PT97108B - Processo para a preparacao de medicamentos contendo antagonistas de bcrf1 uteis para o tratamento de infeccoes pelo virus de epstein-barr - Google Patents

Description

CAMPO DO INVENTO

O invento está relacionado com um método para o tratamento de infecções pelo vírus Epstein-Barr (EBV) através da administração de antagonistas da proteína BCRF1 do EBV.

FUNDAMENTO vírus de Epstein-Barr (EBV) é um vírus herpes de humanos ubíquo que foi inicialmente descoberto em associação com a forma africana (endémica) do linfoma de Burkitt. Subsequentemente encontrou-se o vírus também associado a carcinoma nasofaríngeo e demonstrou-se ser o agente causador da mononucleose infecciosa. A infecçâo geralmente ocorre durante o principio da infância resultando geralmente numa manifestação subclínica, ocasionalmente com sintomas suaves. A infecçâo durante a adolescência ou em adulto, pode no entanto dar origem a mononucleose infecciosa caracterizada por dores de garganta, febre e linfadenopatia. A maior parte dos casos de mononucleose infecciosa resolvem-se em uma a três semanas, se bem que a indisposição e fadiga permaneçam ocasionalmente durante várias semanas a meses. As complicações que ocasionalmente ocorrem incluem um alargamento extremo das amígdalas, trombocitopenia, ruptura do baço, icterícia e encefalite. Também, em doentes imunocomprometidos, tais como recipientes de transplantes e doentes com SIDA, as infecções por EBV podem levar a doenças linfoproliferativas das células B. As populações residentes em universidades e militares são as que têm maior morbidez devido a mononucleose infecciosa, e.g. sendo responsáveis por 5 por cento de todas as hospitalizações dos estudantes da Universidade de Wisconsin infecciosa, estando em quarto lugar como causa de dias perdidos devido a doença no pessoal militar. Thorley-Lawson, Biochemica et Biophvsica Acta. Vol. 948, pgs 263-286 (1988); Schooley et al. capítulo 126 em

Mandell et al., eds. Principies of Infectious Diseases, Ed. (John Wiley Sons, New York, 1985).

A disponibilidade de agentes para tratar pessoas infectadas com EBV poderá ter impacto clínico, particularmente no tratamento de pessoas imunocomprometidas.

SUMARIO DO INVENTO invento proporciona um método para o tratamento de infecções por EBV através da administração de uma quantidade eficaz de um antagonista da proteína BCRF1 de EBV. De preferência os antagonistas de BCRF1 são anticorpos monoclonais ou composições que se lhe ligam derivadas destes por técnicas convencionais.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é uma ilustração esquemática de um vector de expressão em mamíferos útil na produção de BCRF1.

A Figura 2 é uma ilustração esquemática de um vector de expressão bacteriana útil na produção de BCRF1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

O invento baseia-se em parte na descoberta de que BCRF1 suprime a produção de interferão-gama (IFN-gama), uma citocina necessária para as defesas mediadas por células contra infecções virais. Pensa-se que BCRF1 seja produzido por EBV para aumentar a sua sobrevivência no seu hospedeiro. 0 método do invento compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz ou que permita melhorar a doença, de um antagonista de BCRF1.

De preferência, os antagonistas do invento são derivados de anticorpos específicos para BCRF1. Mais preferencialmente, os antagonistas do invento compreendem fragmentos de tais anticorpos ou composições de ligação específicas de BCRF1. Os anticorpos compreendem uma montagem de cadeias polipeptídicas ligadas uma às outras por pontes dissulfureto. Duas cadeias polipeptídicas principais, referidas como a cadeia leve e a cadeia pesada, constituem as principais classes estruturais (isotipos) dos anticorpos. Tanto as cadeias pesadas como as cadeias leves são ainda subdivididas em sub-regiões referidas como regiões variáveis e regiões constantes. As cadeias pesadas compreendem uma única região variável e três regiões constantes diferentes e as cadeias leves compreendem uma única região variável (diferente da da cadeia pesada) e uma única região constante (diferente da da cadeia pesada). As regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve são responsáveis pela especificidade de ligação do anticorpo.

Conforme aqui é usado o termo região variável da cadeia pesada significa um polipeptídeo (1) que tem 110 a 125 aminoácidos de comprimento e (2) cuja sequência de aminoácidos corresponde à da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal do invento. Igualmente, o termo região variável da cadeia leve significa um polipeptídeo (1) que tem 95 a 115 aminoácidos de comprimento e (2) cuja sequência de aminoácidos corresponde à da cadeia leve de um anticorpo monoclonal do invento.

Conforme aqui é usado o termo anticorpo monoclonal refere-se a populações homogéneas de imunoglobulinas que são capazes de se ligar especificamente a BCRF1.

Tal como aqui é usado o termo composição de ligação significa uma composição compreendendo duas cadeias polipeptídicas (1) que, quando operacionalmente associadas, assumem uma conformação tendo elevada afinidade de ligação para BCRFÍ, e (2) que são derivadas de um hibridoma produtor de anticorpos monoclonais específicos para BCRFÍ. 0 termo operacionalmente associado pretende indicar que as duas cadeias polipeptídicas podem estar colocadas uma relativamente â outra para ligação por uma variedade de meios, incluindo a associação num fragmento de anticorpo nativo, como seja Fab ou Fv ou por meio de adaptadores peptídicos obtidos por engenharia genética e contendo cisteina no extremo carbonilo. Normalmente as duas cadeias polipeptídicas correspondem à região variável da cadeia leve e à região variável da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal específico para BCRFÍ. De prefrência, os antagonistas do invento são derivados dos anticorpos monoclonais específicos de BCRFÍ. Os anticorpos monoclonais capazes de bloquear ou neutralizar BCRFÍ são seleccionados pela sua capacidade para inibir a supressão de interferão gama induzida pelo BCRFÍ. Tais ensaios requerem uma linha celular ou uma população de células que sintetize IFN-gama. Convenientemente, os linfócitos do sangeu periférico (PBLs) que tenham sido estimulados com um mitogénio tal como fito-hemaglutinina (PHA) podem servir como tal população de células. Rapidamente, o ensaio funciona como se segue: os PLBs estimulados com PHA são divididos em três partes iguais. À primeira parte, adiciona-se BCRFÍ. À segunda parte adiciona-se BCRFÍ e o antagonista putativo. A terceira parte serve como testemunha. Após vários dias os sobrenadantes das culturas são testados quanto a IFN-gama. Isto poderá ser feito com um ensaio de ELISA convencional usando anticorpos monoclonais e policlonais para IFN-gama, e.g. os da Genzyme, Inc. (Boston, MA). Como alternativa, a leitura do ensaio pode ser da quantidade de mRNA de IFN-gama transcrito, por exemplo medido por transferências de RNA, PCR ou metodologia similar. Os PBLs foram medidos usando técnicas convencionais, e.g. Mishell et al., eds., Selected Methods in

Cellular Immunology (Freeman, New York, 1980) .

Os hibridomas do invento foram produzidos por técnicas conhecidas. De um modo geral o processo envolve a fusão de uma linha celular imortilizada com um linfócito B que produz o anticorpo pretendido. Como alternativa, são possíveis técnicas que não envolvam fusão para a obtenção de linhas celulares imortais produtoras de anticorpos e estão dentro do âmbito do presente invento, e.g. transformação induzida por virus: Casali et al., Human Monoclonals from Antigen-Specific Selection of B-Lymphocytes and Transformation by EBV, Science. Vol. 234, pgs 476-479 (1986). As linhas celulares imortais são normalmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de roedor, bovinas e humanas; e.g. patentes U.S. 4,693,975 e 4,720,459. Mais frequentemente, são empregues linhas celulares de mieloma de rato ou murganho por questões de conveniência e disponibilidade. São bem conhecidas técnicas para obtenção de linfôcitos adequados a partir de mamíferos injectados com o antigénio alvo. De um modo geral, são usados linfôcitos do sangue periférico (PLBs) se as células pretendidas forem de origem humana ou células de baço ou células de nódulos linfáticos se se quiser usar células de mamífero não derivadas de humanos. Um mamífero hospedeiro é injectado com doses repetidas do antigénio purificado e deixa-se que o mamífero gere as células produtoras de anticorpos pretendidas antes delas serem colhidas para fusão com a linha celular imortal. De preferência, a fonte de mamífero das células B produtoras de anticorpos é murganho, rato, coelho ou humanas. Também são bem conhecidas as técnicas de fusão e em geral, envolvem a mistura de células com um agente de fusão, como seja polietilenoglicol. Os hibridomas são seleccionados por processos convencionais, tais como por selecção com HAT. De entre estes hibridomas, os que secretam o anticorpo pretendido, i.e.

específicos para BCRF1, são seleccionados testando o seu meio de cultura através de imunoensaios convencionais tais como transferências Western, ELISA, RIA, capacidade de neutralização de BCRF-1 ou similares. Os anticorpos são recuperados do meio usando técnicas convencionais de purificação de proteínas, e.g. Tijessen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985). Existem disponíveis muitas referências para guia da aplicação de qualquer uma das técnicas acima, e.g. Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Tecniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); e similares. Os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais específicos para BCRF1 foram então sujeitos a um segundo despiste usando o ensaio de supressão de IFN-gama descrito atrás para seleccionar os capazes de bloquear ou neutralizar a actividade biológica de BCRF1.

A utilização e geração de fragmentos de anticorpos é também bem conhecido: e,g. fragmentos Fab: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); e fragmentos Fv: Hochman et al., Biochemistry, Vol. 12, pgs. 1130-1135 (1973), Sharon et al., Biochemistry. Vol. 15 pgs. 1591-1594 (1976) e Ehrlich et al., Patente U.S. 4,355,023; e mais moléculas de anticorpos: Auditore-Hargreaves, Patente U.S. 4,470,925.

Os hibridomas e anticorpos monoclonais do invento são produzidos contra versões não glicosiladas ou glicosiladas do BCRF1 maduro produzido por via recombinante como imunogénios. De um modo geral as versões não glicosiladas de BCRF1 são produzidas em E. coli e as versões glicosiladas são produzidas em células hospedeiras de mamífero, e.g. células CV1 ou COS de macaco, células L de murganho ou similares. BCRFI maduro produzido por via recombinante é produzido pela introdução de um vector de expressão numa célula hospedeira usando protocolos convencionais, e.g.Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Okayama e Berg, Mol. Cell. Biol., Vol. 2, pgs. 161-170 (1982) e Vol. 3, pgs280-289 (1983); Takebe et al., Mol. Cell. Biol.. Vol. 8, pgs. 466-472 (1988); Patente U.S. 4,599,308; Patente U.S. 4,675,285; Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. Vol. 2, pgs. 1304-1319 (1982); ou similares. A construção de vectores de expressão bacterianos ou de mamíferos são bem conhecidos, uma vez determinada a sequência de nucleótidos codificadora de uma proteína pretendida ou de outra conhecida, e.g. De Boer em Patente U.S. 4,551,433 descreve os promotores para usar em vectores de expressão bacterianos; Goeddel et al., em Patente U.S. 4,601,980 e Riggs, em Patente

U.S. 4,431,739 descreve a produção de proteínas de mamífero por sistemas de expressão de E. coli; e Riggs (referido atrás), Ferretti et al., Proc. Natl. Acad. Sei., Vol. 83, pgs 599-603 (1986), Sproat et al., Nucleic Acids Research, Vol. 13, pgs. 2959-2977 (1985) e Mullenbach et al., J, Biol. Chem., Vol. 261, pgs. 719-722 (1986) descreve como construir genes sintéticos para a expressão em bactérias. Assim, estas referências são aqui incluídas como referência. BCRT1 pode também ser produzido por transfecção transitória de células COS 7 com pBCRFl(SRa), um plasmídeo depositado na American Type Culture Collection (Rockville, MD) com o número de acesso 68193 como parte desta divulgação. A Figura 1 é um mapa de restrição de pBCRFl(SRa).

A maior grelha de leitura aberta do cDNA de BCRFI foi definida pela seguinte sequência de aminoãcidos:

Met Glu Arg Arg Leu

Vai Vai

Thr Leu Gin 10

Cys

Leu

Vai

Leu

Leu 15

5

Tyr

Leu

Ala

Pro

Glu

Cys

Gly

Gly

Thr

As D

Gin

Cys

Asp

Asn

Phe

20

25

30

Pro

Gin

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Vai

Lys

35

40

45

Thr

Phe

Phe

Gin

Thr

Lys

Asp

Glu

Vai

Asp

Asn

Leu

Leu

Leu

Lys

50

55

60

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

65

70

75

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Glu

Vai

Met

Pro

Gin

80

85

90

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Glu

Ala

Lys

Asp

His

Vai

Asn

Ser

Leu

95

100

105

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg

Cys

His

110

115

120

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

Vai

Glu

Gin

1 ie

125

130

135

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

140

145

150

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

155

160

165

Thr

Ile

Lys

Ala

Arg

170

•

Uma descrição do genoma do EBV é dada por Baer et al., Nature. Vol. 310 pgs. 207-211 (1984) e a sequência de nucleótidos do cDNA de BCRF1 pode ser conseguida na GenBank saída 26.

Quando BCRF1 é expresso na forma solúvel, por exemplo como um produto secretado de células de levedura ou de mamífero transformadas, ele pode ser purificado de acordo com processos convencionais, incluindo passos de precipitação com sulfato de amónio, cromatografia de permuta iónica, filtração em gel, electroforese, cromatografia de afinidade e/ou similares: e.g. •'Enzyme Purification and Related Techniques, Methods in Enzymology, 22: 233-577 (1977) e Scopes, Protein Purification:

Principies and Practice (Spring-Verlag, New Yor, 1982) proporcionam um guia em tais purificações. Igualmente, quando BCRF1 é expresso na forma insolúvel, por exemplo como agregados, corpos de inclusão ou similares, eles podem ser purificados por processos convencionnais, incluindo separação de corpos de inclusão das células hospedeiras rebentadas por centrifugação, solubilização dos corpos de inclusão com agentes caotrópicos e redutores, diluição da mistura slubilizada e diminuição da concentração de agente caotrópico e de agente redutor de forma a que os polipeptídeos tomem uma conformação biologicamente activa. Estes últimos processos estão descritos nas referências que se seguem, as quais são aqui incluídas como referência: Winkler et al., Biochemistry, 25: 4041-4045 (1986); Winkler et al., Biotechnology, 3:992-998 (1985); Koths et al., patente U.S. 4,569,790; e pedidos de Patente Europeia 4,569,790; e pedidos de Patente Europeia

86306917.5 e 86306353.3.

Os anticorpos e fragmentos de anticorpos característicos dos hibridomas do invento podem ser também produzidos por meios recombinantespor extracção de RNA mensageiro, construção de uma biblioteca de cDNA e selecção de clones que codifiquem segmentos da molécula de anticorpo; e.g. Wall et al., Nucleic Acids Research, Vol. 5, pgs. 3113-3128 (1978); Zakut et al., Nucleic Acids Research. Vol.8, pgs. 3591-3601 (1980); Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sei. Vol.81, pgs 3273-3277 (1984); Boss et al., Nucleic Acids Research, Vol. 12, pgs. 3791-3806 (1984); Amster et al., Nucleic Acids Research, Vol. 8, pgs. 2055-2065 (1980); Moore et al., Patente U.S. 4,642,334; Skerra et al., Science. Vol.240, pgs. 1041-1043 (1988); e Riechmann et al., Nature, Vol. 332, pgs. 323-327 (1988). Em particular, tais técnicas podem ser usadas para produzir anticorpos monoclonais interespecificos, em que a região de ligação de uma das espécies é combinada com a região de não ligação do anticorpo de uma outra espécie para reduzir a imunogenicidade; e.g. Liu et al., Proc. Natl, Acad. Sei.. Vol. 84, pgs. 3439-3443 (1987).

Os antagonistas do invento são administrados como uma composição farmacêutica. Tais composições contêm uma quantidade terapêutica de pelo menos um dos anticorpos monoclonais do invento ou seus fragmentos, num veículo farmacêutico. Um veículo farmacêutico pode ser qualquer substância não tóxica compatível para a libertação das composições do invento num doente. Água estéril, álcool, gorduras, cêras e sólidos inertes podem ser incluídos num veículo. Adjuvantes farmacêuticamente aceitáveis (e.g. agentes tamponantes e agentes dispersantes) podem também ser incluídos na composição farmacêutica. Geralmente as composições úteis para administração parenteral de tais drogas são bem conhecidas, e.g. Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed. (Mack Publishing Company, Easton, PA 1980). Como alternativa, as composições do invento podem ser introduzidas num paciente através de um sistema de libertação de fármacos implantável ou injectãvel, e.g. Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol. 24, pgs. 199-236 (1984); Lewis, ed. Controlled Release of Pesticids and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981); Johnson et al., eds., Drug Delivery Systems: Fundamentais and Techniques (Ellis Horwood, Ltd., London, 1987); Patente U.S. 3,773,919; patente U.S. 3,3270,960; e similares.

Quando os antagonistas do invento são derivados de anticorpos, eles são normalmente administrados parenteralmente, de preferência intravenosamente. Uma vez que tais antagonistas do invento são derivados de anticorpos eles são geralmente administrados parenteralmente, de preferência por via intravenosa. Uma vez que tais proteínas ou antagonistas de peptídeos podem ser imunogénicos eles são de preferência administrados lentamente, quer por meio de uma administração IV convencional quer por um depósito subcutâneo, e.g. como ensinado por Tomasi et al., na Patente U.S. 4,732,863. Quando administrados parenteralmente os anticorpos ou fragmentos serão formulados numa forma de unidade de dosagem injectãvel (solução, suspensão, emulsão) em associação com um veículo parenteral farmacêuticamente aceitável. Tais veículos são inerentemente não tóxicos e não terapêuticos. São exemplos de tais veículos soro fisiológico normal, solução de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank. Os veículos não aquosos tais como óleos e etil-oleato podem também ser usados. Um veículo preferido é 5% dextrose/soro fisiológico. 0 veículo pode conter quantidades mínimas de aditivos tais como substâncias que aumentam a isotonicidade e a estabilidade química, e.g., tampões e preservativos. 0 anticorpo é de preferência formulado nnuma forma substancialmente pura sem sem agregados, outras proteínas, endotoxinas e similares em concentrações entre 5 e 30 mg/ml, de preferência 10 a 20 mg/ml. De preferência, os níveis de endotoxina são inferiores a 2,5 EU/ml.

A selecção de um regime de administração para um antagonista depende de vários factores, incluindo a velocidade conversão do antagonista, o nível de DBCRF1 no soro, a imunogenícidade do antagonista, o acesso do BCRFI alvo e similares. De preferência, um regime de administração maximiza a quantidade de antagonista libertada para o doente consistente com um nível aceitável de efeitos secundários. Assim, a quantidade de antagonista libertado depende em parte do antagonista particular e da gravidade da situação a ser tratada. Um guia para a selecção de doses adequadas encontra-se na literatura sobre a utilização terapêutica de anticorpos, e.g. Bach et al., capítulo 22, em Ferrone et al., eds., Handbook of Monoclonal Antibodies (Noges Publications, Park Ridge, NJ, 1985); e Russell, pgs. 303-357 e Smith et al., pgs. 365-389, em Haber et al., eds., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy (Raven Press, New York, 1977). De preferência, sempre que o antagonista compreenda anticorpos monoclonais ou seus fragmentos do tamanho de Fab (incluindo composições de ligação) a dose é da gama de cerca de 1-20 mg/Kg por dia. Mais preferencialmente a dose está na gama de 1-10 mg/Kg por dia.

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar aspectos do presente invento. Os vectores seleccionados, hospedeiros, parceiros de fusão, concentração de reagentes e temperaturas e os valores de outras variáveis são apenas para exemplificar o invento e não são considerados como sua limitação.

EXEMPLO 1

Expressão de BCRFÍ em células COS 7 de macaco

Um gene codificador da grelha de leitura aberta de BCRFÍ foi amplificado por reacção em cadeia com polimerase usando iniciadores que permitiram mais tarde a inserção do fragmento amplificado num vector pcD(SRa) digerido com EcoRI (Figura 1). A cadeia codificadora do fragmento inserido está apresentada abaixo, onde a grelha de leitura aberta é apresentada em grupos d e três letras de acordo com os codões do sinal de iniciação ATG até ao sinal de paragem TGA:

AATTC ATG GAG CGA AGG TTA GTG GTC ACT CTG CAG TGC CTG GTG CTG 47

CTT	TAC	CTG	GCA	CCT	GAG TC-T GGA GGT ACA GAC CAA TGT GAC AAT	92
TTT	CCC	CAG	ACC	TAA	GAG ATG CCT TCA GTC GTG TTA AAA CCT TTT	137
TCC	AGA	CAA	AGG	ACG	AGG TAG ATA ACC TTT TGC TCA AGG AGT CTC	182
TGC	TAG	AGG	ACT	TTA	AGG ATG CCA GGC CCT GTC AGA AAT GAT CCA	227
ATT	CTA	CCT	GGA	GGA	AGT CAT GCC ACA GGC TGA AAC CAG GAC CCT	272
GAA	GCC	AAA	GAC	CAT	GTC AAT TCT TTG GGT GAA AAT CTA AAG ACC	317
CTA	CGG	CTC	CGC	CTG	CGC AGG TGC CAC AGG TTC CTG CCG TGT GAG	362
AAC	AAG	AGT	AAA	GCT	GTG GAA CAG ATA AAA AAT GCC TTT AAC AAG	407
CTG	CAG	GAA	AAA	GGA	ATT TAC AAA GCC ATG AGT GAA TTT GAC ATT	452
TTT	ATT	AAC	TAC	ATA	GAA GCA TAC ATG ACA ATT AAA GCC AGG TGA G	498

Os clones portadores da inserção na orientação correcta foram identificados por expressão de BCRFÍ e/ou pelo padrão electroforético das digestões de restrição. Um desses vectores portador do gene BCRFÍ foi designado pBCRFl(SRa) e foi depositado na ATCC com o número de acesso 68193. pBCRFl(SRa) foi amplificado em E. coli MC1061, isolado por técnicas convencionais e usado para transfectar células COS 7 de macaco como se segue: Um dia antes da transfecção, aproximadamente 1,5 x 10⁶ células COS 7 de tripsina, para 10 misturada macaco foram semeadas em placas individuais de 100 mm em meio de

Eagle modificação de Dulbecco (DME) contendo 5% de soro fetal (FCS) e 2 mM glutamina. Para realizar a transfecção, as células

COS 7 foram removidas das placas por incubação com lavadas duas vezes em DME sem soro e ressuspensas células/ml em DME sem soro. Uma amostra de 0,75 ml foi com 20 /J,g de DNA e transferido para uma cuvete estéril de electroporação de 0,4 cm. Após 10 minutos, as células foram sujeitas a um pulso de 200 volts, 960 μι numa unidade de Gene Pulser BioRad. Após mais 10 minutos as células foram removidas da cuvetr e adicionado 20 ml de DME contendo 5% FCS, amm glutamina, penicilina, estreptomicina e gentamicina. A mistura foi dividida por quatro placas de cultura de tecidos de 100 mm. Após 12-24 horas a 37°C, 5% C0₂, o meio foi substituido por mrio semelhante contendo apenas 1% FCS e a incubação continuou durante mais 72 horas a

37uC, 5% CO , após o que o meio foi colhido e testado quanto à £ sua capacidade para inibir a síntese de IFN-gama.

Quantidades de 10 ml de PBLs isolados de fresco (cerca de 2 x 10⁶ células/ml) foram incubadas a 37°C com PHA (100 ng/ml) em meio consistindo em (i) 90% de DME suplementado com 5% FCS e 2 mM glutamina e (ii) 10% do sobrenadante de células COS 7 préviamente transfectadas com pBCRFl(SRa). Após 24 horas as células e os sobrenadantes foram colhidos para testar quanto à presença de de mRNA de IFN-gama e proteína de IFN-gama, respectivamente. As testemunhas foram tratadas de forma idêntica excepto os 10% de sobrenadante serem de culturas de células COS7 previamente transfectadas com um plasmídeo portador de uma inserção de cDNA não relacionado. As amostras tratadas com BCRF1 apresentaram cerca de 50% de inibição da síntese de IFN-gama relativamente às testemunhas.

EXEMPLO 2

Expressão de BCRF1 em Escherichia coli

Um gene codificador de BCRF1 maduro da sequência abaixo pode ser expresso em E. coli.

Thr Asp

Gin

Cys

Asp 5

Asn Phe Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg

10

15

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Vai

Lys

Thr

Phe

Phe

Gin

Thr

Lys

Asp

Glu

20

• 25

30

Vai

Asp

Asn

Leu

Leu

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

35

40

45

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

50

55

60

Leu

Glu

Glu

Vai

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Glu

Ala

65

70

75

Lys

Asp

His

Vai

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lvs

Thr

Leu

Arg

80

85

90

Leu

Arg

Leu

Arg

Ara

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lvs

95

100

105

Ser

Lys

Ala

Vai

Glu

Gin

Ile

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

110

115

120

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

I le

125

130

135

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Ile

Lys

Ala

Arg

140

145

A inserção de cDNA do pBCRFl(SRa) foi reclonada num plasmídeo M13 onde foi alterada duas vezes por mutagénese dirigida: primeiro para formar um sítio Ciai no extremo 5' da região codificadora do polipeptídeo maduro BCRF1 e a segunda para formar um sítio BamHI no extremo 3' da região codificadora do polipeptídeo BCRF1 maduro. A sequência mutagenizada foi então facilmente inserida no vector de expressão TRPC11 descrito abaixo.

vector TRPC11 foi construído por ligação de um fragmento consensus RBS sintético a adaptadores Ciai (ATGCAT) e por clonagem dos fragmentos resultantes em pMTllhc cortado com

Ciai (o qual foi previamente modificado para conter um sítio

Çlal). pMTllhc é um pequeno derivado (2,3 kilobases) do pBR322,

R S

AMP , TET , de elevado número de cópias e portador da região de poli-adaptadores EcoRI-HindlII do plasmídeo πνχ. (πνχ está descrito por Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Este foi modificado para conter o sítio Ciai por tratamento de pMTllhc com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI, preenchimento dos extremos coesivoa resultantes e ligação ao adaptador Ciai (CATCGATG), restaurando assim os sítios EcoRI e BamHI e substituindo o sitio Smal por um sítio Clal. Um transformante da construção TRPC11 tem uma sequência RBS em tandem flanqueada por sítios Clal. Um dos sítios Clal e parte da segunda cópia da sequência RBS foram removidos por digestão deste plasmídeo com PstI. tratamento com nuclease Bal31. cortando com EcoRI e tratando com DNA-polimerase de T4 na presença dos quatro trifosfatos de desoxinucleótidos. Os fragmentos resultantes de 30-40 pb foram recuperados via PAGE e clonados em pUC12 cortado com Smal. Um fragmento EcoRI derivado de pKClOl e portador do trpP de E. coli (descrito por Nichols et al. em Methods in Enzymology, Vol. 101, pg. 155 (Academic Press, N.Y. 1983)) foi então clonado no sítio EcoRI para completar a construção de TRPC11, o que está ilustrado na Figura 2. TRPC11 foi empregue como vector para BCRFI digerindo-o primeiro com Clal e BamHI. purificando-o e depois misturando-o numa mistura de ligação convencional com o fragmento Cal-BamHI do M13 contendo a sequência de nucleótidos codificadora do BCRFI maduro. A inserção contendo TRPC11, referida como TRPC11-BCRF1, foi propagada em E. coli K12 estirpe JM101, e.g. disponível na ATCC com o número de acesso 33876.

EXEMPLO 3

Produção de anticorpos monoclonais neutralizantes de BCRF1

Um rato macho Lewis foi imunizado com preparações purificadas de células COS 7 expressas por BCRF1. 0 rato foi primeiro imunizado com 1 ml de solução de BCRF1 (5-100 μ9/ιη1 de BCRF1 em 10 mM Tris-HCl, o,5 M NaCl, pH 7,4) emulsionado com 1 ml de Adjuvante Completo de Freund (FCA) e dadas duas injecções de memória com a mesma quantidade de material em Adjuvante Incompleto de Freund. os animais foram sangrados para realização de testes. Ao animal foi administrada uma injecção de memória final de 25 p,g de BCRF1 em solução de soro fisiológico e quatro dias mais tarde o baço foi retirado para fusão.

Aproximadamente 3 x 10 esplenócitos de rato foram fundidos com um número igual de células de mieloma de murganho P3X63-AG8.653 (adquiridas à ATCC com o número de acesso CRL

1580)usando polietilenoglicol. A suspensão de células (aproxima5 . ...

damente 3,5 x 10 celulas/ml em meio HAT) foi dstnbuido por placas de microtitulação de 96 cavidades, e.g. seguindo o protocolo descrito em Chretien et al., J. Immuno1. Meth. Vol. 117, pgsd. 67-81 (1989). Dez dias mais tarde os sobrenadantes dos hibridomas foram testados quanto à sua capacidade para se ligarem a BCRF1 imobilizado directamente em placas de microtitulação (ELISA indirecta) ou a BCRF1 ligado à fracção IgG policlonal imobilizada de coelho anti-BCRFl. 0 anticorpo ligado foi ddetectado por soro de cabra anti-imunoglobulinas de rato conjugado com peroxidase usando um protocolo convencional. Os hibridomas que secretam anticorpos que reagem com BCRF1 foram clonados por diluição limite. Os hibridomas seleccionados foram guardados (e.g. -70°C em meio de cultura com 10% DMSO) e cultivados usando técnicas convencionais de cultura de tecidos de mamífero (e.g.

RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino, suplementado com lmM glutamina e 50 mM 2-mercaptoetanol). Os hibridomas produtores de anticorpos que bloqueiam BCRF1 foram seleccionados da série de hibridomas produtores de anticorpos específicos de BCRF1 pela sua capacidade para contrariar a supressão induzida por BCRF1 da produção de IFN-gama no ensaio descrito atrás.

As descrições das realizações precedentes do invento foram apresentadas com fins ilustrativos e descritivos. Eles não pretendem ser exaustivos ou limitar o invento a formas precisas divulgadas e óbviamente são possíveis muitas modificações e variações face aos ensinamentos apresentados. As realizações foram escolhidas e descritas para explicar melhor os príncipios do invento para permitir assim que outros familiarizados com a matéria utilizem o invento em várias realizações e com várias modificações conforme adequado à utilização particular a que se destine. Pretende-se que o âmbito do invento seja definido pelas reivindicações apensas.

Os requerentes depositaram E. coli MC1061 portadora de pBCRFl(SRa) na American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), com o número de acesso 68193. Este depósito foi feito nas condições do Tratado de Budapeste para o Depósito de Culturas com Fins de Patente, o qual assegura que o depósito fique disponível ao Comissariado de Patentes e Marcas Registadas com o código 35 USC 122 e 37 CRF 1.14 e ficarão disponíveis ao público após publicação de uma patente U.S. a qual necessita que o depósito seja mantido. A disponibilidade da estirpe depositada não deve ser pensada como uma autorização para a realização do invento em contravenção com os direitos reservados pela autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis de patentes.

O depósito foi modificado para satisfazer as necessida des do Tratado de Budapeste.

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES:

   lã. - Processo para a preparação de um medicamento para o tratamento da doença do virus de Epstein-Barr, caracterizado por se incluir no referido medicamento um antagonista de BCRF1, numa concentração de 5 a 30 mg/ml.
2. 2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido antagonista de BCRF1 ser seleccionado a partir do grupo constituído por um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a supressão do interferão gama induzida por BCRF1, um fragmento de um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a supressão do interferão gama induzida por BCRF1 e uma composição de ligação compreendendo a região variável da cadeia pesada e região variável da cadeia leve de um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a supressão do interferão gama induzida por BCRF-1.
3. 3ã. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido fragmento do referido anticorpo monoclonal ser um fragmento Fab.
4. 4ã. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal ser produzido por um hibridoma humano-humano.
5. 5ã. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido fragmento do referido anticorpo monoclonal ser um fragmento Fab.
6. 6ã. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal ser um anticorpo monoclonal humano.
7. 7ã. - Método para o tratamento de uma pessoa infectada com o vírus de Epstein-Barr, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista de BCRFÍ, especialmente por via intravenosa e numa gama de aproximadamente la 20 mg por quilograma de peso de corpo do referido indivíduo por dia.
8. 8â. - Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido antagonista de BCRFÍ ser seleccionado a partir do grupo constituído por um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a supressão do interferão gama induzida por BCRFÍ, um fragmento de um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a supressão de interferão gama por BCRFÍ e uma composição de ligação compreendendo a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve de um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a supressão do interferão gama.

   gs. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido fragmento do referido anticorpo monoclonal ser um fragmento Fab.
9. 10a. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal ser produzido por um hibridoma humano-humano.

   lia. - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido fragmento do referido anticorpo monoclonal ser um fragmento Fab.

   12ã.

   Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado po monoclonal por o referido anticorpo monoclonal ser um anticorhumano.