PT97107A - Metodo para aumentar o crescimento e proliferacao de mastocitos utilizando interleuquina-9-purificada - Google Patents

Description

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CAMPO DQ INVENTO O invento está relacionado com um método para o tratamento de infecções pelo vírus Epstein-Barr <EBV) através da administração de antagonistas da proteína BCRF1 do EBV.

FUNDAMENTO 0 vírus de Epsiein—Barr (EBV) é um vírus herpes de humanos ubíquo que foi inicialmente descoberto em associação com a forma africana (endémica) do linfoma de Burkitt» Subsequente-mente encontrou-se o vírus também associada a carcinoma nasofa-ringeo ê demonstrou—se ser o agente causador da mononucleose in fecciosa. A infecção geralmenta ocorre durante o principio da infância resultando geralmente numa. manifestação subclínica, ocasionalmente com sintomas suaves. A intenção durante a adolescência ou em adulto, pode no entanto dar origem a mononucleose infecciosa caracterizada por dores de garganta, febre e Xirsfa-denopatia. A maior parte dos casos de mononucleose infecciosa resolvem-se em uma a três semanas, se bem que a indisposição e fadiga permaneçam ocasionalmente durante várias semanas a meses. As complicações que ocasionalmente ocorrem incluem um alargamento extremo das amígdalas, trombocitopenia, ruptura do baço, icterícia s ε-ncefal .i te. Também, em doentes imunocomprometidos, tais como recipientes de transplantes e doentes com SIDA, as infecções por EBV podem levar a doenças linfoproliferativas das células B,

Schooley et al 263-286 (19881 %

As populações residentes em universidades e militares são as que têm maior morbidez devida a mononucleose infecciosa, e.g. sendo responsáveis por 5 por cento de todas as hospitalizações dos estudantes da Universidade de Wisconsin infecciosa, estando em quarto lugar como causa de dias perdidos devido a doença no pessoal militar. Thorley-Lawson, Biochemica et Biophvsica Acta. Vol = 948, pgs 263-286 (19881 % Schooley et al. capítulo 126 em a

v_y A disponibilidade de agentes parai infectadas com EBv poderá ter impacto clínico» tratamento de pessoas imunocomprometidas.

tratar particuL pessoas rmente na

SUMARIO DO INVENTO 0 invento proporciona um método para o tratamento de infecçSes por EBV através da administração de uma quantidade eficaz de um antagonista da proteína BCRFÍ de EBV» De preferência os antagonistas de BuRFÍ s3o anticorpos monoclonais ou composições que se lhe ligam derivadas destes por técnicas convencionais»

BREVE DESCRICaD DOS DESENHOS A Figura 1 á uma ilustração esquemática de um vector de expressão em mamíferos útil na produção de BCRFÍ. A Figura 2 é uma ilustração esquemática de um vector de expressão bacteriana útil na produção de BCRFÍ» ϋ

DESCRICaO DETALHADA DG INVENTO 0 invento baseia—se em parte na descoberta de que BCRFÍ suprime a produção de interferão-gama íIFN-gama)s uma citocina necessária para as defesas mediadas por células contra infecçSes virais» Pensa-se que BCRFÍ seja produzido por EBV para aumentar a sua sobrevivência no seu hospedeiro» 0 método do invento compreende a administração a um índividuo de uma quantidade eficaz ou que permita melhorar a doença, de um antagonista de BCRFÍ»

De preferencia, os antagonxstas dõ inveríta sito deriva.”· dos de anticorpos específicos para BCRF1» Mais prefBrencialmentB? os antagonistas do invento compreendem fragmentos de tais anticorpos ou composições de ligação específicas de BCRF1„ Os anticorpos compreendem uma montagem de cadeias polipeptídicas ligadas uma as ouur«5 por pomes dissulTureco» Duas cadeias polipeptí— dicas principais», referidas como a cadeia leve e a cadeia pesada» constituem as principais classes estruturais (isotipos) dos anticorpos» Tanto as cadeias pesadas como as cadeias leves são ainda subdivididas em sub-regiSes referidas como regiSes variáveis e regiões constantes. As cadeias pesadas compreendem uma única região vsrxdVbfl e tres regiges constantes diferentes e as cadeias leves compreendem uma única região variável (diferente da da cadeia psssadci) e unu* única regigQ constante (diferente ds da cadeia pesada). As regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve são responsáveis pela especificidade de ligeçato do anticorpo»

Conforme aqui é usado λ._. „ . , , , w o termo "região variável da cadeia pesada" significa um poliht3^. ,, ... , ... ^ -Peprideo il> que tem 110 a 125 aminoá.cidos de comprimento e (2) _ - _ . . . . corresponde à da cadeia pesada dt invento» Igualmente, o termo cuja sequência de amxnoacidos um anticorpo monoclonal do ' r*. . X G VtóPXáVGl dâ L.ãdSÍâ l©VS’f Significa um polipeptídeo (i) qUft f .... . v " rem 95 a 115 aramoácidos de comprimento e (2) cuja sequência rt„. aminoâcidos corresponde à da cadeia leve de um anticorpo monocj "^-Onal do invento»

Conforme aaui é usado ^ J termo "anticorpo monoclonal" -»fp»re~se a populações homogén^ ^-S de imunoglobulinas que são :apases de se liqar especificamen-i., * -¾ a BCRF1=

Tal como aqui é usado iignifiea uma composição '•Ompreend en d o t} termo "composição de ligação" rii i uas cadeias

Γ: λ polipeptídicas Cl) que, quando operacionalmente associadas, assumem uma conformação tendo elevada afinidade de ligação para BCRFÍ, e (2) que são derivadas de um hibridoma produtor de anticorpos monoclonais específicos para BCRFÍ» 0 termo "operacional mente associado" pretende indicar que as duas cadeias poli-peptídicas podem estar colocadas uma relativamente à outra para ligação par uma variedade de meios, incluindo a associação num fragmento de anticorpo nativo, como seja Fab ou Fv ou por meio de adaptadores peptídicos obtidos por engenharia genética a contendo cisteina no extremo carbonilo. Normalmente as duas cadeias polipeptídicas correspondem ã região variável da cadeia leve e à região variável da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal específica para BCRFÍ. De prefrtncia, os antagonistas do invento são derivados dos anticorpos monoclonais específicos de BCRFÍ. Os anticorpos monoclonais capazes de bloquear ou neutralizar BCRFÍ são seleccionados pela sua capacidade para inibir a supressão de interferão gama induzida pelo BCRFÍ. Tais ensaios requerem uma linha, celular ou uma população de células que sintetize IFN—gama. Convenientemente, os linfócitos do sangeu periférico ÍPBLs) que tenham sido estimulados com um mitoqénia tal como fito—hemaglu— tinina (PHA) podem servir como tal população de células.

Rapida mente, o ensaio funciona como se segues os F’LBs estimulados com PHA são divididos em três partes iguais, à primeira parte, adiciona—se BCRFÍ. à segunda parte adiciona—se BCRFÍ e o antagonista putativo. A terceira parte serve coma testemunha. Após vários dias os sobrenadam.tes das culturas são testados quanto a IFN-gama. Isto poderá ser feito com um ensaia de ELISA convencional usando anticorpos monoclonais e policlonais para IFN—gama, e.g. os da Senzyme, Inc. {Boston, MA). Como alternativa, a leitura do ensaio pode ser da quantidade de mRMA de IFN-gama transcrito, por exemplo medido por transferências de RNA, PCR ou metodologia similar. Os PBLs foram medidos usando técnicas

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Mishell et al., eds» , Selected Methods in (Frseraan, New York, i 980)»

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convencionais$ e«g» Cellular ImmunoloQV

Os hibridomas do invento foram produzidos por técnicas conhecidas» De um modo geral o processo envolve a fusão de uma linha celular imortilizada com um linfócito B que produz o anticorpo pretendido» Como alternativa, são possíveis técnicas que não envolvam fusão para a obtenção de linhas celulares imortais produtoras de anticorpos e estão dentro do âmbito do presente invento, e.g» transformação induzida por vírus; Casali et al», "Human Monoclanais from Antigen-Specific Selection of B-Lymphocytes and Transformation by EBV”, Science·, Vol» 234, pgs 476-479 (1986). As linhas celulares imortais são normalmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de roedor, bovinas e humanas? e»g = patentes U»S» 4,693,975 e 4,72€*,459» Mais frequentemente, são empregues linhas celulares de mieloma de rato ou murganho por questões de conveniência e disponibilidade» São bem conhecidas técnicas para obtenção de linfócitos adequados a partir de mamíferos injectados com o antigénio alvo» De um modo geral, são usados linfócitos do sangue periférico (PLBs) se as células pretendidas forem de origem humana ou. células de baço ou células de nódulos linfáticos se se quiser usar células de mamífero não derivadas de humanos» Um mamífero hospedeiro é injectado com doses repetidas do antigénio purificado & deixa-se que o mamífero gere as células produtoras de anticorpos pretendidas antes delas serem colhidas para fusão com a linha celular imortal» De preferência, a fonte de mamífero das células B produtoras de anticorpos é murganho, rato, coelho ou humanas» Também são bem conhecidas as técnicas de fusão e em geral, envolvem a mistura de células com um agente de fusão, como seja polietilenoglicol» Os hibridomas são seleccionados por processos convencionais, tais como por selecção com HAT» De entre estes hibridomas, os que secretam o anticorpo pretendido, i»e» 7

N específicos para BCRFi, são seleccionados testando o seu meio de cultura através de imunoensaios convencionais tais como transferências Western , ELISA, RIA, capacidade de neutralização de BCRF—1 ou similares» Os anticorpos são recuperados do meio usando técnicas convencionais de purificação de proteínas, e.g» Tijessen, Practice and Theory of Enzyme 1 mmunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)» Existem disponíveis muitas referências para da aplicação de qualquer uma das técnicas acima, e»g» K.ohler », Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New 198€í)p lijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)ρ Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984)? Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodiess Tecniques and Applications (CRC Press, Boca Raron, FL, Í982)p e similares* Os hibridomss produtores de anticorpos monoclonaís específiuos para BCRFi foram então sujeitos a um segundo despiste usando o ensaio de supressão de IFN-ga-ms descrito atrás para seleccionar os capazes de bloquear' ou neutralizar a actividade biológica de BCRFI» A utilizarão ε gerarão ds fragmentos de anticorpos é também bem conhecidos e,g» fragmentos Fabs Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)

U guia et al York,

e a1», Bi oc hemist rv * Vol. 12, pgs. et al., Biochemistrv» Vol. 15 pgs» et al., Patente U.S. 4 ,355,023p e ma is Audi tore-Hargreaves, Patente U.S. iH ticorpos monoclonaís do invento SãO 4,470,925.

Os hibridomas f produzidos contra versões não glicosiladas ou glicosiladas do BCRFI maduro produzido por via recombinante como imunogénios» De um modo geral as versões não glicosiladas de BCRFI são produzidas sm E» coli e as versões glicosiladas são produzidas em células

s hospedeiras de mamífero, e»g» células CVÍ ou COS de macaco, células L de murganho ou similares» BCRFi maduro produzido por via recombinante é produzido pela introdução ds um vector de expressão numa célula hospedeira usando protocolos convencionais, e„g=Maniatis et al», Molecular Clonings A Lahoratory Manual (Co 1 d Spring Harbor Lahoratory, New York, Í980)s Okayama e Berg, Mol. Ce 11,, Biol»» Vol. 2, pgs» 161-170 (1982) e Vol» 3, pgs280-289 <1983)5 Takebe et al., Mol» Cel1» Biol» , Vol» 8, pgs» 466-472 (1988)5 Patente U.S. 4,599,308? Patente U»S» 4,675,285? Kaufman

Mol

Cel1« Biol nq=. „ i 304—1319 <1982) ou similares» A construção de vectores de expressão bacterianos ou de mamíferos são bem conhecidos-, uma vez determinada a sequência de nucleófcidos codificadora de

Boeddel et al u»s» M* »j -^j*· 31 , 77Γ) ~ / OT LJco “· c rsvs a pn s i s t soí as dS bk ore ss3o de E Ferr •etti et al», Proc» Na tl (1986), Sproat et al» „ NucL 2959-2977 (1985) e Mullenbach et al., J. Biol pgs „ / 1 '7 — /vV < 198¾) oescreve como uma proteína ire tendida ou. de crtr ·* Ί_··„· J. s r, -yrr descrsve sáo bac t erianos? liggs » em Patente de mami f era por Γ* B T fcf i” X d Lí atrás), 83, pgs 599-603 u Vo 1» í 3, pgs» Chem : » » VU 1 D.i. 1 1 L n L :j

'J onstr u. i Γ pene s sintéticos para esta S i refer e'r icias são aqui ode t aiTibêm s er ~ produzido por i COS "7 J com pBCRF l(SRct), um ιη T ype Cu 1 tt .ire Collec 11 on mciuioas como referência» BCRi: transfecção transitória de células COS plasmídeo depositado na American Ts (Rockville, MD) com o número de acesso 68193 como parte desta divulgação» A Figura 1 ê um mapa de restrição de pBCRF 1 <BRo:)» A maior grelha de leitura aberta do cDNA de BCRF1 foi definida pela seguinte sequência de aminoácidoss ^.ί' l': ^.ί' l': Met Glu Arg Arg Leu Vai Vai Thr Leu Gin Cys Leu Vai" Leu Leu 5 10 15 Tyr Leu Ala Pro Glu Cys Gly Gly Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe 20 25 30 Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Vai Lys 35 40 45 Thr Phe Phe Gin Thr Lys Asp Glu Vai Asp Asn Leu Leu Leu Lys 50 55 60 Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala 65 70 75 Leu Ser Glu Met Ile Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Vai Met Pro Gin 80 85 90 Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Vai Asn Ser Leu 95 100 105 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His 110 115 120 Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Vai Glu Gin Ile 125 130 135 Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala 140 145 150 Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met 155 160 165 Thr Ile Lys Ala Arg 170 ·

Uma descrição do genoma do EBV â dada por Baeret al», Naturev!ol« 31Θ pgs. 2y7~2ií C1984) e a sequência de nucleótidos do cDNA de BCRFi pode ser conseguida na BenBank saída 26.

Quando BCRFI ê- expresso na forma solúvel , por exemplo como um produto secretario de células de levedura ou de mamífero transformadas., ele pode ser purificado de acordo com processos convencionais., incluindo passos de precipitação com sulfato de amónio, cromatografia de permuta iónica., filtração em gel, electroforese, cromatografia de afinidade e/ou similares; e.g»

Methods in Purification s "Enzyme Purification and Related Techniques,

Enzymology, 22; 23.3—57/ (1977) e Scopes, Protein ^ ’ I» i©

Principies and Practice (Spring-Verlag, New Yar, 1982) proporcio-nam um guia em tais purificaçSes« IguaImante, quando BCRF1 é expresso na forma insolúvel, por exemplo como agregados, corpos de inclusão ou similares, eles podem ser purificados por processos convencionnais, incluindo separação de corpos de inclusão das células hospedeiras rebentadas por centrifugação, solufailização dos corpos de inclusão com agentes csotrópicos e redutores, diluição da mistura slubilizada e diminuição da concentração de agente caotrópico e de agente redutor de forma a que os polipep-

tideos tomem uma conformação biologicamente activa. Estes últimos processos estão descritos nas referências que se seguem, as quais são aqui incluídas como referências Winkler et ai», Biochemistrv. 255 4041—4045 (1986)? Winkler et al«, Biotechnoloay. 3s992-998 (1985·)? Koths et al», patente U.S. 4,569,790? e pedidos de Patente Europeia 4,569,790? e pedidos de Patente Europeia 86306917.5 e 863Θ6353 * 3

Os anticorpos e fragmentos de anticorpos caracierísti-cos dos hibridomas da invento podem ser também produzidos por meios recombinantespor extracção de RMA mensageiro, construção de uma biblioteca de cDNA e selecção de clones que codifiquem segmentos da molécula de anticorpo? e.ga Wall et al., Nucleic Acids Research, Vai. 5, pgs» 3113-3128 (1978)? Zakut et al., Nucleic Acids Research, Vol.8, pgs. 3591-3,^01 /198©) ? Cabilly et al», Proc. Na11. Acad. 3ci. Vol.8í, pgs 3273-3277 (1.984)? Boss et al», Nucleic Acids Research, Vol. 12, pgs. 3791-3806 (1984)? Ameter et al., Nucleic Acids Research, ναχ _ g? pgs. 2055-2065 (1980)? Moore et al., Patente U.S. ^,642,334? Skerra et al., Science, Vol.24«, pgs» 1©41~í.íí»4o> 11.988)» e Riechmann et al * 9 Nature, Vol. -^---2, pgs·' (1988) e particular, tais técnii_ae- podem &er usada» para ps odu^ir anticorpos monoclonais interespecíficos, em que a região de 1 i'3aÇ£0 de uma das espécies é uomuinada v.om a região de não ligação do anticorpo de um^ outra

lí espécie para reduzir a imunogenicidade; e.g» Liu et al», Proc Natl. ftcad. Sei.. Vol. 84, pgs» 3439-3443 (1987). 'j

Os antagonistas do inventa são administrados como uma composição farmacêutica. Tais composições contêm uma quantidade terapêutica de pelo menos um dos anticorpos monoclonais do invento ou seus fragmentos, num veículo farmacêutico. Um ‘veículo farmacêutico pode ser qualquer substância não tóxica compatível para a libertação das composições do invento num doente. Agua estéril, álcool, gorduras, cfras e sólidos inertes podem ser incluídos num veículo. Adjuvantes farmacêuticaments aceitáveis (e.g. agentes tamponantes e agentes dispersantes) podem também ser incluídos na composição farmacêutica» Geralmente as composições úteis para administração parenteral de tais drogas são bem conhecidas, e.g. Remington?s Pharmaceutical Science, 15th Ed. (M&ck Publishing Company, Easton, PA 1980). Como alternativa, as composições do invento podem ser introduzidas num paciente através de um sistema de libertação de fármacos implantável ou injectável, e.g. Urquhart et al., Ann. Rev» Pharmacol. Toxicol.» Vol» 24, pgs» 199-236 (1984); Lewis, ed. Controlled Release of Pesfcicids and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981); Johnson et al., eds», Drug Delivery Systemss Fundamentais and Techniques (Eliis Horwood, Ltd», London, Í9S7); Patente U.S» 3,773,919; patente U.S. 3,3270,960; e similares, um

Quando os antagonistas do invento são derivados de anticorpos, eles são normalmente administrados parenteralmerste, de preferência intravenosamente. Uma vez que tais antagonistas do invento são derivados de anticorpos eles são geralmente administrados parenteralmente, de preferência por via intravenosa, Uma vez que tais proteínas ou antagonistas de peptídeos podem ser imunogénicos eles são de preferência administrados lentamente, quer por meio de uma administração IV convencional quer por 12

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deposito subcutâneo, e.g, cama ensinado par Tomasi et al», na ratente U„S = 4,732,863= Quando administrados parenteralmente os anticorpos ou fragmentos serão formulados numa forma de unidade de dosagem mjectável (solução, suspensão, emulsão) em associação com um veiculo parenteral farmacêuticamente aceitável„ Tais veículos são inerentemente não tóxicos e não terapêuticos,. São exemplos de tais veículos soro fisiológico normal, solução de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank» Os veículos não aquosos tais como óleos e etil-oleato podem também ser usados. Um veículo preferido ê 5% dextrose/soro fisiológico. 0 veiculo pode conter quantidades mínimas de aditivos tais como substâncias que aumentam a isotonicidade e a estabilidade química, e.g., tampões e preservativos. 0 anticorpo é de preferência formulado nnuma forma substancialmente pura sem sem agregados, outras proteínas, entíotoxinas e similares em concentrações entre 5 e 3© mg/ml, de preferência 10 a 20 mg/ml» De preferêncis, os níveis de endotoxi-na são inferiores a 2,5 EU/ml.

A seiecção de um regime de administração para um antagonista depende de vários factores, incluindo a velocidade conversão do antagonista, o nível de DBCRF1 no soro, a imunogeni-cidade do antagoni^0? ° acesso do BCRFí alvo e similares. De preferência, um reçAms de administração maximiza a quantidade de antagonista libertada para o doente consistente com um nível aceitável de efeito® secundários. Assim, a quantidade cie antagonista libertado depende em parte do antagonista particular e da gravidade da situação a ser tratada. Um guia para a selecção de doses adequadas ©ncontra-se na literatura sobre a utilização terapêutica de anticorpos, e.g» Bach et al», capítulo 22, em Ferrone et al., ©ds., Handbook of Monoclonai Antibodies (Noges Publications, Park Ridas, NJ, 1985); e Ru.ssei 1, pgs. 303-357 e Smith et al., pgs» 365-389, em Haber et al., eds., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy (Raven Press, New York, 1977). De · antagonista prsferSncia, sempre que o compreenda anticorpos moncclonais OU seus f rag mentos QO taman ha de Fa.b C incluindo composições de ligação) a dose é da Qa.íBa de carcs de 1-2Θ mg/Kg por dia* Mais preferencialmente a dose está na gama de 1-1© mg/Kg por dia»

O

Os exemplos que se sequem servem para ilustrar aspectos do presente invento» Os se1ecc ionados, hospedeiros parceiros de fusão, concentração de reagentes e temperaturas e os ) valores de outras variáveis são invento e não são considerados como apí-na·» paira tíssmpii i ii_ar sua 1i mitaç 3o» o EXEMPLO í

Expressão dg BCRF1 bib células COS 7 de macaco

Um gene codificadcar da grelha de leitura aberta de BCRFI foi amplificado por reacção em cadeia com polimerase usando iniciadores que permitiram mais tarde a inserção do fragmento ampliTiçado num vector pcDíSRa) digerido com EcoRI (Figura 1)» A cadeia codificadora do fragmento inserido está apresentada abaixo, onde a grelha de leitura aberta é apresentada em grupos d e trás letras de acordo com os codSes do sinal de iniciação ATG até ao sinal de paragem TSAs AATTC ATG GAG CGA AGG TTA GTG GTC ACT CTG CAG TGC CTG GTG CTG 47 CTT TAC CTG GCA CCT GAG TGT GGA GGT ACA GAC CAA TGT GAC AAT 92 TTT CCC CAG ACC TAA GAG ATG CCT TCA GTC GTG TTA AAA CCT TTT 137 TCC AGA CAA AGG ACG AGG TAG ATA ACC TTT TGC TCA AGG AGT CTC 182 TGC TAG AGG ACT TTA AGG ATG CCA GGC CCT GTC AGA AAT GAT CCA 227 ATT CTA CCT GGA GGA AGT CAT GCC ACA GGC TGA AAC CAG GAC CCT 272 GAA GCC AAA GAC CAT GTC AAT TCT TTG GGT GAA AAT CTA AAG ACC 317 CTA CGG CTC CGC CTG CGC AGG TGC CAC AGG TTC CTG CCG TGT GAG 3 62 AAC AAG AGT AAA GCT GTG GAA CAG ATA AAA AAT GCC TTT AAC AAG 407 CTG CAG GAA AAA GGA ATT TAC AAA GCC ATG AGT GAA TTT GAC ATT 452 TTT ATT AAC TAC ATA GAA GCA TAC ATG ACA ATT AAA GCC AGG TGA G 498

Os clones portadores da inserção na orientação correcta foram identificados por expressão de BCRFI e/ou pelo padrão electroforético das digestões de restrição» Um desses vectores portador do gene BCRFI foi designado pBCRFlCSR<a> e foi depositado na ATCC com o número de acesso 68193« pBCRFl(SRa) foi amplificado em E« coli MC1&61, isolado por técnicas convencionais e usado para transíectar células COS 7 de macaco como se segue? Um dia antes da transfecção, aproximadamente 1,5 x células COS 7 de

V ·\ \ ν $ ;·' ν ·' macaco foram semeadas em placas individuais de 100 mm em meio de Eagle modificação ds Dulbecco (DME) contendo 5% de soro fetal CFCS) e 2 mM glutamins. Para realizar a transfecção, as células COS 7 foram removidas das placas por incubação com tripsina5 lavadas duas vezes em DME sem soro e ressuspensas para 10 cêlulas/ml em DME sem soro. Uma amostra de &,75 ml foi misturada com 2β μα de DNA e transferido para uma cuvete estéril de ele-ctroporaçSo de 0,4 cm. Após 10 minutos,- as células foram sujeitas a um pulso de 200 volts, 96ã pF numa unidade de 8ene Pulser BioRad. Após ma is 10 minutos as células foram removidas da cuve-tr e adicionado 2Θ ml de DME contendo 5¾ FCS, amm glutamina. penicilina, estreptomicina e gentamicina. A mistura foi dividida por quatro placas de cultura de tecidos da 100 mm. Após 12-24 horas- a 37C'C·5 5% CO,, o meio foi substituído por mrio semelhante contendo apenas 1% FCS e a incubação continuou durante ma is 72 horas- a 37uC3 5% CO^, após o que o meio foi colhido e testado quanto à sua capacidade para inibir a síntese de IFM-gama» , cerca

Quantidades de 10 ml de PBLs isolados d© fre^ct de 2 κ 10Ò células/ml) foram incubadas a 37°C com F’HA ~®S'J ng/mli em meio consistindo em <i> 90% de DME suplementado cont FCS e .£ mM glutamina e (ii) 10% do sobrenadante de células COS 7 prévia- menta transfectadas com pBCRFKSRs). Apés 24 horas a5 céiulas e os sobrenadantes foram colhidos para testar quanto â presença de de mRNA de IFN-gama e proteína de IFM-gama., respec tvai7i'-n te - Η·:ί

testemunhas foram tratadas de forma idi'ntica exceP^-° DS sobrenadante serem de culturas de células C0S7 previamen i_s transfec tadas com um plasmídeo portador de uma ins®r£e° cDf*4A não relacionado. As amostras tratadas com BCRF1 apresanicu am cerca de 50% de inibição da síntese de IFN-gama reiativamente às testemunhas.

EXEMPLO 2

Expressão de SCRFí sai E-scherichia coli

Um ysrse codificador de BuRFí maduro da sequência abaixo pode ser expresso em E„ coli„

Thr Asp Gin Cys Asp 5 Asn Phe Pro Gin Met 10 Leu Arg Asp Leu Arg 15 Asp Ala Phe Ser Arg Val 20 Lys Thr Phe Phe 25 Gin Thr Lys Asp Glu 30 Vai Asp Asn Leu Leu 35 Leu Lys Glu Ser Leu 40 Leu Glu Asp Phe Lys 45 Gly Tyr Leu Gly Cys 50 Gin Ala Leu Ser Glu 55 Met Ile Gin Phe Tyr 60 Leu Glu Glu Vai Met 65 Pro Gin Ala Glu Asn 70 Gin Asp Pro Glu Ala 75 Lys Asp His Val Asn 80 Ser Leu Gly Glu Asn 85 Leu Lys Thr Leu Arg 90 Leu Arg Leu Arg Arg Cys 95 His Arg Phe Leu 100 Pro Cys Glu Asn Lys 105 Ser Lys Ala Val Glu 110 Gin Ile Lys Asn Ala 115 Phe Asn Lys Leu Gin 120 Glu Lys Gly Ile Tyr 125 Lys Ala Met Ser Glu 130 Phe Asp Ile Phe Ile 135 Asn Tyr Ile Glu Ala 140 Tyr Met Thr Ile Lys 145 Ala Arg A in serç ãd de c DMA da pBCRFlÍSRa) foi . reclonada plasffixdeo MÍ3 onde foi alterada duas- vezes por mutagénese dirigida; primeiro para formar um sitia Çlal no extremo 5? da região codificadora do polipeptideo maduro BCRFi e a segunda para formar um sitio BamHI no extremo 3S da região codificadora do polipeptí— deo BCRFI maduro» A sequência mutagenizada foi entlo facilmente inserida no vector de expressão TRPClí descrito abaixo» 0 vector TRPC11 foi construído por ligação de um fragmento consensus RBS sintético a adaptadores Clal (ATGCAT) e

Claims (1)

1. REIvTNDICfiÇQ! lâ, - Método para aumentar o crescimento ou proliferação de mastócitos.. caracierisado por compreender a contacto dos vJ ref ΒΓ. idos ma . 5 tóc X t u s C D m uma quan tid ade de u ma protei; na purifica- racteri . z a d a po r t. e r um peso mo lecu.l ar entre csi U íúr Γ CS ,_j ^ g qux1oda1 tons e um po nto isoelèc trico tíe aproximada- mente 1© suficiente para estimular o crescimento ou. proliferação dos referidos mastócitos fí sendo a quantidade de proteína purificada de pelo menos 2© nq/ml=

   2ã „ ricada por os OSSSÃ ** Método de acordo com a reivindicação 1s caracte-"eferidos mastóci tos sserem mastócitos da medul-i 3ã« ~ Método de acordo com a reivindicação 1= caracte-risado por compreender o contacto das referidos mastócitos in vivo, sendo a referida proteína administrada, em particular, a um ÍS;do u-S te 1 óy X C Q LSrSu ter 1 iStíu psle> LfSSi.1· inuiviuuu i.snua >_»« mento ou funcionamento -anormal de mastócitos •4sí·„ — rlél.udu de duoroo com a reivindicação 1, carscts·· 1 \ JKj rxze.QQ por compreenaer o contacto dos rererioos mascocito· x n te r 1 suo u i π a—3 pu. ri.fi c ad a» : om « MéLodo qs acL.ív do com a re5.vinox-„aca.o 1. ? ca.ra.cce— risado por a referida proteína ser obtida a partir de células do baço de murçanho. r zada . - Método : de acordo com a rsivi Π d X cação 1 .-j carac 't 3. referida, p rateina ser obtida a par tir de céX u. X a.s T V 5 ί Ο Λ 71. -· Método do acordo com a reivindicação is caracts-rifado por a referida proteína ser produzida via DMA recombi-nante. 8ã» - Método para aumentar a produção de interisuquina õs caracterizado por compreender a administração a um mastócito de uma quantidade de uma proteína purificada* caractsrizada por possuir um peso molecular entre cerca de 3Θ e cerca de 4Θ quiIodai tons e um ponto isoeléctrico de aproximadamente :l©5 suficiente para provocar um aumento da produção de interisuquina é pelo referido mastócitop sendo a quantidade de proteína purificada de pelo menos 2u ng/mi. Lisboa 3 22 de Março de iwl

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