JP2509774B2 - エプスタイン・バ―ウイルス感染治療用のｂｃｒｆ１拮抗薬 - Google Patents
エプスタイン・バ―ウイルス感染治療用のｂｃｒｆ１拮抗薬Info
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- antagonist
- cells
- antibody
- antibodies
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、エプスタイン・バーウイルス（EBV）感染
を、EBVタンパク質であるBCRF1に対する拮抗薬を投与す
ることによって治療する方法に関する。
を、EBVタンパク質であるBCRF1に対する拮抗薬を投与す
ることによって治療する方法に関する。
背景 エプスタイン・バーウイルス（EBV）は、アフリカ
（風土病すなわちｅ）型のバーキットリンパ腫に関連し
て最初に発見された遍在性ヒトヘルペスウイルスであ
る。続いて、そのウイルスは鼻咽頭癌に関係することが
更に発見され、そして伝染性単核球症の原因物質である
ことが分かった。通常、感染は小児期初期に起こり、概
して、潜伏性徴候を生じ、時々軽い症状を伴う。しかし
ながら、青年期または成人での感染は、咽頭炎、発熱お
よびリンパ節症を特徴とする伝染性単核球症を引き起こ
すことがある。伝染性単核球症の大部分の症状は１〜３
週間で消散するが、倦怠および疲労が数週間〜数か月持
続することが時々ある。時々起きることがある合併症と
しては、極端な扁桃腫脹、血小板減少症、脾臓破裂、黄
疸および脳炎がある。更に、免疫無防備状態の患者、例
えば、移植受容者およびエイズ（AIDS）患者では、EBV
感染がＢ細胞リンパ球増殖性疾患を導くことがある。大
学および軍隊の集団では、伝染性単核球症の最も高い罹
患率を経験しており、例えば、ウィスコンシン大学の学
生の全入院数の５％を占め、軍隊員の病気による欠損日
数の原因として第４位を占めている。トーリー（Thorle
y）−ローソン（Lawson）、Biochimicaet Biophysica A
cta、第948巻、263〜286頁（1988）；スクーリー（Scho
oley）ら、マンデル（Mandell）ら監修のPrinciples an
d Practice of Infectious Diseases、第２版（ジョン
・ウィリー・アンド・サンズ（John Willey ＆ Son
s）、ニューヨーク、1985）の126章。
（風土病すなわちｅ）型のバーキットリンパ腫に関連し
て最初に発見された遍在性ヒトヘルペスウイルスであ
る。続いて、そのウイルスは鼻咽頭癌に関係することが
更に発見され、そして伝染性単核球症の原因物質である
ことが分かった。通常、感染は小児期初期に起こり、概
して、潜伏性徴候を生じ、時々軽い症状を伴う。しかし
ながら、青年期または成人での感染は、咽頭炎、発熱お
よびリンパ節症を特徴とする伝染性単核球症を引き起こ
すことがある。伝染性単核球症の大部分の症状は１〜３
週間で消散するが、倦怠および疲労が数週間〜数か月持
続することが時々ある。時々起きることがある合併症と
しては、極端な扁桃腫脹、血小板減少症、脾臓破裂、黄
疸および脳炎がある。更に、免疫無防備状態の患者、例
えば、移植受容者およびエイズ（AIDS）患者では、EBV
感染がＢ細胞リンパ球増殖性疾患を導くことがある。大
学および軍隊の集団では、伝染性単核球症の最も高い罹
患率を経験しており、例えば、ウィスコンシン大学の学
生の全入院数の５％を占め、軍隊員の病気による欠損日
数の原因として第４位を占めている。トーリー（Thorle
y）−ローソン（Lawson）、Biochimicaet Biophysica A
cta、第948巻、263〜286頁（1988）；スクーリー（Scho
oley）ら、マンデル（Mandell）ら監修のPrinciples an
d Practice of Infectious Diseases、第２版（ジョン
・ウィリー・アンド・サンズ（John Willey ＆ Son
s）、ニューヨーク、1985）の126章。
EBV感染者を治療する薬剤の有効性は、特に、免疫無
防備状態の患者の治療において有意の臨床的効果を有す
ることができるであろう。
防備状態の患者の治療において有意の臨床的効果を有す
ることができるであろう。
発明の要約 本発明は、EBVタンパク質であるBCRF1に対する拮抗薬
の有効量を投与することによってEBV感染を治療する方
法を提供する。好ましくは、BCRF1に対する拮抗薬は、
単クローン性抗体または標準法によってそれから誘導さ
れた結合性組成物である。
の有効量を投与することによってEBV感染を治療する方
法を提供する。好ましくは、BCRF1に対する拮抗薬は、
単クローン性抗体または標準法によってそれから誘導さ
れた結合性組成物である。
図面の簡単な説明 図１は、BCRF1の製造において有用な哺乳動物発現ベ
クターの略図である。
クターの略図である。
図２は、BCRF1の製造において有用な細菌の発現ベク
ターの略図である。
ターの略図である。
発明の詳細な説明 本発明は、一つには、BCRF1が、ウイルス感染に対す
る細胞性防御に必要なサイトカインであるインターフェ
ロン−γ（IFN−γ）の産生を抑制するという発見に基
づいている。BCRF1はEBVによって産生されて、その宿主
中においてその生存を促進させると考えられる。本発明
の方法は、BCRF1に対する拮抗薬の有効なまたは疾患を
好転させる量を患者に投与することを含む。
る細胞性防御に必要なサイトカインであるインターフェ
ロン−γ（IFN−γ）の産生を抑制するという発見に基
づいている。BCRF1はEBVによって産生されて、その宿主
中においてその生存を促進させると考えられる。本発明
の方法は、BCRF1に対する拮抗薬の有効なまたは疾患を
好転させる量を患者に投与することを含む。
好ましくは、本発明の拮抗薬は、BCRF1に特異的な抗
体から誘導される。更に好ましくは、本発明の拮抗薬
は、BCRF1に特異的なこの種の抗体の断片または結合性
組成物を含む。抗体は、ジスルフィド架橋によって互い
に結合したポリペプチド鎖のアッセンブリーを含む。Ｌ
鎖およびＨ鎖と称される２種類の主要なポリペプチド鎖
は、抗体の全ての主要構造クラス（イソタイプ）を構成
している。Ｈ鎖およびＬ鎖双方は、更に、可変領域およ
び定常領域と称される部分領域に分けられる。Ｈ鎖は、
単一の可変領域および３種類の定常領域を含み、そして
Ｌ鎖は単一の可変領域（Ｈ鎖のものとは異なる）および
単一の定常領域（Ｈ鎖のものとは異なる）を含む。Ｈ鎖
およびＬ鎖の可変領域は抗体の結合特異性に関与する。
体から誘導される。更に好ましくは、本発明の拮抗薬
は、BCRF1に特異的なこの種の抗体の断片または結合性
組成物を含む。抗体は、ジスルフィド架橋によって互い
に結合したポリペプチド鎖のアッセンブリーを含む。Ｌ
鎖およびＨ鎖と称される２種類の主要なポリペプチド鎖
は、抗体の全ての主要構造クラス（イソタイプ）を構成
している。Ｈ鎖およびＬ鎖双方は、更に、可変領域およ
び定常領域と称される部分領域に分けられる。Ｈ鎖は、
単一の可変領域および３種類の定常領域を含み、そして
Ｌ鎖は単一の可変領域（Ｈ鎖のものとは異なる）および
単一の定常領域（Ｈ鎖のものとは異なる）を含む。Ｈ鎖
およびＬ鎖の可変領域は抗体の結合特異性に関与する。
本明細書中で用いられる「Ｈ鎖可変領域」という用語
は、（１）長さが110〜125アミノ酸であり、（２）その
アミノ酸配列が本発明の単クローン性抗体のＨ鎖のアミ
ノ酸配列に対応するポリペプチドを意味する。同様に、
「Ｌ鎖可変領域」という用語は、長さが95〜115アミノ
酸であり、（２）そのアミノ酸配列が本発明の単クロー
ン性抗体のＬ鎖のアミノ酸配列に対応するポリペプチド
を意味する。
は、（１）長さが110〜125アミノ酸であり、（２）その
アミノ酸配列が本発明の単クローン性抗体のＨ鎖のアミ
ノ酸配列に対応するポリペプチドを意味する。同様に、
「Ｌ鎖可変領域」という用語は、長さが95〜115アミノ
酸であり、（２）そのアミノ酸配列が本発明の単クロー
ン性抗体のＬ鎖のアミノ酸配列に対応するポリペプチド
を意味する。
本明細書中で用いられる「単クローン性抗体」という
用語は、BCRF1に対して特異的に結合することができる
免疫グロブリンの均一集団を意味する。
用語は、BCRF1に対して特異的に結合することができる
免疫グロブリンの均一集団を意味する。
本明細書中で用いられる「結合性組成物」という用語
は、（１）操作によって結合させた場合にBCRF1に対す
る結合親和性が高いコンホーメーションをとり、そして
（２）BCRF1に特異的な単クローン性抗体を産生するハ
イブリドーマから誘導される２種類のポリペプチド鎖を
含む。「操作によって結合させた」という用語は、その
２種類のポリペプチド鎖が種々の手段によって結合する
のに互いに相対的に位置することができるということを
示す意味であり、FabまたはFvなどの本来の抗体断片で
の結合、或いは遺伝子工学によって処理したシステイン
含有ペプチドリンカーによるカルボキシル末端での結合
を含む。本来、２種類のポリペプチド鎖は、BCRF1に特
異的な単クローン性抗体のＬ鎖可変領域およびＨ鎖可変
領域に対応する。好ましくは、本発明の拮抗薬は、BCRF
1に特異的な単クローン性抗体から誘導される。BCRF1を
阻止するまたは中和することができる単クローン性抗体
は、BCRF1に誘発されたインターフェロン−γ産生抑制
を阻害するそれらの能力によって選択される。このよう
な検定にはIFN−γを合成する細胞系または細胞集団が
必要である。便宜上、フィトヘマグルチニン（PHA）な
どのマイトジェンで刺激された末梢血液リンパ球（PBL
s）がこのような細胞集団として役立つことができる。
およそ検定作業は下記の通りである。すなわち、PHAで
刺激されたPBLsは３等分に分けられる。その第一の部分
にBCRF1を加える。第二の部分にBCRF1および推定上の拮
抗薬を加える。第三の部分は対照として役立つ。数日後
に、培養物の上澄みのIFN−γについて試験する。これ
は、便宜上、標準エライザ検定法によって商業的に入手
可能なIFN−γに対する単クローン性および多クローン
性抗体、例えば、ジェンザイム・インコーポレーテッド
（Genzyme Inc.）（ボストン、MA）からの抗体を用いて
行われる。或いは、検定の読取りは、例えば、RNAブロ
ッティング、PCRまたは類似の方法論によって測定され
る転写されたIFN−γmRNAの量であることができる。PBL
sは標準的な技法を用いて得られる。例えば、ミシェル
（Mishell）ら監修、Selected Methods in Cellular Im
munology（フリーマン（Freeman）、ニューヨーク、198
0）。
は、（１）操作によって結合させた場合にBCRF1に対す
る結合親和性が高いコンホーメーションをとり、そして
（２）BCRF1に特異的な単クローン性抗体を産生するハ
イブリドーマから誘導される２種類のポリペプチド鎖を
含む。「操作によって結合させた」という用語は、その
２種類のポリペプチド鎖が種々の手段によって結合する
のに互いに相対的に位置することができるということを
示す意味であり、FabまたはFvなどの本来の抗体断片で
の結合、或いは遺伝子工学によって処理したシステイン
含有ペプチドリンカーによるカルボキシル末端での結合
を含む。本来、２種類のポリペプチド鎖は、BCRF1に特
異的な単クローン性抗体のＬ鎖可変領域およびＨ鎖可変
領域に対応する。好ましくは、本発明の拮抗薬は、BCRF
1に特異的な単クローン性抗体から誘導される。BCRF1を
阻止するまたは中和することができる単クローン性抗体
は、BCRF1に誘発されたインターフェロン−γ産生抑制
を阻害するそれらの能力によって選択される。このよう
な検定にはIFN−γを合成する細胞系または細胞集団が
必要である。便宜上、フィトヘマグルチニン（PHA）な
どのマイトジェンで刺激された末梢血液リンパ球（PBL
s）がこのような細胞集団として役立つことができる。
およそ検定作業は下記の通りである。すなわち、PHAで
刺激されたPBLsは３等分に分けられる。その第一の部分
にBCRF1を加える。第二の部分にBCRF1および推定上の拮
抗薬を加える。第三の部分は対照として役立つ。数日後
に、培養物の上澄みのIFN−γについて試験する。これ
は、便宜上、標準エライザ検定法によって商業的に入手
可能なIFN−γに対する単クローン性および多クローン
性抗体、例えば、ジェンザイム・インコーポレーテッド
（Genzyme Inc.）（ボストン、MA）からの抗体を用いて
行われる。或いは、検定の読取りは、例えば、RNAブロ
ッティング、PCRまたは類似の方法論によって測定され
る転写されたIFN−γmRNAの量であることができる。PBL
sは標準的な技法を用いて得られる。例えば、ミシェル
（Mishell）ら監修、Selected Methods in Cellular Im
munology（フリーマン（Freeman）、ニューヨーク、198
0）。
本発明のハイブリドーマは周知の技法によって製造さ
れる。通常、その方法は、望ましい抗体を産生するＢリ
ンパ球と不死化細胞系の融合を必要とする。或いは、不
死の抗体産生細胞系を生じさせるための非融合技術が可
能であり、しかも本発明の範囲内であり、例えば、ウイ
ルスによって誘発された形質転換：カサリ（Casali）
ら、「Ｂリンパ球の抗原特異的選択およびEBVによる形
質転換からのヒト単クローン性抗体（Human Monoclonal
s from Antigen−Specific Selection of Blymphocytes
and Transformation by EBV）」、Science、第234巻、
476〜479頁（1986）がある。不死化細胞系は、通常、形
質転換された哺乳動物細胞、特に、齧歯類動物、ウシお
よびヒト起原のミエローマ細胞である。例えば、米国特
許第4,693,975号明細書および同第4,720,459号明細書。
最も頻繁には、ラットまたはマウスミエローマ細胞系が
便宜上および入手可能性上用いられる。標的抗原を注射
された哺乳動物から適当なリンパ球を得るための技法は
周知である。一般的には、ヒト起原の細胞が望ましい場
合に末梢血液リンパ球（PBLs）を用いるかまたは非ヒト
哺乳動物源が望ましい場合に脾臓細胞若しくはリンパ節
細胞を用いる。宿主哺乳動物に、精製抗原の反復投与に
よって注射し、その哺乳動物が望ましい抗体産生細胞系
を生じるのを可能にした後、これらを不死化細胞系と融
合するために採取する。好ましくは、抗体産生Ｂ細胞の
哺乳動物源は、マウス、ラット、ウサギまたはヒトであ
る。融合法も当該技術分野で周知であり、概して、細胞
をポリエチレングリコールなどの融合剤と混合すること
を必要とする。ハイブリドーマはHAT選択法などの標準
法によって選択される。これらのハイブリドーマの中か
ら、望ましい抗体を分泌するもの、すなわち、BCRF1に
特異的なものを、標準免疫検定法、例えば、ウェスター
ンブロッティング、エライザ、RIA、BCRF1中和能または
類似の方法によってそれらの培地を検定することにより
選択する。抗体は、標準タンパク質精製法、例えば、テ
ュッセン（Tijssen）、Practice and Theory of Enzyme
Immunoassays（エルセビア（Elsevier）、アムステル
ダム、1985）を用いて培地から回収される。多数の参考
文献が上記の技法のいずれかを適用する場合の手引きと
して入手可能であり、例えば、コーラー（Kohler）ら、
Hybridoma Techniques（コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）、ニューヨーク、1980）；テュッセン、Practice an
d Theory of Enzyme Immunoassays（エルセビア、アム
ステルダム、1985）；カンプベル（Campbell）、Monocl
onal Antibody Technology（エルセビア、アムステルダ
ム、1984）；ハレル（Hurrell）、Monoclonal Hybridom
a Antibodies;Techniques and Applications（CRC・プ
レス（Press）、ボカ・ラトン、FL、1982）；および類
似のものがある。次に、BCRF1に特異的な単クローン性
抗体を産生するハイブリドーマに、前記に記載したIFN
−γ抑制検定を用いる第二のスクリーンを行い、BCRF1
の生物活性を阻止するまたは中和することができるもの
を選択する。
れる。通常、その方法は、望ましい抗体を産生するＢリ
ンパ球と不死化細胞系の融合を必要とする。或いは、不
死の抗体産生細胞系を生じさせるための非融合技術が可
能であり、しかも本発明の範囲内であり、例えば、ウイ
ルスによって誘発された形質転換：カサリ（Casali）
ら、「Ｂリンパ球の抗原特異的選択およびEBVによる形
質転換からのヒト単クローン性抗体（Human Monoclonal
s from Antigen−Specific Selection of Blymphocytes
and Transformation by EBV）」、Science、第234巻、
476〜479頁（1986）がある。不死化細胞系は、通常、形
質転換された哺乳動物細胞、特に、齧歯類動物、ウシお
よびヒト起原のミエローマ細胞である。例えば、米国特
許第4,693,975号明細書および同第4,720,459号明細書。
最も頻繁には、ラットまたはマウスミエローマ細胞系が
便宜上および入手可能性上用いられる。標的抗原を注射
された哺乳動物から適当なリンパ球を得るための技法は
周知である。一般的には、ヒト起原の細胞が望ましい場
合に末梢血液リンパ球（PBLs）を用いるかまたは非ヒト
哺乳動物源が望ましい場合に脾臓細胞若しくはリンパ節
細胞を用いる。宿主哺乳動物に、精製抗原の反復投与に
よって注射し、その哺乳動物が望ましい抗体産生細胞系
を生じるのを可能にした後、これらを不死化細胞系と融
合するために採取する。好ましくは、抗体産生Ｂ細胞の
哺乳動物源は、マウス、ラット、ウサギまたはヒトであ
る。融合法も当該技術分野で周知であり、概して、細胞
をポリエチレングリコールなどの融合剤と混合すること
を必要とする。ハイブリドーマはHAT選択法などの標準
法によって選択される。これらのハイブリドーマの中か
ら、望ましい抗体を分泌するもの、すなわち、BCRF1に
特異的なものを、標準免疫検定法、例えば、ウェスター
ンブロッティング、エライザ、RIA、BCRF1中和能または
類似の方法によってそれらの培地を検定することにより
選択する。抗体は、標準タンパク質精製法、例えば、テ
ュッセン（Tijssen）、Practice and Theory of Enzyme
Immunoassays（エルセビア（Elsevier）、アムステル
ダム、1985）を用いて培地から回収される。多数の参考
文献が上記の技法のいずれかを適用する場合の手引きと
して入手可能であり、例えば、コーラー（Kohler）ら、
Hybridoma Techniques（コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）、ニューヨーク、1980）；テュッセン、Practice an
d Theory of Enzyme Immunoassays（エルセビア、アム
ステルダム、1985）；カンプベル（Campbell）、Monocl
onal Antibody Technology（エルセビア、アムステルダ
ム、1984）；ハレル（Hurrell）、Monoclonal Hybridom
a Antibodies;Techniques and Applications（CRC・プ
レス（Press）、ボカ・ラトン、FL、1982）；および類
似のものがある。次に、BCRF1に特異的な単クローン性
抗体を産生するハイブリドーマに、前記に記載したIFN
−γ抑制検定を用いる第二のスクリーンを行い、BCRF1
の生物活性を阻止するまたは中和することができるもの
を選択する。
抗体の断片の使用および生産も周知であり、例えば、
Fab断片：テュッセン、Practice and Theory of Enzyme
Immunoassays（エルセビア、アムステルダム、198
5）；およびFv断片：ホフマン（Hochman）ら、Biochemi
stry、第12巻、1130〜1135頁（1973）、シャロン（Shar
on）ら、Biochemistry、第15巻、1591〜1594頁（1976）
およびエーリッヒ（Ehrlich）ら、米国特許第4,355,023
号明細書；並びに抗体２分の１分子；オーディトア（Au
ditore）−ハーグリーブズ（Hargreaves）、米国特許第
4,470,925号明細書がある。
Fab断片：テュッセン、Practice and Theory of Enzyme
Immunoassays（エルセビア、アムステルダム、198
5）；およびFv断片：ホフマン（Hochman）ら、Biochemi
stry、第12巻、1130〜1135頁（1973）、シャロン（Shar
on）ら、Biochemistry、第15巻、1591〜1594頁（1976）
およびエーリッヒ（Ehrlich）ら、米国特許第4,355,023
号明細書；並びに抗体２分の１分子；オーディトア（Au
ditore）−ハーグリーブズ（Hargreaves）、米国特許第
4,470,925号明細書がある。
本発明のハイブリドーマおよび単クローン性抗体は、
免疫原としての組換えによって生じた成熟BCRF1のグリ
コシル化変種かまたは非グリコシル化変種に対して製造
される。一般的には、BCRF1の非グリコシル化変種は大
腸菌（E.coli）で製造され、グリコシル化変種は哺乳動
物細胞宿主、例えば、CV1若しくはCOSサル細胞、マウス
Ｌ細胞または類似のもので製造される。組換えによって
生じた成熟BCRF1は、発現ベクターの宿主細胞中に標準
プロトコルを用いて導入することによって製造される。
例えば、マニアティス（Maniatis）ら、Molecular Clon
ing:A Laboratory Manual（コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー・ニューヨーク、1982）；オカヤ
マ（Okayama）およびベルグ（Berg）、Mol.Cell.Bio
l.、第２巻161〜170頁（1982）および第３巻、280〜289
頁（1983）；タケベ（Takebe）ら、Mol.Cell.Biol.、第
８巻、466〜472頁（1988）；米国特許第4,599,308号明
細書；米国特許第4,675,285号明細書；カオフマン（Kau
fman）ら、Mol.Cell.Biol.、第２巻1304〜1319頁（198
2）；または類似のものがある。細菌または哺乳動物の
発現ベクターの構築は、望ましいタンパク質をコードす
るヌクレオチド配列が分かるかさもなければ入手可能で
あれば当該技術分野で周知であり、例えば、デボア（De
Bore）は米国特許第4,551,433号明細書において細菌の
発現ベクターで用いるためのプロモーターを開示し；ゴ
ーデル（Goeddel）らは米国特許第4,601,980号明細書に
おいておよびリッグス（Riggs）は米国特許第4,431,739
号明細書において、大腸菌発現システムによる哺乳動物
タンパク質の産生を開示し；そしてリッグス（上記に引
用）、フェレッティ（Ferretti）ら、Proc.Natl.Acad.S
ci.，第83巻、599〜603頁（1986）、スプロート（Sproa
t）ら、Nucleic Acids Research、第13巻、2959〜2977
頁（1985）およびムレンバッハ（Mullenbach）ら、J.Bi
ol.Chem.，第261巻、719〜722頁（1986）は、細菌で発
現させるための合成遺伝子を構築する方法を開示してい
る。したがって、これらの文献は、参考文献として後述
される。更に、BCRF1は、この開示の一部分としてアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American
Type Culture Collection）（ロックビル、メリーラン
ド州）に寄託番号68493として寄託されたプラスミドで
あるpBCRF1（SRα）を用いてCOS7細胞を一時的にトラン
スフェクトすることによって製造することができる。図
１は、pBCRF1（SRα）の制限地図である。
免疫原としての組換えによって生じた成熟BCRF1のグリ
コシル化変種かまたは非グリコシル化変種に対して製造
される。一般的には、BCRF1の非グリコシル化変種は大
腸菌（E.coli）で製造され、グリコシル化変種は哺乳動
物細胞宿主、例えば、CV1若しくはCOSサル細胞、マウス
Ｌ細胞または類似のもので製造される。組換えによって
生じた成熟BCRF1は、発現ベクターの宿主細胞中に標準
プロトコルを用いて導入することによって製造される。
例えば、マニアティス（Maniatis）ら、Molecular Clon
ing:A Laboratory Manual（コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー・ニューヨーク、1982）；オカヤ
マ（Okayama）およびベルグ（Berg）、Mol.Cell.Bio
l.、第２巻161〜170頁（1982）および第３巻、280〜289
頁（1983）；タケベ（Takebe）ら、Mol.Cell.Biol.、第
８巻、466〜472頁（1988）；米国特許第4,599,308号明
細書；米国特許第4,675,285号明細書；カオフマン（Kau
fman）ら、Mol.Cell.Biol.、第２巻1304〜1319頁（198
2）；または類似のものがある。細菌または哺乳動物の
発現ベクターの構築は、望ましいタンパク質をコードす
るヌクレオチド配列が分かるかさもなければ入手可能で
あれば当該技術分野で周知であり、例えば、デボア（De
Bore）は米国特許第4,551,433号明細書において細菌の
発現ベクターで用いるためのプロモーターを開示し；ゴ
ーデル（Goeddel）らは米国特許第4,601,980号明細書に
おいておよびリッグス（Riggs）は米国特許第4,431,739
号明細書において、大腸菌発現システムによる哺乳動物
タンパク質の産生を開示し；そしてリッグス（上記に引
用）、フェレッティ（Ferretti）ら、Proc.Natl.Acad.S
ci.，第83巻、599〜603頁（1986）、スプロート（Sproa
t）ら、Nucleic Acids Research、第13巻、2959〜2977
頁（1985）およびムレンバッハ（Mullenbach）ら、J.Bi
ol.Chem.，第261巻、719〜722頁（1986）は、細菌で発
現させるための合成遺伝子を構築する方法を開示してい
る。したがって、これらの文献は、参考文献として後述
される。更に、BCRF1は、この開示の一部分としてアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American
Type Culture Collection）（ロックビル、メリーラン
ド州）に寄託番号68493として寄託されたプラスミドで
あるpBCRF1（SRα）を用いてCOS7細胞を一時的にトラン
スフェクトすることによって製造することができる。図
１は、pBCRF1（SRα）の制限地図である。
BCRF1cDNAの最大の読み取り枠は、配列番号１に示し
たアミノ酸の配列によって定義される。EBVゲノムの説
明は、ベーア（Baer）ら、Nature、第310巻、207〜211
頁（1984）に与えられており、BCRF1cDNAのヌクレオチ
ド配列はジェンバンク（GenBank）リリース26で入手可
能である。
たアミノ酸の配列によって定義される。EBVゲノムの説
明は、ベーア（Baer）ら、Nature、第310巻、207〜211
頁（1984）に与えられており、BCRF1cDNAのヌクレオチ
ド配列はジェンバンク（GenBank）リリース26で入手可
能である。
BCRF1が可溶性形態で、例えば、形質転換した酵母ま
たは哺乳動物細胞の分泌生成物として発現される場合、
それは、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマ
トグラフィーおよび／または類似の操作工程を含む当該
技術分野の標準法にしたがって精製することができる。
例えば、「酵素精製法および関連技術（Enzyme Purific
ation and Related Techniques）」、Methods in Enzym
ology、22:233〜577（1977）およびスコープス（Scope
s）、Protein Purification;Principles and Practice
（スプリンガー・フェアラーク（Springer−Verlag）、
ニューヨーク1982）はこのような精製法の指針を与え
る。同様に、BCRF1が不溶性形態、例えば、凝集物、封
入体またはその類似物として発現される場合、それら
は、封入体を破裂した宿主細胞から遠心分離によって分
離し、封入体をカオトロピズム剤および還元剤で可溶化
し、可溶化した混合物を稀釈し、そしてカオトロピズム
剤および還元剤の濃度を低下させてポリペプチドが生物
学的に活性なコンホーメーションをとるようにさせるこ
とを含む当該技術分野での標準法によって精製すること
ができる。後者の方法は参考文献として後述される下記
の参考文献、すなわち、ウィンクラー（Winkler）ら、B
io-chemistry、25:4041〜4045（1986）；ウィンクラー
ら、Biotechnology、3:992〜998（1985）；コス（Koth
s）ら、米国特許第4,569,790号明細書；並びに欧州特許
出願第86306917.5号明細書および同第86306353.3号明細
書に開示されている。
たは哺乳動物細胞の分泌生成物として発現される場合、
それは、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマ
トグラフィーおよび／または類似の操作工程を含む当該
技術分野の標準法にしたがって精製することができる。
例えば、「酵素精製法および関連技術（Enzyme Purific
ation and Related Techniques）」、Methods in Enzym
ology、22:233〜577（1977）およびスコープス（Scope
s）、Protein Purification;Principles and Practice
（スプリンガー・フェアラーク（Springer−Verlag）、
ニューヨーク1982）はこのような精製法の指針を与え
る。同様に、BCRF1が不溶性形態、例えば、凝集物、封
入体またはその類似物として発現される場合、それら
は、封入体を破裂した宿主細胞から遠心分離によって分
離し、封入体をカオトロピズム剤および還元剤で可溶化
し、可溶化した混合物を稀釈し、そしてカオトロピズム
剤および還元剤の濃度を低下させてポリペプチドが生物
学的に活性なコンホーメーションをとるようにさせるこ
とを含む当該技術分野での標準法によって精製すること
ができる。後者の方法は参考文献として後述される下記
の参考文献、すなわち、ウィンクラー（Winkler）ら、B
io-chemistry、25:4041〜4045（1986）；ウィンクラー
ら、Biotechnology、3:992〜998（1985）；コス（Koth
s）ら、米国特許第4,569,790号明細書；並びに欧州特許
出願第86306917.5号明細書および同第86306353.3号明細
書に開示されている。
本発明のハイブリドーマに特有の抗体および抗体断片
は、メッセンジャーRNAを抽出し、cDNAライブラリーを
構築し、そして抗体分子のセグメントをコードするクロ
ーンを選択することによる組換え手段によっても製造す
ることができる。例えば、ウォール（Wall）ら、Nuclei
c Acids Research、第５巻、3113〜3128頁（1978）；ザ
クト（Zakut）ら、Nucleic Acids Research、第８巻、3
591〜3601頁（1980）；カビリー（Cabilly）ら、Prc.Na
tl.Acad.Sci.，第81巻、3273〜3277頁（1984）；ボス
（Boss）ら、Nucleic Acids Research、第12巻、3791〜
3806頁（1984）；アムスター（Amster）ら、Nucleic Ac
ids Research、第８巻、2055〜2065頁（1980）；モーア
（Moore）ら、米国特許第4,642,334号明細書；スケラ
（Skerra）ら、Science、第240巻、1038〜1041（198
8）；ヒューズ（Huse）ら、Science、第246巻、1275〜1
281（1989）；ベター（Better）ら、Science，第240
巻、1041〜1043（1989）；およびリーチマン（Riechman
n）ら、Nature、第332巻、323〜327頁（1988）がある。
特に、このような技法は、一つの種の結合性領域が別の
種の抗体の非結合性領域と組み合わされて免疫原性を低
下させる内部特異的単クローン性抗体を製造するのに用
いることができる。例えば、リュー（Liu）ら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.，第84巻、3439〜3443（1987）。
は、メッセンジャーRNAを抽出し、cDNAライブラリーを
構築し、そして抗体分子のセグメントをコードするクロ
ーンを選択することによる組換え手段によっても製造す
ることができる。例えば、ウォール（Wall）ら、Nuclei
c Acids Research、第５巻、3113〜3128頁（1978）；ザ
クト（Zakut）ら、Nucleic Acids Research、第８巻、3
591〜3601頁（1980）；カビリー（Cabilly）ら、Prc.Na
tl.Acad.Sci.，第81巻、3273〜3277頁（1984）；ボス
（Boss）ら、Nucleic Acids Research、第12巻、3791〜
3806頁（1984）；アムスター（Amster）ら、Nucleic Ac
ids Research、第８巻、2055〜2065頁（1980）；モーア
（Moore）ら、米国特許第4,642,334号明細書；スケラ
（Skerra）ら、Science、第240巻、1038〜1041（198
8）；ヒューズ（Huse）ら、Science、第246巻、1275〜1
281（1989）；ベター（Better）ら、Science，第240
巻、1041〜1043（1989）；およびリーチマン（Riechman
n）ら、Nature、第332巻、323〜327頁（1988）がある。
特に、このような技法は、一つの種の結合性領域が別の
種の抗体の非結合性領域と組み合わされて免疫原性を低
下させる内部特異的単クローン性抗体を製造するのに用
いることができる。例えば、リュー（Liu）ら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.，第84巻、3439〜3443（1987）。
本発明の拮抗薬は薬剤組成物として投与される。この
ような組成物は、本発明の単クローン性抗体の少なくと
も１種類またはそれらの断片の治療量を薬剤担体中に含
んでいる。薬剤担体は本発明の組成物を患者に対して送
達するのに適当な任意の相溶性無毒性物質であることが
できる。滅菌水、アルコール、脂肪、蝋および不活性固
体は担体中に含まれることができる。更に、薬学的に許
容し得るアジュバント（例えば、緩衝剤および分散助
剤）を薬剤組成物中に配合することもできる。概して、
この種の薬剤を非経口投与するのに有用な組成物は周知
である。例えば、Remington′s Pharmaceutical Scienc
e、第15版（マック・パブリッシング・カンパニー（Mac
h Publishing Company）、イーストン、PA、1980）。或
いは本発明の組成物を、植込み可能なまたは注射可能な
薬剤送達システムによって患者体内に導入することがで
きる。例えば、アーカート（Urquhart）ら、Ann.Rev.Ph
armcol.Toxicol.，第24巻、199〜236頁（1984）；ルイ
ス（Lewis）監修、Controlled Release of Pesticides
and Pharmaceuticals（プレナム・プレス（Prenum Pres
s）、ニューヨーク、1981）；ジョンソン（Johnson）ら
監修、Drug Delivery Systems:Fundamentals and Techn
iques（エリス・ホーウッド・リミテッド（Ellis Horwo
od Ltd.）、ロンドン、1987）；米国特許第3,773,919号
明細書；米国特許第3,270,960号明細書；等。
ような組成物は、本発明の単クローン性抗体の少なくと
も１種類またはそれらの断片の治療量を薬剤担体中に含
んでいる。薬剤担体は本発明の組成物を患者に対して送
達するのに適当な任意の相溶性無毒性物質であることが
できる。滅菌水、アルコール、脂肪、蝋および不活性固
体は担体中に含まれることができる。更に、薬学的に許
容し得るアジュバント（例えば、緩衝剤および分散助
剤）を薬剤組成物中に配合することもできる。概して、
この種の薬剤を非経口投与するのに有用な組成物は周知
である。例えば、Remington′s Pharmaceutical Scienc
e、第15版（マック・パブリッシング・カンパニー（Mac
h Publishing Company）、イーストン、PA、1980）。或
いは本発明の組成物を、植込み可能なまたは注射可能な
薬剤送達システムによって患者体内に導入することがで
きる。例えば、アーカート（Urquhart）ら、Ann.Rev.Ph
armcol.Toxicol.，第24巻、199〜236頁（1984）；ルイ
ス（Lewis）監修、Controlled Release of Pesticides
and Pharmaceuticals（プレナム・プレス（Prenum Pres
s）、ニューヨーク、1981）；ジョンソン（Johnson）ら
監修、Drug Delivery Systems:Fundamentals and Techn
iques（エリス・ホーウッド・リミテッド（Ellis Horwo
od Ltd.）、ロンドン、1987）；米国特許第3,773,919号
明細書；米国特許第3,270,960号明細書；等。
本発明の拮抗薬が抗体から誘導される場合、通常、そ
れらは非経口によって、好ましくは静脈内に投与され
る。このようなタンパク質またはペプチド拮抗薬は免疫
原性であることができるので、それらは、例えば、トマ
シ（Tomasi）ら、米国特許第4,732,863号明細書に記載
されたように、慣用的なIV投与セットによってかまたは
皮下デポ（depot）から徐々に投与されるのが好まし
い。非経口によって投与される場合、抗体または断片
は、注射可能な単位剤形の形態（溶液、懸濁液、エマル
ジョン）に薬学的に許容し得る注射用ビヒクルと一緒に
配合される。このようなビヒクルは本来的に無毒性且つ
非治療的である。このようなビヒクルの例は、規定食塩
水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンク液で
ある。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性ビヒ
クルを用いることもできる。好ましいビヒクルは５％デ
キスロース／食塩水である。ビヒクルは、等張性および
化学的安定性を増大させる物質などの少量の添加剤、例
えば、緩衝剤および保存剤を含むことができる。抗体
は、凝集物、他のタンパク質、内毒素およびその類似物
を実質的に含まない精製形態において濃度約５〜30mg/m
l、好ましくは、10〜20mg/mlで配合されるのが好まし
い。好ましくは、内毒素濃度は2.5EU/ml未満である。
れらは非経口によって、好ましくは静脈内に投与され
る。このようなタンパク質またはペプチド拮抗薬は免疫
原性であることができるので、それらは、例えば、トマ
シ（Tomasi）ら、米国特許第4,732,863号明細書に記載
されたように、慣用的なIV投与セットによってかまたは
皮下デポ（depot）から徐々に投与されるのが好まし
い。非経口によって投与される場合、抗体または断片
は、注射可能な単位剤形の形態（溶液、懸濁液、エマル
ジョン）に薬学的に許容し得る注射用ビヒクルと一緒に
配合される。このようなビヒクルは本来的に無毒性且つ
非治療的である。このようなビヒクルの例は、規定食塩
水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンク液で
ある。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性ビヒ
クルを用いることもできる。好ましいビヒクルは５％デ
キスロース／食塩水である。ビヒクルは、等張性および
化学的安定性を増大させる物質などの少量の添加剤、例
えば、緩衝剤および保存剤を含むことができる。抗体
は、凝集物、他のタンパク質、内毒素およびその類似物
を実質的に含まない精製形態において濃度約５〜30mg/m
l、好ましくは、10〜20mg/mlで配合されるのが好まし
い。好ましくは、内毒素濃度は2.5EU/ml未満である。
拮抗薬のための投与方式の選択は、拮抗薬の血清代謝
回転速度、BCRF1の血清濃度、拮抗薬の免疫原性、標的B
CRF1の到達可能性およびその類似のものを含むいくつか
の因子に依存する。好ましくは、投与方式は、許容しう
る副作用の水準を堅持しながら、患者に対して送達され
た拮抗薬の量を最大にする。したがって、送達される拮
抗薬の量は、一部分は、特定の拮抗薬および治療される
症状の苛酷さに依存する。適当な投与量を選択する場合
の指針は、抗体の治療的使用についての文献で見出さ
れ、例えば、バッハ（Bach）ら、フェロン（Ferrone）
ら監修のHandbook of Monoclonal Antibodies（ノージ
ス・パブリケーションズ（Noges Publications）、パー
ク・リッジ・NJ、1985）の第22章；並びにハーバー（Ha
ber）ら監修のAntibodies in Human Diagnosis and The
rapy（ラヴェン・プレス（Raven Press）、ニューヨー
ク、1977）中、ラッセル（Russell）、303〜357頁およ
びスミス（Smith）ら、365〜389頁がある。好ましく
は、拮抗薬が単クローン性抗体またはそれらのFabの大
きさ断片（結合性組成物を含む）を含む場合は常に、そ
の投与量は約１〜20mg/kg/日の範囲である。更に好まし
くは、投与量は約１〜10mg/kg/日の範囲である。
回転速度、BCRF1の血清濃度、拮抗薬の免疫原性、標的B
CRF1の到達可能性およびその類似のものを含むいくつか
の因子に依存する。好ましくは、投与方式は、許容しう
る副作用の水準を堅持しながら、患者に対して送達され
た拮抗薬の量を最大にする。したがって、送達される拮
抗薬の量は、一部分は、特定の拮抗薬および治療される
症状の苛酷さに依存する。適当な投与量を選択する場合
の指針は、抗体の治療的使用についての文献で見出さ
れ、例えば、バッハ（Bach）ら、フェロン（Ferrone）
ら監修のHandbook of Monoclonal Antibodies（ノージ
ス・パブリケーションズ（Noges Publications）、パー
ク・リッジ・NJ、1985）の第22章；並びにハーバー（Ha
ber）ら監修のAntibodies in Human Diagnosis and The
rapy（ラヴェン・プレス（Raven Press）、ニューヨー
ク、1977）中、ラッセル（Russell）、303〜357頁およ
びスミス（Smith）ら、365〜389頁がある。好ましく
は、拮抗薬が単クローン性抗体またはそれらのFabの大
きさ断片（結合性組成物を含む）を含む場合は常に、そ
の投与量は約１〜20mg/kg/日の範囲である。更に好まし
くは、投与量は約１〜10mg/kg/日の範囲である。
下記の実施例は本発明の態様を例証するのに役立つ。
選択されたベクター、宿主、融合相手、試薬濃度および
温度並びに他の変数値は、本発明を単に例示するための
ものであり、それらを制限するものと考えるべきではな
い。
選択されたベクター、宿主、融合相手、試薬濃度および
温度並びに他の変数値は、本発明を単に例示するための
ものであり、それらを制限するものと考えるべきではな
い。
実施例１ COSサル細胞におけるBCRF1の発現 BCRF1に対する読取り枠をコードする遺伝子を、プラ
イマーを用いるポリメラーゼ鎖反応によって増幅させた
が、それは増幅した断片をEcoRI消化pcD（SRα）ベクタ
ー（図１）に後で挿入することを可能にした。挿入断片
の暗号鎖を配列番号２に示すが、その読取り枠は、開始
信号ATGから停止信号TGAまでのコドンによって三文字の
群で与えられる。
イマーを用いるポリメラーゼ鎖反応によって増幅させた
が、それは増幅した断片をEcoRI消化pcD（SRα）ベクタ
ー（図１）に後で挿入することを可能にした。挿入断片
の暗号鎖を配列番号２に示すが、その読取り枠は、開始
信号ATGから停止信号TGAまでのコドンによって三文字の
群で与えられる。
適当な方向でインサートを運搬するクローンを、BCRF
1の発現および／または制限消化の電気泳動パターンに
よって同定した。BCRF1遺伝子を運搬するこのようなベ
クターの一つをpBCRF1（SRα）と称し且つATCCに寄託番
号68193として寄託した。pBCRF1（SRα）を大腸菌MC106
1で増幅させ、標準的な技法によって単離し、そして下
記のようにCOS7サル細胞をトランスフェクトするのに用
いた。すなわち、トランスフェクションの前日に、COS7
サル細胞約1.5×106個を、それぞれ100mmプレート上の
５％ウシ胎児血清（FCS）および２ミリモルグルタミン
を含むダルベッコ改良イーグル培地（DME）中に播種し
た。トランスフェクションを行うために、COS7細胞を、
トリプシンとのインキュベーションによって皿から取出
し、血清不含DMEで２回洗浄し、そして血清不含DME中
で、細胞107個/mlになるよう懸濁させた。0.75mlアリコ
ートをDNA20μｇと混合し、0.4cmの滅菌電気めっきキュ
ベットに移した。10分後に、細胞を、バイオラド・ジー
ン・パルサー（BioRad Gene Pulser）装置において200
ボルト、960μＦで脈動させた。更に10分後に細胞をキ
ュベットから取出し、５％FCS、２ミリモルグルタミ
ン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイ
シンを含むDME20mlに加えた。その混合物を４つの100mm
組織培養皿に分配した。37℃、５％CO2で12〜24時間後
に、培地を、１％FCSのみを含む同様の培地と取換え、
インキュベーションを37℃、５％CO2で更に72時間続け
た後、培地を集め、そしてIFN−γ合成を阻害するその
能力について検定した。
1の発現および／または制限消化の電気泳動パターンに
よって同定した。BCRF1遺伝子を運搬するこのようなベ
クターの一つをpBCRF1（SRα）と称し且つATCCに寄託番
号68193として寄託した。pBCRF1（SRα）を大腸菌MC106
1で増幅させ、標準的な技法によって単離し、そして下
記のようにCOS7サル細胞をトランスフェクトするのに用
いた。すなわち、トランスフェクションの前日に、COS7
サル細胞約1.5×106個を、それぞれ100mmプレート上の
５％ウシ胎児血清（FCS）および２ミリモルグルタミン
を含むダルベッコ改良イーグル培地（DME）中に播種し
た。トランスフェクションを行うために、COS7細胞を、
トリプシンとのインキュベーションによって皿から取出
し、血清不含DMEで２回洗浄し、そして血清不含DME中
で、細胞107個/mlになるよう懸濁させた。0.75mlアリコ
ートをDNA20μｇと混合し、0.4cmの滅菌電気めっきキュ
ベットに移した。10分後に、細胞を、バイオラド・ジー
ン・パルサー（BioRad Gene Pulser）装置において200
ボルト、960μＦで脈動させた。更に10分後に細胞をキ
ュベットから取出し、５％FCS、２ミリモルグルタミ
ン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイ
シンを含むDME20mlに加えた。その混合物を４つの100mm
組織培養皿に分配した。37℃、５％CO2で12〜24時間後
に、培地を、１％FCSのみを含む同様の培地と取換え、
インキュベーションを37℃、５％CO2で更に72時間続け
た後、培地を集め、そしてIFN−γ合成を阻害するその
能力について検定した。
新たに単離されたPBLsの10mlアリコート（細胞約２×
106個/ml）を、（ｉ）５％FCSおよび２ミリモルグルタ
ミンを補足したDME90％および（ii）pBCRF1（SRα）で
予めトランスフェクトしたCOS7細胞からの上澄み10％か
ら成る培地中のPHA（100ng/ml）と一緒に37℃でインキ
ュベートした。24時間後に、細胞および上澄みを採取し
て、それぞれIFN−γmRNAおよびIFN−γタンパク質の存
在について検定した。対照は、10％の上澄みが、無関係
のcDNAインサートを運搬するプラスミドで予めトランス
フェクトされたCOS培養物からのものであったことを除
き、同一の処理をした。BCRF1で処理した試料は、対照
に相対してIFN−γ合成を約50％阻害することを示し
た。
106個/ml）を、（ｉ）５％FCSおよび２ミリモルグルタ
ミンを補足したDME90％および（ii）pBCRF1（SRα）で
予めトランスフェクトしたCOS7細胞からの上澄み10％か
ら成る培地中のPHA（100ng/ml）と一緒に37℃でインキ
ュベートした。24時間後に、細胞および上澄みを採取し
て、それぞれIFN−γmRNAおよびIFN−γタンパク質の存
在について検定した。対照は、10％の上澄みが、無関係
のcDNAインサートを運搬するプラスミドで予めトランス
フェクトされたCOS培養物からのものであったことを除
き、同一の処理をした。BCRF1で処理した試料は、対照
に相対してIFN−γ合成を約50％阻害することを示し
た。
実施例２ 大腸菌におけるBCRF1の発現 配列番号３に与えられた配列の成熟BCRF1をコードす
る遺伝子は、大腸菌において発現させることができる。
る遺伝子は、大腸菌において発現させることができる。
pBCRF1（SRα）のcDNAインサートをM13プラスミドに
再クローン化させ、そこでそれは、特定部位の突然変異
誘発によって２回変化し、すなわち、最初に、成熟BCRF
1ポリペプチドに対するコード領域の５′末端でClal部
位を形成し、そして次に、成熟BCRF1ポリペプチドに対
するコード領域の３′末端でBamHI部位を形成する。次
に、突然変異配列は、下記に記載したTRPC11発現ベクタ
ーに容易に挿入される。
再クローン化させ、そこでそれは、特定部位の突然変異
誘発によって２回変化し、すなわち、最初に、成熟BCRF
1ポリペプチドに対するコード領域の５′末端でClal部
位を形成し、そして次に、成熟BCRF1ポリペプチドに対
するコード領域の３′末端でBamHI部位を形成する。次
に、突然変異配列は、下記に記載したTRPC11発現ベクタ
ーに容易に挿入される。
TRPC11ベクターは、合成上の一致PBS断片をClalリン
カー（ATGCAT）に連結することによって、および得られ
た断片をClal制限pMT11hc（Clal部位を含むように予め
修飾された）にクローン化することによって構築され
た。pMT11hcは、πVXプラスミドEcoRI−HindIIIポリリ
ンカー領域を有するpBR322の小さい（2.3キロベース）
高コピー、AMPR、TETS誘導体である。（πVXは、マニア
ティスら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、1982
に記載されている）。これは、EcoRIおよびBamHIでpMT1
1hcを制限し、得られた付着端に入れ、そしてClalリン
カー（CATCGATG）と連結し、それによってEcoRIおよびB
amHI部位を修復し且つSmal部位をClal部位で置き換える
ことによってClal部位を含むように修飾された。TRPC11
構築からのある形質転換細胞は、Clal部位が側面に位置
した縦列のPBS配列を有した。Clal部位の一つおよびPBS
配列の第二コピーの一部分は、このプラスミドをPstlで
消化し、Bal31ヌクレアーゼで処理し、EcoRIで制限し、
そしてT4DNAポリメラーゼを４種類のデオキシヌクレオ
チド三リン酸全部の存在下で用いて処理することによっ
て除去された。得られた30〜40bpの断片をPAGEによって
回収し、Smal制限pUC12にクローン化した。次に、pKC10
1［ニコルス（Nichols）らによってMethods in Enzymol
ogy、第101巻、155頁（アカデミック・プレス（Academi
c Press）、ニューヨーク、1983）に記載された）から
誘導された248bpの大腸菌trpP含有EcoRI断片を、EcoRI
部位にクローン化して、TRPC11構築を完了したが、これ
を図２に図示する。TRPC11は、それをClalおよびBamHI
で最初に消化し、それを精製した後、それを標準的な連
結用溶液中で、成熟BCRF1をコードするヌクレオチド配
列を有するM13のClal−BmaHI断片と混合することによっ
てBCRF1に対するベクターとして用いられる。TRPC11−B
CRF1と称されるインサート含有TRC11は、例えば、ATCC
から寄託番号33876として入手可能な大腸菌K12菌株であ
るJM101において増殖される。
カー（ATGCAT）に連結することによって、および得られ
た断片をClal制限pMT11hc（Clal部位を含むように予め
修飾された）にクローン化することによって構築され
た。pMT11hcは、πVXプラスミドEcoRI−HindIIIポリリ
ンカー領域を有するpBR322の小さい（2.3キロベース）
高コピー、AMPR、TETS誘導体である。（πVXは、マニア
ティスら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、1982
に記載されている）。これは、EcoRIおよびBamHIでpMT1
1hcを制限し、得られた付着端に入れ、そしてClalリン
カー（CATCGATG）と連結し、それによってEcoRIおよびB
amHI部位を修復し且つSmal部位をClal部位で置き換える
ことによってClal部位を含むように修飾された。TRPC11
構築からのある形質転換細胞は、Clal部位が側面に位置
した縦列のPBS配列を有した。Clal部位の一つおよびPBS
配列の第二コピーの一部分は、このプラスミドをPstlで
消化し、Bal31ヌクレアーゼで処理し、EcoRIで制限し、
そしてT4DNAポリメラーゼを４種類のデオキシヌクレオ
チド三リン酸全部の存在下で用いて処理することによっ
て除去された。得られた30〜40bpの断片をPAGEによって
回収し、Smal制限pUC12にクローン化した。次に、pKC10
1［ニコルス（Nichols）らによってMethods in Enzymol
ogy、第101巻、155頁（アカデミック・プレス（Academi
c Press）、ニューヨーク、1983）に記載された）から
誘導された248bpの大腸菌trpP含有EcoRI断片を、EcoRI
部位にクローン化して、TRPC11構築を完了したが、これ
を図２に図示する。TRPC11は、それをClalおよびBamHI
で最初に消化し、それを精製した後、それを標準的な連
結用溶液中で、成熟BCRF1をコードするヌクレオチド配
列を有するM13のClal−BmaHI断片と混合することによっ
てBCRF1に対するベクターとして用いられる。TRPC11−B
CRF1と称されるインサート含有TRC11は、例えば、ATCC
から寄託番号33876として入手可能な大腸菌K12菌株であ
るJM101において増殖される。
実施例３ BCRF1中和単クローン性抗体の製造 雄のルイスラットを、COS7細胞で発現したBCRF1の精
製調製試料で免疫する。最初に、ラットに完全フロイン
トアジュバント（FCA）1mlで乳化したBCRF1溶液（10ミ
リモルトリス−HC1、0.5モルNaCl、pH7.4中、BCRF1が５
〜100μg/ml）で免疫し、そして不完全フロイトアジュ
バント中の同量の材料で２回追加抗原を行った。試験採
血を行う。被験動物に、リン酸緩衝溶液中25μｇのBCRF
1溶液の最終追加抗原を与え、４日後にその脾臓を融合
用に得る。
製調製試料で免疫する。最初に、ラットに完全フロイン
トアジュバント（FCA）1mlで乳化したBCRF1溶液（10ミ
リモルトリス−HC1、0.5モルNaCl、pH7.4中、BCRF1が５
〜100μg/ml）で免疫し、そして不完全フロイトアジュ
バント中の同量の材料で２回追加抗原を行った。試験採
血を行う。被験動物に、リン酸緩衝溶液中25μｇのBCRF
1溶液の最終追加抗原を与え、４日後にその脾臓を融合
用に得る。
ラット脾臓細胞約３×108個を等数のP3X63−AG8.653
マウスミエローマ細胞（ATCCから寄託番号CRL1580とし
て入手可能）と一緒にポリエチレングリコールを用いて
融合する。細胞懸濁液（HAT培地中細胞約3.5×105個/m
l）を、例えば、クレティエン（Chretien）ら、J.Immun
ol.Meth.,第177巻、67〜81頁（1989）に記載されたプロ
トコルにしたがって、40個の96ウェル微量滴定プレート
に分配した。10日後に、ハイブリドーマ上澄みを、微量
滴定プレート上に直接固定化されたBCRF1と結合する能
力を調べるために（間接エライザ）、またはウサギ抗BC
RF1の固定化された多クローン性IgG画分に結号したBCRF
1と結合する能力を調べるために試験する。結合した抗
体は標準プロトコルを用いるペルオキシダーゼ結合ヤギ
抗ラット免疫グロブリンによって検出される。BCRF1と
反応する抗体を分泌するハイブリドーマを限界稀釈によ
ってクローン化する。選択されたハイブリドーマを貯蔵
し（例えば、10％DMSOを含む培地中において−70℃
で）、そして標準的な哺乳動物細胞培養技術（例えば、
10％ウシ胎児血清を含み、１ミリモルグルタミンおよび
50ミリモル２−メルカプトエタノールを補足したRPMI16
40）を用いて培養する。BCRF1阻止抗体を産生するハイ
ブリドーマを、BCRF1特異的抗体を産生するハイブリド
ーマの組から、前記に記載した検定におけるBCRF1に誘
発されたIFN−γ産生抑制に対抗するそれらの能力によ
って選択する。
マウスミエローマ細胞（ATCCから寄託番号CRL1580とし
て入手可能）と一緒にポリエチレングリコールを用いて
融合する。細胞懸濁液（HAT培地中細胞約3.5×105個/m
l）を、例えば、クレティエン（Chretien）ら、J.Immun
ol.Meth.,第177巻、67〜81頁（1989）に記載されたプロ
トコルにしたがって、40個の96ウェル微量滴定プレート
に分配した。10日後に、ハイブリドーマ上澄みを、微量
滴定プレート上に直接固定化されたBCRF1と結合する能
力を調べるために（間接エライザ）、またはウサギ抗BC
RF1の固定化された多クローン性IgG画分に結号したBCRF
1と結合する能力を調べるために試験する。結合した抗
体は標準プロトコルを用いるペルオキシダーゼ結合ヤギ
抗ラット免疫グロブリンによって検出される。BCRF1と
反応する抗体を分泌するハイブリドーマを限界稀釈によ
ってクローン化する。選択されたハイブリドーマを貯蔵
し（例えば、10％DMSOを含む培地中において−70℃
で）、そして標準的な哺乳動物細胞培養技術（例えば、
10％ウシ胎児血清を含み、１ミリモルグルタミンおよび
50ミリモル２−メルカプトエタノールを補足したRPMI16
40）を用いて培養する。BCRF1阻止抗体を産生するハイ
ブリドーマを、BCRF1特異的抗体を産生するハイブリド
ーマの組から、前記に記載した検定におけるBCRF1に誘
発されたIFN−γ産生抑制に対抗するそれらの能力によ
って選択する。
本発明の前述の実施態様についての説明は、例示およ
び説明のために示された。それらは、本発明を網羅する
ものではなく、またその開示された正確な形態に制限す
るためのものではなく、明らかに、多くの修正および変
更が前記の内容に照らして可能である。実施態様は、本
発明の原理を最もよく説明するために選択され且つ記載
さたものであり、それによって当業者は本発明を種々の
実施態様においておよび予想される特定の使用に適当で
あるような種々の修正を用いて最もよく利用することが
できる。それは、本発明の範囲が本明細書に添付の請求
の範囲によって定義されるということを意味する。
び説明のために示された。それらは、本発明を網羅する
ものではなく、またその開示された正確な形態に制限す
るためのものではなく、明らかに、多くの修正および変
更が前記の内容に照らして可能である。実施態様は、本
発明の原理を最もよく説明するために選択され且つ記載
さたものであり、それによって当業者は本発明を種々の
実施態様においておよび予想される特定の使用に適当で
あるような種々の修正を用いて最もよく利用することが
できる。それは、本発明の範囲が本明細書に添付の請求
の範囲によって定義されるということを意味する。
本出願人は、pBCRF1（SRα）を有する大腸菌MC1061を
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロッ
クビル、メリーランド州、米国（ATCC）に受託番号6819
3として寄託した。この寄託は特許手続き上の微生物の
寄託に関するATCCの承認に基づいて与えられる条件に基
づいて行ったものであり、それによって、寄託は、米国
成文法35条122および米国規制基準37条1.14に従って米
国特許商標局長に対して利用可能にさせるものであるこ
とおよび米国特許証の公的発行に対して利用可能にさせ
るものであることが保証され、それによって寄託が維持
されることが必要とされる。寄託された菌株の入手可能
性は、いかなる政府のその特許法による代理権に基づい
て付与された権利に違反して本考案を実施する許可とし
て解釈されるべきではない。
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロッ
クビル、メリーランド州、米国（ATCC）に受託番号6819
3として寄託した。この寄託は特許手続き上の微生物の
寄託に関するATCCの承認に基づいて与えられる条件に基
づいて行ったものであり、それによって、寄託は、米国
成文法35条122および米国規制基準37条1.14に従って米
国特許商標局長に対して利用可能にさせるものであるこ
とおよび米国特許証の公的発行に対して利用可能にさせ
るものであることが保証され、それによって寄託が維持
されることが必要とされる。寄託された菌株の入手可能
性は、いかなる政府のその特許法による代理権に基づい
て付与された権利に違反して本考案を実施する許可とし
て解釈されるべきではない。
寄託は、ブダペスト条約の要件を満たすように修正さ
れた。
れた。
配列表 配列番号:1 配列の型：アミノ酸 配列の長さ:170アミノ酸残基 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質／ポリペプチド 起源生物：エプスタイン・バーウイルス 性状:BCRF−１ 配列番号:2 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ:498塩基 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA配列 起源生物：エプスタイン・バーウイルス 性状:BCRF−１ 配列番号:3 配列の型：アミノ酸 配列の長さ:147アミノ酸残基 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質／ポリペプチド 起源生物：エプスタイン・バーウイルス 性状:BCRF−１
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） 9162−4Ｂ Ｃ
Claims (1)
- 【請求項１】配列番号１または３に示すアミノ酸配列を
有するBCRF1に対する抗体。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US49898590A | 1990-03-26 | 1990-03-26 | |
| US498,985 | 1990-03-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05501116A JPH05501116A (ja) | 1993-03-04 |
| JP2509774B2 true JP2509774B2 (ja) | 1996-06-26 |
Family
ID=23983319
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3507265A Expired - Lifetime JP2509774B2 (ja) | 1990-03-26 | 1991-03-22 | エプスタイン・バ―ウイルス感染治療用のｂｃｒｆ１拮抗薬 |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5756342A (ja) |
| EP (1) | EP0522010B1 (ja) |
| JP (1) | JP2509774B2 (ja) |
| KR (1) | KR960004856B1 (ja) |
| CN (1) | CN1056245A (ja) |
| AT (1) | ATE126704T1 (ja) |
| AU (1) | AU650013B2 (ja) |
| CA (1) | CA2079230C (ja) |
| DE (1) | DE69112392T2 (ja) |
| DK (1) | DK0522010T3 (ja) |
| ES (1) | ES2076526T3 (ja) |
| FI (1) | FI924278A (ja) |
| GR (1) | GR3017920T3 (ja) |
| HU (1) | HUT63339A (ja) |
| IE (1) | IE70910B1 (ja) |
| IL (1) | IL97629A0 (ja) |
| MX (1) | MX9203522A (ja) |
| MY (1) | MY106163A (ja) |
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| OA (1) | OA09674A (ja) |
| PT (1) | PT97108B (ja) |
| WO (1) | WO1991014451A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| CN111574621B (zh) * | 2020-04-30 | 2022-03-29 | 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） | 一种中和eb病毒的单克隆抗体及其应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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- 1991-03-21 IL IL97629A patent/IL97629A0/xx unknown
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-
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- 1992-09-24 FI FI924278A patent/FI924278A/fi not_active Application Discontinuation
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- 1992-09-25 NO NO923749A patent/NO923749D0/no unknown
-
1995
- 1995-06-05 US US08/461,778 patent/US5756342A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-31 GR GR950403026T patent/GR3017920T3/el unknown
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