Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Behandeln von
Epstein-Barr-Virusinfektionen (EBV) durch Verabreichen von
Antagonisten gegen das EBV-Protein BCRF1.
HINTERGRUND
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Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist ein allgegenwärtiges
menschliches Herpesvirus, das zuerst im Zusammenhang mit der
afrikanischen (endemischen oder e-) Form des Burkitt Lymphoms entdeckt
wurde. In der Folge wurde das Virus auch zusaininen mit dem
Nasopharyngealkarzinom gefunden und es wurde gezeigt, daß es der
Verursacher von infektiöser Mononukleose ist. Die Infektion
tritt üblicherweise während der frühen Kindheit auf und hat im
allgemeinen eine subklinische Manifestation mit gelegentlich
milden Symptomen zur Folge. Eine Infektion während des
Heranwachsens oder im Erwachsenenalter kann jedoch eine infektiöse
Mononukleose hervorrufen, die durch Angina, Fieber und
Lymphadenopathie gekennzeichnet ist. Die meisten Fälle von infektiöser
Mononukleose lösen sich in einer bis drei Wochen auf, obschon
Unwohlsein und Müdigkeit gelegentlich mehrere Wochen bis Monate
andauern. Komplikationen, die gelegentlich auftreten, schließen
eine extreme Vergrößerung der Mandeln, Thrombozytopenie,
Nilzruptur, Gelbsucht und Enzephalitis ein. Ferner können bei
immungeschädigten Patienten, wie etwa Transplantatempfänger und AIDS-
Patienten, EBV-Infektionen zu lymphoproliferativen Störungen der
B-Zellen führen. College- und militärische Bevölkerung erleiden
die höchste Sterblichkeit durch infektiöse Mononukleose, die
z.B. für 5 Prozent aller Krankenhauseinweisungen von Studenten
der Universität von Wisconsin verantwortlich ist, und an vierter
Stelle als Ursache durch Krankheit verlorener Tage beim Personal
der Armee steht; Thorley-Lason, Biochimica et Biophysica Acta,
Bd. 948, S. 263-286 (1988); Schooley et al., Kapitel 126 in
Mandell et al., Hrsg., Principles and Practice of Infectious
Diseases, 2. Ausg. (John Wiley & Sons, New York, 1985).
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Hudson et al. (Virology, Bd. 147, Nr. 1 [Nov. 1985], S. 81-98)
beschreiben die kurze, eigentümliche Region des B95-8-Epstein-
Barr-Virusgenoms und führen einen hypothetischen offenen
Leserahmen an, der bei Base 9675 beginnt und ein hypothetisches,
BCRF1 bezeichnetes Protein kodiert. Sie berichten nicht über
irgendeine Arbeit mit diesem hypothetischen Protein, auch wenn
sie einige mögliche Eigenschaften theoretisch analysieren.
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Die Verfügbarkeit von Mitteln zum Behandeln EBV-infizierter
Personen könnte eine bedeutende klinische Wirkung, insbesondere
bei der Behandlung immungeschädigter Personen besitzen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich in ihrem ersten Aspekt
auf eine Verwendung eines Antagonisten gegen BCRF1 (ein Epstein-
Barr-Virusprotein) bei der Herstellung eines Arzneimittels zur
Behandlung einer Epstein-Barr-Viruserkrankung.
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In einem zweiten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung
auf eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer
Epstein-Barr-Viruserkrankung, die einen Antagonisten gegen BCRF1
zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder
Vehikel umfaßt.
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In einem dritten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein
Verfahren zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung
gemäß dem zweiten Aspekt, welches das Vermischen eines
Antagonisten gegen BCRF1 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger
oder Vehikel umfaßt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Figur 1 ist eine diagrammartige Veranschaulichung eines zur
Herstellung von BCRF1 brauchbaren Säuger-Expressionsvektors.
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Figur 2 ist eine diagrammartige Veranschaulichung eines zur
Herstellung von BCRF1 brauchbaren bakteriellen
Expressionsvektors.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung, daß BCRF1 die
Produktion von Interferon-γ (IFN-γ), ein zur zellvermittelten
Verteidigung gegen Virusinfektionen notwendiges Cytokin,
unterdrückt. Es wird angenommen, daß BCRF1 zum Verbessern seines
Überlebens in seinem Wirt durch EBV produziert wird. Das
Verfahren der Erfindung umfaßt das Verabreichen einer wirksamen
oder krankheitsvermindernden Menge eines Antagonisten gegen
BCRF1 an eine Person.
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Vorzugsweise stammen Antagonisten der Erfindung aus Antikörpern,
die auf BCRF1 spezifisch sind. Bevorzugter umfassen die
Antagonisten der Erfindung Fragmente derartiger Antikörper oder auf
BCRF1 spezifische Bindungszusammensetzungen. Antikörper umfassen
eine Zusammensetzung von Polypeptidketten, die durch
Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Zwei als die leichte Kette
und die schwere Kette bezeichnete Hauptpeptidketten bilden alle
Hauptstrukturklassen (Isotypen) eines Antikörpers. Sowohl
schwere Ketten als auch leichte Ketten werden weiter in Unterregionen
aufgeteilt, die als variable Regionen und konstante Regionen
bezeichnet werden. Schwere Ketten umfassen eine einzelne
variable Region und drei unterschiedliche konstante Regionen und
leichte Ketten umfassen eine einzelne variable Region (von
derjenigen der schweren Kette verschieden) und eine einzelne
konstante Region (von denjenigen der schweren Kette
verschieden). Die variablen Regionen der schweren Kette und der leichten
Kette sind für die Bindungsspezifität des Antikörpers
verantwortlich.
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Hier verwendet bedeutet der Ausdruck "variable Region der
schweren Kette" ein Polypeptid (1), das 110 bis 125 Aminosäuren lang
ist und (2) dessen Aminosäuresequenz derjenigen der schweren
Kette eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung entspricht.
In ähnlicher Weise bedeutet der Ausdruck "variable Region der
leichten Kette" ein Polypeptid (1), das 95 bis 115 Aminosäuren
lang ist und (2) dessen Aminosäuresequenz derjenigen der
leichten Kette eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung
entspricht.
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Hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "monoklonaler
Antikörper" auf homogene Populationen von Immunglobulinen, die zum
spezifischen Binden an BCRF1 befähigt sind.
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Hierin verwendet bedeutet der Ausdruck "Bindungszusammensetzung"
eine Zusammensetzung, die zwei Polypeptidketten (1) umfaßt, die
wenn sie funktionell verbunden sind, eine Konf ormation mit einer
hohen Bindungsaffinität zu BCRF1 annehmen und (2) die aus einem
Hybridom stammen, das auf BCRF1 spezifische Antikörper
produziert. Der Ausdruck "funktionell verbunden" wird so verstanden,
daß er anzeigt, daß die beiden Polypeptidketten zum Binden durch
eine Vielfalt Mittel einschließlich der Verbindung mit einem
natürlichen Antikörperfragment, wie etwa Fab oder Fv, oder
mittels genetisch veränderten, cysteinhaltigen Peptidlinkern an
den Carboxyltermini in Bezug aufeinander angeordnet werden
können. Normalerweise entsprechen die beiden Polypeptidketten der
variablen Region der leichten Kette und der variablen Region der
schweren Kette eines auf BCRF1 spezifischen monoklonalen
Antikörpers. Vorzugsweise stammen Antagonisten der Erfindung aus auf
BCRF1 spezifischen Antikörpern. Zum Blockieren oder
Neutralisieren von BCRF1 befähigte monoklonale Antikörper werden durch
ihrer Fähigkeit, die durch BCRF1 ausgelöste Unterdrückung der
Interferon-γ-Produktion zu hemmen, selektiert. Derartige Tests
erfordern eine Zellinie oder Zellpopulation, die IFN-γ
synthetisiert. Üblicherweise können periphere Blutlymphozyten (PBL), die
mit einem Mitogen wie etwa Phytohämagglutinin (PHA) stimuliert
worden sind, als eine derartige Zellpopulation dienen. Grob
gesagt, funktioniert der Test wie folgt: die PHA-stimulierten
PBL werden in drei gleiche Teile aufgeteilt; dem ersten Teil
wird BCRF1 zugesetzt; dem zweiten Teil werden BCRF1 und der
vermutliche Antagonist zugesetzt; der dritte Teil dient als
Kontrolle. Nach mehreren Tagen werden die Kulturüberstände auf
IFN-γ getestet. Dies wird üblicherweise mit einem Standard-
ELISA-Test mittels im Handel erhältlicher monoklonaler und
polyklonaler Antikörper auf IFN-γ, z.B. diejenigen von Genzyme,
Inc. (Boston, MA), durchgeführt. Wahlweise kann die Anzeige des
Tests die zum Beispiel durch RNA-Blotting, PCR oder eine
ähnliche Methodik gemessene Menge transkribierte IFN-γ-mRNA sein.
PBL werden mittels Standardtechniken, z.B. Mishell et al.,
Hrsg., Selected Methods in Cellular Immunology (Freeman, New
York, 1980), erhalten.
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Hybridome der Erfindung werden durch wohlbekannte Techniken
hergestellt. Üblicherweise umfaßt das Verfahren die Fusion einer
immortalisierenden Zellinie mit einem B-Lymphozyten, der den
gewünschten Antikörper produziert. Wahlweise sind Techniken ohne
Fusion zum Erzeugen unsterbliche Antikörper produzierender
Zellinien möglich und fallen unter den Umfang der vorliegenden
Erfindung, z.B. eine viral induzierte Transformation: Casali et
al., "Human Monoclonals from Antigen-Specific Selection of B
Lymphocytes and Transformation by EBV", Science, Bd. 234, S.
476-479 (1986). Immortalisierende Zellinien sind üblicherweise
transformierte Säugerzellen, insbesondere Myelomzellen mit einer
Herkunft aus einem Nager, Rind und Menschen; z.B. US-Patente 4
693 975 und 4 720 459. Am häufigsten werden aus Gründen der
Bequemlichkeit und Verfügbarkeit Ratten- oder
Maus-Myelomzellinien eingesetzt. Techniken zum Erhalten der geeigneten
Lymphozyten aus Säugern, denen das Zielantigen injiziert wurde,
sind wohlbekannt. Im allgemeinen werden entweder periphere
Blutlymphozyten (PBL) verwendet, falls Zellen menschlichen
Ursprungs gewünscht werden, oder Milzzellen oder
Lymphknotenzellen werden verwendet, falls nicht-menschliche Säugerquellen
gewünscht werden. Einem Wirtssäuger werden wiederholte Dosen
gereinigtes Antigen injiziert und man läßt den Säuger die
gewünschten Antikörper-produzierenden Zellen erzeugen, bevor diese
zur Fusion mit der immortalisierenden Zellinie geerntet werden.
Vorzugsweise sind Maus, Ratte, Kaninchen oder Mensch die
Säugerquelle Antikörper-produzierender B-Zellen. Fusionstechniken sind
in der Technik ebenfalls wohlbekannt und umfassen im allgemeinen
das Vermischen der Zellen mit einem Fusionierungsmittel wie etwa
Polyethylenglykol. Hybridome werden durch Standardverfahren wie
etwa durch HAT-Selektion selektiert. Unter diesen Hybridomen
werden die den gewünschten Antikörper ausscheidenden, d.h. auf
BCRFL spezifische, durch Testen ihres Kulturmediums durch
Standardimmuntests, wie etwa Western-Blotting, ELISA, RIA, BCRF1-
Neutralisierungsfähigkeit oder dergleichen, selektiert.
Antikörper werden aus dem Medium mittels Standardtechniken der
Proteinreinigung, z.B. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme
Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985), isoliert. Viele
Literaturstellen stehen als Anleitung beim Anwenden einer der
vorstehenden Techniken zur Verfügung, z.B. Kohler et al., Hybridoma
Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980);
Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier,
Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology
(Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma
Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton,
FL, 1982) und dergleichen. Hybridome, die auf BCRF1 spezifische
monoklonale Antikörper produzieren, werden anschließend einer
zweiten Durchmusterung mittels des vorstehend beschriebenen IFN-
γ-Unterdrückungstests unter Selektieren zum Blockieren oder
Neutralisieren der biologischen Aktivität von BCRF1 befähigter
unterzogen.
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Die Verwendung und Erzeugung von Antikörperfragmenten ist
ebenfalls wohlbekannt: z.B. Fab-Fragmente: Tijssen, Practice and
Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985), und
Fv-Fragmente: Hochman et al., Biochemistry, Bd. 12, S. 1130-1135
(1973), Sharon et al., Biochemistry, Bd. 15, S. 1591-1594
(1976), und Ehrlich et al., US-Patent 4 355 023, und Antikörper-
Molekülhälften: Auditore-Hargreaves, US-Patent 4 470 925.
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Hybridome und monoklonale Antikörper der Erfindung werden
entweder gegen glykosylierte oder unglykosylierte Arten von
rekombinant erzeugtem reifem BCRF1 als Immunogene erzeugt. Im
allgemeinen werden unglykosylierte Arten von BCRF1 in E. coli
erzeugt und glykosylierte Arten werden in Säugerzellwirten, z.B.
CV1- oder COS-Affenzellen, Maus-L-Zellen oder dergleichen,
erzeugt. Rekombinant erzeugter reifer BCRF1 wird durch Einführen
eines Expressionsvektors in eine Wirtszelle mittels
Standardvorschriften,
z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982); Okayama
und Berg, Mol. Cell. Biol., Bd. 2, S. 161-170 (1982), und Bd. 3,
S. 280-289 (1983), Takebe et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 8, S.
466-472 (1988), US-Patent 4 599 308, US-Patent 4 675 285,
Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 2, S. 1304-1319 (1982), oder
dergleichen, hergestellt. Der Aufbau von bakteriellen oder
Säugerexpressionsvektoren ist in der Technik wohlbekannt, sobald
die ein gewünschtes Protein kodierende Nucleotidsequenz bekannt
oder auf andere Weise verfügbar ist; z.B. offenbart DeBoer im
US-Patent 4 551 433 Promotoren zur Verwendung in bakteriellen
Expressionsvektoren; Goeddel et al. im US-Patent 4 601 980 und
Riggs im US-Patent 4 431 739 offenbaren die Herstellung von
Säugerproteinen durch E. coli-Expressionssysteme und Riggs
(vorstehend zitiert), Ferretti et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd.
83, S. 599-603 (1986), Sproat et al., Nucleic Acids Research,
Bd. 13, S. 2959-2977 (1985), und Mullenbach et al., J. Biol.
Chem., Bd. 261, S. 719-722 (1986), offenbaren, wie synthetische
Gene zur Expression in Bakterien aufgebaut werden. Demgemäß sind
diese Zitate durch Verweis inbegriffen. BCRF1 kann auch durch
vorübergehendes Transfizieren von COS7-Zellen mit pBCRF1(SRα),
ein bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD)
unter der Zugangsnummer 68193 als Teil dieser Offenbarung
hinterlegtes Plasmid, hergestellt werden. Fig. 1 ist eine
Restriktionskarte von pBCRF1(SRα).
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Der größte offene Leserahmen der BCRF1-cDNA wird durch die in
SEQ. ID. NR. 1 dargestellte Aminosäuresequenz definiert. Eine
Beschreibung des EBV-Genoms wird von Baer et al., Nature, Bd.
310, S. 207-211 (1984), angegeben und die Nucleotidsequenz der
BCRF1-cDNA ist in GenBank Ausgabe 26 verfügbar.
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Wenn BCRF1 in löslicher Form, zum Beispiel als sekretiertes
Produkt transformierter Hefe- oder Säugerzellen, exprimiert
wird, kann es gemäß Standardverfahren der Technik,
einschließlich der Schritte der Ammoniumsalzfällung,
Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Elektrophorese,
Affinitätschromatographie
und/oder dergleichen, gereinigt werden: z.B. bieten
"Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in
Enzymology, 22:233-577 (1977), und Scopes, Protein Purification:
Principles and Practice (Springer-Verlag, New York, 1982) eine
Anleitung zu derartigen Reinigungen. Wenn BCRF1 in unlöslicher
Form, zum Beispiel als Aggregate, Einschlußkörper oder
dergleichen, exprimiert wird, können diese gleichermaßen durch
Standardverfahren der Technik einschließlich des Abtrennens der
Einschlußkörper von den aufgebrochenen Zellen durch Zentrifugieren,
Löslichmachens der Einschlußkörper mit chaotropen und
Reduktionsmitteln, Verdünnens des löslichgemachten Gemischs und
Erniedrigen der Konzentration des chaotropen Mittels und
Reduktionsmittels, so daß das Polypeptid eine biologisch aktive
Konformation annimmt, gereinigt werden. Die letzteren Verfahren
werden in den folgenden Literaturstellen offenbart, die durch
Verweis inbegriffen sind: Winkler et al., Biochemistry, 25:4041-
4045 (1986); Winkler et al., Biotechnology, 3:992-998 (1985);
Koths et al., US-Patent 4 569 790 und die europäischen
Patentanmeldungen 86 306 917.5 und 86 306 353.3.
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Antikörper und Antikörperfragmente, die für Hybridome der
Erfindung kennzeichnend sind, können ferner durch rekombinante Mittel
durch Extrahieren von Boten-RNA, Aufbauen einer cDNA-Bank und
Selektieren von Klonen, die Segmente des Antikörpermoleküls
kodieren; z.B. Wall et al., Nucleic Acids Research, Bd. 5, S.
3113-3128 (1978); Zakut et al., Nucleic Acids Research, Bd. 8,
S. 3591-3601 (1980); Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd.
81, S. 3273-3277 (1984); Boss et al., Nucleic Acids Research,
Bd. 12, S. 3791-3806 (1984); Amster et al., Nucleic Acids
Research, Bd. 8, S. 2055-2065 (1980); Moore et al., US-Patent 4 642
334; Skerra et al., Science, Bd. 240, S. 1038-1041 (1988); Huse
et al., Science, Bd. 246, S. 1275-1281 (1989); Better et al.,
Science, Bd. 240, S. 1041-1043 (1988), und Riechmann et al.,
Nature, Bd. 332, S. 323-327 (1988), hergestellt werden.
Insbesondere können derartige Techniken zum Herstellen
interspezifischer monoklonaler Antikörper verwendet werden, wobei die
Bindungsregion einer Art mit der nicht-bindenden Region des
Antikörpers einer anderen Art unter Verringern der Immunogenität
kombiniert wird; z.B. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd.
84, S. 3439-3443 (1987).
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Antagonisten der Erfindung werden als pharmazeutische
Zusammensetzung verabreicht. Derartige Zusammensetzungen enthalten eine
therapeutische Menge wenigstens eines monoklonalen Antikörpers
der Erfindung oder Fragmente desselben in einem pharmazeutischen
Träger. Ein pharmazeutischer Träger kann jede verträgliche,
nicht-toxische Substanz sein, die zum Zuführen der
Zusammensetzungen der Erfindung an einen Patienten geeignet ist.
Steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe können
in einem Träger enthalten sein. Pharmazeutisch angenommene
Hilfsstoffe (z.B. Puffermittel und Dispersionsmittel) können
ebenfalls in die pharmazeutische Zusammensetzung eingearbeitet
werden. Im allgemeinen sind zur parenteralen Verabreichung
derartiger Wirkstoffe brauchbare Zusammensetzungen wohlbekannt;
z.B. Remington's Pharmaceutical Science, 15. Ausg. (Mack
Publishing Company, Easton, PA, 1980). Wahlweise können
Zusammensetzungen der Erfindung durch ein implantierbares oder
injizierbares Wirkstoff zuführungssystem, z.B. Urquhart et al., Ann. Rev.
Pharmacol. Toxicol., Bd. 24, S. 199-236 (1984), Lewis, Hrsg.,
Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum
Press, New York, 1981); Johnson et al., Hrsg., Drug Delivery
Systems: Fundamentals and Techniques (Ellis Horwood, Ltd.,
London, 1987); US-Patent 3 773 919; US-Patent 3 270 960 und
dergleichen, in den Körper eines Patienten eingeführt werden.
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Wenn die Antagonisten der Erfindung von Antikörpern stammen,
werden sie normalerweise parenteral, vorzugsweise intravenös
verabreicht. Da derartige Protein- oder Peptidantagonisten
immunogen sein können, werden sie vorzugsweise langsam, entweder
durch eine herkömmliche i.v.-Verabreichungsanordnung oder aus
einem subkutanen Depot, wie z.B. durch Tomasi et al. im US-
Patent 4 732 863 gelehrt, verabreicht. Wenn die Antikörper oder
Fragmente parenteral verabreicht werden, werden sie in einer
injizierbaren Einheitsdosierungsform (Lösung, Suspension,
Emulsion)
in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren
parenteralen Träger formuliert. Derartige Träger sind selbst
nichttoxisch und nicht-therapeutisch. Beispiele derartiger Träger
sind normale Kochsalzlösung, Ringersche Lösung, Dextroselösung
und Hanksche Lösung. Nicht-wäßrige Träger, wie etwa fette Öle
und Ölsäureethylester können ebenfalls verwendet werden. Ein
bevorzugter Träger ist 5% Dextrose/Kochsalzlösung. Der Träger
kann untergeordnete Mengen Zusatzstoffe enthalten, wie etwa
Substanzen, welche die Isotonie und chemische Stabilität
erhöhen, z.B. Puffer und Konservierungsstoffe. Der Antikörper wird
vorzugsweise in gereinigter Form im wesentlichen frei von
Aggregaten, anderen Proteinen, Endotoxinen und dergleichen in
Konzentrationen von etwa 5 bis 30 mg/ml, vorzugsweise 10 bis 20
mg/ml, formuliert. Vorzugsweise ist der Endotoxingehalt geringer
als 2,5 IU/ml.
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Das Auswählen einer Verabreichungsweise für einen Antagonisten
hängt von mehreren Faktoren einschließlich der Serumumsatzrate
des Antagonisten, des Serumgehalts an BCRF1, der Immunogenität
des Antagonisten, der Zugänglichkeit des Ziel-BCRF1 und
dergleichen ab. Vorzugsweise maximiert eine Verabreichungsweise die
dem Patienten zugeführte Antagonistenmenge, die mit einem
annehmbaren Wert für die Nebenwirkungen verträglich ist. Demgemäß
hängt die zugeführte Antagonistenmenge zum Teil von dem
besonderen Antagonisten und der Schwere des zu behandelten Zustands ab.
Eine Anleitung beim Auswählen geeigneter Dosen ist in der
Literatur über therapeutische Verwendungen von Antikörpern zu
finden; z.B. Bach et al., Kapitel 22, in Ferrone et al., Hrsg.,
Handbook of Monoclonal Antibodies (Noges Publications, Park
Ridge, NJ, 1985), und Russell, S. 303-357, und Smith et al., S.
365-389, in Haber et al., Hrsg., Antibodies in Human Diagnosis
and Therapy (Raven Press, New York, 1977).
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Immer wenn der Antagonist monoklonale Antikörper oder Fragmente
desselben in Fab-Größe (einschließlich
Bindungszusammensetzungen) umfaßt, liegt die Dosis vorzugsweise im Bereich von etwa 1-
20 mg/kg je Tag. Bevorzugter liegt die Dosis im Bereich von etwa
1-10 mg/kg je Tag.
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Die folgenden Beispiele dienen zum Veranschaulichen von Aspekten
der vorliegenden Erfindung. Die ausgewählten Vektoren, Wirte,
Fusionspartner, Reagenzienkonzentration und Temperaturen und die
Werte anderer Variablen sollen nur die Erfindung
veranschaulichen und sind nicht als deren Einschränkung anzusehen.
BEISPIEL 1
Expression von BCRF1 in COS7-Affenzellen
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Ein den offenen Leserahmen für BCRF1 kodierendes Gen wurde durch
eine Polymerasekettenreaktion mittels Startern verstärkt, welche
die spätere Inserierung des verstärkten Fragments in einen
EcoR1-verdauten pcD(SRα)-Vektor (Figur 1) gestatteten. Der
Kodierungsstrang des inserierten Fragments wird in SEQ. ID. NR.
2 dargestellt, worin der offene Leserahmen als Gruppen aus drei
Buchstaben entsprechend den Kodons vom START-Signal ATG zum
STOP-Signal TGA angegeben ist.
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Das Insert in der richtigen Ausrichtung tragende Klone wurden
durch die Expression von BCRF1 und/oder das elektrophoretische
Muster von Restriktionsverdautem ermittelt. Ein derartiger, das
BCRF1-Gen tragender Vektor wurde als pBCRF1(SRα) bezeichnet und
wurde bei der ATCC unter der Zugangsnummer 68193 hinterlegt.
pBCRF1(SRα) wurde in durch Standardtechniken isolierter E. coli
MC1061 verstärkt und zum Transfizieren von COS7-Affenzellen wie
folgt verwendet: einen Tag vor der Transfizierung wurden
einzelne 100 mm-Platten in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium
(DME), das 5% fetales Kälberserum (FCS) und 2 mM Glutamin
enthielt, mit ungefähr 1,5 x 10&sup6; COS7-Affenzellen beimpft. Zum
Ausführen der Transfizierung wurden die COS7-Zellen von den
Schalen durch Inkubation mit Trypsin entfernt, zwei Mal in
serumfreiem DME gewaschen und zu 10&sup7; Zellen/ml in serumfreiem DME
suspendiert. Eine aliquote Menge von 0,75 ml wurde mit 20 ug DNA
gemischt und in eine sterile Elektroporationsküvette von 0,4 cm
überführt. Nach 10 Minuten wurden die Zellen bei 200 Volt, 960
uF
in einer BioRad Gene Pulser-Einheit gepulst.- Nach weiteren 10
Minuten wurden die Zellen aus der Küvette entnommen und 20 ml
DME zugesetzt, das 5% FCS, 2 mM Glutamin, Penicillin,
Streptomycin und Gentamycin enthielt. Das Gemisch wurde auf vier 100 mm-
Gewebekulturschalen aliquot verteilt. Nach 12-24 Stunden bei
37ºC, 5% CO&sub2;, wurde das Medium durch ein ähnliches Medium
ersetzt, das nur 1% FCS enthielt, und die Inkubation wurde weitere
72 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2; fortgesetzt, wonach das Medium
gesammelt und auf seine Fähigkeit, die IFN-γ-Synthese zu hemmen,
getestet wurde.
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Aliquote Mengen von 10 ml frisch isolierten PBL (etwa 2 x 10&sup6;
Zellen/ml) wurden bei 37ºC mit PHA (100 ng/ml) in Medium
inkubiert, das aus (i) 90% mit 5% FCS und 2 mM Glutamin ergänztem
DME und (ii) 10% Überstand aus zuvor mit pBCRF1(SRα)
transfizierten COS7-Zellen bestand. Nach 24 Stunden wurden die Zellen
und Überstände zum Testen auf die Anwesenheit von IFN-γ-mRNA
beziehungsweise IFN-γ-Protein geerntet. Kontrollen wurden
identisch behandelt, außer daß die 10% überstand aus COS7-Kulturen
stammten, die zuvor mit einem Plasmid transfiziert wurden, das
ein nicht-verwandtes cDNA-Insert trug. Die BCRF1-behandelten
Proben zeigten etwa 50% Hemmung der IFN-γ-Synthese bezogen auf
die Kontrollen.
BEISPIEL 2
Expression von BCRF1 in Escherichia coli
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Ein Gen, das reifen BCRF1 mit der in SEQ. ID. NR. 3 angegebenen
Sequenz kodiert, kann in E. coli exprimiert werden.
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Das cDNA-Insert von pBCRF1(SRα) wird erneut in ein M13-Plasmid
kloniert, wo es durch ortsgerichtete Mutagenese zwei Mal
verändert wird: erstens unter Bilden einer ClaI-Stelle am 5'-Ende
der Kodierungsregion für das reife BCRF1-Polypeptid und zweitens
unter Bilden einer BAMHI-Stelle am 3'-Ende der Kodierungsregion
für das reife BCRF1-Polypeptid. Die mutierte Sequenz wird
anschließend leicht in den nachstehend beschriebenen
TRPC11-Expressionsvektor
inseriert.
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Der TRPC11-Vektor wurde durch Ligieren eines synthetischen RBS-
Konsensusfragments mit ClaI-Linkern (ATGCAT) und durch Klonieren
der sich daraus ergebenden Fragmente in ClaI-verkürztes pMT11hc
(das zuvor zum Enthalten der ClaI-Stelle verändert wurde)
aufgebaut. pMT11hc ist ein kleines (2,3 Kilobasen) AMP , TETS-Derivat
von pBR322 mit hoher Kopienzahl, welches die EcoRI-HINDIII-
Polylinkerregion des πVX-Plasmids trägt. (πVX wird von Maniatis
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1982, beschrieben.) Dieses wurde zum
Enthalten der Clal-Stelle durch Verkürzen von pMT11hc mit EcoRI und
BamHI, Auffüllen der sich daraus ergebenden klebrigen Enden und
Ligieren mit ClaI-Linker (CATCGATG) verändert, wodurch die
EcoRI- und BAMHI-Stellen wiederhergestellt und die 5mal-Stelle
durch eine ClaI-Stelle ersetzt wurde. Eine Transformante aus dem
TRPC11-Aufbau besaß eine durch ClaI-Stellen flankierte Tandem-
RBS-Sequenz. Eine der ClaI-Stellen und ein Teil der zweiten
Kopie der RBS-Sequenz wurden durch Verdauen dieses Plasmids mit
PstI, Behandeln mit Bal31-Nuklease, Verkürzen mit EcoRI und
Behandeln mit T4-DNA-Polymerase in Anwesenheit aller vier
Deoxynucleotidtriphosphate entfernt. Die sich daraus ergebenden 30-40
bp-Fragmente wurden durch PAGE isoliert und in SmaI-verkürztes
pUC12 kloniert. Ein aus pKC101 (von Nichols et al. in Methods in
Enzymology, Bd. 101, S. 155 (Academic Press, N.Y. 1983)
beschrieben) stammendes, E. coli-trp-tragendes EcoRI-Fragment
wurde anschließend in die EcoRI-Stelle zum Vervollständigen des
TRPC11-Aufbaus kloniert, der in Figur 2 veranschaulicht wird.
TRPC11 wird als Vektor für BCRF1 durch zuerst sein Verdauen mit
ClaI und BamHI, sein Reinigen und anschließend sein Mischen in
einer Standardligierungslösung mit dem ClaI-BamHI-Fragment des
M13, das die für reifen BCRF1 kodierende Nukleotidsequenz
enthält, eingesetzt. Der als TRPC11-BCRF1 bezeichnete inserthaltige
TRPC11 wird im E. coli K12-Stamm JM101, der z.B. von der ATCC
unter der Zugangsnummer 33876 erhältlich ist, vermehrt.
BEISPIEL 3
Herstellung eines BCRF1-neutralisierenden
monoklonalen Antikörpers
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Eine männliche Lewis-Ratte wird mit gereinigten Zubereitungen
von in COS7-Zellen exprimiertem BCRF1 immunisiert. Die Ratte
wird zuerst mit 1 ml BCRF1-Lösung (5-100 ug/ml BCRF1 in 10 mM
Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH 7,4), die mit 1 ml Freundschem
komplettem Adjuvans (FCA) emulgiert ist, immunisiert und zwei Mal
mit derselben Menge Material in Freundschem inkomplettem
Adjuvans verstärkt. Testblutentnahmen wurden abgenommen. Dem Tier
wird eine Schlußverstärkung von 25 ug BCRF1-Lösung in
phosphatgepufferter Kochsalzlösung verabreicht und vier Tage später wird
die Milz zur Fusion erhalten.
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Ungefähr 3 x 10&sup8; Ratten-Splenozyten werden mit der gleichen
Anzahl P3X63-AGB.653-Maus-Myelomzellen (von der ATCC unter der
Zugangsnummer CRL 1580 erhältlich) mittels Polyethylenglykol
fusioniert. Die Zellsuspension (ungefähr 3,5 x 10&sup5; Zellen/ml in
HAT-Medium) wurden in vierzig Mikrotiterplatten mit 96 Näpfchen
verteilt, indem z.B. der in Chretien et al., J. Immunol. Meth.,
Bd. 117, S. 67-81 (1989), beschriebenen Vorschrift gefolgt
wurde. Zehn Tage später werden Hybridomüberstände auf ihre
Fähigkeit, direkt an Mikrotiterplatten immobilisierten BCRF1 zu
binden (indirekter ELISA) oder an BCRF1, der an die
immobilisierte polyklonale IgG-Fraktion von Kaninchen-anti-BCRF1
gebunden ist. Gebundener Antikörper wird durch
Peroxidase-konjugiertes Ziege-anti-Ratte-Immunglobulin mit einer Standardvorschrift
nachgewiesen. Hybridome, die mit BCRF1 reagierende Antikörper
sekretieren, werden durch Grenzverdünnung kloniert. Die
selektierten Hybridome werden gelagert (z.B. -70 ºC in Kulturmedium
mit 10% DMSO) und mittels Standardtechniken der Säugerzellkultur
(z.B. RPMI 1640 mit 10% fetalem Rinderserum, das mit 1 mM
Glutamin und 50 mM 2-Mercaptoethanol ergänzt ist) kultiviert.
Hybridome, die BCRF1-blockierende Antikörper produzieren, werden aus
dem BCRF1-spezifische Antikörper produzierenden Hybridomensatz
durch ihre Fähigkeit, der BCRF1-induzierten Unterdrückung der
IFN-γ-Produktion in dem vorstehend beschriebenen Test
entgegenwirken, selektiert.
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Die Beschreibungen der vorstehenden Ausführungsformen der
Erfindung sind zum Zweck der Veranschaulichung und Beschreibung
dargelegt worden. Sie sind nicht dazu bestimmt, erschöpfend zu
sein oder die Erfindung auf die genauen offenbarten Formen zu
beschränken und offensichtlich sind im Lichte der vorstehenden
Lehre viele Änderungen und Abwandlungen möglich. Die
Ausführungsformen wurden ausgewählt und beschrieben, um die Prinzipien
der Erfindung am besten zu erklären und dadurch anderen
Fachleuten das beste Verwenden der Erfindung in verschiedenen
Ausführungsformen und mit verschiedenen Änderungen zu ermoglichen, die
an die besondere beabsichtigte Verwendung angepaßt sind. Der
Umfang der Erfindung soll durch die hieran angefügten Ansprüche
definiert werden.
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Die Anmelder haben pBCRF1(SRα) tragende E. coli MC1061 bei der
American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC),
unter der Zugangsnummer 68193 hinterlegt.
SEOUENZLISTE
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SEQ ID NR: 1
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SEQUENZTYP: Aminosäure
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SEQUENZLÄNGE: 170 Aminosäurereste
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STRÄNGIGKEIT: einzel
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TOPOLOGIE: linear
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MOLEKÜLTYP: Protein/Polypeptid
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URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Epstein-Barr-Virus
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EIGENSCHAFTEN: BCRF-1
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SEQ ID NR: 2
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SEQUENZTYP: Nucleotid
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SEQUENZLÄNGE: 498 Basen
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STRÄNGIGKEIT: einzel
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TOPOLOGIE: linear
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MOLEKÜLTYP: DNA-Sequenz
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URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Epstein-Barr-Virus
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EIGENSCHAFTEN: BCRF-1
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SEQ ID NR: 3
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SEQUENZTYP: Aminosäure
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SEQUENZLÄNGE: 147 Aminosäurereste
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STRÄNGIGKEIT: einzel
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TOPOLOGIE: linear
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MOLEKÜLTYP: Protein/Polypeptid
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URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Epstein-Barr-Virus
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EIGENSCHAFTEN: BCRF-1