SK282947B6 - Použitie interleukínu-10 alebo jeho analógu, agonistu alebo antagonistu na výrobu farmaceutického prostriedku - Google Patents

Použitie interleukínu-10 alebo jeho analógu, agonistu alebo antagonistu na výrobu farmaceutického prostriedku Download PDF

Info

Publication number
SK282947B6
SK282947B6 SK129-94A SK12994A SK282947B6 SK 282947 B6 SK282947 B6 SK 282947B6 SK 12994 A SK12994 A SK 12994A SK 282947 B6 SK282947 B6 SK 282947B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
cells
mice
lps
tnfα
ifnγ
Prior art date
Application number
SK129-94A
Other languages
English (en)
Other versions
SK12994A3 (en
Inventor
Waal Malefyt Rene De
Maureen Howard
Di-Hwei Hsu
Hiroshi Ishida
Anne O'garra
Hergen Spits
Albert Zlotnik
Original Assignee
Schering Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering Corporation filed Critical Schering Corporation
Publication of SK12994A3 publication Critical patent/SK12994A3/sk
Publication of SK282947B6 publication Critical patent/SK282947B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5428—IL-10
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

Interleukín-10 alebo jeho analóg, agonista alebo antagonista sa používa na výrobu farmaceutického prostriedku na liečenie zápalu alebo imunitnej funkcie sprostredkovávanej T-bunkami, ktoré sú sprevádzané abnormálnou hladinou nekrózového tumorového faktora alfa. Podávaný interleukín-10 alebo jeho analóg podľa vynálezu moduluje hladiny interleukínu-1 a interleukínu-6, kde abnormálna hladina je zvýšená a je sprevádzaná mikrobiálnou infekciou, horúčkou, hypotenziou, nekrózou tkanív, metabolickou acidózou alebo dysfunkciou orgánov.ŕ

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka použitia interleukínu-10 alebo jeho analógu, agonistu alebo antagonistu na výrobu farmaceutického prostriedku, ktorý ovplyvňuje imunitné odpovede zahrnujúce symptómy septického alebo toxického šoku, napríklad toxicity vyvolanej endotoxínom alebo superantigénom.
Doterajší stav techniky
Niektoré infekcie môžu viesť k hlbokým fyziologickým a metabolickým zmenám. Symptómy môžu byť rôzne, ale zahrnujú horúčku, hypotenziu, prekyseľovanie metabolizmu, nekrózu tkanív, všeobecné narušenie funkcie orgánov a, pokiaľ nie sú správne liečené, nakoniec i smrť. Pozri, napr. práce Berkow (editor) The Merck Manual, Rahway, New Jersey; Weatherall a kol. (editori) Harrison's Textbook of Intemal Medicíne, Mcgrw-Hill, New York; nebo Wyngarden a kol. (editori) Ceciľs Textbook of Medicíne. Saunders Co., Philadelphia; z ktorých každá je v tomto dokumente citovaná. Stavy septického a toxického šoku sú charakteristické pri reakciách na rôzne infekcie a často majú niektoré alebo všetky zo zmienených symptómov.
Septický šok je model reakcii vyvolaných endotoxínom. Septický šok je spôsobený uvoľnením endotoxínu, najbežnejšie lipopolysacharidových zložiek, zo stien gramnegatívnych buniek, do imunitného systému. Toxický šok je model reakcií vyvolaných superantigénom a je spôsobený uvoľnením proteínových zložiek z bunkových membrán grampozitívnych baktérií, napr. stafylokokového enterotoxínu B (SEB). Hoci obe reakcie sú pôvodne spôsobené mikrobiálnou infekciou, imunitný systém reaguje rozdielne podľa toho, ktorý mikrobiálny produkt reakciu zapríčiní.
Na šokovej reakcii vyvolanej endotoxínom, napr. EPS, proteín upravený hostiteľom, faktor nekrózy tumoru (TNF), bolo najnovšie ukázané vyvolanie mnohých škodlivých vplyvov gramnegatívnych septicemií. Pasívna imunizácia antisérom TNF môže zabrániť mnohým smrteľným prípadom pri napadnutí gramnegatívnymi bakteremiami alebo endotixemiami. Pozri, napr. práce Tracey a kol. (1986) Science. 234: 470 - 474; Beutler a kol. (1986) Náture. 320: : 584 - 588; a Tracey a kol. (1987) Náture, 330: 662 - 664. Vysoké hodnoty TNF v sére boli tiež pozorované pri niektorých iných infekčných chorobách vrátane zápalu mozgových blán, malárie a leishmaniazy. Mnoho pacientov s vysokými hodnotami TNF má vyššie všeobecné narušenie funkcie orgánov so zodpovedajúcou vyššou úmrtnosťou. Pozri, napr. práce Waage a kol. (1987) Lancet 355 - 357; Girardin a kol. (1988) New Engl. J- Med., 319: 397 - 400; Scuderi a kol. (1988) Lancet 1364 - 1365; a Kem a kol. (1989) Am. J. Med., 87: 139 -.
Bolo zistené, že dodanie TNF zvieracím alebo ľudským subjektom vedie k detegovateľným sérovým hodnotám interleukínu-6 (IL-6) po 2 až 6 hodinách. Mclntosh a kol. (1989) J. Immunol. 143: 162 - 167; Jablons a kol., J. Immunol., Vol. 169, str. 2257 (1989). IL-6, známy tiež ako faktor-2 stimulujúci B-bunky. interferón β2 alebo faktor stimulujúci hepatocyty, bol identifikovaný ako glykoproteín odvodený z T-buniek, ktorý’ spôsobuje zrenie B-buniek. Pozri, napr. prácu Kishimoto, Blood 74: 1 - 10. Najnovšie bola pri IL-6 preukázaná pleiotropná biologická aktivita vrátane indukcie proteínov akútnej fázy v hepatocytoch a vplyvu na hematopoetické progenitóme bunky a T-bunky. Pozri, napr. práce Geiger a kol., Eur. J. Immunol., Vol. 18, str. 717 (1988); Marinjovic a kol., J. Immunol.,
Vol. 1.42, str. 808 (1989); Morrone a kol., J. Biol, Chem., Vol. 263, str. 12554 (1988); a Perlmutter a kol., J. Clin. Invest., Vol. 84, str. 138 (1989). Starneš a kol., J. Immunol., Vol. 145, str. 4185 - 4191 (1990), v ktorých preukázali, že protilátkový antagonista k IL-6 predĺži prežitie myší pri modelovaní septického šoku.
Stafylokokový enterotoxín B (SEB) je superantigén a môže vyvolať reakciu toxického šoku. Tieto reakcie sú dôsledkom aktivácie podstatnej časti T-buniek, ktorá vedie k prudkej imunitnej reakcii systému sprostredkovanej T-bunkami. Táto reakcia je typická reakcia sprostredkovaná T-bunkami. pri ktorej je možné terapeuticky pôsobiť IL-10, jeho analógmi alebo antagonistami. Čo sa mechanizmu týka, superantigén reaguje priamo s VB prvkami receptorov T-buniek a aktivuje T-bunky s relatívne nízkou MHC II triednou špecifitou. Pozri prácu Herman a kol. (1991) v An. Rev. Immunol. 9: 745 - 772.
V súčasnosti sa septické podmienky, také ako je septicemia, bacteremia apod., typicky liečia antimikrobiálnymi prípravkami. Septicemia je bežná v nemocničných prostrediach, kde sa bakteriálna infekcia často objavuje po zavedení katétru alebo chirurgických zásahoch. Ničmenej, keď sú také podmienky doprevádzané šokom, neexistuje účinná terapia na zmiernenie šokových syndrómov, ktoré sú čiastočne vyvolané cytokínmi indukovanými ako odpoveď na infekciu. Pozri, napr. práce Young (1985) str. 468 - 470, v Mandel a kol. (editori) Principles and Infectious Diseases (2. vydanie) John Wiley & Sons, New York. Zvlášť liečba antibiotikami vedie k mikrobiálnej smrti a ponecháva bakteriálne produkty, ktoré spôsobujú šokovú reakciu.
Bakteriálna sepsa a s ňou súvisiaci septický šok sú častými príčinami smrti zapríčinenými infekciou, ktorá vzniká pri určitých typoch chirurgie, brušných traumatoch a potlačení imunity pri liečení rakoviny alebo transplantácii alebo za iných lekárskych podmienok.
V Spojených štátoch utrpí každý rok 700 000 pacientov septický šok zapríčinený bakteriálnymi infekciami. Z nich sa u 160 000 rozvinú symptómy septického šoku a 50 000 následkom toho zomrie. Toxický šok každoročne napadá menej ľudí, ale závažnejšia reakcia organizmu vedie k väčšiemu ohrozeniu života.
Vo svetle vážnych následkov týchto niekoľkých imunologických reakcií na infekciu, je účinná technika k liečeniu mikrobiálne vyvolaného šoku, či už profylaktický alebo terapeuticky, obzvlášť potrebná. Predkladaný vynález poskytuje prípravky a metódy na liečenie týchto a ďalších prudkých imunitných reakcií.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je použitie interleukínu-10 alebo jeho analógu, agonistu alebo antagonistu na výrobu farmaceutického prostriedku na podávanie hostiteľovi na liečenie zápalu alebo imunitnej funkcie sprostredkovávanej T-bunkami, ktoré sú sprevádzané abnormálnou hladinou nekrózového tumorového faktora alfa.
Podávaný interleukín-10 alebo jeho analóg podľa vynálezu moduluje hladiny interleukínu-1 a interleukínu-6, kde abnormálna hladina je zvýšená a je sprevádzaná mikrobiálnou infekciou, horúčkou, hypotenziou, nekrózou tkanív, metabolickou acidózou alebo dysfunkciou orgánov.
Podľa vynálezu je mikrobiálna infekcia príčinou septického šoku, toxického šoku, meningokokovej meningitídy alebo malárie a infekciou hostiteľa je bakteriálna infekcia, ktorá je vyvolaná gramnegatívnymi baktériami a kde hos titeľ má symptómy septického šoku. Bakteriálna infekcia podľa vynálezu môže byť vyvolaná aj grampozitívnymi baktériami, kde hostiteľ má symptómy toxického šoku.
Interleukín-10 podľa vynálezu sa používa na výrobu farmaceutického prostriedku na liečenie septického alebo toxického šoku hostiteľa, na liečenie porúch autoimunity hostiteľa, kde poruchy autoimunity sú sprostredkované B-bunkami alebo TNFa.
Podľa vynálezu antagonistom interleukínu-10 je molekula protilátky, ktorá je schopná viazať interleukin-10.
Podávanie interleukínu-10 podľa vynálezu moduluje najmenej jeden z TNFa, interleukínu-6 alebo interleukínu-1 a kde hostiteľom je myš, najmä NZB/W myš.
lnterleukín-10 používaný vo vynáleze je výhodne vybraný zo skupiny obsahujúcej zrelé polypeptidy otvoreného čítacieho rámca definované nasledujúcimi sekvenciami:
Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Glv
Val Arg Ala Ser Pro Giy Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser cys
Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg
Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin
Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys
Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met íle Gin Phe Tyr
Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Asp íle
Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg
Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys
Ser Lys Ala Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin
Glu Lys Gly íle Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp íle Phe íle
Asn Tyr íle Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys íle Arg Asn
a Met Glu Arg Arg Leu Val Val Thr Leu Gin Cys Leu Val Leu Leu
Tyr Leu Ala Pro Glu cys Gly Gly Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe
Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys
Thr Phe Phe Gin Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys
Glu Ser Ieu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala
Leu Ser Glu Met íle Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin
Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu
Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His
Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin íle
Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly íle Tyr Lys Ala
Met Ser Glu Phe Asp íle Phe íle Asn Tyr íle Glu Ala Tyr Met
Thr íle Lys Ala Arg
v ktorých sa používajú štandardné trojpísmenové skratky k označeniu L-aminokyselín, s počiatkom na N-konci. Tieto dve formy IL-10 sú niekedy označované ako ľudský IL-10 (alebo ľudský inhibičný faktor syntézy cytokínu) a virálny IL-10 (alebo BCRF1). Pozri práce Moore a kol. (1990) Science 248: 1230 - 1234; Vieira a kol. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 1172 - 1176; Fiorentino a kol. (1989) J. Exp. Med. 170: 2081 - 2089; a Hsu a kol. (1990) Science 250: 830 - 832. Mutácie prirodzených proteínových sekvencií, napr. alieíické varianty a muteíny vrátane variant skrátených a predĺžených, sú alternatívne prípravky, ktorých použitie je opísané v tomto dokumente.
Najvýhodnejšie je zrelý IL-10 užívaný spôsobom podľa tohto vynálezu vybraný zo skupiny pozostávajúcej zo:
Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe
Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe
Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn
Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu
Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met íle Gin Phe Tyr Leu Glu Glu
Val Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Asp íle Lys Ala His
Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu
Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala
Val Glu Gin val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly
íle Tyr Lys Ala· Met Ser Glu Phe Asp íle Phe íle Asn Tyr íle
Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys íle Arg Asn
IhrAspGlnCysAspMnPheProGlnMetLeuArgAspLeuArg a Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys thr Plte Phe Gin Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys
Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met íle Gin Phe Tyr
Leu Glu Glu val Met Pro Gin Ale Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala
Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys mr Leu Arg
Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys
Ser Lys Ala Val Glu Gin íle Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin
Glu Lys Gly íle Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp íle Phe íle
Asn Tyr íle Glu Ala Tyr Met Thr íle Lys Ala Arg.
Predkladaný vynález je čiastočne založený na objave, že IL-10 inhibuje tak syntézu niekoľkých cytokínov, ktoré sprostredkovávajú nežiaduce zápalové reakcie (napr. septický šok), ako aj aktiváciu T-buniek superantigénom, čo vedie k syndrómom toxického šoku. Naopak antagonisty IL-10 prehĺbia tieto imunitné odpovede, čo je v niektorých prípadoch klinických prostredí žiaduce, napr. pri určitých typoch tumorov alebo autoimunitných odpovedí.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1. Ilustrácia plazmidu TRPC11. [pozri príklad 3]
Obrázok 2. IL-4, hIL-10 a vIL-10 inhibujú syntézu IFNy (A) a TNFa (B) periférnymi mononukleárnymi krvnými bunkami (PBCM) aktivovanými IL-2. ND neurčené. Chybové stípčeky ukazujú rozmedzie, v ktorom sa pohybovali duplicitné vzorky pri jednom experimente. PMBC od rôznych darcov sa líši vo svojej kapacite produkovať IFNy a TNFa po stimulácii IL-2. Inhibičný vplyv IL-4 a IL-10 je narušený neutralizujúcimi protilátkami anti-lL-4 a anti-IL-10 PBMC boli kultivované tak, ako je opísané v experimentálnej časti s 200 U/ml rekombinantného IL-2 (rIL-2) a rôznymi množstvami buď rIL-4 alebo COS buniek produkujúcich ľudský IL-10 (COS-hIL-10), s prídavkom 10 pg/ml neutralizujúceho anticytokínu alebo izotypovo kontrolných imunoglobulínov.
Protilátky a cytokín boli inkubované 30 min. pred pridaním PBMC.
Obrázok 3. (A) IL-4, ale nie ľudský IL-10 (hIL-10) alebo virálny IL-10 (vIL-10) inhibuje lymfocytmi aktivovanú zabíjaciu (LAK) aktivitu vyvolanú IL-2 v PMBC. PMBC z experimentu podobného tomu na obrázku 2, boli odobrané spolu so supernatantom a testované na cytotoxicitu proti bunkám COLO (karcinóm kolonu, obr. 3A1) značených 51Cr a bunkám Daudi (Burkittov lymfom, obr. 3A2). (B) LAK aktivita je vyjadrená CD56+ bunkami v PMBC kultivovanom s IL-2 a IL-10. PMBC boli sfarbené protilátkou anti-CD56 pripojenou k FITC a delené na FacStar Plus (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Bola testovaná cytotoxická aktivita vo frakciách CD56+ a CD56- (čistota 99,7 %). Podobné výsledky boli získané s bunkami odvodenými z kultúr PMBC so samotným IL-2.
Obrázok 4. (A) Syntéza IFNy purifikovanými NK bunkami vyvolaná IL-2 je priamo inhibovaná IL-4, ale nie hlL-10 ani vIL-10. Purifikované bunky FACS (čistota 99,5 %) boli kultivované v 106 buniek/ml s 200 jednotiek/ml rIL-2 a buď s 500 jednotiek/ml rIL-4, alebo COS-hIL-10, COS-vIL-10, alebo COS-blank supematantmi (10 %) v Ysselovom médiu počas 4 až 5 dni, potom bol supernatant z duplicitných kultúr spojený a zmiešaný na meranie IFNy ELISA testom. (B) Proliferácia purifikovaných NK buniek a PMBC vyvolaná IL-2 je inhibovaná IL-4 ale nie hlL-10/vIL-lO (obr. 4B1: triedené NK, obr. 4B2: PBL).
Obrázok 5. (A) Prídavok adherentných buniek, ale nie T-buniek, obnoví inhibíciu syntézy IFNy purifikovanými NK bunkami, vyvolanej IL-2, sprostredkovanú IL-10. (B)
Prídavok purifikovaných monocytov obnoví inhibíciu syntézy IFNy purifikovanými NK bunkami, vyvolanej IL-2, sprostredkovanú IL-10. Monocyty samy produkujú menej než detegovateľné množstvo IFNy. Chybové stípčeky ukazujú rozmedzie, v ktorom sa pohybovali duplicitné vzorky pri jednom experimente. Bez prídavku IL-2 bola produkcia IFNy pod hranicou detekcie (obr. 2). NK bunky od rôznych darcov sa líšia vo svojej kapacite produkcie IFNy. (C) Vplyvy IL-10 na syntézu TNFa vyvolanú IL-2, NK bunkami, CD 14+ bunkami, oboma typmi buniek spoločne. NK bunky (106 buniek/ml) a/alebo CD14+ bunky (3 x 105 buniek/ml) boli kultivované päť dní s prídavkom alebo bez prídavku 400 U/ml rIL-2 a 10 % COS-hIL/10 supematantu.
Obrázok 6. Kinetiky produkcie IL-10, IL-6, TNFa a GM-CSF ľudskými monocytmi aktivovanými LPS. Ľudské monocyty, izolované centrifugačným vymývaním, boli kultivované v teflónových vrecúškach (4 x 106 buniek/ml) s prídavkom alebo bez prídavku LPS (1 pg/ml) a produkcia (A) IL-10, (B) IL-6, (C) TNFa alebo (D) GM-CSF bola určená v supematante kultúry, ktorý bol odoberaný v časoch určených na test ELISA špecifický na cytokíny.
Obrázok 7. Produkcia IL-10 ľudskými monocytmi ako odpoveď na zvýšenie koncentrácie LPS. Ľudské monocyty (4 x 106 buniek/ml) boli pestované v teflónových vrecúškach so zvyšujúcimi sa koncentráciami LPS počas 24 hodín a produkcia IL-10 bola stanovená testom ELISA.
Obrázok 8. Vplyv IL-10 na produkciu cytokínov monocytmi aktivovanými IFNy, LPS alebo IFNya LPS. Ľudské monocyty (4 x 106 buniek/ml) boli pestované s IFNy (100 U/ml), 1, 10, 100 alebo 1000 ng/ml LPS a zmesou LPS (1, 10, 100 alebo 1000 ng/ml) a IFNy (100 U/ml) buď bez prídavku (□) alebo s prídavkom (0) IL-10 (100 U/ml) počas 24 hodín a produkcia (A) IL-Ία, (B) IL-Ιβ, (C) IL-6, (D) TNFa alebo (E) GM-CSF bola stanovená v supernatantoch testom ELISA špecifickým na cytokíny.
Obrázok 9. Vplyv ľudského IL-10 alebo virálneho IL-10 na produkciu TNFa a GM-CSF monocyty aktivovanými LPS. Ľudské monocyty (4 x 106 bunick/ml) boli aktivované LPS (1 pg/ml) a kultivované s ľudským IL-10 (100 U/ml) alebo virálnym IL-10 bez prídavku alebo s prídavkom neutralizujúceho anti-IL-10 mAb 19F1 (10 pg/ml) počas 24 hodín a produkcia (A) TNFa alebo (B) GM-CSF bola stanovená testom ELISA špecifickým na cytokíny.
Obrázok 10. Vplyv exogénneho IL-10, endogénne produkovaného IL-10 a IL-4 na expresiu cytokín špecifickej mRNA ľudskými monocytmi aktivovanými LPS. Ľudské monocyty (4 x 106 buniek/ml) boli kultivované v médiu pri 4 °C a 37 °C alebo boli aktivované LPS (1 pg/ml) bez prídavku alebo s prídavkom IL-4 (100 U/ml), IL-10 (100 U/ml) a neutralizujúcim anti-IL-10 mAb 19F1 (10 pg/ml) a mRNA bola izolovaná po 24 hodinách. Expresia β-aktínu, IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF a G-CSF bola stanovená na reverzne prepísanej mRNA PCR analýzou s cytokín špecifickými primermi, nasledovanou Southem blotovaním reakčných produktov s vnútornou probou. cDNA získaná z klonu T-buniek CD4+ bola použitá ako kontrola expresie TNFa a GM-CSF.
Obrázok 11. Vplyv IL-10 na expresiu cytokín špecifickej mRNA ľudskými monocytmi aktivovanými LPS. mRNA bola izolovaná z ľudských monocytov (4 x 106 buniek/ml) aktivovaných LPS (1 pg/ml) bez prídavku alebo s prídavkom IL-10 (100 U/ml) po 7 hodinách a expresia IL-6, IL-8, IL-10, TNFa, GM-CSF a G-CSF bola stanovená Northern analýzami.
Obrázok 12. Vplyv exogénneho IL-10, endogénne produkovaného IL-10 a ZL-4 na expresiu IL-10 a TGFB špecifickej mRNA ľudskými monocytmi aktivovanými LPS.
Ľudské monocyty (4 x 106 buniek/ml) boli kultivované v médiu pri 4 °C a 37 °C alebo boli aktivované LPS (1 pg/ml) bez prídavku alebo s prídavkom IL-4 (100 U/ml), IL-10 (100. U/ml) a neutralizujúcim anti-IL-10 mAb 19F1 (10 pg/ml). mRNA bola izolovaná po 24 hodinách. Expresia (A) IL-10, TGFB aP-aktívu bola stanovená Northern analýzami a (B) expresia IL-10 bola stanovená na reverzne prepísanej mRNA PCR analýzou s cytokín špecifickými primermi, nasledovanou Southem blotovaním reakčných produktov s vnútornou sondou.
Obrázok 13. Vplyv endogénne produkovaného IL-10 na triedu II MHC expresie ľudskými monocytmi aktivovanými LPS. Ľudské monocyty boli kultivované s (A) 0,1 ng/ml LPS, (B) 0,1 ng/ml LPS, (C) 10 ng/ml LPS alebo (D) 1000 ng/ml LPS bez prídavku alebo s prídavkom neutralizujúceho anti-IL-10 mAb 19F1 (10 pg/ml) počas 40 hodín. Expresia HLA-DR/DP (Q5/13) bola stanovená nepriamou fluorescenciou.
Obrázok 14. Vplyv IL-10 na funkciu APC bunkovej línie makrofágov. Hore (obr. 14A). 1G18.LA alebo PU5.1 bunková línia makrofágov (106 buniek/ml) bola aktivovaná IFNy (2 ng/ml). Tieto APC boli potom premyté a inkubované (105 buniek/jamku) s bunkami HDK.l Thl (5 x 104 buniek/jamku) a antigénom (TNP-KLH, 10 pg/ml) s prídavkom (0) alebo bez prídavku () čisteného IL-10 (200 jednotiek/ml). Supematanty boli po 48 hodinách spojené a testované na IFNy. Dole (obr. 14B). 1G18.LA makrofágy boli aktivované ako v predošlom prípade a potom inkubované (105 buniek/jamku) buď s bunkami HDK. 1 Thl (5 x 104 buniek/jamku) a TNP-KLH (10 pg/ml) alebo s hybridómom T-buniek DO11.10 (5 x 104 buniek/jamku) a ovalbuminom (2,5 mg/ml) a s prídavkom (0) alebo bez prídavku () čisteného IL-10 (dole) (200 jednotiek/ml). Supematanty boli po 20 hodinách spojené a testované na IL-2. Na všetkých grafoch sú ukázané priemery a SD triplicitných kultúr.
Obrázok 15. IL-10 vyvoláva morfologické zmeny v čistených peritoneálnych makrofágoch. Peritoneálne makrofágy (Mac-l+'ta'Bht, B220-) boli purifikované na FACS a potom inkubované 72 hodín v prítomnosti IFNy (2 ng/ml) (hore, obr. 15A), alebo IFNy (2 ng/ml) a IL-10 (200 jednotiek/ml) (dole, obr. 15B). Supematanty boli odstránené, bunky sušené na vzduchu, fixované, farbené Wrighťs Gemsa, usušené a potom fotografované.
Obrázok 16. IL-10 inhibuje produkciu IL-1, TNFa a IL-6 proteínov bunkovou líniou makrofágov. Bunkové línie makrofágov lG18.LA(obr. 16A, B aC) aPU5.1 (obr. 16D, E a F) boli inkubované (106 buniek/ml) s LPS (10 pg/ml) alebo s LPS (10 pg/ml) a IFNy (2 ng/ml); s prídavkom alebo bez prídavku IL-10 alebo IL-4 (v niektorých prípadoch), oboch v množstve 200 jednotiek/ml. ako je naznačené. Supematanty boli spojené a testované na hodnotu IL-1, IL-6 alebo TNFa.
Obrázok 17 (časti A, BI, B2 a C). IL-10 inhibuje expresiu TNFa RNA bunkovou líniou makrofágov vyvolanou LPS. Bunková línia makrofágov 1G18.LA bola stimulovaná ako v predošlom prípade na obrázku 16. Po 6 hodinách boli odstránené supematanty a po odobraní buniek k preparácii RNA bol pridaný roztok guanidinium isotiokyanátu. Celkom 10 pg RNA zo vzoriek bunkovej línie 1G18.LA stimulovaných tak, ako je opísané, bolo nanesených na gél, blotovaných a potom testovaných na TNFa a aktív.
Obrázok 18. Stimulácia peritoneálnych makrofágov. IL-10 inhibuje syntézu proteínu IL-6 peritoneálnymi makrofágmi vyvolanou LPS. Peritoneálne makrofágy (Mac -l+.brighi^ 3220-) boli purifikované na FACS a inkubované samostatne alebo s LPS (10 pg/ml) s prídavkom alebo bez prídavku ÍL-10 (200 jednotiek/ml), anti-IL-10 (10 pg/ml) alebo IFNy (2ng/ml), v množstve 7 x 105 buniek/ml Supematanty boli odobrané a testované na množstvo IL-6, relatívne k známemu štandardu s použitím špecifického imunotestu (ELISA).
Obrázok 19. 1L-10 neobmedzuje rozpustné kostimulátory ani neindukuje rozpustné inhibítory z makrofágov. (A) Supematanty boli získané z bunkovej línie 1G18.LA makrofágov (106 buniek/ml) po stimulácii pomocou ΙΕΝγ počas 24 hodín a následnej stimulácii bunkami Th-1 (HDK-1, 2 x 105 buniek/ml) a antigénom (KLH, 500 pg/ml) počas hodín. Supematanty boli koncentrované a depletované z IFNy a IL-2 a potom použité pre test CSIF. Supematanty samy neobsahovali detegovatelné množstvo IFNy. 1G18.LA makrofágy APC (105 buniek/jamku) aktivované IFNy boli inkubované s bunkami HDK-1 (5 x 104 buniek/jamku) a antigénom (TNP-KLH 10 pg/ml), samy (Δ) alebo v prítomnosti rôznych dávok IL-10 a s (□) alebo bez (A) zmienených supernatantov (konečná koncentrácia
%). Supematanty z testu CSIF boli po 48 hodinách zhromaždené a testované na množstvo IFNy. Zobrazené sú priemery a SD triplicitných kultúr z jedného experimentu.
(B) Zvyšujúce sa dávky purifikovaných slezinných makrofágov s prídavkom (□) alebo bez prídavku IL-10 () (200 jednotiek/ml) alebo zmes zvyšujúcich sa dávok čistených makrofágov s B-bunkami (2,5 x 103 buniek/jamku) s prídavkom (o) alebo bez prídavku IL-10 (·) (200 jednotiek/ml): alebo B-bunky samy s prídavkom (O) alebo bez prídavku IL-10 í^2>) (200 jednotiek/ml): boli použité ako APC pre kloň HDK-1 Thl (104 buniek/jamku) s TNP-KLH (10 pg/ml). Supematanty boli po 48 hodinách zhromaždené a testované na množstvo IFNy. Zobrazené sú priemery a SD triplícitných kultúr zjedného experimentu.
Obrázok 20. IL-10 chráni myši BALB/c pred toxicitou vyvolanou SEB; Obrázok 20A: 20 pg SEB/ 30 mg d-Gal; Obrázok 20B: IL-10/20 pg SEB/ 30 mg d-Gal; Obrázok 20C: 10 pg SEB/ 30 mg d-Gal; Obrázok 20D: IL-10/10 pg SEB/ 30 mg d-Gal: Obrázok 20E: 30 mg galaktozamínu: Obrázok 20F: 10 pg IL-10.
Obrázok 21. IL-10 chráni myši pred smrteľnou endotoxémiou. Skupinám 20 BALB/c myší bolo každej injikovaných intraperitoneálne (i. p.) buď 350 pg LPS alebo 350 pg LPS s rôznymi konkurujúcimi množstvami čisteného rekombinantného myšacieho IL-10. Úmrtia boli monitorované počas nasledujúcich 6 dní.
Obrázok 22. Protilátky anti-IL-10 neutralizujú schopnosť IL-10 chrániť myši pred smrteľnou endotoxémiou. Skupiny 20 BALB/c myší dostali každá 1 mg protilátky 2A5 anti-IL-10 (obrázok 22A) alebo 1 mg izotypovej kontrolnej protilátky GL113 (obrázok 22B) intraperitoneálne jednu hodinu pred podaním LPS. Myšiam potom bolo injikovaných 350 pg LPS i. p. buď samostatne alebo s rôznymi konkurujúcimi množstvami IL-10, ako je opísané v legende k obrázku 21.
Obrázok 23. IL-10 chráni myši pred smrteľnou endotoxémiou, keď je pridaný 30 minút po injikovaní LPS. Skupiny 20 BALB/c myší dostali 350 pg LPS i. p. v čase 0 a 1,0 pg rekombinantného IL-10 i. p. v časoch 0, 0,5 hodiny, 1 hodina, 2 hodiny alebo 5 hodín po injekcii LPS. Kontrolné myši, ktoré obdržali 350 pg LPS i. p. bez prídavku IL-10 pri tomto experimente všetky zomreli.
Obrázok 24. Imunofluorescenčné analýzy povrchovej expresie IgM a IgD úplne živými purifikovanými peritoneálnymi bunkami získanými z myší kontrolných a z myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10. BALB/c myšiam bola od narodenia až do 8 týždňov injikovaná protilátka SXC-1 anti-IL-10 (obrázok 24D), izotypová kontrolná protilátka (obrázok 24B), fosfátom pufrovaný salín (PBS) (obrázok 24C) alebo nič (obrázok 24A), ako je opísané v experimentálnej časti. Výsledky ukazujú fluorescenčné intenzity 5000 živých buniek počítaných z každej experimentálnej skupiny.
Obrázok 25. Hodnoty sérového IgM kontrolných myši a myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 stanovené po 8 týždňoch pôsobenia. Výsledky ukazujú geometrický priemer ± SEM u piatich jednotlivých sér v každej skupine a obsahujú údaje z dvoch rôznych experimentov. Tri ďalšie experimenty poskytli rovnaké výsledky.
Obrázok 26. In vivo protilátková reakcia kontrolných myší a myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 na al, 3-dextran (obrázok 26B) alebo fosforylcholín (obrázok 26A). BALB/c myšiam bola od narodenia až do 9 týždňov injikovaná protilátka SXC-1 anti-IL-10, izotypová kontrolná protilátka J5/D, PBS alebo nič. V 8 týždni boli myši stimulované al, 3-dextranom alebo tepelne zabitým Streptococcus pneumoniae ako zdrojom fosforylcholínu tak, ako je opísané v experimentálnej časti. Výsledky ukazujú geometrický priemer ± SEM hodnôt špecifických protilátok stanovených u piatich jednotlivých sér.
Obrázok 27. Imunofluorescenčné analýzy povrchovej expresie B220 a CD3 živými slezinnými lymfatickými bunkami získanými z myší kontrolných a z myší podrobených pôsobeniu SXC-1 anti-IL-10. Ďalšie detaily pozri legendu k obrázku 24 - časti A - D obrázku 27 zodpovedajú príslušným častiam A - D obrázku 24.
Obrázok 28. In vivo reakcia kontrolných myší alebo myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 na TNP-KLH. Myšiam bola od narodenia až do 9 týždňov injikovaná protilátka anti-IL-10 (·) alebo izotypová kontrola (o). V 8 týždni boli zvieratá stimulované intraperitoneálne 10 pg TNP-KLH. Sérové hodnoty TNP-špecifického IgM (obrázok 28A) a IgC (obrázok 28B) boli stanovené po 7 a 14 dňoch po imunizácii. Výsledky ukazujú tri rôzne experimenty, kde každý krúžok predstavuje jednu myš.
Obrázok 29. Protilátky anti-IL-10 nie sú priamo cytotoxické pre peritoneálne čistené B-bunky. 8 týždňov starým BALB/c myšiam bol intraperitoneálne injikovaný 1 mg protilátky anti-IL-10 (SXC.l - obrázok 29 časti A, B a C) alebo 1 mg izotypovej kontroly (J5/D - obrázok 29 časti D, E a F). Peritoneálne purifikované bunky boli získané z rôznych zvierat 1, 2 alebo 3 dni neskôr a analyzované na expresiu povrchového IgD a IgM. Výsledky ukazujú fluorescenčné intenzity 5000 živých buniek počítaných z každej experimentálnej skupiny.
Obrázok 30. Sérové hodnoty IFNy u kontrolných myší a myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10. BALB/c myšiam bola od narodenia až do 8 týždňov injikovaná protilátka anti-IL-10 (·) alebo izotypová kontrola (o). Séra získané v 8 týždňoch boli analyzované na obsah IFNy pomocou imunotestu. Výsledky ukazujú päť rôznych experimentov kde každý krúžok predstavuje jednu myš.
Obrázok 31. Dodanie protilátok IFNy znižuje schopnosť anti-IL-10 pôsobiť depleciu myšacích peritoneálnych buniek. Na BALB/c myši sa od narodenia až do 8 týždňov pôsobilo protilátkami anti-IL-10 (obrázok 31 C) a anti-IFNy (obrázok 31 B) alebo ničím (obrázok 31 A). Peritoneálne premyté bunky potom boli analyzované na koexpresiu B220 a IgM. Výsledky ukazujú fluorescenčné intenzity 5000 živých buniek počítaných z každej experimentálnej skupiny.
Obrázok 32. Sérové hodnoty TNFa u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 po 8 týždňoch. Na myši sa pôsobilo od narodenia až do 8 týždňov protilátkou SXC.l anti-lL-10 (·), alebo izotypovou kontrolnou protilátkou (o), ako je opísané v experimentálnej sekcii. Séra získané v 8 týždňoch boli analyzované na obsah TNFa pomocou testu ELISA. Výsledky ukazujú päť rôznych experimentov, kde každý krúžok predstavuje jednu myš.
Obrázok 33. Sérové hodnoty IL-6 u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10. Séra získané od myší, na ktoré sa pôsobilo od narodenia až do 8 týždňov protilátkou SXC.l anti-IL-10 (·), alebo izotypovou kontrolnou protilátkou (o) boli testované na obsah IL-6 pomocou testu ELISA. Výsledky ukazujú päť rôznych experimentov, kde každý krúžok predstavuje jednu myš.
Obrázok 34. Myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 majú zvýšenú náchylnosť k úmrtiu následkom šoku vyvolaného LPS (500 pg LPS na obrázku 34A, 400 pg LPS na obrázku 34B, 100 pg LPS na obrázku 34C, 50 pg LPS na obrázku 34D, 10 pg LPS na obrázku 34E a I pg LPS na obrázku 34F). Na myši sa pôsobilo od narodenia až do 8 týždňov veku SXC.l potkaniou IgM anti-IL-10 protilátkou (·), 2A5 potkaniou IgGl anti-IL-10 protilátkou (A) alebo vhodnými izotypovými kontrolnými protilátkami (o) (Δ). Po 8 týždňoch boli myšiam (5 myší/skupina) intraperitoneálne injikované rôzne dávky LPS. Úmrtia boli monitorované počas nasledujúcich 4 dní.
Obrázok 35. Sérové hodnoty izotypov imunoglobulínu u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10. Na myši sa pôsobilo od narodenia až do 8 týždňov veku protilátkami SXC.l alebo 2A5 anti-IL-10 potkaniou, vhodnými izotypovými kontrolnými protilátkami, alebo PBS. Séra získané v 8 týždňoch boli analyzované na celkový obsah myšacieho IgGl (obrázok 35A), IgG2a (obrázok 35C), IgG2b (obrázok 35E), IgG3 (obrázok 35B), IgE (obrázok 35D) alebo IgA (obrázok 35F) s použitím testov ELISA špecifických na izotypové imunoglobulíny. Výsledky ukazujú štyri nezávislé experimenty a pri každej analýze izotypových imunoglobulinoV. Dáta sú pri každom experimente zobrazené ako geometrický priemer ± SEM množstva imunoglobulínu stanoveného v piatich individuálnych sérach.
Obrázok 36. Deplecia B buniek Lyl u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 je transientná. Na myši sa pôsobilo od narodenia až do 8 týždňov veku protilátkou SXC.l anti-IL-10 a potom bolo pôsobenie prerušené. Peritoneálne premyté bunky boli zhromaždené z rôznych skupín takých myší (3 myši/skupina) behom 8 týždňov (obrázok 36A a D), 12 týždňov (obrázok 36B a E) a 16 týždňov (obrázok 36C a D). Výsledky ukazujú imunofluorescenčné analýzy expresie povrchového IgM a povrchového B220 úplne živými premytými peritoneálnymi bunkami, počítaných 5000 živých buniek z každej experimentálnej skupiny.
Obrázok 37. Imunofluorescenčné analýzy expresie povrchového Lyl a povrchového IgM živými premytými peritoneálnymi lymfoidnými bunkami získanými z myší, na ktoré sa pôsobilo SXC.l anti-IL-10 (obrázok 37D) alebo kontrolných myší (na ktoré sa pôsobilo J5/D izotypovou kontrolnou protilátkou na obrázku 37C, fosfátom pufrovaným salínom na obrázku 37B alebo ničím na obrázku 37A). Výsledky ukazujú fluorescenčné intenzity 5000 živých buniek počítaných z každej experimentálnej skupiny.
Obrázok 38. Imunofluorescenčné analýzy expresie povrchového Mac-l+,brieht a povrchového IgM úplne živými premytými peritoneálnymi bunkami získanými zmyší, na ktoré sa pôsobilo SXC.l anti-IL-10 alebo kontrolných myší (rovnaké ako na obrázku 37). Výsledky ukazujú fluorescenčné intenzity 5000 živých buniek počítaných z každej experimentálnej skupiny.
Obrázok 39. In vivo protilátková reakcia kontrolných myší alebo myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 na TNP-Ficoll. Myšiam bola od narodenia až do 8 týždňov in jikovaná protilátka SXC.l anti-IL-10 (o) alebo izotypová kontrola (·). V 8 týždňoch boli zvieratá stimulované intraperitoneálne 10 pg TNP-Ficoll. Sérové hodnoty TNP špecifického IgM boli stanovené po 5 a IgG po 10 dňoch pomocou testu ELISA. Každý krúžok predstavuje jednu myš.
Obrázok 40. Pôsobenie protilátky anti-IL-10 oneskorí začiatok autoimunitnej reakcie u myší NZB/W. Skupinám 20 samíc myší NZB/WF1 bola injikovaná trikrát týždenne od narodenia počas celej štúdie buď protilátka SXC. 1 potkaní IgM anti-myšací IL-10 (·) alebo kontrolná izotypová protilátka označená J5/D (o). Počas nasledujúcich 42 týždňov sa sledovalo prežitie zvierat.
Obrázok 41. Rozvoj proteinurie (> 3 +) u samíc myší NZBAV, na ktoré sa pôsobilo protilátkami anti-IL-10. Skupinám 22 samíc myší NZB/WF1 bola injikovaná trikrát týždenne od narodenia počas celej štúdie buď protilátka SXC.l anti-IL-10 (·) alebo kontrolná izotypová protilátka (o). Rozvoj ľadvinovej choroby bol určený meraním proteinurie s použitím testovacích prúžkov Albustix od 12. týždňa do 42. týždňa. Údaje ukazujú podiel myší s viac než 300 mg proteínu/dl moču.
Obrázok 42. Histologický test ľadvín NZB/W myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10. Obrázok 42A ukazuje kontrolnú NZB/W ľadvinu (PAS farbenie): objavilo sa niekoľko glomerulonephritis s homogénnym rozložením imunitných a proteínových komplexov v tubulách. Obrázok 42B ukazuje NZB/WF1 ľadvinu, na ktorú sa pôsobilo antiIL-10 (PAS farbenie).
Obrázok 43. Autoprotilátková produkcia u NZB/W myší, na ktoré sa pôsobilo anti-IL-10. Samiciam myší NZB/W bola injikovaná protilátka SXC.l anti-IL-10 (·) alebo kontrolná izotypová protilátka (o) každé tri dni od narodenia počas celej štúdie. V sérach odobraných v 5 alebo 6 mesiacoch bol stanovený obsah IgG protilátok viažucich dvojšrubovicovú DNA pomocou testu ELISA. Každý krúžok predstavuje jednu myš.
Obrázok 44. Hodnoty sérového TNFa u NZB/WF1 myší, na ktoré sa pôsobilo. anti-IL-10. Samiciam myší NZB/W bola injikovaná protilátka SXC.l anti-IL-10 (·) alebo kontrolná izotypová protilátka (o) každé tri dni od narodenia počas celej štúdie. V sérach odobraných v 5, 7 alebo 8 mesiacoch bol stanovený obsah TNFa pomocou cytokín špecifického testu ELISA. Každý krúžok predstavuje jednu myš.
Obrázok 45. Anti-TNFa protilátky rušia ochranu NZB/WF1 myší vyvolanú anti-IL-10. Skupinám 36 a 18 samíc myší NZB/W bola injikovaná dvakrát týždenne protilátka 2A5 anti-IL-10 () (Á) alebo kontrolná izotypová protilátka označená GL113 (O) od narodenia počas celého experimentu. Polovica zvierat, ktorým bola injikovaná protilátka anti-IL-10, navyše obdržala dvakrát týždenne protilátku XT22 anti-TNFa od 30 týždňov po narodení (Ä). Počas nasledujúcich 34 týždňov sa sledovalo prežitie zvierat.
Podrobný opis vynálezu
Predkladaný vynález je zameraný na metódy použitia IL-10 alebo jeho analógov alebo antagonistov k ovplyvneniu imunitnej funkcie, hlavne k prevencii a/alebo obmedzeniu škodlivých vplyvov mikrobiálne vyvolaných šokov alebo ku kontrole diferenciácie a vývoja B-buniek. Vynález tiež zahrnuje farmaceutické prípravky obsahujúce IL-10 alebo jeho analógy alebo antagonistov určené k vykonaniu týchto metód. IL-10 používaný v tomto vynáleze je prednostne vybraný zo skupiny maturovaných polypeptidov kódovaných otvorenými čítacími rámcami definovanými cDNA vloženou z pHSC, pH15C a pBCRFl (SRa), ktoré sú uložené v Americkej zbierke typových kultúr (ATCC), Rockville, Maryland, pod prístupovými číslami 68191, 68192 a 68193.
IL-10 inhibuje syntézu TNFa a IFNy monocytmi alebo monocytmi s prirodzenými zabíjačmi (NK), ale nie ibaNK bunkami. IL-4 inhibuje vylučovanie cytokínu z NK buniek aktivovaných IL-2 priamo. To svedčí o tom, že IL-4 a IL-10 pôsobia na NK bunky rôznymi cestami, napr. pôsobenie IL-10 vyžaduje participáciu monocytov. IL-10 inhibuje vylučovanie cytokínu z NK buniek aktivovaných IL-2, ale nie LAK aktivitu, čo svedčí o tom, že syntéza cytokínu vyvolaná IL-2 a aktivita zabíjačov aktivovaných lymfocytmi (LAK) sú regulované rozdielnym mechanizmom.
IL-10 má protizápalovú aktivitu, zrejme mechanizmom svojej schopnosti inhibovať produkciu prozápalových cytokinov monocytmi a/alebo aktivovanými makrofágmi alebo NK bunkami. Táto inhibícia produkcie cytokínu sa vyskytuje na úrovni transkripcie.
Pri IL-10 bolo v tomto dokumente tiež preukázané, že ovplyvňuje reakcie vyvolané superantigénom, napr. T bunkami sprostredkovanú reakciu vo zvieratách. Stafylokokálny enterotoxín B (SEB) môže vyvolať prudkú šokovú reakciu a štúdie na myšiach ukázali jeho schopnosti i in vivo. Súčasné podanie IL-10 alebo dokonca i neskoršie než vystavenie superantigénu, je účinné v zabránení úmrtnosti po vystavení veľkej dávke SEB.
Gramnegatívny bakteriálny lipopolysacharid (LPS) vyvoláva reakciu septického šoku u cicavcov Táto endotoxínom vyvolaná septická šoková reakcia je dôsledkom uvoľnenia TNFa, IL-1 a/alebo IL-6 zo stimulovaných makrofágov/monocytov, ako je opísané. Ničmenej dodanie IL-10 potlačuje vyvolanú expresiu IL-la, IL-1, IL-6, IL-8 a GM-CSF. Dáta preukazujú skutočnosť, že IL-10 je schopný chrániť myši pred šokom vyvolaným endotoxínom, dokonca i pri dodaní po LPS. Naopak, protilátky anti-IL-10 môžu blokovať ochranný efekt. Ďalšie štúdie ukazujú, že myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 tiež majú zásadne zvýšené hodnoty faktora nekrózy tumoru-α (TNFa) a IL-6 a hlbokú náchylnosť k šoku vyvolanému endotoxínom (napr. LPS).
Protilátky anti-IL-10 majú tiež použitie v liečbe pri iných imunologických stavoch. Údaje ukazujú, že pri dlhotrvajúcom podávaní protilátky anti-IL-10 mladým myšiam môže dôjsť k deplecii podtriedy B buniek Ly-1. To preukazuje účasť IL-10 v regulácii vývoja B buniek Ly-1 a zaisťuje prostriedky k deplecii B buniek Ly-1. Toto pozorovanie viedlo k porozumeniu pri liečení autoimúnnych stavov.
Rozvoj autoimúnnej odpovede vyžaduje komplexnú interakciu s T bunkami. Kmeň myší NZB/W je lupus (systematicky lupus erythematosus, SLE) a poskytuje model na testovanie terapeutických prípravkov na liečenie autoimúnnych stavov. Okrem toho tieto myši majú neobvyklý podiel Ly-1 B buniek v porovnaní s ostatnými typmi B buniek. K experimentom na myšiach in vivo bol použitý kmeň NZB/W.
Pôsobenie anti-ILI 0 na tieto myši podstatne oneskorí začiatok autoimunitnej odpovede, ako bolo preukázané stanovením celkového prežitia, rozvojom proteinaie, zápalu ľadvín alebo protilátkovými titráciami Tieto výsledky ukazujú, že liečenie anti-ILlO je použiteľné i pri liečení iných cicavcov, napr. ľudí.
Na produkciu polypeptidov používaných v metódach podľa tohto vynálezu možno použiť veľké množstvo jedno či mnohobunkových expresných systémov (t. j. kombinácia hostiteľských expresných vektorov). Typy hostiteľských buniek zahrnujú baktérie, kvasnice, hmyz, cicavce, apod. (ale nie sú týmto vymedzené). Na vyberanie a/alebo modi fikáciu špecifických expresných systémov je dostupných mnoho prehľadných článkov. Pozri napr. práce de Boer a Shepard „Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli“, strany 205 - 274, v Kroon (editor) Genes: Structure and Expression (John Wiley & Sons, New York, 1983), kde je zhrnutých niekoľko E. coli expresných systémov; Kucherlapati a kol., Critical Reviews in Biochemistry, Vol. 16, číslo 4, strany 349 - 379 (1984) a Baneiji a kol., Genetic Engineering, Vol. 5, Strany 19-31 (1983), kde sú zhrnuté metódy transfekcie a transformácie buniek cicavcov; Reznikoff a Gold (editori), Maximízing Gene Expression (Butterworths, Boston, 1986), kde sú zhrnuté vybrané témy génovej expresie v E. coli, kvasniciach, a bunkách cicavcov: a Thilly, Mammalian Celí Technology (Butterworths, Boston, 1986), kde sú zhrnuté cicavčie expresné systémy. Všetky tieto práce sú tu uvedené ako referencie. Podobne je mnoho prehľadných článkov, ktoré opisujú techniky a podmienky na spojovanie a/alebo manipulovanie s cDNA a sekvenciami kontrolujúcimi expresiu na tvorbu a/alebo modifikáciu expresných vektorov vhodných na použitie v predkladanom vynáleze, napr. práce Maniatis a kol. (1982) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; a Ausubel a kol. (1987 a periodické dodatky) Current Protocols in Molecular Biologv. Wiley and Sons, New York, ktoré sú tu všetky uvedené ako referencie.
E. coli expresný systém je opísaný Riggsom v U.S. patente 4,431,739, ktorý je tu uvedený ako referencia. Hlavný prokaryotný promotor, ktorý' je použiteľný na zvýšenú expresiu v E. coli je tac promotor opísaný de Boerom v U.S. patente 4,551,433, ktorý je tu uvedený ako referencia. Sekrečné expresné vektory sú tiež dostupné pre hostiteľa E. coli. Hlavne použiteľné sú pIN-lII-ompA vektory, opísané Ghrayebom a kol. v EMBO J., Vol. 3, strany 2437 - 2442 (1984), pri ktorých je transkribovaná cDNA pripojená k časti génu E. coli OmpA, ktorý kóduje signálny peptid z ompA proteínu, ktorý naopak spôsobuje maturáciu proteínu, ktorý je potom vylučovaný do periplazmového priestoru baktérie. U.S. patenty 4,336,336 a 4,338,397 tiež opisujú sekrečné expresné vektory pre prokaryoty. Tieto patenty sú tu uvedené ako referencie. Početné kmene baktérií sú vhodnými hostiteľmi pre prokaryotné expresné vektory vrátane kmeňov E. coli, ako sú W3110 (ATCC č. 27325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB101, X1776 (ATCC č. 31244), X2282, RR1 (ATCC č. 31343), MRCI; kmeňov Bacillus Subtilus; a ďalších enterobaktérii, ako sú Salmonella typhimurium alebo Serratia marcescens a rôzne druhy Pseudomonas. Všeobecné metódy na odvodzovanie bakteriálnych kmeňov, ako sú E. coli K12 X1776, ktoré možno použiť pri expresii eukaryotných proteínov sú opísané Curtisom III v U.S. patente 4,190, 495. Tento patent je tu tiež uvedený ako reľerencia. Okrem prokaryotných a eukaryotných mikroorganizmov možno použiť na produkciu proteínov z tohto vynálezu tiež expresné systémy obsahujúce bunky odvodené z mnohobunkových organizmov. Veľký záujem je o expresné systémy cicavcov, pretože ich posttranslačný aparát má väčšiu pravdepodobnosť produkovať biologicky aktívne cicavčie proteiny. Ako vektory pre cicavčích hostiteľov bolo použitých niekoľko DNA rakovinových vírov. Zvlášť dôležité sú početné vektory, ktoré obsahujú SV40 replikáciu, transkripciu a/alebo transláciu kontrolujúce sekvencie pripojené k sekvenciám kontrolujúcim bakteriálnu replikáciu, napr. pcD vektory vyvinuté Okayamom a Bergom opísané v Mol. Celí. Biol., Vol. 2, strany 161 - 170 (1982) a Mol. Celí. Biol., Vol. 3, strany 280 - 289 (1983) a vylepšené Takebom a kol., Mol. Celí. Biol., Vol. 8, strany 466 - 472 (1988). Tieto práce sú tu u vedené ako referencie. Iné cicavčie expresné vektory založené na SV-40 boli opísané Kaufmanom a Sharpom v Mol. Celí. Biol., Vol. 2, strany 1304 - 1319 (1982) a Clarkom a kol. v U.S. patente 4, 675,285. Obe práce sú tu uvedené ako referencie.
Preferovaný hostitelia pre zmienené vektory sú opičie bunky. Také vektory obsahujúce SV40 ori sekvencie a intaktný A gén sa môžu replikovať autonómne v opičích bunkách (dajú vyššie množstvo kópií a/alebo stabilnejšie množstvo kópií než neautonómne sa replikujúce plazmidy). Navyše vektory obsahujúce SV40 ori sekvencie bez intaktného A génu sa môžu autonómne replikovať do vysokého množstva kópií (ale nestabilných) v opičích bunkách COS7, opísaných Gluzmanom, Celí, Vol. 23, strany 175 - 182 (1981) a dostupných z ATCC (prístupové číslo CRL 1651). Zmienené vektory založené na SV-40 sú tiež schopné premeny iných buniek cicavcov, ako sú myšacie bunky, integráciou do bunkovej DNA hostiteľa.
Mnohobunkové organizmy môžu tiež slúžiť ako hostitelia pre tvorbu polypeptidov z tohto vynálezu, napr. hmyzie larvy, Maeda a kol., Náture, Vol. 315, strany 592 - 594 (1985) a Ann. Rev. Entomol., strany 351 - 372 (1989); a transgénne zvieratá, Jaenisch, Science, Vol. 240, strany 1468 - 1474 (1988). Tieto práce rovnako ako i iné sú tu uvedené ako referencie.
1. Testy na Interleukín 10 a analógy
Proteiny a polypeptidy vzťahujúce sa k IL-10 označované spoločne ako IL-10, majú niekoľko biologických aktivít, ktoré môžu tvoriť základ testov. Zvlášť majú IL-10 schopnosť inhibície syntézy prinajmenšom jedného cytokínu zo skupiny pozostávajúcej z ΙΡΝγ, lymfotoxínu, IL-2, IL-3 a GM-CSF v populácii T pomocných buniek, pri ktorých je syntéza jedného alebo viacerých z týchto cytokínov vyvolaná vystavením vplyvu buniek produkujúcich syngeneieký antigén (APC) a antigén. Pri tejto aktivite sa na APC pôsobí tak, že nie sú schopné replikácie, ale ich aparát upravujúci antigén zostáva funkčný. Toho sa vhodne dosiahne vystavením APC žiareniu, napr. 1500 - 3000 R (gama alebo X-lúče ) pred zmiešaním s T bunkami. Pozri tiež tabuľku 2 testu na myšací IL-10.
Tabuľka 2
IL-10 (CSIF) test - upravený na proliferačný test
Antigén produkujúce bunky (APC)
L BALB/c sleziny (asi 108 buniek/slezina) umiestniť do skúmavky s cRPMI.
2. Vyrobiť suspenziu jednotlivých buniek s použitím cedníka a 10 ml striekačky (použitie sterilnej techniky), odstrediť pri 1200 ot./min.
3. Resuspendovaa palety v 5 ml studeného NH4C1 (0,83 % vo vode. Opäť odstrediť pri 1200 ot./min.
4. Resuspendovat palety v 5 ml cRPMI (bez IL-2 pre test) a odstrediť do premytia.
5. Resuspendovať palety v 5 ml cRPMI a spočítať.
6. Ožiariť 3000 rad. (počas 20 minút).
7. Upraviť koncentráciu buniek na 8xl06/ml. (pri teste sa bude pridávať 50 ml na jamku, čo dá konečnú koncentráciu 4 x 106/jamka) (Titrovať IL-10 buď 100 ml konečného objemu na mikrotitračnej doske alebo 50 ml konečného objemu pokiaľ si prajete pridať protilátku anti-IL-10).
Bunky Thl
L Tri dni pred testom vložiť ampulu buniek HKD1 priamo do 2 x 25 ml cRPMI obsahujúceho IL-2.
2. Skontrolovať bunky deň potom a pokiaľ je potreba rozdeliť 1 : 2 alebo 1:3.
3. V deň testu odstrediť bunky pri 1200 ot./min. tesne pred nanesením na dosku, resuspendovať v 5 ml cRPMI a spočítať (zriediť 1 : 2 trypanovou modrou).
4. Znovu nastaviť koncentráciu na 2 x 105 na ml a pridať 50 ml na jamku (nakoniec 104 buniek na jamku). Pred nanesením na dosku pridať KLH tak, aby jeho výsledná koncentrácia bola 400 mg/ml. (Tak vznikne konečná koncentrácia 100 mg/ml).
Kontroly ml buniek Thl bez KLH.
ml buniek Thl s KLH.
ml APC zo sleziny.
s prídavkom a bez prídavku IL-10 (najvyššia koncentrácia je pravdepodobne v poriadku).
zriediť na konečný objem 200 ml.
Poradie testu
1. Pripraviť APC.
2. Naniesť na dosku IL-10.
3. Pripraviť bunky Thl a naniesť na dosku.
4. Naniesť na dosku APC.
Po 48 hodinách odstrániť 100 ml supematantu pre IFNy ELISA test; potom pridať 3H-thymidín (1 mCi na jamku) a odobrať ďalšie ráno.
Alternatívne môže byť inhibícia cytokínu stanovená v primárnej alebo, výhodne, v sekundárnej zmiešanej lymfocytovej reakcii (MLR), kde nie je potreba použiť syngencické APC. MLR sú v tejto problematike dobre známe, pozri, napr. práce Bradley, strany 162 - 166, v Mishell a kol. (editori) Selected Methods in Cellular Immunology (Freeman, San Francisco, 1980); a Battisto a kol., Meth. in Enzymol., Vol. 150, strany 83 - 91 (1987), ktoré sú tu uvedené ako referencie. Stručne, dve populácie allogenických lymfatických buniek sa zmiešajú, jedna z populácií je vopred vybavená proti proliferácii, napr. ožiarením. Výhodne je populácia buniek pripravovaná v koncentrácii asi 2 x 106 buniek/ml v doplnenom médiu, napr. RPMI 1640 s 10 % teľacieho fetálneho séra. Pri kontrolnej i testovanej kultúre sa pre test zmieša 0,5 ml každej populácie. Pri sekundárnej MLR sú bunky zostávajúce po T dňoch v primárnej MLR restimulované čerstvo pripravenými, ožiarenými stimulačnými bunkami. Vzorka, pri ktorej sa očakáva obsah IL-10 sa môže pridať k testovaným kultúram v momente zmiešania a kontrolná i testovaná kultúra môžu byť testované na produkciu cytokínu 1 až 3 dni po zmiešaní.
Na získanie T-buniek a/alebo APC populácií pre IL-10 testy sa používajú postupy v tejto problematike dobre známe, ktoré sú plne opísané napr. v DiSabato a kol. (editori), Meth. in Enzymol., Vol. 108 (1984), ktorá je tu uvedená ako referencia. APC pre preferovaný IL-10 test sú periférne krvné monocyty alebo tkanivo makrofágov. Tie sú získavané použitím štandardných techník, napr. ako opisuje Boyum, Meth. in Enzymol., Vol. 108, strany 88 - 102 (1984); Mage, Meth. in Enzymol., Vol. 108, strany 118 - 132 (1984); Litvin. a kol., Meth. in Enzymol., Vol. 108, strany 298 - 302 (1984): Stevenson, Meth. in Enzymol., Vol. 108, strany 242 - 249 (1989) a Romain a kol., Meth. in Enzymol., Vol. 108, strany 88 - 102 (1984). Tieto práce sú tu uvedené ako referencie. Výhodne sú pri IL-10 testoch používané T pomocné bunky, ktoré sú získané najprv separáciou lymfocytov z krvi, slezín alebo lymfatických uzlín a potom oddelením, napr. prúdovou cytometriou, pomocných buniek použitím komerčne dostupnej protilátky anti-CD4, napr. 0KT4 opísanou v U. S. patente 4,381,295 a dostupnou od Ortho Pharmaceutical Corporation. Myšacia anti-CD4 je dostupná od Becton-Dickinson alebo Pharmigen. Používané techniky sú plne opísané v prácach Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest., Vol. 21 (Dodatok 97), strana 77 (1968); Meth. in Enzymol., Vol. 108 (citované skôr) a v Bram a kol., Meth. in Enzymol., Vol. 121, strany 737 - 748 (1986). Všetky tieto práce sú tu uvedené ako referencie. Všeobecne PBL sú získavané z čerstvej krvi centrifiigáciou v hustotnom gradiente podľa Ficoll-Hipaque.
Pri testoch možno použiť množstvo antigénov, napr. prílipkový (keyhole limpet) hemocyanín (KLH), hydinový γ-globulín a podobne. Najvýhodnejšie sú T pomocné bunky stimulované pri teste monoklonálnou protilátkou anti-CD3, napr. OKT3 opísanou v U.S. patente 4,361,549.
Koncentrácie cytokínu v kontrole a testovaných vzorkách sú merané štandardnými biologickými a/alebo imunochemickými testami. Postup imunochemických testov na špecifické cytokíny je v tejto problematike dobre známy, pokiaľ je dostupný čistený cytokín. Pozri, napr. práce Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Tijssen, Practice and Theory of Enzýme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985) a U.S. patent 4,486,534, ktoré sú tu uvedené ako referencie a sú príkladmi rozsiahlej literatúry o tejto téme. Testy ELISA na ľudský IL-2, ľudský IL-3 a ľudský GM-CSF sú komerčne dostupné od Genzyme Corporation (Boston, MA): a test ELISA na ľudský IFNy je komerčne dostupný od Endogen Inc. (Boston, MA). Polyklonálne protilátky špecifické na ľudský lymfotoxín sú dostupné od Genzyme Corporation a je možné ich použiť pre rádioimunotest na ľudský lymfotoxín, napr. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques (Elsevier, Amsterdam, 1982).
Biologické testy cytokínov zmienených skôr možno tiež použiť na určenie aktivity IL-10. Biologický test na ľudský lymfotoxín je opísaný v prácach Aggarwal, Meth. in Enzymol., Vol. 116, strany 441 - 447 (1985) a Matthews a kol., strany 221 - 225 v Clemens a kol. (editori), Lymphokines and Interferons: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1987). Obe práce sú tu uvedené ako referencie. Ľudský IL-2 a GM-CSF možno testovať faktor dependentnými bunkovými líniami CTLL-2 a KG-1, dostupných z ATCC pod prístupovými číslami TIB 214 a CCL 246. Ľudský IL-3 možno testovať pomocou jeho schopnosti stimulovať tvorbu širokého rozsahu hematopoietických bunkových kolónií v agarových kultúrach, napr. ako je opísané Metcalfom, The Hematopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, Amsterdam, 1984). IFNy možno stanoviť antivirálnymi testami, napr. Meager, strany 129 - 147 v Clemens a kol. (editori) (citované skôr). Myšacie ekvivalenty môžu byť podobne testované vhodnými bunkovými líniami.
Produkciu cytokínu možno tiež určiť analýzou mRNA. Cytokínové mRNA možno merať cytoplazmickou bodovou hybridizáciou ako opisuje White a kol., J. Biol. Chem., Vol. 257, strany 8569 - 8572 (1982) a Gillespie a kol. U.S. patent 4,483,920. Tieto práce sú v tomto dokumente citované. Iné prístupy zahrnujú bodové blotovanie s použitím purifikovanej RNA, napr. kapitola 6 v Hames a kol. (editori), Nucleic Acid Hybridization A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1985). Možno použiť i techniku polymerázovej reťazovej reakcie, pozri prácu Innis a kol. (editori), (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., New York. Zmienené práce sú tu uvedené ako referencie.
V niektorých prípadoch sa vzorky, v ktorých sa stanovuje IL-10, musia vopred ošetriť, aby sa odstránili predur čené cytokíny, ktoré môžu rušiť test. Napríklad IL-2 zvyšuje produkciu IFNy pri niektorých bunkách. Z toho dôvodu, v závislosti od typu T pomocných buniek použitých v teste by mal byť IL-2 odstránený z testovanej vzorky. Toto odstránenie sa výhodne vykonáva preliatím vzorky cez štandardnú anticytokín afinitnú kolónu.
Z dôvodu pohodlia sú jednotky aktivity IL-10 definované schopnosťou IL-10 zvyšovať proliferáciu buniek MC/9 vyvolanou 1L-4, ktoré sú opísané v U.S. patente 4,559,310 a dostupné z ATCC pod prístupovým číslom CRL 8306. Jedna jednotka/ml je definovaná ako koncentrácia IL-10, ktorá dá 50 % maxima stimulácie proliferácie MC/9 nad hodnotu IL-4 v nasledujúcom teste. Duplicitné alebo triplicitné zriedenie IL-4 a IL-10 sú pripravované v 50 ml média na jamku na štandardnej mikrotitračnej doske. Médium obsahuje RPMI 1640, 10 % teľacieho fetálneho séra, 50 ml 2-merkaptoetanolu, 2mM glutamínu, penicilín (100 U/L) a streptomycín (100 mg/L). Pridá sa IL-4, 25 pg/jamku z 1600 U/ml (nakoniec 400 U/ml) rozpustený v médiu a inkubuje cez noc, napr. 20 - 24 hodín. 3H-thymidín (napr. 50 mCi/ml v médiu) se pridá v množstve 0,5 - 1,0 mCi/jamku a bunky sa opäť inkubujú cez noc, po ktorej sú bunky odobrané a meria sa vnútorná rádioaktivita. Pre všeobecný opis prípravy cytokínov IL-4 a IL-10, pozri U.S. patent 5,017,691 a U.S.S.N. 07/453,951. Oba patenty sú tu uvedené ako referencie.
II. Agonisty a antagonisty
IL-10 agonisty môžu byť molekuly, ktoré napodobňujú interakciu, IL-10 s jeho receptormi. Môžu to byť analógy alebo fragmenty IL-10 alebo protilátky proti ligandom viažucim sa na epitopálne miesta receptorov IL-10 alebo antiidiotypické protilátky proti hlavným protilátkam, ktoré sa viažu na časti IL-10 interagujúce s receptorom.
Antagonisty môžu mať podobu proteínov, ktoré súperia o väzbu k receptoru, napr. ktorým sa nedostáva schopnosti aktivovať receptor, zatiaľ čo, ale bránia väzbe IL-10, alebo molekuly viažucej sa k IL-10, napr. protilátky.
Môže sa zvýšiť množstvo protilátok na IL-10 cytokín, fragmenty a analógy, ako na prirodzene sa vyskytujúce formy, tak na ich rekombinantné formy. Navyše sa môže zvýšiť množstvo protilátok na IL-10 buď v jeho aktívnej alebo neaktívnej forme, rozdiel je, že protilátky na aktívny cytokín pravdepodobnejšie rozoznajú epitopy, ktoré sú prítomné iba v aktívnej konformácii. Antiidiotypické protilátky sú v týchto metódach tiež sledované a môžu byť potenciálne IL-10 agonisty.
Množstvo protilátok vrátane väzbových fragmentov a jednoreťazcových verzií proti predurčeným fragmentom požadovaného antigénu, napr. cytokínu sa môže zvýšiť imunizáciou zvierat konjugátmi fragmentov s imunogenickými proteínmi. Monoklonálne protilátky sú pripravované z buniek vylučujúcich požadovanú protilátku. Tieto protilátky môžu byť testované na väzbu k normálnym alebo neaktívnym analógom alebo testované na agonistickú alebo antagonistickú aktivitu. Tieto monoklonálne protilátky sa budú obvykle viazať s KD prinajmenšom 1 mM, obvyklejšie prinajmenšom 300 μΜ, typicky prinajmenšom 10 μΜ, typickejšie prinajmenšom 30 μΜ, výhodne 10 μΜ a výhodnejšie 3 μΜ alebo lepšie. Hoci ide predovšetkým o IL-10, množstvo podobných protilátok sa zvýši i oproti iným analógom, ich receptorom a antagonistom.
Protilátky vrátane fragmentov viažucich antigén, v tomto vynáleze môžu mať významnú diagnostickú alebo terapeutickú hodnotu. Môžu byť silnými antagonistami, ktoré sa viažu na receptory IL-10 a inhibujú väzbu ligandov k re ceptoru alebo inhibujú schopnosť IL-10 vyvolať biologickú reakciu.
IL-10 alebo fragmenty možno pripojiť k iným látkam, hlavne polypeptidom, ako kondenzované alebo kovalente pripojené polypeptidy sa používajú ako imunogény. Cytokín a jeho fragmenty možno kondenzovať alebo kovalentne viazať k mnohým imunogénom, takým ako je prílipkový (keyhole limpet) hemocyanín, hovädzie sérum albumín, tetanový toxoid atd. Pozri práce Microbiology. Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specifitv of Serological Reactions, Dover Publications, New York a Williams a kol. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, Academic Press, New York. Tieto práce opisujú metódy priprav polyklonálnych antisér a sú tu uvedené ako referencie. Typická metóda zahrnuje hyperimunizáciu zvieraťa antigénom. Krv zvieraťa je potom zhromaždená krátko po opakovanej imunizácii a izoluje sa gamaglobulín.
V niektorých prípadoch je žiaduce pripraviť monoklonálne protilátky z rôznych cicavčích hostiteľov, ako sú myši, hlodavci, primáty, ľudia, atď. Opis technik na prípravu takých monoklonálnych protilátok je možné nájsť v prácach napr. Stites a kol. (editori) Basic and Clinical Immunology (4. vydanie), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, a odkazy tam uvedené: Harlow a Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. vydanie) Academic Press, New York: Colligan a kol. (editori; 1991 a periodické doplnky) Current Protocols in Immunology. Wiley and Sons, New York; a hlavne Kohler a Milstein (1975) v Náture 256: 495 - 497, kde diskutujú jednu z metód tvorby monoklonálnych protilátok. Zmienené práce sú tu uvedené ako referencie. Stručne zhrnuté, táto metóda zahrnuje injikovanie antigénu zvieraťu. Zviera je potom zabité a bunky zo sleziny sú kondenzované s bunkami myclomu. Výsledkom jc hybridná bunka alebo „hybridoma“, ktorá je za určitých podmienok schopná reprodukcie in vitro na rozdiel od pôvodných buniek myelomu. Populácia hybridom je potom testovaná na izoláciu jednotlivých klonov, z ktorých každý vylučuje jediné protilátkové species k imunogénu. Pri tomto spôsobe sú jednotlivé získané protilátkové species produkty jednotlivých klonovaných B-buniek z imúnneho zvieraťa tvorené ako reakcie na špecifické miesta rozpoznané na imunogánnej substancii:
Iná vhodná technika zahrnuje in vitro vystavenie lymfocytov antigénnym polypeptidom alebo alternatívne výber knižnice protilátok vo fágu alebo podobných vektoroch. Pozri práce Huse a kol. (1989) „Generation of a Large Combinatorial library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda“, Science 246: 1275.1281; a Ward a kol. (1989) Náture 341: 544 - 546, ktoré sú tu uvedené ako referencie. Polypeptidy a protilátky z tohto vynálezu možno použiť s modifikáciou alebo bez modifikácie vrátane chimerických a ľudských protilátok. Produkované môžu byť tiež rekombinantné imunoglobulíny, pozri patent Cabilly, U. S. patent 4,816,567, ktorý'je tu uvedený ako referencia.
Zvýšenie množstvo protilátok proti cytokínu alebo jeho receptorom je tiež použiteľné na zvýšenie množstva antiidiotypických protilátok, ktoré môžu mať agonistické alebo antagonistické vlastnosti. Toto možno využiť pri ovplyvňovaní rôznych imunologických reakcií, ako je v tomto dokumente diskutované.
III. Čistenie a farmaceutické prípravky
Keď sú polypeptidy z tohto vynálezu vylúčené v rozpustnej forme, napr. ako sekrečný produkt kvasiniek alebo cicavčích buniek, možno ich čistiť podľa štandardných pro cedúr známych v tejto problematike vrátane postupného zrážania síranom amónnym, chromatografiou na ionexi, gélovou filtráciou, elektroforézou, afínitnou chromatografiou a/alebo podobnými metódami, pozri napr. práce „Enzýme Purification and Related Techniques“, Methods in Enzymology, 22: 233 - 577 (1977) a Scopes, R., Proteín Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York, 1982), ktoré poskytujú sprievodcu pre metódy čistenia. Zmienené práce sú tu uvedené ako referencie. Podobne, keď sú polypeptidy z tohto vynálezu vylúčené v nerozpustnej forme, napr. ako agregáty, inklúzna hmota a podobne, možno ich čistiť podľa štandardných procedúr známych v tejto problematike vrátane oddelenia inklúznej hmoty z rozbitých hostiteľských buniek centrifúgáciou, solubilizovaním inklúznych hmôt s chaotropnými a redukčnými činidlami, zriedením solubilizovanej zmesi a znížením koncentrácie chaotropného činidla redukčného činidla tak, že sa polypeptid dostane do biologicky aktívnej konformácie. Zmienené procedúry sú opísané v nasledujúcich prácach, ktoré sú tu uvedené ako referencie: Winkler a kol., Biochemistry, 25: 4041 - 4045 (1986); Winkler a kol., Biotechnology, 3: 992 - 998 (1985); Koths a kol., U. S. patent 4,569,790; a Europské patentové prihlášky 86306917.5 a 86306353.3. Výraz „účinné množstvo“, tak ako jc používaný v tomto dokumente, znamená množstvo postačujúce na zmiernenie alebo prevenciu podmienok šoku, ktoré sú charakteristické napríklad symptómami, ako je chlad, vasokonštrikcia, duševný zmätok, hypoperfúzia, hyperpyrexia a podobne. Účinné množstvo pre jednotlivého pacienta sa líši v závislosti od takých faktorov, ako je stav a typ sepse, ktorá sa lieči, celkový zdravotný stav pacienta, metóda podania, prudkosť vedľajších príznakov a podobne. Všeobecne je IL-10 podávaný ako farmaceutický prípravok obsahujúci účinné množstvo činidla a farmaceutického nosiča. Pozri napr. práce Kaplan a Pasce (1984) Clinical Chemistry: Theory, Analysis, and Correlation, Mosby and Co., St. Louis, MO; a Gilman a kol. (1990) Goodman and Gilmans: The pharmacological Basis of Therapeutics (8. vydanie), Pergamon Press, ktoré sú tu uvedené ako referencie. Pri určitých aplikáciách môže byť IL-10 kombinovaný s ďalšími farmaceutický aktívnymi látkami vrátane antibiotických prípravkov.
Farmaceutický nosič môže byť akákoľvek nejedovatá látka vhodná na dopravu prípravku z tohto vynálezu do pacienta. Je známych mnoho prípravkov použiteľných na parenterálne podanie takých liekov, napr. Remington's Pharmaceutical Science, 15. vydanie (Mack Publishing Company, Easton, PA 1980). Alternatívne je možné dodať prípravky z tohto vynálezu do pacientovho tela implantovateľným alebo injikovateľným systémom dopravujúcim lieky. Pozri napr. práce Urquhart a kol., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol. 24, strany 199 - 236 (1984); Lewis (editor), Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plénum Press, New York, 1981): U.S. patent 3,773,919; U.S. patent 3,270,960, z ktorých každá je tu uvedená ako referencia, a podobne.
Pri podávaní parenterálne je jednotková dávka IL-10 v injikovateľnej forme (roztok, suspenzia, emulzia) spolu s farmaceutickým nosičom. Príklady takých nosičov sú fyziologický roztok, Ringerov roztok, roztok dextrózy a Hankov roztok. Možno tiež použiť nevodné nosiče, ako sú oleje a etyl oleáty. Preferovaný nosič je 5 % dextróza/fyziologický roztok. Nosič môže obsahovať menšinový podiel doplnkov, ktoré zaisťujú izotonicitu a chemickú stabilitu, napr. pufre a stabilizačné prostriedky. IL-10 je výhodne prezentovaný v čistenej forme bez agregátov a iných protcínov v koncentrácii pohybujúcej sa v rozmedzí od 5 do mg/ml. Výhodne je IL-10 podávaný kontinuálnou infúziou tak, žc sa dodá každý deň množstvo v rozmedzí 50 - 800 mg (t. j. 1 - 16 mg/kg/deň). Množstvo denných infúzií sa môže meniť na základe sledovania vedľajších efektov a počítania krvných buniek.
Podobná rozvaha sa prevedie na určenie účinného množstva IL-10 agonistu alebo antagonistu, hoci niektoré antagonisty môžu vyžadovať širšie rozmedzie dávok, napr. vyššie dávky.
IV. Biologické pozorovania a mechanizmus
I keď nie je viazaná následne navrhnutým mechanizmom, nasledujúca diskusia poskytuje hlboký pohľad do použitia a aplikácií IL-10 analógov, agonistov a antagonistov. Využiteľné základy pre funkciu imunitného systému, rozvoj a diferenciáciu poskytuje napr. práca Paul (editor) (1989) Fundamental Immunology (2. vydanie) Raven Press, New York, ktorá je v tomto dokumente citovaná. Kapitoly 26 o infekcii, 28 o oneskorenom type hypersenzitivity a 31 o autoimunite sa vzťahujú na použitia opísané v tomto dokumente predovšetkým.
Bol skúmaný vplyv IL-4 a IL-10 na syntézu cytokínu a LAK aktivitu vyvolanou IL-2 v ľudských PBMC a purifikovaných NK bunkách, napr. v štúdii A. Zatiaľ čo IL-4 a IL-10 inhibujú syntézu IFNy a TNFa v PBMC, syntézu IFNy purifikovanými NK bunkami vyvolanú IL-2 inhibuje iba IL-4. To ukazuje, že IL-4 a IL10 inhibujú syntézu cytokínu NK bunkami rozdielnym mechanizmom.
Výsledky pokusov, v ktorých sa skúmala produkcia TNFa, naznačujú podobné riešenie. Ničmenej v tomto prípade monocyty produkujú tento cytokin. IL-10 nemá žiadny priamy vplyv na syntézu TNFa NK bunkami vyvolanou IL-2, ale je schopný blokovať produkciu TNFa v monocytoch. Stimulácia kultúr obsahujúcich NK bunky a CD14+ bunky pomocou IL-2 viedla k veľkému zvýšeniu produkcie TNFa a IL-10 toto zvýšenie kompletne zablokoval. Od toho okamihu IL-2 neaktivoval bunky CD 14+ k produkcii ďalšieho TNFa, synergické zvýšenie pravdepodobne reprezentuje prírastok zo syntézy TNFa NK bunkami. To ukazuje, že IL-10 inhibuje produkciu TNFa v monocytoch rovnako dobre ako ich kostimulačné vplyvy na syntézu TNFa NK bunkami.
Hoci IL-4 i hIL-10/vIL-10 znížia syntézu TNFa a IFNy PBMC vyvolanú IL-2, iba IL-4 inhibuje LAK aktivitu vyvolanú IL-2. Tieto pozorovania ukazujú, že produkcia cytokínov a cytotoxicita sú regulované v PBMC rozdielnymi spôsobmi. Tieto zistenia sú dôležité v klinickom použití IL-2 a LAK buniek. Problémy spojené s terapiou IL-2 zahrnujú kardiovaskulárne vplyvy a syndróm presakovania kapilár. Príčiny týchto vedľajších efektov sú neisté, ale môžu zahrnovať uvoľnenie cytokínov tak, ako TNFa vyvoláva IL-2 u pacientov s rakovinou. To, že IL-10 inhibuje syntézu cytokínu vyvolanú IL-2, ale neinhibuje LAK aktivitu ukazuje, že tento cytokin možno použiť v kombinácii s IL-2 na liečenie takých pacientov. Navyše sa z pohľadu dát ukazuje, že TNFa môže vyvolať expresiu HIV v infikovaných T-bunkách a schopnosť IL-10 inhibovať syntézu TNFa sa javí v tomto svetle zaujímavá.
Tieto štúdie tiež ukazujú, že ľudský- IL-10 je produkovaný v relatívne veľkom množstve monocytmi po aktivácii. Kinetické štúdie ukazujú, že nízke hodnoty IL-10 možno detegovať 7 hodín po aktivácii monocytov a maximálna produkcia IL-10 sa objavuje 24 až 48 hodín po aktivácii. To bolo relatívne neskoro v porovnaní s produkciou IL-la, IL-7p, IL-6, IL-8 a TNFa, ktoré boli vylučované vo veľkom množstve 4 až 8 hodín po aktivácii. Tiež bolo preukázané, žc ľudský IL-10 má silné inhibičné vplyvy na pro dukciu cytokínov monocytmi po aktivácii IFNy, LPS alebo kombinácii IFNy a LPS. Tieto inhibičné vplyvy sú špecifické pre IL-10, pretože môžu byť úplne neutralizované mAb 19F1, ktorý inhibuje aktivity IL-10 i v-IL-10. IL-10 pridaný v koncentrácii 100 U/ml zníži syntézu IL-la, TNFa, GM-CSF a G-CSF o viac než 90 % po optimálnej aktivácii monocytov kombináciou IFNy (100 U/ml) a LPS (1 mg/ml). Inhibičný vplyv na produkciu IL-1 β, IL-6 a IL-8 bol o niečo menej výrazný, hlavne keď boli monocyty optimálne aktivované kombináciou IFNy a LPS. Mechanizmus, ktorým IL-10 inhibuje produkciu cytokínu monocytmi nie je jasný, napr. či tieto vplyvy IL-10 sú priame alebo nepriamo sprostredkované inými faktormi. Pretože IL-1 môže vyvolať produkciu IL-6 vo fibroblastoch, thymocytoch a monocytoch, je napríklad možné, že čiastočná inhibícia produkcie IL-6 je dôsledok zníženia produkcie IL-1.
Virálný-IL-10, ktorý, ako bolo preukázané, je biologicky aktívny proti ľudským bunkám, bol v porovnaní s ľudským IL-10 testovaný menej rozsiahlo. Ničmenej v-IL-10 inhibuje produkciu TNFa a GM-CSF monocytmi aktivovanými LPS v tom istom rozsahu ako ľudský IL-10. Tieto inhibičné vplyvy v-IL-10 na produkciu TNFa a GM-CSF boli neutralizované mAb 19F1, čo ilustruje špecifitu vplyvov vIL-10.
Inhibícia vylučovania IL-la , IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF a G-CSF sa deje na úrovni transkripcie. Syntéza cytokin špecifickej mRNA vyvolaná LPS je silne inhibovaná IL-10, ako bolo stanovené Northem a PCR analýzami. PCR analýzy boli vykonané za podmienok, ktoré poskytli porovnanie reakčných produktov jednotlivých vzoriek v semikvantitatívnom meradle. To bolo overené skutočnosťou, že amplifikácia cDNA s primermi špecifickými na β-aktín viedla k ekvivalentnému množstvu reakčných produktov medzi vzorkami a kvantitatívne porovnateľné výsledky boli získané, keď expresia IL-10 mRNA bola stanovená v tej istej vzorke Nothem i PCR analýzami. Navyše, úroveň expresie cytokin mRNA je vo vzťahu k množstvu proteinov v supematante týchto kultúr. IL-10 nemal vplyv na expresiu TGFB mRNA v aktivovaných monocytoch. Ničmenej, je treba poznamenať, že ΤΟΕβ bol konštitutívne exprimovaný v neaktivovaných monocytoch a žc aktivácia monocytov LPS nemala vplyv na hodnotu TGFB mRNA. Assoian a kol. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 6020 - 6024 demonštruje, že monocyty konštitutívne exprimujú TGFp mRNA a že vylučovanie TGFp vyžaduje aktiváciu monocytov. Ničmenej, či má IL-10 vplyv na premenu ΤΟΡβ z latentnej do aktívnej formy je nejasné.
Produkcia IL-10 bola inhibovaná IL-4 na úrovni transkripcie. Hoci inhibičný účinok IL-4 na produkciu IL-10 bol značný, IL-4 nebol schopný zablokovať produkciu IL-10 úplne. IL-4 inhibovať produkciu IL-10 iba do 70 %, dokonca pri takých vysokých koncentráciách (400 U/ml), že boli postačujúce ku kompletnej inhibícii produkcie IL-1, IL-6 a TNFa. Bolo už demonštrované, že IL-4 je schopný inhibovať produkciu IL-la, IL-1 B, IL-6, IL-8 a TNFa ľudskými monocytmi. Tieto objavy boli potvrdené a rozšírené zistením, že IL-4 tiež inhibuje produkciu IL-8, GM-CSF a G-CSF LPS-aktivovanými ľudským monocytmi. Táto inhibícia nastávala na úrovni transkripcie. Údaje uvedené ďalej ilustrujú, že IL-4 a IL-10 majú podobné efekty na expresiu cytokínov ľudskými monocytmi, ktoré zdôrazňujú pleiotropné efekty cytokínov a redundanciu v imunitnom systéme.
Je zaujímavé, že IL-10 je autoregulačný cytokin, pretože silne inhibuje syntézu IL-10 mRNA v monocytoch aktivovaných počas 24 hodín. Navyše aktivácia monocytov účinkom LPS v prítomnosti neutralizujúceho anti-IL-10 mAbs spôsobila vzrast expresie IL-10 mRNA počas 24 hodín, čo indikuje, že endogénne produkovaný IL-10 tiež inhibuje syntézu IL-10 mRNA. Fakt, že IL-10 je schopný regulovať (znižovať) svoju vlastnú produkciu ľudskými monocytmi, znamená, žc ide o prvý cytokín regulovaný negatívnou spätnou väzbou. Autoregulačné účinky endogénne produkovaného IL-10 boli tiež pozorované na produkcii ILla, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF a G-CSF LPSaktivovanými monocytmi s LPS v prítomnosti protilátky anti-IL-10. Ale inhibičné účinky endogénneho IL-10 na produkciu týchto cytokínov boli menej výrazné než účinky exogénneho IL-10 pridaného na počiatku do kultúry. To sa vzťahuje k faktu, že IL-Ια, IL-lfl, IL-6, IL-8, TNFa a GCSF sú produkované na vysokých úrovniach už 4 - 8 hodín po aktivácii, zatiaľ čo k maximálnej produkcii endogénneho IL-10 dochádza omnoho neskôr, 24 - 48 hodín po aktivácii. Túto predstavu podporuje pozorovanie, že najsilnejšie inhibičné účinky endogénne produkovaného IL-10 sa našli v sekrécii GM-CSF produkovaného neskoro po aktivácii monocytov. Za predpokladu, že syntéza IL-10 mRNA odráža a predchádza sekrécii proteínu IL-10, a že IL-10 jediný môže interagovať so svojím receptorom na povrchu bunky, dávajú tieto výsledky tušiť, že inhibičné účinky endogénne produkovaného IL-10 nastávajú relatívne neskoro a môžu teda nadobúdať značný význam v neskorších fázach imunologickej reakcie.
IL-10 bol prvý raz opísaný u myší ako faktor inhibujúci syntézu cytokínu (CSIF) produkovaný Th2 bunkami (ktoré inhibovali syntézu cytokínu), ktorý inhiboval produkciu cytokínu (predovšetkým IFNy) Thl bunkami. Pre tento inhibičný účinok m-IL-10 na produkciu cytokínu Thl bunkami je nutná prítomnosť makrofága, pozri napr. Fiorentino a kol. (1991) J. Immunol. 146, 3444 - 3451, Trowbridge a kol. (1981) J. Epť 1 Med. 154, 1517 - 1524, Lambert a kol. (1989) Celí. Immunol. 120, 401 - 418 a Hirsch a kol. (1981) J. Ept 1 Med. 154, 713 - 725, ktoré sú tu uvedené ako referencie. IL-10 a v-IL-10 silne inhibujú proliferáciu antigén-špecifických T buniek, ak sú monocyty použité ako APC. Navyše redukcie odpovedí antigén-špecifických T buniek nastávajú väčšinou vďaka redukcii „antigén-prezentujúcej“ kapacity monocytov spôsobenej silným efektom regulačného zníženia IL-10 v triede II MHC expresie antigénov v týchto bunkách. Tieto údaje spolu so súčasným objavom, že IL-10 je produkovaný monocytmi neskoro a má autoregulačný efekt na sekréciu IL-10 týmito bunkami, indukujú, že IL-10 má silný efekt regulačného zníženia na prebiehajúcich antigén-špecifických odpovediach T buniek. Takže IL-10 môže hrať hlavnú rolu pri tlmení antigénom riadených odpovedí proliferujúcich T buniek. Predstava, že IL-10 produkovaný monocytmi môže mať tiež silnú autoregulačnú spätnoväzbovú aktivitu na aktiváciu T buniek, je podporená pozorovaním, že IL-10 produkovaný monocytmi po aktivácii LPS je zodpovedný za regulačné zníženie triedy II MHC antigénov v týchto bunkách, pretože expresia triedy II MHC nebola redukovaná a dokonca bola silne zvýšená, keď boli prevedené LPS stimulácie v prítomnosti neutralizujúceho anti-IL-10 mAb.
Protizápalové cytokíny IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 a TNFa sa zúčastňujú zápalových procesov a mnohých autoimunitných chorôb vrátane reumatoidnej artritídy. Tieto cytokíny modulujú aktiváciu a funkciu buniek imunitného systému, ale iba buniek endoteliálnych, keratinocytov a hepatocytov. Objav, že IL-10 má silný efekt regulačného zníženia na sekréciu týchto cytokínov, dáva tušiť, že IL-10 je silný inhibítor zápalov. Vďaka týmto vlastnostiam, ktoré zahrnujú inhibíciu proliferácie antigén-špecifických T buniek redukciou APC kapacity monocy tov cestou regulačného zníženia triedy II MHC antigénov v týchto bunkách a inhibičných efektov na sekréciu prozápalových cytokínov monocytmi, sa zdá, že IL-10 hrá hlavnú rolu ako supresor imunologických a zápalových odpovedí. Táto rola je potvrdená ďalšími štúdiami na in vitro a in vivo modeloch endotoxínových a enterotoxínových superantigénnych odpovedí.
Súčasné štúdie ukazujú, že IL-10 má inhibičný účinok na produkciu LPS-indukovaného cytokínu bunkovými líniami makrofágov a peritoneálnych makrofágov. IL-10 teda nehrá dôležitú rolu iba pri reakciách T buniek, ale tiež pri zápalových reakciách vzniknutých pri infekcii alebo pri zranení.
Efekt IL-10 na bunkové línie makrofágov je výraznejší než efekt, ktorý majú podobné množstvá IL-4, pri ktorom bol už skôr zistený inhibičný účinok na produkciu cytokínov myšacími a ľudskými makrofágmi a monocytmi. Tieto výsledky ukazujú na silnú inhibíciu proteínu TNFa indukovaného LPS a produkovaného IL-4, ale menej tiež na významnú inhibíciu syntézy IL-6 v týchto bunkových líniách. Inhibícia TNFa IL-4 však nie je tak veľká ako tá, ktorá bola nedávno opísaná pre ľudské monocyty. Tento rozdiel môže byť vysvetlený rozdielom v látkach, použití diferencovaných línií buniek makrofágov skôr než monocytov alebo tým, že pre tieto štúdie bolo použitých 10 pg/ml LPS oproti dávke 100 ng/ml použitej v prípade ľudských monocytov. V kontraste k IL-4, IL-10 významne inhiboval pri týchto vysokých koncentráciách LPS produkciu proteínov IL-6, TNFa a IL-1. Stimulácia bunkových línií makrofágov LPS a IFNy môže mať protiváhu v niektorých aspektoch aktivácic makrofágov. To je opäť v rozpore so štúdiami ľudských monocytov, ktoré boli konané s malými množstvami LPS. Čo viac, IL-10-sprostredkovaná inhibícia IFNy a LPS-indukovaná produkcia IL-6 a proteínu TNFa bola o mnoho významnejšia než tá, ktorá bola pozorovaná pri IL-4. Inhibícia LPS alebo IFNy a LPS-indukovaná expresia RNA kódujúcej IL-6 a TNFa bola tiež pozorovaná pri semikvantitatívnej PCR amplifikácii pre reverzne transkribovanú RNA. V niektorých prípadoch IL-4 inhiboval expresiu až do podobného rozsahu ako IL-10, čo dáva tušiť, že IL-10 tiež účinkuje na sekréciu alebo stabilitu translatovaných proteínov. Hoci IL-10 má tieto efekty, ukazuje sa, že jeho konečný inhibičný účinok na produkciu cytokínov makrofágmi je podstatne väčší, než je tomu pri IL-4. Účinok IL10 na produkciu monokínu dáva tušiť, že tento silný inhibítor môže mať uplatnenie ako protizápalový agens pravdepodobne v celom rade klinických aplikácii.
Pretože sa ukázalo, že peritoneálne makrofágy boli inhibované IL-10 zo stimulovaných T buniek, bola testovaná sekrécia cytokínov inhibovaná IL-10 v tejto purifikovanej populácii buniek. FACS-purifikované peritoneálne makrofágy získané z BALB/c alebo CBA/J myší stimulované LPS produkovali významné množstvo proteínu IL-6. Produkcia IL-6 bola len málo redukovaná prítomnostou IL-10. Pretože predbežné PCR údaje dávali tušiť, že purifikované makrofágy produkovali IL-10, protilátka smerovaná proti IL-10 bola zahrnutá v niektorých LPS stimuláciách. Pridaním tejto protilátky do LPS stimuláciou v oboch myšacích líniách vzrástla produkcia IL-6 na omnoho vyššiu úroveň (30 - 35 ng/ml na 7 x 105 buniek/ml, počas 20 hodín). To je konzistentné s produkciou cytokínu makrofágmi za silnej autokrinnej kontroly alebo s tým, že viac než jedna populácia makrofágov je obsiahnutá v Mac-1 +, Bnght peritoneálných makrofágoch, pričom jedna z nich kontroluje ostatné svojou produkciou IL-10. Údaje získané z paralelného systému ľudských monocytov purifikovaných elutriáciou tiež ukazujú, že IL-10 inhibuje produkciu LPS-indukovaného cytokínu vrátane produkcie IL-10 samotného. V súlade s predchádzajúcimi správami o efektoch cytokínov T-pomocných buniek, ako sú IL-4 a IL-10, s cytokínmi Thl T-pomocných buniek, ako je ΙΡΝγ, sú poskytnuté ďalšie zistenia, že tieto cytokíny môžu pôsobiť proti svojím vlastným účinkom. ΙΓΝγ zvýšil úroveň produkcie IL-6 ako odpoveď na LPS až do takmer rovnako vysokej úrovne dosiahnutej anti-IL-10 inhibovaného produkciou IL-10 tými istými makrofágmi. Tieto údaje dávajú tušiť, že produkcia cytokínov, ako je IL-6 a TNFa, je regulovaná IL-10, ktorá je striedavo kontrolovaná IFNy produkovaným aktivovanými T bunkami a NK. bunkami. Tento účinok IFNy môže vysvetliť predchádzajúce pozorovania ukazujúce, že inkubácia peritoneálnych makrofágov s IFNy počas 24 hodín zväčšila ich kapacitu stimulácie Thl buniek.
Mechanizmus toho, ako IL-10 inhibuje makrofág zo stimulovaných buniek zo syntetizovaných cytokínov, ešte nie je známy.
Ak vezmeme do úvahy významný pokles syntézy cytokínov pozorovaný pri stimulácii makrofágov v prítomnosti IL-10, môže mať IL-10 aktivitu regulačného zníženia a kostimulácie nutnej na optimálnu sekréciu cytokínov v odpovedi na makrofágy a antigén. Použitím supematantov získaných zo stimulovaných 1G18.LA makrofágových buniek nebolo možné prekonať inhibičný účinok IL-10 na makrofág a antigén-dependentnú stimuláciu Thl buniek. To je konzistentné s mechanizmom, kde IL-10 nesprostredkováva jeho účinky na syntézu cytokínov regulačným znížením rozpustného kostimulátora. Je možné, i keď nepravdepodobné, že IL-10 ruší účinok skôr než produkciu takého faktoru alebo, že taký kostimulátor je vysoko labilný alebo je absorbovaný, a tak nie je prítomný v týchto pripravených supematantoch. Alternatívne môže IL-10 inhibovať expresiu membránovo viazaného kostimulátora, čo by malo tiež vysvetliť predchádzajúce tušenie naznačujúce, že stimulácia buniek vyžaduje APC/doplnok, ktorý nemôže byť nahradený rozpustným kostimulátorom. Alternatívne vysvetlenie mechanizmu inhibície syntézy cytokínu proteínom IL-10 by mohlo byť tiež, že IL-10 indukuje produkciu inhibičného faktora makrofágom, ktorý potom pôsobí na T bunky za inhibície sekrécie cytokínov. Zmiešanie makrofága a B buniek APC v antigén-špecifickom systéme na stimuláciu Thl buniek vedie k aditívnej stimulácii T buniek v porovnaní so stimuláciou s jednotlivými APC. Prítomnosť IL-10 inhibuje syntézu cytokínov bunkami na tú úroveň, ktorú B bunky APC dosahujú samy. To naznačuje, že makrofág neindukuje produkciu inhibítora, ktorý pôsobí priamo na T bunky alebo B bunky APC. Hoci je to nepravdepodobné, je možné, že taký inhibítor môže byť tiež špecifický pre interakcie makrofág-T bunka, alebo že B bunky APC nejako prekonávajú alebo maria účinok takej aktivity. Údaje získané z ľudského systému naznačujú, že IL-10 nedosahuje inhibíciu proliferácie T pomocných buniek viac rozpustný inhibítor alebo kostimulačný faktor produkovaný monocytmi. Ale ich účinky môžu byť vysvetlené regulačným znížením antigénov MHC triedy II proteínom IL-10 na ľudských monocytoch, ktorý ešte nebol pozorovaný v myšacom systéme.
Okrem regulácie funkcie efektora by tiež mohol IL-10 hrať rolu v iniciácii imunitnej odpovede na produkciu protilátky alebo precitlivelosti neskorého typu aktivácií rôznych podskupín CD4 T pomocných buniek produkujúcich rôzne typy cytokínov. Tieto B bunky a makrofágy produkujú IL-10 a tiež fungujú ako APC a sú senzitívne k rôznym cytokínovým modulátorom (IFNy inhibuje mnoho funkcií B buniek, IL-10 inhibuje makrofágy, ale nie funkciu B buniek APC), čo podporuje túto teóriu. Navyše tieto štúdie ukazujú, že IL-10 má signifikantný inhibičný účinok na syntézu cytokínov makrofágmi, rovnako ako zapríčiňuje značné morfologické zmeny v peritoneálnych makrofágoch. Súhrnne vzaté naznačujú tieto pozorovania dôležitú rolu IL-10 a nielen pri regulácii odpovedí T buniek, ale tiež rolu dôležitého modulátora akútnych zápalových odpovedí spôsobených infekciou alebo zranením.
V štúdii D bola testovaná schopnosť IL-10 inhibovať superantigénom sprostredkovanú toxicitu in vivo. IL-10 je schopný inhibovať produkciu cytokínov T bunkami a čiastočne inhibovať schopnosť makrofágov aktivovať T bunky. Superantigény boli definované ako molekuly, ktoré aktivujú T bunky formovaním „mostíka“ medzi VB reťazcom TCR a triedou II MHC molekúl prítomných na APC. Tieto výsledky naznačujú, že IL-10 by mohol inhibovať produkciu cytokínov T bunkami aktivovanými superantigénmi prezentovanými makrofágmi. Tento účinok bol pozorovaný in vitro. Suprantigény môžu byť endogénne, napr. kódované víry, alebo exogénne, napr. mikrobiálne enterotoxíny. Väčšina študovaných superantigénov z druhej skupiny zahrnuje stafylokokové enterotoxíny. Teraz je známe, že toxicita vykazovaná týmito toxínmi závisí od ich schopnosti aktivovať T bunky in vivo. Tieto pozorovania naznačujú, že agens, ktoré inhibujú aktiváciu T buniek budú predchádzať toxicite vykazovanej superantigénmi. To je konzistentné s pozorovaním, že cyklosporin predchádza SEB-sprostredkovanej toxicite. Vzhľadom na tento model je TNFa hlavný sprostredkovateľ toxicity. Výsledky tu predložené indikujú, že IL-10 je schopný predchádzať toxicite SEB pravdepodobne cez jeho schopnosť inhibovať produkciu TNF T bunkami.
Tieto pozorovania majú opäť zaujímavé implikácie pre mechanizmus pôsobenia IL-10 in vivo. Ukázalo sa, že IL-10 inhibuje funkcie makrofága, napr. produkciu cytokínov, schopnosť aktivovať T bunky a indukuje expresiu la antigénu v B bunkách. Ale pretože toxicita SEB závisí od expresie la antigénov APC, význam týchto experimentov in vivo bol neistý. To, že IL-10 predchádza SEB-indukovanej toxicite naznačuje, že hlavný APC in vivo je makrofág a nie B bunky.
Tieto výsledky majú dôležité implikácie na terapeutické využitie IL-10. Okrem otráv potravín stafylokokovými enterotoxínmi bolo nedávno opísaných mnoho ochorení spôsobených superantigénovou indukciou, napr. Syndróm toxického šoku, Kawasakiho choroba, choroby spôsobené streptokokovými toxínmi a autoimúnne choroby ako reumatická artritída.
IL-10 je vysoko efektívny pri ochrane myší pred letálnou endotoxémiou, čo je objav, ktorý naznačuje, že IL-10 môže byť užitočný pri liečbe bakteriálnych sepsí. Zatiaľ čo mnoho ďalších látok je v súčasnosti v klinických skúškach na liečbu bakteriálnych sepsí, napr. protilátky proti TNFa alebo endotoxínu a IL-IRa, väčšina z nich potrebuje byť na optimálnu ochranu podávaná v animálnych modelových experimentoch pred vznikom sepse. Iba jedna výnimka z toho, IL-IRa, je efektívny pri administrácii súčasne s indukciou sepse v animálnych modelových experimentoch, ale musí byť administrovaná v množstvách dostatočných na blokovanie všetkých endogénnych receptorov 1L-1. Farmakologické dávky IL-10 tiež majú účinky na funkcie makrofága/monocytu, ktoré by mali prispieť k ochrane pred letálnou endotoxémiou, v možno dosť menších množstvách, než sú množstvá nutné na saturáciu receptorov.
Zatiaľ čo predchádzajúca diskusia bola zameraná na účinky administrácie IL-10 na reguláciu a diferenciáciu v rôznych aspektoch imunitného systému, ďalší prístup je cez blokovanie účinku cytokínu IL-10 použitím protilátky antiIL-10.
Tu uvedené údaje indikujú, že kontinuálne pôsobenie na myši od narodenia po dospelosť protilátkou anti-IL-10 drasticky redukuje celkový počet a funkciu Ly-1 B buniek bez zmeny počtu, fenotypu alebo imunokompetencie konvenčných B buniek umiestnených v slezine týchto zvierat. Rôzne pozorovania podporujú predpokladanú depleciu Ly-1 B buniek v myšiach podrobených pôsobeniu anti-IL-10: a) myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 obsahujú vo svojich peritoneálnych dutinách, mieste Ly-1 B bunkového nabohacovania u normálnych myší, málo alebo žiadne B bunky. (Peritoneálne premyté bunky 8-wk-old BALB/c myší v DNAX zvieratách príležitostne obsahujú menej než 5 % konvenčných B buniek - zistené fenotypovou analýzou), b) myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 obsahujú 0 - 10 % úrovne normálnych sérových IgM, čo je konzistentné s predchádzajúcimi rekonštitučnými experimentmi, identifikujúcimi Ly-1 B bunky ako predominantný zdroj cirkulačných IgM, a c) myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 generujú málo alebo žiadnu protilátku v odpovedi na injekciu fosforylcholinu a al, 3-dextranu, antigénov, kvôli ktorým sídlia špecifické B bunky v Ly-1 B bunkových podskupinách. Dáta naznačujúce nemennosť konvenčných B bunkových kompartmentov v myšiach podrobených pôsobeniu anti IL-10 sa zhodujú s nezmenenými počtami slezinných B buniek s normálnym bunkovým povrchom značených fenotypov a normálne zodpovedajúcimi thymus-dependentnému antigénu a mitogénom B buniek. Selektívna deplecia Ly-1 B buniek u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 bola nájdená dočasnou, tak ako sa Ly-1 B bunky znova objavili v peritoneálnych dutinách týchto zvierat niekoľko týždňov po prerušení účinku anti-IL-10.
Do úvahy bolo braných niekoľko možných mechanizmov ako vysvetlenie selektívnej deplecie Ly-1 B buniek u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10. Uvedené údaje indikujú, že to je aspoň čiastočne dôsledok vzrastu IFNy účinkom anti-IL-10, pretože koadministrácia neutralizujúcich protilátok anti-IL-10 a anti-IFNy v týchto štúdiách podstatne zabránila deplecii peritoneálnych B buniek. Implikácia, že IFNy buď priamo alebo nepriamo inhibuje vývoj Ly-1 B buniek, pripomína predchádzajúce pozorovanie, že IFNy slabo podporuje supresiu IL-5 indukovaného in vitro proliferáciou Ly-1+ B lymfómu BCL1. V pokračovaní týchto štúdií bola pozorovaná supresia LPS indukovaného proliferáciou peritoneálnych buniek sprostredkovaná IFNy, ale nie proliferáciou myšacích slezinných buniek z normálnych BALB/c. Či vzrast IFNy u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 vysvetľuje depleciu Ly-1 B buniek a či to priamo odráža účinok IFNy Ly-1 B buniek alebo nejakého nepriameho účinku sprostredkovaného IFNy, nie je úplne pochopené. Možno, že k deplecii Ly-1 B buniek prispievajú navyše ďalšie zmeny u myší podrobených pôsobeniu antiIL-10. Účinok anti-IL-10 bude pravdepodobne viesť k vzrastu úrovne endogénnych monokínov. Myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 sú asi 50-krát viac náchylné k úmrtiu šokom indukovaným LPS, je známy prípad sprostredkovania monokínmi a 5 z 32 myší individuálne podrobených pôsobeniu anti-IL-10 obsahuje podstatnú úroveň séra 1L-6, ďalej je známe, že monokíny neboli nájdené v obehu normálnych zvierat, a že nemohli byť detegované v sére asi 10 kontrolných myší z týchto experimentov. Ale IL-6 transgénne myši alebo zvieratá s veľkým vzrastom hladiny séra monokínov v in vivo administrácii LPS sa zdajú mať normálnu hladinu séra IgM naznačujúcu nezmenený počet Ly-1 B buniek. Skorší nález, že Ly-1 B bunky, ale nie konvenčné B bunky, generujú konštitutívny a inducibilný
IL-10, viedol k tušeniu, že IL-10 pôsobí ako autokrinný rastový faktor. To sa teraz zdá nepravdepodobné vo svetle podstatného počtu peritoneálnych Ly-1 B buniek získaných zmyší podrobených pôsobeniu protilátok anti-IL-10 a antiIFNy.
Depletované myšacie Ly-1 B bunky, ktoré vznikli kontinuálnym pôsobením anti-IL-10 majú značnú podobnosť s imunodeficientnými xid myšami, čo je spontánny mutantný kmeň derivovaný z CBA/caH myší, ktorý nemá Ly-1 B bunky a je necitlivý k podskupine thymus-independentných antigénov. I cez tieto podobnosti naše predbežné výskumy odhalili, že xid myši produkujú IL-10 normálne a obsahujú funkčné IL-10 receptory a tak sa rozlišujú xid myši a myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 mechanisticky. Ďalšia významná vlastnosť myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 z xid myší je in vitro citlivosť slezinných buniek na stimuláciu anti-IgM vykazovanú predchádzajúcimi, ale nie ďalšími zvieratami.
Fyziologická rola IL-10 bola študovaná injikovanim monoklonálnych protilátok špecificky neutralizujúcich IL-10 do myší od narodenia do dospelosti. Takéto pôsobenie vedie k početným zmenám v imunitnom systéme týchto zvierat. Zvieratá sú charakterizovateľné zvýšením cirkulačného TNFa, IFNy a v mnohých prípadoch i IL-6. Tieto účinky sú konzistentné s predtým zistenými vlastnosťami 1L-10 in vitro, potentného supresantu IFNy a produkcie monokínov v experimentoch na bunkových kultúrach. Vzrast endogénneho IFNy sa ukazuje byť zodpovedný za niektoré ďalšie dôsledky vyplývajúce z pôsobenia anti-IL-10. To vedie napr. k deplecii Ly-1 B buniek a vysvetľuje redukciu cirkulačných IgM a IgA protilátok a špecifické odpovede protilátok na fosforylcholín a al,3-dextran. Zvýšené hladiny IFNy sú tiež asi zodpovedné za vzrast cirkulačného IgG2a tak, že tento izotyp je pozitívne regulovaný IFNy. Zostávajúce zmeny vzrastu v peritoneálnych T bunkách, granulocytoch a cirkulačných lgG2b nie sú mechanisticky pochopené, ale môžu byť dôsledkom sekundárnych perturbancií cytokínov. Na rozdiel od bežných zdravých zvierat boli myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 nájdené vysoko náchylnými na úmrtie v dôsledku šoku indukovaného endotoxinmi. Táto letálna zápalová reakcia je sprostredkovaná monokínmi, ktorej môže byť zabránené pasívnym prenosom protilátok špecifických buď pre TNFa, IL-1, IL-6 alebo endotoxíny. Nie je preto prekvapujúce, že myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10, ktoré majú reguláciu zvýšením endogénnych monokínov, a ktoré nemajú populáciu B buniek produkujúcich antiendotoxínové protilátky (t. j. Ly-1 B bunky), sú viac náchylné na túto zápalovú reakciu. Tieto údaje naznačujú klinické využitie IL-10 ako protizápalového agens. V súlade s touto predstavou experimenty indikujú, že farmakologické dávky IL-10 chránia myši pred úmrtím príčinou šoku indukovaným endotoxínmi.
Zatiaľ čo navrhnutý fenotyp myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 je úplne v súlade so známymi vlastnosťami IL-10 in vitro, je ničmenej v kontraste s predbežnými výsledkami o myšiach s IL-10-deficienciou vzniknutou cielenou génovou manipuláciou. Tieto mutanty majú nedetegovateľné úrovne cirkulačného IFNy, TNFa a IL-6, normálne počty Ly-1 B buniek v peritoneálnej dutine a, v prvom priblížení, normálne hladiny sérového Ig. Vysvetlenie tejto diskrepancie nie je jasné, hoci podobná diskrepančná situácia existuje medzi myšami s vyradeným génom IL-2 a myšami od narodenia až do dospelosti podrobenými pôsobeniu receptorových protilátok anti-IL-2. Vysvetlenie tejto redundancie možno tiež hľadať v súvislosti s cytokínovým systémom. Je možné, že vyvíjajúce sa myšacie embryo bude kompenzovať stratu kritického génu cytokínu amplifikačnou expresiou génu kódujúceho cytokín veľmi príbuzných funkcií. Napr. pretože 1L-4 zdieľa mnoho vlastností s IL-10, bol by tento cytokín výborným kandidátom ku kompenzácii totálnej straty IL-10, a tak by jeho expresia mohla viesť k regulačnému zvýšeniu u myší bez IL-10 génu. Naopak neutralizácia endogénneho IL-10 protilátkou u myší od ich narodenia by v najlepšom prípade reprezentovala „deravú“ elimináciu cytokínu, a tak môžu byť zostávajúce stopy endogénneho IL-10 dostatočné na vyhnutie sa hlbokej deficiencii a regulačnej aktivácii kompenzačného metabolizmu. Náhradné vysvetlenie spočíva v tom, že u zvierat podrobených pôsobeniu protilátky stúpne artificielna imunitná odpoveď na administrované xenogenetické protilátky a/alebo výsledné imunitné komplexy nemôžu byť úplne eliminované. Táto alternatíva sa zdá nepravdepodobná, pretože izotypová kontrola protilátok a protilátok na ostatné cytokíny, ktoré tiež generuje imunitný komplex in vivo, neprodukuje imunomodulácie pripisované myšiam podrobeným pôsobeniu anti-IL-10.
Zatiaľ čo charakteristické rysy imunomodulácie pozorovanej u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 nekorelujú úplne so žiadnym zo známych ľudských imunodefícientných ochorení, existujú isté podobnosti s Wiskott-Aldrichovou chorobou a syndrómom IgA deficiencie, Tieto ľudské imunodeficiencie sú charakteristické absenciou cirkulačného lgM alebo IgA, zníženou schopnosťou generovať antibakteriálnu imunitnú odpoveď a často i vzrastom cirkulačného IgGl, hlavného komplement-fixujúceho protilátkového izotypu, ktorý' zrejme koreluje s myšacím IgG2a. Či takí pacienti majú zníženú produkciu alebo citlivosť k IL-10, a keď, či to naopak prispieva k ich imunodefíciencii, očakáva dosiaľ potvrdenie: Potenciálna rola IL-10 v syndróme IgA deficiencie je nejasná, zvlášť preto, že súčasné štúdie jasne implikujú, že IL-10 je dôležitý kofaktor pre ľudské B bunky pre ich diferenciáciu v IgA-sekretujúce bunky po ich aktivácii sietovanými anti-CD40 protilátkami a TGFO.
Navyše k získavaniu informácií o fyziologickej role a potenciálnom klinickom využití IL-10 poskytujú myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 novú príležitosť na vyhodnotenie príspevku Ly-1 B buniek k imunitnému systému. Ako bolo zmienené, druhotné konzekvencie vyplývajúce z deplecie Ly-1 B buniek v myšiach podrobených pôsobeniu anti-IL-10 potvrdzujú mnoho z vlastností skôr pripisovaných tejto minoritnej subpopulácii B buniek. Ale tieto dáta ďalej poskytujú nový náhľad na príspevok Ly-1 B buniek k imunitnému systému. Zvlášť je dôvod sa domnievať, že Ly1 B bunky nie sú potrebné na vývoj lgGb IgG2a, IgGsb, IgG3 alebo IgE odpovedi, pretože obsahy týchto izotypov v sére nie sú znížené v depletovaných Ly-1 B bunkách v myšiach podrobených pôsobeniu anti-IL-10. Podobne zatiaľ čo Ly-1 B bunky sú esenciálne pre citlivosť k niektorým thymus-independentným antigénom typu ÍL, napr. fosforylcholín aal,3-dextran, sú nepotrebné pre ďalšie, napr. TNP-Ficoll a anti-IgM. Nezmenené alebo mierne zvýšené hladiny cirkulačného IgG3, izotypu jedinečne spojeného s odpoveďou B buniek na polysacharidové antigény naznačujú, že myši s deficienciou Ly-1 B buniek sú pravdepodobne schopné reagovať na väčšinu thymus-dependentných antigénov typu IL. Tento aspekt u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 ich ľahko odlišuje od xid myší, spontánne vzniknutého imunodeficientného kmeňa myší, ktorý tiež postráda Ly-1 B bunky, ale ktorý nereaguje na všetky thymus-independen-tné antigény typu IL.
Ďalej nám získanie informácií o príspevku Ly-1 B buniek k imunitnému systému myší podrobených pôsobeniu IL-10 dovolilo zhodnotiť konzekvencie zvýšenia TNFa in vivo. Naše výsledky jasne ilustrujú, že in vivo antagonizmus IL-10 vedie k podstatnému zvýšeniu hladiny sérového TNFa. Zatiaľ čo nepriaznivé konzekvencie zvýšenia TNFa boli zvážené detailne, pozri skôr (napr. septický šok, cerebrálna malária atď.), malo by byť tiež zvážených mnoho priaznivých konzekvencií zvýšenia TNFa. To zahrnuje predvedenie priameho protinádorového účinku, expanzie granulocyt-monocyt hemopoietických rodov, rádioprotekcie a protekcie proti niektorým autoimúnnym a infekčným ochoreniam na animálnych modeloch. Tieto úvahy preto implikujú IL-10 antagonistov ako kandidátov pre terapeutické intervencie pri liečbe týchto ochorení. Potvrdili sme tento návrh na mnohých príkladoch, kde anti-IL-10 protilátky môžu podstatne zbrzdiť rozvoj autoimunity u lupusprone NZB/W myší.
V súhrne sa predkladaný vynález vzťahuje na použitie IL-10 alebo IL-10 antagonistov na reguláciu produkcie monokínov, ktoré sú hlavnými mediátormi pri mnohých ochoreniach. IL-10 a jeho antagonisty zapríčiňujú značnú supresiu monokínov, ako je TNFa, a tak poskytujú ochranu proti nežiaducim zápalovým reakciám, ako je bakteriálna sepsa, toxický šok, reumatická artritída a psonáza. Podobne IL-10 antagonisty budú zvyšovať hladinu monokínov, ako je TNFa, ktorý naopak môže slúžiť ako protinádorové agens a pri poskytovaní rádioprotekcie a protekcie proti niektorým autoimunitným a infekčným chorobám.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Nasledujúce príklady slúžia na ilustráciu predkladaného vynálezu. Vybrané vektory a hostiteľské systémy rovnako ako koncentrácie reagencií, teploty a hodnoty ďalších variabilných parametrov sú uvedené s cieľom ilustrácie v predloženom vynáleze a nie je možné ich považovať za jeho obmedzenie.
Príklad 1. Expresia ľudského IL-10 v baktériách
Syntetický gén ľudského IL-10 bol zložený z mnohých chemicky pripravených fragmentov dvojvláknových DNA za vytvorenia expresného vektora nazvaného TAC-RBS-hIL-10. Klonovanie a expresia boli prevedené v štandardnom bakteriálnom systéme, napr. E. coli K-12 kmeni JM101, JM103 alebo podobných, opísaných v práci Viera a Messing v Gene, 19, 259 - 268 (1982). Digescia reštrikčnou endonukleázou a ligazové reakcie boli väčšinou prevedené podľa štandardných protokolov, napr. Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982), Sambrook a kol. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) a Ausubel a kol. (1987 a periodické dodatky) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York, ktoré sú tu uvedené ako referencie. Na preparáciu malých množstiev plazmidov bola použitá metóda v alkalickom prostredí. Na preparáciu veľkých množstiev plazmidov bola použitá modifikovaná metóda v alkalickom prostredí, kde boli nukleové kyseliny z čisteného lyzátu precipitované pridaním rovnakého množstva izopropanolu. Precipitácia studeným 2,5 M octanom amónnym bola použitá na odstránenie RNA ešte pred rovnovážnou hustotnou centrifugáciou v chloride céznom za detekcie etidium bromidom.
Na filtračnú hybridizáciu boli použité filtračné krúžky Whatman 540, ktoré boli použité na vytiahnutie kolónií, a tie potom boli lyzované a fixované intenzívnym pôsobením (vždy počas 2 minút) 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl, 1 M TrisHCl pH = 8, 0, 1,5 M NaCl a zahriate na 80 °C počas minút. Hybridizácie boli prevedené v systéme 6 x SSPE, 20 % formamid, 0,1 % dodecylsulfát sodný (SDS), 100 pg/ml E, coli tRNA a 100 pg/ml Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio-Rad) pri 42 °C počas 6 hodín s použitím 32P kinázou značených syntetických DNA. (20 x SSPE bol pripravený rozpustením 174 g NaCl, 27,6 g NaH2P04.9H2O a 7,4 g EDTA v 800 ml vody. pH bolo upravené na 7,4 NaOH. Objem bol doplnený na 1 1 a roztok sterilizovaný autoklávovaním.) Filtre boli premyté dvakrát (15 min, lab. teplota) 1 x SSPE, 0,1 % SDS. Po autorádiografli (Fuji RX film) boli vybrané pozitívne kolónie priradením znovuvzrástlych kolónií k modro sfarbeným kolóniám na filtroch. DNA bola sekvcnovaná didcoxymetódou, Sanger a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463 (1977). Templáty pre dideoxyreakcie boli buď jednovláknové DNA relevantných oblastí neklonovaných do M13mp vektorov, napr. Messing a kol. Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), alebo dvojvláknové DNA pripravené minialkalickou metódou a denaturované 0,2 M NaOH (5 min, lab. teplota) a precipitované z 0,2 M NaOH, 1,43 M octanu amónneho prídavkom dvoch objemov etanolu. DNA bola syntetizovaná fosforamiditovou metódou použitím Applied Biosystems 380A syntetizátorov. Syntéza, odchránenie, štiepenie a purifikácia (7 M močovina PAGE, elúcia, chromatografia na DEAE-celulóze) bola prevedená, ako je opísané v manuáli k syntetizátoru 380A.
Komplementárne vlákna syntetických DNA ku klonovaniu (400 ng každej) boli zmiešané a fosforylované polynukleotid kinázou v objeme 50 ml. Táto DNA bola ligovaná s 1 mg vektora DNA, štiepaná príslušnými reštrikčnými enzýmami a ligácia bola prevedená v objeme 50 ml za lab. teploty od 4 do 12 hodín. Podmienky na fosforyláciu, štiepenie reštrikčnými enzýmami, polymerázovú reakciu a ligáciu boli opísané ( Maniatis a kol., uvedené skôr). Kolónie boli testované na lacZ+ (ak bolo žiaduce) na miskách s L agarom doplneným o ampicilín, izopropyl-1-tio-beta-D-galaktozid (IPTG) (0,4 mM) a 5-bróm-4-chlór-3-indolylbeta-D-galaktopyranozid (X-gal) (40 pg/ml).
Vektor TAC-RBS bol konštruovaný pomocou DNA-polymerázy začlenením do jednoduchého BamHI miesta plazmidu pDR540 s tacP miestom (Pharmacia). Ten bol potom ligovaný do nefosforylovaných syntetických oligonukleotidov (Pharmacia), ktoré tvorili dvojvláknový fragment kódujúci konsensus miesto viazajúci ribozóm (RBS, GTAAGGAGGTTTAAC) Po ligácii bola zmes fosforylovaná a religovaná s SstI linkerom ATGAGCTCAT. Tento komplex bol potom štiepený SstI a EcoRI a fragment s veľkosťou 173 bp bol izolovaný elektroforézou na polyakrylamidovom géli (PAGE) a klonovaný do pUC19 (Pharmacia) s vystrihnutným miestom EcoRI-SstI (ako je opísané neskôr). Sekvencie polylinkerových oblastí RBS-ATG finálneho konštruktu (nazvaného TAC-RBS) sú opísané v U.S. Patent 5, 017, 691, ktorý je tu uvedený ako referencia.
Syntetický gén IL-10 bol vložený do plazmidu pUC19 v ôsmich krokoch. V každom kroku mohli byť inzerty bez delécie a/alebo inzerty detegované po klonovaní prítomným génom lacZ (a) pUC19 s ATG štartovným kodónom vloženým v kroku 1. Klony obsahujúce delečné a/alebo inzerčné zmeny boli testované na modré sfarbenie kolónií na L-ampicilínových miskách obsahujúcich X-gal a IPTG. Alternatívne môžu byť sekvencie inzertov ľahko potvrdené v každom kroku s použitím univerzálneho sekvenačného primeru pri preparáciách plazmidových DNA v malých množstvách.
V kroku 1 bol vektor TAC-RBS štiepený SstI, potom bol podrobený pôsobeniu T4 DNA polymerázy (ktorej 3 exonukleázová aktivita umožňuje štiepenie 3 prečnievajúcich vlákien SstI štepov za vzniku fragmentov s tupými koncami) a po deaktivácii T4 DNA polymerázy bol vektor štiepený EcoRI za vzniku 173 bp fragmentu. Tento fragment obsahuje oblasť TAC-RBS a má tupý koniec na ATG štartovnom kodóne a EcoRI štep na opačnom konci. Nakoniec bol izolovaný 173 bp TAC-RBS fragment.
V kroku 2 bol zmiešaný fragment TAC-RBS izolovaný v kroku 1 s plazmidom pUC19 štiepaným EcoRI/ KpnI a syntetickým fragmentom 1A/B, ktorý (pozri neskôr) má tupý koniec na svojom jednom konci a striedavo usporiadaný koniec zodpovedajúci KpnI štepu na svojom antiparalelnom konci. Tento KpnI koniec susedí s antiparalelným BstEII miestom. Fragmenty boli ligované za vzniku pUC19 kroku 2.
V kroku 3 bol zmiešaný fragment 2A/B a 3A/B (pozri neskôr) s plazmidom pUC19 izolovaným v kroku 2 (po amplifikácii a purifikácii) štiepeným BstEII/. Smal a ligovaný za vzniku pUC19 kroku 3. Antiparalelný koniec fragmentu 3A/B obsahuje extra bázy, ktoré tvoria tupý koniec Smal miesta. Tieto extra bázy boli štiepané v kroku 4. Tiež fragmenty 2A/B a 3A/B majú 9 komplementárnych reziduálnych jednovláknových koncov, ktoré anelujú po zmiešaní a ponechávajú paralelný BstEII štep 2A/8 fragmentu a antiparalelný tupý koniec 3A/B fragmentu na ligáciu do pUC19.
V kroku 4 bol plazmid pUC19 izolovaný v kroku 3 (po amplifikácii a purifikácii) štiepaný AílII/Xbal, repurifikovaný a zmiešaný so syntetickým fragmentom 4A/B (pozri neskôr) a ligovaný za vzniku pUC19 kroku 4.
V kroku 5 bol plazmid pUC19 izolovaný v kroku 4 (po amplifikácii a purifikácii) štiepaný Xbal/Sall zmiešaný so syntetickým fragmentom 5A/B (pozri neskôr) a ligovaný za vzniku pUC19 kroku 5. Striedavo usporiadaný koniec Sali fragmentu 5A/B je eliminovaný štiepenim-Hpal v kroku 6.
V kroku 6 bol plazmid pUC19 izolovaný v kroku 5 (po amplifikácii a purifikácii) štiepený Hpal/PstI zmiešaný so syntetickým fragmentom 6A/B (pozri neskôr) a ligovaný za vzniku pUC19 kroku 6.
V kroku 7 bol plazmid pUC19 izolovaný v kroku 6 (po amplifikácii a purifikácii) štiepaný Clal/Sphl zmiešaný so syntetickým fragmentom 7A/B (pozri neskôr) a ligovaný za vzniku pUC19 kroku 7.
V kroku 8 bol plazmid pUC19 izolovaný v kroku 7 (po amplifikácii a purifikácii) štiepený MluI/HindlII zmiešaný so syntetickými fragmentmi 8A/B a 9A/B (pozri neskôr) a ligovaný za vzniku finálneho konštruktu. Finálny konštrukt bol vložený do E. coli K-12 kmeňa JM101, napr. dostupný z ATCC pod číslom 33876 štandardnými technikami. Po napestovaní bol proteín extrahovaný z JM101 buniek a zriedené extrakty boli testované na biologickú aktivitu. Sekvencie fragmentov sú uvedené v tabuľke 1.
Tabuľka 1. Malé písmená označujú bázy odlišné od báz v rovnakom mieste natívnej sekvencie.
AGCCCAGGCC AGGGCACCCA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC ACTTCTCGGGTCCGG TCCCGTGGGT CAGACTCTTG TCGACGTGGG TGAAG“
CCAGGtAACC ggtac
GGTCCaTTGG c
Fragment ΙΔ/Β
GtAACCTGCC GACGG
TAACATGCTT CGAGATCTCC ATTGTACGAA GCTCTAGAGG
GAGATGCCTT CAGCACTCTACGGAA GTCGTGAGTGAAGACTTTCTTT CTCÄCTTC
Fragment 2A7B
CAAATGAAGG ATCAGCTGGA -CAACTTGTTc TtAAG TGAAAGAAA GTTTACTTCC TAGTCGACCT GTTGAACAAg AaTTC
Fragment 3Ά/Β
GAGTCCTTGC TGGAGGACTT TAAGGGTTAC CTGGGTTGCC AAGCCCTCAGGAACG ACCTCCTGAA ATTCCCAATG GACCCAACGG TTCGGTTGTCTGAGA TGATCCAGTT TTAt AACAGACTCT ACTAGGTCAA AATaGAtC
Fragment 4A/B
CTaGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC CAAGACCCAG ACATCGAtCTCCTCC ACTACGGGGT TCGACTCTTG GTTCTGGGTC TGTAGAAGGCGCATG TtAACg TTCCGCGTAC AaTTGcagct
Fcament 5Λ/Β
AACTCCCTGG GGGAGAACCT GAAGACCCTC AGGCTGAGGC TACGGTTGAGGGACC CCCTCTTGGA CTTCTGGGAG TCCGACTCCG ATGCCCGCTGTCATC GATCtgca GCGACAGTAG CTAg
Fragment 6A/B
CGATTTCTTC CCTGTCAAAA CAAGAGCAAG TAAAGAAG GGACAGTTTT GTTCTCGTTC
AAGAAcGCgT gcatg
TTCTTgCGcA c
Fragment 7A/R
CGCGTTTAAT AATAAGCTCC AAGACAAAGG
AAATTA TTATTCGAGG TTCTGTTTCC
GCCGTGGAGC AGGTGCGGCACCTCG TCCACCATCTACAAA GCCATGTAGATGTTT CGGTAGAGTGAGTTT GAG
CTCA
Fragment 8A/B
ATCTTCATCA ACTACATAGA
AGCCTACATG ACAATCTCAAACTG TAGAAGTAGT TGATGTATCT TCGGATGTAC TGTTAGAAGATACGA AACTGA CTTCTATGCT TTGACTtcga
Fragment 9A/B
Príklad 2. Expresia vIL-10 v COS 7 opičích bunkách
Gén kódujúci otvorený čítací rámec pre vIL-10 bol amplifikovaný polymerázovou reťazovou reakciou s použitím prímerov, ktoré dovoľujú neskoršiu inzerciu amplifikovaného fragmentu do vektora pcD (SRa) štiepaného EcoRI opísaného v Takeba a kol. (1988) Mol. Celí. Biol. 8, 466 - 472. Kódujúce vlákno vloženého fragmentu je uvedené neskôr (Otvorený čítací rámec je vypísaný veľkými písmenami).
aattcATGGA GCGAAGGTTA GTGGTCACTC TGCAGTGCCT GGTGCTGCTT TACCTGGCAC CTGAGTGTGG AGGTACAGAC CAATGTGACA ATTTTCCCCA
GACCTAAGAG ATGCCTTCAG TCGTGTTAAA ACCTTTTTCC AGACAAAGGA CGAGGTAGAT AACCTTTTGC TCAAGGAGTC TCTGCTAGAG GACTTTAAGG ATGCCAGGCC CTGTCAGAAA TGATCCAATT CTACCTGGAG GAAGTCATGC CACAGGCTGA AACCAGGAC CCTGAAGCCA AAGACCATGT CAATTCTTTG GGTGAAAATC TAAAGACCCT ACGGCTCCGC CTGCGCAGGT GCCACAGGTT CCTGCCGTGT GAGAACAAGA GTAAAGCTGT GGAACAGATA AAAAATGCCT TTAACAAGCT GCAGGAAAAA GGAATTTACA AAGCCATGAG TGAATTTGAC ΑΤΤΤΤΤΑΤΤΑ ACTACATAGA AGCATACATG ACAATTAAAG CCAGGTGAg
Klony nesúce inzert v správnej orientácii boli identifikované expresiou vIL-10 a/alebo elektroforézou reštrikčných fragmentov po štiepení. Jeden taký vektor nesúci vIL-10 gén bol označený ako pBCRFl (SRa) a bol uložený v ATCC pod číslom 68193. pBCRFl (SRa) bol amplifikovaný v E. coli MC1061, izolovaný štandardnými technikami a použitý na transfekciu opičích buniek COS 7 podľa nasledujúceho postupu. 1 deň pred transfekciou bolo asi 1,5 x 106 opičích buniek COS 7 vysiatych na jednotlivé 100 mm misky Dulbecco s modifikovaným Eagle médiom (DME) obsahujúcim 5 % fetálne teľacie sérum (FCS) a 2 mM glutamín. Na transfekciu boli z misiek odobrané COS 7 bunky: najprv boli inkubované s trypsínom, dvakrát premyté sérom bez DME a suspendované v sére bez DME do výslednej koncentrácie 107 buniek/ml. 0,75 ml alikvot bol zmiešaný s 20 pg DNA a prenesený do sterilnej 0,4 cm elektroporačnej kyvety. Po 10 minútach bolo na bunky pôsobené pulzmi s 200 V, 960 mF v Bio-Rad Gene Pulsar aparáte. Po ďalších 10 minútach boli bunky vyňaté z kyvety a pridané k 20 ml DME obsahujúcom 5 % FCS, 2 mM glutamín, penicilín, streptomycín a gentamycín. Zmes bola rozdelená do štyroch 100 mm misiek na pestovanie tkanivových kultúr. Po 12-24 hodinách pri 37 °C, 5 % CO2 bolo médium nahradené jednoduchým médiom obsahujúcim len 1 % FCS a inkubácia pokračovala ďalších 72 hodín pri 37 °C, 5 % CO2, po ktorej bolo médium odobrané a testované na schopnosť inhibovať IFNy syntézu.
ml alikvoty čerstvo izolovaných periférnych krvných leukocytov (PBL) (asi 2 x 106 buniek/ml) boli inkubované pri 37 °C s fytohemo-aglutinínom (PHA) (100 ng/ml) v médiu pozostávajúcom z (i) 90 % DME doplneného 5 % FCS a 2 mM glutamínom a (ii) 10 % supernatantu z COS 7 buniek vopred transfekovaných pBCRFl (SRa). Po 24 hodinách boli bunky a supematanty odobrané na testovanie na prítomnosť buď IFNy mRNA alebo IFNy proteínu. Kontroly boli stanovované identicky mimo 10 % supernatant, ktorý bol z COS 7 kultúr predom transfekovaný plazmidom nesúcim nepríbuzný cDNA inzert. Vzorky testované na vIL-10 mali okolo 50 % inhibície IFNy syntézy vzhľadom na kontroly.
Príklad 3. Expresia vIL-10 v Escherichia coli.
Gén kódujúci nasledujúci maturovaný vIL-10 môže byť exprimovaný v E. coli
Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe Fro Gin Mst Leu Arg Asp Leu Arg
Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gin Thr Lys Asp Glu
Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys
Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met Zle Gin Phe Tyr
Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala
Lys Asp Hls Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg
Leu Arg Leu Arg Arg Cys Hls Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys
Ser Lys Ala Val Glu Gin íle Lys Asn Ala Pbe Asn Lys Leu Gin
Glu Lys Gly íle Tyr Lys Ala ttet Ser Glu Phe Asp íle Phe íle
Asn Tyr íle Glu Ala Tyr Met Thr íle Lys Ala Arg.
cDNA inzert pBCRFl (SRA) bol zaklonovaný do plazmidu M13, kde bol dvakrát zmenený miestne riadenou mutáciou: najprv tvorbou Clal miesta na 5 konci kódujúcej oblasti pre maturovaný vIL-10 polypeptid, a potom tvorbou BamHI miesta na 3 konci kódujúcej oblasti pre maturovaný vIL-10 polypeptid. Mutovaná sekvencia potom bola ľahko vložená do expresného vektora TRPC11 opísaného neskôr.
TRPC11 vektor bol konštruovaný ligáciou syntetického konsensus RBS fragmentu do Clal linkerov (ATGCAT) a klonovaním výsledných fragmentov do pMTllhc štiepeného Clal (ktorý bol predtým modifikovaný, aby obsahoval Clal miesto). pMTl lhc je malý (2,3 kilobázy) vysoko kopírovaný, AMPR, TETs plazmid odvodený z pBR322, ktorý nesie EcoRI-HindíII polylinkerovú oblast pVX plazmidu. (pVX je opísaný v Maniatis a kol. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1982). Ten bol modifikovaný, aby obsahoval Clal miesto, a to štiepením pMTllhc EcoRI a BamHI, zaplnením výsledných 5 lepivých koncov a ligáciou s Clal linkerom (CATGATC), tým sa znova obnovili miesta EcoRI a BamHI a odstránili miesta Smal a Clal. Jeden transformant z TRPC11 konštruktu mal tandemovú RBS sekvenciu vedľa Clal miesta. Jedno z Clal miest a časť druhej kópie RBS sekvencie boli odstránené štiepením plazmidu PstI, pôsobením Bal31 nukleázy, štiepením EcoRI a pôsobením T4 DNA polymerázy v prítomnosti všetkých štyroch deoxynukleotidových trifosfátov. Výsledné 30 - 40 bp fragmenty získané PAGE a klonovaním do pUC12 štiepeného Smal. 248 bp trpP-fragment z E. coli nesúci EcoRI miesto pripravený z pKCIOl (opísaný v Nichols a kol. (1983) Methods in Enzymology 101, 155 - 164, Academic Press, N.Y.) bol potom klonovaný do EcoRI miesta za vzniku TRPC 11 konštruktu, ktorý je zobrazený na obr. 1. TRPC 11 bol použitý ako vektor pre vIL-10. Najprv bol štiepený Clal a BamHI, purifikovaný, a potom zmiešaný v štandardnom ligačnom roztoku s Clai-BamHI fragmentom plazmidu M13 obsahujúcim nukleotidovú sekvenciu kódujúcu maturovaný BCRF1. TRPC11 obsahujúci inzert nazvaný ako TRPC11-BCRF1 bol namnožený v E. coli K12 kmeňa JM101, dostupnom napr. z ATCC pod číslom 33876.
ŠTÚDIA A. Rozdielne účinky interleukínu-4 a -10 na syntézu interferónu-γ indukovanú interleukínom-2 a lymfokínom aktivovanú „killer“ (zabíjajúcu) aktivitu.
Údaje uvedené v tejto časti boli publikované v práci Hsu akol. (1992) Int 1 Immunology 4, 563 - 569, a ktorá je tu uvedená ako referencia.
Zhrnutie
Kultúra ľudských periférnych krvných mononukleárnych buniek (PBMC) s interleukínom-2 (IL-2) stimuluje syntézu cytokínov a generovanie lymfokinom aktivovanej „killer“ (LAK) aktivity. IL-4 a IL-10 (IL-10 je faktor inhibujúci syntézu cytokínov, CSIF) inhibujú IL-2-indukovanú syntézu IFNy a TNFa ľudskými PBMC. Ale na rozdiel od IL-4 neinhibuje IL-10 žiadnu IL-2-indukovanú proliferáciu PBMC a čerstvých „prirodzených zabíjačov“ (NK bunky) ani IL-2-indukovanú LAK aktivitu. Navyše IL-4 inhibuje IL-2-indukovanú syntézu IFNy čerstvými purifikovanými NK bunkami, zatiaľ čo inhibičný efekt IL-10 je sprostredkovaný CD14+ bunkami (monocyty/makrofágy). IL-10 inhibuje syntézu TNFa monocytmi alebo monocytmi s NK bunkami, ale nie samotnými NK bunkami. Tieto výsledky ukazujú, že IL-4 a IL-10 pôsobí na NK bunky cez odlišné cesty, a že IL-2-indukované syntézy cytokínu a LAK aktivita sú regulované rôznymi mechanizmami.
IL-10 (CSIF) inhibuje syntézy cytokínov, tak ako IFNy, myšacími a ľudskými T-lymfocytmi a monocytmi/makro fágmi. Inhibičný efekt na syntézu cytokínov T bunkami je nepriamy, sprostredkovaný monocytmi/makrofágmi ako antigénprezentujúcimi bunkami. Myšací a ľudský IL-10 (mIL-10, hIL-10) sú homológne k víru Epsteina-Baarovej otvoreného čítacieho rámca BCRF1 (vírový IL-10, vIL-10), ktorý tiež má IL-10 aktivitu na myšacích a ľudských bunkách. Už skôr bolo pozorované, že vIL-10 inhiboval IL-2-indukovanú syntézu IFNy ľudskými PBMC. Pretože NK bunky boli opísané ako hlavný zdroj IFNy v IL-2-stimulovaných PBMC, boli študované účinky hIL-10 a vIL-10 na IL-2-indukovanú syntézu cytokínov a LAK aktivitu spolu s porovnávaním týchto cytokínov s IL-4, známym inhibítorom LAK aktivity. Údaje ukazujú, že IL-4, hIL-10 a vIL-10 inhibujú syntézy IFNy a TNFa IL-2-stimulovanými PBMC, ale iba IL-4 inhibuje syntézu IFNy purifikovanými NK bunkami. Navyše IL-10 neinhibuje, na rozdiel od IL-4, IL-2-indukovanú LAK aktivitu. Tieto výsledky podporujú teóriu, že IL-4 a IL-10 pôsobia na NK bunky rôznymi mechanizmami, a že IL-2-indukované syntézy cytokínov a LAK aktivita sú regulované odlišne.
Príklad Al. Účinky IL-4 a IL-10 na IL-2-indukované syntézy cytokínov a LAK aktivitu
Cytokíny
Ľudský rekombinantný IL-2 (rIL-2) bol šetrne pripravený štandardnými procedúrami podľa S. Zurawského alebo zakúpený (Cetus, Emeryville, CA). Ľudský rlL-4 získaný od Schering-Plough Research. Ľudský rIL-Ιβ bol získaný od Biosource Intemational (Camarillo, CA). Rekombinantné hIL-10 a vIL-10 boli použité ako COS7 transfekčné supernatanty a supernatanty z transfekcii s irelevantnou cDNA alebo bez cDNA boli použité ako kontroly. Pozri Viera a kol. (1991) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88, 1172 -
- 1176, a Hsu a kol. (1990) Scicncc 250. 830 - 832, ktoré sú tu uvedené ako referencie. IFNy a TNFa (Endogen, Boston, MA) boli merané ELISA testami. Produkcia cytokínov za absencie ZL-2 bola pod hranicou citlivosti IFNy a TNFa ELISA testov, ktoré boli 0, 3 ng/ml a 12 pg/ml.
Bunkové línie
Daudi (Burkittov lymfom) bunky boli získané z Schering-Plough (Lyon, Francie). COLO (karcinóm kolonu) bunky získané od Dr. Lewis Laniera boli kultivované v médiu RPMI 1640s5%FCS.
Protilátky
Monoklonálne protilátky proti povrchovým antigénom leukocytov (CD3, CD4, CDS, CDU, CD16, CD19, CD56) boli získané od Becton-Dickinson (San Jose, CA). Protilátky na magnetické deplečné experimenty (CD3, CD4, CD5, CDU, CD19) boli pripravené z ascitových tekutín myší SCID, do ktorých bola injikovaná príslušná bunková línia. Neutralizačné protilátky anti-IL-4 a anti-IL-10 boli opísané napr. v Chretien a kol. (1989) J. Immunol. Methods 117, 67-81, alebo Yssal a kol. J. Immunol. Methods 72, 219 -
- 227, ktoré sú tu uvedené ako referencie.
Preparácia a kultivácia PBMC
Ľudské PBMC boli izolované zo zdravých darcov centrifugáciou v Ficoll-Hypaque a kultivované v 106 /ml ub rlL-2 (200 jednotiek/ml) s alebo bez ďalších cytokínov v Ysselovom médiu s l % ľudského Ab+ séra. Kultúry boli pestované 5 dní v 24- (alebo 96-) jamkových miskách, z ktorých boli získané supernatanty. PBMC od rôznych darcov sa líšili svojou kapacitou produkcie IFNy a TNFa po stimulácii IL-2.
Purifikácia buniek
PBMC boli premyté a inkubované v nádobách na pestovanie tkanivových kultúr počas 40 minút pri 37 °C. Adherované bunky boli zhromaždené pomocou gumovej stierky. Neadherované bunky boli odstránené, peletované, nanesené na stĺpec z nylonovej vlny a inkubované 40 minút pri 37 °C. Po elúcii zo stĺpca boli bunky peletované a resuspendované v 30 % Percoll s 10 % FCS/PBS a prevrstvené 40 % Percollom. Nasledovala centrifúgácia 30 minút za laboratórnej teploty. Z fázového rozhrania boli získané veľké granuláme lymfocyty a dvakrát premyté. Tieto bunky boli inkubované s protilátkou anti-CD56 (Becton-Dickinson, San Josc, CA) 30 minút pri 4 °C, premyté, a pred FACS triedením farbené kozim-antimyšacím-FITC (Jackson Immunoresearch, Avondale, PA). CD56+ bunky obsahovali asi 35 - 50 % buniek, ktoré boli triedené. Triedené bunky boli väčšie než 99,5 % CD56+ pri reanalýze. 9 x 104 purifikovaných NK buniek bolo zmiešaných s 3 x 104 adherovaných buniek alebo T buniek v konečnom objeme 100 ml a kultivovaných s 1L-2 s alebo bez ďalších cytokínov.
Purifikované NK bunky a monocyty od toho istého darcu boli získané nasledovne: PBMC boli cez noc inkubované s ovčími červenými krvinkami a rosetujúce „E+“ (CD2+) a nerosetujúce „E-„ bunky boli separované centrifugáciou v ficoll-hypaque gradiente. E+ bunky boli podrobené tej istej purifikačnej procedúre, ako bolo opísané pre PBMC (pozri skôr) na získanie purifikovaných NK buniek. E-bunky boli inkubované postupne s anti-CD14 mAb (LeuM3) a kozím-anti-myšacím IgG značeným FITC a CD14+ bunky boli triedené na FACStar plus. Čistota týchto buniek bola vyššia než 98 % . 105 purifíkovaných NK buniek bolo zmiešaných s 104 čistých monocytov v 100 ml a kultivovaných samostatne alebo s IL-2 a ďalšími opísanými doplnkami.
Alternatívne boli NK bunky a monocyty nabohatené magnetickou selekciou, a potom triedené: PBMC boli najprv inkubované s monoklonálnymi protilátkami anti-CD3, -CD4, -CD5 a anti-CD19 k ofarbeniu T a B buniek. Po dvojnásobnom premytí PBS boli pridané magnetické častice potiahnuté kozím-anti-myšacím IgG. (Dynabeads M450, Dynal Inc., Great Neck, NY) na odstránenie T a B buniek potiahnutých protilátkami magnetickou selekciou. Výsledné nabohatené NK bunky a monocyty boli farbené antiCD56-PE a anti-CD14-FITC a CD56+ a CD14+ bunky boli izolované triedičom buniek. Čistota dvoch populácií roztriedených buniek bola väčšia než 98,5 %.
Stanovenie cytotoxicity
PBMC boli inkubované s 200 U/ml IL-2 (106 buniek/ml) po 3 dni v Ysselovom médiu s 1 % ľudského AB+ séra. Kultúry boli kultivované v 1-ml jamkách 24-jamkovej misky Linbro (Flow Laboratories, McLean, VA). Po kultivačnej perióde boli bunky odobrané, dvakrát premyté a použité ako efektorové bunky v 5lCr vylučovacom stanovení. Pozri prácu Spits a kol. (1988) J. Immunol. 141, 29-, ktorá je tu uvedená ako referencia. 1000 cieľových buniek značených 5lCr (COLO alebo Daudi) bolo zmiešaných s rôznymi počtami efektorových buniek v Iscoveho médiu s 0,25 % BSA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) v 96-jamkových miskách v tvare U. Misky boli centrifugované 5 minút pri 50 x g, a potom inkubované 4 hodiny pri 37 °C vo vlhkej atmosfére 5 % CO2 Vzorky boli zhromaždené a počítané v gamma počítači (LAB, Bromma, Sweden).
Rekombinantné hIL-10, vIL-10 a hIL-4 boli testovane na ich účinnosť pri syntéze IFNy a TNFa a na LAK aktivitu indukovanú IL-2 v PBMC. PBMC boli kultivované v 200 U/ml rIL-2 buď s rIL-4 (200 U/ml) alebo CGS7 supernatantmi obsahujúcimi hIL-10, vIL-10 alebo bez cytokínov (placebo) počas 5 dní, po ktorých bola meraná syntéza cytokínov. Syntéza IFNy a TNFa indukovaná IL-2 v kultúrach obsahujúcich hIL-10, vIL-10 alebo IL-4 bola podstatne inhibovaná (obr. 2A, 2B).
Výsledok získaný s IL-4 potvrdzuje pozorovanie, že IL4 inhibuje IL-2-indukovanú expresiu IFNy mRNA a proteínu. Inhibícia syntézy cytokínov IL-4 i IL-10 je závislá od dávky a je vratná blokovaním anti-hIL-4 a anti-hIL-10 monoklonálnych protilátok, ale nie izotypovou kontrolou imunoglobulínov (obr. 2C, 2D).
Bola tiež stanovovaná LAK aktivita proti bunkám Burkittovho lymfómu línie Daudi a karcinómu kolonu línie COLO, ktoré sú účinne zabíjané LAK bunkami, ale nie čerstvými NK bunkami. IL-2-indukovaná LAK aktivita proti Daudi a COLO bunkám bola inhibovaná len v kultúrach obsahujúcich IL-4 a bola nezmenená alebo iba mierne zvýšená v kultúrach s hIL-10 a vIL-10 (obr. 3A). IL-2-indukovaná LAK aktivita je primáme sprostredkovaná CD56(Leul9)+ NK bunkami. To, že LAK aktivita proti COLO bunkám nebola inhibovaná IL-10, indikovalo, že cytotoxicita sprostredkovaná aktivovanými NK bunkami nebola týmto cytokínom zvýšená. Ale pretože aktivované CD3+ gd+ T bunky môžu zabíjať Daudi bunky, bolo možné, že IL-10 stimuloval IL-2-indukovanú cytotoxicitu gd+ T buniek proti Daudi bunkám za simultánneho blokovania IL-2-indukovanej NK aktivity' proti týmto cieľovým bunkám.
Na určenie fenotypu anti-Daudi LAK buniek indukovaných v PBMC kultivovaných s IL-2 a hIL-10 boli triedené populácie CD56+ a CD56- pomocou FACS a testované na cytotoxicitu proti Daudi bunkám.
Obr. 3B ukazuje značnú LAK aktivitu v populácii CD56+ iba v prítomnosti IL-2. Zatiaľ čo IL-4 a IL-10 majú inhibíciu syntézy IFNy a TNFa indukovanú IL-2, len IL-4 inhbuje IL-2-indukovanú cytotoxicitu aktivovanými NK bunkami prítomnými v PBMC.
Príklad A2. IL-10 neinhibuje syntézu IFNy ani proliferáciu IL-2-stimulovaných purifíkovaných NK buniek
Testy proliferácie
Bunky boli rozdelené v počte 105 buniek/jamka do 96-jamkovej guľatej misky a inkubované v a bez prítomnosti cytokínov 4 dni v konečnom objeme 200 ml/jamka. Na to bolo do každej jamky pridaných 10 μΐ 1 mCi roztoku 3H-tymidínu. Po 6 hodinách boli kultúry zhromaždené a bolo prevedené scintilačné meranie inkorporovanej rádioaktivity·
Hlavný podiel IL-2-indukovanej syntézy IFNy v PBMC je odvodený z NK buniek skôr než z T buniek. Preto bol účinok hIL-10, vIL-10 a IL-4 na IL-2-indukovanú IFNy syntézu testovaný na FACS-purifikovaných (čistota > 99,5 %) NK bunkách. IL-4 inhiboval v týchto bunkách IL-2indukovanú sekréciu IFNy. Naopak ani hIL-10- ani vIL-10 nepotlačovali syntézu IFNy v purifíkovaných NK bunkách (obr. 4A). Ďalej IL-4 značne inhiboval IL-2-indukovanú proliferáciu PBMC a purifíkovaných NK buniek, zatiaľ čo IL-10 nemal žiadny vplyv na proliferáciu sprostredkovanú IL-2 (obr. 4B).
Oproti IL-4 neúčinkuje IL-10 na NK bunky priamo, ale inhibuje schopnosť monocytu vysielať kostimulačný signál. Tento záver najviac podporujú účinky IL-10 na IL-2-indukovanú produkciu IFNy. Ako bolo povedané, preparácie doplnkových buniek neprodukovali IFNy. Hoci stimu lované NK bunky produkovali značné množstvá IFNy bez doplnkových buniek (obr. 4A, 5A a 5B), prídavok buniek adherujúcich sa na plastika purifikovaných CD14+ buniek k purifikovaným NK bunkám mal za následok veľké zvýšenie syntézy IFNy. Neprítomnosť priameho účinku IL-10 na NK bunky (obr. 4A a 4B) dáva tušiť, že IL-10 inhibuje IL-2-indukovanú produkciu IFNy svojím účinkom na monocyty. Rovnako tak je inhibícia syntézy cytokínov T bunkami účinkom IL-10 sprostredkovaná monocyt/makrofág doplnkovými bunkami.
Príklad A3. Monocyty sprostredkovávajú IL-10-indukovanú inhibíciu IL-2-stimulovanej syntézy IFNy a TNFa NK bunkami
To, že syntéza IFNy bola inhibovaná IL-10 v kultúrach PBMC, ale nie čistými NK bunkami, naznačuje, že tento účinok IL-10 bol sprostredkovaný doplnkovými bunkami. S cieľom preskúmať tieto doplnkové bunky boli metódou triedenia CD56+ buniek purifikované NK bunky z nízkohustotnej bunkovej frakcie získané centrifugáciou v percollovom gradiente alebo z T-, B- alebo monocyt-depletovaných PBMC a boli zmiešané s bunkami adherujúcimi sa na plastik alebo s vysokohustotnou bunkovou populáciou (98 % T bunky) z percollového gradientu. Prídavok adherujúcich buniek k NK bunkám silne zvýšil IL-2-indukovanú produkciu IFNy NK bunkami. Tento stimulačný efekt adherujúcich buniek bol blokovaný IL-10 (obr. 5A). Populácia adherujúcich buniek sama neprodukuje detegovateľné hladiny IFNy ako odpoveď na IL-2. Naopak frakcia obsahujúca T bunky nevykazovala žiadny účinok na IL-2-indukovanú produkciu IFNy NK bunkami a nesprostredkovávala inhibíciu produkcie IFNy účinkom IL-10 (obr.5A).
Bunky adherujúce sa na plastik sú nabohatené monocytmi, ale môžu obsahovať i iné populácie buniek. S cieľom potvrdiť, že monocyty zvyšovali IL-2-indukovanú produkciu IFNy a sprostredkovávali aj jej inhibíciu účinkom IL-10, boli triedením purifikované a kultivované NK bunky a CD 14+ monocyty v prítomnosti IL-2 a IL-10. Obr. 5B ukazuje, že prídavok purifikovaných monocytov k NK bunkám zvyšoval IL-2-indukovanú produkciu IFNy, a že IL-10 inhiboval tento nárast.
Kvalitatívne podobné výsledky boli pozorované pre syntézu TNFa. Obr. 5C ukazuje, že - podľa očakávania - NK bunky produkovali detegovateľný TNFa ako odpoveď na IL-2. CD 14+ bunky produkujú TNFa nezávisle od IL-2. IL-10 inhibuje produkciu TNFa monocytmi v prítomnosti (obr. 5C) i neprítomnosti IL-2. Oproti tomu nebola syntéza TNFa NK bunkami inhibovaná IL-10. Stimulácia NK a CD 14+ buniek dohromady mala za následok podstatné zvýšenie produkcie TNFa než bolo pozorované pre každé bunky zvlášť a toto zvýšenie bolo blokované IL-10.
Monocyty a ich produkty podstatne zvyšovali 1L-2-indukovanú produkciu IFNy pokojovými NK bunkami (obr. 5B). Niektoré monokíny, ako IL-1 a TNFa, boli použité za rôznych podmienok ako kostimulátory syntézy IFNy ľudskými a myšími NK bunkami. To, že IL-10 inhibuje syntézu monokínov, ako sú IL-1, IL-6 a TNFa LPS- alebo IFNy-stimulovanými monocytmi/makrofágmi, naznačuje, že tu opísané účinky IL-10 nastali v dôsledku IL-10-inhibujúcej produkcie kostimulačných molekúl doplnkovými bunkami. Supematanty adherujúcich buniek (obsahujúce hlavne monocyty) boli skúmané z hľadiska zvýšenia produkcie IFNy IL-2-stimulovanými purifíkovanými bunkami, zatiaľ čo supematanty adherujúcich buniek kultivovaných v prítomnosti IL-10 nemajú túto kapacitu i v prípade deplecie
IL-10. Či je táto aktivita supematantu pričítaná každému kostimulačnému efektu doplnkových buniek, nie je jasné. Bolo pozorované, že IL-Ία a IL-Ιβ, ale nie IL-6 alebo, TNFa , kostimulujú IL-2-indukovanú produkciu IFNy NK bunkami. Ale prídavok až do 1000 U/ml IL-1 neobracia inhibičný účinok IL-10 na IL-2-indukovanú syntézu IFNy nefrakcionovanými PBMC. Preto existuje možnosť, že v tomto systéme funguje jedna alebo viac prídavných aktivít, alebo že IL-10 indukuje syntézu sekundárneho faktora inhibujúceho syntézu cytokínu NK bunkami.
Štúdia B. IL-10 inhibuje syntézu cytokínu ľudskými monocytmi: autoregulačná rola IL-10 produkovaného monocytmi.
Údaje uvedené v tejto časti boli už publikované v práci: de Waal Malefyt a kol. (1990) J. Exptl. Med. 174, 1209 - 1220, ktorá je tu uvedená ako referencia.
Zhrnutie
Táto časť demonštruje, že ľudské monocyty aktivované LPS sú schopné produkovať vysoké hladiny IL-10 predtým označeného ako CSIF v tejto súvislosti. IL-10 bol detegovateľný 7 hodín po aktivácii monocytov a maximálne hladiny produkcie IL-10 boli pozorované po 24 - 48 hodinách. Tieto kinetické efekty indikovali, že produkcia IL-10 ľudskými monocytmi nastala relatívne neskoro v porovnaní s produkciou IL-la, IL-ΙΒ, IL-6, IL-8, TNFa a G-CSF, ktoré boli všetky sekretované vo vysokých hladinách 4-8 hodín po aktivácii. Produkcia IL-10 monocytmi aktivovanými LPS bola, podobne ako IL-Ία , IL-Ιβ,, IL-6, IL-8, TNFa , GM-CSF a G-CSF, inhibovaná IL-4. ďalej IL-10 aktivovaný IFNy, LPS alebo kombináciami LPS a IFNy pridaný k monocytom na počiatku kultivácii silne inhiboval produkciu IL-la, LL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa , GM-CSF a G-CSF na úrovni transkripcie. vIL-10, ktorý má v ľudských bunkách podobné biologické aktivity, tiež inhiboval produkciu TNFa a GM-CSF monocytmi s následnou LPS aktiváciou. Aktivácia monocytov účinkom LPS v prítomnosti neutralizujúceho anti-IL-10 mAbs, ktorá mala za následok produkciu väčších množstiev cytokínov vzhľadom na účinok samotného LPS, indikuje, že endogénne produkovaný IL-10 inhiboval produkciu iL-la , IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa GM-CSF a G-CSF. Navyše IL-10 mal autoregulačné účinky, pretože silne inhiboval syntézu mRNA v monocytoch aktivovaných LPS. Ďalej bol endogénne produkovaný IL-10 nájdený zodpovedným za redukciu expresie v triede II MHC nasledovanou aktiváciou monocytov LPS. Spoločne tieto výsledky indikujú, že IL-10 má dôležité regulačné účinky na imunologické a zápalové odpovede vďaka svojej kapacite regulačného znižovania expresie triedy II MHC a inhibicii produkcie prozápalových cytokínov monocytmi.
Nedávno bol identifikovaný a zaklonovaný gén myšacieho interleukínu 10 (IL-10), čo bolo založené na znalosti jeho CSIF aktivity. V myšacom systéme bol IL-10 produkovaný CD4+ Th2 systémom a inhiboval produkciu cytokinov, zvlášť IFNy, Thl klonmi. Inhibícia produkcie cytokínov účinkom IL-10 bola pozorovaná len s použitím makrofágov, ale nie B buniek, ako antigén-prezentujúcich buniek (APC). Navyše k jeho aktivite sa IL-10 ukázal ako pleiotropný a schopný účinkovať na rôzne typy buniek vrátane thymocytov, cytotoxických T buniek, žírnych buniek, B buniek a makrofágov.
Ľudský IL-10 tiež má CSIF aktivitu. Produkcia IFNy a GM-CSF PBMC aktivovanými PHA alebo anti-CD3 mAbs bola silne inhibovaná účinkom IL-10 a táto inhibícia nastala na úrovni transkripcie. Ľudský i myšací IL-10 má extenzívnu sekvenčnú homológiu k predchádzajúcemu necharakterizovanému rámcu v genóme víru Epsteina-Baarovej,
SK 282947 Β6
BCRF-1. Expresia tohto rámca poskytovala aktívny proteín nazvaný virálny IL-10 (vIL-10), ktorý’ zdieľa väčšinu vlastností s ľudským a myšacím IL-10 vrátane CSIF aktivity na myšie a ľudské T bunky.
Ľudský IL-10 a vIL-10 sú schopné inhibovať odpovede antigcn-špecifických proliferujúcich T bunkových odpovedí redukciou antigén-prezentujúcej kapacity ľudských monocytov via regulačné zníženie molekúl triedy II MHC. Výsledky tu uvedené ukazujú, že ľudské monocyty sú schopné produkovať vysoké hladiny IL-10 s následnou aktiváciou LPS, a že táto produkcia nastáva relatívne neskoro v porovnaní s ďalšími monokínmi. Navyše je tu uvedené, že IL-10 silne inhibuje produkciu prozápalových cytokínov, napr. IL-1 a , IL-1 B, IL-6, IL-8 a TNFa a hematopoietických rastových faktorov GM-CSF a G-CSF, monocytmi aktivovanými LPS, IFNy nebo LPS a IFNy. Endogénne produkovaný IL-10 nemá len autoregulačné účinky na produkciu IL-1 a , IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF a G-CSF monocytmi, ale tiež efekt regulačného zníženia svojej vlastnej produkcie a expresie triedy II MHC na monocyty v zmysle autoregulácie. Tieto výsledky indikujú, že IL-10 má dôležité regulačné účinky na imunologické a zápalové odpovede.
Príklad BI. IL-10 je produkovaný ľudskými monocytmi
Izolácia a kultivácia ľudských monocytov
Ľudské periferálne krvné monocyty boli izolované z 500 ml krvi normálneho darcu. Mononukleáme bunky boli izolované hustotnou centrifugáciou v separátore krvných častíc, nasledovala frakcionácia na lymfocyty a monocyty metódou centrifugačnej elutriácie. Preparácia monocytov mala viac než 95 % čistoty (podľa nešpecifického esterázového sfarbenia) a obsahovala viac než 98 % buniek schopných samostatnej existencie. Monocyty boli kultivované v Ysselovom médiu obsahujúcom ľudský sérumalbumín (HSA) s % prídavkom tepelne inaktivovaného ľudského AB+ séra. Toto médium bolo zbavené všetkých endotoxínov, ako bolo zistené Limulus amebocytovým lyzátovým testom (< 0,2 ng/ml endotoxínov). Monocyty boli kultivované v koncentrácii 4 x 106 buniek/ml v teflónových vreciach (Jansen MNL, St Niklaas, Belgium), ktoré zabraňovali adhézii buniek. Po kultivácii boli monocyty odobrané a bola priamou imunofluorescenciou analyzovaná povrchová bunková expresia, alebo bola analyzovaná lymfokínová génová expresia metódou Northern a PCR analýzy. Navyše boli zhromaždené supematanty z monocytových kultivácií a bola stanovená produkcia IL-1 a, IL-1 B, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa, GM-CSF a G-CSF s následnou aktiváciou týchto buniek. Schopnosť samostatnej existencie buniek po kultivácii vždy prekračovala 95 %, ako bolo určené metódou s použitím trypanovej modrej.
Reagencie
Rekombinantné hlL-10 a vIL-10 boli exprimované v E. coli ako glutation-S-transferázové fúzne proteiny, purifikovanc a podrobené digescii s thrombínom na odstránenie N-koncovej fúznej časti, a tak bol získaný aktívny hIL-10 a vIL-10. Purifikovaný ľudský rIL-4 a rIFNy bol získaný od Schering-Plough Research (Bloomfield, NJ). LPS (E. coli 0, 127: B8) bol získaný z laboratórií Difco (Detroit, MI). Produkcia neutralizačného anti-TL-10 mAb 19F1 proti vIL-10 bola zvýšená a efektívne neutralizovala ľudský i virálny IL-10.
Stanovenie lymfokínov
Produkcia IL-Ία a TNFa monocytmi bola meraná špecifickými lymfokínovými ELISA testami získanými z Endogen (Boston, MA). Spodné hranice detegovateľnosti týchto ELISA testov činili 50 pg/ml alebo 10 pg/ml. Produkcia IL-1 B bola stanovená špecifickým lymfokínovým ELISA testom získaným z Cistron (Pine Brook, NJ). Citlivosť tohto testu predstavovala 20 pg/ml. Hladiny IL-6 boli stanovené a špecifickými lymfokínovými ELISA testami získanými z Genzyme (Boston, MA). Citlivosť tohto testu predstavovala 0,313 pg/ml. IL-8 a G-CSF špecifické ELISA testy boli získané z R a D Systems (Minneapolis, MN) a použité na kvantitatívnu produkciu IL-8 a G-CSF. Citlivosti týchto testov činili 4,7 pg/ml alebo 7,2 pg/ml. Produkcia GM-CSF bola stanovovaná špecifickým lymfokínovým ELISA testom. Citlivosť tohto testu predstavovala 50 pg/ml. Produkcia IL-10 bola stanovovaná špecifickým ELISA testom, v ktorom bol použitý anti-IL-10 mAb (JES 9D7) ako povrchová protilátka a ďalej anti-IL-10 mAb (JES 3-12G8) ako značená protilátka. Citlivosť tohto testu predstavovala 50 pg/ml.
IL-10 je produkovaný aktivovanými klonmi ľudských T buniek, aktivovanými periferálnymi krvnými T a B bunkami, líniami B buniek transformovaných EBV a monocytmi. Vysoko purifikované ľudské monocyty izolované centrifugačnou elutriáciou produkovali IL-10 s nasledujúcou aktiváciou účinkom LPS. Navyše sa ukázalo, že tieto ľudské monocyty boli schopné produkovať vysoké hladiny IL-6, TNFa a GM-CSF (obr. 6). Kinetické merania produkcie cytokínov LPS-aktivovanými monocytmi indikovali, že produkcia IL-10 týmito monocytmi nastávala relatívne neskoro. To bolo detegované najprv v supematantoch odobraných po 7,5 hodine, ale maximálna produkcia nastala 20 - 48 hodín po aktivácii. Naopak produkcia TNFa a IL-6 nastala rýchle po aktivácii a dosiahla maxima 3,5 a 7,5 hodín po aktivácii (obr. 6). Produkcia GM-CSF bola tiež detegovaná najprv 7,5 hodiny po aktivácii monocytov LPS, ale v tomto prípade boli dosiahnuté maximálne hladiny produkcie po 20 hodinách. Štúdie odpovedí v závislosti od množstva podávanej látky indikovali, že aktivácia monocytov LPS s koncentráciou 10 ng/ml už viedla k značnej produkcii IL-10, zatiaľ čo maximálna syntéza IL-10 bola pozorovaná pri koncentrácii LPS 1 pg/ml. (obr. 7)
Príklad B2. IL-10 inhibuje produkciu cytokínov ľudskými monocytmi
Ukázalo sa, že IL-10 inhibuje produkciu IFNy a GM-CSF aktivovanými PBMC. S cieľom stanoviť účinky IL-10 na produkciu cytokínov monocytmi boli počas 24 hodín účinkom LPS aktivované vysoko purifikované monocyty bez alebo v prítomnosti IL-10. Navyše boli monocyty aktivované LPS po 24 hodín v prítomnosti IL-4 (100 U/ml) alebo neutralizačného anti-IL-10 mAb 19F1, ktorého produkcia proti vIL-10 bola zvýšená, ale efektívne neutralizovala hIL-10 a vIL-10. Produkcia cytokínov bola stanovená po 24 hodinovej aktivácii v supematantoch týchto kultúr použitím špecifických cytokínových ELISA testov. Ako je uvedené v tabuľke BI, monocyty inkubované v samotnom médiu pri 37 °C neprodukovali IL-la, ILΗβ, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa , GM-CSF a G-CSF. Za týchto podmienok boli syntetizované len značné hladiny IL-8. Aktivácia monocytov účinkom LPS (1 pg/ml) spôsobila produkciu vysokých hladín IL-la , IL-1 B, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa , GM-CSF a G-CSF. Je zaujímavé, že IL-10 inhiboval produkciu IL-la , IL-1 B, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa, GM-CSF a G-CSF v rôznom rozsahu (tab. BI). Najsilnejšie inhibičné účinky IL-10 boli pozorované na pro dukciu IL-Ια, TNFa, GM-CSF a G-CSF, ktorá bola blokovaná z 80 - 100 %. Inhibicia produkcie IL-1 β a IL-6 bola menej výrazná, zatiaľ čo syntéza IL-8 účinkom IL-10 bola iba mierne zvýšená.
Tabuľka BI
Účinky exogénneho IL-10, endogénneho IL-10 a IL-4 na produkciu cytokínov ľudskými monocytmi
IL-1 a ii-te IL-8 IL-8 IL-10 TNFa GM-CSF G-CSF
Médium 37*C D 0 0 150 n&mi 0 0 0 0
LFS 1.2 44.0 261.7 479 30.6 21.2 0.6 90
LPS*IL-4 0 9.7 135.7 418 11.9 5.1 0 17.5
LPS+IL-10 0 13.9 78 434 ND 2.6 0 21.1
LPS+alL-tO 27 50.6 323 672 ND 47.6 5.5 110
Ľudské monocyty izolované centrifugačnou elutriáciou boli kultivované v koncentrácii 4 x 106 buniek/ml v teflónových vrecúškach a aktivované LPS (1 mg/ml) bez alebo v prítomnosti IL-10 (100 U/ml), IL-4 (100 U/ml) alebo anti-IL10 mAb 19F1 (10pg/ml) počas 24 hodín a produkcia cytokínov bola stanovená v supematantoch špecifickými cytokínovými ELISA testami. ND: neprevádzané.
Príklad B3. IL-10 tiež inhibuje produkciu cytokínov monocytmi aktivovanými IFNy
IL-10 tiež inhiboval produkciu cytokínov monocytmi aktivovanými IFNy alebo kombináciami IFNy a LPS. Obr. 8 ukazuje, že IFNy v optimálnych koncentráciách 100 U/ml bol všeobecne menej potentným induktorom sekrécie cytokínov než bol LPS v optimálnych koncentráciách 1 pg/ml. Ďalej je demonštrované, že účinky kombinácií IFNy a LPS na produkciu cytokínov monocytmi boli nájdené všeobecne aditívnymi. Najsilnejší inhibičný účinok IL-10 bol pozorovaný na produkciu IL-Ια, TNFa a GM-CSF. TNFa a GM-CSF sekrécia bola potlačená z viac než 90 %, pri následnej aktivácii monocytov optimálnymi koncentráciami LPS a IFNy. Hoci boli za optimálnych stimulačných podmienok pozorované značné inhibičné účinky na sekréciu IL-Ιβ a IL-6, bola ich inhibicia výraznejšia, keď boli monocyty stimulované suboptimálnymi koncentráciami LPS buď bez alebo v prítomnosti optimálnych koncentrácií IFNy.
Príklad B4. vIL-10 inhibuje produkciu cytokínov monocytmi vIL-10 a hIL-10 majú podobné účinky na ľudské bunky. Obr. 9 ukazuje, že IL-10 a vIL-10 podobne inhibovali produkciu TNFa a GM-CSF monocytmi. IL-10 a vIL-10 pridané v koncentráciách 100 U/ml vykazovali značné inhibičné účinky na produkciu TNFa a GM-CSF monocytmi s následnou aktiváciou LPS (1 pg/ml). Tieto inhibičné účinkv IL-10 a vIL-10 na sekréciu TNFa a GM-CSF boli obrátené v prípade inkubácií prevádzaných v prítomnosti mAb 19F1 (obr. 9), čo demonštruje špecifitu inhibičných účinkov vIL-10. Aktivácia monocytov LPS v prítomnosti IL-10 alebo vIL-10 a neutralizačného anti-IL-10 mAb spôsobila i zvýšenú produkciu TNFa a GM-CSF, čo indikuje, že endogénne produkovaný IL-10 potlačil produkciu týchto cytokínov.
Inhibičné účinky endogénne produkovaného IL-10 na produkciu cytokínov monocytmi boli ďalej vyhodnotené kvantifikáciou hladín cytokínov produkovaných monocytmi aktivovanými LPS v prítomnosti neutralizačného antiIL-10 mAb. V tabuľke BI je uvedené, že pôsobenie LPS a anti-IL-10 na monocyty malo za následok vyššiu produkciu cytokínov v porovnaní s aktiváciou samotným LPS, čo in dikuje, že endogénne produkovaný IL-10 okrem jeho inhibičných účinkov na produkciu TNFa a GM-CSF blokuje produkciu IL-la , IL-1 B, IL-6, IL-8, TNFa a G-CSF. Najväčšie inhibičné účinky boli nájdené pri produkcii IL-la, TNFa a GM-CSF, zatiaľ čo inhibičné účinky na expresiu IL-1 B, IL-6, IL-8 a G-CSF boli síce značné, ale nižšie. Súhrnne tieto výsledky indikujú, že exogénne a endogénne produkované IL-10 inhibujú produkciu IL-la , IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa . GM-CSF a G-CSF monocytmi aktivovanými LPS.
Príklad B5. IL-4 inhibuje produkciu IL-10 aktivovanými monocytmi
IL-4 inhibuje produkciu IL-1 B, IL-6 a TNFa monocytmi aktivovanými LPS. Na určenie, či IL-4 tiež inhiboval produkciu IL-10, boli monocyty aktivované LPS po 24 hodín, a potom bola meraná sekrécia IL-10. Tab. BI ukazuje, že IL-4 silne inhiboval produkciu IL-10 monocytmi aktivovanými LPS. Okrem inhibičných účinkov IL-4 na sekréciu IL-Ιβ, IL-6 a TNFa má IL-4 schopnosť efektívneho blokovania GM-CSF a G-CSF. Ale ako bolo pozorované pri IL-10, bola produkcia IL-8 len slabo zvýšená účinkom IL-4. V súhrne tieto údaje indikujú, že IL-4 a IL-10 majú porovnateľné inhibičné účinky na produkciu cytokínov aktivovanými monocytmi.
Príklad B6. Inhibicia produkcie monokínov nastáva na úrovni transkripcie
Próby.
Pre Northem analýzu boli použité nasledujúce próby: 600. bp Smal fragment (nt 1299 - 1899) z pCD-hTGFp, pozri Yokota a kol. (1987) v Lymphokines (Goeddel a Webb, eds.) 13, Academic Press, New York, 1200 bp PstI fragment z pAL (B-aktín), pozri Viera a kol. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1172 - 1176, 567 bp BamHI-Xbal fragment (nt 1 - 567) z pCD-hIL-6, pozri Yokota a kol. (1987), 268 bp HindlII fragment (nt 29 - 297) z SP64-3-10c (IL-8), pozri Schmid a kol. (1987) J. Immunol. 139. 250-__, 760 bp BglII-HindlII fragment (nt 159 - 919) z pCD-SRa-hIL-10, pozri Viera a kol. (1991). Pre Southern analýzu PCR produktov boli použité nasledujúce oligonukleotidy: IL-Ια: 5'-CATGGGTGCTTATAAGTCATC-3' (nt 500 - 521), pozri March a kol. (1985) Náture 315, 641-_, IL-1 : 5'-CGATCACTGAACTGCACGCTCCGGG-3 (nt 444 - 469), pozri March a kol. (1985) Náture, IL6: 5-GAGGTA- TACCTAGAGTACCTC-3'(nt 510 - 531), pozri Hirano a kol. (1986) Náture 324, 73-__, IL-8 : 5'-TAAAGACATACTCCAAACCTT-3' (nt 200 - 221), pozri Schmid a kol. (1987) J. Immunol., IL-10 5'-CAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGG CATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATC-3' (nt 429 - 498), pozri Viera a kol. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, TNFa : 5'-GGCGTGGAGCTGAGAGATAAC-3' (nt 500 - 521), pozri Pennica a kol. (1984) Náture 312, 724-__,
GM-CSF 5 -CCGGCGTCTCCTGAACCT-3 (nt 150 168), pozri Lee a kol. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4360 - 4364, aktin: 5-CTGAACCCTAAGGCCAACCGTG-3' (nt 250 - 272), pozri Alonso a kol. (1986) J. Mol. Evol. 23, ll-_ a G-CSF: 5-GCCCTGGAAGGGATCTCCCCC-3' (nt 400 - 421), pozri Nagata a kol. (1986) Náture 319, 415-__. Oligonukleotidové sekvencie sú dostupné z GENBANK, c/o Intelligenetics, Inc., Menlo Park, CA, z BCCG bázy a University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin. Biosyntéza oligonukleotidov je opísaná v knihe Oligonucleotide Synthesis: A Prac tical Approach, IRL Press, Oxford, ktorá je tu uvedená ako referencia.
Izolácia mRNA a Northem analýza.
Celková RNA bola izolovaná z 20 x 106 monocytov guanidinium tiokyanát-CsCl procedúrou. Pre Northem analýzu bolo separovaných 10 pg celkovej RNA na vzorku podľa veľkosti na 1 % agarózovom géli obsahujúcom 6,6 % formaldehydu, prenesených na membránu z nylonu Nytran (Schleicher a Schuell, Keene, NH) a hybridizovaných s próbami, a potom rádioaktívne označených na vysokú špecifickú aktivitu (> 108 cpm/mg). Filtre boli hybridizované, premyté za dodržania prísnych pravidiel a vyvinuté.
PCR analýzy
Jeden mikrogram celkovej RNA bol spätne transkribovaný s použitím oligo(dT), 2.18 primeru (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a AMV reverznej transkriptázy (Boehringer Mannheim) v reakcii s objemom 20 pl. Dva mikrolitre reverznej transkriptázy (ekvivalent k 10 ng celkovej RNA) boli použité priamo na každú ampliflkačnú reakciu. Podmienky pre PCR boli nasledujúce: objem reakcie 50 pl, 25 nmol každého primeru, 125 μΜ každého dGTP, dATP, dCTP a dTTP (Pharmacia, Uppsala, Sweden), 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgC12, 1 mg/ml želatíny, 100 pg/ml. neacetylovaného BSA a 1 jednotka Vent DNA polymeráza (New England Biolabs, Beverly, MA). Použité primery boli : IL-Ια sepse primer 5'CATCGCCAATGACTCAGAGGAAG-3' (nt
302 - 325), IL-la anti-sepse primer 5'-TGCCAAGCACACCCAGTAGTCTTGCTT-3' (nt 770 - 743), ÍL-IB sense primer 5'-CCAGCTACGAATCTCGGACCACC-3' (nt 230 - 253), IL-1B anti-sepse primer 5'-TTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAAGTCAGT-3' (nt 896 - 863), IL-6 sense primer 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGC-3' (nt 1 - 21), IL-6 anti-sense primer 5'-CTACATTTGCCGAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3' (nt 810 - 777), IL-8 sense primer 5'-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTG-3' (nt 1 - 21), IL-8 anti-sense primer 5'-TTATGAATTCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC-3'(nt 302 - 269), IL-10 sense primer 5-ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA-3' (nt 323 - 349), IL-10 anti-sense primer 5'-TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA-3' (nt 674 - 648), TNFa sense primer 5-AGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGAC-3' (nt 310 - 333), TNFa anti-sense primer 5'-TGAGTCGGTCACCCTTCTCCAG-3' (nt 782 - 760), GM-CSF sense primer 5-GCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCC-3' (nt 76 - 100), GM-CSF anti-sense primer 5-CCTGCTTGTACAGCTCCAGGCGGGT-3' (nt 276 - 250), G-CSF sense primer 5’-GAGTGTGCCACCTACAAGCTGTGCC-3' (nt 233 - 258), G-CSF anti-sense primer 5'-CCTGGGTGGGCTGCAGGGCAGGGGC-3' (nt 533 - 508), β-aktív sense primer 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3' (nt 1 - 20), β-aktív anti-sense primer 5'-GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3 (nt 548 - 530), reakcie boli inkubované v prístroji Perkin-Elmer/Cetus DNA Thermal Cycler nastavenom na 20 cyklov (denaturácia 30 sekúnd pri 94 °C, anelácía 30 sekúnd pri 55 °C, extenzia 60 sekúnd pri 72 °C). Reakcie boli extrahované chloroformom a na l % agarozový gél v TAE pufri bolo nanášané po 40 pl vzoriek. Produkty boli vizualizované farbením cthidium bromidom. Potom boli gély denaturované v 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl, neutralizované v 10 M acetáte amónia prenesené na membrány z nylonu Nytran. Membrány boli prehybridizované v 6 x SSC, 1 % SDS, 10 x Denhardtovom roztoku (0,2 % Ficoll, 0,2 % polyvinyl pyrrolidón, 0,2 % BSA, pentax frakcia V) a
200 pg/ml E. coli tRNA (Boehringer Mannheim, FRG) po 4 hodiny pri 55 °C. Oligonukleotidové próby (200 ng) špecifické pre vnútorné sekvencie primerov použitých v amplifikácii boli značené na 5 konci T4 polynukleotid kinázou (New England Biolabs) a γ-32Ρ-ΑΤΡ (Amersham, Arlington Heigths, IL). Próby boli separované od neinkorporovaných nukleotidov čistením cez Nick kolonu (Pharmacia, Uppsala, Sweden) a pridané do hybridizačnej zmesi. Po následnej hybridizácii 12 hodín pri 55 °C boli filtre premyté v 0,1 x SSC (1 x SSC: 150 mM NaCl, 15 mM citrát sodný pH = 7,0) a 1 % SDS pri laboratórnej teplote a Kodak XAR-5 filmy boli exponované 1 - 2 hodiny.
Na stanovenie, v ktorej úrovni inhiboval IL-10 produkciu cytokínov monocytmi, boli prevedené komparatívne PCR analýzy s použitím RNA izolovanej z monocytov aktivovaných LPS bez alebo v prítomnosti IL-10, IL-4 alebo neutralizačného anti-IL-10 mAb po 24 hodín. Dáta získané z tohto experimentu sú uvedené v tab. BI. mRNA izolovaná z týchto vzoriek bola reverzne transkribovaná do cDNA a postupne amplifikovaná s cytokín špecifickými primermi. Relatívne malý počet cyklov použitý pri amplifikácii zaisťoval, že množstvo amplifikovanej DNA zodpovedalo počtu cyklov a korelovalo s množstvom špecifickej mRNA v pôvodnej vzorke. Obr. 10 ukazuje, že za týchto podmienok bolo amplifikované ekvivalentné množstvo β-aktín špecifickej cDNA. Monocyty inkubované pri 4 °C v samotnom médiu po 24 hodín exprimovali veľmi nízke hladiny IL-8 mRNA. Inkubácia týchto buniek pri 37 °C viedla ku zvýšeniu tejto expresie, ale neindukovala expresiu IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-10, TNFa, GM-CSF a G-CSF mRNA. LPS aktivácia viedla k silnej expresii IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 a G-CSF mRNA, zatiaľ čo TNFa a GM-CSF boli slabo indukované. Navyše obr. 10 ukazuje, že expresia IL-Ια, IL-6, TNFa, GM-CSF a G-CSF bola silne inhibovaná IL-10 a IL-4 na úrovni mRNA, zatiaľ čo expresia IL-1 B a IL-8 bola len mierne zvýšená IL-10. Aktivácia monocytov LPS v prítomnosti anti-IL-10 mAb viedla k miernemu zvýšeniu expresie IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 a G-CSF mRNA silnému zvýšeniu syntézy TNFa a GM-CSF mRNA. Úrovne expresie cytokín špecifickej mRNA a ich modulácie exogénnym a endogénnym IL-10 alebo IL-4 dobre korelovali so sekréciou príslušných proteínov, ako je uvedené v tab. BI, tzn. že IL-10 a IL-4 inhibovali expresiu cytokínov monocytmi aktivovanými LPS na úrovni transkripcie.
Príklad B7. IL-10 reguluje IL-10 mRNA, ale nie expresiu TGFB mRNA v aktivovaných monocytoch
Po zistení, že ľudské monocyty produkujú IL-10 relatívne neskoro po aktivácii LPS, bolo stanovované, či IL-10 môže zvýšiť endogénnu syntézu IL-10 mRNA. Ľudské monocyty boli aktivované LPS bez alebo v prítomnosti IL-10 počas 7 hodín a expresia mRNA bola analyzovaná Northem blotovaním. Obr. 11 ukazuje, že IL-10 mRNA bola detegovaná 7 hodín po aktivácii LPS, a že IL-10 v tomto čase nemá žiadne alebo len minimálne inhibičné účinky na expresiu IL-10 mRNA. Naopak expresia IL-6 a IL-8 mRNA bola silne inhibovaná IL-10. Ale v iných sériách experimentov, kde monocyty boli aktivované LPS počas 24 hodín, IL-10 silne redukoval expresiu IL-10 mRNA, ako ukazuje Northem analýza na obr: 12. Navyše obr. 12 ukazuje, že aktivácia monocytov LPS v prítomnosti neutralizačného anti-vIL-10 mAb vedie k regulačnému zvýšeniu expresie IL-10 mRNA behom 24 hodín. Tieto výsledky boli potvrdené PCR analýzou s IL-10 špecifickými primermi, pretože RNA použitá v tomto neskoršom experimente bola tiež použitá na PCR analýzy uvedené na obr.
10. Na obr. 12B je uvedené, že kvantitatívne rozdiely pozorované pri expresii IL-10 mRNA Northem analýzou korelovali s výsledkami komparatívnej PCR analýzy. Omnoho citlivejšia PCR analýza dovolila detegovať i nízke hladiny mRNA, ktoré boli indukované 24 hodinovou kultiváciou monocytov v samotnom médiu pri 37 °C. Tieto výsledky indikujú, že IL-10 má autoregulačné účinky na syntézu IL-10 mRNA a v prípade, že hladiny mRNA správne odrážajú produkciu IL-10 proteínu, tiež na produkciu IL-10 ľudskými monocytmi. Ale regulačné zníženie produkcie IL-10 nastáva v aktivačnom procese dosť neskoro. Produkcia TGFB mRNA, ktorá bola exprimovaná konštitutívne v čerstvo izolovaných neaktivovaných monocytoch, nebola aktiváciou LPS počas 7 alebo 24 hodín zvýšená (obr. 11 a 12). Navyše obr. 11 a 12 ukazujú, že hladiny TGFB mRNA neboli zvýšené pri aktiváciách prevádzaných v prítomnosti IL-4, IL-10 alebo neutralizačného anti-IL-10 mAb.
Príklad B8. IL-10 má autoregulačné účinky na expresiu triedy II MHC monocytmi
Imunofluorescenčná analýza
Bunky (105) boli inkubované v mikrotitračných miskách s V dnom (Flow Laboratories, McLean, VA) s 10 μΐ purifikovaného mAb (1 mg/ml) po 30 minút pri 4 °C. Po dvoch premytiach PBS obsahujúcom 0,02 mM azidu sodného a 1 % BSA (Sigma, St. Louis, MO) boli bunky inkubované so značenými FITC F(ab') 2 fragmentmi (zriedenie 1/40) kozej-antimyšacej protilátky (TÁGO, Inc. Burlingame, CA) po 30 minút pri 4 °C. Po troch ďalších premytiach boli značené vzorky buniek analyzované flow-mikrofluorimetriou na FACScan (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Anti MHC triedy II mAb PdV5.2)HLA-DR/DP/DQ), Q5/13 HLA-DR/DP a L243 (HLA-DR) boli opísané skôr, pozri Koning a kol. (1984) Hum. Immunol. 9, 221-__, Quaranta a kol. (1980) J. Immunol. 125. 1421 - 1425, a Lampson a kol. (1980) J. Immunol. 125,293-__.
IL-10 regulačné znižuje expresiu molekúl triedy MHC na povrchu buniek ľudských monocytov. IL-10 takto reguluje konštitutívnu IL-4- alebo IFNy-indukovanú expresiu MHC triedy II. Pretože monocyty produkujú po aktivácii LPS vysoké hladiny IL-10, bolo skúmané, či endogénne IL-10 môže inhibovať expresiu MHC triedy II monocytmi aktivovanými LPS. Monocyty boli aktivované rôznymi koncentráciami LPS bez alebo v prítomnosti neutralizačného anti-IL-10 mAb. Obr. 13 ukazuje, že aktivácia monocytov LPS redukuje konštitutívnu HLA-DR/DP expresiu v týchto bunkách podľa týchto závislostí. Ale v prítomnosti neutralizačného anti-IL-10 mAb 19F1 bola pozorovaná silná indukcia expresie HLA-DR/DP. Identické výsledky boli získané z niekoľkých HLA-DR nebo HLA-DR/DP špecifickým mAb. Tieto výsledky indikujú, že endogénne produkovaný IL-10 autoregulačným spôsobom, je zodpovedný za regulačné znižovanie expresie MHC triedy II pri ľudských monocytoch pri aktivácii LPS.
Štúdia C. IL-10 inhibuje produkciu cytokínov aktivovanými makrofágmi
Údaje uvedené v tejto časti boli publikované podľa Fiorentino a kol. (1991) J. Immunol. 147. 3815 - 3822, čo je tu uvedené ako referencia.
Zhrnutie
IL-10 inhibuje schopnosť makrofága, ale nie antigenprezentujúcich (APC) B buniek stimulovať syntézu cytokínov Thl T bunkových klonov. Boli študované priame účin ky IL-10 na bunkové línie makrofágov a normálnych peritoneálnych makrofágov. LPS- (alebo LPS a ΙΕΝγ) indukovaná produkcia IL-1, IL-6 a TNFa proteínov bola značne inhibovaná IL-10 pri dvoch líniách makrofágov. Ukázalo sa tiež, že IL-10 je po pridaní podaných koncentrácií potentnejší inhibítor syntézy monokínov než IL-4. LPS- alebo LPS a IFNy-indukovaná expresia IL-Ια, IL-6 alebo TNFa mRNA bola tiež inhibovaná IL-10, ako sa ukázalo pri semikvantitatívnej PCR analýze a pri Northern blot analýze. Inhibicia LPS-indukovanej sekrécie IL-6 účinkom IL-10 bola menej významná pri FACS-purifikovaných peritoneálnych makrofágov, než pri iných líniách makrofágov. Ale produkcia IL-6 peritoneálnymi makrofágmi bola zvýšená prídavkom anti-IL-10 protilátok, čo potvrdzuje prítomnosť endogénneho IL-10 v týchto kultúrach. To vedie k vrodenej redukcii syntézy monokínov po aktivácii LPS. Ďalej sa ukázalo, že LPS-stimulované peritoneálne makrofágy priamo produkujú IL-10 detegovateľný ELISA testami. Bolo zistené, že ΙΕΝγ zvyšuje produkciu IL-6 LPS-stimulovanými peritoneálnymi makrofágmi, a to vyplýva z jeho supresie produkcie IL-10 v tejto populácii buniek. Okrem týchto účinkov na syntézu monokínov IL-10 tiež indukuje podstatnú zmenu v morfológii IFNy-stimulovaných peritoneálnych makrofágov. Silný účinok IL-10 na makrofágy, zvlášť na úrovni produkcie monokínov, indikuje dôležitú rolu tohto cytokínu nielen v regulácii odpovedi T buniek, ale tiež akútnych zápalových odpovedi.
IL-10 bol prvý raz opísaný ako cytokín produkovaný klonmi Th2 T-pomocných buniek, ktorý inhibuje syntézu APC-dependentných cytokínov makrofágov Thl T-pomocnými bunkami a má pleiotropné účinky na rôzne ďalšie bunky a je produkovaný ďalšími bunkami. Thl bunky vylučujú IL-2 a IFNy a preferenčne indukujú aktiváciu makrofága a precitlivelosť neskoršieho typu (DTH), zatiaľ čo Th2 bunky produkujú IL-4 a IL-5 a zaisťujú pomoc pre odpovede B buniek. Po aktivácii môže byť každý typ Th buniek schopný regulovať proliferáciu a/alebo funkciu druhých buniek. Táto krížová regulácia je sprostredkovaná rôznymi cytokínmi a ponúka vysvetlenie pozorovania, že niektoré protilátky a DTH odpovede môžu byť vzájomne výlučné. IL-10 účinkuje na makrofágy, ale nie na B bunky. IL-10 inhibuje syntézu cytokínov Thl klonmi a má priamy účinok na makrofágy.
Produkty makrofágov, ako sú IL-1, IL-6 a TNFa, boli implikované pri mnohých zápalových a imunologických odpovediach behom infekcie alebo zranenia tkaniva. TNFa a IL-1 sú endogénne pyrogény, ktoré navyše spôsobujú mnoho metabolických zmien pri mnohých typoch buniek. Ďalej sú IL-1 a IL-6 hlavnými induktormi syntézy proteínov hepatickej akútnej fázy. Nasledujúce príklady ukazujú, že IL-10 inhibuje produkciu cytokínov, ako je IL-1, TNFa a IL-6, LPS-aktivovanými makrofágmi. IL-10 teda hrá dôležitú rolu pri aktivácii T buniek a pri zápalových odpovediach ovplyvnením regulačných funkcií makrofága.
Príklad Cl. IL-10 inhibuje APC funkciu rôznych línií makrofágov
Cytokíny
Purifikovaný rekombinantný mlL-la bol získaný láskavosťou P. Lomedico, Hoffman-La Roche, Nutley, NJ. Rekombinantné mIL-2 a mIFNy boli získané od Schering Research, Bloomfield, NJ. Rekombinantný purifikovaný myšací IL-6 bol získaný láskavosťou M. Pearce, DNAX, a bol exprimovaný v COS 7 bunkách a imunoafinitne purifikovaný. Myšací TNFa bol získaný od Genzyme Corporation (Boston, MA). Rekombinantný myšací IL-10 získaný
SK 282947 Β6 transfekciou COS 7 buniek Fl 15 cDNA klonom (pozri skôr) a kontrolné supernatanty z placeba transfekovaných buniek boli použité v 2 % výslednej koncentrácii, ak nie je uvedené inak. Alternatívne bol rekombinantný myšací IL-10, získaný láskavosťou W. Danga, exprimovaný v E. coli a afinitne purifikovaný s použitím SXC2 anti-IL-10 protilátky.
Protilátky
Boli použité neutralizačné monoklonálne protilátky (mAb) proti IFNy (XMG1.2) a IL-10 (SXC1), pozri Cherwinski a kol. (1987) J. Expt 1 Med. 166, 1229 - 1244, Mosmann a kol. (1990) J. Immunol. 145. 2938 - 2945. J5, izotypová kontrola SXC1 bola láskavo prevedená R. Coffmanom (DNAX). Monoklonálne protilátky k IL-6 (20F3 a 32C11) podľa Starneš a kol. (1990) J. Immunol. 145, 4185-4191 a TNFa (MP6.XT3.il a XT22.11) boli purifikované J. Abramsom (DNAX). Protilátky použité pre FACS-triedenie vrátane potkanieho anti-myšacieho B220 (RA3-6B2) pozri Coffman a kol. (1981) Náture 289, 681 - 683 a potkaní anti-myšací Mac-1 (M 1/70) pozri Springer a kol. (1978) Eur. J. Immunol. 8, 539 - 542. Potkania monoklonálna protilátka k Fc-gR bola 2.4G2 pozri Unkeless a kol. (1979) J. Expt 1 Med. 150, 580 - 596.
Média
Médium pre testy (cRPMI) pozostávalo z RPMI 1640 (J.R. Scientific Inc, Woodland, CA) s 10 % tepelne inaktivovaným íetálnym teľacím sérom (FCS) (J.R. Scientific Inc., Woodland, CA), 0,05 mM 2-ME (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a 10 mM Hepes pufra (Gibco Laboratories, Grand Island, NY). Pri kultivácii T buniek bol do cRPMI média pridaný rekomhinantný mIL-2 (330 U/ml).
Antigény
Hemocyanín z prílipok (keyhole limpet, KLH) získaný z Pacific Bio-Marine Laboratories, Inc (Venice, CA) alebo Calbiochem. Labs (La Jolla, CA) bol použitý v konečnej koncentrácii 100 - 500 pg/ml a ovalbumín od Sigma Chemical Co. v konečnej koncentrácii 1 mg/ml.
Bunkové línie
Pre testy inhibície syntézy cytokínov boli použité Thl kloň, HDK1 (špecifický pre I-Ad/KLH) pozri Cherwinski a kol. (1987) J. Expt 1 Med., a hybridoma T buniek DO11.10 (špecifické pre I-Ad/ovoalbumín) pozri Kappler a kol. (1981) J. Expt 1 Med., 153. 1198-_. Pre IL-1 testy podľa Suda a kol. J. Immunol. Methods 120, 173 - 178 bol použitý Th2 kloň D10.G4.1 (D10), AKR/J anti-conalbumín, získaný od C. Janeway (Yale University, New Hawen, CT) pozri Kaya a kol. (1983) J. Expt 1 Med. 153, 836 - 856. Všetky klony boli udržiavané periodickou stimuláciou antigénom (Ag) a vystavené pôsobeniu APC s následnou kultiváciou v médiu obsahujúcom IL-2 pozri Cherwinski a kol. (1987) J. Expt 1 Med.. Klonovaný IG.18. LA línie makrofága (H-2d) bol odvodený z thymových stromálnych bunkových kultúr a udržovaný v 20 % supernatante z L buniek. Línia makrofága PU5.1 (H-2d) pozri Ralph a kol. (1977) J. Immunol. 119, 950 - 954 bola udržovaná v cRPMI s 10 % FCS. Pri použití ako APC boli 1G.18 LA a PU5.1 bunkové línie aktivované po 24 hodín IFNy (0,5 - 2 ng/ml). Bunková línia WEHI.164,13 citlivá na TNFa a TNFB pozri Espevik a kol. J. Immunol. Methods 65. 55 - 63 bola uchovávaná v cRPMI/5 % FCS:
Imunometrické testy na cytokíny
Hladiny cytokínov (IL-6, IFNy a CSIF/IL-10) boli merané v dvojmiestnom sendvičovom ELISA formáte.
Biotesty
Kolorimetrický MTT proliferačný test bol použitý pre TNFa (bunky línie WEHI.164.13), pre IL-2 (bunky HT-2) a pre IL-1 (bunky D10), vždy 104 buniek v jednej miske. Aktivity sú vyjadrené v U/ml relatívne ku známym štandardom alebo v pg resp. ng/ml. V každom prípade U/ml predstavuje množstvo každého cytokínu, ktoré zodpovedá 50 % maximálnej odpovedi v bioteste.
Meranie indukcie a syntézy cytokínov
- 5 x 104 Thl, HDK.l buniek alebo DO-11.10 hybridoma T buniek boli kombinované s rôznymi množstvami živých APC bez alebo v prítomnosti antigénu v 96-jamkovej mikrotitračnej miske s plochým dnom v celkovom objeme 200 ml/jamku. Hladiny cytokínov boli merané v supematantoch po 24, resp. 48 hodinách.
Stimulácia bunkových línií makrofágov
Bunkové línie makrofágov 1G.18.LA a PU 5.1 boli jemne zoškrabané, omyté a nesuspendované v cRPMI/5 % FCS v koncentrácii 106/ml v 9,5 cm miskách na tkanivové kultúry (Becton Dickinson, NJ) pri 37 °C v atmosfére vzduch/5 % CO2 na 6 hodín pre expresiu RNA, alebo na 24 hodín pre detekciu cytokínov v supematantoch. Stimulácia LPS bola prevedená pri koncentrácii 10 pg/ml alebo v niektorých prípadoch LPS a IFNy pri koncentrácii 100 U/ml, v alebo bez prítomnosti IL-10 pri koncentrácii 200 U/ml alebo pri IL-4 pri koncentrácii 200 U/ml. Supernatanty boli odobrané, centrifugovanc (800 x g), pred vlastným testom uskladnené pri teplote -80 °C a testované na hladiny IL-1, IL-6 alebo TNFa. Línie makrofágov boli ďalej stimulované IFNy počas 24 hodín, alebo v niektorých prípadoch počas ďalších 24 hodín v prítomnosti Thl klonu, HDK.l a jeho špecifického antigénu KLH. V takom prípade boli supernatanty ďalej koncentrované s použitím AMICON filtra s membránou s priechodnosťou do 10 000 Mr a depletované od IL-2 a IFNy s použitím imunoafinitných kolón. Aj supernatanty' a filtráty po koncentrácii boli testované na schopnosť kostimulovať antigén-špecifickú a APCdependentnú syntézu cytokínov Thl. Ďalej, pri použití makrofágov ako APC boli bunkové línie makrofágov 1G18.LA a PU5.1 najprv aktivované po 20 - 24 hodín v prítomnosti IFNy s koncentráciou 0,5 - 2 ng/ml.
IL-10 inhibuje schopnosť APC stimulovať produkciu IFNy Thl bunkami pri použití peritoneálnych alebo slezinných makrofágov alebo makrofágov línie 1G18.LA ako APC. IL-10 je tiež účinný na líniu makrofága PU5.1, ktorý má iný pôvod než 1G18.LA (obr. 14), hoci stimulácia dosiahnutá použitím bunkovej línie PU5.1 ako APC pre Thl bunky nebola taká vysoká ako pri 1G18.LA línii. Obr. 14B ukazuje, že 1G18.LA línia tiež môže sprostredkovávať antigén-špecifickú indukciu produkcie IL-2 Thl klonom i DO 11.10 ovalbumín-špecifickými hybridoma T bunkami. Obe stimulácie boli podstatne inhibované IL-10.
Príklad C2. IL-10 indukuje morfologické zmeny v IFNy-stimulovaných peritoneálnych makrofágoch
Purifíkácia a stimulácia peritoneálnych makrofágov
Peritoneálne bunky boli získané injikovaním a odohraním 7 ml studeného CRPMI/10 % FCS a makrofágy boli triedené na základe Mac-1 a B222 (makrofágy sú Mac-1+ br’8ht, B220'). Bunky boli stimulované 10 pg/ml LPS bez alebo v prítomnosti IL-10, anti-IL-10 monoklonálnych protilátok alebo IFNy. Supernatanty boli zhromaždené po inkubácii 8 x 105 buniek/ml 20 hodín v atmosfére 5 % CO2 pri 37 °C. Supernatanty boli testované na TNFa a IL-6 metódou enzýmových imunoteslov.
FACS- purifikované peritoneálne makrofágy boli inkubované s IFNy bez alebo v prítomnosti IL-10 počas rôzneho času. Supernatanty boli potom odstránené, bunky vysušené vzduchom, fixované a farbené Wright s-Giemsa. Ako je uvedené na obr. 15, IL-10 indukuje zaguľaťovanie buniek a deadherenciu, čo môže mať význam v súvislosti s inhibíciou APC funkcie makrofágov.
Príklad C3. IL-10 regulačné znižuje produkciu biologicky aktívnych alebo cytokínov vylučovaných aktivovanými makrofágovými líniami
Predchádzajúce pozorovania dávajú tušiť, že IL-10 má priamy účinok na schopnosť makrofágov fungovať ako APC a aktivovať syntézu Thl cytokínov. Bol testovaný priamy účinok IL-10 na produkciu monokínov týmito makrofágmi. Supernatanty z makrofágov stimulovaných IFNy, LPS alebo IFNy a LPS bez alebo v prítomnosti IL-10 boli testované na hladinu cytokínov. Tam, kde to bolo možné, bol IL-4 použitý ako kontrola, pretože sa ukázalo, že tento faktor inhibuje produkciu cytokínov aktivovanými makrofágmi. Stimulácia makrofágových línií samotným IFNy neindukovala detegovateľné hladiny monokínov, IL-1, IL-6 alebo TNFa v supematantoch. Naopak LPS alebo LPS a IFNy indukovali značné hladiny týchto cytokínov (obr. 16). Test D10.G4.1 použitý na detekciu IL-1 a prevedený za absencie Conconavalínu A (ConA) nedetegoval iné cytokíny exprimované makrofágmi. Schopnosť makrofágových línií 1G.18.LA a PU5.1 produkovať IL-1 bioaktivitu po indukcii LPS bola značne inhibovaná (obr. 16). IL-10 tiež má veľmi silný inhibičný účinok na produkciu TNFa indukovanú LPS alebo IFNy a LPS v supematantoch oboch línií makrofágov, ako bolo stanovené pomocou biotestu WEHI.164.13 (ukázalo sa, že všetky aktivity týchto supernatantov sú priraditeľné k TNFa s použitím špecifickej blokujúcej protilátky). Podobne IL-10 inhibuje produkciu protcínov IL-6 líniami makrofágov stimulovaných IFNy a LPS a/alebo indukovaných LPS, čo bolo merané metódou enzýmového imunotestu pre IL-6. Vo všetkých experimentoch mal testovaný IL-10 omnoho väčší inhibičný účinok na produkciu monokínov indukovaných LPS alebo IFNy a LPS než IL-4 (na úrovni proteinov).
Príklad C4. IL-10 regulačné znižuje expresiu cytokínov mRNA aktivovanými makrofágmi
Extrakcia a analýza
Celková bunková RNA bola extrahovaná z makrofágov metódou s použitím guanidinium izotiokyanátu. Koncentrácia RNA bola meraná absorpciou pri 260 nm. RNA Hotová analýza bola opísaná v práci Moore a kol. (1990) Science 248, 1230 - 1234, PCR reverzná transkripcia RNA bola opísaná v práci O Garra a kol (1990) Intn 1 Immunol. 2, 821 - 832. Špecifické množstvo každej vzorky cDNA (zriedenie 1/20 cDNA) bolo amplifikované 2,5 U termalázy (Thermus aquaticus DNA polymeráza) (IBI) v cyklovacom prístroji Cetus/Perkin-Elmer za nasledujúcich podmienok: 94 °C topenie, 30 sekúnd, 55 °C anelácia, 30 sekúnd a 72 °C extenzia, 1 minúta s použitím špecifických primerov pre HPRT, TNFa a IL-6, ako je tu uvedené:
HPRT sense: 5'-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3' (nt 422 - 444), HPRT anti-sense: 5'-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3' (nt 598 - 575), HPRT próba: 5'-GCTTTCCCTGGTTAAGCAGTACAGCCCC-3' (nt 543 - 570), TNFa sense: 5'-GCGACGTGGAACTGGCA
GAAG-3' (nt 4499 - 4519), TNFa anti-sense: 5'-GGTACAACCCATCGGCTGGCA-3’ (nt 5865 - 5845), TNFa próba: 5'-CAGTTCTATGGCCCAGACCCTC-3' (nt 5801 - 5821), IL-6 sense: 5'-CCAGTTGCCTTCTTGGGACTG-3' (nt 1520 - 1540), IL-6 anti-sense: 5-GGTAGCTATGGTACTCCA-3' (nt 6093 - 6075), IL-6 próba: 5’-GTGACAACCACGGCCTTCCCTACT-3' (nt 1547 -1570).
Všetky primery pokryli sekvencie tohto génu. Citlivosť a špecifita boli ďalej zvýšené probovaním dot-blotmi amplifikovaných produktov s 32P, γ-ATP značených vnútorných oligonukleotidov k amplifikovanému produktu. Rádioaktívne bloty boli kvantifikované použitím Ambis Image scanneru a vizualizované expozíciou RTG filmu. V každom prípade bola vložená štandardná krivka P388D1 RNA na zaistenie reproducibility testu a z koncového dot-blotu boli získané jednotky relatívne k pg vloženej RNA. Navyše bol použitý' vnútorný štandard enzýmu pre HPRT na zaistenie toho, že bolo použité presne rovnaké množstvo RNA, a že všetky vzorky boli reverzne transkribované a amplifikované PCR s rovnakou účinnosťou.
RNA bola extrahovaná z makrofágových línií 1G18.LA a PU5.1 6 hodín po stimulácii LPS alebo LPS a IFNy bez alebo v prítomnosti IL-10 alebo IL-4. Blot analýza 10 pg celkovej RNA odhalila, že IL-10 regulačné znižuje expresiu TNFa RNA indukovanú LPS alebo LPS a IFNy v oboch líniách (obr. 17), hoci v menšom rozsahu. To bolo potvrdené použitím metódy semikvantitatívnej PCR na analýzu reverzne transkribovanej RNA z oboch línií. Vložením štandardnej krivky pre každý cytokín (ako je opísané v tab. Cl) bolo možné získať jednotky relatívne k pg celkovej štandardnej RNA reprezentovanej v každom bode, a tak vyjadriť dáta číselne. Tab. Cl ukazuje, že IL-10 a IL-4 inhibujú expresiu TNFa indukovanú LPS alebo LPS a IFNy v 1G18.LA línii. To je najlepšie znázornené hodnotami získanými z lineárnej časti štandardnej krivky a legenda v tab. Cl vysvetľuje metódu použitú na odvodenie číselných hodnôt. Analýza expresie RNA línií PU5.1 v odpovedi LPS alebo LPS a IFNy, bola prevedená použitím tej istej metódy a ukazuje, že expresia IL-6 a TNFa bola tiež inhibovaná IL-10 (tab. C2).
Tabuľka C1
Inhibícia LPS-indukovanej expresie TNFa v bunečnej línii makrofága 1G18.LA účinkom IL-10 a IL-4a
Sfknulus tiktor 0 cpm *pflRMA IL-4 IL-10
cpm *cpm •pgRNA cpm *cpm ‘paRNA
LPS+IFNy 1:6 1260 300 1967 2682 Plateau 1232 1034 200
1:27 984 160 601 769 110 713 589 90
1:B1 722 110 110 332 57 411 312 50
LPS 1:9 1114 210 210 1587 330 1387 1068 200
1:27 696 120 120 403 60 460 271 45
1:61 472 72 72 403 60 310 220 33
a Bunkové línie makrofága IG18.LA boli stimulované ako na obr. 3. Supernatanty boli po 6 hodinách odstránené a k bunkám bol na preparáciu RNA pridaný roztok guanidinium izotiokyanátu. 1 pg celkovej RNA z bunkovej línie makrofága IG18.LA bol reverzne transkribovaný v objeme 20 μΐ. Bolo prevedené zriedenie cDNA (pozri obr.) a 1 μ] každého roztoku bol amplifikovaný PCR s primermi špecifickými pre HPRT (interný štandard) alebo pre TNFa. 10 μΐ amplifikovanej cDNA bolo dot-blotovaných a ďalej probovaných s každou z rádioaktívne značených prób (vnútorných k primeru). Zodpovedajúce signály boli merané prístrojom Ambis image Scanner. Pre každé zriedenie boli hrubé hodnoty cpm pre TNFa štandardizované (cpm) podľa korekčného faktora (*) získaného z HPRT cpm relatívne k „0“ vzorke (t. j. bez IL-10 alebo IL-4). Ľubovoľné jednotky, relatívne k titrácii pozitívnych kontrol a korigované na ich HPRT obsah (*pg RNA/dot) potom môžu byť priradené pomocou štandardnej krivky (nie je uvedená).
Tabuľka C2
Mechanizmy účinku IL-10
IL-10 inhibuje LPS-indukovanú expresiu RNA kódujúcu
IL-6 a TNFa v bunkovej línii makrofága PU5.1a
Trttoviná RNA pr· cytokin Stlmulus
LPS+IFN-n LPS
+0 »IL-10 + 0 +IL-1O
cpm •PORNA cpm •M RNA cpm •PORNA cpm •pfl RNA
TNF-a 1031 370 587 80 1864 730 489 23
IL-8 580 1000 207 700 108 90 27 44
a Vzorky PU5.1 boli upravené, ako bolo opísané v predchádzajúcej tabuľke a analyzované hladiny HPRT, TNFa a IL-6. Hrubé hodnoty cpm boli najprv korigované vzhľadom na hodnoty HPRT vzoriek rovnako ako v predchádzajúcej tabuľke. S použitím štandardných kriviek pre známe množstvá v kontrolách pozitívnych na TNFa alebo IL-6, ľubovoľné jednotky *pg RNA na dot blotu boli priradené rovnako ako v predchádzajúcej tabuľke. Hodnoty pre TNFa boli získané z 27-násobného zriedenia a IL-6 u 9-násobného zriedenia 1 μΐ cDNA (1 μg RNA bol reverzne transkribovaný vo výslednom objeme 20 μΐ).
Príklad C5. Regulačné zníženie produkcie proteínu 1L-6 peritoneálnymi makrofágmi aktivovanými LPS
Bolo dokázané, že IL-10 inhiboval APC funkciu peritoneálnych makrofágov (triedených na základe Mac-ll+ (bnght), β220) k Thl bunkám a tieto makrofágy boli ďalej testované na produkciu TNFa a IL-6 v reakcii na LPS. TNFa nebol detegovateľný v supernatantoch (LPSstimulovaných FACS triedených) peritoneálnych makrofágov s hustotou 7 x 105 buniek.-rnl. V kontraste s tým bola v supernatantoch peritoneálnych makrofágov z BALB/c alebo CBA/J myší stimulovaných LPS detegovaná značná hladina IL-6, ako pozri skôr (obr. 18). Hladiny IL-6 boli redukované, ak bunky boli stimulované LPS v prítomnosti IL-10, ale úroveň inhibície bola prekvapivo menej významná (obr. 18), než bolo pozorované pri líniách makrofágov. Úroveň produkcie IL-6 indukovaná stimuláciou LPS sa môže zvýšiť pridaním monoklonálnej protilátky proti IL-10. To, že makrofágy produkovali IL-10 v odpovedi na LPS, bolo potvrdené špecifickým ELISA testom pre IL-10 (BALB/c alebo CBA/J peritoneálne makrofágy stimulované LPS, ako pozri skôr, produkovali 4,5 U/ml alebo 2 U/ml IL-10).
Obr. 18 tiež ukazuje, že purifikované BALB/c peritoneálne makrofágy produkujú vyššie hladiny IL-6 po stimulácii LPS v prítomnosti IFNy v protiklade ku stimulácii samotným LPS. To môže byť vysvetlené výsledkami nasledujúceho experimentu s produkciou IL-10 peritoneálnymi makrofágmi z BALB/c myší. V tomto experimente makrofágy stimulované LPS produkovali 12 U/ml IL-10 a to bolo redukované na menej než 3 U/ml pri bunkách stimulovaných LPS v prítomnosti IFNy.
Príklad C6. Test na rozpustné kostimulátorové mechanizmy inhibície APC funkcie makrofágov sprostredkovanej IL-10
V prítomnosti živých antigén-prezentujúcich buniek (APC) bude IL-10 iba inhibovať syntézu Thl cytokínov. Jedným možným mechanizmom účinku IL-10 je supresia produkcie rozpustného kofaktora nutného na optimálne u voľňovanie cytokínov z Thl buniek. Supematanty boli získané z makrofágov stimulovaných IFNy bez alebo v prítomnosti Thl buniek a špecifického antigénu. Tiež supernatanty (obr. 19A) alebo filtráty získané počas ich koncentrovania neboli schopné obnoviť IL-10 sprostredkovanú inhibíciu APC funkcie makrofágov pre Thl bunky. Tieto údaje neposkytujú dôkaz, že IL-10 regulačné znižuje rozpustný kostimulátor vyžadovaný na syntézu Thl cytokínov. Podobné experimenty neposkytujú dôkaz, že IL-10 indukuje makrofágy na produkciu rozpustného inhibičného faktora, ktorý pôsobí priamo na T bunky, hoci taký inhibítor môže byť labilný alebo membránovo viazaný. K testovaniu tohto mechanizmu bol prevedený experiment so zmesou buniek, ako je uvedené nasledovne. Slezinné B bunky a makrofágy boli FACS triedené (na základe B220 a Mac-1). Triedené makrofágy boli, bez alebo v prítomnosti B buniek a tiež bez alebo v prítomnosti IL-10, použité ako APC pre antigén-špecifickú stimuláciu buniek HDK.l. Makrofágová, ale nie B bunková, stimulácia syntézy Thl cytokínov bola inhibovaná IL-10 (obr. 19B). Výsledkom zmiešania triedených makrofágov s konštantným počtom B buniek bola aditívna stimulácia syntézy Thl cytokínov (obr. 19B). Ale pridanie IL-10 do tejto zmesi APC viedlo k syntéze cytokínov Thl len na spodnej úrovni vzhľadom na úroveň dosiahnutú pri samotných APC B bunkách, čo je v rozpore s prítomnosťou labilného inhibítora alebo s malým rozsahom funkcií, ktorý účinkuje priamo na Thl bunky alebo na B bunky APC.
Štúdia D. IL-10 ochraňuje myši proti superantigénom indukovanému letálnemu šoku
Zhrnutie
Na modele myší bola skúmaná rola IL-10 pri ochrane proti letálnemu šoku indukovanému stafylokokálnym enterotoxínom B (SEB). Myši boli premedikované IL-10, aby bolo zabránené úmrtiu po injikovaní SEB a D-galaktozamínu (ktorý bol nutný na prekonanie prirodzenej rezistencie myší proti SEB). Tento efekt indikuje, že 11,-10 je schopný inhibovať aktiváciu T buniek in vivo, pravdepodobne svojou schopnosťou inhibovať schopnosť makrofágov aktivovať T bunky.
Superantigény sú T bunkové mitogény, ktoré aktivujú T bunky v T receptoroch (TCR) VB- špecifickým spôsobom viazaním TCR VB reťazcov a β reťazcov triedy II MHC molekúl. Superantigény zahrnujú endogénne molekuly produkované myšacími mammary rakovinovými vírmi a exogénne superantigény, medzi ktoré patria enterotoxíny, ako je napr. enterotoxín produkovaný Staphylococcus aureus. Toxický účinok superantigénov závisí od prítomnosti antigén-prezentujúcich buniek (APC). V nedávnych rokoch bolo zistené, že tieto toxíny účinkujú vďaka svojej Tmitogénnej aktivite, čo je záver, ktorý bol ale demonštrovaný in vivo.
IL-10 je cytokin s pleiotropnou aktivitou proti mnohým líniám buniek. To zahrnuje: rastový kofaktor pre myšacie T bunky a žírne bunky, Ια indukciu v B bunkách a schopnosť inhibovať aktiváciu T buniek. Ďalšie efekty boli demonštrované nepriamo, inhibíciou schopnosti makrofágov pôsobiť ako APC. Zdá sa, že tento účinok je časťou všeobecného inhibičného efektu IL-10 na funkcie makrofágov vrátane ich schopnosti produkovať cytokíny ako IL-1, TNFa a IL-6.
Táto štúdia využila stafylokokálnym enterotoxínom B (SEB) indukovaný šok in vivo na myšiach ako model letálneho šoku sprostredkovaného T bunkami. V tomto modeli sú myši senzibilizované k toxickým účinkom SEB preme dikáciou D-galaktozamínom. Toto pôsobenie znižuje prirodzenú rezistenciu myší k enterotoxinom, pravdepodobne ovplyvňovaním pečeňových metabolických pochodov. Neskoršia administrácia malých dávok SEB má za následok úmrtie myší behom dvoch dní. V tomto modeli je toxicita spôsobená v dôsledku masívnej aktivácie T buniek, pri ktorej bunky produkujú TNFa, čo tu hrá kritickú rolu. Pôsobenie IL-10 inhibuje u myší toxicitu sprostredkovanú SEB, pravdepodobne vďaka schopnosti inhibovať aktiváciu makrofág-dependentných T buniek.
Príklad Dl. IL-10 predchádza SEB-sprostredkovanej toxicite in vivo
Myši
Štyri až päť týždňov starí samčekovia BALB/c H-2d myší boli získaní od Simonson Laboratories, Gilroy, CA.
Reagencie
Boli použité tieto látky: myšací interleukin-10 (mlL10) bol pripravený štandardnými procedúrami podľa S. Menona, DNAX Research Inštitúte, Palo Alto, CA. D(+)-galaktozamín (G-0500) bol získaný od Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Stafylokokálny enterotoxin B (SEB) použitý v počiatočnom experimente bol získaný tiež od Sigma Chemical Co. SEB použitý v ďalších experimentoch bol získaný od Toxín Technology, Madison, WIS, láskavosťou P. Hugo (National Jewish Center for Immunology, Denver, CO). Všetky látky boli riedené puframi.
Pôsobenie IL-10
Štyri až päť týždňov starí samčekovia myší boli injikovaní (i.p.) rôznymi koncentráciami mIL-10. Po 3 - 4 hodinách boli opäť injikovaní D-galaktozamínom a hodinu potom boli injikovaní niekoľkými koncentráciami SEB. Myši boli kontrolované po 24, 36 a 48 hodinách.
Pôvodné experimenty ukázali, že IL-10 mení toxicitu SEB v tomto modeli in vivo. Predbežné experimenty boli zamerané na zistenie minimálnej dávky SEB potrebnej na zaistenie vysokej úmrtnosti v tomto modeli. Tieto dávky sa menia v závislosti od pôvodu (dodávateľovi) a dodávke SEB. Bola testovaná jedna táto dávka SEB z jednej a tej istej dodávky u myší premedikovaných IL-10 (10 pg/myš). Obr. 20 ukazuje, že premedikácia IL-10 má za následok prežitie všetkých myší injikovaných 10 pg SEB/myš. Hoci premedikácia IL-10 nepredchádza eventuálnemu úmrtiu zvierat injikovaných 20 pg SEB/myš, predlžuje čas ich života.
Štúdia E. IL-10 chráni myši pred letálnou endotoxémiou
Zhrnutie
IL-10 znižuje produkciu IL-1, IL-6 a TNFa in vitro a neutralizácia IL-10 v myšiach vedie ku zvýšeniu rovnakých monokínov. Táto štúdia skúma, či táto monokíny-supresujúca vlastnosť IL-10 mu prepožičiava schopnosť chrániť myši pred LPS-indukovaným šokom, zápalovou reakciou sprostredkovanou monokínmi. Jedna injekcia 0,5 -1 pg rekombinantného mIL-10 reprodukovateľné chráni BALB/c myši pred letálnou intraperitoneálnou injekciou endotoxínu. Tento výsledok bol získaný, ak IL-10 bol administrovaný súčasne alebo 30 minút po injekcii endotoxínu. Ochranný účinok IL-10 bol zmenený predchádzajúcou injekciou neutralizujúcou protilátky anti-IL-10 a korelovaný s podstatným znížením endotoxín-indukovaným uvoľnením TNFa. Tieto údaje implikujú, že IL-10 je vhodným kandidátom na liečbu bakteriálnych sepsí a je všeobecne efektívnym protizápalovým agens.
Silné bakteriálne infekcie môžu mať za následok hlboké fyziologické zmeny, ako je hypotenzia, horúčka, nekrózy tkanív, rozšírené disfunkcie orgánov a smrť. V prípade gramnegatívnych baktérií nastáva toxicita v dôsledku endotoxínu, lipopolysacharidovej (LPS) zložky bakteriálnej steny. Injekcia príslušnej dávky LPS králikom, myšiam a ďalším zvieratám má za následok zmeny typické pre syndróm septického šoku, čo je jednoduchý model tejto zápalovej reakcie.
Endotoxínom indukovaná toxicita sa zdá byť následkom uvoľnenia TNFa, IL-1 a /alebo IL-6 z endotoxínom stimulovaných makrofágov/monocytov, pretože zvieratá môžu byť chránené pred bakteriálnym a endotoxínom indukovaným šokom neutralizáciou týchto monokínov, s použitím monoklonálnych protilátok alebo fyziologického IL-1 antagonistu zvaného IL-IRa.
IL-10 má mnohé in vitro vlastnosti vrátane supresie produkcie IFNy T-pomocnými a NK bunkami, rastovej kostimulácie thymocytov, žírnych a B buniek a supresie produkcie monokínov. IL-10 hlboko potlačuje indukovanú, produkciu TNFa, IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 a GM-CSF ľudskými monocytmi a myšacími peritoneálnymi makrofágmi. Oproti tomu nemá IL-10 žiadny efekt na konštitutívnu expresiu TGFB monocytmi a skutočne regulačné zvyšuje produkciu monocytov IL-IRa. Tieto údaje získané in vitro sú podporované in vivo experimentmi ukazujúcimi, že neutralizácia IL-10 s použitím špecifických monoklonálnych protilátok vedie u myší k vzrastu hladín cirkulačného TNFa a IL-6. Bolo testované, či sa schopnosť IL-10 potlačovať produkciu TNFa, IL-1 a IL-6 kombinovaná s jeho schopnosťou zvyšovať hladinu IL-IRa môže uplatniť pri ochrane myší pred endotoxínom indukovaným šokom.
Príklad El. Účinok IL-10 na letálnu endotoxémiu u myší
Myši týždňov staré samičky BALB/c myší boli získané od Simonson Laboratories (Gilroy, CA).
Reagencie
Lipopolysacharid (LPS) z Escherichia coli sérotypu 0111 :B4_ bol získaný od Sigma Chemical Co. Rekombinantný myšací IL-10 bol exprimovaný v E. coli a vysoko špecificky purifikovaný afinitnou purifikáciou a ionexovou chromatografiou. Tento materiál obsahoval minimum endotoxínu a zostal stabilný pri 4 °C najmenej 4 mesiace. Špecifická aktivita myšacieho IL-10 bola vyhodnocovaná testom inhibície syntézy cytokínov, pozri Fiorentino a kol. (1989) J. Expt 1. Med. 170, 2081 - 2095, a kostimulačným testom žírnych buniek MC/9, pozri Thompson-Snipes a kol. (1991) J. Exp. Med. 173, 507 - 510. Neutralizačné protilátkové experimenty využívali 2A5 potkaniu IgGl anti-mIL-10 m monoklonálnu protilátku alebo izotypovou kontrolou označenú protilátku GL113.
Test TNFa
Sérové hladiny TNFa boli získané použitím špecifického cytokínového ELISA testu.
Skupine 20 HALB/c myší bola intraperitoneálne indikovaná buď letálna dávka samotného LPS alebo rovnakého množstva LPS spolu s rôznymi množstvami rekombinant ného mIL-10. V niektorých experimentoch tohto typu boli myši celkom ochránené pred úmrtím vyplývajúcim z LPS-indukovaného šoku tým, že bolo vo zvieratách administro vane 0,5 pg, 1,0 pg alebo 10 pg IL-10 súčasne s LPS (obr. 21). V niektorých z týchto experimentov bola tiež pozorovaná čiastočná ochrana u myší s dávkami 0,1 pg alebo 0,05 pg IL-10 v čase LPS administrácie (obr. 21).
Príklad E2. Neutralizácia ochranného účinku anti-IL-10 protilátkami
Ochrana pred letálnou endotoxémiou sprostredkovaná IL-10 môže byť blokovaná predchádzajúcou administráciou neutralizačných anti-IL-10 protilátok, ale nie izotypovou kontrolou protilátok (obr. 22), čo potvrdzuje špecificitu tohto účinku.
Príklad E3. Dlhodobý účinok oneskorenej administrácie IL-10
Kinetické štúdie ukázali, že IL-10 zostáva dlhodobo účinný pri ochrane pred letálnou endotoxémiou, dokonca i pri administrácii IL-10 30 minút po injikovaní LPS (obr. 23). Ale ďalšie oneskorenie v administrácii IL-10 podstatne znižuje ochranný účinok a pri administrácii IL-10 5 hodín po injikovaní LPS nebol pozorovaný žiadny ochranný účinok (obr. 23).
Príklad E4. Účinok IL-10 na TNFa
Letálna endotoxémia je nežiaduca zápalová reakcia sprostredkovaná monokínmi. Ukázalo sa, že IL-10 potlačuje produkciu monokínov aktivovanými makrofágmi a monocytmi in vitro, čo naznačuje, že ochrana sprostredkovaná IL-10 odrážala potlačenie produkcie monokínov v odpovedi indukovanej endotoxínom. Séra odobrané 1, 2 a 3 hodiny po injekcii LPS s alebo bez IL-10 indikovali silnú redukciu hladín cirkulačného TNFa vo zvieratách s ochranou IL-10. Pretože anti-TNF protilátky podobne chránia myši pred letálnou endotoxémiou, je pravdepodobné, že IL-10-indukovaná supresia TNFa prinajmenšom prispieva k ochrannému účinku proti letálnej endotoxémii, ktorý tento cytokín má. Ďalšie účinky IL-10 na funkciu makrofága/monocytu môžu tiež prispievať k jeho schopnosti chrániť pred letálnou endotoxémiou. In vitro štúdie indikovali, že IL-10 nepotlačuje len IL-1 a IL-6, ale tiež regulačné zvyšuje hladinu IL-IRa, čo tiež napomáha ochrane pred letálnou endotoxémiou. To naznačili experimenty s neutralizačnými anti-cytokínovými protilátkami alebo s priamou administráciou IL-IRa.
Štúdia F. Kontinuálna administrácia anti-IL-10 protilátky depletuje myšacie Ly-1 B bunky, ale nie konvenčné B bunky
Zhrnutie
Ly-1 B bunky majú odlišnú schopnosť kontinuálnej sebaobnovy a môžu byť ďalej odlíšené od konvenčných B buniek na základe výrazne zvýšenej konštitutívnej a indukovateľnej produkcie nedávno opísaného cytokínu IL-10. Bolo testované, či IL-10 účinkuje buď ako autokrinný alebo parakrinný rastový faktor pre Ly-1 B bunky, a to kontinuálnym pôsobením monoklonálnej potkanej IgM protilátky špecificky neutralizujúcej mIL-10 na myši od narodenia do veku 8 týždňov. Myši, na ktoré bolo takto pôsobené, postrádali rezidentné peritoneálne Ly-1 B bunky, mali vysoko redukované hladiny sérového IgM a neboli schopné in vivo generovať signifikantné imunitné odpovede na intraperitoneálne injekcie al,3-dcxtranu alebo fosforylcholínu, čo sú antigény, pre ktoré sú B bunky v Ly-1 podsystéme B bu niek. Naopak konvenčné slezinné B bunky myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 boli normálne vzhľadom na celkový počet, fenotypu a in vitro citlivosti k mitogénom B buniek a thymus-dependentnému trinitrofenylhemocyanínu z prílipok (TNP-KLH). Mechanizmus deplecie Ly-1 B buniek je zrejme podobný mechanizmu zvýšenia endogénneho IFNy v myšiach podrobených pôsobeniu anti-IL-10, pretože koadministrácia neutralizačných anti-IFNy protilátok podstatne obnovuje počet rezidentných peritoneálnych Ly-1 B buniek v týchto myšiach. Tieto výsledky radia IL-10 k regulátorom vývoja Ly-1 B buniek a opisujú proces špecifickej deplecie Ly-1 B buniek, čo dovoľuje následné zhodnotenie role týchto buniek v imunitnom systéme.
Ly-1 B bunky obsahujú 2 % B buniek dospelej myši a majú niekoľko zaujímavých vlastnosti, ktoré ich odlišujú od konvenčných B buniek: (a) hoci ťažko detegovateľné vo väčšine primárnych a sekundárnych lymfatických tkanív, sú prítomné vo vysokých obsahoch v peritoneálnych a pleurálnych dutinách a črevných lymfatických tkanivách, (b) vyvíjajú sa a prevládajú v ranných fázach ontogenézy a majú schopnosť sebaobnovy počas života zvieraťa, (c) produkujú obmedzené spektrum protilátok s nízkou afinitou, ktoré sú ale vysoko reaktívne proti svojím vlastným determinantom a nezdá sa, že by podliehali maturácii somatickou mutáciou, (d) generujú väčšinu IgM nájdeného v sére a produkujú všetky protilátky vyvolané bakteriálnymi determinantmi, ako je fosforylcholín a al,3-dextran. I keď nie je ich presná rola vo funkcii imunitného systému a bakteriálnej imunity jasná, existujú rôzne vyspelé modely založené na špecifite protilátok produkovaných Ly-1 B bunkami. Hrajú tiež určitú rolu pri odstraňovaní poškodených alebo opotrebovaných buniek, ako sú o. i. starnúce erytrocyty a tiež v modulácii spektra protilátok generovaných behom vývoja. Zistili sme, že Ly-1 B bunky sú potentnými producentmi IL-10, imunosupresívneho cytokínu, ktorý regulačné znižuje produkciu niektorých monokínov a cytokínov T buniek, zvyšuje možnosť imunoregulácie B bunkami. Mnohé z týchto vlastností sú ťažko vyhodnotiteľné u ľudí, ale boli už nájdené populácie ľudských B lymfocytov nesúcich Ly-1 s podobnými vlastnosťami.
Príklad Fl. Kontinuálna neutralizácia IL-10 depletuje myšacie Ly-1 B bunky
Myši
Strednedobo gravidné BALB/c a C3H/HeJ myši boli získané od Simonson Laboratory (Gilroy, CA).
Pôsobenie anti-IL-10
5-10 BALB/c myší vyhovejúceho veku bolo peritoneálne injikovaných 3x týždenne od narodenia do veku 8 týždňov neutralizujúcou potkaniou IgM protilátkou anti-m-IL-10 označenou ako SXC.l (0,2 mg/injekcia pre prvý týždeň, 0,5 mg/injekcia pre druhý týždeň, 1,0 mg/injekcia pre tretí až ôsmy týždeň), ekvivalentnými množstvami J5/D označeného takto izotypovou kontrolou alebo ekvivalentnými objemami (100 alebo 200 μΐ) PBS (fosfátom pufrovaný salín). Pre porovnanie boli do všetkých experimentov začlenené BALB/c myši vyhovejúceho veku, ktoré neboli podrobené pôsobeniu týchto látok. Protilátky SXC. 1 a J5/D boli získané z hybridomálnych supernatantov bez prítomnosti séra a purifikované dvoma po sebe idúcimi precipitačnými krokmi s použitím 35 % sulfátu amónneho. V niektorých experimentoch myši dostali podobné množstvo zvláštnej potkanej IgGl protilátky anti-myšacej-IL-10 označenej ako 2A5 alebo jej izotypu GL113. Tieto ďalšie protilátky boli administrované inlraperitoneálne v množ29 stvách 0,5 mg/injekcia pre prvý týždeň, 1,0 mg/injekcia pre druhý týždeň, 2,0 mg/injekcia pre tretí až ôsmy týždeň.
Imunofluorescencia
Premyté bunky boli farbené kombináciou nasledujúcich látok: fluorescenčné značená protilátka anti-myšací IgM (DS-1, Pharmingen, San Diego, CA), biotinylovaná potkania protilátka anti-myšací IgD (1 l-26c, pripravená J. Keameym), fluorescenčné značená protilátka anti-myšací CD3 (145-2C11, Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN, Caltag Labs., South San Francisco, CA). Biotinylované reagencie boli použité spoločne so streptavidínom konjugovaným fykoerythrínom (Becton Dickinson a Co., Mountain View, CA). Bunky boli analyzované s použitím prístroja FACScan a mŕtve bunky boli vylúčené na základe uhlu rozptylu. Výsledky ukazujú fluorescenčné intenzity 5000 živých buniek počítaných v každej experimentálnej skupine.
Protilátkové ELISA testy
Vzorky séra zhromaždené po 8 týždňoch experimentu boli testované na prítomnosť myšacieho IgM s použitím „sendvičového“ ELISA testu, kde bolo 5 pg/ml potkanieho anti-myšacieho IgM (R8-103, Pharmingen) prichytených na PVC mikrotitračné misky, ako štandard boli pridané zriedené vzorky séra alebo zmes rôznych purifikovaných myšacích IgM proteínov z myelomu a imunitné komplexy boli postupne detegované s použitím biotinylovaného potkanieho anti-myšacieho IgM (R 19-15, Pharmingen) a peroxidázy z chrenu konjugovanej avidínom (CalBiochem Corp., La Jolla, CA) s 1 mg/ml substrátu (2,2-azinobis[3-etyl-bcnztiazolin] sírová kyselina, Sigma Chemical Corp.).
Špecifické imunitné odpovede na fosforylcholín, al, 3-dextran boli zistené po opakovanej imunizácii anti-IL-10 alebo intraperitoneálnej injekcii 0,5 ml salínu u kontrolných myší alebo 50 pg al,3-dextranu z Leuconostoc mesantroides (láskavosťou Dr. SLodki, U.S. Department of Agriculture Agricultural Research service) alebo 2 x 108 tepelne umŕtvených Streptococcus pneumoniae ako zdroja fosforylcholínu. Séra od všetkých myší boli zhromaždené po 7 dňoch a testované na protilátky špecifické pre al, 3-dextran alebo fosforylcholín špecifickými ELISA testami. Špecifické odpovede protilátok na TNP-KLH boli stanovené po intraperitoneálnej imunizácii myší 10 pg TNP-KLH a séra pre IgM analýzu boli odobrané po 7 dňoch a po ďalších 10 a 14 dňoch pre IgG analýzu. TNP-špecifické protilátky boli kvantifikované s použitím ELISA. Vo všetkých prípadoch bolo pôsobenie anti-ZL-10 medzi imunizáciou a odberom séra kontinuálne.
IFNy ELISA
Vzorky séra zhromaždené od myší, na ktoré bolo pôsobené anti-IL-10 a od kontrolných myší, boli testované na myšací IFNy cytokín-špecifickými ELISA testami.
Samčekovia a samičky BALB/c myší boli 3 x týždenne od narodenia do veku 8 týždňov injikované stupňovanými dávkami neutralizujúceho potkanieho IgM anti-m-IL-10 mAb označeného ako SXC. 1 a následne testované na počet a funkciu Ly-1 B buniek. Kontrolné skupiny myší príslušného veku, ktoré neboli imunizované ani na nich nebolo pôsobené PBS alebo iným potkaním IgM označeným J5/D, boli zahrnuté pre porovnanie. Protilátky boli administrované buď intraperitoneálne alebo podkožné bez zvláštnych zmien v reakciách. Týmto spôsobom bola získaná priemerná hladina sérového potkanieho IgM po 8 týždňoch ako 50 mg/ml. Tento údaj bol získaný potkaním-IgM-špecifickým ELISA testom tak pre SXC.l, ako i pre J5/D. Po týždennom pôsobení boli myši podrobené pôsobeniu antiIL-10 nerozoznateľné od troch kontrolných skupín myší spĺňajúcich nasledujúce kritériá: celková telesná hmotnosť, celková histologická kontrola pečene a sleziny, thymu, lymfatických tkanív, čriev, pľúc a peritonea, ďalej proporcie B a T buniek a non-B/T buniek v slezine, lymfatických tkanivách a thymu. Naopak imunofluorescenčné zistenie fenotypu buniek získaných z 5 - 10 myší zahrnujúcich každú zo 4 experimentálnych skupín ukázalo prekvapivú depleciu IgM+ a lgD+ buniek v myšiach podrobených pôsobeniu anti-IL-10 (SXC.l), ale nie v iných kontrolných zvieratách (obr. 24). Identické dáta boli získané z 24 nezávislých experimentov vrátane dvoch s C3H/HeJ myšami a niekoľkých iných so zvláštnou potkaniou IgGl anti-IL-10 neutralizačnou protilátkou. U zvierat s pôsobením anti-IL-10 bola zaznamenaná deplecia peritoneálnych buniek nesúcich B220 ako bolo stanovené imunofluorescenciou a LPS-citlivými peritoneálnymi bunkami, ako bolo stanovené podľa schopnosti týchto buniek inkorporovať 3H-thymidín po 3 dňoch kokultivácie s 50 pg/ml LPS. Tieto výsledky naznačujú, že BALB/c myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 neobsahujú vo svojich peritoneálnych dutinách žiadne B bunky na rozdiel od normálneho stavu, keď možno v týchto dutinách bežne nájsť 1 - 5 x 106 B buniek. Je významné, že trojfarebná imunofluorescencia peritoneálnych dutín 8 týždňov starých BALB/c myší dokázala málo (< 5 %) konvenčných B buniek. Výsledky uvedené v obr. 24 preto reprezentujú prevládajúcu depleciu Ly-1 B buniek. I cez túto prekvapivú depleciu peritoneálnych B buniek nebola celková celularita peritoneálnych dutín myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 podstatne odlišná od myší z kontrolných skupín. Ďalšia imunofluorescečná analýza, spoločne s diferenciálnym hemopoietickým sčítaním buniek ukázala, že strata B buniek bola kompenzovaná vzrastom počtu pertoneálnych CD4+ T buniek a granulocytov vo zvieratách podrobených pôsobeniu anti-IL-10. Ďalšie dve pozorovania indikovali, že k deplecii Ly-1 B buniek v myšiach podrobených pôsobeniu anti-IL-10 došlo prostredníctvom imunitného systému a nebola obmedzená na peritoneálne dutiny. Najprv myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 mali v porovnaní s 3 kontrolnými skupinami prekvapivé 90 - 100 % zníženie hladiny sérového IgM, ako bolo zistené pre myši špecifickými ELISA testami (obr. 25). Ďalej bola u týchto myší zistená hlboká deficiencia schopnosti generovať in vivo odpovede protilátok na al,3-dextran alebo fosforylcholín (obr. 26), t. j. dva thymusdependentné antigény, pre ktoré sa funkčne zodpovedajúce B bunky nachádzajú v Ly-1 B bunkových subsystémoch.
Príklad F2. Myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 obsahujú fenotypovo a funkčne normálne konvenčné B bunky
Vzhľadom na prekvapivý účinok anti-IL-10 na Ly-1 B bunky bolo dôležité starostlivo vyhodnotiť stav konvenčných B buniek v týchto zvieratách. Ako bolo uvedené, celkový počet bielych krviniek v slezinách myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 alebo kontrolných zvierat sa podstatne nelíšil v 24 nezávislých experimentoch. Obr. 27 ukazuje, že sa proporcie B220+ B buniek, CD3+ T buniek a nonB/T buniek (B220 CD3’) nelíšia v žiadnej zo 4 experimentálnych skupín myší. Ekvivalentné údaje boli získané z porovnania s Ig+ B bunkami alebo CD4+ T bunkami. Tieto údaje indikujú, že celkový počet slezinných B buniek tohto fenotypu v myšiach podrobených pôsobeniu anti-IL-10 je rovnaký ako v každej kontrolnej skupine. Imunokompctcncia konvenčných B buniek v myšiach podrobených pôsobeniu ant-IL-10 bola testovaná dvoma spôsobmi. Najprv myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 produkovali normálne IgM a IgG protilátky v odpovedi na injekciu thymus-dependentného antigénu TNP-KLH (obr. 28). Sekundárne odpovede na TNP-KLH boli v týchto myšiach tiež normálne. Ďalej slezinné B bunky z myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 mali normálne in vitro proliferatívne odpovede na 50 pg/ml LPS alebo anti-IgM protilátky (tab. Fl). Základné proliferatívne odpovede slezinných buniek u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 boli často 3 - 5 x vyššie než pri kontrolách. Tieto údaje dokopy dávajú tušiť, že konvenčné B bunky u myší podrobených pôsobeniu antiIL-10 sú kvantitatívne a funkčne nerozoznateľné od buniek myší z kontrolných súborov.
Tabuľka Fl. In vitro proliferatívna odpoveď slezinných buniek myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 a myší z kontrolných súborov na stimuláciu LPS, anti-IgM a antiCD3.
Skupina zvierat* 3H-thy»idín (cnp)
+0 +LPS +Anti-igM +Anti-CD3
bez pôsobenia 224.0 22.6 3.3 90.1
PBS 320.0 42.3 3.8 115.7
J5/D 547.0 46.7 2.9 135.2
SXC.l 2.8 61.6 7.2 96.4
Na zvieratá bolo pôsobené od narodenia do veku 8 týždňov, ako bolo opísané v obr. 1. Slezinné bunky (2 x 106/ml) získané z 3 myší v každej skupine boli kultivované po 3 dni v médiu, alebo médiu doplnenom 50 mg/ml LPS, 50 mg/ml kozou anti-myšacou-IgM protilátkou, alebo 5 mg/ml škrečou anti-myšacou-CD3 protilátkou. Pre anti-CD3 stimulácie boli mikrotitračné misky potiahnuté protilátkou pred pridaním slezinných buniek. Proliferácia bola vyčíslená via inkorporácia 3H-thymidínu po 16 hodinách, puls 1 mC/misku, 3H-thymidín, (NET 027, New England Nuclear, Boston, MA).
Príklad F3. Mechanizmus deplecie Ly-1 B buniek
Testy proliferácie
Slezinné bunky 2 x 106 z 3 myší z každej skupiny boli kultivované 3 dni v samotnom médiu alebo médiu doplnenom 50 pg/ml LPS alebo 50 mg/ml kozou anti-myšacouIgM protilátkou (0611 - 0201, Cappel Laboratories, Cochranville, PA), alebo 5 mg/ml škrečou anti-myšacou-CD3 protilátkou (láskavosťou D. J. Bluestonea, University of Chicago, Chicago, IL). Pre anti-CD3 stimulácie boli mikrotitračné misky potiahnuté protilátkou pred pridaním slezinných buniek. Proliferácia bola vyčíslená via inkorporácia 3H-thymidínu po hodinách, puls 1 mC/misku, 3H-thymidín, (NET 027, New England Nuclear, Boston, MA).
Bolo navrhnutých niekoľko možných mechanizmov na vysvetlenie deplecie Ly-1 B buniek u myší, na ktoré bolo pôsobené anti-IL-10. Tento účinok, ako sa zdá, nezahrnuje selektívnu cytotoxicitu pre Ly-1 B bunky podrobené pôsobeniu anti-IL-10 protilátok, ako injekcia rovnakých protilátok do dospelých myší nemal účinok na následnú obnovu celkových peritoneálnych buniek, alebo celkových peritoneálnych B buniek po 1, 2 alebo 3 dňoch (obr. 29). Za alternatívne vysvetlenie možno považovať možnosť, že deplecia Ly-1 B buniek odráža sekundárne konzekvencie v perturbancii niektorých iných endogénnych cytokínov. Myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 mali skutočne vyššie hladiny sérového IFNy (obr. 30), čo súhlasí s predchádzajúcim pozorovaním, že IL-10 je schopný znižovať produkciu IFNy Thl a NK bunkami in vitro. K zisteniu možnosti, že toto anti-IL-10-indukované zvýšenie hladiny IFNy je priamo alebo nepriamo zodpovedné za depleciu Ly-1 B buniek, boli myši od narodenia do dospelosti injikované kombináciou anti-IL-10 a anti-IFNy neutralizujúcimi protilátkami alebo anti-IL-10 a príslušnou protilátkou pre izotypovú kontrolu. Výsledky ukázali, že anti-IFNy protilátky (obr. 31) na rozdiel od izotypovej kontroly značne redukovali achopnosť pôsobenia anti-IL-10 depletovať myšacie peritoneálne Ly-1 B bunky. Je dôležité poznamenať, že kontinuálna administrácia samotnej anti-IFNy protilátky alebo kombinácie anti-IL-10 a anti-IFNy protilátok nemenila obnovenie celkových peritoneálnych buniek myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 alebo jeho izotypových kontrol. Tieto údaje podporujú myšlienku, že deplecia Ly-1 B buniek je aspoň čiastočne dôsledkom elevácie IFNy u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10.
Štúdia G. Modifikovaný imunologický stav myší, na ktoré bolo pôsobené anti-IL-10
Zhrnutie
Ako bolo uvedené, kontinuálne pôsobenie neutralizujúcej protilátky anti-IL-10 na myši od narodenia do dospelého veku viedlo ku špecifickej deplecii Ly-1 B buniek, zatiaľ čo konvenčné B bunky zostali čo sa týka počtu, fenotypu a funkcie normálne (Štúdia F). Ďalšia charakterizácia týchto zvierat ukázala, že myši podrobené pôsobeniu antiIL-10 môžu byť odlíšené od myší nepodrobených pôsobeniu protilátok alebo od izotypových kontrol pomocou niekoľkých ďalších kritérií. Myši podrobené pôsobeniu antiIL-10 majú značne zvýšené hladiny obehového TNFa a v mnohých prípadoch tiež obehového IL-6 a boli veľmi náchylné na úmrtie LPS-indukovaným šokom, monokínmi mediovanou zápalovou reakciou. Analýzy sérových imunoglobulínov u myši podrobených pôsobeniu anti-IL-10 ukázali pokles hladín sérového IgA spolu so skôr opísanou redukciou sérového IgM a prekvapivého poklesu hladín IgG2a a IgG2b. Ďalšie výskumy ukázali, že efekt deplecie Ly-1 buniek u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 nastáva iba dočasne, čo bolo preukázané nálezom obnovenia Ly-1 B buniek 8 týždňov potom, čo bolo prerušené podávanie anti-IL-10. Deplecia Ly-1 B buniek, ktorá nastala behom podávania anti-IL-10 bola, ako sa ukázalo, kompenzovaná vzrastom počtu peritoneálnych T buniek a granulocytov. Nakoniec sa ukázalo, že zatiaľ čo myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 neboli schopné produkovať protilátky na fosforylcholin a al, 3-dextran, majú normálne imunitné odpovede po intraperitoneálnych injekciách roztoku TNP-Ficoll. Tieto výsledky dávajú tušiť existenciu subkategórií thymus independentných polysacharidových antigénov typu II. Tieto údaje sú diskutované v kontexte implikácií pre roly IL-10 a Ly-1 B buniek v imunitnom systéme.
Imunitný systém je regulovaný rodinami rozpustných glykoproteínov nazývaných cytokíny, ktoré sú produkované radom hemopoietických a nonhemopoietických buniek. Extenzívna in vitro charakterizácia týchto imunoregulátorov viedla za posledných päť rokov ku koncepcii extenzívnej funkčnej pleiotropie a redundancie v cytokínovom systéme. Imunológovia teraz stoja pred nutnosťou vyhodnotiť či táto koncepcia presne odráža fyziologické roly cytokínov in vivo. Fyziologická rola recentne objaveného cytokínu IL10 je predmetom skúmania. Bohatý výpočet in vitro vlastností charakterizoval IL-10 ako potentný imunosupresant schopný regulačné znižovať produkciu niektorých monokínov a cytokínov a inhibovať prezentáciu antigénov pri niektorých (nie všetkých) antigén prezentujúcich buniek. Rovnako obsažný zoznam stimulačných vlastností ukazuje niektoré cytokíny ako rastové kostimulátory thymocytov, peri ferálnych T buniek, B buniek a žírnych buniek, ako amplifíkátory rozvoja a funkcie cytotoxických T buniek a ako induktory viability a diferenciácie B buniek. S cieľom postihnúť fyziologickú rolu IL-10 in vivo boli myši od narodenia do dospelosti injikované neutralizujúcou monoklonálnou protilátkou anti-IL-10. Ranné analýzy preukázali, že toto pôsobenie viedlo k výraznej deplecii minoritných subsystémov B lymfocytov, zvaných Ly-1 alebo B-l B bunky, čo implikuje, že IL-10 je regulátor vývoja Ly-l/B-1 B buniek.
Ly-1 B bunky sú subpopuláciou B lymfocytov, ktoré sú vysoko prevládajúce v zárodočných a neonatálnych lymfatických tkanivách ľudí a myší, ale ktoré boli iba v malom množstve nájdené v imunitných systémoch dospelých subjektov. Zatiaľ čo sú Ly-1 B bunky sotva zistiteľné v primárnych a sekundárnych lymfatických tkanivách dospelých subjektov, sú peritoneálne a pleurálne dutiny dospelých myší na tieto bunky vysoko bohaté a sú v malých množstvách prítomné, i v obehu dospelých ľudí. Ich extenzívna charakterizácia v myšacom systéme odhalila mnoho zložitých vlastností vrátane obmedzenia repertoáru protilátok s nízkou afinitou, ktoré nepodliehajú ľahko somatickým mutáciám a sú značne reaktívne proti autoanti génom a komponentom bakteriálnych bunkových stien. Rekonštitučné experimenty na myšiach ukázali, na rozdiel od konvenčných B buniek, že Ly-1 B bunky sú schopné sebaobnovy po celý život hostiteľa a generujú väčšinu sérového IgM a každú imunitnú odpoveď na niektoré bakteriálne determinanty, ako je fosforylcholin a al,3-dextran. Predchádzajúci opis Ly-1 B buniek ukázal na ich odlišnosť od konvenčných B buniek na základe vysoko zvýšenej a indukovateľnej produkcie IL-10, zvyšujúcu možnosť širokej imunoregulačnej roly týchto buniek. I cez všetky výskumy však zostáva rola Ly-1 B buniek v imunitnom systéme nejasná.
Myši, na ktoré bolo kontinuálne od narodenia do dospelosti pôsobené neutralizujúcou protilátkou anti-IL-10 mali depleciu Ly-1 B buniek, čo bolo zistené na základe neprítomnosti ich peritoneálnych B buniek a faktu, že drasticky poklesli hladiny sérového IgM a imunitné odpovede na fosforylcholin a al,3-dextran. Deplecia Ly-1 8 buniek bola nájdená v druhotnej konzekvencii so zvýšením endogénneho IFNy a môže jej byť predchádzané koadministráciou s anti-IFNy protilátkami. Je tu tiež opísaná konzekvencia špecifickej deplecie Ly-1 B buniek a endogénneho IL-10 v následnom imunitnom stave týchto myší.
Príklad Gl. Účinok pôsobenia anti-IL-10 na endogénne hladiny cytokínov u myší
Myši
Strednedobo gravidné BALB/c myši boli získané od Simonson Laboratory (Gilroy, CA).
Pôsobenie anti-IL-10
5-10 BALB/c myší vyhovujúceho veku bolo peritoneálne injikovaných od narodenia do veku 8 týždňov oboma anti-IL-10 protilátkami podľa nasledujúcich protokolov. V niektorých experimentoch boli myši injikované 3 x týždenne SXC.l potkaniou IgM protilátkou anti-m-lL-10, pozri Mossmann a kol. (1990) J. Immunol. 145. 2938 - 2945, (0,2 mg/injekcia pre prvý týždeň, 0,5 mg/injekcia pre druhý týždeň, 1,0 mg/injekcia pre tretí až ôsmy týždeň), ekvivalentnými množstvami J5/D označeného takto izotypovou kontrolou alebo ekvivalentnými objemami (100 alebo 200 pl) PBS (fosfátom pufrovaný salín). V ďalších experimentoch myši injikované 2 x týždenne potkaniou IgGl protilátkou anti-myäací-IL-10 označenou ako 2A5 (0,2 mg/injekcia pre prvý týždeň, 0,5 mg/injekcia pre druhý týždeň, 1,0 mg/injekcia pre tretí až ôsmy týždeň), ekvivalentnými množstvami jej izotypu označeného GL113 alebo ekvivalentnými objemami (100 alebo 200 ml) PBS (fosfátom pufrovaný salín) . BALB/v myši vyhovujúceho veku nevystavené pôsobeniu protilátok boli zahrnuté do experimentov ako kontrola. Všetky protilátky boli získané z hybridomálnych supernatantov bez prítomnosti séra a purifikované precipitáciou s použitím sulfátu amónneho. Po ukončení podávania protilátok boli ľadviny, brzlíky, lymfatické uzliny alebo peritoneálne bunky odobrané z každej zo štyroch skupín myší analyzované flow cytometriou a funkčnými testami.
Cytokinové ELISA testy
Vzorky sér od myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 alebo od kontrol boli testované na myšací TNFa alebo TL-6 na cytokíny špecifickými ELISA testami.
Kontinuálne pôsobenie anti-IL-10 na myši od narodenia do dospelosti vedie po ôsmich týždňoch k prítomnosti značných množstiev IFNy v sére, na rozdiel od myší z kontrolných súborov alebo izotypových kontrol, ktoré postrádajú detegovateľné množstvá IFNy v sére. S cieľom preskúmať perturbáciu endogénnych cytokínov následkom pôsobenia anti-IL-10 boli séra odobrané po 8 týždňoch pôsobenia testované na prítomnosi TNFa alebo IL-6 na cytokíny špecifickými ELISA testami. Séra myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 obsahovali značne zvýšené hladiny TNFa (obr. 32), a často tiež zvýšené hladiny IL-6 (obr. 33). Zvýšenie hladín TNFa a IL-6 u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 je konzistentné s opísanou schopnosťou TL-10 potlačovať produkciu monokínov in vitro.
Príklad G2. Účinok pôsobenia anti-IL-10 na hladinu myšacieho sérového Ig
Endotoxínom indukovaný šok
Myši boli intraperitoneálne injikované dávkami endotoxínu (lipopolysacharidy z E. coli o sérotype 0111.B4, Sigma Chemical Co.) v rozsahu 1 - 500 pg. Počet myší, ktorc prežili, bol sledovaný počas nasledujúcich 1 - 6 dní.
Účinok pôsobenia anti-IL-10 na hladiny endogénnych monokínov bol ďalej analyzovaný a bola tiež vyhodnotená náchylnosť zvierat k LPS-indukovanému šoku, monokínmi sprostredkovanej zápalovej reakcie. Skôr publikované údaje ukázali, že neutralizačné monoklonálne protilátky proti TNFa, IL-1 alebo IL-6 a fyziologický IL-1 antagonista nazývaný IL-IRa účinne chráni, myši pred LPS-indukovaným šokom. Tieto experimenty indikujú, že myši injikované buď SXC.l (potkaní IgM) alebo 2A5 (potkaní IgG|) anti-IL-10 protilátkami od narodenia do 8 týždňov veku boli veľmi náchylné na úmrtie LPS-indukovaným šokom (obr. 34). Zatiaľ čo LPS LD10o u 8 týždňov starých BALB/c myší (zariadenie DNAX) bola > 380 pg/myš i. p., usmrtilo veľmi malé množstvo endotoxínu (1 pg) väčšinu myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 (obr. 34). Presný mechanizmus tejto zvýšenej náchylnosti nebol ešte určený, ale tieto údaje sú konzistentné so všeobecnou reguláciou zvýšením zápalových monokínov u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10.
ELISA testy na protilátky
Vzorky sér odobrané po 8 týždňoch pôsobenia holi testované na prítomnosť všetkých izotypov myšacích imunoglobuiínov pomocou ELISA testov v sendvičovom uspo riadaní. Pre fixáciu na nosič boli použité nasledujúce protilátky: potkaní anti-myšací IgGl (3096, láskavosťou R. Coffmana, DNAX), potkaní anti-myšací IgG2a (R8-103, Pharmingen, San Diego, CA), potkaní anti-myšací IgG2b (R9-91, Pharmingen), potkaní anti-myšací IgG3 (R2-38, Pharmingen), potkaní anti-myšací IgA (R5-140, Pharmingen), potkaní anti-myšací IgE (EM95, láskavosťou R. Coffmana). Pre poťahovanie nosiča bola použitá koncentrácia protilátok 1 - 5 pg/ml. Pre toto sendvičové usporiadanie ELISA testov boli použité tieto biotinylované protilátky: potkaní anti-myšací IgGl (3098B, láskavosťou R. Coffmana, DNAX), potkaní anti-myšací IgG2a (R19-15, Pharmingen, San Diego, CA), potkaní anti-myšací IgG2b (R12-3, Pharmingen), potkaní anti-myšací IgG3 (R40-82, Pharmingen), potkaní anti-myšací IgA (2740B, láskavosťou R. Coffmana), potkaní anti-myšací IgE (R35-118, Pharmingen), v koncentrácii 1 - 3 pg/ml v konjunkcii so streptavidínom konjugovanou chrenovou peroxidázou (CalBiochem., La Jolla, CA) s 1 mg/ml substrátu [2,2-azinobis-(3-etylbenztiazolín)sírová kyselina, Sigma]. ELISA testy boli kvantifikované použitím purifikovaných imunoglobulínov myšacieho myelomu ako štandardu.
Kontinuálne pôsobenie anti-lL-10 na myši od narodenia do dospelosti vedie ku značnej deplecii hladín sérového IgM, na rozdiel od normálnych hladín sérového IgM myši z izotypových kontrol. Meranie ďalších izotypov imunoglobulínov v sérach odobraných po 8 týždňoch pôsobenia je uvedené na obr. 35. Hladiny každého imunoglobulínového izotypu v troch kontrolných skupinách myší (t. j. nepodrobených pôsobeniu, s pôsobením PBS alebo podrobené pôsobeniu protilátky izotypovej kontroly) sa významne nelíšili od skôr opísaných rozsahov hladín sérového Ig v normálnych myšiach. Boli však pozorované početné zmeny v hladinách sérového Ig v myšiach podrobených pôsobeniu anti-IL-10. Tieto myši mali značné zníženie hladín sérového IgA, čo doplňuje skôr opísané zníženie sérového IgM a prekvapivý vzrast IgG2a a IgG2D (obr. 35). Zostávajúce izotypy (lgGb IgG3 a IgE) boli nezmenené alebo boli v týchto experimentoch 2 až 4 x vyššie.
Príklad G3. Deplecia Ly-1 B buniek u myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 je dočasná
Imunofluorescencia
Premyté bunky boli farbené kombináciami nasledujúcich reagencií: fluoresceinovaná anti-myšacia IgM protilátka (DS-1, Pharmingen, San Diego, CA), biotinylovaný potkaní anti-myšací IgD (ll-26c, láskavosťou J. Kearneya, U. Birmingham, Ala.), fluoresceinovaný anti-mousa CD3 (145-2C11, Boehringer- Mannheim, Indianapolis, IN), biotinylovaný anti-myšací B220 (RA3-6B2, Caltag, S F.) a biotinylovaná potkania anti-myšacia granulocyt/eosinofilná protilátka (8C5, láskavosťou R. Coffmana, DNAX). Biotinylované reagencie boli použité spoločne s fykoerytrínkonjugovaným streptavidínom (Becton-Dickinson, Mountain View, CA). Bunky boli analyzované s použitím prístroja FACScan a mŕtve bunky boli vylúčené. Výsledky ukazujú fluorescenčné intenzity 5000 živých buniek počítaných z každej experimentálnej skupiny.
Myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 boli vyhodnotené po prerušení pôsobenia a bola stanovovaná ireverzibilita deplecie Ly-1 B buniek. Niektoré skupiny myší boli injikované anti-IL-10 od narodenia do 8 týždňov veku, a potom bolo pôsobenie prerušené. V každej skupine bola zisťovaná prítomnosť peritoneálnych Ly-1 B buniek, a to hneď alebo v rôznych časových intervaloch behom 8 týždňov po ukončení pôsobenia. Je dôležité, že neboli pozorované výz namné zmeny v celkových počtoch peritoneálnych buniek odobraných v rôznom čase. V niektorých experimentoch myši zostali bez peritoneálnych Ly-1 B buniek po 3 počiatočné týždne od ukončenia pôsobenia anti-IL-10. Po tomto časovom intervale sa Ly-1 B bunky začali znova objavovať v peritoneálnych dutinách spolu s normálnymi doplnkami Ly-1 B buniek pozorovanými 8 týždňov po ukončení pôsobenia anti-IL-10 (obr. 36). Rekonštitúcia kompartmentov peritoneálnych B buniek bola charakterizovaná počiatočným objavením sa B220br'EhtIgMtiul1 B buniek asi 4 týždne potom, čo bolo prerušené pôsobenie anti-IL-10 s následným objavením sa B220briei’lIgMllul1 B buniek o niekoľko týždňov neskôr (obr, 36).
Príklad G4. Zvýšenie počtu peritoneálnych T buniek a granulocytov u myši podrobených pôsobeniu anti-IL-10
Diferenciálne stanovenie počtu hemopoietických buniek
Suspenzie slezinných buniek alebo peritoneálne premytia boli použité na preparáciu cytospínov pre bunkovú morfologickú analýzu. Vzorky boli farbené Wright sGiemsa (Sigma, St. Louis) a mikroskopicky analyzované na lymfocyty, makrofágy, granulocyty, eosinofily a žírne bunky.
Zatiaľ čo u myší podrobených kontinuálnemu pôsobeniu od narodenia do 8 týždňov veku nastala dcplccia peritoneálnych B buniek, celkový počet peritoneálnych buniek, ktoré mohli byť získané z týchto myší, sa významne nelíšil od kontrol. Diferenciálne stanovenie počtu hemopoietických buniek z peritoneálnych buniek odobraných z myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 odrážalo vzrast peritoneálnych granulocytov/eosinofilov a zdanlivých non-B lymfocytov (tab. Gl). Stanovenie fenotypu pomocou povrchových markerov peritoneálnych buniek z myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 odhalilo vzrast počtu Ly-1-bright Ig-negatívnych buniek (obr. 37), CD3-pozitivnych Ig-negatívnych buniek, Macl-bright Ig negatívnych buniek (obr. 38) a 8C5-bright Ig-negatívnych buniek. Tieto analýzy indikovali vzrast počtu Lyl-pozitívnych, CD3-pozitívnych T lymfocytov a potvrdili (tab. Gl) vzrast počte granulocytov, ktoré exprimujú Macl a 8C5 povrchové markery·
Tabuľka Gl. Pomer hemopoietických subpopulácií v myšiach podrobených pôsobeniu anti-IL-10 a v myšiach z kontrolných súborov.
1 o P Makrotágy Neutrofily Eosinofily Zím· bunky
P«riton«u> +
Bez pôsobenia 74.0 22.0 1.8 1.7 0.5
Pôsobenie PBS 66.0 29.0 1.4 34.3 0.3
Pôsob, izotypovej kontroly 64.0 31.0 1.2 4.5 0.3
Pôsobenie anti-IL-10 44.0 22.0 18.0 16.0 0.0
Slezina 4
Bez pôsobenia 94.0 2.7 2.3 0.5 0.0
Pôsobenie PBS 92.0 3.6 3.6 1.4 0.0
Pôsob, izotypovej kontroly 96.0 1.2 1.8 0.6 0.0
Pôsobenie anti-IL-10 92.0 2<4 5.0 0.9 0«0
+ Všetky skupiny mali zhruba rovnaký počet peritoneálnych a slezinných buniek/myš, čísla predstavujú percentá celkového počtu nájdených buniek.
Príklad G5. Odpoveď myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 na thymus-independentný antigén TNP-Ficoll
Špecifické protilátkové odpovede
Špecifické protilátkové odpovede na TNP-Ficoll boli stanovené po opakovanej intraperitoneálnej imunizácii myší 10 pg TNP-Ficoll (poskytnuté Dr. J. Mondom, USUHS) a odbere sér 5 alebo 10 dní neskôr. Medzi antigénovou imunizáciou a odoberaním sér bola kontinuálne prevádzaná injikácia anti-IL-10 alebo kontrolnej protilátky. TNP-špecifické protilátky boli kvantifikované ELISA testom.
Myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 majú zníženú schopnosť získať in vivo imunitné odpovede na dva thymus-dependentné antigény II typu, íbsforylcholín a al, 3-dextran. Obr. 39 ukazuje, že myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 majú normálne in vivo imunitné odpovede na tretí thymue-independentný antigén typu IL TNP-Ficoll. Táto citlivosť je v konzistencii s našimi predchádzajúcimi pozorovaniami, že slezinné B bunky myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 majú normálne proliferatívne odpovede následne po stimulácii anti-IgM protilátkami, predpokladanými polyklonálnymi analógmi thymus-independentných antigénov IL typu.
Štúdia H. Kontinuálna administrácia anti-IL-10 protilátok oneskoruje začiatok autoimunity u NZB/W myší
Zhrnutie
Kontinuálna administrácia anti-IL-10 protilátok viedla u BALB/c myší k modifikácii endogénnych hladín autoprotilátok, plex TNFa a IFNy, troch imunitných mediátorov so známou schopnosťou pôsobiť na vývoj autoimunity pri „lupus-prone“ NZB/W myší. S cieľom preskúmať tieto konzekvencie neutralizácie IL-10 u NZB/W myši, boli tieto myši injikované od narodenia do 8 - 10 týždňov veku injikovanc 2 - 3 x týždenne anti-IL-10 protilátkami alebo protilátkami pre izotypovú kontrolu. Pôsobenie anti-IL-10 výrazne oneskoruje začiatok autoimunity u NZB/W myší, čo bolo zistené buď skúmaním počtov zvierat, ktoré prežili, alebo rozvojom proteinurie, zápalu ľadvín a autoprotilátok. U myší podrobených pôsobeniu vzrástol behom 9 mesiacov počet myší, ktoré prežili, z 10 % na 80 % vzhľadom na kontroly. Táto ochrana proti autoimunite nastala v dôsledku anti-IL-10-indukovanej regulácie zvýšením endogénneho 'TNFa, pretože chránené NZB/W myši rapídne rozvíjali autoimunitu potom, čo boli počas 30 týždňov do myší podrobených pôsobeniu anti-IL-10 vkladané neutralizačné anti-TNFa protilátky. Tieto údaje indikujú, že IL-10 antagonisty budú užitočné pri liečbe ľudskej kožnej erythematózy.
U (NZB x NZW) Fl hybridných myší sa prejavujú rôzne autoimunitné choroby, ktoré sa veľmi podobajú ľudskej erythematóze. NZB/W myši spontánne vyvíjajú fatálny imunokomplex sprostredkovaný glomerulonefritídou, a to u samičiek zhruba po 6 - 9 mesiacoch a u samčekov po 12-18 mesiacoch. Predchádzajúce pokusy definovať príčinu zvýšenia autoimunity u NZB/W myší boli sústredené na potenciálnu rolu MHC génov. Bolo zistené, že IFNy a cytokíny, ktoré regulačné zvyšujú expresiu MHC antigénov triedy II v mnohých bunkových typoch, akcelerujú rozvoj autoimunity v NZB/W myšiach. Niekoľko nedávnych štúdií naznačilo, že TNFa gén, ktorý je umiestnený s MHC komplexom, môže hrať rolu v patogenéze kožnej nefritídy u NZB/W myší. Tieto štúdie odhaľujú, že NZB/W myši produkujú výnimočne nízke hladiny TNFa, a to koreluje s reštrikčným fragmentom dlhého polymorfizmu v TNFa géne j a polymorfizmus v jednoduchom dinukleotidovom tandeme sa opakuje v 5 regulačnej oblasti TNFa génu. Príčinnosť týchto pozorovaní je implikovaná faktom, že substitučná terapia s použitím rekombinantného TNFa podstatne oneskoruje rozvoj nefritídy u NZB/W myší.
IL-10 je cytokín produkovaný podsystémami aktivovaných T buniek, B buniek a makrofágov, ktoré sprostredkovávajú rozmanitosť imunostimulačných a imunosupresívnych vlastností u myšacích i ľudských in vitro testov. V snahe vyhodnotiť fyziologickú rolu IL-10 boli BALB/c myši od narodenia do 8 týždňov veku kontinuálne podrobené pôsobeniu neutralizačných anti-IL-10 protilátok. Okrem týchto známych in vitro vlastností IL-10 sú myši podrobené pôsobeniu anti-IL-10 charakterizované zvýšením hladín endogénnych IFNy a TNFa. Zvýšenie IFNy naopak vedie k deplecii početne malého podsystému B lymfocytov, zvaných Ly-1 alebo CD5 alebo B-l B bunky, populácie, z ktorej je odvodená väčšina myšacích autoprotilátok. Tieto štúdie u normálnych myši naznačujú, že neutralizácia IL-10 môže mať u NZB/W myší priaznivé následky, t. j. vzrast endogénneho TNFa a zníženie produkcie autoprotilátok, alebo nepriaznivé následky, t. j. vzrast endogénneho IFNy. Sú tu uvedené celkové účinky kontinuálneho pôsobenia anti-IL-10 na rozvoj autoimunity u samičiek NZB/W myší. Jav, že neutralizácia IL-10 podstatne oneskoruje u týchto myší začiatok autoimunity, je následkom regulačného zvýšenia endogénneho TNFa.
Myši
NZB/W Fl myši boli namnožené v chovoch DNAX Research Inštitúte z NZB samičiek získaných z Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) a NZW samčekov získaných z Simonson Laboratories (Gilroy, CA). Iba samičky Fl myší však boli použité vzhľadom na ich rýchly počiatok autoimunity.
Pôsobenie anti-IL-10
Na skupiny 17 - 23 samičiek B/W Fl myší bolo pôsobené potkaním IgM mAb alebo IgG mAb proti IL-10, nazvaným SXC.l alebo JES 2A5. Na skupiny 21 - 23 samičiek B/W Fl myší vhodného veku bolo pôsobené vhodnými izotypovými kontrolami mAb nazvanými J5/D (IgM) alebo GL113 (IgG). Anti-IL-10 mAb a izotypové kontroly mAb boli odobrané vo forme ascitov z holých (nu/nu) myší, purifikované dvoma následnými precipitáciami síranom amónnym, dialyzované proti PBS a kvantifikované proteínovou elektroforézou a meraním optickej hustoty. Pôsobenie pozostávalo z troch častí: a) od narodenia do prvého týždňa veku bolo intraperitoneálne injikované 0,2 mg mAb/myš a to 4 x IgM alebo 2 x IgG, b) 2. týždeň 0,5 mg mAb/myš 3 x IgM alebo 2 x IgG a c) od 3. týždňa do dospelosti 1 mg mAb/myš 3 x IgM alebo 2 x IgG každý týždeň. Predchádzajúce štúdie indikovali, že tieto súbory zvierat udržovali koncentráciu potkanieho IgM v sére okolo hodnoty 50 pg/ml.
Posúdenie ľadvinového ochorenia
Proteinuria bola meraná kolorimetricky s použitím Albustix indikátorov (Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN) a klasifikovaná podľa nasledujúcich kódov: stopa = 10 mg/dl, 1 + = 30 mg/dl, 2 + = 100 mg/dl, 3 + = 300 mg/dl, 4 + = 1000 mg/dl. Histologická hĺbka glomerulonefritídy bola stanovená v rozmedzí 0 až 2 + stupňa, založené na intenzite a rozsah histopatologických zmien od 0 = ľadviny bez glomerulárnych lézií, 1 + = slabé lezie, napr. vzrast mesangiálneho matrixu, mesangiálnej/glomerulárnej celularity, srpkovitej formácie alebo prítomnosť zápalových výmeškov a kapsulárnych adhezii, a žiadne významné tubu láme vlásočnicové útvary, 2 + = silné lézie, napr. glomeruláma stavba vyhladená z viac než 70 % glomerúl s extenzívnymi tubulárnymi vlásočnicovými útvarmi.
Protiiátkové ELISA testy
Sérové protilátky špecifické pre dvoj- alebo jednovláknovú DNA (ds- alebo ssDNA) boli kvantifikované ELISA testom. Na modifikáciu ELISA nosičov (Flow Laboratories, Mcl.ean, VA) bolo použitých 5 mg/ml ds- alebo ssDNA a inkubovaných pri 4 °C cez noc. Nosiče s naviazanými antigénmi boli postupne blokované počas 1 hodiny PBS obsahujúcim 0,05 % Tween 20, 0,02 % NaN3 a inkubované 1 hodinu pri laboratórnej teplote s 1 mg/ml chrenovej peroxidázy (HRP) konjugovanej s anti-myšacím IgG alebo IgM (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA). Absorbancia bola meraná s použitím Vmax mikromiskového detektora (Molecular Devices, Menlo Park, CA) 30 minút po prídavku 1 mg/ml 2,2 -azino-bis(3-etylbenztiazolín6-sulfó-novej kyseliny), ABTS (Sigma Chemical Co., St Louis, MO). Anti-DNA titre boli vyjadrené v jednotkách s použitím referenčného štandardu spojených sér z MRL/MpJ-lpr/lpr myší starých 4 mesiace poskytnutých Dr. S. Umlandomz Schering-Plough Corp. Zriedenie 1/100 tohto štandardného séra bolo považované za 100 U/ml.
Sérová koncentrácia Ig a TNFa
Na vykonanie Ig ELISA testov boli inkubované nosiče s 1 pg/ml kozieho anti-myšacieho IgG (Kirkegaard a Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) s testovaným sérom v zriedení 1/1000 alebo 1/5000, a potom s HRP-konjugovaným kozím anti-IgG alebo anti-IgM (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA) a ponechané vyfarbiť. Koncentrácie IgG a IgM boli stanovené zo štandardnej krivky získanej inkubáciou so známymi koncentráciami našich štandardov, čo bola zmes proteinov z myelomu.
Na vykonanie TNFa ELISA testov boli inkubované, nosiče s 5 pg/ml potkanieho anti-myšacieho TNFa mAb (MP6-XT3.il) s testovaným sérom v zriedení 1/10, a potom s HRP-konjugovaným potkaním anti-myšacím TNFa mAb (MP6-XT22) a ponechané vyfarbiť.
Predkladatelia uložili jednotlivé kultúry E. coli MC1061 nesúce pHSC, pH15C a pBCRFl (SRa) v Americkej typovej zbierke kultúr („Američan Type Culture Collection“), Rockville, MD, USA (ATCC) pod prístupovými číslami 68191, 68192 a 68193. To bolo vykonané za podmienok nutných pre súhlas ATCC pre Depozit kultúr na patentové účely, čo zaisťuje dostupnosť kultúr pre US komisárov pre patenty a ochranné známky (US Commissioner of Patents and Trademarks) podľa 35 USC 122 a 37 CFR 1.14 a pre verejnosť dostupnosť vo forme US patentu, ktorý vyžaduje údržbu uložených línií. Dostupnosť uložených línií nie je formulovaná ako povolenie na vykonávanie vynálezu v rozpore správami garantovanými autoritou akejkoľvej vlády v súlade s jej patentovými zákonmi.
Výpis sekvencií
1. Všeobecné informácie:
i) Predkladatelia: Rene de Waal Malefyt, Di-Hwei Hsu, Anne O'Garra a Hergen Spits ii) Názov vynálezu:
iii) Počet sekvencií: 2 iv) Adresa:
a) Adresa: Stephen C. Maccvicz, DNAX Research Inštitúte
b) Ulica: Califomia Avenue 901
c) Mesto: Palo Alto
d) Štát: Califomia, USA
e) ZIP: 94304
v) Forma výstupných dát pre počítač:
a) Typ média: 3,5 diskety
b) Počítač: Macintosh SE
c) Operačný systém: Macintosh 6.0.1
d) Software: MS Word 4.0 vi) Súčasné údaje prihlášky:
a) číslo prihlášky:
b) Dátum vyplnenia:
c) Klasifikácia:
vii) Pôvodné údaje prihlášky:
a) Číslo prihlášky:
b) Dátum vyplnenia:
viii) Splnomocnená osoba/agent:
a) Meno: Stephen C. Macevicz
b) Registračné číslo: 30,285
c) Referencia/poradové číslo: DX0221 ix) Telekomunikačné spojenie:
a) Telefón: (415)496-1204
b) Telefax: (415)496-1200
2. Informácie o sekvencií č. 1:
i) Charakteristiky sekvencie:
a) Dĺžka: 160 aminokyselín
b) Typ: aminokyselinový
c) Vláknitosť
d) Topológia: lineárny útvar xi) Opis sekvencie č. 1:
Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe
1015
Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp AlaPhe
2530
Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu AspAsn
4045
Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly TyrLeu
5560
Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met íle Gin Phe Tyr Leu GluGlu
7075
Val Mat Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Asp íle Lys AlaHis
8590
Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu ArgLeu
100105
Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser LysAla
110 115120
Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gin Glu LysGly _ 125 130135 íle Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp íle Phe íle Asn Tyríle
140 145150
Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys íle ArgAsn
155160
2. Informácie o sekvencií č. 2:
i) Charakteristiky sekvencie:
a) Dĺžka: 147 aminokyselín
b) Typ: aminokyselinový
c.) Vláknitosť:
d) Topológia: lineárny útvar xi) Opis sekvencie č. 2:
Ihr Asp Gin Cys Asp Asn Phe Pro Gin Mst Leu Arg Asp Leu Arg
1015
Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Itir Phe Phe Gin Thr Lys AspGlu
2530
Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp PheLys
4045
Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala Leu Ser Glu Met íle Gin PheTyr
5560
Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Prt> GluAla
7075
Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr LeuArg
8590
Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu AsnLys
100105
Ser Lys Ala Val Glu Gin íle Lys Asn Ala Phe Asn Lys LeuGin
110 115120
Glu Lys Gly íle Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp íle Pheíle
125 130135
Asn Tyr íle Glu Ala Tyr Met Ihr íle Lys Ala Arg
140145
19. Použitie podľa nároku 16, kde antagonistom interleukinu-10 je molekula protilátky.
20. Použitie podľa nároku 19, kde molekula protilátky je schopná viazať interleukín-10.
21. Použitie podľa nároku 16, kde podávanie moduluje najmenej jeden z TNFa, interleukínu-6 alebo interleukínu-1.
22. Použitie podľa nároku 16, kde hostiteľom je myš.
23. Použitie podľa nároku 22, kde myšou je NZB/W myš.

Claims (18)

1. Použitie interleukínu-10 alebo jeho analógu, agonistu alebo antagonistu na výrobu farmaceutického prostriedku na podávanie hostiteľovi na liečenie zápalu alebo imunitnej funkcie sprostredkovávanej T-bunkami, ktoré sú sprevádzané abnormálnou hladinou nekrózového tumorového faktora alfa.
2. Použitie podľa nároku 1 na liečenie zápalu.
3. Použitie podľa nároku 2, kde je podávaný interleukín-10.
4. Použitie podľa nároku 2, kde podávanie moduluje hladiny interleukínu-1 a interleukínu-6.
5. Použitie podľa nároku 2, kde abnormálna hladina je zvýšená.
6. Použitie podľa nároku 2, kde abnormálna hladina je sprevádzaná mikrobiálnou infekciou.
7. Použitie podľa nároku 2, kde abnormálna hladina je sprevádzaná horúčkou, hypotenziou, nekrózou tkanív, metabolickou acidózou alebo dysfúnkciou orgánov.
8. Použitie podľa nároku 6, kde mikrobiálna infekcia je príčinou septického šoku, toxického šoku, meningokokovej meningitídy alebo malárie.
9. Použitie podľa nároku 2, kde infekciou hostiteľa je bakteriálna infekcia.
10. Použitie podľa nároku 9, kde bakteriálna infekcia je vyvolaná gramnegatívnymi baktériami.
11. Použitie podľa nároku 10, kde hostiteľ má symptómy septického šoku.
12. Použitie podľa nároku 9, kde bakteriálna infekcia je vyvolaná grampozitívnymi baktériami.
13. Použitie podľa nároku 12, kde hostiteľ má symptómy toxického šoku.
14. Použitie interleukínu-10 na výrobu farmaceutického prostriedku na liečenie septického šoku hostiteľa.
15. Použitie interleukínu-10 na výrobu farmaceutického prostriedku na liečenie toxického šoku hostiteľa.
16. Použitie antagonistu interleukínu-10 na výrobu farmaceutického prostriedku na liečenie porúch autoimunity hostiteľa.
17. Použitie podľa nároku 16, kde poruchy autoimunity sú sprostredkované B-bunkami.
18. Použitie podľa nároku 16, kde poruchy autoimunity sú sprostredkované TNFa.
SK129-94A 1991-08-06 1992-08-06 Použitie interleukínu-10 alebo jeho analógu, agonistu alebo antagonistu na výrobu farmaceutického prostriedku SK282947B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US74212991A 1991-08-06 1991-08-06
PCT/US1992/006378 WO1993002693A2 (en) 1991-08-06 1992-08-06 Use of interleukin-10 analogs or antagonists to treat endotoxin- or superantigen induced toxicity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK12994A3 SK12994A3 (en) 1994-12-07
SK282947B6 true SK282947B6 (sk) 2003-01-09

Family

ID=24983602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK129-94A SK282947B6 (sk) 1991-08-06 1992-08-06 Použitie interleukínu-10 alebo jeho analógu, agonistu alebo antagonistu na výrobu farmaceutického prostriedku

Country Status (17)

Country Link
EP (2) EP0600970B1 (sk)
JP (3) JPH07502019A (sk)
KR (1) KR100271197B1 (sk)
AT (1) ATE187336T1 (sk)
AU (1) AU678137B2 (sk)
CA (1) CA2115060C (sk)
CZ (1) CZ281796B6 (sk)
DE (1) DE69230403T2 (sk)
DK (1) DK0600970T3 (sk)
ES (1) ES2138976T3 (sk)
FI (1) FI940519A (sk)
GR (1) GR3032167T3 (sk)
HU (1) HU224437B1 (sk)
NO (1) NO315409B1 (sk)
PT (1) PT600970E (sk)
SK (1) SK282947B6 (sk)
WO (1) WO1993002693A2 (sk)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993018783A1 (en) * 1992-03-20 1993-09-30 Schering Corporation Use of interleukin-10 to induce the production of interleukin-1 receptor antagonist
WO1994006473A1 (en) * 1992-09-18 1994-03-31 Schering Corporation Restoration of immunocompetency to t helper cells in hiv infected patients
WO1994017773A2 (en) * 1993-02-01 1994-08-18 Université Libre de Bruxelles Use of a pharmaceutical composition comprising an effective amount of interleukin-10, an analog and/or an agonist of interleukin-10
ZA945434B (en) * 1993-07-26 1995-01-23 Schering Corp Agonists and antagonists of human interleukin-10
PT769054E (pt) 1994-07-05 2000-11-30 Steeno Res Group A S Imunoreguladores
US5753218A (en) * 1996-05-03 1998-05-19 Schering Corporation Method for treating inflammation
WO2002066069A1 (fr) * 2001-02-20 2002-08-29 Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd. Remedes contre l'inflammation/les maladies tumorales
WO2005047324A2 (en) 2003-11-10 2005-05-26 Schering Corp ANTI-INTERLEUKIN ANTIBODY-10
CA2782004A1 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Biotest Ag Humanized anti-il-10 antibodies for the treatment of systemic lupus erythematosus (sle)
CA2899835A1 (en) * 2013-03-20 2014-09-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Specific detection of rat antibodies in mouse serum

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL94878A (en) * 1989-06-28 2003-01-12 Schering Corp Cytokine synthesis inhibitory factor, antagonists thereof and methods of using same
PH31669A (en) * 1989-12-20 1999-01-18 Schering Corp Bcrf1 proteins as inhibitors of interferon-gamma.

Also Published As

Publication number Publication date
EP0541214A3 (en) 1993-09-08
FI940519A0 (fi) 1994-02-04
CZ281796B6 (cs) 1997-02-12
ATE187336T1 (de) 1999-12-15
ES2138976T3 (es) 2000-02-01
NO940370D0 (no) 1994-02-04
HU9400314D0 (en) 1994-05-30
WO1993002693A2 (en) 1993-02-18
EP0541214A2 (en) 1993-05-12
JP2004250454A (ja) 2004-09-09
EP0600970B1 (en) 1999-12-08
HUT66865A (en) 1995-01-30
KR100271197B1 (ko) 2000-11-01
DE69230403T2 (de) 2000-05-11
WO1993002693A3 (en) 1993-07-22
CZ24394A3 (en) 1995-01-18
DE69230403D1 (de) 2000-01-13
NO315409B1 (no) 2003-09-01
CA2115060C (en) 2003-05-06
AU678137B2 (en) 1997-05-22
EP0600970A1 (en) 1994-06-15
PT600970E (pt) 2000-05-31
AU2441192A (en) 1993-03-02
GR3032167T3 (en) 2000-04-27
FI940519A (fi) 1994-02-04
DK0600970T3 (da) 2000-05-29
HU224437B1 (hu) 2005-09-28
NO940370L (no) 1994-02-04
SK12994A3 (en) 1994-12-07
JP2008013573A (ja) 2008-01-24
CA2115060A1 (en) 1993-02-18
JPH07502019A (ja) 1995-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5837232A (en) Use of an interleukin-10 antagonist to treat a B cell mediated autoimmune disorder
Kishimoto B-cell stimulatory factors (BSFs): molecular structure, biological function, and regulation of expression
US5776451A (en) Use of interleukin-10 in adoptive immunotherapy of cancer
RU2120802C1 (ru) Фармацевтическая композиция, предназначенная для торможения зависимой от интерлейкина-2 пролиферации опухолевых клеток, увеличения содержания интерферона, лечения воспалительных заболеваний кишечника, потенцирования торможения производства цитокина и ограничения или торможения аллергической реакции замедленного типа
KR0183035B1 (ko) 사람 사이토킨 합성 억제 인자 및 이의 길항제
JP2008013573A (ja) 内毒素または超抗原に誘導された毒性を治療するインターロイキン−１０類似体またはアンタゴニストの使用
CZ282523B6 (cs) Iterleukin - 10 pro léčení nádorů, farmaceutický prostředek jej obsahující, jeho použití a způsob výroby
EP0629130A1 (en) Use of interleukin-10 to suppress graft-vs.-host disease
US6207154B1 (en) Methods of treatment using antagonists of cytokine synthesis inhibitory factor
US6319493B1 (en) Treatment of neoplastic disease with interleukin-10
CA2079230C (en) Bcrf1 antagonists for treating epstein-barr virus infections
Shurin et al. Interleukin-15 and 21
IE902346L (en) Cytokine synthesis inhibitory factor

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20090806