HU224437B1 - Eljárás interleukin-10 analógokat vagy antagonistákat tartalmazó endotoxin- vagy szuperantigén-indukált toxicitás kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás egy gazdaszervezetben abnormálistumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás vagy T-sejt-közvetített immunfunkció módosítására szolgáló, hatóanyagkéntinterleukin–10-et vagy egy analógját, egy agonistáját vagyantagonistáját tartalmazó, többek között Gram-negatív baktériumokáltal kiváltott szeptikus sokk állapotok, Gram-pozitív baktériumokáltal kiváltott toxikus sokk állapotok, valamint bizonyos autoimmunbetegségek kezelésében is ígéretesen alkalmazhatógyógyszerkészítmények előállítására.

Description

A találmány tárgya eljárás immunválaszok modulálására, például többek között szeptikus vagy toxikus sokkszerű tünetek, így endotoxin- vagy szuperantigénindukált toxicitás és autoimmun zavarok kezelésére szolgáló, hatóanyagként interleukin-10-et (IL-10) vagy analógját vagy agonistáját vagy antagonistáját tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.

A súlyos fertőzések mélyreható fiziológiai és metabolikus változásokat okozhatnak. A tünetek változatosak lehetnek, de általában lázzal járnak, alacsony vérnyomással, metabolikus acidózissal, szövetelhalással, kiterjedt szervdiszfunkcióval, és megfelelő kezelés hiányában végül halált okoznak. Lásd például: Berkow (szerk.), The Merck Manual, Rahway, New Jersey; Weatherall és munkatársai (szerk.) Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, New York; Braunwald és munkatársai (szerk.) Harrison’s Textbook of Internál Medicine, McGraw-Hill, New York, vagy Wyngaarden és munkatársai (szerk.) Cecil's Textbook of Medicine, Saunders Co., Philadelphia; a felsorolt kiadványokat itt referenciaként tekintjük. A szeptikus sokk és toxikus sokk állapotok a különböző fertőzésekre adott válaszokra jellemzők, és gyakran mutatnak néhány vagy minden ilyen tünetet.

A szeptikus sokk az endotoxinindukált válaszok modellje. Valamely endotoxin - rendszerint a Gram-negatív baktériumok sejtfalából származó lipopoliszacharid- (LPS) komponens - hatása az immunrendszerre szeptikus sokkot okoz. A toxikus sokk, amelyet a Gram-pozitív baktériumok sejtmembránjából származó valamilyen proteinkomponens, például a Staphylococcus enterotoxin B (SEB) kibocsátása okoz, a szuperantigénindukált válaszok modellje. Bár mindkét választ kezdetben mikrobaeredetű fertőzés okozza, az immunrendszer különbözőképpen válaszol a mikrobiális termékre, azaz a termékeknek megfelelő választ adja.

Egy endotoxin - ilyen például az LPS - által indukált sokk válaszban képződő gazdaeredetű proteinről, a tumornekrózis-faktorról (TNF) legújabban kimutatták, hogy ez indukálja a Gram-negatív szeptikémia legtöbb káros hatását. TNF elleni szérummal való passzív immunizálással a Gram-negatív bakteriémia vagy endoxémia számos letális hatása megelőzhető [lásd például: Tracey et al., Science, 234, 470-474 (1986); Beutler et al., Natúré, 320, 584-588 (1986); Tracey et al., Natúré, 330, 662-664 (1987)]. Magas TNF-szinteket más súlyos fertőző betegségekben is megfigyeltek, beleértve a Meningococcus okozta meningitist, a maláriát és a leishmaniasist. Sok betegnél, akiknél magas a keringő TNF-szint, gyakoribb a szervek rendellenes működése, és ezzel együtt jár a magas mortalitás [lásd például: Waage et al., Láncét, 355-356 (1987); Girardin et al., New Engl. J. Med., 319, 397-400 (1988); Scuderi et al., Láncét, 1364-1365 (1988); Kern et al., Am. J. Med., 87, 139 (1989)].

Egyes közlések szerint, ha TNF-et adtak akár beteg állatnak, akár beteg embernek, ennek az volt a következménye, hogy 2-6 órával később kimutatható interleukin-6- (IL—6) szinteket lehetett észlelni [Mclntosh et al., J. Immunoi., 143, 162-167 (1989); Jablons et al., J.

Immunoi., 142, 1542 (1989); Brouckaert et al., J. Exp. Med., 169, 2257 (1989)]. Megállapították, hogy az IL—6, melyet B-sejt-stimuláló faktor-2-nek, interferon-p2-nek vagy hepatocita stimuláló faktornak is neveznek, egy olyan T-sejt-eredetű glükoprotein, amelynek B-sejt-érést előidéző hatása van. Lásd például: Kishimoto, Blood, 74, 1-10. Nemrég kimutatták, hogy az IL-6-nak pleiotróp biológiai hatásai vannak, például hepatocitákban akut fázisú proteineket indukál, és hatással van a hematopoetikus progenitor sejtekre és a T-sejtekre [például: Geiger et al., Eur. J. Immunoi., 18, 717 (1988); Merinjovic et al., J. Immunoi., 142, 808 (1989); Morrone et al., J. Bioi. Chem., 263, 12 554 (1988); Perimutter et al., J. Clin. Invest., 84, 138 (1989)]. Starner és munkatársai [J. Immunoi., 145, 4185-4191 (1990)] kimutatták, hogy egy IL—6 antitest antagonista meghosszabbítja a túlélést szeptikus sokkban egérmodellekben.

A Staphylococcus enterotoxin B (SEB) olyan szuperantigén, amely toxikus sokk reakciót képes indukálni. Ezeket a reakciókat egy fontos T-sejt-alcsoport aktiválódása okozza, amely súlyos T-sejt-közvetített szisztémás (az egész szervezetet érintő) immunreakciókhoz vezet. Ez a válasz a T-sejt-közvetített válaszokra jellemző, és ennek terápiás kezelésében lesznek használhatók az IL-10 vagy analógjai vagy antagonistái. Mechanikusan értelmezve úgy tűnik, hogy a szuperantigének közvetlen kölcsönhatást gyakorolnak a T-sejt-receptorok νβ elemére, és aktiválják a viszonylag kevés II osztályú MHC specificitású T-sejtet [lásd: Hermán et al., Ann. Rév. Immunoi., 9, 845-772 (1991)].

Jelenleg a szeptikus állapotokat, így a szeptikémiát, bakteriémiát és hasonlókat rendszerint antibakteriális vegyületekkel kezelik. Kórházi környezetben, ahol a bakteriális fertőzés gyakran előfordul katéterbehelyezések és sebészeti beavatkozások következtében, gyakori a szeptikémia. Az ilyen állapotokkal együtt járó sokk esetén azonban nincsenek hatékony járulékos terápiás rendszabályok a sokkszindróma enyhítésére, amelyet részben a fertőzésre adott válaszban indukálódott citokinek okoznak [lásd például: Mandell et al., (szerk.) Principles and Practice of Infectious Diseases (2. kiadás) c. kiadványban Young dolgozatát, 468-470. old., John Wiley and Sons New York (1985)]. Főként az antibiotikumokkal való kezelés - ami a mikrobák pusztulásához és a bakteriális termékek kiszabadulásához vezet - okoz sokkválaszt.

A bakteriális szepszis és az ezzel kapcsolatos szeptikus sokk gyakran halálos kimenetelű. Az ilyen állapotokat az olyan fertőzések eredményezik, amelyeket bizonyos típusú sebészeti beavatkozások, hasi trauma, a rák vagy a transzplantáció terápiájában használt immunszuppresszió vagy más orvosi beavatkozásra szoruló állapotok (medical conditions) okoznak. Az Egyesült Államokban minden évben több mint 700 000 beteg szenved olyan szeptikus sokkban, amelyet bakteriális fertőzések okoztak. Ezek közül mintegy 160 ezren mutatnak szeptikus sokk tüneteket, és körülbelül 50 ezren halnak meg ennek következtében. A toxikus sokk kevesebb személyt érint évenként, de a vá2

HU 224 437 Β1 lasz súlyossága rendszerint sokkal inkább életet veszélyeztető.

A fertőzésre adott súlyos immunológiai válaszok komoly következményeit tekintve igen nagy szükség van hatékony technikákra a mikrobák által indukált 5 sokk profilaktikus és terápiás kezelésében. A találmány készítményeket bocsát rendelkezésre a fent említett és más súlyos immunológiai reakciók kezelésére.

A találmány tárgyát a különböző mikrobák által indukált sokk tüneteinek a kezelésére szolgáló olyan gyógyszerkészítmények előállítási eljárása képezi, amelyek az interleukin-10-zel rokon vegyületeket tartalmaznak. Előnyös, ha a találmány szerinti interleukin-10-et a következő aminosavszekvenciákkal jellemzett nyílt leolvasási keretekkel meghatározott érett polípeptideket tartalmazó csoportból választjuk ki.

Met His Ser Ser Alá Leu Leu Cys

Val Arg Alá Ser Pro Gly Gin Gly

Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro

Asp Alá Phe Ser Arg Val Lys Thr

Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu

Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Alá Leu

Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Alá

Lys Alá His Val Asn Ser Leu Gly

Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

Ser Lys Alá Val Glu Gin Val Lys

Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Alá Met

Asn Tyr Ile Glu Alá Tyr Met Thr és

Met Glu Arg Arg Leu Val Tyr Leu Alá Pro Glu Cys Pro Gin Met Leu Arg Asp Thr Phe Phe Gin Thr Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Leu Ser Glu Met Ile Gin Alá Glu Asn Gin Asp Pro Gly Glu Asn Leu Lys Thr Arg Phe Leu Pro Cys Glu Lys Asn Alá Phe Asn Lys Met Ser Glu Phe Asp Ile Thr Ile Lys Alá Arg

Fenti szekvenciákban a standard hárombetűs rövidítést használtuk az L-aminosavak jelölésére, az N-terminális végtől kezdve. Az IL-10 ezen két formáját néha humán IL—10-nek (vagy humán citokinszintézis-gátló faktornak), illetve virális IL-10-nek (vagy BCRF1-nek) nevezik [lásd: Moore et al., Science, 248, 1230-1234 (1990); Vieira et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 1172-1176 (1991); Fiorentino et al., J. Exp. Med., 170, 2081-2095 (1989); és Hsu et al., Science, 250,

Val

Gly

Leu

Asp

Phe

Phe

Glu

Phe

Cys Leu Thr Gin Asn Met Phe Phe Ser Leu Ser Glu Glu Asn Glu Asn Phe Leu Asn Alá Ser Glu Met Lys

Thr Leu Gin Gly Thr Asp Arg Asp Alá Glu Val Asp Lys Gly Tyr Tyr Leu Glu Alá Lys Asp Arg Leu Arg Lys Ser Lys Gin Glu Lys Ile Asn Tyr

Val	Leu	Leu
Ser	Glu	Asn
Leu	Arg	Asp
Gin	Met	Lys
Leu	Glu	Asp
Met	Ile	Gin
Gin	Asp	Pro
Leu	Lys	Thr
Pro	Cys	Glu
Phe	Asn	Lys
Phe	Asp	Ile
Ile	Arg	Asn
Cys	Leu	Val
Gin	Cys	Asp
Phe	Ser	Arg
Asn	Leu	Leu
Leu	Gly	Cys
Glu	Val	Met
His	Val	Asn
Leu	Arg	Arg
Alá	Val	Glu
Gly	Ile	Tyr
Ile	Glu	Alá

Thr Gly Ser Cys Leu Arg Asp Gin Phe Lys Phe Tyr Asp Ile Leu Arg Asn Lys Leu Gin Phe Ile

Leu Leu Asn Phe Val Lys Leu Lys Gin Alá Pro Gin Ser Leu Cys His Gin Ile Lys Alá Tyr Met

830-832 (1990)]. A természetes proteinszekvencia mutánsai, például az allélvariánsok és muteinek, beleértve a deléciós és inszerciós variánsokat, alternatív összetételt jelentenek, ezek alkalmazása szintén a találmány oltalmi körébe tartozik.

Előnyösebb, ha a találmány szerinti eljárásban az érett IL-10-et az alábbi szekvenciákkal jellemzett csoportból választjuk ki:

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Alá Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Alá Leu Ser Glu Met Ile Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Alá Glu Asn Gin Asp Pro Asp Ile Lys Alá His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Alá Val Glu Gin Val Lys Asn Alá Phe Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Alá Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Alá Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn és

Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Alá Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gin Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys

HU 224 437 Β1

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Alá

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Alá

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Glu

Alá

Lys

Asp

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Alá

Val

Glu

Gin

Ile

Lys

Asn

Alá

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Alá

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Alá

Tyr

Met

Thr

Ile

Lys

Alá

Arg

A WO 91/00349 számú szabadalmi iratban történik említés CSIF vagy antagonistái önmagukban vagy vak- 10 cinaadjuvánsokként sejtközvetített immunválasz vagy humorális immunválasz szelektív kiváltására való alkalmazásáról, annak alapján, hogy a citokinok közé tartozó IFN-γ, interleukin-2 (IL—2), interleukin-3 (IL—3) vagy granulocita-makrofág telep stimuláló faktor (GM-CSF) 15 termelését gátolni képes. A találmány alapja azonban az a felismerés, hogy az IL—10 gátolja egyrészt számos olyan citokin szintézisét is, amelyek a nemkívánatos gyulladásos reakciókat (például ilyen a szeptikus sokk) közvetítik, másrészt gátolja a T-sejtek szuperan- 20 tigének által történő aktiválását, mely történés a toxikus sokkszerű szindrómákhoz vezet. Megfordítva, az IL—10 antagonisták fokozni fogják ugyanezeket az immunválaszokat, és az ilyen fokozás végeredményben más klinikai körülmények, például bizonyos tumorok és 25 autoimmun modellek esetén kívánatos.

Az alábbiakban az ábrák rövid ismertetése következik.

1. ábra. A TRPC11 plazmid vázlatos rajza (lásd a 3. példát). 30

2. ábra. Az IL—4, hlL-10 és vlL-10 gátolja (A) az

IFNy és (B) a TNFa szintézisét az IL—2 által aktivált perifériás vér mononukleáris sejtekben (peripheral blood mononuclear cell=PBMC). [ND=(=not 35 determined) nincs meghatározva.] Egy kísérlet párhuzamos mintáinak tartományát hibahatárvonalak mutatják. A különböző donoroktól származó IL-2-vel stimulált PBMC-k IFNy- és TNFa-terme- 40 lő képessége változó. Az IL—4 és IL-10 gátlóhatását az anti-IL—4 (c), illetve anti-IL—10 (d) neutralizáló antitestek megsemmisítik. A PMBC tenyésztését a kísérleti részben leírtak szerint végez- 45 zük 200 E/ml rekombináns IL-2-vel (rlL-2) és vagy változó mennyiségű rlL-4-gyel vagy COS-sejtek által termelt IL-10-zel (COS-hlL-10), 10 pg/μΙ neutralizáló anticitokin vagy megfelelő izotí- 50 pusú kontroli-immunglobulinok jelenlétében. Az antitestet és a citokint 30 percig inkubáljuk a PBMC hozzáadása előtt.

3. ábra. (A) Az IL—4 az IL-2-vel indukált limfocita 55 aktivált ölő aktivitást (LAK=lymphocyte activated kills activity) gátolja PBMCben, a humán IL-10 (hlL-10) vagy a virális IL-10 (vlL-10) nem gátolja.

A 2. ábrában szereplő egyik hasonló ki- 60 sérletből származó PBMC-t a felülúszóval együtt learattuk, és citotoxicitásra vizsgáltuk ⁵¹Cr-jelzett COLO (vastagbél-karcinóma, 3A1. ábra) és Daudi (Burkitt lymphoma, 3A2. ábra) sejtekkel szemben.

(B) Az IL-2-vel és IL-10-zel tenyésztett PBMC-ben a CD56+ sejtek LAK-aktivitást fejeznek ki. A PBMC-t FITC-konjugált anti-CD56 antitesttel festettük meg, és FacStar Plus (Becton-Dickinson, San Jose, CA., USA) készülékben szortíroztuk. Vizsgáltuk a CD56+ és CD56(tisztaság: 99,7%) frakciókban a citotoxikus aktivitást. Hasonló eredményeket kaptunk olyan PBMC-tenyészetekből származó sejtekkel, amelyekben csak IL—2 volt jelen.

4. ábra. (A) Az IL-2-vel indukált tisztított NK sejtek IFNy-szintézisét közvetlenül gátolja az IL—4, de sem a hlL-10, sem a vlL-10 nem gátolja. A FACS-tisztított NK sejteket (tisztaság: 99,5%) 10® sejt/ml mellett 200 E/ml rlL-2-vel tenyésztettük, vagy 500 E/ml rIL—4 vagy COS-hlL-10, COS-vlL-10 vagy vak-COS (COS-mock) felülúszókkal (10%), Yssel-féle táptalajban 4-5 napon át, majd a párhuzamos tenyészetekről összegyűjtött felülúszókat összekevertük, és IFNy-ra vizsgáltuk ELISA-val. (B) A tisztított NK sejtek és PBMC IL-2-vel indukált proliferációját gátolja az IL—4, de nem gátolja a hIL-10/vlL-10 (4B1. ábra: szortírozott NK; 4B2. ábra: PBL).

5. ábra. (A) Az IL—2-indukált IFNy-szintézis

IL-10-közvetített gátlását az adherens sejtek (AS) hozzáadása visszaállítja a tisztított NK sejtekben, de a T-sejtek hozzáadása nem. (B) Az IL—2-indukált IFNy-szintézis IL-10-közvetített gátlását tisztított monociták hozzáadása visszaállítja a tisztított NK sejtekben. A monociták egyedül az IFNy kimutatható mennyiségénél kevesebbet termelnek. Egy kísérlet párhuzamos mintáinak tartományát hibahatárvonalak mutatják. IL—2 nélkül az IFNy-termelés a kimutathatósági határ alatt volt (2. ábra). A különböző donoroktól származó NK sejteknek különböző az IFNy-termelő képessége. (C) Az IL-10 hatása az

HU 224 437 Β1

IL—2-indukált TNFa-szintézisre NK sejtekben, CD14+ sejtekben és a két sejttípusban összesen. Az NK sejteket (10⁶ sejt/ml) és/vagy a CD14+ sejteket (3«10⁵ sejt/ml) 5 napig tenyésztettük 400 E/ml rlL-2 és 10% COS-hlL-10 felülúszó jelenlétében vagy ezek nélkül.

6. ábra. IL-10-, IL-6-, TNFa- és GM-CSF- (granulocyte-monocyte colony stimulating factor) termelés kinetikája LPS-sel aktivált humán monocitákban. A humán monocitákat, amelyeket centrifugában való kimosással (centfifugal elutriation) izoláltunk, teflonzsákokban tenyésztettük (4*10⁶ sejt/ml) LPS (1 pg/ml) jelenlétében vagy LPS nélkül, és az IL—10(A), IL-6- (B), TNFa- (C) vagy GM-CSF(D) termelést a tenyészet-felülúszókból határoztuk meg, amelyeket a citokinspecifikus ELISA módszer szerint jelzett időben vetettünk le.

7. ábra. Humán monociták által termelt IL—10 az

LPS növekvő koncentrációira adott válaszban. A humán monocitákat (4«10⁶ sejt/ml) teflonzsákokban tenyésztettük növekvő LPS-koncentrációk mellett 24 órán át, és az IL-10-termelést ELISA-val határoztuk meg.

8. ábra. IL—10 hatása a citokintermelésre

IFNy-val, LPS-sel vagy LPS-sel és IFNy-val aktivált monocitákban. A humán monocitákat (4«10⁶ sejt/ml) 100 E/ml IFNy-val, 1, 10, 100 vagy 1000 pg/ml LPS-sel és LPS (1, 10, 100 vagy 1000 pg/ml) és IFNy (100 E/ml) kombinációjával tenyésztettük IL—10 nélkül (□) vagy IL—10 (100 E/ml) jelenlétében (0) 24 órán át, és az IL-1a- (A), IL-Ιβ- (B), IL-6- (C), TNFa- (D) vagy GM-CSF- (granulocita/monocita telep stimuláló faktor) (E) termelést a felülúszókból határoztuk meg citokinspecifikus ELISA-val.

9. ábra. A humán IL—10 vagy virális IL—10 hatása a TNFa- és GM-CSF-termelésre LPS-sel aktivált monocitákban. A humán monocitákat (4«10⁶ sejt/ml) LPS-sel (1 gg/ml) aktiváltuk, és humán IL-10-zel (100 E/ml) vagy virális IL—10-zel tenyésztettük neutralizáló 19F1 anti-lL—10 mAt jelenlétében vagy enélkül 24 órán át, és a TNFa- (A) termelést vagy a GM-CSF- (B) termelést citokinspecifikus ELISA-val határoztuk meg.

10. ábra. Exogén IL—10 és endogéntermelődött IL-10 és IL—4 hatása a citokinspecifikus mRNS-szintek kifejeződésére LPS-sel aktivált monocitákban. A humán monocitákat (4«10⁶ sejt/ml) táptalajban tenyésztettük 4 °C-on és 37 °C-on, és vagy LPS-sel aktiváltuk (1 μg/ml) IL—4 (100 E/ml), IL-10 (100 E/ml) és neutralizáló 19F1 anti-IL—10 mAt jelenlétében, vagy ezek nélkül, majd az RNS-t 24 óra múlva izoláltuk. A β-aktin, IL-1a, IL—1 β, IL-6, IL—8, TNFa, GM-CSF és G-CSF (granulocita telep stimuláló faktor) kifejeződését reverz átírt mRNS-en PCRanalízissel határoztuk meg citokinspecifikus primerekkel, amelyet a reakciótermékek Southern-blotting-vizsgálata követett belső szondák használatával. Egy CD4+ T-sejt-klónból kapott cDNS-t használtunk kontrollként a TNFa és GM-CSF kifejeződésénél.

11. ábra. Az IL-10 hatása a citokinspecifikus mRNS-szintek express2ójára LPS-sel aktivált monocitákban. Az mRNS-t humán monocitákból (4«10⁶ sejt/ml) izoláltuk, LPS-sel (1 pg/ml) aktiváltuk 7 óra hosszat IL-10 (100 E/ml) jelenlétében vagy enélkül, és az IL-6, IL—8, IL-10, ΤΘΡβ (transzformáló növekedési faktor) és β-aktin expresszióját Northern-analízisekkel határoztuk meg.

12. ábra. Exogén IL-10, endogéntermelődött

IL-10 és IL—4 hatása az IL-10- és ΤΟΕβ-ερβάίί^ε mRNS-szintek kifejeződésére LPS-sel aktivált humán monocitákban. A humán monocitákat (4«10⁶ sejt/ml) táptalajban tenyésztettük 4 °C-on és 37 °C-on, és vagy LPS-sel (1 gg/ml) aktiváltuk IL—4 (100 E/ml), IL-10 (100 E/ml) és 19F1 neutralizáló IL-10 mAt (10 pg/ml) jelenlétében, vagy ezek nélkül. Az mRNS-t 24 óra múlva izoláltuk. Az IL-10, ΤΘΕβ és β-aktin expresszióját (A) Northern-analízisekkel, az IL-10 expresszióját (B) reverz átírt mRNS-en PCR-analízissel határoztuk meg, citokinspecifikus primerekkel, amelyet a reakciótermékek Southernblotting-vizsgálata követett, belső szondák használatával.

13. ábra. Endogéntermelődött IL-10 hatása a II osztályú MHC expressziójára, LPS-sel aktivált humán monocitákban. A humán monocitákat (A) 0 ng/ml LPS-sel, (B) 0,1 ng/ml LPS-sel, (C) 10 ng/ml LPS-sel vagy (D) 1000 ng/ml LPS-sel tenyésztettük neutralizáló 19F1 anti-IL—10 mAT (10 pg/ml) jelenlétében vagy enélkül 40 órán át. A HLA-DR/DP (Q5/13) expresszióját indirekt immunfluoreszcenciával határoztuk meg.

14. ábra. IL-10 hatása makrofágsejtvonalak

APC-funkciójára.

14A. ábra, fent. 1G18.LA vagy PU5.1 makrofágsejtvonalakat (10⁶ sejt/ml) aktiváltunk

HU 224 437 Β1

IFNy-val (2 pg/ml). Az APC-t ezután mostuk, és tartályonként 10⁵ sejtet HDK.1 Th1 sejtekkel (5*10⁴ sejt/tartály) és antigénnel (TNP-KLH, 10 pg/ml) inkubáltuk tisztított IL-10 (200 E/ml) jelenlétében (0) vagy nélküle (). A felülúszókat 48 óra múlva összegyűjtöttük, és IFNy-ra vizsgáltuk.

14B. ábra, alul. Az 1G18.LA vagy makrofágokat, mint fent, aktiváltuk, majd tartályonként 10⁵ sejtet vagy HDK.1 Th1 sejtekkel (5*10⁴ sejt/tartály) plusz TNP-KLH-val (10 pg/ml) inkubáltunk, vagy DO11.10 T-sejt hibridóma sejtekkel (5*10⁴ sejt/tartály) plusz ovalbuminnal (2,5 mg/ml), tisztított IL-10 (alul) (200 E/ml) jelenlétében (0) vagy távollétében (). A felülúszókat 20 óra múlva összegyűjtöttük, és IL-2-re vizsgáltuk. Mindegyik táblában három tenyészet középértékeit és a standard eltérést (SD=standard deviation) tüntettük fel.

15. ábra. Az IL-10 morfológiai változást okoz a tisztított peritoneális makrofágokban. Peritoneális makrofágokat (Mac-1⁺-^br|9^bl, B220^-) FACS módszerrel tisztítottunk, majd 72 órán át IFNy (2 pg/ml) jelenlétében (15A. ábra, felül) vagy IFNy (2 pg/ml) plusz IL-10 (200 E/ml) (15B. ábra, alul) jelenlétében inkubáltuk. A felülúszókat eltávolítottuk, a sejteket levegőn szárítottuk, fixáltuk, és Wright-Giemsa szerint festettük, majd szárítottuk és fényképeztük.

16. ábra. Az IL-10 gátolja az IL—1, TNFa és

IL—6 proteinek LPS-sel indukált termelését makrofágsejtvonalakban. Az 1G18.LA (16A., B. és C. ábra) és a PU5.1 (16D., E. és F. ábra) makrofágsejtvonalakat (10⁶ sejt/ml) LPS-sel (10 pg/ml) inkubáltuk; vagy LPS-sel (10 pg/ml) plusz IFNy-val (2 pg/ml); IL-10 vagy IL—4 (néhány esetben) (200-200 E/ml) jelenlétében vagy ezek nélkül, a jelölés szerint. A felülúszókat összegyűjtöttük, és IL—1-, IL-6- vagy TNFa-szintjeit vizsgáltuk.

17. ábra (A., B1., B2. és C. részei). Az IL-10 gátolja a TNFa RNS LPS-indukált expresszóját egy makrofágsejtvonalban. Az 1G18.LA makrofágsejtvonalat a 16. ábránál leírtak szerint stimuláltuk. A felülúszókat 6 óra múlva távolítottuk el, és guanidinium-izotiocianát-oldatot adtunk a sejtekhez, amikor RNS-készítéshez gyűjtöttük össze. A megfelelően stimulált 1G18.LA sejtvonalminták teljes RNS-ének 10 pg-ját gélre vittük fel, felcseppentettük, és ezután TNFa-ra és aktinra szondáztuk.

18. ábra. Peritoneális makrofágok stimulálása. Az

IL-10 gátolja az LPS-indukált IL-6 protein szintézisét peritoneális makrofágokban. Peritoneális makrofágokat (Mac-1^{+ br}'9^ht, B220-) FACS módszerrel tisztítottunk, és ezután 7*10⁵ sejt/ml sűrűségben vagy LPS-sel (10 pg/ml), vagy LPS nélkül inkubáltuk IL-10 (200 E/ml), anti-IL—10 (10 pg/ml) vagy IFNy (2 pg/ml) jelenlétében vagy ezek nélkül. A felülúszókat összegyűjtöttük, és IL-6-szintjeit ismert standardhoz viszonyítva specifikus immunassay-vel (ELISA) vizsgáltuk.

19. ábra. Az IL-10 nem gyengíti le valamilyen oldható kostimulátor kibocsátását a makrofágból, és nem indukálja a makrofágot valamilyen oldható inhibitor kibocsátására. (A) 1G18.LA makrofágsejtvonalat (10⁶ sejt/ml) IFNy-val stimuláltunk 24 órán át, ezután tovább stimuláltuk Th1 sejtekkel (HDK.1; 2*10⁵ sejt/ml) és antigénnel (KLH, 511 pg/ml) 24 óra hosszat, majd összegyűjtöttük a felülúszókat. A felülúszókat bekoncentráltuk, IFNy-ra és IL-2-re kimerítettük, és ezután használtuk a CSIF assay-ben. Ezek a felülúszók nem tartalmaztak kimutatható mennyiségű IFNy-t. IFNy-val aktivált 1G18.LA makrofág APC-t (10⁵ sejt/tartály) HDK.1 sejtekkel (5*10⁴ sejt/tartály) és antigénnel (TNP-KLH, 10 pg/ml) inkubáltunk így (Δ) vagy különböző mennyiségű IL-10-zel, továbbá a fent említett felülúszókkal (□) (25% végső koncentráció) vagy nélkülük (A). A CSIF assay-ből 48 óra múlva összegyűjtöttük a felülúszókat, és meghatároztuk IFNy-szintjeit. Egy kísérletben három párhuzamos tenyésztés középértékét és az SD-t mutatja az ábra. (B) Tisztított lép makrofágok növekvő mennyiségei IL-10 (200 E/ml) jelenlétében (□) vagy IL-10 nélkül (); vagy a tisztított makrofágok növekvő dózisainak B-sejtekkel (2,5* 10³ sejt/tartály) való keveréke IL-10 nélkül (·) vagy IL-10 jelenlétében (O); vagy csak B-sejtek IL-10 (200 E/ml) jelenlétében (O) vagy IL-10 nélkül (0); a makrofágokat APC gyanánt használtuk HDK.1 Th1 klón (10⁴ sejt/ml) számára TNP-KLH-val (10 pg/ml). A felülúszókat 48 óra múlva gyűjtöttük össze, és IFNy-ra vizsgáltuk. Három párhuzamos tenyészet középértékét és az SD-t mutatja az ábra.

20. ábra. Az IL-10 védelmet nyújt SEB-indukált toxicitással szemben BALB/c egerekben; 20A. ábra: 20 pg SEB/30 mg d-Gal; 20B. ábra: IL—10/20 pg SEB/30 mg

HU 224 437 Β1 d-Gal; 20C. ábra: 10 pg SEB/30 mg d-Gal; 20D. ábra: IL—10/10 pg SEB/30 mg d-Gal; 20E. ábra: 30 mg galaktóz-amin; 20F. ábra: 10 pg IL—10.

21. ábra. Az IL—10 megvédi az egereket a letális endoxémiától. 20 BALB/c egérből álló csoportokat intraperitoneálisan (ip.) oltottunk, vagy 350 pg LPS-sel vagy 350 pg LPS-sel együtt különböző dózisú tisztított, rekombináns egér IL—10-zel. Az elhullást a következő 6 napon át kísértük figyelemmel.

22. ábra. Anti-IL—10 antitestek neutralizálják az

IL-10-nek azt a képességét, mely szerint megvédi az egereket a letális endoxémiától. 20 BALB/c egérből álló csoportokat oltottunk ip. vagy 1 mg 2A5 anti-IL-10 antitesttel (22A. ábra) vagy 1 mg GL113 megfelelő izotípusú kontrollantitesttet (22B. ábra) egy órával az LPS alkalmazása előtt. Az egerek ezután 350 pg LPS-t kaptak ip. vagy egyedül, vagy különböző dózisú IL-10-zel együtt, mint a 21. ábránál ismertettük.

23. ábra. Az IL—10 megvédi az egereket a letális endoxémiától, ha az LPS-injekció után 30 perc múlva adjuk be. 20 BALB/c egérből álló csoportokat oltottunk ip, 350 pg LPS-sel a 0 időpontban és 1,0 pg IL—10-zel ip. a 0 időpontban, majd az LPS-injekció után 0,5, 1,2 vagy 5 óra múlva. A kontroliegerek, amelyek 350 pg LPS-t kaptak ip. IL—10 nélkül, mind elhullottak ebben a kísérletben.

24. ábra. Anti-IL-10-zel kezelt és kontrollegerekből származó teljes peritoneumból mosott élő sejtek felületén kifejeződő IgM és IgD immunfluoreszcenciás analízise. BALB/c egereket oltottunk a születésük után 8 hétig SXC.1 anti-IL-10 antitestekkel (24D. ábra), J5/D megfelelő izotípusú kontrollantitestekkel (24B. ábra), foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal (PBS; 24C. ábra) vagy semmivel (24A. ábra), ahogy a kísérleti részben leírjuk. Az egyes kísérleti csoportokból leszámolt 5000 élő sejt fluoreszcenciaintenzitását mutatják az eredmények.

25. ábra. Antí-IL—10-zel kezelt és kontrollegerek szérum IgM szintjei 8 héttel a kezelés után. Az eredmények minden csoportban 5 egyedi szérum mértani középértékét (±SEM) mutatják, és két különböző kísérletből származó adatokat tartalmaznak. Három további kísérlet ugyanilyen eredményeket adott.

26. ábra. Anti-IL—10-zel kezelt és kontroliegerek antitestválasza a1,3-dextránra (26B. ábra) vagy foszforil-kolinra (26A. ábra). BALB/c egereket születésüktől 9 hétig oltottunk SXC.1 anti-IL-10 antitesttel, J5/D megfelelő izotípusú kontroliantitesttel, PBS-sel, vagy kezeletlenek maradtak. A 8. héten az egereket a1,3-dextránnal (DEX) vagy hővel elölt Streptococcus pneumoniae-val - melyet foszforil-kolin- (FK) forrásként használunk - oltottunk be, ahogyan ezt a kísérleti részben leírjuk. Az eredmények 5 egyedi szérumban kimutatott specifikus antitestszintek mértani középértékét (±SEM) mutatják.

27. ábra. SXC.1 anti-IL-10-zel kezelt és kontroliegerekből származó élő lép limfoid sejtek felületén kifejeződő B220 és CD3 immunfluoreszcenciás vizsgálata. További részletekért lásd a 24. ábra magyarázatát - a 27. ábra A.-D. része megfelel a 24. ábra A.-D. részének.

28. ábra. Anti-IL—10-zel kezelt és kontrollegerek in vivő válasza TNP-KLH-ra. Az egereket születésüktől fogva 10 hetes korukig oltottuk anti-IL-10 antitesttel (·) vagy izotípuskontrollal (O)· A 8. héten az állatok intraperitoneálisan kaptak 10 pg TNP-KLH-t. A TNP-specifikus IgM (28A. ábra) és IgG (28B. ábra) szérum szinteket az immunizálás után a 7., illetve a 14. napon határoztuk meg. Az eredmények három külön kísérletből származnak, minden kör egy egyedi egeret képvisel.

29. ábra. Az anti-IL-10 antitestek nem közvetlenül citotoxikusak a peritoneumból mosott B-sejtekre. Kezeletlen 8 hetes korú BALB/c egereket oltottunk intraperitoneálisan 1 mg anti-IL-10 antitesttel (SXC.1 - 29. ábra A., B. és C. része) vagy 1 mg megfelelő izotípusú kontrollal (J5/D - 29. ábra D., E. és F. része). Peritoneális mosott sejteket gyűjtöttünk a különböző állatokból 1, 2 vagy 3 nappal később, és a sejtek felületén analizáltuk az IgD és IgM koexpresszióját. Az eredmények a kísérleti csoportokból leszámolt 5000 élő sejt fluoreszcenciaintenzitását mutatják.

30. ábra. Szérum IFN szintek anti-IL-10-zel kezelt vagy kontroliegerekben. BALB/c egereket születésük után 8 héten át anti-IL-10 antitesttel (» vagy izotípuskontrollal (O) oltottunk. A 8. héten összegyűjtöttük a szérumokat, és IFMy-ra analizáltuk immunassay-vel. Az eredmények öt független kísérletet mutatnak be, az egyes körök egy egeret képviselnek.

31. ábra. Anti-IFNy antitestek együttes alkalmazása csökkenti az anti-IL-10-kezelés azon hatását, amely az egerekből a perito7

HU 224 437 Β1 neális B-sejteket kimeríti. BALB/c egereket születésüktől 8 héten át anti-IL-10 antitestekkel (31C. ábra), anti-IL-10 plusz anti-IFNy antitestekkel (31B. ábra) kezeltünk, vagy kezeletlenek maradtak (31 A. ábra). A peritoneális mosott sejteket ezután B220 és IgM koexpressziójára vizsgáltuk. Az eredmények az egyes kísérleti csoportokból leszámolt 5000 sejt fluoreszcenciaintenzitását mutatják.

32. ábra. Szérum TNFa szintek anti-IL-10-zel kezelt egerekben a 8. héten. Az egereket születésüktől kezdve 8 héten át SXC.1 anti-IL-10 antitestekkel (*) vagy megfelelő izotípusú kontroliantitesttel (O) kezeltük. A szérumokat a 8. héten vettük le, és TNFa-tartalomra vizsgáltuk ELISA-val. Az eredmények 5 független kísérlet adatait mutatják, minden kör egy egeret képvisel.

33. ábra. Szérum IL—6 szintek anti-IL-10-zel kezelt egerekben. A születésüktől fogva 8 héten át SXC.1 anti-IL-10 antitesttel (·) vagy egy hasonló izotípusú kontroliantitesttel (O) kezelt egerekből levett szérumokat IL-6-tartalomra vizsgáltuk ELISA-val. Az eredmények 5 független kísérlet adatait mutatják, az egyes körök egy egeret képviselnek.

34. ábra. Az anti-IL-10-zel kezelt egereknél az

LPS által indukált sokk okozta elhullás előfordulása nő (500 pg LPS a 34A. ábrában, 400 pg LPS a 34B. ábrában, 100 pg LPS a 34C. ábrában, 50 pg LPS a 34D. ábrában, 5 pg LPS a 34E. ábrában és 1 pg LPS a 34F. ábrában). Az egereket születésük után 8 hetes korukig vagy SXC.1 patkány IgM anti-IL-10 antitesttel (·), 2A5 patkány lgG1 anti-IL-10 antitesttel (Á) vagy megfelelő izotípusú kontrollantitestekkel (Ο) (Δ) kezeltük. A 8. héten az egereket (5 egér/csoport) intraperitoneálisan oltottuk a különböző dózisú LPS-sel. Az elhullásokat a következő 4 napon át kísértük figyelemmel.

35. ábra. Immunglobulin-izotípusok szérumszintje anti-lL-10-zel kezelt egerekben. Az egereket születésüktől 8 héten át SXC.1 vagy 2A5 anti-IL-10 patkány antitestekkel, a megfelelő izotípusú kontrollantitestekkel vagy PBS-sel kezeltük. A 8. héten levett szérumokat teljes egér lgG1 (35A. ábra), lgG2a (35C. ábra), lgG2b (35E. ábra), lgG3 (35B. ábra), IgE (35D. ábra) vagy IgA (35F. ábra) tartalomra vizsgáltuk izotípusspecifikus immunglobulin ELISA kitekkel. Az eredmények négy független kísérletet mutatnak minden immunglobulin izotípus analízisből. Minden kísérlet 5 egyedi szérumából kimutatott immunglobulinszintek mértani középértékét (±SEM) mutatják az adatok.

36. ábra. A Ly-1 B-sejt-kimerülés az anti-IL-10-zel kezelt egerekben átmeneti jelenség. Az egereket születésüktől fogva 8 hetes korukig SXC.1 anti-IL-10 antitesttel kezeltük, majd a kezelést megszakítottuk. Az egerek különböző csoportjaiból (3 egér/csoport) peritoneális mosott sejteket gyűjtöttünk a 8. héten (36A. és D. ábra), a 12. héten (36B. és

E. ábra) és a 16. héten (36C. és

F. ábra). Az eredmények a teljes élő peritoneális mosott sejtek - minden kísérleti csoportból 5000 leszámolt élő sejt által kifejezett felületi IgM és felületi B220 immunfluoreszcenciás analízisét mutatják.

37. ábra. SXC.1 anti-IL—10-zel kezelt (37D. ábra) vagy kontroliegerekből (J5/D izotípuskontroll-antitesttel 37C. ábrán, foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal - PBS - kezelt a 37B. ábrán és kezeletlen a 37A. ábrán) nyert peritoneális mosott limfoid sejtek által kifejezett felületi Ly-1 és felületi IgM immunfluoreszcenciás analízise. Az eredmények minden kísérleti csoportból 5000 leszámolt élő sejt fluoreszcenciaintenzitását mutatják.

38. ábra. SXC.1 anti-lL-10-zel kezelt vagy kontrollegerekből (mint a 37. ábránál) nyert teljes élő mosott peritoneális sejtek által kifejezett felületi Mac-1 és felületi IgM immunfluoreszcenciás analízise. Az eredmények minden kísérleti csoportból 5000 leszámolt élő sejt fluoreszcenciaintenzitását mutatják.

39. ábra. Anti-IL—10-zel kezelt vagy kontrollegerek in vivő antitestválasza TNP-Ficollra. Az egereket születésük után 9 hetes korukig SXC.1 anti-IL-10 antitesttel (O) vagy megfelelő izotípusú kontrollantitesttel (·) oltottuk. A 8. héten az állatokat ip. oltottuk 10 pg TNP-Ficollal. A TNP-specifikus IgM- vagy IgG-szérumszinteket 5, illetve 10 nappal később ELISA-val határoztuk meg. Az egyes körök egy-egy egeret képviselnek.

40. ábra. Az anti-IL-10 antitest kezelés késlelteti az autoimmunitás megnyilvánulását NZB/W egerekben. 20-20 nőstény NZB/W F1 egérből álló csoportokat születésüktől fogva és végig az egész kísérlet folyamán hetente háromszor oltottunk vagy SXC.1 patkány IgM antiegér IL—10 antitesttel (·), vagy egy J5/D jelű megfelelő izotípusú kontrollantitesttel

HU 224 437 Β1 (O). Az állatok túlélését a következő 42 héten át kísértük figyelemmel.

41. ábra. Anti-IL—10 antitestekkel kezelt nőstény

NZB/W egerekben proteinuria (>3+) fejlődik ki. 22-22 nőstény NZB/W egérből álló csoportokat születésüktől kezdve és az egész kísérlet folyamán hetenként háromszor oltottunk vagy SXC.1 anti-IL-10 antitesttel (», vagy megfelelő izotípusú kontroliantitesttel (O). A vesebetegség kifejlődését a proteinuria mérésével, Albustix reagenscsíkok használatával határoztuk meg. Az adatok azoknak az egereknek az arányát mutatják, melyek vizelete deciliterenként 300 mg-nál több proteint tartalmazott.

42. ábra. Anti-IL-10-zel kezelt NZB/W egerek veséinek szövettani vizsgálata. 42A. ábrán egy kontroll NZB/W vese látható (PAS-festés): súlyos glomerulonephritis homogén immunkomplex-üledékkel és a tubulusokban proteincilinderekkel, ami arra vall, hogy fehérje szivárog a tubulusokba. A 42B. ábrán egy anti-lL—10-zel kezelt vese (PAS-festés) látható.

43. ábra. Autoantitesttermelés anti-IL-10-zel

NZB/W egerekben. NZB/W nőstény egereket SXC.1 antí-IL—10 antitesttel (·) vagy megfelelő izotípusú kontrollantitesttel (O) oltottunk születésüktől fogva és az egész kísérlet folyamán háromnaponként. Az 5. vagy 6. hónapban levett szérumok kettős szálú DNS-t kötő IgG antitest tartalmát vizsgáltuk ELISA-val. Az egyes körök egy-egy egeret képviselnek.

44. ábra. Szérum TNFa szintek anti-IL-10-zel kezelt NZB/W egerekben. NZB/W nőstény egereket SXC.1 anti-IL-10 antitesttel (·) vagy megfelelő izotípusú kontroliantitesttel (O) oltottunk születésüktől fogva és az egész kísérlet alatt háromnaponként. Az 5., 7. vagy 8. hónapban levett szérumokat TNFa-tartalomra vizsgáltuk egy citokinspecifikus ELISA használatával. Az egyes körök egy-egy egeret képviselnek.

45. ábra. Az anti-TNFa antitestek az NZB/W egerek anti-IL-10-zel indukált védelmét megsemmisítik. 36 és 18 NZB/W nőstény egérből álló csoportokat oltottunk születésüktől fogva és végig a kísérlet folyamán kétszer egy héten 2A5 anti-IL-10 antitesttel () (A), illetve egy GL113 jelű megfelelő izotípusú kontroliantitesttel (□). Az anti-IL-10 antitesttel oltott állatok felét születésük után a 30. napon XT22 anti-TNFa antitesttel is beoltottuk (A)· Az állatok túlélését 34 héten át kísértük figyelemmel.

A találmány az IL—10-nek vagy analógjainak vagy antagonistáinak az immunfunkció modulálásánál való felhasználásának módszereire vonatkozik, különösen mikrobák által indukált sokk káros hatásainak megakadályozására és/vagy csökkentésére, vagy a B-sejtek differenciálódásának vagy fejlődésének a szabályozására. A találmány tárgyát képezik az IL—10-et vagy analógjait vagy antagonistáit tartalmazó gyógyszerkészítmények is, amelyek az említett módszerek kivitelezésénél kerülnek felhasználásra. Előnyös, ha a találmányban való felhasználásra szolgáló IL—10-et azon érett polipeptidek csoportjából választjuk ki, melyeket a pH5C, pH15C és pBCRFI(SRa) cDNS inszertumai által meghatározott nyílt leolvasási keretek kódolnak. Az említett plazmidokat az American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland, USA) intézményben helyeztük letétbe, 68 191, 68 192, illetve 68 193 letéti számon.

Az IL—10 gátolja TNFa és IFNy szintézisét monocitákban vagy monocitákban plusz természetes ölősejtekben (natural killer cell=NK), de egyedül NK sejtekben nem. Az IL—4 közvetlenül gátolja az IL-2-aktivált NK sejtek citokinszekretálását. Ebből arra lehet következtetni, hogy az IL—4 más úton hat az NK sejtekre, mint az IL—10, például az IL-10-hatásnak szüksége van monociták részvételére. Az IL—10 gátolja az IL—2-aktivált NK sejtek citokinszekrécióját, de nem gátolja a LAK- (lymphocyte activated killer) aktivitást, ami arra enged következtetni, hogy az IL—2-indukált citokinszintézist és a limfocitaaktivált killer (LAK) aktivitást különböző mechanizmusok szabályozzák.

Kimutattuk, hogy az IL—10-nek gyulladásgátló hatása van, valószínűleg egy olyan mechanizmuson keresztül, amely gátolja a monociták és/vagy aktivált makrofágok vagy NK sejtek gyulladáskeltő citokintermelését. A citokintermelés gátlása a transzkripció szintjén történik.

Bemutatjuk, hogy az IL—10 modulálja a szuperantigénindukált válaszokat, például állatokban a T-sejtközvetített válaszokat. A Staphylococcus enterotoxin B (SEB) súlyos toxikus sokk választ indukálhat, és egérvizsgálatokban kimutattuk az IL—10 in vivő hatékonyságát. Az IL-10 alkalmazása a szuperantigénhatásnak való kitétellel egyidejűleg vagy még ezután is hatékonynak bizonyul a súlyos SEB-expozíció által okozott letalitás megelőzésében.

A Gram-negatív bakteriális lipopoliszacharid (LPS) szeptikus sokk választ indukál emlősökben. Ezen endotoxinindukált sokk válasznak az eredménye az lesz, hogy TNFa, IL—1 és/vagy IL—6 szekretálódik a stimulált makrofág/monocitákból, mint fent leírtuk. Az IL-10 alkalmazása azonban elnyomja az IL- 1a, IL—1β, IL—6, IL—8 és GM-CSF indukált expresszióját. Adatokat mutatunk be, amelyek alapján megállapítható, hogy az IL-10 képes megvédeni az egereket az endotoxinindukált sokktól, még akkor is, ha az LPS bemutatása után alkalmazzuk. Megfordítva, az anti-IL-10 antitestek blokkolni képesek ezt a védőhatást. További vizsgálatok azt mutatták, hogy az anti-IL-10-zel kezelt egerekben a keringő tumornekrózisfaktor-alfa (TNFa) és a ke9

HU 224 437 Β1 ringő IL—6 szintjei is lényegesen magasabbak, és ezek az egerek az endotoxinindukált (például LPS-indukált) sokkal szemben erős érzékenységet mutatnak.

Az anti-IL—10 antitestek más immunológiai állapotok kezelésére is használhatók. Adatokkal támasztjuk alá, hogy fiatal egereknél az anti-IL—10 antitest hosszan tartó alkalmazása a B-sejtek Ly-1 alcsoportját kimerítheti. Ez azt jelenti, hogy az IL-10 a Ly-1 B-sejt-fejlődés regulátoraként működik, és ez módot ad arra, hogy a Ly-1 B-sejteket kimerítse. Ez a megfigyelés az autoimmun állapotok kezelésének jobb megismeréséhez vezetett.

Egy autoimmun válasz kialakulásához komplex T-sejt-kölcsönhatások szükségesek. Az NZB/W egértörzs hajlamos lupusra (szisztémás lupus erythematosus=SLE), és modellként használható az autoimmun állapotok kezelésére szolgáló terápiás szerek teszteléséhez. Ezek az egerek ezenkívül szokatlan arányban tartalmaznak Ly-1 B-sejteket, más B-sejt-típusokhoz képest. In vivő egérkísérleteket írtunk le az NZB/W törzs használatával.

Ezeknek az egereknek a kezelése anti-IL-10-zel lényegesen késleltette az autoimmun válasz kialakulását, melyet az általános túlélés vagy a proteinuria kifejlődése, a vese nephritis vagy az autoimmun titerek figyelemmel kísérése támasztott alá. Ez az eredmény arra mutat, hogy az anti-IL-10-kezelésnek hasznosnak kell lennie más emlősök, például emberek kezelésében is.

Nagyszámú egysejtű és többsejtű expressziós rendszert (például gazda expressziós vektor kombinációkat) használhatunk a találmány szerinti módszerekben használt polipeptidek termelésére. A gazdasejttípusokhoz tartoznak - de nem korlátozó jelleggel - a bakteriális, élesztő-, rovar-, emlős- és hasonló sejtek. Számos összefoglaló munka nyújt útmutatást a specifikus expressziós rendszerek kiválasztásához és/vagy módosításához. Lásd például: de Boer és Shepard, „Strategies fór Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli”, 205-247. old., Kroon (szerk.), Genes: Structure and Expression c. kiadványban (John Wiley and Sons, New York, 1983), amely számos E. coli expressziós rendszert tekint át; Kucherlapati és munkatársai, Critical Reviews in Biochemistry, 16. kötet, 4. kiadás, 349-379. old. (1984) és Banerji és munkatársai, Genetic Engineering, 5. kötet, 19-31. old. (1983), amelyek az emlőssejtek transzfektálásának és transzformálásának módszereit foglalják össze; Reznikoff és Gold (szerk.), Maximizing Gene Expression (Butterworths, Boston, 1986), amely E. coliban, élesztőben és emlőssejtekben a génexpresszióról szóló közlésekből ad válogatást; Thilly, Mammalian Cell Technology (Butterworths, Boston, 1986), az emlős expressziós rendszereket tekinti át. Az idézett kiadványokat és közleményeket referenciaként említjük. Ugyanígy, sok olyan összefoglaló munka áll rendelkezésre, amelyek a találmányban való felhasználásra alkalmas expressziós vektorok készítéséhez és/vagy módosításához szükséges specifikus cDNS-ek és expressziószabályozó szekvenciák összekapcsolásának és/vagy manipulálásának technikáit és körülményeit írják le, mint például Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982); Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. kiadás, 1-3. kötet) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; és Ausubel és munkatársai, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York (1987 és időszakos kiegészítések). Az említett kiadványokat szintén referenciaként tekintjük.

Egy E. coli expressziós rendszert ismertet Riggs a 4,431,739 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amelyet leírásunkban ugyancsak referenciaként tekintünk. E. coliban a magas szintű expresszióra különösen jól használható prokarióta promoter a tac promoter (lásd: de Boer, 4,551,433 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; ezt szintén referenciaként tekintjük). Szekréciós expressziós vektorok is rendelkezésre állnak E. coli gazdasejtek számára. Különösen jól használhatók a pIN-lll-OmpA vektorok [lásd: Ghrayeb et al., EMBO J., 3, 2437-2442 (1984)], amelyekben az átírandó cDNS-t az OmpA protein szignálpeptidjét kódoló E. coli OmpA gén egy részéhez fuzionálják, és ennek következtében az érett protein a baktériumok periplazmatikus terébe szekretálódik. A 4,336,336 és 4,338,397 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások szintén közölnek szekréciós expressziós vektorokat prokarióták számára. Az említett szabadalmi leírásokat szintén referenciaként tekintjük.

Számos baktériumtörzs alkalmas gazda prokarióta expressziós vektorok számára. Ilyenek például a következő E. coli törzsek: W3110 (ATCC No. 27 325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB101, X1776, (ATCC No. 31 244), X2282, RR1 (ATCC No. 31 343), MRCI; vagy a Bacillus subtilis törzsek és más enterális baktériumok, mint például a Salmonella typhimurium vagy Serratia marcescens és a különböző Pseudomonas fajok. Eukarióta proteinek expressziójához használható baktériumtörzs-származékok készítéséhez, mint például az E. coli K12 X1776, általános módszereket közöl Curtis III a 4,190,495 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Ezt a leírást itt szintén referenciaként tekintjük.

A prokarióta és eukarióta mikroorganizmusokon kívül többsejtű szervezetekből származó sejteket tartalmazó expressziós rendszereket is használhatunk a találmány szerinti proteinek termelésére. Különösen előnyösek az emlős expressziós rendszerek, mivel ezekben nagyobb a valószínűsége annak, hogy a transzlációt követő feldolgozómechanizmusok biológiailag aktív emlősproteineket termelnek. Számos DNS-tumorvírust használnak vektorként emlősgazdasejtekhez. Különösen fontos számos olyan vektor, amelyek bakteriális replikációs szabályozószekvenciákhoz kapcsolt SV40 replikációs, transzkripciós és/vagy transzlációs szabályozószekvenciákat tartalmaznak, mint például az Okayama és Berg által [Mól. Cell. Bioi., 2, 161-170 (1982)] kifejlesztett és Takebe és munkatársai által [Mól. Cell. Bioi., 8, 466-472 (1988)] tökéletesített pcD vektorok. Az említett közleményeket a leírásban szin10

HU 224 437 Β1 tén referenciaként tekintjük. Más SV40-alapú emlős expressziós vektorokat ismertetnek Kaufman és Sharp [Mól. Cell. Bioi., 2, 1304-1319 (1982)] és Clark és munkatársai a 4,675,285 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Az említett leírásokat szintén referenciákként tekintjük. Rendszerint a majomsejtek az előnyösek a fenti vektorok számára. Az ilyen vektorok, melyek SV40 őri szekvenciákat és egy ép A gént tartalmaznak, autonóm módon tudnak replikálódni majomsejtekben (így magasabb másolatszámot és/vagy stabilabb másolatszámot adnak, mint a nem autonóm módon replikálódó plazmidok). Ezenfelül az SV40 őri szekvenciákat tartalmazó vektorok ép A gén nélkül is autonóm módon tudnak replikálódni magas másolatszámmal (de nem stabilan) Gluzman közlése szerint [Cell., 23, 175-182 (1981)] COS 7 majomsejtekben. A COS 7 sejtek az ATCC intézménytől szerezhetők be (letéti szám: CRL 1651). A fent említett SV40-alapú vektorok más emlőssejtek - ilyenek az egérsejtek - transzformálására is képesek úgy, hogy integrálódnak a gazdasejt DNS-ébe.

Többsejtű szervezeteket is használhatunk gazdasejt gyanánt a találmány szerinti polipeptidek termelésére, így például rovarlárvákat [Maeda et al., Natúré, 315, 592-594 (1985) és Ann. Rév. Entomol., 351-372 (1989)] és transzgenikus állatokat [Jaenisch, Science, 240, 1468-1474 (1988)]. Ezeket a közleményeket, hasonlóan a többihez, a leírásban ugyancsak referenciaként tekintjük.

/. Meghatározási módszerek interieukin-10-re és analógokra

Az IL-10-zel rokon proteinek, melyeket közös néven IL—10-nek nevezünk, számos olyan biológiai aktivitást fejtenek ki, amelyek alapján meghatározhatók, és egységük definiálható. Részletesebben kifejtve, az IL-10-ek képesek meggátolni az IFNy-t, limfotoxint, IL-2-t, IL-3-at és GM-CSF-et magában foglaló csoportból legalább egy citokin szintézisét egy olyan T-helper sejtpopulációban, amely egy vagy több ilyen citokin szintézisére indukálható azáltal, hogy szingenikus antigénbemutató sejtek (APC=antigen presenting cell) és antigén hatásának voltak kitéve. A vizsgálatban az APC-ket olyan módon kezeljük, hogy ne legyenek képesek replikálódni, de antigénfeldolgozó mechanizmusuk működőképes maradjon. Ezt rendszerint úgy érjük el, hogy az APC-ket körülbelül 1500-3000 R dózissal (gamma- vagy röntgenbesugárzás) besugározzuk, mielőtt T-sejtekkel összekevernénk. Lásd a 2. táblázatot, amely egér esetében az IL-10 meghatározását tartalmazza.

2. táblázat

IL-10- (CSIF) meghatározás - Módosítva proliferációs vizsgálattá (CSIF=cytokine synthesis inhibitory factor)

Antigénbemutató sejtek (APC)

1. BALB/c lépeket (körülbelül 10⁸ sejt/lép) helyezünk cRPMI csövekbe.

2. Egysejtszuszpenziót készítünk 10 ml-es fecskendőt használva (fülke alatt, steril technikával); centrifugálás 1200 ford./perc mellett.

3. Az üledéket 5 ml hideg ammónium-klorid-oldatban (0,83%-os vizes oldat) reszuszpendáljuk újbóli centrifugálás 1200 ford./perc mellett.

4. Az üledéket 5 ml cRPMI oldatban (IL-2-mentes, vizsgálathoz) reszuszpendáljuk, és centrifugálással mossuk.

5. A sejteket 5 ml cRPMI-ben reszuszpendáljuk, és számoljuk.

6. Besugárzás 3000 R dózissal (rendszerint 20 perc).

7. A sejtkoncentrációt 8*10⁶/ml-re állítjuk be (a vizsgálatban tartályonként 50 μΙ-t adunk hozzá, hogy 4*10⁵ sejt/tartály végső koncentrációt kapjunk).

[Mikrotitrálólemezen titráljuk az IL—10-et vagy 100 μΙ végtérfogatban (vagy 50 μΙ végtérfogatban, ha anti-IL-10 antitestet kívánunk hozzáadni).]

Th1 sejtek

1. Három nappal a vizsgálat előtt felolvasztunk egy ampulla HDK.1 sejtet, és közvetlenül hozzáadjuk 2*25 ml IL-2-tartalmú cRPMI oldathoz.

2. A következő nap ellenőrizzük a sejteket, és ha szükséges, kétfelé vagy háromfelé osztjuk.

3. A vizsgálat napján, közvetlenül a lemezre vitel előtt, 1200 ford./perc mellett lecentrifugáljuk a sejteket, majd 5 ml cRPMI oldatban reszuszpendáljuk (tripánkék festékoldatban kétszeresére hígítjuk), és számoljuk.

4. A sejtkoncentrációt 2*10⁵ sejt/ml-re állítjuk be, és tartályonként 50 μΙ-eket mérünk be (10⁴ sejt/tartály végső koncentráció). A lemezre vitel előtt KLH-t adunk hozzá, hogy a koncentráció 400 mg/ml legyen. (A végső koncentráció 100 mg/ml lesz.)

Kontrollok μΙ Th1 sejt KLH nélkül.

μΙ Th1 sejt + KLH.

μΙ lép APC plusz és mínusz IL-10 (valószínűleg a legmagasabb koncentráció a legjobb).

Kiegészítés 200 μΙ végtérfogatra.

Vizsgálat menete

1. APC-készítés.

2. IL-10 lemezre vitel.

3. Th1 sejt készítés és lemezre vitel.

4. APC lemezre vitel.

óra múlva IFNy ELISA vizsgálatra 100 μΙ felülúszót kiveszünk; ezután hozzáadunk ^{2 3}H-timidint (1 pCi/tartály). Learatás a következő reggel.

A citokingátlást másképpen is vizsgálhatjuk első vagy előnyösebben második kevert limfocita reakciókban (MLR=mixed-lymphocyte reaction), és ebben az esetben nem szükséges szingenikus APC-ket használni. A szakterületen jól ismertek az MLR-ek. [Például a „Selected Methods in Cellular Immunology” (szerk.; Mishell et al.) (Freeman, San Francisco, 1980) című kiadványban Brandley közleménye, 162-166. old.; és Battisto et al., Meth. in Enzymology, 150, 83-91 (1987). Az említett közleményeket referenciaként tekintjük.] Röviden kifejtve: allogén limfoid sejtek két populációját keverjük össze, az egyik populációt a keverés előtt a proliferáció megakadályozása céljából például besugárzással kezeljük. A sejtpopulációkat elő11

HU 224 437 Β1 nyösen úgy készítjük, hogy a kiegészített táptalajban, például a 10% fetális borjúszérummal (FBS) kiegészített RPMI táptalajban koncentrációjuk körülbelül 2*10⁶ sejt/ml legyen. A meghatározásban mind a kontroll-, mind a teszttenyészetek készítéséhez mindegyik populációból 0,5 ml-t keverünk össze. A második MLRben az első MLR-ben 7 napig tartott sejteket ezután újból stimuláljuk frissen készített, besugárzott stimulátorsejtekkel. A mintát, amelyről gyanítjuk, hogy IL-10-et tartalmaz, a keveréskor adhatjuk a teszttenyészetekhez, majd 1-3 nappal a keverés után mind a kontroll-, mind a teszttenyészeteket citokintermelésre vizsgáljuk.

Az IL-10-meghatározáshoz szükséges T-sejt-populációkat és/vagy APC-populációkat jól ismert technikákkal állítjuk elő. Ezeket a technikákat pontosan ismertetik DiSabato és munkatársai [Meth. in Enzymol., 108 (1984)]. Közleményüket a leírásban referenciaként tekintjük. Az IL-10-vizsgálatoknál előnyben részesített APC-k a perifériás vér monociták és a szöveti makrofágok. Ezeket standard technikák használatával nyerjük [lásd: Boyum, Meth. in Enzymol., 108, 88-102 (1984); Magé, Meth. in Enzymol., 108, 118-132 (1984); Litvin et al., Meth. in Enzymol., 108, 298-302 (1984); Stevenson, Meth. in Enzymol., 108, 242-249 (1984); és Romáin et al., Meth. in Enzymol., 108, 148-153 (1984)]. Az említett közlemények ebben a leírásban referenciákként szerepelnek. Előnyös, ha az IL-10-meghatározásokhoz helper T-sejteket használunk. Ezeket úgy nyerjük, hogy először a perifériás vérből, lépből vagy nyirokcsomókból elkülönítjük a limfocitákat, azután szelektáljuk a helpersejteket panning vagy folyadékcitometria segítségével, kereskedelemben kapható anti-CD4 antitest használatával, például a 4,381,295 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett OKT4-gyel (beszerezhető az Ortho Pharmaceutical Corporationtől). Egér anti-CD4 a Becton-Dickinson vagy Pharmingen cégtől kapható. [A szükséges technikák leírását lásd: Boyum, Scand. J. Clin. Láb. Invest., 21 (Suppl. 97), 77 (1968); Meth. in Enzymol., 108 (lásd fent) és Bram et al., Meth. in Enzymol., 127, 737-748 (1986), amely közleményeket ebben a leírásban referenciák gyanánt tekintjük.] A PBL (peripheral blood lymphocyte) sejtek általában friss vérből nyerhetők Ficoll-Hypaque sűrűséggradienscentrifugálással.

A vizsgálatban többféle antigén alkalmazható, így például a csiga-hemocianin (keyhole limpet hemoxyanin=KLH), a szárnyas γ-globulin vagy hasonlók. Előnyösebb, ha a vizsgálatban a helper T-sejteket antigén helyett anti-CD3 monoklonális antitesttel, például OTK3-mal (lásd a 4,361,549 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást) stimuláljuk.

A kontroll- és tesztmintákban a citokinkoncentrációkat standard biológiai és/vagy immunkémiai módszerekkel mérjük. A szakterületen - ha rendelkezésre áll tisztított citokin - jól ismertek a specifikus citokinek immunkémiai vizsgálatára szolgáló eljárások [lásd például: Campbell, Monocolnal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam,

1985); 4,486,530 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; a kiadványokat és az említett szabadalmi leírást referenciaként tekintjük]. Humán IL-2, humán IL-3 és humán GM-CSF ELISA kitek a Genzyme Corporation (Bostin, MA, USA) cégtől vásárolhatók. Humán limfotoxinspecifikus poliklonális antitesteket a Genzyme Corp. forgalmaz, és ezeket a humán limfotoxin radioimmunassay-ben használhatjuk [például: Chard: An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques (Elsevier, Amsterdam, 1982)].

A citokinek fent felsorolt biológiai vizsgálómódszereit az IL—10-aktivitás meghatározására is fel lehet használni. Humán limfotoxin biológiai vizsgálatokat ismertetnek a következő közlemények: Aggarwal, Meth. in Enzymol., 116, 441-447 (1985); Matthews és munkatársai írása (221-225. old.) a „Lymphokines and Interferons: A Practical Approach” (szerk.: Clements et al., IRL Press Washington, DC., USA, 1987) című kiadványban; az említett közleményeket a leírásban referenciaként tekintjük. A humán IL-2-t és a GM-CSF-et a CTLL-2 és KG-1 (beszerezhetők az ATCC-től TIB 214, illetve CCL 246 letéti számon) faktor dependens sejtvonalakkal vizsgálhatjuk. A humán IL—3 vizsgálata annak alapján történik, hogy számos hematopoetikus sejttelep képződését képes stimulálni lágy agartenyészetekben [például: Metcalf: „The Hemopoietic Colony Stimulating Factors” (Elsevier, Amsterdam, 1984)]. Az IFNy antivirális vizsgálatokkal mérhető [például: Clemens et al., szerkesztésében (lásd fentebb) Meager közleménye, 129-147. old.]. Egyenértékű egér citokineket hasonló módon vizsgálhatunk megfelelő sejtvonalakon.

A citokintermelés mRNS-analízissel is kimutatható. A citokin-mRNS-eket a White és munkatársai [J. Bioi. Chem., 257, 8569-8572 (1982)] és Gillespie és munkatársai [4,483,920 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] által leírt citoplazma dót hibridizációval mérhetjük. A közölt módszert leírásunkban referenciaként tekintjük. Más megoldásokban dot-blotting szerepel, tisztított RNS használatával [például: Hames et al., (szerk.) „Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach” (IRL Press, Washington, DC, USA, 1985); a kiadvány leírásunkban referenciaként szerepel], Polimeráz-láncreakció- (PCR) technikákat is használhatunk [lásd: Innis et al. (szerk.) PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc., New York), melyet referenciaként tekintünk].

Bizonyos esetekben az IL-10-re vizsgálandó mintáknak előkezelést kell kapniuk az előzőleg meghatározott citokinek eltávolítása céljából, amelyek zavarhatják a vizsgálatot. Bizonyos sejtekben például az IL—2 növeli az IFN-termelést, tehát a vizsgálatban használt helper T-sejtektől függően az IL-2-t esetleg el kell távolítani a vizsgálandó mintából. Az eltávolítást könnyen kivitelezhetjük, ha a mintát anticitokinaffinitás-oszlopon engedjük át.

Az egyszerűség kedvéért az IL—10-aktivitás egységét az IL—10 azon képességével fejezzük ki, hogy mennyire tudja növelni az MC/9 sejtek IL—4-indukált proliferációját. (Az MC/9 sejteket a 4,559,310 számú

HU 224 437 Β1 amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertette; beszerezhetők az ATCC-től CRL 8306 letéti számon.) 1 egység/ml az IL—10 azon koncentrációja, amellyel az MC/9 sejtproliferáció maximális stimulációjának 50%-a érhető el az IL-4 szintje felett a következő vizsgálatban. Standard mikrotitrálólemezen, tartályonként 50 μΙ táptalajban az IL—4 és IL—10 kétszeres vagy háromszoros hígításait készítjük el; a táptalaj RPMI 1640, kiegészítve 10% fetális borjúszérummal, 50 μΜ 2-markapto-etanollal, 2 mM glutaminnal, 100 E/l penicillinnel és 100 pg/l sztreptomicinnel. Táptalajjal hígított IL—4-ből (1600 E/ml) 25 μΙ-t mérünk be tartályonként (végső koncentráció: 400 E/ml), és a lemezt egy éjszakán át - például 20-24 órán át - inkubáljuk. ³H-timidinből (például 50 pCi/ml táptalaj) tartályonként 0,5-1,0 pCi-t mérünk be, és a sejteket újból egy éjszakán át inkubáljuk; ezután a sejteket learatjuk, és mérjük a beépült radioaktivitást.

Az IL—4 és IL—10 citokinek előállítására vonatkozó általános leírásokat az 5,017,691 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és a 07/453,951 sorozatszámon benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés tartalmazza, amelyeket a leírásban referenciaként tekintünk.

II. Agonisták és antagonisták

IL—10 antagonisták olyan molekulák lehetnek, amelyek mímelik az IL—10 receptoraival való kölcsönhatását. Ilyen molekulák lehetnek az IL—10 analógjai vagy fragmentumai vagy az IL—10 receptorok ligandum kötőhelyet képviselő epitopjai elleni antitestek vagy az olyan speciális antitestek elleni antiidiotípus antitestek, amelyek az IL—10 receptor-kölcsönhatást biztosító részeit megkötik.

Az antagonisták olyan proteinformákat vehetnek fel, amelyek a receptorhoz való kötődésért versengenek, azaz amelyek nem képesek aktiválni a receptort, de blokkolják az IL—10 kötődését, vagy ilyenek az IL-10-et kötő molekulák, például az antitestek. Az IL—10 citokin vagy fragmentumai vagy analógjai ellen, ezeknek akár természetben előforduló formái, akár rekombináns formái ellen termelhetők antitestek. Termelhetők antitestek az IL—10 ellen, ha akár aktív formáiban, akár inaktív formáiban fordul elő, a különbség az, hogy az aktív citokin elleni antitestek nagyobb valószínűséggel ismerik fel azokat az epitópokat, amelyek csak az aktív konformációban vannak jelen. Az antiidiotípus antitestek szintén számításba jönnek ezekben a módszerekben, és hatásos IL—10 agonisták lehetnek.

Antitesteket - beleértve a kötésre képes fragmentumokat és az egyszálú változatokat - termelhetünk a kívánt antigén - például citokin - előre meghatározott fragmentumai ellen is úgy, hogy a fragmentum immunogén proteinekkel készített konjugátumaival immunizálunk állatokat. A monoklonális antitesteket a kívánt antitesteket szekretáló sejtekből állítjuk elő. Ezeket az antitesteket vagy arra szűrjük, hogy a normál- vagy az inaktív analógokat kötik-e meg, vagy szűrhetjük agonista vagy antagonista aktivitásuk szempontjából. Ezek a monoklonális antitestek szokásosan legalább körülbelül 1 mM, méginkább legalább körülbelül 300 μΜ, rendszerint legalább körülbelül 10 μΜ, még gyakrabban legalább körülbelül 30 μΜ, előnyösen legalább 3 μΜ K_D aktivitással vagy nagyobb aktivitással kötődnek. Jóllehet az előzőekben az IL—10-et tárgyaltuk, azonban hasonló antitestek más analógok, receptorok és antagonistáik ellen is termelhetők.

A találmány szerinti antitesteknek és antigénkötő fragmentumoknak jelentős diagnosztikai és terápiás értéke lehet, ugyanis hatásos, olyan antagonisták lehetnek, amelyek az IL—10 receptorokhoz kötődnek, és így meggátolják a ligandumok receptorhoz való kötődését, vagy gátolják az IL-10-et abban, hogy biológiai választ váltson ki.

Az IL-10-et vagy fragmentumait más anyagokhoz, főként polipeptidekhez köthetjük, ilyenek a fuzionált vagy kovalens kötésű polipeptidek, amelyek immunogének gyanánt használhatók. A citokin és fragmentumai számos immunogénnel fuzionálhatok, vagy számos immunogénhez köthetők kovalens kötéssel. Ilyen immunogén a csiga-hemocianin (keyhole limpet hemocyanin=KLH), a marhaszérum-albumin, tetanusz-toxoid stb. [lásd: Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row (1969); Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; és Williams és munkatársai (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, 1. kötet, Academic Press, New York]. A felsorolt irodalmakat referenciaként tekintjük poliklonális antiszérumok előállítási módszereinek leírása tekintetében. A szokásos módszer szerint állatokat antigénnel hiperimmunizálunk. Az állatok vérét levesszük röviddel az ismételt immunizáló oltások után, és izoláljuk a gamma-globulint.

Bizonyos esetekben monoklonális antitestek előállítása kívánatos, különböző emlősgazdasejtekből, például egér-, rágcsáló-, főemlős-, ember- stb. sejtekből. A monoklonális antitestek előállítási technikáinak leírása megtalálható például a következő kiadványokban: Stites és munkatársai (szerk.) Basic and Clinical Immunology (4. kiadás), Lángé Medical Publications, Los Altos, CA és az ebben hivatkozott referenciák; Harlow és Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding, (1986) Monoclonal antibodies: Principle and Practice (2. kiadás), Academic Press, New York; Coligan és munkatársai (szerk.), (1991 és időszakos kiegészítések), Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons, New York; továbbá lényeges Köhler és Milstein közleménye [Natúré, 256, 495-497 (1975)], amely a monoklonális antitestek előállításának egy módszerét tárgyalja. A felsorolt irodalom a leírásban referenciaként szerepel. Röviden összefoglalva, a módszer abból áll, hogy egy állatot egy immunogénnel oltunk. Az állatot ezután leöljük, és lépéből sejteket veszünk ki, amelyeket mielomasejtekkel fuzionálunk. Ennek eredménye egy hibrid sejt vagy „hibridóma”, amely in vitro szelektív körülmények között képes szaporodni, ellentétben a mieloma-szülősejtekkel. A hibridóma sejteket ezután szűrjük, olyan egyedi kiónok izolálása céljából, amelyek az immunogén ellen egyetlen antitestfajtát szekretálnak. Ilyen módon a kapott egyedi antitestfajta az immunizált állatból származó halhatatlanná

HU 224 437 Β1 változtatott, klónozott egyetlen B-sejt terméke, amely az immunogénen felismert egy specifikus helyre adott válaszként keletkezett.

Más alkalmas technikákban a limfocitákat antigénpolipeptidek hatásának teszik ki, vagy pedig antitestgyűjteményeket szelektálnak fágban vagy hasonló vektorokban. Lásd: Huse és munkatársai „Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda” Science, 246, 1275-1281 (1989); és Ward és munkatársai, Natúré, 341, 544-546 (1989), melyeket referenciákként tekintünk. A találmány szerinti polipeptideket és antitesteket módosítással vagy módosítás nélkül használhatjuk, beleértve a kiméra vagy humanizált antitesteket. Rekombináns immunglobulinokat is termelhetünk, lásd a 8,816,567 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, amely a leírásban referenciaként szerepel.

A citokin vagy receptora ellen termelt antitesteket olyan antiidiotípus antitestek termelésére is használhatjuk, amelyek agonista vagy antagonista tulajdonságokat mutatnak. Ezek a különböző immunológiai válaszok itt tárgyalt modulálásában lehetnek hasznosak.

III. Tisztítás és gyógyszerkészítmények

Abban az esetben, ha a találmány szerinti polipeptidek oldott formában fejeződnek ki, például mint a transzformált élesztő- vagy emlőssejtek szekretált termékei, akkor a szakterület standard eljárásai szerint végezhetjük a tisztításukat. Ezek az eljárások a következő lépéseket tartalmazhatják: ammónium-szulfátos kicsapás, ioncserés kromatográfia, gélszűrés, elektroforézis, affinitáskromatográfia és/vagy hasonlók. Az ilyen tisztítási eljárásokhoz [például a következő kiadványok tartalmaznak útmutatást: „Enzyme Purification and Related Techniques” Methods in Enzymology, 22, 233-577 (1977) és R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, New York (1982), amelyeket a leírásban referenciaként tekintünk], Abban az esetben, ha a találmány szerinti polipeptidek oldatlan formában - például mint aggregátumok, zárványtestek vagy hasonlók - fejeződnek ki, ezeket olyan standard eljárásokkal tisztíthatjuk, amelyek a következő lépéseket tartalmazzák: a roncsolt sejtekből centrifugálással választjuk el a zárványtesteket, majd kaotróp szerekkel és redukálószerekkel oldjuk a zárványtesteket. Az oldott elegyet hígítjuk, és annyira csökkentjük a kaotróp szer és a redukálószer koncentrációját, hogy a polipeptid biológiailag aktív konformációt vegyen fel. Ez utóbbi eljárások ismertetését tartalmazzák az alábbi közlemények, illetve szabadalmi leírások: Winkler és munkatársai, Biotechnology, 3, 992-998 (1985); Winkler és munkatársai; Biochemistry, 25, 4041-4045 (1986); 4,569,790 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; és a 86306917.5 és 86306353.3 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentések. Az említett közleményeket és leírásokat referenciaként tekintjük.

Az általunk használt „hatékony mennyiség” kifejezés olyan mennyiséget jelent, amely elégséges a sokkállapot enyhítésére vagy megelőzéséhez. Ezt az állapotot például olyan tünetek révén, mint a hidegrázás, érszűkület, értelmi zavarodottság, hipoperfúzió (csökkent vérátáramlás), hiperpirexia (magas, 40 °C feletti láz) és hasonlók, határozzuk meg. Egy adott betegnél a hatékony mennyiség a következő faktoroktól függ: a kezelendő szepszis foka és típusa, a beteg általános egészségi állapota, az alkalmazás módja, a mellékhatások súlyossága és hasonlók. Általában az IL-10-et olyan gyógyszerkészítmény formájában alkalmazzuk, amely az IL—10 hatékony mennyiségét, valamint valamilyen, a gyógyszergyártásban szokásosan használt vivőanyagot tartalmaz. Lásd például: Káplán és Pasce (1984), Clinical Chemistry: Theory, Analysis and Correlation, Mosby and Co., St.Louis, MO; és Gilman és munkatársai (1990), Goodman and Gilman: The Pharmacological Basis of Therapeutics (8. kiadás) Pergamon Press. Ezek a kiadványok ebben a leírásban referenciaként szerepelnek. Bizonyos alkalmazások esetén az IL—10 terápiás reagenst más gyógyhatású anyaggal, például antibiotikus készítménnyel kombinálhatjuk.

Gyógyszervivőanyag lehet bármilyen kompatibilis, nem toxikus anyag, amely alkalmassá teszi a találmány szerinti készítményeket a betegnek való beadásra. Az ilyen gyógyszerek parenterális beviteléhez alkalmas készítmények általában jól ismertek [például: Remington’s Pharmaceutical Science, 15. kiadás, Mack Publishing Co., Easton, PA., (1980)]. A találmány szerinti készítményeket beültethető vagy injektálható gyógyszerleadó rendszerek segítségével is bejuttathatjuk a beteg szervezetébe. [Például: Urquhart et al., Ann. Rév. Pharmacol. Toxicol., 24, 199-236 (1984); Lewis (szerk.) Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals, Plenum Press, New York (1981); 3,773,919 számú és 3,270,960 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások és hasonlók. Az említett közlemények és szabadalmi leírások ebben a leírásban referenciaként szerepelnek.]

Parenterális alkalmazás esetén az IL—10-et egyadagos injekció formájában formulázzuk (oldat, szuszpenzió, emulzió) egy gyógyszergyártásban szokásos vivőanyaggal. Ilyen vivőanyag lehet az izotóniás konyhasóoldat, a Ringer-oldat, glükózoldat és a Hank-féle oldat. Nemvizes vivőanyagokat is használhatunk, ezek közé tartoznak a stabilizált olajok és az etil-oleát. Előnyös vivőanyag az 5%-os glükóz/nátrium-klorid oldat. A vivőanyag kis mennyiségű olyan adalék anyagokat tartalmazhat, amelyek biztosítják az izotonicitást és a kémiai stabilitást. Ilyenek például a pufferek és a konzerválószerek. Az IL—10 reagenst előnyösen tisztított formában, lényegében aggregátumoktól és más proteinektől mentes állapotban formulázzuk, körülbelül 5-20 pg/ml koncentrációhatárok között. Előnyös, ha az IL-10-et folyamatos infúzióban alkalmazzuk úgy, hogy a naponta beadott mennyiség körülbelül 50-800 mg között legyen (azaz körülbelül 1-16 mg/kg/nap). A napi infúzió mennyiségének változtatása a mellékhatások és a vérsejtszámok figyelésén alapul.

Hasonló meggondolások alapján határozzuk meg egy IL—10 agonista vagy antagonista hatékony mennyiségét, bár bizonyos antagonisták esetén valószínűleg

HU 224 437 Β1 szélesebb dózistartományok - a magasabb tartományokban - szükségesek.

IV. Biológiai megfigyelések és mechanizmusok

Ugyan nem ragaszkodunk a következőkben felvetett mechanizmusokhoz, de e fejtegetésben bepillantást engedünk az IL-10 analógok, agonisták és antagonisták használatába és alkalmazási területébe. Hasznos áttekintést ad az immunrendszer működéséről, fejlődéséről és differenciálódásáról például Paul (szerk.) Fundamental Immunology (2. kiadás), Raven Press, New York (1989) című munkája, melyet referenciaként tekintünk. A gyulladásról szóló 26. fejezete, a késleltetett típusú túlérzékenységről szóló 28. fejezete és az autoimmunitást tárgyaló 31. fejezete különösen lényeges a találmány alkalmazása szempontjából.

Vizsgáltuk - például az A) tanulmányban - az IL—4 és az IL-10 hatását a citokinszintézisre, az IL-2 által indukált LAK-aktivitást humán PBMC-ben és tisztított NK sejtekben. Mind az IL—4, mind az IL-10 gátolja az IL—2 által indukált IFN- és TNFa-szintézist PBMC-ben, de csak az IL—4 gátolja az IL—2-indukált IFNy-szintézist tisztított NK sejtekben. Tehát az IL—4 és az IL-10 különböző mechanizmusok révén gátolják NK sejtekben a citokinszintézist.

A TNFa-termelés vizsgálatára vonatkozó kísérletek eredményeiből hasonló következtetéseket lehetett levonni. Azonban ebben az esetben a monociták is termelik ezt a citokint. Az IL—10-nek nem volt közvetlen hatása az IL—2-indukált TNFa-szintézisre NK sejtekben, de képes volt blokkolni a monociták TNFa-termelését. Mind NK sejteket, mind CD14+ sejteket tartalmazó tenyészetek stimulálása IL-2-vel a TNFa-termelés erős fokozódását eredményezte, és az IL-10 teljesen blokkolta ezt a fokozódást. Minthogy az IL-2 nem aktiválja a CD14+ sejteket fokozottabb TNFa-termelésre, e szinergista fokozódás valószínűleg az NK sejtek megnövekedett TNFa-szintézisét jelenti. Úgy tűnik tehát, hogy az IL-10 gátolja a monocitákban a TNFa-termelést, valamint e sejtek kostimuláló hatását az NK sejtek TNFa-szintézisére.

Bár mind az IL—4, mind a hIL—10/vlL—10 gátolja az IL—2-stimulált PBMC TNFa-szintézisét, csak az IL—4 gátolja az IL—2-indukált LAK-aktivitást. Ezek a megfigyelések azt jelentik, hogy az IL-2-indukált citokintermelést és a citotoxicitást a PBMC-ben különböző folyamatok szabályozzák. Ezek a felfedezések az IL-2 és a LAK-sejtek klinikai felhasználása szempontjából fontosak. Az IL-2-terápiával kapcsolatos problémák közt szerepelnek a kardiovaszkuláris hatások és a kapillárisszivárgás szindróma. Ezeknek a mellékhatásoknak bizonytalanok az okai, de szerepet játszhat bennük a citokinkibocsátás, mint rákos betegekben az IL-2 által indukált TNFa-kibocsátás. Abból a tényből, hogy az IL-10 gátolja az IL—2-indukált citokinszintézist, arra lehet következtetni, hogy ez a citokin IL-2-vel kombinálva hasznos lehet ilyen betegek kezelésében. Ezenkívül, mivel adatok utalnak arra, hogy a TNFa indukálni képes a humán immunelégtelenség-vírus expresszióját fertőzött T-sejtekben, az IL-10 azon képességének, hogy gátolja a TNFa-szintézist, ebben a vonatkozásban is lehet jelentősége.

Ezek a vizsgálatok azt is mutatják, hogy a monociták az aktiválást követően viszonylag nagy mennyiségben termelik a humán IL-10-et. Kinetikai vizsgálatok kimutatták, hogy a monociták aktiválása után 7 órával lehet észlelni alacsony IL-10-szinteket, és a maximális IL-10-termelés az aktiválás után 24-48 óra múlva következik be. Tehát az IL-10-termelés viszonylag későn indul meg, összehasonlítva az IL-1a-, IL—1β-, IL—6-, IL—8- és TN Fa-termeléssel, amelyek az aktiválás után 4-8 óra között magas szinten szekretálódnak. Kimutattuk továbbá, hogy a humán IL-10 erős gátlóhatást gyakorol a monociták IFNa-val, LPS-sel vagy IFNa és LPS kombinációval végzett aktiválása utáni citokintermelésre. Ezek a gátlóhatások specifikusak az IL-10-re nézve, ugyanis ezek teljes mértékben neutralizálhatók a 19F1 mAt-tel, mely mind az IL-10, mind a vlL-10 aktivitását gátolja. IL-10 adása 100 E/ml koncentrációban több mint 90%-ban csökkenti az IL-1a-, TNFa-, GM-CSF- és G-CSF-szintézist azután, hogy a monocitákat optimálisan aktiváltuk IFN (100 E/ml) és LPS (1 gg/ml) kombinációjával. Az IL—1 β-, IL—6- és IL-8-termelésre gyakorolt gátlóhatás kevésbé kifejezett, különösen, ha a monocitákat optimálisan aktiváljuk IFNy és LPS kombinációval. Az a mechanizmus, amellyel az IL-10 gátolja a monociták citokintermelését, nem tisztázott, azaz, hogy vajon az IL-10 hatásai közvetlenek-e, vagy pedig közvetve más faktorok közvetítik. Minthogy az IL—1 képes indukálni az IL—6 termelését fibroblasztokban, timocitákban és monocitákban, lehetséges, hogy az IL-6-termelés részleges gátlása a csökkent IL—1 -termelés következménye.

A virális IL-10-et, melyről kimutatták, hogy humán sejtekre biológiailag hat, hasonlóan a humán IL—10-hez, kevésbé behatóan tesztelték. Azonban a vlL-10 hasonló mértékben gátolta az LPS-sel aktivált monociták TNFa- és GM-CSF-termelését, mint a humán IL-10. A vlL-10-nek a TNFa- és GM-CSF-termelésre gyakorolt gátlóhatását neutralizálta a 19F1 mAt, mely a vlL-10-hatások specificitását támasztja alá.

Az IL-1a-, IL-Ιβ-, IL-6-, IL-8-, TNFa-, GM-CSFés G-CSF-szekréció gátlása a transzkripció szintjén történik. Az IL-10 erősen gátolja az LPS-indukált citokinspecifikus mRNS szintézisét. A meghatározást Northern- és PCR-analízissel végeztük. A PCR-analízist olyan körülmények között végeztük, amelyek lehetővé tették (szemikvantitatív módon) az egyes minták reakciótermékeinek az összehasonlítását. Ezt a tényt validálta, hogy a cDNS-ek sokszorozása β-aktinra specifikus primerekkel a minták reakciótermékeinek azonos mennyiségeit eredményezte, és mennyiségileg összehasonlítható eredményeket kaptunk, amikor az IL-10 mRNS expresszióját ugyanazokban a mintákban mind Northern-, mind PCR-analízissel határoztuk meg. Ezenkívül e tenyészetek felülúszóiban a citokin mRNS expressziós szintek a proteinszintekkel korreláltak. Az IL-10 nem befolyásolta a TGFp mRNS expresszióját aktivált monocitákban. Meg kell jegyezzük azonban, hogy a ΤΰΡβ konstitutív módon fejeződött ki a nem aktivált monocitákban, és hogy a monociták aktiválása LPS-sel nem befolyásolta a ΤΰΡβ mRNS szinteket. As15

HU 224 437 Β1 soian és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 6020-6024 (1987)] kimutatták, hogy a monociták konstitutív módon fejezik ki a TGFp mRNS-t, és hogy a TGFp szekréciója igényli a monocita aktiválását. Nem világos azonban, hogy vajon az IL-10-nek van-e hatása a ΤΘΡβ latens formájának aktív formává történő konverziójára.

Kimutattuk, hogy az IL-10-termelést az IL-4 transzkripciós szinten gátolja. Bár az IL-4 gátlóhatása az IL-10-termelésre jelentős, az IL-4 nem képes teljesen blokkolni az IL-10-termelést. Az IL-4 csak 70%-ig gátolta az IL-10-termelést, még akkor is, ha olyan magas IL-4-koncentrácíókat (400 E/ml) használtunk, amelyek elegendőek az IL-1-, IL—6- és TNFa-termelést teljesen gátolni. Már ezelőtt kimutatták, hogy az IL-4 gátolja a humán monociták IL-1a-, IL—1β-, IL-6-, IL—8- és TNFa-termelését. Ezeket a megfigyeléseket megerősítettük, és további vizsgálatokkal megállapítottuk, hogy az IL-4-, az IL—8-, GM-CSF- és G-CSF-termelést is gátolja LPS-sel aktivált humán monocitákban. Ez a gátlás a transzkripció szintjén következik be. Az adatok azt is megmutatják, hogy az IL-4 és az IL—10 hasonló hatást gyakorol a humán monociták citokinexpressziójára, mely aláhúzza a citokinek pleiotróp hatásait és az immunrendszerben fellelhető bőséget.

Érdekes, hogy az IL—10 egy önszabályozó citokin, ugyanis erősen gátolja az IL—10 mRNS szintézist a 24 órán át aktivált monocitákban. Emellett a monociták aktiválása LPS-sel neutralizáló anti-IL—10 mAt jelenlétében az IL—10 mRNS megnövekedett expresszióját eredményezi 24 óra alatt, mely arra utal, hogy az endogéntermelődött IL-10 is gátolja az IL-10 mRNS szintézist. Az a tény, hogy az IL-10 a saját termelését is képes lecsökkenteni humán monocitákban, azt jelenti, hogy ez az első olyan citokin, amelyet egy negatív feedback (visszacsatolásos gátlás) mechanizmus szabályoz. Az endogéntermelődött IL-10 önszabályozó hatását figyeltük meg az IL-1a-, IL—1β-, IL—6-, IL—8-, TNFa-, GM-CSF- és G-CSF-termelésre LPS-sel aktivált monocitákban anti-IL—10 antitestek jelenlétében. Az endogén IL-10 gátlóhatása e citokinek termelésére azonban kevésbé kifejezett, mint a tenyésztés elkezdésekor adagolt exogén IL-10-é. Ez azzal a ténnyel kapcsolatos, hogy az IL-1a, IL—1 β, IL—6, IL—8, TNFa és a G-CSF az aktiválás után 4-8 órával már magas szinten termelődik, míg az endogén IL-10-termelés sokkal később, az aktiválás után 24-48 órával következik be. Ezt a nézetet támasztja alá az a megfigyelés, hogy az endogéntermelt IL-10 legerősebben a GM-CSF-szekréciót gátolta, amelyről kimutatták, hogy a monociták aktiválása után későn termelődik. Feltételezve, hogy az IL-10 mRNS szintézis tükrözi és megelőzi az IL-10 protein szekrécióját, és hogy az IL-10 csak receptorával lép kölcsönhatásba a sejt felületén, ezek a következtetések azt sugallják, hogy az endogéntermelődött IL-10 gátlóhatása viszonylag későn érvényesül, és ezért különös fontossága lehet egy immunválasz késői fázisaiban.

Az IL-10-et először egérben észlelték, és mint citokinszintézis-gátló faktort (cytokine synthesis inhibitor factor=CSIF) írták le, melyet Th2 sejtek termelnek, és amely gátolja a Th1 sejtek citokintermelését (főként IFNy termelését). Az m-IL-10-nek szüksége van makrofágok jelenlétére, hogy a Th1 sejtek citokintermelésére gátlóhatást fejthessen ki. [lásd például: Fiorentino et al., J. Immunoi., 146, 3444-3451 (1991); Trowbridge et al., J. Exptl. Med., 154, 1517-1524 (1981); Lambert et al., Cell. Immunoi., 120, 401-418 (1989); Hirsch et al., J. Exptl. Med., 154, 713-725 (1981). A felsorolt közleményeket referenciaként tekintjük.] A közlemények szerint az IL-10 és a v-IL-10 erősen gátolja az antigénspecifikus T-sejtek proliferációját, ha monocitákat használunk APC-k gyanánt. Ezenfelül az antigénspecifikus proliferatív T-sejt-válaszok csökkenése főként a monociták csökkent antigénbemutató kapacitásának tudható be, melynek oka, hogy az IL-10 nagyon legyengíti a II osztályú MHC antigén kifejeződését ezeken a sejteken. Ezek az adatok a jelenleg talált eredményekkel együtt, miszerint az IL-10-et későn termelik a monociták, és hogy az IL—10-nek önszabályozó hatása van ezen sejtek IL-10-szekréciójára, arra mutatnak, hogy az IL-10 jelentős legyengítő hatást gyakorol a folyamatban lévő antigénspecifikus T-sejt-válaszokra. Ennélfogva az IL-10 főszerepet játszhat az antigénindított proliferatív T-sejt-válaszok elfojtásában. Azt a nézetet, miszerint a monociták által termelt IL—10-nek szintén erős önszabályozó feedback (visszacsatolásos gátló) hatása lehet a T-sejt-aktiválásra, alátámasztja az a megfigyelés, hogy az LPS-sel való aktiválás után a monociták által termelt IL-10 a felelős a II osztályú MHC antigének lecsökkenéséért ezeken a sejteken, ugyanis amikor az LPS-sel végzett stimulálást neutralizáló anti-IL—10 mAt jelenlétében végeztük, a II osztályú MHC-expresszió nem csökkent.

A gyulladáskeltő citokinek, az IL-1a, IL—1β, IL—6, IL—8 és TNFa szerepelnek az akut és krónikus gyulladásos folyamatokban, számos autoimmun betegségben, beleértve a rheumatoid arthritist is. Ezek a sejtek modulálják az immunrendszer sejtjeinek aktiválódását és működését, sőt az endoteliális sejtek, keratinociták és hapatociták aktiválódását és működését is. Az a felfedezés, hogy az IL-10 erősen legyengíti e citokinek szekrécióját, azt sugallja, hogy az IL-10 hatékony inhibitora a gyulladásnak. Az eddigiekben leírt tulajdonságaira alapozva - hogy ugyanis gátolja az antigénspecifikus T-sejt-proliferációt a monociták APC-kapacitásának csökkentése révén azáltal, hogy ezeken a sejteken lecsökkenti a II osztályú MHC antigéneket, és hogy gátolja a gyulladáskeltő citokinek szekrécióját a monocitákból - úgy tűnik, hogy az IL—10-nek fő szerepe van az immunválaszok és gyulladásos válaszok elfojtásában. Ezt a szerepét a továbbiakban in vitro vizsgálatokkal és mind endotoxinra, mind enterotoxin-szuperantigénre adott válaszok in vivő modelljeivel erősítjük meg.

Vizsgálatainkban bemutatjuk, hogy az IL-10 gátlóhatást fejt ki az LPS-sel indukált citokintermelésre makrofágsejtvonalakban és peritoneális makrofágokban. Az IL-10-nek tehát nemcsak a T-sejt-válaszok szabályozásában van fontos szerepe, hanem a fertőzések és sérülések folyamán kialakuló gyulladásos válaszokban is.

HU 224 437 Β1

Az IL—10 erősebb hatást gyakorol a makrofágsejtvonalakra, mint az IL—4 hasonló mennyiségei, amelyről előzőleg kimutatták, hogy gátolja mind az egér, mind a humán makrofágok és monociták citokintermelését. Az eredmények szerint ezekben a sejtvonalakban erősen gátolja az IL—4 az LPS-indukált TNFa protein termelést, de kevésbé jelentős az IL-6-szintézis gátlása. Mindazonáltal az IL—4 nem gátolja olyan erősen a TNFa-t, mint ahogy ezt előzőleg a humán monocitáknál kimutatták. Ez a különbség talán a fajok közti különbséggel magyarázható, valamint azzal, hogy a használt makrofágsejtvonalak differenciáltabbak voltak, mint a monociták, vagy mivel ezekben a kísérletekben 10 pg/ml LPS-t használtak, ezzel szemben 100 ng/ml dózist használtak humán monocita rendszerben. Az IL—4-gyel ellentétben az IL-10 szignifikánsan gátolja az IL-6-, TNFa- és IL—1 -termelést ilyen magas LPS-koncentrációnál. A makrofágsejtvonalak stimulálása LPS-sel és IFNy-val magasabb TNFa- és IL-6-szinteket indukál, s ez az IL-4-hatást bizonyos esetekben visszaszorítja, amiből arra lehet következtetni, hogy az IL—4 és az IFNy ellenkező és ellensúlyozó hatással lehetnek a makrofágaktiválás bizonyos vonatkozásaiban. Ez is ellentétben áll a humán monocitákon végzett azon vizsgálatokkal, amelyeket kevesebb LPS-mennyiségekkel végeztünk. Összefoglalva, az IFNy plusz LPS-indukált IL—6 és TNFa protein termelés IL-10-közvetített gátlása sokkal kifejezettebb, mint ami az IL—4-nél észlelhető. Az LPS-sel vagy az IFNy plusz LPS-sel indukált IL-6-ot és TNFa-t kódoló RNS-kifejeződés gátlását szintén megfigyeltük, amikor reverz átírt RNS-re szemikvantitatív PCR-sokszorozási módszert használtunk. Bizonyos esetekben az IL—4 által kifejtett gátlás hasonló mértékű, mint az IL-10-é, ami azt sugallja, hogy az IL-10 is hat a transzlatált proteinek szekréciójára vagy stabilitására. Az IL-10, bár kifejt ugyanilyen hatásokat, mégis úgy tűnik, hogy a makrofágok citokintermelésére kifejtett gátlóhatása hatékonyabb, mint ami az IL—4-nél látható. Az IL-10 monokintermelésre gyakorolt hatásából arra lehet következtetni, hogy e hatékony inhibitor talán potenciális gyulladásgátló szerként jöhet számításba a klinikai megnyilvánulások (manifesztációk) széles változatánál.

Minthogy azt is kimutatták, hogy a peritoneális makrofágok T-sejtek által történő stimulációját gátolja az IL-10, megvizsgáltuk, vajon az IL-10 gátolja-e ezen tisztított sejtpopuláció citokinszekrécióját. A BALB/c vagy cBA/J egerekből nyert, FACS-tisztított, majd LPS-sel stimulált peritoneális makrofágok jelentős mennyiségű IL-6-ot termeltek, mely csak enyhén csökkent IL-10 jelenlétében. Minthogy az előzetes PCR-adatok arra mutattak, hogy a tisztított makrofágok IL-10-et termelnek, IL-10 elleni antitesteket adtunk az egyes LPS-stimulációkhoz. Az antitest adagolása az LPS-stimulációkhoz azzal járt, hogy mindkét egértörzsben sokkal magasabb szintre nőtt az IL—6 protein termelése (20 órán belül 30-35 ng/ml per 7^χ10⁵ sejt/ml). Ez egybevág azzal, hogy a makrofágok citokintermelése szoros autokrin szabályozás alatt áll, vagy hogy a Mac-1 ^{+ br}'9^ht peritoneális makrofágok között nemcsak egy makrofágpopuláció létezik, s ezek egyike a többit ellenőrzése alatt tartja IL-10-termelése révén. Ezzel párhuzamosan a humán monocita rendszerben kapott adatok szintén azt mutatták, hogy az IL-10 gátolja az LPS-indukált citokintermelést, beleértve magát az IL-10-termelést a kimosással (elutriációval) tisztított humán monocitákban. Az előzőleg megjelent közleményekkel összhangban, további bizonyítékát kaptuk annak, hogy a T-helper sejtekből származó citokineknek - ilyen az IL—4 és IL-10 - a Th1 T-helper sejtek citokinjeivel - ilyen az IFNy - ellentétes hatásaik vannak, azaz ezek a citokinek egymásra ellentétes hatást fejthetnek ki. Az IFNy az LPS-válaszban termelt IL-6-szintet majdnem olyan magasra növelte, mint amit anti-IL—10-zel értünk el, amely láthatóan gátolta ugyanazon makrofágokban az IL-10 termelését. Ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy az olyan citokinek termelését, mint az IL—6 és TNFa, az IL-10 szabályozza, amely ezután az aktivált T-sejtek és NK sejtek által termelt IFNy szabályozása alá kerül. Az IFNy-nak ezzel a hatásával magyarázhatjuk előző megfigyeléseinket, miszerint a peritoneális makrofágok IFNy-val 24 órán át való inkubálása javítja kapacitásukat a Th1 sejtek stimulálását illetően.

Azt a mechanizmust, amelyben az IL-10 gátolja a makrofágokat abban, hogy stimulálják a sejteket citokinek szintetizálására, még fel kell deríteni. Ha a makrofágokat IL-10 jelenlétében stimuláljuk, a citokinszintézis szignifikáns csökkenése következik be, ugyanis az IL-10 legyengíthet egy olyan kostimulátor aktivitást, amely a makrofágokra és antigénre adott válaszban az optimális citokinszekrécióhoz szükséges. Stimulált 1G18.LA makrofágsejtekről származó felülúszókat használva nem lehetett az IL—10-nek a makrofágokra és a Th1 sejtek antigénfüggő stimulációjára kifejtett gátlóhatását leküzdeni. Ez egybevág egy olyan mechanizmussal, amikor az IL-10 nem valamely szolubilis kostimulátor legyengítése révén közvetíti hatásait a citokínszintézisre. Lehetséges, bár nem valószínű, hogy az IL-10 egy ilyen faktornak inkább a hatását zavarja, és nem a termelését, vagy hogy egy ilyen kostimulátor erősen labilis vagy abszorbeált, és így nincs jelen ezekben a felülúszó-készítményekben. Másik lehetőség, hogy az IL-10 egy membránhoz kötött kostimulátor expresszióját gátolja. Ezt szintén magyarázhatjuk azokkal a már megjelent közleményekkel, amelyek azt sugallják, hogy a sejtek stimulálásához egy APC/kiegészítő sejtre van szükség, mely nem helyettesíthető a szolubilis kostimulátorral. A mechanizmusnak, amellyel az IL-10 a citokinszintézist gátolja, egy másik magyarázata az lehet, hogy az IL-10 gátlófaktor(ok) termelésére indukálja a makrofágokat, amelyek ezután úgy hatnak a T-sejtekre, hogy gátolják a citokinszekréciót. Makrofág és B-sejt APC hozzáadása antigénspecifikus rendszerhez Th1 sejtek stimulálására a T-sejtek additív stimulációját eredményezi, összehasonlítva az egyedi APC-vel elért stimulációval. Az IL-10 jelenléte oly mértékig gátolja a sejt citokinszintézisét, amilyen szintig a Β-sejt APC a sajátján ér el. Ebből arra lehet következtetni, hogy a makrofág nem olyan inhibitor termelését indukálja,

HU 224 437 Β1 amely közvetlenül hat a T-sejtekre vagy a B-sejt APC-re. Bár valószínűtlen, mégis lehetséges, hogy egy ilyen inhibitor vagy specifikus a makrofág-T-sejt kölcsönhatásra, vagy hogy a B-sejt APC valahogyan leküzdi vagy kikerüli egy ilyen aktivitás hatását. Humán rendszerben kapott adatok arra utalnak, hogy az IL-10 nem monocita által termelt valamilyen szolubilis gátló- vagy kostimuláló faktor révén éri el, hogy gátolja a T-helper sejtek proliferációját. Hatásait mindazonáltal úgy magyarázhatjuk, hogy az IL-10 legyengíti a II osztályú MHC antigén megjelenését humán monocitákon, és ezt még nem figyelték meg egérrendszerben.

Effektorfunkció-szabályozáson kívül az IL-10 szerepet játszhat az antitesttermeléssel és a késleltetett típusú túlérzékenységgel (delayed type hypersensitivity=DTH) szembeni immunválasz megindításában azáltal, hogy aktiválja a különböző típusú citokineket termelő CD4 T-helper sejtek különböző alcsoportjait. Az a tény, hogy mind a B-sejtek, mind a makrofágok termelnek IL-10-et, és mint APC-k is működnek, miközben érzékenyek a különböző citokinmodulátorokra (az IFNy számos B-sejt-funkciót gátol; az IL-10 gátolja a makrofágfunkciót, de nem gátolja a B-sejt APC funkciót), alátámasztja ezt az elméletet. Ezenfelül a vizsgálatokból kitűnt, hogy az IL-10 szignifikáns gátlóhatást fejt ki a makrofágok citokinszintézisére, továbbá jelentős morfológiai változást hoz létre a peritoneális makrofágokban. Összegezve a megfigyeléseket, az IL-10 nemcsak a T-sejt-válaszok szabályozásában játszik fontos szerepet, hanem fertőzés vagy sérülés által kiváltott akut gyulladásos válaszoknak is fontos modulátora.

A D) tanulmányban megvizsgáljuk, hogy az IL-10 gátolja-e in vivő a szuperantigénközvetített toxicitást. Az IL-10 képes gátolni a T-sejtek citokintermelését, részben azáltal, hogy gátolja a makrofágok T-sejt-aktiváló képességét. A szuperantigének olyan molekulák, amelyek úgy aktiválják a T-sejteket, hogy „hidat” képeznek a TCR [T-limfocita (antigén) receptor] Vp lánca és az APC-ken jelen lévő II osztályú MHC molekulák között. Ezen eredmények szerint az IL-10 meg tudja gátolni a makrofágok által bemutatott szuperantigénekkel aktivált T-sejtek citokintermelését. Ezt a hatást in vitro figyeltük meg. A szuperantigének lehetnek endogén eredetűek, például vírusok kódolta szuperantigének, vagy exogén eredetűek, ilyenek például a mikrobiális enterotoxinok. Ez utóbbi csoport legbehatóbban tanulmányozott szuperantigénjei közé tartoznak a Staphylococcus enterotoxinok. Ma már tudjuk, hogy e toxinok által kifejtett toxicitás in vivő a toxinok T-sejt-aktiváló képességétől függ. Ezeknek a megfigyeléseknek az alapján arra lehet következtetni, hogy az olyan szerek, amelyek gátolják a T-sejtek aktiválódását, meg tudják akadályozni a szuperantigéneket abban, hogy toxikus hatást fejtsenek ki. Ez megegyezik azzal a megfigyeléssel, hogy a ciklosporin megakadályozza a SEB-közvetített toxicitást. Ennek a modellnek megfelelően a TNFa a toxicitás fő mediátora. Az itt közölt eredmények rámutatnak, hogy az IL-10 valószínűleg azáltal tudja megakadályozni a SEB toxicitását, hogy képes gátolni a T-sejtek TNF-termelését.

Ezek a megfigyelések érdekes következtetésekhez vezetnek az IL-10 in vivő hatásmechanizmusát illetően. Kimutatták, hogy az IL-10 gátolja a makrofágfunkciókat, azaz a citokintermelést, a T-sejtek aktiválását, és megindítja a B-sejtekben az la antigén kifejeződését. Minthogy azonban a SEB-toxicitás az APC által kifejezett la antigének kifejeződésétől függ, ezeknek a kísérleteknek az in vivő kimenetele bizonytalan volt. Az a körülmény, hogy az IL-10 akadályozza a SEB-indukált toxicitást, azt sugallja, hogy a fő in vivő APC a makrofág, nem pedig a B-sejt.

Ezek az eredmények fontos következtetésekhez vezetnek az IL-10 terápiás felhasználását illetően. Az élelmiszer-mérgezést okozó Staphylococcus enterotoxinok mellett legutóbb nagyszámú betegségről közölték, hogy szuperantigén indukálta, ilyen a toxikus sokk szindróma, a Kawasaki-betegség, a Streptococcus toxinok okozta betegségek és a rheumatoid arthritisszerű autoimmun betegségek.

Az IL-10 igen hatékonyan védi meg az egereket a letális endoxémiától. Ez a felfedezés arra enged következtetni, hogy az IL-10 hasznos lehet a bakteriális szepszis kezelésében. Számos más reagens, például a TNFa vagy endotoxin elleni antitestek és az IL-1Ra klinikai kipróbálása jelenleg folyamatban van a bakteriális szepszis kezelésére, azonban állatmodell-kísérletekben a legtöbb ilyen szert a szepszisindukció előtt szükséges beadni az optimális védelem elérése érdekében. Egy kivétel az IL-1Ra, amely hatékony, ha állatmodell-kísérletekben a szepszisindukcióval egy időben adják be, de elég nagy mennyiségeket kell alkalmazni ahhoz, hogy minden endogén IL—1 receptort blokkoljon. Az IL-10 farmakológiai dózisai azonban, amelyek ugyancsak egy sor hatást gyakorolnak a makrofág/monocita funkcióra, és a letális endoxémia elleni védelemhez hozzájárulnak, nagyon valószínű, hogy kisebb mennyiségek, mint amennyi a receptor telítéséhez szükséges.

Az előző fejtegetések az IL-10 alkalmazásának az immunrendszer különböző megnyilvánulásai szabályozására és differenciálódására kifejtett hatásaira irányultak, a következőkben azt taglaljuk, hogy mit érhetünk el az IL-10 citokinhatásának anti-IL-10 antitestekkel való blokkolásával.

Az itt közölt adatok szerint, ha egereket születésüktől kifejlett korukig folyamatosan anti-IL-10 antitestekkel kezelünk, drasztikusan csökken a teljes Ly-1 Bsejt-szám és funkció anélkül, hogy megváltozna ugyanezen állatok lépében a konvencionális B-sejtek száma, fenotípusa vagy immunkompetenciája. Számos megfigyelés támasztja alá a Ly-1 B-sejtek kimerülését anti-IL-10-zel kezelt egerekben: a) az anti-IL-10-zel kezelt egerek peritoneális üregeiben kevés B-sejt van, vagy egyáltalán nincs B-sejt, holott normálegerekben a Ly-1 B-sejtek feldúsulnak [DNAX állattartó berendezésben a 8 hetes BALB/c egerek peritoneális mosott sejtjei kevesebb mint 5% konvencionális B-sejtet tartalmaznak, fenotipizálással meghatározva]; b) anti-IL—10-zel kezelt egerek a normálszérum IgM szintek 0-10%-át tartalmazzák, és ez egybevág előze18

HU 224 437 Β1 tes rekonstitúciós kísérletek adataival, amelyekben a Ly-1 B-sejteket a keringő IgM fő forrásaként azonosították; és c) az anti-IL-10-zel kezelt egerek nem, vagy kevés antitestet termelnek foszforil-kolin- és a1,3-dextráninjekcióra adott válaszként. A foszforil-kolin és az a1,3-dextrán antigénekre a Ly-1 B-sejt-alcsoport képviseli a specifikus B-sejteket. Ezek az adatok azt sugallják, hogy egy változatlan konvencionális B-sejt kompartment az anti-IL-10-zel kezelt egerekben éppen úgy, mint a lép B-sejtjeinek - amelyek normálsejt felület marker fenotípusokat képviselnek, és normálmódon válaszolnak tímuszdependens antigénre és B-sejt-mitogénekre -, változatlan a száma. Úgy találtuk, hogy az anti-IL-10-zel kezelt egerekben a Ly-1 B-sejtek szelektív kimerülése átmeneti, mivel a Ly-1 B-sejtek újra megjelennek ezeknek az állatoknak a peritoneális üregeiben az anti-IL-10-zel való kezelés megszakítása után több hét múlva.

Több lehetséges mechanizmust vettünk fontolóra a Ly-1 B-sejtek szelektív kimerítésének magyarázatára anti-IL-10-zel kezelt egerekben. A bemutatott adatok arra mutatnak, hogy ez legalább részben az anti-IL-10-kezelés után megnövekedett IFN következménye, ugyanis a neutralizáló anti-IL—10 alkalmazása ezekben a kísérletekben lényegében megakadályozta a peritoneális B-sejtek kimerítését. Az a következtetés, hogy az IFNy akár közvetlenül, akár közvetve gátolja a Ly-1 B-sejtek kifejlődését, arra az előbbi megfigyelésre emlékeztet, hogy az IFNy gyengén elnyomja a Ly-1⁺ B-limfóma BCL1 sejtek IL—5 által indukált proliferációját. Kiterjesztve ezeket a vizsgálatokat, megfigyeltük, hogy normál BALB/c egerekből származó peritoneális sejtek esetén az LPS-indukált proliferáció IFNy-közvetített szuppressziója következik be, de a lépsejtek esetén nem. Még nem teljesen tisztázott, hogy vajon az anti-IL-10-zel kezelt egerekben csak az IFNy növekedése járul-e hozzá a Ly-1 B-sejtek kimerüléséhez, és hogy vajon ez az IFNy közvetlen hatását tükrözi-e a Ly-1 B-sejtekre, vagy hogy ez esetleg valamilyen IFNy-közvetített közvetett hatás-e. Lehetséges, hogy az anti-IL-10-zel kezelt egerekben más változások is előfordulnak, amelyek hozzájárulnak a Ly-1 B-sejtek kimerüléséhez. Az anti-IL-10-zel kezelt egerek közel ötvenezer érzékenyebbek az LPS-indukált sokk következtében az elhullásra. Ismert, hogy ezt a körülményt monokinek közvetítik. Ezekben a kísérletekben 32 anti-IL- 10-zel kezelt egér közül 5-ben jelentős IL-6-szérumszinteket találtunk. Az IL—6 egy olyan monokin, amely normálállatok keringésében nem fordul elő, és nem tudtuk kimutatni 10 kontrollegerünk egyikének szérumában sem. Jóllehet az IL-6-transzgenikus egerek vagy állatok erősen emelkedett szérum monokin szinteket tartalmaznak LPS in vivő alkalmazása következtében, úgy tűnik, hogy Ly-1 B-sejt-számuk változatlan. A korábbi olyan tapasztalatok, miszerint a Ly-1 B-sejtek konstitucionálisan képződnek, de a konvencionális B-sejtek nem, és hogy az IL—10 indukálható, ahhoz a feltételezéshez vezettek, hogy az IL—10 mint egy autókon növekedési faktor működik. Ez most valószínűtlennek látszik annak fényében, hogy nagyszámú perioneális Ly-1 B-sejtet nyertünk mind anti-IL-10, mind anti-IFNy antitestekkel kezelt egerekből.

A Ly-1 B-sejt-kimerített egér, amelyet folyamatos anti-IL-10-kezeléssel állítottunk elő, nagy hasonlóságot mutat az immundeficiens xid egérhez, amely a CBA/CaH egerekből - melyekben nincsenek Ly-1 B-sejtek - származó spontán mutáns törzs, és nem ad feleletet a tímuszindependens antigének egy alcsoportjára. E hasonlóságok ellenére előzetes vizsgálataink kiderítették, hogy a xid egerek normálmódon termelnek IL-1O-et, és működőképes IL-10 receptorokat tartalmaznak, s ez a xid egereket és az anti-IL—10-zel kezelt egereket mechanisztikusán megkülönbözteti. Ezenkívül van még egy tulajdonság, mely megkülönbözteti a xid egerektől az anti-IL-10-zel kezelt egereket, éspedig, hogy a xid egerek lépsejtjei anti-IgM-stimulálásra képesek válaszolni, az utóbbi állatok lépsejtjei nem.

Az IL-10 fiziológiai szerepének tanulmányozása során egereket születésüktől kifejlett korukig oltottunk olyan monoklonális antitestekkel, amelyek specifikusan neutralizálják az IL-10-et. Ez a kezelés nagyszámú megkülönböztethető változást okozott az állatok immunstátusában. Az állatokra jellemző volt, hogy növekedett a keringésben a TNFa és INFy, és sok esetben az IL—6 is. Ezek a hatások megegyeznek az IL-10 in vitro tulajdonságait illetően az előzőek során közöltekkel, miszerint hatékonyan gátolja az IFNy- és monokíntermelést sejttenyésztéses kísérletekben. Úgy tűnik, hogy az endogén IFNy megnövekedése a felelős az anti-IL-10-kezelés számos más következményéért. Például: ez vezet a Ly-1 B-sejtek kimerüléséhez, ami a továbbiakban hozzájárul a keringő IgM és IgA antitestek csökkenéséhez és a foszforil-kolinra és a1,3-dextránra adott specifikus antitestválaszokhoz. A megnövekedett IFNy-szintek valószínűleg szintén felelősek a keringő lgG2a megnövekedéséért, ugyanis ezt az izotípust pozitívan szabályozza az IFNy. A peritoneális T-sejtek, granulociták és keringő lgG2a növekedésében bekövetkező többi változás mechanisztikusán nem értelmezhető, de ezek egy szekunder citokinzavar következményei lehetnek. Az anti-IL-10-zel kezelt egerek általánosságban egészségesek, de nagymértékben hajlamosak az endotoxin által indukált sokkban való elhullásra. Ez a letális gyulladásos reakció egy monokin által közvetített történés, amelyet meg lehet előzni TNFa-; IL—1-, IL—6- vagy endotoxinspecifikus antitestek passzív átvitelével. Ennélfogva nem meglepő, hogy az anti-IL—10-zel kezelt egerek, melyek az endogén monokin felerősödését mutatják, és hiányzik a nagy valószínűséggel antiendotoxin antitesteket termelő B-sejt-populációjuk (azaz a Ly-1 B-sejtek), sokkal érzékenyebbek e gyulladásos reakcióval szemben. Ezek az adatok felvetik az IL—10-nek, mint gyulladásgátló szernek a klinikai szerepét. Ezzel az elképzeléssel megegyezően a kísérletek azt mutatják, hogy az IL-10 farmakológiai dózisai megvédik az egereket az endotoxinindukált sokkban való elhullástól.

Bár az anti-IL—10-zel kezelt egerek vázolt fenotípusa világosan megegyezik az IL-10 ismert in vitro tulaj19

HU 224 437 Β1 donságaival, mindamellett ellentétes azokkal az előző közleményekkel, amelyek az egerek géntechnikával való IL—10 deficienssé változtatását tárgyalják. Ezekben a mutánsokban a keringő IFNy-, TNFa- és IL-6-szintek kimutathatatlanok, a peritoneális üregekben a Ly-1 B-sejt-szám normális, és első megközelítésben a szérum lg szintek is normálisak. Ennek az ellentmondásnak a magyarázata nem világos, bár hasonló ellentétes helyzet áll fenn az IL-2-hiányos egér és néhány olyan közlés között, amelyek olyan egerekről szólnak, amelyeket anti-IL—2 receptor antitestekkel kezeltek születésüktől kifejlett korukig. Az egyik magyarázat a citokinrendszer jól ismert bőségén alapul. Lehetséges, hogy a fejlődő egérembrió kompenzálni fogja egy kritikus citokin gén elvesztését azzal, hogy egy szorosan rokon funkciót kódoló citokin gén expresszióját sokszorozza. Például ha az IL—4 több tulajdonságát megosztja az IL-10-zel, ez a citokin kitűnő jelölt lenne az IL—10 teljes elvesztésének a kompenzálására, és ezáltal expressziója felerősödne IL—10-hiányos egerekben. Ezzel szemben az endogén IL—10 neutralizációja az egerek születésétől fogva végzett antitestkezelés révén a citokin „szivárgásos” eltávolítását jelentené a legjobb esetben, és így az endogén IL—10 visszamaradt nyomai elégségesek lehetnek a tökéletes immunhiányosság elkerülésére, és egy kompenzációs citokin folyamat szabályozott aktiválására. Egy másik magyarázat szerint az antitesttel kezelt állatok mesterséges immunválaszokat adnak a beadott xenogén antitestekre, és/vagy a keletkezett immunkomplexeket nem lehet teljesen eltávolítani. Ez az alternatíva azonban valószínűtlennek látszik, mivel a megfelelő izotípusú kontroliantitestek és más citokinek elleni antitestek, amelyek ugyancsak immunkomplexeket képeznének in vivő, nem hoznak létre olyan immunmodulációkat, mint amilyeneket az anti-IL-10-zel kezelt egereknek tulajdonítanak.

Jóllehet az anti-IL-10-zel kezelt egerekben megfigyelt immunmodulációs kép nem korrelál teljesen egyetlen ismert humán immunhiányos betegséggel, bizonyos hasonlóságok fennállnak a Wiskott-Aldrich-betegek esetében és az IgA-hiányos szindrómában szenvedő betegek esetében. Ezeket a humán immunhiányos állapotokat a keringő IgM, illetve IgA hiánya jellemzi, továbbá csökkent képesség antibakteriális antitestválaszok adására, és gyakran megnő a keringő lgG1-szint. Az lgG1 a fő komplementkötő humán antitestizotípus, amely valószínűleg az egér lgG2a-val korrelál. Megerősítésre vár, hogy vajon az ilyen betegeknél csökkent-e az IL-10-termelés vagy válaszadási készség, és ha igen, vajon ez azután hozzájárul-e immunhiányos állapotukhoz. Az IL—10 potenciális szerepe az IgA-hiányos szindrómában különlegesen izgalmas egy legújabb tanulmány fényében, amely világosan bevonja az IL—10-et, mint fontos kofaktort, melyre a természetes B-sejteknek azért van szükségük, hogy IgA-szekretáló sejtekké differenciálódjanak, miután térhálós anti-CD40 antitestekkel és TGFp-val aktiválták őket. Az a körülmény, hogy az anti-IL-10-zel kezelt egerek képtelenek specifikus antitestválaszokat adni két bakteriális antigénre, azt a nézetet támasztja alá, hogy az IL—10 hatékony adjuváns lesz az antibakteriális immunitásban, mint fent leírtuk.

Az IL-10 fiziológiai szerepéről és potenciális klinikai felhasználásáról adott tájékoztatáson kívül az anti-IL-10-zel kezelt egerek új lehetőséget kínálnak a Ly-1 B-sejtek immunrendszerben elfoglalt helyének a kiértékelésére. Mint fent megjegyeztük, a másodlagos következmények, melyeket az anti-IL-10-zel kezelt egerekben a Ly-1 B-sejtek kimerülése okoz, megerősítik azokat a tulajdonságokat, amelyeket megelőzőleg ezen kis B-sejt-szubpopulációnak tulajdonítottak. Ezek az adatok azonban új ismereteket szolgáltatnak a Ly-1 B-sejtek immunrendszerbeli szerepéről. Különösen célszerű arra következtetni, hogy nincs szükség Ly-1 B-sejtekre az lgG1 -, lgG2a-, lgG2b-, lgG3- vagy IgE-válaszok kifejlődéséhez, minthogy ezen izotípusok szérumszintjei nem csökkennek a Ly-1 B-sejtekre kimerített anti-IL-10-zel kezelt egerekben. Ugyanígy, míg a Ly-1 B-sejtek esszenciálisak bizonyos tímuszindependens II típusú antigének - például ilyen a foszforil-kolin és az a1,3-dextrán - elleni válaszkészséghez, úgy tűnik, nem szükséges másokhoz, például TNP-Ficollhoz és anti-IgM-hez. Valóban, a változatlan vagy enyhén emelkedett keringő lgG3-szintek - ez az egyetlen izotípus, amely kapcsolatban van a B-sejtek poliszacharid antigénekkel szembeni válaszadási készségével - arra utalnak, hogy a Ly-1 B-sejt-hiányos egerek képesek a legtöbb tímuszindependens II típusú antigénre válaszolni. Az anti-IL-10-zel kezelt egerek ebben a tekintetben jól megkülönböztethetők a xid egerektől. A xid egér egy spontán keletkezett immunhiányos egértörzs, amelynek szintén nincsenek Ly-1 Bsejtjei, de nem tud választ adni egyetlen tímuszindependens II típusú antigénre sem.

A Ly-1 B-sejteknek az immunrendszerben való részvételéről kapott tájékozódás mellett az anti-IL-10-zel kezelt egerek lehetővé teszik számunkra, hogy a TNFa in vivő megnövekedésének következményeit kiértékeljük. Adataink mutatják, hogy az IL—10 in vivő antagonizmusa a szérum TNFa szintek lényeges emelkedéséhez vezet. Jóllehet a TNFa-emelkedés kedvezőtlen következményeit (például: szeptikus sokk, cerebrális malária stb.) a fentiekben részletesen taglaltuk, a TNFa emelkedésének sok kedvező következményét is tekintetbe kell venni. Ilyenek az állatmodellekben kimutatott közvetlen antitumorhatások, a granulocita-monocita hematopoetikus ágak expanziója, a radioprotekció és bizonyos autoimmun és fertőző betegségek elleni védelem. E megfontolásokból következően az IL-10 antagonisták jelöltként jönnek számításba terápiás beavatkozás céljára az ilyen típusú betegségek kezelésénél. Mi valóban alátámasztottuk ezt az elgondolást annak bemutatásával, hogy az anti-IL-10 antitestek lényegesen tudják késleltetni az autoimmunitás kifejlődését a lupusra hajlamos NZB/W egerekben.

Összefoglalva, a találmány az IL-10-nek és IL-10 antagonistáknak a monokintermelés szabályozásában való felhasználására vonatkozik. A monokinek számos, betegséggel járó állapot fő mediátorai. Az

HU 224 437 Β1

IL-10 és antagonistái a monokinek, például a TNFa jelentős szuppresszióját eredményezik, és ilyen módon nyújtanak védelmet a nem kívánt gyulladásos reakciók, így a bakteriális szepszis, toxikus sokk, rheumatoid arthritis és pszoriázis ellen. Az IL-10 antagonisták fokozzák a monokinek, például a TNFa szintjét, amely mint tumorellenes szer fejtheti ki hatását, radioprotekciót nyújt, és védelmet bizonyos autoimmun és fertőző betegségekkel szemben.

A találmányt a következő példákkal szemléltetjük, azonban e példákkal nem óhajtjuk korlátozni a találmány oltalmi körét. A vektorok, gazdasejtek kiválasztása, valamint a reagensek koncentrációja, a hőmérsékletek és a különböző egyéb paraméterek értékei csak példaként szolgálnak a találmány alkalmazását illetően, de nincs korlátozó jelentésük.

1. példa

Humán IL-10 kifejeződése bakteriális gazdasejtben

Szintetikus humán IL-10 gént állítottunk össze több kémiailag szintetizált kettős szálú DNS-fragmentumból. Az így előállított expressziós vektornak TAC-RBS-hlL-10 elnevezést adtunk. A klónozás és kifejezés standard bakteriális rendszerben, például E. coli K12 JM101, JM103 vagy hasonló törzsben történt [lásd: Viera és Messing, Gene, 19, 259-268 (1982)]. A restrikciós endonukleázzal való emésztéseket és a ligázreakciókat standard technikák szerint végeztük. [Például: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York); Ausuber et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York (1987 és periodikus kiegészítések); az említett kiadványokat referenciaként tekintjük.]

Kis mennyiségű plazmid izolálásához az alkalikus módszert használjuk. Nagybani feldolgozáshoz módosított alkalikus módszert használunk, amelyben azonos mennyiségű izopropil-alkohollal csapjuk ki a derített lizátumból a nukleinsavakat. Az RNS-t hideg 2,5 M ammónium-acetát-oldattal csapjuk ki, majd cézium-kloriddal egyensúlyi sűrűségcentrifugálás és etidium-bromiddal való kimutatás következik.

Szűrőhibridizáláshoz kerek Whatman 540 szűrőket használunk, ezekre visszük fel a telepeket, amelyeket ezután lizálunk. Fixáláshoz a következő oldatokat használjuk egymás után: 0,5 M nátrium-hidroxid, 1,5 M nátrium-klorid; 1 M trisz.HCI (pH=8,0), 1,5 M nátrium-klorid (mindkét oldattal 2 perc); végül hevítés 80 °C-on (30 perc). A hibridizálást 6«SSPE, 20% formamid, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS), 100 pg/ml E. coli tRNS és 100 gg/ml Coomassie Brilliant Blue G-250- (BioRad) tartalmú oldatban, 42 °C-on 6 órán át ³²P-jelzett (kinázos) szintetikus DNS-ekkel végezzük. (20*SSPE készítése: 174 g nátrium-kloridot, 27,6 g nátrium-dihidrogén-foszfát-víz 1/9-et és 7,4 g EDTA-t 800 ml vízben feloldunk. A pH-t 7,4-re állítjuk be nátrium-hidroxid-oldattal. A térfogatot 1 literre egészítjük ki, majd autoklávban sterilizáljuk.) A szűrőket kétszer mossuk (15 perc, szobahőmérséklet) 1«SSPE, 0,1% SDS-tartalmú oldattal. Autoradiografálás után (Fuji RX film) a pozitív telepeket úgy lokalizáljuk, hogy az újból kinőtt telepeket a szűrökön kékre festődött telepekhez igazítjuk. A DNS-t didezoximódszerrel Sanger és munkatársai szerint [Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463 (1977)] szekvenáljuk. A didezoxireakciókhoz szolgáló templátokként vagy az M13mp vektorokba reklónozott megfelelő szakaszok egyszálú DNS-eit [például: Messing et al., Nucleic Acids Rés., 9, 309 (1981)], vagy olyan kétszálú DNS-eket használtunk, melyeket a minialkalikus módszerrel a következőképpen készítettünk: denaturálás 0,2 M nátrium-hidroxid-oldattal (5 perc; szobahőmérséklet), kicsapás a 0,2 M nátrium-hidroxid-, 1,43 M ammónium-acetát-tartalmú oldatból 2 térfogat etanol hozzáadásával. A DNS-t foszfor-amidit-módszerrel szintetizáljuk az Applied Biosystems 380A szintetizátoraival. A szintetizálást, a védőcsoport-eltávolítást, a hasítást és a tisztítást (7 M húgysavas PAGE, kioldás, DEAE-cellulóz kromatográfia) a 380A szintetizátor kézikönyvében leírtak szerint végezzük.

A klónozandó szintetikus DNS-ek komplementer szálait (400-400 ng) összekeverjük, és polinukleotid-kinázzal foszforiláljuk 50 ml reakció-térfogatban. Ezt a DNS-t ligáljuk 1 mg megfelelő restrikciós enzimekkel emésztett vektor-DNS-sel. A ligálásokat 50 μΙ térfogatban, szobahőmérsékleten, 4-12 órán át végezzük. A foszforilálás, restrikciós enzimes emésztés, polimerázreakciók és ligálás leírását lásd Maniatis és munkatársai kézikönyvében (lásd fentebb). A telepeket kívánt esetben lacZ+-ra szűrjük ampicillinnel, izopropil-1-tiobéta-D-galaktoziddal (0,4 mM IPTG-vel) és 5-bróm4-klór-3-indolil-béta-D-galaktopiranoziddal (40 pg/ml X-gal-lal) kiegészített L-agar-lemezre öntéssel.

A TAC-RBS vektort úgy szerkesztjük, hogy a tacP-t hordozó pDR540 plazmid (Pharmacia) egyetlen BamHI helyét DNS-polimeráz segítségével betöltjük. Ezt ezután olyan nem foszforilált szintetikus oligonukleotidokhoz (Pharmacia) ligáljuk, amelyek egy általánosan elfogadott riboszómakötő helyet (RBS=ribosome binding site; GTAAGGAGGTTTAAC) kódoló kétszálú fragmentumot képeznek. Ligálás után a keveréket foszforiláljuk, és az ATGAGCTCAT Sstl linkerhez ligáljuk. Ezt a komplexet ezután Sstl-gyel és EcoRI-gyel hasítjuk, és a poliakrilamid-gélelektroforézissel (PAGE) izolált 173 bp méretű fragmentumot az EcoRI-Sstl-gyel hasított pUC 19-be (Pharmacia, leírását lásd alább) klónozzuk. A végső szerkezet (neve: TAC-RBS) RBS-ATG-polilinker szakaszának a szekvenciáját az 5,017,691 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban - amelyet a jelen leírásban referenciaként tekintünk - közük.

A szintetikus IL-10 gént nyolc lépésben illesztjük be a pUC19 plazmidba. Az egyes lépéseknél a delécióktól mentes inszertumokat és/vagy inszertumokat a klónozás után úgy tudjuk kimutatni, hogy a pUC19-ben lévő lacZ(a) gént az első lépésben beépített ATG startkodon szabályozása alatt tartjuk. A deléciós és/vagy inszerciós változásokat tartalmazó kiónokat úgy szűrhetjük ki, hogy X-gal- és IPTG-tartalmú L-ampicillin leme21

HU 224 437 Β1 zeken a kék telepeket megjelöljük. Egy másik eljárás szerint minden lépésben kis mennyiségű plazmid DNS készítményeken az inszertumok szekvenciáit univerzális szekvenáló primer segítségével egyszerűen ellenőrizhetjük.

1. lépés. A TAC-RBS vektort Sstl-gyel emésztjük,

T4 DNS-polimerázzal (ennek 3’-exonukleáz-aktivitása az Sstl végeken a 3’ túlnyúló szálakat megemészti, és így tompa végű fragmentumok keletkeznek) kezeljük, majd a T4 DNS-polimeráz hatástalanítása után Eco- 10 Rl-gyel kezeljük, amikor is egy 173 bp méretű fragmentumot kapunk. Ez a fragmentum tartalmazza a TAB-RBS szakaszt, amelynek ATG startkodonjánál tompa vége van, ellenkező végén pedig egy EcoRI hasítási hely. Végül a 173 bp hosszú TAC-RBS fragmen- 15 tumot izoláljuk.

2. lépés. Az 1. lépésben izolált TAC-RBS fragmentumot összekeverjük az EcoRI/Kpnl-gyel emésztett pUC19 plazmiddal és az 1A/B szintetikus fragmentummal, amelynek - mint alább bemutatjuk - 5'-terminális 20 vége tompa, 3'-terminális vége pedig lépcsős a Kpnl-gyel való hasítás következtében. Ez a KpnI vég szomszédos egy BstEII hellyel, és ettől 3’-irányban helyezkedik el. A fragmentumokat ligáljuk, és így kapjuk a 2. lépés szerinti pUC19-et.

3. lépés. A 2A/B és a 3A/B szintetikus fragmentumokat - alább bemutatjuk - összekeverjük a 2. lépésben kapott, BstEII/Smal-gyel emésztett pUC19 plazmiddal (sokszorozás és tisztítás után). A komponenseket ligáljuk, és így jutunk a 3. lépés szerinti 30 pUC19-hez. Megjegyezzük, hogy a 3A/B fragmentum 3’-terminális vége extra bázisokat tartalmaz, amelyek Smal tompa véget képeznek. Ezeket az extra bázisokat a 4. lépésben lehasítjuk. A 2A/B és 3A/B fragmentumok 9 komplementer csoportból álló egyszálú vége- 35 két is tartalmaznak, amelyek a keveréskor egymáshoz illeszkednek, és ez lehetővé teszi, hogy a 2A/B 5’ BstEII-vel hasított vége és a 3A/B 3’ tompa vége a pUC19-hez ligálódjék.

4. lépés. A 3. lépésben kapott pUC19-et (sokszorozás és tisztítás után) AflII/Xbal-gyel emésztjük, újra tisztítjuk, majd összekeverjük a 4A/B szintetikus fragmentummal (lásd alább). A komponenseket ligáljuk, és így kapjuk a 4. lépés szerinti pUC19-et.

5. lépés. A 4. lépésben kapott pUC19-et (sokszorozás és tisztítás után) Xbal/Sall-gyel emésztjük, és összekeverjük az 5A/B szintetikus fragmentummal (lásd alább). Ligálás következik, és így képezzük az 5. lépés szerinti pUC19-et. Megjegyezzük, hogy az 5A/B lépcsős végét a 6. lépésben Hpal-gyel való emésztéssel távolítjuk el.

6. lépés. Az 5. lépésben kapott pUC19-et (sokszorozás és tisztítás után) Hpal/Pstl-gyel emésztjük, majd összekeverjük a 6A/B szintetikus fragmentummal (lásd alább). A komponenseket ligáljuk, és így kapjuk a 6. lépés szerinti pUC19-et.

7. lépés. A 6. lépésben kapott pUC19-et (sokszorozás és tisztítás után) Clal/Sphl-gyel emésztjük, majd a 7A/B szintetikus fragmentummal (lásd alább) keverjük össze. Ligálás után kapjuk a 7. lépés szerinti pUC19-et.

8. lépés. A 7. lépésben kapott pUC19-et (sokszorozás és tisztítás után) összekeverjük a 8A/B és 9A/B szintetikus fragmentumokkal. Ligálás után kapjuk a végső szerkezetet. A végső szerkezetet az E. coli K-12 LM101 törzsbe (hozzáférhető például az ATCC intézménynél, 33 876 szám alatt) építjük be standard technikák segítségével. Tenyésztés után a JM101 sejtekből kivonjuk a proteint, és a kivonatok hígításait biológiai aktivitásra vizsgáljuk. Az említett fragmentumszekvenciákat az 1. táblázatban ismertetjük.

1. táblázat

A kisbetűk azt jelentik, hogy ezeken a helyeken a bázis a natív szekvencia ugyanezen a helyén lévő bázistól különbözik.

1A/B fragmentum:

AGCCCAGGCC AGGGCACCCA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC ACTTCTCGGGTCCGG TCCCGTGGGT CAGACTCTTG TCGACGTGGG TGAAGCCAGGtAACC ggtac

GGTCCaTTGG C

2A/B fragmentum:

GtAACCTGCC TAACATGCTT CGAGATCTCC GAGATGCCTT CAGCA— GACGG ATTGTACGAA GCTCTAGAGG CTCTACGGAA GTCGTGAGTGAAGACTTTCTTT

CTCACTTC

3A/B fragmentum:

CAAATGAAGG ATCAGCTGGA CAACTTGTTc TtAAG

TGAAAGAAA GTTTACTTCC TAGTCGACCT GTTGAACAAg AaTTC

4A/B fragmentum:

GAGTCCTTGC TGGAGGACTT TAAGGGTTAC CTGGGTTGCC AAGCC— CTCAGGAACG ACCTCCTGAA ATTCCCAATG GACCCAACGG TTCGGTTGTCTGAGA TGATCCAGTT TTAt

AACAGACTCT ACTAGGTCAA AATaGAtC

HU 224 437 Β1

1. táblázat (folytatás)

5A/B fragmentum:

CTaGAGGAGG

GAtCTCCTCC

AAGGCGCATG

TTCCGCGTAC

AACTCCCTGG

TTGAGGGACC

CGCTGTCATC

GCGACAGTAG

TGATGCCCCA

ACTACGGGGT

TtAACg

AaTTGcagct

GGGAGAACCT

CCCTCTTGGA

GATctgca

CTAg

AGCTGAGAAC CAAGACCCAG ACATCTCGACTCTTG GTTCTGGGTC AGTAG6A/B fragmentum:

GAAGACCCTC AGGCTGAGGC TACGGCTTCTGGGAG TCCGACTCCG ATGCC7A/B fragmentum:

CGATTTCTTC CCTGTCAAAA CAAGAGCAAG GCCGTGGAGC AGGTGTAAAGAAG GGACAGTTTT GTTCTCGTTC CGGCACCTCG TCCACAAGAAcGCgT gcatg

TTCTTgCGcA c

8A/B fragmentum:

CGCGTTTAAT AATAAGCTCC AAGACAAAGG CATCTACAAA GCCATAAATTA TTATTCGAGG TTCTGTTTCC GTAGATGTTT CGGTAGAGTGAGTTT GAC

CTCA

9A/B fragmentum:

ATCTTCATCA ACTACATAGA AGCCTACATG ACAAT—

CTCAAACTG TAGAAGTAGT TGATGTATCT TCGGATGTAC TGTTAGAAGATACGA AACTGA CTTCTATGCT TTGACTtcga

2. példa

A vlL-10 kifejezése COS 7 majomsejtekben A vlL-10 nyílt leolvasási keretét kódoló gént polimeráz-láncreakcióval sokszorozzuk olyan primerek használatával, amelyek lehetővé teszik, hogy a kiegészített fragmentumot később egy EcoRI-gyel emésztett pcD(SRa) vektorba [Takebe et al., Mól. Cell. Bioi. 8, 466-472 (1988)] építhessük be. A beépített fragmentum kódolószálát alább bemutatjuk (a nyílt leolvasási keretet nagybetűkkel jelöljük):

aattcATGGA

TACCTGGCAC

GACCTAAGAG

CGAGGTAGAT

ATGCCAGGCC

CACAGGCTGA

GGTGAAAATC

CCTGCCGTGT

TTAACAAGCT

ATTTTTATTA

GCGAAGGTTA

CTGAGTGTGG

ATGCCTTCAG

AACCTTTTGC

CTGTCAGAAA

AACCAGGAC

TAAAGACCCT

GAGAACAAGA

GCAGGAAAAA

ACTACATAGA

GTGGTCACTC

AGGTACAGAC

TCGTGTTAAA

TCAAGGAGTC

TGATCCAATT

CCTGAAGCCA

ACGGCTCCGC

GTAAAGCTGT

GGAATTTACA

AGCATACATG

TGCAGTGCCT

CAATGTGACA

ACCTTTTTCC

TCTGCTAGAG

CTACCTGGAG

AAGACCATGT

CTGCGCAGGT

GGAACAGATA

AAGCCATGAG

ACAATTAAAG

GGTGCTGCTT

ATTTTCCCCA

AGACAAAGGA

GACTTTAAGG

GAAGTCATGC

CAATTCTTTG

GCCACAGGTT

AAAAATGCCT

TGAATTTGAC

CCAGGTGAg

Azokat a kiónokat, amelyek az inszertumot a helyes irányítottsággal tartalmazzák, a vlL-10 expressziójának és/vagy a restrikciós emésztési elegyek elektroforetikus képének a segítségével azonosítjuk. Egy vlL-10-et hordozó ilyen vektor pBCRFI(SRa) elnevezést kapott, és az ATCC intézményben 68 193 letéti szám alatt helyeztük letétbe. A pBCRFI(SRa) vektort E. coli MC1061 sejtekben szaporítottuk, standard technikákkal izoláltuk, és COS 7 majomsejtek transzformálására használjuk a következőképpen: A transzfekciót megelőző napon egy-egy 100 mm átmérőjű lemezre körülbelül 1,5*10⁶ COS 7 majomsejtet oltunk le. A lemezek Dulbecco által módosított, 5% fetális borjúszérumot 60 (FCS) és 2 mM glutamint tartalmazó Eagle táptalajt (DME) tartalmaznak. A transzfekció kiviteléhez a COS 7 majomsejteket tripszinnel való inkubálás segítségével távolítjuk el a csészékről, a sejteket kétszer mossuk szérummentes DME-ben, majd szérummentes DMEben szuszpendáljuk úgy, hogy a sűrűség 10⁷ sejt/ml legyen. A szuszpenzió 0,75 ml-éhez 20 pg DNS-t adunk, és átvisszük steril, 0,4 cm-es elektroporációs küvettába. A sejteket 10 perc múlva 200 V és 960 pF mellett pulzáljuk BioRad Gene Pulser készülékben. További 10 perc múlva a sejteket eltávolítjuk a küvettából, és hozzáadjuk 20 ml DME-hez, mely 5% FCS-t, 2 mM glutamint, penicillint, sztreptomicint és gentamicint tartal23

HU 224 437 Β1 máz. A szuszpenziót négy 100 mm-es szövettenyésztő csészébe osztjuk el egyenlő részekben. A csészéket 12-14 órán át 37 °C-on, 5% szén-dioxid-tartalmú atmoszférában tartjuk, majd a táptalajt lecseréljük hasonló táptalajra, amely csak 1% FCS-t tartalmaz. Az inku- 5 bálást további 72 órán át folytatjuk 37 °C-on 5% szén-dioxid mellett. Utána a táptalajt összegyűjtjük, és arra vizsgáljuk, hogy képes-e gátolni az IFNy-szintézist.

Frissen izolált perifériás vér leukocita (PBL= peripheral blood leukocyte) szuszpenzióból (körülbelül 2*10⁶ sejt/ml) 10 ml-eket PHA-val (fitohemagglutinin;

100 ng/ml) inkubálunk 37 °C-on olyan táptalajban, amelynek (i) 90%-át 5% FCS-sel és 2 mM glutaminnal kiegészített DME és (ii) 10%-át olyan COS 7 sejtek fe10 lülúszója alkotja, amelyeket előzőleg pBCRFI(SRa) plazmiddal transzformáltunk. A sejteket és a felülúszókat 24 óra múlva learatjuk, és IFNy mRNS vagy IFNy protein tartalomra vizsgáljuk. A kontrollokat azonos módon kezeljük, kivéve, ha olyan COS 7 tenyészetekről származik a 10%-nyi felülúszó, amelyeket egy nem rokon cDNS-inszertumot hordozó plazmiddal transzformáltunk. A vlL-10-zel kezelt minták a kontrolihoz képest az IFNy-szintézis 50%-os gátlását okozták.

3. példa

A vlL-10 kifejezése Escherichia coliban

Az alább bemutatott érett vlL-10-et kódoló gén E.

coliban kifejezhető.

Thr

Asp

Gin

Cys

Asp

Asn

Phe

Pro

Gin

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Alá

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Phe

Gin

Thr

Lys

Asp

Glu

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Alá

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Alá

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Glu

Alá

Lys

Asp

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Alá

Val

Glu

Gin

Ile

Lys

Asn

Alá

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Alá

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Alá

Tyr

Met

Thr

Ile

Lys

Alá

Arg

A pBCRFI(SRa) cDNS inszertumát reklónozzuk egy M13 plazmidba, ahol kétszer módosítjuk helyre irányuló mutagenezissel: először egy Glal helyet képezünk az érett vlL-10 polipeptidet kódoló szakasz 5’-végén, és másodszor egy BamHI helyet képezünk az érett vlL-10 polipeptidet kódoló szakasz 3’-végén. A mutagenizált szekvenciát ezután könnyen be tudjuk építeni az alább leírt TRPC11 expressziós vektorba.

A TRPC11 vektort a következőképpen szerkesztjük meg: egy szintetikus, általánosan elfogadott RBS fragmentumot Clal linkerekhez (ATGCAT) ligálunk, és a kapott fragmentumokat clal-gyel hasított pMT11hc plazmidba (melyet előzőleg úgy módosítottunk, hogy Clal helyet tartalmazzon) klónozzuk be. A pMT11hc a pBR322-nek egy kicsiny, 2,3 kb méretű, nagy másolatszámú, AMP^R TET^S származéka, és ez a pVX plazmid EcoRI-HindlII polilinker szakaszát tartalmazza (a pVX plazmidot Maniatis és munkatársai írták le; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Az említett plazmidot Clal hasítási hely kialakítása céljából a következőképpen módosítjuk: a pMT11hc-t EcoRI-gyel és BamHI-gyel hasítjuk, a kapott ragadós végeket betöltjük, és egy Clal linkerhez (CATCGATG) ligáljuk. így helyreállítottuk az EcoRI és BamHI helyeket, és a Smal helyet Clal helyre cseréltük. A TRPC11 szerkezet egy transzformált egyede egy tandem RBS szekvenciát tartalmazott, amelyet Clal helyek határoltak. Az egyik Clal helyet és az RBS szekvencia második másolatának egy részét úgy távolítjuk el, hogy a plazmidot Pstl-gyel emésztjük, majd Ba131 nukleázzal kezeljük, EcoRI-gyel hasítjuk, és T4 DNS-polimerázzal kezeljük a négy dezoxinukleotid-trifoszfát jelenlétében. A kapott 30-40 bp méretű fragmentumokat PAGE segítségével izoláljuk, és beklónozzuk a Smal-gyel hasított pUC12-be. A pKC101-ből [Nichols et al., Methods in Enzymology, 101, 155-164 (1983)] származó, E. coli trpP-t hordozó 248 bp méretű EcoRI fragmentumot ezután beklónozzuk az EcoRI helyre, hogy a TRPC11 szerkezetét teljessé tegyük (lásd az 1. ábrát). A TRPC11-et a vlL-10 vektoraként használjuk úgy, hogy először Clal-gyel és BamHI-gyel emésztjük, tisztítjuk, majd egy standard ligálóelegyben az M13 Clal-BamHI fragmentumhoz keverjük, amely az érett BCRF1-et kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazza. A TRPC11-et tartalmazó inszertumot, amelyet TRPC11-BCRF1-nek neveztünk el, E. coli K12 JM101 törzsben (hozzáférhető például az ATCC-nél 33 876 lajstromszámon) szaporítottuk.

A) tanulmány

Az interleukin-4 és-10 különbözőképpen hatnak az interieukin-2-indukált interferon-y-szintézisre és a limfokinaktivált killer aktivitásra

Az ebben a fejezetben bemutatott adatokat az elsőbbségi időpont után Hsu és munkatársai közölték [Int’l (Immunology, 4, 563-569 (1992)], a közleményt azonban itt teljes egészében referenciaként tekintjük.

Összefoglalás

A humán perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC=peripheral blood mononuclear cell) az interleukin-2 (IL—2) citokinek szintézisére és limfokinaktivált killer (LAK) aktivitás kifejtésére serkenti. Mind az interleukin-4 (IL—4), mind az interleukin-10 (IL-10; cytokine synthesis inhibitory factor=CSIF) gátolja az IL—2-indukált IFNy- és TNFa-szintézist humán PBMC-ben. Ellentétben azonban az IL—4-gyel, az IL-10 sem a PBMC és a friss természetes ölősejtek (NK=natural killer) IL—2-indukált proliferációját, sem az IL-2-indukált LAK-aktivitást nem gátolja. Az IL—4 ezenkívül gátolja

HU 224 437 Β1 az IL—2-indukált IFNy szintézisét friss NK sejtekben, míg ezzel ellentétben az IL-10 gátlóhatását a CD14+ sejtek (monociták/makrofágok) közvetítik. Az IL-10 gátolja a TNFa szintézisét monocitákban vagy a monocitákban plusz NK sejtekben, de csak az NK sejtekben történő szintézisét nem. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az IL^t és az IL-10 megkülönböztethető folyamatokon keresztül hatnak az NK sejtekre, és az IL—2-indukált citokinszintézist és a LAK-aktivitást különböző mechanizmusok szabályozzák.

Az interleukin-10 (cytokine synthesis inhibitory factor CSIF) a citokinek - mint az IFNy - szintézisét gátolja egér és humán limfocitákban és monocitákban/makrofágokban. A T-sejtek citokinszintézisére gyakorolt hatása közvetett, a monociták/makrofágok antigénbemutató sejtekként való kapacitásuk szerint közvetítik. Mind az egér, mind a humán IL-10 (mlL-10; hlL-10) homológok az Epstein-Barr-vírus BCRF1 (virális IL-10; vlL-10) nyílt leolvasási keretével, amely szintén IL—10-aktivitást fejt ki egér és humán sejteken. Korábban megfigyelték, hogy a vlL-10 gátolja az IL-2-indukált IFNy-szintézist humán PBMC-ben. Minthogy a közlések szerint az NK sejtek a fő forrásai az IFNy-nak az IL—2-stimulált PBMC-ben, tanulmányoztuk a hlL-10 és vlL-10 hatását az IL—2-indukált citokinszintézisre és LAK-aktivitásra, összehasonlítva egyidejűleg ezeket a citokineket az IL-4-gyel, amely ismert inhibitora a LAK-aktivitásnak. A kapott adatok mutatják, hogy az IL—4, hlL-10 és vlL-10 gátolják az IFNy- és TNFa-szintézist az IL—2-stimulált PBMC-ben, de csak az IL—4 gátolja a tisztított NK sejtek IFNy-szintézisét. Ezenkívül, az IL—4-gyel ellentétben, az IL-10 nem gátolja az IL—2-indukált LAK-aktivitást. Ezek az eredmények egy olyan modellt támogatnak, amelyben az IL—4 és az IL-10 különböző mechanizmusokon keresztül hatnak az NK sejtekre, és az IL—2-indukált citokinszintézis és LAK-aktivitás szabályozása megkülönböztethető folyamatokon keresztül történik.

A1. példa

Az IL-4 és IL-10 hatása az IL-2-indukált citokinszintézisre és a LAK-aktivitásra Citokinek

A humán rekombináns IL-2-t (rlL-2) S. Zurawski (DNAX) állította elő részünkre standard eljárásokkal, vagy vásároltuk a Cetus (Emerville, CA.) cégtől. A humán rIL—4 a Schering-Plough Researchtől származik. A humán rIL—1 β-t a Biosource International cégtől (Camarillo, CA.) vásároltuk. A rekombináns IL—10-et és vlL-10-et COS 7 transzfekciós felülúszókként használtuk; kontrollok gyanánt nem rokon cDNS-sel vagy nem cDNS-sel végzett transzfektálásokból származó felülúszókat használtunk [Viera et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 1172-1176 (1991); Hsu et al., Science, 250, 830-832 (1990); ezeket a közleményeket referenciákként tekintjük]. Az IFNy-t és TNFa-t (Endogén, Boston, MA.) ELISA assay-vel mértük. IL—2 távollétében a citokintermelés az IFNy és TNFa ELISA assay-k érzékenységi határai - 0,3 ng/ml, illetve 12 pg/ml - alatt volt.

Sejtvonalak

Daudi (Burkitt lymphoma) sejteket a ScheringPlough (Lyon, Franciaország) bocsátott rendelkezésünkre. A dr. Lewis Lanier-től kapott COLO vastagbélkarcinóma-sejteket 5% fetális borjúszérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajban tenyésztettük.

Antitestek

A leukocita sejt felületi antigének (CD3, CD4, CD5, CD14, CD16, CD19, CD56) elleni monoklonális antitesteket a Becton-Dickinson cégtől (San Jose, CA.) vásároltuk. A mágneses szemcsével való kimerítéses kísérletekhez (CD3, CD4, CD5, CD14, CD19) való antitesteket a megfelelő sejtvonallal oltott SCID egerek ascites folyadékából állítottuk elő. Az anti-IL—4 és anti-IL—10 neutralizáló antitestek leírása megtalálható például Chretien és munkatársai [J. Immunoi. Methods, 117, 67-81 (1989)] és Yssel és munkatársai [J. Immunoi. Methods, 72, 219-227 (1984)] közleményeiben, melyeket leírásunkban referenciaként tekintünk.

PBMC izolálás és tenyésztés

A humán PBMC-t egészséges donorok fehérvérsejt-trombocita rétegéből (buffy coat) izoláljuk Ficoll-Hypaque-on való centrifugálással, és a sejteket 10⁶/ml mellett rlL-2-vel vagy más citokinekkel vagy nélkülük tenyésztjük 1% humán AB+ szérummal kiegészített Yssel táptalajban. A tenyésztéseket 24 (vagy 96) tartályos lemezeken végezzük 5 napon át, majd a felülúszókat learatjuk. A különböző donoroktól származó PBMC-k IFNy- és TNFa-termelő kapacitása - ha a sejteket IL-2-vel stimuláltuk - változó volt.

Sejttisztítás

A PBMC-t mossuk, és szövettenyésztő csészékben 40 percig 37 °C-on inkubáljuk. Az adherens sejteket úgy gyűjtjük össze, hogy gumibottal lekaparjuk. A nem adherens sejteket eltávolítjuk, ülepítjük, nejlon-gyapot oszlopra visszük, és 40 percig 37 °C-on inkubáljuk. Az oszlopról való leoldás után a sejteket ülepítjük, és 10% FCS/PBS-tartalmú 30%-os Percollban reszuszpendáljuk, majd 40%-os Percollra rétegezzük. Centrifugálás 30 perc, szobahőmérséklet - után a határfelületről a nagy, szemcsés limfocitákat kinyerjük és kétszer mossuk. Ezeket a sejteket anti-CD56 antitesttel (Becton-Dickinson, San Jose, CA.) 30 percig 4 °C-on inkubáljuk, mossuk, majd kecske antiegér FITC konjugátummal (Jackson Immunoresearch, Avondale, PA.) festjük, ezután FACS-szortírozást végzünk. A sejtek 35-50%-át kitevő CD56+ sejteket szortírozzuk. A szortírozott sejtek több mint 99,5%-a CD56+ sejt volt az újbóli analízis szerint. 9*10⁴ tisztított NK sejtet keverünk 3*10⁴ adherens sejttel vagy T-sejtekkel 100 ml végtérfogatban, és IL-2-vel tenyésztjük más citokinekkel együtt vagy nélkülük.

Ugyanazon donortól a következőképpen kapunk tisztított NK sejteket és monocitákat: PBMC-t inkubálunk birkavörösvérsejttel egy éjszakán át, a rozettaképző „E+” sejteket (CD2+) Ficoll-Hypaque gradienscentrifugálással választjuk el a rozettát nem képező „E-” sejtektől. Az E+ sejteket ugyanolyan tisztítási eljárásnak vetjük alá, mint amit a PBMC-re leírtunk (lásd fen25

HU 224 437 Β1 tebb), hogy tisztított NK sejteket kapjunk. Az E- sejteket ezután anti-CD14 monoklonális antitesttel (LeuM3) és FITC-jelzett kecske antiegér IgG antitesttel indubáljuk, majd a CD 14+ sejteket FACStar plus készülékben szortírozzuk. E sejtek tisztasága 98% volt. 10⁵ NK sejtet és 10⁴ tisztított limfocitát keverünk össze 100 ml térfogatban, és a sejteket vagy egyedül, vagy IL-2-vel és mások hozzáadásával - mint fent leírtuk - tenyésztjük.

Eljárhatunk úgy, hogy az NK sejteket és a monocitákat mágneses szemcsés szelekcióval dúsítjuk, majd a következőképpen szortírozzuk: a PBMC-t először anti-CD3, -CD4, -CD5 és -CD19 monoklonális antitestekkel inkubáljuk a T-sejtek és B-sejtek jelölésére.

PBS-sel való kétszeri mosás után kecske antiegér IgG-vel fedett mágneses szemcséket (Dynabeads M-450, Dynal Inc., Great Neck, NY.) adunk a sejtekhez, hogy mágneses szelekcióval válasszuk el az antitesttel fedett T-sejteket a B-sejtektől. A kapott dúsított NK sejteket és monocitákat anti-CD56-PE és anti-CD14-FITC konjugátumokkal jelezzük, és a CD56+ és CD 14+ sejteket sejtszortírozó készülékben izoláljuk. A két szortírozott sejtpopuláció tisztasága 98,5%-nál nagyobb volt.

Citotoxicitási vizsgálat

PBMC-t (10⁶ sejt/ml) inkubálunk 200 E/ml IL-2-vel 3 napig 1 % humán AB+ szérumtartalmú Yssel táptalajban. A tenyésztéseket Linbro 24 tartályos lemezeken (Flow Laboratories, McLean, VA.), 1 ml-es tartályokban végezzük. A tenyésztési idő után a sejteket learatjuk, kétszer mossuk, és effektorsejtek gyanánt használjuk egy ⁵¹Cr-kibocsátási vizsgálatban. [Lásd: Spits és munkatársai, J. Immunoi., 141, 29 (1988). Ezt a közleményt leírásunkban referenciaként tekintjük.] 1000 ⁵¹Cr-jelzett célsejtet (COLO vagy Daudi) különböző számú effektorsejttel keverünk össze 0,25% BSA-tartalmú Iscove táptalajban (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) U alakú 96 tartályos lemezeken. A lemezeket 5 percig 50 g mellett centrifugáljuk, majd 4 órán át 37 °C-on 5% szén-dioxid-tartalmú nedves levegőben inkubáljuk. A mintákat learatjuk, és gamma-számlálóban (LÁB, Bromma, Svédország) számláljuk.

A rekombináns hlL-10, vlL-10 és hlL-10 hatását vizsgáltuk IL—2-indukált IFNy- és TNFa-szintézisre és LAK-aktivitásra perifériás vér mononukleáris sejtekben. A PBMC-t 200 E/ml rlL-2 jelenlétében vagy rlL-4-gyel (200 E/ml) vagy hlL-10-et, illetve vlL-10-et tartalmazó COS 7 felülúszókkal vagy citokin nélkül (álcitokinnel) 5 napig tenyésztettük, ezután mértük a citokinszintézist. Az IL—2-indukált IFNy- és TNFa-szintézis a hlL-10-, vlL-10- vagy IL-4-tartalmú tenyészetekben lényegesen gátolt volt (2A., 2B. ábra).

Az IL-4-gyel kapott eredmények megerősítik azokat a megfigyeléseket, miszerint az IL-4 gátolja az IFN mRNS és protein IL—2-indukált expresszióját. Mind az IL—4, mind az IL-10 dózisfüggően gátolja a citokinszintézist, amely megfordítható anti-hlL-4, illetve anti-hlL—10 monoklonális antitestekkel, de megfelelő izotípusú kontroli-immunglobulinokkal való blokkolással nem (2C., 2D. ábra).

A LAK-aktivitást szintén vizsgáltuk Daudi Burkitt lymphoma sejtvonalon és COLO vastagbélkarcinóma-sejtvonalon. Ezeket hatékonyan ölik a LAK-sejtek, de a friss NK sejtek nem. A Daudi és COLO sejtek elleni IL—2-indukált LAK-aktivitást csak az IL-4-tartalmú tenyészetek blokkolták, de változatlan maradt vagy enyhén fokozódott is a hlL-10 és a vlL-10 tenyészetekben (3A. ábra). Az IL—2-indukált LAK-aktivitást elsődlegesen a CD56(Leul9)+ NK sejtek közvetítik. Az a körülmény, hogy a COLO sejtek elleni LAK-aktivitást nem gátolta az IL-10, azt jelentette, hogy az aktivált NK sejtek által közvetített citotoxicitást nem befolyásolta ez a citokin. Azonban, minthogy az aktivált CD3+ gd+ T-sejtek meg tudják ölni a Daudi sejteket, lehetségesnek tartjuk, hogy az IL-10 stimulálta a Daudi elleni IL—2-indukált gd+ T-sejt citotoxicitást, míg ezzel egy időben blokkolta ezen célsejt elleni IL—2-indukált NK-aktivitást.

Annak érdekében, hogy meghatározzuk PBMC-ben az indukált anti-Daudi LAK-sejtek fenotípusát, IL-2-vel és IL—10-zel tenyésztettük, és CD56+ és CD56- populációt szortíroztunk FACS segítségével, majd Daudi sejtek elleni citotoxicitásra vizsgáltuk. A 3B. ábra mutatja, hogy egyedül IL-2-vel, csak a CD56+ populációban figyeltünk meg szignifikáns LAK-aktivitást. Tehát, míg mind az IL—4, mind az IL-10 gátolja az IL-2-indukált IFNy- és TNFa-szintézist, csak az IL—4 gátolja a PBMC-ben jelen lévő aktivált NK sejtek által kifejtett IL—2-indukált citotoxicitást.

A2. példa

Az IL-10 nem gátolja az IL-2-stimulált tisztított NK sejtekben az IFNy-szintézist és e sejtek proliferációját

Proliferációs vizsgálat

A sejteket gömbölyű fenekű 96 tartályos lemezekre osztjuk szét, 10⁵ sejt/tartály sűrűségben, és citokinek jelenlétében vagy citokinek nélkül inkubáljuk 4 napon át 200 μΙ/tartály összmennyiségben. Ezután 10 μΙ-ben 1 pCi ³H-timidint adunk minden tartályhoz. Hat óra múlva a tenyészeteket learatjuk, és a beépült radioaktivitást szcintillációs számlálóban mérjük.

A közlemények szerint a PBMC-ben az IL-2-indukált IFNy-szintézis fő része inkább NK sejtekben megy végbe, mint T-sejtekben. Ezért a hlL-10, vlL-10 és az IL—4 hatását az IL—2-indukált IFNy-szintézisre FACS-tisztított NK sejtekben (tisztaság: >99,5%) teszteltük. Az IL-4 gátolta az IL—2-indukált IFNy-szintézist ezekben a sejtekben; ezzel szemben sem a hlL-10, sem a vlL-10 nem nyomta el az IFNy-szintézist a tisztított friss NK sejtekben (4A. ábra). Ezenkívül az IL-4 szignifikánsan gátolta a PBMC vagy tisztított NK sejtek proliferációját, míg az IL—10-nek nem volt hatása az IL-2-közvetített proliferációra (4B. ábra).

Az IL—4-gyel ellentétben az IL-10 közvetlenül nem befolyásolja az NK sejteket, de gátolja a monociták azon képességét, hogy kostimulációs szignált adjanak. Ezt a következtetést sokkal világosabban támasztják alá az IL—10-nek az IL—2-indukált IFNy-termelésre kifejtett hatásai. Mint fent megjegyeztük, járulékos sejtkészítmények nem termelnek IFNy-t. Bár az IL-2-stimu26

HU 224 437 Β1

Iáit NK sejtek jelentős IFNy-szinteket termelnek járulékos sejtek nélkül (4A., 5A. és 5B. ábra), műanyaghoz tapadó sejtek és tisztított CD 14+ sejtek hozzáadása a tisztított NK sejtekhez az IFNy-szintézis nagymértékű fokozódását eredményezi. Abból, hogy az IL—10-nek nincs közvetlen hatása az NK sejtekre (4A. és 4B. ábra), arra lehet következtetni, hogy az IL—10 a monocitákra való hatása révén gátolja az IL—2-indukált IFNy-termelést. Ugyanígy, az IL—10 gátlóhatását a T-sejtek citokinszintézisére monocita/makrofág járulékos sejtek közvetítik.

A3. példa

Az IL—10 gátlóhatását NK sejtekben az IL-2-stimulált IFNy- és TNFa-termelésre a monociták közvetítik

Az a körülmény, hogy az IFNy-szintézist az IL—10 PBMC-tenyészetekben gátolja, de tiszta NK sejtekben nem, arra enged következtetni, hogy az IL—10-nek ezt a hatását járulékos sejtek közvetítik. Ezen járulékos sejtek természetének a tanulmányozása céljából NK sejteket tisztítottunk oly módon, hogy a CD56+ sejteket a Percoll gradienscentrifugálással kapott kis sűrűségű sejtfrakciótól vagy a T-sejtre, B-sejtre és monocitára kimerített PBMC-től elválasztottuk, és összekevertük, vagy műanyagra tapadó sejtekkel vagy a Percoll gradiensből származó nagy sűrűségű sejtpopulációval (98%-ban T-sejt). Az adherens sejtek hozzáadása az NK sejtekhez erősen fokozta az NK sejtek IL—2-indukált IFNy-termelését; az adherens sejteknek ezt a stimuláló hatását az IL-10 blokkolta (5A. ábra). Az adherens sejtpopuláció maga az IL-2-re adott válaszban nem termel kimutatható mennyiségű IFNy-t. Ezzel szemben a T-sejt-tartalmú frakciónak nem volt hatása az NK sejtek IL—2-indukált IFNy-termelésére, és nem közvetítette az IL-10 gátlóhatását az IFNy-termelésre (5A. ábra).

A műanyagra tapadó sejtek dúsított monociták, de tartalmazhatnak más sejtpopulációkat is. Annak alátámasztására, hogy a monociták az IL-2-indukált IFNy-termelést fokozzák, és közvetítik ennek IL-10 által történő gátlását is, NK sejteket és CD14+ monocitákat tisztítottunk szortírozással, és e sejteket IL—2 és IL-10 jelenlétében tenyésztettük. Az 5B. ábra mutatja, hogy a tisztított monociták hozzáadása az NK sejtekhez fokozza az IL—2-indukált IFNy-termelést, és hogy az IL-10 gátolja ezt a fokozódást.

Mennyiségi szempontból hasonló eredményeket figyeltünk meg a TNFa szintézisénél. Az 5C. ábra mutatja, hogy - mint előrelátható volt - az NK sejtek kimutatható mennyiségű TNFa-t termeltek IL-2-re adott válaszként. A CD14+ sejtek az IL—2-től függetlenül termelnek TNFa-t. Az IL-10 gátolja a monociták TNFa-termelését akár IL—2 jelenlétében (5C. ábra), akár IL—2 távollétében. Ezzel szemben az NK sejtek TNFa-szintézisét nem gátolta az IL-10. Az NK és CD14+ sejtekkel végzett együttes stimulálás lényegesen magasabb TNFa-szintet eredményezett, mint a csak egyik sejttel végzett stimulálás, és ezt a növekedést blokkolta az IL-10.

Kimutattuk, hogy a monociták és termékeik lényegesen növelik a nyugvó NK sejtek IL—2-indukált IFNy-termelését (5B. ábra). Számos monokin, így az IL—1 és a TNFa a humán és egér NK sejtekben történő IFNy-szintézis kostimulátoraiként működnek különböző feltételek mellett. Az a körülmény, hogy az IL-10 gátolja olyan monokinek szintézisét, mint az IL-1, IL—6 és TNFa az LPS-sel vagy IFNy-val stimulált monocita/makrofágokban, azt sugallja, hogy az IL-10 itt ismertetett hatásai annak tudhatok be, hogy az IL-10 kostimulátor molekulák termelését gátolja a járulékos sejtekben. Megfigyeltük, hogy az adherens sejtek (főleg monocitákból állnak) felülúszói növelik az IL—2-stimulált IFNy-termelést tisztított NK sejtekben, míg az IL-10 jelenlétében tenyésztett adherens sejtek felülúszóinak nincs ilyen tulajdonsága, még akkor sem, ha IL-10-re ki van merítve. Hogy ez a felülúszó-aktivitás hozzájárul-e a járulékos sejtek teljes kostimulációs hatásához, nem tisztázott. Megfigyeltük, hogy az IL-1a és IL—1 β - de az IL—6 és TNFa nem - kostimulálja az IL—2-indukált IFNy-termelést NK sejtekben; mindazonáltal IL—1 hozzáadása egészen 1000 E/ml-ig nem semmisíti meg a nem frakcionált PBMC-ben az IL-10 IL—2-indukált IFNy szintézisére gyakorolt hatását. Ennélfogva fennáll az az eshetőség, hogy egy vagy több további hatás működik ebben a rendszerben, vagy hogy az IL-10 egy szekunder faktor szintézisét indukálja, mely gátolja az NK sejtek citokinszintézisét.

B) tanulmány

Az IL-10 gátolja a humán monociták citokinszintézisét; a monociták által termelt IL-10 önszabályozó szerepe

Az ebben a fejezetben ismertetett adatokat az elsőbbségi időpont után de Waal Malefyt és munkatársai közölték [J. Exptl. Med., 174, 1209-1220 (1990)}; a teljes közleményt leírásunkban referenciaként tekintjük.

Ez a fejezet bemutatja, hogy az LPS-sel aktivált monociták nagy mennyiségű interleukin-10-et (IL-10; előző neve: cytokine synthesis inhibitory factor=CSIF; citokinszintézis-gátló faktor) képesek termelni, dózisfüggő módon. A monociták aktiválása után 7 órával az IL-10 már kimutatható, és a termelés maximális szintjeit 24-48 óra múlva figyeltük meg. Ez a kinetika arra mutat, hogy a monociták az IL—10-et viszonylag későn termelik, összehasonlítva az IL-1a-, IL—1β-, IL-6-, IL-8-, TNFa- és G-CSF-termeléssel, amelyek az aktiválás után 4-8 órával magas szinteken szekretálódnak. Az LPS-sel aktivált monociták IL-10-termelését, ugyanúgy, mint az IL-1a-, IL—1 β-, IL-6-, IL-8-, TNFa-, GM-CSF- és G-CSF-termelést, az IL—4 gátolja. Továbbá ha IL—10-et adunk az IFNa-val, LPS-sel vagy LPS és IFNy kombinációjával aktivált monocitákhoz a tenyésztés megindításakor, ez erősen gátolja az IL-1a-, IL-Ιβ-, IL-6-, IL-8-, TNFa-, GM-CSF- és G-CSF-termelést a transzkripció szintjén. A virális IL-10, mely hasonló biológiai hatásokat gyakorol humán sejtekre, szintén gátolja a monociták TNFa- és GM-CSF-termelését LPS-aktiválás után. Az LPS-sel aktivált monociták neutralizáló anti-IL—10 mAt jelenlétében a csak

HU 224 437 Β1

LPS-kezeléshez viszonyítva nagyobb mennyiségben termelnek citokineket, ami azt jelenti, hogy az endogéntermelődött IL—10 gátolja az IL-1a-, IL—1β-, IL—6-, IL-8-, TNFa-, GM-CSF- és G-CSF-termelést. Ezenkívül az IL-10-nek önszabályozó hatása van, minthogy erősen gátolja az IL—10 mRNS szintézisét az LPS-sel aktivált monocitákban. Továbbá azt találtuk, hogy az endogéntermelődött IL—10 a felelős azért, hogy az LPS-aktiválást követően a monocitákon csökken a II osztályú MHC kifejeződése. Ezeknek az eredményeknek az összegezése arra mutat, hogy az IL—10 fontos szabályozó hatásokat fejt ki az immunológiai és gyulladásos válaszokra, mivel képes legyengíteni a II osztályú MHC-expressziót, és gátolni a gyulladáskeltő citokinek termelését a monocitákban.

Nemrég azonosították az egér interleukin-10-et (mlL-10), és génjét citokinszintézis-gátló faktor (CSIF) aktivitása alapján klónozták. Egérrendszerben az IL—10-et a CD4⁺ Th2 alcsoport termeli. Gátolja a citokintermelést, főként a Th1 kiónok IFNy-termelését. A citokintermelés IL—10 által történő gátlása akkor volt megfigyelhető, amikor makrofágokat és nem B-sejteket használtunk antigénbemutató sejtekként (APC). Kimutattuk, hogy az IL—10 - CSIF aktivitása mellett pleiotróp tulajdonságú, és különböző sejttípusokra fejti ki hatását, például tímuszsejtekre, citotoxikus T-sejtekre, hízósejtekre, B-sejtekre és makrofágokra.

A humán IL—10 is CSIF aktivitást fejt ki. A PHA-val vagy anti-CD3 mAt-tel aktivitáit PBMC-ben az IFNy- és GM-CSF-termelést erősen gátolja az IL—10, és ez a gátlás transzkripciós szinten történik.

A humán és egér IL—10-nek kiterjedt a szekvenciahomológiája egy, az Epstein-Barr-vírus genomban lévő előzőleg meg nem határozott nyílt leolvasási kerettel, a BCRF1-gyel. Ennek a nyílt leolvasási keretnek a kifejeződése aktív proteint eredményez, amelyet virális IL-10-nek (vlL-10) nevezünk, és amely legtöbb tulajdonságát tekintve megegyezik a humán és egér IL-10-zel, beleértve egér és humán T-sejtekre kifejtett CSIF aktivitását.

A humán IL—10 és a vlL-10 képes gátolni az antigénspecifikus proliferatív T-sejt-válaszokat azáltal, hogy csökkenti a monociták antigénbemutató kapacitását a II osztályú MHC molekulák legyengítése révén. Az itt bemutatott eredmények arra utalnak, hogy a monociták LPS-sel való aktiválásukat követően az IL—10 magas szintjeit képesek előállítani, és hogy a termelés viszonylag késői, összehasonlítva más monokinekével. Itt számolunk be továbbá arról, hogy az IL—10 erősen gátolja a gyulladáskeltő citokinek - például: IL-1a, IL—1 β, IL—6, IL—8 és TNFa - továbbá a hematopoetikus növekedési faktorok - GM-CSF és G-CSF - termelését LPS-sel, IFNy-val vagy LPS plusz IFNy-val aktivált monocitákban. Az endogéntermelődött IL—10-nek nemcsak önszabályozó hatása van a monociták által termelt IL-1a-ra, IL-1p-ra, IL-6-ra, IL-8-ra, TNFa-ra, GM-CSF-re és G-CSF-re, hanem saját termelődését is legyengíti, és önszabályozó módon legyengíti a II osztályú MHC kifejeződését a monocitákon. Ezek az eredmények arra mutatnak, hogy az

IL—10 fontos szabályozó hatásokat gyakorol az immunológiai és gyulladásos válaszokra.

B1. példa

Az IL-10-et humán monociták termelik

Humán monociták izolálása és tenyésztése

Normáldonoroktól levett 500 ml vérből humán perifériás vér monocitákat izoláltunk. A mononukleáris sejteket sürüséggradiens-centrifugálással - vérkomponens-szeparátorban - izoláltuk, majd centrifugálelutriációval limfocitákra és monocitákra frakcionáltuk. A monocita készítmény tisztasága >95%-os volt - ezt nemspecifikus észtérázfestéssel állapítottuk meg -, és több mint 98%-ban élő sejtet tartalmazott. A monocitákat humán szérumalbumint (HSA) tartalmazó, 1% kevert, hővel inaktivált AB+ szérummal kiegészített Yssel táptalajban tenyésztettük. A táptalaj endotoxinmentes volt, amit Limulus amöbocita lizátum assay-vel határoztunk meg (<0,2 ng/ml endotoxin). A monocitákat 4*10® sejt/ml koncentráció mellett olyan teflonzsákokban (Jansen MNL. St. Niklaas, Belgium) tenyésztettük, amelyek megakadályozták a sejtek adhézióját. A megadott ideig végzett tenyésztés után a sejteket összegyűjtöttük, és indirekt immunfluoreszcenciával sejtfelület-expresszióra vagy Northern- és PCR-analízissel limfokin gén expresszióra analizáltuk. A monocita tenyészetek felülúszóit is összegyűjtöttük, és IL-1a-, IL-Ιβ-, IL-6-, IL-8-, IL-10-, TNFa-, GM-CSF- és G-CSF-termelésre vizsgáltuk, miután a sejteket aktiváltuk. Az élő sejtszám a tenyésztés után mindig meghaladta a 95%-ot a tripánkék-kizárásos vizsgálat szerint.

Reagensek

A rekombináns humán IL-10-et és vlL-10-et E. coliban mint glutation-S-transzferáz fúziós proteineket fejeztük ki, tisztítottuk, és trombinnal emésztettük, hogy eltávolítsuk az N-terminális fuzionált részt, és így aktív humán és virális IL—10-et kaptunk. Tisztított humán rlL-4-et és rlFNy-t a Schering-Plough Research (Bloomfield, NJ.) cég bocsátott rendelkezésünkre. LPS-t (E. coli 0127:B8) a Difco laboratóriumból (Detroit, Ml.) kaptunk. A 19F1 neutralizáló anti-IL—10 mAt-et vlL-10 ellen termeltük, és hatékonyan neutralizálta mind a humán, mind a virális IL-10-et.

Limfokinmeghatározások

A monociták IL-1a és TNFa-termelését limfokinspecifikus ELISA-val (Endogén, Boston, MA.) mértük. Ennek az ELISA kitnek az alsó kimutathatósági határa 50 pg/ml, illetve 10 pg/ml volt. Az IL-Ιβ-t a Cistron (Pine Brook, NJ.) cégtől származó limfokinspecifikus ELISA-val határoztuk meg. Ennek az ELISA kitnek az érzékenysége 20 pg/ml volt. Az IL-6-szinteket a Genzyme (Boston, MA.) cégtől vásárolt limfokinspecifikus ELISA-val határoztuk meg. Ennek a vizsgálatnak az érzékenysége 0,313 ng/ml volt. Az IL—8- és G-CSF-specifikus ELISA kitet az R and D Systemstől (Minneapolis, MN.) kaptuk, és az IL—8- és G-CSF-termelés mérésére használtuk. Ennek az ELISA kitnek az érzékenysége 4,7 pg/ml, illetve 7,2 pg/ml volt. A GM-CSF-termelést is limfokinspecifikus ELISA-val határoztuk meg, amelynek érzékenysége 50 pg/ml volt. Az IL-10-terme28

HU 224 437 Β1 lést olyan specifikus ELISA kittel határoztuk meg, amelyben egy anti-IL—10 mAt-et (JES 9D7) használtunk fedőantitestként, és egy másik anti-IL-10 mAT-et (JES3-12G8) jelzőantitestként. Ennek az ELISA kitnek az érzékenysége 50 pg/ml volt. 5

Az IL-10-et aktivált humán T-sejt-klónok, aktivált perifériás vér T- és B-sejtek EBV-vel transzformált B-sejtvonalak és monociták termelik. A centrífugálelutriációval izolált, nagymértékben tisztított humán monociták LPS-sel való aktiválás után termelnek IL-10-et. 10 Ezenkívül kimutattuk, hogy ezek a humán monociták magas szinten képesek IL-6-ot, TNFa-t és GM-CSF-et termelni (6. ábra). Az LPS-sel aktivált monociták citokintermelésének kinetikája azt mutatta, hogy az LPS-sel aktivált monociták IL-10-termelése viszonylag 15 későn következik be. Először a 7,5 órás levett felülúszókban mutattuk ki, de a maximális termelést az aktiválás után 20-48 óra múlva észleltük. Ezzel ellentétben a TNFa és IL—6 termelése az aktiválásra gyorsan megindul, és az aktiválás után 3,5, illetve 7,5 óra múlva 20 eléri a maximális szinteket (6. ábra). A GM-CSF-termelést azonban a monociták LPS-sel való aktiválása után 7,5 óra múlva észleltük először, de ebben az esetben a termelés 20 óra múlva érte el a maximális szinteket.

A dózis-válasz vizsgálatok arra mutattak, hogy a 25 10 ng/ml LPS-sel aktivált monociták már szignifikáns IL-10-termelési szinteket érnek el, míg a maximális IL-10-szintézist 1 pg/ml LPS-koncentrációnál figyeltük meg (7. ábra).

B2. példa

Az IL-10 gátolja a monociták citokintermelését Kimutatták, hogy az IL-10 gátolja az aktivált PBMC

IFNy- és GM-CSF-termelését. Annak érdekében, hogy meghatározzuk az IL—10-nek a monociták citokintermelésére gyakorolt hatásait, nagymértékben tisztított monocitákat aktiváltunk 24 órán át LPS-sel IL-10 jelenlétében és IL-10 nélkül. Ezenkívül monocitákat aktiváltunk LPS-sel 24 órán át IL—4 jelenlétében (100 E/ml) vagy a 19F1 neutralizáló anti-IL—10 mAt jelenlétében, melyet vlL-10-zel szemben termeltünk, de ez mind a humán IL-10-et, mind a v-IL-10-et hatékonyan neutralizálta. Az aktiválás után 24 órával learatott tenyészetek felülúszójából citokinspecifikus ELISA kitekkel határoztuk meg a citokintermelést. A B1. táblázatban bemutatjuk, hogy a csak táptalajban 37 °C-on inkubált monociták nem termeltek IL-1a-t, Ιί-ΐβ-t, IL-6-ot, IL-10-et, TNFa-t, GM-CSF-et és G-CSF-et. ilyen körülmények között csak IL—8 termelődött jelentős mennyiségben. A monociták LPS-sel (1 pg/ml) való aktiválása magas szintű IL-1a-, IL-Ιβ-, IL—6-, IL-8-, IL-10-, TNFa-, GM-CSFés G-CSF-termelést eredményezett. Érdekes, hogy az IL-10 különböző mértékben gátolta az IL-1a-, IL-Ιβ-, IL-6-, IL—8-, TNFa-, GM-CSF- és G-CSF-termelést (B1. táblázat). Az IL-10 legerősebb gátlóhatását az IL-1a, TNFa, GM-CSF és G-CSF termelésében észleltük, amelyeket 80-100%-ban blokkolt. Az IL-Ιβ- és IL-6-termelés gátlása kevésbé kifejezett volt, míg az IL—8 szintézisét csak enyhén befolyásolta az IL-10.

B1. táblázat

Exogén IL-10, endogén IL-10 és IL—4 hatása a humán monociták citokintermelésére

	IL-1a	IL-Ιβ	IL-6	IL-8	IL-10	TNFa	GM-CSF	G-CSF
ng/ml
Táptalaj 37 °C	0	0	0	150	0	0	0	0
LPS	1,2	44,8	261,7	479	30,6	21,2	0,6	90
LPS+IL-4	0	9,7	135,7	418	11,9	5,1	0	17,5 I
LPS+IL-10	0	13,6	78	434	ND	2,6	0	21,1 I
LPS+alL-10	2,7	50,6	323	672	ND	47,6	5,5	110 I

Centrifugálelutriációval izolált humán monocitákat teflonzsákokban tenyésztettünk 4*10⁶ sejt/ml koncentráció mellett. A sejteket LPS-sel (1 mg/ml) aktiváltuk 24 órán át IL-10 (100 E/ml), IL—4 (100 E/ml) vagy 19F1 anti-IL—10 mAt (10 pg/ml) jelenlétében és ezek nélkül. A citokin termelését specifikus ELISA kitekkel határoztuk meg a felülúszókból. ND=(not done) nincs meghatározva.

B3. példa

Az IL-10 az IFNa-val aktivált monociták citokintermelését is gátolja

Az IL-10 az IFNy-val vagy IFNy plusz LPS-sel akti- 55 vált monociták citokintermelését is gátolja. A 8. ábra mutatja, hogy az IFNy, 100 E/ml optimális koncentráció mellett, általában kevésbé hatékony megindítója a citokinszekréciónak, mint az LPS 1 pg/ml optimális koncentráció mellett. Ezenkívül kimutattuk, hogy az IFNy 60 és LPS kombinációinak hatása a monociták citokintermelésére általában additív. Az IL-10 legerősebb gátlóhatását az IL-1a, TNFa és GM-CSF termelésénél figyeltük meg. A monociták TNFa- és GM-CSF-szekréciójának a szuppressziója 90%-nál nagyobb volt, még optimális LPS- és IFNy-koncentrációkkal való aktiválás után is. Bár jelentős gátlóhatást figyeltünk meg az IL-Ιβ és IL—6 szekréciójánál optimális stimulációs feltételek mellett, gátlásuk még kifejezettebb volt, ha a

HU 224 437 Β1 monocitákat az optimális alatti LPS-koncentrációkkal stimuláltuk, optimális vagy nem optimális IFNy-koncentrációk mellett.

B4. példa

A virális IL-10 gátolja a monociták citokintermelését

A virális IL-10 és a humán IL-10 hasonló hatásokat gyakorolnak a humán sejtekre. A 9. ábra bemutatja, hogy mind az IL-10, mind a vlL-10 hasonló módon gátolja a monociták TNFa- és GM-CSF-termelését. LPS-sel (1 pg/ml) való aktiválásuk után a monociták TNFa- és GM-CSF-termelésére szignifikáns gátlóhatással volt az IL-10 és vlL-10 100 E/ml koncentrációkban való hozzáadása. Az IL—10-nek és a vlL-10-nek a TNFa- és GM-CSF-szekrécióra gyakorolt gátlóhatása megszűnt, ha az inkubálást a 19F1 mAt jelenlétében végeztük (9. ábra), és így kimutattuk a vlL-10 gátlóhatásának a specificitását. Tény, hogy a monociták LPS-sel való aktiválása IL-10 vagy vlL-10 és a neutralizáló anti-IL—10 mAt jelenlétében fokozottabb TNFaés GM-CSF-termelést eredményezett, és ez is bizonyítja, hogy az endogéntermelődött IL-10 nyomta el ezen citokinek termelését.

Az endogéntermelt IL-10 gátlóhatását a monociták citokintermelésére tovább vizsgáltuk úgy, hogy neutralizáló anti-IL—10 mAt jelenlétében mértük az LPS-sel aktivált monociták által termelt citokinszinteket. A B1. táblázatból látható, hogy a monociták kezelése LPS plusz anti-IL-10-zel a citokintermelés növekedését idézte elő, összehasonlítva a csak LPS-sel való aktiválással, mely azt jelenti, hogy az endogéntermelődött IL-10 a TNFa-ra és a GM-CSF-re gyakorolt gátlóhatásán kívül az IL-1a-, IL—1 β-, IL-6-, IL—8- és G-CSF-termelést is blokkolja. A legkifejezettebb gátlóhatást az IL—1a-nál, GM-CSF-nél és TNFa-nál észleltük, míg az IL—1 β, IL—6, IL—8 és G-CSF expressziójára kifejtett gátlóhatás tekintélyes volt ugyan, de kevésbé kifejezett. Összegezve az eredményeket, megállapítható, hogy mind az exogén IL-10, mind az endogéntermelődött IL-10 gátolja az LPS-sel aktivált monociták IL-1a-, IL-Ιβ-, IL-6-, IL-8-, TNFa-, GM-CSF- és G-CSF-termelését.

B5. példa

Az IL-4 gátolja az aktivált monociták IL-10-termelését

Az IL-4 gátolja az LPS-sel aktivált monociták IL-Ιβ-, IL—6- és TNFa-termelését. Annak meghatározására, hogy vajon az IL-4 gátolja-e az IL-10-termelést, monocitákat 24 órán át LPS-sel aktiváltunk, és mértük az IL-10-szekréciót. A B1. táblázat mutatja, hogy az IL-4 erősen gátolja az LPS-sel aktivált monociták IL-10-termelését. Az IL-4 ezenfelül, hogy gátlóhatást fejt ki az IL-Ιβ-, IL-6- és TNFa-szekrécióra, hatékonyan blokkolja a GM-CSF- és G-CSF-termelést. Azonban, ahogy ezt az IL-10-nél megfigyeltük, az IL-4- az IL-8-termelést csak enyhén befolyásolja. Összegezve ezeket az adatokat, megállapítható, hogy az IL-4 és IL-10 összehasonlítható gátlóhatásokat fejt ki az aktivált monociták citokintermelésére.

B6. példa

A monokintermelés gátlása a transzkripció szintjén megy végbe

Szondák

Northern-analízishez a következő szondákat használtuk: a pCD-hTGF8 600 bp méretű Smal fragmentuma (1299-1899. nukleotid) [lásd Yokota et al., közlését a „Lymphokines” című kiadványban (Goeddel és Webb, szerk., Academic Press, New York, 1987], a pAL (β-aktin) 1200 bp méretű Pstl fragmentuma [lásd Vieira et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 1172-1176 (1991)], a pCD-hlL-6 567 bp méretű BamHI-Xbal fragmentuma (1-567. nukleotid) [lásd Yokota et al. (1987)], az SP64-3-10c (IL—8) 268 bp méretű Hindlll fragmentuma (29-297. nukleotid) [lásd Schmid et al., J. Immunoi., 139, 250 (1987)], a pCD-SRa-hlL-10 760 bp méretű Bglll-Hind111 fragmentuma [lásd Vieira et al. (1991)]. A PCR-termékek Southern-analíziséhez a következő nukleotidokat használtuk: IL-1a: 5-CATGGGTGCTTATAAGTCATC-3’ (500-521. nukleotid) [lásd March et al., Natúré, 315, 641 (1985)], IL-Ιβ: 5’-CGATCACTGAACTGCACGCTCCGGG-3’ (444-469. nukleotid) [lásd March et al., Natúré (1985)], IL—6: 5’-GAGGTATACCTAGAGTACCTC-3’ (510-531. nukleotid) [lásd Hirano et al., Natúré, 324, 73 (1986)], IL—8: 5'-TAAAGACATACTCCAAACCTT-3’ (200-221. nukleotid) [lásd Schmid et al., J. Immunoi. (1987)], IL-10: 5’-CAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGT TTGACATC-3’ (429-498. nukleotid) [lásd Vieira et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1991)], TNFa: 5’-GGCGTGGAGCTGAGAGAG-ATAAC-3' (500-521. nukleotid) [lásd Pennica et al., Natúré, 312, 724 (1984)], GM-CSF: 5'-CCGGCGTCTCCTGAACCT-3’ (150-168. nukleotid) [lásd Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 4360-4364 (1985)], aktin: 5'-CTGAACCCTAAGGCCAACCGTG-3’ (250-272. nukleotid) [lásd Alonso et al., J. Mól. Evői., 23, 11 (1986)], G-CSF: 5’-GCCCTGGAAGGGATCTCCCCC-3’ (400-421. nukleotid) [lásd Nagata et al., Natúré, 319, 415 (1986)]. A nukleotidszekvenciák megkaphatok a GENBANK-tól (c/o Intelligenetics, Inc., Menlo Park, CA.), a BCCG adatbázistól és a Wisconsin Egyetem Biotechnológiai Központjától (Madison, Wisconsin). Szintetikus nukleotidszintézis a tárgya Gait (1984) „Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach” (IRL Press, Oxford) című kiadványának, amelyet ebben a leírásban referenciaként tekintünk.

mRNS-izolálás és Northern-analízis

Össz-RNS-t izoláltunk 20*10® monocitából guanidinium-tiocianát-cézium-klorid-eljárással. Northernanalízishez mintánként 10 pg össz-RNS-t választottunk el. A méret szerinti elválasztást 6,6% formaldehidtartalmú 1%-os agarózgélben végeztük. Az elválasztott RNS-t Nytran nejlonmembránokra (Schleicher és Schuell, Keene, NH) vittük át, ahol erős specifikus aktivitással jelzett (>10⁸ cpm/mg) szondákkal hibridizáltuk. A hibridizált szűrőket szigorúan meghatározott körülmények mellett mostuk, majd kifejlesztettük.

HU 224 437 Β1

PCR-analízis

Egy pg össz-RNS-t oligo(dT)₁₂_₁₈ primerrel és AMV reverz transzkriptázzal (Boehringer-Mannheim) 20 μΙ reakcióelegyben visszaírattunk. Minden sokszorozási reakcióhoz 2 μΙ visszaírt RNS-t (egyenértékű az össz-RNS 100 ng-jával) használtunk fel közvetlenül. A PCR feltételei a következők voltak: 50 μΙ reakcióelegyben az egyes printerekből 25-25 nmol, 125-125 μΜ dGTP, dATP, dCTP és dTTP (Pharmacia, Uppsala, Svédország), 50 mM kálium-klorid, 10 mM trisz.HCI (pH=8,3), 1,5 mM magnézium-klorid, 1 mg/ml zselatin, 100 μg/ml acetilezett BSA és 1 egység Vént DNS-polimeráz (New England Biolabs, Beverley, MA.). A használt primerek a következők voltak: IL-1a szensz primer: 5’-CATCGCCAATGACTCAGAGGA-AG-3’ (302-325. nukleotid); IL-1a antiszensz primer: 5'-TGCCAAGCACACCCAGTAGTCTTGCTT-3’ (770-743. nukleotid); IL—1 β szensz primer: 5-CCAGCTACGAATCTCGGACCACC-3’ (230-253. nukleotid); IL—1 β antiszensz primer: 5'-TTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAAGTCAGT-3’ (896-863. nukleotid); IL—6 szensz primer: 5’-ATGAACTCCTTCTCCACAAGC-3’ (1-21. nukleotid); IL—6 antiszensz primer: 5’-CTACATTTGCCGAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3’ (810-777. nukleotid); IL-8 szensz primer: 5’-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTG-3’ (1-21. nukleotid); IL—8 antiszensz primer: 5’-TTATGAATTCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC-3' (302-269. nukleotid); IL—10 szensz primer: 5’-ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA-3’ (323-349. nukleotid); IL—10 antiszensz primer: 5’-TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA-3’ (674-648. nukleotid); TNFa szensz primer: 5’-AGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGAC-3’ (310-333. nukleotid); TNFa antiszensz primer: 5’-TGAGTCGGTCACCCTTCTCCAG-3’ (782-760. nukleotid); GM-CSF szensz primer: 5’-GCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCC-3’ (76-100. nukleotid); GM-CSF antiszensz primer: 5’-CCTGCTTGTACAGCTCCAGGCGGGT-3’ (276-250. nukleotid); G-CSF szensz primer: 5’-GAGTGTGCCACCTACAAGCTGTGCC-3’ (233-258. nukleotid); G-CSF antiszensz primer: 5’-CCTGGGTGGGCTGCAGGGCAGGGGC-3’ (533-508. nukleotid); β-aktin szensz primer: 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’ (1-20. nukleotid); β-aktin antiszensz primer: 5’-GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’ (548-530. nukleotid). A reakciókat Perkin-Elmer/Cetus DNS Thermal Cycler készülékben inkubáltuk 20 ciklusban (denaturálás 30 mp 94 °C, anellálás 30 mp 55 °C, extenzió 60 mp 72 °C). A reakcióelegyeket kloroformmal extraháltuk, és mintánként 40 μΙ-eket vittünk fel 1%-os agarózgélre TAE pufferben. A termékeket etidium-bromid-festéssel tettük láthatóvá. Ezután a géleket 0,5 M nátrium-hidroxid- és 1,5 M nátrium-klorid-tartalmú oldattal denaturáltuk, 10 M ammónium-acetát-oldattal neutralizáltuk, majd Nytran nejlonmembránokra vittük át. A membránokat 6*SSC, 1% SDS, 10*Denhardt oldat [0,2% Ficoll, 0,2% poli(vinil-pirrolidon), 0,2% BSA, Pentax frakció V] és 200 pg/ml E. coli tRNS- (Boehringer Mannheim, NSZK) tartalmú oldattal előhibridizáltuk 4 órán át, °C-on. Egy belső szekvenciára specifikus oligonukleotidszondákat (200 ng) használtunk primerekként a sokszorozási reakcióban, melyeket 5’-végükön T4 polinukleotid-kinázzal (New England Biolabs) és y-32p-ATP-vel (Amersham, Arlington Heights, IL.) jeleztünk. A szondákat a be nem épült nukleotidoktól Nick oszlopon (Pharmacia, Uppsala, Svédország) választottuk el, és hozzáadtuk a hibridizációs keverékhez. A hibridizálást 12 órán át 55 °C-on végeztük, a szűrőket 0,1*SSC (1*SSC: 150 mM nátrium-klorid, 15 mM nátrium-citrát, pH=7,0) és 1% SDS-tartalmú oldattal mostuk szobahőmérsékleten, majd Kodak XAR-5 filmre exponáltuk 1-2 órán át.

Annak érdekében, hogy meghatározzuk, milyen szinten gátolja az IL—10 a monociták citokintermelését, összehasonlító PCR-analíziseket végeztünk IL—10, IL—4 vagy neutralizáló anti-IL—10 mAt jelenlétében - vagy ezek nélkül - 24 órán át aktivált monocitákból izolált RNS-sel. Ennek a kísérletnek a citokinméréseit a B1. táblázat mutatja be. Az ezekből a mintákból izolált mRNS-t visszaírattuk cDNS-sé, és ezután citokinspecifikus primerekkel sokszoroztuk. A sokszorozáshoz viszonylag kevés ciklust használtunk. Ezzel óhajtottuk biztosítani, hogy a sokszorozott DNS mennyisége arányos legyen a ciklusszámmal, és korreláljon az eredeti mintában lévő specifikus mRNS mennyiségével. A 10. ábra mutatja, hogy ilyen feltételek mellett a β-aktin-specifikus cDNS azonos mennyiségeit sokszoroztuk. A monociták, melyeket 4 °C-on csak táptalajban 24 órán át inkubáltunk, igen alacsony szinten fejezik ki az IL—8 mRNS-t. Ha ezeket a sejteket 37 °C-on inkubáljuk, növekszik az IL—8 mRNS expressziója, de nem indul meg az IL-1a, IL—1 β, IL—6, IL-10, TNFa, GM-CSF vagy G-CSF mRNS expressziója. Az LPS-sel való aktiválás az IL-1a, IL—1 β, IL—6, IL—8 és G-CSF mRNS expresszióját eredményezte, míg a TNFa és GM-CSF mRNS közepesen fejeződött ki. A 10. ábra azt is megmutatja, hogy az IL-1a, IL—6, TNFa, GM-CSF és G-CSF expresszióját erősen gátolja az IL-10 és IL—4 mRNS-szinten, míg az IL—1 β és IL—8 expresszióját csak kevéssé zavarta az IL-10. A monociták LPS-sel való aktiválása anti-IL-10 mAt jelenlétében mérsékelten fokozza az IL-1a, IL—1 β, IL—6, IL—8 és G-CSF mRNS expresszióját, és erősen növeli a TNFa- és GM-CSF mRNS-szintézist. A citokinspecifikus mRNS-expresszió szintjei és exogén és endogén IL-10-zel vagy IL—4-gyel való modulálásuk jól egyezett a megfelelő proteinek szekréciójával, amint ezt a B1. táblázat mutatja. A táblázatból kitűnik, hogy az IL-10 és az IL—4 a transzkripció szintjén gátolja az LPS-sel aktivált monociták citokinexpresszióját.

B7. példa

Az IL-10 szabályozza az IL-10 mRNS expresszióját, de nem szabályozza a TGFfi mRNS expresszióját aktivált monocitákban Miután kimutattuk, hogy a monociták viszonylag későn termelnek IL—10-et LPS-sel való aktiválás után, megvizsgáltuk, hogy vajon az IL-10 tudja-e befolyásol31

HU 224 437 Β1 ni az endogén IL—10 mRNS szintézist. Humán monocitákat LPS-sel aktiváltunk IL-10 jelenlétében és IL—10 nélkül 7 órán át, és az mRNS-expressziót Northern-blottinggal analizáltuk. A 11. ábra mutatja, hogy LPS-sel való aktiválás után csak 7 óra múlva tudtunk kimutatni IL-10 mRNS-t, és hogy az IL-10 nem vagy csak minimális gátlóhatást fejtett ki az IL-10 mRNS expressziójára ebben az időpontban. Ezzel szemben az IL—6 és IL—8 mRNS expresszióját erősen gátolta az IL-10. Egy másik kísérletsorozatban azonban, amelyben a monocitákat 24 órán át aktiváltuk LPS-sel, az IL-10 erősen csökkentette az IL-10 mRNS expresszióját. Ezt Northern-analízissel határoztuk meg, és a 12. ábrán mutatjuk be. A 12. ábrából ezenkívül látható, hogy a monociták LPS-sel való aktiválása neutralizáló anti-vIL—10 mAt jelenlétében, az IL-10 mRNS expressziójának felerősödését eredményezte a 24. órában. Ezeket az eredményeket PCR-analízissel erősítettük meg, melyben IL-10-specifikus primereket használtunk, mivel ez utóbbi kísérletben használt RNS-t használtuk a 10. ábrán bemutatott PCR-analízishez is. A 12B. ábrán látható, hogy a Northern-analízissel mért IL-10 mRNS expresszióban megfigyelt mennyiségi különbségek korreláltak az összehasonlító PCR-analízissel észlelt különbségekkel. Ezenkívül az érzékenyebb PCR-analízis révén lehetővé vált az IL-10 mRNS kis mennyiségeinek a kimutatása. Ezek az alacsony szintek a monociták 37 °C-on csak táptalajban való 24 órás tenyésztése után indukálódtak. Ezekből az eredményekből arra következtettünk, hogy az IL-10 önszabályozó hatást fejt ki az IL-10 mRNS szintézisre, és ha az mRNS-szintek pontosan tükrözik az IL-10 protein termelést, valószínűleg a humán monociták IL-10-termelésére is. Azonban az IL-10-termelés legyengítése az aktiválási folyamatban meglehetősen későn következik be. A TGFp mRNS, melyet a frissen izolált, nem aktivált monociták konstitutív módon fejeznek ki, nem fokozódott LPS-aktiválásra, sem 7, sem 24 óra múlva (11. és 12. ábra). A 11. és 12. ábra azt is mutatja, hogy a TGFp mRNS szinteket nem befolyásolta, ha az aktiválásokat IL-4, IL-10 vagy neutralizáló anti-IL—10 jelenlétében végeztük.

B8. példa

Az IL-10 önszabályozó hatást fejt ki a monociták II osztályú MHC-expressziójára Immunfluoreszcenciás analízis A sejteket (10⁵) mikrotitrálólemezeken, V fenekű tartályokban (Flow Laboratories, McLean, VA.) inkubáltuk 10 μΙ tisztított mAt-tel (1 mg/ml) 30 percig 4 °C-on. A sejteket kétszer mostuk 0,02 mM nátrium-azid- és 1% BSA- (Sigma, St. Louis, MO.) tartalmú PBS-sel, utána a sejteket FITC-jelzett kecske antiegér antitest F(ab)₂ fragmentumának (TAGO Inc. Burlingame, CA.) 1/40 hígításával inkubáltuk 30 percig 4 °C-on. Három további mosás után a jelzett sejtmintákat folyadékmikrofluorometriával analizáltuk FACScan (Becton-Dickinson, Sunnyvale, CA.) készülékben. A PdV5.2 (HLA-DR/DP/DQ), Q5/13 (HLA-DR/DP) és L243 (HLA-DR) II osztályú anti-MHC mAt-ek leírását lásd:

Koning et al., Hűm. Immunoi., 9, 221 (1984); Quaranta et al., J. Immunoi., 125, 1421-1425 (1980); Lampson et al., J. Immunoi., 125, 293 (1980).

Az IL-10 legyengíti a humán monocita sejtek felületén a II osztályú MHC molekulák kifejeződését. Kimutattuk, hogy az IL-10 legyengíti az IL—4- vagy az IFNy-indukált II osztályú MHC konstitutív kifejeződését. Minthogy a monociták LPS-sel való aktiválás után az IL-10-et magas szinten termelik, megvizsgáltuk, hogy vajon az endogén IL-10 meg tudja-e gátolni az LPS-sel aktivált monociták II osztályú MHC-expresszióját. A monocitákat különböző koncentrációjú LPS-sel aktiváltuk neutralizáló anti-IL—10 mAt jelenlétében vagy enélkül. A 13. ábra mutatja, hogy a monociták LPS-sel való aktiválása dózisfüggően csökkenti a konstitutív HLA-DR/DP kifejeződését a sejteken. Azonban, a 19F1 neutralizáló anti-IL—10 mAt jelenlétében a HLA-DR/DP kifejeződés erős indukcióját észleltük. Azonos eredményeket kaptunk számos HLA-DR vagy HLA-DR/DP specifikus mAt-tel. Ezek az eredmények jelzik, hogy az endogéntermelődött IL-10 felelős - önszabályozó módon - a II osztályú MHC kifejeződésének legyengítéséért az LPS-sel aktivált monocitákban.

C) tanulmány

Az IL-10 gátolja az aktivált makrofágok citokintermelését

Az ebben a fejezetben tárgyalt adatokat az elsőbbségi időpont után Fiorentino és munkatársai [J. Immunoi., 147, 3815-3822 (1991)] közölték. A közleményt ebben a leírásban referenciaként tekintjük.

Összefoglalás

Az IL-10 gátolja a makrofágokat abban - a B-sejt antigénbemutató sejteket (APC=antigen presenting cell) nem -, hogy stimulálják Th1 sejtklónokban a citokinszintézist. Tanulmányoztuk az IL-10 közvetlen hatását mind makrofágsejtvonalakra, mind normál peritoneális makrofágokra. Az IL—1, IL—6 és TNFa proteinek LPS-sel (vagy LPS-sel és IFNy-val) indukált termelését jelentősen gátolta az IL-10 két makrofágsejtvonalban. Ezenkívül úgy tűnt, hogy az IL-10 hatékonyabb inhibitora a monokinszintézisnek, mint az IL—4, ha ezeket azonos koncentrációkban adagoltuk. Az IL-1a, IL-6 vagy TNFa mRNS LPS-sel vagy LPS-sel plusz IFNy-val indukált expresszióját szintén gátolta az IL-10, melyet szemikvantitatív PCR-rel vagy Northernblot-analízissel mutattunk ki. Az LPS-sel indukált IL-6-szekréciót az IL-10 kevésbé kifejezetten gátolta a FACS-tisztított peritoneális makrofágokban, mint a makrofágsejtvonalakban. Azonban a peritoneális makrofágok IL-6-termelése fokozódott anti-IL—10 antitestek hozzáadására, melyből következik, hogy ezekben a tenyészetekben jelen van az endogén IL-10, s ez a monokinszintézis belső (intrinsic) csökkenését eredményezi az LPS-sel való aktiválás után. Ezenfelül kimutattuk, hogy az LPS-sel stimulált peritoneális makrofágok direkt termelnek ELISA módszerrel észlelhető IL-10-et. Megállapítottuk, hogy az IFNy növeli az LPS-stimulált peritoneális makrofágok IL-6-termelését,

HU 224 437 Β1 és ez valószínűleg abból ered, hogy ugyanez a sejtpopuláció nyomja el az IL-10-termelést. A monokinszintézisre kifejtett hatásán kívül az IL—10 jelentős morfológiai változást indukál az IFNy-val stimulált peritoneális makrofágokban. Az IL-10 erős hatása a makrofágokra, főként a monokintermelés szintjén, azt jelenti, hogy ennek a citokinnek nemcsak a T-sejt-válaszok szabályozásában van fontos szerepe, hanem az akut gyulladásos válaszokban is.

Az IL-10-et először olyan citokinként írták le, amelyet a Th2 T-helper sejtklónok termelnek, gátolja a makrofág APC-függő citokinszintézist a TH1 T-helper sejtekben, és különböző más sejtekre pleiotróp hatásokat gyakorol. Más sejtek is termelnek IL-10-et. A Th1 sejtek IL-2-t és IFNy-t szekretálnak, főként a makrofágaktíválást indukálják, valamint a késleltetett típusú túlérzékenységet (DTH=delayed type hypersensitivity), míg a Th2 sejtek IL—4-et és IL-5-öt termelnek, és segítséget adnak a B-sejt-válaszokhoz. Mihelyt aktiválódnak, mindegyik Th sejttípus szabályozhatja a másik proliferációját és/vagy funkcióját. Az ilyen keresztszabályozásokat a különböző citokinek közvetítik, és magyarázatot kínálnak arra a megfigyelésre, hogy bizonyos antitestek és DTH-válaszok kölcsönösen kizáróak lehetnek. Az IL-10 úgy hat a makrofágokra - de a B-sejtekre nem -, hogy a makrofágok gátolják a Th1 kiónok citokinszintézisét, és az IL-10 közvetlen hatást gyakorol a makrofágokra.

A makrofágtermékek - ilyen az IL—1, IL—6 és TNFa - szerepet játszanak a fertőzés vagy szövetkárosodás folyamán kialakuló számos gyulladásos és immunológiai válaszban. A TNFa és az IL—1 olyan endogén pirogének, amelyek ezenkívül még sok metabolikus változást okoznak különböző sejttípusokban. Ezenkívül az IL—1 és IL—6 a fő megindítói a májban az akut fázisú proteinek szintézisének. A következő példákban bemutatjuk, hogy az IL-10 gátolja az LPS-sel aktivált makrofágok citokintermelését, így az IL-1-, TNFa- és IL-6-termelést. Tehát az IL-10 fontos szerepet játszik a gyulladásos reakciókban azáltal, hogy T-sejt-aktiváló szerepén kívül a makrofágfunkciót is szabályozza.

C1. példa

Az IL-10 gátolja a különböző makrofágsejtvonalak

APC-funkcióját

Citokinek

A tisztított rekombináns mlL-1a P. Lomedico (Hoffman-La Roche, Nutley, NJ.) nagylelkű adománya volt. A rekombináns mlL-2-t és mIFNy-t a Schering Researchtől (Bloomfield, NJ.) szereztük be. A rekombináns, tisztított egér IL—6-ot, amelyet M. Pearce (DNAX) bocsátott rendelkezésünkre, COS 7 sejtekben fejezték ki, és immunaffinitással tisztították. Az egér TNFa-t a Genzyme Corporationtől (Boston, MA.) szereztük be. A rekombináns egér IL-10-et (CSIF) úgy állítottuk elő, hogy COS 7 sejteket transzfektáltunk az F115 cDNSklónnal - mint fent leírtuk -, és az áltranszfektált sejtekről származó kontrollfelülúszókat 2%-os végső koncentrációban használtuk, hacsak másként nem jeleztük. Olyan rekombináns egér IL-10-et is használtunk, melyet Warren Dangtól kaptunk, és amelyet E. coliban fejeztek ki, és SXC.2 anti-IL—10 antitest használatával, affinitással tisztították.

Antitestek

IFNy elleni (XMG1.2) és IL-10 elleni (SXC.1) neutralizáló monoklonális antitesteket (mAt) használtunk [lásd: Cherwinski et al., J. Expt’l Med., 166, 1229-1244 (1987) és Mosmann et al., J. Immunoi., 145, 2938-2945 (1990)]. Az SXC.1-nek megfelelő J5 izotípuskontrollt Róbert Coffman (DNAX) bocsátotta rendelkezésünkre. Az IL—6 elleni monoklonális antitesteket [20F3 és 32C11; lásd: Starnes et al., J. Immunoi., 145, 4185-4191 (1990)] és a TNFa elleni monoklonális antitesteket (MP6-XT3.11 és XT22.11) tisztították, és John Abrams (DNAX) bocsátotta rendelkezésünkre. A FACS-szortírozáshoz használt antitestek között volt a patkány antiegér B220 (RA3-6B2) [Coffman et al., Natúré, 289, 681-683 (1981)] és a patkány antiegér Mac-1 [Springer et al., Eur. J. Immunoi., 8, 539-542 (1978)]. Használtuk az Fc-gR elleni patkány antiegér 2.4G2 jelű monoklonális antitestet [lásd: Unkeless, J. Expt’l Med., 150, 580-596 (1979)].

Táptalajok

A kísérleti táptalaj (cRPMI) összetétele a következő volt: 10% hővel inaktivált fetális borjúszérum- (FCS; J. R. Scientific Inc., Woodland, CA.), 0,05 mM 2-ME(Sigma Chemical Co., StLouis, MO.) és 10 mM HEPES-puffer- (Gibco Laboratories, Grand Island, NY.) tartalmú REPMI 1640. T-sejt-növekedéshez rekombináns mlL-2-t (330 E/ml) adtunk a cRPMI-hez.

Antigének

A csiga-hemocianint (KLH=Keyhole limpet hemocyanin) a Pacific Bio-Marine Laboratories Inc.-tői (Venice, CA.) vagy a Calbiochem Labs.-tól (La Jolla, CA.) szereztük be, és 100-150 pg/ml végső koncentrációban használtuk. A Sigma cégtől beszerzett ovalbumint 1 mg/ml végső koncentrációban használtuk.

Sejtvonalak

A citokinszintézis-gátlási vizsgálathoz (CSIF assay) a HDK.1 Th1 kiónt [l-A^d/KLH-ra specifikus; lásd: Cherwinski et al., J. Expt’l Med., (1987)] és a D011.10 T-sejt hibridómát [l-A^d/ovalbuminra specifikus; lásd: Kappler et al., J. Expt’l Med., 153, 1198 (1981)] használtuk. Az IL-1-meghatározáshoz [lásd: Suda et al., J. Immunoi. Methods, 120, 173-178 (1989)] használt D10.G4.1 (D10) Th2 kiónt és az AKR/J antikonalbumint C. Janewaytől (Yale Egyetem, New Haven, CT.) kaptuk [lásd: Kaye et al., J. Expt’l Med., 153, 836-856 (1983)]. Minden kiónt úgy tartottunk fenn, hogy időközönként antigénnel (Ag) és besugárzott APC-vel stimuláltuk, majd IL-2-tartalmú táptalajban tenyésztettük [lásd: Cherwinski et al., J. Expt’l Med. (1987)]. A klónozott 1G18.LA makrofágsejtvonal (H—2^d) tímuszváz-sejttenyészetekből származott, és 20%-os L-sejt felülúszóban tartottuk fenn. A PU5.1 makrofágsejtvonalat (H—2^d) [lásd: Ralph et al., J. Immunoi., 119, 950-954 (1977)] 10% FCS-t tartalmazó cRPMI táptalajban tar33

HU 224 437 Β1 tottuk fenn. APC-ként való felhasználáshoz az 1G18.LA és PU5.1 sejtvonalakat 20-24 órán át IFNy-val (0,5-2 ng/ml) aktiváltuk. A WEHI.164.13 sejtvonalat, amely a TNFa-ra és TNFp-ra ad választ [lásd: Espevik et al., J. Immunoi. Methods, 65, 55-63 (1986)], 5% FCS-t tartalmazó cRPMI táptalajon tartottuk fenn.

Citokinek immunometriás vizsgálata

A citokinszinteket (IL—6, IFNy és CSIF/IL—10) kétoldalas szendvics ELISA assay-vel mértük.

Bioassay-k

Kolorimetriás MTT proliferációs vizsgálatot használtunk a TNFa (WEHI.164.13 sejtek), IL-2 (HT-2 sejtek) és IL-10 (D10 sejtek) (10⁴ sejVtartály minden vizsgálatban) bioassay-khez [MTT=3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid]. Az aktivitást egy ismert standardhoz viszonyítva vagy egység/mlben vagy pg/ml-ben vagy ng/ml-ben fejeztük ki. Egy egység/ml egy adott citokin azon mennyiségét képviseli, amely ebben a bioassay-ben a maximális válasz 50%-át éri el.

Th1 citokinszintézis indukciója és mérése

Lapos fenekű 96 tartályos mikrotitrálólemezeken, 200 μΙ/tartálytérfogatban 1-5*10⁴Th1, HDK.1 sejteket vagy D0.11.10 T-sejt hibridóma sejteket különböző számú élő APC-vel hoztunk össze antigén jelenlétében vagy antigén nélkül. A citokinszinteket a 20 vagy 48 órás felülúszókban mértük.

Makrofágsejtvonalak stimulálása

Az 1G18.LA és a PU5.1 makrofágsejtvonalakat óvatos kaparással arattuk le, a sejteket mostuk, és 5% FCS-sel kiegészített cRPMI táptalajban reszuszpendáltuk 10⁶ sejt/ml sűrűségben, 9,5 cm-es szövettenyésztő csészékben (Becton-Dickinson, JN.). A sejteket 37 °C-on 5% szén-dioxid/95% levegő atmoszférában tartottuk 6 órán át az RNS-expresszióhoz, vagy 24 órán át a citokin felülúszóból való kimutatásához. A stimulálást LPS-sel végeztük (10 pg/ml), vagy néhány esetben LPS-sel és IFNy-val (100 E/ml) IL-10 (200 E/ml) vagy IL—4 (200 E/ml) jelenlétében vagy ezek nélkül. A felülúszókat összegyűjtöttük, lecentrifugáltuk (800 g), és -80 °C-on tároltuk. Megfelelő mennyiségeit használtuk IL—1, IL—6 vagy TNFa vizsgálatához. A makrofágsejtvonalakat ezenkívül IFNy-val stimuláltuk 24 órán át a HDK.1 klón és specifikus KLH antigén jelenlétében. Ebben az esetben a felülúszókat AMICON ultraszűrőben (a membrán kizárási molekulatömeg határa: 10 000) koncentráltuk, majd immunaffinitás-oszlopokon IL-2-re és IFNy-ra kimerítettük. Ezeket a felülúszókat és a koncentrálási lépésből származó átfolyt folyadékot teszteltük arra nézve, hogy mennyire képesek kostimulálni az antigénspecifikus és APC-függő Th1 citokinszintézist. Ezenkívül, APC-ként való felhasználáshoz az 1G18.LA és PU5.1 makrofágsejtvonalakat először 20-24 órán át IFNy-val (0,5-2 ng/ml) aktiváltuk.

Az IL-10 akkor gátolja az APC-t abban, hogy stimulálja a Th1 sejtek IFNy-termelését, ha APC gyanánt normál peritoneális vagy léperedetű makrofágokat vagy 1G18.LA makrofágsejtvonalat használunk. Az IL-10 a

PU5.1 makrofágvonalra - amely más eredetű, mint az 1G18.LA (14. ábra) - is hatott, bár a PU5.1 sejtvonallal, mint APC-vel, a Th1 sejteknél elért stimulálás nem volt olyan jó, mint amit az 1G18.LA makrofágsejtvonalnál megfigyeltünk. A14B. ábra bemutatja, hogy az 1G18.LA sejtvonal mind a Th1 klón, mind a DP11.10 ovalbumin specifikus T-sejt hibridóma IL-2-termelésének antigénspecifikus indukcióját is közvetíti. Mindkét stimulációt szignifikánsan gátolja az IL-10.

C2. példa

Az IL-10 morfológiai változást idéz elő az IFNy-val stimulált peritoneális makrofágokban A peritoneális makrofágok tisztítása és stimulálása A peritoneális sejteket úgy nyertük, hogy 7 ml hideg cRPMI táptalajt - 10% FCS-sel kiegészítve - injektáltunk a peritoneumba, majd visszaszívtuk. A makrofágokat Mac-1 és B220 (a makrofágok Mac-1^+bn9^ht; B220~ típusúak) alapon szortírozzuk. A sejteket 10 pg/ml LPS-sel stimuláltuk IL-10, anti-IL-10 monoklonális antitestek vagy IFNy jelenlétében vagy ezek nélkül. A felülúszókat 20 órás 5% szén-dioxid-tartalmú nedvesített atmoszférában, 37 °C-on való inkubálás után gyűjtöttük össze, 8*10⁵ sejt/ml mellett. A felülúszókat TNFa-ra és IL-6-ra vizsgáltuk ELISA assay-vel.

FACS-tisztított peritoneális makrofágokat inkubáltunk IFNy-val IL-10 jelenlétében vagy IL-10 nélkül, különböző ideig. Ezután eltávolítottuk a felülúszókat, a sejteket levegőn szárítottuk, fixáltuk, majd Wright-Giemsa szerint festettük. A 15. ábrából látható, hogy az IL-10 a sejtek felgömbölyödését és letapadóképességük elvesztését indukálja, ami jelentős lehet a makrofág APC funkció gátlása szempontjából.

C3. példa

Az IL-10 legyengíti a biológiailag aktív vagy szekretált citokinek termelését az aktivált makrofágsejtvonalakban

Korábbi felfedezésekből arra lehetett következtetni, hogy az IL-10 közvetlen hatást gyakorol a makrofágok azon képességére, hogy mint APC-k működjenek, és hogy aktiválják a Th1 citokinszintézist. Az IL-10 közvetlen hatását vizsgáltuk ezen makrofágsejtvonalak monokintermelésére. Makrofágsejtvonalakról, amelyeket IFNy-val, LPS-sel vagy IFNy plusz LPS-sel stimuláltunk IL-10 jelenlétében vagy IL-10 nélkül, felülúszókat gyűjtöttünk, és ezek citokintartalmát vizsgáltuk. Ahol lehetett, kontrollként IL-4-et használtunk, ugyanis erről a faktorról kimutatták, hogy gátolja az aktivált makrofágok citokintermelését. A makrofágsejtvonalaknak egyedül IFNy-val való stimulálása nem indukált kimutatható IL-1, IL—6 vagy TNFa monokin szinteket a felülúszókban. Ezzel szemben az LPS vagy az LPS plusz IFNy ezen citokinekből szignifikáns mennyiségeket indukált (16. ábra). A konkanavalinA (conA) nélkül végzett D10.G4.1 assay, amelyet az IL—1 kimutatására használtunk, nem mutat ki más, makrofág által kifejezett citokineket. Az 1G18.LA és a PU5.1 makrofágsejtvonalak IL—1 bioaktivitás termelő képessége jelentősen gátolt volt LPS-sel való indukció után (16. ábra). Az

HU 224 437 Β1

IL-10 igen jelentős gátlóhatást fejt ki mindkét makrofágsejtvonalnál az LPS-sel vagy IFNy plusz LPS-sel indukált TNFa-termelésre, amint ezt a felülúszók WEHI.164.13 bioassay-je bemutatta (ezekben a makrofág-felüiúszókban minden aktivitás a TNFa-nak volt tulajdonítható; ennek bemutatásához egy specifikus blokkolóantitestet használtunk). Az IL-10 ehhez hasonlóan gátolja az IFNy-val plusz LPS-sel és/vagy LPS-sel stimulált makrofágsejtvonalak IL-6 protein termelését, amit egy IL-6-specifikus enzimimmunassay-vel mértünk. Az IL-10-nek minden kísérletben sokkal jelentősebb volt a gátlóhatása az LPS- vagy az IFNy plusz LPS-indukált monokinszintézisre (proteinszinten), mint az IL-4-nek.

C4. példa

Az IL-10 legyengíti aktivált makrofágokban a citokin mRNS kifejeződést RNS extrakció és RNS-analízis A makrofágsejtvonalakból a guanidinium-izotiocianát-eljárással vontuk ki a teljes sejt RNS-t. Az RNS-koncentrációt a 260 nm-nél mért abszorpcióval határoztuk meg. Az RNS-blot-analízist Moore és munkatársai szerint [Science, 248,1230-1234 (1990)] végeztük. A fordítottan átírt RNS PCR-analízisét O’Garra és munkatársai [Int’l Immunoi., 2, 821-832 (1990)] szerint végeztük. A cDNS-minták specifikus mennyiségét (a cDNS hússzoros hígításai) 2,5 egység Thermalase (Thermus aquaticus DNS-polimeráz; IBI) és Cetus/Perkin-Elmer Thermocycler készülék használatával sokszoroztuk. A feltételek a következők voltak: denaturálás 94 °C, 30 mp; anellálás 55 °O, 30 mp; extenzió 72 °C, 1 perc. HPRT- (house-keeping enzyme), TNFa- és IL-6-specifikus primereket használtunk: HPRT szensz: 5-GTA ATG ATC AGT CAA CGG GGG AC-3’ (422^44. nukleotid); HPRT antiszensz: 5’-CCA GCA AGC TTG CAA CCT TAA CCA-3’ (598-575. nukleotid); HPRT szonda: 5’-GCT TTC CCT GGT TAA GCA GTA CAG CCC C-3’ (543-570. nukleotid); TNFa szensz: 5’-GCG ACG TGG AAC TGG CAG AAG-3’ (4499-4519. nukleotid); TNFa antiszensz: 5’-GGT ACA ACC CAT CGG CTG GCA-3’ (5865-5845. nukleotid); TNFa szonda: 5’-CAG TTC TAT GGC CCA GAC CCT C-3’ (5801-5821. nukleotid); IL-6 szensz: 5’-CCA GTT GCC TTC TTG GGA CTG-3’ (1520-1540. nukleotid); IL-6 antiszensz: 5-GGT AGC TAT GGT ACT CCA-3’ (6093-6075. nukleotid);

IL-6 szonda: 5'-GTG ACA ACC ACG GCC TTC CCT

ACT-3’ (1547-1570. nukleotid).

Minden primer átírta a génben lévő közbenső szekvenciákat. Az érzékenységet és specificitást tovább növeltük a sokszorozott termékek dot-blotjainak a sokszorozott termék belsejéből származó radiojelzett (³²P-y-ATP) oligonukleotidokkal való szondázásával. A radioaktív biotokat Ambis Image Scanner használatával mértük, és röntgenfilmre exponálva tettük láthatóvá. Minden esetben egy P388D1 RNS-sel készített standardgörbét használtunk, hogy biztosítsuk a vizsgálat reprodukálhatóságát, és így egy végső dot-blotban megkaptuk a bevitt RNS-hez viszonyított önkényes egységeket pg-ban. Ezenkívül a HPRT house-keeping enzim egy belső standardját használtuk, hogy biztosan pontosan egyenlő mennyiségű RNS-t használjunk, és hogy minden minta fordított átírása és PCR-sokszorozása azonos hatékonysággal menjen végbe.

Az 1G18.LA és PU5.1 makrofágsejtvonalakból IL-10 vagy IL-4 jelenlétében - vagy ezek nélkül LPS-sel vagy LPS plusz IFNy-val való stimulálás után 6 órával vontuk ki az RNS-t. Az RNS-blot-analízist 10 pg össz-RNS-sel végeztük, amellyel kimutattuk, hogy az IL-10 legyengíti az LPS-sel vagy IFNy plusz LPS-sel indukált TNFa RNS expresszióját mindkét sejtvonalban (17. ábra), jóllehet kisebb mértékben az utóbbi esetben, Ezt szemikvantitatív PCR-rel állapítottuk meg a mindkét sejtvonalból fordítottan átírt RNS analízisével. Azzal, hogy minden citokinhez standardgörbét készítettünk - lásd a C1. táblázatot -, lehetővé vált, hogy az egyes dótokban jelen lévő, az ossz standard RNS pg-jához viszonyított önkényes egységeket megkapjuk, és így az eredményeket számokkal fejezhettük ki. A C1. táblázatban bemutatjuk, hogy az IL-10 és az IL-4 gátolja az LPS- és IFNy plusz LPS-indukált TNFa kifejeződését az 1G18.LA makrofágsejtvonalban. Ezt legjobban a standardgörbe vízszintes részéből származó értékek mutatják, és a C1. táblázat magyarázata megadja, hogy milyen módszer használatával jutottunk a számszerű adatokhoz. LPS-re és IFNy plusz LPS-re adott válaszként a PU5.1 makrofágsejtvonal által kifejezett RNS analízisének - azonos módszerrel - szintén az volt az eredménye, hogy az IL-6 és TNFa expresszióját is gátolja az IL-10 (C2. táblázat).

C1. táblázat 1. táblázat

Az IL-10 és IL-4 gátolja 1G18.LA makrofágsejtvonalban az LPS-indukált TNFa expresszióját^a>

Stimulus	cDNS hígítási faktor	0	IL-4	IL-10
cpm	‘pgRNS	cpm	*cpm	‘pgRNS	cpm	*cpm	‘pgRNS
LPS+IFN	1:9	1260	300	1987	2682	Plató	1232	1034	200
1:27	984	160	601	769	110	713	589	90
1:81	722	110	110	332	57	411	312	50

HU 224 437 Β1

C1. táblázat (folytatás)

Stimulus	cDNS hígítási faktor	0	IL—4	IL-10
cpm	‘pgRNS	cpm	*cpm	‘pgRNS	cpm	*cpm	‘pgRNS
LPS	1:9	1114	210	210	1587	330	1387	1068	200 |
1:27	896	120	120	403	60	460	271	45 I
1:81	472	72	72	403	60	310	220	33 I

^a)Az 1G18.LA makrofágsejtvonalat a 3. ábra szerint stimuláltuk. A felülúszókat 6 óra múlva eltávolítottuk, és guanidinium-izotiocianát-oldatot adtunk a sejtekhez RNS izolálása céljából. Az 1G18.LA makrofágsejtvonalból kapott össz-RNS 1 pg-ját használtuk fel a fordított átíráshoz 20 pl össztérfogatban. A cDNS-ből hígításokat (a táblázat szerint) készítettünk, és minden hígításból 1 μΙ-t használtunk fel a PCR-sokszorozáshoz. A reakcióban HPRT- (belső standard) vagy TNFa-specifikus primereket alkalmaztunk. A sokszorozott cDNS-termékből 10 μΙ-t használtunk fel a dot-blot-analízishez. A biotokat a megfelelő radioaktív jelzett szondával (a primerek belső része) vizsgáltuk. A kapott szignált Ambis Image Scanner használatával mértük. Minden hígításnál úgy jártunk el, hogy a TNFa-ra kapott nyers cpm-et a „0” mintához (IL-10 és IL—4 nélküli minták) viszonyított HPRT cpm alapján kapott korrekciós faktor (*) szerint standardizáltuk (*cpm). A pozitív kontroll títrálásához viszonyítva és a HPRT-tartalomnak megfelelően (*pg RNS/dot) lehet ezután meghatározni az önkényes egységeket, standardgörbe (nem látható) használatával.

C2. táblázat

IL-1O-hatásmechanizmus 2. táblázat

Az IL-10 gátolja az IL-6-ot és TNFa-t kódoló RNS LPS-indukált expresszióját a PU5.1 makrofágsejtvonalban.³)

Vizsgált citokin RNS	Stimulus
LPS+IFN-	LPS
+0	+IL-10	+0	+IL-10
cpm	‘pg RNS	cpm	*pg RNS	cpm	‘pg RNS	cpm	‘pg RNS
TNFa	1031	370	587	80	1864	730	469	23
IL-6	589	1000	207	700	108	90	27	44

^a> A PU5.1 mintákat lényegében az 1. táblázat szerint kezeltük, és HPRT-, TNFa-, IL-6-szintekre vizsgáltuk. A nyers cpm-et (lásd fent) először a minták HPRT-szintjei alapján korrigáltuk (az 1. táblázatban leírtak szerint). A TNFa- vagy IL-6-pozitív kontrollok ismert mennyiségeivel készített standardgörbék használatával meghatároztuk dot-blotonként a *pg RNS önkényes egységét (ahogyan az 1. táblázatban leírtuk). A TNFa és az IL—6 feltüntetett értékeit 1 μΙ cDNS 1:27, illetve 1:9 hígításaiból kaptuk (1 pg RNS fordított átírását 20 pl össztérfogatban végeztük).

C5. példa

Az IL-10 legyengíti az LPS-sel aktivált peritoneális makrofágok IL-6 protein termelését A peritoneális makrofágokat (MAC-1 és B220 alapján szortírozva) (makrofágtípusok: Mac-1^+(bri9^ht\ B220^-), melyekről már kimutattuk, hogy az IL-10 gátolja APC-funkciójukat, és így a Th1 sejteket a továbbiakban az LPS-re adott válaszban termelt TNFa- és IL-6-termelésre vizsgáltuk. TNFa nem volt kimutatható az LPS-sel stimulált, FACS-szortírozott makrofágok (sejtsűrűség: 7*10⁵ sejt/ml) felülúszójában. Ezzel szemben BALB/c vagy CBA/J egerek LPS-sel stimulált (lásd fent; 8. ábra) peritoneális makrofágjairól származó felülúszókban jelentős IL-6-szinteket mutattunk ki. Az IL-6-szintek csökkentek, ha a sejteket IL-10 jelenlétében stimuláltuk LPS-sel, de a gátlás mértéke meglepő módon - kevésbé kifejezett volt, mint amit a makrofágsejtvonalaknál figyeltünk meg (16. ábra). Az

LPS-sel indukált IL-6-termelés mértékét azonban meg lehetett növelni, ha IL-10 elleni monoklonális antitestet vittünk be az LPS stimulációs reakcióba (18. ábra). IL-10-specifikus ELISA módszerrel bizonyítottuk, hogy a makrofágok IL—10-et termelnek válaszként az LPS-re. A fentiek szerint LPS-sel stimulált CBA/J vagy BALB/c peritoneális makrofágok 2 egység/ml, illetve

4,5 egység/ml IL-10-et termeltek.

A 18. ábrán ugyancsak látható, hogy a tisztított

BALB/c peritoneális makrofágok nagyobb mennyiségben termelnek IL-6-ot, ha IFNy jelenlétében stimuláljuk LPS-sel, mint egyedül LPS-sel stimulálva. Ezt egy to55 vábbi olyan kísérlet eredményeivel magyarázhatjuk, amelynek tárgya a BALB/c egerekből származó peritoneális makrofágok IL-10-termelése volt. Ebben az esetben az LPS-sel stimulált makrofágok 12 egység/ml IL-10-et termeltek, és ez kevesebb mint 3 egység/ml-rel csökkent, ha a sejteket IFNy jelenlétében stimuláltuk.

HU 224 437 Β1

C6. példa

A makrofág APC funkció IL-10-zel való gátlásának vizsgálata arra vonatkozóan, hogy vajon oldható kostimulátortól függő mechanizmusról van-e szó Az IL-10 csak élő antigénbemutató sejtek (APC) (makrofágok) jelenlétében gátolja a Th1 citokinszintézist. Az IL-10 hatásának egy lehetséges mechanizmusa egy olyan oldható kofaktor termelés elnyomását feltételezi, amely a Th1 sejtekből való optimális citokinkibocsátáshoz szükséges. Makrofágokat stimuláltunk IFNy-val Th1 sejtek és specifikus antigén jelenlétében vagy ezek nélkül, és a felülúszókat összegyűjtöttük. Sem ezek a felülúszók (19A. ábra), sem a koncentrálásuk folyamán képződött átfolyó folyadék nem voltak képesek visszafordítani a Th1 sejtek részére megnyilvánuló makrofág APC funkció IL-10-közvetített gátlását. Ezek az adatok nem bizonyítják, hogy az IL-10 legyengítene egy olyan oldható kostimulátort, mely a Th1 citokinszintézishez szükséges. Hasonló kísérletek sem szolgáltak bizonyítékkal arra nézve, hogy az IL-10 indukálná a makrofágokat olyan szolubilis gátlófaktor termelésére, mely közvetlenül hatna a T-sejtre, jóllehet egy ilyen inhibitor labilis vagy membránhoz kötött is lehet. Ennek vizsgálata céljából egy sejtkeverési kísérletet végeztünk a következőképpen. Lép B-sejteket és makrofágokat szortíroztunk (B220 és Mac-1 alapján) FACS módszerrel. Makrofágok növekvő dózisait B-sejtek jelenlétében vagy B-sejtek nélkül és IL-10 jelenlétében és IL-10 nélkül - APC gyanánt használtuk HDK.1 sejtek antigénspecifikus stimulálására. A Th1 citokinszintézis makrofággal való stimulációját gátolta az IL-10, de a B-sejtekkel való stimulációt nem (19B. ábra). Ha a makrofágok növekvő dózisaihoz állandó számú B-sejtet kevertünk, ez a Th1 citokinszintézisre additív stimulációt jelentett (19B. ábra). Ha azonban ehhez az APC-keverékhez IL—10-et adtunk, a Th1 citokinszintézis szintje csak olyan szintre csökkent, mint amit egyedül B-sejt APC-vel lehet elérni. Ez a megfigyelés egy olyan rövid hatású vagy labilis inhibitor ellen szól, amely közvetlenül hatna a Th1 sejtre vagy a B-sejt APC-re.

D) tanulmány

Az IL-10 megvédi az egereket a szuperantigénindukált letális sokkal szemben

Összefoglalás

Egérmodellben tanulmányoztuk az IL-10 szerepét Staphylococcus enterotoxin B (SEB) által indukált letális sokk elleni védelem szempontjából. Az egerek IL-10-zel való előkezelése a később SEB-bel és D-galaktóz-aminnal (ez utóbbira azért volt szükség, hogy legyőzze az egerek természetes rezisztenciáját a SEB-bel szemben) beoltott egereket megvédte az elhullástól. Ez a hatás azt jelenti, hogy az IL-10 képes meggátolni a T-sejtek in vivő aktiválását, feltehetően azon képessége révén, hogy gátolja a makrofágok T-sejt-aktiváló képességét.

A szuperantigének olyan T-sejt-mitogének, amelyek T-sejt-receptor (TCR) Vp-specifikus módon aktiválják a T-sejteket azáltal, hogy kötődnek a TCR Vp láncokhoz és a II osztályú MHC molekulák β láncához. A szuperantigének az egér-emlőtumorvírusok (MMTV) által termelt endogén molekulák és az exogén szuperantigének, amelyek közé tartoznak az enterotoxinok, mint amilyeneket például a Staphylococcus aureus termel. A szuperantigének toxikus hatása az antigénbemutató sejtek (APC) jelenlététől függ. A legutóbbi években felismerték, hogy ezen toxinok toxikus hatása T-sejt-mitogén aktivitásuknak tudható be, és ennek a következtetésnek in vivő bemutatása meg is történt.

Az IL-10 egy olyan citokin, mely pleiotróp aktivitásokat fejt ki különböző sejtvonalakra: növekedési kofaktor egér T-sejtek és hízósejtek számára, B-sejtekben la indukciós hatással és T-sejt-aktiválást gátló képességgel rendelkezik. Ez utóbbi hatás közvetett, ugyanis a makrofágokat gátolja abban, hogy mint APC-k működjenek. Úgy tűnik, hogy ez a hatás az IL-10 makrofágfunkcióra gyakorolt hatásának egy része, ugyanis az IL-10 gátolja a makrofágok citokintermelő képességét is, így IL-1-, TNFa- és IL-6-termelő képességüket.

A tanulmányban Staphylococcus enterotoxin B-vel (SEB) egerekben kiváltott sokkot alkalmaztunk a T-sejt-közvetített letális sokk in vivő modelljeként. Ebben a modellben az egereket érzékennyé tettük a SEB toxikus hatásával szemben az állatok D-galaktóz-aminnal való előkezelésével. Ez a kezelés csökkenti az egerekben az enterotoxinok elleni természetes rezisztenciát, feltehetően azáltal, hogy a máj clearance mechanizmust megzavarja. A SEB kis dózisainak alkalmazása ezután az egerek elhullását eredményezi 2 napon belül. E modell szerint a toxicitás a masszív T-sejt-aktiválás eredménye, és úgy tűnik, hogy ebben a T-sejtek TNFa-termelésének van döntő szerepe. Az egerek kezelése IL-10-zel gátolja a SEB-közvetített toxicitást feltehetően azáltal, hogy gátolja a makrofágfüggő T-sejt-aktiválást.

D1. példa

Az IL-10 védőhatást gyakorol a SEB-közvetített toxicitással szemben in vivő

Egerek

Négy- vagy öthetes hím BALB/c H-2^d egereket vásároltunk a Simonsen Laboratories (Gilroy, CA.) cégtől.

Reagensek

A következő anyagokat használtuk. Az egér interleukin-10-et (mlL-10) standard módszerekkel állította elő Satish Menőn (DNAX Research Institute, Palo Alto, CA.). A D(+)-galaktóz-amint (G-0500) a Sigma cégtől (St. Louis, MO.) szereztük be. Az első kísérletben használt Staphylococcus enterotoxin B-t (SEB) szintén a Sigma cégtől vásároltuk. A következő kísérletekben használt SEB a Toxin Technologytól (Madison, WIS.) származott, és P. Hugó (National Jewish Center fór Immunology, Denver, CO.) bocsátotta rendelkezésünkre. Minden anyagot kiegyensúlyozott sóoldattal hígítottunk.

Kezelés

Négy- vagy öthetes hím egereket oltottunk (ip.) különböző koncentrációjú mlL-10-zel. Három-négy órával később ugyanezeknek az egereknek D-galak37

HU 224 437 Β1 tóz-amint injektáltunk (ip.). A második injekció után egy órával az egereket a SEB különböző koncentrációival oltottuk be. Az egereket az injekció utáni 24., 36. és 48. órában figyeltük meg.

Az első kísérletek szerint az IL—10 módosítja a SEB toxicitását in vivő egérmodellben. Az előzetes kísérleteket úgy terveztük, hogy megállapítsuk a SEB-nek azt a minimális dózisát, amely ebben a modellben magas mortalitást idéz elő. Ez a dózis a SEB származásától (szállító cég) és gyártási tételétől függően változott. Mihelyt egy adott SEB gyártási tételnél ezt a dózist meghatároztuk, megvizsgáltuk az IL—10-zel (10 pg/egér) való előkezelést. A 20. ábrán bemutatjuk, hogy IL-10-zel való előkezelés eredményeként minden 10 pg SEB/egér mennyiséggel oltott egér túlélő volt. Bár az IL—10 előkezelés végül nem gátolta meg a 20 pg SEB/egér mennyiséggel oltott egerek elhullását, a túlélésüket meghosszabbította.

E) tanulmány

Az interleukin-10 megvédi az egereket a letális endoxémiától

Összefoglalás

Az IL—10 csökkenti az IL—1 -, IL—6- és TNFa-termelést in vitro, és az IL—10 neutralizálása egérben ugyanezen monokinek megemelkedéséhez vezet. Ez a tanulmány azt vizsgálja, hogy vajon az IL—10-nek ez a monokinszuppressziós tulajdonsága együtt jár-e azzal a képességével, hogy megvédi az egereket az LPS-indukált sokktól, mely egy monokinközvetített gyulladásos reakció. Egyetlen 0,5 1 pg-os rekombináns egér IL—10 injekció reprodukálható módon megvédi a BALB/c egereket egy intraperitoneálisan beadott letális endotoxindózissal szemben. Ugyanezt az eredményt kaptuk, ha az IL-10-et akár egyidejűleg alkalmaztuk az endotoxininjekcióval, akár 30 perccel később. Az IL—10 védőhatását a neutralizáló anti-IL-10 antitestek előzetes injekciója megszünteti, ami együtt jár az endotoxinindukált TNFa-kibocsátás lényeges csökkenésével. Ezekből az adatokból következik, hogy az IL—10 számításba vehető bakteriális szepszis kezeléséhez, és még általánosabban mint hatékony gyulladás elleni reagens.

A súlyos bakteriális fertőzések mélyreható fiziológiai változásokat okozhatnak - ilyen az alacsony vérnyomás, láz, szövetelhalás, a szervek kiterjedt rendellenes működése -, és végül halált. Gram-negatív baktériumok esetében a toxicitás az endotoxinból - amely a bakteriális sejtfal lipopoliszacharíd- (LPS) komponense ered. Tehát ha LPS megfelelő dózisaival nyulat, egeret vagy más állatot oltunk be, ez olyan változásokat eredményez, amelyek a szeptikus sokk szindrómára jellemzőek, és így megkapjuk e gyulladásos reakció egyszerű állatmodelljét. Az endotoxinindukált toxicitást valószínűleg az endotoxinstimulált makrofágokból monocitákból kibocsátott TNFa, IL—1 és/vagy IL—6 okozzák, ugyanis az állatokat meg lehet védeni a bakteriális endotoxinindukált sokktól, ha ezeket a monokineket akár monoklonális antitestekkel, akár egy Fiziológiás IL—1 antagonista, az IL-1Ra használatával neutralizáljuk.

Az interleukin-10-nek számos in vitro tulajdonsága van, többek között gátolja a helper T-sejtek és NK sejtek IFNy-termelését. Ez utóbbi tulajdonságát tekintve az IL—10 mélyrehatóan gátolja a TNFa, IL-1a, IL—1 β, IL-6, IL—8 és GM-CSF indukált termelését humán monocitákban és egér peritoneális makrofágokban. Ezzel szemben az IL—10 nincs hatással a ΤΩΕβ monocitákban történő konstitutív expressziójára, és ténylegesen felerősíti monocitákban az IL—1 Ra-termelést. Ezeket az in vitro adatokat alátámasztották az in vivő kísérletek, amelyekben kimutattuk, hogy ha az IL-10-et specifikus monoklonális antitestekkel neutralizáltuk, ez egerekben megnövelte a keringő TNFa- és IL-6-szinteket. Megvizsgáltuk, hogy ha az IL—10 TNFa-, IL-1- és IL-6-termelést gátló képessége kombinálódna IL-Ra-t növelő képességgel, vajon ez a citokin képes lenne-e megvédeni az egereket az endotoxinindukált sokkal szemben.

E1. példa

IL-10 hatása a letális endoxémiára egérben

Egerek

Nyolchetes BALB/c egereket szereztünk be a Simonsen Laboratories cégtől (Gilroy, CA.).

Reagensek

A lipopoliszacharidot (LPS) - 0111 :B4 szerotípusú E. coliból készült - a Sigma Chemical Co.-tól vásároltuk. A rekombináns egér IL-10-et E. coliban fejeztük ki, affinitástisztítást végeztünk, és ioncserés kromatográfiát, hogy magas specifikus aktivitást érjünk el. Ez az anyag minimális endotoxint tartalmazott, és 4 °C-on legalább 4 hónapig stabil maradt. Az egér IL-10 specifikus aktivitását citokinszintézis-gátlási vizsgálattal [Fiorentino et al., J. Expt’l Med., 170, 2081-2095 (1989)] és az MC/9 hízósejt kostimulációs vizsgálattal [Thompson-Snipes et al., J. Expt’l Med., 173, 507-510 (1991)] határoztuk meg. Neutralizáló antitest kísérletekben a 2A5 lgG1 antiegér IL-10 monoklonális antitestet vagy a GL113 jelű megfelelő izotípusú kontrollantitestet használtuk.

TNFa-vizsgálat

A szérum TNFa szinteket citokinspecífikus ELISA kit használatával határoztuk meg.

20-20 BALB/c egérből álló csoportokat vagy csak LPS letális dózisával vagy ugyanilyen mennyiségű LPS-nek és különböző mennyiségű rekombináns egér IL-10-nek a keverékével oltottunk intraperitoneálisan. Számos ilyen típusú kísérletben az egereket teljesen megvédte az LPS-indukált sokkban való elhullástól, ha az IL—10-ből 0,5 pg-ot, 1,0 pg-ot vagy 10 pg-ot adtunk az állatoknak az LPS-sel egyidejűleg (21. ábra). Ezekben a kísérletekben részleges védelmet figyeltünk meg, ha az egerek 0,1 pg vagy 0,05 pg IL-10-et kaptak az LPS beadásával egy időben.

E2. példa

A védelem neutralizálása anti-IL-10 antitestekkel

A letális endoxémiával szembeni IL-10-közvetített védelem blokkolható, ha előzőleg neutralizáló anti-IL-10 antitesteket alkalmazunk. Megfelelő izotípusú kontrollantitest adása nem blokkolja a védelmet (22. ábra). Ezzel bizonyítottuk a hatás specificitását.

HU 224 437 Β1

E3. példa

Az IL-10 késői alkalmazása a védelem szempontjából hatékony marad

Kinetikai vizsgálatokkal megállapítottuk, hogy a letális endoxémiával szembeni IL-10-közvetített védelmet akkor is elérjük, ha az IL-10-et az LPS-injekció után 30 perccel alkalmazzuk (23. ábra). Az IL-10 adásának további késleltetése azonban lényegesen csökkentette a védelmet, és nem volt észlelhető védelem, ha az IL-10-et az LPS-injekció után 5 órával alkalmaztuk (23. ábra).

E4. példa

IL-10 hatása a TNFa-ra

A letális endoxémia egy nemkívánatos monokinközvetített gyulladásos reakció. Kimutattuk, hogy az IL-10 gátolja az aktivált makrofágok és monociták termelését in vitro, amiből arra lehet következtetni, hogy a fent említett IL-10-közvetített védelem az endotoxinindukált válaszként létrejött monokintermelés gátlását tükrözi. Ugyanis az LPS plusz IL-10 injekció után 1, 2 és 3 órával levett szérumokban a keringő TNFa-szintek erős csökkenését észleltük az IL-10 által védett állatoknál. Minthogy az anti-TNFy hasonlóan védi az egereket a letális endoxémiától, valószínűleg a TNFa IL-10 által indukált szuppressziója hozzájárul ahhoz a védelemhez, amelyet ez a citokin nyújt a letális endoxémiával szemben. Az IL—10-nek a makrofág/monocita funkcióra gyakorolt egyéb hatásai szintén részét képezhetik a letális endoxémiával szembeni védekezőképességnek. In vitro vizsgálatok kimutatták, hogy az IL-10 az IL—1-et és IL-6-ot nemcsak gátolja, hanem felerősíti az IL-1 Ra-t, és ezek olyan következmények, amelyek szintén védelmet nyújtanak a letális endoxémiával szemben. Ugyanerre a következtetésre jutottak a szerzők, akik neutralizáló anticitokin antitesteket használtak, vagy közvetlenül IL-Ra-t alkalmaztak.

F) tanulmány

Antiinterleukin-10 antitest folyamatos alkalmazása egerekben kimeríti a Ly-1 B-sejteket, de a konvencionális B-sejteket nem

Összefoglalás

A Ly-1 B-sejtek egy megkülönböztető tulajdonsága, hogy folyamatosan feltöltik önmagukat, továbbá olyan alapon lehet megkülönböztetni ezeket a sejteket a konvencionális B-sejtektől, hogy igen erős a konstitutív és indukálható interleukin-10- (IL-10; a legutóbb leírt citokin) termelésük. Annak meghatározására, hogy vajon az IL-10 mint autokrin vagy mint parakrin növekedési faktor hat-e a Ly-1 B-sejtekre, egereket születésüktől fogva 8 hetes korukig folyamatosan kezeltünk olyan monoklonális patkány IgM antitesttel, amely specifikusan neutralizálta az egér IL-10-et. Az ilyen módon kezelt egerek nem tartalmaztak peritoneális Ly-1 B-sejteket, nagyon alacsony volt a szérum immunglobulin M (IgM) szintjük, és képtelenek voltak szignifikáns in vivő antitestválaszt adni a1,3-dextrán- vagy foszforil-kolin- ezek olyan antigének, amelyek számára a specifikus B-sejteket a Ly-1 B-sejt-alcsoport jelenti - injekciókra.

Ezzel szemben az anti-IL-10-zel kezelt egerek konvencionális B-sejtjeinek száma, fenotípusa, továbbá B-sejt-mitogénekre és a tímuszfüggő trinitro-fenil-csiga-hemocianinra (TNP-KLH) való válaszadási készsége normális volt. A Ly-1 B-sejt-kimerítés mechanizmusa valószínűleg kapcsolatban van azzal a körülménnyel, hogy az anti-IL-10-zel kezelt egerekben megnő az endogén interferon-γ- (IFNy-) szint, ugyanis neutralizáló anti-IFNy antitestek együttes adása lényegében visszaállította a peritoneális Ly-1 B-sejtek számát ezekben az egerekben. Ezekből az eredményekből következik, hogy az IL-10 mint szabályozó szerepel a Ly-1 B-sejtek kialakulásában, és meghatároz egy olyan folyamatot, amely specifikusan kimeríti a Ly-1 B-sejteket. Ezáltal lehetővé válik e sejtek immunrendszerbeli szerepének további kiértékelése.

A Ly-1 B-sejtek egy kifejtett egér B-sejtjeinek mintegy 2%-át teszik ki, és számos olyan érdekes tulajdonságuk van, amely megkülönbözteti őket a konvencionális B-sejtektől: a) jóllehet a legtöbb primer és szekunder limfoid szövetben alig lehet kimutatni, nagymértékben feldúsulnak a hashártya és mellhártya üregeiben, minthogy szaporulatuk a béllel társult limfoid szövetben van; b) a korai ontogenezisben túlnyomóan ezek a sejtek fejlődnek ki, majd önmagukat töltik fel az állat élete folyamán; c) korlátozott számban termelnek alacsony affinitású antitesteket, amelyek saját determinánsaikkal erősen keresztreagálnak, és nem valószínű, hogy szomatikus mutáció révén érnek; d) ezek a sejtek termelik a szérum IgM legnagyobb részét, és számos bakteriális determinánssal szemben, mint az a1,3-dextrán és a foszforil-kolin, ezek adják a teljes antitestválaszt. Bár pontos szerepük az immunrendszerben nem világos, a különböző modellekben, amelyekben már előrehaladás történt a Ly-1 B-sejtek által termelt antitestek specificitását illetően, kitűnt, hogy az antibakteriális immunitásban van szerepük; a gazda sejttörmelékeinek - ilyenek az elöregedő vörösvérsejtek - eltakarításában; és a fejlődés folyamán az antitestrepertoár modulálásában. Nemrégen fedeztük fel, hogy a Ly-1 B-sejtek hatékony IL-10-termelők. Az IL-10 egy olyan immunszuppresszív citokin, amely legyengíti számos monokin és T-sejt-eredetű citokin termelését, és megnöveli annak lehetőségét, hogy a Ly-1 B-sejtek szélesebb immunszabályozó szerephez jussanak. E megkülönböztető vonások nagy részét nehéz emberben kiértékelni, azonban azonosítottunk egy Ly-1 viselkedésű, rokon tulajdonságokkal rendelkező humán B-limfocita-populációt.

F1. példa

A folyamatos IL-10-neutralizálás kimeríti egerekben a Ly-1 B-sejteket Egerek

Félidős vemhes BALB/c egereket és C3H/HeJ egereket kaptunk a Simonsen Laboratóriumtól (Gilroy, CA.).

Antí-IL-10-kezelés

5-10 azonos korú BALB/c egeret születésüktől fogva 8 hetes korukig háromszor egy héten intraperítoneálisan oltottunk SXC.1 jelű neutralizáló patkány IgM antiegér IL-10 antitesttel (első hét: 0,2 mg/injekció; máso39

HU 224 437 Β1 dik hét: 0,5 mg/injekció; harmadik héttől a nyolcadik hétig: 1,0 mg/injekció), azonos mennyiségű megfelelő izotípusú J5/D jelű kontrollal vagy azonos térfogatú (100 vagy 200 pl) foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal (PBS). Minden kísérletben összehasonlításul azonos korú kezeletlen egereket is használtunk. Az SXC.1 és J5/D antitesteket szérummentes hibridóma felülúszókból nyertük, és kétszer egymás után 35%-os ammónium-szulfátos kicsapással tisztítottuk. Néhány kísérletben az egerek azonos mennyiségű 2A5 jelű patkány lgG1 antiegér IL-10 antitestet vagy GL113 jelű megfelelő izotípusú kontrollt kaptak. Ez utóbbi antitesteket intraperitoneálisan alkalmaztuk. Az első héten: 0,5 mg/injekció; a második héten 1 mg/injekció; a harmadik héttől a nyolcadik hétig: 2 mg/injekció.

Immunfluoreszcencia:

Mosott sejteket festettünk a következő reagensek kombinációival: fluoreszceinnel jelzett antiegér IgM antitest (DS-1; Pharmingen, San Diego, CA.); biotinezett patkány antiegér IgD antitest (11-26c; gyártotta J. Kearney); fluoreszceinnel jelzett antiegér CD3 antitest (145-2C11; Boehringer-Mannheim Corp., Indianapolis, IN.; Caltag Labs., South San Francisco, CA.); a bíotinnel jelzett reagenseket fikoeritrinnel konjugált sztreptavidinnel (Becton-Dickinson and Co., Mountain View, CA.) együtt használtuk. A sejteket FACScan készüléken analizáltuk, és a nem élő sejteket előszög és oldalszórás (forward angle and side scatter) alapján zártuk ki. Minden kísérleti csoportból 5000 élő sejt fluoreszcenciaintenzitását mutatják az eredmények.

Antitest ELISA vizsgálatok:

A 8 hetes kezelés után levett szérummintákat egér IgM jelenlétére vizsgáltuk olyan szendvics ELISA használatával, amelyben az antiegér IgM (R8-103, Pharmingen) 5 pg/ml koncentrációjú oldatával PVC mikrotitrálólemezeket fedtünk. Ehhez adtuk a szérummintákat vagy standard gyanánt a tisztított myeloma egér IgM proteinek keverékét. Az immunkomplexeket ezután biotinezett patkány antiegér IgM-mel (R19-15, Pharmingen) és avidinnel konjugált torma-peroxidázzal (Cal-Biochem Corp., La Jolla, Ca.) plusz 1 mg/ml szubsztrátummal [2,2’-azino-bisz(3-etil-benztiazolin)-szulfonsav; Sigma Chemical Corp.] mutattuk ki.

A foszforil-kolin és a1,3-dextrán elleni specifikus antitestválaszokat úgy határoztuk meg, hogy az antí-IL-10-zel kezelt vagy kontrollegereknek emlékeztető oltást adtunk intraperitoneálisan. Az oltóanyag 0,5 ml nátrium-klorid-oldatból, illetve Leuconostoc mesenteroidesből származó 50 pg a1,3-dextránból [dr. Slodki bocsátotta rendelkezésünkre (U. S. Dept. of Agriculture, Agricultural Research Service], illetve 2^χ10⁸ hővel elölt Streptococcus pneumoniae-ből (mint a foszforil-kolin forrása) állt. Minden egérből 7 nappal később levettük a szérumokat, és ELISA analízissel vizsgáltuk a1,3-dextrán, illetve foszforil-kolin elleni specifikus antitestekre. A TNP-KLH elleni specifikus antitestválaszok meghatározásából az egerek 10 pg TNP-KLH-t tartalmazó emlékeztető oltást kaptak intraperitoneálisan, majd 7 nap múlva levettük a szérumokat IgM analízishez. A TNP-specifikus antitesteket ELISA módszerrel mértük. Az anti-IL-10-kezelést minden esetben folytattuk az emlékeztető oltás és a szérum levétele között.

IFNy ELISA

Az anti-IL-10-zel kezelt vagy kontroliegerekből levett szérumok egér IFNy tartalmát citokinspecifikus ELISA készlettel vizsgáltuk.

Hím és nőstény BALB/c egereket oltottunk születésüktől kezdve 8 hetes korukig háromszor egy héten az SXC.1 jelű neutralizáló patkány IgM antiegér IL-10 mAt különböző dózisaival, majd a Ly-1 B-sejtek számát és funkcióját vizsgáltuk. Azonos korú BALB/c egereket, amelyek nem kaptak kezelést, vagy olyanokat, amelyek PBS-ből vagy egy patkány IgM izotípus kontroliból (J5/D) megfelelő injekciókat kaptak, kontrollként használtunk összehasonlítás végett. A kísérlet végeredménye szignifikánsan nem változott, ha az antitesteket akár intraperitoneálisan, akár szubkután adtuk be. Az antitestinjekciózás rendjének eredményeként a 8. héten a szérumok patkány IgM szintje 50 mg/ml volt. A meghatározást mind az SXC.1, mind a J5/D antitestek esetén egy patkány IgM-specifikus ELISA kittel mértük. A 8 hétig tartó kezelés után az anti-IL-10-zel kezelt egereket nem lehetett megkülönböztetni a három kontrollcsoport egereitől a következő kritériumok szerint: teljes testtömeg; a máj, lép, tímusz, nyirokcsomók, belek és tüdő makroszkópos szövettani vizsgálata; összfehérvérsejtszám a lépben, tímuszban, nyirokcsomókban és hashártyában; B-sejtek, T-sejtek és non-B/-T sejtek aránya a lépben, nyirokcsomókban és tímuszban. Ezzel szemben azonban az említett négy kísérleti csoportból származó 5-10 egérből gyűjtött peritoneális mosadékban lévő sejtek immunfluoreszcenciás fenotipizálása kiderítette, hogy az anti-IL-10-zel (SXC.1) kezelt egerekben az lgM+ és lgD+ sejtek feltűnően kimerültek, viszont a kontrollállatok egyikében sem merültek ki (24. ábra). Ugyanilyen eredményeket kaptunk további 24 független kísérletben. Ezek közül két kísérletben C3H/HeJ egereket használtunk, és többször használtunk külön patkány lgG1 anti-IL—10 neutralizáló antitestet. Az anti-IL-10-zel kezelt állatokból kimerültek a B220-hordozó peritoneális sejtek is - ezt immunfluoreszcenciás vizsgálattal mutattuk ki - és az LPS-re válaszoló peritoneális sejtek is. Ezt úgy állapítottuk meg, hogy az 50 pg/ml LPS-sel 3 napon át tenyésztett sejteket vizsgáltuk, hogy képesek-e beépíteni [³H]-timidint. Ezekből az adatokból arra lehetett következtetni, hogy az anti-IL-10-zel kezelt BALB/c egerek peritoneális üregeiben nincsenek B-sejtek, míg normálkörülmények között innen 1-5*10⁶ B-sejt nyerhető. Fontosnak tartjuk megemlíteni, hogy háromszínű immunfluoreszcenciás vizsgálat szerint - állattartási körülményeink között - a 8 hetes BALB/c egerek nagyon kevés (<5%) konvencionális B-sejtet tartalmaztak. A 24. ábrán bemutatott eredmények ezért túlnyomóan a Ly-1 B-sejtek kimerítését mutatják. A peritoneális B-sejtek szembetűnő kimerítése ellenére az anti-IL—10-zel kezelt egerek peritoneális üregeinek összsejtszáma nem különbözik jelentősen a kontrollcsoportokéitól. A további immunfluoreszcenciás analízis a hemopoetikus vérképpel együtt azt mutatja, hogy an40

HU 224 437 Β1 ti-IL-10-zel kezelt egerekben a B-sejtekben bekövetkezett veszteséget a peritoneális CD4+ T-sejtek és a granulociták felszaporodása kompenzálja. Két további megfigyelés szerint anti-IL-10-zel kezelt egerekben a Ly-1 B-sejtek kimerülése az egész immunrendszert át- 5 hatja, és nem korlátozódik a peritoneális üregekre. Először, az anti-IL-10-zel kezelt egerekben - összehasonlítva a kontrollcsoportokkal - a szérum IgM szintek feltűnő, 90-100%-os csökkenése következik be. Ezt egy egér IgM-specifikus ELISA készlettel kísértük figyelem- 10 mel (25. ábra). Másodszor, az anti-IL-10-zel kezelt egerekben nagymértékben hiányzik az a képesség, hogy a1,3-dextránnal vagy foszforil-kolinnal szemben in vivő antitestválaszt adjanak (26. ábra), ugyanis az a1,3-dextrán és a foszforil-kolin két olyan tímuszfüggő 15 antigén, amelyekre a funkcionálisan feleletet adó B-sejteket kizárólag a Ly-1 B-sejtek képviselik.

F2. példa

Az anti-IL-10-zel kezelt egerek fenotipusra és mü- 20 ködésre nézve normál, konvencionális B-sejteket tartalmaznak

Az anti-IL-10-zel kezelésnek a Ly-1 B-sejtekre gyakorolt meglepő hatására tekintettel fontosnak tartottuk a konvencionális B-sejtek státusának gondos vizs- 25 gálatát ezekben az állatokban. Mint fent megállapítottuk, 24 független kísérletben az anti-IL-10-zel kezelt vagy kontrollállatokban a lépek összfehérvérsejtszáma nem különbözött jelentősen. A 27. ábrán látható, hogy a B220+ B-sejtek, a CD3+ T-sejtek és a non-B/-T sejtek (B220^- CD3^-) aránya nem különbözött a négy kísérleti egércsoportban. Azonos eredményeket kaptunk, ha az lg+ B-sejteket vagy a CD4+ T-sejteket hasonlítottuk össze. Ezek az adatok arra mutatnak, hogy anti-IL-10-zel kezelt egerekben a lép B-sejt fenotípusok össz-száma megegyezik az egyes kontrollcsoportok lép B-sejt fenotípusai számával. Az anti-IL-10-zel kezelt egerekben a konvencionális B-sejtek immunkompetenciáját kétféleképpen teszteltük. Először: az anti-IL-10-zel kezelt egerek normál IgM és IgG antitesteket termeltek válaszként a TNP-KLH tímuszfüggő antigénnel való oltásra (28. ábra). A TNP-KLH-ra adott másodlagos válaszok is normálisak voltak anti-IL-10-zel kezelt egerekben. Másodszor: az anti-IL-10-zel kezelt egerekből származó lép B-sejtek normál in vitro proliferatív válaszokat adtak 50 gg/ml LPS-re vagy anti-lgM antitestre (F1. táblázat). Az anti-IL-10-zel kezelt egerek esetén a lépsejtek háttér proliferatív válaszai három-ötször magasabbak voltak, mint a kontrolioké (F1. táblázat). Ezek az adatok összességükben arra utalnak, hogy anti-IL-10-zel kezelt egerekben a konvencionális B-sejteket mennyiségileg és működésük szempontjából nem lehet megkülönböztetni a kontrollegerek konvencionális B-sejtjeitől.

Ft. táblázat

Anti-IL-10-zel kezelt és kontrollegerekből származó lépsejtek in vitro proliferatív válasza LPS-, anti-lgM- és anti-CD3-stimulusra

Állatcsoport	[3+H]-timidin
+ 0	+ LPS	+ anti-lgM	+ anti-CD3
cpm
Kezeletlen	224	22,570	3,346	90,093
PBS	320	42,298	3,821	115,692
J5/D	547	46,748	2,897	135,172
SXC.1	2,779	61,609	7,218	96,389

Az állatokat születésüktől kezdve 8 hetes korukig úgy kezeltük, ahogyan az F1. példában leírtuk. Minden csoportból három egér lépsejtjeit egyesítettük, és 2*10⁶ sejt/ml sűrűségben tenyésztettük 3 napon át csak táptalajban vagy LPS-sel (50 gg/ml) kiegészített, kecske antiegér IgM antitesttel (50 mg/ml) kiegészített vagy hörcsög antiegér CD3 antitesttel (5 mg/ml) kiegészített táptalajban. Az anti-CD3-stimulációhoz az antitestet mikrotitrálólemezzel reagáltattuk, mielőtt a lépsejteket hozzáadtuk. A proliferációt a [³H]-timidin beépülésével vizsgáltuk, miután 16 órán át reagáltattuk 1 gCi/tartály [³H]-timidinnel (NEN 027; New England Nuclear, Boston, MA.).

F3. példa

A Ly-1 B-sejt-kimerítés mechanizmusa

Proliferációs vizsgálat

Minden csoportból három egér lépsejtjeit egyesítettük, és a sejteket 2*10⁶ sejt/ml sűrűség mellett 3 napon át tenyésztettük csak táptalajban vagy LPS-sel (50 gg/ml) kiegészített, kecske antiegér IgM-mel (50 gg/ml; 0611-0201; Cappel Laboratories, Cochranville, PA.) kiegészített vagy hörcsög antiegér CD3 antitesttel (5 gg/ml; D. J. Bjuestone, University of Chicago, Chicago, IL.) kiegészített táptalajban. Az anti-CD3-stimulációhoz a mikrotitrálólemezt antitesttel fedtük, mielőtt a lépsejteket hozzáadtuk. A proliferációt [³H]-ti41

HU 224 437 Β1 midin beépülése révén vizsgáltuk, miután 16 órán át reagáltattuk 1 pCi/tartály [³H]-timidinnel (NEN 027; New England Nuclear, Boston, MA.).

Több lehetséges mechanizmust vettünk számításba annak magyarázatára, hogy mi okozza a Ly-1 B-sejtek kimerülését anti-IL—10-zel kezelt egerekben. Nem valószínű, hogy ez a hatás az anti-IL—10 antitest által a Ly-1 B-sejtekre gyakorolt szelektív citotoxicitás eredménye volna. Ugyanis, ha ugyanezt az antitestet kifejlett egerekbe injektáltuk, ennek nem volt hatása az ezt követő 1, 2 vagy 3 nappal később a teljes peritoneális mosott sejtek vagy ossz peritoneális B-sejtek kinyerésére (29. ábra). Egy másik magyarázatként arra a lehetőségre gondoltunk, hogy a Ly-1 B-sejt-kimerülés bizonyos endogén citokinzavar másodlagos következményét tükrözi. Az anti-IL—10-zel kezelt egerekben valóban, többnyire megemelkedett szérum IFNy szinteket találtunk (30. ábra). Ez a megfigyelés egybevág azzal az előző közléssel, miszerint az IL-10 képes in vitro gátolni a Th1 és NK sejtek IFNy-termelését. Az IFNy anti-IL-10-indukált emelkedését abból a szempontból vizsgáltuk, hogy vajon ez közvetlenül vagy közvetve felelős-e a Ly-1 B-sejtek kimerüléséért. Ebből a célból egereket születésüktől fogva kifejlett korukig oltottunk anti-IL—10 és anti-IFNy neutralizáló antitestek kombinációjával vagy anti-IL-10 és egy megfelelő izotípusú kontroliantitest kombinációjával. Az eredmények azt mutatták, hogy az anti-IFNy antitestek (31. ábra) izotípuskontrollja azonban nem - lényegesen csökkentik az anti-IL-10-kezelésnek azt a hatását, amely kimeríti egerekben a peritonális Ly-1 B-sejteket. Fontos megjegyezni, hogy egyedül az anti-IFNy antitestek vagy az anti-IL-10 plusz anti-IFNy antitestek folyamatos alkalmazása nem változtatják meg az ossz peritoneális mosott sejtek kinyerését a csak anti-IL—10-zel vagy izotípuskontrolljával kezelt egerekből. Ezek az adatok azt az elméletet támasztják alá, hogy a Ly-1 B-sejt-kimerülés legalábbis részben annak a következménye, hogy anti-IL—10-zel kezelt egerekben az IFNy megnövekszik.

G) tanulmány

Anti-IL-10-zel kezelt egerek módosult immunológiai státusa Összefoglalás

Fentiekben bemutattuk, hogy egerek neutralizáló anti-IL-10 antitestekkel való folyamatos kezelése, születésüktől kezdve kifejlett korukig, a Ly-1 B-sejtek specifikus kimerüléséhez vezet, míg a konvencionális B-sejtek száma, fenotípusa és funkciója normális marad [lásd az F) tanulmányt]. Ezen állatok vizsgálatának a kiterjesztése révén kapott adatok mutatják, hogy az anti-IL—10-zel kezelt egerek számos más kritérium alapján is megkülönböztethetők a kezeletlen vagy a megfelelő izotípusú kontrollal kezelt egerektől. Anti-IL-10-zel kezelt egerekben lényegesen magasabbak a keringő TNFa-szintek, és sok esetben a keringő IL—6 szintje is, továbbá nagyon hajlamosak egy monokinközvetített gyulladásos reakció, az LPS-indukált sokk által kiváltott elhullásra. Anti-IL—10-zel kezelt egerekben a szérum immunglobulin szintek analízise kimutatta, hogy a szérum IgA szintek csökkenését a szérum IgM már ismertetett csökkenése, ezenkívül az IgG2a- és lgG2b-szintek meglepő növekedése kíséri. Anti-IL-10-zel kezelt egerekben a Ly-1 B-sejt-kimerülés további vizsgálata kimutatta, hogy ez a hatás átmeneti, mivel a Ly-1 B-sejtek normálszáma visszaáll 8 héttel az anti-IL-10-kezelés megszüntetése után. Azt találtuk, hogy a Ly-1 B-sejt-kimerülést, ami az anti-IL-10-kezelés folyamán következik be, kompenzálja a peritoneális T-sejtek és a granulociták számának növekedése. Végül, míg az anti-IL—10-zel kezelt egerek nem voltak képesek foszforil-kolin és a1,3-dextrán elleni antitestek termelésére, ugyanakkor normál-antítestválaszt adtak TNP-Ficoll intraperitoneális injekcióit követően. Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a tímuszfüggetlen II típusú poliszacharid antigének családján belül alosztályok léteznek. Ezeket az adatokat az IL-10 és a Ly-1 B-sejtek immunrendszerbeli szerepének jelentősége vonatkozásában fejtjük ki.

Az immunrendszert oldható glükoproteinek egy családja szabályozza. Ezeket citokineknek nevezzük. A citokineket különböző hemopoetikus és nem hemopoetikus sejtek termelik. A legutóbbi öt év folyamán ezeknek az immunregulátoroknak a széles körű in vitro vizsgálata ahhoz a felfogáshoz vezetett, hogy a citokinrendszeren belül messzemenő funkcionális pleiotrópia és bőség uralkodik. Az immunológusok most azzal a kihívással néznek szembe, hogy megvizsgálják, vajon ez a felfogás pontosan tükrözi-e a citokinek in vivő fiziológiai szerepét. A legutóbb felfedezett citokinnek, az ínterleukin-10-nek a fiziológiai szerepe a kutatás tárgya. Az in vitro tulajdonságok terjedelmes sora úgy jellemzi az IL-10-et, mint hatékony immunszuppresszív szert, amely képes számos monokin és citokin termelését legyengíteni, és képes meggátolni bizonyos antigénbemutató sejteket - de nem minden antigénbemutató sejtet - az antigénbemutatásban. A stimulátor tulajdonságok hasonlóan hosszú sora jellemzi ugyanezt a citokint: a timociták, perifériás T-sejtek, B-sejtek és hízósejtek növekedésének konstimulátora; erősíti a citotoxikus T-sejtek fejlődését és funkcióját; a B-sejtek életképességét erősíti, és differenciálódásukat elősegíti. Annak érdekében, hogy az IL-10 in vivő fiziológiai szerepét tanulmányozzuk, egereket születésüktől kezdve kifejlett korukig hetente két-háromszor neutralizáló anti-IL-10 monoklonális antitestekkel oltottunk, A korai analízisekből kiderült, hogy ez a kezelés a B-limfociták egy kis alcsoportjának - ezeket a sejteket Ly-1 B-sejteknek nevezzük - feltűnő kimerüléséhez vezet. Következésképpen az IL-10 a Ly—1/B-1 sejtfejlődés regulátoraként működik.

A Ly-1 B-sejtek a B-limfociták egy alpopulációját képezik, emberben és egérben a magzati és újszülött limfoid szövetekben nagyon gyakoriak, de csak kis számban fordulnak elő a felnőtt, kifejlett immunrendszerben. Míg felnőttek elsődleges és másodlagos limfoid szöveteiben alig lehet kimutatni a Ly-1 B-sejteket, kifejlett egerek hashártya- és mellhártyaüregeiben erősen feldúsulnak. Felnőtt ember keringésében kis szám42

HU 224 437 Β1 bán fordulnak elő. Széles körű tanulmányozásuk az egérimmunrendszerben számos érdekes tulajdonságukat tárta fel, többek között alacsony affinitáséi antitestek korlátozott repertoárját. Ezek az antitestek nem mennek át könnyen szomatikus mutáción, és erősen keresztreagálnak autoantigénekkel és bakteriális sejtfal komponensekkel. Ezenfelül egérben a rekonstrukciós kísérletek arra mutattak, hogy a konvencionális B-sejtekkel ellentétben a Ly-1 Β-sejtek képesek az önfeltöltésre a gazdaszervezet egész élete folyamán, és hogy ezek a sejtek állítják elő a szérum IgM nagy részét, és ezek adják számos bakteriális determináns például foszforil-kolin és a1,3-dextrán - ellen a teljes antitestválaszt. A Ly-1 Β-sejtek előzetes vizsgálatai kimutatták, hogy további megkülönböztetésük a konvencionális B-sejtektől azon az alapon történhet, hogy IL-10-termelésük igen magas és indukálható, ami megnöveli e sejtek szélesebb immunregulációs szerepének lehetőségét. Ezen különleges tulajdonságok ellenére a Ly-1 Β-sejtek immunrendszerben betöltött szerepe homályos maradt.

Azokban az egerekben, amelyeket születésüktől kezdve kifejlett korukig folyamatosan kezeltünk neutralizáló anti-IL—10 antitestekkel, a Ly-1 Β-sejtek kimerültek. Ennek bizonyítéka volt az a tény, hogy hiányoztak belőlük a peritoneális Β-sejtek, hogy drasztikusan csökkent szérum IgM szintjük, valamint hiányzott az in vivő antitestválaszuk a1,3-dextránnal és foszforil-kolinnal szemben. Úgy találtuk, hogy a Ly-1 B-sejt-kimerülés az endogén IFNy megemelkedésének másodlagos következménye, amelyet meg lehet előzni anti-IFNy antitestek együttes alkalmazásával. Ebben a tanulmányban a Ly-1 Β-sejtek specifikus kimerülésének és az endogén IL—10-nek ezen egerek immunstátusán észlelt következményeit tárgyaljuk.

G1. példa

Anti-IL-10-kezelés hatása egerekben az endogén citokinszintekre

Egerek

Félidős vemhes BALB/c egereket szereztünk be a Simonsen Laboratory (Gilroy, CA.) cégtől.

Anti-IL—10-kezelés

Azonos korú BALB/c egereket (5-10) születésüktől kezdve 8 hetes korukig oltottuk intraperitoneálisan a két anti-IL—10 antitest közül az egyikkel a következő kísérleti előirat szerint. Néhány kísérletben hetente háromszor oltottuk az egereket SXC.1 patkány IgM antiegér IL-10 antitesttel [Mosmann et al., J. Immunoi., 145, 2938-2945 (1990)] (első héten: 0,2 mg/injekció, második héten: 0,5 mg/injekció, a harmadik héttől kezdve a nyolcadik hétig: 1,0 mg/injekció) vagy azonos mennyiségű megfelelő izotípusú kontrollal (jele: J5/D) vagy azonos térfogatú (100 vagy 200 μΙ) foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal (PBS). Más kísérletekben az egereket kétszer oltottuk a 2A5 jelű patkány IgG 1 antiegér IL-10 antitesttel (első héten: 0,2 mg/injekció, második héten: 0,5 mg/injekció, a harmadik héttől kezdve a nyolcadik hétig: 1,0 mg/injekció) vagy azonos mennyiségű megfelelő izotípusú kontrollal (jele:

GL113) vagy azonos térfogatú (100 vagy 200 μΙ) PBS-sel. Minden kísérletbe kezeletlen azonos korú BALB/c egereket is bevontunk összehasonlítás céljából. Az antitesteket szérummentes hibridóma felülúszókból nyertük, majd ammónium-szulfátos kicsapással tisztítottuk. Az előírt kezelések után mind a négy egércsoportból lép-, tímusz-, nyirokcsomósejteket gyűjtöttünk, vagy peritoneális mosott sejteket, majd folyadékcitometriával analizáltuk. A sejtek működőképességét is vizsgáltuk.

Citokin ELISA vizsgálatok

Az anti-IL-10-zel kezelt és kontroliegerektől levett szérummintákat egér TNFa-ra vagy egér IL-6-ra vizsgáltuk citokinspecifikus ELISA készletekkel.

Az egerek folyamatos kezelése anti-IL—10-zel születésüktől kezdve kifejlett korukig azt eredményezte, hogy a 8. héten levett szérumok jelentős mennyiségű IFNa-t tartalmaztak, ellentétben a kezeletlen vagy izotípuskontrollal kezelt egerekkel, ugyanis ebben a két csoportban a szérumok kimutatható mennyiségű IFΝα-t nem tartalmaztak. Az anti-IL—10-zel kezelés okozta endogén citokinzavarok további felderítése érdekében a 8 hetes kezelés után levett szérumokat TNFa és IL—6 jelenlétére vizsgáltuk citokinspecifikus ELISA kitekkel. Az anti-IL-10-zel kezelt egerek szérumában erősen emelkedtek a TNFa-szintek (32. ábra), és gyakran magas IL-6-szinteket tartalmaztak (33. ábra). A TNFa- és IL-6-szintek megemelkedése az anti-IL-10-zel kezelt egerekben egybevág az IL-10 ismert azon képességével, miszerint in vitro gátolja a monokintermelést.

G2. példa

Anti-IL-10-kezelés hatása egérben a szérum lg szintekre

Endotoxinindukált sokk

Egereket oltottunk intraperitoneálisan 1 pg-tól 500 pg-ig terjedő adagokban endotoxinnal (0111.B4 szerotípusú Escherichia coliból származó lipopoliszacharidok; Sigma Chemical Co.). A túlélést a következő 1-6 nap folyamán kísértük figyelemmel.

Az anti-IL—10-kezelés hatását az endogén monokinszintekre tovább analizáltuk olyan módon, hogy megvizsgáltuk ezeknek az állatoknak az érzékenységét az LPS-indukált sokkal szemben, amely egy monokinközvetített gyulladásos reakció. A korábban bemutatott adatokból látható volt, hogy a TNFa, IL—1 vagy IL-6 elleni neutralizáló monoklonális antitestek és egy fiziológiás IL—1 antagonista, az IL-1Ra, hatékonyan megvédi az egereket az LPS-indukált sokkal szemben. Ezek a kísérletek jelezték, hogy akár az SXC.1 (patkány IgM), akár a 2A5 (patkány lgG1) anti-IL—10 antitesttel születésüktől 8 hetes korukig oltott egerek mélyrehatóan hajlamosakká váltak az LPS-indukált sokkban való elhullásra (34. ábra). Míg a 8 hetes BALB/c egereknél - DNAX állattartás mellett - az LPS LD₁₀₀-értéke >380 pg/egér ip. volt, addig a legtöbb anti-IL-10-zel kezelt egeret már 1 pg endotoxin is elpusztította (34. ábra). E fokozott érzékenységnek a pontos mechanizmusát még nem határoztuk meg, de ezek az

HU 224 437 Β1 adatok egyezőek azzal a megfigyeléssel, miszerint a gyulladáskeltő monokinek általánosan felerősödnek anti-IL-10-zel kezelt egerekben.

Antitest ELISA vizsgálatok

A 8 hétig tartó kezelés után levett szérumokat egér immunglobulin izotípusok jelenlétére vizsgáltuk izotípusspecifikus szendvics ELISA készletekkel. A lemez fedezése céljára használt antitestek a következők voltak: patkány antiegér lgG1 (3096; R. Coffman bocsátotta rendelkezésünkre - DNAX); patkány antiegér lgG2a (R8-103; Pharmingen, San Diego, CA.); patkány antiegér lgG2b (R9-91; Pharmingen); patkány antiegér lgG3 (R2-38; Pharmingen); patkány antiegér IgA (R5-140; Pharmingen); patkány antiegér IgE (EM95; R. Coffman bocsátotta rendelkezésünkre). A lemezek fedéséhez 1-5 pg/ml koncentrációban használtuk az antitesteket. Ezekben az ELISA vizsgálatokban a használt szendvics antitestek a következők voltak: biotinezett patkány antiegér lgG1 (3098B; R. Coffman bocsátotta rendelkezésünkre); biotinezett patkány antiegér lgG2a (R19-15; Pharmingen); biotinezett patkány antiegér lgG2b (R12-3; Pharmingen); biotinezett patkány antiegér lgG3 (R40-82; Pharmingen); biotinezett patkány antiegér IgA (2740B; R. Coffman bocsátotta rendelkezésünkre); biotinezett patkány antiegér IgE (R35-118; Pharmingen). A szendvics antitesteket 1-3 pg/ml koncentrációban, sztreptavidinnel konjugált torma-peroxidázzal (Cal-Biochem, La Jolla, CA.) plusz 1 mg/ml szubsztrátummal [2,2-azino-bisz(3-etilbenztiazolin)-szulfonsav; Sigmaj együtt használtuk. Az ELISA vizsgálatok kiértékelésére tisztított egér myeloma immunglobulinokat használtunk standardként.

Az egerek folyamatos anti-IL-10-kezelése születésüktől kezdve kifejlett korukig a szérum IgM szintek jelentős kimerüléséhez vezet, összehasonlítva az izotípuskontrollal kezelt egerekben megfigyelt szérum IgM szintekkel. A 8 hetes kezelés után levett szérumokban a többi immunglobulin-izotípus mérési eredményeit a 35. ábra mutatja. A három kontrollegércsoportban (kezeletlen, PBS-sel kezelt vagy megfelelő izotípusú kontroliantitesttel kezelt) az egyes immunglobulin-izotípusok szintje nem tért el szignifikánsan a normálegerek szérum lg szintjének előzőleg dokumentált tartományától. Az anti-IL—10-zel kezelt egerek szérum lg szintjeiben azonban több változást figyeltünk meg. Ezekben az egerekben a már ismertetett szérum IgM csökkenést a szérum IgA szintek jelentős csökkenése és az lgG2a és lgG2b meglepő növekedése kísérte (35. ábra). A többi izotípus (lgG1, lgG3, IgE) vagy változatlan maradt, vagy kétszer-négyszer emelkedett néhány kísérletben.

G3. példa

Anti-IL-10-zel kezelt egerekben a Ly-1 B-sejt-kimerülés átmeneti

Immunfluoreszcencia

A mosott sejteket a következő reagenskombinációkkal festettük meg: fluoreszceinnel jelzett antiegér IgM antitest (DS-1; Pharmingen, San Diego, CA.); biotinnel konjugált patkány antiegér IgD antitest (11-26c, gyártotta J. Kearney, U. Birmingham, Alá.); fluoreszceinnel jelzett antiegér CD3 antitest (145-2C11, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN.); biotinnel konjugált antiegér B220 antitest (RA3-6B2; Caltag, S. F.); biotinezett patkány antiegér granulocita/eozinofil antitest (8C5; gyártotta R. Coffman, DNAX). A biotinezett reagenseket fikoeritrinnel konjugált sztreptavidinnel (Becton-Dickinson, Mountain View, CA.) együtt használtuk. A sejteket FACScan készülékkel analizáltuk, és a nem élő sejteket az előszög és oldalszörás (forward angle and side scatter) alapján zártuk ki. Az eredmények az egyes kísérleti csoportokból leszámolt 5000 élő sejt fluoreszcenciaintenzitását mutatják.

Az anti-IL—10-zel kezelt egereket az anti-IL—10-zel kezelés beszüntetése után megvizsgáltuk, hogy meghatározzuk, vajon ezekben az állatokban a Ly-1 B-sejtek kimerülése irreverzíbilis-e. Több egércsoportot oltottunk anti-IL—10 antitestekkel a születéstől a 8. hétig, majd ezután a kezelést megszüntettük. Ezután a kezelés befejezése után következő 8 hét folyamán különböző időpontokban minden csoportot megvizsgáltunk peritoneális Ly-1 B-sejtek jelenlétére. Fontos megjegyezni, hogy a különböző időpontokban gyűjtött ossz peritoneális mosott sejt kihozatalban nem figyeltünk meg jelentős különbségeket. Az ilyen természetű legtöbb kísérletben az anti-IL-10-kezelés beszüntetését követő első 3 héten az egerek továbbra sem tartalmaztak Ly-1 B-sejteket. Ezen időköz után megkezdődött a Ly-1 B-sejtek újbóli megjelenése a peritoneális üregekben, az anti-IL-10-kezelés befejeződését követő 8. héten megfigyelt Ly-1 B-sejtek normálpótlásával (36. ábra). A peritoneális B-sejt kompartmentum rekonstitúcióját a B220^br|9^bt lgM^dul1 B-sejtek kezdeti megjelenése jellemezte az anti-IL-10-kezelés beszüntetése után 4 hét múlva, majd néhány héttel később a B220^dul1 lgm^br|9^ht B-sejtek megjelenése (36. ábra).

G4. példa

Anti-IL-10-zel kezelt egerekben megnövekszik a peritoneális T-sejtek és granulociták száma Hemopoetikus vérsejtkép

Lépekből és peritoneális mosadékokból származó sejtszuszpenziókból citológiai mintákat (cytospins) készítettünk a sejtek morfológiai analíziséhez. A mintákat Wright-Giemsa (Sigma, St. Louis) oldattal festettük, és mikroszkóp alatt vizsgáltuk limfociták, makrofágok, granulociták, eozinofilek és hízósejtek jelenlétére.

Jóllehet a születésüktől kezdve 8 hetes korukig folyamatosan kezelt egerekből kimerültek a peritoneális B-sejtek, az ezekből az egerekből nyert peritoneális mosott sejtek össz-száma azonban nem változott jelentősen a kontrollegerekéhez képest. Az anti-IL-10-zel kezelt egerekből gyűjtött peritoneális mosott sejtek hemopoetikus vérsejtképe azt mutatta, hogy a kezelés következtében nőtt a peritoneális granulociták/eozinofilek száma, és valószínűleg a non-B-sejt limfociták száma (G1. táblázat). Az anti-IL—10-zel kezelt egerekből származó peritoneális mosott sejtek felületi marker fenotipizálásával kimutattuk, hogy nőtt a Ly- 1-bright Ig-negatív sejtek, a Mac-1 bright Ig-nega44

HU 224 437 Β1 tív sejtek (38. ábra) és a 85C-bright Ig-negatív sejtek száma. Ezek az analízisek bemutatták, hogy növekedés következett be a Ly-1-pozitív, CD3-pozitív T-limfociták számában, és megerősítették, hogy növekedett azon granulociták száma, amelyek Mac-1 és 85C felületi markereket fejeznek ki (G1. táblázat).

G1. táblázat

Hemopoetikus szubpopulációk aránya anti-IL-10-zel kezelt és kontroliegerekben

	Limfociták	Makrofágok	Neutrofilek	Eozinofilek	Hízósejtek I
Hashártya1·
Kezeletlen	74	22	1,8	1,7	0,5
PBS-sel kezelt	66	29	1,4	34,3	0,3
Izotípuskontrollal kezelt	64	31	1,2	4,5	0,3
Anti-IL—10-zel kezelt	44	22	18,0	16,0	0
Lép+
Kezeletlen	94	2,7	2,3	0,5	0
PBS-sel kezelt	92	3,6	3,6	1,4	0
Izotípuskontrollal kezelt	96	1,2	1,8	0,6	0
Anti-IL—10-zel kezelt	92	2,4	5,0	0,9	0

⁺ Minden csoportban megközelítőleg azonos volt egerenként a peritoneális és lépsejtek száma; a számok a számlált összsejtszám százalékát jelentik.

G5. példa

Az anti-IL-10-zel kezelt egerek válaszolnak a tímuszfüggetlen TNP-Ficoll antigénre Specifikus antitestválaszok Egereknek emlékeztető oltásként 10 pg TNP-Ficollt (dr. James Mond, USUHS, bocsátotta rendelkezésünkre) adtunk intraperitoneálisan, majd 5 vagy 10 nappal később levettük a szérumokat, és meghatároztuk a TNP-Ficoll elleni specifikus antitestválaszokat. Az anti-IL—10- vagy kontrollantitest-injekciókat az antigénnel való oltás és a szérum levétele között is folytattuk. A TNP-specifikus antitesteket ELISA módszerrel mértük.

Az anti-IL-10-zel kezelt egerekben hiányzik az a képesség, hogy in vivő antitestválaszt adjanak két tímuszfüggetlen II típusú antigénre, a foszforil-kolinra és az a1,3-dextránra. A 39. ábrán látható, hogy az anti-IL—10-zel kezelt egerek normál in vivő antitestválaszt adnak egy harmadik tímuszfüggetlen II típusú antigénre, a TNP-Ficollra. Ez a válaszadási készség egyezik előzetes megfigyeléseinkkel, miszerint az anti-IL-10-zel kezelt egerek lép B-sejtjei normál proliferatív választ adnak anti-lgM antitesttel - a tímuszfüggetlen II típusú antigének feltételezett polikonális analógja - való stimulálást követően.

H) tanulmány

Anti-IL-10 antitestek folyamatos alkalmazása késlelteti NZB/W egerekben az autoimmunitás megjelenését

Összefoglalás

Az anti-IL—10 antitestek folyamatos alkalmazása BALB/c egereknél módosítja az autoantitestek, TNFa és IFNy endogén szintjeit. Ismeretes, hogy e három im30 munmediátor okozza a „lupusra hajlamos” NZB/W egerekben az autoimmunitás kialakulását. NZB/W egerekben az IL-10 neutralizálása következményeinek kutatása céljából az állatokat születésüktől kezdve 8-10 hónapig hetenként két-háromszor oltottuk anti-IL-10 antitestekkel vagy megfelelő izotípusú kontroliantitestekkel. Az anti-IL-10-kezelés lényegesen késlelteti NZB/W egerekben az autoimmunitás megjelenését. Ezt vagy az általános túlélés alapján, vagy a proteinuria, vese nephritis vagy autoantitestek kifejlődése figyelemmel kísérése révén állapítottuk meg. A 9. hónapban a túlélés 10-80%-kal javult a kezelt egereknél a kontrolihoz viszonyítva. Úgy látszik, hogy az autoimmunitással szembeni védelem az endogén TNFa anti-IL-10 által indukált felerősítésének köszönhető, ugyanis a megvédett NZB/W egerekben gyorsan kifejlődött az autoimmunitás, ha neutralizáló anti-TNFa antitesteket juttattunk be a 30. héten az anti-IL—10-zel hosszú ideig kezelt egerekbe. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az IL-10 antagonisták jótékony hatással lehetnek a humán szisztémás lupus erythematosus kezelésében.

Az (NZB«NZW) F1 hibrid egerekben súlyos autoimmun betegség fejlődik ki, amely erősen hasonlít az embereknél előforduló szisztémás lupus erythematosushoz. NZB/W egereknél spontán fejlődik ki egy végzetes immunkomplex-közvetített glomerulonephritis, a nőstény egerekben a 6-9. hónap körül, hím egerekben a 12-18. hónap körül. Előzetes próbálkozások az autoimmunitás alapvető okának NZB/W egerekben való meghatározására az MHC gének lehetséges szerepére összpontosultak. Az interferon-γ (IFNy) - egy olyan citokin, amely felerősíti a II osztályú MHC antigének kifejeződését a sejttípusok széles változatában - tényle45

HU 224 437 Β1 gesen gyorsítja NZB/W egerekben az autoimmunitás kifejlődését. Számos legújabb vizsgálat arra mutat, hogy a TNFa génnek, amely az MHC komplexen belül helyezkedik el, szerepe lehet a lupus nephritis patogenezisében NZB/W egereknél. Ezek a vizsgálatok kiderítették, hogy az NZB/W egerek kivételesen alacsony TNFa-szinteket mutatnak, és hogy ez egybevág egy, a TNFa j génjében lévő restrikciós fragmentum hossz polimorfizmussal és a TNFa gén 5’ szabályozószakaszában egy tandem ismétlődő dinukleotidszakasz polimorfizmussal. E megfigyelt tények okozója az volt, hogy a rekombináns TNFa-val végzett visszapótló terápia szignifikánsan késleltette a nephritis kialakulását NZB/W egerekben.

Az IL-10 egy olyan citokin, amelyet aktivált T-sejtek, B-sejtek és makrofágok alcsoportjai termelnek. Az IL-10 különböző immunstimulációs és immunszuppresszív tulajdonságokat közvetít in vivő egér- és humán vizsgálatokban. Egy, az IL-10 fiziológiai szerepének kiértékelését célzó legújabb kísérletben BALB/c egereket születésüktől kezdve 8 hetes korukig folyamatosan kezeltünk neutralizáló anti-IL-10 antitestekkel. Az IL-10 ismert in vitro tulajdonságainak megfelelően, az anti-IL-10-zel kezelt egerekben az endogén IFNy- és TNFa-szintek megemelkedtek. A megemelkedett IFNy ezután a B-limfociták egy szám szerint kis alcsoportjának - elnevezésük: Ly-1 vagy CD5 vagy B-1 B-sejtek - a kimerüléséhez vezet. Ebből a sejtpopulációból származtatható a legtöbb egér autoantitest. A normálegerekkel végzett ilyen vizsgálatok arra engednek következtetni, hogy az IL-10 neutralizálása kívánatos következményekkel járna az NZB/W egereknél, azaz az endogén TNFa megemelkedésével és az autoantitesttermelés csökkenésével, valamint bizonyos nemkívánatos következményekkel, így az endogén IFN megnövekedésével. Ebben a fejezetben a folyamatos anti-IL-10-kezelés átfogó hatását tanulmányozzuk az autoimmunitás kifejlődésére NZB/W egerekben.

Egerek

NZB/W F1 egereket tenyésztettek a DNAX Kutató Intézet állat telepén. Az NZB nőstény egereket a Jackson Laboratóriumból (Bar Harbor, ME.) és az NZW hím egereket a Simonsen Laboratories cégtől (Gilroy, CA.) vásárolták. Csak F1 nőstény egereket használtunk, mivel ezekben sokkal gyorsabban jelent meg az autoimmunitás.

Anti-IL-10-kezelés

17-23 B/W F1 nőstény egerekből álló csoportokat kezeltünk IL-10 elleni patkány IgM mAt-tel (jele: SXC.1) vagy IgG mAt-tel (jele: JEs 2A5). Csoportonként azonos korú 21-23 B/W F1 nőstény egeret megfelelő izotípusú kontroll mAt-ekkel (J5/D=lgM és GL113=lgG) kezeltünk. Az anti-IL-10 mAt-eket és az izotípuskontroll mAt-eket csupasz egerek (nu/nu) ascites folyadékából nyertük. Az ascitest úgy tisztítottuk, hogy kétszer egymás után ammónium-szulfátos kicsapást végeztünk, ezután PBS-sel szemben dializáltuk, a proteintartalmat elektroforézissel és optikai sűrűség (O.D.) mérésével határoztuk meg. A kezelés három részből állt: (a) a születéstől az első héten 0,2 mg mAt/egér dózissal oltottunk intraperitoneálisan (ip.) négyszer IgM-et vagy kétszer IgG-t; (b) a második héten 0,5 mg mAt/egér dózissal oltottunk ip., háromszor IgM-et vagy kétszer IgG-t; és (c) a harmadik héttől kezdve kifejlett korukig 1 mg mAt/egér dózist alkalmaztunk ip., háromszor IgM-et vagy kétszer IgG-t hetenként. Előzetes vizsgálatokkal meghatároztuk, hogy ez az oltási rendszer körülbelül 50 pg/ml patkány IgM koncentrációt tud fenntartani az egerek szérumában.

Vesebetegség kimutatása A proteinuriát kolorimetriásan mértük, Albustix reagenscsík (Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN.) használatával a következő kód szerint: nyom=10 mg/dl; 1+=30 mg/dl; 2+=100 mg/dl; 3+=300 mg/dl; 4+=1000 mg/dl. A glomerulonephritis szövettani súlyosságát O-tól 2+-ig beosztott skálán, a kórszövettani változások intenzitása és kiterjedése alapján értékeltük ki. 0=glomerularis léziók nélküli vesék; 1+=enyhe léziók, azaz növekvő mesangialis mátrix, mesangialis/glomerularis cellularitás, sarló alakú képletek képződése vagy gyulladásos exsudatumok jelenléte és vesetok-adhéziók; a tubulusokban nem észlelhetők cilinderek; 2+=súlyos léziók, azaz a glomerulusok több mint 70%-ában eltűnt a glomerularis architektúra; kiterjedt tubuláris cilinder képződés.

Autoantitest ELISA vizsgálat A kétszálú és egyszálú DNS-re (ds- vagy ss-DNS) specifikus szérumantitesteket ELISA vizsgálattal mutattuk ki. A vizsgálat rövid leírása: 5 mg/ml ds- vagy ss-DNS-sel fedtünk ELISA lemezeket (Flow Laboratories, McLean, VA.) 4 °C-on egy éjszakán át tartó inkubálással. Az antigénnel fedett lemezeket ezután 1 órán át 0,05% Tween 20, 0,02% nátrium-azid-tartalmú PBS-sel blokkoltuk, majd 1 órán át inkubáltuk a vizsgálandó mintával vagy 1:100 hígítású kontrollszérummal. A lemezeket ezután 0,05% Tween 20-tartalmú PBS-sel mostuk, és 1 órán át inkubáltuk 1 pg/ml torma-peroxidázzal (HRP) konjugált antiegér IgG-vel vagy IgM-mel (Zymed Laboratories, Inc., S. San Francisco, CA.). Az abszorpciót V_max mikrotitrálólemez-leolvasó készülékkel (Molecular Devices, Menlo Park, CA.) mértük 30 perccel azután, hogy hozzáadtunk 1 mg/ml ABTS-t [Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.; 2,2’-azino-bisz(3-etil-benztiazolin-6-szulfonsav)j. Az anti-DNS-titereket egységekben fejeztük ki, referencia standard szérumhoz viszonyítva. A standard 4 hónapos MRL/MpJ-1pr/1pr egerek kevert széruma volt, amelyet dr. Shelby Umland (Schering-Plough Corp.) bocsátott rendelkezésünkre. E standard szérum 1:100 hígítását önkényesen 100 egység/ml értékűnek vettük.

lg- és TNFa-szérum-koncentráció lg ELISA vizsgálathoz a lemezeket 1 pg/ml kecske antiegér IgG-vel (Kirkegaard és Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD.) fedtük. A lemezeket 1:1000 vagy 1:5000 hígítású vizsgálandó szérumokkal inkubáltuk, majd HRP-konjugált kecske anti-lgG-vel vagy anti-IgM-mel (Zymed Laboratories, Inc.), végül kifejlesztettük a színreakciót. Az IgG- és IgM-koncentrációt standardgörbéhez viszonyítva határoztuk meg,

HU 224 437 Β1 amelyet úgy készítettünk, hogy myeloma protein keveréket tartalmazó törzsoldatunk ismert koncentrációival inkubáltuk.

A TNFa ELISA-hoz a lemezeket 5 pg/ml patkány antiegér TNFa mAt-tel (MP6-XT3.11) fedtük, majd a 5 vizsgált szérumok 1:10 hígításával inkubáltuk. Ezután HRP-konjugált patkány antiegér TNFa mAt-tel (MP6-XT22) inkubáltuk. Végül a színt kifejlesztettük.

A feltalálók a pH5C- vagy pH15C- vagy pBCRF1(SRa)-tartalmú E. coli MC1061 tenyészeteket 10 letétbe helyezték az American Type Culture Collection Intézménynél (ATCC; Rockville, MD., USA) 68 191,

192, illetve 68 193 letéti számokon. A letétbe helyezés az ATCC „Szabadalmi Célokat Szolgáló Letétek”-re vonatkozó megállapodásban kikötött feltételek mellett történt. E megállapodás biztosítja, hogy a letét - a 35 USC 122 és 37 CFR 1.14 értelmében - az Egyesült Államok szabadalmak és védjegyek ügyében eljáró kormánybiztosának rendelkezésére álljon, valamint egy egyesült államokbeli szabadalmi vita esetén a nyilvánosság számára hozzáférhető legyen. Fentiek megkívánják a letét fenntartását. A letétbe helyezett törzsek hozzáférhetősége nem úgy értelmezendő, hogy a szabadalmat fel lehet használni azon jogok megsértésével, amelyeket az egyes kormányok hatóságai szabadalmi törvényeikben elfogadtak.

i) A szekvencia jellemzői:

a) A szekvencia hossza: 160 aminosavmaradék

b) A szekvencia típusa: aminosav

c) Száltípus:

d) Topológia: lineáris xi) A szekvencia leírása:

1. számú szekvenciavázlat

Ser

Pro

Gly

Gin

Gly 5

Thr

Gin

Ser

Glu Asn 10

Ser

Cys

Thr

His

Phe 15

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Alá

Phe

20

25

30

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Phe

Gin

Met

Lys

Asp

Gin

Leu

Asp

Asn

35

40

45

Leu

Leu

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

50

55

60

Gly

Cys

Gin

Alá

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Glu

65

70

75

Val

Met

Pro

Gin

Alá

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

Lys

Alá

His

80

85

90

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

95

100

105

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Alá

110

115

120

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Alá

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

125

130

135

Ile

Tyr

Lys

Alá

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

140

145

150

Glu

Alá

Tyr

Met

Thr

Met

Lys

Ile

Arg

Asn

155

160

2. számú szekvenciavázlat

i) A szekvencia jellemzői:

a) A szekvencia hossza: 147 aminosavmaradék

b) A szekvencia típusa: aminosav

c) Száltípus:

d) Topológia: lineáris

HU 224 437 Β1

xi) A szekvencia leírása:

Phe

Pro

Gin

Met 10

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg 15

Thr Asp

Gin

Cys

Asp Asn 5

Asp

Alá

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Phe

Gin

Thr

Lys

Asp

Glu

20

25

30

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

35

40

45

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Alá

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

50

55

60

Leu

Glu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Alá

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Glu

Alá

65

70

75

Lys

Asp

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

80

85

90

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

95

100

105

Ser

Lys

Alá

Val

Glu

Gin

Ile

Lys

Asn

Alá

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

110

115

120

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Alá

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

125

130

135

Asn

Tyr

Ile

Glu

Alá

Tyr

Met

Thr

Ile

Lys

Alá

Arg

140

145

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (23)

1. Eljárás egy gazdaszervezetben abnormális tumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás vagy T-sejt-közvetített immunfunkció módosítására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy interleukin—10-et vagy egy analógját, egy agonistáját vagy antagonistáját önmagában vagy adott esetben egy vagy több, a gyógyszergyártásban szokásosan használt kompatibilis hígítóval, vivőanyaggal és/vagy egyéb segédanyaggal kombinálva önmagában ismert módszerrel abnormális tumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás vagy T-sejt-közvetített immunfunkció módosítására szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázunk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy interleukin-10-et formázunk abnormális tumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás vagy T-sejt-közvetített immunfunkció módosítására szolgáló gyógyszerkészítménnyé.

3. Az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-10-et abnormális tumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás módosítására szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-10-et vagy egy analógját, egy agonistáját vagy antagonistáját az interleukin-1- vagy interleukin-6-szinteket is módosító gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-10-et vagy egy analógját, egy agonistáját vagy antagonistáját megnövekedett tumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás vagy T-sejt-közvetített immunfunkció módosítására szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-10-et vagy egy analógját, egy agonistáját vagy antagonistáját mikrobiális fertőzéssel együtt járó megnövekedett tumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás vagy T-sejt-közvetített immunfunkció módosítására szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-10-et vagy egy analógját, egy agonistáját vagy antagonistáját lázzal, alacsony vérnyomással, szövetelhalássai, metabolikus acidózissal és rendellenes szervműködéssel kísért megnövekedett tumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás vagy T-sejt-közvetített immunfunkció módosítására szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-10-et vagy egy analógját, egy ago48

HU 224 437 Β1 nistáját vagy antagonistáját szeptikus sokkot, toxikus sokkot, Meningococcus okozta meningitist vagy maláriát okozó mikrobiális fertőzéssel együtt járó megnövekedett tumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás vagy T-sejt-közvetített immunfunkció módosítására szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-10-et vagy egy analógját, egy agonistáját vagy antagonistáját bakteriális fertőzésben szenvedő gazdaszervezetben mikrobiális fertőzéssel együtt járó megnövekedett tumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás vagy T-sejt-közvetített immunfunkció módosítására szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-10-et vagy egy analógját, egy agonistáját vagy antagonistáját Gram-negatív baktériumok által okozott bakteriális fertőzésben szenvedő gazdaszervezetben mikrobiális fertőzéssel együtt járó megnövekedett tumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás vagy T-sejt-közvetített immunfunkció módosítására szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-10-et vagy egy analógját, egy agonistáját vagy antagonistáját Gram-negatív baktériumok által okozott bakteriális fertőzésben szenvedő, szeptikus sokk tüneteit mutató gazdaszervezetben mikrobiális fertőzéssel együtt járó megnövekedett tumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás vagy T-sejt-közvetített immunfunkció módosítására szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-10-et vagy egy analógját, egy agonistáját vagy antagonistáját Gram-pozitív baktériumok által okozott bakteriális fertőzésben szenvedő gazdaszervezetben mikrobiális fertőzéssel együtt járó megnövekedett tumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás vagy T-sejt-közvetített immunfunkció módosítására szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-10-et vagy egy analógját, egy agonistáját vagy antagonistáját Gram-pozitív baktériumok által okozott bakteriális fertőzésben szenvedő, toxikus sokk tüneteit mutató gazdaszervezetben mikrobiális fertőzéssel együtt járó megnövekedett tumornekrózisfaktor-alfa-szinttel társult gyulladás vagy T-sejtközvetített immunfunkció módosítására szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

14. Eljárás szeptikus sokkban szenvedő gazdaszervezet kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy interleukin-10-et önmagában vagy adott esetben egy vagy több, a gyógyszergyártásban szokásosan használt kompatibilis hígítóval, vivőanyaggal és/vagy egyéb segédanyaggal kombinálva önmagában ismert módszerrel szeptikus sokkban szenvedő gazdaszervezet kezelésére szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

15. Eljárás toxikus sokkban szenvedő gazdaszervezet kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy interleukin-10-et önmagában vagy adott esetben egy vagy több, a gyógyszergyártásban szokásosan használt kompatibilis hígítóval, vivőanyaggal és/vagy egyéb segédanyaggal kombinálva önmagában ismert módszerrel toxikus sokkban szenvedő gazdaszervezet kezelésére szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

16. Eljárás gazdaszervezetben autoimmun rendellenesség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy interleukin-10 antagonistát önmagában vagy adott esetben egy vagy több, a gyógyszergyártásban szokásosan használt kompatibilis hígítóval, vivőanyaggal és/vagy egyéb segédanyaggal kombinálva önmagában ismert módszerrel gazdaszervezetben autoimmun rendellenesség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázunk.

17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-10 antagonistát B-sejt-közvetített autoimmun rendellenesség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

18. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-10 antagonistát TNF-α által közvetített autoimmun rendellenesség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.

19. A 16-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy interleukin-10 antagonistaként egy antitestmolekulát formázunk autoimmun rendellenesség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítménnyé.

20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy interleukin-10 megkötésére képes antitestmolekulát formázunk autoimmun rendellenesség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítménnyé.

21. A 16-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tumornekrózisfaktor-alfa-, az interleukin-6- vagy interleukin-1-szint legalább egyikét módosító gyógyszerkészítményt állítunk elő.

22. A 16-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egér-gazdaszervezetben autoimmun rendellenesség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.

23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy NZB/W egérben autoimmun rendellenesség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.