des Verabreichens von
etwa 1 x 10¹&sup0; bis etwa 2 x 10¹¹ tumorinfiltrierenden
Lymphocyten durch intravenöse Infusion umfaßt.
7. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
die passive Immunotherapie die Schritte des Kultivierens
tumorinfiltrierender Lymphocyten in Gegenwart von
Interleukin-2 und Interleukin-10, so daß die
tumorinfiltrierenden Lymphocyten sich vermehren, des Verabreichens der
kultivierten tumorinfiltrierenden Lymphocyten an den
Patienten sowie des Verabreichens einer wirksamen Menge
Interleukin-2 und einer wirksamen Menge Interleukin-10 an
den Patienten nach der Verabreichung der kultivierten
tumorinfiltrierenden Lymphocyten umfaßt.
8. Verwendung von Interleukin-2 bei der Herstellung eines
Medikaments zur Verabreichung an einen Patienten bei der
passiven Immunotherapie von Krebs, wobei auch
Interleukin-10 verabreicht wird, um Cytokin-induzierte Nebenwirkungen
zu reduzieren.
9. Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die passive
Immunotherapie wie in einem der Ansprüche 2 bis 7 definiert ist.
10. Verfahren des Züchtens tumorinfiltrierender Lymphocyten zur
Verwendung bei der Behandlung von Krebs, das den Schritt
des Kultivierens tumorinfiltrierender Lymphocyten in
Gegenwart von Interleukin-2 und Interleukin-10, so daß die
tumorinfiltrierenden Lymphocyten sich vermehren, einschließt.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64134291A | 1991-01-16 | 1991-01-16 | |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69203443D1 DE69203443D1 (de) | 1995-08-17 |
| DE69203443T2 true DE69203443T2 (de) | 1995-12-07 |
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ID=24571960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69203443T Expired - Fee Related DE69203443T2 (de) | 1991-01-16 | 1992-01-15 | Verwendung von interleukin-10 in der adoptive immunotherapie von krebs. |
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|---|---|
| US (1) | US5776451A (de) |
| EP (2) | EP0495639A1 (de) |
| JP (1) | JPH06505250A (de) |
| CN (1) | CN1063308A (de) |
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