CN1056245A - 含有bcrf1拮抗物的药物组合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明介绍了用于治疗爱泼斯坦—巴尔病毒感 染的BCRF1拮抗物，其特征在于所述BCRF1拮抗 物选自能封阻由BCRF1诱导抑制干扰素—γ的单 克隆抗体或其片段和含有能封阻由BCRF1诱导抑 制干扰素—γ的单克隆抗体的重链可变区和轻链可 变区的结合组合物。

Description

本发明涉及通过施用爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）蛋白BCRF1拮抗物治疗EBV感染的方法。

EBV是一种普遍存在的人疱疹病毒，其第一次发现与非洲的勃氏淋巴瘤（Burkitt′s    lymphoma）有关，后来还发现它与鼻咽癌有关，并且是传染性单核细胞增多症的病原体。传染通常发生在幼儿时期，一般都无明显临床症状的表现，偶尔表现轻微的症状。但是在中青年期的感染，则出现传染性单核细胞增多症，其症状表现为咽喉炎、发烧和淋巴结病。虽然不适和疲劳有时会延续数周至数月，但是大多数情况下，传染性单核细胞增多症在1至3周内都会消退。包括扁桃体的严重肿大、血小板减少、脾脏破裂、黄疸和脑炎等的并发症偶尔也会出现。在免疫受损害的患者中，例如移植接受者和爱滋病患者，EBV感染会导致B细胞淋巴增生紊乱症。在学校和部队人口集居的地方，传染性单核细胞增生症的发病率最高，例如威斯康辛大学学生住院治疗率达5%，而部队每天因患此种病的缺勤率为第四位（参阅Thorley-Lawson，Biochimica    et    BiophysicaActa，Vol.948，pgs    263-286，1988;Mandell等编Princi-ples    andPractice    of    Infectious    Diseases一书中由Schooley等著第126章，第2版，John    Wiley    &    Sons，New    York，1985）。

利用药物治疗EBV感染者具有显著的临床效果，尤其是用于治疗免疫受损害患者。

本发明提供了通过施用有效量的EBV蛋白BCRF1拮抗物治疗EBV感染的方法。最好BCRF1拮抗物是单克隆抗体或采用常规技术由其产生的组合物。

附图1的图示说明用于产生BCRF1的哺乳动物表达载体。

附图2的图示说明用于产生BCRF1的细菌表达载体。

本发明部分是基于发现了BCRF1抑制干扰素-γ（IFN-γ）-一种细胞防御病毒感染所需的细胞素-的产生。人们认为，BCRF1是由EBV产生，以提高其在宿主中的生存。本发明方法包括给患者施用有效（或改轻病症）量的BCRF1拮抗物。

本发明的拮抗物以由对BCRF1有特异性的抗体衍生的为佳，本发明的拮抗物尤以含有这种抗体的片段或对BCRF1有特异性的组合物为佳。抗体含有一组由二硫桥键连接在一起的多肽链。被称为轻链和重链的两个多肽主链构成抗体的各种类型的主要结构（同型物）。重链和轻链又可分为可变区和不变区两个亚区。重链包括一个可变区和三个不同的不变区，轻链包括一个可变区（不同于重链的可变区）和一个不变区（不同于重链的不变区）。重链和轻链的可变区决定抗体的结合特异性。

本文所述“重链可变区”意指多肽为（1）氨基酸的长度为110-125，（2）其氨基酸顺序相当于本发明单克隆抗体重链的氨基酸顺序。与此相似，“轻链可变区”意指多肽为（1）氨基酸长度为95-115，（2）其氨基酸顺序相当于本发明单克隆抗体轻链的氨基酸顺序。

本文所述“单克隆抗体”意指能对BCRF1进行特异性结合的免疫球蛋白的均一群体。

本文所述“结合组合物”意指含有两个多肽链的组合物，并且该两个多肽链为（1）在进行操作联结时具有对BCRF1很高结合亲和力的构象，（2）是由对BCRF1具有特异性的杂交瘤产生的单克隆抗衍生的。“操作联结”意指两个多肽链相对另一个链而言通过改变某种方式能够定位结合，包括诸如Fab或Fv天然抗体片段，或通过遗传工程方法在羧基末端连接含半胱氨酸的肽联结子。通常两个多肽链对应于BCRF1特异性单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区。本发明的拮抗物最好由BCRF1特异性单克隆抗体产生。能够封阻或中和BCRF1的单克隆抗体可通过它们能够抑制由BCRF1引起的对干扰素-γ产生的抑制进行选择。这样的测定需要能合成IFN-γ的细胞系或细胞群。较为方便的是将由分裂素如植物凝血素（PHA）已刺激过的周围血淋巴细胞（PBL）用作这样的细胞群。一般说来，按如下所述方法进行测定：将PHA刺激过的PLB分成三等份，把BCRF1加到第一部分，把BCRF1和假定的拮抗物加到第二部分，第三部分作为对照。数天后，测定培养物上清液中的IFN-γ。采用常规的ELISA测定方法和市售用于IFN-γ的单克隆和多克隆抗体（例如由麻省波士顿Genzyme公司出售的那些抗体）很容易进行这种测定。此外，测定的读数可以是用RNA印迹法和PCR等方法测定录下的IFN-γ    mRNA的量。用常规技术，例如Mishell等编的Selected    Methods    in    Cellular    Immunology（Freeman，New    York，1980）一书中所述方法得到PBL。

本发明的杂种瘤可采用已知技术产生。通常该方法包括将永久性的细胞系与产生所需抗体的B淋巴细胞相融合。此外，还可采用非融合技术产生永久性抗体的细胞系，这也属于本发明的范围，例如通过病毒诱导的转化（参阅Casali    et    al.，“Human    Monoclonals    from    Antigen-Specific    Selection    of    B    Lymphocytes    and    Transformation    by    EBV”，Science，Vol.234，pp.476-479，1986）。永久性细胞通常都是被转化的哺乳动物细胞，尤其是啮齿动物、牛和人的骨髓瘤细胞（参阅美国专利4693975和4720459）。最常用的是大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系，既很方便又易于得到。将靶抗原注射到哺乳动物中，由其得到适合的淋巴细胞，这种技术也是已知的。一般说来，如果需要人细胞，则可使用周围性血淋巴细胞（PBL）;如果需要非人哺乳动物细胞，则可使用脾脏细胞或淋巴细胞。将重复剂量的经过纯化的抗原注入到宿主哺乳动物中，使其能产生所需的产生抗体的细胞，然后收集这些细胞用于与永久性细胞系融合。产生抗体的B细胞的最佳哺乳动物是小鼠、大鼠、兔或人。融合技术是本领域已知的，一般说来是将细胞与融合剂（如聚乙二醇）混合。杂种瘤可通过常规方法（如HAT选择法）选择。采用常规免疫测定法例如Western印迹法、ELISA法、RIA法和BCRF1中和能力法等方法，测定杂种瘤的培养基，从而从这些杂种瘤中，选择能分泌对BCRF1具有特异性的所需抗体的杂种瘤。用常规的蛋白质纯化技术，例如Tijssen著的“Practice    and    Theory    of    Enzyme    Immunoassays”（Elsevier，Amsterdam，1985）一书中介绍的方法，从培养基中回收抗体。指导使用上述任何技术有许多文献可以参考利用，例如Kohler    et    al.，Hybridoma    Techniques（Cold    Spring    Harbor    Laboratory，New    York，1980）Tijssen，Practice    and    Theory    of    Enzyme    Immunoassays（Elsevier，Amsterdam，1985）;Campbell，Monoclonal    Antibody    Technology（Elsevier，Amsterdam，1984）;Hurrell，Monoclonal    Hybridoma    Antibodies：Techniques    and    Applications（CRC    Press，Boca    Raton，FL，1982）等杂种瘤产生的对BCRF1具有特异性的单克隆抗体采用上述IFN-γ-抑制测定法进行第二次筛选，选出具有能封阻或中和BCRF1生物活性的抗体。

抗体片段的使用和产生也是已知的，例如Fab片段：Tijssen，Practice    and    Theory    of    Enzyme    Immunoassays（Elsevier，Amsterdam，1985）;Fv片段：Hochman    et    al.，Biochemistry，Vol.12，pgs.1130-1135（1973），Sharon    et    al.，Biochemistry，Vol.15，pgs.1591-1594（1976）和Ehrlich    et    al.，美国专利4，355，023;和抗体半分子;Auditore-Hargreaves，美国专利4，470，925。

本发明的杂种瘤和单克隆抗体采用由重组方法产生的成熟免疫原BCRF1的糖基化或非糖基形式进行生产。一般说来，非糖基化形式的BCRF1在大肠杆菌中产生，而糖基化形式的BCRF1则在哺乳动物细胞宿主中产生，例如CV1或COS猴细胞和鼠L细胞等。重组产生的成熟BCRF1是通过将表达载体引入宿主细胞产生的，其所采用的是常规方法，例如Maniatis    et    al.，Molecular    Cloning：A    Laboratory    Manual（Cold    Spring    Harbor    Laboratory，New    York，1982）;Okayama    and    Berg，Mol.Cell.Biol.，Vol.2，pgs.161-170（1982）和Vol.3，pgs.280-289（1983）;Takebe    et    al.，Mol.Cell.Biol.，Vol.8，pgs.466-472（1988）;美国专利4，599，308;美国专利4，675，285;Kaufman    et    al.，Mol.Cell.Biol.，Vol.2，pgs.1304-1319（1982）;一经了解编码所需蛋白质的核苷酸顺序，则细菌或哺乳动物表达载体的构建是本领域已知的，也可从文献中得到，例如DeBoer在美国专利4551433中公开了用于细菌表达载体的启动子;Goeddel    et    al.，在美国专利4，601，980和Riggs在美国专利4，431，739中公开了通过大肠杆菌表达系统产生哺乳动物蛋白，和Riggs（引文同上），Ferretti    et    al.，Proc.Natl.Acad，Sci.，Vol.83，pgs.599-603（1986），Sproatet    al.，Nucleic    Acids    Research，Vol.13，pgs.2959-2977（1985）和Mullenbach    et    al.，J.Biol.Chem.，Vol.261，pgs.719-722（1986）公开了如何构建用于细菌表达的合成基团。因此，这些文献也是本文的参考文献。BCRF1也可以通过用质粒pBCRF1（SRα）过渡转染COS7细胞产生。质粒pBCRF1（SRα）作为本发明公开的一部分，已保藏在美国典型培养物保藏中心（ATCC）（Rockville，MD），保藏号为：68193。图1给出pBCRF1（SRα）的限制性图。

BCRF1    cDNA的最大开放读码定义为下列氨基酸顺序：

Met  Glu  Arg  Arg  Leu  Val  Val  Thr  Leu  Gln  Cys  Leu  Val  Leu  Leu

5    10    15

Tyr  Leu  Ala  Pro  Glu  Cys  Gly  Gly  Thr  Asp  Gln  Cys  Asp  Asn  Phe

20    25    30

Pro  Gln  Met  Leu  Arg  Asp  Leu  Arg  Asp  Ala  Phe  Ser  Arg  Val  Lys

35    40    45

Thr  Phe  Phe  Gln  Thr  Lys  Asp  Glu  Val  Asp  Asn  Leu  Leu  Leu  Lys

50    55    60

Glu  Ser  Leu  Leu  Glu  Asp  Phe  Lys  Gly  Tyr  Leu  Gly  Cys  Gln  Ala

65    70    75

Leu  Ser  Glu  Met  Ile  Gln  Phe  Tyr  Leu  Glu  Glu  Val  Met  Pro  Gln

80    85    90

Ala  Glu  Asn  Gln  Asp  Pro  Glu  Ala  Lys  Asp  His  Val  Asn  Ser  Leu

95    100    105

Gly  Glu  Asn  Leu  Lys  Thr  Leu  Arg  Leu  Arg  Leu  Arg  Arg  Cys  His

110    115    120

Arg  Phe  Leu  Pro  Cys  Glu  Asn  Lys  Ser  Lys  Ala  Val  Glu  Gln  Ile

125    130    135

Lys  Asn  Ala  Phe  Asn  Lys  Leu  Gln  Glu  Lys  Gly  Ile  Tyr  Lys  Ala

140    145    150

Met  Ser  Glu  Phe  Asp  Ile  Phe  Ile  Asn  Tyr  Ile  Glu  Ala  Tyr  Met

155    160    165

Thr  Ile  Lys  Ala  Arg

170

EBV基因组已由Baer等作了介绍（Nature，Vol.310，pp.207-211，1984），BCRF1    cDNA的核苷酸顺序可从GenBank    release    26得到。

当BCRF1以可溶解形式表达时，例如转化的酵母或哺乳动物细胞的分泌产物，则可按本领域的常规方法纯化，包括硫酸铵沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤、电泳、亲和性色谱和/或其他方法，例如“Enzyme    Purification    and    Related    Techniques”，Methods    in    Enzymology，22∶233-577（1977）和Scopes的“Protein    Purification：Principles    and    Practice    （Springer-Verlag，New    York，1982）为这种纯化提供了指导。同样，当BCRF1表达为不溶解形式时，例如集合物和包涵体等，则它们可以按本领域常规方法纯化，包括通过离心从分裂的宿主细胞中分离包涵体、用促溶剂和还原剂溶解包涵体、稀释已溶解的混合物和降低增溶剂和还原剂的浓度，使多肽具有生物活性的构型。上述方法在下列文献中已作了介绍：Winkler    et    al.，Biochemistry，25∶4041-4045（1986）;Winkler    et    al.，Biotechnology，3∶992-998（1985）;Koths    etal.，美国专利4，569，790;以及欧洲专利申请86306917.5和86306353.3.这些文献都作为本文的参考文献。

本发明杂种瘤的特征性抗体和抗体片段也可通过提取信使RNA、构建cDNA库和选择编码抗体分子片段的克隆等重组方法产生，例如Wall    et    al.，Nucleic    Acids    Research，Vol.5，pgs.3113-3128（1978）;Zakut    et    al.，Nucleic    Acids    Research.Vol.8，pgs.3591-3601（1980）;Cabilly    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.81，pgs.3273-3277（1984）;Boss    et    al.，Nucleic    Acids    Research，Vol.12，pgs.3791-3806（1984）;Amster    et    al.，Nucleic    Acids    Research，Vol.8，pgs.2055-2065（1980）;Moore    et    al.，美国专利4，642，334;Skerra    et    al.，Science，Vol.240，pgs.1038-1041（1988）;Huse    et    al.，Science，Vol.246，pgs.1275-1281（1989）;Better    et    al.，Science，Vol.240，pgs.1041-1043（1988）;和Riechmann    et    al.，Nature，Vol.332，pgs.323-327（1988）。特别是这些技术可以用于产生种间单克隆抗体，其中一个种的结合区与另一种抗体的非结合区相结合，从而降低免疫原性，例如Liu    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.84，pp.3439-3443（1987）。

本发明的拮抗物可以药物组合物的形式使用。这类组合物含有治疗量的至少一种本发明单克隆抗体或其片段和药物载体。该药物载体可以是任何能相容的无毒性的适合于将本发明组合物传递给患者的物质。载体可以包括无菌水、醇、油脂、石蜡和惰性固体。药物上可接受的助剂（例如缓冲剂和分散剂）也可结合到药物组合物中。一般说来，非经肠胃道使用这类药物的组合物都是已知的，例如Remington著的“Pharmaceutical    Science”，15th    Ed.（Mack    Publishing    Company，Easton，PA，1980）。此外，将本发明的组合物引入患者体内可以通过可植入或注入药物的传递系统，例见Urquhart    et    al.，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，Vol.24，pgs.199-236（1984）;Lewis，ed.，Controlled    Release    of    Pesticides    and    Pharmaceuticals（Plenum    Press，New    York，1981）;Johnson    et    al.，eds.，Drug    Delivery    Systems：Fundamentals    and    Techniques（Ellis    Horwood，Ltd.，London，1987）;美国专利3，773，919;美国专利3，270，960等等。

当本发明的拮抗物由抗体产生时，它们通常是非经肠胃道用药，尤以静脉注射为佳。由于这类蛋白或肽拮抗物可以是免疫原性的，所以最好采用常规的第Ⅳ种用药方式或皮下储存方式缓慢用药，例如按Tomasi等在美国专利4732863中所述方式用药。以非经肠胃道用药时，抗体或片段与药物上可接受的非经肠胃道的载体结合，配制成可注射的单位剂量形式（溶液，悬浮液，乳液）。这类载体应是固有无毒性的和非治疗性的。这类载体的例子有标准盐水、Ringer溶液、葡萄糖溶液和Hank溶液。还可以使用非液体载体，例如固体油和油酸乙酯。较佳的载体是5%的葡萄糖盐水。载体可以含有少量的添加剂，例如可增加等渗性和化学稳定性的物质，如缓冲液和防腐剂。抗体最好以纯化过的形式配制，基本不含聚合物、其他蛋白质和内毒素等，浓度约为5-30mg/ml，尤以10-20mg/ml为佳。内毒素的量最好低于2.5E /ml。

使用拮抗物方式的选择决定于若干因素，包括拮抗物的血清转换率、BCRF1的血清水平、拮抗物的免疫原性和靶BCRF1的可接受性等。用药方式最好以可接受的副作用程度，将最大量的拮抗物传送给患者。此外，传递拮抗物的量部分决定于具体的拮抗物和需要治疗的患者的病情严重程度。指导如何选择适宜的剂量在有关抗体的治疗应用的文献中都可参考，例如Bach等在Ferrone等编的“Handbook    of    MonoclonalAntibodies”（Noges    Publications，Park    Ridge，NJ，1985）一书中的第22章，Russell和Smith等在Haber等编的“Antibodies    in    Human    Diagnosis    and    Therapy”（Raven    Press，New    York，1977）一书中所介绍的方法。拮抗物最好总是含有单克隆抗体或其Fab大小的片段（包括结合组合物），剂量范围约为1-20mg/kg/天，尤以大约1-10mg/kg/天最佳。

以下的实施例用于说明本发明的各个方面，选择的载体、宿主、融合对象、试剂浓度、温度以及其他可变值等仅仅举例说明本发明而不是限制本发明。

实施例1：BCRF1在COS7猴细胞中的表达

编码BCRF1开放读码的基因使用以后能将放大的片段插入EcoRI消化的pcD（SRα）载体（图1）引物通过聚合酶链反应放大。插入片段的编码链如下所述，其中按从起始信号ATG至终止信号TGA的密码子以三字母一组给出开放读码：

带有在适当方向上插入物的克隆通过BCRF1的表达和/或限制性消化的电泳型式鉴定。带有BCRF1基因一种这样的载体命名为pBCRF1（SRα）并已保藏在ATCC，保藏号为68193。pBCRF1（SRα）在大肠杆菌MC1061中放大，通过常规方法分离，并按如下所述转染COS7猴细胞：转染前一天，将大约1.5×10⁶COS7猴细胞接种在各个100mm培养皿上，使用Dulbecco改进的Eagle培养基（DME），含有5%胎牛血清（FCS）和2mM谷氨酰胺。为了完成转染，通过与胰蛋白酶一起培养，从培养皿中移去COS7细胞，在不含血清的DME中洗涤2次，再在不含血清的DME中悬浮到10⁷细胞/ml。将0.75ml等份液与20μg DNA混合，然后转移到0.4cm的无菌electroporation杯中。10分钟后，将细胞置于200伏960微法的BioRad基因脉冲仪中振动。10分钟后，将从杯中移出的细胞加到含有5%FCS、2mM谷氨酰胺、青霉素、链霉素和庆大霉素的20ml DME中。将混合物等份分配在4个100mm组织培养皿中，在37℃和5%CO₂下放置12-24小时后，用仅含1%FCS的相似培养基取换原来的培养基，再在37℃和5%CO₂下继续温育72小时，然后收集培养基，测定其抑制IFN-γ合成的能力。

在37℃下，将10ml等份的新鲜分离的PBL（约2×10⁶细胞/ml）与PHA（100ng/ml）一起在培养基中温育，培养基的成份为：（ⅰ）90%DME，附加5%FCS和2mM谷氨酰胺，（ⅱ）10%经上述pBCRF1（SRα）转染的COS7细胞的上清液。24小时后，收集细胞和上清液，分别测定IFN-γmRNA和IFN-γ蛋白。对照也按同样方法处理，但是10%上清液取自经上述带不相关的cDNA插入物的质粒转染的COS7培养物。与对照相比，抑制IFN-γ合成约为50%。

实施例2：BCRF1在大肠杆菌中的表达

以下给出的编码成熟BCRF1基因的顺序可以在大肠杆菌中表达：

Thr  Asp  Gln  Cys  Asp  Asn  Phe  Pro  Gln  Met  Leu  Arg  Asp  Leu  Arg

5    10    15

Asp  Ala  Phe  Ser  Arg  Val  Lys  Thr  Phe  Phe  Gln  Thr  Lys  Asp  Glu

20    25    30

Val  Asp  Asn  Leu  Leu  Leu  Lys  Glu  Ser  Leu  Leu  Glu  Asp  Phe  Lys

35    40    45

Gly  Tyr  Leu  Gly  Cys  Gln  Ala  Leu  Ser  Glu  Met  Ile  Gln  Phe  Tyr

50    55    60

Leu  Glu  Glu  Val  Met  Pro  Gln  Ala  Glu  Asn  Gln  Asp  Pro  Glu  Ala

65    70    75

Lys  Asp  His  Val  Asn  Ser  Leu  Gly  Glu  Asn  Leu  Lys  Thr  Leu  Arg

80    85    90

Leu  Arg  Leu  Arg  Arg  Cys  His  Arg  Phe  Leu  Pro  Cys  Glu  Asn  Lys

95    100    105

Ser  Lys  Ala  Val  Glu  Gln  Ile  Lys  Asn  Ala  Phe  Asn  Lys  Leu  Gln

110    115    120

Glu  Lys  Gly  Ile  Tyr  Lys  Ala  Met  Ser  Glu  Phe  Asp  Ile  Phe  Ile

125    130    135

Asn  Tyr  Ile  Glu  Ala  Tyr  Met  Thr  Ile  Lys  Ala  Arg

140    145

将pBCRF1（SRα）的cDNA插入物再克隆到质粒M13中，其通过定位诱变已有两次改变，即在成熟BCRF1多肽编码区的5′端形成ClaⅠ位点和在成熟BCRF1多肽编码区的3′端形成BamHⅠ位点。然后很容易将经过突变的顺序插入到以下所述的TRPC11表达载体中。

TRPC11载体的构建可通过合成的RBS片段与ClaⅠ联结子（ATGCAT）连接和将得到的片段克隆到预先经过修饰含有ClaⅠ位点的ClaⅠ限制的pMTllhc中。pMTllhc是由具有πⅤⅩ质粒EcoRⅠ-HindⅢ多联结子区的pBR322衍生的小（2.3Kb）高拷贝AMP，TET。（πⅩⅤ已由Maniatis等作过介绍：Molecular    Cloning：A    Laboratory    Manual，Cold    Spring    Harbor    Laboratory，1982）。这是经过用EcoRⅠ和BamHⅠ限制pMTllhc、插入生成的粘性末端和用ClaⅠ联结子（CATCGATG）联接等步骤修饰后，含有ClaⅠ位点，从而恢复EcoRⅠ和BamHⅠ位点并由ClaⅠ位点取代SmaⅠ位点。由TRPC11构建得到的一个转化株具有由ClaⅠ位点于侧翼联接的衔接RBS顺序。在4个脱氧核苷三磷酸存在下，通过用PstⅠ消化该质粒、Bal31核酸酶处理、EcoRⅠ限制和T4    DNA聚合酶处理，除去1个ClaⅠ位点和部分第二拷贝的RBS顺序。经PAGE回收生成的30-40bp片段，并将其克隆到SmaⅠ限制的pUC12中。然后将由pKC101衍生的具有大肠杆菌trpP的248pb    EcoRⅠ片段（参阅Nichols等在“Methods    in    Enzymology”Vol.101，p.155，Academic    Press，N.Y.1983）克隆到EcoRⅠ位点，从而完成TRPC11的构建（示于图2）。TRPC11用作BCRF1的载体是先用ClaⅠ和BamHⅠ对其进行消化和纯化，然后将其置于常规的连接溶液中与含有编码成熟的BCRF1的核苷酸顺序的Ml3的ClaⅠ-BamHⅠ片段混合。含有插入物的TRPC11，命名为TRPC11-BCRF1，使其在大肠杆菌K12    JM101（可从ATCC获得，保藏号为33876）中繁殖。

实施例3：BCRF1中和单克隆抗体的生产

用经过纯化的COS7细胞表达的BCRF1制剂使Lewis雄鼠免疫。该大鼠先用1ml    BCRF1溶液（5-100μg/mlBCRF1溶于10mM    Tris-HCl中，0.5M    NaCl，pH7.4）免疫，该溶液预先用1ml弗罗因德氏完全佐剂（FCA）乳化，并用相同量的材料在弗罗因德氏不完全佐剂中加助2次。移去试验液体。最后再用25μg    BCRF1的磷酸缓冲盐水溶液处理试验动物，4天后得到用于融合的脾脏。

用聚乙二醇将大约3×10⁸大鼠脾细胞与等量的P3X63-AG8，653小鼠骨髓瘤细胞（可从ATCC得到，保藏号为CRL 1580）融合。按照Chret-ien等所述方法（J.Immunol.Meth.Vol.117，pp.67-81，1989）将细胞悬浮液（约3.5×10⁵细胞/ml于HAT培养基中）分配在40个96穴微量滴定皿中。10天后，测定杂种瘤上清液与直接固定在微量滴定皿上（间接的ELISA的BCRF1的结合能力，或兔抗BCRF1的被固定的多克隆IgG部分与BCRF1相结合的能力。结合抗体可按常规方法用与过氧化酶结合的羊抗鼠免疫球蛋白进行检测。分泌与BCRF1反应的抗体的杂种瘤通过限制稀释进行克隆。将所选择的杂种瘤贮藏在-70℃和含有10%DMSO的培养基中，并用常规的哺乳动物细胞培养技术（例如含有10%胎牛血清的RPMI    1640的培养基，补充/mM谷氨酰胺和50mM2-巯基乙醇）进行培养。产生BCRF1封阻抗体的杂种瘤是按上述测定方法，通过其减弱由BCRF1诱导的对产生IFN-γ的抑制的能力，从一组产生BCRF1特异性抗体的杂种瘤中进行选择。

对上述本发明实施例的介绍，其目的是说明本发明，不可能是完整无遗的，也不是为了将本发明限制在所公开的精确内容上。显然从以上所述，可以作出许多改进和改变。实施例的选择和介绍，是为了更好地说明本发明的原理，从而能使本领域的其他专业人员作出适宜于具体应用的各种实施方案和各种改进。本发明的保持范围由所附权利要求书予以限定。

申请人已将带有pBCRF1（SRα）的大肠杆菌MC1061保藏在美国的ATCC，保藏号为68193。该保藏是在ATCC同意保藏用于专利目的培养下提供的条件下予以保藏的，该保藏根据35USC    122和37    CFR    1.14可使美国专利和商标委员会能够得到，并在要求保藏的美国专利公开以后可使公众能够得到。可以获得所保藏的菌株并不认为可以违反各国政府按其专利法授予的专利权而许可实施本发明。

该保藏物已经改进，以符合布达佩斯条约的要求。

Claims (4)

1、BCRF1拮抗物的药物组合物的制备方法，包括将BCRF1的拮抗物与药物上可接受的载体相混合，其特征在于所述BCRF1拮抗物选自能封阻由BCRF1诱导抑制干扰素-γ的单克隆抗体或其片段和含有能封阻由BCRF诱导抑制干扰素-γ的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的结合组合物。

2、根据权利要求1的方法，其中所述单克隆抗体片段是Fab片段。

3、根据权利要求1的方法，其中所述单克隆抗体是由人-人杂种瘤产生的。

4、根据权利要求1的方法，其中所述单克隆抗体是人单克隆抗体。

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