CZ281796B6 - Použití interleukinu-10, jeho analoga, agonisty nebo antagonisty pro výrobu léčiva a farmaceutický přípravek je obsahující - Google Patents

Abstract

Řešení se týká použití interleukinu-10, jeho analoga, agonisty nebo antagonisty pro výrobu léčiva pro modulaci zánětu nebo T buňkami zprostředkované imunitní funkce v hostiteli. Dále se řešení týká i farmaceutického přípravku pro modulaci zánětu nebo T buňkami zprostředkované imunitní funkce v hostiteli, spočívajícího v tom, že tento obsahuje účinné množství interleukinu 10, jeho analoga, agonisty nebo antagonisty.ŕ

Description

Použití interleukinu-10 nebo jeho analogu, agonisty nebo antagonisty a farmaceutický přípravek je obsahující

Oblast techniky

Vynález se týká použití interleukinu-10 nebo jeho analogu, agonisty nebo antagonisty k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení zánětu nebo T-buňkami zprostředkované imunní funkce, provázené abnormální hladinou tumorového nekrózového faktoru alfa. Vynález se rovněž týká farmaceutického přípravku, obsahujícího jako účinnou látku interleukin-10, jeho antagonistu nebo protilátku proti interleukinu-10.

Dosavadní stav techniky

Některé infekce mohou vést k hlubokým fyziologickým a metabolickým změnám. Symptomy mohou být různé, ale zahrnují horečku, hypotenzi, překyselování metabolismu, nekrózu tkání, všeobecné narušení funkce orgánů a, pokud nejsou správně léčeny, nakonec i smrt. Viz např. práce Berkow (editor) The Měrek Manual, Rahway, New Jersey; Weatherall a kol. (editoři) Harrison’s Textbook of Internal Medicíně, Mcgrw-Hill, New York; nebo Wyngarden a kol. (editoři) Cecil*s Textbook of Medicíně, Saunders Co., Philadelphia; z nichž každá je zde uvedena jako reference. Stavy septického a toxického šoku jsou charakteristické u reakcí na různé infekce a často vykazují některé nebo všechny ze zmíněných symptomů.

Septický šok je model reakci, vyvolaných endotoxinem. Septický šok je způsoben uvolněním endotoxinu, nejbéžněji lipopolysacharidových složek, ze stěn gramnegativních buněk do imunitního systému. Toxický šok je model reakcí, vyvolaných superantigenem, a je způsoben uvolněním proteinových složek z buněčných membrán grampozitivních bakterií, např. stafylokokového enterotoxinu B (SEB). Ačkoliv obé reakce jsou původně způsobeny mikrobiální infekcí, imunitní systém reaguje rozdílně podle toho, který mikrobiální produkt reakci zapříčiní.

Na šokové reakci vyvolané endotoxinem, např. LPS, protein upravený hostitelem, faktor nekrózy tumoru (TNF), bylo nejnovéji ukázáno vyvolání mnoha škodlivých vlivů gramnegativních septicemií. Pasivní imunizace antiserem TNF může zabránit mnoha smrtelným případům při napadení gramnegativními bakteremiemi nebo endotixemiemi. Viz např. práce Tracey a kol. (1986) Science, 234: 470-474; Beutler a kol. (1986) Nátuře, 320: 584-588; a Tracey a kol. (1987) Nátuře, 330: 662-664. Vysoké hodnoty TNF v séru byly také pozorovány při některých jiných infekčních onemocněních, včetně zánětu mozkových blan, malárie a leishmaniasy. Mnoho pacientů s vysokými hodnotami TNF má vyšší všeobecné narušeni funkce orgánů s odpovídající vyšší úmrtností. Viz např. práce Waage a kol. (1987) Lancet 355-357; Girardin a kol. (1988) New Engl. J. Med. , 319: 397-400; Scuderi a kol. (1988) Lancet 1364-1365; a Kern a kol. (1989) Am. J. Med., 87; 139.

Bylo zjištěno, že dodání TNF zvířecím nebo lidským subjektům vede k detekovatelným sérovým hodnotám interleukinu-6 (IL-6) po

-1CZ 281796 B6 až 6 hodinách. Mclntosh a kol. (1989) J. Immunol. 143: 162-117; Jablons a kol., J. Immunol., Vol, 169, str. 2257 (1989). IL-6, známý také jako faktor-2 stimulující B-buňky interferon β₂ nebo faktor stimulující hepatocyty, byl identifikovám jako glykoprotein odvozený z T-buněk, který způsobuje zrání B-buněk. Viz např. práce Kishimoto, Blood 74: 1-10. Nejnověji byla u IL-6 prokázána pleiotropní biologická aktivita, včetně indukce proteinů akutní fáze v hepatocytech a vlivu na hematopoetické progenitorní buňky a T-buňky. Viz např. práce Geiger a kol., Eur. J. Immunol., Vol. 18, str. 717 (1988); Marinjovic a kol., J. Immunol.. Vol. 1.42, str. 808 (1989); Morrone a kol., J. Biol. Chem., Vol. 263, str. 12554 (1988); a Perlmutter a kol., J. Clin. Invest., Vol. 84, str. 138 (1989). Stárneš a kol., J. Immunol.. Vol. 145, str. 4185-4191 (1990), v kterých prokázali, že protilátkový antagonista k IL-6 prodlouží přežití myší při modelování septického šoku.

Stafylokokový enterotoxin B (SEB) je superantigen a může vyvolat reakci toxického šoku. Tyto rakce jsou důsledkem aktivace podstatné části T-buněk, která vede k prudké imunitní reakci systému, zprostředkované T-buňkami. Tato reakce je typická reakce, zprostředkovaná T-buňkami, při které je možné terapeuticky působit IL-10, jeho analogy nebo antagonisty. Co se mechanismu týče, superantigen reaguje přímo s νβ prvky receptorů T-buněk a aktivuje T-buňky s relativné nízkou MHC II třídní specifitou. Viz práce Herman a kol. (1991) v An. Rev. Immunol. 9: 745-772.

V současnosti se septické podmínky, takové jako je septicemia, bacteremia apod., typicky léčí antimikrobiálními přípravky. Septicemia je běžná v nemocničních prostředích, kde se bakteriální infekce často objevuje po zavedení katetru nebo chirurgických zásazích. Nicméně, když jsou takové podmínky doprovázeny šokem, neexistuje účinná terapie pro zmírnění šokových syndromů, které jsou částečně vyvolány cytokiny, indukovanými jako odpověď na infekci. Viz např. práce Young (1985) ---- str. 468-470, v Mandel a kol. (editoři) Principles and Infectious Diseases (2. vydání) John Wiley & Sons, New York. Zejména léčba antibiotiky vede k mikrobiální smrti a ponechává bakteriální produkty, které způsobují šokovou reakci.

Bakteriální sepse a s ní související septický šok jsou častými příčinami smrti, zapříčiněnými infekcí, která vzniká při určitých typech chirurgie, břišních traumatech a potlačení imunity při léčení rakoviny nebo transplantaci, nebo za jiných lékařských podmínek. Ve Spojených státech utrpí každý rok 700.000 pacientů septický šok, zapříčiněný bakteriálními infekcemi. Z nich se u 160.000 rozvinou symptomy septického šoku a 50.000 následkem toho zemře. Toxický šok každoročně napadá méně lidí, ale závažnější reakce organismu vede k většímu ohrožení života.

Ve světle vážných následků těchto několika imunologických reakcí na infekci je účinná technika k léčení mikrobiálně vyvolaného šoku, ať profylakticky nebo terapeuticky, obzvláště potřebná. Předkládaný vynález poskytuje přípravky a metody pro léčeni těchto a dalších prudkých imunitních reakcí.

-2CZ 281796 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je použití interleukinu-10 nebo jeho analogu, agonisty nebo antagonisty k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení zánětu nebo T-buňkami zprostředkované imunní funkce, provázené abnormální hladinou tumorového nekrózového faktoru alfa.

Jedním použitím podle vynálezu je použití samotného interleukinu-10.

Jiným řešením je použití interleukinu-10 nebo jeho analogu, agonisty nebo antagonisty k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení zánětu nebo T-buňkami zprostředkované imunní funkce, provázené zvýšenými hladinami interleukinu-1 nebo interleukinu-6.

Dalším řešením podle vynálezu je použití k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení zánětu nebo T-buňkami zprostředkované imunní funkce, provázené mikrobiální infekcí.

Předmětné prostředky lze dále používat k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení zánětu nebo T-buňkami zprostředkované imunní funkce, provázené horečkou, hypertenzí, nekrózou tkáně, metabolickou acidózou nebo orgánovou dysfunkcí.

Jiným použitím předmětných prostředků je aplikace k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení mikrobiální infekce, způsobující stav septického šoku, toxického šoku, zánětu mozkových blan nebo malárie.

Další aplikací předmětných prostředků je použiti k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení bakteriální infekce, způsobované gramnegativní bakterií nebo grampozitivní bakterií a projevující symptomy septického šoku.

Předmětem vynálezu je také farmaceutický přípravek k léčení septického nebo toxického šoku v hostiteli, který jako účinnou látku obsahuje interleukin-10 nebo antagonistu interleukinu-10 nebo protilátku proti interleukinu-10, přičemž tato protilátka se s výhodou používá ve farmaceutickém přípravku k léčení autonomní poruchy, zprostředkované T-buňkami nebo TNFa.

Interleukin-10, používaný v přípravcích podle tohoto vynálezu, se s výhodou volí ze skupiny, zahrnující polypeptidy otevřeného čtecího rámce, definované následujícími sekvencemi:

Met

His

Ser

Ser

Ala

Leu

Leu

Cys

Cys

Leu

Val

Leu

Leu

Thr

Gly

Val

Arg

Ala

Ser

Pro

Gly

Gin

Gly

Thr

Gin

Ser

Glu

Asn

Ser

Cys

Thr

His

Phe

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Phe

Gin

Met

Lys

Asp

Gin

Leu

Asp

Asn

Leu

Leu

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

Lys

Ala

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Met

Lys

Ile

Arg

Asn

-3CZ 281796 B6

a Met

Glu

Arg

Arg

Leu

Val

Val

Thr

Leu

Gin

Cys

Leu

Val

Leu

Leu

Tyr

Leu

Ala

Pro

Glu

Cys

Gly

Gly

Thr

Asp

Gin

Cys

Asp

Asn

Phe

Pro

Gin

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Phe

Gin

Thr

Lys

Asp

Glu

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Glu

Ala

Lys

Asp

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Ile

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Ile

Lys

Ala

Arg

f

ve kterých se používá standardních třípísmenných zkratek k označení L-amino kyselin, s počátkem na N-konci. Tyto dvě formy IL-10 jsou někdy označovány jako lidský IL-10 (nebo lidský inhibiční faktor syntézy cytokinu) a virální IL-10 (nebo BCRF1). Viz práce Moore a kol. (1990) Science 248: 1230-1234; Vieira a kol. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. 88: 1172-1176; Fiorentino a kol. (1989) J. Exp. Med. 170: 2081-2089; a Hsu a kol. (1990) Science 250: 830-832. Mutace přirozených proteinových sekvencí, např. allelické varianty a muteiny, včetně variant zkrácených a prodloužených, jsou alternativní přípravky, jejíchž použití je popsáno v tomto dokumentu.

Nejvýhodněji je maturovaný IL-10, užívaný způsobem podle tohoto vynálezu, vybrán ze skupiny,sestávající z:

Ser

Pro

Gly

Gin

Gly

Thr

Gin

Ser

Glu

Asn

Ser

Cys

Thr

His

Phe

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Phe

Gin

Met

Lys

Asp

Gin

Leu

Asp

Asn

Leu

Leu

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

Lys

Ala

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Met

Lys

Ile

Arg

Asn

a Thr

Asp

Gin

Cys

Asp

Asn

Phe

Pro

Gin

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Phe

Gin

Thr

Lys

Asp

Glu

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Glu

Ala

Lys

Asp

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Ile

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Ile

Lys

Ala

Arg

Předkládaný vynález je částečně založen na objevu, že IL-10 inhibuje jak syntézu několika cytokinů, které zprostředkovávají nežádoucí zánétlivé reakce (např. septický šok), tak aktivaci T-bunék superantigenem, což vede k syndromům toxického šoku. Naopak antagonisté IL-10 prohloubí tyto imunitní odpovědi, což je

-4CZ 281796 B6 v některých případech klinických prostředích žádoucí, např. u určitých typů tumorů nebo autoimunitních odpovědí.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1. Ilustrace plasmidu TRPC11. [viz příklad 3]

Obrázek 2. IL-4, hIL-10 a vIL-10 inhibuji syntézu IFNt (A) a TNFa (B) periferními mononukleárními krevními buňkami (PBCM), aktivovanými IL-2. ND neurčeno. Chybové sloupečky ukazují rozmezí, v kterém se pohybovaly duplicitní vzorky při jednom experimentu. PMBC od různých dárců se liší ve své kapacitě produkovat IFNt a TNFa po stimulaci IL-2. Inhibiční vliv IL-4 a IL-10 je narušen neutralizujícími protilátkami anti-IL-4 (c) a anti-IL-10 (d). PBMC byly kultivovány tak, jak je popsáno v experimentální části s 200 U/ml rekombinantního IL-2 (rIL-2) a různými množstvími buď rIL-4 nebo COS buněk, produkujících lidský IL-10 (COS-hIL-10), s přídavkem 10 ^g/ml neutralizujícího anticytokinu nebo isotypově kontrolních imunoglobulinů. Protilátky a cytokin byly inkubovány 30 min před přidáním PBMC.

Obrázek 3. (A) IL-4, ale ne lidský IL-10 (hIL-10) nebo virální IL-10 (vIL-10) inhibuje lymfocyty aktivovanou žabíječí (LAK) aktivitu vyvolanou IL-2 v PMBC. PMBC z experimentu, podobného tomu na obrázku 2, byly odebrány spolu se supernatantem a testovány na cytotoxicitu proti buňkám COLO (karcinom kolonu, obr. 3A1) značených ⁵¹Cr a buňkám Daudi (Burkittův lymfom, obr. 3A2). (B) LAK aktivita je vyjádřena CD56+ buňkami v PMBC kultivovaném s IL-2 a IL-10. PMBC byly obarveny protilátkou anti-CD56 připojenou k FITC a děleny na FacStar Plus (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Byla testována cytotoxická aktivita ve frakcích CD56+ a CD56- (čistota 99.7%). Podobné výsledky byly získány s buňkami, odvozenými z kultur PMBC se samotným IL-2.

Obrázek 4. (A) Syntéza IFNt purifikovanými NK buňkami vyvolaná IL-2 ie přímo inhibována IL-4 ale ne hIL-10 ani vIL-10. Purif ikované buňky FACS (čistota 99.5%) byly kultivovány v 10⁶ buněk/ml s 200 jednotek/ml rIL-2 a buď s 500 jednotek/ml rIL-4, nebo COS-hIL-10, COS-vIL-10, nebo COS-blank supernatanty (10%) v Ysselově médiu po dobu 4 až 5 dní, pak byl supernatant z duplicitních kultur spojen a smíchán pro měření IFNt ELISA testem. (B) Proliferace purifikovaných NK buněk a PMBC vyvolaná IL-2 je inhibována IL-4 ale ne hIL-10/vIL-10 (obr. 4B1: tříděné NK, obr. 4B2: PBL).

Obrázek 5. (A) Přídavek adherentních buněk, ale ne T-buněk, obnoví inhibici syntézy IFNt purifikovanými NK buňkami, vyvolané IL-2, zprostředkovanou IL-10. (B) Přídavek purifikovaných monocytů obnoví inhibici syntézy IFNt purifikovanými NK buňkami, vyvolané IL-2, zprostředkovanou IL-10. Monocyty sami produkuji méně než detekovatelné množství IFNt. Chybové sloupečky ukazují rozmezí, v kterém se pohybovaly duplicitní vzorky při jednom experimentu. Bez přídavku IL-2 byla produkce IFNt pod hranicí detekce (obr. 2). NK buňky od různých dárců se liší ve své kapacitě produkce IFNt. (C) Vlivy IL-10 na syntézu TNFa vyvolanou IL-2, NK buňkami, CD14+ buňkami, oběma typy buněk společně. NK buňky (10⁶

-5CZ 281796 B6 bunék/ml) a/nebo CD14+ buňky (3 x 10^B bunék/ml) byly kultivovány pět dní s nebo bez přídavku 400 U/ml rIL-2 a 10% COS-hIL/lO supernatantu.

Obrázek 6. Kinetiky produkce IL-10, IL-6, TNFa a GM-CSF lidskými monocyty aktivovanými LPS. Lidské monocyty, izolované centrifugačním vymýváním, byly kultivovány v teflonových sáčcích (4 x 10 bunék/ml) s nebo bez přídavku LPS (1 μg/ml) a produkce (A) IL-10, (B) IL-6, (C) TNFa nebo (D) GM-CSF byla určena v supematantu kultury, který byl odebírán v časech, určených pro test ELISA specifický na cytokiny.

Obrázek 7. Produkce IL-10 lidskými monocyty jako odpověčť na zvýšení koncentrace LPS. Lidské monocyty (4 x 10⁶ buněk/ml) byly pěstovány v teflonových sáčcích se zvyšujícími se koncentracemi LPS po dobu 24 hodin a produkce IL-10 byla stanovena testem ELISA.

Obrázek 8. Vliv IL-10 na produkci cytokinů monocyty aktivovanými IFNt , LPS nebo IFNt a LPS. Lidské monocyty (4 x 10⁶ buněk/ml) byly pěstovány s IFNt (100 U/ml), 1, 10, 100 nebo 1000 ng/ml LPS a směsí LPS (1, 10, 100 nebo 1000 ng/ml) a IFNt (100 U/ml) bud bez přídavku ( □ ) nebo s přídavkem (0) IL-10 (100 U/ml) po dobu 24 hodin a produkce (A) IL-Ια, (B) IL-Ιβ, (C) IL-6, (D) TNFa nebo (E) GM-CSF byla stanovena v supernatantech testem ELISA specifickým na cytokiny.

Obrázek 9. Vliv lidského IL-10 nebo virálního IL-10 na produkci TNFa a GM-CSF monocyty aktivovanými LPS. Lidské monocyty (4 x 10⁶ buněk/ml) byly aktivovány LPS (1 μg/ml) a kultivovány s lidským IL-10 (100 U/ml) nebo virálním IL-10 bez přídavku nebo s přídavkem neutralizujícího anti-IL-10 mAb 19F1 (10 μg/ml) po dobu 24 hodin a produkce (A) TNFa nebo (B) GM-CSF byla stanovena testem ELISA specifickým na cytokiny.

Obrázek 10. Vliv exogenního IL-10, endogenně produkovaného IL-10 a IL-4 na expresi cytokin specifické mRNA lidskými monocyty aktivovanými LPS. Lidské monocyty (4 x 10⁶ buněk/ml) byly kultivovány v médiu při 4 ’C a 37 °C, nebo byly aktivovány LPS (1 μg/ml) bez přídavku nebo s přídavkem IL-4 (100 U/ml), IL-10 (100 U/ml) a neutralizujícím anti-IL-10 mAb 19F1 (10 μg/ml) a mRNA byla izolována po 24 hodinách. Exprese β-aktinu, IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF a G-CSF byla stanovena na reverzně přepsané mRNA PCR analýzou s cytokin specifickými primery, následované Southern blotováním reakčních produktů s vnitřní probou. cDNA získaná z klonu T-buněk CD4+ byla použita jako kontrola exprese TNFa a GM-CSF.

Obrázek 11. Vliv IL-10 na expresi cytokin specifické mRNA lidskými monocyty aktivovanými LPS. mRNA byla izolována z lidských monocytů (4 x 10⁶ buněk/ml) aktivovaných LPS (1 μg/ml) bez přídavku nebo s přídavkem IL-10 (100 U/ml) po 7 hodinách a exprese IL-6, IL-8, IL-10, TNFa, GM-CSF a G-CSF byla stanovena Northern analýzami.

-6CZ 281796 B6

Obrázek 12. Vliv exogenního IL-10, endogenně produkovaného IL-10 a IL-4 na expresi IL-10 a TGFP specifické mRNA lidskými monocyty aktivovanými LPS. Lidské monocyty (4 x 10⁶ buněk/ml) byly kultivovány v médiu při 4 ’C a 37 “C nebo byly aktivovány LPS (1 μg/ml) bez přídavku nebo s přídavkem IL-4 (100 U/ml), IL-10 (100 U/ml) a neutralizujícím anti-IL-10 mAb 19F1 (10 μg/ml). mRNA byla izolována po 24 hodinách. Exprese (A) IL-10, TGFP a β-aktinu byla stanovena Northern analýzami a (B) exprese IL-10 byla stanovena na reverzně přepsané mRNA PCR analýzou s cytokin specifickými primery, následované Southern blotováním reakčních produktů s vnitřní probou.

Obrázek 13. Vliv endogenně produkovaného IL-10 na třídu II MHC exprese lidskými monocyty aktivovanými LPS. Lidské monocyty byly kultivovány s (A) 0 ng/ml LPS, (B) 0,1 ng/ml LPS, (C) 10 ng/ml LPS nebo (D) 1000 ng/ml LPS bez přídavku nebo s přídavkem neutralizujícího anti-IL-10 mAb 19F1 (10 μg/ml) po dobu 40 hodin. Exprese HLA-DR/DP (Q5/13) byla stanovena nepřímou fluorescencí.

Obrázek 14. Vliv IL-10 na funkci APC buněčné linie makrofágů. Nahoře (obr. 14A). 1G18.LA nebo PU5.1 buněčná linie makrofágů (10⁶ buněk/ml) byla aktivována IFN τ (2 ng/ml). Tyto APC byly pak promyty a inkubovány (10⁵ buněk/jamku) s buňkami HDK.l Thl (5xl0⁴ buněk/jamku) a antigenem (TNP-KLH, 10 μg/ml) s přídavkem (θ) nebo bez přídavku (tf ) čištěného IL-10 (200 jednotek/ml). Supernatanty byly po 48 hodinách spojeny a testovány na IFNt. Dole (obr. 14B). 1G18.LA makrofágy byly aktivovány jako v předešlém případě a pak inkubovány (10⁵ buněk/jamku) buď s buňkami HDK.l Thl (5xl0⁴ buněk/jamku) a TNP-KLH (10 μg/ml) a nebo s hybridomem T-buněk D011.10 (5xl0⁴ buněk/jamku) a ovalbuminem (2,5 mg/ml) a s přídavkem (gZJ) nebo bez přídavku (·) čištěného IL-10 (dole) (200 jednotek/ml). Supernatanty byly po 20 hodinách spojeny a testovány na IL-2. Na všech grafech jsou ukázány průměry a SD triplicitních kultur.

Obrázek 15. IL-10 vyvolává morfologické změny v čištěných peritoneálních makrofázích. Peritoneální makrofágy (Mac-l^+bright, B220“) byly purifikovány na FACS a pak inkubovány 72 hodin v přítomnosti IFNt (2 ng/ml) (nahoře, obr. 15A), nebo IFNt (2 ng/ml) a IL-10 (200 jednotek/ml) (dole, obr. 15B). Supernatanty byly odstraněny, buňky sušeny na vzduchu, fixovány, barveny Wrighťs Giemsa, usušeny a pak fotografovány.

Obrázek 16. IL-10 inhibuje produkci IL-1, TNFa a IL-6 proteinů buněčnou linií makrofágů. Buněčné linie makrofágů 1G18.LA (obr. 16A, B a C) a PU5.1 (obr. 16D, E a F) byly inkubovány (10⁶ buněk/ml) s LPS (10 μg/ml) nebo s LPS (10 μg/ml) a IFNt (2 ng/ml), s přídavkem nebo bez přídavku IL-10 nebo IL-4 (v některých případech), obou v množství 200 jednotek/ml, jak je naznačeno. Supernatanty byly spojeny a testovány na hodnotu IL-1, IL-6 nebo TNFa.

-7CZ 281796 B6

Obrázek 17 (části A, Bl, B2 a C). IL-10 inhibuje expresi TNFa RNA buněčnou linií makrofágů vyvolanou LPS. Buněčná linie makrofágú 1G18.LA byla stimulována jako v předešlém případě u obrázku 16. Po 6 hodinách byly odstraněny supernatanty a po odebrání buněk k preparaci RNA byl přidán roztok guanidinium isothiokyanátu. Celkem 10 μg RNA ze vzorků buněčné linie 1G18.LA stimulované tak jak je popsáno výše, bylo naneseno na gel, blotováno a pak testováno na TNFa a aktin.

Obrázek 18. Stimulace peritoneálních makrofágů. IL-10 inhibuje syntézu proteinu IL-6 peritoneálnimi makrofágy vyvolanou LPS. Peritoneální makrofágy (Mac-l^+13rig^ht, B220“) byly purifikovány na FACS a inkubovány samostatně nebo s LPS (10 μg/ml) s přídavkem nebo bez přídavku IL-10 (200 jednotek/ml), anti-IL-10 (10 μg/ml) nebo IFNt (2 ng/ml), v množství 7xl0⁵ buněk/ml. Supernatanty byly odebrány a testovány na množství IL-6, relativně k známému standardu za užití specifického imunotestu (ELISA).

Obrázek 19. IL-10 neomezuje rozpustné kostimulátory ani neindukuje rozpustné inhibitory z makrofágů. (A) Supernatanty byly získány z buněčné linie 1G18.LA makrofágů (10⁶ buněk/ml) po stimulaci pomocí IFNt po dobu 24 hodin a následné stimulaci buňkami Th-1 (HDK-1, 2xl0⁵ buněk/ml) a antigenem (KLH, 500 μg/ml) po dobu 24 hodin. Supernatanty byly koncentrovány a depletovány z IFN a IL-2 a potom užity pro test CSIF. Supernatanty samy neobsahovaly detekovatelné množství IFNt 1G18.LA makrofágy APC (10⁵ buněk/jamku) aktivované IFNt byly inkubovány s buňkami HDK-1 (5xl0⁴ buněk/jamku) a antigenem (TNP-KLH 10 μg/ml), samy (A ) nebo v přítomnosti různých dávek IL-10 a s (o ) nebo bez ( A. ) výše zmíněných supernatantů (konečná koncentrace 25%). Supernatanty z testu CSIF byly po 48 hodinách shromážděny a testovány na množství IFNt. Zobrazeny jsou průměry a SD triplicitních kultur z jednoho experimentu. (B) Zvyšující se dávky purifikovaných slezinných makrofágů s přídavkem ( □ ) nebo bez přídavku IL-10 (W) (200 jednotek/ml) nebo směs zvyšujících se dávek čištěných makrofágů s B-buňkami (2.5X10³ buněk/jamku) s přídavkem ( O ) nebo bez přídavku IL-10 ( · ) (200 jednotek/ml); nebo B-buňky samy s přídavkem (o) nebo bez přídavku IL-10 (<s?) (200 jednotek/ml), byly užity jako APC pro klon HDK-1 Thl (10⁴ buněk/jamku) s TNP-KLH (10 μg/ml). Supernatanty byly po 48 hodinách shromážděny a testovány na množství IFNt. Zobrazeny jsou průměry a SD triplicitních kultur z jednoho experimentu.

Obrázek 20. IL-10 chrání myši Balb/c před toxicitou vyvolanou SEB; Obrázek 20A: 20 μg SEB/ 30 mg d-Gal; Obrázek 20B: IL—10/20 μg SEB/ 30 mg d-Gal; Obrázek 20C: 10 μg SEB/ 30 mg d-Gal; Obrázek 20D: IL-10/10 μg SEB/ 30 mg d-Gal; Obrázek 20E: 30 mg galaktosaminu; Obrázek 20F: 10 μg IL-10.

Obrázek 21. IL-10 chrání myši před smrtelnou endotoxemií. Skupinám 20 BALB/c myší bylo každé injikováno intraperitoneálně (i.p.) bud 350 μg LPS nebo 350 μg LPS s různými konkurujícími množstvími čištěného rekombinantního myšího IL-10. Úmrtí byla monitorována po dobu následujících 6 dní.

-8CZ 281796 B6

Obrázek 22. Protilátky anti-IL-10 neutralizují schopnost IL-10 chránit myši před smrtelnou endotoxemií. Skupiny 20 BALB/c myší obdržely každá 1 mg protilátky 2A5 anti-IL-10 (obrázek 22A) nebo 1 mg isotypové kontrolní protilátky GL113 (obrázek 22B) intraperitoneálně jednu hodinu před podáním LPS. Myším pak bylo injikováno 350 μg LPS i.p. bud samostatné nebo s různými konkurujícími množstvími IL-10, jak je popsáno v legendě k obrázku 21.

Obrázek 23. IL-10 chrání myši před smrtelnou endotoxemií, když je přidán 30 minut po injikování LPS. Skupiny 20 BALB/c myší obdržely 350 μg LPS i.p. v čase 0 a 1.0 μg rekombinantního IL-10 i.p. v časech 0, 0,5 hodiny, 1 hodina, 2 hodiny nebo 5 hodin po injekci LPS. Kontrolní myši, které obdržely 350 μg LPS i.p. bez přídavku IL-10 při tomto experimentu všechny zemřely.

Obrázek 24. Imunofluorescenční analýzy povrchové exprese IgM a IgD zcela živými purifikovanými peritoneálními buňkami, získanými z myší kontrolních a z myší podrobených působení anti-IL-10. BALB/c myším byla od narození až do 8 týdnů injikována protilátka SXC-1 anti-IL-10 (obrázek 24D), isotypová kontrolní protilátka (obrázek 24B), fosfátem pufrovaný šalin (PBS) (obrázek 24C) nebo nic (obrázek 24A), jak je popsáno v experimentální části. Výsledky ukazují fluorescenční intenzity 5000 živých buněk, počítaných z každé experimentální skupiny.

Obrázek 25. Hodnoty sérového IgM kontrolních myší a myší podrobených působeni anti-IL-10, stanovené po 8 týdnech působení. Výsledky ukazují geometrický průměr ± SEM u pěti jednotlivých sér v každé skupině a obsahují data z dvou různých experimentů. Tři další experimenty poskytly tytéž výsledky.

Obrázek 26. In vivo protilátková reakce kontrolních myší a myší podrobených působení anti-IL-10 na al,3-dextran (obrázek 26B) nebo fosforylcholin (obrázek 26A). BALB/c myším byla od narození až do 9 týdnů injikována protilátka SXC-1 anti-IL-10, isotypová kontrolní protilátka J5/D, PBS nebo nic. V 8. týdnu byly myši stimulovány al,3-dextranem nebo tepelně zabitým Streptococcus pneumoniae jako zdrojem fosforylcholinu tak, jak je popsáno v experimentální části. Výsledky ukazují geometrický průměr ± SEM hodnot specifických protilátek, stanovených u pěti jednotlivých sér.

Obrázek 27. Imunofluorescenční analýzy povrchové exprese B220 a CD3 živými slezinnými lymfatickými buňkami, získanými z myší kontrolních a z myší podrobených působení SXC-1 anti-IL-10. Další detaily viz legenda k obrázku 24 - části A-D obrázku 27 odpovídají příslušným částem A-D obrázku 24.

Obrázek 28. In vivo reakce kontrolních myši nebo myší podrobených působení anti-IL-10 na TNP-KLH. Myším byla od narození až do 9 týdnů injikována protilátka anti-IL-10 ( · ) nebo isotypová kontrola ( O ). V 8. týdnu byla zvířata stimulována intraperitoneálně 10 μg TNP-KLH. Sérové hodnoty TNP-specifického IgM (obrázek 28A) a IgC (obrázek 28B) byly stanoveny po 7 a 14 dnech po imunizaci. Výsledky ukazují tři různé experimenty, kde každý kroužek představuje jednu myš.

-9CZ 281796 B6

Obrázek 29. Protilátky anti-IL-10 nejsou přímo cytotoxické pro peritoneální čištěné B-buňky. 8 týdnů starým BALB/c myším byl intraperitoneálně injikován 1 mg protilátky anti-IL-10 (SXC.l

- obrázek 29 části A, B a C) nebo 1 mg isotypové kontroly (J5/D

- obrázek 29 části D, E a F). Peritoneální purifikované buňky byly získány z různých zvířat 1, 2 nebo 3 dny později a analyzovány na expresi povrchového IgD a IgM. Výsledky ukazují fluorescenční intenzity 5000 živých buněk, počítaných z každé experimentální skupiny.

Obrázek 30. Sérové hodnoty IFNt u kontrolních myší a myší podrobených působení anti-IL-10. BALB/c myším byla od narození až do 8 týdnů injikována protilátka anti-IL-10 ( φ ) nebo isotypová kontrola (O ). Séra získaná v 8 týdnech byla analyzována na obsah IFNt pomocí imunotestu. Výsledky ukazují pět různých experimentů, kde každý kroužek představuje jednu myš.

Obrázek 31. Dodání protilátek IFNt snižuje schopnost anti-IL-10 působit depleci myších peritoneálních buněk. Na BALB/c myši se od narození až do 8 týdnů působilo protilátkami anti-IL-10 (obrázek 31C) a anti-IFNT (obrázek 31 B) nebo ničím (obrázek 31A). Peritoneální promyté buňky pak byly analyzovány na koexpresi B220 a IgM. Výsledky ukazují fluorescenční intenzity 5000 živých buněk, počítaných z každé experimentální skupiny.

Obrázek 32. Sérové hodnoty TNFa u myší podrobených působení anti-IL-10 po 8 týdnech. Na myši se působilo od narození až do 8 týdnů protilátkou SXC.l anti-IL-10 ( · ), nebo isotypovou kontrolní protilátkou (O ), jak je popsáno v experimentální sekci. Séra získaná v 8 týdnech byla analyzována na obsah TNFa pomocí testu ELISA. Výsledky ukazují pět různých experimentů, kde každý kroužek představuje jednu myš.

Obrázek 33. Sérové hodnoty IL-6 u myší podrobených působení anti-IL-10. Séra získaná od myši, na které se působilo od narození až do 8 týdnů protilátkou SXC.l anti-IL-10 ( · ), nebo isotypovou kontrolní protilátkou ( O ), byla testována na obsah IL-6 pomocí testu ELISA. Výsledky ukazují pět různých experimentů, kde každý kroužek představuje jednu myš.

Obrázek 34. Myši podrobené působení anti-IL-10 vykazují zvýšenou náchylnost k úmrtí následkem šoku vyvolaného LPS (500 y.g LPS v obrázku 34A, 400 μg LPS v obrázku 34B, 100 μg LPS v obrázku 34C, 50 μg LPS v obrázku 34D, 10 μg LPS v obrázku 34E a 1 μg LPS v obrázku 34F). Na myši se působilo od narození až do 8 týdnů věku SXC.l krysí IgM anti-IL-10 protilátkou ( · ), 2A5 krysí IgGl anti-IL-10 protilátkou (A ) nebo vhodnými isotypovými kontrolními protilátkami ( O ) ( Δ )· Po 8 týdnech byly myším (5 myši/skupina) intraperitoneálně injikovány různé dávky LPS. Úmrtí byla monitorována po dobu následujících 4 dní.

Obrázek 35. Sérové hodnoty isotypů imunoglobulinu u myši podrobených působení anti-IL-10. Na myši se působilo od narození až do 8 týdnů věku protilátkami SXC.l nebo 2A5 anti-IL-10 krysí, vhodnými isotypovými kontrolními protilátkami, nebo PBS. Séra získaná v 8 týdnech byla analyzována na celkový obsah myšího IgGl (obrázek 35A), IgG2a (obrázek 35C), IgG2b (obrázek 35E), IgG3 (obrázek 35B), IgE (obrázek 35D) nebo IgA (obrázek 35F) za

-10CZ 281796 B6 použití testů ELISA specifických na isotypové imunoglobuliny. Výsledky ukazují čtyři nezávislé experimenty a u každého analýzu isotypových imunoglobulinů. Data jsou u každého experimentu zobrazena jako geometrick průměr ± SEM množství imunoglobulinu, stanoveného v pěti individuálních sérech.

Obrázek 36. Deplece B-buněk Lyl u myší podrobených působení anti-IL-10 je transientní. Na myši se působilo od narození až do 8 týdnů věku protilátkou SXC.l anti-IL-10 a pak bylo působení přerušeno. Peritoneální promyté buňky byly shromážděny z různých skupin takových myší (3 myši/skupinu) během 8 týdnů (obrázek 36A a D), 12 týdnů (obrázek 36B a E) a 16 týdnů (obrázek 36C a D). Výsledky ukazují imunofluorescenční analýzy exprese povrchového IgM a povrchového B220 zcela živými promytými peritoneálními buňkami, počítáno 5000 živých buněk z každé experimentální skupiny.

Obrázek 37. Imunofluorescenční analýzy exprese povrchového Lyl a povrchového IgM živými promytými peritoneálními lymfoidními buňkami, získanými z myší, na které se působilo SXC.l anti-IL-10 (obrázek 37D) nebo kontrolních myší (na které se působilo J5/D isotypovou kontrolní protilátkou na obrázku 37C, fosfátem pufrovaným salinem v na obrázku 37B nebo ničím na obrázku 37A). Výsledky ukazují fluorescenční intenzity 5000 živých buněk, počítaných z každé experimentální skupiny.

Obrázek 38. Imunofluorescenční analýzy exprese povrchového Mac-1 a povrchového IgM zcela živými promytými peritoneálními buňkami získanými z myší, na které se působilo SXC.l anti-IL-10 nebo kontrolních myší (stejné jako u obrázku 37). Výsledky ukazuji fluorescenční intenzity 5000 živých buněk, počítaných z každé experimentální skupiny.

Obrázek 39. In vivo protilátková reakce kontrolních myší nebo myší podrobených působení anti-IL-10 na TNP-Ficoll. Myším byla od narození až do 8 týdnů injikována protilátka SXC.l anti-IL-10 ( O ) nebo isotypová kontrola ( * ). V 8 týdnech byla zvířata stimulována intraperitoneálně 10 μg TNP-Ficoll. Sérové hodnoty TNP specifického IgM byly stanoveny po 5 a IgG po 10 dnech pomocí testu ELISA. Každý kroužek představuje jednu myš.

40. Působení protilátky reakce u myší NZB/W. injikována třikrát týdně

Obrázek autoimunitní NZB/WF1 byla studie buď protilátka SXC.l krysí IgM kontrolní isotypová protilátka označená J5/D ledujících 42 týdnů se sledovalo přežiti zvířat· zpozdí začátek anti-IL-10

Skupinám 20 myších samic od narození po dobu celé anti-myší IL-10 ( * ) nebo (O ). Po dobu násObrázek 41. Rozvoj proteinurie (> 3+) u myších samic NZB/W, na které se působilo protilátkami anti-IL-10. Skupinám 22 myších samic NZB/WF1 byla injikována třikrát týdně od narození po dobu celé studie buď protilátka SXC.l anti-IL-10 ( · ) nebo kontrolní isotypová protilátka ( O ). Rozvoj ledvinové choroby byl určen měřením proteinurie za použití testovacích proužků Albustix od 12. týdne do 42. týdne. Data ukazují podíl myší s více než 300 mg proteinu/dl moče.

Obrázek 42. Histologický test ledvin NZB/W myší podrobených působení anti-IL-10. Obrázek 42A ukazuje kontrolní NZB/W ledvinu

-11CZ 281796 B6 (PAS barveni): objevilo se několik glomerulonefritis s homogenním rozložením imunitních a proteinových komplexů v tubulech. Obrázek 42B ukazuje NZB/WF1 ledvinu, na kterou se působilo anti-IL-10 (PAS barvení).

Obrázek 43. Autoprotilátková produkce u NZB/W myší, na které se působilo anti-IL-10. Myším samicím NZB/W byla injikována protilátka SXC.l anti-IL-10 ( · ) nebo kontrolní isotypová protilátka ( O ) každé tři dny od narození po dobu celé studie. V sérech odebraných v 5 nebo 6 měsících byl stanoven obsah IgG protilátek, vážících dvojšroubovicovou DNA pomocí testu ELISA. Každý kroužek představuje jednu myš.

Obrázek 44. Hodnoty sérového TNFa u NZB/WF1 myší, na které se působilo anti-IL-10. Myším samicím NZB/W byla injikována protilátka SXC.l anti-IL-10 ( · ) nebo kontrolní isotypová protilátka ( 0 ) každé tři dny od narození po dobu celé studie. V sérech odebraných v 5, 7 nebo 8 měsících byl stanoven obsah TNFa pomocí cytokin specifického testu ELISA. Každý kroužek představuje jednu myš.

Obrázek 45. Anti-TNFa protilátky ruší ochranu NZB/WF1 myši vyvolanou anti-IL-10. Skupinám 36 a 18 myších samic NZB/W byla injikována dvakrát týdně protilátka 2A5 anti-IL-10 ( ) ( A ) nebo kontrolní isotypová protilátka označená GL113 ( □ ) od narození po dobu celého experimentu. Polovina zvířat, kterým byla injikována protilátka anti-IL-10, navíc obdržela dvakrát týdně protilátku XT22 anti-TNFa od 30 týdnů po narození ( A ) · Po dobu následujících 34 týdnů se sledovalo přežití zvířat.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález je zaměřen na metody užití IL-10 nebo jeho analogů nebo antagonistů k ovlivnění imunitní funkce, hlavně k prevenci a/nebo omezení škodlivých vlivů mikrobiálně vyvolaných šoků nebo ke kontrole diferenciace a vývoje B-buněk. Vynález také zahrnuje farmaceutické přípravky obsahující IL-10 nebo jeho analogy nebo antagonisty, určené k provedení těchto metod. IL-10 používaný v tomto vynálezu je přednostně vybrán ze skupiny maturovaných polypeptidů, kódovaných otevřenými čtecími rámci definovanými cDNA složenou z pH5C, pH15C a pBCRFl (SRa), které jsou uloženy v Americké sbírce typových kultur (ATCC), Rockville, Maryland, pod přístupovými čísly 68191, 68192 a 68193.

IL-10 inhibuje syntézu TNFa a IFNt monocyty nebo monocyty s přirozenými zabiječi (NK), ale ne pouze NK buňkami. IL-4 inhibuje vylučování cytokinu z NK buněk aktivovaných IL-2 přímo. To svědčí o tom, že IL-4 a IL-10 působí na NK buňky různými cestami, např. působeni IL-10 vyžaduje participaci monocytů. IL-10 inhibuje vylučování cytokinu z NK buněk aktivovaných IL-2, ale ne LAK aktivitu, což svědčí o tom, že syntéza cytokinu vyvolaná IL-2 a aktivita zabiječů aktivovaných lymfocyty (LAK) jsou regulovány rozdílným mechanismem.

IL-10 vykazuje protizánětlivou aktivitu, zřejmě mechanismem své schopnosti inhibovat produkci prozánětlivých cytokinů monocyty a/nebo aktivovanými makrofágy nebo NK buňkami. Tato inhibice produkce cytokinu se vyskytuje na úrovni transkripce.

-12CZ 281796 B6

U IL-10 bylo v tomto dokumentu také prokázáno, že ovlivňuje reakce vyvolané superantigenem, např. T-buňkami zprostředkovanou reakcí ve zvířatech. Stafylokokální enterotoxin B (SEB) může vyvolat prudkou šokovou reakci a studie na myších ukázaly jeho schopnosti i in vivo. Současné podání IL-10, nebo dokonce i pozdější než vystavení superantigenu, je účinné v zabránění úmrtnosti po vystaveni velké dávce SEB.

Gramnegativní bakteriální lipopolysacharid (LPS) vyvolává reakci septického šoku u savců. Tato endotoxinem vyvolaná septická šoková reakce je důsledkem uvolnění TNFa, IL-1 a/nebo IL-6 ze stimulovaných makrofágú/monocytů, jak je popsáno výše. Nicméně dodání IL-10 potlačuje vyvolanou expresi IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 a GM-CSF. Data prokazují skutečnost, že IL-10 je schopen chránit myši před šokem vyvolaným endotoxinem, dokonce i při dodání po LPS. Naopak, protilátky anti-IL-10 mohou blokovat ochranný efekt. Další studie ukazují, že myši podrobené působení anti-IL-10 také vykazují zásadné zvýšené hodnoty faktoru nekrózy tumoru-α (TNFa) a IL-6 a hlubokou náchylnost k šoku, vyvolanému endotoxinem (např. LPS).

Protilátky anti-IL-10 mají také použití v léčbě při jiných imunologických stavech. Data ukazují, že při dlouhotrvajícím podávání protilátky anti-IL-10 mladým myším může dojít k depleci podtřídy B-bunék Ly-1. To prokazuje účast IL-10 v regulaci vývoje B-buněk Ly-1 a zajišťuje prostředky k depleci B-buněk Ly-1. Toto pozorování vedlo k porozumění při léčení autoimunních stavů.

Rozvoj autoimunní odpovědi vyžaduje komplexní interakci s T-buňkami. Kmen myší NZB/W je lupus (systematicky lupus erythematosus, SLE) a poskytuje model pro testování terapeutických přípravků pro léčeni autoimunních stavů. Kromě toho tyto myši vykazují neobvyklý podíl Ly-1 B-buněk ve srovnání s ostatními typy B-buněk. K experimentům na myších in vivo byl použit kmen NZB/W.

Působení anti-IL-10 na tyto myši podstatně zpozdí začátek autoimunitní odpovědi, jak bylo prokázáno stanovením celkového přežití, rozvojem proteinaie, zánětu ledvin nebo protilátkovými titracemi. Tyto výsledky ukazují, že léčení anti-IL-10 je použitelné i při léčení jiných savců, např. lidí.

Pro produkci polypeptidů používaných v metodách podle tohoto vynálezu lze užít velké množství jedno či mnohobuněčných expresních systémů (t.j., kombinace hostitelských expresních vektorů). Typy hostitelských buněk zahrnují bakterie, kvasinky, hmyz, savce, apod. (ale nejsou tímto vymezeny). Pro vybírání a/nebo modifikaci specifických expresních systémů je dostupných mnoho přehledných článků. Viz např. práce de Boer a Shepard Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli, strany 205-274, v Kroon (editor) Genes: Structure and Expression (John Wiley & Sons, New York, 1983), kde je shrnuto několik E. coli expresních systémů; Kucherlapati a kol., Critical Reviews in Biochemistry, Vol. 16, číslo 4, strany 349-379 (1984) a Banerji a kol., Genetic Engineering, Vol. 5, strany 19-31 (1983), kde jsou shrnuty metody transfekce a transformace savčích buněk; Reznikoff a Gold (editoři), Maximizing Gene Expression (Butterworths, Boston, 1986), kde jsou shrnuta vybraná témata genové exprese v E. coli, kvasnicích, a savčích buňkách; a Thilly, Mamma

-13CZ 281796 B6 lián Cell Technology (Butterworths, Boston, 1986), kde jsou shrnuty savčí expresní systémy. Všechny tyto práce jsou zde uvedeny jako reference. Podobně je mnoho přehledných článků, které popisují techniky a podmínky pro spojování a/nebo manipulování s cDNA a sekvencemi kontrolujícími expresi k tvorbě a/nebo modifikaci expresních vektorů vhodných k užití v předkládaném vynálezu, např. práce Maniatis a kol. (1982) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; a Ausubel a kol. (1987 a periodické dodatky) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York, které jsou zde všechny uvedeny jako reference.

coli, je který je také jsou Vol.

včetně kmenů E. coli, jako jsou W3110 (ATCC č. C600, ED767, DH1, LE392, HB101, X1776 (ATCC č. RR1 (ATCC č. 31343), MRCI; kmenů Bacillus Subtienterobakterií, jako jsou Salmonella typhimurium

E. coli expresní systém je popsán Riggsem v U.S. patentu 4 431 739, který je zde uveden jako reference. Hlavní prokaryotní promotor, který je použitelný pro zvýšenou expresi v E. tac promotor popsaný de Boerem v U.S. patentu 4 551 433, zde uveden jako reference. Sekrečni expresní vektory jsou dostupné pro hostitele E. coli. Hlavně použitelné pIN-III-ompA vektory, popsané Ghrayebem a kol. v EMBO J., 3, strany 2437-2442 (1984), u kterých je transkribovaná cDNA připojena k části genu E. coli OmpA, který kóduje signální peptid z ompA proteinu, který naopak způsobuje maturaci proteinu, který je pak vylučován do periplazmového prostoru bakterie. U.S. patenty 4 336 336 a 4 338 397 také popisují sekrečni expresní vektory pro prokaryota. Tyto patenty jsou zde uvedeny jako reference. Četné kmeny bakterií jsou vhodnými hostitely pro prokaryotní expresní vektory, 27325), JA221,

31244), X2282, lus; a dalších nebo Serratia marcescens a různé druhy Pseudomonas. Obecné metody pro odvozování bakteriálních kmenů, jako jsou E. coli K12 X1776, které lze použít při expresi eukaryotních proteinů, jsou popsány Curtisem III v U.S. patentu 4 190 495. Tento patent je zde také uveden jako reference. Kromě prokaryotních a eukaryotních mikroorganismů lze užít k produkci proteinů z tohoto vynálezu také expresní systémy, obsahující buňky, odvozené z mnohobuněčných organismů. Velký zájem je o savčí expresní systémy, protože jejich posttranslačni aparát má větší pravděpodobnost produkovat biologicky aktivní savčí proteiny. Jako vektory pro savčí hostitele bylo použito několika DNA rakovinných virů. Zejména důležité jsou četné vektory, které obsahují translaci kontrolující sekvence, jícím bakteriální replikaci, a Bergem, popsané v Mol. Cell. (1982) a Mol. Cell. Biol., Vol. šené Takebou a kol., Mol. (1988). Tyto práce jsou zde uvedeny jako reference, expresní vektory, založené a Sharpem v Mol. Cell. Biol a Clarkem a kol. v U.S. uvedeny jako reference, vektory jsou opičí sekvence a intaktní čích buňkách (dají množství kopií než vektory, obsahující mohou autonomně replikovat do vysokého množství kopii (ale nesta

SV40 replikaci, transkripci a/nebo připojené k sekvencím, kontrolunapř. pcD vektory, vyvinuté Okayamou Biol., Vol. 2, strany 161-170 3, strany 280-289 (1983) a vylepCell. Biol., Vol. 8, strany 466-472 Jiné savčí byly popsány Kaufmanem strany 1304-1319 (1982) 285. Obě práce jsou zde pro výše zmíněné buňky. Takové vektory, obsahující SV40 ori A gen, se mohou replikovat autonomně v opivyšší množství kopií a/a nebo stabilnější neautonomně se replikující plasmidy). Navíc SV40 ori sekvence bez intaktního A genu, se na SV-40, ., Vol. 2, patentu 4 675 Preferovaní hostitelé

-14CZ 281796 B6 bilních) v opičích buňkách COS7, popsaných Gluzmanem, Cell, Vol. 23, strany 175-182 (1981) a dostupných z ATCC (přístupové číslo CRL 1651). Výše zmíněné vektory, založené na SV-40, jsou také schopné přeměny jiných savčích buněk, jako jsou myší buňky, integrací do buněčné DNA hostitele.

Mnohobuněčné organismy mohou také sloužit jako hostitelé pro tvorbu polypeptidů z tohoto vynálezu, např. hmyzí larvy, Maeda a kol., Nátuře, Vol. 315, strany 592-594 (1985) a Ann. Rev. Entomol., strany 351-372 (1989); a transgenní zvířata, Jaenisch, Science, Vol. 240, strany 1468-1474 (1988). Tyto práce stejně jako i další jsou zde uvedeny jako reference.

I. Testy na Interleukin 10 a analogy

Proteiny a polypeptidy, vztahující se k IL-10, označované společně jako IL-10, vykazují několik biologických aktivit, které mohou tvořit základ testů. Zejména mají IL-10 schopnost inhibice syntézy přinejmenším jednoho cytokinu ze skupiny sestávající z IFNt , lymfotoxinu, IL-2, IL-3 a GM-CSF v populaci T pomocných buněk, u kterých je syntéza jednoho nebo více z těchto cytokinů vyvolána vystavením vlivu buněk produkujících syngeneický antigen (APC) a antigen. Při této aktivitě se na APC působí tak, že nejsou schopné replikace, ale jejich aparát upravující antigen zůstává funkční. Toho se vhodně dosáhne vystavením APC záření, např. 1500-3000 R (gama nebo X-paprsky) před smísením s T-buňkami. Viz také tabulku 2 testu na myší IL-10.

Tabulka 2

IL-10 (CSIF) test - upravený na proliferační test

Antigen produkující buňky (APC)

1) BALB/c sleziny (asi 10⁸ buněk/slezina) umístit do zkumavky s cRPMI.

2) Vyrobit suspenzi jednotlivých buněk za užití cedníku a 10 ml stříkačky (užití sterilní techniky), odstředit při 1200 ot./min.

3) Resuspendovat pelety v 5 ml studeného NH₄C1 (0.83% ve vodě). Opět odstředit při 1200 ot./min.

4) Resuspendovat pelety v 5 ml cRPMI (bez IL-2 pro test) a odstředit do promytí.

5) Resuspendovat pelety v 5 ml cRPMI a spočítat.

6) Ozářit 3000 rad. (po dobu 20 minut).

7) Upravit koncentraci buněk na 8xl0^{4 5 6 7}/ml. (při testu se bude přidávat 50 ml na jamku, což dá konečnou koncentraci 4xl0⁶/jamku) (Titrovat IL-10 buď 100 ml konečného objemu na mikrotitrační desce nebo 50 ml konečného objemu pokud si přejete přidat protilátku anti-IL-10).

-15CZ 281796 B6

Buňky Thl

1) Tři dny před testem vložit ampuli buněk HKD1 přímo do 2x25 ml cRPMI obsahujícího IL-2.

2) Zkontrolovat buňky den poté a pokud je potřeba, rozdělit 1 : 2 nebo 1:3.

3) V den testu odstředit buňky při 1200 ot./min těsně před nanesením na desku, resuspendovat v 5 ml cRPMI a spočítat (zředit 1 : 2 trypanovou modří).

4) Znovu nastavit koncentraci na 2xl0⁵ na ml a přidat 50 ml na jamku (nakonec 10⁴ buněk na jamku). Před nanesením na desku přidat KLH tak, aby jeho výsledná koncentrace byla 400 mg/ml. (Tak vznikne konečná koncentrace 100 mg/ml).

Kontroly ml buněk Thl bez KLH.

ml buněk Thl s KLH.

ml APC ze sleziny.

s a bez přídavku IL-10 (nejvyšší koncentrace je pravděpodobně v pořádku).

zředit na konečný objem 200 ml.

Pořadí testu

1) Připravit APC

2) Nanést na desku IL-10

3) Připravit buňky Thl a nanést na desku.

4) Nanést na desku APC.

Po 48 hodinách odstranit 100 ml supernatantu pro IFNt ELISA test; pak přidat ³H-thymidin (1 mCi na jamku) a odebrat další ráno .

Alternativně může být inhibice cytokinu stanovena v primární nebo, s výhodou, v sekundární smíšené lymfocytové reakci (MLR), kdy není potřeba užit syngeneické APC. MLR jsou v této problematice dobře známé, viz např. práce Bradley, strany 162-166, v Mishell a kol. (editoři) Selected Methods in Cellular Immunoloqy (freeman, San Francisco, 1980); a Battisto a kol., Meth. in Enzymol., Vol. 150, strany 83-91 (1987), které jsou zde uvedeny jako reference. Stručně, dvě populace allogenických lymfatických buněk se smíchají, jedna z populací je předem opatřena proti proliferaci, např. ozářením. S výhodou je populace buněk připravována v koncentraci asi 2xl0⁶ buněk/ml v doplněném médiu, např. RPMI 1640 s 10 % telecího fetálniho séra. U kontrolní i testované kultury se pro test smíchá 0,5 ml každé populace. Při sekundární MLR jsou buňky zbývající po 7 dnech v primární MLR restimulovány čerstvé připravenými, ozářenými stimulačními buňkami, Vzorek, u kterého se očekává obsah IL-10, se může přidat k testovaným kulturám v momentě smíchání a kontrolní i testovaná kultura mohou být testovány na produkci cytokinu 1 až 3 dny po smíchání.

K získání T-buněk a/nebo APC populací pro IL-10 testy se používají postupy v této problematice dobře známé, které jsou plné popsány např. v DiSabato a kol. (editoři), Meth. in Enzymol.,

-16CZ 281796 B6 která je test jsou

Máge, Litvín zde uvedena jako reference. APC pro periferní krevní monocyty nebo tkáň jsou získávány užitím standardních technik, např. Boyum, Meth. in Enzymol., Vol. 108, strany 88-102 Vol. 108, strany 11 8-132 in Enzymol., Vol. 108, strany Meth. in Enzymol., Vol. 108, strany kol., Meth. in Enzymol., Vol. 108,

Meth. in Enzymol., a kol., Meth. Stevenson,

Romain a

Vol. 108 (1984), preferovaný IL-10 makrofágů. Ty jak popisuje (1984);

(1984),

298-302 (1984);

242-249 (1989) a Romain a kol., Meth. in Enzymol., strany 88-102 (1984). Tyto práce jsou zde uvedeny jako reference. S výhodou jsou při IL-10 testech používány T pomocné buňky, které jsou získány nejprve separací lymfocytú z krve, slezin nebo lymfatických uzlin a potom oddělením, např. proudovou cytometrií, pomocných buněk použitím komerčně dostupné protilátky anti-CD4, např. OKT4, popsanou v U.S. patentu 4 381 295 a dostupnou od Ortho Pharmaceutical Corporation. Myší anti-CD4 je dostupná od Becton-Dickinson nebo Pharmigen. Používané techniky jsou plně popsány v pracích Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest., Vol. 21 (Dodatek 97), strana 77 (1968); Meth. in Enzymol., Vol. 108 (citované výše) a v Bram a kol., Meth. in Enzymol., Vol. 121, strany 737-748 (1986). Všechny tyto práce jsou zde uvedeny jako reference. Obecně PBL jsou získávány totnim gradientu z čerstvé krve centrifugací v huspodle Ficoll-Hipaque.

Při testech lze použit množství antigenů, např. přílipkový (keyhole limpet) hemocyanin (KLH), drůbeží τ-globulin a podobně. Nejvýhodněji jsou T pomocné buňky stimulovány při testu monoklonální protilátkou anti-CD3, např. OKT3, popsanou v U.S. patentu 4 361 549.

Koncentrace cytokinu v kontrole a testovaných vzorcích jsou měřeny standardními biologickými a/nebo imunochemickými testy. Postup imunochemických testů na specifické cytokiny je v této problematice dobře známý, pokud je dostupný čištěný cytokin. Viz např. práce Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985) a U.S. patent 4 486 530, které jsou zde uvedeny jako reference a jsou příklady rozsáhlé literatury o tomto tématu. Testy ELISA na lidský IL-2, lidský IL-3 a lidský GM-CSF jsou komerčně dostupné od Genzyme Corporation (Boston, MA); a test ELISA na lidský IFNt je komerčně dostupný od Endogen lne. (Boston, MA). Polyklonální protilátky, specifické na lidský lymfotoxin, jsou dostupné od Genzyme Corporation a lze je užít pro rádioimunotest na lidský lymfotoxin, např. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques (Elsevier, Amsterdam, 1982).

Biologické testy cytokinů, zmíněných výše, lze také užít k určeni aktivity IL-10. Biologický test na lidský lymfotoxin je popsán v pracích Aggarwal, Meth. in Enzymol., Vol. 116, strany 441-447 (1985) a Matthews a kol., strany 221-225 v Clemens a kol. (editoři), Lymphokines and Interferons: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D. C., 1987). Obě práce jsou zde uvedeny jako reference. Lidský IL-2 a GM-CSF lze testovat faktor dependentními buněčnými liniemi CTLL-2 a KG-1, dostupnými z ATCC pod přístupovými čísly TIB 214 a CCL 246. Lidský IL-3 lze testovat pomocí jeho schopnosti stimulovat tvorbu širokého rozsahu hematopoietických buněčných kolonií v agarových kulturách, např. jak je popsáno Metcalfem, The Hematopoietic Colony Stimulating Factors (Else

-17CZ 281796 B6 vier, Amsterdam, 1984). IFNt lze stanovit anti-virálními testy, např. Meager, strany 129-147 v Clemens a kol. (editoři) (citováno výše). Myší ekvivalenty mohou být podobně testovány vhodnými buněčnými liniemi.

Produkci cytokinu lze také určit analýzou mRNA. Cytokinové mRNA lze měřit cytoplazmickou bodovou hybridizací, jak popisuje White a kol., J. Biol. Chem., Vol. 257, strany 8569-8572 (1982) a Gillespie a kol. U.S. patent 4 483 920. Tyto práce jsou v tomto dokumentu citovány. Jiné přístupy zahrnují bodové blotování za užití čištěné RNA, např. kapitola 6 v Hames a kol. (editoři), Nuceic Acid Hybridization A Practical Approach (IRL Press, Washington, D. C. , 1985). Lze užít i techniku polymerasové řetězové reakce, viz práci Innis a kol. (editoři), (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academie Press, lne., New York. Zmíněné práce jsou zde uvedeny jako reference.

V

IL-10, ny, které mohou rušit u některých buněk. Z ných buněk, použitých váného vzorku. Toto vzorku skrz standardní anti-cytokin afinitní kolonu.

se vzorky, v kterých se stanovuje aby se odstranily předurčené cytokiNapříklad IL-2 zvyšuje produkci IFNt T pomocz testoprolitím některých případech musí předem ošetřit, test, toho důvodu, v závislosti na typu v testu, by měl být IL-2 odstraněn odstranění se s výhodou provádí

Z důvodu pohodlí jsou jednotky aktivity IL-10 definovány schopností IL-10 zvyšovat proliferaci buněk MC/9 vwolanou IL-4, které jsou popsány v U.S. patentu 4 559 310 a dostupné z ATCC pod přístupovým číslem CRL 8306. Jedna jednotka/ml je definována jako koncentrace IL-10, která dá 50% maxima stimulace proliferace MC/9 nad hodnotu IL-4 v následujícím testu. Duplicitní nebo triplicitní zředění IL-4 a IL-10 jsou připravována v 50 μΐ média na jamku na standardní mikrotitrační desce. Médium obsahuje RPMI 1640, 10% telecího ftálniho séra, 50 μΐ 2-merkaptoetanolu, 2 mM glutaminu, penicilín (100 U/L) a streptomycin (100 mg/L). Přidá se IL-4, 25 μg/jamku z 1600 U/ml (nakonec 400 U/ml) rozpuštěný v médiu a inkubuje přes noc, např. 20-24 hodin. ³H-thymidin (např. 50 mCi/ml v médiu) se přidá v množství 0.5-1.0 mCi/jamku a buňky se opět inkubují přes noc, po které jsou buňky odebrány a měří se vnitřní radioaktivita.

Pro obecný popis přípravy cytokinů IL-4 a IL-10 viz U.S. patent 5 017 691 a U.S.S.N. 07/453,951. Oba patenty jsou zde uvedeny jako reference.

II. Agonisté a antagonisté

IL-10 agonisté mohou být molekuly, které napodobují interakci IL-10 s jeho receptory. Mohou to být analogy nebo fragmenty IL-10, nebo protilátky proti ligandům, vázajícím se na epitopální místa receptorů IL-10 nebo anti-idiotypické protilátky proti hlavním protilátkám, které se váží na části IL-10, interagující s receptorem.

Antagonisté mohou mít podobu proteinů, které soupeří o vazbu k receptorů, např. kterým se nedostává schopnosti aktivovat receptor, zatímco, ale brání vazbě IL-10, nebo molekuly, vázající se k IL-10, např. protilátky.

-18CZ 281796 B6

Může se zvýšit množství protilátek na IL-10 cytokin, fragmenty a analogy, jak na přirozeně se vyskytující formy, tak na jejich rekombinantní formy. Navíc se může zvýšit množství protilátek na IL-10 budf v jeho aktivní nebo neaktivní formě, rozdíl je, že protilátky na aktivní cytokin pravděpodobněji rozeznají epitopy, které jsou přítomné pouze v aktivní konformaci. Anti-idiotypické protilátky jsou v těchto metodách také sledovány a mohou být potenciální IL-10 agonisté.

Množství protilátek, včetně vazebných fragmentů a jednořetězcových verzí, proti předurčeným fragmentům požadovaného antigenu, např. cytokinu, se může zvýšit imunizací zvířat konjugáty fragmentů s imunogenickými proteiny. Monoklonální protilátky jsou připravovány z buněk, vylučujících požadovanou protilátku. Tyto protilátky mohou být testovány na vazbu k normálním nebo neaktivním analogům nebo testovány na agonistickou nebo antagonistickou aktivitu. Tyto monoklonální protilátky se budou obvykle vázat s K_D přinejmenším 1 mM, obvykleji přinejmenším 300 μΜ, typicky přinejmenším 10 μΜ, typičtěji přinejmenším 30 μΜ, s výhodou 10 μΜ a výhodněji 3 μΜ nebo lépe. Ačkoliv se jedná především o IL-10, množství podobných protilátek se zvýši i proti jiným analogům, jejich receptorúm a antagonistům.

Protilátky, včetně fragmentů vázajících antigen, v tomto vynálezu mohou mít významnou diagnostickou nebo terapeutickou hodnotu. Mohou být silnými antagonisty, kteří se váží na receptory IL-10 a inhibují vazbu ligandů k receptorů, nebo inhibují schopnost IL-10 vyvolat biologickou reakci.

IL-10 nebo fragmenty lze připojit k jiným látkám, hlavně polypeptidům, jako kondenzované nebo kovalentě připojené polypeptidy se užívají jako imunogeny. Cytokin a jeho fragmenty lze kondenzovat nebo kovalentně vázat k mnoha imunogenům, takovým jako je přílipkový (keyhole limpet) hemocyanin, hovězí sérum albumin, tetanový toxoid atd. Viz práce Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specifitv of Seroloqical Reactions, Dover Publications, New York a Williams a kol. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistrv, Vol. 1, Academie Press, New York. Tyto práce popisují metody příprav polyklonálních antisér a jsou zde uvedeny jako reference. Typická metoda zahrnuje hyperimunizaci zvířete antigenem. Krev zvířete je pak shromážděna krátce po opakované imunizaci a izoluje se gama globulin.

V některých případech je žádoucí připravit monoklonální protilátky z různých savčích hostitelů, jako jsou myši, hlodavci, primáti, lidé, atd. Popis technik pro přípravu takových monoklonálnich protilátek je možné nalézt v pracích např. Stites a kol. (editoři) Basic and Clinical Immunology (4. vydání), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, a odkazy tam uvedené; Harlow a Lané (1988) Antibodies: A Laboratorv Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. vydáni) Academie Press, New York; Colligan a kol. (editoři; 1991 a periodické doplňky) Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons, New York, a hlavně Kohler a Milstein (1975) v Nátuře 256: 495-497, kde diskutují jednu z metod tvorby monoklonálních protilátek. Zmíněné práce jsou zde uvedeny jako reference. Stručně

-19CZ 281796 B6 shrnuto, tato metoda zahrnuje injikování antigenů zvířeti. Zvíře je pak zabito a buňky ze sleziny jsou kondenzovány s buňkami myelomu. Výsledkem je hybridní buňka neboli hybridoma, která je za určitých podmínek schopná reprodukce in vitro na rozdíl od původních buněk myelomu. Populace hybridom je pak testována na izolaci jednotlivých klonů, z nichž každý vylučuje jediné protilátkové species k imunogenu. Při tomto způsobu jsou jednotlivá získaná protilátková species produkty jednotlivých klonovaných B-buněk z imunního zvířete, tvořené jako reakce na specifická místa, rozpoznaná na imunogenní substanci.

Jiná vhodná technika zahrnuje in vitro vystavení lymfocytů antigenním polypeptidům nebo alternativně výběr knihovny protilátek ve fágu nebo podobných vektorech. Viz práce Huse a kol. (1989) Generation of a Large Combinatorial library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda, Science 246: 1275.1281; a Ward a kol. (1989) Nátuře 341: 544-546, které jsou zde uvedeny jako reference. Polypeptidy a protilátky z tohoto vynálezu lze užít s anebo bez modifikace, včetně chimérických a lidských protilátek. Produkovány mohou být také rekombinantní imunoglobuliny, viz patent Cabilly, U.S. patent 4 816 567, který je zde uveden jako reference.

Zvýšení množství protilátek proti cytokinu nebo jeho receptorům je také použitelné k zvýšení množství anti-idiotypických protilátek, které mohou vykazovat agonistické nebo antagonistické vlastnosti. Toho lze využít při ovlivňování různých imunologických reakcí, jak je v tomto dokumentu diskutováno.

III. Čištění a farmaceutické přípravky

Když jsou polypeptidy z tohoto vynálezu vyloučeny v rozpustné formě, např. jako sekreční produkt kvasinek nebo savčích buněk, lze je čistit podle standardních procedur, známých v této problematice, včetně postupného srážení síranem amonným, chromatograf ií na iontoméniči, gelovou filtrací, elektroforézou, afinitní chromatografií a/nebo podobnými metodami, viz např. práce Enzyme Purification and Related Techniques, Methods in Enzymology, 22: 233-577 (1977) a Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York, 1982), které poskytují průvodce pro metody čištění. Zmíněné práce jsou zde uvedeny jako reference. Podobně když jsou polypeptidy z tohoto vynálezu vyloučeny v nerozpustné formě, např. jako agregáty, inkluzní hmota a podobně, lze je čistit podle standardních procedur, známých v této problematice, včetně oddělení inkluzni hmoty z rozbitých hostitelských buněk centrifugací, solubilizováním inkluzních hmot s chaotropními a redukčními činidly, zředěním solubilizované směsi a snížením koncentrace chaotropního činidla redukčního činidla tak, že se polypeptid dostane do biologicky aktivní konformace. Zmíněné procedury jsou popsány v následujících pracích, které jsou zde uvedeny jako reference: Winkler a kol., Biochemistry, 25: 4041-4045 (1986); Winkler a kol., Biotechnology, 3: 992-998 (1985); Koths a kol., U.S. patent 4 569 790; a Evropské patentové přihlášky 86306917.5 a 86306353.3. Výraz účinné množství, tak jak je používán v tomto dokumentu, znamená množství, postačující k zmírnění nebo prevenci podmínek šoku, které jsou charakteristické například symptomy jako je chlad, vasokonstrikce, duševní zmatek, hypoperfuse, hyperpyrexie a podobně.

-20CZ 281796 B6

Účinné množství pro jednotlivého pacienta se liší v závislosti na takových faktorech, jako je stav a typ sepse, která se léčí, celkový zdravotní stav pacienta, metoda podání, prudkost vedlejších příznaků a podobně. Obecně je IL-10 podáván jako farmaceutický přípravek, obsahující účinné množství činidla a farmaceutického nosiče. Viz např. práce Kaplan a Pasce (1984) Clinical Chemistrv: Theorv, Analvsis and Correlation, Mosby and Co., St. Louis, MO; a Gilman a kol. (1990) Goodman and Gilmans: The pharmacological Basis of Therapeutics (8. vydání), Pergamon Press, které jsou zde uvedeny jako reference. Při určitých aplikacích může být IL-10 kombinován s dalšími fanmaceuticky aktivními látkami včetně antibiotických přípravků.

Farmaceutický nosič může být jakákoliv nejedovatá látka, vhodná pro dopravu přípravku z tohoto vynálezu do pacienta. Je známo mnoho přípravků, použitelných pro parenterální podání takových léků, např. Remington's Pharmaceutical Science, 15. vydání (Mack Publishing Company, Easton, PA 1980). Alternativně je možné dodat přípravky z tohoto vynálezu do pacientova těla implantovatelným nebo injikovatelným systémem dopravujícím léky. Viz např. práce Urquhart a kol., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol. 24, strany 199-236 (1984); Lewis (editor), Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenům Press, New York, 1981); U.S. patent 3 773 919; U.S. patent 3 270 960, z nichž každá je zde uvedena jako reference, a podobné.

Při podávání parenterálně je jednotková dávka IL-10 v injikovatelné formě (roztok, suspenze, emulze) spolu s farmaceutickým nosičem. Příklady takových nosičů jsou fyziologický roztok, Ringerův roztok, roztok dextrózy a Hankův roztok. Lze také užít nevodné nosiče, jako jsou oleje a ethyl oleáty. Preferovaný nosič je 5% dextróza/fyziologický roztok. Nosič může obsahovat menšinový podíl doplňků, které zajištuji isotonicitu a chemickou stabilitu, např. pufry a stabilizační prostředky. IL-10 je s výhodou prezentován v čištěné formě bez agregátů a jiných proteinů v koncentraci, pohybující se v rozmezí od 5 do 20 mg/ml. S výhodou je IL-10 podáván kontinuální infuzi tak, že se dodá každý den množství v rozmezí 50-800 mg (t.j. 1-16 mg/kg/den). Množství denních infuzi se může měnit na základě sledování vedlejších efektů a počítání krevních buněk.

Podobná rozvaha se provede pro určení účinného množství IL-10 agonisty nebo antagonisty, ačkoliv někteří antagonisté mohou vyžadovat širší rozmezí dávek, např. vyšší dávky.

IV. Biologická pozorování a mechanismus

I když není vázána následně navrženým mechanismem, následující diskuze poskytuje hluboký pohled do užití a aplikací IL-10 analogů, agonistů a antagonistů. Využitelné základy pro funkci imunitního systému, rozvoj a diferenciaci poskytuje např. práce Paul (editor) (1989) Fundamental Immunoloqy (2. vydání) Raven Press, New York, která je v tomto dokumentu citována. Kapitoly 26 o infekci, 28 o zpožděném typu hypersenzitivity a 31 o autoimunitě se vztahují k užitím, popsaným v tomto dokumentu především.

-21CZ 281796 B6

Byl zkoumán vliv IL-4 a IL-10 na syntézu cytokinu a LAK aktivitu vyvolanou IL-2 v lidských PBMC a purifikovaných NK buňkách, např. ve studii A. Zatímco IL-4 a IL-10 inhibují syntézu IFNt a TNFa v PBMC, syntézu IFNt purifikovanými NK buňkami vyvolanou IL-2 inhibuje pouze IL-4. To ukazuje, že IL-4 a IL-10 inhibují syntézu cytokinu NK buňkami rozdílným mechanismem.

Výsledky pokusů, ve kterých se zkoumala produkce TNFa, naznačují podobné řešení. Nicméně v tomto případě monocyty produkují tento cytokin. IL-10 nemá žádný přímý vliv na syntézu TNFa NK buňkami vyvolanou IL-2, ale je schopen blokovat produkci TNFa v monocytech. Stimulace kultur, obsahujících NK buňky a CD14+ buňky, pomocí IL-2 vedla k velkému zvýšení produkce TNFa a IL-10 toto zvýšení kompletně zablokoval. Od toho okamžiku IL-2 neaktivoval buňky CD14+ k produkci dalšího TNFa, synergické zvýšení pravděpodobně reprezentuje přírůstek ze syntézy TNFa NK buňkami. To ukazuje, že IL-10 inhibuje produkci TNFa v monocytech stejně dobře, jako jejich kostimulační vlivy na syntézu TNFa NK buňkami.

Ačkoliv IL-4 i hIL-10/vIL-10 sníží syntézu TNFa a IFNt PBMC vyvolanou IL-2, pouze IL-4 inhibuje LAK aktivitu vyvolanou IL-2. Tato pozorování ukazují, že produkce cytokiny a cytotoxicita jsou regulovány v PBMC rozdílnými způsoby. Tato zjištění jsou důležitá v klinickém užití IL-2 a LAK buněk. Problémy spojené s terapií IL-2 zahrnují kardiovaskulární vlivy a syndrom prosakování kapilár. Příčiny těchto vedlejších efektů jsou nejisté, ale mohou zahrnovat uvolnění cytokinů, tak jako TNFa vyvolává IL-2 u pacientů s rakovinou. To, že IL-10 inhibuje syntézu cytokinu vyvolanou IL-2, ale neinhibuje LAK aktivitu ukazuje, že tento cytokin lze užít v kombinaci s IL-2 k léčení takových pacientů. Navíc se z pohledu dat ukazuje, že TNFa může vyvolat expresi HIV v infikovaných T-buňkách a schopnost IL-10 inhibovat syntézu TNFa se jeví v tomto světle zajímavá.

Tyto studie také ukazuji, že lidský IL-10 je produkován v relativně velkém množství monocyty po aktivaci. Kinetické studie ukazují, že nízké hodnoty IL-10 lze detekovat 7 hodin po aktivaci monocytů a maximální produkce IL-10 se objevuje 24 až 48 hodin po aktivaci. To bylo relativně pozdě ve srovnáni s produkcí IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 a TNFa, které byly vylučovány ve velkém množství 4 až 8 hodin po aktivaci. Také bylo prokázáno, že lidský IL-10 má silné inhibiční vlivy na produkci cytokinů monocyty po aktivaci IFNt , LPS nebo kombinace IFNt a LPS. Tyto inhibiční vlivy jsou specifické pro IL-10, poněvadž mohou být úplně neutralizovány mAb 19F1, který inhibuje aktivity IL-10 i v-IL-10. IL-10, přidaný v koncentraci 100 U/ml, sníží syntézu IL-1 a, TNFa, GM-CSF a G-CSF o více než 90% po optimální aktivaci monocytů kombinací IFNt (100 U/ml) a LPS (1 μg/ml). Inhibiční vliv na produkci IL-Ιβ, IL-6 a IL-8 byl poněkud méně výrazný, hlavně když byly monocyty optimálně aktivovány kombinací IFNt a LPS. Mechanismus, kterým IL-10 inhibuje produkci cytokinu monocyty není jasný, např. zda tyto vlivy IL-10 jsou přímé nebo nepřímo zprostředkované jinými faktory. Poněvadž IL-1 může vyvolat produkci IL-6 ve fibroblastech, thymocytech a monocytech, je například možné, že částečná inhibice produkce IL-6 je důsledek snížení produkce IL-1.

-22CZ 281796 B6

Virální-IL-10, který, jak bylo prokázáno, je biologicky aktivní vůči lidským buňkám, byl ve srovnání s lidským IL-10 testován méně rozsáhle. Nicméně v-IL-10 inhibuje produkci TNFa a GM-CSF monocyty aktivovanými LPS v témže rozsahu jako lidský IL-10. Tyto inhibiční vlivy v-IL-10 na produkci TNFa a GM-CSF byly neutralizovány mAb 19F1, což ilustruje specifitu vlivů v-IL-10.

Inhibice vylučování IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF a G-CSF se děje na úrovni transkripce. Syntéza cytokin specifické mRNA, vyvolaná LPS, je silně inhibovaná IL-10, jak bylo stanoveno Northern a PCR analýzami. PCR analýzy byly provedeny za podmínek, které poskytly srovnání reakčních produktů jednotlivých vzorků v semikvantitativním měřítku. To bylo ověřeno skutečností, že amplifikace cDNA s primery specifickými na β-aktin vedlo k ekvivalentnímu množství reakčních produktů mezi vzorky a kvantitativně srovnatelné výsledky byly získány, když exprese IL-10 mRNA byla stanovena v témže vzorku Nothern i PCR analýzami. Navíc, úroveň exprese cytokin mRNA je ve vztahu k množství proteinů v supernatantu těchto kultur. IL-10 neměl vliv na expresi τσΡβ mRNA v aktivovaných monocytech. Nicméně, je třeba poznamenat, že ΤβΡβ byl konstitutivně exprimován v neaktivovaných monocytech a že aktivace monocytů LPS neměla vliv na hodnotu ΤΰΡβ mRNA. Assoian a kol. (1987) Proč. Nati. Acad. Sci USA 84: 6020-6024 demonstruje, že monocyty konstitutivně exprimují Τ6Γβ mRNA a že vylučování ΤΰΡβ vyžaduje aktivaci monocytů. Nicméně, zda má IL-10 vliv na přeměnu ΤΰΡβ z latentní do aktivní formy je nejasné.

na úrovni transkripce. IL-10 byl značný, IL-4 úplně. IL-4 inhiboval tak vysokých končentrakompletní inhibici prože IL-4 je schoIL-8 a TNFa lidskými že GM-CSF a G-CSF lidskými monocyProdukce IL-10 byla inhibována IL-4 Ačkoli inhibiční účinek IL-4 na produkci nebyl schopen zablokovat produkci IL-10 produkci IL-10 jen do 70%, dokonce i při cích (400 U/ml), že byly dostačující ke dukce IL-1, IL-6 a TNFa. Bylo již demonstrováno, pen inhibovat produkci IL-la, IL-Ιβ, IL-6, monocyty. Tyto objevy byly potvrzeny a rozšířeny zjištěním, IL-4 také inhibuje produkci IL-8, ty aktivovanými LPS. Tato inhibice nastávala na úrovni transkripce. Údaje uvedené dále ilustrují, že IL-4 a IL-10 mají podobné efekty na expresi cytokinů lidskými monocyty, které zdůrazňují pleiotropní efekty cytokinů a redundanci v imunitním systému.

Je zajímavé, že IL-10 je autoregulační cytokin, protože silně inhibuje syntézu IL-10 mRNA v po 24 hodin aktivovaných monocytech. Navíc aktivace monocytů účinkem LPS v přítomnosti neutralizujícího anti-IL-10 mAbs způsobila vzrůst exprese IL-10 mRNA během 24 hodin, což ukazuje, že endogenně produkovaný IL-10 také inhibuje syntézu IL-10 mRNA. Fakt, že IL-10 je schopen regulovat (snižovat) svou vlastní produkci lidskými monocyty, znamená, že se jedná o první cytokin, regulovaný negativní zpětnou vazbou. Autoregulační efekty endogenně produkovaného IL-10 byly také pozorovány na produkci IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF a G-CSF monocyty aktivovanými LPS s LPS v přítomnosti protilátky anti-IL-10. Ale inhibiční efekty endogenního IL-10 na produkci těchto cytokinů byly méně výrazné než efekty exogenního IL-10, přidaného na počátku do kultury. To se vztahuje k faktu, že IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa a G-CSF už jsou produkovány na vysokých úrovních 4 až 8 hodin po aktivaci, zatímco k maximální

-23CZ 281796 B6 produkci endogenního IL-10 dochází mnohem později, 24 až 48 hodin po aktivaci. Tuto představu podporuje pozorování, že nejsilnéjší inhibiční vlivy endogenně produkovaného IL-10 byly nalezeny v sekreci GM-CSF, produkované pozdě po aktivaci monocytů. Za předpokladu, že syntéza IL-10 mRNA odráží a předchází vylučování proteinu IL-10, a že IL-10 jediný může interagovat se svým receptorem na povrchu buňky, dávají tyto výsledky tušit, že inhibiční vlivy endogenně produkovaného IL-10 nastávají relativné pozdě a mohou tedy nabývat značného významu v pozdějších fázích imunologické reakce.

IL-10 byl poprvé popsán u myši jako faktor inhibující syntézu cytokinu (CSIF) produkovaný Th2 buňkami, které inhibovaly syntézu cytokinu, který inhiboval produkci cytokinu (především IFNt) Thl buňkami. Pro tento inhibiční efekt m-IL-10 produkce cytokinu Thl buňkami je nutná přítomnost makrofága, viz např. práce Fiorentino a kol. (1991) J. Immunol. 146, 3444-3451, Trowbridge a kol. (1981) J. Ept' I Med. 154, 1517-1524, Lambert a kol. (1989) Cell. Immunol. 120, 401-418 a Hirsch a kol. (1981) J. Ept' I Med. 154, 713-725, které jsou zde uvedeny jako reference. IL-10 a v-IL-10 silně inhibují proliferaci antigen-specifických T-buněk, jsou-li monocyty použity jako APC. Navíc redukce odpovědí antigen-specifických T-bunék nastávají většinou díky redukci antigen prezentující kapacity monocytů způsobené silným efektem regulačního sníženi IL-10 v třídě II MHC exprese antigenů v těchto buňkách. Tyto údaje spolu se současným objevem, že IL-10 je produkován monocyty pozdě a má autoregulační vliv na sekreci IL-10 těmito buňkami, ukazují, že IL-10 má silný vliv regulačního snížení na probíhajících antigen specifických odpovědích T-buněk. Takže IL-10 může hrát hlavní roli při tlumení antigenem řízených odpovědí proliferujících T-buněk. Představa, že IL-10 produkovaný monocyty může mít také silnou autoregulační zpětnovazebnou aktivitu na aktivaci T-bunék, je podpořena pozorováním, že IL-10 produkovaný monocyty po aktivaci LPS je odpovědný za regulační snížení třídy II MHC antigenů v těchto buňkách, protože exprese třídy II MHC nebyla redukována a dokonce byla silně zvýšená, když byly provedeny LPS stimulace v přítomnosti neutralizujícího anti-IL-10 mAb.

Prozánětlivé cytokiny IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 a TNFa se účastní zánětlivých procesů a mnoha autoimunitních chorob včetně revmatoidní artritidy. Tyto cytokiny moduluji aktivaci a funkci buněk imunitního systému, ale pouze buněk endoteliálních, keratinocytů a hepatocytů. Objev, že IL-10 má silný vliv regulačního snížení na sekreci těchto cytokinů, dává tušit, že IL-10 je silný inhibitor zánětů. Diky těmto vlastnostem, které zahrnují inhibici proliferace antigen specifických T-buněk redukcí APC kapacity monocytů cestou regulačního snížení třídy II MHC antigenů v těchto buňkách a inhibičních vlivů na sekreci prozánětlivých cytokinů monocyty, se zdá, že IL-10 hraje hlavní roli jako supresor imunologických a zánětových odpovědí. Tato role je potvrzena dalšími studiemi na in vitro a in vivo modelech endotoxinových a enterotoxinových superantigenních odpovědí.

Současné studie ukazují, že IL-10 vykazuje inhibiční vliv na produkci cytokinu buněčnými liniemi makrofágů a peritoneálních makrofágů vyvolanou LPS. IL-10 nehraje tedy důležitou roli jen

-24CZ 281796 B6 při reakcích T-buněk, ale také u zánětových reakcí, vzniklých při infekci nebo při zranění.

Vliv IL-10 na buněčné linie makrofágů je výraznější než vliv, který vykazují podobná množství IL-4, u kterého byla již dříve zjištěna inhibiční činnost na produkci cytokinů myšími a lidskými makrofágy a monocyty. Tyto výsledky ukazují na silnou inhibici TNFa proteinu indukovaného LPS produkovaného IL-4, ale méně také na významnou inhibici syntézy IL-6 v těchto liniích. Inhibice TNFa IL-4 však není tak velká jako ta, která byla nedávno popsána pro lidské monocyty. Tento rozdíl může být vysvětlen rozdílem v látkách, použití diferencovaných linií buněk makrofágů spíše než monocytů nebo tím, že pro tyto studie bylo použito 10 μg/ml LPS oproti dávce 100 ng/ml, použité v případě lidských monocytů. V kontrastu k IL-4, IL-10 významné inhiboval při těchto vysokých koncentracích LPS produkci proteinů IL-6, TNFa a IL-1. Stimulace buněčných linií makrofágů LPS a IFNt může mít protiváhu v některých aspektech aktivace makrofágů. To je opět v rozporu se studiemi lidských monocytů, které byly konány s malými množstvími LPS. Navíc, inhibice IFNt zprostředkovaná IL-10 a produkce IL-6 a proteinu TNFa vyvolaná LPS byla mnohem významnější než ta, která byla pozorována u IL-4. Inhibice LPS nebo IFNt plus exprese RNA kódující IL-6 a TNFa vyvolaná IL-10 byla také pozorována při semikvantitativní PCR amplifikaci pro reverzně transkribovanou RNA. V některých případech IL-4 inhiboval expresi až do podobného rozsahu jako IL-10, což dává tušit, že IL-10 také účinkuje na sekreci nebo stabilitu translatovaných proteinů. Ačkoli IL-10 vykazuje tyto vlivy, ukazuje se, že jeho konečný inhibiční eefekt na produkci cytokinů makrofágy je podstatně větší, než je tomu u IL-4. Vliv IL-10 na produkci monokinu dává tušit, že tento silný inhibitor může mít uplatnění jako protizánétové agens pravděpodobně v celé řadě klinických uplatnění.

Jelikož se ukázalo, že peritoneální makrofágy byly inhibovány IL-10 ze stimulovaných T-bunék, bylo testováno, zda IL-10 inhiboval sekreci cytokinů v této purifikované populaci buněk. FACS-purifikované peritoneální makrofágy, získané z BALB/c nebo CBA/J myší, stimulované LPS produkovaly významné množství proteinu IL-6. Produkce IL-6 byla jen málo redukována přítomností IL-10. Protože předběžná PCR data dávala tušit, že purifikované makrofágy produkovaly IL-10, protilátka směrovaná proti IL-10 byla zahrnuta v některých LPS stimulacích. Přidáním této protilátky do LPS stimulaci v obou liniích myší vzrostla produkce IL-6 na mnohem vyšší úroveň (30-35 ng/ml na 7.10⁵ buněk/ml, během 20 hodin) .To je konzistentní s produkcí cytokinů makrofágy za silné autokrinní kontroly, nebo s tím, že více než jedna populace makrofágů je obsažena v Mac-1 ⁺/^Bri9ht peritoneálních makrofázích, přičemž jedna z nich kontroluje ostatní svojí produkcí IL-10. Data získaná z paralelního systému lidských monocytů purifikovaných elutriaci také ukazují, že IL-10 inhibuje produkci LPS indukovaného cytokinů včetně produkce IL-10 samotného. V souladu s tím předchozí zprávy o efektech cytokinů T-pomocných buněk jako jsou IL-4 a IL-10 s cytokiny Thl T-pomocných buněk jako je IFNt , jsou poskytnuta další zjištění, že tyto cytokiny mohou působit proti svým vlastním efektům. IFNt zvýšil úroveň produkce IL-6 jako odpověď na LPS až do téměř stejné vysoké úrovně dosažené anti-IL-10 inhibovaného produkci IL-10 týmiž makrofágy. Tato data

-25CZ 281796 B6 dávají tušit, že produkce cytokinů jako je IL-6 a TNFa je regulována IL-10, která je střídavě kontrolována IFNt produkovaným aktivovanými T-buňkami a NK buňkami. Tento účinek IFNt může vysvětlit předchozí pozorování, ukazující, že inkubace peritoneálních makrofágů s IFNt po dobu 24 hodin zvětšila jejich kapacitu stimulace Thl buněk.

Mechanismus toho, jak IL-10 inhibuje makrofág ze stimulovaných buněk ze syntetizovaných cytokinů, ještě není znám.

Nahlédneme-li významný pokles syntézy cytokinů, pozorovaný při stimulaci makrofágů v přítomnosti IL-10, IL-10 může mít aktivitu regulačního snížení a kostimulace nutné pro optimální sekreci cytokinů v odpovědi na makrofágy a antigen. Použitím supernatantů, získaných ze stimulovaných 1G18.LA makrofágových buněk, nebylo možné překonat inhibiční efekt IL-10 na makrofág a antigen-dependentní stimulaci Thl buněk. To je konzistentní s mechanismem, kde IL-10 nezprostředkovává jeho účinky na syntézu cytokinů regulačním snížením rozpustného kostimulátoru. Je možné, i když nepravděpodobné, že IL-10 ruší účinek spíše než produkci takového faktoru, nebo že takový kostimulátor je vysoce labilní nebo je absorbován a tak není přítomný v těchto připravených supernatantech. Alternativně může IL-10 inhibovat expresi membránově vázaného kostimulátoru, což by mělo také vysvětlit předchozí sdělení, naznačující, že stimulace buněk vyžaduje APC/doplněk, který nemůže být nahrazen rozpustným kostimulátorem. Alternativní vysvětlení mechanismu inhibice syntézy cytokinů proteinem IL-10 by mohlo být takové, že IL-10 indukuje produkci inhibičního faktoru(ů) makrofágem, který pak působí na T-buňky za inhibice sekrece cytokinů. Smísení makrofága a B-buněk APC v antigen-specifickém systému pro stimulaci Thl buněk vede k aditivní stimulaci T-buněk ve srovnání se stimulací s jednotlivými APC. Přítomnost IL-10 inhibuje syntézu cytokinů buňkami na tu úroveň, které B-buňky APC dosahují samy. To naznačuje, že makrofág nevyvolává produkci inhibitoru, který působí přímo na T-buňky nebo B-buňky APC. Ačkoli je to nepravděpodobné, je možné, že takový inhibitor může být také specifický pro interakce makrofág-T-buňka, nebo že B-buňky APC nějak překonávají nebo maří účinek takové aktivity. Data získaná z lidského systému naznačují, že IL-10 nedosahuje své inhibice proliferace T-pomocných buněk via rozpustný inhibitor nebo kostimulační faktor produkovaný monocyty. Avšak jejich účinky mohou být vysvětleny regulačním snížením antigenů MHC třídy II proteinem IL-10 na lidských monocytech, který ještě nebyl pozorován v myším systému.

Kromě regulace funkce efektoru by také mohl IL-10 hrát roli v iniciaci imunitní odpovědi na produkci protilátky nebo přecitlivělosti pozdního typu aktivací různých podskupin CD4 T-pomocných buněk produkujících různé typy cytokinů. Tyto B-buňky a makrofágy produkují IL-10 a také funguji jako APC a jsou senzitivní k různým cytokinovým modulátorům (IFNt inhibuje mnoho funkcí B-buněk, IL-10 inhibuje makrofágy, ale ne funkci B-bunék APC), což podporuje tuto teorii. Navíc tyto studie ukazují, že IL-10 má výrazný inhibiční účinek na syntézu cytokinů makrofágy stejně jako zapříčiňuje značné morfologické změny v peritoneálních makrofázích. Souhrnně naznačují tato pozorování důležitou roli IL-10 nejen při regulaci odpovědi T-buněk, ale také

-26CZ 281796 B6 roli důležitého modulátoru odpovědí akutních zánětových odpovědí, způsobených infekcí nebo zraněním.

Ve studii D byla testována schopnost IL-10 inhibovat superantigenem zprostředkovanou toxicitu in vivo. IL-10 je schopen inhibovat produkci cytokinú T-buňkami a částečně inhibovat schopnost makrofágů aktivovat T-buňky. Superantigeny byly definovány jako molekuly, které aktivují T-buňky formováním můstku'’ mezi νβ řetězcem TCR a třídou II MHC molekul přítomných na APC. Tyto výsledky naznačují, že IL-10 by mohl inhibovat produkci cytokinú T-buňkami aktivovanými superantigeny prezentované makrofágy. Tento účinek byl pozorován in vitro. Superantigeny mohou být endogenní, např. kódované viry, nebo exogenní, např. mikrobiální enterotoxiny. Většina studovaných superantigenů z druhé skupiny zahrnuje stafylokokové enterotoxiny. Nyní je známo, že toxicita, vykazovaná těmito toxiny, závisí na jejich schopnosti aktivovat T-buňky in vivo. Tato pozorování naznačují, že agens, která inhibují aktivaci T-buněk, budou předcházet toxicitě, vykazované superantigeny. To je konzistentní s pozorováním, že cyklosporin předchází SEB-zprostředkované toxicitě. Vzhledem k tomuto modelu je TNFa hlavní zprostředkovatel toxicity. Výsledky zde předložené indikují, že IL-10 je schopen předcházet toxicitě SEB, pravděpodobně přes jeho schopnost inhibovat produkci TNF T-buňkami.

Tato pozorování mají zajímavé implikace pro mechanismus působeni IL-10 in vivo. Ukázalo se, že IL-10 inhibuje funkce makrofága, např. produkci cytokinú, schopnost aktivovat T-buňky a indukuje expresi la antigenů v B-buňkách. Ale protože toxicita SEB závisí na expresi la antigenů APC, význam těchto experimentů in vivo byl nejistý. To, že IL-10 předchází toxicitě, vyvolané SEB, naznačuje, že hlavní APC in vivo je makrofág a ne B-buňky.

Tyto výsledky mají důležité implikace pro terapeutická využiti IL-10. Kromě otrav potravin stafylokokovými enterotoxiny bylo nedávno popsáno mnoho nemocí, způsobených superantigenovou indukcí, např. syndrom toxického šoku, Kawasakiho nemoc, nemoci způsobené streptokokovými toxiny a autoimunní nemoci jako revmatická artritida.

IL-10 je vysoce efektivní při ochraně myší před letální endotoxemií, což je objev, který naznačuje, že IL-10 může být užitečný při léčbě bakteriálních sepsí. Zatímco mnoho dalších látek je v současné době v klinických zkouškách na léčbu bakteriálních sepsí, např. protilátky proti TNFa nebo endotoxinu a IL-IRa, většina z nich potřebuje být pro optimální ochranu podávána v animálních modelových experimentech před vznikem sepse. Jedna výjimka z toho, IL-IRa, je efektivní při podání současně s vyvoláním sepse v animálních modelových experimentech, ale musí být podávána v množstvích dostatečných k blokování všech endogenních receptorů IL-1. Farmakologické dávky IL-10 také mají účinly na funkci makrofág/monocyt, která by měla přispět k ochraně před letální endotoxemií, v dost možná menších množstvích než jsou množství nutná k saturaci receptoru.

Zatímco předchozí diskuse byla zaměřena na účinky podání IL-10 na regulaci a diferenciaci v různých aspektech imunitního systému, další přistup je přes blokováni účinku cytokinú IL-10 použitím protilátky anti-IL-10.

-27CZ 281796 B6

Data zde uvedená ukazuji, že kontinuální působení na myši od narození po dospělost protilátkou anti-IL-10 drasticky redukuje celkový počet a funkci Ly-1 B-buněk beze změny počtu, fenotypu nebo imunokompetence konvenčních B-buněk, umístěných ve slezině těchto zvířat. Různá pozorování podporují předpokládanou depleci Ly-1 B-buněk v myších, podrobených působení anti-IL-10: a) myši, podrobené působení anti-IL-10, obsahují ve svých peritoneálních dutinách, místě Ly-1 B-buněčného nabohacování u normálních myší, málo nebo žádné B-buňky. (Peritoneální promyté buňky 8 týdnů starých BALB/c myší v DNAX zvířatech příležitostně obsahují méně než 5% konvenčních B-buněk - zjištěno fenotypovou analýzou), b) myši, podrobené působení anti-IL-10, obsahují 0-10% úrovně normálních sérových IgM, což je konzistentní s předchozími rekonstitučními experimenty, identifikujícími Ly-1 B-buňky jako predominantní zdroj cirkulačních IgM, a c) myši, podrobené působení anti-IL-10, generují málo nebo žádnou protilátku v odpovědi na injekci fosforylcholinu a αΐ,3-dextranu, antigeny, kvůli kterým sídlí specifické B-buňky v Ly-1 B-buněčných podskupinách. Data, naznačující neměnnost konvenčních B-buněčných kompartmentů v myších, podrobených působení anti-IL-10, se shodují s nezměněnými počty slezinných B-buněk s normálním buněčným povrchem značených fenotypů a normálně odpovídajícími thymus-dependentnímu antigenu a mitogenům B-buněk. Selektivní deplece Ly-1 B-buněk v myších, podrobených působení anti-IL-10, byla shledána dočasnou, neboť Ly-1 B-buňky se znovu objevily v peritoneálních dutinách těchto zvířat několik týdnů po přerušení působení anti-IL-10.

V úvahu bylo bráno několik možných mechanismů jako vysvětlení selektivní deplece Ly-1 B-buněk v myších, podrobených působení anti-IL-10. Uvedená data ukazují, že to je alespoň částečné důsledek vzrůstu IFNt po působení anti-IL-10, protože podání neutralizujících protilátek anti-IL-10 a anti-IFNT v těchto studiích podstatně zabránilo depleci peritoneálních B-buněk. Implikace, že IFNt buď přímo nebo nepřímo inhibuje vývoj Ly-1 B-buněk, připomíná předchozí pozorování, že IFNt slabě podporuje supresi IL-5, indukovaného in vitro proliferací Ly-1⁺ B lymfom BCL1. V pokračování těchto studií byla pozorována suprese LPS, vyvolaného proliferací peritoneálních buněk, zprostředkovaná IFNt, ale ne proliferací myších slezinných buněk z normálních BALB/c. Zda vzrůst IFNt v myších, podrobených působení anti-IL-10, úplně vysvětluje depleci Ly-1 B-buněk a zda to přímo odráží účinek IFNt Ly-1 B-buněk nebo nějakého nepřímého účinku, zprostředkovaného IFNt, není plně jasné. Možná, že k depleci Ly-1 B-buněk přispívají navíc další změny v myších, podrobených působení anti-IL-10. Působení anti-IL-10 bude pravděpodobně vést ke vzrůstu úrovně endogenních monokinů. Myši, podrobené působení anti-IL-10, jsou 50krát více náchylné k úmrtí šokem, vyvolaným LPS, je znám případ zprostředkování monokiny a 5 z 32 myší, individuálně podrobených působení anti-IL-10, obsahuje podstatnou úroveň séra IL-6, je známo, že monokiny nebyly nalezeny v oběhu normálních zvířat, a že nemohly být detekovány v séru asi 10 kontrolních myší z těchto experimentů. Avšak IL-6 transgenní myši nebo zvířata s velkým vzrůstem úrovně séra monokinů v in vivo podávání LPS se zdají mít normální úroveň séra IgM, naznačující nezměněný počet Ly-1 B-buněk. Dřívější nález, že Ly-1 B-buňky, ale ne konvenční B-buňky, generují konstitutivní a inducibilní IL-10, vedlo k tušení, že IL-10 působí jako autokrinní růstový

-28CZ 281796 B6 faktor. To se nyní zdá nepravděpodobné ve světle podstatného počtu peritoneálních Ly-1 obou protilátek B-buněk, získaných z myší, podrobených působení obou protilátek, anti-IL-10 a anti-IFNT.

Depletované myší Ly-1 B-buňky, vzniklé kontinuálním působením anti-IL-10, vykazují značnou podobnost s imunodeficientními xid myšmi, což je spontánní mutantní kmen, odvozený z CBA/caH myší, který nemá Ly-1 B-buňky a je necitlivý k podskupině thymus-independentních antigenů. I přes tyto podobnosti naše předběžné výzkumy odhalily, že xid myši produkují IL-10 normálně a obsahují funkční IL-10 receptory, a tak se rozlišují xid myši a myši, podrobené působení anti-IL-10, mechanisticky. Další významná vlastnost myší, podrobených působeni anti-IL-10 z xid myší je in vitro citlivost slezinných buněk na stimulaci anti-IgM, vykazovanou předchozími, ale ne dalšími zvířaty.

Fyziologická role IL-10 byla studována injikováním monoklonálních protilátek, specificky neutralizujících IL-10, do myší od narození do dospělosti. Takové působení vede k početným změnám v imunitním systému těchto zvířat. Zvířata jsou charakterizovatelná zvýšením oběhového TNFa, IFNt a v mnoha případech i IL-6. Tyto efekty jsou konzistentní s předtím zjištěnými vlastnostmi IL-10 in vitro, potentního supresantu IFNt a produkce monokinů v experimentech na buněčných kulturách. Vzrůst endogenního IFNt se ukazuje být zodpovědný za některé další důsledky, vyplývající z působení anti-IL-10. To vede např. k depleci Ly-1 B-buněk a vysvětluje redukci oběhových IgM a IgA protilátek a specifické odpovědi protilátek na fosforylcholin a al,3-dextran. Zvýšené hladiny IFNt jsou také asi odpovědné za vzrůst oběhového IgGja tak, že tento izotyp je pozitivně regulován IFNt . Zbývající změny vzrůstu v peritoneálních T-buňkách, granulocytech a cirkulačních IgG₂b nejsou mechanisticky pochopeny, ale mohou být důsledkem sekundárních perturbací cytokinů. Na rozdíl od běžných zdravých zvířat byly myši, podrobené působení anti-IL-10, shledány vysoce náchylnými k úmrtí v důsledku šoku, vyvolaného endotoxiny. Tato letálni zánétlivá reakce je zprostředkována monokiny, které může být zabráněno pasivním přenosem protilátek specifických buď pro TNFa, IL-1, IL-6 nebo endotoxiny. Není proto překvapující, že myši, podrobené působení anti-IL-10, které vykazují regulaci zvýšením endogenních monokinů, a které nemají populaci B-buněk produkující anti-endotoxinové protilátky (tj. Ly-1 B-buňky), jsou více náchylné k této zánětlivé reakci. Tato data naznačují klinické využití IL-10 jako protizánětového agens. V souladu s touto představou experimenty indikují, že farmakologické dávky IL-10 chrání myši před úmrtím příčinou šoku, vyvolaného endotoxiny.

Zatímco navržený fenotyp myší, podrobených působení anti-IL-10, je zcela v souladu se známými vlastnostmi IL-10 in vitro, je nicméně v kontrastu s předběžnými výsledky o myších s IL-10 deficiencí, vzniklou cílenou genovou manipulací. Tyto mutanty mají nedetekovatelné úrovně oběhového IFNt, TNFa a IL-6, normální počty Ly-1 B-buněk v peritoneální dutině a, v prvním přiblížení, normální úrovně sérového Ig. Vysvětlení této diskrepance není jasné, ačkoli podobná diskrepantní situace existuje mezi myšmi s vyřazeným genem IL-2 a myšmi, podrobenými působení od narození až do dospělosti receptorovými protilátkami anti-IL-2. Vysvětleni této redundance lze také hledat v souvislosti s cytokinovým systémem. Je možné, že vyvíjející se myší em

-29CZ 281796 B6 bryo bude kompenzovat ztrátu kritického genu cytokinu amplifikační expresí genu, kódujícího cytokin velmi příbuzných funkcí. Např. protože IL-4 sdílí mnoho vlastností s IL-10, byl by tento cytokin výtečným kandidátem ke kompenzaci totální ztráty IL-10, a tak by jeho exprese mohla vést k regulačnímu zvýšení v myších bez IL-10 genu. Naopak neutralizace endogenního IL-10 protilátkou u myší od jejich narození by v nej lepším případě reprezentovala děravou eliminaci cytokinu, a tak mohou být zbývající stopy endogenního IL-10 dostatečné k vyhnutí se hluboké deficienci a regulační aktivaci kompenzačního metabolismu. Náhradní vysvětlení spočívá v tom, že u zvířat, podrobených působení protilátky, stoupne artificielní imunitní odpověd na administrované xenogenetické protilátky a/nebo výsledné imunitní komplexy nemohou být úplně eliminovány. Tato alternativa se zdá nepravděpodobná, protože izotypová kontrola protilátek a protilátek na ostatní cytokiny, které také generuje imunitní komplex in vivo, neprodukuje imunomodulace, připisované myším, podrobeným působení anti-IL-10.

Zatímco charakteristické rysy imunomodulace, pozorované u myší, podrobených působení anti-IL-10, nekorelují úplně s žádným ze známých lidských imunodeficientních onemocnění, existují jisté podobnosti s Wiskott-Aldrichovou nemocí a syndromem IgA deficience. Tyto lidské imunodeficience jsou charakteristické absencí oběhového IgM nebo IgA, sníženou schopností generovat antibakteriální imunitní odpověď a často i vzrůstem oběhového IgGl, hlavního komplement-fixujícího protilátkového izotypu, který patrně koreluje s myším IgG2a. Zda takoví pacienti vykazují sníženou produkci nebo citlivost k IL-10, a když, zda to naopak přispívá k jejich imunodeficienci, očekává dosud potvrzení. Potenciální role IL-10 v syndromu IgA deficience je nejasná, zvláště proto, že současné studie jasné implikují, že IL-10 je důležitý kofaktor pro lidské B-buňky pro jejich diferenciaci v IgA-sekretujicí buňky po jejich aktivaci síťovanými anti-CD40 protilátkami a TGFp.

Navíc k získávání informací o fyziologické roli a potenciálním klinickém využití IL-10 myši, podrobené působení anti-IL-10, poskytují novou příležitost k vyhodnocení příspěvku Ly-1 B-buněk k imunitnímu systému. Jak bylo výše zmíněno, druhotné konsekvence, vyplývající z deplece Ly-1 B-buněk v myších, podrobených působení anti-IL-10, potvrzují mnoho z vlastností, dříve připisovaných této minoritní subpopulaci B-buněk. Ovšem tato data dále poskytují nový náhled na příspěvek Ly-1 B-buněk k imunitnímu systému. Zvláště je důvodné se domnívat, že Ly-1 B-buňky nejsou zapotřebí pro vývoj IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 nebo IgE odpovědí, jelikož obsahy těchto izotypů v séru nejsou sníženy v depletovaných Ly-1 B-buňkách v myších, podrobených působení anti-IL-10. Podobně zatímco Ly-1 B-buňky jsou esenciální pro citlivost k některým thymus-independentním antigenům typu II, např. fosforylcholinu a αΐ,3-dextranu, jsou nepotřebné pro další, např. TNP-Ficoll a anti-IgM. Nezměněné nebo lehce zvýšené hladiny oběhového IgG3, izotypu, jedinečně spojeného s odpovědí B-bunék na polysacharidové antigeny naznačují, že myši s deficienci Ly-1 B-buněk jsou pravděpodobně schopné reagovat na většinu thymus-dependentních antigenů typu II. Tento aspekt u myší, podrobených působení anti-IL-10, je snadno odlišuje od xid myší, spontánně vzniklých z imunodeficientního kmene myší, který také postrádá Ly-1

-30CZ 281796 B6

B-buňky, ale který nereaguje na všechny thymus-independentní antigeny typu II.

Dále nám získání informací o příspěvku Ly-1 B-buněk k imunitnímu systému myší, podrobených působení IL-10, dovolilo zhodnotit konsekvence zvýšení TNFa in nivo. Naše -výsledky jasně ilustrují, že in vivo antagonismus IL-10 vede k podstatnému zvýšení hladiny sérového TNFa. Zatímco nepříznivé konsekvence zvýšení TNFa byly zváženy detailně viz výše (např. septický šok, cerebrální malárie atd.), mělo by také být zváženo mnoho příznivých konsekvencí zvýšení TNFa. To zahrnuje předvedení přímého protinádorového účinku, expanze granulocyt-monocyt hemopoietických rodů, radioprotekce a protekce proti některým autoimunním a infekčním onemocněním na animálních modelech. Tyto úvahy proto implikují IL-10 antagonisty jako kandidáty pro terapeutické intervence při léčbě těchto onemocnění. Potvrdili jsme tento návrh na mnoha příkladech, kde anti-IL-10 protilátky mohou podstatně zpozdit rozvoj autoimunity u lupus-prone NZB/W myší.

V souhrnu se předkládaný vynález vztahuje k použití IL-10 nebo IL-10 antagonistů k regulaci produkce monokinů, které jsou hlavními mediátory při mnoha onemocněních. IL-10 a jeho antagonisté zapříčiňují značnou supresi monokinů, jako je TNFa, a tak poskytuji ochranu proti nežádoucím zánětovým reakcím, jako je bakteriální sepse, toxický šok, revmatická artritida a psonaza. Podobně IL-10 antagonisté budou zvyšovat hladinu monokinů jako je TNFa, který naopak může sloužit jako protinádorové agens a v poskytování radioprotekce a protekce proti některým autoimunitním a infekčním nemocem.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady slouží k ilustraci předkládaného vynálezu. Vybrané vektory a hostitelské systémy, stejně jako koncentrace reagencií, teploty a hodnoty dalších variabilních parametrů, jsou uvedeny za účelem ilustrace v předloženém vynálezu a nelze je považovat za jeho omezení.

Přiklad 1. Exprese lidského IL-10 v bakteriích

Syntetický gen lidského IL-10 byl složen z mnoha chemicky připravených fragmentů dvouvláknových DNA za vytvoření expresního vektoru, nazvaného TAC-RBS-hIL-10. Klonování a exprese byly provedeny ve standardním bakteriálním systému, např. E. coli K-12 kmeni JM101, JM103 nebo podobných, popsaných Viera a Messing v Gene, 19, 259-268 (1982). Digesce restrikčni endonukleázou a ligazové reakce byly většinou provedeny podle standardních protokolů, např. Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982), Sambrook a kol. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) a Ausubel a kol. (1987 a periodické dodatky) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York, které jsou v tomto dokumentu citovány. Pro preparaci malých množství plazmidů byla použita metoda v alkalickém prostředí. Pro preparaci velkých množství plazmidů byla použita modifikovaná metoda v alkalickém prostředí, kde byly nukleové kyseliny z čištěného lyzátu sráženy přidáním stejného množství izopropanolu. Srážení studeným 2,5 M octanem amonným byla použita pro odstranění

-31CZ 281796 B6

RNA ještě před rovnovážnou hustotní centrifugací v chloridu česném za detekce etidium bromidem.

K filtrační hybridizaci byly použity filtrační kroužky Whatman 540, které byly použity k vytáhnutí kolonií, které byly lyžovány a fixovány intenzivním působením vždy po dobu 2 minut 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl, 1 M Tris-HCl pH=8,0, 1,5 M NaCl a zahřátý na 80 ’C po dobu 30 minut. Hybridizace byly provedeny v systému 6xSSPE, 20% formamid, 0,1% dodecylsulfát sodný (SDS), 100 μg/ml E. coli tRNA a .100 μg/ml Coomassie Brilliant Blue G-250 (Βίο-Rad) při 42 ‘C po dobu 6 hodin za použití ³²P kinázou značených syntetických DNA. (20xSSPE byl připraven rozpuštěním 174 g NaCl, 27,6 g NaH₂PO₄.9H₂O a 7,4 g EDTA v 800 ml vody. pH bylo upraveno na 7,4 NaOH. Objem byl doplněn na 1 1 a roztok sterilizován autoklávováním.) Filtry byly promyty dvakrát (15 min, lab. teplota) lxSSPE, 0,1% SDS. Po autoradiografii (Fuji RX film) byly vybrány pozitivní kolonie přiřazením znovuvzrostlých kolonií k modře zbarveným koloniím na filtrech. DNA byly sekvenována dideoxymetodou, Sanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 74, 5463 (1977). Templáty pro dideoxyreakce byly bud jednovláknové DNA relevantních oblastí reklonovaných do M13mp vektorů, např. Messing a kol. Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), nebo dvouvláknové DNA připravené minialkalickou metodou a denaturované 0,2 M NaOH (5 min, lab. teplota) a precipitované z 0,2 M NaOH, 1,43 M octanu amonného přídavkem dvou objemů etanolu. DNA byly syntetizována fosforamiditovou metodou použitím Applied Biosystems 380A syntetizátorů. Syntéza, odchránéní, štěpení a purifikace (7 M močovina PAGE, eluce, chromatografie na DEAE-celulóze) byla provedena, jak je popsáno v manuálu k syntetizátoru 380A.

Komplementární vlákna syntetických DNA ke klonování (400 ng každé) byla smíchána a fosforylována polynukleotid kinázou v objemu 50 ml. Tato DNA byla ligována s 1 mg vektoru DNA, štěpena příslušnými restrikčními enzymy a ligace byla provedena v objemu 50 μΐ za lab. teploty od 4 do 12 hodin. Podmínky pro fosforylaci, štěpení restrikčními enzymy, polymerázovou reakci a ligaci byly popsány (Maniatis a kol., uvedeno výše). Kolonie byly testovány na IacZ+ (bylo-li žádoucí) na miskách s L agarem, doplněným o ampicilin, izopropyl-l-thio-beta-D-galaktosid (IPTG) (0,4 mM) a 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galaktopyranosid (X-gal) (40 μσ/ιηΐ).

Vektor TAC-RBS byl konstruován pomocí DNA-polymerázy začleněním do jednoduchého BamHI místa plazmidu pDR540 s tacP místem (Pharmacia). Ten byl pak ligován do nefosforylovaných syntetických oligonukleotidú (Pharmacia), které tvořily dvouvláknový fragment kódující konsensus místo vázající ribozom (RBS, GTAAGGAGGTTTAAC). Po ligaci byla směs fosforylována a religována s Sstl linkerem ATGAGCTCAT. Tento komplex byl pak štěpen Sstl a EcoRI a fragment o velikosti 173 bp byl izolován elektroforézou na polyakrylamidovém gelu (PAGE) a klonován do pUC19 (Pharmacia) s vystřiženým místem EcoRI-Sstl (jak je popsáno níže). Sekvence polylinkerových oblastí RBS-ATG finálního konstruktu (nazvaného TAC-RBS) jsou popsány v U.S. patentu 5 017 691, který je zde uveden jako reference.

-32CZ 281796 B6

Syntetický gen IL-10 byl vložen do plazmidu pUC19 v osmi krocích. V každém kroku inzerty bez delece a/nebo inzerty mohly být detekovány po klonování přítomným genem lacZ (a) pUC19 v kostře s ATG startovním kodonem, vloženým v kroku 1. Klony, obsahující deleční a/nebo inzerční změny, byly testovány na modré zbarvení kolonií na L-ampicilinových miskách, obsahujících X-gal a IPTG. Alternativně mohou být sekvence inzertů snadno potvrzeny v každém kroku za použití univerzálního sekvenačního primeru při preparacích plazmidových DNA v malých množstvích.

V kroku 1 byl vektor TAC-RBS štěpen Sstl, poté byl podroben působení T4 DNA polymerázy (jejíž 3' exonukleázová aktivita umožňuje štěpení 3’ přečnívajících vláken Sstl štěpů za vzniku fragmentů s tupými konci) a po deaktivaci T4 DNA polymerázy byl vektor štěpen EcoRI za vzniku 173 bp fragmentu. Tento fragment obsahuje oblast TAC-RBS a má tupý konec na ATG startovním kodonu a EcoRI štěp na opačném konci. Nakonec byl izolován 173 bp TAC-RBS fragment.

V kroku 2 byl smíchán fragment TAC-RBS, izolovaný v kroku, s plazmidem pUC19, štěpeným EcoRI/KpnI a syntetickým fragmentem 1A/B, který (viz níže) má tupý konec na jednom konci a střídavě uspořádaný konec, odpovídající KpnI štěpu, na svém antiparalelním konci. Tento KpnI konec sousedí s antiparalelním BstEII místem. Fragmenty byly ligovány za vzniku pUC19 kroku 2.

V kroku 3 byl smíchán fragment 2A/B a 3A/B (viz níže) s plazmidem pUC19, izolovaným v kroku 2 (po amplifikaci a purifikaci), štěpeným BstEII/Smal, a ligován za vzniku pUC19 kroku 3. Antiparalelní konec fragmentu 3A/B obsahuje extra báze, které tvoří tupý konec Smál místa. Tyto extra báze byly štěpeny v kroku 4. Také fragmenty 2A/B a 3A/B mají 9 komplementárních reziduálních jednovláknových konců, které anelují po smíchání a ponechávají paralelní BstEII štěp 2A/B fragmentu a antiparalelní tupý konec 3A/B fragmentu pro ligaci do pUC19.

V kroku 4 byl plazmid pUC19, izolovaný v kroku 3 (po amplifikaci a purifikaci), štěpený AfIII/Xbal, repurifikován a smíchán se syntetickým fragmentem 4A/B (viz níže) a ligován za vzniku pUC19 kroku 4.

V kroku 5 byl plazmid pUC19, izolovaný v kroku 4 (po amplifikaci a purifikaci), štěpený Xbal/Sall, smíchán se syntetickým fragmentem 5A/B (viz níže) a ligován za vzniku pUC19 kroku 5. Střídavě uspořádaný konec Sall fragmentu 5A/B je eliminován štěpením Hpal v kroku 6.

V kroku 6 byl plazmid pUC19, izolovaný v kroku 5 (po amplifikaci a purifikaci), štěpený Hpal/Pstl, smíchán se syntetickým fragmentem 6A/B (viz níže) a ligován za vzniku pUC19 kroku 6.

V kroku 7 byl plazmid pUC19, izolovaný v kroku 6 (po amplifikaci a purifikaci), štěpený Clal/Sphl, smíchán se syntetickým fragmentem 7A/B (viz níže) a ligován za vzniku pUC19 kroku 7.

V kroku 8 byl plazmid pUC19, izolovaný v kroku 7 (po amplifikaci a purifikaci), štěpený MluI/HindlII, smíchán se syntetickými fragmenty BA/B a 9A/B (viz níže) a ligován za vzniku finál

-33CZ 281796 B6 ního konstruktu. Finální konstrukt byl vložen do E. coli K-12 kmene JM101, např. dostupného z ATCC pod číslem 33876, standardními technikami. Po napéstování byl protein extrahován z JM101 buněk a zředěné extrakty byly testovány na biologickou aktivitu. Sekvence fragmentů jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1. Malá písmena označují báze odlišné od bází ve stejném místě nativní sekvence.

AGCCCAGGCC AGGGCACCCA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC ACTTCTCGGGTCCGG TCCCGTGGGT CAGACTCTTG TCGACGTGGG TGAAGCCAGGtAACC ggtac

GGTCCaTTGG C

Fragment 1A/B

GtAACCTGCC TAACATGCTT CGAGATCTCC GAGATGCCTT CAGCAGACGG ATTGTACGAA GCTCTAGAGG CTCTACGGAA GTCGTGAGTGAAGACTTTCTTT

CTCACTTC

Fragment 2A/B

CAAATGAAGG ATCAGCTGGA CAACTTGTTc TtAAG

TGAAAGAAA GTTTACTTCC TAGTCGACCT GTTGAACAAg AaTTC

Fragment 3A/B

GAGTCCTTGC TGGAGGACTT TAAGGGTTAC CTGGGTTGCC AAGCCCTCAGGAACG ACCTCCTGAA ATTCCCAATG GACCCAACGG TTCGGTTGTCTGAGA TGATCCAGTT TTAt

AACAGACTCT ACTAGGTCAA AATaGAtC

Fragment 4A/B

CTaGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC CAAGACCCAG ACATCGAtCTCCTCC ACTACGGGGT TCGACTCTTG GTTCTGGGTC TGTAGAAGGCGCATG TtAACg

TTCCGCGTAC AaTTGcagct

Fragment 5A/B

AACTCCCTGG GGGAGAACCT GAAGACCCTC AGGCTGAGGC TACGGTTGAGGGACC CCCTCTTGGA CTTCTGGGAG TCCGACTCCG ATGCCCGCTGTCATC GATctgca

GCGACAGTAG CTAg

Fragment 6A/B

CGATTTCTTC CCTGTCAAAA CAAGAGCAAG GCCGTGGAGC AGGTGTAAAGAAG GGACAGTTTT GTTCTCGTTC CGGCACCTCG TCCACAAGAAcGCgT gcatg

TTCTTgCGcA c

-34CZ 281796 B6

Fragment 7A/B

CGCGTTTAAT AATAAGCTCC AAGACAAAGG CATCTACAAA GCCATAAATTA TTATTCGAGG TTCTGTTTCC GTAGATGTTT CGGTAGAGTGAGTTT GAC

CTCA

Fragment 8A/B

ATCTTCATCA ACTACATAGA AGCCTACATG ACAATCTCAAACTG TAGAAGTAGT TGATGTATCT TCGGATGTAC TGTTAGAAGATACGA AACTGA

CTTCTATGCT TTGACTtcga

Fragment 9A/B

Příklad 2. Exprese vIL-10 v COS 7 opičích buňkách

Gen, kódující otevřený čtecí rámec pro vIL-10, byl amplifikován polymerázovou řetězovou reakcí za použití primerů, které dovolují pozdější inzerci amplifikovaného fragmentu do vektoru pcD (SRa), štěpeného EcoRI, popsaného v Takebe a kol. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 466-472. Kódující vlákno vloženého fragmentu je uvedeno níže (otevřený čtecí rámec je vypsán velkými písmeny).

GACCTAAGAG ATGCCTTCAG TCGTGTTAAA ACCTTTTTCC AGACAAAGGA CGAGGTAGAT AACCTTTTGC TCAAGGAGTC TCTGCTAGAG GACTTTAAGG ATGCCAGGCC CTGTCAGAAA TGATCCAATT CTACCTGGAG GAAGTCATGC CACAGGCTGA AACCAGGAC CCTGAAGCCA AAGACCATGT CAATTCTTTG GGTGAAAATC TAAAGACCCT ACGGCTCCGC CTGCGCAGGT GCCACAGGTT CCTGCCGTGT GAGAACAAGA GTAAAGCTGT GGAACAGATA AAAAATGCCT TTAACAAGCT GCAGGAAAAA GGAATTTACA AAGCCATGAG TGAATTTGAC _ATTTTTATTA ACTACATAGA AGCATACATG ACAATTAAAG CCAGGTGAg

Klony, nesoucí inzert ve správné orientaci, byly identifikovány expresí vIL-10 a/nebo elektroforézou restrikčních fragmentů po štěpení. Jeden takový vektor, nesoucí vIL-10 gen, byl označen jako pBCRFl (SRa) a byl uložen v ATCC pod číslem 68193. pBCRFl (SRa) byl amplifikován v E. coli MC1061, izolován standardními technikami a použit k transfekci opičích buněk COS 7 podle následujícího postupu. 1 den před transfekci bylo asi l,5xl0⁶ opičích buněk COS 7 vyseto na jednotlivé 100 mm misky v Dulbecco’s modifikovaném Eagle médiu (DME), obsahujícím 5% fetální telecí sérum (FCS) a 2 mM glutamin. K transfekci byly z misek odebrány COS 7 buňky: nejprve byly inkubovány s trypsinem, dvakrát promyty sérem bez DME a suspendovány v séru bez DME do výsledné koncentrace 10! buněk/ml. 0,75 ml alikvot byl smisen s 20 μg DNA a přenesen do sterilní 0,4 cm elektroporační kyvety. Po 10 minutách bylo na buňky působeno pulzy o 200 V, 960 mF v Βίο-Rad Gene Pulser aparátu. Po dalších 10 minutách byly buňky vyjmuty z kyvety a přidány ke 20 ml DME, obsahujícím 5% FCS, 2 mM glutamin, penicilín, streptomycin a gentamycin. Směs byla rozdělena do čtyř 100 mm misek na pěstování tkáňových kultur. Po 12-24 hodinách při 37 °C, 5% C0₂ bylo médium nahrazeno jednoduchým médiem, obsahujícím jen 1% FCS, a inkubace pokračovala dalších 72 hodin při 37 ’C, 5%

-35CZ 281796 B6

C0₂, po které bylo médium odebráno a testováno na schopnost inhibovat IFNt syntézu.

ml alikvoty čerstvě izolovaných periferních krevních leukocytů (PBL) (asi 2xl0⁶ buněk/ml) byly inkubovány při 37 °C s fytohemo-agglutininem (PHA) (100 ng/ml) v médiu, sestávajícím z (i) 90% DME, doplněného 5% FCS a 2 mM glutaminem, a (ii) 10% supernatantu z COS 7 buněk, předem transfekovaných pBCRFl (SRa). Po 24 hodinách byly buňky a supernatanty odebrány pro testování na přítomnost bud IFNt mRNA nebo IFNt proteinu. Kontroly byly stanovovány identicky mimo 10% supernatant, který byl z COS 7 kultur předem transfekován plazmidem, nesoucím nepřibuzný cDNA inzert. Vzorky, testované na vIL-10, vykazovaly okolo 50% inhibice IFNt syntézy vzhledem ke kontrolám.

Příklad 3. Exprese vIL-10 v Escherichia coli

Gen, kódující následující maturovaný vIL-10, může být exprimován v E. coli.

Thr

Asp

Gin

Cys

Asp

Asn

Phe

Pro

Gin

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Phe

Gin

Thr

Lys

Asp

Glu

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Glu

Ala

Lys

Asp

HÍS

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Ile

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Ile

Lys

Ala

Arg.

cDNA inzert pBCRFl (SRA) byl zaklonován do plazmidu M13, kde byl dvakrát změněn místně řízenou mutací: nejprve tvorbou Clal místa na 5' konci kódující oblasti pro maturovaný vIL-10 polypeptid, a poté tvorbou BamHI místa na 3' konci kódující oblasti pro maturovaný vIL-10 polypeptid. Mutovaná sekvence pak byla snadno vložena do expresního vektoru TRPC11, popsaného níže.

TRPC11 vektor byl konstruován ligací syntetického konsensus RBS fragmentu do Clal linkerů (ATGCAT) a klonováním výsledných fragmentů do pMTllhc štěpeného Clal (který byl předtím modifikován, aby obsahoval Clal místo). pMTllhc je malý (2,3 kilobáze) vysoce kopírovaný, AMP^R, TET^S plazmid odvozený z pBR322, který nese EcoRI-HindlII polylinkerovou oblast pVX plazmidu. (pVX je popsán v Maniatis a kol. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1982). Ten byl modifikován, aby obsahoval Clal místo, a to štěpením pMTllhc EcoRI a BamHI, zaplněním výsledných 5' lepivých konců a ligací s Clal linkerem (CATGATC), tím se znovu obnovila místa EcoRI a BamHI a odstranila místa Smál a Clal. Jeden transformant z TRPC11 konstruktu měl tandemovou RBS sekvenci vedle Clal místa. Jedno z Clal míst a část druhé kopie RBS sekvence byla odstraněna štěpením plazmidu Pstl, působením Bal31 nukleázy, štěpením EcoRI a působením T4 DNA polymerázy v přítomnosti všech čtyř deoxynukleotidových trifosfátů. Výsledné 30-40 bp fragmenty byly získány PAGE a klonováním do pUC12 štěpeného Smál. 248 bp trpP-fragment z E.

-36CZ 281796 B6 coli nesoucí EcoRI místo připravený z pKCIOl (popsaný v Nichols a kol. (1983) Methods in Enzymology 101, 155-164, Academie Press, N.Y.), byl pak klonován do EcoRI místa za vzniku TRPC11 konstruktu, který je zobrazen na obr. 1. TRPC11 byl použit jako vektor pro vIL-10. Nejprve byl štěpen Clal a BamHI, purifikován, a pak smíchán ve standardním ligačním roztoku s Clal-BamHI fragmentem plazmidu M13, obsahujícím nukleotidovou sekvenci, kódující maturovaný BCRF1. TRPC11, obsahující inzert, nazvaný jako TRPC11-BCRF1, byl namnožen v E. coli K12 kmene JM101, dostupném např. z ATCC pod číslem 33876.

STUDIE A. Rozdílné vlivy interleukinu-4 a -10 na syntézu interferonu-τ, -vyvolanou interleukinem-2, a lymfokinem aktivované zabij ecí aktivity.

Data, uvedená v této části, byla publikována v práci Hsu a kol. (1992) Inťl Immunology 4, 563-569, která je zde uvedena jako reference.

Shrnutí

Kultura lidských periferních krevních mononukleárních buněk (PBMC) s interleukinem-2 (IL-2) stimuluje syntézu cytokinů a generování lymfokinem aktivované zabijecí (LAK) aktivity. IL-4 a IL-10 (IL-10 je faktor, inhibujicí syntézu cytokinů, CSIF) inhibují syntézu IFNt a TNFa lidskými PBMC vyvolanou IL-2. Ale na rozdíl od IL-4 neinhibuje IL-10 žádnou proliferaci PBMC a čerstvých přirozených zabíječů (NK buňky), vyvolanou IL-2, ani LAK aktivitu, vyvolanou IL-2. Navíc IL-4 inhibuje syntézu IFNt čerstvými purifikovanými NK buňkami vyvolanou IL-2, zatímco inhibiční efekt IL-10 je zprostředkován CD14+ buňkami (monocyty/makrofágy). IL-10 inhibuje syntézu TNFa monocyty nebo monocyty s NK buňkami, ale ne samotnými NK buňkami. Tyto výsledky ukazují, že IL-4 a IL-10 působí na NK buňky přes odlišné cesty, a že IL-2-indukované syntézy cytokinů a LAK aktivita jsou regulovány různými mechanismy.

IL-10 (CSIF) inhibuje syntézy cytokinů, tak jako IFNt, myšími a lidskými T-lymfocyty a monocyty/makrofágy. Inhibiční vliv na syntézu cytokinů T-buňkami je nepřímý, zprostředkovaný monocyty/makrofágy jako antigen-prezentujícími buňkami. Myší a lidský IL-10 (mIL-10, hIL-10) jsou homologní k viru Epsteina-Baarové otevřeného čtecího rámce BCRF1 (virový IL-10, vIL-10), který také vykazuje IL-10 aktivitu na myších a lidských buňkách. Již dříve bylo pozorováno, že vIL-10 inhiboval IL-2-indukovanou syntézu IFNt lidskými PBMC. Protože NK buňky byly popsány jako hlavni zdroj IFNt v PBMC stimulovaných IL-2, byly studovány účinky hIL-10 a vIL-10 na syntézu cytokinů a LAK aktivitu vyvolanou IL-2 spolu se srovnáváním těchto cytokinů s IL-4, známým inhibitorem LAK aktivity. Data ukazují, že IL-4, hIL-10 a vIL-10 inhibují syntézy IFNt a TNFa PBMC stimulovanými IL-2, ale jen IL-4 inhibuje syntézy IFNt purifikovanými NK buňkami. Navíc IL-10 neinhibuje, na rozdíl od IL-4, LAK aktivitu vyvolanou IL-2. Tyto výsledky podporují teorii, že IL-4 a IL-10 působí na NK buňky různými mechanismy, a že syntézy cytokinů a LAK aktivita vyvolané IL-2 jsou regulovány odlišně.

-37CZ 281796 B6

Příklad Al. Účinky IL-4 a IL-10 na syntézy cytokinů, vyvolané IL-2, a LAK aktivitu

Cytokiny.

Lidský rekombinantní IL-2 (rIL-2) byl šetrně připraven standardními procedurami podle S. Zurawského nebo zakoupen (Cetus, Emeryville, CA). Lidský rIL-4 získán od Schering-Plough Research. Lidský rIL-Ιβ byl získán od Biosource International (Camarillo, CA). Rekombinantní hIL-10 a vIL-10 byly použity jako COS7 transfekční supernatanty a supernatanty z transfekcí s irelevantní cDNA nebo bez cDNA byly použity jako kontroly. Viz Viera a kol. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 1172-1176, a Hsu a kol. (1990) Science 250, 830-832, které jsou zde uvedeny jako reference. IFNt a TNFa (Endogen, Boston, MA) byly měřeny ELISA testy. Produkce cytokinů za absence IL-2 byla pod hranicí citlivosti IFNt a TNFa ELISA testů, které byly 0,3 ng/ml a 12 pg/ml.

Buněčné linie.

Daudi (Burkittův lymfom) buňky byly získány z Schering-Plough (Lyon, Francie). COLO (karcinom kolonu) buňky, získané od Dr. Lewis Laniera, byly kultivovány v médiu RPMI 1640 s 5% FCS.

Protilátky.

Monoklonální protilátky proti povrchovým antigenům leukocytů (CD3, CD4, CD5, CD14, CD16, CD19, CD56) byly získány od

Becton-Dickinson (San Jose, CA). Protilátky na magnetické depleční experimenty (CD3, CD4, CD5, CD14, CD19) byly připraveny z ascitových tekutin myší SCID, do kterých byla injikována příslušná buněčná linie. Neutralizační protilátky anti-IL-4 a anti-IL-10 byly popsány např. v Chretien a kol. (1989) J. Immunol. Methods 117, 67-81, nebo Yssel a kol. J. Immunol. Methods 72, 219-227, které jsou zde uvedeny jako reference.

Preparace a kultivace PBMC.

Lidské PBMC byly izolovány ze zdravých dárců centrifugací ve Ficoll-Hypaque a kultivovány v 10⁶/ml ub rIL-2 (200 jednotek/ml) s nebo bez dalších cytokinů v Ysselově médiu s 1 % lidského Ab+ séra. Kultury byly pěstovány 5 dní v 24- (nebo 96-) jamkových miskách, ze kterých byly získány supernatanty. PBMC od různých dárců se lišily svojí kapacitou produkce IFNt a TNFa po stimulaci IL-2.

Purifikace buněk.

PBMC byly promyty a inkubovány v nádobách na pěstování tkáňových kultur po 40 minut při 37 ’C. Adherované buňky byly shromážděny pomocí gumové stěrky. Neadherované buňky byly odstraněny, peletovány a naneseny na sloupec z nylonové vlny a inkubovány 40 minut při 37 ’C. Po eluci ze sloupce byly buňky peletovány a resuspendovány v 30% Percollu s 10% FCS/PBS a převrstveny 40% Percollem. Následovala centrifugace 30 minut za laboratorní teploty. Z fázového rozhraní byly získány velké granulám! lymfocyty a dvakrát promyty. Tyto buňky byly inkubovány s protilátkou anti-CD56 (Becton-Dickinson, San Jose, CA) 30 minut při 4 ’C, promyty, a před FACS tříděním barveny kozím-anti-myším-FITC (Jackson Immunoresearch, Avondale, PA). CD56+ buňky obsahovaly asi 35-50% buněk, které byly tříděny. Tříděné buňky byly větší než

-38CZ 281796 B6

99,5% CD56+ při reanalýze. 9xl0⁴ purifikovaných NK buněk bylo smíseno s 3xl0⁴ adherovaných buněk nebo T buněk v konečném objemu 100 ml a kultivováno s IL-2 s nebo bez dalších cytokinů.

Purifikované NK buňky a monocyty z téhož dárce byly získány následovně: PBMC byly přes noc inkubovány s ovčími červenými krvinkami a rosetující ”E+ (CD2+) a nerosetující E- buňky byly separovány centrifugací ve ficoll-hypaque gradientu. E+ buňky byly podrobeny téže purifikační proceduře, jak bylo popsáno pro PBMC (viz výše) k získání purifikovaných NK buněk. E-buňky byly inkubovány postupně s anti-CD14 mAb (LeuM3) a kozím-anti-myšim IgG značeným FITC a CD14+ buňky byly tříděny na FACStar plus. Čistota těchto buněk byla vyšší než 98%. 10⁵ purifikovaných NK buněk bylo smícháno s 10⁴ čistých monocytů ve 100 ml a kultivováno samostatně nebo s IL-2 a dalšími doplňky, popsanými výše.

Altennativně byly NK buňky a monocyty nabohaceny magnetickou selekcí, a pak tříděny: PBMC byly nejprve inkubovány s monoklonálními protilátkami anti-CD3, -CD4, -CD5 a anti-CD19 k obarvení T a B-bunék. Po dvojím promytí PBS byly přidány magnetické částice, potažené kozím-anti-myším IgG (Dynabeads M-450, Dynal lne., Great Neck, NY) k odstranění T a B-buněk, potažených protilátkami, magnetickou selekcí. Výsledné nabohacené NK buňky a monocyty byly barveny anti-CD56-PE a anti-CD14-FITC a CD56+ a CD14+ buňky byly izolovány třídičem buněk. Čistota dvou populací roztříděných buněk byla větší než 98,5%.

Stanovení cytotoxicity.

PBMC byly inkubovány s 200 U/ml IL-2 (10⁶ buněk/ml) po 3 dny v Ysselově médiu s 1 % lidského AB+ séra. Kultury byly kultivovány v 1-ml jamkách 24-jamkové misky Linbro (Flow Laboratories, McLean, VA). Po kultivační periodě byly buňky odebrány, dvakrát promyty a použity jako efektorové buňky v ⁵¹Cr vylučovacím stanovení. Viz práce Spits a kol. (1988) J. Immunol. 141. 29-, která je zde uvedena jako reference. 1000 cílových buněk, značených ⁵¹Cr (COLO nebo Daudi), bylo smícháno s různými počty efektorových buněk v Iscoveho médiu s 0,25% BSA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) v 96-jamkových miskách ve tvaru U. Misky byly centrifugovány 5 minut při 50 x g, a pak inkubovány 4 hodiny při 37 “C ve vlhké atmosféře 5% CO₂· Vzorky byly shromážděny a počítány v gamma počítači (LAB, Bromma, Sweden).

Rekombinantní hIL-10, vIL-10 a hIL-4 byly testovány na jejich účinnost při syntéze IFNt a TNFa a na LAK aktivitu, vyvolanou IL-2 v PBMC. PBMC byly kultivovány v 200 U/ml rIL-2 bud s rIL-4 (200 U/ml) nebo COS7 supernatanty, obsahujícími hIL-10, vIL-10 nebo bez cytokinů (placebo) po dobu 5 dnů, po kterých byla měřena syntéza cytokinů. Syntéza IFNt a TNFa indukovaná IL-2 v kulturách, obsahujících hIL-10, vIL-10 nebo IL-4, byla podstatné inhibována (obr. 2A, 2B).

Výsledek získaný s IL-4 potvrzuje pozorováni, že IL-4 inhibuje IL-2-indukovanou expresi IFNt mRNA a proteinu. Inhibice syntézy cytokinů IL-4 i IL-10 je závislá na dávce a je vratná

-39CZ 281796 B6 blokováním anti-hIL-4 a anti-hIL-10 monoklonálních protilátek, ale ne isotypovou kontrolou imunoglobulinů (obr. 2C, 2D).

stanovována LAK aktivita proti buňkám Burkittova a karcinomu kolonu linie COLO, které jsou , ale ne čerstvými NK buňkami. LAK akbuňkám, vyvolaná IL-2, byla inhibována a byla nezměněna nebo jenom hIL-10 a vIL-10 (obr. 3A). primárně zprostředkována COLO buňkám že cytotoxicita, zprostředtímto cytokinem zvýšena.

zabíjeny LAK buňkami proti Daudi a COLO kulturách, obsahujících IL-4, zvýšena v kulturách s LAK aktivita buňkami. To, že je xw, a.<= LAK aktivita proti indikovalo, NK buňkami, nebyla

T-buňky mohou zabíjet Daudi buň, že IL-10 stimuloval IL-2-indukovanou cytotoxicitu proti Daudi buňkám za simultánního blokování

Byla také lymfomu linie Daudi účinné tivita jen v lehce

IL-2 2-indukovaná

CD56(Leul9)+ NK nebyla inhibována IL-10, kovaná aktivovanými

Ale protože aktivované CD3+ gd+ ky, bylo možné gd+ T-bunék proti Daudi buňkám za simultánního IL-2-indukované NK aktivity proti těmto cílovým buňkám.

K určení fenotypu anti-Daudi LAK buněk, indukovaných v PBMC, kultivovaných s IL-2 a hIL-10, byly tříděny populace CD56+ a CD56- pomocí FACS a testovány na cytotoxicitu proti Daudi buňkám. Obr. 3B ukazuje značnou LAK aktivitu v populaci CD56+ pouze v přítomnosti IL-2. Zatímco IL-4 a IL-10 vykazují inhibici syntézy IFNt a TNFa, vyvolanou IL-2, jen IL-4 inhibuje cytotoxicitu, vyvolanou IL-2 aktivovanými NK buňkami, přítomnými v PBMC.

Přiklad A2. IL-10 neinhibuje syntézu IFNt ani proliferaci IL-2-stimulovaných purifikovaných NK buněk.

Testy proliferace.

Buňky byly rozděleny v počtu 10⁵ buněk/jamku do 96-jamkové kulaté misky a inkubovány v a bez přítomnosti cytokinů 4 dny v konečném objemu 200 μΐ/jamku. Nato bylo do každé jamky přidáno 10 μΐ 1 mCi roztoku ³H-thymidinu. Po 6 hodinách byly kultury shromážděny a bylo provedeno scintilační měření inkorporované radioaktivity.

Hlavní podíl syntézy IFNt v PBMC, vyvolané IL-2, je odvozen z NK buněk spíše než z T-buněk. Proto byl účinek hIL-10, vIL-10 a IL-4 na IFNt syntézu, vyvolanou IL-2, testován na FACS-purifikovaných (čistota >99,5%) NK buňkách. IL-4 inhiboval v těchto buňkách sekreci IFNt, vyvolanou IL-2. Naopak ani hIL-10 ani vIL-10 nepotlačovaly syntézu IFNt v purifikovaných NK buňkách (obr. 4A). Dále IL-4 značně inhiboval proliferaci PBMC a purifikovaných NK buněk, vyvolanou IL-2, zatímco IL-10 neměl žádný vliv na proliferaci, zprostředkovanou IL-2 (obr. 4B).

Oproti IL-4 neúčinkuje IL-10 na NK buňky přímo, ale inhibuje schopnost monocytu vysílat kostimulační signál. Tento závěr nejvíce podporují účinky IL-10 na produkci IFNt , vyvolanou IL-2. Jak bylo řečeno, preparace doplňkových buněk neprodukovaly IFNt. Ačkoliv stimulované Nk buňky produkovaly značná množství IFNt bez doplňkových buněk (obr. 4A, 5A a 5B), přídavek buněk, adherujících se na plastik a purifikovaných CD14+ buněk k purifikovaným NK buňkám měl za následek velké zvýšení syntézy IFNt. Nepřítomnost přímého účinku IL-10 na NK buňky (obr. 4A a 4B) dává tušit, že IL-10 inhibuje produkci IFNt, vyvolanou IL-2, svým účinkem na

-40CZ 281796 B6 monocyty. Stejně tak je inhibice syntézy cytokinů T-buňkami účinkem IL-10 zprostředkována monocyt/makrofág doplňkovými buňkami.

Příklad A3. Monocyty zprostředkovávají inhibici IL-2-stimulované syntézy IFNt a TNFa NK buňkami vyvolané IL-10

To, že syntéza IFNt byla inhibována IL-10 v kulturách PBMC, ale ne čistými NK buňkami, naznačuje, že tento účinek IL-10 byl zprostředkován doplňkovými buňkami. Za účelem prozkoumání těchto doplňkových buněk byly metodou třídění CD56+ buněk purifikovány NK buňky z nízkohustotní buněčné frakce, získané centrifugací v percollovém gradientu, nebo z T-, B- nebo monocyt-depletovaných PBMC, a byly smíseny s buňkami, adherujícími se na plastik, nebo s vysokohustotní buněčnou populací (98% T buňky) z percollového gradientu. Přídavek adherujících buněk k NK buňkám silně zvýšil produkci IFNt NK buňkami, vyvolanou IL-2. Tento stimulační efekt adherujících buněk byl blokován IL-10 (obr. 5A). Populace adherujících buněk sama neprodukuje detekovatelné hladiny IFNt jako odpověd na IL-2. Naopak frakce, obsahující T-buňky, nevykazovala žádný účinek na produkci IFNt NK buňkami, vyvolanou IL-2, a nezprostředkovávala inhibici produkce IFNt účinkem IL-10 (obr. 5A).

Buňky, adherující se na plastik, jsou nabohaceny monocyty, ale mohou obsahovat i jiné populace buněk. Za účelem potvrzení, že monocyty zvyšovaly produkci IFNt, vyvolanou IL-2, a zprostředkovávaly i její inhibici účinkem IL-10, byly tříděním purifikovány a kultivovány NK buňky a CD14+ monocyty v přítomnosti IL-2 a IL-10. Obr. 5B ukazuje, že přídavek purifikovaných monocytů k NK buňkám zvyšoval produkci IFNt , vyvolanou IL-2, a že IL-10 inhiboval tento nárůst.

Kvalitativně podobné výsledky byly pozorovány pro syntézu TNFa Obr. 5C ukazuje, že - podle očekávání - NK buňky produkovaly detekovatelný TNFa jako odpověď na IL-2. CD14+ buňky produkují TNFa nezávisle na IL-2. IL-10 inhibuje produkci TNFa monocyty v přítomnosti (obr. 5C) i nepřítomnosti IL-2. Oproti tomu nebyla syntéza TNFa NK buňkami inhibována IL-10. Stimulace NK a CD14+ buněk dohromady měla za následek podstatné zvýšení produkce TNFa, než bylo pozorováno pro každé buňky zvlášť, a toto zvýšení bylo blokováno IL-10.

Monocyty a jejich produkty podstatně zvyšovaly produkci IFNt, vyvolanou IL-2, klidovými NK buňkami (obr. 5B). Některé monokiny, jako IL-1 a TNFa, byly použity za různých podmínek jako kostimulátory syntézy IFNt lidskými a myšími NK buňkami. To, že IL-10 inhibuje syntézu monokinů, jako jsou IL-1, IL-6 a TNFa, monocyty/makrofágy, stimulovanými LPS nebo IFNt, naznačuje, že zde popsané účinky IL-10 nastaly v důsledku IL-10-inhibující produkce kostimulačních molekul doplňkovými buňkami. Supernatanty adherujících buněk (obsahující hlavně monocyty) byly zkoumány z hlediska zvýšení produkce IFNt purifikovanými buňkami, stimulovanými IL-2, zatímco supernatanty adherujících buněk, kultivovaných v přítomnosti IL-10, postrádají tuto kapacitu i v případě deplece IL-10. Zda je tato aktivita supernatantu přičítána veškerému kostimulačnímu efektu doplňkových buněk, není jasné. Bylo pozorováno, že IL-Ια a IL-10, ale ne IL-6 nebo TNFa, kostimulují

-41CZ 281796 B6 produkci IFNt NK buňkami, vyvolanou IL-2. Ale přídavek až do 1000 U/ml IL-1 neobrací inhibiční účinek IL-10 na syntézu IFNt nefrakcionovanými PBMC, vyvolanou IL-2. Proto existuje možnost, že v tomto systému funguje jedna nebo více přídavných aktivit, nebo že IL-10 vyvolává syntézu sekundárního faktoru, inhibujícího syntézu cytokinu NK buňkami.

Studie B. IL-10 inhibuje syntézu cytokinu lidskými monocyty: autoregulační role IL-10, produkovaného monocyty.

Data, uvedená v této části, byla již publikována v práci: de Waal Malefyt a kol. (1990) J. Exptl. Med. 174, 1209-1220, která je zde uvedena jako reference.

Shrnutí

Tato část demonstruje, že lidské monocyty, aktivované LPS, jsou schopné produkovat vysoké hladiny IL-10, předtím označeného jako CSIF v této souvislosti. IL-10 byl detekovatelný 7 hodin po aktivaci monocytů a maximální hladiny produkce IL-10 byly pozorovány po 24 až 48 hodinách. Tyto kinetické efekty ukazovaly, že produkce IL-10 lidskými monocyty nastala relativné pozdě ve srovnání s produkcí IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa a G-CSF, jež byly všechny vylučovány ve vysokých hladinách 4 až 8 hodin po aktivaci. Produkce IL-10 monocyty, aktivovanými LPS, byla, podobně jako IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF a G-CSF, inhibována IL-4. Dále IL-10, aktivovaný IFNt , LPS nebo kombinacemi LPS a IFNt, přidaný k monocytům na počátku kultivací, silně inhiboval produkci IL-la, IL-10, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF a G-CSF na úrovni transkripce. vIL-10, který má v lidských buňkách podobné biologické aktivity, také inhiboval produkci TNFa a GM-CSF monocyty s následnou LPS aktivací. Aktivace monocytů účinkem LPS v přítomnosti neutralizujícího anti-IL-10 mAbs, která měla za následek produkci větších množství cytokinů vzhledem k účinku samotného LPS, ukazuje, že endogenně produkovaný IL-10 inhiboval produkci IL-la, IL-10, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF a G-CSF. Navíc IL-10 vykazoval autoregulační účinky, protože silně inhiboval syntézu mRNA v monocytech aktivovaných LPS. Dále byl endogenně produkovaný IL-10 shledán odpovědným za redukci exprese v třídě II MHC, následovanou aktivací monocytů LPS. Společné tyto výsledky ukazují, že IL-10 má důležité regulační účinky na imunologické a zánětové odpovědi díky své kapacitě regulačního snižování exprese třídy II MHC a inhibici produkce prozánětových cytokinů monocyty.

Nedávno byl identifikován a zaklonován gen myšího interleukinu-10 (IL-10), což bylo založeno na znalosti jeho CSIF aktivity. V myším systému byl IL-10 produkován CD4+ Th2 systémem a inhiboval produkci cytokinů, zvláště IFNt , Thl klony. Inhibice produkce cytokinů účinkem IL-10 byla pozorována jen za použití makrofágů, ale ne B-buněk, jako antigen-prezentujících buněk (APC). Navíc k jeho aktivitě se IL-10 ukázal jako pleiotropní a schopný účinkovat na různé typy buněk včetně thymocytů, cytotoxických T-bunék, žírných buněk, B-buněk a makrofágů.

Lidský IL-10 také vykazuje CSIF aktivitu. Produkce IFNt a GM-CSF PBMC aktivovanými PHA nebo anti-CD3 mAbs byla silné inhibována účinkem IL-10 a tato inhibice nastala na úrovni transkripce. Lidský i myší IL-10 má extenzivní sekvenční homologii k předchozímu necharakterizovanému rámci v genomu viru

-42CZ 281796 B6

Epsteina-Baarové, BCRF-1. Exprese tohoto rámce poskytovala aktivní protein nazvaný virální IL-10 (vIL-10), který sdílí většinu vlastností s lidským a myším IL-10 včetně CSIF aktivity na myší a lidské T-buňky.

Lidský IL-10 a vIL-10 jsou schopné inhibovat odpovědi antigen-specifických proliferujících T-buněčných odpovědí redukcí antigen-prezentující kapacity lidských monocytů via regulační snížení molekul třídy II MHC. Výsledky zde uvedené ukazují, že lidské monocyty jsou schopny produkovat vysoké hladiny IL-10 s následnou aktivací LPS, a že tato produkce nastává relativně pozdě ve srovnáni s dalšími monokiny. Navíc je zde uvedeno, že IL-10 silné inhibuje produkci prozánětových cytokinů, např. IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 a TNFa a hematopoietických růstových faktorů GM-CSF a G-CSF, monocyty aktivovanými LPS, IFNt nebo LPS a IFNt. Endogenně produkovaný IL-10 nemá jen autoregulační účinky na produkci IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF a G-CSF monocyty, ale také efekt regulačního snížení své vlastní produkce a exprese třídy II MHC na monocyty ve smyslu autoregulace. Tyto výsledky indikují, že IL-10 má důležité regulační účinky na imunologické a zánětlivé odpovědi.

Příklad Bl. IL-10 je produkován lidskými monocyty.

Izolace a kultivace lidských monocytů.

Lidské periferní krevní monocyty byly izolovány z 500 ml krve normálního dárce. Mononukleární buňky byly izolovány hustotní centrifugací v separátoru krevních částic, následovala frakcionace na lymfocyty a monocyty metodou centrifugační elútriace. Preparace monocytů vykazovala více než 95% čistoty (podle nespecifického esterázového barvení) a obsahovala více než 98% buněk, schopných samostatné existence. Monocyty byly kultivovány v Ysselově médiu, obsahujícím lidský serumalbumin (HSA) s % přídavkem tepelně inaktivovaného lidského AB+ séra. Toto médium bylo prosto všech endotoxinů, jak bylo zjištěno Limulus amebocytovým lyzátovým testem (< 0,2 ng/ml endotoxinů). Monocyty byly kultivovány v koncentraci 4x10° buněk/ml v teflonových pytlích (Jansen MNL, St Niklaas, Belgium), které zabraňovaly adhezi buněk. Po kultivaci byly monocyty odebrány a byla přímou imunofluorescencí analyzována povrchová buněčná exprese, nebo byla analyzována lymfokinová genová exprese metodou Northern a PCR analýzy. Navíc byly shromážděny supernatanty z monocytových kultivaci a byla stanovena produkce IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa, GM-CSF a G-CSF s následnou aktivací těchto buněk. Schopnost samostatné existence buněk po kultivaci vždy překračovala 95%, jak bylo určeno metodou za použití trypanové modři.

Reagencie.

Rekombinantni hIL-10 a vIL-10 byly exprimovány v E. coli jako glutathion-S-transferázové fúzní proteiny, purifikovány a podrobeny digesci s thrombinem k odstranění N-koncové fúzní části, a tak byl získán aktivní hIL-10 a vIL-10. Purifikovaný lidský rIL-4 a rlFNi byl získán od Schering-Plough Research (Bloomfield, NJ). LPS (E. coli 0,127: B8) byl získán z laboratoří Difco (Detroit, MI). Produkce neutralizačního anti-IL-10 mAb 19F1 proti vIL-10 byla zvýšena a efektivně neutralizovala lidský i virální IL-10.

-43CZ 281796 B6

Stanovení lymfokinů.

Produkce IL-Ια a TNFa monocyty byla měřena specifickými lymfokinovými ELISA testy, získanými z Endogen (Boston, MA). Spodní hranice detekovatelnosti těchto ELISA testů činily 50 pg/ml nebo ¹⁰ pg/ml. Produkce IL-Ιβ byla stanovena specifickým lymfokinovým ELISA testem, získaným z Cistron (Pine Brook, NJ). Citlivost tohoto testu činila 20 pg/ml. Hladiny IL-6 byly stanoveny specifickými lymfokinovými ELISA testy, získanými z Genzyme (Boston, MA). Citlivost tohoto testu činila 0,313 pg/ml. IL-8 a G-CSF specifické ELISA testy byly získány z R a D Systems (Minneapolis, MN) a použity ke kvantitativní produkci IL-8a G-CSF. Citlivosti těchto testů činily 4,7 pg/ml nebo 7,2 pg/ml. Produkce GM-CSF byla stanovována specifickým lymfokinovým ELISA testem. Citlivost tohoto testu činila 50 pg/ml. Produkce IL-10 byla stanovována specifickým ELISA testem, v kterém byl použit anti-IL-10 mAb (JES 9D7) jako povrchová protilátka, a dále anti-IL-10 mAb (JES 3-12G8) jako značená protilátka. Citlivost tohoto testu činila ⁵⁰ pg/ml.

IL-10 je produkován aktivovanými klony lidských T buněk, aktivovanými periferními krevními T a B-buňkami, liniemi B-buněk, transformovaných EBV a monocyty. Vysoce purifikované lidské monocyty, izolované centrifugační elutriací, produkovaly IL-10 s následující aktivací účinkem LPS. Navíc se ukázalo, že tyto lidské monocyty byly schopné produkovat vysoké hladiny IL-6, TNFa a GM-CSF (obr. 6). Kinetická měření produkce cytokinů LPS-aktivovanými monocyty indikovala, že produkce IL-10 těmito monocyty nastávala relativně pozdě. To bylo detekováno nejprve v supernatantech, odebraných po 7,5 hodině, ale maximální produkce nastala 20 až 48 hodin po aktivaci. Naopak produkce TNFa a IL-6 nastala rchle po aktivaci a dosáhla maxima 3,5 a 7,5 hodin po aktivaci (obr. 6). Produkce GM-CSF byla také detekována nejprve 7,5 hodiny po aktivaci monocytů LPS, ale v tomto případě bylo dosaženo maximálních hladin produkce po 20 hodinách. Studie odpovědi v závislosti na množství podávané látky ukazovaly, že aktivace monocytů LPS o koncentraci 10 ng/ml již vedla k značné produkci IL-10, zatímco maximální syntéza IL-10 byla pozorována při koncentraci LPS 1 μg/ml. (obr. 7).

Přiklad B2. IL-10 inhibuje produkci cytokinů lidskými monocyty.

Ukázalo se, že IL-10 inhibuje produkci IFNt a GM-CSF aktivovanými PBMC. Za účelem stanovení účinků IL-10 na produkci cytokinů monocyty byly po dobu 24 hodin účinkem LPS aktivovány vysoce purifikované monocyty bez nebo v přítomnosti IL-10. Navíc byly monocyty aktivovány LPS po 24 hodin v přítomnosti IL-4 (100 U/ml) nebo neutralizačního anti-IL-10 mAb 19F1, jehož produkce proti vIL-10 byla zvýšena, ale efektivně neutralizovala hIL-10 a vIL-10. Produkce cytokinů byla stanovena po 24 hodinové aktivaci v supernatantech těchto kultur použitím specifických cytokinových ELISA testů. Jak je uvedeno v tabulce Bl, monocyty, inkubované v samotném médiu při 37 ’C, neprodukovaly IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa, GM-CSF a G-CSF. Za těchto podmínek byly syntetizovány jen značné hladiny IL-8. Aktivace monocytů účinkem LPS (1 ug/ml) způsobila produkci vysokých hladin IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa, GM-CSF a G-CSF. Je zajímavé, že IL-10

-44CZ 281796 B6 inhiboval produkci IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa, GM-CSF a G-CSF v různém rozsahu (tab. Bl). Nejsilnější inhibiční účinky IL-10 byly pozorovány na produkci IL-Ία, TNFa, GM-CSF a G-CSF, která byla blokována z 80 až 100%. Inhibice produkce IL-Ιβ a IL-6 byla méně výrazná, kdežto syntéza IL-8 účinkem IL-10 byla jen lehce zvýšena.

Tabulka Bl

Účinky exogenního IL-10, endogenního IL-10 a IL-4 na produkci cytokinů lidskými monocyty

	IL-la ng/ml	IL-Ιβ	IL-6	IL-8	IL-10	TNFa	GM-CSF	G-CSF
Médium 37 'C	0	0	0	150	0	0	0	0
LPS	1.2	44.8	261.7	479	30.6	21.2	0.6	90
LPS+IL-4	0	9.7	135.7	418	11.9.	5.1	0	17.5
LPS+IL-10	0	13.6	78	434	ND	2.6	0	21.1
LPS+aIL-10	2.7	50.6	323	672	ND	47.6	5.5	110

Lidské monocyty, izolované centrífugační elutriací, byly kultivovány v koncentraci 4x10° bunék/ml v teflonových sáčcích a aktivovány LPS (1 mg/ml) bez nebo v přítomnosti IL-10 (100 U/ml), IL-4 (100 U/ml) nebo anti-IL-10 mAb 19F1 (10 μg/ml) po 24 hodin a produkce cytokinů byla stanovena v supernatantech specifickými cytokinovými ELISA testy. ND: neprováděno.

Příklad B3. IL-10 také inhibuje produkci cytokinů monocyty, aktivovanými IFNt.

IL-10 také inhiboval produkci cytokinů monocyty, aktivovanými IFNt nebo kombinacemi IFNt a LPS. Obr. 8 ukazuje, že IFNt v optimálních koncentracích 100 U/ml byl obecně méně potentním induktorem sekrece cytokinů, než byl LPS v optimálních koncentracích 1 μg/ml. Dále je demonstrováno, že účinky kombinací IFNt a LPS na produkci cytokinů monocyty byly nalezeny obecně aditivními. Nejsilnější inhibiční účinek IL-10 byl pozorován na produkci IL-Ία, TNFa a GM-CSF TNFa a GM-CSF sekrece byla potlačena z více než 90%, při následné aktivaci monocytů optimálními koncentracemi LPS a IFNt. Ačkoli byly za optimálních stimulačních podmínek pozorovány značné inhibiční účinky na sekreci IL-Ιβ a IL-6, byla jejich inhibice výraznější, když byly monocyty stimulovány suboptimálními koncentracemi LPS buď bez nebo v přítomnosti optimálních koncentrací IFNt.

Příklad B4. vlL-10 inhibuje produkci cytokinů monocyty.

vIL-10 a hIL-10 mají podobné účinky na lidské buňky. Obr. 9 ukazuje, že IL-10 a vIL-10 podobně inhibovaly produkci TNFa a GM-CSF monocyty. IL-10 a vIL-10, přidané v koncentracích 100 U/ml, vykazovaly značné inhibiční účinky na produkci TNFa a GM-CSF monocyty s následnou aktivací LPS (1 μg/ml). Tyto inhibiční účinky IL-10 a vIL-10 na sekreci TNFa a GM-CSF byly obráce

-45CZ 281796 B6 né v případě inkubací, prováděných v přítomnosti mAb 19F1 (obr. 9), což demonstruje specifitu inhibičních účinků vIL-10. Aktivace monocytú LPS v přítomnosti IL-10 nebo vIL-10 a neutralizačního anti-IL-10 mAb způsobila i zvýšenou produkci TNFa a GM-CSF, což indikuje, že endogenně produkovaný IL-10 potlačil produkci těchto cytokinú.

Inhibiční účinky endogenně produkovaného IL-10 na produkci cytokinú monocyty byly dále vyhodnoceny kvantifikací hladin cytokinů, produkovaných monocyty, aktivovanými LPS v přítomnosti neutralizačního anti-IL-10 mAb. V tabulce B1 je uvedeno, že působeni LPS a anti-IL-10 na monocyty mělo za následek vyšší produkci cytokinú ve srovnáni s aktivací samotným LPS, což indikuje, že endogenně produkovaný IL-10 kromě jeho inhibičních účinků na produkci TNFa a GM-CSF blokuje produkci IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa a G-CSF. Největší inhibiční účinky byly nalezeny u produkce IL-Ια, TNFa a GM-CSF, zatímco inhibiční účinky na expresi IL-Ιβ, IL-6, IL-8 a G-CSF byly sice značné, ale nižší. Souhrnně tyto výsledky indikují, že exogenně a endogenně produkované IL-10 inhibují produkci IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF a G-CSF monocyty, aktivovanými LPS.

Přiklad B5. IL-4 inhibuje produkci IL-10 aktivovanými monocyty.

IL-4 inhibuje produkci IL-Ιβ, IL-6 a TNFa monocyty, aktivovanými LPS. K určení, zda IL-4 také inhiboval produkci IL-10, byly monocyty aktivovány LPS po 24 hodin, a pak byla měřena sekrece IL-10. Tab. B1 ukazuje, že IL-4 silně inhiboval produkci IL-10 monocyty, aktivovanými LPS. Kromě inhibičních účinků IL-4 na sekreci IL-Ιβ, IL-6 a TNFa vykazuje IL-4 schopnost efektivního blokování GM-CSF a G-CSF. Ale jak bylo pozorováno u IL-10, byla produkce IL-8 jen slabě zvýšena účinkem IL-4. V souhrnu tato data indikují, že IL-4 a IL-10 mají srovnatelné inhibiční účinky na produkci cytokinú aktivovanými monocyty.

Příklad B6. Inhibice produkce monokinů nastává na úrovni transkripce.

Proby.

Pro Northern analýzu byly použity následující proby. 600 bp Smál fragment (nt 1299-1899) z ρΰϋ-ύΤσΓβ, viz Yokota a kol. (1987) v Lymphokines (Goeddel a Webb, eds.) 13, Academie Press, New York, 1200 bp Pstl fragment z pAL (b-aktin), viz Viera a kol. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 1172-1176, 567 bp

BamHI-Xbal fragment (nt 1-567) z pCD-hIL-6, viz Yokota a kol. (1987), 268 bp HindlII fragment (nt 29-297) z SP64-3-10C (IL-8), viz Schmid a kol. (1987) J. Immunol. 139, 250-, 760 bp

BglII-HindlII fragment (nt 159-919) z pCD-SRa-hIL-10, viz Viera a kol. (1991). Pro Southern analýzu PCR produktů byly použity následující oligonukleotidy: IL-la: 5'-CATGGGTGCTTATAAGTCATC-3' (nt 500-521), viz March a kol. (1985) Nátuře 315, 641-, IL-Ιβ: 5'-CGATCACTGAACTGCACGCTCCGGG-3' (nt 444-469), VÍZ March a kol. (1985) Nátuře, IL-6: 5'-GAGGTATACCTAGAGTACCTC-3’ (nt 510-531), viz Hirano a kol. (1986) Nátuře 324, 73-, IL-8:

5’-TAAAGACATACTCCAAACCTT-3' (nt 200-221), viz Schmid a kol.

-46CZ 281796 B6 (1987) J. Immunol., IL- 10:

5'-CAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGT TTGACATC-3' (nt 429-498), viz Viera a kol. (1991) Proč Acad. Sci. USA, TNFa: viz Pennica a kol.

5'-CCGGCGTCTCCTGAACCT-3' Proč. Nati. Acad.

5'-CTGAACCCTAAGGCCAACCGTG-3' (1986) J. Mol. Evol.

5'-GCCCTGG-AAGGGATCTCCCCC-3' (nt (1986) Nátuře 319, 415z GENBANK, c/o Intelligenetics, lne., Menlo Park, CA, z BCCG databáze a University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin. Biosyntéza oligonukleotidů je popsána v knize Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, která je zde , viz Viera a kol 5'-GGCGTGGAGCTGAGAGATAAC-3’

312, Lee 4360-4364 viz

11(1984) (nt 150-168) Sci (nt

Nature , viz USA 82 250-272) 23 , 400-421)

Nati (nt 500-521) 724-, a kol f

Alonso a viz Nagata

GM-CSF: (1985) aktin: a kol. G-CSF: a kol.

t

Oligonukleotidové sekvence jsou dostupné oligonukleotidů je popsána A Practical Approach, uvedena jako reference.

Izolace mRNA a Northern analýza.

Celková RNA byla izolována z 20xl0⁶ monocytů guanidinium thiokyanát-CsCl procedurou. Pro Northern analýzu bylo separováno 10 μg celkové RNA na vzorek podle velikosti na 1% agarozovém gelu, obsahujícím 6,6% formaldehydu, přeneseno na membránu z nylonu Nytran (Schleicher a Schuell, Keene, NH) a hybridizováno s probami, a poté radioaktivně označeno na vysokou specifickou aktivitu

Q (> 10° cpm/mg). Filtry byly hybridizovány, promyty za dodržení přísných pravidel a vyvinuty.

PCR analýzy.

Jeden mikrogram celkové RNA byl zpětně transkribován za použití oligo(dT)12-18 P^ri^meru (Boehringer Mannheim, Indianapolis,

IN) a AMV reverzní transkriptázy (Boehringer Mannheim) v reakci o objemu 20 μΐ. Dva mikrolitry reverzní transkriptázy (ekvivalent k 10 ng celkové RNA) byly použity přímo pro každou amplifikační reakci. Podmínky pro PCR byly následující, objem reakce 550 μΐ, 25 nmol každého primeru, 125 μΜ každého dGTP, dATP, dCTP a dTTP (Pharmacia, Uppsala, Sweden), 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 1 mg/ml želatiny,

100 μg/ml neacetylovaného BSA a 1 jednotka Vent DNA polymeráza (New England Biolabs, Beverly, IL-la sense primer CATCGCCAATGACTCAGAGGAAG-3’ (nt 302-325), IL-la anti-sense pri5'-TGCCAAGCACACCCAGTAGTCTTGCTT-3’ (nt 770-743), IL-Ιβ sense 5'-CCAGCTACGAATCTCGGACCACC-3' (nt 230-253), primer 5’-TTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAAGTCAGT-3'

IL-6 sense primer 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGC-3' IL-6 anti-sense

CTACATTTGCCGAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3’ (nt 810-777), 5’-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTG-3' (nt 1-21), IL-8

5'-TTATGAATTCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC-3' (nt sense primer IL-10

MA) . 5’-< mer primer anti-sense 896-863), 1-21), 5’primer primer IL-10 323-349), 5’-TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA-3’ 5'-AGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGAC-3' (nt 310-333), mer 5’-TGAGTCGGTCACCCTTCTCCAG-3’ (nt mer 5'-GCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCC-3' (nt 76-100) anti-sense primer 5’-CCTGCTTGTACAGCTCCAGGCGGGT-3’ G-CSF sense primer 5'-GAGTGTGCCACCTACAAGCTTGTGCC-3’

Použité primery byly:

IL-Ιβ (nt (nt primer

IL-8 sense anti-sense 302-269), 5'-ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA-3' (nt anti-sense primer (nt 674-648), TNFa sense primer TNFa anti-sénse pri782-760), GM-CSF sense pri(nt 76-100), GM-CSF (nt 276-250), (nt

-47CZ 281796 B6

233-258), G-CSF anti-sense primer 5’-CCTGGGTGGGCTGCAGGGCAGGGGC-3’ (nt 533-508), β-aktin sense přiměř 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’ (nt 1-20), β-aktin anti-sense primer 5'-GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (nt 548-530), reakce byly inkubovány v přístroji Perkin-Elmer/Cetus DNA Thermal Cycler, nastaveném na 20 cyklů (denaturace 30 sekund při 94 “C, anelace 30 sekund při 55 ’C, extenze 60 sekund při 72 ’C). Reakce byly extrahovány chlorofonmem a na 1% agarozový gel v TAE pufru bylo nanášeno po 40 μΐ vzorků. Produkty byly vizualizovány barvením ethidium bromidem. Poté byly gely denaturovány v 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl, neutralizovány v 10 M acetátu amonném a přeneseny na membrány z nylonu Nytran. Membrány byly prehibridizovány v 6x SSC, 1% SDS, lOx Denhardtově roztoku (0,2% Ficoll, 0,2% polyvinyl pyrrolidon, 0,2% BSA, pentax frakce V) a 200 μg/ml E. coli tRNA (Boehringer Mannheim, FRG) po 4 hodiny při 55 °C. Oligonukleotidové proby (200 ng),specifické pro vnitřní sekvence primerů, použitých v amplifikaci, byly značeny na 5' konci T4 polynukleotid kinázou (New England Biolabs) a t-³²P-ATP (Amersham, Arlington Heigths, IL). Proby byly separovány od neinkorporováných nukleotidů čištěním přes Nick kolonu (Pharmacia, Uppsala, Sweden) a přidány do hybridízační směsi. Po následné hybridizaci 12 hodin při 55 °C byly filtry promyty v 0,lx SSC (lx SSC: 150 mM NaCl, 15 mM citrát sodný pH=7,0) a 1% SDS při laboratorní teplotě a Kodak XAR-5 filmy byly exponovány 1-2 hodiny.

Ke stanovení, ve které úrovni inhiboval IL-10 produkci cytokinů monocyty, byly provedeny komparativní PCR analýzy za použití RNA, izolované z monocytů, aktivovaných LPS bez nebo v přítomnosti IL-10, IL-4 nebo neutralizačního anti-IL-10 mAb po 24 hodin. Data, získaná z tohoto experimentu, jsou uvedena v tab. Bl. mRNA, izolovaná z těchto vzorků, byla reverzně transkribována do cDNA a postupně amplifikována s cytokin specifickými primery. Relativně malý počet cyklů, použitý při amplifikaci, zajišťoval, že množství amplifikované DNA odpovídalo počtu cyklů a korelovalo s množstvím specifické mRNA v původním vzorku. Obr. 10 ukazuje, že za těchto podmínek bylo amplifikováno ekvivalentní množství β-aktin specifické cDNA. Monocyty, inkubované při 4 ’C v samotném médiu po 24 hodin, exprimovaly velmi nízké hladiny IL-8 mRNA. Inkubace těchto buněk při 37 ’C vedla ke zvýšení této exprese, ale neindukovala expresi IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-10, TNFa, GM-CSF a G-CSF mRNA. LPS aktivace vedla k silné expresi IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 a G-CSF mRNA, zatímco TNFa a GM-CSF byly slabě indukovány. Navíc obr. 10 ukazuje, že exprese IL-la, IL-6, TNFa, GM-CSF a G-CSF byla silně inhibována IL-10 a IL-4 na úrovni mRNA, zatímco exprese IL-Ιβ a IL-8 byla jen lehce zvýšena IL-10. Aktivace monocytů LPS v přítomnosti anti-IL-10 mAb vedla k mírnému zvýšeni exprese IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 a G-CSF mRNA, silnému zvýšení syntézy TNFa a GM-CSF mRNA. Úrovně exprese cytokin specifické mRNA a jejich modulace exogenním a endogenním IL-10 nebo IL-4 dobře korelovaly se sekrecí příslušných proteinů, jak je uvedeno v tab. Bl, tzn. že IL-10 a IL-4 inhibovaly expresi cytokinů monocyty, aktivovanými LPS, na úrovni transkripce.

Přiklad B7. IL-10 reguluje IL-10 mRNA, ale ne expresi ΤΟΡβ mRNA v aktivovaných monocytech.

-48CZ 281796 B6

Po zjištění, že lidské monocyty produkují IL-10 relativně pozdě po aktivaci LPS, bylo stanovováno, zda IL-10 může zvýšit endogenní syntézu IL-10 mRNA. Lidské monocyty byly aktivovány LPS bez nebo v přítomnosti IL-10 po 7 hodin a exprese mRNA byla analyzována Northern blotováním. Obr. 11 ukazuje, že IL-10 mRNA byla detekována 7 hodin po aktivaci LPS, a že IL-10 v tomto čase nemá žádné nebo jen minimální inhibiční účinky na expresi IL-10 mRNA. Naopak exprese IL-6 a IL-8 mRNA byla silné inhibována IL-10. Ale v jiných sériích experimentů, kde monocyty byly aktivovány LPS po 24 hodin, IL-10 silně redukoval expresi IL-10 mRNA, jak ukazuje Northern analýza na obr. 12. Navíc obr. 12 ukazuje, že aktivace monocytů LPS v přítomnosti neutralizačního anti-vIL-10 mAb vede k regulačnímu zvýšení exprese IL-10 mRNA během 24 hodin. Tyto výsledky byly potvrzeny PCR analýzou s IL-10 specifickými příměry, protože RNA, použitá v tomto pozdějším experimentu, byla také použita pro PCR analýzy, uvedené na obr. 10. Na obr. 12B je uvedeno, že kvantitativní rozdíly, pozorované u exprese IL-10 mRNA Northern analýzou, korelovaly s výsledky komparativní PCR analýzy. Mnohem citlivější PCR analýza dovolila detekovat i nízké hladiny mRNA, které byly indukovány 24 hodinovou kultivací monocytů v samotném médiu při 37 °C. Tyto výsledky ukazují, že IL-10 má autoregulační účinky na syntézu IL-10 mRNA a v případě, že hladiny mRNA správně odrážejí produkci IL-10 proteinu, také na produkci IL-10 lidskými monocyty. Ale regulační snížení produkce IL-10 nastává v aktivačním procesu dost pozdě. Produkce TGF3 mRNA, která byla exprimována konstitutivně v čerstvě izolovaných neaktivovaných monocytech, nebyla aktivací LPS po 7 nebo 24 hodin zvýšena (obr. 11 a 12). Navíc obr. 11 a 12 ukazují, že hladiny TGF3 mRNA nebyly zvýšeny při aktivacích, prováděných v přítomnosti IL-4, IL-10 nebo neutralizačního anti-IL-10 mAb.

Příklad B8. IL-10 má autoregulační účinky na expresi třídy II MHC monocyty.

Imunofluorescenční analýza.

Buňky (10⁵) byly inkubovány v mikrotitračních miskách s V dnem (Flow Laboratories, McLean, VA) s 10 μ.1 purifikováného mAb (1 mg/ml) po 30 minut při 4 ’C. Po dvou promytích PBS, obsahujícím 0,02 mM azidu sodného a 1% BSA (Sigma, St. Louis, MO), byly buňky inkubovány se značenými FITC F(ab') 2 fragmenty (zředění 1/40) kozí-anti-myší protilátky (TÁGO, lne. Burlingame, CA) po 30 minut při 4 ’C. Po třech dalších promytích byly značené vzorky buněk analyzovány flow-mikrofluorimetrii na FACScan (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Anti MHC třídy II mAb PdV5.2)HLA-DR/DP/DQ), Q5/13 HLA-DR/DP a L243 (HLA-DR) byly popsány výše, viz Koning a kol. (1984) Hum. Immunol. 9, 221-, Quaranta a kol. (1980) J. Immunol. 125, 1421-1425, a Lampson a kol. (1980) J. Immunol. 125. 293-.

IL-10 regulačně snižuje expresi molekul třídy MHC na povrchu buněk lidských monocytů. IL-10 takto reguluje konstitutivní IL-4 nebo IFNt -indukovanou expresi MHC třídy II. Protože monocyty produkují po aktivaci LPS vysoké hladiny IL-10, bylo zkoumáno, zda endogenní IL-10 může inhibovat expresi MHC třídy II monocyty, aktivovanými LPS. Monocyty byly aktivovány různými koncentracemi LPS bez nebo v přítomnosti neutralizačního anti-IL-10 mAb. Obr.

-49CZ 281796 B6 ukazuje, že aktivace monocytů LPS redukuje konstitutivní HLA-DR/DP expresi v těchto buňkách podle těchto závislostí. Ale v přítomnosti neutralizačního anti-IL-10 mAb 19F1 byla pozorována silná indukce exprese HLA-DR/DP. Identické výsledky byly získány s několika HLA-DR nebo HLA-DR/DP specifickým mAb. Tyto výsledky ukazují, že endogenně produkovaný IL-10 autoregulačním způsobem je odpovědný za regulační snižování exprese MHC třídy II u lidských monocytů při aktivaci LPS.

Studie C. IL-10 inhibuje produkci cytokinů aktivovanými makrofágy.

Data, uvedená v této části, byla publikována po Fiorentino a kol. (1991) J. Immunol. 147, 3815-3822, což je zde uvedeno jako reference.

Shrnutí.

IL-10 inhibuje schopnost makrofága, ale ne antigen-prezentujících (APC) B-buněk, stimulovat syntézu cytokinů Thl T buněčnýcl klonů. Byly studovány přímé účinky IL-10 na buněčné linie makrofágů a normálních peritoneálních makrofágů. LPS(nebo LPS a IFNt ) indukovaná produkce IL-1, IL-6 a TNFa proteinů byla značně inhibována IL-10 u dvou linií makrofágů. Ukázalo se rovněž, že IL-10 je po přidání podobných koncentrací potentnéjší inhibitor syntézy monokinů než IL-4. LPS- nebo LPS a IFNt indukovaná exprese IL-Ια, IL-6 nebo TNFa mRNA byla také inhibována IL-10, jak se ukázalo při semikvantitativní PCR analýze a při Northern blot analýze. Inhibice LPS-indukované sekrece IL-6 účinkem. IL-10 byla méně významná u FACS-purifikováných peritoneálních makrofágů, než u jiných linií makrofágů. Ale produkce IL-6 peritoneálními makrofágy byla zvýšena přídavkem anti-IL-10 protilátek, což potvrzuje přítomnost endogenního IL-10 v těchto kulturách. To vede k vrozené redukci syntézy monokinů po aktivaci LPS. Dále se ukázalo, že LPS-stimulované peritoneální makrofágy přímo produkují IL-10, detekovatelný ELISA testy. Bylo zjištěno, že IFNt zvyšuje produkci IL-6 LPS-stimulovanými peritoneálními makrofágy a to vyplývá z jeho suprese produkce IL-10 v této populaci buněk. Kromě těchto účinků na syntézu monokinů IL-10 také indukuje podstatnou změnu v morfologii peritoneálních makrofágů, stimulovaných IFNt. Silný účinek IL-10 na makrofágy, zvláště na úrovni produkce monokinů, indikuje důležitou roli tohoto cytokinů nejen v regulaci odpovědí T-buněk, ale také akutních zánětových odpovědí .

IL-10 byl poprvé popsán jako cytokin, produkovaný klony Th2 T-pomocných buněk, který inhibuje syntézu APC-dependentních cytokinů makrofágů Thl T-pomocnými buňkami a vykazuje pleiotropní účinky na různé další buňky a je produkován dalšími buňkami. Thl buňky vylučují IL-2 a IFNt a preferenčně indukují aktivaci makrofága a přecitlivělost pozdního typu (DTH), zatímco Th2 buňky produkují IL-4 a IL-5 a zajišťují pomoc pro odpovědi B-buněk. Po aktivaci může být každý typ Th buněk schopen regulovat proliferaci a/nebo funkci druhých buněk. Tato křížová regulace je zprostředkována různými cytokiny a nabízí vysvětlení pozorování, že některé protilátky a DTH odpovědi mohou být vzájemně výlučné. IL-10 účinkuje na makrofágy, ale ne na B-buňky. IL-10 inhibuje syntézu cytokinů Thl klony a vykazuje přímý účinek na makrofágy.

-50CZ 281796 B6

Produkty makrofágů, jako jsou IL-1, IL-6 a TNFa, byly implikovány při mnoha zánětových a imunologických odpovědích během infekce nebo zranění tkáně. TNFa a IL-1 jsou endogenní pyrogeny, které navíc způsobují mnoho metabolických změn u mnoha tvpů buněk. Dále jsou IL-1 a IL-6 hlavními induktory syntézy proteinů hepatické akutní fáze. Následující příklady ukazují, že IL-10 inhibuje produkci cytokinů, jako je IL-1, TNFa a IL-6, LPS-aktivovanými makrofágy. IL-10 tedy hraje důležitou roli při aktivaci T-buněk a při zánětlivých odpovědích ovlivněním regulačních funkcí makrofága.

Příklad Cl. IL-10 inhibuje APC funkci různých linií makrofágů.

Cytokiny.

Purifikovaný rekombinantní mlL-Ια byl získán laskavostí P. Lomedico, Hoffman-La Roche, Nutley, NJ. Rekombinantní mIL-2 a mlFNr byly získány od Schering Research, Bloomfield, NJ. Rekombinantní purifikovaný myší IL-6 byl získán laskavostí M. Pearce, DNAX, a byl exprimován v COS 7 buňkách a imunoafinitně purifikován. Myší TNFa byl získán od Genzyme Corporation (Boston, MA). Rekombinantní myší IL-10, získaný transfekcí COS 7 buněk F115 cDNA klonem, viz výše a kontrolní supernatanty z placeba transfekovaných buněk byly použity ve 2% výsledné koncentraci, není-li uvedeno jinak. Alternativně byl rekombinantní myší IL-10, získaný laskavostí W. Danga, exprimován v E. coli a afinitně purifikován za použití SXC2 anti-IL-10 protilátky.

Protilátky.

Byly použity neutralizační monoklonální protilátky (mAb) proti IFNt (XMG1.2) a IL-10 (SXC1), viz Cherwinski a kol.

(1987) J. Expťl Med. 166, 1229-1244, Mosmann a kol. (1990) J.

Immunol. 145, 2938-2945. J5, isotypová kontrola SXC1 byla laskavě provedena R. Coffmanem (DNAX). Monoklonální protilátky k IL-6 (20F3 a 32C11) podle Stárneš a kol. (1990) J. Immunol. 145, 4185-4191 a TNFa (MP6.XT3.il a XT22.11) byly purifikovány J. Abramsem (DNAX). Protilátky, použité pro FACS-třídéní včetně krysího anti-myší B220 (RA3-6B2) viz Coffman a kol. (1981) Nátuře

289, 681-683 a krysí anti-myší Mac-1 (Ml/70) viz Springer a kol. (1978) Eur. J. Immunol. 8, 539-542. Krysí monoklonální protilátka k Fc-gR byla 2.4G2, viz Unkeless a kol. (1979) J. Expťl Med. 150. 580-596.

Média.

Médium pro testy (cRPMI) sestávalo z RPMI 1640 (J. R. Scientific lne., Woodland, CA) s 10% tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem (FCS) (J. R. Scientific lne., Woodland, CA), 0,05 mM 2-ME (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a 10 mM Hepes pufru (Gibco Laboratories, Grand Island, NY). Při kultivaci T buněk byl do cRPMI média přidán rekombinantní mIL-2 (330 U/ml).

Antigeny.

Hemocyanin z přílipek (keyhole limpet, KLH), získaný z Pacific Bio-Marine Laboratories, lne (Venice, CA) nebo Calbiochem. Labs (La Jolla, CA), byl použit v konečné koncentraci 100-500

-51CZ 281796 B6 μ9/πι1 a ovalbumin od Sigma Chemical Co. v konečné koncentraci 1 mg/ml.

Buněčné linie.

Pro testy inhibice syntézy cytokinu byly použity Thl klon, HDK1 (specifický pro I-A^/KLH) viz Cherwinski a kol. (1987) J. Expťl Med., a hybridoma T buněk DO11.10 (specifické pro I-A^d/ovoalbumin) viz Kappler a kol. (1981) J. Expťl Med., 153, 1198-. Pro IL-1 testy podle Suda a kol. J. Immunol. Methods 120, 173-178 byl použit Th2 klon D10.G4.1 (D10), AKR/J anti-conalbumin, získaný od C. Janeway (Yale University, New Hawen, CT) viz Kaye a kol. (1983) J. Expťl Med. 153, 836-856. Všechny klony byly udržovány periodickou stimulací antigenem (Ag) a vystavené působení APC s následnou kultivací v médiu, obsahujícím IL-2, viz Cherwinski a kol. (1987) J. Expťl Med. Klonovaný IG.18.LA linie makrofága (H-2^) byl odvozen z thymových stromálních buněčných kultur a udržován ve 20% supernatantu z L-buněk. Linie makrofága PU5.1 (H-2^) viz Ralph a kol. (1977) J. Immunol. 119, 950-954 byla udržována v cRPMI s 10% FCS. Při použití jako APC byly 1G.18 LA a PU5.1 buněčné linie aktivovány po 24 hodin IFNt (0,5-2 ng/ml). Buněčná linie WEHI.164.13, citlivá na TNFa a TNFP viz Espevik a kol. J. Immunol. Methods 65, 55-63, byla uchovávána v cRPMI/5% FCS.

Imunometrické testy na cytokiny.

Hladiny cytokinů (IL-6, IFNt a CSIF/IL-10) byly měřeny ve dvoumístném sendvičovém ELISA formátu.

Biotesty.

Kolorimetrický MTT proliferační test byl použit pro TNFa (buňky linie WEHI.164.13), pro IL-2 (buňky HT-2) a pro IL-1 (buňky D10), vždy 10⁴ buněk v jedné misce. Aktivity jsou vyjádřeny v U/ml relativně ke známým standardům nebo v pg resp. ng/ml. V každém případě U/ml představuje množství každého cytokinu, které odpovídá 50% maximální odpovědi v biotestu.

Měření indukce a syntézy cytokinů.

1-5X10⁴ Thl, HDK.l buněk nebo DO-11.10 hybridoma T-buněk bylo kombinováno s různými množstvími živých APC bez nebo v přítomnosti antigenů v 96-jamkové mikrotitrační misce s plochým dnem v celkovém objemu 200 μΐ/jamku. Hladiny cytokinů byly měřeny v supernatantech po 24, resp. 48 hodinách.

Stimulace buněčných linií makrofágů.

Buněčné linie makrofágů 1G.18.LA a PU 5.1 byly jemně seškrabány, omyty a resuspendovány v cRPMI/5% FCS v koncentraci 10/ml v 9,5 cm miskách pro tkáňové kultury (Becton Dickinson, NJ) při 37 ’C v atmosféře vzduch/5% C0₂ na 6 hodin pro expresi RNA, nebo na 24 hodin pro detekci cytokinů v supernatantech. Stimulace LPS byla provedena při koncentraci 10 μg/ml nebo v některých případech LPS a IFNt při koncentraci 100 U/ml, v nebo bez přítomnosti IL-10 při koncentraci 200 U/ml nebo u IL-4 při koncentraci 200 U/ml. Supernatanty byly odebrány, centrifugovány (800 x g), před

-52CZ 281796 B6 vlastním testem uskladněny při teplotě -80 ’C a testovány na hladiny IL-1, IL-6 nebo TNFa. Linie makrofágů byly dále stimulovány IFNt po 24 hodin, nebo v některých případech po dalších 24 hodin v přítomnosti Thl klonu, HDK.l a jeho specifického antigenu KLH. V takovém případě byly supernatanty dále koncentrovány za použití AMICON filtnu s membránou o průchodnosti do 10 000 Mr a depletovány od IL-2 a IFNt za použití imunoafinitních kolon. Takové supernatanty a filtráty po koncentraci byly testovány na schopnost kostimulovat antigen-specifickou a APC-dependentní syntézu cytokinů Tgl. Dále, při použití makrofágů jako APC byly buněčné linie makrofágů 1G18.LA a PU5.1 nejprve aktivovány po 20-24 hodin v přítomnosti IFNt o koncentraci 0,5-2 ng/ml.

IL-10 inhibuje schopnost APC stimulovat produkci IFNt Thl buňkami při použití peritoneálních nebo slezinných makrofágů nebo makrofágů linie 1G18.LA jako APC. IL-10 je také účinný na linii makrofága PU5.1, který má jiný původ než 1G18.LA (obr. 14), ačkoli stimulace, dosažená použitím buněčné linie PU5.1 jako APC pro Thl buňky, nebyla tak vysoká jako u 1G18.LA linie. Obr. 14B ukazuje, že 1G18.LA linie také může zprostředkovávat antigen-specifickou indukci produkce IL-2 Thl klonem i D011.10 ovalbumin-specifickými hybridoma T-buňkami. Obě stimulace byly podstatně inhibovány IL-10.

Příklad C2. IL-10 vyvolává morfologické změny v IFNt -stimulovaných peritoneálních makrofázích.

Purifikace a stimulace peritoneálních makrofágů.

Peritoneální buňky byly získány injikováním a odebráním 7 ml studeného CRPMI/10% FCS a makrofágy byly tříděny na základě Mac-1 a B222 (makrofágy jsou Mac-1^{+ bri}g^bt/ B220”). Buňky byly stimulovány 10 μg/ml LPS bez nebo v přítomnosti IL-10, anti-IL-10 monoklonálních protilátek nebo IFNt. Supernatanty byly shromážděny po inkubaci 8xl0⁵ buněk/ml 20 hodin v atmosféře 5% CO2 při 37 “C. Supernatanty byly testovány na TNFa a IL-6 metodou enzymových imunotestů.

FACS- purifikované peritoneální makrofágy byly inkubovány s IFNt bez nebo v přítomnosti IL-10 po různou dobu. Supernatanty pak byly odstraněny, buňky vysušeny vzduchem, fixovány a barveny Wright's-Giemsa. Jak je uvedeno na obr. 15, IL-10 vyvolává zakulacování buněk a deadherenci, což může mít význam v souvislosti s inhibicí APC funkce makrofágů.

Příklad C3. IL-10 regulačně snižuje produkci biologicky aktivních nebo cytokinů, vylučovaných aktivovanými makrofágovými liniemi.

Předchozí pozorování dávají tušit, že IL-10 má přímý účinek na schopnost makrolágů fungovat jako APC a aktivovat syntézu Thl cytokinů. Byl testován přímý účinek IL-10 na produkci monokinů těmito makrofágy. Supernatanty z makrofágů stimulovaných IFNt, LPS nebo IFNt a LPS bez nebo v přítomnosti IL-10 byly testovány na hladinu cytokinů. Tam, kde to bylo možné, byl IL-4 použit jako

-53CZ 281796 B6 kontrola, protože se ukázalo, že tento faktor inhibuje produkci cytokinů aktivovanými makrofágy. Stimulace makrofágových linií samotným IFNt nevyvolala detekovatelné hladiny monokinů, IL-1, IL-6 nebo TNFa v supernatantech. Naopak LPS nebo LPS a IFNt vyvolaly značné hladiny těchto cytokinů (obr. 16). Test D10.G4.1, použitý k detekci IL-1 a provedený za absence Conconavalinu A (ConA), nedetekoval jiné cytokiny, exprimované makrofágy. Schopnost makrofágových linií 1G.18.LA a PU5.1 produkovat IL-1 bioaktivitu po indukci LPS byla značně inhibována (obr. 16). IL-10 také vykazuje velmi silný inhibiční účinek na produkci TNFa, vyvolanou LPS nebo IFNt a LPS v supernatantech obou linií makrofágů, jak bylo stanoveno pomocí biotestu WEHI.164.13 (ukázalo se, že všechny aktivity těchto supernatantů jsou přiřadítělně k TNFa za použití specifické blokující protilátky). Podobně IL-10 inhibuje produkci proteinů IL-6 liniemi makrofágů, stimulovaných IFNt a LPS a/nebo indukovaných LPS, což bylo měřeno metodou enzymového imunotestu pro IL-6. Ve všech experimentech měl testovaný IL-10 mnohem větší inhibiční účinek na produkci monokinů, indukovaných LPS nebo IFNt a LPS, než IL-4 (na úrovni proteinů) .

Příklad C4. IL-10 regulačně snižuje expresi cytokinů mRNA aktivovanými makrofágy.

Extrakce a analýza.

Celková buněčná RNA byla extrahována z makrofágů metodou za použití guanidinium izothiokyanátu. Koncentrace RNA byla měřena absorpcí při 260 nm. RNA blotová analýza byla popsána v práci Moore a kol. (1990) Science 248, 1230-1234, PCR reverzní transkripce RNA byla popsána v práci O'Garra a kol (1990) Intn’1 Imunol. 2, 821-832. Specifické množství každého vzorku cDNA (zředění 1/20 cDNA) bylo amplifikováno 2,5 U termalázy (Thermus aquaticus DNA polymeráza) (IBI) v cyklovacím přístroji Cetus/Perkin-Elmer za následujících podmínek: 94 °C tání, 30 sekund, 55 “C anelace, 30 sekund a 72 C extenze, 1 minuta za použití specifických primerů pro HPRT, TNFa a IL-6, jak je zde uvedeno:

5’-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3’ (nt 422-444),

5·-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3’ (nt 598-575), *-GCTTTCCCTGGTTAAGCAGTACAGCCCC-3¹ (nt 543-570), TNFa 4499-4519), 5865-5845), TNFa

5801-5821), IL-6 1520-1540), IL-6 anti-sense: 6093-6075), IL-6 proba: 1547-1570).

HPRT HPRT senTNFa anti-sense:

proba: sense:

HPRT sense anti-sense proba se: 5·-GCGACGTGGAACTGGCAGAAG-3’ (nt

5·-GGTACAACCCATCGGCTGGCA-3’ 5’-CAGTTCTATGGCCCAGACCCTC-3· 5'-CCAGTTGCCTTCTTGGGACTG-3’ 5’-GGTAGCTATGGTACTCCA-3'

5'-GTGACAACCACGGCCTTCCCTACT-3' (nt (nt (nt (nt (nt

Všechny primery pokryly sekvence tohoto genu. Citlivost a speciifita byly dále zvýšeny probováním dot-bloty amplifikovaných produktů s ³²P, τ -ATP značených vnitřních oligonukleotidů k amplifikovanému produktu. Radioaktivní bloty byly kvantifikovány použitím Ambis Image scanneru a vizualizovány expozici RTG filmu. V každém případě byla vložena standardní křivka P388D1 RNA k zajištění reproducibility testu a z koncového dot-blotu byly získány jednotky, relativní k pg vložené RNA. Navíc byl použit vnitřní standard enzymu pro HPRT k zajištění toho, že bylo použi

-54CZ 281796 B6 to přesně stejné množství RNA, a že všechny vzorky byly reverzně transkribovány a amplifikovány PCR se stejnou účinností.

RNA byla extrahována z makrofágových linií 1G18.LA a PU5.1 6 hodin po stimulaci LPS nebo LPS a IFNt bez nebo v přítomnosti IL-10 nebo IL-4. Blot analýza 10 μg celkové RNA odhalila, že IL-10 regulačně snižuje expresi TNFa RNA, indukovanou LPS nebo LPS a IFNt, v obou liniích (obr. 17), ačkoli v menším rozsahu. To bylo potvrzeno použitím metody semikvantitativní PCR pro analýzu reverzně transkribované RNA z obou linií. Vložením standardní křivky pro každý cytokin (jak je popsáno v tab. Cl) bylo možné získat jednotky, relativní k pg celkové standardní RNA, reprezentované v každém bodu, a tak vyjádřit data číselně. Tab. Cl ukazuje, že IL-10 a IL-4 inhibují expresi TNFa, indukovanou LPS nebo LPS a IFNt v 1G18.LA linii. To je nejlépe znázorněno hodnotami, získanými z lineární části standardní křivky a legenda v tab. Cl vysvětluje metodu, použitou k odvození číselných hodnot. Analýza exprese RNA linií PU5.1 v odpovědi LPS nebo LPS a IFNt byla provedena použitím téže metody a ukazuje, že exprese IL-6 a TNFa byla také inhibována IL-10 (tab. C2).

Tabulka Cl

Inhibice LPS-indukované exprese TNFa v buněčné linii makrofága 1G18.LA Účinkem IL-10 a IL-4^a

Stimulus	cDNA Zřeď, faktor	0 cpm *pg RNA	IL-4	*pg RNA	IL-10	*pg RNA
cpm	cpm	cpm	cpm
LPS+IFNr	1:9	1260 300	1987	2682	Plateau	1232	1034	200
	1:27	984 160	601	769	110	713	589	90
	1:81	722 110	110	332	57	411	312	50
LPS	1:9	1114 210	210	1587	330	1387	1068	200
	1:27	896 120	120	403	60	460	271	45
	1:81	472 72	72	403	60	310	220	33

^aBuněčné linie makrofága 1G18.LA byly stimulovány jako u obr. 3. Supernatanty byly po 6 hodinách odstraněny a k buňkám byl pro preparaci RNA přidán roztok guanidinium izothiokyanátu. 1 μg celkové RNA z buněčné linie makrofága 1G18.LA byl reverzně transkribován v objemu 20 μΐ. Bylo provedeno zředění cDNA (viz obr.) a 1 μΐ každého roztoku byl amplifikován PCR s primery, specifickými pro HPRT (interní standard) nebo pro TNFa. 10 μΐ amplifikované cDNA bylo dot-blotováno a dále probováno s každou z radioaktivně značených prob (vnitřních k primeru). Odpovídající signály byly měřeny přístrojem Ambis Image Scanner. Pro každé zředění byly hrubé hodnoty cpm pro TNFa standardizovány (*cpm) podle korekčního faktoru (*) získaného z HPRT cpm relativně k 0 vzorku (tj. bez IL-10 nebo IL-4). Libovolné jednotky, relativní k titraci pozitivních kontrol a korigované na jejich HPRT obsah ( pg RNA/dot), potom mohou být přiřazeny za pomoci standardní křivky (není uvedena).

-55CZ 281796 B6

Tabulka C2

Mechanismy účinku IL-10

IL-10 Inhibuje LPS-indukovanou expresi RNA, kódující IL-6 a TNFa v buněčné linii makrofága PU5.1^a

Testovaná RNA	Stimulus LPS+IFN-r	LPS
pro cytokin	+0 cpm	*pgRNA	+IL-10 4	+0 cpm	*pgRNA	+IL-10 *
cpa	pgRNA	cpm	pgRNA
TNF-c	1031	370	587	80	1864	730	469	23
IL-6	589	1000	207	700	108	90	27	44

^aVzorky PU5.1 byly upraveny, jako bylo popsáno v předchozí tabulce a analyzovány hladiny HPRT, TNFa a IL-6. Hrubé hodnoty cpm byly nejprve korigovány vzhledem k hodnotám HPRT vzorků stejně jako v předchozí tabulce. Za použití standardních křivek pro známá množství v kontrolách pozitivních na TNFa nebo IL-6, libovolné jednotky *pg RNA na dot blotu byly přiřazeny stejně jako v předchozí tabulce. Hodnoty pro TNFa byly získány z 27-násobného zředění a IL-6 z 9-násobného zředění 1 μΐ cDNA (1 μg RNA byl reverzně transkribován ve výsledném objemu 20 μΐ).

Příklad C5. Regulační snížení produkce proteinu IL-6 peritoneálními makrofágy, aktivovanými LPS.

Bylo prokázáno, že IL-10 inhiboval APC funkci peritoneálních makrofágů (tříděných na základě Mac-l¹⁺ (bright), b220“) k Thl buňkám a tyto makrofágy byly dále testovány na produkci TNFa a IL-6 v reakci na LPS. TNFa nebyl detekovatelný v supernatantech (LPS-stimulovaných FACS tříděných) peritoneálních makrofágů o hustotě 7xl0⁵ bunék/ml. V kontrastu s tím byla v supernatantech peritoneálních makrofágů z BALB/c nebo CBA/J myší, stimulovaných LPS, detekována značná hladina IL-6, jako viz výše (obr. 18). Hladiny IL-6 byly redukovány, jestliže buňky byly stimulovány LPS v přítomnosti IL-10, ale úroveň inhibice byla překvapivě méně významná (obr. 18), než bylo pozorováno u linií makrofágů. Ale úroveň produkce IL-6, indukovaná stimulací LPS, se může zvýšit přidáním monoklonální protilátky proti IL-10. To, že makrofágy produkovaly IL-10 v odpovědi na LPS, bylo potvrzeno specifickým ELISA testem pro IL-10 (BALB/c nebo CBA/J peritoneální makrofágy, stimulované LPS, jako viz výše, produkovaly 4,5 U/ml nebo 2 U/ml IL-10).

Obr. 18 také ukazuje, že purifikované BALB/c peritoneální makrofágy produkují vyšší hladiny IL-6 po stimulaci LPS v přítomnosti IFNt v protikladu ke stimulaci samotným LPS. To může být vysvětleno výsledky následujícího experimentu s produkcí IL-10 peritoneálními makrofágy z BALB/c myší. V tomto experimentu mak

-56CZ 281796 B6 rofágy, stimulované LPS, produkovaly 12 U/ml IL-10, a to bylo redukováno na méně než 3 U/ml u buněk, stimulovaných LPS v přítomnosti IFNt.

Příklad C6. Test na rozpustné kostimulátorové mechanismy inhibice APC funkce makrofágů, zprostředkované IL-10.

V přítomnosti živých antigen-prezentujících buněk (APC) bude IL-10 jen inhibovat syntézu Thl cytokinů. Jedním možným mechanismem účinku IL-10 je suprese produkce rozpustného kofaktoru, nutného pro optimální uvolňování cytokinů z Thl buněk. Supernatanty byly získány z makrofágů, stimulovaných IFNt bez nebo v přítomnosti Thl buněk a specifického antigenů. Takové supernatanty (obr. 19A) nebo filtráty, získané během jejich koncentrování, nebyly schopné obnovit IL-10 zprostředkovanou inhibici APC funkce makrofágů pro Thl buňky. Tato data neposkytují důkaz, že IL-10 regulačně snižuje rozpustný kostimulátor, vyžadovaný pro syntézu Thl cytokinů. Podobné experimenty neposkytují důkaz, že IL-10 indukuje makrofágy k produkci rozpustného inhlbičního faktoru, který působí přímo na T buňky, ačkoli takový inhibitor může být labilní nebo membránově vázaný. K testování tohoto mechanismu byl proveden experiment se směsí buněk, jak je uvedeno následovně. Slezinné B-buňky a makrofágy byly FACS tříděny (na základě B220 a Mac-1). Tříděné makrofágy byly, bez nebo v přítomnosti B-buněk a také bez nebo v přítomnosti IL-10, použity jako APC pro antigen-specifickou stimulaci buněk HDK.l. Makrofágová, ale né B buněčná, stimulace syntézy Thl cytokinů byla inhibována IL-10 (obr. 19B). Výsledkem smísení tříděných makrofágů s konstantním počtem B-buněk byla aditivní stimulace syntézy Thl cytokinů (obr. 19B). Ale přidání IL-10 do této směsi APC vedlo k syntéze cytokinů Thl jen na spodní úrovni vzhledem k úrovni, dosažené u samotných APC B-buněk, což je v rozporu s přítomností labilního inhibitoru nebo s malým rozsahem funkcí, který účinkuje přímo na Thl buňky nebo na B-buňky APC.

Studie D. IL-10 ochraňuje myši proti superantigenem vyvolanému letálnímu šoku.

Shrnutí

Na modelu myší byla zkoumána role IL-10 při ochraně proti letálnímu šoku, vyvolanému stafylokokálním enterotoxinem B (SEB). Myši byly premedikovány IL-10, aby bylo zabráněno úmrtí po injikování SEB a D-galaktosaminu (který byl nutný k překonáni přirozené rezistence myší vůči SEB). Tento efekt ukazuje, že IL-10 je schopen inhibovat aktivaci T-buněk in vivo, pravděpodobné svojí schopností inhibovat schopnost makrofágů aktivovat T-buňky.

Superantigeny jsou T buněčné mitogeny, které aktivují T-buňky v T receptorech (TCR) V0- specifickým způsobem vázáním TCR V0 řetězců a β řetězců třídy II MHC molekul. Superantigeny zahrnují endogenní molekuly, produkované myšími mammary rakovinnými viry a exogenní superantigeny, mezi které patři enterotoxiny, jako je např. enterotoxin, produkovaný Staphylococcus aureus. Toxický účinek superantigenů závisí na přítomnosti antigen-prezentujících buněk (APC). V nedávných letech bylo zjištěno, že tyto toxiny účinkují diky své T-mitogenní aktivitě, což je závěr, který byl ovšem demonstrován in vivo.

-57CZ 281796 B6

IL-10 je cytokin s pleiotropní aktivitou vůči mnoha liniím buněk. To zahrnuje, růstový kofaktor pro myší T-buňky a žírné buňky, la indukci v B-buňkách a schopnost inhibovat aktivaci T-buněk. Další vlivy byly demonstrovány nepřímo, inhibicí schopnosti makrofágů působit jako APC. Zdá se, že tento účinek je částí obecného inhibičního vlivu IL-10 na funkce makrofágů, včetně jejich schopnosti produkovat cytokiny, jako IL-1, TNFa a IL-6.

Tato studie využila stafylokokálním enterotoxinem B (SEB) indukovaný šok in vivo na myších jako modelu letálniho šoku, zprostředkovaného T-buňkami. V tomto modelu jsou myši senzibilizovány k toxickým účinkům SEB premedikací D-galaktosaminem. Toto působení snižuje přirozenou rezistenci myši k enterotoxinům, pravděpodobně ovlivňováním jaterních metabolických pochodů. Pozdější administrace malých dávek SEB má za následek úmrtí myší během dvou dnů. V tomto modelu je toxicita způsobena v důsledku masivní aktivace T-buněk, při které buňky produkují TNFa, což zde hraje kritickou roli. Působení IL-10 inhibuje u myší toxicitu, zprostředkovanou SEB, pravděpodobné díky schopnosti inhibovat aktivaci makrofág-dependentních T-buněk.

Příklad Dl. IL-10 předchází SEB-zprostředkované toxicitě in vivo.

Myši.

Čtyři až pět týdnů staří samečci BALB/c H-2^d myší byli získáni od Simonson Laboratories, Gilroy, CA.

Reagencie.

Byly použity tyto látky: myší interleukin-10 (mIL-10) byl připraven standardními procedurami podle S. Menona, DNAX Research Institute, Palo Alto, CA. D(+)-galaktosamin (G-0500) byl získán od Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Stafylokokální enterotoxin B (SEB), použitý v počátečním experimentu, byl získán také od Sigma Chemical Co. SEB, použitý v dalších experimentech, byl získán od Toxin Technology, Madison, WIS, laskavostí P. Hugo (National Jewish Center for Immunology, Denver, CO). Všechny látky byly ředěny pufry.

Působení IL-10.

Čtyři až pét týdnů staří samečci myší byli injikováni (i.p.) různými koncentracemi mIL-10. Po 3-4 hodinách byli opět injikováni D-galaktosaminem a hodinu poté byli injikováni několika koncentracemi SEB. Myši byly kontrolovány po 24, 36 a 48 hodinách.

Původní experimenty ukázaly, že IL-10 mění toxicitu SEB v tomto modelu in vivo. Předběžné experimenty byly zaměřeny na zjištěni minimální dávky SEB, potřebné k zajištění vysoké úmrtnosti v tomto modelu. Tyto dávky se mění v závislosti na původu (dodavateli) a dodávce SEB. Byla testována jedna tato dávka SEB z jedné a té samé dodávky u myší, premedikovaných IL-10 (10 μg/myš). Obr. 20 ukazuje, že premedikace IL-10 má za následek přežití všech myší, injikovaných 10 μg SEB/myš. Ačkoli premedikace IL-10 nepředchází eventuálnímu úmrtí zvířat, injikovaných 20 μg SEB/myš, prodlužuje dobu jejich života.

-58CZ 281796 B6

Studie E. IL-10 chrání myši před letální endotoxemií.

Shrnutí

IL-10 snižuje produkci IL-1, IL-6 a TNFa in vitro a neutralizace IL-10 v myších vede ke zvýšení stejných monokinů. Tato studie zkoumá, zda tato monokiny-supresující vlastnost IL-10 mu propůjčuje schopnost chránit myši před šokem, vyvolaným LPS, zánětlivou reakcí, zprostředkovanou monokiny. Jedna injekce 0,5-1 rekombinantního mIL-10 reprodukovatělně chrání BALB/c myši před letální intraperitoneální injekcí endotoxinu. Tento výsledek byl získán, jestliže IL-10 bvl podán současně nebo 30 minut po injekci endotoxinu. Ochranný účinek IL-10 byl změněn předchozí injekcí neutralizující protilátky anti-IL-10 a korelován s podstatným snížením endotoxin-indukovaným uvolněním TNFa. Tato data implikuji, že IL-10 je vhodným kandidátem pro léčbu bakteriálních sepsí a je obecně efektivním protizánétlivým agens.

Silné bakteriální infekce mohou mít za následek hluboké fyziologické změny, jako je hypotenze, horečka, nekrózy tkání, všeobecné narušení funkce orgánů a smrt. V případě gramnegativnich bakterií nastává toxicita v důsledku endotoxinu, lipopolysacharidové (LPS) složky bakteriální stěny. Injekce příslušné dávky LPS králíkům, myším a dalším zvířatům má za následek změny, typické pro syndrom septického šoku, což je jednoduchý model této zánětové reakce.

Endotoxinem vyvolaná toxicita se zdá být následkem uvolněni TNFa, IL-1 a/nebo IL-6 z endotoxinem stimulovaných makrofágů/monocytů, neboť zvířata mohou být chráněna před bakteriálním a endotoxinem vyvolaným šokem neutralizací těchto monokinů, za použití monoklonálních protilátek nebo fyziologického IL-1 antagonisty, zvaného IL-IRa.

IL-10 má mnohé in vitro vlastnosti včetně suprese produkce IFNt T-pomocnými a NK buňkami, růstové kostimulace thymocytů, žírných a B-buněk a suprese produkce monokinů. IL-10 hluboce potlačuje indukovanou produkci TNFa, IL-la IL-Ιβ, IL-6, IL-8 a GM-CSF lidskými monocyty a myšími peritoneálními makrofágy. Oproti tomu nemá IL-10 žádný efekt na konstitutivní expresi ΤΟΕβ monocyty a skutečné regulačně zvyšuje produkci monocytů IL-IRa. Tato data, získaná in vitro, jsou podporována in vivo experimenty, ukazujícími, že neutralizace IL-10 za použití specifických monoklonálních protilátek vede u myší ke vzrůstu hladin cirkulačního TNFa a IL-6. Bylo testováno, jestli se schopnost IL-10 potlačovat produkci TNFa, IL-1 a IL-6, kombinovaná s jeho schopností zvyšovat hladinu IL-IRa, může uplatnit při ochraně myší před endotoxinem vyvolaným šokem.

Příklad El. Účinek IL-10 na letální endotoxemií u myší.

Myši.

týdnů staré samičky BALB/c myší byly získány od Simonsen Laboratories (Gilroy, CA).

Reagencie.

Lipopolysacharid (LPS) z Escherichia coli serotypu 0111:B4 byl získán od Sigma Chemical Co. Rekombinantní myší IL-10 byl exprimován v E. coli a vysoce specificky purifikován afinitní puri

-59CZ 281796 B6 fikací a ionexovou chromatografií. Tento materiál obsahoval minimum endotoxinu a zůstal stabilní při 4 ’C nejméně 4 měsíce. Specifická aktivita myšího IL-10 byla vyhodnocována testem inhibice syntézy cytokinů, viz Fiorentino a kol. (1989) J. Expt'1. Med. 170, 2081-2095, a kostimulačním testem žírných buněk MC/9, viz Thompson-Snipes a kol. (1991) J. Exp. Med. 173, 507-510. Neutralizační protilátkové experimenty využívaly 2A5 krysí IgGl anti-mIL-lOm monoklonální protilátku nebo izotypovou kontrolou značenou protilátku GL113.

Test TNFa.

Sérové hladiny TNFa byly získány použitím specifického cytokinového ELISA testu.

Skupině 20 BALB/c myší byla intraperitoneálně injikována bud letální dávka samotného LPS, nebo stejného množství LPS spolu s různými množstvími rekombinantního mIL-10. V některých experimentech tohoto typu byly myši zcela ochráněny před úmrtím, vyplývajícím z šoku, vyvolaného LPS, tím, že bylo do zvířat podáno 0,5 μg, 1,0 μg nebo 10 μg IL-10 současné s LPS (obr. 21). V některých z těchto experimentů byla také pozorována částečná ochrana u myší s dávkami 0,1 μg nebo 0,05 μg IL-10 v době podání LPS (obr. 21).

Příklad E2. Neutralizace ochranného účinku anti-IL-10 protilátkami .

Ochrana před letální endotoxemií, zprostředkovaná IL-10, může být blokována předchozí administrací neutralizačních anti-IL-10 protilátek, ale ne isotypovou kontrolou protilátek (obr. 22), což potvrzuje specificitu tohoto účinku.

Příklad E3. Dlouhodobý účinek zpožděného podání IL-10

Kinetické studie ukázaly, že IL-10 zůstává dlouhodobě účinný při ochraně před letální endotoxemií, dokonce i při podání IL-10 30 minut po injikování LPS (obr. 23). Ovšem další prodleva v podání IL-10 podstatně snižuje ochranný účinek a při podání IL-10 5 hodin po injikování LPS nebyl pozorován žádný ochranný účinek (obr. 23).

Příklad E4. Účinek IL-10 na TNFa.

Letální endotoxemie je nežádoucí zánétlivá reakce, zprostředkovaná monokiny. Ukázalo se, že IL-10 potlačuje produkci monokinů aktivovanými makrofágy a monocyty in vitro, což naznačuje, že ochrana, zprostředkovaná IL-10, odrážela potlačení produkce monokinů v odpovědi, indukované endotoxinem. Séra, odebraná 1,2 a 3 hodiny po injekci LPS s nebo bez IL-10, vykazovala silnou redukci hladin cirkulačního TNFa ve zvířatech s ochranou IL-10. Protože anti-TNF protilátky podobné chrání myši před letální endotoxemií, je pravděpodobné, že suprese TNFa, vyvolaná IL-10, přinejmenším přispívá k ochrannému účinku proti letální endotoxemii, který tento cytokin vykazuje. Další účinky IL-10 na funkci makrofága/monocytu mohou také přispívat k jeho schopnosti chránit

-60CZ 281796 B6 před letální endotoxemií. In vitro studie ukazovaly, že IL-10 nepotlačuje jen IL-1 a IL-6, ale také regulačně zvyšuje hladinu IL-IRa, což také napomáhá ochraně před letální endotoxemií. To naznačily experimenty s neutralizačními anti-cytokinovými protilátkami nebo s přímým podáním IL-IRa.

Studie F. Kontinuální podání anti-IL-10 protilátky depletuje myši Ly-1 B-buňky, ale ne konvenční B-buňky.

Shrnutí.

Ly-1 B-buňky mají odlišnou schopnost kontinuální sebeobnovy a mohou být dále odlišeny od konvenčních B-buněk na základě výrazně zvýšené konstitutivní a indukovatělně produkce nedávno popsaného cytokinů IL-10. Bylo testováno, jestli IL-10 účinkuje buď jako autokrinní nebo parakrinní růstový faktor pro Ly-1 B-buňky a to kontinuálním působením monoklonální krysí IgM protilátky, specificky neutralizující mIL-10, na myši od narození do stáří 8 týdnů. Myši, na které bylo takto působeno, postrádaly rezidentní peritoneální Ly-1 B-buňky, měly vysoce redukované hladiny sérového IgM a nebyly schopné in vivo generovat signifikantní imunitní odpovědi na intraperitoneální injekce αΐ,3-dextranu nebo fosforylcholinu, což jsou antigeny, pro které jsou B-buňky v Ly-1 podsystému B-buněk. Naopak konvenční slezinné B-buňky myší , podrobených působení anti-IL-10, byly normální vzhledem k celkovému počtu, fenotypu a in vitro citlivosti k mitogenům B-buněk a thymus-dependentnímu trinitrofenylhemocyaninu z přílipek (TNP-KLH). Mechanismus deplece Ly-1 B-buněk je zřejmě podobný mechanismu zvýšení endogenního IFNt v myších, podrobených působení anti-IL-10, protože podání neutralizačních anti-IFNT protilátek podstatně obnovuje počet rezidentních peritoneálních Ly-1 B-buněk v těchto myších. Tyto výsledky řadí IL-10 k regulátorům vývoje Ly-1 B-buněk a popisují proces specifické deplece Ly-1 B-buněk, což dovoluje následné zhodnocení role těchto buněk v imunitním systému.

Ly-1 B-buňky obsahují 2% B-buněk dospělé myši a vykazují několik zajímavých vlastnosti, které je odlišují od konvenčních B-buněk: (a) ačkoli těžko detekovatelné ve většině primárních a sekundárních lymfatických tkáních, jsou přítomné ve vysokých obsazích v peritoneálních a pleurálních dutinách a střevních lymfatických tkáních, (b) vyvíjejí se a převládají v časných fázích ontogeneze a mají schopnost sebeobnovy po dobu života zvířete, (c) produkují omezené spektrum protilátek s nízkou afinitou, které jsou ale vysoce reaktivní vůči svým vlastním determinantům a nezdá se, že by podléhaly maturaci somatickou mutací, (d) generují většinu IgM, nalezeného v séru a produkují veškeré protilátky, vyvolané bakteriálními determinanty, jako je fosforylcholin a αΐ,3-dextran. I když není jejich přesná role ve funkci imunitního systému a bakteriální imunitě jasná, existují různé vyspělé modely, založené na specifitě protilátek, produkovaných Ly-1 B-buňkami. Hrají také určitou roli při odstraňování poškozených nebo opotřebených buněk,jako jsou mj. stárnoucí erytrocyty, a také v modulaci spektra protilátek, generovaných během vývoje. Zjistili jsme, že Ly-1 B-buňky jsou potentními producenty IL-10, imunosupresivního cytokinů, který regulačně snižuje produkci některých monokinů a cytokinů T-buněk, zvyšuje možnost imunoregulace B-buňkami. Mnohé z těchto vlastností jsou obtížně vyhodnotitelné

-61CZ 281796 B6 u lidí, ale byly již nalezeny populace lidských B lymfocytů, nesoucích Ly-1 s podobnými vlastnostmi.

Příklad Fl. Kontinuální neutralizace IL-10 depletuje myší Ly-1 B-buňky.

Myši.

Střednědobě gravidní BALB/c a C3H/HeJ myši byly získány od Simonsen Laboratory (Gilroy, CA).

Působení anti-IL-10.

5-10 BALB/c myší vyhovujícího věku bylo peritoneálně injikováno 3x týdně od narození do stáří 8 týdnů neutralizující krysí IgM protilátkou anti-mIL-10, označenou jako SXC.l (0,2 mg/injekce pro první týden, 0,5 mg/injekce pro druhý týden, 1,0 mg/injekce pro třetí až osmý týden), ekvivalentními množstvími J5/D označeného takto isotypovou kontrolou nebo ekvivalentními objemy (100 nebo 200 μΐ) PBS (fosfátem pufrovaný šalin). Pro porovnání byly do všech experimentů začleněny BALB/c myši vyhovujícího věku, které nebyly podrobeny působení těchto látek. Protilátky SXC.l a J5/D byly získány z hybridomálních supernatantů bez přítomnosti séra a purifikovány dvěma po sobě jdoucími precipitačními kroky za použití 35% sulfátu amonného. V některých experimentech myši dostaly podobná množství zvláštní krysí IgGl protilátky anti-mIL-10, označené jako 2A5, nebo jejího izotypu GL113. Tyto další protilátky byly podány intraperitoneálně v množstvích 0,5 mg/injekce pro první týden, 1,0 mg/injekce pro druhý týden, 2,0 mg/injekce pro třetí až osmý týden.

Imunofluorescence.

Promyté buňky byly barveny kombinací následujících látek, fluorescenčně značená protilátka anti-myší IgM (DS-1, Pharmingen, San Diego, CA), biotinylovaná krysí protilátka anti-myší IgD (11 -26c, připravená J. Kearneym), fluorescenčně značená protilátka anti-myší CD3 (145-2C11, Boehringer Mannheim Corp., Indianapolls, IN, Caltag Labs., South San Francisco, CA). Biotinylované reagencie byly použity společné se streptavidinem konjugovaným fykoerythrinem (Becton Dickinson a Co., Mountain View, CA). Buňky byly analyzovány za použití přístroje FACScan a mrtvé buňky byly vyloučeny na základě úhlu rozptylu. Výsledky ukazují fluorescenční intenzity 5 000 živých buněk, počítaných v každé experimentální skupině.

Protilátkové ELISA testy.

Vzorky séra, shromážděné po 8 týdnech experimentu, byly testovány na přítomnost myšího IgM za použití sendvičového ELISA testu, kdy bylo 5 μg/ml krysího anti-myšího IgM (R8-103, Pharmingen) přichyceno na PVC mikrotitračni misky, jako standard byly přidány zředěné vzorky séra nebo směs různých purifikovaných myších IgM proteinů z myelomu a imunitní komplexy byly postupně detekovány za použití biotinylovaného krysího anti-myšího IgM (R19-15, Pharmingen) a peroxidázy z křenu, konjugované avidinem (CalBiochem Corp., La Jolla, CA) s 1 mg/ml substrátu (2,2'-azínobist3-etyl-benzthiazolin]sírová kyselina, Sigma Chemical Corp.).

-62CZ 281796 B6

Specifické imunitní odpovědi na fosforylcholin, al,3-dextran byly zjištěny po opakované imunizaci anti-IL-10 nebo intraperitoneálni injekci 0,5 ml šalinu u kontrolních myší, nebo 50 μg al,3-dextranu z Leuconostoc mesentroides (laskavostí Dr. SLodki, U. S. Department of Agrículture Agricultural Research Service) nebo 2xlo8 tepelné usmrcených Streptococcus pneumoniae jako zdroje fosforylcholinu. Séra od všech myší byla shromážděna po 7 dnech a testována na protilátky, specifické pro @l,3-dextran nebo fosforylcholin,specifickými ELISA testy. Specifické odpovědi protilátek na TNP-KLH byly stanoveny po intraperitoneální imunizaci myší 10 μg TNP-KLH a séra pro IgM analýzu byla odebrána po 7 dnech a po dalších 10 a 14 dnech pro IgG analýzu. TNP-specifické protilátky byly kvantifikovány za použití ELISA. Ve všech případech bylo působení anti-IL-10 mezi imunizací a odběrem séra kontinuální.

IFNt ELISA.

Vzorky séra, shromážděné od myší, na které bylo působeno anti-IL-10 a od kontrolních myší, byly testovány na myší IFNt cytokin-specifickými ELISA testy.

Samečci a samičky BALB/c myší byly 3x týdně od narození do stáří 8 týdnů injikovány stupňovanými dávkami neutralizujícího krysího IgM anti-mlL-10 mAb, označeného jako SXC.l a následně testovány na počet a funkci Ly-1 B-buněk. Kontrolní skupiny myší příslušného věku, které nebyly imunizovány, ani na ně nebylo působeno PBS nebo jiným krysím IgM, označeným J5/D, byly zahrnuty pro srovnání. Protilátky byly administrovány buď intraperitoneálně nebo podkožně bez zvláštních změn v odezvách. Tímto způsobem byla získána průměrná hladina sérového krysího IgM po 8 týdnech jako 50 mg/ml. Tento údaj byl získán krysím-IgM-specifickým ELISA testem jak pro SXC.l, tak pro J5/D. Po 8 týdenním působení byly myši, podrobené působeni anti-IL-10, nerozeznatelné od tří kontrolních skupin myší, splňujících následující kriteria: celková tělesná hmotnost, celková histologické kontrola jater a sleziny, thymu, lymfatických tkání, střev, plic a peritonea, dále proporce Ba T buněk a non-B/T buněk ve slezině, lymfatických tkáních a thymu. Naopak imunofluorescenční zjištění fenotypu buněk, získaných z 5-10 myší, zahrnujících každou ze 4 experimentálních skupin, ukázalo překvapivou depleci IgM+ a IgD+ buněk v myších, podrobených působení anti-IL-10 (SXC.l), ale ne v jiných kontrolních zvířatech (obr. 24). Identická data byla získána z 24 nezávislých experimentů včetně dvou s C3H/HeJ myšmi a několika jiných se zvláštní krysí IgGl anti-IL-10 neutralizační protilátkou. U zvířat s působením anti-IL-10 byla zaznamenána deplece peritoneálních buněk, nesoucích B220, jak bylo stanoveno imunofluorescencí, a LPS-citlivými peritoneálními buňkami, jak bylo stanoveno podle schopnosti těchto buněk inkorporovat ³H-thymidin po 3 dnech kokultivace s 50 μg/ml LPS. Tyto výsledky naznačují, že BALB/c myši, podrobené působení anti-IL-10,neobsahují ve svých peritoneálních dutinách žádné B-buňky na rozdíl od normálního stavu, kdy lze v těchto dutinách běžně nalézt 1-5X10⁵ B-buněk. Je významné, že tříbarevná imunofluorescence peritoneálních dutin 8 týdnů starých BALB/c myší dokázala málo (< 5%) konvenčních B-buněk. Výsledky, uvedené v obr. 24, proto reprezentují převládající depleci Ly-1 B-buněk. I přes tuto překvapivou depleci peritoneálních B-buněk nebyla celková celularita peritoneálních dutin myši, pod

-63CZ 281796 B6 robených působení anti-IL-10, podstatně odlišná od myší z kontrolních skupin. Další imunofluoresceční analýza, společně s diferenciálním hemopoietickým sčítáním buněk, ukázala, že ztráta B-buněk byla kompenzována vzrůstem počtu peritoneálních CD4+ T buněk a granulocytů ve zvířatech, podrobených působení anti-IL-10. Další dvě pozorování indikovala, že k depleci Ly-1 B-buněk v myších, podrobených působení anti-IL-10, došlo prostřednictvím imunitního systému a nebyla omezena na peritoneální dutiny. Nejprve myši, podrobené působení anti-IL-10, vykazovaly ve srovnání se 3 kontrolními skupinami překvapivé 90 až 100% snížení hladiny sérového IgM, jak bylo zjištěno pro myši specifickými ELISA testy (obr. 25). Dále byla u těchto myší zjištěna hluboká deficience schopnosti generovat in vivo odpovědi protilátek na al,3-dextran nebo fosforylcholin (obr. 26), tj. dva thymus-dependentní antigeny, pro které se funkčně odpovídající B-buňky nalézají v Ly-1 B buněčných subsystémech.

Příklad F2. Myši, podrobené působení anti-IL-10, obsahují fenotypově a funkčně normální konvenční B-buňky.

Vzhledem k překvapivému účinku anti-IL-10 na Ly-1 B-buňky bylo důležité pečlivě vyhodnotit stav konvenčních B-buněk v těchto zvířatech. Jak bylo uvedeno výše, celkový počet bílých krvinek ve slezinách myší, podrobených působení anti-IL-10, nebo kontrolních zvířat se podstatně nelišil ve 24 nezávislých experimentech. Obr. 27 ukazuje, že* se proporce B220+ B buněk, CD3+ T-buněk a non-B/T buněk (B220^-CD3~) neliší v žádné ze 4 experimentálních skupin myší. Ekvivalentní data byla získána ze srovnání s Ig+ B-buňkami nebo CD4+ T-buňkami. Tato data ukazují, že celkový počet slezinných B-buněk tohoto fenotypu v myších, podrobených působení anti-IL-10, je stejný jako v každé kontrolní skupině. Imunokompetence konvenčních B-buněk v myších, podrobených působení anti-IL-10, byla testována dvěma způsoby. Nejprve myši, podrobené působení anti-IL-10, produkovaly normální IgM a IgG protilátky v odpovědi na injekci thymus-dependentního antigenů TNP-KLH (obr. 28). Sekundární odpovědi na TNP-KLH byly v těchto myších také normální. Dále slezinné B-buňky z myší, podrobených působení anti-IL-10, vykazovaly normální in vitro proliferativní odpovědi na 50 |xg/ml LPS nebo anti-IgM protilátky (tab. Fl). Základní prolif erativní odpovědi slezinných buněk u myší, podrobených působení anti-IL-10, byly často 3-5x vyšší než u kontrol. Tato data dohromady dávají tušit, že konvenční B-buňky u myší, podrobených působení anti-IL-10, jsou kvantitativně a funkčně nerozeznatelné od buněk myší z kontrolních souborů.

Tabulka Fl. In vitro proliferativní odpovědí slezinných buněk myší, podrobených působení anti-IL-10, a myší z kontrolních souborů na stimulaci LPS, anti-IgM a anti-CD3.

-64CZ 281796 B6

	3H-thymidin	(cpm)
Skupina zvířat*	+0	+LPS	+Anti-IgM	+Anti-CD3
bez působení	224,0	22,6	3,3	90,1
PBS	320,0	42,3	3,8	115,7
J5/D	547,0	46,7	2,9	135,2
SXC.l	2,8	61,6	7,2	96,4

Na zvířata bylo působeno od narození do věku 8 týdnů, jak bylo posáno v obr. 1. Slezinné buňky (2xl0⁶/ml), získané ze 3 myší v každé skupině, byly kultivovány po 3 dny v médiu, nebo médiu, doplněném 50 mg/ml LPS, 50 mg/ml kozí anti-myší-IgM protilátkou, nebo 5 mg/ml křeččí anti-myší-CD3 protilátkou. Pro anti-CD3 stimulace byly mikrotitrační misky potaženy protilátkou před přidáním slezinných buněk. Proliferace byla vyčíslena via inkorporace H-thymidinu po 16 hodinách, plus 1 mC/misku, ^JH-thymidin, (NET 027, New England Nuclear, Boston, MA).

Příklad F3. Mechanismus deplece Ly-1 B-buněk

Testy proliferace.

Slezinné buňky 2xl0⁶ ze 3 myší z každé skupiny byly kultivovány 3 dny v samotném médiu nebo médiu, doplněném 50 μ-g/ml LPS nebo 50 mg/ml kozí anti-myší-IgM protilátkou (0611-0201, Cappel Laboratories, Cochranville, PA), nebo 5 mg/ml křeččí anti-myší-CD3 protilátkou (laskavostí D. J. Bluestone, University of Chicago, Chicago, IL). Pro anti-CD3 stimulace byly mikrotitrační misky potaženy protilátkou před přidáním slezinných buněk. Proliferace byla vyčíslena via inkorporace ³H-thymidinu po 16 hodinách, plus 1 mC/misku, ³H-thymidin, (NET 027, New England Nuclear, Boston, MA).

Bylo navrženo několik možných mechanismů pro vysvětlení deplece Ly-1 B-buněk u myši, na které bylo působeno anti-IL-10. Tento účinek, jak se zdá, nezahrnuje selektivní cytotoxicitu pro Ly-1 B-buňky, podrobené působení anti-IL-10 protilátek, jako injekce stejných protilátek do dospělých myší neměla účinek na následnou obnovu celkových peritoneálních buněk, nebo celkových peritoneálních B-buněk po 1, 2 nebo 3 dnech (obr. 29). Za alternativní vysvětlení lze považovat možnost, že deplece Ly-1 B-buněk odráží sekundární konsekvence v perturbanci některých jiných endogenních cytokinů. Myši, podrobené působení anti-IL-10, měly opravdu vyšší hladiny sérového IFNt (obr. 30), což souhlasí s předchozím pozorováním, že IL-10 je schopen snižovat produkci IFNt Thl a NK buňkami in vitro. Ke zjištění možnosti, že toto anti-IL-10-indukované zvýšení hladiny IFNt je přímo nebo nepřímo odpovědné za depleci Ly-1 B-buněk, byly myši od narození do dospělosti injikovány kombinací anti-IL-10 a anti-IFNT neutralizujícími protilátkami nebo anti-IL-10 a příslušnou protilátkou pro isotypovou kontrolu. Výsledky ukázaly, že anti-IFNT protilátky (obr. 31) na rozdíl od izotypové kontroly značně redukovaly schopnost působení anti-IL-10 depletovat myší peritoneální Ly-1

-65CZ 281796 B6

B-buňky. Je důležité poznamenat, že kontinuální administrace samotné anti-IFNT protilátky nebo kombinace anti-IL-10 a anti-IFNT protilátek neměnila obnovení celkových peritoneálních buněk myší, podrobených působení anti-IL-10 nebo jeho isotypových kontrol. Tato data podporují myšlenku, že deplece Ly-1 B-buněk je alespoň částečně důsledkem elevace IFNt u myší, podrobených působení anti-IL-10.

Studie G. Modifikovaný imunologický stav myší, na které bylo působeno anti-IL-10.

Shrnutí.

Jak bylo uvedeno výše, kontinuální působení neutralizující protilátky anti-IL-10 na myši od narození do dospělého věku vedlo ke specifické depleci Ly-1 B-buněk, zatímco konvenční B-buňky zůstaly co se týče počtu, fenotypu a funkce normální (Studie F). Další charakterizace těchto zvířat ukázala, že myši, podrobené působení anti-IL-10, mohou být odlišeny od myší, nepodrobených působení protilátek nebo od izotypových kontrol, pomocí několika dalších kriterií. Myši, podrobené působení anti-IL-10, měly značně zvýšené hladiny oběhového TNFa a v mnoha případech také oběhového IL-6 a byly velmi náchylné k úmrtí LPS-indukovaným šokem, monokiny mediovanou zánětovou reakcí. Analýzy sérových imunoglobulinů u myši, podrobených působení anti-IL-10, ukázaly pokles hladin sérového IgA spolu s dříve popsanou redukcí sérového IgM a překvapivého poklesu hladin IgG2a a IgG2b. Další výzkumy ukázaly, že efekt deplece Ly-1 buněk u myší, podrobených působení anti-IL-10, nastává pouze dočasně, což bylo prokázáno nálezem obnovení Ly-1 B-buněk 8 týdnů poté, co bylo přerušeno podávání anti-IL-10. Deplece Ly-1 B-buněk, která nastala během podávání anti-IL-10, byla, jak se ukázalo, kompenzována vzrůstem počtu peritoneálních T-bunék a granulocytů. Nakonec se ukázalo, že zatímco myši, podrobené působení anti-IL-10, nebyly schopny produkovat protilátky na fosforylcholin a al,3-dextran, vykazují normální imunitní odpovědi po intraperitoneálních injekcích roztoku TNP-Ficoll. Tyto výsledky dávají tušit existenci subkategorií thymus independentních pólysacharidových antigenů typu II. Tato data jsou diskutována v kontextu implikací pro role IL-10 a Ly-1 B buněk v imunitním systému.

Imunitní systém je regulován rodinami rozpustných glykoproteinů, nazývaných cytokiny, které jsou produkovány řadou hemopoietických a nonhemopoietických buněk. Extenzivní in vitro charakterizace těchto imunoregulátorů vedla za posledních pět let ke koncepci extenzivní funkční pleiotropie a redundance v cytokinovém systému. Imunologové nyní stojí před nutností vyhodnotit, zda tato koncepce přesně odráží fyziologické role cytokinú in vivo. Fyziologická role recentně objeveného cytokinú IL-10 je předmětem zkoumání. Bohatý výčet in vitro vlastností charakterizoval IL-10 jako potentní imunosupresant, schopný regulačně snižovat produkci některých monokinů a cytokinú a inhibovat prezentaci antigenů u některých (ne všech) antigen prezentujících buněk. Stejné obsažný seznam stimulačních vlastností ukazuje některé cytokiny jako růstové kostimulátory thymocytů, periferálních T-buněk, B-buněk a žírných buněk, jako amplifikátory rozvoje a funkce cytotoxických T-buněk a jako induktory viability a diferenciace B-buněk. Za účelem postižení fyziologické role IL-10 in vivo byly

-66CZ 281796 B6 myši od narození do dospělosti injikovány neutralizující monoklonální protilátkou anti-IL-10. Ranné analýzy prokázaly, že toto působení vedlo k výrazné depleci minoritních subsystémů B-lymfocytů, zvaných Ly-1 nebo B-l B-buňky, což ukazuje, že IL-10 je regulátor vývoje Ly-l/B-1 B-buněk.

Ly-1 B-buňky jsou subpopulací B lymfocytů, které jsou vysoce převládající v zárodečných a neonatálních lymfatických tkáních lidí a myší, ale které byly pouze v malém množství nalezeny v imunitních systémech dospělých subjektů. Zatímco jsou Ly-1 B-buňky sotva zjistitelné v primárních a sekundárních lymfatických tkáních dospělých subjektů, jsou peritoneálni a pleurální dutiny dospělých myší na tyto buňky vysoce bohaté a jsou v malých množstvích přítomny i v oběhu dospělých lidí Jejich extenzivní charakterizace v myším systému odhalila mnoho složitých vlastností, včetně omezení repertoáru protilátek s nízkou afinitou, které nepodléhají snadno somatickým mutacím a jsou značně reaktivní vůči autoantigenům a komponentám bakteriálních buněčných stěn. Rekonstituční experimenty na myších ukázaly, na rozdíl od konvenčních B-buněk, že Ly-1 B-buňky jsou schopné sebeobnovy po celý život hostitele a generují většinu sérového IgM a veškerou imunitní odpověď na některé bakteriální determinanty, jako je fosforylcholin a αΐ,3-dextran. Předchozí popis Ly-1 B-buněk ukázal na jejich odlišnost od konvenčních B-buněk na základě vysoce zvýšené a indukovatelné produkce IL-10, zvyšující možnost široké imunoregulační role těchto buněk. I přes všechny výzkumy však zůstává role Ly-1 B-buněk v imunitním systému nejasná.

Myši, na které bylo kontinuálně od narozeni do dospělosti působeno neutralizující protilátkou anti-IL-10, vykázaly depleci Ly-1 B-buněk, což bylo zjištěno na základě nepřítomnosti jejich peritoneálních B-bunék a faktu, že drasticky poklesly hladiny sérového IgM a imunitní odpovědi na fosforylcholin a αΐ,3-dextran. Deplece Ly-1 B-buněk byla lezena v druhotné konsekvenci se zvýšením endogenního IFNt a může jí být předcházeno koadministrací s anti-IFNT protilátkami. Je zde také popsána konsekvence specifické deplece Ly-1 B-buněk a endogenního IL-10 v následném imunitním stavu těchto myší.

Příklad Gl. Účinek působení anti-IL-10 na endogenní hladiny cytokinů u myší.

Myši.

Střednědobě gravidní BALB/c myši byly získány od Simonsen Laboratory (Gilroy, CA).

Působení anti-IL-10.

5-10 BALB/c myši vyhovujícího véku bylo peritoneálné injikováno od narození do stáří 8 týdnů oběma anti-IL-10 protilátkami podle následujících protokolů. V některých experimentech byly myši injikovány 3x týdně SXC.l krysí IgM protilátkou anti-mIL-10, viz Mossmann a kol. (1990) J. Immunol. 145, 2938-2945, (0,2 mg/injekce pro první týden, 0,5 mg/injekce pro druhý týden, 1,0 mg/injekce pro třetí až osmý týden), ekvivalentními množstvími J5/D označeného takto izotypovou kontrolou nebo ekvivalentními objemy (100 nebo 200 μΐ) PBS (fosfátem pufrovaný šalin). V dalších experimentech myši injikovány 2x týdně krysí IgGl protilát

-67CZ 281796 B6 kou anti-myší-IL-10, označenou jako 2A5 (0,2 mg/injekce pro první týden, 0,5 mg/injekce pro druhý týden, 1,0 mg/injekce pro třetí až osmý týden), ekvivalentními množstvími jejího izotypu, označeného GL113, nebo ekvivalentními objemy (100 nebo 200 μΐ) PBS (fosfátem pufrovaný šalin). BALB/v myši vyhovujícího věku, nevystavené působení protilátek, byly zahrnuty do experimentů jako kontrola. Všechny protilátky byly získány z hybridomálních supernatantů bez přítomností séra a purifikovány precipitací za použití sulfátu amonného. Po ukončení podávání protilátek byly ledviny, brzlíky, lymfatické uzliny nebo peritoneální buňky, odebrané z každé ze čtyř skupin myší, analyzovány flow cytometrií a funkčními testy.

Cytokinové ELISA testy.

Vzorky sér od myší, podrobených působeni anti-IL-10, nebo od kontrol, byly testovány na myší TNFa nebo IL-6 na cytokiny specifickými ELISA testy.

Kontinuální působení anti-IL-10 na myši od narození do dospělosti vede po osmi týdnech k přítomnosti značných množství IFNt v séru, na rozdíl od myší z kontrolních souborů nebo isotypových kontrol, které postrádají detekovatelná množství IFNt v séru. Za účelem prozkoumání perturbace endogenních cytokinů následkem působení anti-II-10 byla séra, odebraná po 8 týdnech působení, testována na přítomnost TNFa nebo IL-6 na cytokiny specifickými ELISA testy. Séra myší, podrobených působení anti-IL-10, obsahovala značně zvýšené hladiny TNFa (obr. 32), a často také zvýšené hladiny IL-6 (obr. 33). Zvýšení hladin TNFa a IL-6 u myši, podrobených působení anti-IL-10, je konzistentní s popsanou schopnosti IL-10 potlačovat produkci monokinů in vitro.

Příklad G2. Účinek působení anti-IL-10 na hladinu myšího sérového Ig.

Endotoxinem indukovaný šok.

Myši byly intraperitoneálně injikovány dávkami endotoxinu (lipopolysacharidy z E. coli o serotypu 0111:B4, Sigma Chemical Co.) v rozsahu 1-500 μg. Počet přeživších myší byl sledován po dobu následujících 1-6 dní.

Účinek působení anti-IL-10 na hladiny endogenních monokinů byl dále analyzován a byla také vyhodnocena náchylnost zvířat k LPS-indukovanému šoku, monokiny zprostředkované zánětové reakci. Dříve publikovaná data ukázala, že neutralizační monoklonální protilátky proti TNFa, IL-1 nebo IL-6 a fyziologický IL-1 antagonista, nazývaný IL-lŘa, účinné chrání myši před LPS-indukovaným šokem. Tyto experimenty ukazují, že myši, injikované bud SXC.l (krysí IgM) nebo 2A5 (krysí IgGl) anti-IL-10 protilátkami od narození do 8 týdnů věku byly velmi náchylné k úmrtí šokem, vyvolaným LPS (obr. 34). Zatímco LPS LD₁₀₀ u 8 týdnů starých BALB/c myší (zařízení DNAX) byla > 380 μg/myš i.p., usmrtilo velmi malé množství endotoxinu (1 μg) většinu myší, podrobených působení anti-IL-10 (obr. 34). Přesný mechanismus této zvýšené náchylnosti nebyl ještě určen, ale tyto údaje jsou konzistentní s obecnou regulací zvýšením zánětových monokinů u myší, podrobených působení anti-IL-10.

-68CZ 281796 B6

ELISA testy na protilátky.

Vzorky sér, odebrané po 8 týdnech působení, byly testovány na přítomnost všech izotypů myších imunoglobulinů pomocí ELISA testů v sendvičovém uspořádání. Pro fixaci na nosič byly použity následující protilátky: krysí anti-myší IgGl (3096, laskavostí R. Coffmana, DNAX), krysí anti-myší IgG2a (R8-103, Pharmingen, San Diego, CA), krysí anti-mouse IgG2b (R9-91, Pharmingen), krysí anti-myší IgG3 (R2-38, Pharmingen), krysí anti-myší IgA (R5-140, Pharmingen), krysí anti-myší IgE (EM95, laskavostí R. Coffmana). Pro potahování nosiče byla použita koncentrace protilátek 1-5 μg/ml. Pro toto sendvičové uspořádání ELISA testů byly použity tyto biotinylované protilátky: krysí anti-myší IgGl (3098B, laskavostí R. Coffmana, DNAX), krysí anti-myší IgG2a (R19-15, Pharmingen, San Diego, CA), krysí anti-myší IgG2b (R12-3, Pharmingen), krysí anti-myší IgG3 (R40-82, Pharmingen), krysí anti-myší IgA (2740B, laskavostí R. Coffmana), krysí anti-myší IgE (R35-118, Pharmingen), v koncentraci 1-3 μg/ml v konjunkci se streptavidinem konjugovanou křenovou peroxidázou (CalBiochem., La Jolla, CA) s 1 mg/ml substrátu [2,2-aznobis-(3-etylbenzthiazolin)sírová kyselina, Sigma]. ELISA testy byly kvantifikovány použitím purifikovaných imunoglobulinů myšího myelomu jako standardu.

Kontinuální působení anti-IL-10 na myši od narození do dospělosti vede ke značné depleci hladin sérového IgM, na rozdíl od normálních hladin sérového IgM myší z izotypových kontrol. Měření dalších izotypů imunoglobulinů v sérech, odebraných po 8 týdnech působení, je uvedeno na obr. 35. Hladiny každého imunoglobulinového izotypů ve třech kontrolních skupinách myši (tj. nepodrobených působení, s působením PBS nebo podrobené působení protilátky izotypové kontroly) se významně nelišily od dříve popsaných rozsahů hladin sérového Ig v normálních myších. Byly však pozorovány četné změny v hladinách sérového Ig v myších, podrobených působení anti-IL-10. Tyto myši vykazovaly značné sníženi hladin sérového IgA, což doplňuje dříve popsané snížení sérového IgM a překvapivý vzrůst IgG2a a IgG23 (obr. 35). Zbývající isotypy (IgGl, IgG3 a IgE) byly nezměněny, nebo byly v těchto experimentech 2 až 4x vyšší.

Příklad G3. Deplece Ly-1 B-buněk u myší, podrobených působení anti-IL-10, je dočasná.

Imunofluorescence.

Promyté buňky byly barveny kombinacemi následujících reagencií: fluoresceinovaná anti-myší IgM protilátka (DS-1, Pharmingen, San Diego, CA), biotinylovaný krysí anti-myší IgD (ll-26c, laskavosti J. Kearney, U. Birmingham, Ala.), fluoresceinovaný anti-myší CD3 (145-2C11, Boehringer- Mannheim, Indianapolis, IN), biotinylovaný anti-myší B220 (RA3-6B2, Caltag, S. F.) a biotinylovaná krysí anti-myší granulocyt/eosinofilni protilátka (8C5, laskavostí R. Coffman, DNAX). Biotinylované reagencie byly použity společné s fykoerythrin-konjugovaným streptavidinem (Becton-Dickinson, Mountain View, CA). Buňky byly analyzovány za použití přístroje FACScan a mrtvé buňky byly vyloučeny. Výsledky ukazují fluorescenční intenzity 5 000 živých buněk, počítaných z každé experimentální skupiny.

-69CZ 281796 B6

Myši, podrobené působení anti-IL-10, byly vyhodnoceny po přerušení působení a byla stanovována ireverzibilita deplece Ly-1 B-buněk. Některé skupiny myší byly injikovány anti-IL-10 od narození do 8 týdnů věku, a pak bylo působení přerušeno. V každé skupině byla zjišťována přítomnost peritoneálních Ly-1 B-buněk a to hned nebo v různých časových intervalech během 8 týdnů po ukončení působení. Je důležité, že nebyly pozorovány významné změny v celkových počtech peritoneálních buněk, odebraných v různém čase. V některých experimentech myši zůstaly bez peritoneálních Ly-1 B-buněk po 3 počáteční týdny od ukončení působení anti-IL-10. Po tomto časovém intervalu se Ly-1 B-buňky začaly znovu objevovat v peritoneálních dutinách spolu s normálními doplňky Ly-1 B-buněk, pozorovanými 8 týdnů po ukončení působení anti-IL-10 (obr. 36). Rekonstituce kompartmentů peritoneálních B-buněk byla charakterizována počátečním objevením se B220^bri^^htIgM^du11 B-buněk asi 4 týdny poté, co bylo přerušeno působení anti-IL-10, s následným objevením se B220^brX^^btIgM^<XuXX B-buněk o několik týdnů později (obr. 36).

Příklad G4. Zvýšení počtu peritoneálních T-buněk a granulocytů u myší, podrobených působení anti-IL-10.

Diferenciální stanoveni počtu hemopoietických buněk.

Suspenze slezinných buněk nebo peritoneální promytí byly použity k preparaci cytospinů pro buněčnou morfologickou analýzu. Vzorky byly barveny Wright’s-Giemsa (Sigma, St. Louis) a mikroskopicky analyzovány na lymfocyty, makrofágy, granulocyty, eosinofily a žírné buňky.

Zatímco u myší, podrobených kontinuálnímu působení od narození do 8 týdnů věku, nastala deplece peritoneálních B-buněk, celkový počet peritoneálních buněk, které mohly být získány z těchto myší, se významné nelišil od kontrol. Diferenciální stanovení počtu hemopoietických buněk z peritoneálních buněk, odebraných z myší, podrobených působeni anti-IL-10, odráželo vzrůst peritoneálních granulocytů/eosinofilů a zdánlivých non-B lymfocytů (tab. Gl). Stanovení fenotypu pomocí povrchových markérů peritoneálních buněk z myší, podrobených působení anti-IL-10, odhalilo vzrůst počtu Ly-l-bright Ig-negativních buněk (obr. 37), CD3-pozitivních Ig-negativních buněk, Macl-bright Ig negativních buněk (obr. 38) a 8C5-bright Ig-negativních buněk. Tyto analýzy indikovaly vzrůst počtu Lyl-pozitivních, CD3-pozitivních T lymfocytů a potvrdily (tab. Gl) vzrůst počtu granulocytů, které exprimují Macl a 8C5 povrchové markéry.

Tabulka Gl.

Poměr hemopoietických subpopulací v myších, podrobených působení anti-IL-10, a v myších z kontrolních souborů

-70CZ 281796 B6

Lymfocyty Makrofágy Neutrofily Eosinofily Žírné buňky

Peritoneum⁺

Bez působení	74,0	22,0	1,8	1,7	0,5
Působení PBS	66,0	29,0	1,4	34,3	0,3
Působ, izotypové	64,0	31,0	1,2	4,5	0,3
kontroly
Působení anti-IL-10	44,0	22,0	18,0	16,0	0,0

Slezina⁴

Bez působení	94,0	2,7	2,3	0,5	0,0
Působení PBS	92,0	3,6	3,6	1,4	0,0
Působ, izotypové	96,0	1,2	1,8	0,6	0,0
kontroly Působení anti-IL-10	92,0	2,4	5,0	0,9	0,0

⁺ Všechny skupiny měly zhruba stejný počet peritoneálních a slezinných buněk/myš, čísla představují procenta celkového počtu nalezených buněk.

Příklad G5. Odpověď myší, podrobených působení anti-IL-10, na thymus-independentní antigen TNP-Ficoll.

Specifické protilátkové odpovědi.

Specifické protilátkové odpovědi na TNP-Ficoll byly stanoveny po opakované intraperitoneální imunizaci myší 10 μg TNP-Ficoll (poskytnuto Dr. J. Mondem, USUHS) a odběru sér 5 nebo 10 dní později. Mezi antigenovou imunizací a odebíráním sér byla kontinuálně prováděna injikace anti-IL-10 nebo kontrolní protilátky. TNP-specifické protilátky byly kvantifikovány ELISA testem.

Myši, podrobené působení anti-IL-10, mají sníženou schopnost získat in vivo imunitní odpovědi na dva thymus-dependentní antigeny II typu, fosforylcholin a al,3-dextran. Obr. 39 ukazuje, že myši, podrobené působení anti-IL-10, vykazují normální in vivo imunitní odpovědi na třetí thymus-independentní antigen typu II TNP-Ficoll. Tato citlivost je v konzistenci s našimi předchozími pozorováními, že slezinné B-buňky myší, podrobených působeni anti-IL-10, vykazují normální proliferativní odpovědi následně po stimulaci anti-IgM protilátkami, předpokládanými polyklonálními analogy thymus-independentních antigenú II typu.

Studie H. Kontinuální administrace anti-IL-10 protilátek zpožďuje začátek autoimunity u NZB/W myší.

Shrnutí.

Kontinuální podávání anti-IL-10 protilátek vedla u BALB/c myší k modifikaci endogenních hladin autoprotilátek, plex TNFa a IFNt , tří imunitních mediátorů se známou schopností účinkovat na vývoj autoimunity u lupus-prone NZB/W myší. Za účelem prozkoumání těchto konsekvencí neutralizace IL-10 u NZB/W myší, byly ty

-71CZ 281796 B6 to myši injikovány od narození do 8 až 10 týdnů věku 2-3x týdně anti-IL-10 protilátkami nebo protilátkami pro izotypovou kontrolu. Působení anti-IL-10 výrazně zpožďuje začátek autoimunity u NZB/W myší, což bylo zjištěno buď zkoumáním počtů přeživších zvířat, nebo rozvojem proteinurie, zánětu ledvin a autoprotilátek. U myší, podrobených působení, vzrostl během 9 měsíců počet přeživších myší z 10% na 80% vzhledem ke kontrolám. Tato ochrana proti autoimunitě nastala v důsledku anti-IL-10-indukované regulace zvýšením endogenního TNFa, protože chráněné NZB/W myši rapidně rozvíjely autoimunitu poté, co byly během 30 týdnů do myší, podrobených působení anti-IL-10, vkládány neutralizační anti-TNFa protilátky. Tato data indikují, že IL-10 antagonisté budou užiteční při léčbě lidské kožní erythematoze.

U (NZB x NZW FI hybridních myší se projevují různé autoimunitní nemoci, které se velmi podobají lidské erythematoze. NZB/W myši spontánně vyvíjejí fatální imunokomplex, zprostředkovaný glomerulonefritidou, a to u samiček zhruba po 6-9 měsících a samečků po 12-18 měsících. Předchozí pokusy definovat příčinu zvýšení autoimunity u NZB/W myší byly soustředěny na potenciální roli MHC genů. Bylo zjištěno, že IFNt a cytokiny, které regulačně zvyšují expresi MHC antigenů třídy II v mnoha buněčných typech, akcelerují rozvoj autoimunity v NZB/W myších. Několik nedávných studií naznačilo, že TNFa gen, který je umístěn s MHC komplexem, může hrát roli v patogenezi kožní nefritidy u NZB/W myší. Tyto studie odhalují, že NZB/W myši produkují výjimečně nízké hladiny TNFa a to koreluje s restrikčním fragmentem dlouhého polymorfismu v TNFa genu a polymorfismus v jednoduchém dinukleotidovém tandemu se opakuje v 5’ regulační oblasti TNFa genu. Přičinnost těchto pozorování je implikována faktem, že substituční terapie za použití rekombinantního TNFa podstatně zpožďuje rozvoj nefritidy u NZB/W myši.

IL-10 je cytokin, produkovaný podsystémy aktivovaných T-buněk, B-buněk a makrofágů, které zprostředkovávají rozmanitost imunostimulačních a imunosupresivních vlastností u myších i lidských in vitro testů. Ve snaze vyhodnotit fyziologickou roli IL-10 byly BALB/c myši od narození do 8 týdnů věku kontinuálně podrobeny působení neutralizačních anti-IL-10 protilátek. Kromě těchto známých in vitro vlastností IL-10 jsou myši, podrobené působení anti-IL-10, charakterizovány zvýšením hladin endogenních IFNt a TNFa. Zvýšení IFNt naopak vede k depleci početně malého podsystému B lymfocytů, zvaných Ly-1 nebo CD5 nebo B-l B-buňky, populace, z které je odvozena většina myších autoprotilátek. Tyto studie u normálních myší naznačují, že neutralizace IL-10 může mít u NZB/W myší příznivé následky, tj. vzrůst endogenního TNFa a snížení produkce autoprotilátek, nebo nepříznivé následky, tj. vzrůst endogenního IFNt. Jsou zde uvedeny celkové účinky kontinuálního působení anti-IL-10 na rozwoj autoimunity u samiček NZB/W myší. Jev, že neutralizace IL-10 podstatné zpožďuje u těchto myší začátek autoimunity, je následkem regulačního zvýšení endogenního TNFa.

Myši.

NZB/W FI myši byly namnoženy v chovech DNAX Research Institute z NZB samiček, získaných z Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) a NZW samečků, získaných z Simonsen Laboratories (Gilroy,

-72CZ 281796 B6

CA). Pouze samičky FI myší však byly použity vzhledem k jejich rychlému počátku autoimunity.

Působení anti-IL-10.

Na skupiny 17-23 samiček B/w FI myší bylo působeno krysím IgM mAb nebo IgG mAb proti IL-10, nazvaným SXC.l nebo JES 2A5. Na skupiny 21-23 samiček B/W FI myší vhodného věku bylo působeno vhodnými izotypovými kontrolami mAb, nazvanými J5/D (IgM) nebo GL113 (IgG). Anti-IL-10 mAb a izotypové kontroly mAb byly odebrány ve formě ascitů z holých (nu/nu) myší, purifikovány dvěma následnými precipitacemi síranem amonným, dialyzovány proti PBS a kvantifikovány proteinovou elektroforézou a měřením optické hustoty. Působení sestávalo ze tří částí: a) od narození do prvního týdne věku bylo intraperitoneálně injikováno 0,2 mg mAb/myš, a to 4x IgM nebo 2x IgG, b) 2. týden 0,5 mg mAb/myš 3x IgM nebo 2x IgG a c) od 3. týdne do dospělosti 1 mg mAb/myš 3x IgM nebo 2x IgG každý týden. Předchozí studie ukazovaly, že tyto soubory zvířat udržovaly koncentraci krysího IgM v séru kolem hodnoty 50 μg/ml.

Posouzení ledvinového onemocnění.

Proteinurie byla měřena kolorimetricky za použití Albustix indikátorů (Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN) a klasifikována podle následujících kódů: stopa= 10 mg/dl, l+= 30 mg/dl, 2+=

100 mg/dl, 3+= 300 mg/dl, 4+= 1000 mg/dl. Histologická hloubka glomerulonefritidy byla stanovena v rozmezí 0 až 2+ stupně, založeno na intenzitě, a rozsah histopatologických změn od 0= ledviny bez glomerulárních lézí, l+= slabé léze, např. vzrůst mesangiálního matrixu, mesangiální/glomerulární celularity, srpkovité formace nebo přítomnost zánětových -výměšků a kapsulárních adhezi, a žádné významné tubulární vlásečnicové útvary, 2+= silné léze, např. glomerulární stavba vyhlazena z více než 70% glomerulí s extenzivními tubulárními vlásečnicovými útvary.

Protilátkové ELISA testy.

Sérové protilátky, specifické pro dvou- nebo jednovláknovou DNA (ds- nebo ssDNA), byly kvantifikovány ELISA testem. K modifikaci ELISA nosičů (Flow Laboratories, McLean, VA) bylo použito 5 mg/ml ds- nebo ssDNA a inkubováno při 4 ’C přes noc. Nosiče s navázanými antigeny byly postupně blokovány po dobu 1 hodiny PBS, obsahujícím 0,05% Tween 20, 0,02% NaN₃ a inkubovány 1 hodinu při laboratorní teplotě s 1 μg/ml křenové peroxidázy (HRP), konjugované s anti-mouse IgG nebo IgM (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA). Absorbance byla měřena za použití Vmax mikromiskového detektoru (Molecular Devices, Menlo Park, CA) 30 minut po přídavku 1 mg/ml 2,2'-azino-bis(3-etylbenzthiazolin-6-sulfonové kyseliny), ABTS (Sigma Chemical Co., St Louis, MO). Anti-DNA titry byly vyjádřeny v jednotkách za použití referenčního standardu spojených sér z MRL/MpJ-Ipr/Ipr myší, starých 4 měsíce, poskytnutých Dr. S. Umlandem z Schering-Plough Corp. Zředění 1/100 tohoto standardního séra bylo považováno za 100 U/ml.

Sérová koncentrace Ig a TNFa.

K provedení Ig ELISA testů byly inkubovány nosiče s 1 μg/ml kozího anti-myšího IgG (Kirkegaard a Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) s testovaným sérem ve zředění 1/1 000 nebo 1/5 000, a pak s HRP-konjugovaným kozím anti-IgG nebo anti-IgM (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA) a ponechány vybarvit. Kon

-73CZ 281796 B6 centrace IgG a IgM byly stanoveny ze standardní křivky, získané inkubací se známými koncentracemi našich standardů, což byla směs proteinů z myelomu.

K provedení TNFa ELISA testů byly inkubovány nosiče s 5 μg/ml krysího anti-myšiho TNFa mAb (MP6-XT3.il) s testovaným sérem ve zředění 1/10, a pak s HRP-konjugovaným krysím anti-myším TNFa mAb (MP6-XT22) a ponechány vybarvit.

Předkladatelé uložili jednotlivé kultury E. coli MC1061, nesoucí pH5C, pH15C a pBCRFl (SRa), v Americké typové sbírce kultur (Američan Type Culture Collection), Rockville, MD, USA (ATCC) pod přístupovými čísly 68191, 68192 a 68193. To bylo provedeno za podmínek nutných pro souhlas ATCC pro Depozit kultur pro patentové účely, což zajišťuje dostupnost kultur pro US komisaře pro patenty a ochranné známky (US Commissioner of Patents and Trademarks) podle 35 USC 122 a 37 CFR 1.14 a pro veřejnost dostupnost ve formě US patentu, který vyžaduje údržbu uložených linií. Dostupnost uložených linií není formulována jako povolení k provádění vynálezu v rozporu s právy, garantovanými autoritou jakékoli vlády v souladu s jejími patentovými zákony.

Výpis sekvencí

1. Obecné informace:

i) Předkladatelé. Rene de Waal Malefyt, Di-Hwei Hsu, Anně O'Garra a Hergen Spits ii) Název vynálezu:

iii) Počet sekvencí: 2 iv) Adresa:

a) Adresa: Stephen C. Macevicz, DNAX Research Institute

b) Ulice: California Avenue 901

c) Město: Palo AIto

d) Stát: California, USA

e) ZIP: 94304

v) Forma výstupních dat pro počítač:

a) Typ média: 3,5 diskety

b) Počítač: Macintosh SE

c) Operační systém: Macintosh 6.0.1

d) Software: MS Word 4.0 vi) Současné údaje přihlášky:

a) Číslo přihlášky:

b) Datum vyplnění:

c) Klasifikace:

vii) Původní údaje přihlášky:

a) Číslo přihlášky:

b) Datum vyplnění:

-74CZ 281796 B6 viii) Zplnomocněná osoba/agent:

a) Jméno: Stephen C. Macevicz

b) Registrační číslo: 30,285

c) Reference/pořadové číslo: DX0221 ix) Telekomunikační spojení:

a) Telefon: (415) 496-1204

b) Telefax: (415) 496-1200

2. Informace o sekvenci č. 1:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 160 aminokyselin

b) Typ: aminokyselinový

c) Vláknitost:

d) Topologie: lineární útvar xi) Popis sekvence č. 1:

Ser

Pro Gly

Gin

Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys

Thr

His

Phe 15

5

10

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

20

25

30

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Phe

Gin

Met

Lys

Asp

Gin

Leu

Asp

Asn

35

40

45

Leu

Leu

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

50

55

60

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Glu

65

70

75

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

Lys

Ala

His

80

85

90

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

95

100

105

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

110

115

120

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

125

130

135

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

140

145

150

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Met

Lys

Ile

Arg

Asn

155

160

2. Informace o sekvenci č. 2:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 147 aminokyselin

b) Typ: aminokyselinový

c) Vláknitost:

d) Topologie: lineární útvar xi) Popis sekvence č. 2:

Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg 5 10 15

-75CZ 281796 B6

Asp Ala Phe Ser Arg

Val Lys

Thr

Phe

Phe Gin Thr Lys Asp Glu

20

25

30

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

35

40

45

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

50

55

60

Leu

Glu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Glu

Ala

65

70

75

Lys

Asp

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

80

85

90

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

95

100

105

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Ile

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

110

115

120

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

125

130

135

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Ile

Lys

Ala

Arg

140 145

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použiti interleukinu-10 nebo jeho analogu, agonisty nebo antagonisty k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení zánětu nebo T-buňkami zprostředkovávané imunní funkce, provázené abnormální hladinou tumorového nekrózového faktoru alfa.
2. 2. Použití podle nároku 1 samotného interleukinu-10.
3. 3. Použití podle nároku 1 k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení zánětu nebo T-buňkami zprostředkovávané imunní funkce, provázené zvýšenými hladinami interleukinu-1 nebo interleukinu-6.
4. 4. Použití podle nároku 3 k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení zánětu nebo T-buňkami zprostředkovávané imunní funkce, provázené mikrobiální infekcí.
5. 5. Použití podle nároku 3 k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení zánětu nebo T-buňkami zprostředkovávané imunní funkce, provázené horečkou, hypertenzí, nekrózou tkáně, metabolickou acidózou nebo orgánovou dysfunkcí.
6. 6. Použití podle nároku 4 k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení mikrobiální infekce, způsobující stav septického šoku, toxického šoku, zánětu mozkových blan nebo malárie.
7. 7. Použití podle nároku 3 k výrobě farmaceutického přípravku pro léčení bakteriální infekce, způsobované gramnegativní bakterií nebo grampozitivní bakterii a projevující symptomy septického šoku.
8. 8. Farmaceutický přípravek k léčení septického nebo toxického šoku v hostiteli, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje interleukin-10.

   -76CZ 281796 B6
9. 9. Farmaceutický přípravek k léčení autoimunní poruchy v hostiteli, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje antagonistu interleukinu-10.
10. 10. Farmaceutický přípravek podle nároku 9 k léčení autoimunní poruchy, zprostředkovávané T-buňkami nebo TNFa, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje protilátku proti interleukinu-10.